Sistemele de restricție -modificare bacteriene [616439]

Sistemele de restricție -modificare bacteriene

Nucleazele sau fosfodiesterazele sunt enzime care degradează moleculele acizilor
nucleici, modul lor de acțiune constând în hidroliza legăturii fosfodiester ice din structu ra
lanțurilor polinucleotidice.
Endonucleazele atacă moleculele în interiorul acestora, unele dintre ele acționând
nespecific (nu au nevoie de un situs de recunoaștere la nivelul căruia să -și desfășoare
activitatea enzimatică), în timp ce altele recunosc secvențe nucleotidice specifice p entru
a-și putea desfășura activitatea catalitică. Acestea din urmă se numesc endonucleaze de
restricție.
Inițial, enzimele de restricție au fost descoperite ca făcând parte din cadrul
sistemelor de restricție și modificare ( ex. metilare) din organismele p rocariote.
Datorită înaltei lor specificități de acțiune, enzimele de restricție au devenit unele
dintre cele mai importante instrumente în ingineria genetică. Acestea au capacitatea de
acționa asupra ADN dublucatenar prin recunoașterea unor secvențe pali ndromice cu
mărimi variabile, în prezent existând un număr foarte mare de enzime de restricție,
fiecare având propriul ei situs de recunoaștere.
În funcție de mărimea secvenței (de obicei palindromică), enzimele vor tăia
molecula de ADN mai frecvent sau m ai rar, iar în funcție de poziția situsului de clivare
acestea vor furniza fragmente cu capete drepte („ blunt ends ”) sau cu capete coezive
(„sticky ends ”).
Enzimele de restricție au nume provenite de la speciile bacteriene din care au fost
izolate. În prac tică se folosește un cod de trei litere, în format italic, prima literă
provenind de la genul, iar celelalte două de la specia bacteriană din care a fost izolată
enzima.

Exemplu: Sau – Staphyloccocus aureus
Mbo – Moraxella bovi
Taq – Thermus aquaticus

Există și cazuri în care apare și o a patra literă, în format normal, care indică tulpina
bacteriană de proveniență.

Exemplu: EcoR – Escherichia coli, tulpina RY13.

La toate acestea se mai adaugă și o cifră în f ormat roman, în funcție de câte
endonucleaze de restricție au fos t izolate din specia/ tulpina bacteriană respectivă.

Exemplu: EcoRV – Escherichia coli , tulpina RY13, a cincea enzimă de restricție
diferită izolată din această tulpină.

Enzimele de restric ție care recunosc aceeași secvență, dar sunt izolate din gazde
diferite se numesc izoschizomere .
O categorie aparte de enzime izoschizomere sunt acelea care se leagă la același situs
de recunoaștere, dar prezintă situsuri de clivare diferite. Aceste endon ucleaze se numesc
neoschizomere .
Enzimele de restricție care prezintă situsuri de recunoaștere și de restricție diferite
dar generează în urma acțiunii lor aceleași capete se numesc izocaudomere .

Sistemele de restri ție-modificare se împart în patru tipuri: I, II III și IV.

Sistemele de restricție -modificare de tip II: sunt cele mai des întâlnite și constau
în enzime care realizează funcțiile de restricție și de metilare separat, activitatea lor fiind
dependentă de prezența ionilor de magneziu. Enzi mele de restricție din acest sistem
prezintă secvențe de recunoaștere scurte, de 4 -6 nucleotide, în cele mai multe cazuri
palindromice și generează prin tăiere atât capete coezive, cât și capete drepte. Ele pot tăia
ADN fie la nivelul situsului de recunoaș tere, fie la o distanță variabilă de acesta.

