Spectrometria de Masa

TEZA DE DOCTORAT

Spectrometria de masa

Cuprins

Introducere

Spectrometria de masă utilizează instrumente care nu s-au schimbat fundamental în ultimul deceniu, dar automatizarea lor precum și îmbunătățirea colectării și prelucrării datelor obținute reprezintă progrese importante realizate în dezvoltarea acestora.

Popularitatea largă a spectrometriei de masă, ce o recomandă ca o tehnică de vârf in biomedicină, este dată de specificitatea moleculară de neegalat (datorită capacitătii unice de a măsura cu precizie masa moleculară și de a oferi informații cu privire la structura fragmentelor de ioni diagnostic din proba analit), sensibilitate ultrainaltă la detecție, aplicabilitatea extrem de largă pentru toate tipurile de probe (volatile sau nevolatile, polare sau nepolare precum și materiale gazoase, lichide sau solide) și la majoritatea claselor de compuși. De aceea putem spune despre spectrometria de masă că este cea mai cuprinzătoare și mai adaptabilă tehnică de analiză aflată la dispoziția biofizicienilor, biologilor, chimiștilor și biochimiștilor.

Dispozitivele polifuncționale, așa-numitele sisteme de microanaliză totală (micrototal analysis systems, micro-TAS) reprezintă cea mai avansată micro-biotehnologie existenta în prezent. În cazul cuplării sistemelor de microanaliză totală cu spectrometria de masă (MS) platforma rezultată este capabilă să înlocuiască sursele clasice de ioni cu electrospray aducându-le la nivelul de chip, iar prin funcțiile lor integrate, acestea să efectueze operații analitice multiple.

Un astfel de exemplu este sistemul NanoMate produs de compania Advion BioSciences, în care funcțiile analitice sunt integrate într-un singur robot, dotat cu un chip de siliciu prin care se realizează ionizarea și introducerea probei în spectrometrul de masă. Acest sistem poate fi considerat un adevărat laborator, care include un mecanism robotizat, o coloană de infuzie, o placă de microtitrare pentru depunerea probei și chipul de siliciu pentru electrospray având o suprafață de numai câțiva cm2.

La nivel internațional tehnologia bazată pe sisteme de microanaliză totală este foarte avansată din punct de vedere tehnic, însă ea se află numai într-un stagiu incipient în relația sa cu aplicațiile și optimizarea pentru probe biologice. Numai câteva laboratoare din lume au testat această tehnologie de avangardă și au semnalat concomitent avantajele sale enorme. Cuplajul între sisteme de microanaliză și MS pentru o analiză totală (în vederea investigării structurii fine a biomoleculei) a fost până acum testat numai de câteva grupuri care însă au efectuat experimentele pentru studii de genomică și proteomică și sunt într-o fază incipienta. Această situație de la nivel mondial are două cauze majore: 1) explozia de cunoștințe în domeniul microtehnologiei, dublate de dobîndirea unor competențe multiple asociate progreselor tehnologice și 2) de faptul că majoritatea laboratoarelor dispun deja de echipamente scumpe și sofisticate bazate pe aparatură masivă cu care sunt obișnuite să lucreze.

În acest context prezenta teză combină tehnologia de avangardă a spectrometriei de masă cu microanaliza prin metode inovatoare și avantajoase de infuzie în scopul depășirii limitelor curente ale tehnicilor existente și folosite în mod tradițional ca metode analitice interdisciplinare în cercetarea din domeniile: biologie moleculară, celulară, medicină, biochimie și biofizică.

Totodată, teza a urmărit implementarea microtehnologiei cu spectrometria de masă în studii de glicomică și aplicarea acestei metodologii ultramoderne pentru analiza anumitor compuși glicoconjugați funcționali. Astfel, obiectivele tezei au fost:

– optimizarea și dezvoltarea cuplajului sistemului robotizat NanoMate, dotat cu un chip de siliciu cu spectrometria de masă de înaltă performanță, astfel integrându-se manipularea și injectarea automată a soluțiilor în spectrometrul de masă prin chip electrospray.

– optimizarea cuplajului dintre spectrometrul de masă de tip capcană ionică de mare capacitate (HCT MS) și robotul NanoMate pentru analiza glicanilor, glicolipidelor, proteinelor și în final pentru probe constând în material biologic uman

– s-au realizat spectre de screening ale probelor standard de gangliozide precum și fragmentări de tipul disocierii induse prin ciocnire pentru confirmarea structurală a moleculelor precum și pentru optimizarea cuplajului

– în urma optimizării, inovatorul sistem de infuzie a fost aplicat cercetărilor structurale și de caracterizare interdisciplinare, adică celor din domeniile glicolipidomică, glicomică, biochimie, biofizică și parțial proteomică

– au fost investigate și caracterizate diverși compuși glicoconjugați, și anume specii de glicosfingolipide exprimate în membranele neuronale fetale umane

– analiza gangliozidelor din celulele gliale extrase din rămășițele emisferelor cerebrale ale feților suferinzi de malformația congenitală care poartă numele de anencefalie, a fost o parte importantă în stabilirea parametrilor necesari pentru optimizarea cuplajului dintre robot și spectrometrul de masă, precum și o aplicație importantă a acestuia

– analiza gangliozidelor din creier fetal uman sănătos în scopul realizării unei comparații cu gangliozidele extrase din creierul fetal anencefalic în scopul descoperirii unor biomarkeri specifici acestei malformații

Ca scop final al tezei am avut demonstrarea fezabilității și avantajul utilizării unei surse de infuzie robotizată, automată și funcțională în regim „high throughput” pentru aplicații în biomedicină. Aceste aplicații au avut ca țintă realizarea unui protocol experimental care îmbină tehnicile moderne de analiză din cadrul laboratoarelor de cercetare cu inovațiile din domeniul spectrometriei de masă pentru realizarea unor investigații preclinice necesare bolnavilor cu afecțiuni de stocare lizozomală, precum și identificării biomarkerilor malformațiilor congenitale (anencefalie). Pentru a reliefa avantajul infuziei robotizate s-au realizat și studii control prin infuzia clasică prin seringa pompă, în urma acestora s-a determinat clar și neechivoc importanța tipului de sursă de infuzie utilizată pentru aceste biomolecule.

In capitolul I, în urma studiului bibliografic, am relatat noțiuni teoretice de spectrometrie de masă, ionizare prin electrospray, sisteme de microanaliză cuplate spectrometriei de masă precum și cele mai recente descoperiri din acest domeniu. Am descris, principalele categorii de macromolecule asupra cărora s-au realizat analizele de optimizare și caracterizare ale tehnicilor menționate mai sus.

In capitolul II am descris metodele de lucru, prelucrarea și extragerea biomoleculelor, precum și materialele folosite pentru efectuarea experimentelor analitice.

In capitolul III am adus contribuții privind cuplajul dintre sistemul robotizat de infuzie a probelor și spectrometrul de masă cu capcană ionică de mare capaciatate. Am explicat și descris metodele de optimizare ale acestuia pentru diverse clase de biomolecule formate din specii distincte de gangliozide și o proteină cu masă moleculară mică. Am realizat fragmentarea ETD a citocromului C. Apoi am scris punctual concluziile trase în urma acestor analize, demonstrând astfel că sistemul realizat este optim pentru măsurători de probe biologice fiind mult mai fiabil decât alte metode utilizate în domeniu.

In capitolul IV am analizat rezultatele experimentale pe probe extrase din matrici biologice umane, folosind noul sistem format din cuplajul robotului de infuzie automată a probelor cu spectrometrul de masă cu capcană ionică de mare capacitate. Am realizat prelucrarea spectrelor prin (intrebat EA)

Capitolul V cuprinde concluziile generale desprinse din lucrare și contribuțiile proprii.

Teza se încheie cu bibliografia și cu lucrările științifice proprii din domeniul tezei, publicate sau prezentate la conferințe naționale și internaționale.

Scopul cercetării

Scopul tezei de doctorat a fost realizarea și optimizarea cuplajului dintre spectrometrul de masă cu capcană ionică de mare capacitate și robotul de infuzie automată a probelor NanoMate. Optimizarea acestui cuplaj s-a efectuat pe probe biologice standard și anume glicosfingolipide sialilate și Citocrom C.

Un alt scop al lucrării se referă la efectuarea unor experimente preliminarii pentru determinarea eficacității metodei implementate în cadrul laboratorului nostru și anume analiza unor probe mai complexe extrase din matrici biologice umane.

Ca scop final al tezei am avut demonstrarea fezabilității și avantajul utilizării unei surse de infuzie robotizată, automată și funcțională în regim „high throughput” pentru aplicații în biomedicină. Aceste aplicații au avut ca țintă realizarea unui protocol experimental care îmbină tehnicile moderne de analiză din cadrul laboratoarelor de cercetare cu inovațiile din domeniul spectrometriei de masă pentru realizarea unor investigații preclinice.

Totodată am prezentat o metodă de optimizare a spectrelor inregistrate. In acest sens, s-au examinat procedee de eliminare a zgomotului si a liniei de baza, precum si de deconvolutie a peak-urilor multiple ce rezulta din existenta in fascicolul molecular a unor specii distincte cu rapoarte m/z apropiate.

Obiectivele cercetării

Cercetarea efectuată în cadrul tezei de doctorat a avut următoarele obiective:

– documentarea cu privire la tematica tezei de doctorat și la obținerea de probe diferite extrase din matrici biologice umane;

– implementarea microtehnologiei cu MS în studii de glicomică și aplicarea acestei metodologii ultramoderne pentru analiza anumitor compuși glicoconjugați funcționali.

– dezvoltarea și optimizarea cuplajului dintre sistemul robotizat NanoMate dotat cu chip de siliciu și spectrometrul de masă cu capcană ionică (HCT), în vederea integrării manipulării și injectării automate a probei prin chip electrospray în spectrometrul de masă.

– optimizarea cuplajului robotului NanoMate cu spectrometrul de masă de tip capcană ionică de mare capacitate (HCT MS) pentru a funcționa pentru analiza glicanilor, glicolipidelor, proteinelor și în final pentru probe constând în material biologic uman

– determinarea parametrilor optimi necesari pentru obținerea unui semnal constant de intensitate ridicată a ionilor precum și a unei ionizări optime a moleculelor analizate;

– s-au realizat spectre de screening ale probelor standard de gangliozide și Citocrom C precum și fragmentări de tipul disocierii induse prin ciocnire și disocierii prin transfer de electroni pentru caracterizarea și confirmarea structurală a moleculelor precum și pentru optimizarea cuplajului

– în urma optimizării, metodele obținute s-au aplicat în investigații comparative cuprinse în sfera cercetărilor biochimice, biofizice, biomedicale, și anume: în glicomică, glicolipidomică și parțial proteomică pentru fragmentare, analiză generală și structurală, a diferitelor tipuri de zaharide, peptide și compuși glicoconjugați (glicosfingolipide).

– analiza gangliozidelor din celulele gliale extrase din rămășițele emisferelor cerebrale ale feților suferinzi de malformația congenitală care poartă numele de anencefalie, a fost o parte importantă în stabilirea parametrilor necesari pentru optimizarea cuplajului dintre robot și spectrometrul de masă, precum și o aplicație importantă a acestuia

– analiza gangliozidelor din creier fetal uman sănătos în scopul realizării unei comparații cu gangliozidele extrase din creierul fetal anencefalic în scopul descoperirii unor biomarkeri specifici acestei malformații

CAPITOLUL I

SPECTROMETRIA DE MASĂ.TEHNICI BIOFIZICE ȘI ANALITICE DE STUDIU A BIOMOLECULELOR

1.1 Spectrometria de masă cu ionizare prin electrospray (ESI)

Spectrometria de masă este o metodă fizică utilizată, în special, pentru analiza substanțelor organice deoarece substanța investigată se ionizează, apoi ionii rezultați sunt separați în funcție de raportul masă pe sarcină (m/z). Spectrul rezultat eszultat este caracteristic fiecărui compus, iar tehnicile de fragmentare permit stabilirea structurii analitului [1,2].

Tehnicile de ionizare din MS sunt foarte variate. Unul dintre cele mai importante considerente este energia internă transferată în timpul procesului de ionizare precum și proprietățile fizico-chimice ale analitului ionizabil. Unele tehnici de ionizare necesită mai multă energie și cauzează fragmentări excesive, altele, în schimb, sunt mai blânde producând ioni ai speciilor moleculare (ioni pseudomoleculari) intacți. Ionizările electronice, chimice și de câmp sunt potrivite doar pentru formele gazoase ale compușilor, având ca dezavantaj limitarea posibilităților de analiză la compuși volatili și stabili termic. Totuși, un număr mare de compuși sunt labili termic, iar vaporii lor nu au presiunea corespunzătoare [3,4]. Acest tip de molecule trebuie extrase din starea condensată în cea gazoasă. Sursele de ioni directe sunt de două tipuri: surse de ioni pentru lichide (liquid-phase ion sources) și pentru solide (solid-state ion sources). În cazul surselor de ioni pentru lichide, analitul este in soluție [5].

În anul 1984, Yamashita și Fenn [6], în același timp cu Aleksandrov și colaboratorii [7] au demonstrat tehnica ionizării prin electropulverizare, elctrospray (ESI). Tehnica ESI (ionizare prin electropulverizare, electrospray ionisation) a luat amploare, în momentul în care Fenn și colaboratorii [8,9] au arătat că se pot obține ioni multiplu încărcați ai proteinelor, facând posibilă determinarea greutății lor moleculare cu instrumente limitate la un interval de mase de pâna la 2000 Th. La început ESI a fost considerată o sursă de ionizare dedicată analizei proteinelor. Ulterior, utilizarea sa a fost extinsă, nu numai la alți polimeri și biopolimeri, ci și la analiza moleculelor mici polare. S-a preconizat, într-adevăr, ca ESI permite atingerea unei sensibilități foarte mari, fiind o tehnică adaptabilă interfațării cu alte instrumente și tehnici, cum ar fi cromatografia lichidă de înaltă performanță (HPLC) sau electroforeza capilară. Principiile ESI, precum și aplicațiile sale biologice au fost revizuite extensiv [10]. Astfel, în 1996 și 1997 au apărut, mai multe carți editate pe acest subiect [11].

Figura 1.1 Spectrul de masă în tehnica ionilor pozitivi ai glicerofosfolipidelor extrase din miocard de șobolan [10]

ESI [12] este produs prin aplicarea unui câmp electric puternic, la presiune atmosferică, in timpul trecerii unui lichid, cu un flux slab (1-10 μl min-1), printr-un tub capilar. Câmpul electric este obținut prin aplicarea unei diferențe de potențial de 3-6 kV între capilar și contra-electrod, separate de un spatiu de 0.3-2 cm, astel se vor genera câmpuri electrice de ordinul a 106V m-1, care induc o acumulare de sarcini la suprafața lichidului situat la capătul capilarului. Picaturile se vor divide formând astfel picături mai mici cu sarcini multiple.

a)

b)

Figura 1.2 Schema generală a sursei pentru electrospray (a), și un detaliu al capilarului cu depunere metalică pentru electrospray(b) [12]

ESI poate fi considerată ca fiind împărțită în trei etape: i) crearea unui aerosol încarcat electric, electrospray; ii) reducerea considerabilă a dimensiunii picăturilor; iii) eliberarea de ioni complet desolvatați. Pentru a înțelege formarea unui spray continuu se ia în considerare suprafața unui lichid cu un conținut oarecare de ioni, lichid aflat într-un capilar încărcat electric la un potențial de 3-4 kV, cu un diametru intern de aproximativ 75 μm. Capilarul este poziționat la 2-3 cm distanță față de un contraelectrod,care face parte din spectrometrul de masă. Câmpul electric cauzează separarea sarcinilor din interiorul lichidului și în final deformarea meniscului acestuia într-un con, a cărui formare a fost descoperită de Zeleny [13] și descrisă teoretic pentru prima dată de către Taylor [14]. Abordând procesul în detaliu, se poate spune că suprafața lichidului va forma un oval sub influenta creșterii intensității câmpului, în schimb o curbare accentuată a ovalului va determina creșterea intensității câmpului. Când se atinge un anumit nivel de câmp echilibrul dintre tensiunea superficiala a lichidului și forțele electrostatice devine independent de raza curburii, iar matematic raza poate deveni zero. Cu toate acestea intr-un sistem real, intensitatea infinita a campului este imposibilă. În schimb, la atingerea momentului critic al câmpului electric, conul Taylor se formează instantaneu și începe ejecția imediată a unui jet fin de lichid, de la vârful sau spre contraelectrod [15]. Acest mod de operare este denumit modul con-jet [16]. Jetul poartă un exces de ioni cu stare de încărcare identică deoarece ia naștere din punctul în care există cea mai mare densitate de sarcini, ex: din vârful conului. Cu toate acestea un astfel de jet nu poate rămâne stabil pentru o perioadă lunga de timp, asa că se va sparge în picături mici. Datorită sarcinilor identice și în pofida forței de coeziune, aceste picături se vor sparge prin repulsie coulombiană. În concluzie, în urma acestui proces se generează un spray fin, astfel dând naștere la termenul de electrospray.

Primele studii privitoare la fenomenul ionizarii prin electropulverizare precum și la introducerea sursei de ioni cu electrospray ca sursă de ioni în faza gazoasă cu analiza prin spectrometrie de masă au fost inițiate înca din 1968 de către Malcolm Dole si colab. [17] care au întreprins o serie de experimente de generare în vid a fasciculelor de ioni macromoleculari. În experimente se urmărea electropulverizarea unei soluții diluate de polistiren într-o baie de gaz (azot) la presiune atmosferică pentru că, prin evaporarea solventului (3:2 benzen:acetonă) din picaturile încărcate, densitatea superficială de sarcină să crească până la atingerea limitei Rayleigh care cauzează subdivizarea picăturilor [18]. Prin continuarea procesului de divizare în soluția original, suficient diluată, se poate atinge o stare în care, în medie, fiecare picatură conține o singură macromoleculă. După ce întreg solventul se evaporă, cel puțin câteva sarcini rămân localizate pe macromoleculă. Rezultatul concret este o dispersare a macroionilor în baia de gaz care poate fi destins apoi sub forma unui jet supersonic, într-o cameră vidată. Se obțin astfel fascicule moleculare de intensitate ridicată și cu o împraștiere redusă după viteze.

Eficacitatea acestei metode a fost demonstrată, de Malcolm Dole, în doua seturi de experimente realizate în laboratoare separate, obținându-se pentru moleculele de polistiren un curent de ioni de la 10-14 pana la 6.10-13 A. Presupunând că macroionii au atins viteza limită a gazului, în jetul liber, Dole a obținut valori ale raportului m/z corespunzătoare unor molecule simplu încărcate [17].

Scopul studiilor lui Dole fiind detectarea speciilor polimerice precum cele de polisitren care nu sunt ionizate în soluție, rezultatele obținute au fost pentru acea dată prea puțin convingătoare. Din acest motiv, în 1980, Yamashita și Fenn, cuplând sursa ESI cu un spectrometru de masă quadrupolar reiau studiile privitoare la posibilitatea aducerii moleculelor complexe și nevolatile în faza gazoasă, fără descompunere, cu formarea unui jet liber, detectabil cu spectrometrul de masă. Încep astfel primele investigații cu scopul de a se elucida mecanismele evaporării picăturilor și ionizării prin electrospray [10,19].

În locul macromoleculelor, Yamashita și Fenn au utilizat însă specii moleculare cu masă moleculară suficient de mică astfel încât să fie posibilă învestigarea cu ajutorul unui analizor cuadrupolar care avea un domeniu de mase de până la 450 u.a.m. Prin această analiză s-au elucidat procesele complexe prin care picăturile încărcate se divid prin evapoare. Experimentele lui Yamashita și Fenn au arătat pentru prima dată că fasciculul ionic rezultat prin ESI conține o largă varietate de specii ionice. Spectrul de masă înregistrat prin ESI a dovedit că aceste specii includ ioni în clusteri cu molecule de solvent și/sau specii neionizate și că natura ionilor rezultați depinde de compoziția soluției originale, de temperatură și compoziția băii de gaz și de potențialul aplicat capilarului [19]. Rapoartele lor au demonstrat că această tehnică de ionizare este capabilă să producă o varietate de clusteri de ioni, și mai ales, că ESI permite analiza prin spectrometrie de masă a moleculelor organice și bioorganice de masă moleculară foarte mare și oferă posibilitatea obținerii de ioni în fază gazoasă din compuși nevolatili sau prea labili pentru a putea fi analizați prin spectrometria de masă, utilizând metodele clasice de ionizare [19].

Picăturile incărcate produse prin spray suferă în continuare, în sursa ESI, un fenomen de divizare datorită evaporării continue a solventului, în timp ce sarcina rămâne constantă. Divizarea picăturilor la o sarcină constantă a fost confirmată experimental prin observarea directă a picăturilor de către Davis et al. [20] într-un experiment utilizând un analizor quadrupolar de tip capcană ionică (ion trap), cu vizualizarea picăturii prin “light –scattering”.

Prin evaporarea solventului raza, rc, a picăturii descrește continuu conducând în acest fel la o micșorare a forței de coeziune ce menține picătura [20]. Sarcina electrică a picăturii rămânând constantă, va conduce la o mărire a forței de respingere electrostatică a sarcinii situată pe suprafață, până când picătura atinge așa-numita limită de stabilitate Rayleigh:

qRy = 8(0rc3)1/2 (1.1)

Ecuația de mai sus reprezintă expresia matematică a limitei Rayleigh arată de fapt condiția în care forța de respingere electrostatică devine egală cu forța de coeziune care menține picătura întreagă. Picătura încărcată devine instabilă când raza rc și sarcina satisfac ecuația (ce se obține matematic, din egalarea celor două forțe: de repulsie coulombiană și de tensiune superficială). Experimental, s-a observat că picăturile suferă fisiune în momentul în care sunt foarte aproape de limita Rayleigh. Prin micșorarea treptată a volumului, la o evaporare continuă a solventului, raportul sarcină/volum crește foarte mult ceea ce are drept consecință atingerea stării de instabilitate care provoacă fisiunea Rayleigh sau dezintegrarea electrodinamică. În acest proces, de fapt, prin fragmentarea picăturii, sarcinile electrice excendentare responsabile de instabilitate sunt expulzate până când raportul sarcină/volum atinge din nou valoarea stării de stabilitate. În dezintegrare, se apreciază că se elimină aproximativ 15% din sarcina totală a unei picături și totodată aproximativ 2% din masa de dinainte de fisiune (fig 1.3). După câteva cicluri de evaporare/fisiune Rayleigh, se produc clusteri de ioni în fază gazoasă [21].

Figura 1.3. Mecanismul formării picăturilor încărcate [22]

Sursa de ioni cu nanoelectrospray a fost concepută și introdusă pentru prima dată în spectrometria de masă de către Mann și Wilm [22,23]. În cazul tehnicii clasice de nanoelectrospray emitorul de ESI este format dintr-un capilar de sticlă terminat printr-un vârf cu un orificiu de aproximativ 20-30 m diametru interior, în care proba lichidă de analizat (10-15 L) este introdusă cu ajutorul unei pipete de tip „microloader”. Un fir de oțel inoxidabil conectat la sursa de inaltă tensiune este de asemenea introdus în capilar. Procesul de ESI se declanșează prin aplicarea pe firul de oțel din interiorul soluției [23] a unei tensiuni mult mai mici decât în cazul surselor microESI și anume de 1-1.5 kV.

Figura 1.4 Procesul de electropulverizare în sursa convențională cu microspray și cea cu nanospray [23]

O altă variantă o reprezintă nano-emitorii de tip capilar de sticlă, având depus pe suprafața exterioară un strat dintr-un material conductor precum, aur, argint, cupru, carbon sau diverse aliaje. În cazul acestor sisteme de nanoESI, procesul de electrospray se asigură prin conectarea suprafeței exterioare la sursa de inaltă tensiune a spectrometrului, cu ajutorul unui fir conductor. Astfel de nano-emitori pot funcționa atât în regim de sursă ESI independentă cât și ca electropulverizator pentru MS în cuplaje cu sisteme de separare precum HPLC, CE etc. [24,25]. Debitele asigurate de aceștia sunt de 400-500 nL/min ceea ce face ca sensibilitatea surselor de nanoESI să fie mult superioară celor cu infuzie de tip microESI prin ac de seringă.

În ultimii ani, o dată cu explozia tehologiei microfluidice și a sistemelor de chip, așa cum se va discuta în cele ce urmează, sursele nanoESI au fost mult îmbunătățite în termeni de debit, sensibilitate, reproductibilitate și calitate a semnalului prin conceperea, dezvoltarea și introducerea în spectrometria de masă a micro- și nano-chipurilor pentru electrospray [26].

Ionizarea prin electropulverizare este o tehnică de usoară ionizare, la presiune atmosferică, aplicabilă probelor nevolatile, deoarece implică diluarea acestora în solvenți volatili acizi sau bazici. Această ionizare este deosebită deoarece oferă posibilitatea formării ionilor din macromolecule și impiedică apariția fragmentărilor în sursă. Spre deosebire de celelalte procese de ionizare la presiune atmosferică (de ex. MALDI) [27], ESI prezintă avantajul de a produce ioni cu sarcină multiplă, acomodând astfel extinderea în mod eficient a gamei de mase a analizorului pentru mărimi de ordinul kDa-lor caracteristice proteinelor, fragmentelor polipeptidice și altor macromolecule.

Figura 1.5 Principiul de funcționare al unei surse de ionizare MALDI [27]

ESI utilizează energia electrică pentru a asigura transferul ionilor moleculari din soluție in fază gazoasă inainte de a fi supusi analizei MS. De asemenea compușii neutri pot fi transformați în forma pseudoionică într-un lichid sau gaz prin protonare sau cationare și ca urmare studiați prin ESI MS.

Lichidul conținând analitul de interes este dispersat prin electrospray [6] formându-se astfel un aerosol fin. Solvenții utilizați frecvent pentru această tehnică sunt compuși organici volatili (de ex. acetonitril, metanol etc.) în amestec cu apa bidistilată și deionizată.

În anul 2002 Premiul Nobel în Chimie a fost acordat profesorului John Bennet Fenn, și lui Koichi Tanaka pentru dezvoltarea metodelor blânde de ionizare (ESI și MALDI) a macromoleculelor biologice în spectrometria de masă, și lui Kurt Wüthrich pentru dezvoltarea spectroscopiei nucleare cu rezonanță magnetică (RMN) în scopul determinării structurii tridimensionale a macromoleculelor biologice în soluție.

1.2 Sisteme de chip-uri pentru ESI si microTAS (micro total analysis sistems)

Instrumentele utilizate în spectrometria de masă nu au evoluat fundamental în ultimul deceniu, totuși progresele importante realizate în acest domeniu constau în îmbunătățirea prelucrării și colectării datelor obținute în acelasi timp cu automatizarea acestora. Implementarea automatizării a fost necesară din punct de vedere al reducerii costurilor, dar și a timpului de lucru a persoanelor implicate în analiza și caracterizarea probelor, persoane care efectuează activități repetitive, consumatoare de timp și energie. Automatizarea a dus și la o reproductibilitate foarte bună a datelor și la o gestionare mai eficientă a rezultatelor obținute. Sistemele de automatizare asigură astfel un control mai strict al realizării operațiunilor de rutină precum și o calitate superioară a datelor rezultate. De asemenea popularitatea largă a spectrometriei de masă, ce o recomandă ca o tehnică de vârf în biomedicină, este dată de specificitatea moleculară de neegalat (datorită capacității unice de a masura cu precizie masa moleculară și de a oferi informații cu privire la structura fragmentelor de ioni diagnostic din proba analizată), sensibilitate ultrainaltă la detecție, aplicabilitatea extrem de largă pentru toate tipurile de probă (volatilă sau nevolatilă, polare sau nepolare precum si materiale gazoase, lichide sau solide) si la majoritatea claselor de compuși. De aceea putem încadra spectrometria de masă ca fiind cea mai cuprinzătoare și mai adaptabilă tehnică de analiză aflată la dispoziția medicilor, cercetătorilor, biologilor, geologilor, chimistilor și biochimiștilor.

Dispozitivele polifuncționale, asa-numitele sisteme de microanaliză totală (micrototal analysis systems, micro-TAS) reprezintă cea mai avansată micro-biotehnologie care există în prezent. În cazul cuplarii sistemelor de microanaliza totala cu spectrometria de masa (MS), platforma rezultată este capabilă să inlocuiască sursele clasice de ioni cu electrospray aducându-le la nivelul de chip, iar prin funcțiile lor integrate, acestea să efectueze operații analitice multiple. Un astfel de exemplu este sistemul NanoMate produs de compania Advion BioSciences, în care funcțiile analitice sunt integrate într-un singur robot, dotat cu un chip de siliciu prin care se realizează ionizarea și introducerea probei în spectrometrul de masă. Acest sistem poate fi considerat un adevărat laborator, care include un mecanism robotizat, o coloană de infuzie, o placă de microtitrare pentru depunerea probei și chipul de siliciu pentru electrospray având o suprafață de numai câțiva cm2.

Avantajele folosirii în bioanalitică a unui asemenea sistem sunt numeroase. Printre acestea se numără eliminarea procedurilor laborioase și a experimentelor care necesită echipamente și aparate scumpe, spațiu si investiții pentru menținere și reparare. Consumul redus de probă și solvenți ajunge la valori minime de 5-10 microlitri, la concentrații de ordinul atto și femtomolilor, în cazul analiților și aproximativ 100 de microlitri reprezentânt cantitatea de solvenți. Minituarizarea este de un real folos din punct de vedere al spațiului, iar din aceasta derivă ușurința de manipulare. Precizia excepțională și acuratețea ridicată precum și reproductibilitatea înaltă permit analiza probelor biologice care necesită condiții speciale de măsurare. Datele rezultate sunt obținute la sensibilitate ultraînaltă permițând detectarea și elucidarea structurală a biomarkerilor. Costurile reduse, de asemenea, reprezintă un avantaj deosebit de important.

Evaluarea comparativă a performanțelor obținute cu diferite tipuri de aliniamente față de orificiul MS va ghida optimizarea ulterioară a funcțiilor microchipului precum: adaptarea volumului injectorului microfabricat și starea suprafeței microcanalului pentru a putea asigura un control riguros al fluxului electroosmotic și pentru a limita interacțiunea moleculei analitice cu pereții microcanalului. În cazul tuturor cuplajelor, etapa imediat următoare asamblării mecanice microTAS-MS o constituie optimizarea parametrilor electrolitului tampon (pH, concentratie, temperatura, natura), ai probei (concentratie, volum injectat), ai procesului de ESI (tensiune, flux gaz desolvatare, temperatura desolvatare) si ai MS (detecție, viteză de scanare, parametri de izolare/fragmentare precursor).

Unul din elementele esențiale ale sistemului chip-ESI MS îl reprezintă emițătorul ESI, întrucat calitatea spectrelor de masa obținute depinde esențial de caracteristicile acestuia și, în ultimă instanță, informația structurală rezultată din întregul experiment. În prezent, prin dezvoltarea puternică a tehnologiei de microfabricație, s-a putut elabora un numǎr mare de prototipuri funcționale pentru emițǎtorul de electrospray corespunzătoare cuplării dispozitivelor microfluidice cu MS.

În anii anteriori, MEMS a fost principala tehnologie pentru fabricarea microdispozitivelor din substraturi pe bazǎ de siliciu, ca de exemplu cuarț și sticlǎ. Primul microdispozitiv ESI a fost construit folosind aceastǎ abordare. În 1997, Ramsey și colaboratorii [28] au construit un chip din sticlǎ pentru ESI. Acest model a extins aplicabilitatea microdispozitivelor de la detecția prin fluorescențǎ la detecția prin spectrometrie de masă. În același timp, grupul condus de Barry Karger a dezvoltat un dispozitiv similar cu un multicanal ESI pentru a permite analize mai performante [29]. Totuși, au fost semnalate anumite probleme legate de faptul că un emițǎtor deschis la exterior construit pe o margine platǎ fǎrǎ nici un mecanism de reglare sau control al fluidului va forma o picǎturǎ mare ce va diminua eficacitatea separǎrii datoritǎ lǎrgirii benzii. Mai mult, existǎ probleme asociate cu interfața ESI datoritǎ hidrofilicităăii emițǎtorului din sticlǎ sau cuarț. Soluția de spray va fi atrasǎ pe suprafata microchipului și va tinde sǎ formeze o picǎturǎ mare ce intra in competiție cu o ionizare stabilǎ. Pentru a elimina această posibilitate și pentru a îmbunǎtǎți performanțele microchipului suprafața a fost hidrofobizată [29]. În acest fel, la iesirea din capilar a chipului, se reduce umectarea însa stabilitatea chimicǎ poate fi afectată prin descǎrcare electricǎ. În plus, fǎrǎ o presiune externǎ semnificativă pentru a genera o ratǎ a fluxului de 100-200 μL/min, semnalul de electrospray nu a fost stabil din cauza curgerii electroosmotice scǎzute. O altǎ încercare de a înlatura neajunsul a fost recurgerea la asistența pneumatica. În acest sens, un gaz de pulverizare și un lichid auxiliar au fost adǎugate la capătul terminal al canalului de separare pentru a reduce dimensiunea picǎturii și de asemnea, pentru a crește eficiența ionizǎrii [30]. Aceast precedeu s-a constituit in timp ca baza pentru construirea nebulizatoarelor pneumatice miniaturizate ca parte integranta a chipului. Într-un astfel de dispozitiv integrat, un amestec conținând 5 peptide au fost bine separate și ionizate pentru analizǎ prin MS [30].

Un model de electrospray direct de pe capǎtul unui canal a fost realizat pe un chip microTAS pe bazǎ de polimer. Wen și colaboratorii [31] au utilizat policarbonatul (PC) pentru a fabrica un microchip și au încorporat o duzǎ triunghiularǎ ascuțitǎ la marginea chipului pentru a susține ionizarea și rezervoare pentru a facilita zona de concentrare isoelectricǎ (IEF). Cu un asemenea sistem, un amestec de 3 proteine a fost bine separat prin IEF în canalul de separare și ionizat secvențial prin emițǎtorul ESI. Eficiența separǎrii a fost mai slabǎ decât in cazul folosirii capilarelor funcționalizate, dar în schimb s-au eliminat problemele de umectare întâlnite în dispozitivele de sticlǎ ce exploatează proprietatea hidrofobă nativǎ a polimerului utilizat.

Producerea ionilor în faza gazoasă din ESI este mult mai eficientǎ dacă este utilizat un emițator de dimensiuni mai mici. Dealtfel, este mai puțin complicat de atașat o linie de transfer ca o interfațǎ de electrospray decât fabricarea prin decapare umedǎ. De asemenea se pot prevedea avantajele metodelor de fabricare a microchipurilor pentru a produce funcțiuni multiple prin microfabricare. Acest tip de model a fost prima oarǎ introdus de grupul lui Ruedi Aebersold [32].

Un capilar lung de 12 cm se ataseaza la marginea dispozitivului microfluidic și conectat la spectrometrul de masǎ. Acest capilar transportǎ proteinele prin curgere electroosmotică cǎtre spectrometrul de masǎ. Aplicarea unei tensiuni ridicate capilarei determinǎ ionizarea probelor la intrarea în spectrometrul de masǎ. În sistemul Aebersold, problema poziționării prin aliniere a capilarei nu este complet rezolvată, ea rămânând o deficiență a acestui model. În scopul de a atașa o capilarǎ la capǎtul unui dispozitiv cu substrat tare, douǎ metode principale au fost raportate pentru aceastǎ cuplare.

Prima raportare a formării electrosprayului din capătul planar deschis a unui microcanal de la marginea unui chip de sticlă a fost realizată de către Karger [33], o interfață similară a fost folosită de Ramsey [28]. În ambele cazuri, dispozitivele au furnizat o suprafață plată, hidrofilică de sticlă pentru formarea electrosprayului. Mai întâi Zhang și colaboratorii [33,34] au utilizat decaparea dublă pentru a construi un canal larg în care a fost introdusǎ capilara. Procedura a fost reproductibilǎ dar după interconectare s-a observat apariția unui volum mort semnificativ. Thibault și colaboratorii au raportat un microsistem integrat din sticlă pentru analiza probelor digestionate în gel [35]. Sistemul include un port de injectare mare (2.4 µl), un canal pentru separare prin electroforeză capilară (CE) si un volum mic de probă pierdută, un emițător nano-ESI pentru interfațarea ESI/MS. Dispozitivul a fost folosit pentru identificarea rapidă a 72 de proteine din celule canceroase de prostată umană într-un ritm de 12 probe pe oră [35]. Acest dispozitiv este prima platformă complet integrată și bazată pe chip de proteomică pentru analize MS, chiar dacă sensibilitatea de detecție încă poate fi îmbunătățită pentru proteine cu abundență mică. Harrison și grupul lui Thibault au demonstrat cǎ există posibilitatea de a fixa capilara de volum mort mic (<0,7nL) prin modelarea unui orificiu superior îngust. Aceasta face chipul utilizabil cu un performant emițător de nanosprayer [35]. În conformitate cu rezultatele raportate, probele din canalul separator pot fi bine transferate cu mai puțin fluid injectat, însă forarea necesitǎ îndemânare pentru a obține un aliniament precis al canalului și a reduce contaminarea lui în timpul fabricǎrii chipului.

În timp, atașarea unei capilare a devenit principalul model pentru chipurile ESI datoritǎ ușurinței fabricǎrii și performanțelor excelente ale ESI. Totuși, aceastǎ abordare s-a dovedit a nu fi ușor de controlat și nu oferǎ reproductibilitate prea mare.

În scopul depășirii acestor neajunsuri și imbunătățirii performanțelor sistemelor microTAS cu capilar extern atașat, Henion și colab. [36] au construit un microchip ce include separare prin electroforeză capilară urmată de electrospray. Dispozitivul este reglabil și prezintă un tub emițǎtor din oțel inoxidabil ce include un flux de reîncărcare și un gaz de pulverizare pentru a intensifica eficiența ionizǎrii. Această realizare oferǎ nu numai posibilitatea aplicǎrii unei tensiuni optime de ESI dar și de a se constitui ca o zonǎ tampon, ceea ce înseamnǎ cǎ separarea nu este afectatǎ de fluxul de pulverizare. Toate condițiile pot fi bine complementate în emițătorul separat pentru fiecare dispozitiv microfluidic în parte. În acest model, perfomanțele de electrospray au fost optimizate în afara dispozitivului și pulverizatorul a putut fi reatașat la diferite chipuri, ceea extinde timpul de viațǎ și eliminǎ problemele de contaminare. Rezultatele arată cǎ eficiența separǎrii prin utilizarea unui astfel de chip microfluidic permite separarea și detectarea clară a moleculelor mici precum carnitina și acrilcarnitina utilizând dispozitive de electropulverizare cuplate. Dezavantajul semnalat în cazul acestui model este că efectul de diluare provenit de la fluxul pneumatic poate reduce dramatic sensibilitatea de detecție impunand lucru la concentrații ceva mai ridicate ale probei în solvent.

Pentru a se elimina efectul de diluare determinat de fluxul de pulverizare, un emițător de electropulverizare neacoperit este o alternativǎ pentru utilizarea microchipurilor ESI. În scopul de a obține o ionizare fǎrǎ ajutor pneumatic, stabilǎ trebuie luate în considerare forma, dimensiunea interioarǎ și proprietǎțile suprafetei emițatorului. De obicei o capilarǎ îngustǎ cu o reducere a diametrului exterior poate genera conul lui Taylor de ESI la o tensiune mai mica, inainte de a începe o descǎrcare corona. Pe de altǎ parte, unele materiale conductoare folosite pentru depunere pe suprafața emițǎtorului, ca de exemplu aurul și carbonul, pot mǎri stabilitatea semnalului de ESI si eficienta ionizǎrii [37]. Totuși, în anumite condiții de operare ale electropulverizarii, s-a putut observa efectul de efervescenta care consta in aparitia bulelor de gaz la capatul pulverizatorului de ESI. In scopul de a elimina efectul de efervescențǎ și a obține performanțele unei ionizǎri stabile, tensiunea adecvata aplicata in vederea ESI joacǎ un rol important în modelul fara strat conductor.

Douǎ proprietǎti critice fac ca polimerii sa fie foarte potriviți ca materiale pentru fabricarea dispozitivelor microTAS pentru ESI. In primul rand, în comparație cu materialele din sticlǎ sau cuarț, plasticitatea polimerului la temperaturi acceptabile îl face adaptabil pentru fiecare formǎ. În acest fel, utilizarea materialelor plastice devine o alternativǎ satisfǎcǎtoare pentru tehnologiile MEMS complicate. O a doua proprietate cheie a dispozitivelor din plastic este hidrofobicitatea lor. Datoritǎ caracterului sǎu hidrophobic nativ, plasticul este ideal pentru utilizare ca emițǎtor pentru MS fǎrǎ nici o altǎ procedurǎ de modificare. Mai mult, temperatura redusǎ solicitata la producție este o caracteristicǎ atractivǎ a substraturilor din polimer, ceea ce face fabricarea microchipurilor extrem de facila în laboratoare fara o dotare speciala. Cu toate acestea, fabricarea chipurilor ESI pe substraturile din polimer este oarecum limitatǎ de plasticitatea acestora [38].

Asemǎnǎtor cu chipurile din sticlǎ, fabricarea dispozitivelor ESI presupune fie o capilarǎ atașatǎ la capǎt fie modelarea canalului electropulverizator direct pe suprafața chipului pe bazǎ de polimer.

O primă variantă interesantă de microTAS CE/ESI MS polimeric a fost raportata de Kameoka și colaboratorii care au construit un chip microfluidic din polimer cu o ieșire deschisǎ la capǎtul canalului. Chipul a fost cuplat cu un micropulverizator [39]. Separarea probelor prin CE pe chip a fost urmată de ionizare prin electropulverizare ESI, ceea ce a demonstrat pentru prima dată cǎ dispozitivele microfluide pe bazǎ de polimer pot fi cuplate on-line pentru detectie prin MS prin intermediul ionizarii prin electrospray. Pentru interfațarea cu detectorul de tip MS, grupul lui Chen [40] a utilizat PDMS ca substrat pentru chipuri. O joncțiune lichidă a fost fixată la capǎtul canalului pentru a conecta capǎtul ascuțit al capilarei cu canalul de separare. Folosind ca detector spectrometrul de masă grupul amintit a obținut rezultate excelente în separarea și identificarea atât a peptidelor standard cât și a celor derivatizate prin acetilare [40]. Comparativ cu substraturile din sticlǎ, chipurile din plastic au avantajul costurilor scǎzute și procedurilor de fabricare ușoare, de aceea sunt mult mai potrivite pentru utilizare pe scara largă [41].

