SPECIALIZAREA BIOTEHNOLOGII MEDICAL VETERINARE [618282]

UNIVERSITATEA DE ȘTIINȚE AGRONOMICE ȘI MEDICINĂ VETERINARĂ
BUCUREȘTI
FACULTATEA DE BIOTEHNOLOGII
SPECIALIZAREA BIOTEHNOLOGII MEDICAL VETERINARE

LUCRARE DE DIPLOMĂ

CARACTERIZAREA MOLECULARĂ A
UNOR SPECII DE FUSARIUM IZOLATE DE
LA GRÂU, ÎN CONDIȚII DE DE POZITARE

Coordonator științific ,
Șef lucrări Dr. Cătălina VOAIDES
Îndrumător științific,
Asist. Dr. Boiu Sicuia Oana Student: [anonimizat] 2018

2

3
REZUMATUL LUCRĂRII
Grâul este printre cele mai vechi și cele mai raspândite culturi de cereal din lume.
Perioada în care oamenii au influențat cultivarea grâului este, totuși, redusă în comparațive cu
existența umană pe pamant.Este acceptată perioada cuprinsă intre 10.000 -8.000 de ani în
urmă, ca fiind perioada începerii cultivării grâului ca o cultură alimentară ( Wrigley, C. W.
2009) .
Pe plan mondial grâul ocupă cea mai mare suprafață cultivată, 222 milioane de
hectare, cu o producție de 730 milioane de tone (Razi, 2016). De aceea s -au căutat soluții
tehnologice, genetice care să sprijine obținerea de produc ții mai mari, mai sănătoase,
rezistente și adaptabile condițiilor climatice diferite. Pentru a se putea creea aceste soiuri
trebuie cunoscute bolile păgubitoare.
Prin intensitatea pagubelor economice și răspândirii, Fusarium care face parte din
diviziunea Ascomycota a ciupercilor, este considerat unul dintre cei mai importanți agenți
patogeni din so l, care provoacă putrezirea rădacinilor în rând ul culturilo r de grâu și porumb
(Parikh, & Adesemoye 2018).Detectarea fuzariilor este importantă pentru că acestea sunt
responsabile de provocarea micotoxinelor, acestea în urma ingerării pot provoca
micotoxic oze.
Scopul acestei lucrări, este detectarea prezenței Fusariozei și a micotoxinelor…??
Lucrarea de diplom ă intitulată “Caracterizarea moleculară a unor specii de fusarium
izolate de la grâu, în condiții de depozitare ” este structurată pe două părți și cuprinde patru
capitole.
Prima parte, este formată din două capitole.În primul capitol sunt sintetizate date
principale din literatura de specialitate cu pri vire la originea grâului, structura genomului său,
structură anatomică și compoziția chimică a b oabelor de grâu.În capitolul doi sunt prezentate
bolile prouse de ciuperci, accentul fiind pus pe fuzarioza spicelor de grâu produsă de specii
din genul Fusarium spp. .Sunt menționate micotoxinele produse de speciile din genul
Fusarium .
Partea a doua, es te formată din capitolele 3, 4, 5 ce cuprind cercetările experimental.
Metodele sunt redate sistematic, împreună cu cercetările și rezultatele prezenței fusariilor și

4
micotoxinelor în probele de grâu analizat.La rezultate s -a ajus prin aplicarea tehnicii de
izolare a ADN -ului și metoda de cromatografie în strat subțire (TLC).
Obiectivul lucrării de diplomă a fost izolarea și purificarea culturilor de Fusarium
pentru a se realiza determinarea fusarilor toxi cogeni prin metoda de cromatografie în strat
subțire (TLC) și pentru izolarea de ADN fungic prin tehnica PCR.Experimentele au fost
realizate în cadrul Facultății de Biotehnologii a USAMV -București.

5
CUPRINS

REZUMATUL LUCRĂRII ………………………….. ………………………….. ………………………….. ….. 3
INTRODUCERE ………………………….. ………………………….. ………………………….. …………………. 7
CAPITOLUL I GRÂUL ………………………….. ………………………….. ………………………….. …….. 8
1.1. Scurt istoric ………………………….. ………………………….. ………………………….. ……………………. 8
1.2. Genomul grâului ………………………….. ………………………….. ………………………….. ……………… 8
1.2.1. Distribuția genelor în grâu ………………………….. ………………………….. ……………………… 9
1.3. Structura anatomică și compoziția chimică a boabelor de grâu ………………………….. ………. 9
CAPITOLUL II BOLILE GRÂULUI PRODUSE DE CIUPERCI ………………………….. .. 10
2.1. Boli produse de ciuperci ………………………….. ………………………….. ………………………….. …. 10
2.1.1 Fuzarioza spicelor de grâu ………………………….. ………………………….. …………………….. 10
2.2. Agenții patogeni ai fusariozei grâului ………………………….. ………………………….. …………… 11
2.2.1. FUSARIUM GRAMINEARUM ………………………….. ………………………….. …………… 12
2.2.2. FUSARIUM CULMORUM ………………………….. ………………………….. …………………. 13
2.2.3. FUSAR IUM POAE ………………………….. ………………………….. ………………………….. … 15
2.3. Micotoxinele produse de specile din genul Fusarium ………………………….. …………………. 16
CAP ITOLUL III MATERIALE ȘI METODE ………………………….. ………………………….. .. 17
3.1. Materialul biologic utilizat ………………………….. ………………………….. ………………………….. 17
3.2. Medii de cultură utilizate ………………………….. ………………………….. ………………………….. .. 17
3.3. Metode de izolare a fungilor din genul Fusarium ………………………….. ……………………….. 20
3.5. Metoda de cromatografie în strat subtire pentru determinarea fusariilor toxicogeni ……. 21