S-a observat că toate endonucleazele de tip II prezintă un centru catalitic activ
similar. Î n acest centru catalitic activ se găsesc trei resturi de aminoacizi esențiali pentru
actul catalitic, două resturi acid e (acid glutamic și acid aspartic) și un rest de lizină cu
caracter bazic, mutațiile la nivelul acestora determinând absența activității enzimatice.
Prin studierea acestor enzime, s -a constatat că în urma acțiunii lor la nivelul ADN
rezultă capete libere 5 ’-fosfat, respectiv 3’ -hidroxil. Din acest motiv se consideră că
legăturile fosfodiesterice dintre nucleotide sunt clivate prin atacul nucleofilic al unei
molecule de apă activate asupra grupării fosfat.
Metilazele de tip II conduc la metilarea citozinelor și adeninelor de la nivelul
nucleotidelor, obținându -se 5-metil -citozină, 4 -metil -citozină sau 6 -metil -adenină.
Structural, aceste enzime prezintă două domenii separate de o fosă în care este legată
molecula de ADN. Pentru manifestarea actului catalitic, secvența țintă de ADN este
denaturată local, pe o anumită porțiune, nucleotidul care urmează a fi metilat este extras
de la nivelul dublului helix, este adăugată gruparea metil, iar apoi totul revine în poziția
inițială .

Sistemele de restricție -modificare de tip I: cuprind enzime care au atât activitate
de restricție, cât și de metilare, mecanismele de acțiune ale acestora fiind diferite de cele
ale sistemelor de tip II și III.
Enzimele de tip I, sunt codificate de grupuri de gene înrudite și sunt împărțite în trei
familii distincte. Ele sunt alcătuite dintr -o singură moleculă proteică care cuprinde trei
subunități cu funcții diferite.
Una dintre subunități are rolul de a recunoaște secvența țintă, o alta de a metila
aceas tă secvență, iar cea de -a treia taie ADN la o distanță oarecare de situsul de legare.
Secvențele de ADN sunt scindate în funcție de starea în care se găsește situsul de
recunoaștere:
i. dacă el este metilat, enzima se leagă la ADN, dar apoi este eliberată fără
manifestarea actului catalitic;
ii. dacă este semimetilat, enzima va metila și cealaltă catenă;

iii. dacă este nemetilat, legarea enzimei se va solda cu scindarea dublei catene.
În cazul enzimelor de tip I, clivarea nu apare la situsul de recunoașt ere, ci la o
anumită distanță de acesta. Scindarea are loc în două etape și este urmată de o acțiune
exonucleazică care se realizează cu consum de ATP. O caracteristică interesantă a
enzimelor de tip I este aceea că rămân legate la secvența ADN chiar dacă clivarea are loc
la distanță de situsul de recunoaștere.

Sistemele de restricție -modificare de tip III: cuprind enzime care au dublă
activitate (restricț ie și metilare).
În cazul acestora, enzima este formată din două tipuri de subunități, una responsabilă
de restricție, cealaltă responsabilă pentru recunoașterea situsului țintă și pentru metilare.
Activitățile enzimatice de restricție, respectiv metilare sunt realizate în același timp.
Metilarea se realizează pentru resturile de adenină din dub lul helix, exact la nivelul
situsului de recunoaștere, în timp ce restricția presupune două incizii succesive pentru
cele două catene și apare la distanță față de situsul de recunoaștere.

Sistemele de restricție -modificare de tip IV : cuprind enzime care r ecun osc
molecule de ADN modi ficate (metilate, deaminate etc ).

Recomandări uzuale privind folosirea endonucleazelor de restricție
Numărul și dimensiunile fragmentelor generate de o enzimă de restricție depind de
frecvența cu care apar situsurile de recunoaștere ale acesteia la nivelul ADN. Fragmente
mici de ADN sunt obținute prin digestie cu enzime care recunosc situsuri de 4 pb
(frecvente) . Pentru experimentele unde sunt necesare fragmente mari de ADN se folosesc
enzime ca re recunosc secvențe mai lu ngi de peste 8 pb (situsuri rare) .
Componentele unei reacții enzimatice de restricție sunt: endonucleaza de restricție,
tamponul reacției, ADN de interes și apă ultrapură. Opțional se poate adăuga și albumină
serică bovină, aceasta optimizând activitatea enzimatică.

