Sisteme de Transport Si Eliberare la Tinta Lipozomi

INTRODUCERE

Scopul tuturor sistemelor de eliberare controlată este ca medicamentul să ajungă intact la zona țintită, într-un mediu care să poată controla administrarea principiului activ pe căi de declanșare chimice sau fiziologice. Pentru a realiza acest scop, cercetătorii își îndreaptă atenția spre lumea micro și nanotehnologiei. În ultimul deceniu, micro și nanosferele, micelele polimerice, materialele de tip hidrogel, nanocapsulele s-au arătat a avea efect în îmbunătățirea țintirii specifice a medicamentelor, scăderea toxicității sistemice a acestora, îmbunătățirea ratei tratamentului și protecția substanțelor active împotriva degradării biochimice.

O categorie aparte de microparticule capabile de a include cantități mari de principii active, atât hidrofile cât și hidrofobe, o constituie lipozomii. Aplicațiile acestora ca sisteme de eliberare controlată este însă limitată de stabilitatea lor redusă în medii fiziologice.

Există mai multe metode de a obține sisteme lipozomale folosite în transportul componentelor active. Una dintre acestea este metoda simplă de hidratare, în care lipidele sunt amestecate și dizolvate într-un solvent organic. Acești solvenți pot fi îndepărtați prin evaporare sau uscare la vacuum. Filmul lipidic omogenizat este apoi hidratat. În timpul hidratării lipidelor se formează vezicule mari multilamelare, mărimea lor este redusă prin omogenizare sau sonicare.

A doua metodă este emulsionarea. Fosfolipidele sunt întâi dizolvate în solvenți organici prin agitare viguroasă. Solventul organic este apoi îndepărtat sub presiune scăzută. Dispersia lipozomală rezultată este crescută prin filtrare sau extrudare.

Pentru transportul medicamentelor, lipozomii pot fi exprimați ca o suspensie sau formă semisolidă similară cremelor gel, loțiunilor sau pudrei veziculare. Lipozomii sunt foarte versatili, variază ca formă, încărcare electrică superficială, compoziția lipidică, permeabilitate. Ei pot încapsula atât în fază apoasă, cât și lipidică, o multitudine de molecule active farmacologic. Acest fapt a condus la dezvoltarea unor tehnici ingenioase pentru prepararea lipozomilor, cu avantaje practice, și de asemenea a ajutat la îmbunătățirea sistemelor cu multe aplicații.

I. SISTEME COLOIDALE DIVERSE FOLOSITE PENTRU TRANSPORTUL MEDICAMENTELOR LA ȚINTĂ

I.1. LIPOPROTEINE

Lipoproteinele sunt substanțe alcătuite din grăsimi, care se atașează de protide, cele din urmă îndeplinind rolul de "cărăuș".

Până în anul 1970, nu se cunoștea faptul că lipidele din sânge circulă legate de proteine. În 1960, nu se putea explica cum grăsimile, care nu sunt miscibile cu apa, sunt atât de prompt distribuite prin toate lichidele corpului. O altă problemă era legată de pătrunderea selectivă prin membranele celulare (prin unele da, prin altele nu) a lipidelor. Toate acestea, s-au lămurit definitiv după descoperirea faptului că unele lipide coexistă cu proteinele.

După densitatea proteinelor conținute, lipoproteinelor sunt de 3 feluri:
– VLDL=Very Low Density Lipoproteins (liproteine de foarte joasă densitate),

– LDL=Low Density Lipoproteins (liproteine de densitate joasă),

– HDL = High Density Lipoproteins (liproteine de înaltă densitate).

Circulația lipidelor în sânge

În sânge, lipidele (trigliceridele, colesterolul, fosfolipidele) circulă legate de lipoproteine. Transportul acestor grăsimi depinde în foarte mare măsură de densitatea proteinelor din structura lipoproteinelor. Lipoproteinele de înaltă densitate transportă lipidele, în special colesterolul spre ficat, unde se depozitează sau servește la sinteza acizilor biliari. LDL transportă grăsimea în sens invers, de la ficat către alte părți ale corpului, prin sistemul circulator. VLDL ia naștere din LDL, după ce acesta din urmă a eliberat materialul lipidic transportat.

"Colesterolul rău" și "colesterolul bun"

Prin faptul că transportă colesterolul spre ficat scoțându-l din sânge, lipoproteinele de înaltă densitate (HDL) de care se leagă, formează "colesterolul bun". Lipoproteinele de densitate joasă (LDL), deoarece aderă ușor la pereții vaselor de sânge, se constituie în "colesterol rău".

Stimulenții naturali ai HDL

Atunci când se urmărește scăderea colesterolului, dar și a nivelul trigliceridelor din sânge, este absolut necesar să se limiteze consumul de substanțe exogene similare, ceea ce înseamnă că hrana trebuie să fie săracă în colesterol și în grăsimi saturate. Această măsură dietetică, nu este însă și suficientă, atâta timp cât LDL predomină. Schimbarea raportului între LDL și HDL în favoarea celei din urmă aduce cu sine scăderea colesterolului și chiar a trigliceridelor.

În formarea HDL, un rol important îl joacă acizii grași nesaturați, în special cei mononesturați (acidul oleic). Polifenolii antioxidanți din afine, merișoare, cireșe, strugurii negrii, mere stimulează de asemenea, în mod semnificativ sinteza de HDL.

I.2. Emulsii, nanoemulsii și aerosoli

Emulsii

În 1960 a fost descoperită de Wretlind prima emulsie lipidică (intralipidică) utilizată pentru nutriția parentală. Acesta a fost începutul pentru obținerea de noi sisteme pentru eliberarea controlată a medicamentelor lipofilice, care pot fi încorporate cu ușurință în picături de ulei.

Emulsiile sunt sisteme coloidale în care atât mediul de dispersie cât și faza dispersă sunt lichide. Cele două faze sunt lichide nemiscibile sau parțial miscibile, una din ele fiind de regulă un lichid polar, iar cealaltă un lichid nepolar sau cu polaritate mică. Emulsionarea se poate realiza prin metode de dispersie, prin metode mecanice (agitarea), cu ajutorul ultrasunetelor (105 oscilații/s), pe cale electrostatică (potențial electric de 104 V), etc. În toate cazurile se produce o micșorare a tensiunii superficiale la interfața celor două faze lichide. Emulsiile sunt preparate farmaceutice lichide, mai mult sau mai puțin vâscoase, constituite dintr-un sistem dispers, format din două faze lichide nemiscibile, realizat cu ajutorul unor emulgatori și destinate administrării interne sau externe. Sunt sisteme disperse microeterogene, în care diamentrul picăturilor de lichid dispersat, în general, este cuprins între 0,5-50 μm, deci particulele sunt vizibile la microscopul obișnuit.

Termenul de emulsie derivă de la verbul latin “molgo, ere” – a mulge și se folosește în domeniul farmaceutic începând din sec. al XVII-lea denumind astfel toate lichidele medicamentoase cu aspect lăptos. Fundamentarea științifică a teoriei emulsionării și a explicării fenomenelor care stau la baza formării emulsiilor a început abia în a doua parte a secolului trecut. În anul 1990 Ostwald dă prima explicație științifică a formării emulsiilor, făcând diferența, între emulsiile de tip U/A (ulei dispersat în apă) și cele A/U (apă dispersată în ulei).

          În practica farmaceutică emulsiile prezintă următoarele avantaje:

– asigură administrarea concomitentă, precisă a două lichide nemiscibile;

– prin emulsionare se poate masca gustul neplăcut al unor medicamente și se poate facilita administrarea unor substanțe medicamentoase vâscoase;

– emulsionarea poate să dirijeze absorbția medicamentelor asigurând o absorbție mai rapidă, mai perfectă.

Clasificarea emulsiilor

1) În funcție de dimensiunea particulelor dispersate și aspectul general al emulsiei există:

– macroemulsii: în care diametrul picăturilor dispersate este mai mare de 0,1 μm, fiind caracterizate prin instabilitate pronunțată și turbiditate evidentă,

– microemulsii: în care diametrul picăturilor dispersate este mai mic de 0,1 μm, fiind caracterizate prin stabilitate termodinamică mare iar macroscopic sunt clare, transparente.

2) După numărul părților componente pot fi:

– emulsii propriu-zise (3 părți principale);

– pseudo- sau cvasiemulsii (2 părți principale – fără emulgator). La cvasiemulsii contopirea picăturilor dispersate este împiedicată de vâscozitatea mare a fazei continue.

3) După compoziție pot fi:

– emulsii ulei în apă (U/A): uleiul este dispersat în apă sau alt lichid hidrofil. Se întrebuințează mai ales intern și pot fi diluate cu apă. Emulsiile de uz intern sunt numai de tip U/A;

– emulsii apă în ulei (A/U): un lichid hidrofil este dispersat într-un lichid lipofil. Se utilizează extern și poate fi diluat cu ulei.

– emulsii complexe de tip apă/ulei/apă – (apă în ulei) în apă (iaurtul).

4) După proveniență pot fi:

– naturale (laptele, latexul diferitelor plante);

– artificiale (emulsii farmaceutice).

5) După modul de utilizare:

– emulsii utilizate ca atare de către consumator (untul, smântâna etc);

– emulsii utilizate ca ingrediente în alte produse (brânzeturi, produse de patisserie, etc);

– emulsii care se destabilizează în tipul procesării pentru a forma structuri noi în produsul finit (înghețata).

b. Nanoemulsii

Nanoemulsiile sunt emulsii foarte fine, heterogene, ce conțin două lichide nemiscibile, în care un lichid este dispersat sub formă de nanopicaturi în alt lichid, cu un diametru mediu al picăturii < 100 nm. Ele pot fi preparate prin emulsifierea spontană, precum inversia de faze sau prin utilizarea unui omogenizator cu grad înalt de forfecare, care permite un control mai bun al dimensiunii picăturii și un domeniu larg de compoziții. Nanoemulsiile sunt sisteme foarte fragile. Fiind sisteme transparente și uzual foarte fluide, destabilizarea se observa foarte ușor, fiind vizibilă datorită opacității și consistentei (devin cremoase). Există două surse majore de instabilitate ale acestor sisteme: una cauzată de natura fazei uleioase și alta ce provine de la adăugarea polimerilor folosiți pentru îngroșarea sau gelifierea nanoemulsiei.

Nanoemulsiile ulei-in-apa reprezintă cele mai importante sisteme de transport al medicamentelor parentale, la care medicamentele lipofile sunt dizolvate în miezul emulsiei. Degradarea picăturilor ce conțin medicament lipofil are loc foarte repede când s-a administrat intravenos, astfel nu se realizează o eliberare întârziată. După intrarea în circulația sangvină, emulsiile grase sunt tratate ca o grăsime ce apare natural și prin urmare este hidrolizată rapid de enzimele lipaze.

c. Emulsiile multiple sunt sisteme complexe și instabile termodinamic care combina o emulsie U/A și alta A/U într-un singur “vehicul”. Emulsia multiplă a fost utilizată ca mijloc de distribuție a medicamentelor către anumite ținte din corp fără efecte adverse ale acestor medicamente asupra altor organe și prelungirea eliberării medicamentelor cu un timp de înjumătățire biologic scurt. În plus, emulsia multiplă a fost recent utilizată ca mediu de reacție pentru sinteza microsferelor polimerice ce conțin încapsulate medicamente, peptide sau proteine prin metoda evaporării solventului. În procesul de evaporare, medicamentul este dispersat într-un solvent nemiscibil în apă ce dizolvă polimerul, și apoi această emulsie rezultată este emulsifiata într-o fază continua apoasă.

d. Aerosoli. Aerosolii sunt dispersii ale unor picături de lichide sau particule solide într-un gaz. Astfel de sisteme sunt de interes pentru distribuția unor proteine terapeutice și a peptidelor, deoarece pot circula în rețeaua sangvină, începând din epiteliul alveolar, fără intensificatori de penetrare și deoarece bolile respiratorii pot fi tratate prin acțiunea directă la partea de interes. În pofida stabilității lor finite, sistemele coloidale disperse de tipul emulsiilor și aerosolilor prezintă câteva avantaje ca sisteme de distribuție a medicamentelor. De exemplu, emulsiile oferă oferă oportunități pentru solubilizarea unor cantități relative mari de ingrediente active hidrofobe, cu avantaje le asociate, de exemplu: solubilitatea efectivă a medicamentului, viteza de eliberare a medicamentului, stabilitatea chimică și mascarea gustului. Cantitatea de surfactant necesară este în general scăzută, și surfactanții sunt relativ netoxici.

I.3. Lipozomi

Lipozomii sunt definiți ca fiind vezicule uni- sau multilamelare, cu dimensiuni ce variază de la 20 nm la câțiva μm, în care un volum de apă esfil are loc foarte repede când s-a administrat intravenos, astfel nu se realizează o eliberare întârziată. După intrarea în circulația sangvină, emulsiile grase sunt tratate ca o grăsime ce apare natural și prin urmare este hidrolizată rapid de enzimele lipaze.

c. Emulsiile multiple sunt sisteme complexe și instabile termodinamic care combina o emulsie U/A și alta A/U într-un singur “vehicul”. Emulsia multiplă a fost utilizată ca mijloc de distribuție a medicamentelor către anumite ținte din corp fără efecte adverse ale acestor medicamente asupra altor organe și prelungirea eliberării medicamentelor cu un timp de înjumătățire biologic scurt. În plus, emulsia multiplă a fost recent utilizată ca mediu de reacție pentru sinteza microsferelor polimerice ce conțin încapsulate medicamente, peptide sau proteine prin metoda evaporării solventului. În procesul de evaporare, medicamentul este dispersat într-un solvent nemiscibil în apă ce dizolvă polimerul, și apoi această emulsie rezultată este emulsifiata într-o fază continua apoasă.

d. Aerosoli. Aerosolii sunt dispersii ale unor picături de lichide sau particule solide într-un gaz. Astfel de sisteme sunt de interes pentru distribuția unor proteine terapeutice și a peptidelor, deoarece pot circula în rețeaua sangvină, începând din epiteliul alveolar, fără intensificatori de penetrare și deoarece bolile respiratorii pot fi tratate prin acțiunea directă la partea de interes. În pofida stabilității lor finite, sistemele coloidale disperse de tipul emulsiilor și aerosolilor prezintă câteva avantaje ca sisteme de distribuție a medicamentelor. De exemplu, emulsiile oferă oferă oportunități pentru solubilizarea unor cantități relative mari de ingrediente active hidrofobe, cu avantaje le asociate, de exemplu: solubilitatea efectivă a medicamentului, viteza de eliberare a medicamentului, stabilitatea chimică și mascarea gustului. Cantitatea de surfactant necesară este în general scăzută, și surfactanții sunt relativ netoxici.

