SPECIALIZAREA: BIOTEHNOLOGII PENTRU INDUSTRIA ALIMENTARĂ [307132]

Universitatea de Știinte Agronomice și Medicină Veterinară București

Facultatea de BIOTEHNOLOGII

SPECIALIZAREA: BIOTEHNOLOGII PENTRU INDUSTRIA ALIMENTARĂ

LUCRARE DE DIPLOMĂ

CERCETĂRI DE CAULOGENEZĂ APLICATĂ LA VARIETĂȚI NOI DE TOMATE: SĂLBATICE, [anonimizat]:

Șef. Lucr. Dr. DĂNĂILĂ-GUIDEA SILVANA MIHAELA

ABSOLVENT: [anonimizat], Iulie 2018

CERCETĂRI DE CAULOGENEZĂ APLICATĂ LA VARIETĂȚI NOI DE TOMATE: SĂLBATICE, [anonimizat]

â

[anonimizat] 2018

Domeniul de studiu BIOTEHNOLOGII PENTRU INDUSTRIA ALIMENTARĂ

Programul de studii de licență /master LICENȚĂ

Forma de învățământ: CU FRECVENȚĂ

Declarație pe proprie răspundere privind

auteticitatea lucrării /proiectului de diplomă/ disertație

Subsemnata LEU A.V. IONELA – MĂDĂLINA legitimat cu C.I seria XZ nr. 670267 CNP [anonimizat] autorul lucrării CERCETĂRI DE CAULOGENEZĂ APLICATĂ LA VARIETĂȚI NOI DE TOMATE: SĂLBATICE, [anonimizat]. Elaborată în vederea susținerii examenului de finalizare a [anonimizat], sesiunea IULIE 2018 a anului universitar 2017-2018, [anonimizat], [anonimizat], și în bibliografie.

Declar, [anonimizat] a convențiilor internaționale privind drepturile de autor.

Delar, [anonimizat] a mai fost prezentată în fața unei alte comisii de examen de licență/disertație.

În cazul constatării ulterioare a [anonimizat], respectiv, anularea examenului de licență/disertație.

Nume, prenume

LEU IONELA MĂDĂLINA

Data

20.06.2018

Semnătura

REZUMATUL LUCRĂRII

În experimentele inițiate prin această lucrare s-a urmărit efectul concentrațiilor de fitohormoni (auxine și citochinine) asupra explantelor prelevate de la 3 varități de tomate luate în studiu.

Experiențele au fost efectuate în cadrul Laboratorului de Biologie al Facultății de Biotehnologii (USAMV București), acesta fiind special amenajat pentru desfășurarea operațiunilor specifice culturilor de celule și țesuturi "in vitro".

S-au utilizat semințe de tomate din cele trei varietăți: tigrate, [anonimizat], ce au fost mai întâi semănate în vederea germinării în substrat organic. Ulterior, răsadurile rezultate au fost folosite ca și material biologic pentru inițierea de experimente de multiplicare prin muguri (lăstari) adventivi conform protocolului recomandat de Badea E.M și Săndulescu D. (2001).

Metodele de lucru utilizate au presupus parcurgerea următoarelor etape de lucru: [anonimizat] & Skoog (dupa rețeta elaborată în 1962), [anonimizat].

Rezultatele au fost evaluate asupra a 3 serii experimentale de inoculări inițiate la intervale diferite pentru cele 3 varietăți de tomateː tomate nerge-ciocolatii (TC), sălbatice (TS) și tigrate (TT). Diferențele înregistrate periodic la nivelul creșterii în lugime a explantelor de hipocotil, frunze, nod cotiledonar și apexuri au fost evaluate timp de 6 luni.

CUPRINS

PARTEA DOCUMENTARĂ

INTRODUCERE

Capitolul I. Caracterizarea botanică și agrobiologică a speciei Licopersicon esculentum

1.1.Încadrarea sistematică a speciei Licopersicon esculentum

1.2.Particularități biologice ale speciei Licopersicon esculentum

1.3.Extinderea speciei pe plan mondial și în România

1.4.Varietăți existente de tomate

1.5.Principalele obiective ale ameliorării culturii

1.6.Importanța economică

Capitolul II.Cercetări efectuate pe plan mondial și în România pentru înmulțirea tomatelor

2.1.Înmulțirea pe cale generativă.

2.2.Înmulțirea pe cale vegetativă convențională

2.3.Înmulțirea pe cale vegetativă neconvențională prin cultura “in vitro”.

Capitolul III. Cercetări propii privind caulogeneza aplicată la varietăți noi de tomate

3.1. Materialul biologic utilizat

3.2. Metode de lucru utilizate

3.3. Varietățile luate în studiu ca material biologic

3.4. Condiții de incubare a explantelor

Capitolul IV.Rezultate experimentale

4.1.Observați ale influenței tipului de explant

4.2.Observați asupra influenței mediului de cultură și a balanței hormonale

CapitolulV.Concluzii

Bibliografie

ANEXE

INTRODUCERE

Scopul

exploatarea variabilității genetice induse la 3 varietăți studiate de tomate, în scopul obținerii unui material biologic de calitate superioară.

Pentru realizarea scopului propus, au fost stabilite următoarele obiective:

Obținerea de răsaduri din material biologic,

Obținera de clone omogene.

Motivația temei:

În modernizarea și progresul dinamic al industriei și agriculturii și implicit al societății umane în ansamblul ei, noile genotipuri cu potențial de producție mai ridicat și o valoare superioară au avut, au și vor avea un rol de o importanță covârșitoare.

Biodiversitatea din punct de vedere holistic trebuie conservată pentru fiecare specie în parte deoarece aceasta reprezintă garanția vieții noastre pe acest pământ. Diversitatea ne asigură hrana de mâine, material genetic cu care se poate jongla pentru a se obține varietăți noi, în concordanță cu cerințele actuale, dar și păstrarea cultivărilor tradiționale, vechi, cu gene de rezistență ascunse.

În cadrul genului Lycopersicon, biodiversitatea se manifestă printr-un adevărat spectacol fenotipic, oferindu-ne astfel posibilitați nenumărate de noi creații biologice și totodată fiind o sursă importantă de gene pentru viitorul ameliorării tomatelor.

Colecția impresionantă a bazei de germoplasmă a tomatelor a “Stațiunii de Cercetare și Dezvoltare pentru Legumicultură Buzău” se îmbogățește de la an la an cu peste 50 de linii noi, reprezentând astfel o adevărată sursă de biodiversitate și de gene importantă pentru amelioratori.

Scurtă prezentare a structurii lucrării, pe capitole

Lucrarea este formată din două parți: una documentară și una experimentală.

Fiecare parte, la rândul ei, este alcătuită din câte două capitole.

În partea documentară, în Capitolul I am descris încadrarea sistematică a speciei din care fac parte cele 3 varietăți de tomate, am abordat extinderea plantei la nivel mondial și principalele obiective ale ameliorării, precum și importanța ecomonică. Tot în acest capitol am vorbit și despre varietățile de tomate existente. În Capitolul II am discutat despre metodele de înmulțire folosite la tomate pe plan mondial și în România.

În partea experimentală (Capitolul III) am prezentat materialul biologic, realizat la SCDL Buzau, din care am prelevat explantele, am descris mediul de cultură pe care l-am utilizat, metoda de lucru aplicată, variantele experimentale și condițiile de incubare, iar în Capitolul IV am vorbit despre rezultatele și discuțile obținute în urma experimentului realizat.

Lucrarea se încheie cu concluziile și bibliografia.

PARTEA DOCUMENTARĂ

CAPITOLUL I. CARACTERIZAREA BOTANICĂ ȘI AGROBIOLOGICĂ A SPECIEI – LYCOPERSICON ESCULENTUM

1.1. Încadrarea sistematică a speciei Lycopersicon esculentum

1.2. Particularități biologice ale speciei Lycopersicon esculentum

Rădăcina

Rădăcinile plantelor de tomate, (Fig. 1.1.) sunt pivotante în cazul culturilor semănate direct, cu o adâncime de înrădăcinare care poate să depășească 100-120 cm ajungând până la 150 cm (Lehman,1953).

Fig. 1.1. – Rădăcină tomate (Sursa: www.notaxe.ro)

Tulpina

Tulpina plantelor de tomate, (Fig. 1.2.) este lipsită de țesuturi mecanice de rezistență, fiind necesară palisarea sa în unele sisteme de cultură.