6
3.6. Metoda de izolare a ADN -ului fungic ………………………….. ………………………….. …………… 22
CAPITOLUL IV REZULTATE ȘI DISCUȚII ………………………….. ………………………….. … 24
4.1. Selectarea contaminațiilor ………………………….. ………………………….. ………………………….. . 24
4.2. Caracterizarea macroscopică ………………………….. …………….. Error! Bookmark not defined.
4.3. Determinarea contaminanțiilor cromatogeni ………………………….. ………………………….. ….. 29
4.5 Rezultatele tehnicii PCR ………………………….. …………………… Error! Bookmark not defined.
CONCLUZII ………………………….. ………………………….. ………………………….. ……………………… 30
Lista de referințe ………………………….. ………………………….. ………………………….. ……………….. 31

7
INTRODUCERE
Fuzarioza spicelor de grâu este cea mai importantă boală a grâului ( Triticum
aestivum ), găsindu -se în multe regiuni ale lumii.
În urma studiilor cei mai răspândiți agenți patogeni s -a demonstrat a fi Fusarium
graminearum și Fusarium culmorum. Importanța speciilor de Fusarium nu este legată numai
de bolile produse plantelor infectate ci și de micotoxine le sintetizate și acu mularea acestora în
materialul vegetal infectat. Micotoxinele tricotecene sunt compuși metabolici produși de
speciile de Fusarium. Cele mai semnificative tricotecene sunt: toxina T -2, toxina HT -2,
deoxinivalenol (DON) , în principal sin tetizate de Fusarium graminearum și Fusarium
culmorum (Grosu & Cornea, 2014).

8
CAPITOLUL I
GRÂUL
1.1. Scurt istoric
Grâu, termen generic care desemnează mai multe cereal, spontane sau cultivate, ce
aparțin genului Triticum , clasa Monocotyled onopsida, ordinal Graminalis, familia Graminae .
După porumb grâul reprezintă a doua cultură mondială ca mărime, iar împreună cu derivatii
săi face parte din alimentația curentă în Europa O ccidentală și Orientil Mijlociu (Dumbravă,
2004) .
Grâul a fost cu ltivat pentru prima oară acum aproximativ 10.00 0 de ani în perioada
revoluției neolitice, perioadă ce a cunoscut trecerea de la vânătoare și adunare de alimente în
agricultura stabilă. Cele mai vechi specii cultivate au fost Einkon, specie diploidă (genomu l
AA) și Emmer, specie tetraploidă (genomul AABB) derivată din hibridizarea spontană a
speciei Einkon cu o specie de iarbă sălbatică. Ambele specii se consideră că au originea în
partea de sud -est a Turciei.
Spre deosebire de speciile Einkon și Emmer, g râul de pâine a existat numai în
cultivare , avand în vedere că a aparut acum aproximativ 9.000 de ani prin hibridizarea speciei
Emmer cu „iarba caprei”( Triticum tauschii/ Aegilops tauschii ). Prin urmare grâul de paine
(Triticum aestivum ) este o specie tetr aploidă (Shewry, P. R. 2017).
1.2. Genomul grâului
Apariția genomului a fost realizată prin hibridarea spontană dintre o specie ce
aparține de Aegilops spp. cu genom BB și specia diploidă Triticum urartu cu genomul AA ce
a dus la formarea grâului te traploid (AABB), iar hibridarea cu Aegilops tauschii , a treia
specie ce avea genomul DD, a condus la formarea grâului hexaploid (AABBDD) (Coța
L.,2011). Fiecare dintre aceste genomuri este aproape de două ori mai mare decât genomul
uman și constă în aproxi mativ 5.500 de milioane de litere. Grâul este un poliploid cu 3
genomi, fiecare dintre ei fiind repetat în proporție de 80%, ceea ce face cercetările de
genomică dificile ( http://www.wheatgenome.info/ ).

