SPECIALIZAREA BIOTEHNOLOGII PENTRU INDUSTRIA ALIMENTARĂ LUCRARE DE DIPLOMĂ CERCETĂRI PRIVIND CONDIȚIILE DE OBȚINERE A PRODUSELOR AGRO -ALIMENTARE… [618053]

UNIVERSITATEA DE ȘTIINȚE AGRONOMICE ȘI
MEDICINĂ VETERINARĂ
BUCUREȘTI

FACULTATEA DE BIOTEHNOLOGII
SPECIALIZAREA BIOTEHNOLOGII PENTRU INDUSTRIA ALIMENTARĂ

LUCRARE DE DIPLOMĂ

CERCETĂRI PRIVIND CONDIȚIILE DE OBȚINERE A
PRODUSELOR AGRO -ALIMENTARE ECOL OGICE

Coordonator științific,
Prof. Univ. Dr. Florentina ISRAEL -ROMING

Student: [anonimizat] – Mihai BANĂ

București
Iunie 2019

3

REZUMATUL LUCRĂRII
În scopul realizării prezentei lucrări, am ales drept material de studiu probe de sol cu origini
diferite, respectiv: probe de sol provenite de la culturi de ardei cre scute în regim ecologic și
convențional (Valencia, Spania) și probe de sol provenite de la f erme ce își desfășoară activitatea
în regim ecologic, de conversie și convențional (România).
Prezenta lucrare de diplomă este structurată în două părți principale și cinci capitole.
Partea documentară este alcătuită din trei capitole. Primul capitol pre zintă aspecte generale
despre enzimele prezente în diferite tipuri de sol, în cel de -al doilea capitol este explicat rolul
fosfatazelor din sol și importanța fosfor ului ca element nutritiv al plantelor, iar capitolul trei oferă
informații despre activitate a enzimatică a fosfatazelor din sol, factori ce influențează activitatea
acestora și valori de referință.
Partea experimentală curpinde capitolele patru și cinci. În capitolul patru , sunt prezentate
metodele de d eterminare a activității enzimatice, a pH -ului și metoda de analiză statistică a
rezultatelor utilizată pentru interpretare. Capitolul cinci conține rezultatele concrete obținute în
urma analizelor și compar ații între valorile obținute .
Scopul lucrării de diplomă a constat în evaluarea impactului practicilor agricole
convenționale și ecologice asupra activității enzimatice a fosfatazelor acide și alcaline, folosind
probe de sol adunate din locații variate, în țări diferite.
În partea finală a lucrării sunt prezentate concluziile și bibliografia.
Locația aleasă pentru realizarea cercetărilor experimentale a fost Laboratorul de Chimie al
Universității Politehnice din Valencia în cadrul Proi ectului INIA RTA2 014-00041 -C02-02
(Selección y mejora de variedades tradicionales de pimiento ( Capsicum annuum L.) para
rendimiento y calidad de fruto y adaptadas a cultivo ecológico) și Centrul de Cercetare pentru
Studiul Calității produselor Agroalimenta re (HORTINVEST), USAMV București.

4
CUPRINS

INTRODUCERE ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………. 5
PARTEA I – STUDII DOCUMENTARE ………………………….. ………………………….. ………………………….. . 6
Capi tolul I – Enzimele din sol ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………… 6
1. Originea enzimelor din sol ………………………….. ………………………….. ………………………….. …………….. 6
2. Tipuri de enzime prezente în sol ………………………….. ………………………….. ………………………….. …… 10
Capitolul II – Rolul fosfatazelor din sol ………………………….. ………………………….. ………………………….. … 11
1. Fosforul ca element nutritiv indispensabil plantelor ………………………….. ………………………….. ……. 11
2. Fosfatazele din sol ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………………. 13
Capitolul III – Factori ce influențează activitatea fosfatazelor și valori d e referință …………………….. 15
1. Factori naturali și antropici ce influențează activitatea enzimatică a fosfatazelor din sol ……………. 15
2. Valori de referință pentru activitățile enzimatice ale fosfatazelor în diferite tipuri de sol …………… 18
PARTEA a II -a – CERCETĂRI EXPERIMENTALE ………………………….. ………………………….. ……….. 19
Capitolul IV – Materiale și metode ………………………….. ………………………….. ………………………….. ……….. 19
1. Materiale – probele de sol ………………………….. ………………………….. ………………………….. ……………. 19
2. Metode de analiză ………………………….. ………………………….. ………………………….. ……………………….. 22
2.1. Determinarea reacției solului (pH) ………………………….. ………………………….. …………………………. 22
2.2. Dozarea fosfatazelor din sol ………………………….. ………………………….. ………………………….. ……… 25
2.3. Analiza statistică a rezultatelor ………………………….. ………………………….. ………………………….. …. 29
Capitolul V – Rezultate și discuții ………………………….. ………………………….. ………………………….. …………. 31
1. Curbele etalon pentru fosfataza acidă și alcalină ………………………….. ………………………….. …………. 31
2. Rezultatele activ ităților enzimatice – Valencia ………………………….. ………………………….. …………….. 32
3. Analiza statistică a rezultatelor – Valencia ………………………….. ………………………….. ………………….. 36
4. Analiza comparativă a rezultatelor pentru lu nile iunie -octombrie – Valencia ………………………….. . 38
5. Activitățile enzimatice corelate cu pH -ul solurilor din România ………………………….. ………………… 41
CONCLUZII ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………………….. …………… 43
BIBLIOGRAFIE ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………………….. …….. 44

5
INTRODUCERE

Solul reprezintă baza ecosistemelor agricole și terestre, iar viața însăși depinde de el. Este
o resursă naturală vie, dinamică și funcționar ea sa optimă este crucială pentru producerea de
alimente și î ntreținerea calității mediului (Ochoa și colab., 2007) .
Agricultura convenț ională a demonstrat capacitatăți superioare de producție și
profitabilitate pe termen scurt cu prețul suprasolicitării resurselor naturale, cum ar fi apa și solul.
Drept urmare, solurile au fost salinizate din cauza apei bogate în săruri folosită pentru ir igații,
contaminate cu metale grele și pesticide, au pierdut calitățile structurale din cauza scăderilor în
materie org anică și au înregistrat pierderi în fertilitate (Gliessman , 2002).
Ca răspuns la degradările resurselor naturale asociate cu agricultura convențională, a apărut
agricultura ecologică, ce respinge utilizarea pesticidelor, are ca scop creșterea fertilității solului și
evită orice tip de contaminare sau degradare a structurii (Altieri , 2001).
Activitățile enzimatice sunt considerate ca fiind indicatori sensibili ai calității solului,
datorită relațiilor directe cu biologia acestuia, prezența lor depinzând de eliberarea continuă de
către organismele prezente în ecosistem. Astfel, activitățile enzimatice pot fi asociate direct cu
disponibilitat ea nutrienților care joacă roluri importante în fiecare ciclu al elementelor necesare
creșterii plantelor (Torres și Lizarazo , 2006).
Obiectivul principal al lucrării de diplomă a constat în evaluarea impactului practicilor
agricole convenționale și ecologice asupra activității enzimatice a fosfatazelor acide și alcaline ,
folosind probe de sol adunate din locații variate, de la culturi multiple, în țări și regimuri de climă
diferite – România și Spania.
Prezenta lucrare de diplomă este structurată în două părți, respectiv partea documentară și
partea experimentală. Partea documentară cuprinde trei capitole în care sunt prezentate
caracteristicile generale ale enzimelor din sol, factori ce influențează activitatea enzimatică și valor i
de referință pentru diferite tipuri de sol. Partea experimentală cuprinde, de asemenea, două capitole
în care sunt prezentate materialele ș i metodele utilizate în vederea realizării cercetărilor
experimentale, precum și rezultatele obținute.

6
PARTEA I – STUDII DOCUMENTARE
Capitolul I – Enzimele din sol
1. Origi nea enzimelor din sol
Solul este mediul în care se desfășoară totalitatea activităților naturale și an tropice necesare
ca viața oamenilor, animalelor și plantelor să existe. Pădurile, plantele, recoltele cresc pe sol; bazine
superficiale de apă și râurile există și curg având ca suport solul; animalele își petrec via ța și se
deplasează pe sol. Totodată, solul este locul în care oamenii și -au construit așezările și toat e cele
necesare vieții. În același timp, tot solul este mediul unde deșeuri periculoase, derivate din
activitățile antropice, sunt eliberate și produc e fecte nocive, uneori ireversibile. Deseori, aceste
activități au produs fenomene de deșertificare, pierd erea biodiversității, alterarea matricii solului și
deficiențe în materii organice și nutrienți. Un sol echilibrat, sigur și productiv poate exista at unci
când proprietățile sale biologice, biochimice, fizice și chimice sunt corelate și contribuie împreu nă
la susținerea tuturor activităților ce se produc în natură. Din totalitatea acestor factori, enzimele din
sol joacă un rol fundamental deoarce catali zează multe reacții chimice din ciclul nutrienților;
transformarea reziduurilor de plante și microorgani sme; mineralizarea și transformarea materiei
organice în interiorul ciclului carbonului și degradarea poluanților cu potențial nociv, contribuind
astfel la restaurarea și remedierea solurilor poluate. Astfel, enzimele din sol sunt implicate în toate
activi tățile fundamentale agriculturii, fiind folosiți cu succes ca indicatori ai cererii de substanțe
nutritive și ai calității și sănătății solului (Lilian a Gianfreda și Maria A. Rao, 2014) .
Enzimele din sol participă la transferul de energie prin descompunerea materiei organice
din sol și facilitează schimbul de substanțe nutritive, având un rol major în agricultură. Aceste
enzime catalizează o serie de rea cții vitale microorganismelor și ajută la stabilizarea structurii
solului. Chiar dacă microor ganismele reprezintă sursa principală de enzime din sol, plantele și
animalele își aduc și ele aportul la totalitatea enzimelor. Enzimele din sol răspund rapid la orice
schimbare de practici agricole și la schimbarea condițiilor de mediu. Activitățile lor sunt strâns
legate de proprietățile fizico -chimice și biologice specifice solului. Așadar, enzimele din sol pot fi
utilizate ca senzori pentru statutul microbian din sol, pentru condițiile fizico -chimice și pentru
influența diferitelor tratamente aplicate culturilor. Înțelegerea posibilelelor roluri ale fiecărei
enzime enzime din sol în relație cu starea generală de sănătate a solului are ca scop menținerea
fertili tății și sănătății ecosistemelor agricole (Srinivasrao și Grover , 2017).