Tulpina tomatelor are o mare capacitate de lăstărire, formând lăstari la subsuoara frunzelor, care poartă denumirea de copili. Copilii de sub primele două inflorescențe au cea mai mare viteză de creștere putând ajunge până la înălțimea tulpinii principale. În practică se aplică sau nu lucrarea de copilit în funcție de sistemul de cultură aplicat.

Tulpinile tomatelor sunt segmentate într-un număr variabil de internoduri care depinde de tipul de creștere și de înălțimea de cârnire. Tulpina emite ușor rădăcini adventive în porțiunile sau la nodurile care sunt în contact cu solul umed, cald, aerat.

Fig. 1.2. – Tulpină de tomate (Sursa: www.agropost.ro)

Frunze

Frunzele, (Fig. 1.3.) imparientat compuse, sectate, au foliole verzi, pubescente, de mărimi și forme diferite. Frunzele, tulpina și lăstarii sunt acoperiți cu perișori glandulari fragili, care se rup ușor eliberând un lichid care conține tanin și solanină.

Fig. 1.3. – Tipuri de frunze la tomate

(În colaborare cu Stațiunea de Cercetare Dezvoltare Legumicolă Buzău (S.C.D.L) Buzău )

Floare

Floarea tomatelor (Fig. 1.4.) este de tipul 5. Petalele sunt de culoare galbenă și sunt concrescute la bază. Staminele sunt concrescute la bază cu tubul corolei, iar anterele sunt unite, formând un con care acoperă pistilul. Pistilul este de obicei mai scurt decât staminele, polenizarea este autogamă, numai în cazuri rare, sub 5%, stigmatul este polenizat cu polen străin (polenizare alogamă).

În cazul condițiilor nefavorabile, fecundarea nu are loc, florile avortează și cad. În aceste condiții sunt necesare măsuri tehnologice pentru asigurarea fructificării.

Florile tomatelor sunt grupate în inflorescențe de tip cimă sau racem. Inflorescențele plantelor de tomate se formează pe interoduri. Înălțimea de inserție a primei inflorescențe este mai scundă (internodul 6-9) la cultivaruri timpurii sau mai înaltă (internodul 10-12) la cultivaruri tardive.

Fig. 1.4. – Floare de tomate (Sursa: www.iseoverde.ro)

Inflorescență

Următoarele inflorescențe, (Fig. 1.5.) apar ulterior de regulă pe fiecare al treilea internod. Literatura de specialitate menționează că distanța dintre inflorescențe la tomate poate fi de 1-4 noduri.
Inflorescențele sunt neramificate sau ramificate simplu ori multiplu. Numărul de flori în inflorescențe variază de la 4-5 în cazul cultivarurilor cu fructe mari până la peste 30 în cazul celor cu fructe mici, tip cireașă.

Fig. 1.5. – Inflorescență tomate (Sursa: www.coline.wordpress)

Semințe

Semințele tomatelor, (Fig. 1.6.) sunt oval rotunjite, turtite și acoperite cu perișori care le dau o culoare argintie. Într-un gram sunt 300-370 semințe. Hibrizii F1 au de obicei semințe mai mici decât soiurile pure. Facultatea germinativă este de 85-90% și se păstrează 5-6 ani. La temperaturi apropiate de cele minime caracteristice speciei, semințele germinează în 15-20 de zile iar la temperatura optimă doar în 3-6 zile.

Fig. 1.6. – Semințe tomate (Sursa: www.pastram-semintele.ro)

Fructul

Fructul la tomate, (Fig. 1.7.) este o bacă cărnoasă, cu forme, mărimi și culori care diferă mult în funcție de cultivar. Forma fructelor se exprimă prin indicele de formă If care reprezintă raportul dintre înălțimea și diametrul acestora.

Mărimea fructelor se apreciază cel mai adesea prin greutate și variază în limite largi. În ultimii ani în sortimentul mondial au apărut numeroase elemente noi în privința mărimii fructelor.

Principalele grupe de mărime a fructelor de tomate sunt următoarele:

–    Fructe tip cireașă cu greutatea de până la 15 – 30g;

–    Fructe midi/coktail cu greutatea cuprinsă între 40-60g;

–    Fructe mici cu greutatea cuprinsă între 60-120g;

–    Fructe mijlocii cu greutatea cuprinsă între 120-150g;

–    Fructe mari 150-220g;

–    Fructe foarte mari/beef cu greutatea fructului mai mare de 220g.

Culoarea fructelor este datorată prezenței în fruct a doi pigmenți lycopen și caroten care se găsesc în diferite proporții la diferitele cultivaruri. Culoarea fructelor poate fi roșie, portocalie sau galbenă și de diferite nuanțe ale acestor culori. Când fructele conțin mai mult betacaroten decât lycopen fructele sunt de culoare galben-oranj.

Culoarea fructelor apreciată la maturitatea fiziologică variază în limite largi la sortimentul mondial. Cea mai frecvent întâlnită culoare este roșu cu nuanțe de la roșu cărămiziu la roșu intens. În unele zone de consum se cultivă și comercializează și tomate cu fructe de culoare galbenă, portocalie sau roz la maturitatea de consum. Culoarea fructului poate fi uniformă pe întreaga suprafață sau cu zone verzi sau galbene în jurul pedunculului.

Fig. 1.7. – Fructe de tomate (Sursa: www.mygarden)

1.3. Extinderea speciei pe plan mondial și în România

“Domesticirea” tomatelor (Fig. 1.8.) a început în America de Sud prin diversificarea varietăților, proces total diferit față de selecția naturală a acestora în sălbaticie. Caracteristicile specifice acestui proces de “domesticire” sunt culoarea roșie foarte atractivă și dimensiunile mărite ale fructelor. Pentru mult timp după ce au fost aduse în Europa de către spanioli, tomatele au fost folosite ca plante ornamentale, eventual medicinale, sau „curiozități botanice”, nefiind consumate datorită mirosului neplăcut și conținutului ridicat de solanină. (Stan și colab., 2003).

Fig. 1.8. – Distribuția geografică a tomatelor sălbatice (În colaborare cu Stațiunea de Cercetare Dezvoltare Legumicolă Buzău ( S.C.D.L.) Buzău)

Indicele de adecvare (Fig. 1.9.) a culturilor pentru producția de tomate în sectorul SADC pe baza nivelului scăzut (A) sau ridicat (B) nivelul de intrare pentru perioada de referință 1961-1990. Înalt nivel de intrare presupune implementarea celor mai bune practici tehnologice, nutritive și de gestionare a culturilor; nivel scăzut de intrare presupune că se utilizează intrări minime (Fischer et al, 2002).

I

Figura 1.9. – Indicatorul de adecvare (Sursa: www.gaez.fao.org)

foarte mare

ridicat

mediu

1.4. Varietăți de tomate

Fig.1.10. – Schema clasificarii tomatelor (În colaborare cu Stațiunea de Cercetare Dezvoltare Legumicolă Buzău ( S.C.D.L.) Buzău)

Există o biodiversitate variată de soiuri de tomate (Fig. 1.11.) foarte gustoase și sănătoase, însă românii sunt foarte sceptici când vine vorba de a încerca ceva nou. Ca urmare cel mai cultivat soi în țara noastră este prekos întrucât este unul din hibrizii extra timpurii de tomate, consumatorii îl apreciază datorită gustului dulceag și a aromei specifice de roșie.

Pe langă culoare, tomatele prezintă o varietate mare de forme:

rotund, rotund înalt, rotund ușor aplatizat, puternic aplatizat;

pruniforme, ușor/puternic costate, tip pară, tip ardei gras;

tip ardei gogoșar, tip ardei lung, tip banană, tip lămâie, etc.

A B C

Fig. 1.11. (A,B,C) – Tomate cu fructul mare (În colaborare cu Stațiunea de Cercetare Dezvoltare Legumicolă Buzău( S.C.D.L.) Buzău)

A B C

Fig. 1.12. ( A,B,C ) – Tomate tip ardei gras și gogoșar (Sursa: În colaborare cu Stațiunea de Cercetare Dezvoltare Legumicolă Buzău( S.C.D.L.) Buzău)

A B C

Fig. 1.13. (A,B,C) – Tomate tip ardei lung

(În colaborare cu Stațiunea de Cercetare Dezvoltare Legumicolă Buzău( S.C.D.L.) Buzău)

A B C

Fig. 1.14. (A,B,C) – Tomate cherry (În colaborare cu Stațiunea de Cercetare Dezvoltare Legumicolă Buzău( S.C.D.L.) Buzău)

1.5. Principalele obiective ale ameliorării culturii

Astfel, asistăm la evoluția ameliorării tomatelor, înflorind mai ales în zonele acestora de cultură tradiționale. Italienii sunt lideri în dezvoltarea de noi cultivări, în timp ce în Europa de Nord varietățile se deosebeau doar prin culoare. Selecția cultivărilor rezistente la bolile specifice speciei a dus la diversificarea sortimentului de tomate.