9
1.2.1. Distribuția genelor în grâu
Până în prezent au fost identificate 48 de regiuni bogate în gene („Gene -Rich –
Regions” -GRRs), localizate în numar diferit pe brațele cromozomilor: 21 pe brațele scurte, 27
pe brațele lungi; 18 din tre acestea sunt considerate majore conținând 60% din genele grâului,
dar acopera numai 11% din genom. Sunt și regiuni sărace în gene („Gene -Poor -Regions” –
GPRs), ce conțin intr-un număr mai mare de retrotranspozomi comp arativ cu numărul de
pseudogene (Gupta P.K., 2008) .
1.3. Stru ctura anatomică și compoziția chimică a boabelor de grâu
Structura anatomică este prezentată in Fig.1.1

Fig.1.1. Secțiune prin cariopsa de grâu1
În proporție de : 62-75% din masa proaspătă a bobului de grâu se găsesc glucidele,
formate din amidon (9 0%), dextrine și alte glucide mai simple; 10-16% reprezintă procentul
pentru proteine, concentrații mari gasindu -se în părțile periferice ale bobului; 1,8-2,6%
reprezintă lipidele (acizi grași nesaturați: acidul linoleic, acidul oleic; acizi grași s aturați :
acidul palmitic); 2,0-3,5% reprezintă procentul de celuloză, aceasta fiind prezentă în cantități
mai mari în învelișurile bobului și cu o pondere de 1,5 -2,3% sărurile minerale aflate spre
părțile periferice ale bobului (Roman, 2011) .

1 https://ro.pinterest.com/pin/71072500345525150/

10
CAPITOLUL II
BOLILE GRÂULUI PRODUSE DE CIUPERCI
2.1. Boli produse de ciuperci
Majoritatea bolilor întâlnite la grâu sunt produse de ciuperci, un num ăr mare fiiind
facultative paraz ite. Bolile produse de fungi prezintă un pericol permanent întrucâ au o rată de
multiplicare crescută, se adaptează repede la condițiile de mediu, pot fi dăunătoar e și pentru
soiurile rezistente , grație apariției continue de noi rase fiziolog ice virulente. În urma infectării
pe plantă apar pete, leziuni , arsuri, putrezirea unor organe prin prod ucerea făinării, ruginii.
(Ceapoiu, Grâul, 1984 )
Printre cele mai problematice boli produse de ciuperci se numără: făinarea, fuzarioza
spicelor de grâu, fuzarioza rădăcinilor, mucegaiul de zăpadă, rugina galb enă, brună și rugina
neagră, mălura comună, mălura pitică, arsura spcelore grâu, înnegrirea baze i tulpinii și
radacinii de grâu (Ceapoiu, Grâul, 1984) .
2.1.1 Fuzarioza spicelor de grâu
Fuzarioza denumită și arsura, înroși rea sau albirea spicelor de grâu este o boală
micotică ce se întâlnește în to ate zonele de cultură de pe glob, fiind asociată cu mai multe
specii de Fusarium spp. anume: Fusarium graminearum, Fusarium culmorum, Fusarium
poae, Fusarium avenaceum. Aceste ciuperci sunt capabile să producă un numar mare de
micotoxine ce reprezintă un re al pericol atât pentru om cât și pentru animale, în urma
ingerării acestor compuși fungali (Osborne, 2007) .
Simptome
Boala se poate stabili în toate fazele de vegetație, dar simptomele sunt diferite în
funcție de stadiul de dezvoltare al plantei. Dacă boala apare imediat după germinare, tânăra
plantă se îngălbenește, se spiralează și piere înainte de răsărire, așa încât, încă din timpul
toamnei apar goluri în culturile de grâu. În faza de înfrățire la rădacini și la baza tulpinii
plantei se observă o brunificare. Spicele infectate cresc greu și rămân mai mici in comparație
cu cele neinfectate, devin moi, își pierd clorofila, treptat se albesc și se usucă
(http://www.sc rigroup.com/afaceri/agricultura/Bolile -graului61416.php ).

11
Faza cea mai periculoasă o reprezintă perioada de după înflorire, când în urma
infestării au loc șistăvirea boabelor, p e rahis apar sporodochii de culoare roz -portocaliu,
aproximativ 10 -20cm di n tulpina din imediata apropiere a spicului capătă culoarea violacee,
iar interiorul său este plin cu hife miceliene (Ceapoiu , 1984) .
Agentul patogen se poate transmite prin semințele infectate, dacă înainte de semănat
nu sunt selectate și tratate cores punzător. O altă problemă este reprezentată de depășirea
procentul de umiditate (peste 90%), atunci infecțiile sunt mai puternice, iar spicele pot fi
cuprinse în întregime de boală. Intensitatea atacului este condiționată și de reacția acidă a
solului ce f avorizează dezvoltarea fusariilor. Rol important au și condițiile climatice și
rezistența soiurilor (Viorel F., 2011).
Boala are ca rezultat pierderi economice semnificative, inclusiv reducerea
randamentului și calități boabelor și pierderile indirecte dat orate contaminării prin micotoxine
care duc la respingerea sau declasarea cerealelor la marketing (Osborne, 2007).
2.2. Agenții patogeni ai fusariozei grâului
 Fusarium graminearum
 Fusarium culmorum
 Fusarium poae