I.3. Lipozomi

Lipozomii sunt definiți ca fiind vezicule uni- sau multilamelare, cu dimensiuni ce variază de la 20 nm la câțiva μm, în care un volum de apă este înconjurat în totalitate de o membrană lipidică (bistraturi de surfactanți lipidici precum: fosfolipide, colesterol, glicolipide).

Cercetătorii farmaceutici utilizează lipozomii încă din 1960 ca instrumente terapeutice în domeniul medicamentelor.

Un număr de formulări lipozomale de astfel de medicamente sunt disponibile pe piață, cum ar fi Doxil ® (doxorubicină), fungizon ® (amfotericină-B), Novasome ® (vaccinul antivariolic) și NyotranTM (Nystatin). Lipozomii sunt utilizați ca transportori potențiali în domenii ca direcționarea tumoală, terapia genică și antisens, vaccinuri genetice, imunomodulatori, îngrijirea pielii și produsele cosmetice de actualitate.

Lipozomii, similar altor tipuri de transportori coloidali de medicamente, pot fi stabilizați steric prin modificarea suprafeței lipozomale cu polietilenoxid (PEO). Aceste tipuri de lipozomi cu suprafața modificată prezintă un interes deosebit în acest context, datorită timpilor de circulație relative lungi și distribuțiilor relative uniforme în țesut ale acestor sisteme după administrare intravenoasă.

Lipidele sunt predominant fosfolipide care formează bistraturi similare celor care se găsesc în biomembrane (fig 1). În majoritatea cazurilor, componenta majoră este fosfatidilcolina. În funcție de condițiile de procesare și compoziția chimică, lipozomii sunt formați cu unul sau mai multe bistraturi concentrice.

Fig. 1. Structura chimică și reprezentarea schematică a unui fosfolipid (lecitina)

Lipozomii se deosebesc deseori după numărul lor de lamele și dimensiuni. Se disting veziculele unilamelare mici (SUV), veziculele unilamelare mari (LUV) și veziculele mari multilamelare (MLV) sau veziculele multiveziculare (MVV) (fig. 2). Lipozomii SUV au diameter de la 20 până la aproximativ 100 nm. Celelalte categorii de lipozomi variază în dimensiuni de la câteva sute de nanometre până la câțiva microni. Grosimea membranei (bistratului lipidic) masoară aproximativ 5-6 nm.

Fig. 2. Ilustrarea schematică a lipozomilor de diferite mărimi și număr de lamele. SUV: Vezicule mici unilamelare; LUV: Vezicule largi unilamelare; MLV: Vezicule multilamelare; MVV: Vezicule multiveziculare.

Lipozomii au fost dezvoltați cu scopul de a reduce efectele toxice secundare ale medicamentelor încorporate și pentru creșterea eficacității tratamentului. Ei sunt utilizați pentru distribuția medicamentelor datorită proprietăților lor unice, fiind capabili să transporte ambele categorii de molecule, hidrofobe și hidrofile. Dimensiunea veziculelor joacă un rol important în activarea complementară și transparența sistemului mononuclear fagocit (MPS) al lipozomilor.

Pentru distribuția moleculelor către pozițiile de acțiune, bistratul lipidic poate fuziona cu alte bistraturi precum membrana celulară, astfel distribuind conținutul din lipozom. Prin obținerea de lipozomi într-o soluție de ADN sau medicamente (care în mod normal ar fi incapabile să difuzeze prin membrana), aceștia pot fi distribuiți prin bistratul lipidic. Utilizarea lipozomilor pentru transformarea sau “transfecția” ADN-ului într-o celulă gazdă este cunoscută ca “lipofection”.

Fig. 3 – Structura compozițională a lipozomilor

I.4. Niozomii și sfingozomii

Niozomii și sfingozomii sunt vezicule cu structură similară. Spre deosebire de lipozomi, surfactanții neionici, ex. poligliceril alchil eteri, sau sfingolipidele alcătuiesc bistratul niozomilor și sfingozomilor, respectiv: (fig. 3).

Fig. 3. Structura chimică a lipidelor din alcătuirea sfingozomilor și niozomilor

Niozomii sunt vezicule de surfactant neionic (NSV-uri), ce se aseamănă în constituția lor cu lipozomii și constau din molecule superficial active sintetice (de ex.: alchil polioxietilen eteri). Lanțurile hidrocarbonate săturate și legăturile eter intramoleculare cresc stabilitatea chimică a niozomilor.

NSV-urile se formează prin autoasamblarea amfifililor neionici în medii apoase, conducând la structuri bistrat închise.

Niozomii, similar lipozomilor, pot fi preparați pe aceeași cale, într-o varietate de condiții, conducând la formarea structurilor unilamelare și multilamelare. Niozomii sunt considerați ca fiind superiori lipozomilor, fiind capabili să încapsuleze ambele categorii de medicamente hidrofile și lipofile și pot servi ca transportori eficienți de medicament. Stabilitatea mare, costul scăzut al surfactantilor și problemele minore de stocare au determinat exploatarea acestor vezicule ca o alternativă a veziculele fosfolipidice.

O aplicație importantă a acestor compuși s-a materializat sub formă de dispersii veziculare utilizate în domeniul chemoterapiei cancerului, medicamente precum doxorubicin și methotrexat fiind încapsulate în niozomi.

Veziculele sunt în general destinate să fie încorporate în amestecuri complexe. Multe substanțe organice sunt mai mult sau mai puțin superficial active, de aceea este essential să se studieze proprietățile surfactantilor în prepararea veziculelor

Încapsularea medicamentelor în niozomi poate scădea toxicitatea, poate crește absorbția medicamentului și de asemenea poate întârzia îndepărtarea medicamentului din circulație, datorită eliberării lente a medicamentului. Cu toate acestea, caracteristicile veziculelor/niozomilor preparați cu surfactanti neionici, precum stabilitatea dispersiei, dimensiunea particulei și microfluiditatea, nu au fost inc ape deplin elucidate, deoarece majoritatea studiilor în acest domeniu au fost anexate pe potențială utilizare a acestor vezicule ca sisteme de distribuție controlată.

I.5. Sisteme de nanoparticule în distribuția medicamentelor

Nanosuspensiile particulelor de medicament sunt produse uzual prin două metode.

Prima metodă a producerii nanosuspensiei implică spargerea particulelor mai mari la dimensiune nanometrică, utilizând omogenizarea la presiune înaltă a suspensiilor de medicament, în prezența unor surfactanti precum Tween 80 și Pluronic F68.

A doua metodă implica cristalizarea, construind nanoparticule de la starea de soluție suprasaturată. Starea solidă a nanosuspensiei este mult mai stabilă chimic, oferă o masă mai mare de medicament pe volum de încărcare și este utilă în special pentru compuși terapeutici care necesită dozare riguroasă. În etapa de preparare este necesară menținerea medicamentului în stare cristalină în domeniul nanometric, dar nu și în starea dizolvată a medicamentului.

Nanoparticulele pot fi subclasate după compoziția lor în: nanoparticule pe bază de lipid (nanoparticule lipidice solide), de polimer (nanoparticule polimerice), de materiale ceramice (nanoparticule ceramice), nanoparticule de albumină și nanogeluri.

a. Nanoparticule lipidice dispersate

A. Faze cristal – lichid dispersate. Astfel de sisteme transportoare sunt preparate prin omogenizarea la presiune înaltă a fazelor cristal lichid cubice, care sunt de asemenea stabile în echilibru în exces de apă. Particulele cu faza cubică dispersată sunt stabilizate împotriva floculării și coalescentei, de exemplu prin adăugarea unui copolimer ce conține PEO. Datorită dimensiunilor mici care pot fi atinse (~100-300 nm) și a acoperirilor pe bază de PEO, este surprinzător faptul că aceste particule sunt capabile să circule prin sistemul sangvin o perioadă considerabilă de timp. Astfel de sisteme oferă avantaje potențiale referitoare la biodisponibilitatea crescută a medicamentelor și reducerea efectelor toxice în țesuturile asociate RES, precum și capacitatea ambelor substanțe solubile în apă și ulei de a fi solubilizate în particule eliberate într-o manieră controlată.

B. Nanoparticule lipidice solide (SLN). Aceste sisteme prezintă un interes deosebit datorită faptului că permit un grad ridicat de încărcare cu medicamente hidrofobe, deoarece degradarea hidrolitică este limitată iar viteza de eliberare a medicamentelor poate fi controlată prin dimensiunea particulelor și a compoziției.

Particulele lipidice solide sunt obținute prin cristalizarea și/sau precipitarea în sisteme de emulsie ulei/apă sau prin dispersia obținută prin omogenizare la presiune ridicată la temperature înalte, urmate de răcirea și solidificarea picăturilor lipidice. Pentru biodisponibilitatea îmbunătățită a SLN-urilor sunt necesare măsuri de protecție ale moleculelor de medicamente sensibile la diferiți factori de mediu (apă, lumina) și cunoașterea caracteristicilor de eliberare controlată. Încapsularea cu succes a medicamentelor a fost realizată nu numai în cazul moleculelor lipofile, ci și în cazul moleculelor hidrofile.

SLN-urile prezintă însă și câteva dezavantaje ce includ: creșterea și agregarea particulelor, tendința de gelifiere neprevăzută, dinamici neașteptate în ceea ce privește tranzițiile polimorfe, eliberarea bruscă a medicamentelor și capacitatea de încorporare relative scăzută datorită structurii cristalină a lipidului solid.

NLC și LDC. La sfârșitul anilor 2000 au fost introduși modificatori ai SLN-urilor, așa-numiții transportori lipidici nanostructurati (NLC) și nanoparticule conjugate cu medicament lipidic (LDC). Aceste sisteme de transport previn limitările obeservate în cazul SLN-urilor convenționale.

Lipidele lichide au capacitate de solubilizare a medicamentelor mult mai mare decât lipidele solide. În acord cu acest model, nanoparticulele NLC oferă o capacitate de încorporare ridicată și un control al eliberării medicamentului. S-a demonstrat că moleculele de trigliceride cu lanț mediu (MCT) pot înlocui cu succes moleculele convenționale de behenat de gliceril, GB în rețeaua cristalină într-o distribuție întâmplătoare, până la o încărcare de MCT de 16% (procente de masă din lipidul total). Alte încercări au arătat că grade de incaracare ridicate de ulei (până la 38%) pot fi încorporate sub formă de clusteri de MCT în interiorul matricei solide, particulele solide fiind descries a fi sferice, forma care le conferă un volum maxim pentru incorporare de ulei sau medicament. În pofida eforturilor de cercetare susținute, la nivelul anului 2004 nici una din cele două categorii de nanoparticule (SLN și NLC) nu a fost industrializata încă pentru utilizare clinică. Utilizarea SLN-urilor pentru incorporare medicamentelor lipofile este o aplicație arhicunoscută. Datorită efectelor de distribuție din timpul procesului de obținere, pot fi încorporate cu succes în matricea lipidica solidă numai medicamente care sunt eficiente în concentrații mici. Cu scopul de a elimina aceasta limitare, au fost dezvoltate așa-numitele “nanoparticule de medicamente lipidice conjugate” (“lipid drug conjugate nanoparticles” – LDC) care prezintă capacitate de înglobare a medicamentului până la 33%.

Nanoparticule polimerice

Nanoparticulele polimerice se obțin din polimeri biodegradabili ai căror produși de degradare sunt netoxici și ușor de resorbit. Avantajul acestor particule îl constituie țintirea specifică și eliberarea controlată a medicamentelor încorporate. Nanoparticulele polimerice dispersate preparate din astfel de polimeri sunt interesante ca transportori pentru distribuția orală a medicamentelor convenționale, antigeni vaccinuri sau enzime, dar în general pentru acele medicamente care nu sunt stabile în stomac, pentru vaccinări orale și pentru formulări unde este dorită biadeziunea. Componentele active pot fi dizolvate sau captate în matricea polimerică sau pot fi absorbite pe suprafața particulelor. În funcție de polimer, de interacțiunea dintre medicament și polimer și metoda de obținere, eliberarea medicamentului este diferită. Ambele căi de administrare, orală și parentala, a sistemelor transportor coloidale sunt dependente de natura transportorului. În ultimul caz, preluarea reticuloendoteliala (RES) a transportorilor coloidali de medicament depinde de o serie de factori, cei mai importanți find proprietățile superficială ale transportorului. Aceasta este asociată cu absorbția anumitor proteine serice (opsonina) la suprafață trasportorului, care inițiază diferite răspunsuri biologice.

Polimerii adecvați pentru prepararea nanoparticulelor includ: derivați celulozici, poli (alchilciano – acrilați), poli (metiliden – malonat), poli (ortoesteri), poli (anhidride), acid poli (lactic), acid poliglicolic și copolimerii lor. Obligatoriu trebuie luate în considerație toxicitatea substanțelor, inițiatorii de radicali sau reziduuri de solvent.

Nanoparticulele formate din polimeri de tipul acidului poli (lactic)-PLA, acidului poli (glycolic)-PGA și amestecuri ale acestora sunt cele mai mult utilizate, deoarece sunt biocompatibile și aprobate de Federația Internațională de Administrare a Medicamentelor pentru administrare umană. PLA și PGA se degradează prin hidroliza la metabolite de tip acid lactic și acid glicolic, care sunt eliminați din organism prin intermediul căilor naturale.

Pot apărea de asemenea și câteva probleme legate de erodarea polimerului, de difuzia medicamentului prin matrices au de desorbția de pe suprafața. Citotoxicitatea polimerilor după introducerea acestora în celule este aspectul crucial și adesea cel mai discutat, alături de producerea problematică la scară industrială a nanoparticulelor polimerice.

Nanocapsule polimerice. Nanocapsulele ce conțin ulei sunt diferite de nanoemulsiile ulei-in-apa în ceea ce privește furnizarea unei bariere de natura polimerică, poziționată între miez și mediul înconjurător. Adesea, pentru prepararea nanocapsulelor sunt aplicate metodele de înlocuire a solventului și polimerizarea interfaciala.