Începând cu anul 1930, amelioratorii au descoperit modalități pentru a îmbunătăți eficiența selecției. Un bun exemplu este încercarea de a combina timpurietatea extremă a L. Pimpinellifolium cu soiul Bison, caracterizat de fructul de dimensiuni mari și de creșterea determinată.

Fig. 1.15. Harta cromozomială a tomatelor

(În colaborare cu Stațiunea de Cercetare Dezvoltare Legumicolă Buzău (S.C.D.L. Buzău))

Harta cromozomială a tomatelor ne dovedește variabilitatea din interiorul genului Lycopersicon cât și efectul linkage al grupelor de gene care sunt responsabile pentru manifestarea unui caracter sau al altuia.

1.6.Importanța economică

Producerea tomatelor este o activitate economică și alimentară de mare importanță, care la ora actuală permite obținerea de profituri, în special, în cazul aplicării tehnologiilor performante.

Tab. 1.1. – Compoziție nutrițională (Sursa: http://www.horticultorul.ro)

În România suprafețele cele mai mari cultivate cu tomate sunt concentrate în partea de sud, sud- vest și sud-est, în preajma marilor orașe, centre industriale și în zona fabricilor de conserve, unde s-au organizat ferme și asociații specializate în cultivarea tomatelor. Ponderea cea mai mare o au în ordine descrescătoare județele: Dolj, Galați, Ilfov, Constanța, Teleorman, Bihor, Arad, Călărași, Timiș și Brăila.

Pe lângă importanța economică și proprietățile lor nutritive, tomatele au și o importantă valoare terapeutică, de care trebuie să profităm mai cu seamă în sezonul cald. Potasiul, vitaminele C si E, licopenul, betacarotenul, folații și fibrele alimentare care se găsesc în roșii sunt un adevărat izvor de sănătate. Compoziția nutrițională a tomatelor este dată în Tab. 1.1.

CAPITOLUL II. CERCETĂRI EFECTUATE PE PLAN MONDIAL ȘI ÎN ROMÂNIA PENTRU ÎNMULȚIREA TOMATELOR

2.1. Înmulțirea pe cale generativă

Deși tomatele sunt universal și comercial propagate prin sămânță, propagarea asexuată prin tehnici precum grefarea și propagarea micro au fost încercate cu succes de mai mulți cercetători din întreaga lume.

Etapele de creștere a tomatelor

1. Germinarea semințelor în timpul vieții:

Prima etapă este, desigur, germinarea semințelor (Fig. 2.1.) ce poate dura în termen de opt zile. Tomatele au nevoie de umezeală până la germinare și 24-29°C. În această etapă germenii de tomate vor începe să-și dezvolte rădăcina, 2 cotiledoane și frunze pentru a începe procesul de fotosinteză. Pentru accelerarea oarecum a acestei etape, sunt necesare. în jur de 12-15 ore de lumină în fiecare zi. (Sursa: www.moef.gov.in/divisions/csurv/geac/Biology).

Fig. 2.1. – Germinarea semințelor de tomate (Sursa: www.envfor.ro.)

2. Stadiul vegetativ

După câteva săptămâni, planta de tomate va intra în cea de a doua etapă a creșterii.(Fig. 2.2.) Aici planta va începe să-și facă primul set de frunze adevărate. În timpul acesta cea mai mare parte a energiei plantei de tomate este îndreptată spre a forma rădăcini și frunze puternice. Tulpina va deveni mai puternică pentru a sprijini creșterea în greutate a frunzelor. În acest stadiu, tomate au nevoie de cel puțin șase ore de soare în fiecare zi.

Fig. 2.2.- Stadiul vegetativ al răsadurilor de tomate (Sursa: www.envfor.ro)

3. Etapa de înflorire

În a treia etapă de creștere a plantei de tomate, aceasta începe să-și dezvolte primul set de flori. (Fig. 2.3.)

Determinarea plantelor de tomate este cea în care planta poartă toate fructele sale deodată.

În urma celei de a treia etapă de creștere, frunzelor noi ale plantelor se opresc din dezvoltare.

O astfel de plantă nu va ajunge mai înaltă. Soiuri de tomate nedeterminate vor continua să crească în înălțime, să producă frunze noi și să se stabilească frunze noi suplimentare chiar și după această etapă de creștere.

Fig. 2.3. – Etapa de înflorire a plantelor de tomate (Sursa: www.envfor.ro)

4. Stadiul de fructificare

A patra etapă a creșterii tomatelor începe când petalele florilor mor, începând rodul tomatelor a se forma. (Fig. 2.4.) Fructele de tomate încep având culoarea verde și vor păstra această culoare până când ajung la dimensiunea completă. Când dimensiunea fructului este deplină, vor începe să se coacă. Primul semn de maturare are loc în partea de jos a fructului sau a vârfului vegetativ al flori. Nedeterminat soiurile vor rămâne mai mult timp în această etapă de creștere decât cele determinate.

După maturarea fructelor, plantele de tomate vor încep să se degradeze și să își înceteze creșterea.

Fig. 2.4. Stadiul de fructificare la tomate

( Sursa: www.google.ro/.Stadiul+de+fructificare)

2.2. Înmulțirea pe cale vegetativă convențională

Au fost cercetări extinse, acestea au fost efectuate pentru mecanismul de altoire, selecție de portaltoi, timp de altoire și alte legături ale tomatelor. Cartofii de porumb "Kufri Sindhuri" au fost folosiți pentru a altoi o specie de soi popular de tomate "Ruby Ruby" pentru a afla efectul timpului de altoire asupra randamentului, randamentul maxim fiind raportat din plantele grefate în luna decembrie.

2.3. Înmulțirea pe cale vegetativă neconvențională prin cultura “in vitro”

Progresul cunoștiințelor privind mecanismele genetice, elaborarea și perfecționarea tehnicilor de inducere a variabilității genetice, utilizând metoda culturilor de celule și țesuturi “in vitro”, precum și perfecționarea procedeelor de intervenție deliberată asupra genomului diverselor organisme vegetale utile (inginerie genetică), fac ca activitatea de creare a unor soiuri și hibrizi noi, din ce în ce mai valoroși, să devină nu numai eficientă, dar și mai specializată.

În procesul de inducere a variabilității genetice se induc numeroase genotipuri noi. O parte dintre acestea depășesc stadiul inițial.

Din punctul de vedere al reunirii într-un complex a caracteristicilor de producție, calitate, adaptabilitate și rezistență la boli și dăunători, acestea se selecționează și sunt utilizate ulterior ca material inițial în crearea de soiuri și hibrizi superiori la diferite plante de cultură.

Regenerarea „in vitro”, considerată inițial ca fiind o metodă rapidă de clonare a unui anumit genotip, este apreciată în prezent și ca o metodă de obținere a unor noi genotipuri, descendenții obținuți nefiind constituiți întotdeauna din copii fidele ale plantelor parentale.

Astfel, s-a demonstrat că, în cultura de celule și țesuturi vegetale este generată o mare variabilitate genetică.

Aceste modificări genetice sunt transmise la plantele regenerate și descendenții lor, putând fi astfel utilizate în programele de ameliorare a plantelor și pentru crearea de linii celulare cultivate în suspensii (RAICU, 1990). SKIRVIN și JANICH (1976) propun termenul de „calliclone” pentru plantele regenerate din calus, SHEPARD și colab. (1980) numesc „protoclone” plantele regenerate din protoplaști. LARKIN și SCOWCROFT (1981) folosesc termenul de „somaclone” pentru definirea plantelor derivate din orice cultură de celule și de „variație somaclonală” pentru variația înregistrată în cadrul culturilor “in vitro” (RAICU și BADEA, 1985).