12
2.2.1. FUSARIUM GRAMINEARUM

Fig.2. 2.1.1 Conidii de Fusarium graminearum : A-D Ma crocondi
(John F. Leslie & Brett A. Summerel , 2006 )

Caracteristici: Sporodochiile sunt mai rar întâlnite , ele putând fi ascunse sub
miceliu , dar când sunt prezente au culoare pal portocali e. Macrocondiile sunt relativ s ubțiri,
ușor curbate sau aproape drepte, cu pereți groși, cu 5-6 septe . Celula apicală este conică, iar
celula bazală este distinctă , bine dezvoltată. Clamidosporii se formează în macrocondii sau în
mice liu, iar forma lor variază . În ceea ce privește aspec tul, clamidosporii, se găsesc în lanțuri
sau ciorchine.
Prin cultivare pe mediu PDA , coloniile cresc rapid , abundent , sunt de culoar i
diferite: de la alb la portocaliu pal pâna la galben. Sporodochiile sunt produse după mai mult
de 30 de zile de incubar e, sunt colorate variat, de la portocaliu la roșu -maro, pigmentul fiind
sensibil la pH. (John F. Leslie, 2006 ).
Fusarium graminearum este principalul agent de cauzalitate al producerii fuzariozei
spicelo r de grâu. Contaminarea poate fi prezentă încă de la început în cariopsă, sau se poate
face indirect prin transportarea sporilor de către vânt sau ploaie la baza spicului de grâu. În
prezența umidității și a temperaturilor relativ ridicate sporii germinează în aproximativ 12 ore
după inoculare, dând nașt ere hifelor neramificate ce se vor dezvolta treptat.

13
Fusarium graminearum produce enzime de degradare a peretelui celular, dar și
micotoxine ca: deoxinivalenol (DON) și (zearalenol (ZEA) (Wcisło & Dzwinel , 2016) .

Fig.2.2.1.2 Fusarium graminear um pe mediul PDA și macrocondii2

2.2.2. FUSARIUM CULMORUM

Fig.2.2. 2.1 Conidii de Fusarium Culmorum :A-D Macrocondii
(John F. Leslie & Brett A. Summerel, 2006 )

2 https://www.researchgate.net/figure/Fusarium -graminearum -on-potato -dextrose -agar -PDA -and-
macroconidia_fig2_235909623?_sg=OH -J5pi6fw4o8Q –
2kMHYVjq4HoXRxJzg5XnMHJbKU1GPwArLkk33i8sU4JPmA4fpg3lpyLEMrK7d4a8LaskXBA

14
Caracteristici: Macrocondi ile se formează din abundență în sporodochii de culoare
portocalie. Macrocondiile sunt scurte, groase, cu pereți groși. Celulele bazale sunt slab
dezvoltate, ușor curbate, cu partea centrală aproape dreaptă. Celula apicală este rotunjită și
tocită, iar celula bazală este crestată și fără o formă distinctă. Prezintă 3 sau 4 septe. Fusarium
culmorum nu formează microconidii , iar c lamidosporii acestuia se formeaza relativ rapid,
după 3-5 săptămâni de încubare .
Caracteristici pe mediu PDA: Fusarium culmorum crește rapid producând multe
sporodochii inițial portocali i, apoi maro închis. Cele mai multe tulpini formează pigmenți
roșii în agar, unele pot avea miceliul maron iu și pigmentul maroniu in agar (John F. Leslie,
2006 ).

Fig.2.2.2.2 Fusarium culmorum pe mediul PDA și macrocondii 3

3 https://www.researchgate.net/figure/Fusarium -culmorum -on-potato -dextrose -agar -PDA -and-
macroconidia_fig3_235909623?_sg=o1fq9I5wpxWDQEBdxp_j32DjI0mpdE7eOUR0oBwj -au1-
q4C7PctrQtN8i0L_OT_kxmCBxfPk3qvsOsWZX -x7g

15
2.2.3. FUSARIUM POAE

Fig.2. 2.3.1 Conidii de Fusarium Culmorum:A -B Marocondi,C -D Microcondi ,E-F
Microcondi în situs (John F. Leslie & Brett A. Summerel, 2006 )

Caracteristici: Macroconidiile sunt rare, cu excepția cazului în care cultura este
expusă la lumină apropiată celei UV. Macroconidiile sunt relativ scurte, falcate , cu 3 septe , cu
celula apicală curbată și conică. Microcondiile sunt produse abundent pe monofialide în formă
de urnă. Conidiofor ii sunt scurți și ramifica ți, iar clamidiospor ii se formează rar.
Caracter istici pe mediu PDA: Miceliul aerian apare abundent , pâslos și devine
pulverulent la momentul formării microconidiilor. Miceliul are inițial o culoare palidă și mai
apoi maro roșcat. În mediu sunt eliberați pigmenți de culoare galbenă (John F. Leslie, 2006 ).