De asemenea, pentru o bună desfășurare a experimentelor, este foarte importantă
cantitatea de enzimă introdusă în reacție, dar și intervalul de timp lăsat la dispoziția
acesteia pentru realizarea activității enzimatice. O unitate de activitate a unei enzime este
definită ca fiind cantitatea de enzimă necesară pentru digestia completă a 1μg de ADN, în
timp de o oră, la temperatura adecvată, într-un volum total de 50 μl.
Enzimele de restricție se stochează la temperaturi de -20°C și la utilizare se mențin
pe gheață. Alegerea enzimei se face în funcție de tipul de probă ADN și de scopul
aplicației.
Temperatura optimă de activitate pentru majoritatea enzimelor este de 37°C, dar
există și enzime termostabile care acționează optim la 65°C (ex. Taq I ).

Tehnica RFLP ( Restriction Fragment Lenght Polymorphism )
Secvențele ADN identice prezintă aceeași succesiune de nucleotide și deci, aceleași
hărți de restricție. Există însă situații în care la nivelul secvențelor apar mici diferențe
cauzate de mutații punctiforme, deleții sau inserții.
Fiecare endonuclează de restricție prezintă un situs unic de recunoaștere la nivelul
secvențelor de nucleotide și orice modificare a acestuia va avea ca efect stoparea
activității nucleazice la acest nivel. Deci, mutațiile pot modifica situsurile de recunoaștere
ale unor endonucleaze astfel încât acestea să nu își mai exercite activitatea enzimatică sau
pot genera noi situsuri de recunoaștere.
În aceste cazuri, hărțile de restricție se modifică în funcție de modificările de
secvență nucleotidică apărute și acest fenomen stă la baza principiului tehnicii RFLP.
Fragmentele obținute în urma reacției de restricție pot fi analizate ușor prin electrof oreză
în gel de agaroză. Fiecare secvență ADN va genera profile de restricție particulare care
diferă prin lungimea fragmentelor rezultate.
Tehnica are aplicații în identificarea și cartarea tulpinilor bacteriene sau în analiza
organismelor înrudite .

OBȚINEREA VECTORILOR RECOMBINA ȚI

Obținerea vectorilor constă în decuparea unei gene sau a unui fragment de interes
dintr -o anumită sursă biologică, inserarea ADN la nivelul unui vector de clonare, iar apoi
multiplicarea acestuia prin introducerea într -o ce lulă gazdă unde vectorul se poate
autoreplica. Fragmentul de ADN care urmează să fie clonat, introdus la nivelul
vectorului, se numește ADN exogen sau insert.
Pentru realizarea practică a clonării trebuie parcurși mai mulți pași. Mai întâi,
vectorul este d ecupat cu ajutorul unei endonucleaze de restricție, el suferind un proces de
linearizare. Vectorul linearizat va conține la fiecare extremitate o parte a secvenței de
ADN recunoscută de către enzima de restricție utilizată. Molecula de ADN exogen va fi
digerată cu aceeași enzimă de restricție ca și cea folosită pentru linearizarea vectorului
astfel încât diferitele fragmente obținute vor avea la capete aceeași secvență ADN, și
anume aceea recunoscută de enzima de restricție utilizată.
Atunci când vectorul linearizat și fragmentele ADN sunt puse împreună se vor
forma punți de hidrogen pe bază de complementaritate între extremitățile coezive ale
acestora.
Ulterior se adăugă ADN ligaza care catalizează formarea legăturilor fosfodiesterice
între capetele fragmentului de ADN exogen și capetele vectorului.
Ligaza necesită pentru exercitarea activității enzimatice două capete, 3’ -hidroxil,
respectiv 5’ -fosfat, ambele libere și dispuse adiacent.
În practică, există și posibilitatea folosirii unor enzime de restricție care să genereze
în urma clivării capete drepte. Ligarea acestor capete drepte dintre vector și insert se
poate realiza prin utilizarea unei ligaze particulare, izolată din bacteriofagul T4, care are
abilitatea de a reforma legăturile fosfodiesterice chiar și în lipsa legăturilor de hidrogen
care se formează în cazul capetelor coezive. Procesul de ligare se desfășo ară cu consum
de ATP .
Pentru elimina rea inconvenientelor create în practică de generarea capetelor drepte,
există mici molecule sintetice de ADN ( linkers sau adaptori) care conțin la nivelul