În acord cu caracterul lipof al conținutului din capsula, pot fi dizolvate medicamente lipofile și hidrofile. În plus, suprafața particulei polimerice poate servi drept compartiment unde medicamentele hidrofile pot fi adsorbite.

c. Nanoparticule ceramice

Nanoparticulele preparate pe bază de materiale ceramice precum silice, alumina și oxidul de titan prezintă câteva avantaje pe lângă nanoparticulele polimerice. În primul rând prepararea lor este simplă, similară cunoscutului proces sol-gel, și necesită condiții de temperatură ambientală. În al doilea rând, materialele ceramice utilizate sunt biocompatibile și suprafețele lor pot fi ușor modificate cu diferite grupări funcționale pentru atașarea unui ligand. În al treilea rând, particulele sunt inerte și pot fi preparate la mărimea și forma dorită. Ele nu suferă modificări în ceea ce privește fenomenele de gonflare și de modificare a porozității odată cu varierea pH-ului și nu sunt sensibile la atacul microbian.

d. Nanoparticule de albumină. Nanoparticulele de albumina au fost investigate pentru distribuția ADN-ului, deoarece complexul ADN-albumina poate evita distrugerea anticorpilor de către celulele immune și preluarea prin MPS. Nanoparticulele de ADN-polietilenimina (PEI)-albumina sunt mai puțin toxice decât complecșii ADN-PEI individuali chiar și în concentrații ridicate.

II. METODE DE PREPARARE A LIPOZOMILOR

Faza de hidratare

Metode mecanice

• Vortexarea sau agitarea manuală a suspensiei de fosfolipide (MLV)

• Tehnica microfluidizării (în principal SUV)

• Omogenizare prin forfecare (în principal SUV)

Metode bazate pe înlocuirea solventului organic cu mediu apos

• Îndepărtarea solventului organic înainte de hidratare (MLV, OLV, SUV)

• Evaporarea de fază inversă (LUV, OLV, MLV)

• Folosirea solvenților nemiscibili cu apa: eter și infuzii de eter de petrol (vaporizarea solventului) (MLV, OLV, LUV)

• Folosirea solvenților miscibili cu apa precum injecția de etanol (MLV, OLV, SUV)

Metode bazate pe îndepărtarea detergentului

• Cromatografia de excludere pe gel (SUV)

• Dializa 'lentă' (LUV, OLV, MLV)

• Diluția rapidă (LUV, OLV)

Metode bazate pe transformarea mărimilor și fuzionare

• Fuzionarea spontană a SUV în fază de gel (LUV)

• Înghețare-dezghețare (MLV)

• Înghețare-uscare (MLV)

Faza de dimensionare

Extrudere la înaltă presiune

Extrudere la joasă presiune

Ultrasonicare

Îndepărtarea materialului neîncapsulat

Dializă

Ultracentrifugare

Cromatografie de trecere prin gel

Rășini schimbătoare de ioni.

II.1. Mecanismul formării veziculare

Lipozomii (veziculele lipidice) se formează atunci când filme subțiri lipidice sau multistraturi lipidice sunt hidratate și stive de bistraturi cristaline lichide se fluidizează și se umflă. Foile hidratate lipidice se detașează în timpul agitării și se autoînchid formînd vezicule mari, multilamelare ( (LMV) care previn interacția apei cu miezul hidrocarbonat al bistratului la margini. Odată aceste particule fiind formate, reducerea dimensiunii lor necesită energie externă sub formă de energie sonică (sonicare) sau energie mecanică (extrudare).

Fig. 4 – Mecanismul formării veziculare

II.2. Principalele metode de preparare a lipozomilor

Lipozomii au fost descoperiți la începutul anilor 1960 și, ulterior, studiați ca modele ale membranei celulare. De atunci, au fost recunoscuți în domeniul de livrare a medicamentelor. Dimensiunea particulelor lipozomilor variază de la 20 nm la 10 μM în diametru. Lipozomii variază în încărcătura electrică și în mărime, în funcție de protocolul de fabricație și de tipul de (fosfo) bistrat lipidic utilizat (vezicule mici unilamelare [SUV] cu dimensiunea de 0.02 -0.05 uM, vezicule mari unilamelare [LUV] cu dimensiunea mai mare de 0.06 uM și vezicule mari multilamelare [MLV] cu dimensiunea de 0.1 – 0.5 uM).Caracteristicile fizico-chimice ale lipozomilor, cum ar fi dimensiunea particulelor, lamelaritatea, încărcarea electrică a suprafaței, sensibilitatea la modificările pH-ului și rigiditatea bistratului pot fi manipulate. Lipozomii au arătat rezultate promițătoare în livrarea medicamentelor, dar aplicabilitatea lor este limitată la uzul specific, datorită timpului scurt de înjumătățire în circulația sanguină. Timpul de circulatie al lipozomilor în fluxul sanguin este crescut dramatic prin atașarea unităților polietilen glicol (PEG) la bistrat, cunoscuți sub denumirea lipozomi cu timp circulant mare.Principalele avantaje ale lipozomilor sunt faptul că oferă mijloace adecvate pentru furnizarea de medicamente și potențialul de îmbunătățire a indicelui terapeutic, în timp ce sunt reduse foarte mult efectele secundare. Fabricarea comercială a medicamentelor lipozomaleOpțiunile pentru combinarea fosfolipidelor cu faza apoasă sunt numeroase, dar două metode majore sunt folosite pentru a produce sisteme lipozomale pentru livrarea de medicamente. A. Prima este metoda simplă de hidratare, în care lipidele de producție sunt amestecate și dizolvate în solvenți organici aprobați oficial precum clorură de metilen, cloroform, butanol terțiar, metanol și alți solvenți. Acești solvenți pot fi eliminați fie prin evaporare, uscare în vid sau liofilizare. Filmul uscat lipidic, pastă sau strat este apoi hidratat.

Alternativ, se poate injecta o soluție lipidică de etanol sau propilen glicol în faza apoasă și se îndepărtează solventul prin filtrare, cromatografie și dializă. La hidratarea lipidelor, se formează vezicule mari multilamelare, dimensiunea acestora fiind redusă prin extrudare, omogenizare sau sonicare.

Elementele generale de procedură implică prepararea lipidelor pentru hidratare, hidratarea cu agitare, și redimensionarea la o distribuție omogenă de vezicule.

Pregătirea lipidelor pentru hidratare:

Când se prepară lipozomi cu compoziție lipidică mixtă, lipidele trebuie mai întâi dizolvate și amestecate într-un solvent organic ca sa asigure omogenitatea amestecului de lipide. În mod uzual, acest proces este realizat folosind cloroform sau amestecuri cloroform: metanol. Intenția este de a obține o soluție lipidică limpede penru amestecarea completă a lipidelor. Soluțiile lipidice tipice se prepară cu 10-20 mg lipid/ mL de solvent organic, deși concentrații mai înalte pot fi folosite dacă solubilitatea lipidului și amestecul sunt acceptabile. Odată ce lipidele sunt amestecate temeinic cu solventul organic, solventul se îndepărtează pentru a obține un film lipidic.

Pentru volume mici de solvent organic (<1mL), solventul poate fi evaporat folosind un curent uscat de azot sau argon într-o hotă. Pentru volume mai mari, solventul organic ar trebui îndepărtat prin centrifugare obținând un film lipidic subțire pe pereții cuvelor cu fund rotund. Filmul lipidic este uscat temeinic pentru a îndepărta solventul organic rezidual prin plasarea flaconului sau cuvelor la un rotavapor peste noapte.

Dacă folosirea cloroformului este controversată, o alternativă este dizolvarea lipidului sau lipidelor în t-butanol sau ciclohexan. Soluția lipidică este transferată în recipiente și înghețată prin plasarea acestora pe un bloc de gheață uscat sau agitarea recipientului într-o baie uscată de acetonă înghețată sau alcool (etanol sau metanol). Trebuie avut grijă în timpul procedeului cu baia ca recipientul să poată suporta schimbări bruște de temperatură fără să crape. După înghețarea completă, stratul lipidic înghețat este plasat la o pompă de vid și liofilizat până la uscare (1-3 zile în funcție de volum). Grosimea stratului lipidic nu ar trebui să fie mai mare decât diametrul recipientului folosit pentru liofilizare. Filmele sau straturile uscate lipidice pot fi îndepărtate de la pompa de vid, recipientul închis strâns și sigilat, și depozitat înghețat până când este gata de hidratare.

Fig. 5 – Etapele procesului de pregătire a lipidelor pentru hidratare

Hidratarea filmului/ stratului lipidic:

Hidratarea filmului/ stratului lipidic uscat se realizează simplu prin adăugarea unui mediu apos în recipientul cu lipidul uscat și agitare. Temperatura mediului de hidratare ar trebui să fie superioară temperaturii de tranziție gel – lichid (Tc sau Tm) a lipidelor cu cel mai înalt Tc înainte de adăugarea lipidelor uscate. După adăugarea mediului de hidratare, suspensia lipidică ar trebui menținută deasupra Tc în timpul perioadei de hidratare. Pentru lipide cu tranziție înaltă, acest lucru se realizează ușor prin transferarea suspensiei lipidice într-un flask cu fund rotund și plasarea acestuia pe un rotavapor fără vid. Învârtirea flaskului cu fund rotund în baie de apă fierbinte menținută la o temperatură peste Tc a suspensiei lipidice permite lipidului să se hidrateze în faza lui fluidă cu o agitare adecvată.

Timpul de hidratare poate varia ușor în funcție de specia și structura lipidului, totuși, este foarte recomandat un timp de hidratare de 1 oră cu agitare viguroasă, amestecare sau mișcare. De asemenea, se crede că permițând suspensiei veziculare să stea peste noapte (îmbătrânire) înainte de micșorarea dimensiunilor face procesul de dimensionare mai ușor și îmbunătățește omogenitatea distribuției dimensionate. Procesul de îmbătrânire nu este recomandat pentru lipidele cu tranziție înaltă deoarece hidroliza lipidelor crește cu temperatura ridicată.

Mediul de hidratare este în general determinat de aplicația veziculelor lipidice. Mediul de hidratare potrivit include apă distilată, soluții tampon, saline, și neelectroliți, precum soluțiile zaharoase. Osmolalitatea fiziologică (290 mOsm/kg) este recomandată pentru aplicațiile in vivo. Soluțiile general acceptate care întrunesc această condiție sunt 0.9% sare, 5% dextroză, și 10% sucroză. În timpul hidratării, unele lipide formează complexe unice cu structura lor. Lipidele cu încărcare electrică înaltă s-a observat că formează un gel vâscos când sunt hidratate cu soluții cu tărie ionică slabă. Problema poate fi evitată prin adăugarea de sare sau prin micșărarea dimensiunilor suspensiei lipidice. Lipidele slab hidratate, cum este fosfatidiletanolamina, au tendința de a forma agregate după hidratare. Veziculele lipidice care conțin mai mult de 60 mol% fosfatidiletanolamină formează particule care prezintă un strat subțire de hidratare în jurul veziculei. Pe măsură ce particulele se apropie unele de altele nu există repulsie de hidratare care să le facă să se respingă și cele două membrane cad într-un minim de energie în care aderă și formează agregate. Agregatele se separă de soluție sub formă de flocoane mari care se dispersează la agitare, dar se refac în repaus.

Fig. 6 – Etapele procesului de hidratare

Produsul hidratării este o veziculă mare, multilamelară (LMV), analoagă în structură unei cepe, în care fiecare bistrat lipidic este separat de un strat apos. Distanța dintre bistraturile lipidice este dictată de compoziție cu straturi polihidratate mai apropiate decât straturile cu încărcare electrică înaltă care se separă datorită repulsiilor electrostatice. Odată ce a fost produsă o suspensie stabilă, hidratată de vezicule LMV, particulele pot fi micșorate printr-o varietate de tehnici, incluzând sonicarea sau extruzia.

B. A doua metodă este emulsionarea. Fosfolipidele se dizolvă întâi într-un solvent organic (cum ar fi clorura de metilen) și apoi se adaugă controlat într- un mediu apos cu agitare energică. Solventul organic se îndepărtează apoi la presiune redusă. Dispersia lipozomală rezultată este dimensionată și prin filtrare sau extrudare.

c. Dimensionarea suspensiei lipidice

i. Sonicarea: Dezagregarea suspensiei de LMV folosind energie sonică (sonicare) produce în general vezicule mici, unilamelare (SUV) cu diametre de ordinul 15-50 nm. Cea mai obișnuită aparatură pentru prepararea particulelor sonicate sunt băi și sonicatoare tip sondă. Sonicatoarele de tip ceașcă, deși mai rar folosite, au produs cu succes SUV. Sonicatoarele tip sondă transmit energie înaltă suspensiei lipidice dar suferă de supraîncălzire, cauzând degradarea suspensiei lipidice. Sonicatoarele mai au, de asemenea, tendința să elibereze particule de titan în suspensia lipidică care trebuie îndepărtate prin centrifugare înainte de folosire. Din aceste motive, sonicatoarele cu baie sunt aparatele cel mai înțelept de folosit pentru obținerea de SUV. Sonicarea unei dispersii LMV se realizează prin plasarea unui tub test conținând suspensia într-un sonicator tip baie (sau plasând al tip de sonicator în tubul test) și sonicând pentru 5-10 minute peste temperatura Tc a lipidului.

Suspensia lipidică ar trebui să se limpezească conducând la o soluție ușor opalescentă. Opalescența se datorează împrăștierii luminii induse de particulele mari reziduale rămase în suspensie. Mărimea principală și distribuția sunt influențate de compoziție și concentrație, temperatură, timp de sonicare și putere, volum și frecvența sonicatorului. Cum sunt aproape imposibil de reprodus condițiile sonicării, variații de dimensiuni între loturi diferite nu sunt neobișnuite. De asemenea, datorită gradului înalt de curbare al acestor membrane, SUV sunt instabile prin naștere și și vor fuziona spontan pentru a forma vezicule mai mari daca sunt depozitate sub temperatura lor de tranziție de fază.