Fig.2.2.3.2 Fusarium Poae pe mediul PDA și micro/macrocondii4

4 https://www.researchgate.net/figure/Fusarium -poae -on-potato -dextrose -agar -PDA -and-micro –
macroconidia_fig4_235909623

16
2.3. Micotoxinele produse de specile din genul Fusarium
Speciile din genul Fusarium sunt capabile să producă în grâu trei dintre cele mai
importante clase de micotoxine: fumonisina (FB1,FB2,FB3 ); zearalenona (ZAD);
trichotecene (toxina HT -2 (HT -2) și toxina T -2 (T -2), diactoxiscripenol (DAS),
monoacetoxiscripeno1 (M AS). De asemenea, pot produce micotoxine emergente cum ar fi:
fusoproliferina (FUS), beauvericina (BEA), eniatine, moni liformina (MON) sau alte
micotoxine ca acid fusaric, fusarina AD, gliotoxina, butenolit sunt recent descoperite și mai
puțin studiate (Stanciu, 2017 ).
Micotoxine de fusarium dacă sunt ingerate au efecte toxice acute și efecte cronice,
s-a dovedit că pr ovocă o mare varietate de efecte toxice la animale în urma consumului.
Consecințele ingerării acestor compuși fungali variază de la boli acute, cu morbiditate ridicată
până la boli cronice în urma careia rezultă decesul. C u toate acestea, problema majoră în urma
consumului de produs contaminat nu sunt episoadele de boală acută , ci mai degrabă ingerarea
unor nivele scăzute de toxine care pot provoca o serie de tulburări metabolice, fiziologice și
imunologice. Simptomele legate de micotoxicoză pot apărea la concentrații foarte mici , chiar
sub limitele de detecție (Escriva & Manyes, 2015).

17
CAPITOLUL III
MATERIALE ȘI METODE
3.1. Materialul biologic utilizat
Materialul biologic analizat a constat în 9 probe de grâu integral neprelucrat , colectat
în timpul campaniei de recoltare 2017 și furnizat de Moara de grâu Oltina din Urlați. Grâul a
fost cultivat pe teritoriul județului Ialomița (terenurile din Fierbinți și cele din apropierea
comunei Bucu). Primele 6 probe sunt de grâu NON -GMO (Nemodificate ge netic), soiuri
cultivate în România. Probele 7, 8, 9 sunt de asemenea NON -GMO însă neomologate și în
UE.
3.2. Medii de cultură utilizate
Mediul MGA (Malachite Green Agar) , mediu de cultură semi -selectiv preparat
conform reț etei lui (Leslie & Summere ll, 2006) . Ingrediente le folosite pentru prepararea
mediuui MGA (Malachite Green Agar) sunt trecute în tab .3.2-1.

Tab.3.2 -1 Ingrediente folosite pentru prepararea mediuui MGA
INGREDIENTE 1L
Peptonă 15g
KH 2PO 4 1g
MgSO 4 x 7H 2O 0,5g
Verde Malachit (2,5pp m) 2,5g
Agar 20g
Streptomicină (50 ppm) 50mg
Cloranfenicol (100 ppm) 100mg

18
După sterilizare prin autoclavare (la 121 C, 15 -20 de minute) mediul a fost răcit la
50-55C și s -a adăugat antibioticele (streptomicină și chloranfenicol), urmând ca mediul s ă fie
distribuit în plăci Petri.
Mediul PDA (Potato Dextrose Agar) a fost preparat conform instrucțiunilor
fabricantulu i, iar pH -ului de 5,4 . Compoziția pudrei de PDA este trecută în tab.3.2 -2.

Tab.3.2 -2 Ingrediente folosite pentru prepararea mediului PDA

Pentru prepararea mediului s -a adăugat 39g de pulbere comercială de PDA la 1L de
apă distilată. Amestecul a fost fiert până la dizolvarea pudrei și s -a sterilizat prin autoclavat
(15 minute la 121 C), după a fost distribuit în plăci Petri.
Mediul lichid PEGB (Potato extract -glucose broth ) , a fost preparat potrivit
instrucțiunilor de pe ambalaj. Cantitatea necesara a fost de 20 ml pentru fiecare probă , 120 de
mililitri cantitat ea totală . Pentru cele 6 probe analizate s-au folosit 3,18g de pulbere .
Ingredientel e raportate la 1L de mediu sunt trecute în tab.3.2 -3.