Pentru micropropagarea roșiilor, au fost raportate rezultate privind regenerarea directă de la explante diferite, cum ar fi apexuri meristematice, cotiledoane, hipocotil, frunze și semințe, precum și de regenerare indirectă prin intermediul caulogenezei explantelor.

PARTEA EXPERIMENTALĂ

CAPITOLUL III. CERCETĂRI PROPII PRIVIND CAULOGENEZA APLICATĂ LA VARIETĂȚI NOI DE TOMATE

3.1. Materialul biologic utilizat

Acest experiment a fost realizat în cadrul Facultății de Biotehnologii, în Laboratorul de Biologie. În prima parte a experimentului am efectuat semănarea semințelor celor 3 varietăți noi de tomate (Fig. 3. 1.):

tomate sălbatice;

tomate tigrate;

tomate negre – ciocolatii.

A. B. C.

Fig.3.1. – Semințele din cele 3 Varietățile de tomate:

A-tomate sălbatice, B-tomate negre ciocolatii , C- tomate tigrate

Aceasta s-a realizat în pahare din plastic. Mediul de creștere al tomatelor a fost constituit din pământ negru de flori, ce are următoarea compoziție:

– turbă neagră;

– turbă sphagnum;

– îngrăsământ.

Pământul a fost repartizat în pahare de culoare albă, mici din plastic, în prima fază am pus pământ negru până la jumătatea paharului, apoi am însămânțat câte 4 semințe de tomate, după acoperim suprafața cu pământ.

După semănare, semințele au fost lăsate la germinat, în lumina directă a soarelui, fiind udate regulat, o dată pe săptămână (Fig. 3. 2.)

Pentru fiecare specie am avut 8 variante experimentale (pahare), fiecare cu câte 4 semințe.

Fig. 3.2. – Semănarea semințelor de tomate

După o perioadă de 2 săptămâni, s-a observat apariția germinării plantulelor de tomate (Fig. 3. 3.) Tomatele tigrate au germinat în procent de 50%, cele negre ciocolatii în procent de 60% , iar cele sălbatice în procent de 80%.

Fig. 3.3. – Răsărirea semințelor din cele 3 varietăți de tomate

3.2. Metode de lucru utilizate

Protocolul de lucru folosit în Laboratorul de Biologie (Facultatea de Biotehnologii din cadrul USAMV-București) la inițierea culturilor de înmulțire vegetativă neconvențională a cuprins parcurgerea mai multor etape de lucru precum:

prepararea mediului de cultură;

prelevarea explantelor;

sterilizarea materialului biologic;

inocularea și incubarea explantelor;

asigurarea parametrilor fizici favorabili inducerii dezvoltării proceselor morfogenetice.

3.2.1. Modul de lucru pentru prepararea mediului de cultură

Mediul de cultură se pregătește (Tab. 3. 1.) într-un recipient de 1000 ml în care se adaugă 400 ml H2Od, apoi se adaugă reactivii (Fig. 3.4.) în ordinea din rețetă, agitând vasul după adăugarea fiecărei soluții.

Tab. 3.1. Mediul de culturǎ Murashige and Skoog (1962) cu suplimentul hormonal optim pentru creșterea explantelor caulinare.

Rețeta de mediu bazal Murashige & Skoog (1962) utilizată pentru cultura ”in vitro” conține o serie de săruri organice și anorganice recomandate de autori să se administreze în următoarele cantități/1 litru de mediu de cultură.

Pentru stimularea alungirii lăstarilor din mugurii axilari, cât și pentru stimularea obținerii de muguri și lăstari regenerativi multiplii la speciile luate în studiu s-a testat efectul concentrațiilor de fitohormoni (auxine și citochinine) folosind mediul bazal Murashige & Skoog (dupa rețeta elaborată în 1962) agarizat cu 8 g/l Agar Noble și cu adaos de carbohidrați. PH-ul mediului de cultură a fost corectat înainte de autoclavare la valori cuprinse între 5 și 6.

Trebuie precizat și rolul pe care îl au carbohidrații în echilibrarea presiunii osmotice a mediului de cultură. Creșterea concentrației de zaharoză peste anumite limite are ca efect creșterea presiunii osmotice și plasmolizarea celulelor explantelor, iar în cazul culturilor de cartof poate asigura apariția și formarea microtuberculilor.

Fig. 3.4.. – Pregătirea mediului de cultură

După omogenizare, se adaugă inozitol și agar în cantitate de 8 g, urmând aducerea la semn cu apă distilată pană la 1000 ml.

După omogenizarea perfectă a întregului conținut, acesta va fi repartizat egal în 2 pahare Erlenmeyer de 500 ml, prevăzute cu dopuri. Mediul se va autoclava timp de 30 de minute la 121˚C (Fig. 3.5.).

Fig. 3.5. – Autoclav, Laborator de Biologie Facultatea de Biotehnologii

După autoclavare mediul trebuie lăsat puțin să se răcească și apoi repartizat în plăci petri într-un mediu steril la hotă (Fig. 3.6.).

Fig.3.6. – Repartizarea mediului de cultură

3.2.2. Fasonarea explantelor prelevate de la plantulele de tomate

Au fost pegătite 3 pahare Erlenmeryer de 200 ml, s-a notat cu markerul inițialele celor 3 varietăți de tomate (TT,TC,TS), fiecare pahar având inițială corespunzătoare soiului respectiv.

TT- reprezintă varietatea de tomate tigrate

TC-reprezintă varietatea de tomate ciocolatii

TS-reprezintă varietatea de tomate sălbatice

Faza de inițiere și stabilire a culturilor “in vitro” presupune, sterilizarea materialului vegetal, izolarea explantelor (meristeme, apexuri, fragmente uninodale) și inocularea acestora pe un mediu de inițiere.

În această fază este importantă realizarea culturii aseptice și începerea creșterii explantelor.

Fragmentele de organe sau de țesuturi folosite pentru inițierea culturii poartǎ numele de explante sau inoculi. Celulele din structura acestora, inoculate aseptic pe medii nutritive cu compoziții corespunzatoare (care sǎ inducǎ și sǎ susținǎ diviziunile celulare) și incubate în condiții controlate de temperaturǎ și de luminǎ, își pierd structura specializatǎ și sunt stimulate sǎ prolifereze, fapt ce face posibilǎ exprimarea unor noi procese morfogenetice.

În experiențele inițiate, ne-am propus testarea posibilităților de stimulare a formării de lăstari multipli în scopul elaborării unei metodologii de înmulțire clonală la specii de plante aromatice precum tomatele sălbatice, tomatele ciocolatii și tomatele negre-tigrate, cu ajutorul tehnicilor de culturi de țesuturi.

Pentru a testa capacitatea morfogenetică a tipurilor diferite de explante au fost folosite materiale tinere biologice, (explante nodale și apexuri meristematice prelevate de la lăstarii dezvoltați pe plante tinere comercializate în ghivece). Mugurii axilari de pe fragmentele nodale aveau dimensiuni foarte mici fiind imperceptibili cu ochiul liber în momentul inoculării.

Tipul de explant utilizat de noi pentru micropropagare a constat din apexuri caulinare, terminale cu dimensiunea de aproximativ 1 cm, constând din mugure și o porțiune din lǎstar fiind supuse anterior inoculǎrii unei aseptizǎri de suprafațǎ. Același protocol a fost utilizat la initierea culturii la tomate (Fig. 3.7.).

Inocularea a constat din plasarea explantelor pe variantele de medii de culturǎ alese pentru experimentare, repartizate în vase de culturǎ sterile, operațiile de lucru fiind efectuate la hota cu flux laminar.

Fig. 3.7. – Etapa de fasonare a plantulelor

Pentru inocularea explantelor la hota cu flux laminar aceasta va fi sterilizată cu alcool sanitar de 70˚.

Explantul în primă fază va fi repartizat cu ajutorul unei pense pe un servețel steril în jurul flăcării de gaz, apoi acesta cu ajutorul pensei va fi inoculat în placă petri după ce deschiderea plăcii a fost sterilizată.

După efectuarea inocularii tuturor explantelor pe plăcile Petri, acestea au fost notate cu inițiala corespunzătoare fiecărei specii de tomate și cu data când acestea au fost efectuate.

La sfârșitul etapei de inoculare am sigilat plăcile Petri cu folie adezivă pentru a reduce riscul contaminări.