Figura 1.6 Microchip PDMS: (a) vârf emitor cu grafit, (E) rezervor pentru probă, (S) volumul neutilizat al probei, (SW), soluție tampon (B) [41]

Un alt tip de dispozitiv microTAS este cel dedicat infuziei directe, prin care se elimină neajunsurile tehnice ce decurg din integrarea etapei de separare. Într-un dispozitiv microTAS de infuzie directă, emițătorul ESI poate fi construit în formatul unui șir de microcapilare dispuse paralel, format în general utilizabil în analizele multiple. Abordarea analizei prin infuzia directǎ are însă dezavantajul că poate conduce la suprimarea ionilor minori din amestecuri complexe și la posibilitatea apariției efectului de interferență în timpul analizei MS, însă prezintă avantajul clar al vitezei de lucru, ceea ce permite sǎ fie executate cicluri multiple de fracționare a ionilor pe instrumente de MS în timp foarte scurt. Majoritatea dispozitivelor de infuzie directă au fost fabricate prin tehnologii MEMS utilizând substraturi din silicon. Lee și colaboratorii descriu un proces de fabricare a duzelor din parilenă la marginea unui microchip din silicon [42,43]. Emisia stabilǎ a ionilor poate fi atinsǎ la un debit minim de numai câțiva nL/min fǎrǎ utilizarea unui gaz de pulverizare. Deși acest tip de dispozitiv necesitǎ o tenisune relativ mare pentru obținerea unei electropulverizări uniforme, utilizarea parilenei pentru fabricarea microvârfului surmontează problemele de fragilitate asociate cu vârfurile capilarelor și astfel dispozitivul devine mai robust pentru comercializare.

Într-un alt model de infuzie comercializat pentru bioanaliza probelor reale [44] autorii au utilizat un proces de decapare profundǎ cu ioni reactivi (DRIE) sau MEMS pentru a construi o placǎ ESI miniaturizatǎ. Un canal a fost gravat de-a lungul plǎcii din silicon și o duzǎ (10 μm DI x 30 μm DE) au fost conectate peste capǎtul canalului. Rezervorul gravat în partea din spate poate reține analitul pentru ionizare directǎ. Este de asemenea posibilǎ cuplarea altor dispozitive de separare datoritǎ volumului mort scǎzut. Prin utilizarea tehnologiei MEMS, pot fi realizate analize multiple prin alinierea duzelor în serie, cu o mare densitate pe plăcuțe de câțiva cm2 [44]. Datoritǎ vitezei mari de prelevare a analiților asigurată de acest gen de dispozitive, se poate utiliza convenabil un instrument MS funcționând în regim de tandem MS, pentru selectarea ionilor în primul analizator de masǎ și apoi detecția în cel de-al doilea analizator de masǎ pentru a compensa lipsa separǎrii. Acest microchip este de asemenea compatibil cu interfața MALDI-MS. Când este cuplat cu prelevarea probelor direct de pe un gel 2-D, probele formate în-gel pot fi analizate secvențial prin instrumente MALDI-MS și ESI-MS pentru a mǎri cantitatea de informații obținutǎ. Limitările legate de neintegrarea separării în varianta infuziei directe [45], sunt surmontate de forma miniaturizatǎ și viteza de analizǎ rapidǎ ceea ce furnizeazǎ o platformă convenabilă și la costuri mici pentru analiza în proteomicǎ.

În scopul de a obține o microelectropulverizare performantă și stabilă, canalul de ieșire ESI trebuie să fie întodeauna ascuțit pentru a reduce fenomenul de rǎspândire al lichidului și a micșora tensiunea necesară inițierii procesului ESI și stabilirii conului Taylor. Substraturile polimerice, precum PDMS, PMMA și poliamidele, au fost des utilizate în acest scop întrucât corespund destul de bine acestor deziderate [46].

Ca și în cazul substraturilor siliconice, și clasa de microTAS polimerice cu infuzie directă prezintă varianta de dispozitiv de pulverizare multicanal pentru analiza probelor multiple în regim „high throughput”. Se remarca studiile lui Yuan și Shiea care au construit un analizator secvențial sub formǎ de stea compus dintr-un canal deschis și dintr-o formă ascuțitǎ la ieșirea canalului deschis, care a fost tǎiat manual in substratul de PMMA [47]. Lichidul poate fi prins în canalele adânci fǎrǎ utilizarea unei plǎci de acoperire. Dispozitivele de acest gen necesitǎ insa rezervoare suficient de adanci pentru a minimiza efectul evaporǎrii din canalul deschis. Mai mult, pentru a obține o ionizare prin electropulverizare eficientă este necesară aplicarea unei tensiuni relativ mari (3-4 kV).

Rolando și colaboratorii au dezvoltat o sursǎ model cu un microvârf ce funcționeazǎ în conditii de nano-electrospray [48]. În acest scop autorii au conceput în chip o „peniță” cu structurǎ planară prin utilizarea fotorezistorului epoxi negativ SU-8, ce oferǎ calitate și reproductivitate mare în procesul de fabricație.

Funcționarea micropeniței este foarte asemǎnǎtoare cu aceea a unui stilou cu pompǎ, astfel cǎ incat penitele conțin un rezervor și o deschizǎturǎ capilarǎ ce conduce proba de analizat în punctul de vârf al „penitei”. În aceasta variantă de concepere a micropulverizării, potențialul de electrospray este redus cu succes la 1,5 kV, ceea ce îl face mult mai compatibil cu cerințele nanoESI decât multe dintre celelalte dispozitive microfluidice bazate pe canale.

Pentru majoritatea formelor ascuțite obținute prin prelucrare manuală, poziția conului lui Taylor nu este stabilǎ, ceea ce cauzează contaminarea între canale. În scopul reducerii fenomenului de contaminare, Kameoka și colaboratorii au inserat o foaie tringhiulară de parilenă între cele douǎ plăcuțe pentru a limita lichidul la ieșirea din sistem [49]. Acest artificiu a permis realizarea unui dispozitiv dens cu distanța de 80 μm între fiecare vârf. Din rezultatele prezentate de autori, sistemul a arǎtat o bunǎ stabilitate la electrospray și o reproductibilitate mărită. Această realizare tehnologică și-a găsit aplicabilitatea în descoperirea drogurilor și a substanțelor dopante, activitate ce necesitǎ o analizǎ calitativǎ și cantitativǎ deosebit de performantă. Alte emițǎtoare ESI multiple au fost realizate de grupul lui Smith [50]. Autorii au utilizat metoda de ablațiune cu laser pentru a fabrica canalele de trecere (30 μm) prin plǎcile de PC și le-au introdus în producția de serie. Spre deosebire de aplicarea ESI secvențială , emițătorul de pe placǎ realizează spray simultan constituindu-se de fapt într-o sursǎ de multielectrospray a ionilor. În acest fel, intensitatea semnalului poate fi intensificată prin colectarea totalității ionilor generați de la toți emițǎtorii în același timp.

1.3 Biomolecule

1.3.1 Gangliozidele – monosialogangliozidele

Gangliozidele sunt componente glicolipidice prezente în membrana externă a celulelor nervoase periferice. Gangliozidele aparțin grupului de glicolipide acide care conțin lipide (ceramide), oligozaharide și acid sialic.

Gangliozidele și glicosfingolipidele precursoare sunt abreviate conform sistemului introdus de Svennerholm [51] și potrivit recomandărilor Comisiei Reunite IUPAC-IUB privind Nomenclatura Biochimică [52].

Cu toate că au mai existat propuneri alternative de denumire, nomenclatura dezvoltată de Svennerholm este cel mai frecvent utilizată în literatură datorită simplității, raționalității sale și ușurinței în amintire și redare.

În acest sistem:

– litera G semnifică gangliozida

– literele M, D, T, Q, P, H, S se referă la numărul resturilor de acid sialic care este poziționat pe structura oligozaharidică, respectiv mono-, di-, tri-, tetra-, penta-, și în mod excepțional hexa- și heptasialogangliozide.

– numerele 1, 2, 3, 4 se referă la ordinea de migrare a gangliozidelor în cromatografia pe strat subțire. De exemplu, ordinea de migrare a monosialogangliozidelor este: GM4>GM3>GM2>GM1.

– indici precum a, b, c arată calea prin care molecula a fost sintetizată, poziția de legare a acizilor sialici fiind diferită în cele 3 căi: de exemplu in GM1b, restul de acid sialic este poziționat la un rest de galactoză de la capătul lantului oligozaharidic, iar în cazul GM1a, acidul sialic este poziționat pe un rest de galactoză interioară.

În prezent, determinarea expresiei și structurii gangliozidelor din diverse probe biologice se realizează utilizând o serie de metode, grupate astfel:

– metode imunochimice, imunocitochimice și imunohistochimice, ce au la bază anticorpi directionați impotriva unor epitopi glucidici din constituția gangliozidelor; aceste metode nu pot detecta însă diferențele în ceea ce priveste structura ceramidei și a lanțului glucidic.

– metode cromatografice: cromatografia pe strat subțire (TLC), utilizate în analiza glicolipidelor nu pot oferi informații despre elementele structurii fine a gangliozidelor.

– metodele care au la bază spectrometria de masă (MS) care oferă nu numai o determinare exactă a masei moleculare ci și o determinare în detaliu a structurii compușilor analizați prin generarea unor fragmente specifice ale ionilor precursori selectați. Aceste metode permit nu numai detecția și caracterizarea structurală a fracțiilor izolate, ci și cartografierea sistematică a extractelor native de GSL izolate din țesuturi, urmată de secvențializarea MS/MS a speciilor individuale din amestecurile complexe. MS/MS prin CID într-un singur stadiu de fragmentare a fost aplicată în analiza gangliozidelor utilizând fie Q-TOF, fie FTICR MS, în unele cazuri cuplându-se electroforeza capilară (CE) cu (-)nano-ESI-QTOF MS/MS.

Figura 1.10 Schema nomenclaturii gangliozidelor [51]

Structuri asemanătoare gangliozidelor apar de asemenea pe suprafața unor microorganisme. Neuropatiile inflamatorii apar cel mai adesea în urma infecțiilor cu Campylobacter jejuni, cu Citomegalovirus, cu virusul Epstein-Barr, cu Mycoplasma pneumoniae sau Haemophilus influenzae. Anticorpii indreptați împotriva gangliozidelor aflate în structura microorganismelor pot determina reacții încrucișate cu gangliozidele din structura mielinei și a fibrelor nervoase inducând procese inflamatorii cu demielinizări consecutive. Ca rezultat al acestei reacții încrucișate cu structurile microbiene, anticorpii anti GM1 de tip IgM pot fi întâlniți și la persoane sănătoase (o singură determinare cu valoare crescută nu este patognomonică pentru neuropatie) [53].

Neuropatii motorii periferice pot să apară la pacienti cu gamapatie monoclonală IgM, a căror paraproteine IgM reacționează cu gangliozidele GM1 și GD1b . Deși anticorpii anti GM1 și GD1b pot fi implicați într-o varietate de sindroame neurologice, prezența lor în titruri crescute este mai caracteristică afecțiunilor neuronale motorii decât altor tipuri de afecțiuni neuronale.

Metoda – Test imunodot pentru determinarea calitativă, față de gangliozide, a anticorpilor IgG și/sau IgM (test screening – nu se vor diferenția anticorpii IgG de cei IgM); stripurile sunt alcătuite dintr-o membrană pe care sunt trasate 13 linii diferite corespunzătoare diverselor autoantigene – o linie servește drept control pozitiv iar celelalte 12 conțin următoarele gangliozide înalt purificate: GM1, GM2, GM3, GM4, GD1a, GD1b, GD2, GD3, GT1a, GT1b, GQ1b și sulfatide. În cursul primei etape de incubare autoanticorpii din proba pacientului se leagă de antigenele țintă imobilizate la nivelul membranei (faza solidă). După o etapă de spălare, strip-ul este incubat cu 2 soluții de conjugat (anti-IgG și respectiv anti-IgM uman) marcat cu peroxidază. Conjugatul se va atașa la porțiunea IgG și/sau IgM a complexului antigen-anticorp. După îndepărtarea prin spălare a conjugatului nelegat se adaugă substratul – tetrametilbenzidină. Dacă este prezent conjugatul legat, peroxidaza va transforma soluția incoloră a substratului într-o linie de precipitare corespunzătoare autoantigenului țintă de pe strip. După etapa de uscare, benzile obținute vor fi vizualizate și interpretate [54].

Valori de referință – anticorpi anti-gangliozide: GM1, GM2, GM3, GM4, GD1a, GD1b, GD2, GD3, GT1a, GT1b, GQ1b și sulfatide.  – negativ.

Următorii anticorpi antigangliozide, prezentați in tabelul 1.1, au fost descriși ca fiind specifici pentru diferite neuropatii ale sistemului nervos periferic:

Tabel 1.1 Neuropatiile sistemului nervos periferic cu speciile de gangliozide specific si anticorpii aferenti [84]

În mod normal determinarea ar trebui să fie negativă la indivizii sănătosi. Totuși anticorpi anti-GM1 tip IgM pot fi pozitivi la persoane sănătoase datorită reactivității încrucișate cu antigenele microbiene. De aceea diagnosticul clinic nu se va baza doar pe această determinare ci va lua în considerare coroborarea tuturor datelor clinice și paraclinice

Prin spectrometria de masă cuplată cu robotul de infuzie automată prin chip, metoda dezvoltată și optimizata de către noi [55-61] și pe care am utilizat-o în cercetările din cadrul tezei de doctorat, se pot detecta cu precizie mult mai multe specii de gangliozide decât prin orice altă metodă de analiză. Unul dintre cele mai importante avantaje ale acestui tip de screening îl constituie sensibilitatea foarte mare, ceea ce este foarte benefic în cazul probelor biologice deoarece necesită cantitate foarte mică de probă. De asemenea un alt avantaj important este realizarea de ioni multiplu încărcați, astfel, masele mari ale proteinelor pot fi elucidate. Pentru a arăta aceste avantaje și a scoate în evidență utilitatea metodei proprii dezvoltate de către colectivul nostru, am analizat mai multe probe standard de tip gangliozide, a căror spectre însoțite de calculul parametrilor și interpretarea aferentă le voi prezenta în capitolul 3.

Monosialogangliozida GM2

Monosialogangliozida GM2 are, în comparație cu GM1 o compoziție structurală cu lanțul zaharidic este mai scurt, lipsind o galactoză, cea externă. Este foarte importantă pentru dezvoltarea fizică normală, fiind în corelație cu numeroase tulburări metabolice.

GM2 gangliozidozele – apar în urma deficitului enzimei ß-hexozaminidaza, fiind un grup de tulburări genetice înrudite.

GM2 gangliozidoza se manifestă clinic sub trei forme:

a) Boala Tay-Sachs – este o tulburare metabolică recesiv autozomală, cu debut după varsta de 6 luni. Această tulburare metabolică rezultă în urma unei mutații prezente la nivelul cromozomului 15 în gena HEXA care codează subunitatea α a enzimei lizozomale ß-N-acetil-hexozaminidaza A și determină deficitul de hexozaminidaza A. Această enzimă, și anume hexozaminidaza A, hidrolizează restul de GalNAc din GM2, iar absența ei cauzează acumularea unor cantități mari și nocive de GM2 în neuronii creierului și în alte țesuturi, determinând distrucția progresivă a acestora și în final duce la decesul bolnavilor în jurul vârstei de 4 ani. Au fost descoperite numeroase mutații ale acestei gene și în același timp sunt raportate noi mutații. Aceste mutații au frecvența cea mai mare la evreii Ashkenazi (incidența la aceștia este de 1:3600), la canadienii de origine franceză din Quebec și la cajunii din Louisiana. O caracteristică morfologică a bolii Tay-Sachs este prezența corpilor citoplasmatici membranoși, care sunt agregate de fosfolipide, colesterol și gangliozide împreună cu o fracție mică de proteine [62].

Boala Tay-Sachs are de asemenea 3 forme clinice, clasificate in functie de momentul apariției simptomelor neurologice:

• Boala Tay-Sachs infantila – copiii cu această formă par să se dezvolte normal în primele 6 luni de viață, apoi, pe masură ce neuronii sunt destinși prin acumularea de gangliozide, se produce o deteriorare neîncetată a capacităților psihice și fizice: copiii sunt macrocefali, devin orbi (apare amauroza prin prezența de pete roșii hemoragice în rețeaua vasculară retiniană), au hiperacuzie și sunt incapabili de a inghiți [63]. Musculatura începe să se atrofieze și se instalează paralizia. Decesul apare de obicei înainte de vârsta de 4 ani. Diagnosticul prenatal poate fi realizat prin amniocenteză.

• Boala Tay-Sachs juvenilă – este extrem de rară și apare de obicei la copiii între 2 și 10 ani. Aceștia dezvoltă dificultați cognitive, motorii, dizartrie, disfagie, ataxie, spasticitate. Decesul survine de obicei între 5 și 15 ani.

• Boala Tay-Sachs adulta (cu debut tardiv) – este o formă rară, cu debut între 20 și 30 de ani. Boala este de obicei diagnosticată greșit și nu este letală. Simptomele apar în adolescență sau la adultul tânăr și constau în dizartrie, disfagie, ataxie, spasticitate, declin cognitiv și afectare psihiatrică, în special psihoza de tip schizofrenic.

b) Boala Sandhoff (sindromul Jatzkewitz-Pilz) – este o tulburare metabolică recesiv autozomală cu debut juvenil (la varsta de 3-4 ani). Boala rezultă în urma unei mutații la nivelul cromozomului 5 în gena HEXB care codează o proteină esențială pentru enzimele ß-N-acetilhexozaminidaza A și B. Apare astfel un deficit de hexozaminidaza A și B, care determină acumularea de GM2, care este toxică în concentrații mari, având drept rezultat distrucția progresivă a neuronilor din creier și maduva spinarii.

Există trei forme clinice ale bolii, în funcție de momentul în care apar simptomele pacientului și de severitatea acestora: clasică infantilă, juvenilă și cu debut tardiv (la varsta adultă). Ultimele 2 forme sunt foarte rare.

• Forma clasica infantilă – este cea mai comună și mai severă formă; simptomele apar la vârsta de 2-9 luni iar decesul pacientului survine de obicei înainte de vârsta de 3 ani.

În ceea ce privește semnele și simptomele clinice, mai întâi apare slabiciunea musculaturii implicate în mișcare și se produce pierderea deprinderilor motorii. Pe măsură ce boala progresează apare pierderea vederii și auzului, retardare mentală și paralizie. La nivelul ochiului se observă pată maculară cireșie care este caracteristică bolii. Unii bolnavi pot dezvolta organomegalie sau anomalii osoase, pneumonie sau bronhopneumonie.

• Forma juvenilă – simptomele apar între 3 și 10 ani, de obicei decesul se produce în jurul vârstei de 15 ani. Cu toate acestea, dacă se afla sub ingrijire constantă, bolnavii pot trăi mult mai mult. Simptomele sunt similare celor din forma infantilă, însă apar într-o măsură mult mai mică.

• Forma cu debut tardiv (la varsta adultă) – apare la indivizii de vârstă înaintată și de obicei afectează funcția motorie: determină slabiciune musculară, care afectează capacitatea de a merge sau de a se da jos din pat. Înca nu se cunoaste dacă boala are efect asupra speranței de viață a acestor pacienți [63].

În prezent, pentru boala Sandhoff nu există tratament curativ, singurul tratament disponibil fiind cel simptomatic.

c) GM2-gangliozidoza – varianta AB – este o tulburare metabolică rară, recesiv autozomală, determinată de mutații în gena GM2A. Această genă este implicată în sinteza unei proteine numită GM2 activator, care este un cofactor necesar pentru funcționarea normală a ß -hexozaminidazei A (implicată în degradarea GM2). Boala este de obicei fatală în copilăria timpurie.

Semnele clinice și simptomele se datorează distrucției progresive a neuronilor din creier și din maduva spinarii și sunt identice cu cele ale bolii Tay-Sachs infantile, însă spre deosebire de aceasta, în varianta AB, testele enzimatice arată niveluri normale ale hexozaminidazei A. Indivizii cu această afecțiune au o dezvoltare normală până la vârsta de 3-6 luni, când dezvoltarea încetinește și apare slabiciunea musculaturii implicate în mișcare și pierderea deprinderilor motorii. Cu timpul apare pierderea vederii și auzului, retardare mentală și paralizie. Deoarece varianta AB este diagnosticată extrem de rar, se poate ca mutațiile GM2A să fie fatale în stadiul embrionar sau fetal la homozigoți, și astfel nu sunt identificate decât extrem de rar în clinică [64].

Datorită importanței acestei gangliozide am realizat în laboratorul nostru analiza structurală a acestei specii de gangliozide. Aceasta a fost analizată și prin alte metode, cum ar fi cea utilizată de Merrill Jr et al. prin cromatografie lichidă de întaltă performanață cuplată cu spectrometrie de masă cu capcană ionică, cuadrupolară hibridă. Kasama et al. [65] au analizat gangliozidele prin FAB (fast atom bombardment) și prin disociere indusă prin ciocnire la energie joasă. O'Connor et al. [66] au realizat un design pentru un instrument nou de tip MALDI-FTMS, adica MALDI cuplat cu un spectrometru de masă cu transformantă Fourier și rezonanță ciclotronică. Ei au observat că acesta este superior ca rezolutie, sensibilitate și acuratețe față de un spectrometru de masă de tip MALDI-TOF. Kamerling și Vliegenthart [67] au realizat analize cu un gas cromatograf și mai apoi cromatografie de gaze și lichide combinate cu spectrometrie de masă (g.l.c./m.s.).

Ivleva et al. [68] au realizat măsurători ale standardelor de gangliozide prin cromatografie pe strat subțire combinată cu MALDI. În tehnica MALDI folosită de autori s-a introdus un gaz de răcire, care s-a observat că stabilizează legăturile labile ale moleculelor, dar totuși tehnica chip-ESI MS este cu mult superioară acesteia din punct de vedere al sensibilității și posibilității de detecție a speciilor minore aflate în proba analizată.

Monosialogangliozida GM1

Patologia metabolismului sfingolipidelor este dată de defecte la nivelul enzimelor lizozomale ce catabolizează sfingolipidele. Ca urmare, se produc acumulări de sfingolipide în lizozomi, sfingolipidoze. Deficitul enzimatic este prezent în toate țesuturile. În caz de deficit total, boala este severă afectând sistemul nervos (caracterizat printr-un conținut ridicat de sfingolipide), ficatul (hepatosplenomegalie), și poate produce orbire (de exemplu maladia Tay-Sachs). În cazul unui defect parțial (de exemplu boala Gaucher), debutul bolii are loc în stadiul adult, fără a afecta sistemul nervos, dar generând splenomegalie, trombocitopenie, etc.

Gangliozidozele sunt un grup de boli ereditare cu transmitere recesiv autozomală ce se caracterizează prin acumularea de gangliozide în sistemul nervos, ficat, splină, măduva osoasă, retină, ca urmare a unor defecte enzimatice în căile de catabolism ale gangliozidelor:

Figura 1.11 Structura gangliozidei GM1 [51]

GM1 gangliozidoza – apare datorită deficitului enzimei GM1-ß galactozidaza, care hidrolizează restul de Gal terminală din GM1, având drept rezultat depunerea patologică de gangliozide (GM1) în sistemul nervos central și periferic, și în mod particular în neuroni.

Afecțiunea are trei forme clinice în funcție de vârsta de debut: infantilă timpurie, infantilă tardivă și adultă.

a) Forma infantilă timpurie – apare la scurt timp după naștere și este cea mai severă. Semnele și simptomele clinice includ: hidrops fetal, neurodegenerare, atacuri cerebrale, hepato- și splenomegalie, înăsprirea trăsăturilor faciale, iregularitați scheletale (disostoze multiple), abdomen destins, slabiciune musculară, rigiditate articulară și ataxie. Aproximativ jumatate din pacienți dezvoltă pete maculare roșii. Copiii pot deveni surzi și orbi în jurul vârstei de 1 an și decedează adesea până la vârsta de 3 ani datorită complicațiilor cardiace sau pneumoniei.

b) Forma infantilă tardivă (juvenilă) – apare tipic la copiii intre 1 și 3 ani. Simptomele neurologice includ: ataxie, atacuri cerebrale, demență și disartrie. Ocazional se poate observa radiologic prezența de cioc inferior al corpurilor vertebrale L1 și L2. Decesul survine în jurul vârstei de 4-5 ani.

c) Forma adultă – apare între 3 și 30 de ani. Simptomele manifestae includ: atrofie musculară, încețoșarea corneei (doar la unii pacienți), distonie, disartrie [69] și complicații neurologice, care sunt mai puțin severe și progresând mai lent față de celelalte forme clinice ale bolii. În partea inferioară a corpului există posibilitatea dezvoltării de angiokeratoame. Marea majoritate a pacienților au o dimensiune normală a ficatului și a splinei. Diagnosticul pozitiv se face doar prin determinarea deficitului de GM1-ß galactozidază în culturile de leucocite sau de fibroblaști. Diagnosticul prenatal este posibil, iar tratamentul este numai simptomatic.

Deficitul enzimei α galactozidaza determină apariția bolii Fabry. Boala Fabry este o boală genetică de metabolism în care deficitul enzimei lizozomale -alfa-galactozidaza A (numită și ceramidetrihexosidaza), determină acumularea patologică a unor particule lipidice (globotriaosylceramide) în pereții vaselor de sânge din întregul organism, cu afectarea în mod special a vaselor din piele, rinichi, inimă, creier și sistem nervos. Boala- cunoscută și sub denumirea de Angiokeratoma difuză, Morbus Fabry sau boala Anderson-Fabry, a fost descrisă pentru prima dată în 1898 de catre Anderson în Anglia și Fabry în Germania. Boala apare la toate grupele etnice, incidența fiind apreciată la 1:40 000 baieti [70].

Boala Fabry se transmite în mod recesiv legat de cromozomul X. Gena mutantă este situată pe cromozomul Xq22 , unul dintre cei doi cromozomi care determină sexul. Femeile au doi cromozomi X, câte unul moștenit de la fiecare părinte. Barbații au un cromozom X moștenit de la mamă și un cromozom Y moștenit de la tată. O femeie cu Fabry a primit un cromozom X cu gena mutantă si alt cromozom X cu gena normală, astfel ea fiind protejată de manifestările majore ale bolii. În schimb baieții cu boala Fabry primesc numai un cromozom X care are gena mutantă (de la mamă), celalalt cromozom fiind cromozomul Y de la tată. Toți copiii unei mame cu boala Fabry, atât fetele cât și baieții, au un risc de 50% de a moșteni gena mutantă de la mama lor. În schimb, dacă tatăl este bolnav Fabry, toate fetele lui vor moșteni gena, dar baieții nu. La baieți boala debutează în copilarie, prin episoade de durere și senzație de arsură la nivelul mâinilor și a picioarelor, declanșate de exerciții fizice, stres, febră, oboseală sau schimbarea condițiilor meteorologice. În evoluție apar angiokeratoamele, care sunt micromacule de culoare roșu-închis, cu localizare de la nivelul ombilicului până la genunchi și densitate mare. Progresia bolii este foarte lentă, astfel că, între 30 și 45 ani, apar manifestările clinice legate de afectarea renală, cardiacă sau neurologică [71].

1.3.2 Proteine – peptide

Proteinele sunt molecule mari, complexe de o importanță majoră în organism, fiind necesare pentru reglementarea structurii și funcțiilor țesuturilor respectiv organelor.

Proteinele sunt formate din sute sau chiar mii de unități mai mici numite aminoacizi care sunt atașați unii de alții formând lanțuri lungi [72]. Sunt 20 de tipuri diferite de aminoacizi esențiali care pot fi combinați pentru a fosrma o proteină. Secvența aminoacizilor determină structura tridimensională unică a fiecărei proteine și funcția ei specifică [73]. Proteinele sunt polimeri ai aminoacizilor, în care secvența acestora este codificată de către o genă. Fiecare proteină are secvența ei unică de aminoacizi, determinată de secvența nucleotidică a genei [74].

Proteinele pot fi descrise în concordanță cu funcțiile pe care le îndeplinesc [75], după cum este ilustrat în tabelul 1.2 astfel:

Tabelul 1.2. Exemple de proteine și funcțiile pe care acestea le îndeplinesc

Structura primară este dată de aminoacizii care intră în lantul proteic prin formarea legăturilor pepetidice. Structura secundară se referă la forma și la lungimea lanțurilor polipeptidice, proprietăți induse de legăturile de hidrogen. Cele mai întîlnite tipuri de structura secundară sunt alpha helixul și lanțurile beta. În cazul structurii terțiare macromoleculele proteice au o conformație tridrimensională, realizată de obicei prin intermediul cuplării mai multor lanțuri polipeptidice scurte între ele, cuplare care duce la formarea fibrelor proteice. Structura cuaternară se referă la modul în care se unesc subunitățile proteice [76].

1.4 Tendințe recente ale aplicării sistemelor chip-ESI si microTAS ESI pentru analiza biomoleculelor

1.4.1 Aplicații pentru proteine și peptide

În ultimii ani, au fost investite eforturi semnificative în dezvoltarea spectrometrelor de masă cuplate prin intermediul ionizarii de tip electrospray cu dispozitive miniaturizate [81], iar în viitorul apropiat este de așteptat interfațarea cu sisteme mai complexe. Până în prezent a fost realizată integrarea electroforezei capilare (CE), electrocromatografiei capilare (CEC) și microcromatografiei lichide (LC), a elementelor de preconcentrare și microreactie precum și cuplarea acestor dispozitive microfabricate cu spectrometria de masă cu ionizare prin electrospray [82-86]. Dezvoltarea unor strategii precise de injectare a probelor prin intermediul chipurilor, în separările ultrarapide prin CE și a separărilor complexe 2D, cum ar fi cromatografia electrocinetică micelară urmată de electroforeza capilară sau CEC urmată de CE ca și implementarea analizei cu viteza mare pe microchip, reprezintă un reper major în performanțele și proiectarea microhidrodinamica. Utilizarea de rutină a tehnicilor microfluidice in analiza ADN, a proteinelor, a hidratilor de carbon sau în selecția medicamentelor a stabilit câteva repere care demonstrează pe deplin puterea acestor dispozitive analitice microfabricate. Aceste aparate sunt capabile să opereze volume de probă în domeniul microlitrilor și să analizeze volume mici de ordinul 1 – 10pL.

Utilizând tehnologia sistemelor micro-electromecanice (MEMSs) și variate metode chimice, o multitudine de microcanale interconectate (10-100 μm diametru interior) pot fi fabricate pe un microchip, permițând ca proceduri analitice ce cuprind o arie largă precum separǎri ale fragmentelor de ADN, reacții antigen-anticorp, metode flowcitometrice și amplificări PCR să poată fi executate pe un dispozitiv microTAS. Nu doar complexa analiză a ADN poate fi realizatǎ pe un chip de microTAS, dar și pretratarea, detectarea, digestia, separarea, depolimerizarea specifică, reacții enzimatice specifice în analiza proteinelor, hidraților de carbon, compușilor glicoconjugați, lipidelor, moleculelor mici, medicamentelor, poluanților și diverși metaboliți pot fi executate pe un microdispozitiv de tip microTAS. Cele mai larg utilizate dispozitive microfluidice de pânǎ acum sunt acelea ilustrate de microchipul pentru electroforezǎ. Ele utilizeazǎ un flux electroosmotic (EOF) ce conduce fluidul în microcanale și permite o separare de o eficiențǎ ridicatǎ comparabilǎ cu electroforeza capilarǎ, doar că în acest caz, timpul necesar poate fi atins doar într-o zecime din timpul necesar în CE clasică [41,87].

Pentru a cupla dispozitivele microTAS cu MS este necesară o interfață robustă și stabilă. Douǎ tipuri de interfețe de ionizare, ionizare prin electrospray și o matrice de desorbție/ionizare cu laser (MALDI), au fost dezvoltate pentru instrumentele comerciale MS [88]. Majoritatea dispozitivelor microfluidice de analiză totală sunt cuplate cu interfețe pentru nanoESI, din moment ce ordinul de mărime al eșantioanelor lichide în varianta nanoESI sunt mult mai compatibile cu cele ale fluidelor din microcanale. Ultimul scop a cuplǎrii sistemelor microTAS cu MS este de a utiliza un chip microfluidic pentru o preparare a probelor mai rapidǎ, într-o singurǎ etapǎ si introducerea probelor on-line subsecvențial pentru analiza MS întrucat, majoritatea chipurilor microfluide utilizate pânǎ în prezent și mai mult sau mai puțin disponibile comercial execută doar separarea probelor urmatǎ de electrospray sau MALDI sau numai electrospray prin chip. Existǎ, desigur, o mare provocare tehnicǎ asociatǎ dezvoltǎrii unei analize totale pe chip și din acest motiv realizarile metodologice de până acum sunt întrucâtva mai modeste decât cele legate de chipurile monofuncționale însa totodată foarte promițătoare.

Pentru analiza proteomică, digestia proteinelor joacǎ un rol important în procesul de pretratare a probelor. Prima strategie de digestie cu tripsină integrata pe un chip ESI a fost pusă la punct de cǎtre Xue și colaboratorii [89]. Soluția de tripsină și probele au fost puse în rezervor, apoi injectate direct pentru analiza MS. Strategia fiind simplǎ, rata de digestie a fost limitatǎ de raportul mic tripsină-proteinǎ precum și de timpul scurt de contact. Pentru a intensifica gradul de digestie, Harisson și colaboratorii [90] au construit o camerǎ microfluidică conținând tripsinǎ imobilizatǎ pe un suport solid (2.4 μl). În acest fel proteinele pot fi fragmentate în peptide mici cu un bun randament când trec prin camera de digestie, asigurându-se astfel și un raport optim enzimă/proteină. Mai mult, suportul solid ce conține enzima imobilizată poate fi îndepǎrtat pentru utilizarea în varianta fǎrǎ digestie enzimatică sau poate fi înlocuit cu unul nou. Din rezultatele prezentate, acoperirea (sequence coverage) aminoacizilor poate atinge 92% pentru proteinele standard, ceea ce fac dispozitivele integrate o platformă convenabilǎ pentru procesarea automată a probelor și identificare de novo a proteinelor.

O altǎ aplicație a polimerizǎrii în situ a fost demonstratǎ de Lazăr și colaboratorii pentru chip-urile electrocromatografice în separarea probelor complexe în canalele dispozitivelor microfluidice inainte de analiza prin MS [91]. Încǎrcarea pozitivǎ a polimerilor monolitici îmbunǎtǎțește performanțele separǎrii și curgerea electroosmotică ceea ce mǎrește eficiența eluției. În acest studiu, pentru o digestie standard a proteinelor a fost obținutǎ o acoperire secvențialǎ a aminoacizilor de aproximativ 70-80% iar eficiența separǎrii a fost de aproximativ 3000-4000 secvențe în canale de 5-6 cm lungime. Un astfel de dispozitiv ESI microfluidic se comercializează actualmente pe piațǎ. Canalul a fost construit prin ablația laser pe un film PI, iar un electrod din platinǎ a fost depus la capǎtul canalului pentru a aplica tensiunea necesară pentru ESI [91,92].

În studiile de proteomica clasice, spectrometrele de masă care funcționează cu ionizare prin electrospray, fie că sunt de la firmele Waters/Micromass, Bruker, Thermo Finnigan, Shimadzu, sau Applied Biosystems, folosesc pentru introducerea probelor sistemul cu sursă nanoESI sau microESI. În sistemul microESI proba este aspirată într-o seringă conectată printr-un capilar la vârful sursei care constă dintr-un ac metalic relativ subțire. Seringa este încastrată într-un dispozitiv de pompaj cu debit reglabil, iar soluția este pompată din seringa prin capilar înspre vârful electropulverizator. Sistemele nanoESI folosesc capilare foarte fine de sticlă în care proba este introdusă cu ajutorul unei pipete cu vârf foarte fin de tipul celor folosite în tehnica gel-electroforeză. Aceste capilare sunt fie disponibile comercial, fie pot fi obținute și confecționate în laborator. Cele comerciale au o depunere metalică pe suprafață exterioară, iar la utilizare se introduc în orificiul sursei venind în contact cu sursa aflată la tensiunea de electrospray. Capilarele care, din scopuri practice și de economie, se confecționează în laborator sunt din sticla ce are interiorul profilat în formă de omega pentru a preveni formarea bulelor în timpul electropulverizării. Tuburile capilare se comandă de regulă de la o companie specializată și apoi se trag cu ajutorul unui trăgător care poate fi și el confecționat în laborator, în scopul obținerii unui vârf foarte ascuțit, fin și totodată deschis. Și în acest caz proteina sau amestecul de peptide rezultat din digestie se introduce cu ajutorul pipetei sau micropipetei, care este echipata cu varfuri foarte fine si alungite pentru a se permite patrunderea in în interiorul nanocapilarului, însă cum suprafața acestuia nu este depusă cu un material conductor, în interiorul capilarului se introduce un fir de oțel inoxidabil care se conectează la sursa de înaltă tensiune a ESI [93].

Deseori în literatura este semnalat faptul că una și aceeași proteină aflată în condiții identice de analiză a furnizat spectre diferite la schimbarea capilarului electropulverizator. Din această cauză tendința cercetării în proteomică la ora actuală este spre introducerea sistemelor microTAS care fac ca reproductibilitatea orificiilor de ESI ale chipului să fie de 100% [64].

Mai mult, tehnologia de fabricare a chipurilor a atins in acest moment stagiul în care poate construi micro și nanochipuri ce lucrează la debite de maxim 50 nl/min și cu o eficiență a ionizării atât de mare încât sunt capabile să ionizeze și să furnizeze în spectru semnale ale unor componenți aflați în amestec la nivel de urmă și care prin nici o altă metodă analitică nu ar putea fi vreodată detectați.

Figura 1.7 Spectrul de masă chip-MALDI a proteinei LAG3 din plasma umană după digestia cu tripsină [94].

Pentru analiza proteinelor prin MS, pretratamentul probelor include o multitudine de etape ce consumă timp și resurse. Etapele de pretratare, ca de exemplu digestia enzimaticǎ, mǎresc puterea de acoperire a secvențializarii în timp ce altele, ca de exemplu degresarea, mǎrește sensibilitatea detecției. Integrarea microTAS a acestor pași este de o importanțǎ specialǎ pentru analiza proteomicǎ pe scara largǎ, în care complexitatea probelor este extrem de mare. Sistemele microfluidice trebuie așadar să se constituie într-un mijloc puternic de integrare a metodelor precum pretratarea și analiza automatǎ a proteinelor.

Compania Agilent Technologies a lansat de curând un dispozitiv microTAS HPLC-chip constând dintr-o coloanǎ cu fazǎ inversǎ construitǎ în interiorul chipului pe bazǎ de polimer ce execută separarea prin cromatografie lichidă cuplată cu un sistem de pompare nanofluidică. În acest dispozitiv integrat chipul este plasat între „stator” și un „rotor” valvă, ceea ce obligă proba sǎ curgǎ atât prin coloana de îmbogățire cât și prin coloana de separare [95].

Pe lângǎ aceasta chipul nu necesitǎ nici un adaptor între separare și vârful de nanospray permițând și schimbarea valvei complexe, ceea ce eliminǎ scurgerile de lichid și problemele de blocare, și scurteaza timpul de analiza în comparație cu sistemele LC-ESI tradiționale.

Figura 1.8 Dispozitiv microTAS HPLC-chip de la firma Agilent [95]

Pornind de la aceste avantaje, se poate obtine o capacitate de secvențializare mărita și prin cuplarea la o coloanǎ de schimb ionic puternic acidă ceea ce face ca acest chip microTAS să fie extrem de performant pentru aplicațiile din proteomicǎ.

Deși tehnologia microTAS este atât de avansată, în studiile de proteomică chipurile ESI nu pot funcționa fără un cuplaj adecvat cu spectrometrul de masă. Din acest punct de vedere cercetările nu sunt chiar atât de avansate întrucât sistemele de chip trebuie adaptate la configurațiile, parametrii de funcționare și caracteristicile spectrometrului de masă [96]. Aceste caracteristici diferă foarte mult nu numai de la un tip de spectrometru la altul, ci și între spectrometre de acelasi tip dar produse de firme diferite.

1.4.2 Aplicații pentru glicani și compuși glicoconjugați

Diversitatea structurală a glicoconjugaților în țesuturi și celule este determinată de complexitatea foarte mare a compoziției lor precum și de specificitatea tisulară a acestor compoziții. Pentru a elucida structura unei anume specii de glicoconjugați implicată într-un anume proces fiziologic sau patologic este literalmente necesară o foarte precisă și detaliată analiză structurală. În ultimii ani, prin metode bazate pe electroforeză capilară și pe gel (1 și 2 –dimensională), cromatografie lichidă, cromatografie pe strat subțire (TLC) cât și prin metode imunochimice și imunohistochimice [97] a fost demonstrată diferența în compozitia și cantitatea glicoconjugaților din diferitele matrici umane, precum și distribuirea lor la suprafața celulelor și în spațiul extracelular. Rezultatele experimentale obținute cu tehnicile enumerate mai sus, sunt însă bazate numai pe comparații și oferă date numai asupra componentelor majore prezente în amestecurile native complexe. Acest neajuns a fost atribuit atât sensibilității reduse a metodelor implicate până acum în analiza compusilor glicoconjugați cât și a posibilităților lor de detecție, limitată numai la caracterizarea structurală a speciilor majore din diferitele matrici umane. Elucidarea structurală a speciilor individuale de glicoconjugați în amestecurile complexe extrase din matrici umane (țesuturi, fluide ale corpului etc) reprezintă o cerință fundamentală pentru determinarea compoziției lor în regiuni specifice și pentru corelarea specificitații acestor structuri cu funcția specializată a fiecărei matrici umane, în condiții de subiect sănătos și bolnav.

Pentru a defini și înțelege interelația structură-funcție a fiecărei entități structurale de glicoconjugați, implicată într-un anume proces fiziologic/patologic, și pentru a îmbunătăți potențialul lor terapeutic și de diagnostic, în deceniul trecut spectrometria de masă cu ionizare prin electrospray [98] a fost aplicată pentru analize la sensibilități de ordin picomolar. În prezent însă, sunt necesare noi platforme spectrometrice de masă pentru a permite analize care să ofere date privitoare la complexitatea structurală ridicată a glicoconjugaților.

În laboratoarele analitice ale lumii au fost implementate cu succes strategii pentru detectarea și fragmentarea diferitelor tipuri de glicoconjugați incluzând glicopeptide, glicoproteine, gangliozide și sulfo-GlcA-glicosfingolipide. Aceste strategii au fost bazate pe spectrometrie de masă cu ionizare prin nanoESI în cuplaj cu analizoare de masă precum cuadrupolar hibrid cu timp de zbor (QTOF), cu rezonanță ciclotronică și transformată Fourier (FTICR) în tandem MS sau prin cuplaj direct (on-line) al electroforezei capilare (CE) cu ESI QTOF MS/MS utilizând interfețe construite în laboratoarele respective [99-107].