Tab.3.2 -3 Ingredientele folosite pentru prepararea mediului PEGB

Ingrediente 1L
Extract de cartof 20g
Dextroză 15g
Agar 15g
Ingrediente 1L
Infuzie de cartof 6,5g
Glucoză 20g
pH 5,6±0,2

19
Mediul PSA (Potato -Sucrose -Agar), a fost folosit pentru stimularea producerii de
micotoxine . De asemenea, în raportul lui Vujanovic și Monsour (2011) specia de Fusarium
graminearum a produs micotoxina DON și ZEA numai în prezența co ncentrațiilor mari de
zaharoză (20% și peste), (Grosu & Cornea, 2014).
Mediul s -a preparat conform instrucțiunilor de pe ambalaj folosind pulbere
comercială. Îngredientele folosite raportate la un litru de mediu sunt trecute în tab.3.2 -4.

Tab.3.3 -4 Ingre diente folosite pentru prepararea mediului PSA

Ingrediente 1L
Infuzie de cartof
(infuzie din 200g de
cartof)
4g
Sucroză 20g
Agar 20g

20
3.3. Metode de izolare a fungilor din genul Fusarium
Pentru însămânțarea probelor s -a folosi t mediul MGA (Malachit Green Agar). După
ce a fost preparat conform (Leslie & Summerell, 2006) a fost sterilizat (la 121 C, 15 minute)
și ulterior suplimentat cu antibioticele streptomicină și chloranfenicol în proporția
corespunzătoare.
Pe substratul nutritiv (MGA cu antibiotice) au fost plasate câte 10 cariopse de grâu
selectate pe baza simptomatologică. Astfel, din fiecare probă au fost selectate boabe șistave,
mate cu simptome similare infecției cu fungi. Boabele au fost puse cu ajutorul unei pense
sterile pe mediul de cultură semi -selectiv pentru Fusarium spp. Acest substrat este inhibitor
pentru contaminanții din genul Aspergillus și Penicillium spp. Însămânțările au fost realizate
la hota cu flux laminar. Probele au fost incubate timp de o săptăm ână la temperatura de 28 C.

Fig.3.3.1 Însămânțarea probelor pe mediu MGA

3.4. Metoda de purificare a culturilor de Fusarium
Pentru purificarea izolatelor de interes, s -a realizat o repicare pe mediul PDA
(Potato Dextrose Agar ). În condiții ase ptice și în prezența becului de gaz cu ajutorul unei anse
metalice sterile, au fost prelevate bucăți de mediu pe care s -au dezvoltat fungi filamentoși din
familia Fusarium. Probele ce conțin fungii filamentoși au fost cultivate pe mediul PDA.

21
Plăcile Petri ce conțin probele au fost ținute timp de o săptămână la temperatura de
28C.
3.5. Metoda de cromatografie în strat subtir e pentru determinarea fusariilor
toxicogeni
Pentru a determina prezența micotoxinelor în probele de analiză, s -au însămânțat
fungii filamentoși crescuți pe mediul PDA pe mediul PSA (Potato -Sucrose -Agar). Mediul
PSA prin componența sa, stimulează producerea de micotoxine.
Pentru aplicarea metodei de cro matografie în strat subțire au fost necesare realizarea
următoarelor etap e: folosirea culturile de 12 zile de pe mediul PSA de unde au fost prelevate
4 rondele miceliene de 6 mm în diametru. Cu ajutorul unui ac steril rondelele au fost introduse
în tuburi și mojarate energic. Amestecul mojarat s -a omogenizat intr -un 1 ml soluț ie de
extracție 2:1 (v/v) de cloroform:metanol, toate probele au fost vortexate și incubate peste
noapte la temperatura de 4 C.

Fig.3.5.1 Cele 6 tubu ri ce conțin micelii și părți din mediu mojarat

22
A doua zi probele au fost scoase de la frigider, ce ntrifugate, iar faza lichidă reluată în
tuburi de 1,5 ml pentru a se realiza concentrarea prin evaporarea totală a solvenților de
extracție. În acest timp a fost pregătită și placa de TLC cu silicagel, prin măsurarea distanțelor
dintre cele 6 probe, urmând ca din fiecare probă să se ia 5 µl si să se distribuie în spoturi pe
plăci.
Separarea cromatografică a fost realizată în amestec 5:4:1 (v/v/v) de toluen:acetat de
etil:acid formic . După aproximativ 30 de minute, perioadă în care a avut loc migrarea,
cromatograma a fost uscată și vizualizată în UV la 365nm.
3.6. Metoda de izolare a ADN -ului fungic
Cu scopul de a pregatii materialul genetic folosit în izolarea ADN -ului fungic, din
probele obținute pe mediul PDA se pornește o cultură lichidă de fungi în bulion cu extract de
cartof si glucoză. S-au prelevat 4 fâșii de mediu, din fiecare probă, fâșii pe suprafața cărora
s-au dezvoltat fungii de Fusarium. Probele extrase au fost introduse în mediul lichid din
paharele Erlenmeyer. Recoltarea fungiilor d e pe mediul PDA s -a realizat în interiorul hotei cu
flux laminar, langă becul de gaz, cu ajutorul unei anse sterile.