secvenței lor situsuri pentru enzime de restricție și care se leagă la capetele drepte ale
unei molec ule de ADN. Ulterior, prin legarea acestora, se creează noi situsuri de restricție
care conduc, prin clivarea lo r, la capete coezive .
Când ADN exogen și vectorul sunt digerați cu o singură enzimă de restricție,
insertul are posibilitatea de a se integra î n vector în ambele sensuri. În aceste cazuri
trebuie determinat sensul de inserare al fragmentului prin secvențializarea vectorului
recombinant. Orientarea clară a integrării poate fi evitată prin clivarea vectorului și
insertului cu două enzime de restric ție diferite. În acest caz vorbim despre o clonare
direcționată, deoarece este posibil un singur sens pentru inserarea ADN exogen.
În urma clonării realizate după tăierea cu o singură enzimă de restricție există două
posibilități practice. Fie vectorul li nearizat se leagă cu insertul, fie vectorul se
recircularizează fără a integra insertul.
Pentru a favoriza inserarea ADN exogen, recircularizarea vectorului simplu este
împiedicată prin tratamentul acestuia cu fosfatază alcalină. Enzima are rolul de a eli mina
grupările fosfat prezente la extremitatea 5’ a vectorului linearizat, iar ligaza nu mai poate
cataliza formarea unei legături fosfodiesterice între cele două extremități, ci numai unirea
capetelor defosforilate ale vectorului cu cele nemodificate ale insertului.
După obținerea vectorului recombinant, acesta poate fi introdus prin procedee
specifice î n interiorul unei celule gazdă.

INTRODUCEREA VECTORILOR ÎN CELULELE GAZDĂ

După obținerea vectorilor recombinanți, aceștia sunt integrați într -un organism
gazdă în vederea amplificării și apoi a exprimării genei pe care o conțin, dacă se dorește
analiza produsului acesteia sau evaluarea efectelor determinate de prezența sa. Practic,
atunci când vectorul recombina t este introdus într -o celulă nouă, p rocesul autonom de
replicare asigură atât replicarea vectorului cât și a fragmentului de ADN exogen pe care îl
conține.

Procesul de i ntegrare a vectorilor recombina ți în celulele gazdă se numește
transformare în cazul procariotelor sau transfecție în cazul celulelor eucariote.

Transformarea celulelor procariote
Prin procesul de transformare, bacteriile încorporează molecule de ADN libere,
situate în afara celulelor (plasmide, vectori recombinanți, fragmente de ADN etc.),
menținând stabilă informația geneti că conținută de acestea și chiar exprimând -o. Totuși,
nu oricare celulă poate să accepte o moleculă de ADN extracelulară.
Pentru a realiza practic acest lucru, celula trebuie să se afle într -o stare fiziologică
permisivă, stare care poate fi indusă experi mental și care este numită stare de
competență .
Există mai multe procedee de transformare a bacteriilor in vitro cu scopul de a le
face competente: tratamentul cu clorură de calciu sau cu enzime specifice capabile să
degradeze structura peretelui celular, expunerea celulelor la pulsuri de curent electric
(electroporare) sau bombardarea celulelor cu miniparticule la nivelul cărora sunt
adsorbite molecule de ADN.
Transformarea genetică cuprinde două etape:
i. punerea în contact și adsorbția ADN extracelular la nivelul membranei plasmatice
a celulei receptor;
ii. internalizarea ADN în celulă.
Odată pătrunsă în celula receptoare, molecula de ADN poate fi amplificată, iar
ulterior exprimată sau nu.
Pentru a f acilita intrarea vectorului prin peretele celular și membrana plasmatică,
bacteriile aflate în faza exponențială de creștere trebuie „fragilizate” folosind diverse
metode, cum ar fi de exemplu tratarea acestora cu clorură de calciu la o temperatură de
4șC. Ca urmare a acestui procedeu peretele celular și sau/membrana plasmidială devin
permeabile temporar datorită formării unor pori.
Ulterior, aceste celule competente sunt puse în contact cu soluția care conține
vectorul ce trebuie integrat în prezență de p olietilen glicol (PEG). Ca urmare a