7
Există o multitudin e de factori ce pot influența activitățile enzimatice din sol. Parametrii
naturali (schimbarile de anotimp, localizarea geografică, distribuția in situ , proprietăț ile fizico –
chimice, nivelurile de materie organică și argilă) afectează nivelurile de activit ate enzimatică,
influențând atât sinteza de enzime de către plante și microorganisme cât și prezența lor în condiții
uzuale. Proprietățile fizice și chimice ale un ui sol sunt implicate în imobilizarea și stabilizarea
majorității enzimelor extracelulare. Un conținut ridicat de argilă sau coloizi humici este asociat cu
prezența unor enzime stabile, dar mai puțin active. Activitatea agricolă și poluarea mediului
(ferti lizatori, pesticide, metale grele) pot afecta compoziția chimică și caracteristicile structur ale
ale solului. Ca urmare a acestor practici, va fi influențat ansamblul speciilor microbiene, abundența
lor, implicit activitatea metabolică, având ca urmări sup linirea sau supresia producției de enzime
și activitatea generală a unei enzime în sol (Gianf reda L și Bollag JM, 1996) .
În literatură există diferite clasificări ale enzimelor din sol, una dintre cele mai timpurii și
exhaustive fiind cea propusă de Burns (Burns RG, 1978) . Determinările activității enzimatice
măsoară activitățile cumulate ale enz imelor ce includ: (1) enzime care funcționează extracelular,
fie libere în soluția solului sau legate de constituenți organici și anorganici și (2) enzime prezente
în celule vii sau moarte.
Aceste localizări ale enzimelor se împart la rândul lor în (1) en zime asocitate cu celule vii,
metabolic active. Aceste enzime sunt în principal hidrolaze și pot fi situate în citoplasmă, în spațiul
periplasmic, legate de perete le celular sau complet extracelular. (2) Enzime asociate cu celule
viabile dar care nu prolif erează precum endospori bacterieni, spori fungici, oochisturi de protozoare
sau semințele plantelor. (3) Enzime ce sunt asociate, pentru puțin timp, cu substratul în complexe
E-S. (4) Enzime atașate de celule moarte, fragmente celulare sau care difuzează d in celule moarte
și lizate celulare. Multe enzime din aceste categorie ar fi putut avea o locație funcțională în interirul
unei celule însă își pot manifesta pentr u o perioadă scurtă în momentul eliberării în faza aopoasă a
solului. (5) Enzime mai mult sau mai puțin imobilizate în argile sau coloizi humici. Enzimele
asociate în sol cu substanțe humice își păstrează activitatea pentru perioade lungi de timp. Enzimele
pot să aparțină mai multor categorii și își pot schimba categoria de care aparțin în timp (Briceño –

8
Salazar și Jorge Arturo , 1988). Complexitatea activității schimburilor enzimatice între diferite
medii și categorii poate fi ilustrată schematic la fel ca in Figura 1.1.
Figura 1.1. Complexitatea schimbului de enzime în sol
Totalitatea activităților enzimatice din sol poate fi descrisă ca fiind suma a 3 componente
(Figura 1.2). Prima dintrea acestea este cea intracelulară; a doua extracelulară și stabiliza tă de
asocierea între enzi mă și substanțe coloidale; iar a treia extracelulară însă liberă în soluția solului
sau atașată de celule vii. Cataliza intracelulară are loc atât în celule viabile cât și în celule moarte
dar intacte, în timp ce cataliza extracel ulară se desfășoară când e nzimele extracelulare sunt
excretate în mediu de celule viabile și prin liza celulelor moarte. Enzimele rezultate din liza
celulelor sunt de fapt enzime intracelulare ce au devenit extracelulare din cauza circumstanțelor
naturale. Contribuția pe care o adu ce fiecare dintre aceste componente la totalitatea activităților
enzimatice din sol variază considerabil în timp, de la sol la sol și în funcție de enzima analizată.

Figura. 1.2. Componente ale activității enzimatice totale. A = enzime eliberate odată cu liza
celulară; B = exoenzime legate de coloizii din sol; C = enzime imobilizate care difuzeză în soluția
solului ( Adaptat după Richard G. Burns 1977 )

9
Eficiența oricărei enzime extracelulare este determinată de o multitudine de factori, cea mai
importan tă fiind rezistența într -un mediu ostil. Enzimele libere sunt supuse activității proteolitice
ale altor enzime extracelulare. Există însă dovezi că enzimele difuzează la o anumită distanță de
punctul de origine și că o fracție nu numai că supraviețuiesc da r sunt capabile de a -și îndeplini
activitățile catalitice pentru perioade îndelungate. De exemplu, Skujins și Mclaren (1968) au
demonstrat că solurile din permafrost, care nu au avut niciun input biologic de 9000 de ani sau mai
mult, încă manifestă activit ate enzimatică pentru fosfatază și urează. Motivul longevității este
reprezentat de asocierea enzimelor cu unii coloizi prezenți în sol – argilele și materia organică.
Unitatățile structural -fundamentale ale argilei sunt dioxidul de siliciu și oxidul de a luminiu.
Această fracție coloidală, ce poartă o sarcină globală negativă se poate dilata (montmorillonit,
vermiculit) sau nu (caolinit) în momentul hidratării. Enzimele pot fi adsorbite în ambele cazuri la
suprafață sau în interio rul argilei, consevând ast fel funcția enzimelor și încetinind inactivarea lor.
În cazul entrapării interlamelare, enzimele sunt protejate suplimentar, fiind apărate de atactul
microorganismelor. Materiile coloidale organice sunt de asemenea încărcate negat iv și sunt
alcătuite din p olifenoli, compuși aromatici, aminoacizi, vitamine, polizaharide și poliuronide cu
masă moleculară mare, toate produse și resintetizate în timpul descompunerii materiei
macroorganice pentru a forma gelul coloidal complex cunoscut drept humus. Enzimele pot fi
captate în această materie humică în timpul formarii sale și adsorbite prin schimb ionic, legături de
hidrogen sau covalente. Apărarea suplimentară împotriva atacului microbian poate fi oferită de
proprietățile bacteriostatice ale compușilor fenolici al e humusului. Totuși, deoarece în solurile
agricole materia organică și argilele sunt asociate și formează un complex organo -mineral, este
dificil de stabilit care dintre cele două componente coloidale joacă cel mai important rol î n
stabilizarea enzimelor e xtracelulare. Dovezile actuale indică faptul că materia organică ar fi
componenta -cheie (Ladd J.N. și Butler J.H.A., 1975) .

10
2. Tipuri de enzime prezente în sol
Din multitudinea de potențiali indicatori biologici sensibili ai cal ității și fertilității solului,
activitățile enzimatice oferă informații rapide în ceea ce privește funcția solului, în special
activitățile enzimelor ce catalizează o gamă largă de procese biologice precum dehidrogenaza,
ureaza și fosfataza (Nannipieri P și colab., 2002) . Enzimele din sol au funcții -cheie de natură
biochimică în ansamblul de transformări a materiei organice și a circuitelor nutrienților din sistem
(Burns RG, 1983) . Importanța agricolă a enzimelor din sol a fost extinsă în mod progresiv de la
primul raport, formulat în urmă cu aproape un secol. Enzimele din sol, care erau folosite doar ca
parametrii desciptivi, sunt la momentul actual apreciate pentru multiplele funcții în activitatea
microbiană, procesele din sol, răspunsurile ecosistemelor la practi cile agricole și la schimbările
climatice (Finzi și colab., 2006) . Enzimele selcționate, de o deosebită importanță în agricultură sunt
prezentate mai jos, în Tabelul 1.1.
Tabelul 1.1 Enzime din sol cu importanță agricolă și funcțiile lor în sol
Clasa/Număr ul EC Numele Funcția în sol și importanța în agricultură Reacția catalizată
Oxidoreductaze
1.11.1.6 Catalaza Eliberează oxigenul din peroxidul de
hidrogen, rol de detoxifiere în celule 2H 2O2 → 2H 2O+O 2
1.11.1.7 Peroxidaza S+ H 2O2→ S oxidat
+H 2 O
1.18.6.1 Nitrogenaza Fixarea azotului, catalizează conversia
azotului atmosferic și a hidrogenului în
NH 3 N2 +3H 2 →2NH 3
Hidrolaze
3.1.4.1 Fosfodiesteraza Indicator al circuitului P, bun indicator al
P disponibil plantelor R2 NaPO 4 +H 2 O →
ROH+R -NaHPO 4
3.6.1.1 Pirofosfataza Indicator al circuitului P, interesul pentru
această enzimă derivă din faptul că
polifosfatul de amoniu (sare anorganică)
este folosit adeseori ca fertilizant Pirofosfat+H 2 O →
2PO 4 3 –
3.5.1.1 L-Asparaginaza Acționează asupra le găturilor C -N
(difer ite de cele peptidice), eliberând NH 3 Asparagină → acid
aspartic+NH 3
3.5.1.2. L-Glutaminaza Glutamină → acid
glutamic + NH 3
3.5.1.4 Amidaza Hidroliza legăturilor C -N, importantă
pentru eliberarea de N disponibil plantelor Amidă acidă
monocarboxilică +
H2O → acid
monocarboxilic + NH 3
3.2.1.26 Inverataza Indicator pentru circuitul C, catalizează
hidroliza zaharozei la glucoză și fructoză C12H22O11+H 2O →
C6H12O6 +C 6H12O6
3.2.1.8 Xilanaza Responsabilă pentru descompunerea
xilanului, un polizaharid asociat cu
celuloza în sol Hidroliza legăturilor
B-1,4-xilanazice