Fig. 7 – Ultrasonicator

ii. Extruzia: Extruzia lipidelor este o tehnică în care o suspensie lipidică este forțată să treacă printr-un filtru policarbonat cu dimensiuni definite ale porilor pentru a obține particule cu un diametru apropiat de dimensiunea porilor filtrului utilizat. Înainte de extruzia prin filtrul cu mărimea finală a porilor, suspensiile LMV sunt dezagregate fie prin câteva cicluri de înghețare – dezghețare, fie prin prefiltrarea suspensiei printr-un filtru cu marime mai mare a porilor (de obicei 0,2-1 μm). Această metodă ajută la prevenirea vicierii membranelor și îmbunătățește omogenitatea distribuției mărimilor particulelor a suspensiei finale. Ca toate procedurile de micșorare a dispersiilor LMV, extruzia ar trebui făcută la o temperatură peste Tc a lipidului. Încercările de extruzie sub Tc nu vor avea succes deoarece membrana are tendința de a forma membrane rigide care nu pot trece prin pori. Extruzia prin filtre cu pori de 100 nm duce de obicei la vezicule mari, unilamelare (LUV) cu un diametru general de 120-140 nm. Dimensiunea generală a particulelor depinde de asemenea de compoziția lipidică și este destul de reproductibilă de la lot la lot.

Fig. 8 – Graficul extruziei lipozomilor prin filtru cu pori de 100 nm

II.3. Mecanismul de încorporare a medicamentelor în lipozomi

Doi parametri se folosesc pentru a descrie încapsularea componentelor/ medicamentelor solubile în apă în interiorul compartimentelor apoase ale lipozomilor. Volumul intern capturat este volumul închis de o cantitate dată de lipid. Este exprimat în μL/μmol sau μL/mg de lipid. Eficiența încapsulării sau înglobării descrie procentul de fază apoasă (și procentul de medicament solubil în apă) care este capturat în momentul preparării lipozomilor. Este exprimat ca procent % de soluție apoasă originală care a fost prinsă în interiorul lipozomilor sau % din materialele totale care au fost înglobate sau % material înglobat/ mg de lipid.

Volumul intern și eficiența încapsulării depind de conținutul lipozomal, concentrația lipidului, metoda de preparare și tipul de lipozomi. De observat că la compușii hidrofobi, eficiența încapsulării este de obivei mai ridicată, indiferent de tipul și alcătuirea lipozomilor.

Pentru a înțelege performanțele caracteristice ale sistemelor lipozomale, este important să se înțeleagă mecanismul de introducere a medicamentelor în lipozomi. Acest lucru se realizează prin trei mecanisme principale: încapsulare, partiționare și inversarea încărcării.

Încapsulare:

Proprietățile fizico-chimice ale medicamentelor în sine, în special solubilitatea și coeficientul de partiție, sunt determinanți importanți ai gradului lor de integrare în lipozomi. Este utilă pentru medicamentele solubile în apă (doxorubicină, penicilina G), încapsularea fiind hidratarea simplă a unui lipid cu o soluție apoasă de medicament. Formarea lipozomilor prinde în capcană pasiv medicamentele dizolvate în spațiile interlamelare, încapsulând în esență un volum mic.

Fig. 9 – Moduri de încorporare a medicamentelor în lipozomi

2. Partiționare:

Substanțele medicamentoase care sunt solubile în solvenți organici (ex. ciclosporina) vor trece printr-un proces de partiționare. Se dizolvă, împreună cu fosfolipidele, într-un solvent organic potrivit. Această combinație este uscată mai întâi, după care se adaugă direct în faza apoasă și reziduurile de solvenți se elimină sub vid. Lanțurile acil ale fosfolipidelor asigură un mediu solubilizant pentru molecula de medicament. Aceasta va fi situată în spațiul din interiorul bistratului.

3. Inversarea încărcării:

Mecanismul de încărcare inversă se folosește pentru anumite medicamente (5-fluorouracil, mercaptopurină), care pot exista în ambele forme încărcată și neîncărcată în funcție de pH-ul mediului. Acest tip de medicament poate fi adăugat la o fază apoasă în stare neîncărcată și pătrunde în lipozomi prin bistraturile lor lipidice. Apoi, pH-ul intern al lipozomilor este ajustat pentru a crea o încărcare pe moleculele de medicament. Odată încărcate, moleculele de medicament nu mai sunt suficient de lipofile pentru a trece prin stratul dublu lipidic și a reveni la mediul extern.

Metodele enumerate mai sus sunt cele mai folosite, dar ele au variante sau există și alte metode în funcție de tipul de lipozomi pe care dorim să îi obținem. Astfel:

II.4. Metode de obținere în funcție de tipul lipozomilor

A) Lipozomii multilamelari (MLV)

(i) Metoda de hidratare a lipidului

(a) Este metoda cea mai des folosită pentru prepararea MLV. Metoda implică uscarea unei soluții de lipide cu formarea unui film subțire la fundul flaconului cu fund rotund și apoi hidratarea filmului prin adăugare de soluție apoasă tampon și vortexarea filmului din când în când. Hidratarea se face la o temperatură superioară temperaturii de tranziție gel – lichid Tc a lipidului sau temperaturii Tc a componentei cu cel mai înalt punct de topire din amestec. Componentele de încapsulat sunt adăugate fie cu tamponul apos sau cu solventul organic care conține lipidul în funcție de solubilitatea acestuia. MLV se prepară ușor prin această metodă și se pot încorpora în acești lipozomi o varietate de substanțe. Dezavantajele metodei sunt volumul intern mic, eficiența scăzută de încapsulare și distribuția heterogenă a mărimilor.

(b) MLV cu eficiențe înalte de încapsulare pot fi preparați prin hidratarea lipidelor în prezența unui solvent organic nemiscibil (eter de petrol, dietileter). Conținutul este emulsifiat prin vortexare viguroasă sau sonicare. Solventul organic este îndepărtat prin trecerea unui curent de azot gazos prin amestec. MLV se formează imediat în fază apoasă după îndepărtarea solventului organic. Principalul dezavantaj al acestei metode este expunerea materialelor care trebuie încapsulate la solventul organic și sonicare.

(ii) Metoda cu sferule de solvent

Procesul implică dispersarea în fază apoasă a unor sferule mici de solvent volatil hidrofob în care în prealabil au fost dizolvate lipidele. MLV se formează la evaporarea controlată a solventului pe baie de apă.

B) Lipozomii mici unilamelari (SUV)

(i) Metoda sanitară

În această metodă, MLV sunt sonicați cu un sonicator tip baie sau tip sondă înr-o atmosferă inertă. Principalele dezavantaje sunt volumele și eficiențele foarte mici de încapsulare, posibila degradare a fosfolipidelor și componentelor care urmează să fie încapsulate, excluderea moleculelor mari, contaminarea cu metale de la tipul sondă și prezența MLV împreună cu SUV.

(ii) Metoda franceză de presiune celulară

Metoda implică extruderea MLV la 20,000 psi și 4°C printr-un mic orificiu. Metoda are câteva avantaje față de metoda cu sonicare. Metoda e simplă, rapidă, reproductibilă și implică mânuire delicată a materialelor instabile. Lipozomii rezultați sunt uneori mai mari decât cei obținuți prin sonicare. Dezavantajele metodei sunt faptul că temperatura este dificil de atins și volumele de lucru sunt relativ mici (cam 50 mL maxim).

(iii) O nouă metodă penru prepararea SUV a fost dată de Lasic și colaboratorii.

Ei au depozitat fosfatidilcolină din ou amestecată cu 1,5% m/V de bromură de cetil tetrametilamoniu (un detergent) CHCl3/CH3OH pe suporturi diferite precum pudră de silicagel, zeolit X, zeolit ZSM5. După îndepărtarea fazei organice, sistemul a fost resuspendat prin agitare sau scuturare în apă distilată sau soluție NaCl 5 mM. Au existat pierderi de fosfolipide (cam 10-20%) datorită absorbției pe suport. Pierderea a fost de 70% și 95 % în cazul folosirii de silicagel, respectiv zeolit ZSMS. Când s-a folosit zeolitul X (cu dimensiunea particulelor de 0,4 mm), s-a obținut o populație omogenă de vezicule cu diametrul mediu de 21,5 nm.

C) Lipozomi mari unilamelari (LUV)

Aceștia au volum intern/ eficiență de încapsulare ridicate i sunt folosiți în prezent pentru încapsularea medicamentelor și macromoleculelor.

(i) Metode cu injecție de solvent

(a) Metoda de infuzie cu eter

O soluție de lipide dizolvate în ietileter sau amestec eter/ metanol este injectată încet într-o soluție apoasă a materialului care urmează a fi încapsulat 55-65°C sau sub presiune scăzută. Îndepărtarea eterului sub vid duce la formarea lipozomilor. Principalele dezavantaje ale metodei sunt cel că populația obținută este heterogenă (70-190 nm) și expunerea componentelor de încapsulat la solvenți organici sau temperatură ridicată.

(b) Metoda de injecție cu etanol

O soluție lipidică în etanol este injectată rapid într-un volum mare și în exces de tampon. LUV se formează imediat. Dezavantajele metodei sunt faptul că populația este heterogenă (30-110 nm), lipozomii sunt foarte diluați, este dificilă îndepărtarea totală a etanolului deoarece formează un amestec azeotrop cu apa și posibilitatea ca diverse macromolecule active biologic să se inactiveze în prezența unor cantități chiar și scăzute de etanol.

(ii) Metode de îndepărtarea a detergentului

Detergenții la concentrațiile lor micelare critice au fost folosiți să solubilizeze lipidele. Pe măsură ce detergentul este îndepărtat, micelele devin progresiv mai bogate în fosfolipide și în final se combină formând LUV. Detergenții se îndepărtează prin dializă. Avantajele metodei de dializă a detergenților sunt reproductibilitatea excelentă și producerea unor populații de lipozomi omogeni ca dimensiuni. Principalul dezavantaj al metodei este retenția de urme de detergent în interiorul lipozomilor. Alte tehnici folosite pentru îndepărtarea detergenților: folosirea gel-cromatografiei pe coloană de Sephadex G-25, prin adsorbția sau legarea de Triton X 100 (un detergent) la Bio-granule SM-2 sau legarea de octil-glucozid (un detergent) la granule Amberlite XAD-2.

(iii) Metoda de evaporare a fazei reziduale

Mai întâi, se formează o emulsie apă în ulei prin sonicarea scurtă a unui sistem bifazic conținând fosfolipide în solvent organic (dietileter sau izopropileter sau un amestec de izopropileter și cloroform) și soluție tampob apoasă. Solvenșii organici sunt îndepărtați la presiune redusă, rezultând formarea unui gel vâscos. Lipozomii se formează când este îndepărtat continuu solventul rezidual la rotavapor sub presiune scăzută. Cu această metodă, o eficiență a încapsulării de 5% se poate obține într-un mediu cu tărie ionică scăzută, de exemplu NaCl 0,01 M. Metoda este folosită pentru încapsularea moleculelor mici, mari și macromolecule. Principalul dezavantaj este expunerea materialelor de încapsulat la solvenți organici și scurte perioade de sonicare, condiții care pot denatura unele proteine și pot produce rupturi ale lanțurilor de ADN. Prin această metodă rezultă populații de vezicule heterogene ca mărime.

(iv) Metoda fuzionării indusă de calciu

Metoda este folosită pentru prepararea LUV din acizi fosfolipidici. Procedura are la bază observația că adiția calciului la SUV induce fuziune și duce la formarea structurilor multilamelare în configurație spiroidă. Adăugarea de EDTA la aceste preparate conduce la formarea LUV. Principalul avantaj al metodei este cel că macromoleculele pot fi încapsulate în condiții blânde. Lipozomii rezultați sunt în principal unilamelari, deși de o scală heterogenă a dimensiunilor. Dezavantajul major al metodei este cel că LUV se pot obține exclusiv din acizi fosfolipidici.

(v) Metoda microfluidizării

Este o tehnică de microfluidizare/ microemulsifiere/ omogenizare pentru producerea pe scară largă a lipozomilor. Reducerea domeniului de mărimi se poate obține prin recircularea probei. Procesul este reproductibil și duce la lipozomi cu încapsulare bună a fazei apoase. Primii lipozomi preparați prin această metodă au fost alcătuiți din gălbenuș de ou, colesterol și sare disodică de fosfatidilcolină din creier (57:33:10). Din această compoziție s-au preparat întâi MLV, care au fost trecuți printr-un dispozitiv (Microluidiser) la o presiune de 40 psi. După 25 de recirculări, dimensiunile obținute au fost de 150-160 nm. În aparat, interacția curenților fluizi are loc la presiuni înalte în microcanale definite precis prezente în camera de interacțiune. În cameră, presiunea atinge și 10000 psi, ceea ce poate cauza degradarea lipidelor

(vi) Extruderea sub curent de azot prin filtre policarbonate

LUV se pot prepara prin trecerea MLV sub curent de azot prin filtre membranare policarbonate. Veziculele produse au o distribuție a mărimilor în formă de săgeată. Extruderea se face la presiuni moderate (100-250 psi). Este necesar un suport special de filtru. Asemenea dispozitive sunt cunoscute comercial sub denumirea de LUVET sau EXTRUDER și au un mecanism de recirculare care permite multiple extruderi cu dificultate minimă.

(vii) Lasic și colaboratorii au raportat o metodă simplă pentru formarea instantanee a unui preparat de LUV destul de omogen. Formarea lipozomilor multilamelari este prevenită prin introducerea unei suprafețe încărcate pozitiv pe bistrat, iar dimensiunea veziculelor este controlată prin topologia suprafeței suportului pe care se formează filmul de fosfolipid. Ei au depozitat 0,5-1 mg de lecitină din gălbenuș de ou dopată cu 3 ml CHCl3/CH3OH pe o cupă special gravată din silicon, care a fost plasată pe fundul unui flacon Erlenmeyer. După uscare peste noapte la cca 1 Pa presiune, filmul a fost resuspendat prin agitare ușoară în 1-2 mL de apă. Contaminarea cu lipozomi de alte structuri precum MLV, vezicule gigantice sau paticule fosfolipidice a fost controlată prin microscopie video de contrast îmbunătățită.

(viii) Metoda înghețare-dezghețare

SUV sunt congelați rapid și dezhețați încet. Sonicarea scurtă dispersează materialele agregate la LUV. Formarea veziculelor unilamelare se datorează fuzionării SUV în timpul proceselor de înhețare și dezghețare. Acest tip de fuziune este puternic inhibată de tăria ionică a mediului și de creșterea concentrației fosfolipidice. Se obțin eficiențe ale încapsulării de 20-30 %.