Din 2004 au fost analizați, pentru prima dată prin intermediul sistemului automat NanoMate bazat pe infuzie prin chip nanoESI în cuplaj cu QTOF MS, glicoconjugați extrași din creier uman și din urina unor pacienți suferind de dezordini de glicozilare în scopul determinării structurilor moleculare și identificării biomarkerilor diferitelor afecțiuni [108]. Toate aceste noi metode au permis nu numai detectarea și caracterizarea structurală a unor fracțiuni de glicoconjugați izolate, dar și o analiză compozițională detaliată a unor amestecuri native complexe extrase din țesut în cantități extrem de mici (pico și attomolar). Mai mult, prin aceste metode ultraperformante, a fost posibilă și fragmentarea prin tandem MS (MS/MS) direct din amestecul complex, a speciilor individuale minore.

Tehnicile moderne și complexe de spectrometrie de masă definite prin avantaje ca sensibilitatea înaltă, rezoluția și precizia ridicată au oferit o platformă analitică utilă și cu un potențial deosebit pentru dezvoltarea strategiilor, al căror scop este analiza structurală a glicoconjugaților. Până în prezent s-au inițiat și publicat deja asemenea strategii bazate pe ESI QTOF și FTICR echipat cu un magnet ecranat activ de 9,4 Tesla. Acest din urmă spectrometru de masă, a putut oferi o rezoluție de 106 și o precizie în determinarea masei de sub 1 ppm.

Pentru a îmbunătăți procesul de electrospray, stabilitatea semnalului, eficiența ionizării și sensibilitatea analizei s-a implementat în studiile de glicomică, pentru prima dată în lume, cuplajul dintre spectrometria de masă și ionizarea prin chip electrospray utilizând chipuri monofuncționale în combinație cu metode de fragmentare ale ionilor prin disocieri induse prin ciocnire [99,109]. Astfel, două spectrometre de masă diferite (QTOF și FTICR) au fost interfațate fiecare cu două sisteme diferite de ionizare bazate prin chip: un dispozitiv robotizat de introducere a probei, complet automată bazată pe electrospray prin chip de siliciu, și un sistem de chip polimeric micropulverizator subțire pentru injectarea probei prin electrospray în analizor [105,108]. Ambele sisteme de chip ESI au fost testate și aplicate la analiza unui amestec complex de gangliozide extrase din cerebel adult uman normal, a unei fracțiuni polisialilate (GT1) de gangliozide extrase din cerebelul adult uman normal și separate prin cromatografie pe strat subțire (TLC), a amestecurilor complexe de glicopeptide din urina unor pacienți suferind de boala lui Schindler și a unor amestecuri native de glicolipide din tumori ale creierului uman (gliosarcom) [105,110].

Figura 1.9 Spectrul NanoESI-FTICR (9.4 T) a unui amestec de peptide O-glicozilate din urina unor pacienți cu boala Schindler [105]

Acest sistem nou de ionizare și-a dovedit performanța superioară în comparație cu metodele clasice de infuzie a probei prin capilar sau seringă pompă. Cel mai important avantaj derivă din faptul că oferă o eficiență a ionizării foarte ridicată ceea ce permite detectarea speciilor de gangliozide minore care, foarte des reprezintă biomarkeri relevanți și nu ar putea fi altfel detectate/identificate prin nici o altă metodă analitică. Un alt avantaj al tehnologiei MS bazate pe chip a fost senzitivitatea ultraînaltă reprezentată prin cantități sub-picomolare de probă necesare pentru o investigare structurală completă a extractelor din creier [110].

Acest aspect este de o deosebită importanță pentru aplicabilitatea acestei metode în investigațiile clinice pentru care sunt de obicei disponibile cantități infime de material biologic. Toate aceste studii prealabile demonstrează capabilitatea și potențialul sistemelor chip-ESI în combinație cu spectrometria de masă de înaltă performanță pentru elucidarea structurală a componentelor individuale de GSL din amestecuri extrase din regiunile creierului, fără a fi nevoie de tehnici laborioase de separare care să preceadă analiza prin MS.

Aceste studii nu au fost realizate prin cuplajul NanoMate-HCT ESI MS pentru glicolipide și proteine. De aceea prezenta teză urmărește realizarea optimizării și aplicării acestei tehnici pentru categoriile de molecule amintite.

CAPITOLUL 2

MATERIALE ȘI METODE

2.1 Aparatura

2.1.1 Analizorul cuadrupolar cu capcană ionică (QIT)

Pentru realizarea experimentelor din această teză am folosit un analizor cuadrupolar cu capcană ionică de mare capacitate. În cele ce urmează voi descrie pe scurt principiile acstuia.

Analizorul cu capcană ionică este un sistem alcătuit din 3 electrozi (fig.2.1): un electrod în inel situat central și 2 electrozi terminali “end-caps” (electrozi terminali), anterior, respectiv posterior față de electrodul în inel (aceștia au în secțiune o formă hiperbolică).

Figura 2.1 Analizorul cu capcană ionică (IT) [adaptat dupa 111]

Pe electrodul în inel este aplicată o tensiune rf pentru a genera un câmp electric quadrupolar. Câmpul quadrupolar este acela în care intensitatea câmpului E variază liniar cu deplasarea x . Potențialul aplicat (Φ) care stabilizează câmpul electric trebuie să varieze cuadratic cu x pentru a fi respectată condiția de mai sus: Φ = f (x2) (Ε =- dΦ/dx = f (x)) [135]

În câmpul cuadrupolar tridimensional prezent în analizorul QIT, ionii sunt supuși alternativ unor forțe de stabilizare și destabilizare și oscilează atât în direcția r (radială) cât și z (axială). Mișcarea stabilă a ionilor nu permite nici un grad de libertate. Dacă potențialul rf este pozitiv, reprezentarea grafică este în formă de “șa” (fig. 2.2 a) [111,112].

a)b)

Figura 2.2 a) Un ion localizat pe panta descendentă în direcția z va fi accelerat față de centrul sistemului (capcanei ionice). Când potențialul rf își modifică semnul, câmpul se inversează și același ion este accelerat spre centrul sistemului (b)) [113]

Considerații similare celor din fig.2.2 vor fi observate pentru un ion care se deplasează pe direcția radială r. În cazul în care are loc inversarea câmpului la un interval adecvat, ionii vor fi captați atât în direcția r, cât și z, într-un volum definit de cei 3 electrozi (electrodul în inel și cei 2 electrozi “end-caps”).

Deoarece câmpul electric este simetric și se ia în considerare numai deplasarea radială r = √x2+y2 și cea axială, z, potențialul în orice punct în acest câmp este dat de relația:

Φr,z = (U + Vcosωt)( r2-2z2+ 2z02 )/ r02+ 2z02 ), unde primul termen descrie variația sa temporală, iar cel de-al doilea dependența spațială; r0 reprezintă raza internă a electrodului în inel, z0 este cea mai apropiată distanță de la centru la electrozii “end-caps”, U este potențialul dc iar V este potențialul rf aplicat între electrodul în inel și electrozii “end-caps”, ω este frecvența unghiulară, iar t este timpul.

Ionii cu o anumită valoare a raportului m/z vor fi supuși unei mișcări stabile în capcana ionică. Soluția cantitativă pentru condiția de stabilitate este descrisă de o ecuație diferențială de ordinul doi a lui Mathieu. Soluțiile acestei ecuații (de fapt două ecuații independente care descriu mișcarea necuplată a unui ion în direcțiile r și z) reprezintă condiții de stabilitate care sunt redate sumar sub forma unei diagrame de stabilitate [113] (fig.2.3) exprimată în termenii coordonatelor az și qz ai lui Mathieu:

az = -2ar = -16zU/ m(r02 + 2z02 ) ω2 (2.1)

qz = -2qr = 8zV/ m(r02 + 2z02 ) ω2 (2.2)

Figura 2.3 Diagrama de stabilitate a lui Mathieu pentru QIT [113]

Stabilitatea radială, exprimată în termenii ar și qr, trebuie deasemenea menținută simultan cu stabilitatea în direcția z. Ionii cu parmetri Mathieu identici, dar valori diferite ale m/z se comportă identic. Operațiunea optimă cere ca ionii să aibă condiții favorabile inițiale, care sunt realizate prin utilizarea unui gaz-tampon de He (≈1mTorr) pentru a înlătura energia cinetică a ionilor și a-i determina să ocupe regiunea centrală a capcanei ionice. În mod tipic, capcana ionică poate înmagazina 105 -106 ioni înainte ca explozia Coulombiană să afecteze semnificativ traiectoriile acestora și să reducă semnificativ rezoluția de masă.

Spectrele de masă sunt înregistrate în mod normal prin operarea QIT MS în modul de scanare al instabilității selective de masă. Amplitudinea V a potențialului rf aplicat este crescută pentru a determina ”mișcarea” ionilor de-a lungul axei qz (fig.2.3), până când aceștia devin instabili la limita la care qz = 0.908. Pe măsură ce aceștia ating regiunea de instabilitate, energiile lor cinetice și deplasările în direcția z cresc și aceștia părăsesc capcana ionică printr-un orificiu al electrodului “end-cap” și ajung la detectorul extern. Ionii cu m/z crescător sunt evacuați și detectați pe măsură ce tensiunea rf este crescută, generând astfel un spectru de masă. Ecuația analizei de masă pentru un QIT MS care funcționează în modul instabilității selective de masă este obținută prin rearanjarea expresiei parametrului qz din ecuația lui Mathieu: m/z = 8V/ qz (r02 + 2z02 ) ω2

Aceasta arată că în modul de operare descris anterior, mișcarea ionilor este constrânsă de (la) axa az=0 și nici o tensiune dc nu este aplicată electrozilor “end-caps”. Pentru capcanele ionice construite după așa-numita geometrie ideală: r0= z0√2 , iar m/z = 4V/ qz r02 ω2 [113].

Ionii captați au frecvențe de oscilație caracteristice, denumite frecvențe seculare, separate în direcțiile r și z. Componentul principal al acestor frecvențe seculare este (ω/2)β rad/sec, unde β este un parametru care variază cu coordonatele a și q. Mișcarea este decuplată în direcțiile r și z , iar frecvența în direcția r este jumătate din frecvența în direcția z. Deoarece ionii au frecvențe caracteristice, un potențial ac al frecvenței egal cu frecvența seculară a mișcării ionilor va determina ca ionii să primească energii cinetice crescătoare. a) b) Figura 2.4 a) O simulare a traiectoriei unui ion cu m/z=100 într-o capcană ionică ce operează sub o tensiune rf=500V și o frecvență de 1.1MHz; b) O simulare a traiectroriei ionice atunci când de-a lungul electrozilor “end-caps” este aplicat un potențial suplimentar ac (în rezonanță cu frecvența de mișcare a ionului în direcția z). Se poate observa că nu există nici un efect asupra mișcării ionice în direcția r. Totuși, deplasarea în direcția z crește, iar ionul este încărcat cu energie și este evacuat prin orificiile din electrozii “end-caps” după câteva cicluri de aplicare a potențialului ac. Alți ioni, care au m/z diferit nu sunt afectați. [111]

Dacă semnalul este aplicat între electrozii “end-caps”, ionii vor fi activați în direcția z (fig. 2.4). Deplasarea în direcția z crește, iar dacă semnalul rezonant este suficient de puternic, acești ioni activați translațional pot fi evacuați prin orificiile electrozilor “end-caps” în direcția z, după câteva cicluri de aplicare a potențialului ac. Ceilalți ioni, cu m/z diferit, nu sunt afectați [111,113,114].

2.1.2. Analizorul cu capcană ionică de mare capacitate (HCT Ultra)

Toate experimentele de spectrometrie de masă au fost realizate utilizând un spectrometru de masă cu capcană ionică de mare capacitate (HCT Ultra PTM Discovery) de la firma Bruker Daltonics (Bremen, Germania) (fig.2.5), aflat în dotarea laboratorului de spectrometrie de masă biologică din cadrul Institutului Național de Cercetare Dezvoltare pentru Electrochimie și Materie Condensată, Timișoara.

O capacitate mare de stocare a ionilor este obținută prin scăderea densității ionilor care sunt excitați înainte de a fi evacuați din capcana ionică cu geometrie optimizată. Spectrometrele cu capcană ionică de mare capacitate stochează de 103-105 ori mai mulți ioni decât cele cu capacitate normală. Spectrometrul de masă HCT este interfațat cu un computer care rulează pachetul integrat  Compass 1.2 care include modulele Hystar 3.2.37 și Esquire 6.1.512 pentru controlarea instrumentului și achiziționarea spectrelor de masă și a cromatogramelor curentului total de ioni și un portal Data Analysis 3.4.179 pentru stocarea cromatogramelor și a spectrelor precum și pentru procesarea tuturor datelor de MS, adică extragerea semnalului principal, netezirea spectrelor, deconvoluția și calibrarea lor. 

Caracteristicile de performanță ale acestui spectrometru de masă sunt reprezentate de rezoluția și precizia ridicată în determinarea masei, viteza mare de achiziție, sensibilitatea înaltă (infuzie cu cantități de probă de ordinul zecilor de nL/min) și capacitatea ridicată de stocare a ionilor, precum și posibilitatea unică de a efectua stadii multiple de fragmentare (MS11 în modul manual și MS6 în modul automat).

Figura 2.5. Spectrometrul de masă cu capcană ionică de mare capacitate HCT Ultra PTM Discovery (Bruker)

În plus, HCT MS oferă avantajul câtorva tehnici diferite de fragmentare: disociere indusă prin ciocnire (collision – induced dissociation, CID MS/MS) și disocierea prin transfer de electroni (electron transfer dissociation, ETD MS/MS), prima fiind cea mai eficientă și care va fi utilizată pentru disocierea moleculelor de gangliozide. [115]

Figura 2.6 Reprezentare schematică a spectrometrului HCT Ultra Ptm Dyscovery System (Bruker Daltonics, user manual)

O altă caracteristică importanată a spectrometrului de masă HCT Ultra este versatilitatea acestuia prin posibilitatea cuplajului cu diferite surse de infuzie. Sursele de ioni ESI produse de Bruker Daltonics, care pot fi cuplate la spectrometrul de masă HCT Ultra sunt: on-line microelectrospray (cu infuzie prin seringă-pompă), off-line nanoelectrospray, on-line nanoelectrospray, robot automat de infuzie precum și sursa ETD, respectiv sursa CID pentru fragmentarea ionilor.

2.1.3. Robotul cu infuzie automată a probelor

Infuzia automată bazată pe chip-nanoelectrospray s-a efectuat utilizând robotul NanoMate BiVersa care încorporează tehnologia ESI chip 400 (Advion Biosciences, Ithaca, NY, USA), controlat și manipulat prin software-ul ChipSoft 8.1.0 sub sistemul de operare Windows. Robotul NanoMate este primul sistem din lume complet automat pentru introducerea prin ESI a probei în spectrometrele de masă. Acesta a fost cuplat cu spectrometrul de masă HCT Ultra printr-un sistem de interfațare realizat în cadrul laboratorului. Pentru cuplajul robotului NanoMate, sursa convențională de ionizare prin electrospray a spectrometrului de masă a fost detașată și toate setările spectrometrului de masă și conexiunile electrice au fost readaptate pentru funcționarea sistemului NanoMate într-un regim ESI, decuplat de spectrometrul de masă. Robotul a fost așezat pe trei suporturi care pot fi ajustate pe direcția O-xyz și conectat la conducta care furnizează azot spectrometrului de masă. Poziția chipului pentru electrospray a fost ajustată față de contraelectrodul conic de transfer al probei. În scopul îmbunătățirii transferului optim al speciilor ionice în spectrometrul de masă, sistemul NanoMate se poziționeazǎ la o distanță cât mai micǎ (ex. 5 mm) de contraelectrodul spectrometrului de masă.

Robotul este prevăzut cu o placă de microtitrare pentru probe cu 96 minirecipiente (godeuri) și cu o placă-suport cu 96 vârfuri pentru pipeta conductivă care realizează aspirarea și infuzia probei. Un anumit volum din soluția probei de lucru (între 5-50 µL) s-a încărcat pe placa de microtitrare cu 96 godeuri, după care robotul a fost programat să aspire volumul dorit de probă (5 sau 10µL), urmat de 2 μl aer în vârful pipetei. După aspirare, proba a fost plasată pe fața cu orificii a microchipului, apoi infuzată prin orificiul microchipului de siliciu în spectrometrul de masă. [116,117]

Electropulverizarea (electrosprayul) a fost inițiată  prin aplicarea unei tensiuni  de 0.8 kV pe vârful pipetei conductive și a unei presiuni asupra tubului de infuzie de 0.6 p.s.i., ambii parametri fiind optimizați pentru a asigura ionizarea și transferul adecvat al speciilor ionice din probă în spectrometrul de masă. Sistemul NanoMate HCT MS a fost setat pentru a opera în tehnica ionilor negativ, demonstrat anterior ca fiind cel mai adecvat mod de ionizare pentru glicosfingolipidele acide. În scopul de a preveni eventualele fragmentări în sursa HCT, tensiunea de iesire pe capilar a fost stabilită la -50 V. Sursa bloc a fost menținută la temperatura constantă de 2000C, iar gazul de uscare a fost suprimat, furnizându-se astfel o desolvatare optimă a picăturilor generate. După infuzia probei și analiza prin spectrometrie de masă, vârful pipetei a fost îndepărtat automat, astfel că pentru fiecare probă s-a utilizat un vârf nou pentru infuzie și un orificiu nou al chipului, prevenindu-se astfel orice contaminare incrucișată sau aleatoare între probe. Tot în scopul prevenirii contaminării, fiecare probă s-a depus într-un godeu nou și nefolosit al plăcii. Între experimente, placa cu cele 96 godeuri s-a acoperit cu un strat de parafilm pentru a împiedica evaporarea soluției metanolice. După terminarea analizei prin spectrometrie de masă, placa pentru probe s-a spălat cu soluție metanolică 75%. [116]

Chipul ESI este o platformă “microarray” de orificii de nanoelectrospray gravate într-un chip de silicon. Chipul este fabricat dintr-un substrat de silicon monolitic utilizând tehnica DRIE (deep reactive ion etching). Acoperirea inertă a suprafeței permite utilizarea unor concentrații și compoziții acide și organice diverse pentru a grăbi ionizarea fără a degrada orificiul chipului. În chipul ESI, câmpul electric din jurul unui orificiu este rezultatul diferenței de potențial dintre substratul conductor de silicon și tensiunea aplicată probei lichide prin vârful pipetei conductive. Distanța care definește câmpul electric este de 1000 ori mai mică decât distanța de la orificiu la spectrometrul de masă. De aceea poziția MS și tensiunea aplicată acestuia nu mai joacă un rol important în formarea electrosprayului, decuplând în esență procesul de electropulverizare de intrarea în spectrometrul de masă.

Chipul este prevăzut cu 400 orificii (fig. 2.7), fiecare având un diametru intern de 2,5 μm, asigurând astfel debite reduse de infuzie a probelor: 50-100 nL/min. Viteza de infuzie a robotului este de 10 secunde/probă. Partea dorsală a chipului este prevazută cu găuri mici, abia vizibile cu ochiul liber, care reprezintă intrările în orificiile chipului și locul în care se poziționează vârful pipetei conductive pentru a infuza proba (fig.2.8).

Chipul este introdus într-un dispozitiv-suport, care este manevrat prin intermediul programului de software ChipSoft 8.1.0, modificându-se astfel poziția chipului (stânga-dreapta, în față-în spate) în raport cu intrarea în spectrometrul de masă și ajustându-se astfel poziția electrosprayului.

Figura 2.7 Robotul NanoMate cu infuzie automată prin chip-electrospray; ESI Chip cu 400 orificii [prin amabilitatea firmei Advion BioSciences]

Figura2.8 Contactul dintre vârful pipetei cu care este infuzată proba de către brațul robotului și chipul ESI. Tensiunea și contrapresiunea sunt aplicate probei lichide infuzate și promovează ionizarea probei prin vârful pipetei asupra chipului ESI. [prin amabilitatea firmei Advion BioSciences]

Programul ChipSoft 8.1.0 realizează o serie de operații majore :

optimizarea sprayului – se pot seta: volumul de probă ce urmează să fie infuzată (5-15 µL), volumul de aer ce se aspiră după fiecare probă (0-2 µL), alegerea poziției probei în placa pentru probe, ± returnarea probei neutilizate înapoi în minirecipientul corespunzator al plăcii pentru probe, presiunea gazului de desolvatare (0.1-3 p.s.i.), tensiunea (1.20-2.50 kV), modul de ionizare (pozitiv sau negativ)

setarea metodei- se pot încărca noi chipuri, plăci de titrare și plăci cu vârfuri, se poate selecta chipul și tipul de placă utilizate, se pot vizualiza informații despre chipurile existente

infuzarea probei – livrarea probei se poate realiza manual (o probă, un vârf al pipetei și un orificiu al chipului) sau automat (până la 96 probe)

Introducerea miniaturizată a probei oferă o multitudine de avantaje tehnice, analitice și economice. În primul rând, un avantaj deosebit de important și util este reprezentat de completa automatizare a infuziei și manipulării probelor. Prin această tehnică inovativă se simplifică în foarte mare măsură abordările chimice și biochimice laborioase care determinau costuri mărite precum și timp de procesare prelung. Este posibilă identificarea la scară nanoanalitică a biomoleculelor precum și eliminarea procedurilor de optimizare consumatoare de timp. Din aceste avantaje derivă funcționarea în regim HTS („high throughput” screening), ceea ce permite utilizatorilor analiza într-un timp scurt a unui număr foarte mare de probe ceea ce oferă posibilitatea întreprinderii unor studii de statistică, necesare în identificarea biomarkerilor precum și a unor agenți cauzatori ai epidemiilor și bolilor infecțioase. Viteza de analiză este mare ajungându-se la 50 de eșantioane pe oră, ceea ce nu este posibil în cazul infuziei clasice prin seringă pompă sau tuburi capilare.

Reducerea drastică a consumului de probă și reactivilor precum și minimizarea pierderilor de probă sunt rezultatul creșterii sensibilității; sensibilitatea obținută este cu câteva ordine de mărime mai mare decât cea oferită de ionizarea clasică prin capilar – de ordin attomolar (proteomică), respectiv picomolar (glicomică). De asemenea se asigură reproductibilitatea avansată a măsurătorilor, consecință necesară în realizarea experimentelor în care sunt implicate probe reprezentate de amestecuri complexe extrase din matrici biologice complexe.

Datorită eficienței sporite de ionizare este posibilă descoperirea de noi structuri, relevante din punct de vedere biologic. Posibilitatea de formare a ionilor multiplu încărcați ce facilitează detectarea speciilor in special a glicanilor, glicopeptidelor și proteinelor cu masă moleculară mare precum și raportul semnal/zgomot, avantajos reprezintă un avantaje majore ale acestei tehnici de ionizare. Flexibilitatea și aria extinsă de aplicabilitate, prețul redus al analizei, ca urmare a scăderii continue a prețului de fabricare al chip-urilor precum și flexibilitatea în privința actualizării configurației și analizelor sunt deosebit de importante în noua tehnica implementată. Realizarea experimentelor pe un număr mare de probe și eliminarea contaminărilor posibile se datorează minimizării intervenției umane. Fragmentarea redusă în interiorul sursei permite creșterea semnificativă a preciziei de identificare a analiților necunoscuți izolați din matrici biologice. Pentru o funcționare optimă este necesară o infrastructură minimă, ceea ce duce la extinderea posibilităților de analiză și cercetare în cadrul a numeroase laboratoare și universități.

Reducerea dimensiunii sursei de ioni facilitează manipularea și transferul eficient al ionilor cu posibilitatea poziționării precise în direcția orificiului de acces în analizor. Toate aceste avantaje susțin și promovează posibilitățile și eficacitatea acestei tehnici de ionizare inovative și net superioară celor ce o preced.

2.2 Spectrometria de masă în tandem (MS/MS) si MSn utilizând analizorul QIT

Spectrometria de masă în tandem (MS/MS) este un procedeu de examinare individuală a ionilor într-un amestec de ioni: ionii de interes sunt izolați în funcție de valorile raportului m/z caracteristic, activați prin ciocnire, iar fragmentele rezultate fie sunt analizate, fie sunt izolate și supuse în continuare fragmentării.

Într-un spectrometru de masă cu capcană ionică, fragmentarea (MS/MS sau MS2) este realizată prin utilizarea unei succesiuni de operații suplimentare în funcția de scanare. Funcția de scanare începe cu ionizarea și este urmată de selecția unui ion-precursor într-o etapă care implică evacuarea tuturor celorlalți ioni din capcană. Ionul-precursor este apoi excitat translațional în mod tipic prin aplicarea unei tensiuni rf suplimentare pe electrozii din capcana ionică “end-caps”.

Produșii ionici rezultați în urma disocierii indusă prin ciocnirea acestora cu gazul-tampon (He) sunt înregistrați prin scanarea tensiunii rf astfel încât să se obțină o a doua scanare a amestecului rezultat. [117]

Principalul avantaj al experimentului MS/MS este specificitatea crescută.
Acest lucru este util în distincția izomerilor, secvențializarea biopolimerilor și
mai ales în analiza amestecurilor complexe.

O trăsătură unică a spectrometriei de masă cu capcana ionică este posibilitatea de de a realiza MSn, având o importanță deosebită în elucidarea structurală.

Avantajele analizorului cu capcană ionică quadrupolar (QIT):

sensibilitate crescută

caracter compact și simplitate mecanică într-un dispozitiv care este capabil de performanțe înalte

experimentele de spectrometrie de masă în tandem sunt disponibile prin realizarea măsurătorilor secvențiale de spectrometrie de masă

pot fi studiate reacțiile ionilor/moleculelor pentru ionii de masă selectată

este posibilă obținerea unei rezoluții mari (>106 pentru m/z >1000) prin scanări lente, însă exactitatea măsurătorii de masă devine relativ slabă

detecția nedistructivă este posibilă utilizând tehnicile de transformare Fourier [105,107].

2.2.1 Tehnici de fragmentare: disocierea indusa prin ciocnire (CID), disocierea prin transfer de electroni (ETD)

În studiile MS/MS și MSn, ionul corespunzător unei specii moleculare a cărei structură dorim să o determinăm, numit și ion precursor, este fragmentat într-o celulă de coliziune (ciocnire) înainte de achiziția spectrului de masă. Aceste experimente sunt utilizate pentru secventializare (peptide, carbohidrați), elucidare structurală și identificarea analiților prin prezența fragmentelor “amprentă” sau „diagnostic”, cât și pentru a dobândi o selectivitate și sensibilitate mai bună pentru analiza cantitativă.

Cea mai comună metodă de fragmentare este disocierea indusă prin ciocnire (CID), denumită uneori și descompunere activată prin ciocnire (CAD).

Ionul precursor suferă ciocniri repetate cu atomii gazului de coliziune, crește energie potențială a moleculei, până când este atins pragul de fragmentare și se formează ionii-produși (fig.2.9): ionul molecular intră în celula de ciocnire (în cazul analizoarelor IT și FTICR, ionul precursor este izolat în capcană, ceilalți ioni fiind înlăturați) în care există un gaz de ciocnire inert chimic, energizat, la o presiune ridicată – Ar, He, N2, CO2 etc. În urma interacțiunii se formează fragmente mari, fiecare putând fi la rândul lor, separate, reținute și trimise în camera de coliziune unde procesul se reia (MSn) [114,118].

Figura 2.9 Reprezentare schematică a proceselor implicate în CID [114]

Tipul fragmentării variază considerabil cu tipul ionului-produs și cu cantitatea de energie implicată:

la energii joase (aproape de prag), reacțiile de fragmentare sunt adesea limitate la pierderi neutre (H2O, MeOH, CO, CO2, MeCN etc.), depinzând de natura ionului precursor. Aceste pierderi de molecule neutre nu sunt considerate adesea semnificative structural, cu toate că pot fi utilizate pentru a obține informații despre grupările funcționale.

la energii mai mari sunt observate adesea reacții retro-sintetice. Acestea sunt mult mai semnificative din punct de vedere structural și au drept rezultat ruperea moleculei în poziții caracteristice. Dacă energia este prea mare, pot apare scindări ale legăturii C-C ce duc la fragmentare necontrolată, care trebuie evitată.

Pentru a se controla procesul de fragmentare este optim să se utilizeze energii în jurul, sau chiar mai jos de pragul de fragmentare.

MS/MS se poate realiza prin:

– cuplarea a două sau a mai multor instrumente (de același tip sau de tipuri diferite): Q-TOF, TOF-TOF, QIT-TOF,etc. [118]

– utilizarea analizorului cu capcană ionică (IT, Orbitrap) sau a FTICR MS

Instrumentele cu capcana ionică și FTICR MS permit cel mai bun control asupra CID, însă tind să producă mai puține reacții energetice. Instrumentele Q-TOF tind să producă fragmentari mai numeroase, însă cu un control de operare mai redus. Instrumentele cu capcana ionică și FTICR MS permit experimente cu stadii multiple de fragmentare, esențiale pentru studiile de elucidare structurală.

În cazul peptidelor, prin CID se produce o fragmentare aleatorie a lanțului peptididic. Cu toate că se obțin foarte multe informații structurale, o limitare importantă este imposibilitatea de a se studia modificările posttranslationale ale proteinelor deoarece legăturile prin care se atașează acestea de lanțul peptidic sunt mai slabe și se rup mai repede decât legăturile dintre aminoacizii costituenți [119].

ETD este o tehnica nouă și complementară CID pentru secvențializarea peptidelor. ETD permite disocierea peptidelor prin transferul unui electron (provenit de la anionii (A-) reactivului utilizat, de ex. fluorantena) la cationul proteic/peptidic:

De exemplu, în incinta unei capcane ionice, cationii proteici/peptidici multiplu încărcați sunt selectați pentru fragmentare, primesc un electron de la anionii reactivului, devin instabili și sunt fragmentați. Aceste reacții apar la 40-100 ms. Deoarece ETD utilizează energii joase de fragmentare, multe modificări posttranslaționale (de ex. fosforilarea) rămân atașate de aminoacizi și pot fi desemnate ca și rezultat al analizei [119].

2.2.2 Nomenclatura ionilor de fragmentare în spectrele MSn

Desemnarea ionilor de fragmentare rezultați în urma scindării lanțului oligozaharidic s-a realizat conform nomenclaturii de fragmentare a hidraților de carbon introdusă de Bruno Domon și Catherine Costello [120].

Legăturile cele mai frecvent afectate de fragmentare sunt legăturile eterice dintre unitățile monozaharidice. Astfel, conform nomenclaturii Domon&Costello, ionii fragment de la capătul reducător sunt notați "Y" și "Z", iar cei ce cuprind catenele oligozaharidice de la capătul nereducător sunt desemnați "B" și "C" (fig. 2.10).

Uneori fragmentarea lanțului oligozaharidic nu are loc la nivelul legăturilor dintre unitățile monozaharidice ci chiar în interiorul heterociclului constituent al zaharului. Aceste fragmentări interioare ale inelului zaharidic se produc în urma ruperii a două legături interne ale acestuia. Dacă fragmentul rămâne atașat de specia ionizată care conține capătul reducător, el se va nota "X"; în cazul în care fragmentul rămâne atașat de specia ionizată care conține capătul nereducător, el se va nota "A". Atât în notarea lui A cât și a lui X apar indici superiori care indică legătura din inelul zaharidic la nivelul căreia are loc fragmentarea (fig.2.10). De exemplu, fragmentul notat 1,5X1 conține unitatea cu capătul reducător și rezultă prin ruperea legăturilor 1 și 5 ale primului inel zaharidic (numerotat de la capătul reducător), iar fragmentul desemnat 0,2A1 conține capătul nereducător obținut prin ruperea legăturilor 0 și 2 din primul inel zaharidic (numerotat de la unitatea zaharidică terminală-capătul nereducător).

Figura 2.10 Schema de fragmentare a lanțului oligozaharidic din structura glicanilor; desemnarea ionilor obținuți în urma ruperii legăturilor eterice dintre unitățile monozaharidice [111]

Figura 2.11 Schema de fragmentare a lanțului oligozaharidic din structura glicanilor; desemnarea ionilor obținuți în urma ruperii legăturilor interne din inelul zaharidic (fragmentări de inel) [111]

Oligo- și polizaharidele pot fi fragmentate în cele două tehnici de ionizare și anume în tehnica ionilor pozitivi și în tehnica ionilor negativi. În ambele situații fragmentele rezultate pot apărea „îmbogățite” ca masă, observându-se frecvent picuri care sunt cu 23 Da sau 39 Da (sau multipli ai acestor valori) mai grele decât masa calculată teoretic. Acest fapt rezultă din aceea că soluția care conține polizaharidul de ionizat conține ioni de Na sau de K care formează aducți cu grupările hidroxilice; apar astfel în spectru picuri corespunzătoare ionilor mono-, di- sau polisodiați care se notează [M+xNa]n+.

Figura 2.12 Fragmente produse prin CID și ETD într-un lanț peptidic [121]

În locul sodiului poate fi potasiul sau, în unele cazuri, ambii ioni. Frecvente sunt și pierderile unei sau mai multor molecule de apă: în acest caz picul apare mai mic cu valoarea de 18 Da sau multipli ai acesteia. Astfel de picuri se notează [M-pH2O]n+ [121].

Fragmentele obținute în urma fragmentării de tip ETD, (ionii de tip c si z) sunt complementare celor obținute prin CID (ionii b si y).

2.3 Reagenți și materiale utilizate

În vederea pregătirii probelor pentru analiza prin spectrometrie de masă cuplată cu robotul NanoMate și pentru realizarea unor experimente optime s-au folosit numai reactivi cu un grad înalt de puritate și aparatura de laborator performantă și de ultima generație care să corespundă necesităților studiului.

Toate soluțiile probelor au fost stocate în tuburi Eppendorf de 1.5 mL și depozitate între experimente la -270C. Probele uscate au fost cântărite utilizând o balanță analitică AGN100, cu precizia de 0,0001 g și capacitate de măsură până la 100 g.

Astfel, metanolul, acetonitrilul, acidul formic (98%), acidul acetic și cloroformul cu grad de puritate HPLC au fost achiziționați de la firma Merck (Darmstadt, Germania).

Acesti solvenți au putut fi utilizați fără purificare ulterioara, având în vedere calitatea și puritatea acestora, testată în prealabil prin experimente prin infuzie “blank”, adică a fiecărui solvent în parte pentru realizarea spectrelor martor a solvenților în vederea testării eventualelor impurități. În toate experimentele ce au necesitat dizolvarea probei în apa, s-a folosit exclusiv apă deionizată, bidistilată. Pentru obținerea apei bidistilate/deionizate necesare în obținerea soluțiilor probelor s-a folosit sistemul SG 2000, SG Wasseraufbereitung und Regenerierstation GmbH (Barsbüttel, Germania). Acesta are o capacitate bazală de 2000 L apă cu un conținut total de săruri de 1.79 mol/m3, cu conductivitatea de 20μS/cm, debitul maxim este de 450 L/h și operează cu o presiune de 10 bari, astfel încât apa deionizată obținută are o conductivitate de 0.1 μS/cm.

În ceea ce privește controlul permanent al calității apei, acesta s-a realizat utilizând un conductometru digital LFW 200, SG Wasseraufbereitung und Regenerierstation GmbH (Barsbüttel, Germania) cu un domeniu de măsură al conductivității cuprins între 0.1-199.9 μS/cm. Pentru concentrarea soluțiilor, în funcție de necesitățile analitice, acestea au fost liofilizate într-un evaporator rapid cu vid SpeedVac Concentrator, SPD 111V-230, Thermo Electron Corporation (Asheville, NC, USA) cuplat cu o pompă de vid ROTAVAC valve control de la Heidolph (Schwabach, Germania). Evaporatorul SPD 111V-230 are prevăzute 40 de spații pentru tuburi Eppendorf de 1.5-2.0 mL și un display electronic de unde se poate regla temperatura și timpul de funcționare în modul manual sau automat, având capacitatea de a se crește sau scădea temperatura în funcție de condițiile de conservare a proprietăților probei.

Pentru obținerea soluțiilor stoc ale probelor, materialul uscat a fost dizolvat în solventul sau amestecul de solvenți volatili menționați anterior, în funcție de probă, apoi vortexat pentru solubilizare un timp cuprins între 5-10 minute cu ajutorul unui vortex IKA® lab dancer, (IKA® Werke GmbH & Co. KG, Staufen, Germania) care are o viteză de rotație de 2800 rpm și este utilizat pentru tuburi cu diametrul maxim de 30 mm. După vortexare, soluțiile au fost centrifugate 1-1.5 h într-o centrifugă Sigma 2-16, Sartorius (Göttingen, Germania). La 15000 rpm. După centrifugare a fost colectat cu grijă doar supernatantul. Centrifugarea s-a dovedit absolut necesară pentru a evita blocarea orificiului chip-ului de către impurităti solide, nedizolvate rezultate în procesele de extracție și pregătire a probelor din materialul biologic. În același scop al prevenirii blocării chip-ului, etapa de centrifugare s-a efectuat și pentru probele standard disponibile comercial chiar dacă furnizorul a indicat puritate foarte mare a probei solide.

După dizolvarea în solventul sau amestecul de solvenți, între experimente stocarea probelor s-a realizat la -24oC, iar în vederea analizei acestea au fost dezghețate utilizând un termobloc digital de la firma FALC Instruments (Treviglio, Italia). Termoblocul are 20 locuri pentru tuburi Eppedorf de 1.5-2.0 mL și are capacitatea de a încălzi până la 1500C peste temperatura mediului ambiant. Pentru a se evita lezarea probelor de natura biologică analizate, încălzirea pentru scopul dezghețării lor s-a realizat menținând proba în termobloc la 20 oC pentru cel mult 2 minute. Înainte de analiză, în etapa de optimizare a concentrației, s-au realizat diferite diluții ale soluțiilor stoc care și acestea au fost agitate în vortex timp de 1-2 minute și apoi centrifugate din nou aproximativ 15-20 minute într-o minicentrifugă EW-17310-07, Cole-Parmer (Vernon Hills, Illinois, USA). Minicentrifuga este prevazută cu un rotor cu 6 lăcașe pentru tuburi Eppendorf de 1.5/2.0 mL, dar se poate utiliza și pentru tuburi de 0.4-0.5 mL cu ajutorul adaptoarelor furnizate de producător. Viteza de centrifugare este de 6000 rpm. Etapa de dializă în vederea eliminării sărurilor, care a fost necesară pentru pentru toate probele de ganglicolipide, a fost efectuată cu ajutorul unor membranele de dializă de 500 Da „cut-off” cumpărate de la Schuell, Darmstadt, Germania.

Pentru obținerea soluțiilor probelor și pentru aplicarea acestora în plăcile de microtitrare s-au utilizat pipete automate cu volum reglabil de 0.5-10, 5-50, 20-200 și 100-1000 μL și vârfurile aferente de unică folosință de la firma Eppendorf, Hamburg, Germania.

Tabelul 2.1 Valorile m/z pentru ioni pozitivi și negativi pentru standardul de calibrare extern ‘‘tuning mix” G2421A (Agilent)

Toate spectrele de masă HCT MS au fot calibrate cu ajutorul standardului de calibrare extern ‘‘tuning mix” G2421A achiziționat de la firma Agilent Technologies (Santa Rosa, CA, USA). Standardul este un amestec de peptide ai căror ioni acoperă întregul domeniu de m/z în care probele de analiză dau semnale atât în tehnica de detecție a ionilor negativi, cât și în cea a ionilor pozitivi.

Parametrii pentru obținerea acestor ioni la calibrare cu standardul “tuning mix” au fost: presiunea gazului de nebulizare: 50 psi, debitul gazului de desolvatare (evaporare): 0.5L/min, temperatura gazului de uscare (evaporare): 2500C, intervalul de scanare: 20-2800 m/z .

2.4 Probele analizate

Pentru experimentele de optimizare a cuplajului dintre spectrometrul de masă cu capcană ionică de mare capacitate și robotul de infuzie automată prin chip electrospray s-au utilizat o serie de probe biologice printre care s-au aflat probe standard de gangliozide și proteine comandate de la producători autorizați precum și amestecuri native de gangliozide extrase din matrici biologice umane.

2.4.1 Probe standard

Pentru verificarea și optimizarea cuplajului realizat în prezenta teză de doctorat s-au utilizat o serie de probe standard obținute de la firma Sigma Aldich. Gangliozidele standard sunt sub formă de pulbere albă, liofilizate si menținute la o temperatură de -24ᵒC. Au fost extrase din creier bovin, având o puritate HPLC de 99%.

Proteina standard folosită a fost citocromul C.

2.4.2 Amestecuri biologice native

Gangliozidele aflate în amestecuri biologice native au fost obținute de la Facultatea de Medicină a Universității din Zagreb Croația prin amabilitatea Prof. Dr. Zeljka Vukelic.

Unul din marile obstacole în studiul gangliozidelor a fost lipsa unor metode accesibile și mai ales reproductibile pentru izolarea componenților puri din extractele de țesuturi. În mod uzual, gangliozidele sunt ușor contaminate cu alte lipide polare și cu impurități non-lipidice. Una dintre primele metode de izolare a gangliozidelor din creier care s-a impus a fost aceea a lui Klenk, care s-a bazat exclusiv pe extracția selectivă cu solvenți organici.

O tehnică oarecum similară a fost utilizată de Blix [122]. Prin intermediul abordării lui Blix, s-a obținut un amestec gangliozidic extrem de pur dar un dezavantaj ce nu a putut fi surmontat l-a constituit pierderea unor componente zaharice în timpul izolării. Deoarece gangliozidele sunt foarte neomogene în raport cu porțiunea oligozaharidică, este esențială găsirea unor astfel de condiții care să preserve cât mai complet compoziția lor inițială.

Folch a introdus metoda de extracție la lipidele tisulare cu amestec cloroform-metanol, 2:1 [123]. Amestecul brut inițial a fost apoi partiționat repetat între cloroform și apă, gangliozidele acumulându-se în faza superioară apoasă, în raport cu celelalte lipide care au rămas în faza inferioară cloroformică. Prin această metodă s-a obținut o mai bună recuperare a gangliozidelor din materialul biologic, însă metoda și-a dovedit eficacitatea doar în cazul folosirii unor mici cantități de material biologic. Un dezavantaj evident al metodei l-a constituit contaminarea permanentă a fazei apoase cu lipide polare cum ar fi sulfatidele și fosfolipidele (fosfatidil-serina de exemplu) precum și cu mari cantități de impurități nonlipidice care s-au dovedit a fi, foarte greu de îndepărtat. Totuși tehnica extracției introdusă de Folch, s-a dovedit a fi o tehnică excelentă de izolare și purificare a gangliozidelor.

Combinarea acestei tehnici cu precipitarea solventului ca și în tehnica originală a lui Klenk [124] oferă o metodă simplă și practică pe scară largă a determinării gangliozidelor. Metoda are dezavantajul că mari cantități de monosialogangliozide sunt pierdute.

Sevennerholm a introdus o metodă de izolare care permite o recuperare aproape de cantitativ a gangliozidelor [125]. Un extract integral de lipide este aplicat pe o coloană de celuloză, iar marea masă de lipide (altele decât gangliozidele) este eluată cu cloroform conținând mici cantități de alcool și apă. Gangliozidele reținute în coloană, sunt apoi eluate cu solvenți conținând cantități crescute de alcool și apă. În această abordare se realizează astfel o separare între gangliozidele bogate în acid sialic și cele sărace în acid sialic. Metoda a fost aplicată și de Rouser pentru izolarea cantitativă a gangliozidelor din creier cât și pentru izolarea trisialogangliozidelor.