11
Capitolul II – Rolul fosfatazelor din sol
1. Fosforul ca element nutritiv indispensabil plantelor
Fosforul (P) este un element esențial în transportul de energie, struct urile celulare și sinteza
acizilor nucleici, fiind deci esențial pentru viață. Disponibilitatea P este scăzută în majoritatea
ecosistemelor terestre din cauza încorporării în diverse materii minerale. Ocluz ia poate fi realizată
prin acumularea P în molecul e organice asociate cu fracția pasivă a materiei o rganice din sol.
Organismele pot asimila doar ionul fosfat dizolvat iar astfel, activitatea fosfatazelor fiind extrem
de importantă în transformarea P din m ateria organică din sol în forme disponibile organ ismelor
(Cadwell, 2005) .
Fosforul este constituentul structurilor macromoleculare în acizii nucleici. Ca unități ale
moleculei de ADN, sunt purtători ai informației genetice, iar ca unități ale moleculei de ARN sunt
structuri responsabile de procesul trans lației. Atât în ADN și în ARN, gruparea fosfat realizează o
punte între ribonucleozide pentru a forma macromoleculele. Formarea punților de fosfor în diesteri
este de asemenea abundentă și în fosfolipidele biomembranelor (punți între digliceride și alte
molecule – aminoacizi, amine, alcooli). Majoritatea esterilor fosforici sunt intermediari în căile
metabolice de biosinteză și degradare. Funcțiile și formarea lor este legată strict de metabolismul
celular ș i de legăturile macroergice. ATP -ul este principal ul fosfat necesar sintezei amidonului.
Aceste legături macroergice din ATP pot fi transmise și altor coenzime (UTP, GTP). Cantitatea de
fosfor necesară plantelor pentru o creștere și dezvoltare optimă se în cadrează în intervalul [0,3% –
0,5%] din masa substa nței uscate din plante. Deficiențele în fosfor se manifestă printr -o creștere
întârziată și o colorație roșiatică a țestutului vegetal. Plantele ce prezintă această deficeință posedă
o capacitate fotosinte tică scăzută per unitate de clorofilă, efectul fii nd reducerea în viteză a
proceselor metabolice (Sarapatka și Borivoj , 2003 ).
Gurpările fosfat rămân în plante sub forma cea mai oxidată și doar o proporție mică din
fosforul organic este absorbită de plante. În general, plantele obțin acest element prin a bsorbția
formelor solubile anorganice. După absorbția H 2PO 4- de către plantă, acesta rămâne ca fosfor
anorganic (P i) sau este esterificat la o catenă de carbon ca ester fosforic sau atașat unui alt fos fat
printr -o legătura macroergică (ex. ATP). Schimburil e între P i și P înăuntrul esterului sau legăturii
pirofosfat au o frecvență foarte mare (Hedley și colab., 1982) .

12
Circuitul P a fost descris în literatura pedologică. Au fost descrise diferențele între
ecosistemele neamenajate și cele agricole, spre exem plu de către Tivy (1990). Figura 2.1 prezintă
circuitul general al fosforului în soluri, bazat pe disponibilitatea s a în relație cu plantele:

Figura 2.1. Circuitul fosforului ca element nutritiv al plantelor (adaptat după Stewart, Mc
Krecher , 1982 )

13
Necesitatea plantelor de a obține fosforul derivă de la anionii fosfați care se regăsesc în sol
(H2PO 4-, HPO 42-). Pe de altă parte, gama de fosfor disponibil plantelor este restrânsă. Soluția solului
trebuie să fie suplimentată continuu pentru a favoriza creș terea optimă a plantelor. Schema
proceselor majore fiziologice și chimice care influențează disponibiltatea fosfor ului este prezentată
în figura 2 .2, adaptată după Richardson (1994).

Figura 2.2. Schema proceselor fiziologice care influențează disponibili tatea fosforului în
sol (adaptată după Richardson , 1994 )

2. Fosfatazele din sol
Termenul de fosfataze este folosit pentru a descrie un grup larg de enzime ce hidrolizează
compuși organici cu fosfor (P), pirofosfați, metafosfați și polifosfați anorganici ce există în sol.
Este bine -cunoscut faptul că plantele utilizează doar P anorgani c și din moment ce o fracție

14
importantă de P este legată de compuși organici, mineralizarea acestei fracții organice reprezintă
un factor important în nutriția plantelor.
Fosfat azele sunt sintetizate de bacterii, fungi și de sistemul radicular al plantelor, ia r rolul
lor este de a cliva gruparea fosfat din substrat, transformând forme complexe și uneori indisponibile
de P în forme de fosfat care pot fi asimilate. Astfel, sinteza de fosfataze depinde de combinația
între cererea de P a plantelor și microorganisme lor, substratul disponibil de P organic și limitele de
P prezente în sol. Rizosfera este o regiune îngustă din sol care este influențată direct de eliberarea
fosfatazelor și altor enzime de către rădăcini și micorize ce susține populații dense de
microorga nisme libere și asociate cu rădacinile. Rizosfera conține astfel cantități mari de fosfataze
intracelulare (în microorganismele vii) și extracelulare (sintetizate de microor ganismele vii sau
reprezentate de resturi celulare). La fel ca alte enzime, fosfata zele pot fi stabilizate de către particule
reactive aflate la suprafața solului (argile și oxizi de aluminiu sau fier). Această fracție imobilizată
dar activă din punct de v edere enzimatic reprezintă activitatea enzimatică manifestată de sol, chiar
și în a bsența organismelor vii (Margalef și colab., 2017) .
Fosfatazele au primit denumiri triviale în funcție de substratul fiecăreia, însă sunt în
principiu hidrolaze fosforice m onoesterice (EC 3.1.3) sau hidrolaze fosforice diesterice (EC 3.1.4 ).
Din primul grup aparțin următoarele enzime: fitaza , nucleotidazele , fosfatazele glucidice ,
glicerolfosfataza . Din al 2 -lea grup fac parte: nucleazele, f osfolipazele (Speir și Ross, 1978) .
Activitatea enzimatică a fosfatazelor în sol a fost studiată de multe o ri, majoritatea acestor
studii concentrându -se pe activitatea fosfomonoesterazei, în special a fosfatazei acide. Un număr
variat de esteri de fosfat se regăsesc în sol, prin urmare și diferite tipuri de fosfataze. Pe lângă
fosfomonoesterază au fost detect ate și pirofosfataza, metafosfataza și fitaza în sol. Printre
fosfomonoesterazele menționate, atât fosfataza acidă și alcalină se regăsesc în sol. Diferența între
fosfataza acidă și alcalină se bazează pe diferența între intervalele de pH la care aceste en zime sunt
active – cea acidă (4 -6) iar cea alcalină (9 -11). Fosfataza acidă diferă de cea alcalină prin
manifestarea activității optime la un pH sub 7 și având specificitate scăzută pentru substrat. Chiar
dacă în multe soluri s -ar evidenția o fosfatază așa -zis neutră cu un pH optim în jurul valorii de 7,
această fosfatază este considerată ca fiind fosfatază acidă (Kumar și colab., 2011) .

15
Capitolul III – Factori ce influențează activi tatea fosfatazelor și valori de
referință
1. Factori naturali și antropici ce influențează activitatea enzimatică a fosfatazelor din sol
Factori naturali cum ar fi condițiile climatice scad cantitățile principale de P anorganic
(Richardson și colab., 2004) până în punctul în care numai formele organice și secundar -miner ale
rămân rezerve naturale de acest nutrient. Fosforul organic (P org) poate reprezenta până la 90% din
totalul în P în unele tipuri de sol, iar P provenit din surse microbiene constituie o fracț ie importantă
din totalul P org. În aceste tipuri de sol, activ itatea fosfatazelor este crucială pentru a accelera
circularea P între materia organică din sol și P utilizat de plante și reprezintă o metodă bună de
măsurare abilității ecosistemelor de a comb ate limitările în P. Cercetările arată că activitatea
fosfataz elor are consecințe ecologice imporntante și sunt strâns legate de productivitatea plantelor
și diversitatea biomurilor. În consecință, activitățile fosfatazelor din sol au fost studiate intensi v
(Turner și Condron, 2013) .
O serie de factori biotici și ab iotici influențează activitatățile enzimatice ale fosfatazelor:
(i) pH-ul: Una dintre cea mai importantă caracteristică a solurilor este pH -ul. Acesta
afectează disponibilitatea nutrienților, contro lează compoziția și diversitatea
comunităților microbiene, alterează echilibrul fazelor solide din sol și influențează
răspns ul pla ntelor la factori externi. Utilizarea activităților fosfatazei acide și fosfatazei
alcaline pentru a determina pH -ul optim pe ntru recolte și necesarul de CaO pentru a
atinge acest pH a fost studiat de Dick și colab., (2000). S -a concluzionat că în timp ce
pH-ul solului crește, activitatea fosfatazei alcaline crește iar cea a fosfatazei acide scade.
(ii) Conținutul de apă al solului: În general, activitatea fosfatazei alcaline a fost corelată
direct cu cantitatea de apă din sol, spre deosebire de cea a celei acid e. Sardans și colab.,
(2006) au realizat corelația între activitatea enzimatică și conținutul de apă,
concluzionând că în tim pul verii activitatea fosfatazei alcaline depinde de conținutul de
apă din sol, activități maxime ale fo sfatazei fiind raportate vara, când cantități mici de
apă coincid cu valori ridicate ale temperaturilor solului și aerului. Creșterile de
temperatură ti nd să sporească activitatea fosfatazei, însă acest efect a fost semn ificativ
doar în cazul fosfatazei acide (68%) pe timpul verii ș i a fosfatazei alcaline (22%)
primăvara.

16
(iii) Salinitatea solului: Efectul salinității solului în vară și iarnă asupra activitățil or
enzimatice, pe coasta Golfului Bengal, Sundarbans, India a f ost publicat de către
Tripathi și colab., (2007). Media activităților fosfatazelor acide și alcaline în soluri
saline au variat între 213 -584 μg fenol kg-1h-1 și 176 -362 μg fenol kg-1h-1 respec tiv.
Aceste variații cu valori între 40% -48% în solurile saline au fost raportate din cauza
conductivită ții electrice. De asemenea, au fost activități enzimatice mai mari în timpul
iernii. Activitatea hidrolitică mai mare pe timpul iernii pare a fi corelat ă cu nivelul mai
mare de carbon organic din sol și biomasă microbiană.
(iv) Asocierea cu micorizele: Activită țile enzimatice ale fosfatazelor în asociere cu variațiile
spațiale și temporale ale conținutului de fosfor din sol au fost studiate de Van Aarle și
colab., (2010). A fost demonstrat faptul că există o creștere în activitatea
fosfomonoesterazei acide în as ocierile rădacinilor cu micorize; sprijinind rolul acestei
enzime în degradarea compușilor cu fosfor imobilizați în sol.
Multe din experimente ce implic ă folosirea fertilizanților, schimbarea temperaturii și
disponibilitatea apei, în condiții controlate, au fost realizate pentru a identifica factorii ce
influențează cel mai mult activitatea fosfatazei. Markelin și Houlton (2011) au evaluat efectele
fertil izării cu azot (N), fosfor (P) sau NP în 34 de studii și au descoperit că fertilizarea cu N a
crescut activitatea fosfatazei, în timp ce ferilizarea cu P a scăzut activitatea acesteia. Schimbarile
în activitatea fosfatazei în urma fertilizării cu NP depind de proporțiile în care N și P au fost
adăugate, biomuri diferite manifestând limite ale ac tivității enzimatice diferite. Stresul hidric poate
fi și el un factor determinant în activitatea enzimatică a fosfatazei. Spre exemplu, o reducere în
disponibilitat ea apei de 21% în solurile Mediteraneene a scăzut activitatea fosfatazei cu 31 –
40%.Activită țile enzimatice ale fosfatazei sunt de asemenea corelate cu nivelul de materie organică
din sol, compoziția microbiană, adâncimea solului și etapa de succesiune eco logică. Perturbările
solului cum ar fi incendierile implicit reducerea în biomasă microbian ă produsă în urma acestora
și despăduririle afectează negativ activitatea enzimatică a fosfatazelor (Boerner și colab., 2000) .
Activitățile fosfatazelor cresc semnif icativ odată cu aplicarea gunoiului de grajd. Creșterile
în activitățile fosfatazelor și ur eazei coincid cu dezvoltarea biomasei din sol și cu imobilizarea
azotului. Biomasa microbiană și activitatea fosfatazei alcaline a fost semnificativ mai crescute în
soluri tratate cu gunoi de grajd provenit de la vite, în timp ce activitatea fosfatazei aci de a fost