(D) Lipozomii gigant

(i) Procedura pentru obținerea lipozomilor gigant implică dializa unei soluții metanolice de fosfatidilcolină în prezența detergentului metilglucozidă într-o soluție apoasă conținând NaCl 1 M. Lipozomii au diametre între 10 și 100 mm.

(ii)O metodă pentru obținerea lipozomilor giganți unilamelari cu dimensiuni între 10-20 pm este îndepărtarea sub dializă a tricloroacetatului de sodiu.

(E) Lipozomii multiveziculari

(i) O metodă este convertirea unei emulsii apă în ulei la sferule de solvent organic prin adăugarea emulsiei peste soluție. Evaporarea solventulu organic duce la formarea de lipozomi multiveziculari cu diametrul între 5,6-29 pm. Materialele care pot fi încapsulate includ glucoză, EDTA, ADN uman. Acești lipozomi au o eficiență foarte mare a încapsulării (până la 89%).

(ii) Dacă preparatele MLV sunt supuse la cinci cicluri de înghețare cu azot lichid – decongelare, urmate de dezghețarea în apă caldă, se obțin lipozomi multiveziculari cu o eficiență a încapsulării de până la 88%.

(F) Lipozomi asimetrici

Distribuția fosfolipidelor în membranele naturale este asimetrică, de exemplu fosfatidilcolina și sfingomielina se concentrează la jumătatea exterioară a bistratului lipidic, în timp ce fosfatidiletanolamina, fosfatidilinozitolul și fosfatidilserina sunt în principal localizate în jumătatea interioară a bistratului. Datorită acestui fapt, au fost făcute încercări de preparare a LUV în care distribuția lipidică pe cele două suprafețe ale bistratului să fie diferită. Lipozomii asimetrici sunt mai apropiați ca model de membranele naturale decât LUV convenționali.

(i) O metodă pentru prepararea lipozomilor asimetrici care conțin sulfat de cerebrozid exclusiv pe suprafața externă a bistratului lipidic: sulfatul de cerebrozid a fost adsorbit pe un suport din hârtie de filtru (celulozică) și apoi suportul a fost incubat cu lipozomi unilamelari SUV sau LUV. După 6 ore, conținutul de sulfatide a crescut cu 6 procente molare din cantitatea totală de fosfolipid, corespunzând cu cca 10 moli% din fosfolipidul prezent în stratul exterior. Sulfatidul nu a putut fi îndepărtat prin spălare cu soluție NaCl 1M sau uree 1M.

(ii) S-a raportat formarea de vezicule fosfolipidice asimetrice care conțineau un fosfolipid fluorescent fie în stratul exterior, fie interior al bistratului lipidic. Procedura se bazează pe observația că analogii lipidelor suferă un transfer rapid între populațiile de vezicule.

(iii) O altă metodă este conversia enzimatică a unui analog lipidic fluorescent al fosfatidilserinei (NBD-PS) în stratul exterior al LUV la NBD-fosfobietanolamină (NBD-PE).

(iv) Schimburile lipide-proteine pot fi eficace în îndepărtarea fosfatidilinozitolului de la suprafața exterioară a lipozomilor unilamelari. Deci, aceste proteine ar putea fi folosite la prepararea lipozomilor asimetrici.

(v) În SUV, distribuția lipidelor nu este simetrică și raportul lipidelor din stratul exterior la lipidele din stratul interior ar putea fi chiar de 2:1. Deci, SUV pot fi de asemenea considerați asimetrici prin extensie.

II.5. Producerea industrială a lipozomilor

Principalele probleme cu care se confruntă formulatorii și supervizorii producției sunt prezența reziduurilor de solvenți organici, stabilitatea fizică și chimică, controlul pirogenității, sterilitatea, dimensiunile și distribuția mărimilor și reproductibilitatea de la lot la lot.

Pentru livrarea medicamentelor, lipozomii pot fi formulați ca o suspensie, ca un aerosol sau într-o formă semisolidă, cum ar fi un gel, cremă sau loțiune, sub formă de pulbere uscată veziculară (prolipozomi) pentru reconstituire sau pot fi administrate pe cale orală, topic și parenteral.

Lipozomii pentru uz parenteral trebuie sa fie sterili și lipsiți de pirogeni. Pentru experimentele pe animale, o sterilitate adecvată poate fi obținută prin trecerea lipozomilor printr-o membrană filtranta Millipore cu dimensiunea porilor de cca 400 nm. Pentru uzul uman, precauțiile pentru sterilitate trebuie luate pe parcursul întregului proces de preparare, adică:

materialele de lucru trebuie să fie sterile și lipsite de pirogeni

prepararea în sistem steril: zonele de lucru trebuie să fie echipate cu hote în flux laminar

folosirea de containere sterile.

Unele chestiuni legate de fosfolipide necesită atenție. Lipozomii bazați pe fosfolipidele din gălbenușul crud de ou nu sunt foarte stabili. Costul lipidelor purificate este foarte ridicat. Mai nou, au fost preparați lipozomi folosind lipide sintetice și polimerizabile. Lipozomii preparați din lipide polimerizabile sunt expuși la lumină UV. Procesul de polimerizare are loc în bistrat. Unele preparate lipozomale au în mod uzual stabilitate mai mare de depozitare.

(i) Dializa cu detergenți

Avantajele metodei de dializă a detergenților sunt reproductibilitatea excelentă și producerea de populații de lipozomi omogene ca dimensiuni. Principalul dezavantaj este retenția urmelor de detergenți în interiorul lipozomilor.

O instalație pilot denumită LIPOPREPR II-CIS este disponibilă în Diachema, Elveția. Capacitatea de producție la concentrații lipidice ridicate (80 mg/ml) este de 30 ml lipozomi/ minut.

Dar când concentrația lipidică este de 10-20 mg/ml, 100 mg/ml până la mai mulți litri de lipozomi pot fi produși. În SUA, LIPOPREPR este comercializată de compania Dianorm-Geraete.

(ii) Microfluidizarea

O metodă bazată pe microfluidizare/ microemulsificare/ omogenizare a fost dezvoltată pentru prepararea lipozomilor. MICROFLUIDIZERR este disponibil de la compania Microludics Corporation, Massachusetts, SUA. O instalație bazată pe această tehnologie poate produce cca 20 galoane/ minut de lipozomi cu dimensiuni de 50-200 nm. Se poate ajunge la un randament al încapsulării de 75%.

(iii) Dispersiile apoase de lipozomi au adesea tendința de agregare și fuzionare și sunt susceptibile de hidroliză și/ sau oxidare. Au fost propuse două soluții în acest sens:

(iiia) Prolipozomi

În prolipozomi, lipidul și medicamentul sunt îmbrăcate într-un purtător solubil , formând un material granular care prin hidratare formează o suspensie lipozomală izotonică. Această abordare poate oferi o oportunitate de fabricare pe scară largă a lipozomilor conținând medicamente lipofile particulare.

(iiib) Liofilizare

Înghețarea-uscarea (liofilizarea) implică îndepărtarea apei din produse în stare congelată la presiuni extrem de scăzute. Procesul este în general folosit pentru uscarea produselor termolabile și care ar fi distruse prin uscarea la căldură. Tehnica are un mare potențial ca metodă penru rezolvarea problemelor de stabilitate în timp lung cu referire la stabilitatea lipozomilor. În timpul procesului de congelare și uscare și recontituirii pot avea loc scurgeri de materiale înglobate. Recent, s-a constatat că liofilizarea lipozomilor în prezența unor cantități adecvate de trehaloză (un carbohidrat care se găsește în mari concentrații în organism) reține aproape 100% din conținutul original. Trehaloza este un excelent crioprotector pentru lipozomi. Echipamente de liofilizare pe scale de la mici laboratoare până la unități industriale mari sunt disponibile pe piața farmaceutică.

III. STABILITATEA LIPOZOMILOR

Stabilitatea lipozomilor este o chestiune complexă. Există trei tipuri de stabilitate a lipozomilor:

1) Stabilitate fizică;

2) Stabilitate chimică;

3) Stabilitate biologică.

Stabilitatea fizică indică constanța dimensiunilor și raporului lipidelor la componenta activă precum medicamente, molecule ADN etc. Lipozomii cationici pot fi stabili la 4˚C (frigider) pentru o perioadă îndelungată de timp dacă sunt sterilizați corespunzător.

Instabilitatea chimică se referă în principal la hidroliza și oxidarea lipidelor. Hidroliza detașează lanțurile hidrofobice de legăturile esterice. Oxidarea este mai probabil datorată prezenței lanțurilor nesaturate. Adăugarea de antioxidanți formulei lipozomale poate proteja în general lipidele de oxidare.

Stabilitatea biologică a lipozomilor este limitată. Lipozomii cationici în plasmă sunt dispuși agregării și scurgerilor. Lipoproteinele de înaltă densitate (HDL) sunt responsabile de destabilizarea lipozomilor datorită interacției acestora cu celule fagocitare circulante precum monocitele. Destabilizarea lipozomilor se datorează schimburilor de lipide între lipozomi și HDL.

Aplicarea industrială a lipozomilor (ex. comercializarea formulărilor de medicamente lipozomale) cere studii extensive de stabilitate pe raft. Expirarea perioadei de valabilitate a unui produs medicamentos este definită ca fiind timpul la care media caracteristicilor medicamentului (ex. potența) rămâne la niște specificații aprobate după fabricație.

Sunt mai multe modalități de a crește stabilitatea chimică și fizică a lipozomilor:

1. O cale este de a evita folosirea fosfolipidelor nesaturate, care formează obiectul proceselor de peroxidare. Totuși, acest lucru nu este întotdeauna posibil și folosirea lipidelor nesaturate poate fi necesară unor formulări de lipozomi. Dacă sunt folosite lipide nesaturate, atunci este important să se procedeze în următoarele feluri:
* Să se mențină un mediu lipsit de oxigen în timpul procesului de fabricație și depozitării;

* Să se adauge tocoferoli sau alți antioxidanți activi de membrane;
* Să se limiteze expunerea la lumină în timpul procesului de fabricație și depozitării.

2. Depozitarea lipozomilor la 4˚C.

3. Niciodată nu se congelează lipozomii.

4. Menținerea cu ajutorul soluțiilor tampon a pH-ului lipozomilor 6-6.5 în timpul fabricării și depozitării pentru a evita hidroliza catalitică atât acidă cât și bazică.

5. Majoritatea tampoanelor sporesc hidroliza, trebuie asigurată concentrația minimă de tampon suficientă pentru menținerea pH.

6. Adăugarea de acid etilendiaminotetraacetic (EDTA) care să asigure absența cationilor multivalenți. Prezența acestora poate cauza agregări și destabilizări ale bistratului.

7. Controlul temperaturii sau alegerea de lipide astfel încât sa nu se întâmple tranziții de fază lipidice în timpul depozitării.

8. Monitorizarea stadiului de agregare al lipozomilor și ajustarea fazei apoase sau compoziției lipidice corespunzător.

9. Evitarea folosirii compozițiilor lipidice care fuzionează spontan sau își sporesc activitatea fuzională după acumularea de produși de hidroliză

10. Încorporarea de colesterol în lipozomi poate reduce efectele destabilizatoare ale produșilor de hidroliză.

Prezența colesterolului exercită o profundă influență a proprietăților bistratului lipidic al lipozomilor. Se știe că adăugarea de colesterol la un bistrat în fază fluidă, în principal din lipide nesaturate, scade permeabilitatea lui la apă. Un lipozom alcătuit 100% din lipide nesaturate în fază fluidă nu poate menține conținutul încapsulat și medicamentele încapsulate solubile în apă vor ieși în timp, fenomen pentru prevenirea căruia este necesară adăugarea de colesterol. Moleculele de colesterol umplu spațiile libere care se formează în lanțurile de lipide nesaturate și scad flexibilitatea lanțurilor lipidice înconjurătoare. Această interacție crește de asemenea rigiditatea mecanică a bistratului fluid și scade difuzia laterală a acestuia. În opoziție, adăugarea de colesterol la bistraturi în fază de gel, alcătuite în principal din lipide saturate, întrerupe împachetările locale și crește coeficientul de difuzie. Lipozomii alcătuiți 100% din lipide saturate sunt rezistenți la scurgeri în absența colesterolului. Unul din motivele principale de adăugare a colesterolului la lipozomii formați din lipide saturate este scăderea temperaturii de tranziție de fază.

Efectul temperaturii de tranziție de fază la formularea lipozomilor

Proprietățile fizico-chimice ale lipozomilor depind de mulți factori precum tăria ionică, pH și temperatură. Lipozomii obișnuiți au permeabilitate slabă pentru moleculele încapsulate, dacă molecula nu este permeabilă prin membrană. Permeabilitatea membranei se schimbă cu temperatura. Una din cele mai importante proprietăți a bistratului lipidic este relativa fluiditate și mobilitatea individuală a fiecărei molecule de lipid în interiorul bistratului. Mobilitatea lipidelor se schimbă cu temperatura. La o temperatură dată un bistrat lipidic poate exista în fază solidă (gel) sau lichidă. În ambele faze moleculele lipidice sunt constrânse la cele două planuri dimensionale ale membranei, dar în fază lichidă moleculele lipidice pot difuza mult mai ușor în cadrul planului. La o temperatură dată, o moleculă lipidică își va schimba poziția cu moleculele lipidice vecine de milioane de ori pe secundă, iar procesul este total întâmplător.

Temperatura de tranziție de fază a bistraturilor de fosfolipide și lipide depinde de următorii factori:

1) Lungimea lanțului acil în lipid

2) Gradul de saturare al lanțului hidrocarbonat în lipid

3) Tăria ionică a mediului de suspensie

4) Tipul grupării capului polar

Comportarea de fază a bistratului lipidic este determinată de interacțiile Van der Waals între moleculele adiacente de lipid, interacții guvernate în principal de doi factori:

Lungimea lanțului acil în lipid

Împachetarea lipidelor în bistrat

Lipidele cu cozi mai lungi au mai multă suprafață de interacție, ceea ce va crește tăria interacței și va scădea consecvent mobilitatea lipidului. De aceea la o temperatură dată un lipid cu coadă scurtă va fi mai fluid decât un lipid identic cu coadă lungă.