3.2.3. Sterilizarea materialului biologic

O etapǎ obligatorie a micropropagǎrii „in vitro” constǎ din aseptizarea materialului biologic, pentru stabilirea de culturi sǎnǎtoase și viabile în același timp.

Contaminarea cu microorganisme reprezintǎ o problemǎ realǎ care afecteazǎ succesul culturilor „in vitro”, necesitând multǎ experiențǎ, grijǎ și o bunǎ organizare a unitǎții experimentale ( Roșu A., 1999, 2006 )

Atât microorganismele aflate pe suprafața țesuturilor și organelor supuse explantǎrii cât și cele endofitice influențeaza negativ, pe tot parcursul prezenței lor, viabilitatea celulelor explantului și capacitatea morfogeneticǎ. Totodatǎ, sterilizarea de suprafațǎ nu trebuie sǎ afecteze viabilitatea celulelor inoculului.

Sterilizarea chimică (propriu-zisa), de suprafață, a tipurilor de explante folosite de la tomate s-a efectuat în două variante de sterilizare astfel :

– cu o soluție de clorurǎ mercuricǎ în concentrație de 0,05 %, timp de acțiune 20 minute;

– două cu o soluție de Domestos 10%, timp de sterilizare 20 minute.

Etapa de sterilizare a materialului biologic presupune parcurgerea a mai multor sub etape:

pregătirea explantelor în vederea sterilizării (prelevarea si fragmentarea);

presterilizarea;

sterilizarea chimică (propriu-zisa) de suprafață;

îndepărtarea sterilizantului chimic.

Înaintea folosirii pentru culturile “in vitro”, materialul vegetal trebuie pregătit cu minuțiozitate. Materialul vegetal provenit din câmp are un grad de infecție sporit, motiv pentru care înainte de a fi folosit trebuie supus unor operații suplimentare de pregătire:

în prealabil se recomandă îmbăierea lor într-o soluție slabă de fungicid (Topsin 0,1%, Ronilan, Rovral, Benlate);

dintre lăstari se vor alege întotdeauna lăstarii cei mai tineri și porțiunile terminale ale lăstarilor;

dacă este posibil, plantele se vor transfera din câmp în containere, în sere sau camere de creștere și se vor folosi numai părțile crescute ulterior.

Agenții sterilizanți folosiți în culturile “in vitro”, au o compoziție și mod de folosire diferit; întrucât clorura mercuricǎ (HgCl2) este un compus foarte toxic, recomandǎm utilizarea produselor comerciale pe bazǎ de hipoclorit de sodiu și surfactanți neionici (produsul comercial de dezinfectant “Domestos”/ ʺ Cloroxʺ) în concentrație de 10% (v/v) pentru sterilizarea materialului biologic reprezentat de fragmente uninodale si apexuri meristematice, deoarece sunt ieftine, nepoluante și cu toxicitate redusǎ pentru țesuturile vii.

Pentru îndepărtarea sterilizantului chimic, s-au efectuat 3 spălări a câte 10 minute cu apă distilată sterilă.

Procentul de explante aseptice obținute în experimentele inițiate în acest proiect, după fiecare sterilizare a explantelor utilizând atât varianta de sterilizare cu HgCl2 cât și cu Domestos, a fost în medie de 70-80%.

În fiecare pahar Erlenmeryer au fost plasate explantele secționate din varietatea de tomate respectivă. Gura vaselor a fost apoi acoperită cu o pânză care poate absorbi apa și, s-a legat bine cu un șiret. Apoi fiecare pahar Erlenmeryer a fost plasat sub jetul apei de la robinet, omogenizându-le în același timp. Au fost aplicate 6 spălări succesive pentru fiecare pahar.

După această etapă în paharele Erlenmeryer cu explantele secționate s-a adăugat clorură mercurică pentru sterilizarea de suprafață (Fig. 3.8.).

Această etapă s-a efectuat la hotă cu flux laminar, lângă flacăra de gaz timp de 3 min fiecare a 3 repetări sucesive în recipiente aseptice. După fiecare 3 min clorura mercurică a fost deversată într-un borcan.

Fig. 3.8. – Sterilizarea explantelor cu clorură mercurică.

3.2.4. Inocularea explantelor

Inocularea explantelor într-o primă etapă s-a efectuat în vase de cultură tip fiole cu înălțimea de 10 cm, acoperite cu dopuri confecționate din tifon și vată și învelite în staniol sau vase tip fiolă cu filet cu dopuri din teflon.

Repartizarea mediului (aproximativ 10 ml de mediu la o fiolă), precum și operațiile de sterilizare și inoculare a materialului biologic (Fig. 3.9.). au fost efectuate în condiții aseptice, în interiorul hotei cu flux laminar.

Ulterior, pe măsura dezvoltării culturilor, acestea au fost transferate (în momentul efectuării pasajelor) în vase cu capacități mai mari (vase Erlenmayer de 100 ml).

Transferurile culturilor pe medii proaspete cu aceeași balanță hormonală sau pe medii cu alte variante s-a realizat la interval de 3-4 săptămâni.

Fig. 3.9. – Inocularea explantelor în vase Petri

3.3. Varietățile de tomate luate în studiu ca material biologic

Tomate tigrate

O încrucișare naturală și stabilizată între Zebra Verde și o tomată neagră de Jeff Dawson. Acesta este una dintre STARS din întreaga mea prezentare de tomate. Un success sa dovedit pe piețe. Semințele noastre organice de tomate, TomatoFest produc plante de tomate viguroase, nedeterminate, cu frunze regulate, care produc 1-1/2, tomate suculente, rotunde, cu piele purpuriu și mahon, cu dungi verzi (cum ar fi periile) complexe, cu adevărat delicioase arome de tomate care conțin indicii de fum și dulceață. Aroma sa poartă de asemenea, complexitatea bogată asociată cu cele mai bune tomate neagre. Aceasta este una dintre favoritele noastre pentru aspect și gust. (Sursa: www.store.tomatofest.com)

B.) Tomate ciocolatii

Una dintre primele 3 tomate ale TomatoFest 2007. Semințele noastre organice de tomate produc plante foarte mari, nedeterminate, cu frunze regulate, care dau o recoltă bogată de 3-4 cm, de culoare mahon, cu întindere verde, de măsline verzi (similar cu zebra neagră). Fructele au aromă delicioasă, complexă, bogată, dulce, de pământ. Ciocolata de ciocolata, o alta dorita "tomata neagra", este o roșie excelentă și o alegere bună pentru grădina dumneavoastră. de tomate. Produce bine în toamnă o tomată de sandviș mare și tomata de salată. (Sursa: www.store.tomatofest.com/Chocolate)

Tomate sălbatice

Tomata sălbatică sau Solanum Sisymbriifolium este o plantă perenă, dar la noi este anuală, erbacee, din familia Solanaceae, popular sub denumirea de Tomate sălbatice, dar foarte țepoasă, are țepi pe tulpină, frunze, fruct, de aceea este o plantă care se poate planta ca un gard de protectie împotriva rozatoarelor. Solanum Sisymbriifolium are florile asemanatoare cartofului, dar mult mai mari, iar fructele sunt ca la castană, într-o capsulă spinoasă, care la coacere se deschide, putând astfel să culegem fructul de culoare rosie si miez portocaliu,cu multe seminte ca la zmeură, cu un gust dulce-acrișor. (Sursa: www.seminte-exotice.ro)

3.4. Condiții de incubare a explantelor

Experiențele au fost efectuate în cadrul laboratorului special amenajat pentru desfășurarea operațiunilor specifice culturilor de celule și țesuturi "in vitro".

Laboratorul destinat cultivării "in vitro" din cadrul Laboratorul de Biologie este organizat pe sistem clasic și poate deservii tuturor operațiunilor necesare desfășurării în condiții optime a activității de cercetare în domeniul biotehnologiilor vegetale.

Conform fluxului tehnologic caracteristic culturilor "in vitro" operațiunile aseptice din cadrul acestuia se realizează în camera sterilă, izolată – Fig. 3.10.

Fig. 3.10. – Aspect general din camera sterilă

În această încăpere, în cazul în care nu se lucrează suprafețele sunt iradiate cu raze ultraviolete (U.V.). De asemenea aici se găsesc nișe prevăzute cu flux de aer laminar, orizontal de aer steril (Fig. 3.11).