17
semnificativ crescută în solurile tratate cu fertilizanți chimici. Rezultatele acestui studiu sugerează
că P provenit din gunoiul de grajd este mai mobil d ecât P anorganic al fertilizanților (Guan, 1989).
Aplicarea compostului provenit din deșeur ile municipale a stimulat activitatea fosfatazei prin
producția de microorganisme. Fosfatazele din solurile nisipoase au manifestat activitate mai
scăzută comparativ cu solurile aluviale (Albiach și colab., 2001) .
În același timp, fosfatazele sunt influenț ate de fertilizanți minerali. Katai și colab., (1986)
au observat că o cantitate mare de erbicide aplicată înainte de germinare a redus activitatea
fosfatazelor. Tot uși, o doză medie de fertilizant a stimulat activitatea fosfatazelor. Potrivit studiilor
lui Haynes și Swift (198 9) adiția de calcar a crescut activitățile proteazelor și sulfatazelor dar au
scăzut activitățile fosfatazelor.
Kirchner și colab., (1993) au descris efectul fertilizării reduse cu N și adăugarea de gunoi
de grajd ecologic asupra cantității de biomasă microbiană și activității enzimatice. Rezultatele au
demonstrat că fosfataza acidă a avut o activitate enzimatică mai mare în solurile fertilizate cu N
comparativ cu cele nefertilizate și că fosfatazele alcaline au fost mai active odată cu adăugarea
gunoiului de grajd ecologic.

18
2. Valori de referință pentru activitățile enzimatice ale fosfatazelor în diferite tipuri de sol

În scopul comp arării activităților enzimatice ale fosfatazelor obținute în partea experimentală
a lucrării și pentru a avea repere pentru acest bioindicator al solului, au fost colectate diverse valor i
din literatură pentru activitățile fosfatazelor, din medii cât mai v ariate în Tabelul 3.1. :
Tabel 3.1. Valori de referință pentru activitățile enzimatice ale fosfatazei acide și alcaline,
în diverse locații, pentru culturi variate
Descrierea
locației Tipul de sol Fosfataza acidă
(μg fenol kg-1h-1) Fosfataza alcalină
(μg fenol kg-1h-1) Referințe
Plantație de brad
(sud-vestul Chinei) Rizosferă și din afara
rizosferei 181 81 Chen (2003)
Pășuni replantate
(nord -vestul
Chinei) 0-20 cm
20-40 cm 14,11
7,59 – Shao -shan An și
colab (2009)
Sol vegetal (0 -15
cm), Florida (USA) Livezi de citrice 31,20 283,3 – 470 Yu și colab.,
(2006)
Ecosistem format
din arbori de pin –
ienupăr Soluri dominate de
Juniperus
monosperma și
Hilaria jamesii 20,5 ± 20,8

20,0 ± 20,8 126,5 ( ±23,9)

106,6 ( ±24,0) Kramer și colab.,
(2009)
Sol din apropier ea
minelor (Moa,
nord-estul Cubei) Casuarina
equisetifolia
Anacardium
occidentale
Sol nativ 225,2 – 318,3

192,4 – 314,0

248,8
– Izquierdo și
colab., (2005)
Sol minier
(Sokolov, Cehia) Sol vegetal 381 ± 398 –
1510 ± 1010 455 ± 672 –
4820 ± 6590 Baldrian și colab.,
(2008)
Sol minier (Lignită,
Polonia centrală) Plantație de stejar
Plantație mixtă
Pin 323 ± 167
302 ± 157
284 ± 114
– Chodak și colab.,
(2010)
Regiunea costală a
golfului Bengal,
Sundarbans (India). Soluri saline
Soluri non -saline 213 – 584
219 – 287 176 – 362
406 – 417 Tripathi și colab.,
(2007)

19
PARTEA a II -a – CERCETĂRI EXPERIMENTALE
Capitolul IV – Materiale și metode
1. Materiale – probele de sol
Probele de sol supuse analizei au fost prelevate din rizosfera plantelor de ardei cultivate pe
câmpul experimental al Universității Politehnice din Valencia, mai precis în vecinătatea orașului
Puçol (Figura 4.1.) . O deosebită relevanță în studiul prezent îl reprezintă faptul că loturile de sol
cu aceleași specii de ardei, au fost cultivate în regim uri agri cole diferite: convențional și ecologic.

Figura 4.1. Luvosolul specific regiunii Valencia, roșcat, permeabil, nisipos
Pentru fiecare regim agricol practicat, au fost cultivate următoarele soiuri de ardei
(Capsicum annuum L.) (Figura 4.2) :
– Serrano Kike (ECO LOGIC /CON VENȚIONAL )
– BOLA (ECOLOGIC/CONVENȚIONAL)

Figura 4.2. Soiurile de ardei cultivate pe
suprafața câmpului experimental

20
Ardeiul iute ( Capsicum annuum L.) este cel mai important și emblematic condiment în
bucătăria mexicană . Prima var ietate din cele cultivate pe câmpul experimental , ardeiul Serrano își
are originile în reginile montane ale Mexicului, în timp ce a 2 -a, chili Bola (denumită și Cascabella)
este de asemenea cultivată în câteva state mexicane din nord , cum ar fi Coahila.
Semințele și membranele ardeilor iuți au conținutul cel mai bogat în capsaicină, alcaloidul
natural regăsit în cantități diferite în multiple varietăți . Ambele tipuri de ardei (Serrano și Bola ,
Figura 4.3. ) sunt suficient de iuți încât să provoace iritații ale pielii și ale ochilor în contact cu
acestea.
Pe scara Scoville, care determină cât de picant este un aliment condimentat în funcție de
conținutul său în capsaicină, ardeii Bola măsoară între 2 .500 – 8000 SHU (în engleză – Scoville
Heat Units), în ti mp ce varietatea Serrano este mai iute, atingând valori de 10.000 – 25.000 SHU.
Plantele mature ale varetății Serrano ating înățimi de 0,5 – 1 m la maturi tate și pot susține
până la 50 de bucăți de ardei iute. Preferă solurile ce au valori de pH cuprinse între 7,0 și 8,5 – de
la neutru până la moderat alcaline – și temperaturile ridicate, de peste 24oC având o toleranță
scăzută la îngheț.
Plantele de ar dei ale varietății Bola ajung să atingă înălțimi de 45 cm la maturitate, sunt
ușor de întreținut, sunt iubitoare de soare și preferă solurile argiloase și nisipoase cu valori de pH
asemănătoare celor prielnice varie tății Serrano – între 7,0 și 8,5 – de la neutru până la moderat
alcaline.

Figura 4.3. Varietățile de ardei de la care au fost prelevate probele de sol (stânga – Serrano și
dreapta – Bola) – sursa https://www.cayennediane.com/

21
Probele de sol au fost prelevate din rizosfera a trei plante pentru fiecare specie de ardei în parte
în lunile iunie și octombrie și analizate din punct de vedere enzimatic. Odată cu probele a fost
prelevat și un c ontrol din trei puncte diferite ale parcelei. Acest lucru s -a realizat atât pentru solul
ecologic cât și pentr u cel convențional.
În același timp, au fost colectate date experimentale privind activitatea fosfatazelor și valorilor
de pH de la 3 tipuri de soluri din România, respectiv sol convențional, în conversie și ecologic.
Pe solul aflat în perioada de convers ie (an I) au fost cultivate : varză de toamnă și dovlecel.
Solul ecologic este certificat, pe suprafața acestuia cultivându -se bucuioc, fasole (2016 -2017) și
bame. Aceste culturi au fost tratate bio cu lapte și usturoi. Solul conventional a fost folosit pen tru
cultivarea fasolei (201 7-2018), țelinei și florilor, pe acesta aplicându -se pesticide și fertilizanți de
sintez ă chimică.
S-a evitat prelevarea probelor de sol după ploaie sau atunci când umiditatea solului a fost prea
mare, din considerente legate de reprezentativitatea rezulta telor activităților enzimatice.
Prelevarea s -a realizat la o adâncime de 0 -20 cm cu sonde specifice, corespunzătoare fără urme
de rugină sau alți contaminanți. În plus, s -a realizat curățarea locului de unde s -au prelevat probele
pentru a elimina resturile organice.
Imediat după prelevare, probele de sol au fost trimise către diferite laboratoare, cele folosite la
determinarea activității enzimatice a fosfatazelor fiind păstrate la frigider (2 -4oC) pentru un timp
scurt (1 -2 zile) (Figura 4. 4.).

Figura 4.4. Probele de sol
în recipientele folosite pentru prelevar e

22
2. Metode de analiză
2.1. Determinarea reacției solului (pH)
Reacția solului este o însușire chimică importantă, ce este determinată de raportul dintre
concentrați a ionilor de H+ (sub formă de hidroniu H 3O+) și ionii OH- din soluția solului.
Această însușire importantă pentru chimismul solului este hotărâtoare pentru geneza și
evoluția acestuia. Reacția are un rol important în dinamismul proceslor de alterare a părț ii minerale
a solului, precum și în mineralizarea materiei organice, în mobilitatea elementelor chimice din sol
și în dinamica absorbției elementelor nutritive de către plante.
Aciditatea actuală reprezintă cantitatea de H+ aflată la un moment dat în soluț ie și se
exprim ă în unități de pH. Sørensen definește pH -ul în funcție de concentrația ionilor de hidrogen
după următoarea relație:
pH = -log H+
Măsurarea pH -ului se face în soluție de sol, cu un raport sol:soluție de 1:2,5 atât în filtrat,
prin metode col orimetrice cât și în suspensie apoasă, prin metode potențiometrice.
Măsurând pH -ul solului se determină numai concentrația de hidrogen din soluție, adică
aciditatea actuală.
Determinarea potențiometrică a pH -ului
Aceste metode au cea mai largă utilizare d eoarece sunt rapide și au o precizie ridicată. În
cadrul acestora, nu se folosesc extracte de sol ci numai suspensii, ceea ce garantează obținerea unor
precizii mai mari, deoarece rezultatele reflectă și aportul pa rticulelor coloidale din sol în realizarea
reacției.
Determinarea prin metoda potențiometrică are ca principiu măsurearea diferenței de
potențial dintre doi electrozi introduși într -o suspensie de sol, al cărei potențial este dependent de
concentrația ioni lor de hidrogen. Electrodul de comparație (electrodul de calomel) are potențialul
constant nefiind influențat de pH -ul soluției analizate. Poetențialul electrodului indicator, depinde
de valoarea pH -ului soluției analizate, modificându -se în funcție de act ivitatea ionilor de hidrogen
din soluția r espectivă (Figura 4. 5.).