Klenk și Heuer, [126] folosind această metodă, au reușit de asemenea să extragă și să purifice gangliozidele simple din extractele lipidice integrale ale eritrocitelor canine. O separare remarcabilă a mono-, di- și trisialogangliozidelor s-a obținut prin folosirea unor coloane cu umplutură de hârtie și utilizând ca eluent amestecul de propanol-apă.

Pentru purificarea avansată a gangliozidelor, s-a utilizat cromatografia pe acid silicic, folosind ca eluent un amestec de cloroform-metanol. Procedeul dezvoltat de Svennerholm a fost aplicat cu succes și de Van Heyningen și Miller [126]. Procedee similare sau derivate au fost utilizate de Klenk și Gielen [127]. Cu toate că amestecul cloroform-metanol a fost utilizat în general pentru extracția gangliozidelor din țesuturi, s-au încercat și alte variante de solvenți. Trams și Lauter [128] au extras lipide totale din creier proaspăt cu tetrahidrofuran. Prin adăugare de eter etilic saturat cu apă, la extractul lipidic, s-au format doua faze. Gangliozidele sunt conținute în faza apoasă. Kuhn și Wiegandt [129] au extras gangliozidele din creier cu un amestec de tampon fosfat și fenol, însă rezultatele prezentate nu permit o apreciere clară asupra eficacității metodei.

Alte cercetări comunică utilizarea unor metode și abordări mai exotice, neuzitate în general în chimia lipidelor cum ar fi: cromatografia pe hidroxiapatită cu folosirea unui eluent de tip tampon fosfat; separarea pe coloane cu acid silicic și utilizarea unui gradient de propanol-apă; separarea pe coloane cu pulbere de celuloză și cu eluent butanol-piridină-apă. În lipsa unor detalii experimentale și a unor rezultate cantitative comparative este dificil de apreciat utilitatea acestor metode. Extracția și purificarea probelor de gangliozide folosite în determinările prin spectrometrie de masă în partea experimentală a fost realizată pe baza metodei lui Svennerholm și Fredman [130] modificată de Vukelić et.al.[131].

Înainte de extracție, țesutul având masa de 0.1 – 1 g a fost omogenizat într-un amestec de apă cu gheață (0-4oC) pentru a obține un omogenat de concentrație 10%. Lipidele au fost extrase de două ori utilizând un amestec de cloroform-metanol-apă (CHCl3:MeOH:H2O=1:2:0.75 vol). După centrifugare, pentru a separa gangliozidele de alte lipide, supernatantul a fost supus unei partiții de fază, urmată de repartiție prin adăugarea de cloroform, metanol și apă până la un raport volumetric final de 1:1:0.8. Faza superioară mixtă ce conține glicosfingolipidele polare a fost colectată. Extractul brut de gangliozide a fost purificat în mai multe etape. Alternativ, separarea mai poate fi realizată și prin cromatografie cu schimbători de ioni utilizând metodele consacrate. Complexele proteină-sare coextrase au fost precipitate, apoi supuse centrifugării. Pentru a păstra posibilele specii relevante fiziologic, labile în mediu bazic, s-a evitat hidroliza alcalină ușoară ca și etapă comună de purificare, fiind aleși mai mulți pași de gel-cromatografie.

Contaminanții de masă moleculară mică au fost îndepărtați prin cromatografie de gel-filtrare pe o coloană Sephadex G-25 și dializă față de apă (peste noapte, la 4oC). În unele cazuri a fost necesară utilizarea coloanelor Sephadex LH-20 și Sephadex G-50 înainte de dializă, pentru a îndepărta sărurile ce ar face imposibilă electropulverizarea prin chip-MS a extractelor de gangliozide: mai întâi, extractul de gangliozide a fost dizolvat într-un volum de 0.25-0.30 mL amestec de cloroform:metanol:apă (în raport volumetric 50:50 :10) și aplicat pe o coloană Sephadex LH-20 (aprox. 2.7 g, 11.5×135 mm, 14 mL volum pentru o coloană). Gangliozidele au fost eluate între 2.5 și 14 mL. Eluatul (11.5 mL) a fost uscat sub N2 , dizolvat în 0.5 mL apă și aplicat pe o coloană Sephadex G-50 (11×255 mm, 24 mL volum pentru o coloană) așa cum este descris de Ueno și Yu (1978). Gangliozidele au fost eluate între 7 și 24 ml de eluat și liofilizate.

O purificare finală din urmele de impurități s-a realizat utilizând o coloană Sephadex G-25 (aprox. 2.6 g de gel în cloroform:metanol:apă în raport volumetric de 30:60:80; 7.2×100 mm, 4.1 mL volum pentru o coloană. În final, extractul pur a fost evaporat până la deshidratare completă.

CAPITOLUL 3

CONTRIBUȚII CU PRIVIRE LA DEZVOLTAREA ȘI OPTIMIZAREA SPECTROMETRIEI DE MASĂ CU CAPCANĂ IONICĂ ȘI FRAGMENTĂRI ÎN CÂMP DE RADIOFRECVENȚĂ

3.1 Cuplajul robotului de infuzie automată a probelor, NanoMate, cu spectrometrul de masă cu capcană ionică de mare capacitate

În ultimii ani, au fost elaborate nenumărate abordări în design-ul și dezvoltarea interfațelor nano-ESI pentru cuplarea dispozitivelor de microchipuri cu spectrometria de masă, și interfațarea preparării probei pe chip cu analiza MS. Limbach și colaboratorii au fost primii care au clasificat tehnicile nano-ESI bazate pe chip ca fiind produse în afara chipului (off-chip) sau pe chip (on-chip), referinduse la modul de introducere a probei în spectrometrul de masă [132]. Mai multe grupuri de cercetare au utilizat abordarea producerii ionilor off-chip, unde probele sunt transferate indirect de pe dispozitivele chip în sursele de ioni ale spectrometrelor de masă. Această abordare a fost realizată prin lipirea sau legarea unui capilar din siliciu sau aunui ac de nanoelectrospray într-un microcanal de sticlă sau microchip polimeric [132]. O tehnică modificată bazată pe abordările menționate implică atașarea unui capilar separat de sprayere sau un ac interfațat cu o cu o joncțiune cu lichid la ieșirea chipului. O metodă alternativă care utilizează sisteme externe de sprayere a micro-ionilor a fost descrisă de Henion [133]. Datele publicate din abordările menționate demonstrează clar utilitatea și potențialul cuplării sistemelor de microchip cu spectrometria de masă. De exemplu, Liu si colaboratorii au demonstrat infuzia directă a probelor de peptide, cu un debit de 5 s/probă, folosind o platformă de 96 de capilare de siliciu legate între ele [134-136].

Totuși o caracteristică nefavorabila a acestor dispozitive este creșterea volumului de probă pierdut la interfața dintre chip și capilarul de transfer. O abordare alternativă a integrării chipurilor cu MS este producerea ionilor pe chip. În timpul acestui proces, producerea ionilor este integrată direct pe microchip prin fabricarea unui emițător nano-ESI ca parte internă a chip-ului. Se preconizează că această abordare va reduce volumul de probă pierdută și va îmbunătăți performanța [137].

Utilizarea dispozitivelor microfluidice cu detecție MS a progresat la comercializare. Aplicații în proteomică, glicomică și lipidomică ale dispozitivelor bazate pe chip cuplate cu spectrometria de masă este un domeniu activ motivat de nevoia de caracterizare a speciilor de biomolecule cu abundență scăzută și cantități scăzute de probă disponibilă [138]. Tehnica nano-ESI bazată pe chip este foarte promițătoare oferind nu doar automatizare și rapiditate, dar și multe alte beneficii la o mare varietate de aplicații în proteomică, glicomică și lipidomică. Aceste beneficii includ consumul redus de probă, utilizarea ușoară, evitarea contaminării de la o probă la alta și timpi extinși de achiziție care duc la o calitate mai bună a datelor MS.

În vederea cuplajului robotului NanoMate cu spectrometrul de masă HCT ultra a fost necesară construirea în laborator a unui sistem de prindere care să fie complet compatibil și complet adaptabil configurației celor două instrumente în special arhitecturii deosebite a sursei de electrospray cavitară a spectrometrului HCT ultra. Sistemul de prindere respectiv interfațare constă din trei suporți care permit ajustarea pozitiei robotului pe cele trei directii Oxyz. Sistemul de prindere al robotului de spectrometrul de masă are posibilitatea de a culisa în scopul apropierii sau depărtării acestuia de contraelectrodul spectrometrului pentru a se putea ajusta formarea și captarea sprayului pentru obținerea unui semnal cât mai stabil și îndelungat. În analizele efectuate e nevoie de un semnal al ionilor cât mai stabil și de lungă durată pentru a se permite efectuarea experimentelor de fragmentare CID și ETD. Mai ales ca în cazul fragmentării ETD sursa cu fluorantenă are nevoie de o anumită perioadă de timp pentru a fi funcțională. Poziționarea robotului respectiv a chipului în raport cu sursa spectrometrului de masă și cu canalul de intrare a ionilor în acesta joacă un rol esențial atât in procesul de ionizare cât și în cel de transfer efectiv al ionilor dinspre chip în spectrometru. Interfața nou construită a permis un reglaj foarte exact a poziției robotului și implicit chipului, ceea ce a condus la un transfer optim al ionilor și automat la o sensibilitate superioară a sistemului cu posibilitatea de ionizare și identificarea componenților minori din amestecul gangliozidic complex.

Ca urmare a cuplajului întreaga configurație a sursei de electrospray a spectrometrului cât și a robotului precum și parametrii de operare ai ambelor instrumente, trebuie reconsiderate și optimizate cu meticulozitate. Prin cuplarea robotului întregul sistem al celor două instrumente funcționează independent adică nu există un determinism reciproc al celor două aparate. Robotul este controlat de un software separat și anume Chip Soft 8.1.1, prin care se controlează mai mulți parametrii: stabilirea chipului de infuzie care este recunoscut dupa un cod individual, aceasta împiedică refolosirea aceluiași chip sau aceluiași orificiu, ceea ce este foarte benefic pentru împiedicarea contaminării probelor, de asemenea se stabilește presiunea gazului de desolvatare a picăturilor precum și tensiunea aplicată pe chip, de asemenea se programează locul din placa de microtitrare de unde este extrasă proba pentru infuzie. Robotul infuzează proba prin electrospray într-un regim decuplat și independent de prezența spectrometrului de masă și de parametrii de funcționare ai acestuia, iar la rândul său spectrometrul de masă este optimizat pentru a transfera ioni ce nu sunt produși de propria-i sursa. Din acest motiv experimentele de optimizare au condus la stabilirea unui set complet diferit de parametrii de funcționare ai spectrometrului de masă.

Astfel, sistemul de alimentare cu gaz de desolvatare si gaz nebulizator ce avea drept rol sustinerea spray-ului produs de propria sursa a spectrometrului a fost demontat iar conducta de aductie a azotului a fost conectata la bratul robotului pentru a se constitui in canal transportor al gazului (azot) ce sustine electropulverizarea prin pipeta robotului.

Sursa de azot a fost astfel decuplată de la dispozitivul care asigura inițierea electrosprayului sursei inițiale a spectrometrului și cuplată la robotul de infuzie pentru a se realiza desolvatarea prin chip și presiunea de împingere a probei prin micropipeta brațului robotic. Pentru aceasta a trebuit reconfigurat traseul gazului din butelia de azot, dar nu în întregime deoarece spectrometrul de masă are nevoie permanentă de purificare internă cu azot pentru că altfel vidul înaintat creat de pompa de vid poate cauza intrarea în acesta a impurităților existente în aerul înconjurător.

a) b)

Figura 3.1. Primul cuplaj din lume al robotului NanoMate de la firma Advion BioSciences cu spectrometrul de masă HCT Ultra PTM a) Interfațarea robotului; b) Poziționarea precisă a sistemului de chip cu 400 de orificii cu aliniament în dreptul contraelectrodului spectrometrului HCT MS.

Tot în scopul menținerii unei atmosfere cât mai sterile s-a instalat în laborator un purificator de aer cu filtru Hepa, util și pentru captarea bacteriilor și virusurilor care ar putea interfera cu analizele și integritatea sănatății utilizatorului, deoarece probele analizate sunt de natură biologică și în special patologică.

Întreaga sursă de arhitectură cavitară, care asigura formarea electrosprayului prin infuzie cu seringă pompă sau capilar, a spectrometrului a fost demontată, iar chipul robotului a fost plasat in dreptul orificiului de intrare (capillary exit) al spectrometrului de masă. Contraelectrodul, adică orificiul de intrare în spectrometru este constituit dintr-un tub capilar cu înveliș dublu de sticlă cu un diametru intern foarte mic, de numai 0,6 mm. Acesta este învelit la extremități de un strat metalic puternic conductor, iar la capătul extern, care proeminează din spectrometru, este protejat de o piesă metalica circulară care se fixează pe vârful acestuia, piesa metalică mai are si rolul de a dirija sprayul în tubul capilar al aparatului.

Figura 3.2 Spectrometrul de masă cu sursa inițială detașată și robotul NanoMate poziționat în dreptul acestuia

Pentru a împiedica descărcările electrice dintre robot si spectrometru s-a realizat o izolație electrică la nivelul locației fostei surse a spectrometrului de masă. De asemenea, magnetul care asigură închiderea sursei inițiale a spectrometrului a fost poziționat să corespundă situației inițiale pentru a se putea inițializa infuzia în noua sursă, în caz contrar software-ul aparatului nu permitea trecerea în modul de operare a software-ului Esquire Control, modul de operare (operate) implică aplicarea tensiunilor necesare apariției semnalului probei analizate precum și alimentarea cu azot a întregului ansamblu.

Figura 3.3 Tehnica ionizării prin chip ESI [adaptare ADZ]

Infuzia prin chip diferă de cea prin tub capilar prin mai multe aspecte. În primul rând, cantitatea de probă folosită în metoda cuplajului dintre spectrometrul de masă HCT și robotul NanoMate este cu mult mai mică față de cea prin capilar sau alte tehnici de infuzie cum ar fi seringa pompă. Apoi, se poate menționa formarea ionilor multiplu încarcați și stabilitatea semnalului în cazul chip-ului. Acest fapt se datorează concentrării liniilor de câmp electric, spere deosebire de cazul capilarului, unde liniile de câmp sunt dispersate într-un spațiu mai mare fiind mai răsfirate. La infuzia prin chip câmpul electric de la vârful conului Taylor este de 137 x 106 V/m, în timp ce în cazul infuziei prin capilar câmpul electric de la vârful conului Taylor este de numai 53 x 106 V/m (fig. 3.4).

a. b.

Figura 3.4 Comparația liniilor de câmp electric în cazul chip-ului vs. capilar a. Model de infuzie prin chip, câmpul electric de la vârful conului Taylor este 137 x 106 V/m; b. Model de infuzie prin capilar câmpul electric de la vârful conului Taylor este 53 x 106 V/m

În aceste conditii aproape toti parametrii din software-ul spectrometrului care se refereau la sursa sa de ioni originală au fost dezactivati; valoarea potențialului de electrospray al spectrometrului de masă a fost fixată la 0 volti iar pentru a crea un potențial usor atractiv pentru ionii dirijați dinspre chip, valoarea potențialului pe orificiul metalic de intrare a fost fixat la -50 volti. Astfel, ionii au fost dirijați de la un potential de -0.8 kV aplicat pe pipeta conductivă ce electropulverizează prin chip la un potențial de -50 volți aplicat orificiului de intrare în HCT.

În condițiile electropulverizării prin chip gazul de desolvatare și nebulizator nu mai constituie o necesitate pentru aducerea ionilor în faza gazoază și respectiv susținerea pneumatica a pulverizarii motiv pentru care desolvatarea picaturilor încarcate s-a realizat numai prin mentinerea la o temperatura ridicata de 2000C a blocului metalic al sursei spectrometrului plasat in zona orificiului de intrare. Temperatura blocului metalic al spectrometrului de masă are o importanță majoră în funcție de tipul probei analizate. Astfel, în cazul gangliozidelor, precum și în cel al proteinelor, nu poate depăși 2500C deoarece intervine distrugerea moleculeor, denaturarea proteinelor și ruperea legăturilor dintre grupările funcționale, astfel fie nerealizăndu-se înregistrarea unui semnal stabil sau se pot observa fragmentări în sursă a probelor, ceea ce duce la obținerea unor rezultate neconcludente.

Fiecare orificiu al chipului prezintă un diametru de 2.5 μm. Experimentele de testare utilizând drept agent de electropulverizare metanolul pur au dovedit faptul că ȋn condițiile de lucru date și anume potențial ESI pe pipeta 0.8 kV, presiune gaz susținere ESI prin robot 0.6 p.s.i., potențial contraelectrod 50 V, distanța chip contraelectrod 2 mm s-a putut obține un debit de electropulverizare de numai 50 nL/min. Această valoare coroborată cu capacitatea de stocare uriașă a ionilor ȋn spectrometrul de masă de tip HCT și care nu impune o achiziție de spectre de peste 10-15 minute conduce la concluzia că din punct de vedere al sensibilității, vitezei, multitudinii de date structurale oferite și consumului extrem de redus de probă, sistemul nou cuplat HCT/NanoMate este de departe cel mai performant sistem spectrometric la ora actuală.

Singurul parametru care ar putea fi considerat sub instrumentele de tip FTICR, de pildă, este precizia în determinarea masei. FTICR oferă o precizie ȋn determinarea maselor de câțiva ppm ȋn timp ce sistemul HCT/NanoMate oferă precizii cu un ordin de mărime mai mic. Deși la prima vedere, ȋn special pentru identificări de novo a unor biomarkeri cu valoare clinică, acest aspect pare destul de dezavantajos totuși spectrometrul HCT în cuplaj cu NanoMate poate efectua fragmentări ale ionilor precursori în stagii multiple cu o precizie și o viteză cu mult mai mare decât instrumentele de tip FTICR. Prin stagii multiple de fragmentare atât prin CID cât și prin alte metode de disociere precum cele cu transfer de electroni (ETD) sau transfer de protoni (PTR) sistemul NanoMate/HCT oferă posibilitatea unică de a disocia ionul precursor și succesiv fragmentele derivate din acesta pană la elucidarea neechivocă a structurii moleculare necunoscute. În aceste condiții apare evident faptul că precizia foarte mare în determinarea masei nu mai joacă un rol atât de important pentru atribuirea fără dubii a structurilor moleculare ale ionilor detectați prin HCT/NanoMate. În plus, spre deosebire de celelalte tipuri de spectrometre de masă, datorită configurației extrem de flexibile HCT poate lucra în permanență cuplat cu robotul NanoMate iar decuplarea și recuplarea se pot executa extrem de rapid, fără modificări ireversibile ale niciunia dintre instrumente și fără un training prealabil al operatorului sau o infrastructură sofisticată.

3.2. Optimizarea cuplajului NanoMate HCT MS pentru probe standard de gangliozide

3.2.1. N-Acetilgalactozamina ca parte integrantă a gangliozidelor

Majoritatea gangliozidelor conțin zaharuri neutre și o hexozamină. În gangliozidele din creier a fost descoperită doar D-galactozamina, care apare întotdeauna sub forma acetilată (GalNAc). Este un derivat de galactoză ce conține o grupare aminică legată la cel de-al doilea atom de carbon. Este un component important al glicolipidelor și condroitinei. În figura 3.2 am reprezentat structura GalNAc. Proba de GalNAc a fost infuzată cu un debit de 68nl/min, debit scăzut care permite un consum redus de probă.

Figura 3.5 Spectrul (-)nanoESI HCT MS1 al fracțiunii standard GalNAc. Solvent: MeOH; concentrația probei 0.5 pmol/μL; timpul de achiziție 30 s; Chip ESI: -0.7 kV; potențialul pe contaelectrod: -50 V.

Solventul volatil folosit pentru diluția probei a fost metanolul de puritate HPLC, achiziționat de la firma Merk. Tensiunea pe chip a fost de 0.7 kV, iar potențialul pe contraelectrod de -50 V. Proba a avut o concentrație de 0.5 pmol/ μL. Pentru a obține spectrul prezentat în figura de mai sus s-au variat tensiunile pe chip și contraelectrod.

Figura 3.6. N-acetil-α-D-galactozamina

În spectrul acestui standard s-a identificat GalNAc sub forma sa normală precum și cea deshidratată. Acuratețea în determinarea masei a fost de 90 ppm în cazul GalNAc și 49 în cazul GalNAc-H2O.

Tabelul 3.2 Speciile identificate, tipului ionului și acuratețea în determinarea masei în cazul probei standard GalNAc

La m/z corespunzătoare valorilor de 202.17 respectiv 220.27 este molecula de GalNAc deshidratată și sub forma sa hidratată. Acuratețea în determinarea masei a fost de 49 și 90 ppm, ceea ce reliefează puritatea probei, dar și o rezoluție bună.

3.2.2. Monosialogangliozida GM3

GM3 este o monosialogangliozidă cu o compozitie de tipul: Gal-NeuAc-Glc-Cer, unde Gal corespunde galactozei, Glc glucozei, NeuAc acidului sialic și Cer ceramidei.

Lambert K. Sørensen în 2006 [139] a realizat analiza standardului GM3 prin cromatografie lichidă cuplată cu ionizare prin electrospray cu asistare pneumatică. Proba folosită de el a fost extrasă din lapte uman și din lapte praf pentru sugari. Arita et al. [140] a realizat de asemenea măsuratori de gangliozide prin FAB, dar această tehnică este cu mult inferioară celei folosite de noi. Sugiyama et al. [141] au folosit tehnica MALDI TOF (matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry), ionizare prin desorbție laser și timp de zbor. De asemenea prin acestă tehnică s-au elucidat mai putin precis structurile de gangliozide.

În figura 3.7 este prezentat spectrul de masă MS1 al standardului de gangliozide GM3. În această figură se poate observa de asemenea structura chimică a gangliozidei GM3. Proba standard GM3 a fost extrasă din creier bovin și cumparată de la firma Sigma Aldrich.

Figura 3.7 Spectrul (-)nanoESI HCT MS1 al fracțiunii standard GM3. Solvent: MeOH; concentrația probei 0.5 pmol/μL; timpul de achiziție 30 s; Chip ESI: -0.8 kV; potențialul pe contaelectrod: -53 V

Condițiile de achiziție a spectrului din figura 3.7 au fost schimbate în repetate rânduri pentru a obține un semnal de o intensitate cât mai ridicată și de a avea un raport între zgomot și semnale cât mai mic. Tensiunea pe chip a fost de -0.8 kV, iar potențialul pe contraelectrod de -53 V. La valori mai mici decât cele amintite nu am avut semnal, iar la valori mai mari s-a observant fragmentarea în sursă. Proba a avut o concentrație de 0,5 pmol/μL și un debit de 73 nl/min.

În urma analizei probei standard s-au descoperit un număr de 3 structuri și anume: GM3(d18:1/18:0) la un m/z de 1179.85, O-Ac-GM3(d18:1/20:1) sau GM3(d18:1/23:1) la un m/z de 1248.50 și GM3(d18:0/24:0). Dintre acestea două conțin ceramide deosebite GM3(d18:1/23:1) și GM3(d18:0/24:1) la un m/z de 1266.57. Specii de gangliozide cu structuri mai speciale ale ceramidei nu sunt intalnite în mod curent ele fiind părti componente ale membranelor celulare neuronale, dar în cantitate mai scăzută decât GM3(d18:1/18:0) și GM3(d18:1/20:1).

În tabelul următor sunt enumerate structurile calculate și elucidate din spectrul MS1 al probei standard GM3.

Tabelul 3.3 Speciile identificate, tipului ionului și acuratețea în determinarea masei în determinarea masei in cazul probei standard GM3

Lanțul bazei sfingoide de 24 de carboni, în cazul speciei GM3(d18:0/24:1) este mai rar întâlnit, la fel și în cazul speciei GM3(d18:1/23:1), unde baza sfingoidă conține un număr impar de 23 de atomi de carbon și o legătură dublă, acest număr impar fiind foarte rar prezent în gangliozidele din membranele celulare neuronale, ele fiind specifice în unele cazuri structurilor aberante, cum ar fi țesuturile aflate într-un stagiu incipient de dezvoltare sau tumorilor.

La m/z-ul corespunzator valorii de 1179.82 am detectat specia GM3(d18:1/18:0), care are în compoziția ei o ceramidă comună, iar acuratețea în determinarea masei este de 68. La m/z-ul corespunzator valorii de 1248.50 avem două posibilități și anume O-Ac-GM3(d18:1/20:1) sau GM3(d18:1/23:1), ambele corespunzând valorii calculate. Această masă a avut o acuratețe de 72. La m/z-ul de 1266.53 am calculat ca fiind specia GM3(d18:0/24:0), determinată cu o acuratețe a masei de 87.

3.2.3. Monosialogangliozida GM2

Monosialogangliozida GM2 are compoziția structurală aproape identică cu cea a gangliozidei GM1, cu excepția faptului că lanțul zaharidic este mai scurt, lipsind o galactoză, cea externă. GM2 gangliozidozele – apar în urma deficitului enzimei ß-hexozaminidaza, fiind un grup de tulburari genetice înrudite.

În urma screening-ului acestei probe standard, am descoperit un număr de 7 structuri, dintre care 5 sunt de tipul GM2, iar 2 de tipul GM3. Structurile GM3 pot fi prezente în spectrul de masă al standardului GM2 ca urmare a pierderii N-acetil galactozaminei, dar și din alte motive cum ar fi separarea incompletă în urma cromatografiei pe strat subțire, deoarece spoturile celor două specii de gangliozide sunt apropiate. Speciile de GM3 s-au aflat în cantitate mult mai mică în probă, fapt coroborat de intensitatea scazută a semnaleleor corespunzătoare acestora.

În figura 3.8 este ilustrat spectrul de masă al standardului GM2., în cadrul căruia s-au descoperit mai multe specii de GM2, dar și de GM3, ceea ce nu este specificat de producător.

În figura inserată în spectrul probei standard GM2 se poate observa structura chimică a speciei GM2.

Figura 3.8 Spectrul (-)nanoESI HCT MS1 al fracțiunii standard GM2. Solvent: MeOH; concentrația probei 0.5 pmol/μL; timpul de achiziție 50 s; Chip ESI: -0.6 kV; potențialul pe contraelectrod: -50 V

Condițiile de analiză a acestei probe au fost: tensiunea pe chip de -0.6 kV, potențialul pe contraelectrod -50 V. La tensiuni mai mici intensitatea semnalulului a fost foarte mică sau absentă, iar la valori mai mari s-au observant fragmentări în sursă, în urma carora s-a rupt legătura labilă a acidului sialic, precum și porțiuni ale lanțului zaharidic.

În urma încercărilor repetate am ajuns la concluzia că valorile folosite au fost optime pentru ionizarea probei infuzate. Timpul de achiziție a fost de 50 s, ceea ce contribuie la consumul redus de probă. Concentrația probei a fost de 0.6 pmol/µl, iar debitul de infuzie de 68 nl/min. proba a fost diluată in metanol, solvent de puritate HPLC achiziționat de la firma Merk.Proba standard de gangliozide a fost achiziționată de la firma Sigma Aldrich.

Dupa diluție s-a realizat vortexarea pentru a se omogeniza cât mai bine amestecul de solvent-analit, iar apoi s-a centrifugat, timp de 15 minute într-o microcentrifugă care are 2000 de rotații pe minut.

Tabelul 3.4 Speciile identificate, tipului ionului și acuratețea în determinarea masei în cazul probei standard GM2

În proba standard analizată s-au descoperit urmatoarele specii de gangliozide: GM3(d18:1/18:0), GM3(d18:0/20:0), GM2(d18:1/18:0), GM2(d18:1/19:0), GM2(d18:1/22:0), GM2(d18:1/24:0) și GM2(d18:1/20:0). Acuratetile in determinarea maselor sunt 59, 66, 72, 72, 73, 77, si 89 ppm. Datorită sensibilității ridicate a metodei, s-au determinat specii minore de gangliozide care au avut o intensitate a semnalului scăzută, fapt datorat ionizabilitații scăzute a acestora sau cantității mici de probă. Astfel, au fost detectate specii cu ceramide mai rar întalnite precum: GM2(d18:1/19:0), GM2(d18:1/22:0) și GM2(d18:1/24:0).

Pentru a elucida mai în detaliu structura speciei GM2 (d18:1/20:0), s-a fragmentat ionul având m/z 1410.73 prin CID (collision induced dissociation-disociere indusă prin ciocnire). Ciocnirea moleculei s-a realizat cu ioni heliu. CID este o tehnică de fragmentare nespecifică, molecula fiind fragmentată în mod special la legăturile cele mai labile. Legătura cea mai slabă, care se fragmentează prima dată este cea a acidului sialic. Nomenclatura fragmentelor obținute în urma CID este în concordanță cu cea publicată de Domon și Costello.

În spectrul MS1 GM2 (d18:1/20:0) a fost detectat cu o acuratete a masei de 73 ppm. În figura 3.9 putem observa spectrul de fragmentare al GM2, iar în figura 3.10 schema de fragmentare a acestuia, care demonstrează că a fost realizată foarte bine deoarece avem o mare acoperire a secvenței (sequence coverage).

Ionul având m/z la 1410.73, corespunzând, conform calculelor, speciei GD1 (d18:1/20:0), a fost izolat într-o fereastra de 2 unități (u) și fragmentat prin CID (Fig. 3.9). Pentru a obține un număr mare de fragmente de ioni și de a spori producțtia de fragmente structural-informative, CID MS2 a fost efectuată folosind o amplitudine variabilă de semnal RF (0.6 V si 1.0 V).

Figura 3.9 Fragmentarea prin (-) nanoESI chip HCT CID MS2 a ionului [M-H+]- cu m/z 1410.73 corespunzător speciei GM2 (d18:1/20:0) detectată în proba standard GM2. Timp de achiziție 1 min; amplitudinea RF 0.6-1.0 V

Figura 3.10 Schema de fragmentare a a ionului [M-H+]- cu m/z 1410.73 corespunzător speciei GM2(d18:1/20:0)

Spectrul din Figura 3.9 a fost generat prin însumarea scan-urilor achiziționate timp de un minut la amplitudini variind între 0.6 V și 1.0 V. La alte amplitudini, cum ar fi cele mai scăzute decât valorile folosite, s-a observat că ionul izolat, într-o fereastră de 2 u, nu se fragmentează, iar la amplitudini mai mari fragmentarea s-a produs mult mai intens, și distructiv pentru moleculă. Folosind acest protocol, procesul de tip chip tandem MS a dat naștere la suficiente fragmente de ioni pentru realizarea atribuirii corecte a secvenței de carbohidrați ai speciilor de monosialogangliozide, precum și pentru caracterizarea tipului de ceramidă. Fragmentele de ioni obținute confirmă compoziția ionului GM2(d18:1/20:0). Mai mult, analiza în detaliu a spectrului arată că ionul precursor a generat câțiva ioni de tipul Y-, B-, si Z- precum și ioni produși de fragmentări ai legăturilor glicozidice, care prezintă o înaltă relevanță structurală în ceea ce privește confirmarea locului de atașare a acidului N-acetil-neuraminic (Neu5Ac). Cu excepția seriei de ioni B, Y si Z care validează compoziția oligozaharidei (GalNAcNeu5AcGalGlc), la m/z 592.05 spectrul ilustrează un semnal care corespunde ionului Y0, acesta fiind capătul reducător al moleculei, adică ceramida. Deși cu o abundență relativă scăzută, ionul Y0 confirmă compoziția ceramidei și anume (d18:1/20:0). Ionul B2 este aflat la m/z 655.05, structura acestuia fiind GalNAc-Gal-Neu5Ac.

La un m/z corespunzător valorii de 701.85 se află ionul desemnat ca fiind Z1 cu structura Glc-Cer. Z2α/C1β este reprezentat de m/z 863.29 și are structura Gal-Glc-Cer. Y2α/B1β este la m/z corespunzator valorii de 916.89 cu structura Gal-Neu5Ac-Glc-Cer, fiind un ion diagnostic pentru confirmarea poziției acidului sialic la galactoza. Z2β se află la m/z de 1101.83 și are structura GalNAc-Gal-Glac-Cer, adică este lanțul zaharidic cu ceramidă și fără acidul sialic, acest fragment fiind cel mai previzibil, deoarece ruperea legăturii labile a acidului sialic este un eveniment inevitabil în cazul fragmentării CID. Y2β se află la valoarea de 1119.96 și are structura identică fragmentului anterior, dar ca deosebire de acesta este forma hidratată. Z2α aflat la m/z 1189.85, este identic ca structură cu ionul Y2α aflat la m/z 1207.87, adică Gal- Neu5Ac-Glc-Cer, dar în cazul primului putem observa forma deshidratată, iar în cazul celui de-al doilea forma hidratată a moleculei. La m/z de 1393.06 se observă ionul precursor fără o moleculă de apă. Acidul sialic poate fi legat și la atomii de C6 ai GalNAc, dar în cazuri foarte rar întâlnite, în schimb, prin ionii diagnostic pe care i-am obținut în urma fragmentării CID putem postula că Neu5Ac este legat la galactoză. Acești ioni diagnostic, pentru locul de legare al Neu5Ac, sunt: Y2α/B1β la m/z corespunzător valorii de 916.89, Y2α aflat la m/z 1207.87 și Z2α aflat la m/z 1189.85.

3.2.4. Monosialogangliozida GM1

Fiind o gangliozidă cu importanță majoră proba GM1 a fost unul din standardele analizate prin chip-HCT MS. În figura 3.8 este prezentat spectrul de masă al probei standard GM1, disponibilă comercial, izolată din creier bovin, spectrul a fost achiziționat în numai 30 secunde. Spectrul fracțiunii standard GM1 a fost achiziționat timp de 60 de secunde. Proba a fost diluată la o concentrație de 0.5 pmol/µl, ca solvent fiind folosit metanolul de puritate HPLC (Merk). Debitul de infuzie a fost de 65 nl/min, tensiunea pe chip a fost de -0.7 kV, iar potențialul contraelectrodului de – 55 V.

Au fost realizate mai multe încercări la potențiale diferite, dar spectrele rezultate nu au oferit informații concludente, la valori mai mici intensitatea semnalului fiind foarte slabă, iar la valori mai mari s-au observant fragmentări ale moleculei în sursă.

Prin analiza probei standard de GM1 s-au descoperit cinci structuri care diferă prin tipul ceramidei și anume: GM1(d18:0/16:0), GM1(d18:1/18:0), GM1(d18:1/19:1), GM1(d18:1/20:0), GM1(d18:0/23:0). Acuratețea în determinarea masei se încadrează în domeniul de analiză caracteristic spectrometrului de masă cu capcană ionică de mare capacitate.

Figura 3.11 Spectrul (-)nanoESI HCT MS1 al fracțiunii standard GM1. Solvent: MeOH; concentrația probei 0.5 pmol/μL; timpul de achiziție 60 s; Chip ESI: -0.7 kV; potențialul pe capilar: -55 V.

În urmatorul tabel sunt prezentate structurile descoperite în proba analizată.

Tabelul 3.5 Speciile identificate, tipului ionului și acuratețea în determinarea masei în cazul probei standard GM1

Pe lângă structurile ceramidice comune, de tipul GM1(d18:1/18:0), GM1(d18:1/20:0) s-au descoperit și structuri atipice, cum ar fi GM1(d18:0/16:0), GM1(d18:1/19:1), GM1(d18:0/23:0). Structura atipică a ceramidei constă în lungimea lanțului de acid gras și a lanțului bazei sfingoide și de asemenea în numarul impar de atomi de carbon din cadrul bazei sfingoide.

Acestea nu au fost raportate de producător și nici nu au fost descoperite prin alte metode de analiză, cum ar fi infuzia prin capilar, prin seringă pompă, HPLC, TLC, MALDI, FAB și gaz cromatografie cuplată cu spectrometrie de masă. Metoda folosită în laboratorul de spectrometrie de masă, și anume infuzia prin chip electrospray în spectrometrul de masă cu capcană ionică de mare capacitate, beneficiază de numeroase avantaje, cum ar fi sensibilitatea foarte mare ceea ce determină un consum redus de probă. Sensibilitatea unui instrument HCT este de 10 ori mai mare decât cea a unui IT (ion trap-capcană ionică), fiind de 2.5 ppm.

Datorită infuziei prin chip, speciile de gangliozide aflate în cantitate foarte redusă în probă au putut fi detectate, acestea se află sub limita de detecție a spectrometrelor care utilizează alte tipuri de surse de infuzie, cum ar fi: infuzia prin seringă pompă, prin sursa micro, infuzia prin capilar prin sursa nano. Speciile minore au putut fi detectate datorită intensitații și concentrării liniilor de câmp din apropierea orificiilor de infuzie ale chipului.

Speciile comune de gangliozide, care au fost raportate și de producător ca existente în proba, au fost detectate cu o acuratețe a masei de 97 și respectiv 95 ppm. Gangliozidele cu ceramide atipice au avut acuratețea in determinarea masei de 40, 77 și 80 ppm. Aceste valori se încadrează în limitele normale (pana in 150 ppm) de detecție a unui spectrometru de masă cu capcană ionică de mare capacitate.

3.2.5. Disialogangliozida GD2

Gangliozida GD2 este o gangliozidă disialilată conținând 2 acizi sialici, o galactoză, o glucoză, o N-Acetil galactozamină și o ceramidă.

Vera B. Ivleva et al. [142] au studiat gangliozidele cu ajutorul cromatografiei pe strat subțire (TLC) cuplată cu MALDI și un spectrometru de masă ortogonal cu timp de zbor (oTOF). Cho HJ et al. [143] au publicat în revista Cancer Research un studiu despre expresia GD2 în neuroblastoma umană. Ei au ajuns la concluzia că GD2 este biomarker al neuroblastomei, și poate fi folosit în imunoterapia realizată pentru acest tip de tumoare. Zhao-Chun Tsui et al. [144] au utilizat cu spectrometru de masă cu infuzie prin electrospray și spectrometrie de masă în tandem pentru a realiza un profil al gangliozidelor în țesutul de mamifere. E R Sjoberg et al. au studiat GD2, ei au descris structural și immunologic această specie ajungând la concluzia că GD2 este acceptor pentru acetiltransferaza din celulele de melanoma [145].

În figura urmatoare este prezentat spectrul de masă al probei standard GD2 estrasă din creier bovin și cumparată ca probă standard de la Sigma Aldrich.

Figura 3.12 Spectrul (-)nanoESI HCT MS1 al fracțiunii standard GD2. Solvent: MeOH; concentrația probei 0.5 pmol/μL; timpul de achiziție 30 s; Chip ESI: -0.8 kV; potențialul pe contraelectrod: -55 V

În figura 3.12 putem observa 4 specii de tip GD2 cu mai multe tipuri de ceramide. Astfel se observă specia GD2(d18:1/18:0), care are în structura sa o ceramidă comună. Această specie a fost detectată la m/z-ul 1673.89 cu o acuratețe în determinarea masei de numai 54 ppm. Se mai pot observa și alte 3 specii de gangliozide de tip GD2, cum ar fi GD2(d18:1/18:2), aflată la un m/z de 1669.80, detectată în MS1 cu o acuratețe de 78 ppm.

La un m/z de 1684.82 putem observa specia GD2(d18:1/19:2), care are după cum se poate vedea o structură mai rară a ceramidei, această gangliozidă a fost detectată cu o acuratețe în determinarea masei calculată la o valoare de 71 ppm. Lanțul bazei sfingoide are un număr impar de atomi de carbon, ceea ce este mai puțin întalnit în cazul ceramidelor. La m/z corespunzător valorii de 1702.80 am determinat, în urma calculelor, existența speciei GD2(d18:1/20:0), care a fost calculată ca având o acuratețe în determinarea masei de 70 ppm.

Pentru a obține rezultatele prezentate tensiunea chip-ului și potențialului pe contraelectrod au fost variate, spectrul prezentat având optimul acestora, la aceste valori semnalul a devenit stabil și s-au putut observa mai multe specii de gangliozide. Astfel, tensiunea pe chip a fost de -0.8 kV, iar potențialul pe contraelectrod de -55 V. sub aceste valori semnalul a lipsit sau a avut o intensitate scazută, iar peste acestea s-au observant fragmentări în sursă. Debitul de infuzie a fost calculat ca fiind de 65 nl/min.

În acest standard am descoperit un număr relativ crescut de specii de tip GD2, ceea ce arată utilitatea acetei metode și anume infuzia în spectrometrul cu capcană ionică de mare capacitate prin chip electrospray. Prin această tehnică de infuzie, spre deosebire de infuzia prin seringa pompă sau prin capilar, avem posibilitatea obținerii de sarcini multiple. Acest lucru se datoreaza liniilor de câmp electric care sunt mai intense fiind concentrate pe un spațiu mai mic și anume în jurul orificiului chipului de infuzie. Avantajul sarcinilor multiple este acela că avem posibilitatea măsurării maselor mari, aflate peste scala de detecție a spectrometrului, dar și deoarece prin aceasta confirmăm că ionii reprezintă molecule reale și nu artefacte sau impurități.

Tabelul 3.6 Speciile identificate, tipului ionului și acuratețea în determinarea masei în cazul probei standard GD2

3.2.6 Disialogangliozida GD1

Gangliozida GD1 are structura lanțului zaharidic identic cu GM1, dar conține doi acizi sialici. Woods și Jackson [146] au studiat lipidomica țesutului cerebral folosind MALDI. Taki et al au realizat hidroliza enzimatică și gas cromatografie cuplată cu spectrometrie de masa, ei raportând descoperirea unei noi disialogangliozide care are acidul sialic legat la poziția C6 a GalNAc, această gangliozidă a fost denumită GD1 alpha [147]. Tanner M. Schaub et al. descriu mai mult performanțele tehnice ale unui spectrometru linear hibrid cuadrupolar cu capcană ionică, transformantă Fourier și rezonanță ciclotronică [148].

În spectrul de masă realizat în laboratorul nostru au fost detectate cinci semnale corespunzătoare speciilor GD1(d18:1/18:0), GD1(d18:0/19:0), GD1(d18:0/21:1), GD1(d18:1/22:0) si GD1(d18:1/20:0). În inset-ul figurii putem observa structura chimică a acestei gangliozide.

Standardul GD1 a fost analizat la o tensiune de 0.4 kV, potențialul pe contraelectrod a fost de -57 V. Aceste valori au fost optime pentru achiziția spectrului, s-au realizat variații ale acestora, dar la valori mai mici nu s-a obținut semnal, iar la valori mai mari s-au observat fragmentări în sursă. Debitul de infuzie a fost de 71 nl/min, ceea ce a determinat un consum redus de probă.

Astfel în spectrul din figura următoare putem observa detecția unui număr destul de mare de specii de gangliozide, care au putut fi detectate cu metoda de infuzie prin chip-electrospray datorită avantajului acestei metode de a fi foarte sensibilă și de a putea detecta speciile minore existente într-un amestec complex.