Fig. 3.11. – Hota în flux vertical de aer steril

În momentul începerii operațiunilor de inoculare suprafețele de lucru și mâinile operatorului se șterg periodic cu alcool 700, iar inoculările se realizează cât mai aproape de flacără. Cu instrumentele sterilizate prealabil în etuvă la 1600C și flambate periodic în flacără (după ce au fost introduse în alcool), apoi răcite, se prinde fragmentul de țesut, după care se deschide recipientul de cultură, se încălzește gâtul flaconului (astfel încât aerul cald să circule dinspre interior spre exterior, împiedicând accesul în vas al eventualilor spori și germeni) și se introduce țesutul prelevat pe mediul de cultură steril.

După inoculare, atât gura recipientului cât și porțiunea de dop, ce se introduce în gura flaconului se flambează, după care se închide flaconul. Toate obiectele care se introduc în nișă sunt prealabil sterilizate în autoclav sau etuvă.

După inocularea explantelor, recipientele de cultură sunt trecute în camera de creștere – camere de climatizare Sanyo prevăzută cu regim termic, hidric și de iluminare stabil și reglabil (Fig.3.12.).

Flacoanele de cultură sunt așezate pe etajere, la distanțe convenabile, în sensul asigurării iluminării corespunzătoare a culturilor (2400-3000 lucși).

Prezența luminii este indispensabilă pentru declanșarea și susținerea proceselor de organogeneză, respectiv în diferențierea mugurilor, în creșterea lăstarilor, în inițierea rădăcinilor, în cultura de embrioni etc. ea influențând atât prin intensitate și compoziție spectrală, cât și prin fotoperioadă.

Fig. 3.12. – Camera de climatizare Sanyo

În literatura de specialitate alternanța luminii cu întunericul (respectiv fotoperioada) optimă pentru incubarea și creșterea culturilor se recomandă a fi cea care corespunde la 16 ore lumină/24 ore. Temperatura din camera de creștere este reglabilă și stabilă, regimul termic putând fi schimbat, în funcție de tipul de cultură, precum și de necesitățile fiecărei etape de dezvoltare a culturilor tisulare sau celulare. Umiditatea din camera de creștere este menținută în jurul valorii de 70-100%, valoare recomandată de literatura de specialitate (Murashige, 1974).

CAPITOLUL IV. REZULTATE EXPERIMENTALE

4.1. Observații ale influenței tipului de explante

A.) Observații explante din Seria I Experimentală

Evoluția explantelor de hipocotil inoculate la de 7.12.2017, reprezentând Seria I experimentală, iar în data de 13.02.2018 explantele de hipocotil sunt analizate, fiind reprezentate în Fig. 4.1. respectiv în Tab. 4.1.(din Anexa 1).

Fig. 4.1. Evoluția explantelor de hipocotil la data de 13.02.2018

Analizând obervațile din Tab. 4.1. (Anexa 1) și Fig. 4.1. referitor la evoluția explantelor de hipocotil inoculate în Seria I am concluzionat în data de 22.05.2018 următoarele, pentru fiecare dintre cele 3 varietăți de tomate :

varietatea de TS cu fragmente de hipocotil, din 29 de explante viabile inoculate, 24 explante au fost neviabile acestea fiind fără răspuns morfologic iar celelate 5 explante viabile cu dezvoltare de calus, rezultând: 14.50% au dezvoltat calus, și 85.5% fără raspuns morfologic.

varietatea de TT cu fragmente de hipocotil, din cele 14 explante neviabile rezultând 100% fără răspuns morfologic.

varietatea de TC cu fragmente de hipocotil rezultând din cele 6 explante neviabile 100% fară raspuns morfologic.

Fig. 4.2. Varietatea de tomate sălbatice, tigrate și ciocolatii explante de hipocotil și frunze inoculate în data de 07.12.2017 aparținând Seriei I

Evoluția explantelor inițiale de hipocotil inoculate la de 7.12.2017, reprezentând Seria I experimentală, iar în data de 22.05.2018 explantele de hipocotil sunt analizate, fiind reprezentate în Fig. 4.3. respectiv în Tab. 4.2. (din Anexa 2).

Fig. 4.3. – Evoluția explantelor de hipocotil la data de 22.05.2018

Analizând obervațile din (Tab. 4.2.), (Fig. 4.3.) referitor la evoluția explantelor de hipocotil inoculate în Seria I, am concluzionat în data de 22.05.2018 următoarele pentru fiecare dintre cele 3 varietăți de tomate :

varietatea de TT de hipocotil din cele 14 explante rezultând 100% neviabile

varietatea de TS de hipocotil din cele 24 de explante rezultând 13.80% viabile cu calus, 86.20% neviabile.

varietatea de TC de hipocotil din cele 6 explante rezultând 100% neviabile.

Fig. 4.4. Explante din frunze , din tomate tigrate și tomate sălbatice analizat în data de 13.02.2018 aparținând Seriei I

Evoluția explantelor din frunze inoculate la data de 7.12.2017, reprezentând Seria I experimentală, iar la data de 13.02.2018, explantele din frunze sunt analizate, fiind reprezentate în Fig.4.4. respective în Tab. 4.3. din Anexa 3).

Fig. 4.4. –Evoluția explantelor din Frunze la data de 22.03.2018

Analizând rezultatele înregistrate în (Tab.4.3), (Fig.4.4) referitor la evoluția explantelor din frunze inoculate în Seria I din cele 3 varietăți de tomate la aproximativ 3 luni de la inoculare (în data de 22.03.2018), am concluziționat urmatoarele:

varietatea de TT cu frunze din cele 3 explante rezultă 2 explante viabile cu dezvoltare parțială de calus și 1 explant viabil rezultând caulogeneză exprimată prin dezvoltare a 4 lăstari prevăzuți cu o pereche de frunze, rezultând 100% explante viabile.

varietatea de TS cu frunze din cele 7 explante rezutând 100% explante neviabile.

varietatea de TC cu frunze din 3explante rezultând 100% explante neviabile.

Fig. 4.5. Explante din frunze, din tomate tigrate și tomate ciocolatii analizat la data de 22.03.2018 aparținând Seriei I și Seria II.

Evoluția explantelor inoculate din Frunze la data de 7.12.2017 reprezentând Seria I experimentală iar la data de 22.03.2018, explantele din frunze sunt analizate, fiind reprezentate în fig 4.5. respectiv în Tab. 4.4. (din Anexa 4).

Fig.4.6. – Evoluția explantelor din frunze la data de 22.05.2018

Analizând rezultatele înregistrate în Tab. 4.4, Fig.4.6, referitor la evoluția explantelor din frunze inoculate în Seria I, cele 3 varietăți de tomate la aproximativ 6 luni de la inoculare în data de 22.05.2018, am concluzionat urmatoarele:

– varietatea de TT din cele 3 explante, 2 explante viabile cu dezvoltare de calus și dezvoltare de lăstari, 1 explant viabil rezultând caulogeneză exprimată prin dezvoltare a 4 lăstari prevăzuți cu o pereche frunze. 100% explante viabile.

– varietatea de TS din cele 7 explante rezultând 100% explante neviabile.

– varietatea de TC din cele 3 explante rezultând100% explante neviabile.

În data de 5.03.2018, pentru varietatea de TT sa efectuat transfer de explante de frunze de pe mediul MC2.pe același mediu, iar în data de 3.04.2018 , pentru varietatea de TT sa efectuat transfer de apex pe varianta de mediu GD rezultând o alungire a lăstarilor cu o dimensiune de 5 cm.

Fig. 4.7. Explante din frunze , din tomate tigrate și tomate sălbatice analizat în data de 22.05.2018 aparținând Seriei I

Observații explante din Seria II Experimentală

Evoluția explantelor din frunze inoculate la data de 14.02.2018 reprezentând Seria II experimentală, iar la data de 22.05.2018 sunt analizate, fiind reprezentate în Fig. 4.8. respectiv în Tab 4.5.(din Anexa 5).

Fig.4.8. – Evoluția explantelor din Frunze la data de 22.05.2018

Analizând obervațile din (Tab. 4.5.), (Fig. 4.8.) referitor la evoluția explantelor din fruunze inoculate în Seria II, am concluzionat în data de 22.05.2018 următoarele pentru fiecare dintre cele 3 varietăți de tomate :

la varietatea de TT din cele 11 explante din frunze, 3 dintre explante prezintă calus la suprafață iar celelalte 8 dintre explante și-au exprimat răspunsul morfogenetic prin dezvoltare de lăstari, rezultând 100% explante viabile. Diferentele de crestere în lungime au fost cuprinse între 0,10 – 0,20 cm/explant.

la varietatea TS din cele 5 explante din frunze, 3 explante apex din care 2 cu lăstari alungiții și 3 explante cu calus la bază și cu o frunză alungită, rezultănd 100% explante viabile. Diferentele de crestere în lungime au fost doar de 0,10 – 0,14 cm/explant.