23
Mod de lucru
– Se cântăresc la balanța tehnică 10 g de sol, care a fost uscat la aer, mojarat și trecut prin sită
cu ochiuri de 2 mm, și se introduc într -un vas conic de 100 mL;
– Se adaugă 25 mL apă distilată și se agită 10 minute;
– Se lasă soluția cca. 2 ore, iar înainte de efectarea citirii se agită din nou 5 minute.
Calibrarea pH -metrului
Calibrarea se face, utilizând soluțiile tampon corespunzătoare în două puncte: la valoarea 7
a pH -ului, iar a doua valoare se stabilește în func ție de domeniul de măsurare al soluției analizate
(4,01 sau 10,01).

Figura 4.5. pH-metru HANNA

Măsurarea pH -ului
După calibrare, valoarea pH -ului se determină prin imersarea electrodului în soluția ce
urmează a fi analizată și apăsarea tastei de măsura re, valoarea citindu -se direct pe ecranul
aparatului.
După efectuarea citirilor, electrodul se spală cu apă di stilată și se tamponează cu hârtie de
filtru. Este recomandat ca după 10 citiri să se facă verificarea cu soluțiile etalon.
La finalul determin ărilor, electrodul este spălat cu apă distilată, șters cu hârtie de filtru și
este introdus în soluția de stocar e (KCl 3 mol/L) .

24
Importanța pH -ului
Este o caracterisitcă a diferitelor tipuri și subtipuri de sol ce are o mare importanță în
realizarea stud iilor pedologice.
Pe baza reacției se poate stabili o imagine de ansamblu asupra unor însușiri chimice,
biologice și chiar fizice ale solului cum ar fi: gradul de saturație în baze, tipul și calitatea humusului,
stabilitatea structurii solului, intensitat ea activității biologice a solului etc.
De asemenea, este utilizat în caracterizarea agroproductivă a un ui sol, este un criteriu la
stabilirea modului de folosință a terenului și a sortimentului de plante ce urmează a fi cultivat
(majoritatea plantelor de cultură cresc și se dezvoltă normal la valori pH situate între 6,8 -7,5 –
respectiv slab acid – neutru – slab alcalin).
Reacția solului este un indicator ce permite aprecierea oportunității de aplicare a
amendamentelor în vederea ameliorării solurilor aci de și a celor alcaline.
Interpretarea rezultatelor se face conform limitelor din Tabelul 4.1.
Tabelul 4.1. Clase de reacție a solului
Limite Denumire
<3,5 extrem de acidă
3,6 – 4,3 foarte putern ic acidă
4,4 – 5,0 puternic acidă
5,1 – 5,8 moderat acidă
5,9 – 6,8 slab acidă
6,9 – 7,2 Neutră
7,3 – 8,4 slab alcalină
8,5 – 9,0 moderat alcalină
9,1 – 9,4 puternic alcalină
9,5 – 10,0 foarte puternic alcalină
>10,1 extrem de alcalină

25
2.2. Dozarea fosfatazelor din sol
Fosfatazele catalizează hidroliza esterilor fosforici și sunt enzime cu specificitate relativ
largă, capabile să acționeze asupra unui număr variat de substrate. Au primit denumiri triviale,
după substratul asupra căruia acționează; fitaza, nuceotidazele, fosfatazele glucidice și
glicerofosfatazele aparțin fosformonoesterazelor (EC 3.1.3) și acționează conform următorului
mecanism (Figura 4. 6.):

Figura 4.6. Mecanismul de acțiune al fosfatazelor
Atât fosfataza acidă (pH optim 4-6,5) și cea alcalină (pH optim 9 -10) au fost găsite în soluri
acide și alcaline. Temperaturile optime pentru activitățile fosfatazelor au fost determinate ca fiind
în intervalu l 40o-60oC, însă determinările se realizează la temperatura de 37oC.
Încă de la începutul anilor `60, substratele artificiale le -au înlocuit pe cele naturale în
determinările de activitate enzimatică. Un astfel de substrat este p -nitrofenilfosfatul, ester cu
greutate moleculară mică, ce este hidrolizat mai rapid decât un su bstrat natural.
Activitățile fosfomonoesterazelor sunt influențate puternic nu numai de pH și temperatură,
de conținutul în materie organică și de gradul de umiditate al solului. Din aces te considerente,
activitățile în sol ale fosfatazelor variază odată c u anotimpurile.

26
Principiul metodei
Metoda se bazează pe determinarea spectrofotometrică la λ=400nm a p-nitrofenolului
eliberat după incubarea la 37oC timp de 1h a probelor de sol al ături de p -nitrofenilfosfat , conform
cu figura 4. 7.

Figura 4.7. Hidroliza enzimatică a p -nitrofenilfosfatului la p -nitrofenol și ion fosfat
Materiale și aparatură
• Spectrofotometru
• Balanța analitică
• Incubator ajustabil la 37oC
• Parafilm
• Hârtie de filtru
• Pahare Erlenmeyer
• Pahare Berzelius (100 mL)
Reactivi și soluții
• Toluen
• Modified universal buffer (MUB) – soluție stoc
Se dizolvă 12,1 g Tris, 11,6 g acid maleic, 14 g acid citric, 6,3 g acid boric (H 3BO 3) în 500 mL
NaOH (1 M) și se completează cu apă disti lată până la volumul de 1 L. Recipientul se va păstra l a
temperatura de 4oC.
• Modified universal buffer (MUB) – cu pH -ul 6,5 (fosfataza acidă) sau 11 (fosfataza alcalină)

27
Se titrează peste 200 mL MUB – soluție stoc HCl (0,1 M) până la pH 6,5 și se dilueaz ă până la
volumul de 1 L cu apă distilată. Pentru fosfataza alcalină, 200 mL MUB – soluție stoc va fi titrat
NaO H (0,1 M) până la pH 11 si se aduce la volum de 1 L cu apă distilată.
• Soluție p -Nitrofenilfosfat (PNP, 15 mM)
Se dizolvă 2,927 g p-nitrofenilfo sfat disod ic tetrahidrat în 40 m L MUB (pH= 6,5 pentru
fosfataza acida sau pH=11 pentru fosfataza alcalină ) și se aduce la volumul de 50 m L cu soluție
tampon de același pH. Recipientul se va păstra la temperatura de 4oC.
• Soluție CaCl 2 (0,5 M)
Se dizolvă 73,5 g CaCl 2 · H2O în apă distilată și se completează cu apă distilată până la 1 L.
• Soluție NaOH (0,5 M)
Se dizolvă 20 g NaOH în apă distilată și se completează cu apă distilată până la 1 L.
• Soluție NaOH (0,1 M)
Se dizolvă 4 g NaOH în apă distilată și se compl etează cu apă distilată până la 1 L.
• Soluție standard de p -nitrofenol
Se dizolvă 1 g p-nitrofenol în 70 mL apă distilată și se completează cu apă distilată până la
1 L. Recipientul se va păstra la temperatura de 4oC.
Mod de lucru
Se cântărește 1 g din pr oba de sol la balanța analitică într -un pahar Erlenmeyer cu volumul
de 50 mL. Peste proba de sol se adaugă 0,25 mL toluen, 4 mL MUB (cu pH 6,5 pentru determinarea
fosfatazei acide, pH 11 pentru determinarea fosfatazei alcaline) și 1 mL p -nitrofenilfosfat. După
acoperirea pahare lor Erlenmeyer cu parafilm, se agită manual și se incubează la 37oC pentru o oră.
Imediat după perioada de incubare, peste conținutul paharelor se adaugă 1 mL CaCl 2 (0,5 M) ș i
4 mL NaOH (0,5 M).

28
Din nou, paharele Erlenmeyer vor fi agitate manual și se va filtra proba de sol cu ajutorul
hârtiei de filtru. Absorbanța va fi măsurată la λ=400nm. Pentru soluția martor, se adaugă 1mL
PNP după adiția 1 mL CaCl 2 (0,5 M) și 4 mL NaOH (0,5 M) imediat înaint e de filtrarea pr obei de
sol (Figura 4. 8.).