Gradul de nesaturare al cozilor lipidice poate influența împachetarea lipidelor în bistrat. O dublă legătură nesaturată poate produce o deformare a lanțului alcanic, care va crea spațiu liber în plus între bistraturi, ceea ce va permite o mai mare flexibilitate a lanțurilor adiacente. Lipidele nesaturate au o temperatură de tranziție de fază semnificativ mai scăzută comparativ cu lipidele saturate.

Lipozomii formați exclusiv din fosfolipide (în absența colesterolului) nu se vor forma la temperaturi mai scăzute decât temperatura de tranziție de fază a fosfolipidului. Dacă molecula încapsulată este sensibilă la temperatură (ex. o proteină), nu pot fi folosite lipide pure cu lanțuri saturate lungi deoarece acestea trebuie încălzite la temperaturi înalte pe care proteinele nu le tolerează.

Majoritatea bistraturilor lipidice nu sunt alcătuite dintr-un singur tip de lipid. În natură, membranele lipidice sunt de obicei un amestec complex de diverse molecule lipidice. Dacă unele lipide din amestec sunt lichide la o anumită temperatură, în timp ce altele sunt în faza de gel, atunci cele două faze vor exista în populații separate spațial. Acest fenomen se numește "separare de fază".

IV. LIPOZOMII ÎN INDUSTRIA FARMACEUTICĂ

IV.1. Clasificarea lipozomilor

Sistemul lipozomal are un avantaj major față de sistemele transportoare coloidale concurente: permit posibilități aproape infinite de alterare a structurii și caracteristicilor fizico-chimice. Această flexibilitate permite responsablului de formulare să modifice comportamentul lipozomilor in vivo și să adapteze formulările lipozomale la nevoile specifice. Din punctul de vedere al posibilelor versiuni pe bază de lipozomi, se disting patru tipuri majore pe baza compoziției și aplicațiilor in vivo.

Lipozomii conventionali: Pot fi definiți ca lipozomi care sunt compuși doar din fosfolipide (neutre și/ sau încărcate negativ) și/ sau colesterol. Primele cercetări ale lipozomilor ca sisteme transportatoare de medicamente s-au bazat pe acest tip de lipozomi. Lipozomii convenționali sunt o familie de structuri veziculare bazate pe bistraturi lipidice înconjurând compartimente apoase. Pot varia foarte mult în ce privește proprietățile fizicochimice precum dimensiunile, compoziția lipidică, încărcarea suprafeței și numărul și fluiditatea bistraturilor lipidice. Deși manipularea acestor proprietăți este o unealtă valoroasă pentru a modifica, până la un punst, comportamentul in vivo al lipozomilor convenționali (ex. stabilitate, claritate și distribuție), unele trăsături comportamentale in vivo sunt foarte consecvente printre diferite formulări de lipozomi convenționali. Lipozomii convenționali sunt caracterizați printr-un timp de circulație relativ scurt. Administrati in vivo printr-o varietate de căi parenterale (adesea prin administrare intravenoasă), ei dau dovadă de o tendință puternică de a se acumula rapid în celulele fagocitare ale sistemului fagocitar mononuclear (MPS), denumit adesea sistem reticuloendotelial (RES). Organele majore de acumulare sunt ficatul și splina, la ambele în termeni de acumulare totală și acumulare per gram de țesut. Abundența macrofagelor MPS și aprovizionarea bogată cu sânge sunt motivele principale pentru preponderența lipozomilor în ficat și splină. O traducere terapeutică directă a acestei comportări de distribuție direcționată către MPS este aceea că lipozomii convenționali ar putea fi candidați atrăgători pentru livrarea medicamentelor către macrofagele MPS. Există multe exemple de aplicații cu succes a lipozomilor convenționali pentru livrarea agenților antimicrobieni la macrofagele MPS. O altă aplicație interesantă a țintirii macrofagelor implică livrarea imunomodulatorilor pentru a crește capacitatea macrofagelor de a ucide celulele neoplastice și de a crește rezistența împotriva microorganismelor infecțioase.

Lipozomii convenționali au fost de asemenea folosiți pentru livrarea de antigeni. Vaccinurile bazate pe lipozomi s-au dovedit eficiente în modelele experimentale împotriva infecțiilor virale, bacteriene și parazitologice, ca și împotriva tumorilor. Câteva vaccinuri lipozomale au fost testate pe oameni, și unul dintre acestea, vaccinul lipozomal pentru hepatita A, a primit aprobare de scoatere pe piață în Elveția.

Lipozomii cu circulație îndelungată: Dezvoltarea acestora reprezintă o piatră de hotar în cercetarea sistemelor de livrare a medicamentelor lipozomale. În ciuda aplicațiilor valoroase explicate mai sus pentru lipozomii convenționali, eliminarea rapidă și eficientă a acestora din circulație prin macrofagele din ficat și splină a compromis serios aplicabilitatea acestora pentru tratamentul unei serii largi de afecțiuni implicând alte țesuturi. Apariția unor noi formule de lipozomi care pot persista pentru perioade prelungite de timp în circulația sanguină a condus la o reînviere a interesului pentru sistemele de livrare a medicamentelor pe bază de lipozomi la sfârșitul anilor 1980. De fapt, lipozomii cu circulație îndelungată au deschis o cascadă de noi oportunități terapeutice care până atunci păreau nerealizabile datorită eficientei preluări MPS a lipozomilor convenționali. Poate cea mai importantă caracteristică cheie a lipozomilor cu circulație îndelungată este faptul că sunt capabili să extravazeze până la părți ale corpului unde permeabilitatea peretelui vascular este crescută. Din fericire, regiunile cu permeabilitate capilară crescută includ zonele patologice cum sunt tumorile solide și locurile infecțiilor și inflamațiilor. Este reprezentant pentru importanța conceptului de circulație îndelungată că singurele două produse anticancer lipozomale aprobate pentru uz uman se bazează pe folosirea acestor lipozomi pentru livrare selectivă la locul tumorii a medicamentelor antitumorale (Doxil, DaunoXome). În prezent, cel mai popular mod de a produce lipozomi cu circulație îndelungată este atașarea covalentă a polimerului hidrofil polietilenglicol (PEG) la suprafața exterioară. Asemenea lipozomi cu cozi PEG se mai ‘stealth’ sau lipozomi ‘stabilizați steric’, primul termen referindu-se la capacitatea lor de a scăpa de MPS, ultimul termen la mecanismul de stabilizare sterică responsabil pentru inducerea timpului îndelungat de circulație (timpul de înjumătățire la oameni este de cca 48 h). Stabilizarea sterică rezultă din concentrația locală la suprafață de grupări PEG înalt hidratate care creează o barieră sterică împotriva interacțiilor cu componentele moleculare și celulare din mediul biologic.

Fig. – Cinetica circulației sanguine a lipozomilor convenționali și a celor cu circulație îndelungată (PEG-ilați) după administrare intravenoasă la șobolani. 67Ga-DF a fost folosit pentru urmărirea sorții lipozomilor la șobolani. Agentul compexant al metalului desferal (DF) a fost necesar pentru a obține retenția 67Ga în lipozomi. Pentru comparație, este arătată eliminarea rapidă a compusului liber (67Ga-DF).

Imunolipozomii au anticorpi specifici sau fragmente de anticorpi (ca Fab9 sau anticorpi cu un singur lanț) pe suprafață pentru a îmbunătăți legarea de locul țintă. Deși sistemele imunolipozomale au fost investigate pentru diverse aplicații terapeutice, concentrarea primară a fost livrarea țintită a agenților antitumorali. Ca pentru orice altă particulă din fluxul sanguin, este dificil pentru imunolipozomi să părăsească compartimentele sanguine la alte locuri decât ficatul sau splina. De aceea, pentru a garanta accesibilitatea la receptorii țintă, a fost de interes administrarea locală în cavitățile corpului. Încercări de succes au fost făcute pentru a prelungi timpul de înjumătățire al lipozomilor după admisnistrare intravenoasă prin îmbrăcarea cu PEG, aceasta conferindu-le o șansă mai mare să atingo locuri-țintă altele decât macrofagele MPS.

Fig. – Imagine captată prin microscopie electronică care arată legarea specifică a imunolipozomilor la țintă, o celulă canceroasă ovariană umană prezentă în cavitatea peritoneală a unui șoarece. Imunolipozomii expun fragmentele Fab ale anticorpului monoclonal murinic OV-TL3 împotriva unui loc antigenic de pe suprafața celulei canceroase. Imunolipozomii au fost adminisrați intraperitoneal.

Fig. – Imobilizarea anticorpilor pe lipozomi PEG prin (a) cuplare directă la suprafața lipozomului (care poate provoca împiedicare sterică la legarea antigenului) și (b) cuplarea la capetele terminale ale lanțurilor PEG (care nu dă probleme de împiedicae sterică)

Lipozomii cationici reprezintă cel mai tânăr membru al familiei lipozomilor. Aceștia sunt fruntași printre sistemele de livrare în dezvoltare pentru îmbunătățirea livrării materialului genetic. Componentele lor lipidice cationice interacționează cu, și neutralizează , ADN-ul încărcat negativ, condensându-l într-o structură mai compactă. Complexele rezultate ADN-lipid, mai degrabă decât ADN încapsulat în lipozomi, asigură protecție și încurajează internalizarea celulară și expresia plasmidului conținut.

Fig. – Reprezentarea schematică a patru tipuri de lipozomi majore.

Lipozomii convenționali sunt neutri sau încărcați negativ.

Lipozomii stabilizați steric (Stealth) poartă învelișuri de polimeri pentru a prelungi timpul de circulație.

Imunolipozomii (cu țintire la anticorpi) pot fi convenționali sau stabilizați steric.

Pentru lipozomii cationici, sunt arătate câteva moduri de a impune o încărcare pozitivă (interacții mono-, di- sau multivalente)

IV.2. Aspecte farmaceutice

Clasificarea lipozomilor după parametrii structurali:

• MLV, vezicule mari multilamelare – >0.5 μm

• OLV, vezicule oligolamelare – 0.1–1 μm

• UV, vezicule unilamelare (toată scala de dimensiuni)

• SUV, vezicule mici unilamelare – 20–100 nm

• MUV, vezicule medii unilamelare

• LUV, vezicule mari unilamelare – >100 nm

• GUV, vezicule gigant unilamelare >1 μm

• MVV, vezicule multiveziculare (de obicei >1 μm)

Proprietățile mecanice și de suprafață ale lipozomilor pot fi modulate prin selectarea componentelor potrivite ale bistratului. De-a lungul timpului, fosfatidilcolina (PC) a devenit componentul lipidic major al lipozomilor farmaceutici. Rigiditatea si permeabilitatea stratului depinde de tipul și calitatea de PC și lipidele adiționale de substrat folosite. Lanțurile alchil și gradul nesaturării joacă un rol major, de exemplu, un lanț alchil C18 saturat produce bistraturi rigide cu permeabilitate scăzută la temperatura corpului. Prezența colesterolului de asemenea tinde să rigidizeze bistraturile. În funcție de tehnica de producție, lipozomii pot avea diverse caracteristici. Aceste diferențe vor avea impact asupra comportării lor in vivo (dispunere) și in vitro (ex. sterilizare și viață pe raft).

IV.2.Avantajele și dezavantajele folosirii lipozomilor. Administrare.

Pentru a înțelege în ce mod lipozomii pot fi cel mai bine folosiți pentru îmbunătățirea performanței medicamentelor încapsulate, este util de luat în considerare următoarele motive de bază pentru utilizarea lipozomilor ca transportori ai medicamentelor:

Direcție: Lipozomii pot transporta direcționat un medicament la locul de acțiune din organism dorit, acest lucru îmbunătățind eficacitatea lui terapeutică (țintire a medicamentului, livrare la locul specific). De asemenea, lipozomii pot direcționa medicamentele departe de acele părți ale corpului care sunt particular sensibile la acțiunea lor toxică (livrare cu evitarea locului).

Durată: Lipozomii se pot comporta ca un depozit din care componenta încapsulată este eliberată treptat în timp. Un astfel de proces de eliberare susținută poate fi exploatat pentru a menține nivelele terapeutice (dar netoxice) medicamentoase în circulația sanguină sau la locul de administrare pentru perioade prelungite de timp. Astfel, consecințele sunt o durată crescută de acțiune și o scădere a frecvenței administrării.

Protecție: Medicamentele încorporate în lipozomi, în special cele înglobate în interiorul apos, sunt protejate împotriva acțiunii factorilor denaturanți (ex. enzime de degradare) prezente în organismul gazdei. De asemenea, pacientul este protejat de efectele toxice ale medicamentelor.

Internalizare: Lipozomii pot interacționa cu celulele țintă în mai multe feluri și astfel sunt capabili să permită livrarea intracelulară a moleculelor de medicamente care în forma lor liberă (neîncapsulată), nu ar fi putut pătrunde în interiorul celulei datorită caracteristicilor fizico-chimice nefavorabile (ex. molecule de ADN).

Amplificare: Dacă medicamentul este un antigen, lipozomii se pot comporta ca adjuvanți imunologici în formulările de vaccinuri.

Avantajele folosirii lipozomilor

1. Lipozomii sunt biocompatibili, complet biodegradabili, netoxici, flexibili și neimunogeni pentru administrare sistemică și nesistemică.

2. Lipozomii asigură atât un mediu lipofilic cât și un miez apos într-un sistem și deci sunt potriviți penru livrarea agenților și medicamentelor hidrofobe, amfipatice și hidrofile.

3. Lipozomii au abilitatea sa-și protejeze componenta încapsulată de mediul extern și să acționeze ca depozite cu eliberare susținută (Propranolol, Cyclosporin).

4. Lipozomii pot fi formulați ca suspensii, aerosoli sau în formă semisolidă de gel, cremă sau loțiune, ca pudră veziculară uscată (prolipozomi) pentru reconstrucție sau pot fi administrați prin diverse rute de administrare, inclusiv oculară, pulmonară, nazală, orală, intramusculară, subcutanată, topică sau intravenoasă.

5. Lipozomii pot încapsula nu numai molecule mici, dar și macromolecule precum superoxiddismutaza (SOD), hemoglobina, eritropoietina, interleukina 2 și interferonul g.

6. Lipozomii au toxicitate redusă și stabilitate crescută a medicamentului capturat prin (Amphotericin B, Taxol)

7. Lipozomii au o eficacitate crescută și indice terapeutic al medicamentului (Actinomicina-D).

8. Lipozomii ajută la reducerea expunerii țesuturilor sensibile la medicamente toxice.

9. Alterează proprietățile farmacocinetice și farmacodinamice ale medicamentelor (eliminare redusă, timp de circulație ridicat).