permeabilizării temporare și după aplicarea unui prin șoc termic sau electric, o parte din
celulele bacteriene vor integra vectorul. Pentru a putea selecționa numai bacteriile care au
integrat vectorul, acestea vor fi cu ltivate într -un mediu de cultură care conține și factorul
de selecție. Acesta este de cele mai multe ori antibioticul corespunzător genei de
rezistență conținute de către vector.

Transfecția celulelor eucariote
Pentru a elimina ambiguitățile precizăm că în cazul eucariotelor, pentru procesul de
introducere a ADN exogen în celulă și pentru integrarea acestuia la nivelul materialului
genetic propriu, se utilizeaza termenul de transfecție.

Transfecția celulelor de drojdii: o primă tehnică de transfecție pr esupune
incubarea sferoblastele (celule lipsite de perete celular) în prezență de ADN recombinant,
polietilen glicol și clorură de calciu. Acest tratament va facilita pătrunderea ADN exogen
în interiorul celulelor.
În cadrul unei alte metode, celulele sun t tratate cu clorură de litiu, substanță care are
ca efect fragilizarea membranelor. Ionii de litiu au capacitatea de a induce formarea unor
pori la nivelul membranei celulare al drojdiilor. Tratamentul este urmat de incubarea
celulelor receptoare cu vecto rul recombinant, în prezența PEG care are rolul de a
concentra moleculele de ADN transformant.
Intrarea vectorilor în celule poate fi stimulată și prin șocuri electrice
(electroporarea). În cadrul acestei tehnici, celulele drojdiilor sunt mai întâi tratat e cu un
agent labilizator al membranei celulare, iar mai apoi sunt supuse unor pulsuri electrice cu
un anumit voltaj, în prezența vectorului recombinant, pentru un anumit interval de timp.
Pulsurile electrice determină un proces de dezorganizare reversibil ă a membranei
plasmatice, fapt care conduce la o creștere substanțială a permeabilității acesteia.
Condițiile experimentale pentru electroporare variază de la un protocol la altul și sunt
determinate exlusiv prin încercări practice în laborator. Totuși, es te important de știut că
intensitatea și durata pulsului electric aplicat trebuie controlată strict pentru a nu genera

dezorganizarea definitivă a membranei celulare , iar concentrația vectorului nu trebuie s ă
depășească anumite valori .
Vectorul recombina t poate fi menținut în celula transformată fie sub formă integrată
la nivelul ADN genomic, fie sub formă replicativă, independentă de ADN cromozomal.
Vectorul trebuie să posede capacitate de replicare independentă, aceasta fiindu -i conferită
de secvențele A RS ( Autonomus Replicating Sequence ). Vectorii care nu conțin secvențe
ARS trebuie neapărat să se integreze la nivelul genomului prin recombinare omologă,
aceasta determinând obținerea de drojdii recombinate, transformate stabil.

BIBLIOGRAFIE

Tehnici de b iologie moleculară – principii și aplicații practice, Sergiu Emil Georgescu,
Andreea Dudu, Marieta Costache, 2016, Editura Universității din București, București,
România, ISBN 978 -606-16-0729.