În data de 22.05.2018 au fost transferate varietatea de TS din Seria II de pe mediul MC2 pe mediul GD și varietatea TT din Seria III de pe mediul MS pe mediul GD.

Fig. 4.9. Explante din hipocotil din tomate tigrate și tomate sălbatice analizate la data de 14.02.2018 aparținând Seriei II

Evoluția explantelor din frunze inoculate la data de 14.02.2018 reprezentând Seria II experimentală, iar la data de 27.03.2018, sunt analizate, fiind reprezentate în Fig. 4.10. respectiv în Tab 4.6. ( din Anexa 6 ).

Fig. 4.11. – Evoluția explantelor din frunze la data de 22.05.2018

Analizând obervațile din (Tab. 4.6.), (Fig. 4.10.) referitor la evoluția explantelor din fruunze inoculate în Seria II, am concluzionat în data de 27.03.2018 următoarele pentru fiecare dintre cele 3 varietăți de tomate:

– varitatea de TS din cele 5 explante apex, 2 cu lăstari alungiții și 3 explante cu calus la bază cu frunze alungite, rezultând 100% explante viabile.

– varietatea de TT din cele 14 explante din frunze, 3 dintre explante prezintă calus la suprafață iar celelalte 11 rezultă explante viabile prin dezvoltare de lăstari, rezultând 100% explante viabile.

Fig. 4.12. Explante din frunze din tomate tigrate și tomate sălbatice analizat în data de 22.03.2018 aparținând Seriei II

Observații explante din Seria III Experimentală

Evoluția explantelor din frunze inoculate la data de 11.05.2018 reprezentând Seria III experimentală, iar la data de 22.05.2018, sunt analizate, fiind reprezentate în Fig. 4.13. respectiv în Tab 4.7. ( din Anexa 7 ).

Fig. 4.13. – Evoluția explantelor din frunze la data de 22.05.2018

Analizând obervațile din (Tab. 4.7.), (Fig. 4.13.) referitor la evoluția explantelor din frunze inoculate în Seria III, în data de 22.05.2018 a rezultat după aproximativ 1 lună de la inițierea culturilor pe varietatea de TT din cele 28 de explante viabile din apexuri, 14 explante viabile și 14 explante neviabile, rezultând un procent de 50% explante viabile /50% explante neviabile.

Fig. 4.14. Explante din frunze din tomate tigrate și tomate ciocolatii analizat în data de 11.05.2018 aparținând Seriei III.

4.2. Observații ale influenței mediului de cultură și a balanței hormonale

Rezultate pozitive în inducerea caulogenezei (formării de lăstari adventivi) la explantele de tomate din frunze și explante de hipocotil utilizat ca sursă de material biologic de la răsaduri în urma plantări semintelor din cele 3 varietăți de tomate : tomate sălbatice (TS), tomate ciocolatii (TC) și tomate negre-tigrate (TT), furnizate de la SCDL Buzău am obținut doar pe variantă hormonală C2 cu 2,0 mg/lBAP+0,01 mg./l NAA pe același mediu bazal Murashige & Skoog (1962) și adaos de 7 gr./l agar+ 30 gr./l zaharoza.

Tabelul 4.2.1.Compozitia mediului de cultură și a balanței hormonal

Fig. 4.15. – Explante cu calus la bază Fig. 4.16.- Explante de apexuri

Observațiile noastre privind efectul fitohormonilor asupra evoluției explantelor de tomate tigrate cultivate „in vitro” pe variantele V1 și V2 au condus la concluzia cǎ ambele citochinine utilizate (BAP si K) în concentratii de 2 mg/l a stimulat alungirea mugurilor axilari și dezvoltarea de culturi morfogenetice cu lăstari adventivi multipli.

CAPITOLUL V. CONCLUZII

Concluziile din cadrul lucrării de licență intitulată Cercetări de caulogeneză aplicată la varietăți noi de tomate: sălbatice, tigrate și negre-ciocolatii au fost sintetizate pe 3 serii experimentale de inoculări inițiate la intervale calendaristice diferite, pentru cele 3 varietăți de tomateː tomate nerge-ciocolatii(TC), sălbatice (TS) și tigrate(TT), după cum urmeazăː

La Seria I experimentală au rezultat după 6 luni de la inițierea culturilor pentru explantele de hipocotil din tomatele nerge-ciocolatii(TC) un procent de 14,5% explante viabile cu formare de calus proliferativ și respectiv de 13.8% explantele viabile cu formare de calus proliferativ la tomatele sălbatice (TS) comparativ cu explantele de tomate tigrate(TT) la care nu s-au înregistrat răspunsuri de morfogeneză. Referitor la evoluția explantelor de frunze inoculate, doar în cazul explantelor prelevate de la tomatele tigrate au fost observate procesele de multiplicare prin muguri (lăstari) adventivi exprimate prin formarea în medie de 4 lăstari/ explant.

La Seria II-a experimentală a rezultat după 3 luni de la inițierea culturilor din totalul de 14 explante de frunze pentru tomatele tigrate(TT) că 3 dintre explante (21,43%) au prezentat calus la suprafață iar celelalte 11 dintre explante (78,57%) și-au exprimat răspunsul morfogenetic prin dezvoltare de lăstari, iar la varietatea de tomate sălbatice(TS) din cele 5 explante nod cotiledonar au rezultat 2 cu lăstari alungiții(40%) și 3 explante cu calus la bază și cu o frunză alungită.

La Seria III-a experimentală a rezultat la că la aproximativ 1 lună de la inițierea culturilor 50% din explantele de tomate tigrate (TT) inoculate au supraviețuit condițiilor de cultivare in vitro și totodată că și-au început procesele de morfogeneză.

Ținând cont de rezultatele obținute în cele 3 serii experimentale, referitoare la analiza randamentului de multiplicare al explantelor cultivate „in vitro” exprimate prin număr de lăstari dezvoltați/ explantul de frunze și de nod cotiledonar, am ajuns la concluzia că cel mai bine au reacționat tomatele tigrate (78,57%) comparativ cu explantele de tomate nerge-ciocolatii și cele sălbatice, iar în privința analizei dezvoltării de calus la nivelul explantelor de hipocotil acesta s-a manifestat la tomatele nerge-ciocolatii(TC) pe 14,5% dintre explante și la tomatele sălbatice (TS) pe 13.8% dintre explantele viabile.

ANEXE – REZULTATE EXPERIMENTALE

Anexa 1 – Evoluția explantelor de hipocotil inoculate în Seria I experimentală efectuate în perioada 7.12.2017/13.02.2018 (Tab. 4.1)

Legenda: TT- tomate tigrate, TS- tomate sălbatice, TC- tomate ciocolatii

Anexa 2. Evoluția explantelor de hipocotil inoculate în Seria I experimentală efectuate în perioada 7.12.2017 / 22.05.2018 (Tab. 4.2.)

Legenda: TT- tomate tigrate, TS- tomate sălbatice, TC- tomate ciocolatii

Anexa.3 Evoluția explantelor de frunze inoculate în Seria I experimentală efectuate în perioada 7.12.2017/13.02.2018 (Tab. 4.3.)

Legenda: TT- tomate tigrate, TS- tomate sălbatice, TC- tomate ciocolatii

Anexa.4 – Evoluția explantelor de frunze inoculate în Seria I experimentală efectuate în perioada 7.12.2018 /22.05.2018 (Tab. 4.4.)

Legenda: TT- tomate tigrate, TS- tomate sălbatice, TC- tomate ciocolatii.

Anexa.5 – Evoluția explantelor de frunze inoculate în Seria II experimentală efectuate în perioada 14.02.2018 / 22.03.2018 (Tab. 4. 5.)

Legenda: TT- tomate tigrate, TS- tomate sălbatice, TC- tomate ciocolatii.

Anexa.6 – Evoluția explantelor de Frunze inoculate în Seria II experimentală efectuate în perioada 14.02.2018 / 27.03.2018 (Tab. 4.6.)