Figura 3.13 Spectrul (-)nanoESI HCT MS1 al fracțiunii standard GD1. Solvent: MeOH; concentrația probei 0.5 pmol/μL; timpul de achiziție 30 s; Chip ESI: -0.4 kV; potențialul pe contraelectrod: -57 V

Alături de speciile commune de GD1, cum este GD1(d18:1/18:0), putem observa și specii cu o structură ceramidică mai deosebită și anume GD1(d18:0/19:0) și GD1(d18:0/21:1). Acestea sunt mai rar întâlnite în țesuturile normale. Ele au un număr impar de atomi de carbon în cadrul bazei sfingoide. De asemenea se mai pot distinge stările duble de încărcare pe care le au semnalele corespunzătoare ionilor gangliozidelor, ceea ce reliefează un aspect pozitiv al metodei folosite în laboratorul nostru, deoarece astfel pot fi elucidate mase mai mari și de asemenea putem preciza eficiența crescută a acestui tip de infuzie prin chip electrospray.

La m/z-ul corespunzător valorii de 917.41 putem observa ionul dublu încărcat, [M-2H+]2-, aferent speciei GD1(d18:1/18:0). La m/z aferent valorii de 925.41 avem ionul [M-2H+]2- atribuit speciei GD1(d18:0/19:0), care are după cum se vede din structura calculată, o ceramidă mai deosebită. La m/z-ul de 931.43 este ionul [M-2H+]2- calculat ca fiind specia GD1(d18:1/20:0), care de asemenea are în structura sa o ceramidă mai puțin comună. La m/z-urile de 939.63 și 945.46 se află ionii cu sarcini duble, [M-2H+]2-, corespunzători structurilor GD1(d18:0/21:1) și GD1(d18:1/22:0).

Tabelul 3.7 Speciile de gangliozide identificate, tipului ionului și acuratețea în determinarea masei în cazul probei standard GD1

Ceramidele din cazul ultimelor două specii de gangliozide menționate, posedă de asemenea structuri mai puțin comune, acestea nefiind raportate de producător ca existente în proba analizată. Ceramidele amintite au un număr impar și un lanț mai lung de atomi de carbon în cadrul bazei sfingoide.

După cum este menționat în tabelul 3.7, acuratețile în determinarea maselor sunt: în cazul speciei GD1(d18:1/18:0), cu m/z-ul 917.41 avem o acuratețe de 76 ppm, în cazul GD1(d18:0/19:0), cu m/z aflat la valoarea 925.41 acuratețea este de 108 ppm, la specia GD1(d18:1/20:0), cu m/z corespunzător valorii de 931.43 acuratețea este de 64 ppm, la gangliozida având structura GD1(d18:0/21:1), și m/z-ul situat la valoarea de 939.63, acuratețea este de 149, care chiar dacă este mai mare decât la celelalte se încadrează în standardele unui spectrometru de masă de tip HCT, iar la m/z-ul de 945.35, aparținând structurii GD1(d18:1/22:0), acuratețea este de 169 ppm.

3.2.7 Trisialogangliozida GT3

Gangliozida GT3 este identică, din punct de vedere structural în ceea ce privește lanțul zaharidic cu specia GM3, doar că în cazul GT3 molecula conține 3 unităti de acid sialic. Ca și celelalte specii de gangliozide GT3 se găsește în compozitia membranelor celulare a tuturor mamiferelor, având concentrația cea mai abundentă în membranele neuronale. Este implicată în procesele de recunoastere celulară, acționând ca receptor celular și este asociată bolilor degenerative, ca Parkinson, Alzheimer, dar și în cazul apariției tumorilor canceroase, în special cele care cauzează cancerul la creier.

Waki et al. au studiat specia GT3 din creierul unei specii de pește cod, prin cromatografie lichidă de înaltă performanță și FAB MS [149]. Antoine et al. [150] au realizat biosinteza GD3 și GT3 folosind E. coli modificată metabolic. J. Cheng et al. au caracterizat GD2/GD3 oligozaharid sintetaza și sialidaza, dar au caracterizat de asemenea și speciile de gangliozide [151]. Raman et al. [152] au realizat un review în care amintesc de metode ca FTICR și NMR (rezonanta magnetica nucleară) folosite în glicomică.

În figura urmatoare putem observa spectrul de masă al probei standard GT3, extrasă din creier bovin și achiziționată de la Sigma Aldrich. În partea dreapată a figurii putem observa structura chimică a acestei specii de gangliozide.

Figura 3.14 Spectrul (-)nanoESI HCT MS1 al fracțiunii standard GT3. Solvent: MeOH; concentrația probei 0.7 pmol/μL; timpul de achiziție 70 s; Chip ESI: -0.8 kV; potențialul pe contraelectrod: -57 V

În urma analizei probei standard de GT3 s-a descoperit un număr de 3 structuri dintre care una are o ceramidă mai specială, deoarece are un lanț foarte lung de atomi de carbon în cadrul bazei sfingoide, iar două conțin ceramide comune, des întâlnite în cadrul speciilor de gangliozide. La un m/z aflat la valoarea de 1805.25 se află specia GT3 (d18:1/18:0), aceasta are în structura sa o ceramidă normală, cea mai comună din cadrul speciilor de glicosfingolipide. Această specie a avut o acuratețe în determinarea masei calculate la valoarea de 66 ppm.

Tabelul 3.8 Speciile identificate, tipului ionului și acuratețea în determinarea masei în cazul probei standard GT3

Structura calculată ca fiind specia GT3(d18:0/24:0) se află la masa de 1847.35 și a fost determinată cu o acuratețe de 87 ppm. La valoarea m/z de 1960.94 este specia GT2 (d18:1/18:2), care a avut o acuratețe de 122 ppm.

Condițiile de analiză ale spectrului au inclus o concentrație a probei de 0.7 pmol/μL, o tensiune pe chip de -0.8 kV, potențial pe contraelectrod de -57V. sub aceste valori ale tensiunilor nu s-a înregistrat semnal, iar peste aceste valori s-au observant fragmentări în sursă.

3.2.8. Trisialogangliozida GT1, ca izomer de tip b

GT1b este o gangliozidă compusă din galactoză, N-Acetil galactozamină, galactoză, glucoză, ceramidă și trei acizi sialici legați la galatoza internă. Este marker al tumorilor cerebrale, modulează diferențierea celulară și previne neurotoxicitatea glutamatului. Are rol în inhibarea mitogenezei stimulată de lectine. Este convertit în GD1b de sialidaze bacteriene și ale mamiferelor. Spectrul acestei gangliozide este prezentat în figura 3.15.

În figura de mai jos este redat spectrul de masă MS1 al fracției GT1b disponibilă comercial, izolată din creierul bovin, achiziționat în doar 30 secunde. Luând în considerare cele mai comune structuri ceramidice s-a reusit identificarea a 9 specii gangliozidice dintre care, 6 au fost specii GT1 care diferă fie prin compoziția lanțului oligozaharidic, fie prin structura porțiunii ceramidice, spre deosebire de alte metode în care numărul speciilor determinate este mult mai mic, pentru aceeași probă.

Structurile astfel determinate sunt trecute în tabelul 3.9. Totodată, starea de încărcare (tipul ionului) am determinat-o din spectru (fig. 3.15) pentru fiecare masă ce corespunde unui semnal. Atât desemnarea ionilor cât și atribuirea structurilor au fost realizate în conformitate cu măsurarea experimentală a raportului masă/sarcină, (m/z)exp.

Figura 3.15. Spectrul (-)nanoESI HCT MS1 al fracțiunii standard GT1b. Solvent: MeOH; concentrația probei 0.5 pmol/μL; timpul de achiziție 50 s; Chip ESI: -0.6 kV; potențialul pe contraelectrod:-48 V.

Acest raport l-am calculat și teoretic, (m/z)teor, valorile teoretice fiind prezentate comparativ cu cele experimentale în tabelul 3.9. Acuratețea în determinarea masei sau abaterea relativă, am calculat-o din valorile (m/z)exp și (m/z)teor, rezultatele fiind trecute în tabelul 3.9, fiind situate între 58 ppm și 164 ppm ceea ce demonstrează că rezoluția în metoda utilizată este ridicată.

Ca parametrii de achiziție a standardului GT1b am fixat o tensiune de -0.6 kV și un potențial pe contraelectrod de -48 V. Sub aceste valori s-a înregistrat o intensitate a semnalului foarte scazută, iar peste s-au observat fragmentări în sursă. Debitul de infuzie a fost de 64nl/min.

Se poate observa că cei mai abundenți ioni corespund structurilor GT1(d18:1/20:0), (d18:0/20:1) și/sau (d20:0/18:1), (d20:1/18:0) detectate la m/z 1077.16, urmate de GT1 (d18:1/18:0) și/sau (d18:0/18:1) la m/z 1063.26. Prezența a trei specii moleculare minore GT1 este documentată de semnale ionice de intensitate redusă la m/z 1049.29, 1085.29 și 1088.17, cărora pot fi atribuite după calcul structurile: GT1(d18:1/16:0) și/sau (d18:0/16:1), GT1 (d18:0/21:0) și (d18:1/22:2) și/sau GT1(d18:1/22:3).

Tabelul 3.9 Speciile identificate, tipului ionului și acuratețea în determinarea masei în cazul probei standard GT1b

Tot ca ioni de intensitate redusă au fost detectate 3 specii GT2. Speciile GT2 pot proveni fie ca și părți componente din amestecul analizat (fractia GT1 disponibilă comercial) fie ca și produși ai fragmentării în sursă, rezultați în urma ruperii unei galactoze din componentele trisialilate GT1 intacte.

În conformitate cu intensitatea semnalelor care corespund ionilor GT2, în timpul procesului de ionizare MS1 apare doar un nivel redus de fragmentare în sursă: se cunoaște că restul de Neu5Ac legat de Gal terminală ca și grup monosialo- este mai susceptibil la fragmentare; pierderea Neu5Ac legat de Gal interioară ar produce un număr mare de ioni disialo- și ioni-fragment de tipul GM1, care nu sunt detectabili în spectru. Mai mult, prezența GT2 în fracția analizată este susținută și de condițiile blânde de ionizare utilizate, de fragmentarea în sursă redusă, în legatură cu ESI bazată pe chip, precum și de apariția în spectrul MS1 a speciilor GT2 a caror prezență nu poate fi atribuită fragmentării în sursă. Deoarece spectrul MS1 din fig. 3.15 nu poate furniza informații complete despre structura moleculară, în acest stadiu al analizei pentru o anumită (m/z)teor au fost luate în considerare numai cele mai comune variante lipidice. Conform (m/z)teor determinate, toate resturile ceramidice au în compoziție o bază sfingoidă dihidroxilată și diferă între ele în funcție de compoziția acidului gras și a bazei sfingoide și prin numărul și poziția legăturilor duble (vezi tabelul 3.9, structura propusă).

3.3. Optimizarea cuplajului NanoMate HCT MS pentru probe standard de proteine

3.3.1 Standardul Citocrom C

Citocromii sunt o clasă de hemoproteine a căror funcție principală este transferul electronilor de la flavoproteine la oxigenul molecular sau la un alt acceptor de electroni. Atomul central de Fe, spre deosebire de hemoglobine, unde rămâne la valența 2 în tot timpul proceselor fiziologice, aici suferă oxidări și reduceri ciclice. Citocromii sunt compuși ai hematinei. Unii sunt implicați în lanțurile de transfer de electroni în mitocondrii, asociate cuplurilor redox Fe (II)-Fe(III). Membrii terminali ai lanțului citocromilor trebuie să aibă proprietatea de a reacționa direct cu O2, dar citocromii sunt implicați și în ciclul azotului și în reacțiile enzimatice participante la procesele de fotosinteză.

Citocromii au fost descoperiți de Mac Munn în 1886, iar Keilin, în 1925, i-a desemnat ca hemoproteine care absorb în vizibil, clasificându-i în 3 componenți distincți spectroscopic a, b, c, primul absorbând la lungimea de undă (ʎ) cea mai mare [153,154]. Tot Keilin a descoperit și citocromoxidaza, enzima care ocupă poziția finală în lanțul respirator, sensibilă la accentele inhibitorii ale CO, HCN și H2S. Din numărul mare de citocromi cunoscuți (peste cincizeci) cel mai bine studiat a fost citocromul C.

În general, chimia citocromilor este binecunoscută. Spre deosebire de Hb și hidroxiperoxidaze, citocromii nu se combină cu un anumit substrat, dar își modifică starea de oxidare a Fe. Ei sunt cei care transportă electronii între dehidrogenaze și oxigenul molecular (O2). Potențialele redox ale citocromilor din lanțul respirator variază între +0,05 și +0,29V. Citocromii sunt complecși hexacoordinați, de spin jos. La diferențierea citocromilor contribuie lanțurile peptidice. Clasificarea citocromilor se bazează pe sistemul inelului porfirinic și, în ultimă instanță, pe datele spectrale ale derivaților cu piridină. Spectrul normal este dat de citocromii a, b și c, care acoperă benzile de absorbție ale citocromilor minoritari. Datorită autooxidării, citocromii sunt greu de izolat, în afară de citocromul C [155].

Citocromul C este o proteină mitocondrială esentială în respirația celulară la om, animale, plante, fungi și chiar la bacterii. Citocromul c se găseste în concentrații mari în mușchi. El are rolul de transportor al oxigenului din fluxul sanguin la mușchi, unde O2 este utilizat în reacțiile de oxido-reducere ce transformă combustibilii în energie. Citocromii se găsesc în țesuturile vegetale și animale și se disting prin grupări prostetice notate cu a, b si c. Citocromul c este o proteină mică ce joacă un rol vital în respiratia celulară. Are o structură helicoidală, bazată pe histidină și este foarte activ in timpul producerii aerobe de energie. Contribuie la întârzierea apariției lactatului și creșterii acide în țesuturi, ceea ce favorizează producerea de energie și deci posibilitatea menținerii unei activităti fizice mai indelungate. Acest component intracelular, format din aminoacizi și fier poate crește performanța musculară, actionează ca transportor al oxigenului la mitocondrii și participă esential în lanțul metabolic ce face posibil un efort fizic prelungit [155,156].

Mitocondria celulei conține citocromul C, ce are rol în fosforilarea oxidativă. Citocromul C este considerat a fi un reprezentant tipic al citocromilor implicați în fosforilarea oxidativă și fotosintetică. Fosforilarea oxidativă este o cale metabolică ce utilizează oxidarea nutrienților pentru sinteza adenozintrifosfatului. Este un proces exergonic ce implică lanțuri transportoare de electroni. Oxigenul pe care-l respirăm este folosit pentru a genera energie în acest proces.

Nu există motiv pentru a presupune că două organisme diferite care au aceeași secvență de proteine sau chiar și secvențe similare, nu pot fi înrudite. Și în cadrul unei specii, aminoacizii pot suferi mutații, dar din punct de vedere funcțional, nu se observă modificări. De exemplu la oameni, există cel puțin 250 de mutații ale aminoacizilor cunoscute în hemoglobină, purtate de circa 3% din populație. Citocromul c este necesar vieții, și interesant este faptul că doar o treime din cei 104 aminoacizi din citogromul C sunt utilizați pentru a-i defini funcțiile. Oamenii și cimpanzeii au secvența citocromului C identică.

Secvența de aminoacizi a citocromului C din proba analizată este următoarea:

Este cel mai studiat citocrom. El se obține de obicei din țesutul mușchiului inimii de cal sau ton. Are o masă moleculară relativ mică, de aproximativ 12 kDa, fiind o proteină mică. Atomul de Fe tetracoordinează atomii de azot ai porfirinei, iar în pozițiile axiale 5 și 6, se află o grupă imidazol a histidinei și un rest al metioninei. Reacțiile redox ale citocromului c sunt corelate cu conducția de electroni prin legături ale imidazolului și ale inelului porfirinic, către atomul de sulf [156].

Din determinările structurale de cristalografie a proteinelor au rezultat câteva detalii structurale. Secvențele aminoacizilor și structurile terțiare ale citocromului izolat din diferite organisme diferă doar foarte puțin, sugerând că această proteină este foarte bătrână în termenii evoluției și că structura și compoziția ei au fost bine optimizate. Proteina se găsește în afara membranei și de aceea are o suprafață hidrofilă [156,157].

S-a urmărit găsirea parametrilor instrumentali optimi, precum: tensiunea de ionizare, potențialul contraelectrodului, presiunea gazului de injectare a probei, dar și ai parametrilor care descriu soluția, cum sunt: concentrația probei, natura solventului, pH-ul care să determine o ionizare cât mai eficientă și o reducere a posibilelor fragmentari în sursă. Întrucât este binecunoscut faptul că proteinele, peptidele și aminoacizii se ionizează eficient prin formarea de cationi, fie prin protonare, fie prin aducție de cationi ai metalelor alcaline (Na, K) experimentele s-au efectuat în tehnica ionilor pozitivi.

Proba standard de Citocrom C a fost extrasă din mușchi cardiac de cal, având o masă moleculară de aproximativ 12 300 Da, și achizitionată de la firma Sigma Aldrich. Aceasta a fost diluată într-un amestec de apă distilată cu acid formic (v:1:1), de puritate HPLC, achiziționat de la firma Merk. Diluția optimă pentru proba analizată a fost de 5 pmoli/µl. După realizarea soluției, proba a fost amestecată intr-un vortex, apoi centrifugată într-o microcentrifugă, 2000 rpm, timp de 30 de minute. Centrifugarea a fost necesară în scopul eliminării particulelor insolubile existente în standardul comercial de Citocrom C.

Soluția rezultată a fost apoi pipetată în placa de microtitrare a robotului NanoMate (Advion Biosciences), robotul a fost programat să aspire 10 mL din soluția de analiză și să injecteze acest volum, prin chip electrospray, în spectrometrul de masă cu capcană ionică de mare capacitate HCT Ultra (Bruker Daltonics). Chipul robotului, conține 400 de orificii, diametrul unui orificiu fiind de 2,5 µm. Ca urmare a infuziei în spectrometrul de masă s-au obținut mai multe spectre. Au fost optimizate tensiunile si presiunea gazului (azot), deoarece inițial, s-a folosit o tensiune prea mică pe vârful de infuzie al robotului, de 1,3 kV, și nu s-a obținut semnal. Apoi aceasta a fost crescută la 1,8kV, dar la o creștere mai mare de 1,8kV s-au observat fragmentări în sursă. Presiunea optimă a gazului de desolvatare a fost de 0,45 psi. Debitul de infuzie a probei a fost de 60 nl/min. Temperatura sursei a fost fixată la 150oC, iar presiunea gazului nebulizator la 50 psi. Pentru realizarea fragmentării ETD s-a folosit ca reagent încorporat în sursa ETD fluorantena.

Intensitatea semnalului în spectrul MS1 a fost de 107 counts/sec. Se pot observa 6 semnale corespunzătoare proteinei analizate cu număr diferit de sarcini. La m/z 745.43 Citocrom C are un număr de 17 sarcini pozitive, la m/z 790.07 acesta are 16 sarcini pozitive, la m/z 840.55 s-au calculat 15 sarcini, ionul aflat la m/z 898.51 poartă14 sarcini pozitive, la m/z 965.55 sunt 13 sarcini, iar la m/z 1020.11 sunt 12 sarcini pozitive. Numărul mare de sarcini purtate de ioni este un avantaj al utilizării infuziei prin chip ESI, astfel pot fi analizate peptide si proteine cu masă mai mare decât indică scala spectrometrului de masă.

În spectrul MS1 din figura următoare se poate observa distribuția caracteristică a semnalelor pentru o analiză a proteinelor, în acest caz fiind Citocromul C.

Figura 3.16 Spectrul NanoMate HCT MS, în modul ionilor pozitivi, al proteinei standard Citocrom C. Condiții experimentale: solvent H2O/HCOOH 50/50 (v/v); concentrația probei de 5 pmoli/µL; potențial ESI 1.80 kV; tensiune capilar: 50 V; presiunea gazului de infuzie: 0.45 psi; timp de achiziție: 10 min.

Analizând spectrul din figura 3.16 se poate observa că, semnalul cel mai intens (intensitate deosebit de mare de 1.2 x 107 counts/sec) corespunde ionului cu 15 sarcini de la m/z 824.74, aferent citocromului C. Pe lângă acest ion abundent, spectrul prezintă și un semnal relativ intens la m/z 883.60. Acest semnal, corespunde Citocromului C cu 14 sarcini. Surprinzător, la o concentrație a probei în solutie de numai 5 pmol/µL spectrul a prezentat proteina analizată cu sarcini multiple. Aceasta observație indică faptul că, pentru analiza proteinelor/peptidelor sistemul NanoMate HCT prezintă o sensibilitate de câteva ori mai mare decât sistemul de introducere clasică a probei prin capilar, fie el în regim micro- sau nano-ESI. În cazul acestor tehnici de ionizare la o concentrație de 5 pmol/µL, proba nu a putut fi detectată fiind necesară o concentrație de cel puțin 10 pmol/µL pentru a se obține un semnal cu o intensitate suficient de mare cât să permita izolarea ionului și fragmentarea sa ulterioară, prin ETD MS2.

Se poate observa că, spectrul prezintă un raport semnal/zgomot excelent și are aspectul tipic spectrelor ESI ale proteinelor, cu o distribuție gaussiană a picurilor aferente diferitelor stări de încărcare ale moleculei de Citocrom C. Condițiile optimizate aplicate au indus ionizarea eficientă a moleculei și obținerea a 6 peak-uri corespunzătoare următorilor ioni moleculari derivați din protonarea multiplă a moleculei de Citocrom C: [M+17H+]17+, [M+16H+]16+, [M+15H+]15+, [M+14H+]14+, [M+13H+]13+ și [M+12H+]12+. Determinarea stărilor de încărcare (notate în figura 3.16) din rapoartele m/z, ce corespund aceleiași mase m, precum și deducerea din valorile m/z și din stările de încărcare a masei moleculare a proteinei, s-a realizat cu ajutorul programului de deconvoluție din softul Data Analysis al spectrometrului HCT MS. Din spectrul obținut, prin deconvoluție programul a calculat o masă experimentală determinată de 12384.25 Da. Aceasta valoare experimentală situează acuratețea în determinarea masei la o valoare de sub 80 ppm, ceea ce reprezintă o precizie deosebit de bună pentru un instrument de tip capcană ionică.

În vederea testării posibilității de a realiza analiza structurală, prin fragmentarea ionului, utilizând disocierile prin transfer de electroni, ionul corespunzător citocromului C cu 16 sarcini, detectat la m/z 790.07, a fost izolat. Pentru aceasta s-a aplicat o tensiune de izolare într-o fereastră de 2u, în capcana ionică, și apoi a fost supus disocierii prin tranfer de electroni (ETD MS2), folosind florantena drept reagent.

Tabelul 3.10 Speciile identificate, tipului ionului și acuratețea în determinarea masei în cazul probei de Citocrom C

În figura următoare este prezentat spectrul de fragmentare prin ETD a ionului de la m/z 790.07. Zona ilustrată în figura 3.17 corespunde intervalului m/z 210-400. Timpul de interacțiune cu fluorantena a fost variat, de la 20 msec la 100 msec, timpul otim fiind cel de 50 msec. La alte valori ale acestuia molecula fie nu s-a fragmentat, fie nu s-a înregistrat semnal.

Din analiza spectrului ETD rezultă că, a avut loc o fragmentare deosebit de eficientă, cu formarea unui mare număr de ioni fragment de tip c și z, specifici clivării legăturii N-Cα, care apare prin ETD.

Figura 3.17. Spectrul NanoMate HCT ETD MS2, în modul ionilor pozitivi, al Citocromului C. Condiții experimentale: solvent H2O/HCOOH 50/50 (v/v); concentrația probei de 5 pmol/µL; potențial ESI 1.80 kV; tensiune capilar: 50 V; presiunea gazului de infuzie: 0.45 psi; timp de achiziție: 10 min. Fragmentare la amplitudinea semnalului de RF de 0.5, interval m/z 210-400

La m/z 214.42 se poate observa ionul c8 cu 4 sarcini. Acesta corespunde secvenței de aminoacizi formată din GDVEKGKK (glicină-acid aspartic-valină-acid glutamic-lizină-glicină-lizină-lizină). La m/z 220.41 este ionul fragment z22 cu 12 sarcini, corespunzător fracțiunii terminale AGIKKKTE REDLIAYLKK ATNE. 227.48, a fost desemnat ca fiind c12 cu 6 sarcini, structura acestuia reprezentându-se astfel GDVEKGKKIF VQKCAQCHTV EK.

La m/z 232.64, 243.52, 256.57, 271.60 și 276.95 sunt ionii: z126+, z22+, z19/c87+, c3+ și z125+ cu structurile: DLIAYLKK ATNE, NE, KK, GDV și DLIAYLKK ATNE. La m/z 285.87, 304.45, 324.22, 369.65 și 393.83 se află ionii z3314+, c4015+, c3211+, z20/c87+ și c216+ cu structurile aferente de aminoacizi, și anume: KKYIPGTKM IFAGIKKKTE REDLIAYLKK ATNE, GDVEKGKKIF VQKCAQCHTV EK GGKHKTGP NLHGLFGRKT, GDVEKGKKIF VQKCAQCHTV EKGGKHKTGP NL, IKK și GDVEKGKKIF VQKCAQCHTV E.

Semnalul cel mai abundent a fost înregistrat la valoarea de 8×104 counts/sec și este corespunzător m/z 227.48, o abundență relativ mare o are si ionul aflat la m/z 276.95.

În figura următoare este prezentat același spectru de fragmentare ETD, dar la un interval diferit și anume m/z situat între 400 și 580.

Figura 3.18 Spectrul NanoMate HCT ETD MS2, în modul ionilor pozitivi, al Citocromului C. Condiții experimentale: solvent H2O/HCOOH 50/50 (v/v); concentrația probei de 5 pmol/µL; potențial ESI 1.80 kV; tensiune capilar: 50 V; presiunea gazului de infuzie: 0.45 psi; timp de achiziție: 10 min. Interval m/z 400-580.

În figura 3.18 se poate observa un număr de 8 ioni fragment, aceasta este doar o parte din întregul spectru de fragmentare, adică intervalul m/z situat între 400 și 580. La m/z 400.17 se poate vedea ionul c4 monoprotonat, care are o secvență compusă din aminoacizii: GDVE (glicină-acid aspartic-valină-acid glutamic). La m/z 415.19 și 447.32 sunt ionii fragment z4+ și z236+, care corespund aminoacizilor: ATNE și FAGIKKKTE REDLIAYLKK ATNE.

La m/z 462.87 este ionul fragment c34 cu 8 sarcini pozitive, acesta are intensitatea cea mai mare din intervalul ilustrat în figura 8 si anume 4×104 counts/sec. La m/z 478.49 este ionul c266+ cu secvența de aminoacizi GDVEKGKKIF VQKCAQCHTV EKGGKH. La m/z 519.25, 538.21 și 551.23 sunt ionii z6615+, c398+ și z143+, care au următoarele secvențe de aminoacizi: KT GQAPGFTYTD ANKNKGITWK EETLMEYLEN PKKYIPGTKM IFAGIKKKTE REDLIAYLKK ATNE, GDVEKGKKIF VQKCAQCHTV EKGGKHKTGP NLHGLFGRK și REDLIAYLKK ATNE.

În figura următoare se poate observa spectrul ETD cu intervalul m/z cuprins între 580 și 1000. În spectrul din figura 3.19 este prezentat un număr de 17 ioni rezultați în urma fragmentării ETD. Semnalul cel mai intens, de 2500 counts/second, este prezent la m/z 612.47, acesta este ionul c346+ care are următoarea structură de aminoacizi: GDVEKGKKIF VQKCAQCHTV EKGGKHKTGP NLHG.

Figura 3.19 Spectrul NanoMate HCT ETD MS2, în modul ionilor pozitivi, al Citocromului C. Condiții experimentale: solvent H2O/HCOOH 50/50 (v/v); concentrația probei de 5 pmol/µL; potențial ESI 1.80 kV; tensiune capilar: 50 V; presiunea gazului de infuzie: 0.45 psi; timp de achiziție: 10 min. Fragmentare la amplitudinea semnalului de RF de 0.5, interval m/z 580-1000.

Următorul ca intensitate, la 2300 counts/second, este m/z 627.12, care a fost calculat ca fiind ionul c407+ cu structura de aminoacizi GDVEKGKKIF VQKCAQCHTV EKGGKHKTGP NLHGLFGRKT. La m/z 593.87, 671.24, 687.62 și 698.47 sunt ionii c499+, z6+, z5810+ și c589+ cu următorii aminoacizi: GDVEKGKKIF VQKCAQCHTV EKGGKHKTGP NLHGLFGRKT GQAPGFTYT, KK ATNE, TYTD ANKNKGITWK EETLMEYLEN PKKYIPGTKM IFAGIKKKTE REDLIAYLKK ATNE și GDVEKGKKIF VQKCAQCHTV EKGGKHKTGP NLHGLFGRKT GQAPGFTYTD ANKNKGIT. La m/z 741.50, 759.17, 774.64, 812.85, 828.36 și 889.36 sunt ionii fragment z7011+, z7211+, c7511+, c213+, z42+ și z699+ cu următoarele secvențe de aminoacizi: LFGRKT GQAPGFTYTD ANKNKGITWK EETLMEYLEN PKKYIPGTKM IFAGIKKKTE REDLIAYLKK ATNE, HGLFGRKT GQAPGFTYTD ANKNKGITWK EETLMEYLEN PKKYIPGTKM IFAGIKKKTE REDLIAYLKK ATNE, GDVEKGKKIF VQKCAQCHTV EKGGKHKTGP NLHGLFGRKT GQAPGFTYTD ANKNKGITWK EETLMEYLEN PKKYI, GDVEKGKKIF VQKCAQCHTV E, ATNE și FTYTD ANKNKGITWK EETLMEYLEN PKKYIPGTKM IFAGIKKKTE REDLIAYLKK ATNE.

Cel de-al doilea ion fragmentat este la m/z 840.55, a cărui spectru e fragmentare ETD este ilustrat în figura 13. Se pot observa în acest spectru un număr de 19 ioni fragment, calculați și desemnați în conformitate cu regulile de fragmentare ale ETD și a nomenclaturii postulată pentru acest tip de fragmentare [121].

Semnalul cel mai intens, aică 5×105, este la m/z 227.46, acesta fiind ionul c12 cu 6 sarcini pozitive. Următorul semnal, ca intensitate, adica 3×105, este la m/z 462.82, acesta fiind ionul c34 cu 8 sarcini pozitive.

Ionii aflați la m/z 214.42, 220.46, 227.46, 232.51 și 243.51 au fost calculați ca fiind c84+, z2212+, c126+, z126+, z2+, aceștia au ca structuri de aminoacizi constituenți următoarele secvențe: GDVEKGKK (glicină-acid aspartic-valină-acid glutamic-lizină-glicină-lizină-lizină), AGIKKKTE REDLIAYLKK ATNE, GDVEKGKKIF VQKCAQCHTV EK, DLIAYLKK ATNE și NE.

Figura 3.20 Spectrul NanoMate HCT ETD MS2, în modul ionilor pozitivi, al Citocromului C. Condiții experimentale: solvent H2O/HCOOH 50/50 (v/v); concentrația probei de 5 pmol/µL; potențial ESI 1.80 kV; tensiune capilar: 50 V; presiunea gazului de infuzie: 0.45 psi; timp de achiziție: 10 min. Ionul fragmentat 790.07.

La m/z 271.59, 276.98, 304.68, 324.51, 369.46 și 393.82 sunt ionii c3+, z125+, c4015+, c3211+, z258+, c216+, care corespund structurilor: IKK, GDVEKGKKIF VQKCAQCHTV E, GDVEKGKKIF VQKCAQCHTV EK GGKHKTGP NLHGLFGRKT, GDVEKGKKIF VQKCAQCHTV EKGGKHKTGP NL, M IFAGIKKKTE REDLIAYLKK ATNE și GDVEKGKKIF VQKCAQCHTV E. La m/z 447.37, 462.82, 478.45 și 519.35 sunt ionii z236+, c348+, c266+ și z6615+, aceștia corespund secvențelor de aminoacizi: FAGIKKKTE REDLIAYLKK ATNE, GDVEKGKKIF VQKCAQCHTV EKGGKHKTGP NLHG, GDVEKGKKIF VQKCAQCHTV EKGGKH și KT GQAPGFTYTD ANKNKGITWK EETLMEYLEN PKKYIPGTKM IFAGIKKKTE REDLIAYLKK ATNE. La m/z 538.29, 551.27, 612.42 și 627.19 putem observa ionii c398+, z143+, c346+ și c407+, secvențele corespunzătoare de aminoacizi ai acestor ioni sunt: GDVEKGKKIF VQKCAQCHTV EK GGKHKTGP NLHGLFGRK, REDLIAYLKK ATNE, GDVEKGKKIF VQKCAQCHTV EK GGKHKTGP NLHG și GDVEKGKKIF VQKCAQCHTV EK GGKHKTGP NLHGLFGRKT.

Ȋn concluzie se poate observa o acoperire a secvenței de aminoacizi de 64%, aceasta a fost realizată ȋntr-un experiment top-down ETD. S-a dezvoltat și optimizat tehnica de fragmentare ETD. Apoi s-a aplicat pe o proteină standard mica, Citocrom C, care este o proteină cu 104 aminoacizi și o masa moleculară de aproximativ 12384 Da.

Cu ani în urmă se folosea curent metoda bottom-up, în care proteina intactă este supusă reacției de digestie prin enzime specifice. Amestecul de peptide e ulterior analizat prin spectrometrie de masă. Bottom-up are mai multe dezavantajele și anume, lipsa informațiilor privind concentrația probei, este o procedură laborioasă care presupune mai multe etape, și anume incubarea, purificarea, interacția enzimatică și apoi extracția enzimelor din probă, ȋn care se mai găsesc și proteine nedigestionate.

Metoda top-down are avantaje net superioare față de celelalte metode. Noi am perfecționat și optimizat această metodă prin experimentele chip-ETD HCT MS descrise ȋn cadrul acestui capitol.

3.3. Concluzii parțiale

• În cadrul acestui capitol am realizat și implementat pentu prima dată in studii de glicomică, cuplajul dintre ionizarea prin chip electrospray complet automată, utilizând un robot NanoMate și un spectrometru de masă. Instrumentul cu care s-a realizat interfațarea robotului NanoMate este un spectrometru de tip capcană ionică de mare capacitate (HCT MS) în care ionii se separă în funcție de raportul m/z pe baza oscilațiilor în câmp de radiofrecvență. Instrumentul are o viteză de scanare deosebit de ridicată, o sensibilitate mult superioară altor spectrometre și realizează stagii multiple de fragmentare (MSn) ceea ce pentru analize structurale compensează rezoluția și acuratețea mai reduse.

• Platforma analitică a demonstrat performanțe superioare în comparație cu metodele tradiționale de infuzie bazate pe capilare. Avantajul cel mai important derivă din aceea că se realizează o viteză de lucru mult marită prin automatizarea/robotizarea manipulării probei și a infuzării acesteia, semnalul stabil de electrospray în interval de timp îndelungat, reproductibil și totodată de intensitate constantă și, mai ales, o eficiență a ionizării foarte ridicată ceea ce permite detectarea speciilor minore care foarte des reprezintă biomarkeri relevanți și nu ar putea fi detectate/identificate prin nici o alta metoda analitica. Un alt avantaj major al tehnologiei MS bazate pe chip a fost senzitivitatea superioară a experimentului de până la 102 ori în unele cazuri, în comparație cu micro- și nanospray, reprezentată prin cantități sub-picomolare de probă necesare pentru o investigare structurală completă a extractelor biologice complexe.

• Platforma bazată pe chip ESI a fost optimizată, testată și aplicată pe probe standard de gangliozide în scopul verificării fezabilitătii ei precum și pentru elaborarea diverselor protocoale în scopul abordării adecvate (screening și identificare compozițională și structurală în detaliu) a cât mai multor tipuri de biomolecule.

• Sistemul NanoMate-HCT MS, o premieră în lume, a fost succesiv optimizat pentru funcționarea în tehnica de detecție a ionilor negativi, în combinație cu tehnica de fragmentare a disocierii induse prin ciocnire CID (collision induced dissociation) precum și pentru tehnica disocierii prin transfer de electroni (ETD).

• Rezultatele pe care le-am obținut au dovedit că acest sistem este capabil de generarea spectrelor de masă de calitate superioară, cu o eficiență a ionizării, viteză și sensibilitate mult mărite comparativ cu tehnicile de analiză, ionizare și detecție existente pâna în prezent.

CAPITOLUL 4

APLICAȚII ÎN BIOMEDICINĂ A SPECTROMETRIEI DE MASĂ CU CAPCANĂ IONICĂ ȘI FRAGMENTĂRI ÎN CÂMP DE RADIOFRECVENȚĂ

4.1 Studiul comparativ al gangliozidelor din anencefalie vs. lob fetal frontal sănătos

Diversitatea structurală a glicoconjugaților în țesuturi și celule este determinată de complexitatea foarte mare a compoziției lor precum și de specificitatea tisulară a acestor compoziții. Pentru a elucida structura unei anume specii de glicoconjugați implicată într-un anume proces fiziologic sau patologic este necesară o foarte precisă și detaliată analiză structurală. În ultimii ani, prin metode bazate pe electroforeză capilară și pe gel (1 și 2 –dimensională), cromatografie lichidă, cromatografie pe strat subțire (TLC) cât și prin metode imunochimice și imunohistochimice [158] a fost demonstrată diferența în compozitia și cantitatea glicoconjugaților din diferitele matrici umane, precum și distribuirea lor la suprafața celulelor și în spațiul extracelular. Rezultatele experimentale obținute cu tehnicile enumerate mai sus, sunt însă bazate numai pe comparații și oferă date numai asupra componentelor majore prezente în amestecurile native complexe. Acest neajuns a fost atribuit atât sensibilității reduse a metodelor implicate până acum în analiza compusilor glicoconjugați cât și a posibilităților lor de detecție, limitată numai la caracterizarea structurală a speciilor majore din diferitele matrici umane. Elucidarea structurală a speciilor individuale de glicoconjugați în amestecurile complexe extrase din matrici umane (țesuturi, fluide ale corpului etc) reprezintă o cerință fundamentală pentru determinarea compoziției lor în regiuni specifice și pentru corelarea specificitații acestor structuri cu funcția specializată a fiecărei matrice umană, în condiții de subiect sănătos și bolnav.

Pentru a defini și înțelege interelația structură-funcție a fiecărei entități structurale de glicoconjugați, implicată într-un anume proces fiziologic/patologic, și pentru a îmbunătăți potențialul lor terapeutic și de diagnostic, în deceniul trecut spectrometria de masă cu ionizare prin electrospray a fost aplicată pentru analize la sensibilități de ordin picomolar. În prezent însă, sunt necesare noi platforme spectrometrice de masă pentru a permite analize care să ofere date privitoare la complexitatea structurală ridicată a glicoconjugaților [159-176].

Defectele de tub neural (anencefalia, spina bifida deschisă și encefalocelul) sunt un grup heterogen de malformații congenitale decurgând dintr-un eșec de fuziune a tubului neural. Acestea apar cu o incidență de aproximativ 1 caz la 1.000 de nașteri vii. Acest defect este reprezentat de un orificiu în maduva spinării sau creier care apare timpuriu în dezvoltarea embionară. În a 3-a saptamână de gestație – care poartă numele de gastrulație, celulele specializate de pe fața dorsală a fetusului încep să fuzioneze și să formeze tubul neural. Când acest tub nu se închide complet se dezvoltă un defect de tub neural. Defectele de tub neural apar datorită unui defect al procesului de neurulație, deoarece neuroporii anterior și posterior se închid ultimii sunt cei mai vulnerabili la deficiențe [177,178].

Există doua tipuri de defecte de tub neural: cele deschise, fiind mai frecvente și închise. Cele deschise apar când creierul și/sau măduva spinării sunt expuse la naștere printr-un defect al craniului sau vertebrelor. Exemplele de defecte de tub neural deshise cuprind: anencefalia, encefalocelul, hidrancefalia, iniencefalia, schizencefalia și spina bifida. Tipurile rare de defecte de tub neural sunt cele închise sau acoperite de piele. Exemplele cuprind lipomielomeningocelul și lipomeningocelul [179].

Acidul folic (vitamina B9) și vitamina B12 sunt foarte importante în reducerea incidenței defectelor de tub neural. S-a sugerat că embrionul uman este în mod particular sensibil la deficitul de folat datorită diferențelor enzimelor funcționale în acest stadiu al embriogenezei. Totuși, un deficit izolat de folat nu determină aceste anomalii, iar deficitul de vitamina B12 participă de asemenea [179,180].

Figura 4.1 Fetus care manifestă malformatia congenitală numită anencefalie, se poate observa nevroglia (formată din oligodendrocite si asterocite) care nu este acoperită de oase craniene respectiv scalp, precum și lipsa encefalului

Rata de supraviețuire, gradul handicapului și coeficientul de inteligență al copilului cu spina bifidă sau encefalocel variază cu localizarea și severitatea leziunii și cu tratamentul aplicat. Incidența estimată a defectelor de tub neural este de 1/1300 nou-nascuți vii [181].

Testele pentru defecte de tub neural cuprind examenul ecografic și măsurarea alfa-proteinei serice materne. Adesea aceste defecte sunt aparente la naștere, dar defectele oculte pot să nu fie diagnosticate decât foarte târziu. Un nivel ridicat al alfa-proteinei serice materne la 16-18 saptamini de gestație este un bun predictor pentru defectele de tub neural [182].

Tratamentul depinde de severitatea complicațiilor. Nu există un tratament disponibil pentru anencefalie, deoarece copiii nu supraviețuiesc mai mult de câteva ore.

În cazul anencefaliei fătul prezintă un rest de insule gliale în locul emisferelor cerebrale, iar oasele superioare ale scalpului lipsesc. Anencefalia este aproape întotdeauna fatală la sau în cateva ore de la naștere.

Probele de țesut anencefalic au fost recoltate la Universitatea de Medicină din Zagreb, iar prelucrarea lor s-a realizat în aceeași locație. Pentru control, a fost utilizat un eșantion de cortex frontal provenit dintr-un creier al unui fetus sanatos care a decedat printr-un avort accidental. Țesuturile au fost caracterizate morfoanatomic si histopatologic la Universitatea din Zagreb, iar materialul cu care a venit in contact grupul nostru a fost reprezentat exclusiv prin extrase de glicosfingolipide. Analiza morfoanatomică si histopatologică a aratat că creierul folosit drept control nu avea nici o afectiune si era dezvoltat normal pentru varsta respectivă. Proba a fost disecată pentru a servi ca și control; creierul a fost obținut de la departamentul de Medicină Legală, Facultatea de Medicină, Universitatea din Zagreb, Croația. Probele de țesut folosite pentru analiza biochimică au fost cântărite și stocate la -200C. Toate experimentele cu tesut uman au fost efectuate in conformitate cu normele de etica stabilite prin Declarația Asociației Mondiale Medicale de la Helsinki, revizuita la Edinburgh in anul 2000.