Figura 4.8. Prezentarea schematică a modului de determinare a activității fosfatazice din sol

Realizarea curbei etalon
Se diluează 1 mL soluție standard de p -nitrofenol cu apă distilată până la volumul de 100
mL într -un re cipient volumetric. Vor fi pipetate volumele de 0, 1, 2, 3, 4 și 5 mL din soluția standard
diluată în pahare Erlenmeyer de 50 mL. Se ajustează până la volumul de 5 mL prin adiția de apă
distilată și se va proceda la fel ca pent ru analiza probelor de sol.
Calculul rezultatelor
Concentrația produsului de reacție (p -nitrofenolulului) se va calcula în funcție de curba
etalon și extincția filtratului.
A.E. ( μg p-nitrofenol/g sol/h)=𝐶×𝑣
𝑑𝑤𝑡×𝑆𝑤×𝑡,

29
Unde:
C – concentrația p -nitrofenolului
dwt – masa uscată a 1 gram de sol
v – volumul total al suspensiei solului (mL)
Sw – masa probei de sol utilizate (1 g)
t – timpul de incubare (ore)
2.3. Analiza statistică a rezultatelor
Rezultatele obținute au fost interpretate și verificate cu ajutorul test elor statistice, implicit
a testului Student (testul t). Au fost urmărite diferențele semnificative între cele două seturi de date
provenite de la cele două regimuri agricole, cel convențional și cel ecologic.
Testul statistic t este testul de comparare a două medii când abaterile standard sunt egale
(cazul eșantioanelor mici) .
1. Se aplică dacă măsurătorile efectuate la cele două eșantioane sunt independente .
2. Se aplică dacă eșantioanele provin din populații ca re sunt normal distribuite (lucru care
trebuie verificat înainte de aplicarea testului) .
3. Se aplică dacă popula țiile din care provin eșantioanele au dispersii egale (sau abateri
standard, ceea ce este acelasi lucru) .
• Ipoteza că mediile populatiițor din care provin eșantioanele sunt egale o vom n umi ipoteza de
nul (notată totdeauna cu H 0).
H0 : m1 = m2
• Ipoteza, sau ipotezele, care epuizează restul posibilităților le vom numi ipoteze alternative
(notate totdeauna cu H 1, H2 etc.)
H1 : m1 ≠ m2
• Dacă testul respinge H 0, vom spune că datele suportă ipoteza că mediile rezultatelor sunt
diferite

30
• Dacă testul nu respinge H 0, vom spune că datele nu susțin ipoteza că mediile rezultatelor sunt
diferite
Rezultatul p al testului, furnizat ca un număr între 0 și 1, reprezintă probabilitate de a face
o eroare d acă respingem ipoteza H 0.
• Dacă p este mai mic decât pragul de semnificație α ales – de obicei α=0,05 – respingem
ipoteza H0 și admitem ca adevărată ipoteza H 1.
• Interpretarea valorilor p se face l a majoritatea testelor statistice astfel:
 p < 0.05, legăt ura statistică este semnificativă (S, încredere 95%).
 p < 0.01, legătura statistică este semnificativă (S, încredere 99%).
 p < 0.001, legătura statistică este înalt semnificativă (HS, încred ere 99.9%).
 p > 0.05, legătura statistică este nesemnific ativă (NS).

31
Capitolul V – Rezultate și discuții
1. Curbele etalon pentru fosfataza acidă și alcalină
Pentru fiecare zi în care s -au realizat determinările pentru activitățile enzimatice ale
fosfatazelor din probele de sol, a fost realizată cur ba de etalonare pentru a calcula concentrațiile
produsului de reacție (p -nitrofenolului).
Pentru ambele fosfata ze, acidă și alcalină, în intervalul în care au fost efectuate
determinările activităților enzimatice, curbele de etalonare folosite în calc ulul rezultatelor, a u fost
reprezentată grafic sub forma prezentată în figura 5.1. , respectiv figura 5.2. :

Figura 5.1. Curba de calibrare pentru fosfataza alcalină

Figura 5.2. Curba de calibrare pentru fosfataza acidă y = 0.1386x -0.0228
R² = 0.9994
00.10.20.30.40.50.60.70.8
0 1 2 3 4 5 6DOλ=400nm
Concentrația în PNP Curba de calibrare pentru fosfataza alcalină
y = 0.1366x + 0.0286
R² = 0.9993
00.10.20.30.40.50.60.70.8
0 1 2 3 4 5 6DOλ=400nm
Concentrația în PNPCurba de calibrare pentru fosfataza acidă

32
2. Rezultatele activităților enzimati ce – Valencia
Rezultatele cumulate pentru ambele determinări de activități enzimatice ale fosfatazelor
(acide și alcaline), pentru lunile iunie și octombrie vor fi listate în tabelele următoare. Separarea s –
a realizat pe baza regimului agricol practicat, convențional sau ecologic .
În prima fază, vor fi prezentate rezultatele pentru fiecare fos fataza (alcalină și acidă) după
criteriul separării ecologic -convențional, urmând ca interpretarea grafică a acestora să marcheze
distinct diferențele existente:
• Fosfataza alcalină
Tabel 5.1. Rezultatele AE ale fosfatazei alcaline pentru solurile convențio nale

Tabel 5.2. Rezultatele AE a fosfatazei alcaline pentru solurile ecologice

33
• Fosfataza acidă
Tabel 5.3. Rezultatele AE a fosfatazei acide pentru solurile c onvenționale

Tabel 5.4. Rezultatele AE a fosfatazei acide pentru solurile ecologice

Dat fiind faptul că pentru fiecare tip de sol am avut până la 2 repetiții în determin ările
efectuate, am calculat media aritmetică a activităților enzimatice în funcți e de numărul de repetiții
și tipul de sol analizat. După calcularea mediilor activitățiilor enzimatice, pentru a sublinia
suplimentar diferențele între cele solurile prelevate din rizosfera varietăților de ardei și cele două
tipuri de agricultură practicat e, am apelat la interpretarea grafică a datelor obțiunte, figura 5.3 fiind
prima din această serie.

34

Figura 5.3. Mediile activităților enzimatice pentru fosfataza alcalină ( în luna iunie) comparate
între solurile ecologice și convenționale

Figura 5.4. Mediile activităților enzimatice pentru fosfataza alcalină (în luna octombrie)
comparate între solurile ecologice și convenționale
466.80427.16466.06576.17558.69535.13
473.37
420.70459.91476.47525.64 527.96
398.49
309.75436.92
309.66419.19515.28
0.00100.00200.00300.00400.00500.00600.00700.00
Control 1 Control 2 Control 3 Serrano
Kike 1Serrano
Kike 2Serrano
Kike 3Bola 1 Bola 2 Bola 3AE ( μg p-nitrofenol/g sol/h)
Varietăț i de ardeiMediile activităților enzimatice pentru fosfataza alcalină în luna iunie
Ecologic
Conventional
220.37230.92259.30305.68
279.91288.22291.73299.67337.77
190.03202.68
152.30217.35233.64 237.30271.05
248.83
209.57
0.0050.00100.00150.00200.00250.00300.00350.00400.00
Control 1 Control 2 Control 3 Serrano
Kike 1Serrano
Kike 2Serrano
Kike 3Bola 1 Bola 2 Bola 3AE ( μg p-nitrofenol/g sol/h)
Varietăț i de ardeiMediile activităților enzimatice pentru fosfataza alcalină în luna octombrie
Ecologic
Conventional

35

Figura 5.5. Mediile activităților enzimatic e pentru fosfataza acidă (în luna iunie) comparate între
solurile ecologice și co nvenționale

Figura 5.6. Mediile activităților enzimatice pentru fosfataza acidă (în luna octombrie) comparate
între solurile ecologice și convenționale
81.01
71.9083.2779.69 81.05
70.77100.27
79.71 81.31
72.20
59.85 61.12 62.58
44.4864.52
52.7151.2590.45
0.0020.0040.0060.0080.00100.00120.00
Control 1 Control 2 Control 3 Serrano
Kike 1Serrano
Kike 2Serrano
Kike 3Bola 1 Bola 2 Bola 3AE ( μg p-nitrofenol/g sol/h)
Varietăț i de ardeiMediile activităților enzimatice pentru fosfataza acidă în luna iunie
Ecologic
Conventional
60.0858.1655.3575.58 76.9279.3896.0298.67 98.64
27.15 28.6531.6344.09 43.03 43.38 44.32
39.4659.52
0.0020.0040.0060.0080.00100.00120.00
Control 1 Control 2 Control 3 Serrano
Kike 1Serrano
Kike 2Serrano
Kike 3Bola 1 Bola 2 Bola 3AE ( μg p-nitrofenol/g sol/h)
Varietăț i de ardeiMediile activităților enzimatice pentru fosfataza acidă în luna octombrie
Ecologic
Conventional

36
3. Analiza statistică a rezultatelor – Valencia
Rezultatele experimentale au fost prelucrate pentru a fa cilita aplicarea testului statistic t
(Tabelul 5.5., Tabelul 5.6.) ce are ca scop compararea mediilor activităților enzimatice pentru
fiecare tip de sol și pentru fiecare tip de fosfatază – acidă sau alcalină.
H0 : AE fosfatază acidă/alcalină pt. sol conv ențional = AE fosfatază a cidă/alcalină pt.sol ecologic
și ipoteza alternativă
H1 : AE fosfatază acidă/alcalină pt. sol convențional ≠ AE fosfatază acidă/alcalină pt.sol ecologic
Aplicând testul statistic t, urmărim ca valoarea p să sa fie < 0,05 pentru a concluziona că
există diferențe semnificative între cele două eșantioane analizate.

Tabelul 5.5. Testul -t aplicat mediilor activităților enzimatice pentru fosfatazele alcaline (luna
iunie – stânga și octombrie – dreapta)

Tabelul 5.6. Testul -t aplicat mediilor activităților enzimatice pentru fosfatazele acide (luna iunie –
stânga și octombrie – dreapta)

37
• Pentru luna iunie, diferențele în activitățile enzimatice ale fosfatazei a lcaline nu
sunt semnificative între solurile convenționale și cele ecologice;
• Pentru luna octombrie, diferențele în activitățile enzimatice ale fosfatazei alcaline
sunt înalt semnificative între solurile convenționale și cele ecologice, în favoarea
celor ecologice ;
• Pentru luna iunie, diferențele în activitățile enzimatice ale fosfa tazei acide sunt
semnificative între solurile convenționale și cele ecologice, în favoarea celor
ecologice;
• Pentru luna octombrie, diferențele în activitățile enzimatice ale fosfatazei acide
sunt înalt semnificative între solurile convenționale și cele eco logice, în favoarea
celor ecologice.
Procentual, pentru luna iunie există o diferență de 11,85% între activitatea enzimatică a
fosfatazei alcaline din solurile ecologice comp arativ cu cele convenționale, respectiv de 30,37%
pentru fosfataza acidă.
În pri vința rezultatelor obținute pentru luna octombrie, există diferențe clare în favoarea
activității enzimatice ale fosfatazelor din solurile ecologice, respectiv pentru cea alc alină de
28,06% iar pentru fosfataza acidă de 93,45%.
Media acestor rezultate demo strează o diferență procentuală pentru fosfataza alcalină de
20% în favoarea sistemului ecologic, iar pentru fosfataza acidă una de 62%
Un argument în favoarea activitățil or crescute ale fosfatazelor din solurile ecologice a fost
formulat de Oberson și c olab. (1996) care au motivat că încorporarea materiei organice în sol are
ca efect creșterea nivelele de mineralizare ale fosforului organic, promovân d ciclul biogeochimic
al fosforului. În plus, cantitatea de substrat suplimentară a stimulat activitatea m icrobiană,
declanșând creșterea activităților enzimatice ale fosfatazelor (Gálviz și colab., 2007).
Activitățile mai scăzute ale fosfatazelor sub regi muri agricole convenționale pot fi atribuite
disponibilității ridicate ale fosforului. Considerand faptu l că activitățile enzimatice, în special cele
ale fosfatazelor, sunt inhibate atunci când în mediu există o cantitate de fosfor mare, practicile de
fertilizare cu fosfor ar putea suprima sinteza enzimelor implicate în mineralizarea surselor de fosfor
organ ic pe termen lung (Zamora și colab., 2005).