Fig.3.6.1 Cele 6 probe de fungi în cultura lichidă

23
În următoarea zi s -a efectuat filtrarea celor 6 probe, solventul fiind îndepărtat, iar
biomasa curățată de pe hârtia de filtru, cu ajutorul unei spatule sterile. Biomasa a fost pusă în
tuburi și băgată la congelator până la efectuarea izolării și purificării ADN -ului.
Pentru izolarea și purificarea ADN -ului s -au urmărit etapele următo rului protocol
(Metoda CV.)
 Se folosesc probele congelate (cele 6 );
 Materialul genetic este pus în mojar și se mojarează cu nisip de cuarț;
 După mojarare este reluat cu 1ml tampon de solutie CV(?)și pus în
tuburi omogenizându -se ușor;
 Se incubează pe baie de apă 15 minute la 68 C;
 După finalizarea incubării pe baie de apă se centrifughează 10 minute la
10.000 rpm;
 Se reia tot supernatantul și se adaugă un volum egal
fenol:cloroform:izoamilic (25:24:1), se agită energic;
 Se centrifughează 10 minute la 10.00 0 rpm;
 Se reia supernatantul și se adaugă 2,5 volume alcool etilic, se
omogenizează ușor;
 Probele se lasă la congelat până a doua zi.

Pașii urmați a doua zi sunt următorii:
 Probele de la congelator se centrifughează 10 minute la 10.000 rpm și o
tempera tură de 4C;
 Se îndepărtează supernatantul, iar sedimentul de ADN se spală cu
etanol de 70%;
 Se centrifughează 10 minute la 10.000 rpm și o temperatură de 4 C;
 Sedimentul de ADN se usucă 10 minute la 37 C;
 Se reia în 100µl de TE .

24
CAPITOLUL IV
REZULTATE ȘI DISCUȚII
4.1. Selectarea contaminațiilor
În decurs de o săptămână toate cele 9 probe de grâu analizate au fost ținute în
incubator . Condițiile fiind prielnice, s -a realizat contaminarea cu fungi filamentoș în toate
plăcile. S-au dezvoltat fuz arii în toate probele, însă din cauza prezenței altor specii (din genul
Rhizopus și Aspergilllus) nu a fost posibilă izolarea decât din 6 probe, renunțându -se la
probele 1, 2 și 9.

Fig.4.2.1 Proba 1

Fig.4.2.2 Proba 2

25

Fig.4.2.3 Proba 3 Fig.4.2.4 Proba 4

Fig.4.2.5 Proba 5

Fig.4.2.6 Proba 6

26

Fig.4.2.7 Proba 7

Fig.4.2.8 Proba 8

27
4.2. Caracterizarea macroscopică
În urma purificării izolatelor de fungi filamentoși din fa milia Fusarium prin repicarea
pe mediul PDA, după o săptămână în care probele au fost ținute în incubator la temperatura de
28C, fungii de Fusarium s-au dezvoltat așa cum se vede in Fig.4.2.1, căpătând culori diferite:
IS3 roșu -brun cu o pată cenușie, IS4 galben -portocaliu, IS5 brun, IS6 galben -pal, IS7 roșu –
brun, IS8 galben -portocaliu.

Fig.4.2.1 Fungi de Fusarium pe mediu PDA

Rezultatul însămânțării pe mediul PSA (Potato -Sucrode -Agar), mediu folosit pentru
stimularea producerii de micotoxine este vi zibil i n Fig.4.2.2 și Fig.4.2.3 și poate fi interpretat
astfel:
 IS3-pigment galben -pal în mediu, miceliul aerian slab dezvoltat, având o
culoare pală;

28
 IS4-pigment portocaliu în mediu , cu coloni abundente și albe;
 IS5-pigment roșu -brun în mediu, cu miceliu slab colorat;
 IS6-pigment galben în mediu, cu miceli aerian abundent și alb;
 IS7-pigment brun în mediu, cu micelii maroni,
 IS8-pigment roșu-brun în mediu, cu colonii relativ abundente și slab colorate.

Fig.4.2.2 Fungi de Fusarium însămânțați pe mediul PS A (vedere -partea anterioară a placii)

Fig.4.2.3 Fungi de Fusarium pe mediul PSA (vedere -partea superioara a plăcii)

29
4.3. Determinarea contaminanțiilor cromatogeni
În urma efectuării metodei de cromatografie în strat subtire pentru determinarea
fusariilor toxicogeni din probele obținute pe mediul PSA, s-a produs migrarea așa cum se
observa in Fig.4.3.1.