Extracția gangliozidelor a fost efectuată conform metodei Svennerholm și Fredman modificată în laboratorul nostru. Probele de țesut au fost cântărite și omogenizate în apă distilată înghețată pentru obținerea a 10% omogenat. Lipidele au fost extrase de două ori folosind un amestec de solvenți cloroform:metanol (1:2 raport volumetric) urmată de partiția și repartiția prin adăugare de cloroform, metanol și apă la un raport volumetric final 1:1:0.8. Faza superioară conținând glicosfingolipide polare (gangliozide) a fost colectată. Extractul de gangliozide uscat a fost în final purificat prin dializă (peste noapte, la 400C) și folosit pentru analiza calitativă și cantitativă a gangliozidelor.

Pentru analiza MS, soluția stoc de gangliozide a fost preparată prin dizolvarea materialului uscat în metanol pentru a fi stocat la -270C. Diluția soluției stoc cu metanol pur a fost efectuată în scopul de a obține probele uscate la concentrații brute estimate de aproximativ 5 pmol/µL (calculată pentru o masă moleculară medie de 2000 g/mol) pentru experimentele cu nanoESI HCT MS cu chip. În vederea eliminării posibilității de blocare a orificiilor extrem de înguste ale microchipurilor de siliciu, toate soluțiile au fost centrifugate 1h. Probele cu conținut ridicat de săruri au fost desalifiate prin dializa (4 zile) în 5 mM acetat de amoniu la 40ᵒC.

4.1.1 Screening comparativ prin NanoMate HCT MS1

Extrasele de gangliozide native din țesutul de anencefalie (notat ANC) și din lob frontal normal (notat FL) au fost supuse analizei prin NanoMate HCT MS în condiții identice cu privire la parametri instrumentali și cei ai soluției de analizat. Atribuirile ionilor precum și postularea structurilor a fost realizată pe baza evidențelor acumulate în studiile noastre anterioare, a criteriilor căilor de biosinteză coroborate cu informațiile asupra maselor moleculare derivate din calcul exact al valorilor m/z aferente peak-urilor din figuri.

După cum se poate observa din analiza spectrelor rezultate, ambele probe sunt extrem de complexe și conțin nu numai un mare număr de glicoforme dar și o neașteptată diversitate a porțiunii ceramidice pentru anumite specii de gangliozide.

Figura 4.2 Spectrul (-) nanoESI chip HCT MS1 al amestecului nativ de GG din țesutul de ramașiță anencefalică (proba ANC). Solvent: MeOH; Concentrația probei 5 pmol/μL

(calculată pentru o masă moleculară medie de 2000 g/mol); Timp de achiziție a semnalului 10 min; Potențialul Chip ESI: -0.8 kV; Potențialul pe capilar: -50 V. Timp maxim acumulare ioni în capcana: 500 ms. Presiune azot: 0.6 p.s.i.

Figura 4.3 Spectrul (-) nanoESI chip HCT MS1 al amestecului nativ de GG din țesutul normal lob frontal (proba FL). Solvent: MeOH; Concentrația probei 5 pmol/μL (calculată pentru o masă moleculară medie de 2000 g/mol); Timp de achiziție a semnalului 10 min; Potențialul Chip ESI: -0.8 kV; Potențialul pe capilar: -50 V. Timp maxim acumulare ioni

în capcană: 500 ms. Presiune azot: 0.6 p.s.i.

Tabel 4.1. Desemnarea ionilor din proba ANC

Tabel 4.2. Desemnarea ionilor din proba FL

Intrebat EA

Tabel 4.3. Sistematizarea comparativă a structurilor identificate în ANC și FL

d- bază sfingoidă dihidroxilată

+ structura a fost detectată

– structura nu a fost detectată

Dupa cum rezultă din analiza atentă a spectrelor și tabelelor condițiile nanoESI chip HCT MS optimizate au permis formarea simultană a ionilor dublu și simplu încărcați, au favorizat ionizarea lanțurilor lungi polisialilate de tip GT și GQ, au indus o ionizare/detecție excelentă a speciilor minore existente în amestecul complex și au împiedicat fragmentarea nespecifică și necontrolată în sursă a modificarilor labile de tip carbohidrat și ne-carbohidrat precum acidul sialic Neu5Ac si gruparea acetil O-Ac.

Prin metoda nanoESI chip HCT MS au putut fi identificate 31 specii distincte în proba ANC și 53, din care 5 O-acetilate și 3 asialilate, în proba FL. Aceste rezultate indică faptul că în studiile noastre anterioare efectuate asupra probei FL numai pe baza cromatografiei pe strat subtire (HPTLC) fiecare bandă de migrare conținea de fapt mai multe specii ce au putut fi discriminate numai prin metoda de față bazată pe ionizare prin chip electrospray și detecție prin HCT MS.

O caracteristică comună a celor două probe o reprezintă expresia lanțurilor scurte, în particular a celor cu conținut scăzut de acid sialic. Astfel, speciile GD3 (d18:1/18:0), GD2 (d18:1/18:0), GM1 (d18:1/18:0) și izomerii lor au fost detecțati in ambele amestecuri de gangliozide ANC si FL ca ioni monoîncărcați sau dublu deprotonați de o abundență redusă similară.

Examinarea spectrelor din figurile 4.2 și 4.3 relevă de asemenea o diferență clară în ceea ce privește expresia gangliozidelor în proba ANC față de proba control FL. În ANC GT1 (d18:1/18:0) detectat ca ion [M-2H]2- la m/z 1063.41, urmat de GD1 (d18:1/18:0) detectat ca ion [M-2H]2- la m/z 917.55 și [M+Na-2H]- la m/z 1857.70 sunt speciile cele mai abundente în timp ce pentru proba FL distribuția abundențelor relative este inversată.

Un aspect notabil este acela că deși în ambele probe structurile dominante sunt mono-, di- și trisialotetraozele, anumite structuri din ANC apar clar asociate tumorii. Astfel, în condiții absolut identice de masură abundența ionilor corespunzând componenților polisialilați GT și GQ apare complet diferită pentru cele două probe. GT1 este mai bine exprimat in ANC decât în FL în timp ce GQ1 și GQ2 deși vizibile în ANC se află sub limita de detecție în FL care este în fond dominat de structuri de tip GM3.

Mai mult, 3 ioni monodeprotonați la m/z 1037.51, 1165.90 și 1252.17 detectați în proba FL au putut fi atribuiți speciilor asialo de gangliozide având compozițiile HexNAcHex2Cer(d16:0/16:0), HexNAcHex2Cer(d18:0/22:0) și HexHexNAcHex2Cer (d18:1/18:0). Aceste specii și nici alte variante complet desialilate nu au putut fi detectate în proba ANC. Interpretarea acestor rezultate se poate face ținând cont de descoperirile noastre atenrioare, conform cărora există o directă corelare între gradul de sialilare și tipul țesutului. Grade ridicate de sialilare sunt specifice țesuturilor aberante în stadii incipiente de dezvoltare precum ANC în timp ce sialilarea scazută sau chiar asialilarea este caracteristică unei organizări superioare de tipul țesutului FL normal. În consecință prezența structurilor polisialilate în ANC și absența lor în FL respectiv prezența celor asialo constituie marker al dezvoltării aberante în cazul țesutului ANC.

Spectrele celor două probe relevă și prezența unor modificări periferice labile ale lanțurilor de oligozaharide din gangliozide. Aceste modificări sunt acetilările de tip O prin unitatea O-Ac. Aceste structuri sunt și ele marker al dezvoltării tumorale. În timp ce cinci specii O-acetilate GM3 au fost detectate în FL, numai două prezentând lanț lipidic de tip (d18:1/20:0) și (d18:0/22:0) au fost detectate în ANC.

4.1.2 Analiza structurală, detaliata prin NanoMate chip ESI HCT stagii multiple de fragmentare CID, a speciilor GD1; GT1 asociate anencefaliei

MS/MS GD1(d18:1/18:0)

1063 > 1836 > 1545

In primele 2 spectre de fragmentare se pierde cate un acid sialic, astfel putem spune ca avem un bottom –up al restului zaharidic apoi in MS4 se ajunge la fragmentarea…….

MS3 al ionului cu m/z 1835.78

Figura … MS4 al ionului cu m/z 1544.98

CAPITOLUL 5

CONCLUZII GENERALE

1. În cadrul acestei teze de doctorat am realizat și implementat pentu prima dată în studii de glicomică, cuplajul dintre ionizarea prin chip electrospray complet automată, utilizând un robot NanoMate și un spectrometru de masă. Intrumentul cu care s-a realizat interfațarea robotului NanoMate este un spectrometru de tip capcană ionică de mare capacitate (HCT MS) în care ionii se separă în funcție de raportul m/z pe baza oscilațiilor în câmp de radiofrecvență. Instrumentul are o viteză de scanare deosebit de ridicată, o sensibilitate mult superioară altor spectrometre și realizează stagii multiple de fragmentare (MSn) ceea ce pentru analize structurale compensează rezoluția și acuratețea mai reduse.

2. Cuplajul a presupus construirea de către noi a unei interfețe întrucat acesta fiind prima cuplare dintre un asemenea instrument și robotul NanoMate o interfață comercială nu a fost concepută. După ce am realizat cuplajului fizic dintre aparate, a fost necesară optimizarea parametrilor funcționali ai celor două dispozitive pentru a permite lucrul în regim cuplat.

3. Platforma analitică și-a dovedit calitățile și succesul deosebit în comparație cu metodele tradiționale de infuzie bazate pe electrospray cu capilar. Viteza de lucru mult mărită, robotizarea/automatizarea manipulării probelor și infuzării acestora, semnalul stabil, de intensitate constantă, reproductibil și îndelungat al electrospray-ului și, mai ales, o eficiență a ionizarii foarte ridicată, ceea ce permite detectarea speciilor minore care foarte des reprezintă biomarkeri relevanți și nu ar putea fi detectate/identificate prin nici o altă metodă analitică, reprezintă avantaje majore ale acestei tehnici inovative. Un alt avantaj major al tehnologiei MS bazate pe chip a fost sensitivitatea superioară a experimentului de până la 102 ori în unele cazuri, în comparație cu micro- și nanospray, reprezentată prin cantități sub-picomolare de probă necesare pentru o investigare structurală completă a extractelor biologice complexe.

4. Platforma bazată pe chip ESI a fost optimizată, aplicată și testată pe o varietate largă de compuși biologici în scopul elaborării protocoalelor adecvate pentru permiterea abordării (screening și identificare compozițională și structurală în detaliu) a cât mai multor tipuri de biomolecule, precum și a verificării fezabilității acesteia.

5. Sistemul NanoMate-HCT MS, o premieră în lume, a fost succesiv optimizat de către noi atât pentru funcționarea în positive ion mode (tehnica de detecție a ionilor pozitivi) cât și în negative ion mode (tehnica de detecție a ionilor negativi), în combinație cu CID (collision induced dissociation) și ETD (electron transfer dissociation).

6. Rezultatele pe care le-am obținut au dovedit că platforma este capabilă să genereze spectre de masă de ȋnaltă rezoluție și calitate superioară, cu o eficiență a ionizarii, viteză și sensibilitate mult mărite comparativ cu tehnicile de analiză, detecție și ionizare existente până în prezent.

7. Un important avantaj al implementării și optimizării tehnologiei bazate pe chip în spectrometria de masă a gangliozidelor o reprezintă sensibilitatea foarte ridicată a analizei, tradusă prin cantitătți sub-picomolare de probă necesare pentru o analiză structurală completă. Acest aspect este de o mare importanță pentru aplicabilitatea acestei metode în investigațiile clinice, dată fiind cantitatea redusă de probă ce se poate obține în general din matricile biologice și care, prin procedee chimice sofisticate de extracție și purificare, se diminuează extrem de mult pâna când ajunge în faza de a fi investigată printr-o tehnică analitică.

8. Rezultatele obținute au demonstrat că sistemul este potrivit pentru generarea masuratorilor de analiză structurală și compozițională de calitate superioară față de alte metode de analiză, cu o eficiență a ionizării și o sensibilitate mult mai ridicate comparativ cu alte tipuri de infuzie existente la ora actuală.

9. Prin noua tehnică de spectrometrie de masă cu ionizare prin chip electrospray și stagii de fragmentare multiplă am realizat o caracterizare detaliată a compoziției gangliozidelor anencefaliei și a structurii unui biomarker asociat acestei malformații.

10. Caracterul inovator al studiului este sprijinit și de faptul că analiza „state-of-the-art” care arată că până acum spectrometria de masă nu a fost implicată în analiza gangliozidelor din anencefalie. Din acest motiv a apărut absolut necesară optimizarea uneia din cele mai moderne metode spectrometrice pentru o analiză riguroasă, comparativă a expresiei și structurii gangliozidelor din anencefalie și dintr-un lob frontal fetal sănătos.

11. În lucrarea de față, tot pentru prima dată, este implicată metoda de fragmentare prin disocieri induse prin ciocnire cu stagii multiple de fragmentare. Condițiile nanoESI chip HCT MS optimizate au permis ionizarea lanțurilor lungi, polisialilate de tip GT și GQ. Mai mult, metoda și-a demonstrat capabilitatea de a detecta compuși minori în amestecul complex și de a preveni ruperea în sursă a unor modificări labile precum O-acetilarea și sialilarea. S-au putut detecta pentru prima dată 31 de componente în proba ANC față de 53 în FL.

12. Analizele comparative pe care le-am realizat au demonstrat o diferență clară în expresia gangliozidelor în cele două tipuri (aberant și sănătos) de țesuturi. S-a putut totodată observa că spre deosebire de FL, în ANC speciile dominante sunt GT1 (d18:1/18:0), urmat de GD1 (d18:1/18:0), adică specii di- si trisialilate extrem de abundente. Mai mult, speciile de tip GQ1 și GQ2 deși detectabile în ANC, s-au găsit sub limita de detecție în FL în care s-au putut în schimb detecta 4 ioni atribuibili speciilor desialilate HexNAcHex2 și HexHexNAcHex2. Aceasta atesată o corelare directă între gradul de sialilare și acetilare și prezența malformației cu atât mai mult cu cât 5 specii O-acetilate de tip GM3 au fost detectate în FL în timp ce numai 2 au fost identificate în ANC.

13. Fezabilitatea metodei chip- nanoESI HCT cu stagii multiple de fragmentare prin CID MSn pentru caracterizarea structurală detaliată a speciilor asociate anencefaliei a fost testată de către noi prin analiza biomarkerului GT1 (d18:1/18:0) al ANC. Spectrele obținute în condiții optimizate de amplitudine de excitare variabilă a ionului precursor au oferit date structurale extrem de clare care atestă pentru prima dată prezența în anencefalie a izomerului de tip GT1b fără a fi nevoie de nici o altă metodă analitică de confirmare.

14. Acest studiu reprezintă prima analiză comparativă prin spectrometrie de masă de înaltă performanță bazată pe chip electrospray și tandem MS a expresiei și structurii gangliozidelor în anencefalie față de expresia gangliozidelor în țesut sănătos.

Rezultatele demonstrează superioritatea metodei dezvoltate și optimizate în acest studiu, dovedită prin sensibilitatea net superioară, posibilitatea de detectare a componentelor minore, reproductibilitatea ridicată, esențială în analize comparative și posibilitatea de a realiza un studiu structural detaliat prin fragmentarea moleculelor prin stagii multiple de disociere în tandem MS temporal.

Contribuții originale în domeniul tezei

Studiile efectuate în cadrul tezei de doctorat au urmărit în principal, atât aspecte teoretice cât și aplicative referitoare atât la cuplajul spectrometrului de masă de mare capacitate cu robotul de infuzie automată a probelor, cât și la optimizarea acestuia. Principalele rezultate obținute din studiul efectuat, sunt după cum urmează:

Am realizat și implementat pentu prima dată în studii de glicomică, cuplajul dintre ionizarea prin chip electrospray complet automată, utilizând un robot NanoMate și un spectrometru de masă. Intrumentul cu care s-a realizat interfațarea robotului NanoMate este un spectrometru de tip capcană ionică de mare capacitate (HCT MS) în care ionii se separă în funcție de raportul m/z pe baza oscilațiilor în câmp de radiofrecvență. Instrumentul are o viteză de scanare deosebit de ridicată, o sensibilitate mult superioară altor spectrometre și realizează stagii multiple de fragmentare (MSn) ceea ce pentru analize structurale compensează rezoluția și acuratețea mai reduse.

Am realizat o interfață de prindere a robotului de infuzie de spectrometrul de masă

Sistemul NanoMate-HCT MS, o premieră în lume, a fost succesiv optimizat pentru funcționarea în tehnica de detecție a ionilor negativi, în combinație cu tehnica de fragmentare a disocierii induse prin ciocnire CID (collision induced dissociation), precum și în tehnica de detecție a ionilor pozitivi în combinație cu disocierea prin transfer de electroni ETD.

Platforma bazată pe chip ESI a fost optimizată, testată și aplicată pe probe standard de gangliozide precum și pe o proteină standard și anume Citocromul C, în scopul verificării fezabilitătii ei cât și pentru întocmirea diferitelor protocoale necesare pentru permiterea abordării (screening și identificare compozițională și structurală în detaliu) a cât mai multor tipuri de biomolecule.

Rezultatele pe care le-am obținut au dovedit că prin alăturarea celor două aparate este posibilă generarea spectrelor de calitate superioară, cu o eficiență a ionizării, viteză și sensibilitate mult mărite comparativ cu tehnicile de detecție, ionizare, și analiză existente pâna în prezent.

Cu ani în urmă se folosea curent metoda bottom-up, în care proteina intactă este supusă reacției de digestie prin enzime specifice. Amestecul de peptide e ulterior analizat prin spectrometrie de masă. Bottom-up are mai multe dezavantajele și anume, lipsa informațiilor privind concentrația probei, este o procedură laborioasă care presupune mai multe etape, și anume incubarea, purificarea, interacția enzimatică și apoi extracția enzimelor din probă, ȋn care se mai găsesc și proteine nedigestionate. Metoda top-down are avantaje net superioare față de celelalte metode. Noi am perfecționat și optimizat această metodă prin experimentele chip-ETD HCT MS descrise ȋn cadrul acestei teze

Am optimizat una dintre cele mai moderne metode spectrometrice pentru o analiză riguroasă, comparativă a expresiei și structurii gangliozidelor din anencefalie și dintr-un lob frontal fetal sănătos.

Analizele comparative pe care le-am realizat au demonstrat o diferență clară în expresia GG în cele două tipuri (aberant și sănătos) de țesuturi. S-a putut totodată observa că spre deosebire de FL, în ANC speciile dominante sunt GT1 (d18:1/18:0), urmat de GD1 (d18:1/18:0), adică specii di- si trisialilate extrem de abundente. Mai mult, speciile de tip GQ1 și GQ2 deși detectabile in ANC, s-au găsit sub limita de detecție in FL în care s-au putut în schimb detecta 4 ioni aparținând speciilor desialilate HexNAcHex2 si HexHexNAcHex2. Aceasta atesată o corelare directă între gradul de sialilare și acetilare și prezența malformației cu atât mai mult cu cât 5 specii O-acetilate de tip GM3 au fost detectate în FL în timp ce numai 2 au fost identificate în ANC.

Bibliografie

Capitolul 1

[1] L. Van Vaeck, A. Adriaens, R. Gijbels, () Static secondary ion mass spectrometry: (S-SIMIS) Part 1. Methodology and structural information, Mass Spectrom. Rev., 18(1), 1–47, 1999;

[2] T. W. Bentley, R. A. W. Johnstone, Mechanism and structure in mass spectrometry: a comparison with other chemical processes, Advances in Physical Organic Chemistry, vol. 8 (ed. V. Gold), Academic Press, London, 1970;

[3] H. D. Beckey, Principles of Field Ionization and Field Desorption in Mass Spectrometry, Pergamon Press, Oxford, 1977;

[4] R. G. Cooks, G. Chen, P. Wong, H. Wollnik, Mass spectrometers, E. Appl. Phys., 19, 289-294, 1997;

[5] A. Adriaens, L. Van Vaeck, Adams F., Static secondary ion mass spectrometry:

(S-SIMIS) Part 2, Material sciences applications, Mass Spectrom. Rev., 18 (1), 48–81, 1999;

[6] M. Yahmashita, J. B. Fenn, Electrospray Ion Source. Another Variation on the Free-Jet Theme, J.Phys.Chem., 88, 4451-4459, 1984;

[7] M. Aleksandrov, L. Gall, V. Krasnov, V. Nikolaev, V. Pavlenko, V. Shkurov, Ion extraction from solutions at atmospheric pressure – a method for mass-spectrometric analysis of bioorganic substance, Dokl. Acad. Nauk SSSR, 277,378-379, 1984;

[8] J. B.Fenn, M. Mann, C. K. Meng, S .F. Wong, C. M. Whitehouse, Electrospray ionization for mass spectrometry of large biomolecules, Science, 246, 64-71, 1989;

[9] J. B. Fenn, Electrospray wings for molecular elephants (Nobel lecture), Angew. Chem. Int. Ed ., 42, 3871-3894, 2003;

[10] Xianlin Han, Dana R. Abendschein, John G. Kelley and Richard W. Gross, Diabetes-induced changes in specific lipid molecular species in rat myocardium, Biochem. J., 352, 79–89, 2000;

[11] F. Adams, R. Gijbels, R. Van Grieken, Inorganic Mass Spectrometry (Chemical Analysis: A Series of Monographs on Analytical Chemistry and Its Applications), vol. 95, John Wiley & Sons, Inc., New York, 1988;

[12] J. B. Fenn, Ion Formation from Charged Droplets: Roles of Geometry, Energy, and Time, J. Am. Soc. Mass Spectrom., 4, 524, 1993;

[13] J. Zeleny, Instability of Electrified Liquid Surfaces, Phys. Rev., 10, 1-7, 1917;

[14] G. I. Taylor, Disintegration of Water Drops in an Electric Field, Proc. Royal Soc. London A, 280, 383-397, 1964;

[15] M. S. Wilm, M. Mann, Electrospray and Taylor-Cone Theory, Dole's Beam of Macromolecules at Last?, Int. J. Mass Spectrom. Ion Proc., 136, 167-180, 1994;

[16] R. B. Dole, Electrospray Ionization Mass Spectrometry- Fundamentals, Instrumentation and Applications, 1st ed., editor; John Wiley & Sons: Chichester, 1997;

[17] M. Dole, L. Mack, R. Hines, R. Mobley, L. Ferguson, M. Alice, Molecular Beams of Macroions, J. Chem. Phys., 49, 2240, 1968;

[18] L. Rayleigh, On the Equilibrium of Liquid Conducting Masses charged with Electricity, Philosophical Magazine, 14, 184–186, 1882;

[19] X. Han, R. W. Gross, Structural determination of picomole amounts of phospholipids via electrospray ionization tandem mass spectrometry, J. Am. Soc. Mass Spectrom., 6, 1202-1210, 1995;

[20] M. T. Davis, D. C. Stahl, T. D. Lee, Low flow high-performance liquid chromatography solvent delivery system designed for tandem capillary liquid chromatography-mass spectrometry, Journal of the American Society for Mass Spectrometry, 6(7), 571–577, 1995;

[21] R. B. Cole, Electrospray Ionization Mass Spectrometry: Fundamentals, Instrumentation, and Applications, ISBN 0-471-145645, John Wiley: New York, 1997;

[22] A. Schmidt, M. Karas, T. Dülcks, Effect of different solution flow rates on analyte ion signals in nano-ESI MS, or: when does ESI turn into nano-ESI?, J. Am. Soc. Mass Spectrom., 14(5), 492–500, 2003;

[23] M. Wilm, M. Mann, Analytical properties of the nanoelectrospray ion source, Anal. Chem., 68(1), 1–8, 1996;

[24] S. N. Jayasinghe, Bio-electrosprays: from bio-analytics to a generic tool for the health sciences, Analyst, 136, 878-890, 2011;

[25] A. D. Zamfir, Ž. Vukelić, J. Peter-Katalinić, A capillary electrophoresis and off-line capillary electrophoresis/electrospray ionization quadrupole time-of-flight tandem mass spectrometry approach for ganglioside analysis, Electrophoresis, 23, 2894-2903, 2002;

[26] A. D. Zamfir, N. Lion, Ž. Vukelić, L. Bindila, J. Rossier, H. H. Girault, J. Peter-Katalinić, Thin chip microsprayer system coupled to quadrupole time-of-flight mass spectrometer for glycoconjugate analysis, Lab Chip, 5, 298-307, 2005;

[27] M. Karas, D. Bachmann, U. Bahr, F. Hillenkamp, High-resolution mass spectrometer for protein chemistry, Int. J. Mass Spectrom. Ion Processes, 78, 53, 1987;

[28] R. S. Ramsey, J. M. Ramsey, Generating electrospray from microchip devices using electroosmotic pumping, Anal Chem., 69, 2617, 1997;

[29] Q. Xue, F. Foret, Y. M. Dunayevskiy, P. M. Zavracky, N. E. McGruer, B. L. Karger, Multichannel Microchip Electrospray Mass Spectrometry, Anal. Chem., 69 (3), 426–430, 1997;

[30] M. Y. Badal, M. Wong, N. Chiem, H. Salimi-Moosavi, D. J. Harrison, Protein Separation and Surfactant Control of Electroosmotic Flow in Poly(dimethylsiloxane)-Coated Capillaries and Microchips, Journal of Chromatography A, 947, 277-286, 2002;

[31] J. Wen, Y. Lin, F. Xiang, D.W. Matson, H.R. Udseth, R.D. Smith, Microfabricated isoelectric focusing device for direct electrospray ionization-mass spectrometry, Electrophoresis, 21, 191-197, 2000;

[32] D. Figeys, S. P. Gygi, G. McKinnon, R. Aebersold, An integrated microfluidics-tandem mass spectrometry system for automated protein analysis, Anal Chem., 70, 3728-3734, 1998;

[33] B. Zhang, F. Foret, B. L. Karger, High-throughput microfabricated CE/ESI-MS: automated sampling from a microwell plate, Anal Chem., 73, 2675-2681, 2001;

[34] S. Zhang, C. K. Van Pelt, D. B. Wilson, Quantitative determination of noncovalent binding interactions using automated nanoelectrospray mass spectrometry, Anal. Chem., 75, 3010-3018, 2003;

[35] J. Li, T. Tremblay, C. Wang, S. Attiya, D. J. Harrison, P. Thibault, Integrated System for high throughput Protein Identification using a Microfabricated Device Coupled to Capillary Electrophoresis/Nanoelectrospray Mass Spectrometry, Proteomics, 1, 975-986, 2001;

[36] T. Wachs, J. Henion, Electrospray device for coupling microscale separations and other miniaturized devices with electrospray mass spectrometry, Anal. Chem., 73, 632-638, 2001;

[37] K. Huikko, P. Ostman, K. Grigoras, S. Tuomikoski, V. M. Tiainen, A. Soininen, K. Puolanne, A. Manz, S. Franssila, R. Kostiainen, T. Kotiaho, Poly(dimethylsiloxane) electrospray devices fabricated with diamond-like carbonpoly (dimethylsiloxane) coated SU-8 masters, Lab. Chip, 3, 67–72, 2003;

[38] S. Benetton, J. Kameoka, A. Tan, T. Wachs, H. Craighead and J. D. Henion, Chip-Based P450 Drug Metabolism Coupled to Electrospray Ionization-Mass Spectrometry Detection, Anal. Chem., 75(23), 6430-6436, 2003;

[39] Y. Yang, J. Kameoka, T. Wachs, J. D. Henion, H. G. Craighead, Quantitative mass spectrometric determination of methylphenidate concentration in urine using an electrospray ionization source integrated with a polymer microchip, Anal Chem., 76, 2568-2574, 2004;

[40] W. C. Sung, S. Y. Huang, P. C. Liao, G. B. Lee, C. W. Li, S. H. Chen, Poly(dimethylsiloxane)-based microfluidic device with electrospray ionization-mass spectrometry interface for protein identification, Electrophoresis, 24, 3648–3654, 2003;

[41] A. D. Zamfir, Recent advances in sheathless interfacing of capillary electrophoresis and electrospray ionization mass spectrometry, J Chromatogr A., 1159(1-2), 2-13, 2007;

[42] W. D. Zencheck, H. Xiao, B. J. Nolen, R. H. Angeletti, T. D. Pollard, S. C. Almo, Nucleotide- and activator-dependent structural and dynamic changes of arp2/3 complex monitored by hydrogen/deuterium exchange and mass spectrometry, J. Mol. Biol., 390, 414–427, 2009;

[43] L. Licklider, X. Q. Wang, A. Desai, Y. C. Tai, T. D. Lee, A micromachined chip-based electrospray source for mass spectrometry, Anal. Chem., 72, 367–375, 2000;

[44] V . Gobry, J. van Oostrum, M. Martinelli, T. C. Rohner, F. Reymond, J. S. Rossier, H. H. Girault, Microfabricated polymer injector for direct mass spectrometry coupling, Proteomics, 2, 405-412, 2002;

[45] H. Moon, A. R. Wheeler, R. L. Garrell, J. A. Loo, C. J. Kim, An integrated digital microfluidic chip for multiplexed proteomic sample preparation and analysis by MALDI-MS, Lab Chip, 6, 1213-1219, 2006;

[46] S. L. Gac, , S. Arscott, C. Cren-Olive, C. Rolando, Two-dimensional microfabricated sources for nanoelectrospray, J. Mass Spectrom., 38, 1259–1264, 2003;

[47] C. H. Yuan, J. Shiea, Sequential Electrospray Analysis Using Sharp-Tip Channels Fabricated on a Plastic, Chip Anal. Chem. 73, 1080–1083, 2001

[48] W. Denga, J. F. Klemic, X. Li, M. A. Reed, A. Gomez, Increase of electrospray throughput using multiplexed microfabricated sources for the scalable generation of monodisperse droplets, Journal of Aerosol Science, 37 (6), 696–714, 2006;

[49] J. Kameoka, R. Orth, B. Llic, D. Czaplewski, T. Wachs, H. G. Graighead, An Electrospray Ionization Source for Integration with Microfluidics, Anal. Chem., 74, 5897–5901, 2002;

[50] K. Tang, Y. Lin, D. W. Matson, T. Kim, R. D. Smith, Generation of multiple electrosprays using microfabricated emitter arrays for improved mass spectrometric sensitivity, Anal. Chem. 73, 1658–1663, 2001;

[51] L. Svennerholm, Ganglioside designation, Adv. Exp. Med. Biol., 125, 111-114, 1980;

[52] IUPAC-IUB Joint Commission on Biochemical Nomenclature, Eur. J. Biochem. 257-293, 1998;

[53] S. U. Walkley, M. Zervas, S. Wiseman, Gangliosides as modulators of dendritogenesis in normal and storage disease-affected pyramidal neurons, Cerebral cortex, 10, 1028-1037, 2000;

[54] R. W. Ledeen, R. K. Yu, L. F. Eng, Gangliosides of human myelin: sialosylgalactosylceramide (G7) as a major component, J.Neurochem., 21, 829-839, 1973;

[55] I. Ienascu, A. X. Lupea, I. Popescu, C. Mosoarca, A. D. Zamfir, Synthesis and characterization of some new 2-hydroxy-N-(2-trifluoromethyl-phenyl)-benzamide derivatives, Rev. Roum. Chem., 53(4), 2008;

[56] T. Visnapuu, A. D. Zamfir, C. Moșoarcă, M. D. Stanescu, T. Alamäe, Fully automated chip-based negative mode nanoelectrospray mass spectrometry of fructooligosaccharides produced by heterologously expressed levansucrase from Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000, Rapid Commun. Mass Spectrom., 23, 1-10, 2009;

[57] D. Condrat, C. Moșoarcă, A. D. Zamfir, F. Crisan, M. R. Szabo, A. X. Lupea, Qualitative and quantitative analysis of gallic acid in Alchemilla vulgaris, Allium ursinum, Acorus calamus and Solidago virga-aurea by chip – electrospray ionization mass spectrometry and high performance liquid chromatography, Central European Journal of Chemistry, 8, 530-535, 2010;

[58] M. Stanescu, F. Harja, C. Moșoarcă, A. D. Zamfir, Biogenic amines fingerprints evidenced by performant MS analysis, Revue Roumaine De Chimie, 55, 1053, 2010;

[59] C. Moșoarcă, R. M. Ghiulai, C. R. Novaconi, Ž. Vukelić, A. D. Zamfir, Application of chip-based nanoelectrospray ion trap mass spectrometry to compositional and structural analysis of gangliosides in human fetal cerebellum, Analytical Letters, 44, 1036-1049, 2011;

[60] M. N. Stefanut, A. Cata, R. Pop, C. Moșoarcă; A. D. Zamfir, Anthocyanins HPLC-DAD and MS characterization, total phenolics, and antioxidant activity of some berries extracts, Anal. Letters, 44, 2843-2855, 2011;

[61] T. Visnapuu,; K. Mardo, C. Moșoarcă, A. D. Zamfir, A. Vigants, T. Alamaee, Levansucrases from Pseudomonas syringae pv. tomato and P. chlororaphis subsp. aurantiaca: Substrate specificity, polymerizing properties and usage of different acceptors for fructosylation, Journal of Biotechnology, 155, 338-349, 2011;

[62] H. Yuasa, D. A. Scheinberg, A. N. Houghton, Gangliosides of T lymphocytes: evidence for a role in T-cell activation, Tissue Antigens, 36, 47-56, 1990;

[63] S. U. Walkley, M. Zervas, S. Wiseman, Gangliosides as modulators of dendritogenesis in normal and storage disease-affected pyramidal neurons, Cerebral cortex, 10, 1028-1037, 2000;

[64] H. J. Willison, G. O'Hanlon, G. Paterson, Mechanisms of action of anti-GM1 and anti-GQ1b ganglioside antibodies in Guillain-Barré syndrome, J.Infect.Dis., 176, 144-149, 1997;

[65] G. Bolot, M. J. David, T. Kasama, T. Taki, S. Handa, M. Richard, J. C. Pignat, L. Thomas, J. Portoukalian, Occurrence of monosialosyl pentahexaosylceramide GalNAc-GM1 as specifc tumor-associated ganglioside of human head and neck squamous cell carcinomas, Cancer Lett., 135, 159-164, 1999;

[66] H. Li, J. R. Snelling, M. P. Barrow, J. H. Scrivens, P. J. Sadler, P. B. O'Connor, Mass spectrometric strategies to improve the identification of Pt(II)-modification sites on peptides and proteins, J. Am. Soc. Mass Spectrom., 25(7), 1217-1227, 2014;

[67] E. J. Faber, M. J. van den Haak, J. P. Kamerling, J. F.Vliegenthart, Structure of the exopolysaccharide produced by Streptococcus thermophilus S3, Carbohydr. Res., 331(2), 173-82, 2001;

[68] V. B. Ivleva, L. M. Sapp, P. B. O'Connor, C. E.Costello, Ganglioside analysis by thin-layer chromatography matrix-assisted laser desorption/ionization orthogonal time-of-flight mass spectrometry, J. Am. Soc. Mass Spectrom., 16(9), 1552-1560, 2005;

[69] M. Stojiljkovic, T. Blagojevic, S. Vukosavic, N. D. Zvezdina, S. Pekovic, G. Nikezic, L. Rakic, Ganglioside GM1 and GM3 in early human brain development: an immunocytochemical study, Int. J. Devel. Neuroscience, 14(1), 35-44, 1996;

[70] R. El-Abassi, D. Singhal, J. D.England, Fabry's disease, J. Neurol. Sci., 344(1-2), 5-19, 2014;

[71] C. Flangea, C. Moșoarcă, C. Cozma, M. Galusca, M. Przybylski, A. D. Zamfir, Testing the feasibility of fully automated chip-based nanoelectrospray ionization mass spectrometry as a novel tool for rapid diagnosis of Fabry disease, Electrophoresis, 34, 1572-1580, 2013;

[72]

[73]

[74]

[75]

[76]

[77]

[78]

[79]

[80]

[81] A. Tan, S. Benetton, J. D. Henion, Chip-Based Solid-Phase Extraction Pretreatment for direct electrospray mass spectrometry analysis using an array of monolithic columns in a polymeric substrate, Anal. Chem., 75, 5504–5511, 2003;

[82] A. D. Zamfir, Studiul ionizării prin electrospray în spectrometria de masă, Teză de doctorat, Universitatea Babeș-Bolyai, Cluj-Napoca, 2001;

[83] A. D. Zamfir, J. Peter-Katalinic, Glycoscreening by sheathless on-line capillary electrophoresis/electrospray quadrupole time-of flight tandem mass spectrometry, Electrophoresis, 22, 2448-2457, 2001;

[84] P. Kebarle, A brief overview of the present status of the mechanisms involved in electrospray mass spectrometry, Journal of Mass Spectrometry, 35(7), 804-817, 2000;

[85] A. D. Zamfir, S. König, J. Althoff, J. Peter-Katalinic, Capillary electrophoresis and off-line CE/ESI-QTOF tandem MS of carbohydrates, J. Chromatogr. A, 895, 291-299, 2000;

[86] A. D. Zamfir, Sisteme avansate de ionizare prin microchip pentru spectrometria de masa si aplicatii, Ed. Canonica, Cluj-Napoca, ISBN 978-973-88608-7-2, 2008;

[87] F. Kitagawa, K. Otsuka, Recent progress in microchip electrophoresis-mass spectrometry, J. Pharm Biomed Anal., 55, 668-678, 2011;

[88] F. Hillenkamp, M. Karas, R. C. Beavis, B. T. Chait, Matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry of biopolymers, Anal Chem., 24, 1193A-1203A, 1991;

[89] Q. Xue, Y. M. Dunayevskiy, F. Foret, B. L. Karger, Integrated multichannel microchip electrospray ionization mass spectrometry: analysis of peptides from on-chip tryptic digestion of melittin, Rapid Commun. Mass Spectrom., 11, 1253–1256, 1997;

[90] J. Li, T. Leriche, T. L. Tremblay, C. Wang, E. Bonneil, D. J. Harrison, P. Thibault, Application of microfluidic devices to proteomics research: identification of trace-level protein digests and affinity capture of target peptides, Mol Cell. Proteomics, 1, 157–168, 2002;

[91] I. M. Lazar, L. Li, Y. Yang, B. L. Karger, Microfluidic Device for Capillary Electro-Chromatography Mass Spectrometry, Electrophoresis, 24, 3655–3662, 2003;

[92] I. M. Lazar, J. Grym, F. Foret, Microfabricated devices: A new sample introduction approach to mass spectrometry, Mass Spectrom. Rev., 25, 573-594, 2006;

[93] W. Blum, P. Ramstein, G. Eglinton, Coupling of high temperature glass capillary columns to a mass spectrometer. GC/MS analysis of metalloporphyrins from Julia Creek oil shale samples, J. of High Resolution Chromatography, 13 (2), 85–93, 1990;

[94] A. Rouleau, M. El Osta, G. Lucchi, P. Ducoroy, W. Boireau, Immuno-MALDI-MS in human plasma and on-chip biomarker characterizations at the femtomole level, Sensors (Basel), 12(11), 15119-15132, 2012;

[95] http://www.agilent.it/labs/features/2004_microfluidics.html

[96] Y. Deng, H. Zhang, J. Henion, Chip-based quantitative capillary electrophoresis/mass spectrometry determination of drugs in human plasma, Anal. Chem., 73, 1432-1439, 2001;

[97] J. Zaia, Mass spectrometry and glycomics OMICS, 14, 401-418, 2010;

[98] C. Flangea, C. Schiopu, E. Sisu, A. Serb, M. Przybylski, D. G. Seidler, A. D. Zamfir, Determination of sulfation pattern in brain glycosaminoglycans by chip-based electrospray ionization ion trap mass spectrometry, Anal. Bioanal. Chem., 395, 2489-2498, 2009;

[99] J. Peter-Katalinić, Methods in enzymology: O-glycosylation of proteins, Methods Enzymol., 405, 139-171, 2005;

[100] A. D. Zamfir, N. Lion, Ž. Vukelic, L. Bindila, J. Rossier, H. Girault, J. Peter-Kataliniĉ, Thin chip microsprayer system coupled to quadrupole time-of-flight mass spectrometer for glycoconjugate analysis, Lab. Chip, 5, 298-307, 2005;

[101] I. Perdivara, E. Sisu, I. Sisu, N. Dinca, K. B. Tomer, M. Przybylski, A. D. Zamfir, Enhanced electrospray ionization Fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometry of long-chain polysaccharides, Rapid Commun. Mass Spectrom., 22, 773-782, 2008;

[102] E. Sisu, W. T. E. Bosker, W. Norde, T. M. Slaghek, J. W. Timmermans, J. P. Katalinic, M. A. Cohen-Stuart, A. D. Zamfir, Electrospray ionization quadrupole time-of-flight tandem mass spectrometric analysis of hexamethilene diamine-modified maltodextrin and dextran, Rapid. Commun. Mass Spectrom., 20, 209-218, 2006;

[103] I. Sisu, V. Udrescu, C. Flangea, S. Tudor, N. Dinca, L. Rusnac, A. D. Zamfir, E. Sisu, Synthesis and structural characterization of amino-functionalized polysaccharides, Cent. Eur. J. Chem., 7, 66-73, 2009;

[104] A. D. Zamfir, D. Seidler, E. Schonherr, H. Kresse, J. Peter-Katalinić, On-line sheathless capillary electrophoresis/nanoelectrospray ionization-tandem mass spectrometry for the analysis of glycosaminoglycan oligosaccharides, Electrophoresis, 25, 2010-2016, 2004;

[105] M. Froesch, L. Bindila, A. D. Zamfir, J. Peter-Katalinić, Sialylation analysis of O-glycosylated sialylated peptides from urine of patients suffering from Schindler's disease by Fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometry and sustained off-resonance irradiation collision-induced dissociation, Rapid Commun. Mass Spectrom., 17, 2822-2832, 2003;

[106] L. Bindila, M. Froesch, N. Lion, Ž. Vukelic, J. Rossier, H. Girault, J. Peter-Katalinić, A. D. Zamfir, A thin chip microsprayer system coupled to Fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometry for glycopeptide screening, Rapid Commun. Mass Spectrom., 18, 2913-2920, 2004;

[107] A. D. Zamfir, Ž. Vukelic, J. Peter-Katalinić, A capillary electrophoresis and off-line capillary electrophoresis/electrospray ionization quadrupole time-of-flight tandem mass spectrometry approach for ganglioside analysis, Electrophoresis, 23, 2894-2903, 2002;

[108] A.D. Zamfir, S. Vakhrushev , A. Sterling, H. Niebel, M. Allen, J. Peter-Katalinić, Fully automated chip-based mass spectrometry for complex carbohydrate system analysis, Anal. Chem., 76, 2046-2054, 2004;

[109] C. J. Hogan, J. A. Carroll, H. W. Rohrs, P. Biswas, M. L. Gross, Combined charged residue-field emission model of macromolecular electrospray ionization, Anal. Chem., 81(1), 369–77, 2009;

[110] A. Serb, C. Schiopu, C. Flangea, E. Sisu, A. D. Zamfir, Top-down glycolipidomics: fragmentation analysis of ganglioside oligosaccharide core and ceramide moiety by chip-nanoelectrospray collision-induced dissociation MS2-MS6, J. Mass Spectrom., 44, 1434–1442, 2009;

Capitolul 2

[111] J. R. Chapman, Practical Organic Mass Spectrometry, Chichester: Wiley, 1993;

[112] R. G. Cooks, G. Chen, P. Wong, H. Wollnik, Mass spectrometers, Encl. Appl. Phys., 19, 289-294, 1997;

[113] P. S. H. Whong, R. G. Cooks, Ion Trap Mass Spectrometry, Current Separations, 16(3), 1997;

[114] J. B. Fenn, M. Mann, C. K. Meng, S. F. Wong, C. M. Whitehouse, Electrospray ionization-principles and practice, Mass Spectrom. Rev., 9, 37-70, 1990;

[115] L. Svennerholm, P. Fredman, A procedure for the quantitative isolation of brain gangliosides, Biochim. Biophys. Acta, 617, 97-109, 1980;

[116] R. Almeida, C. Moșoarcă, M. Chirita, V. Udrescu, N. Dinca, Ž. Vukelić, M. Allen, A. D. Zamfir, Coupling of fully automated chip-based electrospray ionization to high capacity ion trap mass spectrometer for ganglioside analysis, Anal. Biochem., 378, 43–52, 2008;

[117] C. Flangea, C. Schiopu, F. Capitan, C. Moșoarcă, M. Manea, E. Sisu, A.D. Zamfir, Fully automated chip-based nanoelectrospray combined with electron transfer dissociation for „high throughput top-down proteomics, Central European Journal of Chemistry, 11, 25-34, 2013;

[118] F. F. Hsu, J. Turk, Structural determination of glycosphingolipids as lithiate adducts by electrospray ionization mass spectrometry using low energy collisional activated dissociation on a triple stage quadrupole instrument, J. Am. Soc. Mass. Spectrom., 12, 61-79, 2001.