38

4. Analiza comparativă a rezultatelor pentru lunile iunie -octombrie – Valencia
Suplimentar, am decis să pun în eviden ță scăder ile în activitat ăți enzimatic e pentru ambele
fosfataze din lun a iunie până în octombrie , reconfirmând dependența valorilor obținute de anotimp
și de condițiile specifice ale acestora (temperatură, umiditate, etc.) conforme cu Tabelul 5.7. și
Tabelul 5. 8.
Tabel 5. 7. Informații referitoare la media precipitațiilor pentru Valencia în fiecare lu nă a anului –
Octombrie fiiind luna cea mai ploioasă (sursa: Agencia Estatal de Meteorología )

Tabel 5. 8. Informații referitoare la media temperaturilor pentru Valencia în fiecare lună a anului
(sursa: Agencia Estatal de Meteorología

Figura 5. 7. Med iile activităților enzimatice ale fosfatazei alcaline pentru soluri convenționale în
lunile iunie și octombrie
476.47525.64527.96398.49309.75436.92309.66419.19515.28
190.03202.68152.30217.35233.64237.30271.05248.83209.57
0.00 100.00 200.00 300.00 400.00 500.00 600.00Control 1Control 2Control 3Serrano Kike 1Serrano Kike 2Serrano Kike 3Bola 1Bola 2Bola 3
AE ( μg p-nitrofenol/g sol/h)Varietăț i de ardeiMediile activităților enzimatice pentru fosfataza alcalină -soluri
convenționale
Octombrie Iunie

39

Figura 5. 8. Mediile activităților enzimatice ale fosfatazei alcaline pentru soluri ecologice în lunile
iunie și octombrie

Figura 5. 9. Mediil e activităților enzimatice ale fosfatazei acide pentru soluri convenționale în
lunile iunie și octombrie
466.80427.16466.06576.17558.69535.13473.37420.70459.91
220.37230.92259.30305.68279.91288.22291.73299.67337.77
0.00 100.00 200.00 300.00 400.00 500.00 600.00 700.00Control 1Control 2Control 3Serrano Kike 1Serrano Kike 2Serrano Kike 3Bola 1Bola 2Bola 3
AE ( μg p-nitrofenol/g sol/h)Varietăț i de ardeiMediile activităților enzimatice pentru fosfataza alcalină -soluri ecologice
Octombrie Iunie
72.2059.8561.1262.5844.4864.5252.7151.2590.45
27.1528.6531.6344.0943.0343.3844.3239.4659.52
0.00 10.00 20.00 30.00 40.00 50.00 60.00 70.00 80.00 90.00 100.00Control 1Control 2Control 3Serrano Kike 1Serrano Kike 2Serrano Kike 3Bola 1Bola 2Bola 3
AE ( μg p-nitrofenol/g sol/h)Varietăț i de ardeiMediile activităților enzimatice pentru fosfataza acidă -soluri convenționale
Octombrie Iunie

40

Figura 5. 10. Mediile activităților enzimatice ale fosfatazei acide pentru soluri ecologice în
lunile iunie și octombrie
• Valorile activității enzimati ce ale fosfatazei alcaline din solurile convenționale au scăzut din
luna iunie până în luna octombrie, în medie, cu 99,48% iar pentru cele ecologice s -a înregistrat
o scădere de 76,57% ;
• Valorile activității enzimatice ale fosfatazei aci de din solurile conv enționale au scăzut din luna
iunie până în luna octombrie, în medie, cu 62,55% iar pentru cele ecologice s -a înregistrat o
scădere de doar 8,50% .
Calculând media rezlultatelor, valorile activității enzimatice ale fosfatazei alcaline au scăzut
din luna iuni e până în luna octombrie în medie cu 88%, iar cele ale fosfatazei acide cu 38%.
Rezultatele astfel obținute arată diferențe semnificative între anotimpuri, activități
enzimatice mai mari ale fosfatazelor fiind cauzate de cantități scăzute de precipitații ș i
temperaturi ridicate. Aceste condiții sunt corelate cu o activitate metabolică intensă a
microorganismelor din rizosferă, activitate care are ca rezultat sinteza accelerată a unor cantități
suplimentare de enzime (Sánchez, 2003). Totodată, cantitățile de materie organică concentrate,
rezultate în urma precipitațiilor scăzute oferă un bun substrat nutritiv pentru dezvoltarea
microorganismelor, deci, a unei producții mai mari de enzime (Bandick și Dick, 1999).
81.0171.9083.2779.6981.0570.77100.2779.7181.31
60.0858.1655.3575.5876.9279.3896.0298.6798.64
0.00 20.00 40.00 60.00 80.00 100.00 120.00Control 1Control 2Control 3Serrano Kike 1Serrano Kike 2Serrano Kike 3Bola 1Bola 2Bola 3
AE ( μg p-nitrofenol/g sol/h)Varietăț i de ardeiMediile activităților enzimatice pentru fosfataza acidă -soluri ecologice
Octombrie Iunie

41

5. Activit ățile enzimatice corelate cu pH-ul solu rilor din România
În privința rezultatelor obținute de la solurile convenționale, în conversie și ecologice din
România, rezultatele sunt mai ușor de interpretat, diferențele valorilor fiind vizibile între cele
3 tipuri supuse analizei potrivit Figurii 5. 13.:

Figura 5.11. Valorile activităților enzimatice ale fosfatazei acide pentru cele 3 tipuri de
sol, corelate cu valorile de pH
Se observă în figura 5.1 1. faptul ca pH -ul solului conventional este semnificativ mai mare
față de cel ecologic datorită aplicări pesticidelor . În același timp, în cazul solului aflat în primul an
de conversie se observa modificarea pH -ului. Din punct de vedere al activității enzimatice, se
observa valori mai ridicate în solurile ecologice în comparație cu cele convenționale pentru toate
enzimel e analizate.

124.46177.63287.998.9
8.5
8.2
7.888.28.48.68.89
0.0050.00100.00150.00200.00250.00300.00350.00
Sol convențional Sol conversie Sol ecologic
VALOAREA pH -ULUIAE(µg p -nitrofenol x g sol -1 x h -1)
Tipul de solActivitatea enzimatică a fosfatazei acide

42

Figura 5.12. Valorile activităților enzimatice ale fosfatazei alcaline pentru cele 3 tipuri de
sol, corelate cu valoar ile de pH
În urma calculelor, a rezultat faptul că pentru fosfataza acidă valorile activităților
enzimatice din solurile afla te în conversie au fost cu 4 2,72% mai mari comparativ cu cele din
solurile convenționale. În același timp, valorile activităților enzimatice din solurile ecologice au
fost cu 62,12% mai mari în comparație cu valorile solurilor în conversie.
Pentru fosfataz a alcalină valorile activită ților enzimatice din solurile aflate în conversie au
fost cu 13,51% mai mari comparativ cu cele din solurile convenționale. Valorile activităților
enzimatice din solurile ecologice au fost cu 32,67% mai mari în comparație cu val orile solurilor în
conversie .
Aceste rezultate pot fi corelate cu modificările apărute în pH -ul solului. Aplicarea pe termen
lung a pesticidelor și a îngrăsămintelor chimice duce la creșterea pH -ului solului, lucru ce se poate
observa din figura 5.1 2., und e solul convențional are pH=8.9 (sol moderat alcalin) și solul ecologic
are pH=8.2 (sol slab alcalin).

331.61376.41499.398.9
8.5
8.2
7.888.28.48.68.89
0.00100.00200.00300.00400.00500.00600.00
Sol convențional Sol conversie Sol ecologic
vALOAREA PH -ULUIAE (µg p -nitrofenol x g sol -1 x h -1)
Tipul de sol Activitatea enzimatică a fosfatazei alcaline

43
CONCLUZII

Activitățile enzimatice ale fosfatazelor sunt influențate semnificativ de sistemele agricole
practicate, indiferent de luna pentru care au f ost efec tuate determinările . Atât pentru luna iunie
cât și pentru luna octombrie diferențele sunt înalt semnificative, în favoarea sistemelor
ecologice de agricultură . Astfel, pe termen lung, aceste agroecosisteme asigură utilizarea
eficientă a resurselor din sol și un grad mai scăzut de degradare și contaminare. Din perspectiva
lucrării de față, acest lucru este marcat prin diferențele procentuale rezultate din determinările
efectuate. Pentru fosfataza alcalină, a fost demostrată o diferență medie procentu ală de 2 0% în
favoarea sistemului ecologic, iar pentru cea acidă de 62% în lunile la care ne -am raportat.
Condițiile de mediu ce favorizează a ctivităț i enzimatice crescute ale fosfatazei alcaline și
acide sunt precipitații le scăzute și temperaturi le ridicate, spe cifice lunilor de vară , condiții ce
determină accelerarea metabolismului organismelor implicate în sinteza acest or enzime .
Datorită cantității de precipitații ridicate și a temperaturilor relativ scăzute din luna octombrie ,
a putut fi observată var iația valorilor activităților enzimatice dintre anotimpuri. Valorile
activității enzimatice ale fosfatazei alcaline au scăzut din luna iunie până în luna octombrie în
medie cu 88%, iar cele ale fosfatazei acide cu 38%.
Datele obțin ute în România au reconfi rmat influența practicilor agricole asupra activităților
enzimatice și a valorilor de pH ale solurilor. Aplicarea pe termen lung a pesticidelor și a
îngrășămintelor a dus la creșterea pH -ului solurilor, de la slab alcalin (pH=8,2) pentru cele
ecologice, la moderat alcalin (pH=8,9) pentru cele convenționale. În acest caz, la fel ca în cazul
solurilor din Spania, solurile ecologice au fost mai active pentru fosfataze în comparație cu
cele provenite de la cu alte regimuri agricole in cluse, cel de conversie și cel convențional, astfel:
✓ Pentru fosfataza acidă , valorile activităților enzimatice din solurile aflate în conversie
au fost cu 43% mai mari comparativ cu cele din solurile convenționale. În același
timp, valorile activităților enzimatice din solurile ec ologice au fost cu 62% mai mari
în comparație cu valorile solurilor în conversie ;
✓ Pentru fosfataza alcalină , valorile activităților enzimatice din solurile aflate în
conversie au fost cu 14% mai mari comparativ cu cele din soluril e convenționale.
Valorile activităților enzimatice din solurile ecologice au fost cu 33% mai mari în
comparație cu valorile solurilor în conversie.