10. Flexibilitatea cuplării cu liganzi specifici situsului ca să obțină țintire activă (medicamente anticancer și antimicrobiale).

Probleme întâlnite în dezvoltarea proceselor de convertire a lipozomilor la sisteme purtătoare de medicamente

• Calitate slabă a materiilor prime, fosfolipidele

• Caracterizare slabă a proprietăților fizicochimice ale lipozomilor

• Problema încărcării

• Viață pe raft prea scurtă

• Probleme de fabricație pe scară largă

• Absența datelor despre siguranța acestor transportatori la folosirea cronică.

Materiile prime. Fosfatidilcolina (PC), fosfatidilglicerolul (PG) și fosfatidiletanolamina (PE) din surse naturale sunt folosite adesea ca fosfolipide pentru prepararetele lipozomale parenterale. Aceste fosfolipide au o compoziție dependentă de sursă de lanțuri acil. Compoziția este dependentă chiar și de lot, de exempluapar diferențe considerabile în compoziția de lanțuril acil între PC din ou și PC din soia.

Stocurile de fosfolipide pot conține lizo-fosfolipide, în care un lanț acil este lăsat în poziția C1 a glicerofosfocolinei și celălalt este îndepărtat prin hidroliza esterică în timpul depozitării, de exemplu. Mai mult, poate să apară peroxidarea dacă sunt prezente legături nesaturate în lanțurile acil, ca în cazul PC din ou sau din soia.

În anii 1980 timpurii, calitatea lipidelor varia considerabil în funcție de furnizor, atât în termeni calitativi, cât și cantitativi. În prezent, câțiva furnizori aprovizionează piața globală cu produse de înaltă calitate. Calitatea este asigurată prin scheme de purificare îmbunătățite, introducerea unor tehnici de analiză validate și cunoștințe mai bune privind mecanismele de degradare ale lipidelor, conducând la condiții mai bune pe raft. Interesant, de-a lungul anilor, prețul pe unitate a scăzut considerabil, în timp ce calitatea a crescut.

Teste de control calitativ pentru formulările lipozomale

Proprietățile fizicochimice. Comportarea lipozomilor in vivo și in vitro depinde puternic de mărimea lor, rigiditatea bistratului, sarcină și morfologie (unilamelar, multilamelar, multivezicular). De aceea, o caracterizare completă fizico-chimică este cerută în stadiile timpurii ale cercetării. În stadiile de dezvoltare ulterioare, rezultatele testelor de control pot fi folosite pentru a obține aprobarea pentru produsul lipozomal. O selecție poate fi apoi folosită pentru a asigura consecvența de la lot la lot.

Problema încărcării. După terminarea stadiului de hidratare al procesului de preparare lipozomal, medicamentul neasociat cu lipozomul este îndepărtat. Medicamentele polare și medicamentele care nu au o sarcină electrică opusă bistratului (de obicei încărcat negativ) prezintă o încapsulare slabă după hidratarea lipidului, este o problemă a încărcării. Au fost dezvoltate strategii active care au crescut eficiența încapsulării până la 100%. Forța conducătoare este un grafient de pH aplicat bistratului. Doxorubicina poate fi încapsulată până la 100% în lipozomi folosind un gradient de sulfat de amoniu (care induce un gradient de pH). Aceste strategii active de încărcare a lipozomilor permit, în principiu, încărcarea cu medicamente a lipozomilor goi ‘la patul pacientului’. Aceasta este o opțiune interesantă dacă este necesară utilizarea unor medicamente sau lipozomi labili.

Viața pe raft. Înțelesul termenului de stabilitate depinde puternic de interpretarea grupului țintă profesional. Pentru un biochimist, o viață pe raft de o săptămână la 27°C poate fi acceptabilă. Pentru un produs farmaceutic, cerința primară este de o viață pe raft de minim doi ani, de preferat fără refrigerare. Viața pe raft a lipozomilor poate fi limitată din cauza a doi factori. Întâi, instabilitatea fizică – scurgerile de medicament din sau prin bistratul lipidic și agregarea sau fuziunea lipozomilor. În al doilea rând, instabilitatea chimică – hidroliza legăturilor esterice sau oxidarea grupărilor acil nesaturate.

Oxidarea poate fi prevenită excluzând oxigenul din flaconul de injecție, prin adăugarea unui antioxidant (ex. vitamina E) sau prin selecția lanțurilor acil saturate în fosfolipid. Minimalizarea hidrolizei este posibilă prin selectarea unui mediu cu pH de 6.5 și temperaturi joase. Dacă aceste condiții nu pot fi întrunite, poate fi luată în considerare înghețarea (uscarea) lipozomilor. Lipozomii pot fi congelați cu succes dacă este folosită o substanță lioprotectoare potrivită și dacă sunt întrunite condițiile potrivite de înhețare-congelare. Dizaharidele sunt lioprotectori excelenți. Ele previn agregarea și fuzionarea după reconstituirea straturilor. Nu este posibilă întotdeauna evitarea scurgerilor de medicamente din lipozomi după un ciclu de congelare-uscare-recongelare, dar înțelegeri recente privind mecanismele lioprotecției îmbunătățesc șansele de succes.

Fabricarea pe scară largă. O parte din metodele de preparare ale lipozomilor la scală de laborator au fost extinse la scală industrială. Dacă este posibil, folosirea unui omogenizator cu forfecare înaltă pentru producerea veziculelor mici este o primă alegere. Nu sunt necesari solvenți organici care să dizolve întâi lipidul, nu sunt necesari detergenți care să hidrateze lipidul și este acces ușor la echipamente potrivite (sunt disponibile comercial). Pot apărea probleme cu omogenizarea cu forfecare înaltă dacă sunt prezente componente cu mai mult de un bistrat lipidic.

Tehnologiile alternative aplicabile pe scală mare sunt:

Metoda cu îndepărtarea detergentului, în care detergentul este îndepărtat din micelele mixte conținănd componentele bistratului lipidic.

Metoda cu injecție de etanol, în care lipidele sunt dizolvate în etanol și apoi amestecate cu faza apoasă

Lipidele care alcătuiesc substratul pot fi liofilizate în prezența unui medicament lipofil. După hidratare, straturile de lipid înalt poroase formează lipozomi (MLV>1 μm) și medicamentul lipofil este asociat acewstora.

Probleme care au legătură cu administrarea parenterală a lipozomilor sunt sterilitatea produsului și absența pirogenilor. Calea preferată de sterilizare a lipozomilor este autoclavarea. Aceasta este o opțiune realistă, dacă condițiile de pH sunt optime, medicamentul este stabil la căldură și lipofil. În caz contrar, sunt necesare filtrarea prin membrane cu porozitate de 0,2 μm sau proceduri de producere în condiții aseptice. Pot fi utilizate procedurile standard pentru producerea de parenterali fără pirogeni . Ar trebui absolut validate testele LAL pentru lipozomii farmaceutici.

Date de siguranță. Nu au fost observate probleme directe de securitate legate de lipozomi pentru generația prezentă de lipozomi farmaceutici conținând medicamente înalt potente (ex. citostatice sau fungicide). Totuși, pot apărea schimbări în profilul efectelor secundare. De exemplu, sindromul ‘mână-și-picior’ observat după administrarea lipozomilor de doxorubicină cu circulație îndelungată nu apare la administrarea doxorubicinei libere în protocoalele standard.

Atașarea grupărilor funcționale la suprafața lipozomilor

Pentru abordările cu țintire activă și pentru atașarea covalentă a PEG la suprafața lipozomilor, au fost dezvoltate diferite abordări de formare a punților. Cel mai des sunt folosite peptidele sau proteinele Chimia de cuplare relevantă nu este încă bine stabilită, agenții de încrucișare heterobifuncționali limitează interacțiile proteină-proteină și lipozom-lipozom. Proteinele și peptidele pot fi cuplate fie cu molecule ancoră din bistraturile existente, fie cu moleculele lipidice dinaintea formării lipozomilor. Dezavantajul este faptul că proteina sau peptida implicate sunt supuse unor condiții destul de dificile, cum ar fi forțele mari implicate în omogenizare, căldura sau solvenții organici, care sunt folosiți pentru a crea un lipozom acceptabil din punct de vedere farmaceutic. Recent au fost atașate proteine covalent la capetele grupărilor PEG atașate la bistraturi în încercarea de a combina proprietățile de circulație îndelungată cu capacitatea de țintire selectivă.

Căi de administrare

Administrarea parentală a lipozomilor. Lipozomii, similar altor transportori coloidali de medicamente, pot prezenta câteva efecte avantajoase, de exemplu pentru administrarea directă în țesuturi asociată cu sistemul reticoloendotelial (ficat, splina și măduva), ca auxiliari în formulările de vaccinuri. Formulările pe bază de lipozomi au și numeroase puncte slabe și dificultăți în ceea ce privește condițiile de preparare complicate și costisitoare, dificultățile întâmpinate la sterilizare, stabilitatea scăzută pe timpul depozitarii, limitările privind capacitatea scăzută de solubilizare pentru mai multe medicamente hidrofobe. În administrarea parentală, o altă problemă observată la utilizarea acestui tipde formulare a fost eliminarea rapidă din circuitul sangvin, acest lucru reflectându-se într-o biodisponibilitate scăzută de medicament și o toxicitate locală în țesuturile asociate sistemului reticuloendotelial.

În ultimele două decenii, dezvoltarea așa numiților lipozomi “Stealth” (lipozomi care au suprafața modificată cu derivați de tip polietilenoxid – PEO) a rezolvat cel puțin câteva dintre aceste probleme, existând și în prezent o activitate crescută în acest domeniu.

Administrarea locală a lipozomilor. Distribuția medicamentelor pe cale dermală și locală reprezintă o altă arie de interes în care lipozomii au fost considerați utili. Problemă majoră în ceea ce privește distribuția locală a medicamentului este aceea ca medicamentul poate să nu ajungă la poziția de acțiune. Pentru a contracara această problemă, formulările locale pot să conțină așa-numiții intensificatori de penetrare, cum ar fi dimetilsufoxidul, propilenglicolul. Un mod de a obține o penetrare crescută a medicamentului fără utilizarea intensificatorilor de penetrare este utilizarea microemulsiilor. Deși exista un număr mare de medicamente care pot fi de interes în ceea ce privește distribuția de medicament transdermală lipozomală, de interes particular sunt anestezicele locale, retinoizii și corticosteroizii.

Medicamente înglobate în lipozomi și căi de administrare

IV.3. Principalele aplicații ale preparatelor lipozomale

Lipozomii sunt transportatori potențiali cu eliberare controlată a agentilor terapeutici tumorali și antibioticelor, pentru terapia genică și antisens prin livrare de secvențe de acizi nucleici, imunizarea prin livrare de antigeni și pentru terapia antiparkinson. În ultimul deceniu, cercetătorii farmaceutici utilizează instrumentele biofizicii în evaluarea dozării lipozomilor. Lipozomii au acoperit în principal domeniul medical, dar și unele domenii non-medicale cum ar fi bioreactoare, catalizatori, produse cosmetice și ecologie.

Lipozomii care sunt folosiți ca sisteme de livrare, pot încapsula hidrolitic substanțe în miez. Substanțe amfifile și lipofile, de ex filtre UV liposolubile, pot fi incorporate în bistratul lipidic. Lipozomii cu încărcătură, precum și fară încarcătură, simpli, sunt folosiți în cosmetică. Efectul principal al lipozomilor simpli este o creștere a umidității pielii.

Beneficiile folosirii lipozomilor în produsele de îngrijire a pielii

Lipozomii favorizează frecvent dispoziția ingredientelor active încapsulate în epidermă și dermă, în timp ce rata de pătrundere scade. Aceasta ajută la fixarea ingredientelor active la straturile superficiale ale pielii, așa cum se dorește la produsele cosmetice. Simultan, spălarea lor poate fi întârziată., astfel incât, de exemplu, produsele apoase de îngrijire și protecție colară care conțin lipozomi – filtre UV încapsulate – sunt rezistente la apă.

Mărimea, compoziția și numărul lipozomilor folosiți determină succesul acestora în produsele cosmetice

Totuși, efectele pozitive menționate depend de compoziția, dimensiunile și cantitatea de lipozomi, astfel că nu se justifică concluziile generale. Cătă vreme este vorba de lipozomi goi, efectele positive nu sunt puternic legate de natura veziculară. Prezența lipidelor potrivite (fosfolipide, sfingolipide) este suficientă pentru eficacitate cosmetică.

Compatibilitatea cu pielea a fosfolipidelor aplicate în prezent este foarte înaltă. Nu există restricții privind utilizarea lor în industria alimentară și cosmetică, nici în UE, nici prin reglementările Administrației Alimentelor și Medicamentelor din US, lecitinele sunt în general acceptate ca fiind sigure. Totuși, este cunoscut faptul că doze înalte de fosfolipide care sunt aplicate pe o perioadă mai mare de timp poate duce la iritații pe pielea uscată și normală. Asfel, datorită unui mecanism de feedback biochemic, aplicarea pe termen lung a fosfolipidelor poate influența metabolismul lipidic dermal.

Una din principalele consecințe ale descoperirii inițiale a lipozomilor de către Bengham este folosirea lor ca vectori de livrare selectivă a componentelor active la țesuturile specifice. Bazat pe proprietățile lor unice, datorate lipidelor amfifilice, lipozomii pot fi administrați fără să producă efecte secundare semnificative.

Sistemele de terapie convențională a cancerului au arătat o eficiență scăzută în livrarea componentelor bioactive, astfel că este importantă cercetarea sistemelor de livrare care au ca efecte o eficiență crescută și limitează toxicitatea diverșilor agenți chemoterapeutici. În majoritatea cazurilor, folosirea lipozomilor permite eliminarea și reducerea semnificativă a multor dezavantaje, cum este toxicitatea, și oferă multe beneficii, precum :

– protejarea medicamentului, stabilizarea și prelungirea timpului de înjumătățire biologic;

– doze aplicate reduse;

– căi alternative de aplicare medicamentoasă: intravenos, dermal/transdermal, prin intermediul mucoaselor.