[119] C. Moșoarcă, C. Flangea, C. Cozma, I. Malaescu, M. Przybylski, A. D. Zamfir, Fully Automated Chip-Nanoelectrospray Combined with Collision-Induced and Electron Transfer Dissociation for Rapid Diagnosis of Fabry Disease, 10-13 March 2013, Berlin, Germany, DGMS 2013;

[120] B. Domon, C. Costello, A systematic nomenclature for carbohydrate fragmentations in FAB-MS/MS spectra of glycoconjugates,Glycoconj. J., 5, 397–409, 1988;

[121] P. Roepstorff, J. Fohlman, Proposal for a common nomenclature for sequence ions in mass spectra of peptides, Biomed. Mass Spectrom., 11, 601–609, 1984;

[122] G. Blix, Einige Beobachtungen ϋber eine hexosaminhaltige Substanz in der Protagonfraktion des Gehirns, Skand. Arch. Physiol., 80, 46-51, 1938;

[123] J. Folch, S. Arsove, J. A. Meath, Isolation of brain strandin, a new type of large molecule tissue component, J.Biol.Chem., 191, 819-831, 1951;

[124] E. Z. Klenk, Uber die Ganglioside, eine neue Gruppe von zuckerhaltigen Gehirnlipoiden, Hoppe-Seyler's Zeitschrift fur Physiologische Chemie,: 273, 76-86, 1942;

[125] L. Svennerholm, Composition of gangliosides from human brain, Nature, 177, 524-525, 1956;

[126] W. E. Van Heyningen, P. A. Miller, The fixation of tetanus toxin by ganglioside, J. Gen. Microbiol., 24, 107-19, 1961;

[127] E. Klenk, W. Gielen, Research on the constitution of a ganglioside from human brain and the separation of the mixture into the components, Hoppe Seylers Z Physiol Chem., 326, 144-57, 1961;

[128] E. G. Trams, C. J.Lauter, Adenosine deaminase of cultured brain cells, Biochem. J., 152(3), 681-687, 1975;

[129] R. Kuhn, H. Wiegandt, Further gangliosides from the human brain, Z Naturforsch B. 19, 256-7, 1964;

[130] L. Svennerholm, P. Fredman, A procedure for the quantitative isolation of brain gangliosides, Biochim. Biophys. Acta, 617, 97-109, 1980;

[131] D. L. Nelson, M. M. Cox, Lipids, Lehninger Principles of Biochemistry, 4th edition, W. H. Freeman & Co., 357. ISBN 9780716743392, 2005;

Capitolul 3

[132] C. Wetzel, S. Li, P. A. Limbach, Metabolic de-isotoping for improved LC-MS characterization of modified RNAs, J. Am. Soc. Mass Spectrom., 25(7), 1114-23, 2014;

[133] H. Shinohara, T. Suzuki, F. Kitagawa, J. Mizunoa, K. Otsuka, S. Shoji, Polymer microchip integrated with nano-electrospray tip for electrophoresis–mass spectrometry, Sensors and Actuators B, 132, 368–373, 2008;

[134] Y. Deng, J. Henion, J. Li, P. Thibault, C . Wang, D.J. Harrison, Chip-based capillary electrophoresis/mass spectrometry determination of carnitines in human urine, Anal. Chem., 73, 639-646, 2001;

[135] Y. Deng, H. Zhang, J. Henion, Chip-based quantitative capillary electrophoresis/mass spectrometry determination of drugs in human plasma, Anal. Chem., 73, 1432-1439, 2001;

[136] Y. Liu, B. Liu, P. Yang, H. H. Girault, Microfluidic enzymatic reactors for proteome research, Anal. Bioanal. Chem., 390, 227-229, 2008;

[137] B. Zhang, F. Foret, B. L. Karger, High-throughput microfabricated CE/ESI-MS: automated sampling from a microwell plate, Anal. Chem., 73, 2675-2681, 2001;

[138] Y. Yang, J. Kameoka, T. Wachs, J. D. Henion, H. G. Craighead, Quantitative mass spectrometric determination of methylphenidate concentration in urine using an electrospray ionization source integrated with a polymer microchip, Anal. Chem., 76, 2568-2574, 2004;

[139] L. K.Sørensen, A liquid chromatography/tandem mass spectrometric approach for the determination of gangliosides GD3 and GM3 in bovine milk and infant formulae, Rapid Commun. Mass Spectrom., 20(24), 3625-3633, 2006;

[140] N. Mori, Y. Fukano, R. Arita, R. Shirakawa, K. Kawazu, M. Nakamura, S. Amano, Rapid identification of fatty acids and (O-acyl)-ω-hydroxy fatty acids in human meibum by liquid chromatography/high-resolution mass spectrometry, J. Chromatogr. A., 1347, 129-36, 2014;

[141] Y. T. Li, E. Sugiyama, T. Ariga, J. Nakayama, M. Hayama, Y. Hama, H. Nakagawa, T. Tai, K. Maskos, S. C. Li, T. Kasama, Association of GM4 ganglioside with the membrane surrounding lipid droplets in shark liver, J. Lipid Res., 43(7), 1019-1025, 2002;

[142] V. B. Ivleva, L. M. Sapp, P. B. O'Connor, C. E.Costello, Ganglioside analysis by thin-layer chromatography matrix-assisted laser desorption/ionization orthogonal time-of-flight mass spectrometry, J. Am. Soc. Mass Spectrom., 16(9), 1552-1560, 2005;

[143] H. J. Cho, M. J. Song, A gammaherpesvirus establishes persistent infection in neuroblastoma cells, Mol. Cells., 37(7), 518-525, 2014;

[144] W. Zou, Z. Y. Li, Y. L. Li, K. L. Ma, Z. C. Tsui, Overexpression of PEMT2 downregulates the PI3K/Akt signaling pathway in rat hepatoma cells, Biochim. Biophys. Acta., 1581(1-2), 49-56, 2002;

[145] E. R. Sjoberg, A. E. Manzi, K. H. Khoo, A. Dell, A. Varki, Structural and immunological characterization of O-acetylated GD2. Evidence that GD2 is an acceptor for ganglioside O-acetyltransferase in human melanoma cells, J. Biol. Chem., 267(23), 16200-16211, 1992;

[146] S. N. Jackson, D. Barbacci, T. Egan, E. K. Lewis, J. A. Schultz, A. S. Woods, MALDI-Ion Mobility Mass Spectrometry of Lipids in Negative Ion Mode, Anal. Methods., 6(14), 5001-5007, 2014;

[147] J. Ueyama, M. Kamijima, T. Kondo, K. Takagi, E. Shibata, T. Hasegawa, S. Wakusawa, T. Taki, M. Gotoh, I. Saito, Revised method for routine determination of urinary dialkyl phosphates using gas chromatography-mass spectrometry, J. Chromatogr. B. Analyt. Technol. Biomed. Life Sci., 878(17-18), 1257-1263, 2010;

[148] T. M. Schaub, C. L. Hendrickson, S. Horning, J. P. Quinn, M. W. Senko, A. G.Marshall, High-performance mass spectrometry: Fourier transform ion cyclotron resonance at 14.5 Tesla, Anal. Chem., 80(11), 3985-3990, 2008;

[149] H. Waki, A. Murata, K. Kon, K. Maruyama, S. Kimura, H. Ogura, S. Ando, Isolation and characterization of a trisialyllactosylceramide, GT3, containing an O-acetylated sialic acid in cod fish brain, J. Biochem., 113(4), 502-507, 1993;

[150] T. Antoine, A. Heyraud, C. Bosso, E. Samain, Highly efficient biosynthesis of the oligosaccharide moiety of the GD3 ganglioside by using metabolically engineered Escherichia coli, Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 44(9), 1350-1352, 2005;

[151] H. Yu, J. Cheng, L. Ding, Z. Khedri, Y. Chen, S. Chin, K. Lau, V. K. Tiwari, X. Chen,

Chemoenzymatic synthesis of GD3 oligosaccharides and other disialyl glycans containing natural and non-natural sialic acids, J. Am. Chem. Soc., 131(51), 18467-18477, 2009;

[152] L. N. Robinson, C. Artpradit, R. Raman, Z. H. Shriver, M. Ruchirawat, R. Sasisekharan, Harnessing glycomics technologies: integrating structure with function for glycan characterization, Electrophoresis, 33(5), 797-814, 2012;

[153] R. Kumarswamy, S. Chandna, Putative partners in Bax mediated cytochrome-c release: ANT, CypD, VDAC or none of them?, Mitochondrion, 9, 1–8. 2009;

[154] V. P. Skulachev, Cytochrome c in the apoptotic and antioxidant cascades, FEBS Lett., 423, 275–280, 1998;

[155] P. F. Lurquin, L. Stone, L. L. Cavalli-Sforza, Genes, culture, and human evolution: a synthesis, Oxford: Blackwell, 79, 2007;

[156] E. Margoliash, Primary structure and evolution of cytochrome c, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 50, 672–679, 1963;

[157] S. Orrenius, B. Zhivotovsky, Cardiolipin oxidation sets cytochrome c free, Nat. Chem. Biol., 1, 188–189, 2005;

Capitolul 4

[158] B. T. Higgins, A. Thornton-Dunwoody, J. M. Labavitch, J. S.VanderGheynst, Microplate assay for quantitation of neutral lipids in extracts from microalgae, Anal. Biochem., S0003-2697(14), 00314-00315, 2014;

[159] C. Moșoarcă, T. Visnapuu, T. Alamäe, A. D. Zamfir, Characterization of fructooligosaccharides produced by levansucrases from Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 and Pseudomonas chlororaphis subsp. aurantiaca by fully automated chip-based nanoESI tandem MS, 2nd International Conference of the Romanian Society for Mass Spectrometry, Timisoara, Romania, 1-5 mai 2011;

[160] C. Moșoarcă, C. Flangea, I. Sisu, E. Sisu, M. Manea, A. D. Zamfir, Combining fully automated chip-based electrospray ionization and multistage CID/ETD mass spectrometry for peptides and glycopeptides, 2nd International Conference of the Romanian Society for Mass Spectrometry, Timisoara, Romania, 1-5 mai 2011;

[161] C. Moșoarcă, C. Flangea, E. Sisu, A. D. Zamfir, I. Malaescu, Implementation of chip-based electrospray ionization in combination with electron transfer dissociation mass spectrometry for peptide and glycopeptide sequencing, Physics Conference TIM-11, Timisoara, Romania, 24-27 November 2011;

[162] C. Flangea, C. Schiopu, F. Capitan, C. Moșoarcă, M. Manea, E. Sisu, A.D. Zamfir, A novel platform for top-down proteomics: chip-based nanoelectrospray combined with electron transfer dissociation mass spectrometry, Joint Conference of Polish Mass Spectrometry Society and German Mass Spectrometry Society, Poznan, Poland, March 4-7 2012;

[163] C. Moșoarcă, I. Malaescu, T. Visnapuu, T. Alamäe, A. D. Zamfir, Chip-based nanoelectrospray mass spectrometry of fructooligosaccharides produced by levansucrases from Pseudomonas syringae pv. tomato and P. chlororaphis subsp. aurantiaca, Joint Conference of German Mass Spectrometry Society and Polish Mass Spectrometry Society Poznan, Polonia, March 4-7 2012;

[164] C. Moșoarcă, I. Malaescu, T. Visnapuu, T. Alamäe, A. D. Zamfir, Fructooligosaccharides are produced by levansucrases from Pseudomonas syringae pv. tomato and P. chlororaphis subsp. aurantiaca as revealed by chip-based nanoelectrospray mass spectrometry analysis, 4th International Congress and 30th Annual Scientific Session of RSCB (Romanian Society for Cell Biology), Satu Mare(Romania)/Debrecen(Hungary), June 13-17 2012;

[165] C. Flangea, C. Moșoarcă,　M. Manea,　C. Schiopu,　E. Sisu,　A. D. Zamfir,

Fully automated chip-based nanoelectrospray combined with electron transfer dissociation for high throughput top-down proteomics, 19th International Mass Spectrometry Conference, Kyoto, Japan, 2012;

[166] M. Galusca,　C. Flangea,　 C. Moșoarcă,　C. Cozma,　A. D. Zamfir, Chip-based electrospray ionization tandem mass spectrometry a novel tool for rapid diagnostic of Fabry disease, Kyoto, Japan, 2012;

[167] C. Moșoarcă, I. Malaescu, T. Visnapuu, T. Alamäe, A. D. Zamfir, Chip-Based nanoelectrospray mass spectrometry analysis of fructooligosaccharides produced by levansucrases from Pseudomonas syringae and aurantiaca, 6th Central and Eastern European Proteomics Conference, Budapest, Hungary, 14-17 October 2012;

[168] C. Moșoarcă, I. Malaescu, T. Visnapuu, T. Alamäea, A. D. Zamfir, Chip-based nanoelectrospray mass spectrometry of fructooligosaccharides produced by levansucrases from Pseudomonas syringae pv. tomato and P. chlororaphis subsp. Aurantiaca, International Symposium Research and Education in Innovation Era,. 4th Edition, Arad, Romania (ISREIE 2012), November 08-09 2012;

[169] F. Capitan, C. Schiopu, C. Moșoarcă, C. Flangea, C. Ilie, I. Velea, E. Sisu, A. D. Zamfir, Compositional and structural analysis of gangliosides in human fetal cerebellum by chip electrospray mass spectrometry, International Symposium Research and Education in Innovation Era,. 4th Edition, Arad, Romania (ISREIE 2012), November 08-09 2012;

[170] M. Galusca, C. Flangea, C. Moșoarcă, C. Cozma, A. D. Zamfir, Chip-based electrospray ionization tandem mass spectrometry a novel tool for rapid diagnostic of Fabry disease, International Symposium Research and Education in Innovation Era,. 4th Edition, Arad, Romania (ISREIE 2012), November 08-09 2012;

[171] C. Moșoarcă, I. Malaescu, Ž. Vukelić, A. D. Zamfir, Automated chip-based nanoelectrospray-mass spectrometry of gangliosides from human anencephaly, TIM 12 Physics Conference, Timisoara, Romania, 27-30 November 2012;

[172] M. Galusca, C. Flangea, C. Moșoarcă, C. Cozma, Alina D. Zamfir, Rapid diagnosis of Fabry disease by a novel method based on automated chip-nanoelectrospray ionization mass spectrometry, Mass Spectrometry Forum, Vienna, Austria, February 19-23 2013;

[173] A.D. Zamfir, C. Moșoarcă, C. Flangea, C. Cozma, I. Malaescu, M. Przybylski, Fully automated chip-nanoelectrospray combined with collision induced and electron transfer dissociation, 46th German Society for Mass Spectrometry Conference, Berlin, Germany, March 10-14 2013;

[174] M. Galusca (Sarbu), C. Flangea, C. Moșoarcă, C. Cozma, A. D. Zamfir, Fabry disease-Rapid diagnosis by chip-based nanoelectrospray ionization tandem mass spectrometry, 2nd Middle Eastern and Mediterranean Sea Region Countries Mass Spectrometry Conference, Siena, Italy, June 30 – July 4 2013;

[175] C. Moșoarcă, C. Flangea, M. Galusca, A.D. Zamfir, Rapid diagnosis through molecular markers identified by advanced mass spectrometry, 5th International Congress and the 31th Annual Session of the Romanian Society for Cell Biology, Timisoara, Romania ,June 05-09 2013;

[176] C. Moșoarcă, I. Malaescu, A. D. Zamfir, Testing The Feasibility Of Fully Automated Chip-Based Nanoelectrospray Ionization Mass Spectrometry As A Novel Tool For Rapid Diagnosis Of Fabry Disease, A Treia Sesiune Națională De Comunicări Științifice a Doctoranzilor, 11 June 2013;

[177] J. Liu, L. Jin, L. Zhang, Z. Li, L. Wang, R. Ye, Y. Zhang, A. Ren, Placental concentrations of manganese and the risk of fetal neural tube defects, J. Trace Elem. Med. Biol., 27(4), 322-325, 2013;

[178] J. Tesarík, J. Mrovec, A. Polcrová, Disulphates of neutral steroids in the amniotic fluid from anencephalic preganancies, J. Endocrinol., 51(1), 109-115, 1971;

[179] Z. Vukelić, W. Metelmann, J. Müthing, M. Kos, J. Peter-Katalinić, Anencephaly: structural characterization of gangliosides in defined brain regions, Biol. Chem., 382(2), 259-74, 2001;

[180] Y. Chi, L. Pei, G. Chen, X. Song, A. Zhao, T. Chen, M. Su, Y. Zhang, J. Liu, A. Ren, X. Zheng, G. Xie, W. Jia, Metabonomic profiling of human placentas reveals different metabolic patterns among subtypes of neural tube defects, J. Proteome Res., 13(2), 934-45, 2014;

[181] A. Ren, X. Qiu, L. Jin, J. Ma, Z. Li, L. Zhang, H. Zhu, R. H. Finnell, T. Zhu, Association of selected persistent organic pollutants in the placenta with the risk of neural tube defects, Proc. Natl. Acad. Sci. U S A., 108(31), 12770-12775, 2011;

[182] J. Tesarík, J. Mrovec, A. Polcrová, Disulphates of neutral steroids in the amniotic fluid from anencephalic preganancies, J. Endocrinol., 51(1), 109-115, 1971.

Lista lucrărilor științifice

1) Articole publicate în reviste internaționale cu factor ISI:

[1] R. Almeida, C. Moșoarcă, M. Chirita, V. Udrescu, N. Dinca, Ž. Vukelić, M. Allen, A. D. Zamfir, Coupling of fully automated chip-based electrospray ionization to high capacity ion trap mass spectrometer for ganglioside analysis, Anal. Biochem. 378, 43–52, 2008, factor ISI: 3.1

[2] I. Ienascu, A.X. Lupea, I. Popescu, C. Moșoarcă, A.D. Zamfir, Synthesis and characterization of some new 2-hydroxy-N-(2-trifluoromethyl-phenyl)-benzamide derivatives,

Rev. Roum. Chem. 53(4), 2008, factor ISI: 0.6

[3] T.Visnapuu, A. D. Zamfir, C. Moșoarcă, M. D. Stanescu, T.Alamäe, Fully automated chip-based negative mode nanoelectrospray mass spectrometry of fructooligosaccharides produced by heterologously expressed levansucrase from Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000, Rapid Commun. Mass Spectrom. 23, 1-10, 2009, factor ISI: 2.8

[4] D. Condrat, C. Moșoarcă, A. D. Zamfir, F. Crisan, M. R. Szabo, A. X. Lupea, Qualitative and quantitative analysis of gallic acid in Alchemilla vulgaris, Allium ursinum, Acorus calamus and Solidago virga-aurea by chip – electrospray ionization mass spectrometry and high performance liquid chromatography, Central European Journal of Chemistry, 8, 530-535, 2010, factor ISI: 1.1

[5] D. M. Stanescu, F. Harja, C. Moșoarcă, A. D. Zamfir, Biogenic amines fingerprints evidenced by performant MS analysis, Revue Roumaine De Chimie, 55, 1053-+, 2010, factor ISI: 0.6

[6] C. Moșoarcă, R. M. Ghiulai, C. R. Novaconi, Ž. Vukelić, A. D. Zamfir, Application of chip-based nanoelectrospray ion trap mass spectrometry to compositional and structural analysis of gangliosides in human fetal cerebellum, Analytical Letters, 44, 1036-1049, 2011, factor ISI: 1.1

[7] M. N. Stefanut, A. Cata, R. Pop, C. Moșoarcă, A. D. Zamfir, Anthocyanins HPLC-DAD and MS characterization, total phenolics, and antioxidant activity of some berries extracts,

Analytical Letters, 44, 2843-2855, 2011, factor ISI: 1.1

[8] T. Visnapuu, K. Mardo, C. Moșoarcă, A. D. Zamfir, A.Vigants, T. Alamae, Levansucrases from Pseudomonas syringae pv. tomato and P. chlororaphis subsp. aurantiaca: Substrate specificity, polymerizing properties and usage of different acceptors for fructosylation, Journal of Biotechnology, 155, 338-349, 2011, factor ISI: 3.3

[9] C. Flangea, C. Schiopu, F. Capitan, C. Moșoarcă, M. Manea, E. Sisu, A.D. Zamfir, Fully automated chip-based nanoelectrospray combined with electron transfer dissociation for high throughput top-down proteomics, Central European Journal of Chemistry, 11, 25-34, 2013, factor ISI: 1.1

[10] C. Flangea, C. Moșoarcă, C. Cozma, M. Galusca, M. Przybylski, A. D. Zamfir, Testing the feasibility of fully automated chip-based nanoelectrospray ionization mass spectrometry as a novel tool for rapid diagnosis of Fabry disease, Electrophoresis, 34: 11, 1572-1580, 2013, factor ISI: 3.3

Capitol de carte

C. Moșoarcă, Ž. Vukelić, A.D. Zamfir, Mapping and sequencing of gangliosides from anencephaly by electrospray ionization high capacity ion trap mass spectrometry, in: Applications of Mass Spectrometry in Life Safety, Ed. Springer Verlag, Germany, ISBN 978-1-4020-8810-0; pg. 71-82; 2008

2) Lucrări susținute la Conferințe Internaționale:

[1] C. Moșoarcă, T. Visnapuu, T. Alamäe, A. D. Zamfir, Characterization of fructooligosaccharides produced by levansucrases from Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 and Pseudomonas chlororaphis subsp. aurantiaca by fully automated chip-based nanoESI tandem MS, 2nd International Conference of the Romanian Society for Mass Spectrometry, Timisoara, Romania, 1-5 mai 2011;

[2] C. Moșoarcă, C. Flangea, I. Sisu, E. Sisu, M. Manea, A. D. Zamfir, Combining fully automated chip-based electrospray ionization and multistage CID/ETD mass spectrometry for peptides and glycopeptides, 2nd International Conference of the Romanian Society for Mass Spectrometry, Timisoara, Romania, 1-5 mai 2011;

[3] C. Moșoarcă, C. Flangea, E. Sisu, A. D. Zamfir, I. Malaescu, Implementation of chip-based electrospray ionization in combination with electron transfer dissociation mass spectrometry for peptide and glycopeptide sequencing, Physics Conference TIM-11, Timisoara, Romania, 24-27 November 2011;

[4] C. Flangea, C. Schiopu, F. Capitan, C. Moșoarcă, M. Manea, E. Sisu, A.D. Zamfir, A novel platform for top-down proteomics: chip-based nanoelectrospray combined with electron transfer dissociation mass spectrometry, Joint Conference of Polish Mass Spectrometry Society and German Mass Spectrometry Society, Poznan, Poland, March 4-7 2012;

[5] C. Moșoarcă, I. Malaescu, T. Visnapuu, T. Alamäe, A. D. Zamfir, Chip-based nanoelectrospray mass spectrometry of fructooligosaccharides produced by levansucrases from Pseudomonas syringae pv. tomato and P. chlororaphis subsp. aurantiaca, Joint Conference of German Mass Spectrometry Society and Polish Mass Spectrometry Society Poznan, Polonia, March 4-7 2012;

[6] C. Moșoarcă, I. Malaescu, T. Visnapuu, T. Alamäe, A. D. Zamfir, Fructooligosaccharides are produced by levansucrases from Pseudomonas syringae pv. tomato and P. chlororaphis subsp. aurantiaca as revealed by chip-based nanoelectrospray mass spectrometry analysis, 4th International Congress and 30th Annual Scientific Session of RSCB (Romanian Society for Cell Biology), Satu Mare(Romania)/Debrecen(Hungary), June 13-17 2012;

[7] C. Flangea, C. Moșoarcă,　M. Manea,　C. Schiopu,　E. Sisu,　A. D. Zamfir,

Fully automated chip-based nanoelectrospray combined with electron transfer dissociation for high throughput top-down proteomics, 19th International Mass Spectrometry Conference, Kyoto, Japan, 2012;

[8] M. Galusca,　C. Flangea,　 C. Moșoarcă,　C. Cozma,　A. D. Zamfir, Chip-based electrospray ionization tandem mass spectrometry a novel tool for rapid diagnostic of Fabry disease, Kyoto, Japan, 2012;

[9] C. Moșoarcă, I. Malaescu, T. Visnapuu, T. Alamäe, A. D. Zamfir, Chip-Based nanoelectrospray mass spectrometry analysis of fructooligosaccharides produced by levansucrases from Pseudomonas syringae and aurantiaca, 6th Central and Eastern European Proteomics Conference, Budapest, Hungary, 14-17 October 2012;

[10] C. Moșoarcă, I. Malaescu, T. Visnapuu, T. Alamäea, A. D. Zamfir, Chip-based nanoelectrospray mass spectrometry of fructooligosaccharides produced by levansucrases from Pseudomonas syringae pv. tomato and P. chlororaphis subsp. Aurantiaca, International Symposium Research and Education in Innovation Era,. 4th Edition, Arad, Romania (ISREIE 2012), November 08-09 2012;

[11] F. Capitan, C. Schiopu, C. Moșoarcă, C. Flangea, C. Ilie, I. Velea, E. Sisu, A. D. Zamfir, Compositional and structural analysis of gangliosides in human fetal cerebellum by chip electrospray mass spectrometry, International Symposium Research and Education in Innovation Era,. 4th Edition, Arad, Romania (ISREIE 2012), November 08-09 2012;

[12] M. Galusca, C. Flangea, C. Moșoarcă, C. Cozma, A. D. Zamfir, Chip-based electrospray ionization tandem mass spectrometry a novel tool for rapid diagnostic of Fabry disease, International Symposium Research and Education in Innovation Era,. 4th Edition, Arad, Romania (ISREIE 2012), November 08-09 2012;

[13] C. Moșoarcă, I. Malaescu, Ž. Vukelić, A. D. Zamfir, Automated chip-based nanoelectrospray-mass spectrometry of gangliosides from human anencephaly, TIM 12 Physics Conference, Timisoara, Romania, 27-30 November 2012;

[14] M. Galusca, C. Flangea, C. Moșoarcă, C. Cozma, Alina D. Zamfir, Rapid diagnosis of Fabry disease by a novel method based on automated chip-nanoelectrospray ionization mass spectrometry, Mass Spectrometry Forum, Vienna, Austria, February 19-23 2013;

[15] A.D. Zamfir, C. Moșoarcă, C. Flangea, C. Cozma, I. Malaescu, M. Przybylski, Fully automated chip-nanoelectrospray combined with collision induced and electron transfer dissociation, 46th German Society for Mass Spectrometry Conference, Berlin, Germany, March 10-14 2013;

[16] M. Galusca (Sarbu), C. Flangea, C. Moșoarcă, C. Cozma, A. D. Zamfir, Fabry disease-Rapid diagnosis by chip-based nanoelectrospray ionization tandem mass spectrometry, 2nd Middle Eastern and Mediterranean Sea Region Countries Mass Spectrometry Conference, Siena, Italy, June 30 – July 4 2013;

[17] C. Moșoarcă, C. Flangea, M. Galusca, A.D. Zamfir, Rapid diagnosis through molecular markers identified by advanced mass spectrometry, 5th International Congress and the 31th Annual Session of the Romanian Society for Cell Biology, Timisoara, Romania, June 05-09 2013;

[18] C. Moșoarcă, I. Malaescu, A. D. Zamfir, Testing The Feasibility Of Fully Automated Chip-Based Nanoelectrospray Ionization Mass Spectrometry As A Novel Tool For Rapid Diagnosis Of Fabry Disease, A Treia Sesiune Națională De Comunicări Științifice a Doctoranzilor, 11 June 2013;

[19] C. Moșoarcă, I. Malaescu, C. Flangea, M. Galusca Sarbu, A. D. Zamfir, Rapid diagnosis of Fabry disease through advanced chip-based electrospray mass spectrometry and electron transfer dissociation sequencing, TIM-FIZ 2013, Conferința Internațională de fizică, Timișoara, Romania, 24-27 noiembrie 2013

[20] C. Moșoarcă, A. D. Zamfir, Chip-based ionization electron transfer/collision induced dissociation mass spectrometry analysis of the noncovalent interaction between Cholera toxin and G1 ganglioside class, 3rd Biothechnology World Congress, Dubai, UAE, 10-12 februarie 2014

[21] C. Moșoarcă, L. Lupu, I. Malaescu, A. D. Zamfir, Top-down analysis by electron transfer/collision induced dissociation of noncovalent protein-ganglioside complexes, (oral presentation) 25th MassSpec Forum Vienna, Viena, Austria, 17-19 februarie 2014.

[22] C. Moșoarcă, Alina D. Zamfir, Introduction of chip-based nano-electrospray mass spectrometry with electron transfer /collision induced dissociation in glycoproteomics, (oral presentation) 20th International Symposium on Analytical and Environmental Problems, 22 September 2014, Szeged, Hungary

[23] C. Moșoarcă, Iosif Malaescu, Željka Vukelić, Alina D. Zamfir and Aurel Ercuta, Introducing 2D numerical analysis in modeling of complex carbohydrate mass spectra, TIM-FIZ 2014 Physics whitout frontiers, Conferinta Internationala de fizica, 20-22 noiembrie 2014, Timisoara, Romania

Bibliografie

Capitolul 1

[1] L. Van Vaeck, A. Adriaens, R. Gijbels, () Static secondary ion mass spectrometry: (S-SIMIS) Part 1. Methodology and structural information, Mass Spectrom. Rev., 18(1), 1–47, 1999;

[2] T. W. Bentley, R. A. W. Johnstone, Mechanism and structure in mass spectrometry: a comparison with other chemical processes, Advances in Physical Organic Chemistry, vol. 8 (ed. V. Gold), Academic Press, London, 1970;

[3] H. D. Beckey, Principles of Field Ionization and Field Desorption in Mass Spectrometry, Pergamon Press, Oxford, 1977;

[4] R. G. Cooks, G. Chen, P. Wong, H. Wollnik, Mass spectrometers, E. Appl. Phys., 19, 289-294, 1997;

[5] A. Adriaens, L. Van Vaeck, Adams F., Static secondary ion mass spectrometry:

(S-SIMIS) Part 2, Material sciences applications, Mass Spectrom. Rev., 18 (1), 48–81, 1999;

[6] M. Yahmashita, J. B. Fenn, Electrospray Ion Source. Another Variation on the Free-Jet Theme, J.Phys.Chem., 88, 4451-4459, 1984;

[7] M. Aleksandrov, L. Gall, V. Krasnov, V. Nikolaev, V. Pavlenko, V. Shkurov, Ion extraction from solutions at atmospheric pressure – a method for mass-spectrometric analysis of bioorganic substance, Dokl. Acad. Nauk SSSR, 277,378-379, 1984;

[8] J. B.Fenn, M. Mann, C. K. Meng, S .F. Wong, C. M. Whitehouse, Electrospray ionization for mass spectrometry of large biomolecules, Science, 246, 64-71, 1989;

[9] J. B. Fenn, Electrospray wings for molecular elephants (Nobel lecture), Angew. Chem. Int. Ed ., 42, 3871-3894, 2003;

[10] Xianlin Han, Dana R. Abendschein, John G. Kelley and Richard W. Gross, Diabetes-induced changes in specific lipid molecular species in rat myocardium, Biochem. J., 352, 79–89, 2000;

[11] F. Adams, R. Gijbels, R. Van Grieken, Inorganic Mass Spectrometry (Chemical Analysis: A Series of Monographs on Analytical Chemistry and Its Applications), vol. 95, John Wiley & Sons, Inc., New York, 1988;

[12] J. B. Fenn, Ion Formation from Charged Droplets: Roles of Geometry, Energy, and Time, J. Am. Soc. Mass Spectrom., 4, 524, 1993;

[13] J. Zeleny, Instability of Electrified Liquid Surfaces, Phys. Rev., 10, 1-7, 1917;

[14] G. I. Taylor, Disintegration of Water Drops in an Electric Field, Proc. Royal Soc. London A, 280, 383-397, 1964;

[15] M. S. Wilm, M. Mann, Electrospray and Taylor-Cone Theory, Dole's Beam of Macromolecules at Last?, Int. J. Mass Spectrom. Ion Proc., 136, 167-180, 1994;

[16] R. B. Dole, Electrospray Ionization Mass Spectrometry- Fundamentals, Instrumentation and Applications, 1st ed., editor; John Wiley & Sons: Chichester, 1997;

[17] M. Dole, L. Mack, R. Hines, R. Mobley, L. Ferguson, M. Alice, Molecular Beams of Macroions, J. Chem. Phys., 49, 2240, 1968;

[18] L. Rayleigh, On the Equilibrium of Liquid Conducting Masses charged with Electricity, Philosophical Magazine, 14, 184–186, 1882;

[19] X. Han, R. W. Gross, Structural determination of picomole amounts of phospholipids via electrospray ionization tandem mass spectrometry, J. Am. Soc. Mass Spectrom., 6, 1202-1210, 1995;

[20] M. T. Davis, D. C. Stahl, T. D. Lee, Low flow high-performance liquid chromatography solvent delivery system designed for tandem capillary liquid chromatography-mass spectrometry, Journal of the American Society for Mass Spectrometry, 6(7), 571–577, 1995;

[21] R. B. Cole, Electrospray Ionization Mass Spectrometry: Fundamentals, Instrumentation, and Applications, ISBN 0-471-145645, John Wiley: New York, 1997;

[22] A. Schmidt, M. Karas, T. Dülcks, Effect of different solution flow rates on analyte ion signals in nano-ESI MS, or: when does ESI turn into nano-ESI?, J. Am. Soc. Mass Spectrom., 14(5), 492–500, 2003;

[23] M. Wilm, M. Mann, Analytical properties of the nanoelectrospray ion source, Anal. Chem., 68(1), 1–8, 1996;

[24] S. N. Jayasinghe, Bio-electrosprays: from bio-analytics to a generic tool for the health sciences, Analyst, 136, 878-890, 2011;

[25] A. D. Zamfir, Ž. Vukelić, J. Peter-Katalinić, A capillary electrophoresis and off-line capillary electrophoresis/electrospray ionization quadrupole time-of-flight tandem mass spectrometry approach for ganglioside analysis, Electrophoresis, 23, 2894-2903, 2002;

[26] A. D. Zamfir, N. Lion, Ž. Vukelić, L. Bindila, J. Rossier, H. H. Girault, J. Peter-Katalinić, Thin chip microsprayer system coupled to quadrupole time-of-flight mass spectrometer for glycoconjugate analysis, Lab Chip, 5, 298-307, 2005;

[27] M. Karas, D. Bachmann, U. Bahr, F. Hillenkamp, High-resolution mass spectrometer for protein chemistry, Int. J. Mass Spectrom. Ion Processes, 78, 53, 1987;

[28] R. S. Ramsey, J. M. Ramsey, Generating electrospray from microchip devices using electroosmotic pumping, Anal Chem., 69, 2617, 1997;

[29] Q. Xue, F. Foret, Y. M. Dunayevskiy, P. M. Zavracky, N. E. McGruer, B. L. Karger, Multichannel Microchip Electrospray Mass Spectrometry, Anal. Chem., 69 (3), 426–430, 1997;

[30] M. Y. Badal, M. Wong, N. Chiem, H. Salimi-Moosavi, D. J. Harrison, Protein Separation and Surfactant Control of Electroosmotic Flow in Poly(dimethylsiloxane)-Coated Capillaries and Microchips, Journal of Chromatography A, 947, 277-286, 2002;

[31] J. Wen, Y. Lin, F. Xiang, D.W. Matson, H.R. Udseth, R.D. Smith, Microfabricated isoelectric focusing device for direct electrospray ionization-mass spectrometry, Electrophoresis, 21, 191-197, 2000;

[32] D. Figeys, S. P. Gygi, G. McKinnon, R. Aebersold, An integrated microfluidics-tandem mass spectrometry system for automated protein analysis, Anal Chem., 70, 3728-3734, 1998;

[33] B. Zhang, F. Foret, B. L. Karger, High-throughput microfabricated CE/ESI-MS: automated sampling from a microwell plate, Anal Chem., 73, 2675-2681, 2001;

[34] S. Zhang, C. K. Van Pelt, D. B. Wilson, Quantitative determination of noncovalent binding interactions using automated nanoelectrospray mass spectrometry, Anal. Chem., 75, 3010-3018, 2003;

[35] J. Li, T. Tremblay, C. Wang, S. Attiya, D. J. Harrison, P. Thibault, Integrated System for high throughput Protein Identification using a Microfabricated Device Coupled to Capillary Electrophoresis/Nanoelectrospray Mass Spectrometry, Proteomics, 1, 975-986, 2001;

[36] T. Wachs, J. Henion, Electrospray device for coupling microscale separations and other miniaturized devices with electrospray mass spectrometry, Anal. Chem., 73, 632-638, 2001;

[37] K. Huikko, P. Ostman, K. Grigoras, S. Tuomikoski, V. M. Tiainen, A. Soininen, K. Puolanne, A. Manz, S. Franssila, R. Kostiainen, T. Kotiaho, Poly(dimethylsiloxane) electrospray devices fabricated with diamond-like carbonpoly (dimethylsiloxane) coated SU-8 masters, Lab. Chip, 3, 67–72, 2003;

[38] S. Benetton, J. Kameoka, A. Tan, T. Wachs, H. Craighead and J. D. Henion, Chip-Based P450 Drug Metabolism Coupled to Electrospray Ionization-Mass Spectrometry Detection, Anal. Chem., 75(23), 6430-6436, 2003;

[39] Y. Yang, J. Kameoka, T. Wachs, J. D. Henion, H. G. Craighead, Quantitative mass spectrometric determination of methylphenidate concentration in urine using an electrospray ionization source integrated with a polymer microchip, Anal Chem., 76, 2568-2574, 2004;

[40] W. C. Sung, S. Y. Huang, P. C. Liao, G. B. Lee, C. W. Li, S. H. Chen, Poly(dimethylsiloxane)-based microfluidic device with electrospray ionization-mass spectrometry interface for protein identification, Electrophoresis, 24, 3648–3654, 2003;

[41] A. D. Zamfir, Recent advances in sheathless interfacing of capillary electrophoresis and electrospray ionization mass spectrometry, J Chromatogr A., 1159(1-2), 2-13, 2007;

[42] W. D. Zencheck, H. Xiao, B. J. Nolen, R. H. Angeletti, T. D. Pollard, S. C. Almo, Nucleotide- and activator-dependent structural and dynamic changes of arp2/3 complex monitored by hydrogen/deuterium exchange and mass spectrometry, J. Mol. Biol., 390, 414–427, 2009;

[43] L. Licklider, X. Q. Wang, A. Desai, Y. C. Tai, T. D. Lee, A micromachined chip-based electrospray source for mass spectrometry, Anal. Chem., 72, 367–375, 2000;

[44] V . Gobry, J. van Oostrum, M. Martinelli, T. C. Rohner, F. Reymond, J. S. Rossier, H. H. Girault, Microfabricated polymer injector for direct mass spectrometry coupling, Proteomics, 2, 405-412, 2002;

[45] H. Moon, A. R. Wheeler, R. L. Garrell, J. A. Loo, C. J. Kim, An integrated digital microfluidic chip for multiplexed proteomic sample preparation and analysis by MALDI-MS, Lab Chip, 6, 1213-1219, 2006;

[46] S. L. Gac, , S. Arscott, C. Cren-Olive, C. Rolando, Two-dimensional microfabricated sources for nanoelectrospray, J. Mass Spectrom., 38, 1259–1264, 2003;

[47] C. H. Yuan, J. Shiea, Sequential Electrospray Analysis Using Sharp-Tip Channels Fabricated on a Plastic, Chip Anal. Chem. 73, 1080–1083, 2001

[48] W. Denga, J. F. Klemic, X. Li, M. A. Reed, A. Gomez, Increase of electrospray throughput using multiplexed microfabricated sources for the scalable generation of monodisperse droplets, Journal of Aerosol Science, 37 (6), 696–714, 2006;

[49] J. Kameoka, R. Orth, B. Llic, D. Czaplewski, T. Wachs, H. G. Graighead, An Electrospray Ionization Source for Integration with Microfluidics, Anal. Chem., 74, 5897–5901, 2002;

[50] K. Tang, Y. Lin, D. W. Matson, T. Kim, R. D. Smith, Generation of multiple electrosprays using microfabricated emitter arrays for improved mass spectrometric sensitivity, Anal. Chem. 73, 1658–1663, 2001;

[51] L. Svennerholm, Ganglioside designation, Adv. Exp. Med. Biol., 125, 111-114, 1980;

[52] IUPAC-IUB Joint Commission on Biochemical Nomenclature, Eur. J. Biochem. 257-293, 1998;

[53] S. U. Walkley, M. Zervas, S. Wiseman, Gangliosides as modulators of dendritogenesis in normal and storage disease-affected pyramidal neurons, Cerebral cortex, 10, 1028-1037, 2000;

[54] R. W. Ledeen, R. K. Yu, L. F. Eng, Gangliosides of human myelin: sialosylgalactosylceramide (G7) as a major component, J.Neurochem., 21, 829-839, 1973;