44
BIBLIOGRAFIE

1. Albiach, R., Canet, R., Pomares F. and Ingelmo F. (2001) Organic matter components,
aggregate stability and biological a ctivity in a horticultural soil fertilized with different rates
of two sewage sludges during ten years , Bioresource Technology 77:2, p. 109-114.
2. Altieri, M. (2001) Agroecología: principios y estrategias para diseñar sis temas agrarios
sustentables , (Ed.) Agroecología : el camino hacía una agricultura sustentable , p. 49-56.
3. Baldrian, Petr. (2009) Microbial enzyme -catalyzed processes in soils and their analysis ,
Plant, Soil and Environment 55, p. 370-378.
4. Bandick, A. K.; Dick, R. P. (1999) Field management effects on soil enzyme activities , Soil
Biology and Biochemistry , v. 31, n. 11, p. 1471 -1479.
5. Boerner, R. E. J., Decker, K. L. M. & Sutherland, E. K. (2000) Prescribed burning effects
on soil enzyme activity in a sourth ern Ohio hardwood forest: a landscap e-scale analysis ,
Soil Biol. Biochem 32, p. 899–908.
6. Briceño -Salazar, Jorge Arturo (1988) Effects of redox potential and soil management
practices on enzyme activities of soils: Retrospective Theses and Dissertations , p. 13-14.
7. Burns RG (1978) Soil enzy mes. Academic Press, London, UK.
8. Burns RG (1983) Extracellular enzyme -substrate interactions in soil , Microbes in Their
Natural Environment (1stedn), Cambridge University Press, London, UK.
9. Caldwell, B. A. (2005) Enzyme activities as a component of soil bi odiversity: A review ,
Pedobiologia (Jena) 49, p. 637–644.
10. Ch, Srinivasrao & Grover, Minaksh i & Kundu, Sumanta & Desai, Suseelendra (2017) Soil
Enzymes , p. 2100.
11. Chen, Hongjun (2003) Phosphatase activity and P fractions in soils of an 18 -year-old
Chinese f ir (Cunninghamia lanceolata) plantation , Forest Ecology and Management 178,
p. 301-310.
12. Chodak.M., and M. Niklinsk. (2010) Effect of texture and tree species on microbial
properties of mine soils , Applied Soil Ecology 46, p. 268–275.
13. Dick, W.A., L. Cheng and P. Wang (2000 ) Soil acid and alkaline phosphatase activity as
pH adjustment indicators , Soil Biol. Biochem 32, p. 1915 -1919.

45
14. Finzi AC, Sinsabaugh RL, Long TM, Osgood MP (2006) Microbial community responses
to atmospheric carbon dioxide enrichment in a warm -temperate fo rest, Ecosystems 9, p.
215-226.
15. Gálviz, C.; Burbano, H.; Bonilla, C. (2007) Actividad de fosfatasa ácida en suelos
cultivados con papa y praderas del corregimiento de Catambuco, Pasto – Colombia , Acta
Agronómica , v. 56, n. 1, p. 13-16.
16. Gianfreda L, Boll ag JM (1996) Influence of natural and anthropogenic factors on enzyme
activity , Soil Biochemistry (1stedn), Marcel Dekker Inc., New York, Basel, Hong Kong.
17. Gliessman, S. (2002) Agroecología : procesos ecológicos en agricultura sostenible.
18. Guan, S.Y. (1989) Studies on the factors influencing soil enzyme activities: I. Effects of
organic manures on soil enzyme activities and N and P transformations , Acta Pedologica
Sinica 26:1, p.72 – 78.
19. Haynes R.J. and Knight K.L. (1989) Comparison of ch emical properties, enzyme activities,
levels of biomass N and aggregate stability in the soil profile under conventional and no –
tillage in Canterbury, New Zealand , Soil and Tillage Research 14:3, p. 197 – 208.
20. Hedley M.J., Stewart J.W.B. and Chauhan B.S. (1982) Changes in inorganic and organic
phosphorus fractions induced by cultivation practices and by laboratory incubations , Soil
Sci. Soc. Amer. J. 46, p. 970 – 975.
21. Katai J., Helrneczi B. and Bekecs S. (19 86) Changes in phosphatase activity as a result of
fertilizer and herbicide application , Debrecini Agrartudomanyi Egyetem Tudomanyos
Kozlemenyei XXVI , p. 137 – 152.
22. Kirchner M.J., Wollum A:G. and King L.D. (1993) Soil microbial populations and
activities in reduced chemical input agroecosystems , Soil S cience Society of America
Journal 57:5, p. 1289 – 1295.
23. Kraemer, Susanne & M Green, Douglas (2000) Acid and alkaline phosphatase dynamics
and their relationship to soil microclimate in a semiarid woodland , Soil Biology &
Biochemistry – Soil biol biochem 32, p. 179-188.
24. Kumar, Sanjay & Chaudhuri, S & Maiti, Subodh (2011) Soil Phosphatase Activity in
Natural and Mined Soil – A Review , Ecology and Environment , p. 31.
25. Ladd J.N. & Butler J.H.A, Soil Biochemistry (1975) vol 4. (Ed. de A. D. Mc Laren și E. A.
Paul), p. 143.

46
26. Liliana Gianfreda, Maria A Rao, Enzymes in Agricultural Scienes (2014) OMICS Group
eBooks, p. 9-10.
27. Margalef O, Sardans J, Fernández -Martínez M, Molowny -Horas R, Janssens I A, Ciais P,
Goll D, Richter A, și colab., (2017) Global patterns o f phosphatase activity in natural soils.
Scientific Reports 7 (1) , p. 1337.
28. Marklein, A. R. & Houlton, B. Z. (20 11) Nitrogen inputs accelerate phosphorus cycling
rates across a wide variety of terrestrial ecosystems.
29. Nannipieri P, Kandeler E, Ruggiero P (2002) Enzyme activities and microbiological and
biochemical processes in soil , Enzymes in the environment . Activi ty, ecology and
application . (1stedn), Marcel Dekker, New York. USA.
30. Oberson, A. et al. (1996) Microbiological processes in soil organic phos phorus
transformations in conventional and biological cropping systems , Biology and Fertility of
Soils , v. 21, n. 3 , p. 138-148.
31. Ochoa, V. et al. (2007) Actividades enzimáticas como indicadores de calidad del suelo en
agroecosistemas ecológicos , Iniciació n a la Investigación , v. 2, n. 1, p. 1 -10.
32. Pilar -Izquierdo, Maria & Ortega Santamaría, Natividad & Perez -Mateos, Ma nuel & Busto,
María (2005) Barley seed coating with free and immobilized alkaline phosphatase to
improve P uptake and plant growth , The Journ al of Agricultural Science , p. 150.
33. Richard G. Burns, Science progress vol. 64, No. 254 (1977), Science Reviews 20 00 Ltd.,
p. 277-279.
34. Richardson, S. J., Peltzer, D. A., Allen, R. B., McGlone, M. S. & Parfitt, R. L. (2004) Rapid
development of phosphorus limitation in temperate rainforest along the Franz Josef soil
chronosequence , Oecologia 139, p. 267–276.
35. Sánchez de Prager, M. (2004) Actividad biológica en la rizósfera del maracuyá (Pasiflora
edulis var. Flavicarpa) en diferentes sistemas de manejo, es tados de desarrolly condiciones
fitosanitarias Thesis (Ph.D in Agricultural Engineering) – Universidad Poli técnica de
Madrid, Madrid.
36. Sarapatka, Borivoj (2003) Phosphatase activities (ACP, ALP) in agroecosystem soils. Diss.
(sammanfattning/summary) Uppsala : Sveriges lantbruksuniv., Acta Universitatis
agriculturae Sueciae , Agraria, p. 10.

47
37. Sardans, J. & Peñuelas , J. (2004) Increasing drought decreases phosphorus availability in
an evergreen Mediterranean forest , Plant Soil 267, p. 367–377.
38. Sardans. J., J. Penuelas., and M. Estiarte (2006) Warming and drought alter soil phosphatase
activity and soil P availabili ty in a Mediterranean shrub land , Plant Soil 289, p. 227–238.
39. Shao -shan An, Yi -mei Huang and Fen -li Zheng (2009) Evaluation of soil microbial indice s
along revegetation chronosequence in grassland soils on the Loess Plateau, Northwest
China , Applied Soil Ecology 4, p. 286–292.
40. Skujins J. & McLaren A.D. (1968) Enzymologia , p. 213.
41. Speir, T. W. and Ross, D.J. (1978) Soil phosphatase and Sulphatase , Soil Enzymes ,
Academic Press London , p. 197-250.
42. Tivy, J. (1990) Agricultural Ecology , Longmann Scientific and Technical England, p. 288.
43. Torres, M.; Lizarazo, L. (2006) Evaluación de grupos funcionales (ciclo del C, N, P) y
actividad de la fosfatasa ácida en dos suelos agrícolas del departamento de Boyacá
(Colombia) , Agronomía Colombiana, v. 24, n. 2, p. 317-325.
44. Tripathi. S., A. Chakraborty, K.Chakrabarti, and B.K. Bandyopadhyay (2007) Enzyme
activities and microbial biomass in coastal soils of India , Soil Biology & Biochemistry 39,
p. 2840 –2848.
45. Tscherko, D. et. al., (2003) Functional diversity of the soil microflora in primary succession
across two glacier forelands in the Central Alps. Eur. J. Soil Sci. 54, p. 685–696.
46. Turner, B. L. & Condron, L. M. ( 2013) Pedogenesis, nutrient dynamics, and ecosystem
development: The legacy of T.W. Walker and J.K.Syers , Plant Soil 367, p. 1–10.
47. Van. Aarle. I.M, and C. Plassard (2010) Spatial distribution of phosphatase activity
associated with ectomycorrhizal plants is related to soil type , Soil Biology & Biochemistry .
42, p. 324-330.
48. Yu, Shen & He, Zhenli & Stoffella, P.J. & Calvert, D.V. & Yang, X.E. & Banks, D.J. &
Baligar, V. (2006) Surface runoff phosphorus (P) loss in relation to phosphatase activity
and soil P fractions in Florida sany soils under citrus production , Soil Bi ology and
Biochemistry 38, p. 619-628.
49. Zamora, F.; Mogollón, J.; Rodríguez, N. (2005) Cambios en la biomasa microbiana y la
actividad enzimática inducidos por la rotación de cultivos en un s uelo bajo producción de
hortalizas en el estado Falcón, Venezuela . Multiciencias , v. 5, n. 1, p. 62-70.