Fig.4.3.1. Evidențierea prin TLC a izolatelor de Fusarium spp. producătoare de
micotoxine:
1 = IS3, 2 = IS4, 3 = IS5, 4 = IS6, 5 = IS7, 6 = IS8

Prezenta micotoxinelor este marcată cu sageata roșie = DON (deoxinivalenol),
micotoxină prezentă în probele IS 6 și IS 8; iar cu săgeată galbenă = ZEA (zearalenol ),
micotoxină prezentă in probele IS 1 și IS 6.

30
CONCLUZII
În urma rezultatelor obținu te, care au avut drept obiectiv izolarea și purificarea
culturilor de Fusarium pentru realizarea determinării fusariilor toxicogeni și izolarea de ADN
fungic prin tehnica PCR, concluziile sunt următoarele:

 În ceea ce privește evaluarea prezenței specilor de Fusarium în probele de grâu
analizat, s -a constatat că acestea au fost infestate cu fuzarii, dar și cu alte speciidin genul
Rhizopus și Aspergillus (probele 1, 2 și 9). Probele sigure infestate cu fuzarii au fost 3 -8.
 În urma însămânțării pe mediul PSA, mediu folosit pentru producerea de
micotoxine și aplicarea metodei de cromatografie în strat subțire, s -a constatat prezența
micotoxinelor. Micotoxina ZEA (zearalenol) în proba IS3; ZEA și DON ( deoxinivalenol )
în proba IS6; DON în proba IS8.

31
Lista de referințe

1. Bolile graului , http://www.scrigroup.com/afaceri/agricultura/Bolile -graului61416.php
(accesat pe 15.05.2018).
2. Ceapoiu, N. ( 1984) “Grâul” , Ed. Academ iei Republicii Socialiste Române,
București, pag.137 -150 .
3. Dumbravă, M. (2004), „Tehnologia culturii plantelor ”, Ed. Didactică și pedagogică,
București, pag. 21 -25 .
4. Escrivá, L., Font, G., & Manyes, L. (2015). In vivo toxicity studies of fusarium
mycotoxi ns in the last decade: a review. Food and Chemical Toxicology, 78, 185 -206.
5. Grosu, I., Israel -Roming, F., Sicuia, O. A., Constantinescu, F., Popa, G., & Cornea, C.
P. (2014). Effect of some bacterial antagonists on growth and mycotoxin production of
Fusari um graminearum and F. culmorum isolates. Scientific Bulletin. Series F.
Biotechnologies , 18, 26-31.
6. Gupta P.K., Mir R.R., Mohan A., Kumar J. (2008) Wheat Genomics: Present Status
and Future Prospects. (Review) International Journal of Plant Genomics pag.1-36.
7. John F. Leslie & Brett A. Summerel (2006), ). “ The Fusarium Laboratory Manual”,
Blackwell, USA, pag. 158, 176, 220.
8. Osborne, L. E., & Stein, J. M. (2007). Epidemiology of Fusarium head blight on
small -grain cereals. International journal of food micr obiology , 119(1-2), 103 -108
9. Parikh, L., Kodati, S., Eskelson, M. J., & Adesemoye, A. O. (2018). Identification and
pathogenicity of Fusarium spp. in row crops in Nebraska. Crop Protection , 108, 120 –
127.
10. Razi G. (2016), Top 20 cei mai mari producători de g râu
http://www.agrofinanciar.ro/Top -20-cei-mai-mari-producatori -de-grau-n343.html
(Accesat pe 10.06.2018)

32
11. Roman, G. V. (2011), „ Fitotehnie Vol.1 Cereale și legum e pentru boabe”, Ed.
Universală, București, pag. 70 -73.
12. Shewry, P. R. (2017). Do ancient types of wheat have health benefits compared with
modern bread wheat?. Journal of Cereal Science .
13. Stanciu, O., Juan, C., Miere, D., Loghin, F., & Mañes, J. (2017). Occu rrence and co –
occurrence of Fusarium mycotoxins in wheat grains and wheat flour from
Romania. Food Control , 73, 147 -155 .
14. Viorel F. (2011), Fitopatologie specială . Suport de curs, disponibil online pe
https://www.scribd.com/doc/79017175/AGRICULTURA -FITOPATOLOGIE –
SPECIALA -2012 (accesat pe 15.05.2918).
15. Wcisło, R., Miller, S. S., & Dzwinel, W. (2016). PAM: Particle automata model in
simulation of Fusarium graminearum p athogen expansion. Journal of theoretical
biology , 389, 110 -122.
16. Wheat Genome , http://www.wheatgenome.info/ (accesat pe 15.05.2018).
17. Wrigley, C. W. (2009). Wheat: a unique grain for the world. Wheat: chemist ry and
technology, (Ed. 4), 1 -17.