[55] I. Ienascu, A. X. Lupea, I. Popescu, C. Mosoarca, A. D. Zamfir, Synthesis and characterization of some new 2-hydroxy-N-(2-trifluoromethyl-phenyl)-benzamide derivatives, Rev. Roum. Chem., 53(4), 2008;

[56] T. Visnapuu, A. D. Zamfir, C. Moșoarcă, M. D. Stanescu, T. Alamäe, Fully automated chip-based negative mode nanoelectrospray mass spectrometry of fructooligosaccharides produced by heterologously expressed levansucrase from Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000, Rapid Commun. Mass Spectrom., 23, 1-10, 2009;

[57] D. Condrat, C. Moșoarcă, A. D. Zamfir, F. Crisan, M. R. Szabo, A. X. Lupea, Qualitative and quantitative analysis of gallic acid in Alchemilla vulgaris, Allium ursinum, Acorus calamus and Solidago virga-aurea by chip – electrospray ionization mass spectrometry and high performance liquid chromatography, Central European Journal of Chemistry, 8, 530-535, 2010;

[58] M. Stanescu, F. Harja, C. Moșoarcă, A. D. Zamfir, Biogenic amines fingerprints evidenced by performant MS analysis, Revue Roumaine De Chimie, 55, 1053, 2010;

[59] C. Moșoarcă, R. M. Ghiulai, C. R. Novaconi, Ž. Vukelić, A. D. Zamfir, Application of chip-based nanoelectrospray ion trap mass spectrometry to compositional and structural analysis of gangliosides in human fetal cerebellum, Analytical Letters, 44, 1036-1049, 2011;

[60] M. N. Stefanut, A. Cata, R. Pop, C. Moșoarcă; A. D. Zamfir, Anthocyanins HPLC-DAD and MS characterization, total phenolics, and antioxidant activity of some berries extracts, Anal. Letters, 44, 2843-2855, 2011;

[61] T. Visnapuu,; K. Mardo, C. Moșoarcă, A. D. Zamfir, A. Vigants, T. Alamaee, Levansucrases from Pseudomonas syringae pv. tomato and P. chlororaphis subsp. aurantiaca: Substrate specificity, polymerizing properties and usage of different acceptors for fructosylation, Journal of Biotechnology, 155, 338-349, 2011;

[62] H. Yuasa, D. A. Scheinberg, A. N. Houghton, Gangliosides of T lymphocytes: evidence for a role in T-cell activation, Tissue Antigens, 36, 47-56, 1990;

[63] S. U. Walkley, M. Zervas, S. Wiseman, Gangliosides as modulators of dendritogenesis in normal and storage disease-affected pyramidal neurons, Cerebral cortex, 10, 1028-1037, 2000;

[64] H. J. Willison, G. O'Hanlon, G. Paterson, Mechanisms of action of anti-GM1 and anti-GQ1b ganglioside antibodies in Guillain-Barré syndrome, J.Infect.Dis., 176, 144-149, 1997;

[65] G. Bolot, M. J. David, T. Kasama, T. Taki, S. Handa, M. Richard, J. C. Pignat, L. Thomas, J. Portoukalian, Occurrence of monosialosyl pentahexaosylceramide GalNAc-GM1 as specifc tumor-associated ganglioside of human head and neck squamous cell carcinomas, Cancer Lett., 135, 159-164, 1999;

[66] H. Li, J. R. Snelling, M. P. Barrow, J. H. Scrivens, P. J. Sadler, P. B. O'Connor, Mass spectrometric strategies to improve the identification of Pt(II)-modification sites on peptides and proteins, J. Am. Soc. Mass Spectrom., 25(7), 1217-1227, 2014;

[67] E. J. Faber, M. J. van den Haak, J. P. Kamerling, J. F.Vliegenthart, Structure of the exopolysaccharide produced by Streptococcus thermophilus S3, Carbohydr. Res., 331(2), 173-82, 2001;

[68] V. B. Ivleva, L. M. Sapp, P. B. O'Connor, C. E.Costello, Ganglioside analysis by thin-layer chromatography matrix-assisted laser desorption/ionization orthogonal time-of-flight mass spectrometry, J. Am. Soc. Mass Spectrom., 16(9), 1552-1560, 2005;

[69] M. Stojiljkovic, T. Blagojevic, S. Vukosavic, N. D. Zvezdina, S. Pekovic, G. Nikezic, L. Rakic, Ganglioside GM1 and GM3 in early human brain development: an immunocytochemical study, Int. J. Devel. Neuroscience, 14(1), 35-44, 1996;

[70] R. El-Abassi, D. Singhal, J. D.England, Fabry's disease, J. Neurol. Sci., 344(1-2), 5-19, 2014;

[71] C. Flangea, C. Moșoarcă, C. Cozma, M. Galusca, M. Przybylski, A. D. Zamfir, Testing the feasibility of fully automated chip-based nanoelectrospray ionization mass spectrometry as a novel tool for rapid diagnosis of Fabry disease, Electrophoresis, 34, 1572-1580, 2013;

[72]

[73]

[74]

[75]

[76]

[77]

[78]

[79]

[80]

[81] A. Tan, S. Benetton, J. D. Henion, Chip-Based Solid-Phase Extraction Pretreatment for direct electrospray mass spectrometry analysis using an array of monolithic columns in a polymeric substrate, Anal. Chem., 75, 5504–5511, 2003;

[82] A. D. Zamfir, Studiul ionizării prin electrospray în spectrometria de masă, Teză de doctorat, Universitatea Babeș-Bolyai, Cluj-Napoca, 2001;

[83] A. D. Zamfir, J. Peter-Katalinic, Glycoscreening by sheathless on-line capillary electrophoresis/electrospray quadrupole time-of flight tandem mass spectrometry, Electrophoresis, 22, 2448-2457, 2001;

[84] P. Kebarle, A brief overview of the present status of the mechanisms involved in electrospray mass spectrometry, Journal of Mass Spectrometry, 35(7), 804-817, 2000;

[85] A. D. Zamfir, S. König, J. Althoff, J. Peter-Katalinic, Capillary electrophoresis and off-line CE/ESI-QTOF tandem MS of carbohydrates, J. Chromatogr. A, 895, 291-299, 2000;

[86] A. D. Zamfir, Sisteme avansate de ionizare prin microchip pentru spectrometria de masa si aplicatii, Ed. Canonica, Cluj-Napoca, ISBN 978-973-88608-7-2, 2008;

[87] F. Kitagawa, K. Otsuka, Recent progress in microchip electrophoresis-mass spectrometry, J. Pharm Biomed Anal., 55, 668-678, 2011;

[88] F. Hillenkamp, M. Karas, R. C. Beavis, B. T. Chait, Matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry of biopolymers, Anal Chem., 24, 1193A-1203A, 1991;

[89] Q. Xue, Y. M. Dunayevskiy, F. Foret, B. L. Karger, Integrated multichannel microchip electrospray ionization mass spectrometry: analysis of peptides from on-chip tryptic digestion of melittin, Rapid Commun. Mass Spectrom., 11, 1253–1256, 1997;

[90] J. Li, T. Leriche, T. L. Tremblay, C. Wang, E. Bonneil, D. J. Harrison, P. Thibault, Application of microfluidic devices to proteomics research: identification of trace-level protein digests and affinity capture of target peptides, Mol Cell. Proteomics, 1, 157–168, 2002;

[91] I. M. Lazar, L. Li, Y. Yang, B. L. Karger, Microfluidic Device for Capillary Electro-Chromatography Mass Spectrometry, Electrophoresis, 24, 3655–3662, 2003;

[92] I. M. Lazar, J. Grym, F. Foret, Microfabricated devices: A new sample introduction approach to mass spectrometry, Mass Spectrom. Rev., 25, 573-594, 2006;

[93] W. Blum, P. Ramstein, G. Eglinton, Coupling of high temperature glass capillary columns to a mass spectrometer. GC/MS analysis of metalloporphyrins from Julia Creek oil shale samples, J. of High Resolution Chromatography, 13 (2), 85–93, 1990;

[94] A. Rouleau, M. El Osta, G. Lucchi, P. Ducoroy, W. Boireau, Immuno-MALDI-MS in human plasma and on-chip biomarker characterizations at the femtomole level, Sensors (Basel), 12(11), 15119-15132, 2012;

[95] http://www.agilent.it/labs/features/2004_microfluidics.html

[96] Y. Deng, H. Zhang, J. Henion, Chip-based quantitative capillary electrophoresis/mass spectrometry determination of drugs in human plasma, Anal. Chem., 73, 1432-1439, 2001;

[97] J. Zaia, Mass spectrometry and glycomics OMICS, 14, 401-418, 2010;

[98] C. Flangea, C. Schiopu, E. Sisu, A. Serb, M. Przybylski, D. G. Seidler, A. D. Zamfir, Determination of sulfation pattern in brain glycosaminoglycans by chip-based electrospray ionization ion trap mass spectrometry, Anal. Bioanal. Chem., 395, 2489-2498, 2009;

[99] J. Peter-Katalinić, Methods in enzymology: O-glycosylation of proteins, Methods Enzymol., 405, 139-171, 2005;

[100] A. D. Zamfir, N. Lion, Ž. Vukelic, L. Bindila, J. Rossier, H. Girault, J. Peter-Kataliniĉ, Thin chip microsprayer system coupled to quadrupole time-of-flight mass spectrometer for glycoconjugate analysis, Lab. Chip, 5, 298-307, 2005;

[101] I. Perdivara, E. Sisu, I. Sisu, N. Dinca, K. B. Tomer, M. Przybylski, A. D. Zamfir, Enhanced electrospray ionization Fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometry of long-chain polysaccharides, Rapid Commun. Mass Spectrom., 22, 773-782, 2008;

[102] E. Sisu, W. T. E. Bosker, W. Norde, T. M. Slaghek, J. W. Timmermans, J. P. Katalinic, M. A. Cohen-Stuart, A. D. Zamfir, Electrospray ionization quadrupole time-of-flight tandem mass spectrometric analysis of hexamethilene diamine-modified maltodextrin and dextran, Rapid. Commun. Mass Spectrom., 20, 209-218, 2006;

[103] I. Sisu, V. Udrescu, C. Flangea, S. Tudor, N. Dinca, L. Rusnac, A. D. Zamfir, E. Sisu, Synthesis and structural characterization of amino-functionalized polysaccharides, Cent. Eur. J. Chem., 7, 66-73, 2009;

[104] A. D. Zamfir, D. Seidler, E. Schonherr, H. Kresse, J. Peter-Katalinić, On-line sheathless capillary electrophoresis/nanoelectrospray ionization-tandem mass spectrometry for the analysis of glycosaminoglycan oligosaccharides, Electrophoresis, 25, 2010-2016, 2004;

[105] M. Froesch, L. Bindila, A. D. Zamfir, J. Peter-Katalinić, Sialylation analysis of O-glycosylated sialylated peptides from urine of patients suffering from Schindler's disease by Fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometry and sustained off-resonance irradiation collision-induced dissociation, Rapid Commun. Mass Spectrom., 17, 2822-2832, 2003;

[106] L. Bindila, M. Froesch, N. Lion, Ž. Vukelic, J. Rossier, H. Girault, J. Peter-Katalinić, A. D. Zamfir, A thin chip microsprayer system coupled to Fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometry for glycopeptide screening, Rapid Commun. Mass Spectrom., 18, 2913-2920, 2004;

[107] A. D. Zamfir, Ž. Vukelic, J. Peter-Katalinić, A capillary electrophoresis and off-line capillary electrophoresis/electrospray ionization quadrupole time-of-flight tandem mass spectrometry approach for ganglioside analysis, Electrophoresis, 23, 2894-2903, 2002;

[108] A.D. Zamfir, S. Vakhrushev , A. Sterling, H. Niebel, M. Allen, J. Peter-Katalinić, Fully automated chip-based mass spectrometry for complex carbohydrate system analysis, Anal. Chem., 76, 2046-2054, 2004;

[109] C. J. Hogan, J. A. Carroll, H. W. Rohrs, P. Biswas, M. L. Gross, Combined charged residue-field emission model of macromolecular electrospray ionization, Anal. Chem., 81(1), 369–77, 2009;

[110] A. Serb, C. Schiopu, C. Flangea, E. Sisu, A. D. Zamfir, Top-down glycolipidomics: fragmentation analysis of ganglioside oligosaccharide core and ceramide moiety by chip-nanoelectrospray collision-induced dissociation MS2-MS6, J. Mass Spectrom., 44, 1434–1442, 2009;

Capitolul 2

[111] J. R. Chapman, Practical Organic Mass Spectrometry, Chichester: Wiley, 1993;

[112] R. G. Cooks, G. Chen, P. Wong, H. Wollnik, Mass spectrometers, Encl. Appl. Phys., 19, 289-294, 1997;

[113] P. S. H. Whong, R. G. Cooks, Ion Trap Mass Spectrometry, Current Separations, 16(3), 1997;

[114] J. B. Fenn, M. Mann, C. K. Meng, S. F. Wong, C. M. Whitehouse, Electrospray ionization-principles and practice, Mass Spectrom. Rev., 9, 37-70, 1990;

[115] L. Svennerholm, P. Fredman, A procedure for the quantitative isolation of brain gangliosides, Biochim. Biophys. Acta, 617, 97-109, 1980;

[116] R. Almeida, C. Moșoarcă, M. Chirita, V. Udrescu, N. Dinca, Ž. Vukelić, M. Allen, A. D. Zamfir, Coupling of fully automated chip-based electrospray ionization to high capacity ion trap mass spectrometer for ganglioside analysis, Anal. Biochem., 378, 43–52, 2008;

[117] C. Flangea, C. Schiopu, F. Capitan, C. Moșoarcă, M. Manea, E. Sisu, A.D. Zamfir, Fully automated chip-based nanoelectrospray combined with electron transfer dissociation for „high throughput top-down proteomics, Central European Journal of Chemistry, 11, 25-34, 2013;

[118] F. F. Hsu, J. Turk, Structural determination of glycosphingolipids as lithiate adducts by electrospray ionization mass spectrometry using low energy collisional activated dissociation on a triple stage quadrupole instrument, J. Am. Soc. Mass. Spectrom., 12, 61-79, 2001.

[119] C. Moșoarcă, C. Flangea, C. Cozma, I. Malaescu, M. Przybylski, A. D. Zamfir, Fully Automated Chip-Nanoelectrospray Combined with Collision-Induced and Electron Transfer Dissociation for Rapid Diagnosis of Fabry Disease, 10-13 March 2013, Berlin, Germany, DGMS 2013;

[120] B. Domon, C. Costello, A systematic nomenclature for carbohydrate fragmentations in FAB-MS/MS spectra of glycoconjugates,Glycoconj. J., 5, 397–409, 1988;

[121] P. Roepstorff, J. Fohlman, Proposal for a common nomenclature for sequence ions in mass spectra of peptides, Biomed. Mass Spectrom., 11, 601–609, 1984;

[122] G. Blix, Einige Beobachtungen ϋber eine hexosaminhaltige Substanz in der Protagonfraktion des Gehirns, Skand. Arch. Physiol., 80, 46-51, 1938;

[123] J. Folch, S. Arsove, J. A. Meath, Isolation of brain strandin, a new type of large molecule tissue component, J.Biol.Chem., 191, 819-831, 1951;

[124] E. Z. Klenk, Uber die Ganglioside, eine neue Gruppe von zuckerhaltigen Gehirnlipoiden, Hoppe-Seyler's Zeitschrift fur Physiologische Chemie,: 273, 76-86, 1942;

[125] L. Svennerholm, Composition of gangliosides from human brain, Nature, 177, 524-525, 1956;

[126] W. E. Van Heyningen, P. A. Miller, The fixation of tetanus toxin by ganglioside, J. Gen. Microbiol., 24, 107-19, 1961;

[127] E. Klenk, W. Gielen, Research on the constitution of a ganglioside from human brain and the separation of the mixture into the components, Hoppe Seylers Z Physiol Chem., 326, 144-57, 1961;

[128] E. G. Trams, C. J.Lauter, Adenosine deaminase of cultured brain cells, Biochem. J., 152(3), 681-687, 1975;

[129] R. Kuhn, H. Wiegandt, Further gangliosides from the human brain, Z Naturforsch B. 19, 256-7, 1964;

[130] L. Svennerholm, P. Fredman, A procedure for the quantitative isolation of brain gangliosides, Biochim. Biophys. Acta, 617, 97-109, 1980;

[131] D. L. Nelson, M. M. Cox, Lipids, Lehninger Principles of Biochemistry, 4th edition, W. H. Freeman & Co., 357. ISBN 9780716743392, 2005;

Capitolul 3

[132] C. Wetzel, S. Li, P. A. Limbach, Metabolic de-isotoping for improved LC-MS characterization of modified RNAs, J. Am. Soc. Mass Spectrom., 25(7), 1114-23, 2014;

[133] H. Shinohara, T. Suzuki, F. Kitagawa, J. Mizunoa, K. Otsuka, S. Shoji, Polymer microchip integrated with nano-electrospray tip for electrophoresis–mass spectrometry, Sensors and Actuators B, 132, 368–373, 2008;

[134] Y. Deng, J. Henion, J. Li, P. Thibault, C . Wang, D.J. Harrison, Chip-based capillary electrophoresis/mass spectrometry determination of carnitines in human urine, Anal. Chem., 73, 639-646, 2001;

[135] Y. Deng, H. Zhang, J. Henion, Chip-based quantitative capillary electrophoresis/mass spectrometry determination of drugs in human plasma, Anal. Chem., 73, 1432-1439, 2001;

[136] Y. Liu, B. Liu, P. Yang, H. H. Girault, Microfluidic enzymatic reactors for proteome research, Anal. Bioanal. Chem., 390, 227-229, 2008;

[137] B. Zhang, F. Foret, B. L. Karger, High-throughput microfabricated CE/ESI-MS: automated sampling from a microwell plate, Anal. Chem., 73, 2675-2681, 2001;

[138] Y. Yang, J. Kameoka, T. Wachs, J. D. Henion, H. G. Craighead, Quantitative mass spectrometric determination of methylphenidate concentration in urine using an electrospray ionization source integrated with a polymer microchip, Anal. Chem., 76, 2568-2574, 2004;

[139] L. K.Sørensen, A liquid chromatography/tandem mass spectrometric approach for the determination of gangliosides GD3 and GM3 in bovine milk and infant formulae, Rapid Commun. Mass Spectrom., 20(24), 3625-3633, 2006;

[140] N. Mori, Y. Fukano, R. Arita, R. Shirakawa, K. Kawazu, M. Nakamura, S. Amano, Rapid identification of fatty acids and (O-acyl)-ω-hydroxy fatty acids in human meibum by liquid chromatography/high-resolution mass spectrometry, J. Chromatogr. A., 1347, 129-36, 2014;

[141] Y. T. Li, E. Sugiyama, T. Ariga, J. Nakayama, M. Hayama, Y. Hama, H. Nakagawa, T. Tai, K. Maskos, S. C. Li, T. Kasama, Association of GM4 ganglioside with the membrane surrounding lipid droplets in shark liver, J. Lipid Res., 43(7), 1019-1025, 2002;

[142] V. B. Ivleva, L. M. Sapp, P. B. O'Connor, C. E.Costello, Ganglioside analysis by thin-layer chromatography matrix-assisted laser desorption/ionization orthogonal time-of-flight mass spectrometry, J. Am. Soc. Mass Spectrom., 16(9), 1552-1560, 2005;

[143] H. J. Cho, M. J. Song, A gammaherpesvirus establishes persistent infection in neuroblastoma cells, Mol. Cells., 37(7), 518-525, 2014;

[144] W. Zou, Z. Y. Li, Y. L. Li, K. L. Ma, Z. C. Tsui, Overexpression of PEMT2 downregulates the PI3K/Akt signaling pathway in rat hepatoma cells, Biochim. Biophys. Acta., 1581(1-2), 49-56, 2002;

[145] E. R. Sjoberg, A. E. Manzi, K. H. Khoo, A. Dell, A. Varki, Structural and immunological characterization of O-acetylated GD2. Evidence that GD2 is an acceptor for ganglioside O-acetyltransferase in human melanoma cells, J. Biol. Chem., 267(23), 16200-16211, 1992;

[146] S. N. Jackson, D. Barbacci, T. Egan, E. K. Lewis, J. A. Schultz, A. S. Woods, MALDI-Ion Mobility Mass Spectrometry of Lipids in Negative Ion Mode, Anal. Methods., 6(14), 5001-5007, 2014;

[147] J. Ueyama, M. Kamijima, T. Kondo, K. Takagi, E. Shibata, T. Hasegawa, S. Wakusawa, T. Taki, M. Gotoh, I. Saito, Revised method for routine determination of urinary dialkyl phosphates using gas chromatography-mass spectrometry, J. Chromatogr. B. Analyt. Technol. Biomed. Life Sci., 878(17-18), 1257-1263, 2010;

[148] T. M. Schaub, C. L. Hendrickson, S. Horning, J. P. Quinn, M. W. Senko, A. G.Marshall, High-performance mass spectrometry: Fourier transform ion cyclotron resonance at 14.5 Tesla, Anal. Chem., 80(11), 3985-3990, 2008;

[149] H. Waki, A. Murata, K. Kon, K. Maruyama, S. Kimura, H. Ogura, S. Ando, Isolation and characterization of a trisialyllactosylceramide, GT3, containing an O-acetylated sialic acid in cod fish brain, J. Biochem., 113(4), 502-507, 1993;

[150] T. Antoine, A. Heyraud, C. Bosso, E. Samain, Highly efficient biosynthesis of the oligosaccharide moiety of the GD3 ganglioside by using metabolically engineered Escherichia coli, Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 44(9), 1350-1352, 2005;

[151] H. Yu, J. Cheng, L. Ding, Z. Khedri, Y. Chen, S. Chin, K. Lau, V. K. Tiwari, X. Chen,

Chemoenzymatic synthesis of GD3 oligosaccharides and other disialyl glycans containing natural and non-natural sialic acids, J. Am. Chem. Soc., 131(51), 18467-18477, 2009;

[152] L. N. Robinson, C. Artpradit, R. Raman, Z. H. Shriver, M. Ruchirawat, R. Sasisekharan, Harnessing glycomics technologies: integrating structure with function for glycan characterization, Electrophoresis, 33(5), 797-814, 2012;

[153] R. Kumarswamy, S. Chandna, Putative partners in Bax mediated cytochrome-c release: ANT, CypD, VDAC or none of them?, Mitochondrion, 9, 1–8. 2009;

[154] V. P. Skulachev, Cytochrome c in the apoptotic and antioxidant cascades, FEBS Lett., 423, 275–280, 1998;

[155] P. F. Lurquin, L. Stone, L. L. Cavalli-Sforza, Genes, culture, and human evolution: a synthesis, Oxford: Blackwell, 79, 2007;

[156] E. Margoliash, Primary structure and evolution of cytochrome c, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 50, 672–679, 1963;

[157] S. Orrenius, B. Zhivotovsky, Cardiolipin oxidation sets cytochrome c free, Nat. Chem. Biol., 1, 188–189, 2005;

Capitolul 4

[158] B. T. Higgins, A. Thornton-Dunwoody, J. M. Labavitch, J. S.VanderGheynst, Microplate assay for quantitation of neutral lipids in extracts from microalgae, Anal. Biochem., S0003-2697(14), 00314-00315, 2014;

[159] C. Moșoarcă, T. Visnapuu, T. Alamäe, A. D. Zamfir, Characterization of fructooligosaccharides produced by levansucrases from Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 and Pseudomonas chlororaphis subsp. aurantiaca by fully automated chip-based nanoESI tandem MS, 2nd International Conference of the Romanian Society for Mass Spectrometry, Timisoara, Romania, 1-5 mai 2011;

[160] C. Moșoarcă, C. Flangea, I. Sisu, E. Sisu, M. Manea, A. D. Zamfir, Combining fully automated chip-based electrospray ionization and multistage CID/ETD mass spectrometry for peptides and glycopeptides, 2nd International Conference of the Romanian Society for Mass Spectrometry, Timisoara, Romania, 1-5 mai 2011;

[161] C. Moșoarcă, C. Flangea, E. Sisu, A. D. Zamfir, I. Malaescu, Implementation of chip-based electrospray ionization in combination with electron transfer dissociation mass spectrometry for peptide and glycopeptide sequencing, Physics Conference TIM-11, Timisoara, Romania, 24-27 November 2011;

[162] C. Flangea, C. Schiopu, F. Capitan, C. Moșoarcă, M. Manea, E. Sisu, A.D. Zamfir, A novel platform for top-down proteomics: chip-based nanoelectrospray combined with electron transfer dissociation mass spectrometry, Joint Conference of Polish Mass Spectrometry Society and German Mass Spectrometry Society, Poznan, Poland, March 4-7 2012;

[163] C. Moșoarcă, I. Malaescu, T. Visnapuu, T. Alamäe, A. D. Zamfir, Chip-based nanoelectrospray mass spectrometry of fructooligosaccharides produced by levansucrases from Pseudomonas syringae pv. tomato and P. chlororaphis subsp. aurantiaca, Joint Conference of German Mass Spectrometry Society and Polish Mass Spectrometry Society Poznan, Polonia, March 4-7 2012;

[164] C. Moșoarcă, I. Malaescu, T. Visnapuu, T. Alamäe, A. D. Zamfir, Fructooligosaccharides are produced by levansucrases from Pseudomonas syringae pv. tomato and P. chlororaphis subsp. aurantiaca as revealed by chip-based nanoelectrospray mass spectrometry analysis, 4th International Congress and 30th Annual Scientific Session of RSCB (Romanian Society for Cell Biology), Satu Mare(Romania)/Debrecen(Hungary), June 13-17 2012;

[165] C. Flangea, C. Moșoarcă,　M. Manea,　C. Schiopu,　E. Sisu,　A. D. Zamfir,

Fully automated chip-based nanoelectrospray combined with electron transfer dissociation for high throughput top-down proteomics, 19th International Mass Spectrometry Conference, Kyoto, Japan, 2012;

[166] M. Galusca,　C. Flangea,　 C. Moșoarcă,　C. Cozma,　A. D. Zamfir, Chip-based electrospray ionization tandem mass spectrometry a novel tool for rapid diagnostic of Fabry disease, Kyoto, Japan, 2012;

[167] C. Moșoarcă, I. Malaescu, T. Visnapuu, T. Alamäe, A. D. Zamfir, Chip-Based nanoelectrospray mass spectrometry analysis of fructooligosaccharides produced by levansucrases from Pseudomonas syringae and aurantiaca, 6th Central and Eastern European Proteomics Conference, Budapest, Hungary, 14-17 October 2012;

[168] C. Moșoarcă, I. Malaescu, T. Visnapuu, T. Alamäea, A. D. Zamfir, Chip-based nanoelectrospray mass spectrometry of fructooligosaccharides produced by levansucrases from Pseudomonas syringae pv. tomato and P. chlororaphis subsp. Aurantiaca, International Symposium Research and Education in Innovation Era,. 4th Edition, Arad, Romania (ISREIE 2012), November 08-09 2012;

[169] F. Capitan, C. Schiopu, C. Moșoarcă, C. Flangea, C. Ilie, I. Velea, E. Sisu, A. D. Zamfir, Compositional and structural analysis of gangliosides in human fetal cerebellum by chip electrospray mass spectrometry, International Symposium Research and Education in Innovation Era,. 4th Edition, Arad, Romania (ISREIE 2012), November 08-09 2012;

[170] M. Galusca, C. Flangea, C. Moșoarcă, C. Cozma, A. D. Zamfir, Chip-based electrospray ionization tandem mass spectrometry a novel tool for rapid diagnostic of Fabry disease, International Symposium Research and Education in Innovation Era,. 4th Edition, Arad, Romania (ISREIE 2012), November 08-09 2012;

[171] C. Moșoarcă, I. Malaescu, Ž. Vukelić, A. D. Zamfir, Automated chip-based nanoelectrospray-mass spectrometry of gangliosides from human anencephaly, TIM 12 Physics Conference, Timisoara, Romania, 27-30 November 2012;

[172] M. Galusca, C. Flangea, C. Moșoarcă, C. Cozma, Alina D. Zamfir, Rapid diagnosis of Fabry disease by a novel method based on automated chip-nanoelectrospray ionization mass spectrometry, Mass Spectrometry Forum, Vienna, Austria, February 19-23 2013;

[173] A.D. Zamfir, C. Moșoarcă, C. Flangea, C. Cozma, I. Malaescu, M. Przybylski, Fully automated chip-nanoelectrospray combined with collision induced and electron transfer dissociation, 46th German Society for Mass Spectrometry Conference, Berlin, Germany, March 10-14 2013;

[174] M. Galusca (Sarbu), C. Flangea, C. Moșoarcă, C. Cozma, A. D. Zamfir, Fabry disease-Rapid diagnosis by chip-based nanoelectrospray ionization tandem mass spectrometry, 2nd Middle Eastern and Mediterranean Sea Region Countries Mass Spectrometry Conference, Siena, Italy, June 30 – July 4 2013;

[175] C. Moșoarcă, C. Flangea, M. Galusca, A.D. Zamfir, Rapid diagnosis through molecular markers identified by advanced mass spectrometry, 5th International Congress and the 31th Annual Session of the Romanian Society for Cell Biology, Timisoara, Romania ,June 05-09 2013;

[176] C. Moșoarcă, I. Malaescu, A. D. Zamfir, Testing The Feasibility Of Fully Automated Chip-Based Nanoelectrospray Ionization Mass Spectrometry As A Novel Tool For Rapid Diagnosis Of Fabry Disease, A Treia Sesiune Națională De Comunicări Științifice a Doctoranzilor, 11 June 2013;

[177] J. Liu, L. Jin, L. Zhang, Z. Li, L. Wang, R. Ye, Y. Zhang, A. Ren, Placental concentrations of manganese and the risk of fetal neural tube defects, J. Trace Elem. Med. Biol., 27(4), 322-325, 2013;

[178] J. Tesarík, J. Mrovec, A. Polcrová, Disulphates of neutral steroids in the amniotic fluid from anencephalic preganancies, J. Endocrinol., 51(1), 109-115, 1971;

[179] Z. Vukelić, W. Metelmann, J. Müthing, M. Kos, J. Peter-Katalinić, Anencephaly: structural characterization of gangliosides in defined brain regions, Biol. Chem., 382(2), 259-74, 2001;

[180] Y. Chi, L. Pei, G. Chen, X. Song, A. Zhao, T. Chen, M. Su, Y. Zhang, J. Liu, A. Ren, X. Zheng, G. Xie, W. Jia, Metabonomic profiling of human placentas reveals different metabolic patterns among subtypes of neural tube defects, J. Proteome Res., 13(2), 934-45, 2014;

[181] A. Ren, X. Qiu, L. Jin, J. Ma, Z. Li, L. Zhang, H. Zhu, R. H. Finnell, T. Zhu, Association of selected persistent organic pollutants in the placenta with the risk of neural tube defects, Proc. Natl. Acad. Sci. U S A., 108(31), 12770-12775, 2011;

[182] J. Tesarík, J. Mrovec, A. Polcrová, Disulphates of neutral steroids in the amniotic fluid from anencephalic preganancies, J. Endocrinol., 51(1), 109-115, 1971.

Lista lucrărilor științifice

1) Articole publicate în reviste internaționale cu factor ISI:

[1] R. Almeida, C. Moșoarcă, M. Chirita, V. Udrescu, N. Dinca, Ž. Vukelić, M. Allen, A. D. Zamfir, Coupling of fully automated chip-based electrospray ionization to high capacity ion trap mass spectrometer for ganglioside analysis, Anal. Biochem. 378, 43–52, 2008, factor ISI: 3.1

[2] I. Ienascu, A.X. Lupea, I. Popescu, C. Moșoarcă, A.D. Zamfir, Synthesis and characterization of some new 2-hydroxy-N-(2-trifluoromethyl-phenyl)-benzamide derivatives,

Rev. Roum. Chem. 53(4), 2008, factor ISI: 0.6

[3] T.Visnapuu, A. D. Zamfir, C. Moșoarcă, M. D. Stanescu, T.Alamäe, Fully automated chip-based negative mode nanoelectrospray mass spectrometry of fructooligosaccharides produced by heterologously expressed levansucrase from Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000, Rapid Commun. Mass Spectrom. 23, 1-10, 2009, factor ISI: 2.8

[4] D. Condrat, C. Moșoarcă, A. D. Zamfir, F. Crisan, M. R. Szabo, A. X. Lupea, Qualitative and quantitative analysis of gallic acid in Alchemilla vulgaris, Allium ursinum, Acorus calamus and Solidago virga-aurea by chip – electrospray ionization mass spectrometry and high performance liquid chromatography, Central European Journal of Chemistry, 8, 530-535, 2010, factor ISI: 1.1

[5] D. M. Stanescu, F. Harja, C. Moșoarcă, A. D. Zamfir, Biogenic amines fingerprints evidenced by performant MS analysis, Revue Roumaine De Chimie, 55, 1053-+, 2010, factor ISI: 0.6

[6] C. Moșoarcă, R. M. Ghiulai, C. R. Novaconi, Ž. Vukelić, A. D. Zamfir, Application of chip-based nanoelectrospray ion trap mass spectrometry to compositional and structural analysis of gangliosides in human fetal cerebellum, Analytical Letters, 44, 1036-1049, 2011, factor ISI: 1.1

[7] M. N. Stefanut, A. Cata, R. Pop, C. Moșoarcă, A. D. Zamfir, Anthocyanins HPLC-DAD and MS characterization, total phenolics, and antioxidant activity of some berries extracts,

Analytical Letters, 44, 2843-2855, 2011, factor ISI: 1.1

[8] T. Visnapuu, K. Mardo, C. Moșoarcă, A. D. Zamfir, A.Vigants, T. Alamae, Levansucrases from Pseudomonas syringae pv. tomato and P. chlororaphis subsp. aurantiaca: Substrate specificity, polymerizing properties and usage of different acceptors for fructosylation, Journal of Biotechnology, 155, 338-349, 2011, factor ISI: 3.3

[9] C. Flangea, C. Schiopu, F. Capitan, C. Moșoarcă, M. Manea, E. Sisu, A.D. Zamfir, Fully automated chip-based nanoelectrospray combined with electron transfer dissociation for high throughput top-down proteomics, Central European Journal of Chemistry, 11, 25-34, 2013, factor ISI: 1.1

[10] C. Flangea, C. Moșoarcă, C. Cozma, M. Galusca, M. Przybylski, A. D. Zamfir, Testing the feasibility of fully automated chip-based nanoelectrospray ionization mass spectrometry as a novel tool for rapid diagnosis of Fabry disease, Electrophoresis, 34: 11, 1572-1580, 2013, factor ISI: 3.3

Capitol de carte

C. Moșoarcă, Ž. Vukelić, A.D. Zamfir, Mapping and sequencing of gangliosides from anencephaly by electrospray ionization high capacity ion trap mass spectrometry, in: Applications of Mass Spectrometry in Life Safety, Ed. Springer Verlag, Germany, ISBN 978-1-4020-8810-0; pg. 71-82; 2008

2) Lucrări susținute la Conferințe Internaționale:

[1] C. Moșoarcă, T. Visnapuu, T. Alamäe, A. D. Zamfir, Characterization of fructooligosaccharides produced by levansucrases from Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 and Pseudomonas chlororaphis subsp. aurantiaca by fully automated chip-based nanoESI tandem MS, 2nd International Conference of the Romanian Society for Mass Spectrometry, Timisoara, Romania, 1-5 mai 2011;

[2] C. Moșoarcă, C. Flangea, I. Sisu, E. Sisu, M. Manea, A. D. Zamfir, Combining fully automated chip-based electrospray ionization and multistage CID/ETD mass spectrometry for peptides and glycopeptides, 2nd International Conference of the Romanian Society for Mass Spectrometry, Timisoara, Romania, 1-5 mai 2011;

[3] C. Moșoarcă, C. Flangea, E. Sisu, A. D. Zamfir, I. Malaescu, Implementation of chip-based electrospray ionization in combination with electron transfer dissociation mass spectrometry for peptide and glycopeptide sequencing, Physics Conference TIM-11, Timisoara, Romania, 24-27 November 2011;

[4] C. Flangea, C. Schiopu, F. Capitan, C. Moșoarcă, M. Manea, E. Sisu, A.D. Zamfir, A novel platform for top-down proteomics: chip-based nanoelectrospray combined with electron transfer dissociation mass spectrometry, Joint Conference of Polish Mass Spectrometry Society and German Mass Spectrometry Society, Poznan, Poland, March 4-7 2012;

[5] C. Moșoarcă, I. Malaescu, T. Visnapuu, T. Alamäe, A. D. Zamfir, Chip-based nanoelectrospray mass spectrometry of fructooligosaccharides produced by levansucrases from Pseudomonas syringae pv. tomato and P. chlororaphis subsp. aurantiaca, Joint Conference of German Mass Spectrometry Society and Polish Mass Spectrometry Society Poznan, Polonia, March 4-7 2012;

[6] C. Moșoarcă, I. Malaescu, T. Visnapuu, T. Alamäe, A. D. Zamfir, Fructooligosaccharides are produced by levansucrases from Pseudomonas syringae pv. tomato and P. chlororaphis subsp. aurantiaca as revealed by chip-based nanoelectrospray mass spectrometry analysis, 4th International Congress and 30th Annual Scientific Session of RSCB (Romanian Society for Cell Biology), Satu Mare(Romania)/Debrecen(Hungary), June 13-17 2012;

[7] C. Flangea, C. Moșoarcă,　M. Manea,　C. Schiopu,　E. Sisu,　A. D. Zamfir,

Fully automated chip-based nanoelectrospray combined with electron transfer dissociation for high throughput top-down proteomics, 19th International Mass Spectrometry Conference, Kyoto, Japan, 2012;

[8] M. Galusca,　C. Flangea,　 C. Moșoarcă,　C. Cozma,　A. D. Zamfir, Chip-based electrospray ionization tandem mass spectrometry a novel tool for rapid diagnostic of Fabry disease, Kyoto, Japan, 2012;

[9] C. Moșoarcă, I. Malaescu, T. Visnapuu, T. Alamäe, A. D. Zamfir, Chip-Based nanoelectrospray mass spectrometry analysis of fructooligosaccharides produced by levansucrases from Pseudomonas syringae and aurantiaca, 6th Central and Eastern European Proteomics Conference, Budapest, Hungary, 14-17 October 2012;

[10] C. Moșoarcă, I. Malaescu, T. Visnapuu, T. Alamäea, A. D. Zamfir, Chip-based nanoelectrospray mass spectrometry of fructooligosaccharides produced by levansucrases from Pseudomonas syringae pv. tomato and P. chlororaphis subsp. Aurantiaca, International Symposium Research and Education in Innovation Era,. 4th Edition, Arad, Romania (ISREIE 2012), November 08-09 2012;

[11] F. Capitan, C. Schiopu, C. Moșoarcă, C. Flangea, C. Ilie, I. Velea, E. Sisu, A. D. Zamfir, Compositional and structural analysis of gangliosides in human fetal cerebellum by chip electrospray mass spectrometry, International Symposium Research and Education in Innovation Era,. 4th Edition, Arad, Romania (ISREIE 2012), November 08-09 2012;

[12] M. Galusca, C. Flangea, C. Moșoarcă, C. Cozma, A. D. Zamfir, Chip-based electrospray ionization tandem mass spectrometry a novel tool for rapid diagnostic of Fabry disease, International Symposium Research and Education in Innovation Era,. 4th Edition, Arad, Romania (ISREIE 2012), November 08-09 2012;

[13] C. Moșoarcă, I. Malaescu, Ž. Vukelić, A. D. Zamfir, Automated chip-based nanoelectrospray-mass spectrometry of gangliosides from human anencephaly, TIM 12 Physics Conference, Timisoara, Romania, 27-30 November 2012;

[14] M. Galusca, C. Flangea, C. Moșoarcă, C. Cozma, Alina D. Zamfir, Rapid diagnosis of Fabry disease by a novel method based on automated chip-nanoelectrospray ionization mass spectrometry, Mass Spectrometry Forum, Vienna, Austria, February 19-23 2013;

[15] A.D. Zamfir, C. Moșoarcă, C. Flangea, C. Cozma, I. Malaescu, M. Przybylski, Fully automated chip-nanoelectrospray combined with collision induced and electron transfer dissociation, 46th German Society for Mass Spectrometry Conference, Berlin, Germany, March 10-14 2013;

[16] M. Galusca (Sarbu), C. Flangea, C. Moșoarcă, C. Cozma, A. D. Zamfir, Fabry disease-Rapid diagnosis by chip-based nanoelectrospray ionization tandem mass spectrometry, 2nd Middle Eastern and Mediterranean Sea Region Countries Mass Spectrometry Conference, Siena, Italy, June 30 – July 4 2013;

[17] C. Moșoarcă, C. Flangea, M. Galusca, A.D. Zamfir, Rapid diagnosis through molecular markers identified by advanced mass spectrometry, 5th International Congress and the 31th Annual Session of the Romanian Society for Cell Biology, Timisoara, Romania, June 05-09 2013;

[18] C. Moșoarcă, I. Malaescu, A. D. Zamfir, Testing The Feasibility Of Fully Automated Chip-Based Nanoelectrospray Ionization Mass Spectrometry As A Novel Tool For Rapid Diagnosis Of Fabry Disease, A Treia Sesiune Națională De Comunicări Științifice a Doctoranzilor, 11 June 2013;

[19] C. Moșoarcă, I. Malaescu, C. Flangea, M. Galusca Sarbu, A. D. Zamfir, Rapid diagnosis of Fabry disease through advanced chip-based electrospray mass spectrometry and electron transfer dissociation sequencing, TIM-FIZ 2013, Conferința Internațională de fizică, Timișoara, Romania, 24-27 noiembrie 2013

[20] C. Moșoarcă, A. D. Zamfir, Chip-based ionization electron transfer/collision induced dissociation mass spectrometry analysis of the noncovalent interaction between Cholera toxin and G1 ganglioside class, 3rd Biothechnology World Congress, Dubai, UAE, 10-12 februarie 2014

[21] C. Moșoarcă, L. Lupu, I. Malaescu, A. D. Zamfir, Top-down analysis by electron transfer/collision induced dissociation of noncovalent protein-ganglioside complexes, (oral presentation) 25th MassSpec Forum Vienna, Viena, Austria, 17-19 februarie 2014.

[22] C. Moșoarcă, Alina D. Zamfir, Introduction of chip-based nano-electrospray mass spectrometry with electron transfer /collision induced dissociation in glycoproteomics, (oral presentation) 20th International Symposium on Analytical and Environmental Problems, 22 September 2014, Szeged, Hungary

[23] C. Moșoarcă, Iosif Malaescu, Željka Vukelić, Alina D. Zamfir and Aurel Ercuta, Introducing 2D numerical analysis in modeling of complex carbohydrate mass spectra, TIM-FIZ 2014 Physics whitout frontiers, Conferinta Internationala de fizica, 20-22 noiembrie 2014, Timisoara, Romania