Lipozomii pot fi alcătuiți astfel încât să includă o largă varietate de agenți, atât hidrofili, cât și hidrofobi, și să protejeze agenții încapsulați de procesele metabolice celulare. Pentru o terapie de succes cu componente active incluse în lipozomi, aceștia ar trebui să fie capabili să ajungă cu precizie la destinație, la momentul potrivit, cu o concentrație corectă și o viteză adecvată. Bioîncapsularea componentelor active în lipozomi schimbă proprietățile farmaco-cinetice ale acestora, iar acest lucru poate fi folosit pentru a atinge scopurile terapiei. Utilitatea lor este bazată pe proprietățile lor (mărime, eficiență, proprietăți de suprafață, stabilitate), proprietăți care pot fi modificate de interacțiile biologice și în timpul procesului de preparare

Lipozomii au proprietatea de proteja mediul înconjurător prin păstrarea componentei încapsulate un timp îndelungat fără s-o elibereze. Timpul de păstrare a a componentei este variabil, de la câteva secunde până la câteva săptămâni, în funcție de un mare număr de parametri, precum : timp, dimensiuni, încărcare electrică, fluiditate, polaritate, prezența ionilor bivalenți, a detergenților și a componentelor serice în mediu.

Lipozomii în terapia genetică. La amestecarea lipidelor cu ADN, pot fi obținuți complecși compacți, în special în cazul lipidelor cationice. Prin utilizarea lipozomilor a fost observată o eficiență crescută a distribuției de ADN. S-a observat că eficiența transformării depinde de sarcina netă a complexului. Totuși, această dependentă nu este directă și diferite linii celulare necesita sarcini variate ale complexului în vederea unei exprimări optime. Există câteva probleme potențiale legate de distribuția în vivo de gena, prin preluare mediată de sarcina cationică. De exemplu, în cazul administrării intravenoase, transportorul complex întâlnește proteice serice încărcate negative, lipoproteine și celule din sânge, astfel că apare riscul floculării și de formare de embolii. În ceea ce privește transportorii administrați pe calea aerului, apr probleme referitoare la surfactantii cu catena lungă. În ambele cazuri, exista riscul ca transportorii să nu fie capabili să mențină sarcinile lor positive până când ajung la țintă, ceea ce le deteriorează performanțele. Cu atât mai mult, transportorii administrați intravenos sunt scoși din circulație rapid prin RES. În pofida acestor obstacule, s-a confirmat faptul că ADN-ul administrat prin intermediul complecșilor lipozomici cationici este mult mai eficient decât distribuția ADN-ului liber.

V. Medicamente pe bază de lipozomi existente pe piață

Există o varietate de formule pe bază de lipozomi care au fost comercializate și sunt multe formule pe bază de lipozomi care sunt în diverse stadii de testări clinice.

Mai jos sunt enumerate câteva formule comercializate și din faza a III-a de testare:

1) Myocet (doxorubicină lipozomală)- Aceasta este o formulă non PEG-ilată a doxorubicinei lipozomale. (PEG-ilarea reprezintă modificarea unei proteine, peptide sau molecule neproteice prin legarea unuia sau mai multor lanțuri de polietilenglicol, polimer netoxic, nealergic, care nu declanșează răspuns imun, înalt solubil în apă. Medicamentele conjugate cu PEG au câteva avantaje: rezistență prelungită în corp, degradare scăzută de către enzimele metabolice și reducerea sau eliminarea imunogenității proteice). Lipozomii sunt compuși din fosfatidilcolină (PC) din ou (EPC): colesterol (raport molar 55:45). Este folosit în terapia combinațională a tratamentului cancerului de sân recurent.

2) Doxil, Caelyx (doxorubicină lipozomală)- Aceasta este o formulă PEG-ilată a doxorubicinei lipozomale. Lipozomii sunt compuși din fosfatidilcolină hidrogenată din soia (HSPC): colesterol: PEG 2000-DSPE (raport molar 56:39:5). Este folosit în tratamentul sarcomului Kaposi refractar, cancerul de sân recurent și cancerul ovarian.

3) LipoDox (doxorubicină lipozomală)- Aceasta este o formulă PEG-ilată a doxorubicinei lipozomale. Lipozomii sunt compuși din fosfatidilcolină dehidrogenată din soia (DSPC): colesterol: PEG 2000-DSPE (raport molar 56:39:5). Este folosit în tratamentul sarcomului Kaposi refractar, cancerul de sân recurent și cancerul ovarian.

4) Thermodox (doxorubicină lipozomală)- Aceasta este o formulă PEG-ilată a doxorubicinei lipozomale. Thermodox este o formulă cu eliberare la țintă. Lipozomii își vor elibera conținutul după căldură. Tumpra este încălzită folosind ablație prin radio frecvență (RFA). Lipozomii își eliberează conținutul în interiorul tumori după încălzire. Lipozomii sunt alcătuiți din DPPC, mono steroil PC (MSPC) și PEG2000-DSPE. Este folosit la tratamentul cancerului primar de ficat (carcinom hepatocelular) și cancer de sân recurent. Thermodox este în faza III în testele clinice.

5) DaunoXome (Daunorubicină lipozomală)- Aceasta este o formulă non PEG-ilată a daunorubicinei lipozomale. Lipozomii sunt alcătuiți din DSPC și colesterol. Este folosit pentru tratamentul sarcomului Kaposi.

6) Ambisome (amfoteracină B lipozomală)- Aceasta este o formulă non PEG-ilată a amfoteracinei B lipozomale. Lipozomii sunt alcătuiți din HSPC, DSPG, colesterol și amfoteracină B în raport molar 2:0.8:1:0.4. Este folosit la tratamentul infecțiilor fungice.

7) Marqibo (vincristină lipozomală)- This Aceasta este o formulă non PEG-ilată a vincristinei lipozomale. Lipozomii sunt alcătuiți din sfingomielină din ou și colesterol. Este folosit la tratamentul melanomului malign metastatic uveal. Marqibo este în faza III de teste clinice.

8) Visudyne (verteporfină lipozomală)- Aceasta este o formulă non PEG-ilată a verteporfinei lipozomale (BPD-MA). Lipozomii sunt alcătuiți din BPD-MA:EPG:DMPC în concentrație molară de 1:05:3:5. Este folosit la tratamentul degenerărilor maculare legate de vârstă, miopiei patologice și histoplasmozei oculare.

9) DepoCyt (citarabină lipozomală)- Aceasta este o formulă non PEG-ilată a citarabinei lipozomale. Platforma Depo-Foam este folosită în DepoCyt. Depo-Foam este un matrix lipozomal sferic multilamelar de 20 microni alcătuit din Colesterol: Trioleină: Dioleoilfosfatidilcolină (DOPC): Dipalmitoilfosfatidilglicerol (DPPG) în raport molar de 11:1:7:1. Medicamentul este folosit prin administrare intratecală pentru tratamentul meningitei neoplastice și meningitei limfomatoase.

10) DepoDur (sulfat de morfină lipozomal)- Aceasta este o formulă non PEG-ilată a sulfatului de morfină lipozomal. Platforma Depo-Foam este folosită în DepoCyt. Depo-Foam este un matrix lipozomal sferic multilamelar de 20 microni alcătuit din Colesterol: Trioleină: Dioleoilfosfatidilcolină (DOPC): Dipalmitoilfosfatidilglicerol (DPPG) în raport molar de 11:1:7:1. Medicamentul este folosit prin administrare epidurală pentru tratamentul durerilor postoperatorii care urmează după operațiile chirurgicale majore.

11) Arikace (amikacină lipozomală)- Aceasta este o formulă non PEG-ilată a amikacinei lipozomale. Lipozomii sunt alcătuiți din DPPC și colesterol. Mărimea lipozomilor este de 200-300 nm. Este folosit pentru tratamentul infecțiilor pulmonare datorită patogenilor susceptibili. Arikace este folosit în formă nebulizată și este inhalat de pacienți. Medicamentul este în faza a III-a în testele clinice.

12) Lipoplatin (cisplatin lipozomal)- Aceasta este o formulă PEG-ilată a cisplatinului lipozomal. Lipozomii sunt alcătuiți din DPPG, colesterol PC din soia și PEG2000-DSPE. Este folosit pentru tratamentul malignităților epiteliale cum ar fi cancerele de plamâni, cap și gât, ovarian, vezică urinară și testicular.

13) LEP-ETU (paclitaxel lipozomal)- Aceasta este o formulă non PEG-ilată a paclitaxelului lipozomal. Lipozomii sunt alcătuiți din DOPE, colesterol și cardiolipină. Este folosit pentru tratamentul cancerului ovarian, de sân și pulmonar. LEP-ETU termină faza II a testelor clinice.

14) Epaxal (vaccin pentru Hepatita A)- Lipozomii au fost folosiți ca un adjuvant al vaccinului în această formulare. Vaccinurile inactivate conțin uzual un adjuvant care potențează răspunsul imun la antigen. În ultimii 70 de ani, sărurile de aluminiu au fost singurul adjuvant licențiat pentru uz uman. Activitatea adjuvantului se bazează pe folosirea lui ca depozit de antigeni și inducerea unui răspuns inflamator localizat. Acești lipozomi, cunoscuți ca fiind imunopotențatori ai virusului Influenza reconstituit (IRIV) sunt alcătuiți din DOPC/DOPE în raport molar de 75:25. Lipozomii au dimensiuni de 150 nm.

15) Inflexal V (vaccin gripal)- Lipozomii au fost folosiți ca un adjuvant al vaccinului în această formulare. Lipozomii sunt alcătuiți din DOPC/DOPE în raport molar de 75:25. Lipozomii au dimensiuni de 150 nm.

BIBLIOGRAFIE

O. M. Atrozz, The Incorporation Effects of Methanolic Extracts of Some Plant Seeds on the Stability of Phosphatidylcholine Liposomes, Pakistan Journal of Biological Science 10, 2007;

Bangham, A.D. and R.W. Horne, 1964, Negative staining of phospholipids and their structured modofication by surface active agents as observed in the electron microscope, Mol. Biol. 8;

Barenholz,Y. and Crommelin, D.J.A. (1994) in Encyclopedia of Pharmaceutical Technology (Swarbrick, J., ed.), Marcel Dekker;

Bayomi M. A., A-Angry A. A., Al-Meshal M. A. and Al-Dasdiri M. M., Int. J. Pharmaceutics, 1998;175(1):1-7.

Bergers, J.J., Storm, G. and Den Otter,W. (1993) in Liposome Technology (Vol. 2, 2nd edn) (Gregoriadis, G., ed.), CRC Press

Crommelin, D.J.A. and Storm, G. (1990) in Comprehensive Medicinal Chemistry (Vol. 5) (Sammes, P.G. and Taylor, J.D., eds), Pergamon Press.

Chung K. F., Barens P. J., Drug of today, 1989;

Dean J. A. Crommelin, Gert W. Bos, Gert Storm., Business briefing pharmatech, 2003; 209-213.

Dass C. R., Burton M. A., J. Pharm. Pharmcol., 1999

Friese J. (1984). In: Liposome Technology (Gregoriadis G., ed.) CRC Press, Florida, Vol.1, Chapter 10;

Felgner, P., T.R. Gadek, M. Holm, R. Roman, M.Wenz, J.P. Northrop, G. Ringold and M. Danielsen, 1987, Lipofectin: A highly efficient, lipid mediated DNA transfection procedure, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 84.

Gabizon, A., 1992, Selective tumor localization and improved therapeutic efficacy of anthracyclines encapsulated in long circulating liposomes, Cancer Res. 52;

Gregoriadis G., McCormack B., Perrie Y. and Saffie R., In: Medical applications of liposomes, Lasic D. D., and Papahadjipoulos D. (Eds.), Elsevier, Oxford, 1998.

N. A. Kshirsagar, S. K. Pandya, B.G. Kirodian, S. Sanath, Liposomal drug delivery system from laboratory to clinic, Journal of Postgraduate Medicine, Vol. 51, 2005;

Lasic, D.D., 1992, Liposomes, Am. Sci. 80;

Lasic, D.D., 1993, Liposomes: From Physics to Applications (Elsevier, Amsterdam) 1993;

D.D. Lasic, Applications of Liposomes, R. Lipowsky, E. Sackmann, Handbook of Biological Physics, Elsevier Science, 1995;

Lipowsky, R., 1992, The conformation of membranes, Nature 349;

Aurelia Meghea, Ioana Lăcătușu, Nicoleta Badea, Sinteza dirijată de nanostructuri pentru materiale cu proprietăți multifunctionale,vol.I, Ed. Politehnica Press, Bucuresti 2009;

New R. R. C.,In: Liposomes: A practical approach, OIRL Press, Oxford, London, 1989.

Ostro M. J., In : Liposomes : From biophysics to therapeutics. Marcel Dekker, Newyork, 1987.

Papahadjopoulos, D. (ed.), 1978, Liposomes and their use in biology and medicine, Ann. NY Acad. Sci. 308

Patil S. G., Gattani S. G., Gaud R. S., Surana S. J., Dewani S. P., Mahajan H. S., The Pharma Review., 2005.

W. L. Stone, M. Smith, Therapeutic Uses of Antioxidant Liposomes, Molecular Biotechnology, Volume 27, 2004;

Suggy S. Chrai, R. Murari, Imran Ahmad., Pharm. Technology, 2002;26:28-34

Tsuchida E., Artificial cells, Blood substitutes, and immobilization technology, 1994.

M. U. Uhumwangho, R. S. Okor, Current trends in the production and biomedical applications of liposomes: a review, Journal of Biomedical Science, Vol. 4, No. 1, 2005;

Vyas S. P., and Sihorkar V., In: Advance in liposomal therapeutics, (Eds.), CBS Publishers, New Delhi, 2001.

S. P. Vyas, R. K. Khar, Targeted and controlled drug delivery. First Edition, CBS Publishers, Delhi, 2002.

Wasan M. W., Lopez-Berestein G., In: Medical applications of liposomes. Elsevier, Oxford, 1998.

Working P. K., Newman M. S., Hunag S. K., J. Liposomes Res., 1994.

Woodle, M.C. and Storm, G., eds (1998) Long Circulating Liposomes: Old Drugs, New Therapeutics, Springer-Verlag

Zonneveld, G.M. and Crommelin, D.J.A. (1988) in Liposomes as Drug Carriers:

Recent Trends and Progress (Gregoriadis, G., ed.), J.Wiley and Sons