Legenda: TT- tomate tigrate, TS- tomate sălbatice, TC- tomate ciocolatii

Anexa.7 – Evoluția explantelor de apexuri inoculate în Seria III experimentală efectuate în perioada 11.05.2018/22.05.2018 (Tab.4.7.)

Legendă: TT- tomate tigrate.

REFERINȚE BIBLIOGRAFICE

1 Bălașa M.,Voican V. Savițchi, Stan N. 1984; Legumincultură generală și specială, Editura Didactică și Pedagogică, București.

2. Bodea, C. 1984; Tratat de biochimie vegetală, Editura Academiei Române, București.

3. Butnariu H. și colab. 1993, Legumicultură, Editura Didactică și Pedagogică București, Ciofu R. si colab. 2004, Tratat de legumicultură, Editura Ceres, București, p. 121-124.

4. Hoza G. 2011; Legumicultură Generală, Universitatea de Științe Agronomice și Medicină Veterinară București.

5. Indrea D., Apahidean Al. 1995; Ghid practic pentru cultura legumelor, Editura Ceres București.

6. King, S.R., Davis, A.R., Zhang, X., Crosby, K., 2010; Genetics, breeding and selection of

rootstocks for Solanaceae and Cucurbitaceae. Sci. Hort. 127.

7. Manescu,B. 1972 – Culturi forțate de legume, Editura Didactică și Pedagogică,București.

8. Măniuțiu D. 2008, Legumicultură generală, Editura AcademicPres, Cluj- Napoca.

9. Marinescu, Gh. 1984; Metodă pentru combatrea ofilirii bacteriene a tomatelor, care utilizează altoirea, metodă nepoluantă care limitează infecțiile cu Corinebacterium miciganense din sere. Hotărârea nr. 5144 și brevet de invenție nr. 86353.

10. Popescu V. 1996; Legumicultură voi I,Editura Cedes, București.

11. Popescu V. 1997; Popescu A. Grădina de legume, voi. II, Editura Grand, București.

12. Radu G., Chilom P. 1994; Legumicultură special Editura Cers, București.

13. Ruxandra Ciofu, Nistor Stan, Victor Popescu, Pelaghia Chilom, Silviu Apahidean, Arsenie Horgos, Viorel Berar, Fritz Laurer, Karl Fritz Laurer, Nicolae Atanasiu,2003,Tratat de legumicultura, Editura Ceres.

14. Sestraș R. 2004; Ameliorarea speciilor horticole, Ed. AcademicPres, Cluj-Napoca.

15. Sestraș, R., M. Jidav, 2002,Studiul unor linii de tomate create la SCPP Cluj-Napoca. I. Elementele de productivitate, Agricultura, 1-2 (43-44)/2002, 36-39.

16. Stan N. 1993; Tehnologia cultivării legumelor voi. I, Universitatea Agronomică, Iași.

17. Stan,N. 1999; Legumicultura, Editura „Ion Ionescu de la Brad”,Iași.

18. Stanciu, Gh. 2006; Horticultura României, Editura Cetatea de Scaun, Târgoviște.

19. Stavițchi P și colab. 1994; Aprecierea valorii agroproductive a unui sortiment de soiuri și hibrizi de tomate în solarii, Lucrări științifice voi. 37, Univ. Agronomică, Iași.

20. Takahashi, K.. 1984; Injury by continuous cropping in vegetables: various problems in the cultivation using graftedplants. Yasaishikenjo Kenkyu Shiryo.

21. Tița, I. și colab. 2002; Cultura plantelor horticole – manual, Editura Gimnasium.

22. Tomescu, Ana și Al. Alexandri, 2005. Tehnologia combaterii care produc ofiliri vasculare la speciile de legume Solanacee și Cucurbitacee prin metoda altoirii. Proiect AGRAL, 3396/2003.

23. Yuksel, T., și Eftal, D., 2010. Vegetable Production in Turkey II. Management of Production. Meeting of EU BALKAN VEGETABLES project-Maritsa VCRI, Plovdiv, 5-6 July.

RESURSE ON-LINE

http://www.horticultorul.ro/legume/fertilizarea-tomatelor-in-solarii-si-sere/ accesat la data de 15.06.2018

http://gazetadeagricultura.info/ accesat la data de 12.03.201

http://ro.wikipedia.org/ accesat la data de 12.03.2018

http://www.agropataki.ro/ accesat la data de 20.03.2018.

http:///C:/Users/admin/Desktop/articole%20de%20tradus%20noi/Biology_of_Solanum_lycoperscicum_Tomato.pdf accesat la data de 21.03.2018

http://store.tomatofest.com/Black_Zebra_Tomato_Seeds_p/tf-0066.htm accesat la data de 14.02.2018

http://store.tomatofest.com/Chocolate_Stripes_Tomato_Seeds_p/tf0115a.htmhttps://www.google.ro/search?q=tomato&sa=X&rlz=1C1GCEA accesat la data de 14.02.2018

http://www.moef.gov.in/divisions/csurv/geac/Biology_of_Solanum_lycoperscicum_Tomato.pdf accesat la data de 22.02.2018.

https://www.rhs.org.uk/Search?query=Lycopersicon%20esculentum accesat la data la 13.04.2018.

https://www.google.ro/search?q=3.Stadiul+de+fructificare+tomate&rlz accesat la data la 22.03.2018.

RESURSE ON-LINE IMAGINI

https://www.google.ro/search?q=lycopersicon+cheesmanii+tomato&rlz=1C1GCEA_enRO769RO769&source=lnms&tbm=isch&sa=X&ved=0ahUKEwjxttL1ubfaAhWKLsAKHd1JDtUQ_AUICigB&biw=1366&bih=662#imgrc=s1bkiBPNt43ynM: accesat la data de 13.04.2018

https://www.google.ro/search?q=Lycopersicon+hirsutum&rlz=1C1GCEA_enRO769RO769&source=lnms&tbm=isch&sa=X&ved=0ahUKEwjHlOG5v7faAhXoDMAKHcPRDH0Q_AUICigB&biw=1366&bih=662#imgrc=RUvxyNJr8quVQM: accesat la data de 22.03.2018

https://www.google.ro/search?q=Lycopersicon+hirsutum&rlz=1C1GCEA_enRO769RO769&source=lnms&tbm=isch&sa=X&ved=0ahUKEwjHlOG5v7faAhXoDMAKHcPRDH0Q_AUICigB&biw=1366&bih=662#imgdii=tWokZoN3GusJkM:&imgrc=m8iwJrfTi-MW3M: accesat la data de 22.03.2018

https://www.google.ro/search?q=lycopersicon+peruvianum&rlz=1C1GCEA_enRO769RO769&source=lnms&tbm=isch&sa=X&ved=0ahUKEwjBr7b7wrfaAhWBN8AKHV8OAL8Q_AUICigB&biw=1366&bih=662#imgrc=Efz97XQsz4BWvM accesat la data de 10.04.2018

https://en.wikipedia.org/wiki/Lycopersicon#/media/File:Solanum_carolinense_1391374.jpg accesat la data de 10.04.2018

https://www.google.ro/search?q=Lycopersicon+pennellii&rlz=1C1GCEA_enRO769RO769&source=lnms&tbm=isch&sa=X&ved=0ahUKEwiY3KHHzLfaAhUC2aQKHU1kCAoQ_AUICigB&biw=1366&bih=662#imgrc=m8iwJrfTi-MW3M: accesat la data de 13.06.2018

https://www.google.ro/search?q=3.Stadiul+de+fructificare+tomate&rlz=1C1GCEA_enRO769RO769&source=lnms&tbm=isch&sa=X&ved=0ahUKEwjw8YOCp7zaAhXMAewKHVhTAEEQ_AUICigB&biw=1366&bih=662#imgrc=nmPwrlydOlsJCM: accesat la data de 13.06.2018

https://www.google.ro/search?q=ROSIE+PRUNISOARE&rlz=1C1GCEA_enRO769RO769&tbm=isch&source=iu&ictx=1&fir=HJsSiW5kRqon3M%253A%252CFzaMKDGcAA2rjM%252C_&usg=__u8JrnXzVS_zBE6nySbRF7QjNctY%3D&sa=X&ved=0ahUKEwjiivfscraAhVG2ywKHY0JCroQ9QEIUzAI#imgrc=wU5uzbWKkaSKrM: accesat la data de 13.06.2018.