SISTEME BIOLOGICE ȘI BIOCHIMICE DE DEGRADARE A PRODUSELOR DIN PIELE NATURALĂ [304048]

UNIVERSITATEA DE ȘTIINȚE AGRONOMICE

ȘI MEDICINĂ VETERINARĂ BUCUREȘTI

FACULTATEA DE BIOTEHNOLOGII

TEZĂ DE DOCTORAT

Conducător științific:

Prof. Univ. Dr. Ing. ȘTEFANA JURCOANE

Doctorand: [anonimizat],

2017

TEZĂ DE DOCTORAT

SISTEME BIOLOGICE ȘI BIOCHIMICE DE DEGRADARE A PRODUSELOR DIN PIELE NATURALĂ

Conducător științific:

Prof. Univ. Dr. Ing. Ștefana JURCOANE

Doctorand: [anonimizat],

2017

CUPRINS

INTRODUCERE

PARTEA I STADIUL ACTUAL AL CUNOAȘTERII PRIVIND SISTEMELE BIOLOGICE DE DEGRADARE A PRODUSELOR DIN PIELE

CAPITOLUL I SISTEME BIOLOGICE DE DEGRADARE A PRODUSELOR DIN PIELE

1.1 Aspecte privind compoziția produselor din piele naturală

1.2 Modalități de degradare biologică a produselor din piele naturală

1.3 Selecția microorganismelor capabile să degradeze blănurile naturale

1.4 Tehnologii de degradare biologică a resturilor de blănuri naturale aplicate industrial

CAPITOLUL II SISTEME BIOCHIMICE DE DEGRADARE A PRODUSELOR DIN PIELE NATURALĂ

2.1 Modalități de degradare biochimică a blănurilor

2.2 Mecanismul de degradare a produselor din piele naturală

2.3 Descrierea sistemului enzimatic implicat în degradarea blănurilor

2.4 Tehnologii de degradare biochimică a resturilor din piele naturală aplicate industrial

PARTEA II PARTEA EXPERIMENTALĂ

CAPITOLUL III SCOPUL ȘI OBIECTIVELE CERCETĂRII. MATERIALE ȘI METODE PRIVIND STABILIREA CONDIȚIILOR OPTIME DE CULTIVARE IN VITRO UNOR SPECII DE MICROORGANISME PROTEAZICE

3.1 SCOPUL ȘI OBIECTIVELE CERCETĂRII

3.2 MATERIAL BIOLOGIC TESTAT

3.3 ANALIZE EFECTUATE ÎN LABORATOR PENTRU DETERMINAREA UNOR ÎNSUȘIRI CALITATIVE ALE PRODUSELOR DIN PIELE ȘI BLANĂ NATURALĂ

3.3.1 Materiale utilizate în experimentele de laborator

3.3.2 Medii de cultivare a tulpinilor izolate

3.3.3 Obținerea materialului biologic

3.3.3.1 [anonimizat]

3.3.3.2 [anonimizat]

3.4 METODELE DE ANALIZĂ ȘI CONTROL FOLOSITE PENTRU DETERMINAREA ÎNSUȘIRILOR CHIMICE ALE PRODUSELOR DIN PIELE ȘI BLANĂ NATURALĂ.

3.4.1 [anonimizat] a [anonimizat]

3.4.2 Condiții de cultivare a tulpinilor selecționate

3.4.3 Parametrii de cultivare a tulpinilor selecționate

3.5 METODE DE ANALIZĂ ȘI CONTROL A MATERIILOR PRIME UTILIZATE ÎN EXPERIMENTELE DE LABORATOR

3.5.1 Metoda de determinare a glucidelor reducătoare

3.5.2 Determinarea proteinelor prin metoda Lowry (cu substrat modificat)

3.5.3 Determinarea carbonului organic în produsele de piele naturală

3.5.4 Dozarea carbonului organic.

3.5.5 Determinarea substanței uscate

3.6 METODE DE DETERMINARE A ACTIVITĂȚII ENZIMATICE ALE PREPARATELOR ENZIMATICE OBȚINUTE

3.6.1 Determinarea activității proteolitice

3.6.2 Determinarea α-amilazelor prin metoda Hostettler și colab.

3.6.3 Determinarea activității lipolitice

3.6.4 Determinarea activității keratinolitice

3.6.5 Determinarea activității colagenazice

3.7 Documentație tehnică privind selectarea metodei de concentrare a preparatelor enzimatice

3.8 Identificarea tulpinilor bacteriene izolate

CAPITOLUL IV REZULTATE ȘI DISCUȚII

EXPERIMENTE PRIVIND OBȚINEREA DE BIOPREPARAT ENZIMATIC REZULTAT ÎN URMA DEGRADĂRII UNOR PRODUSE DIN INDUSTRIA PIELARIEI PRIN UTILIZAREA DE MICROORGANISME SPECIALIZATE

4.1 REZULTATE PRIVIND SELECȚIA ȘI IDENTIFICAREA MICROORGANISMELOR CAPABILE SĂ DEGRADEZE PIELEA NATURALĂ

4.1.1 Screeningul bacteriilor izolate și alegerea sistemului biologic de utilizare în degradarea blănurilor

4.1.2 Rezultate obținute în degradarea biologică a blănurilor cu tulpinile selecționate

4.1.3 Identificarea microorganismelor selectate

4.2 REZULTATE PRIVIND DEGRADAREA ENZIMATICĂ A PRODUSELOR DIN BLANĂ

4.2.1 Rezultate privind obținerea preparatului enzimatic utilizat în degradarea blănurilor

4.2.2 Biosinteza unui preparat enzimatic (cu tulpinile izolate) capabil să degradeze pielea naturală.

4.2.2.1 Dinamica acumulării în culture submerse a proteinelor

4.2.2.2 Influența sursei de carbon

4.2.3 Optimizarea biosintezei proteinelor bacteriene

4.2.3.1 Influența componentelor mediului de cultivare asupra biosintezei proteazelor bacteriene

4.2.4. Determinarea activității enzimatice optime

4.2.5 Izolarea din mediul de fermentație a preparatului enzimatic obținut prin biosinteza

4.2.5.1 Separarea biomasei

4.2.5.2 Concentrarea soluției native prin evaporare sub vid

4.2.5.3 Experimete de prelucrare a mediului de cultură prin liofilizarea concentratului

4.2.6 Caracterizarea preparatului enzimatic liofilizat

4.2.7 Rezultate privind gradul de degradare al produselor din piele cu ajutorul preparatului enzimatic obținut

4.3 EXPERIMENTĂRI PRIVIND OBȚINEREA DE BIOPREPARATE ENZIMATICE CU APLICABILITATE ÎN AGRICULTURA ECOLOGICĂ

4.3.1 Influența adaosului de preparat enzimatic obținut asupra culturilor de graminee și leguminoase

CAPITOLUL V – CONCLUZII ȘI RECOMADĂRI

5.1 Concluzii generale

5.2 Contribuții originale

5.3 Dezvoltarea tehnologiilor privind degradarea biologică și enzimatică a produselor din blană naturală

Listă de tabele

Listă de figuri

REFERINȚE BIBLIOGRAFICE

REZUMAT

Cuvinte cheie: Sistem biologic, izolare bacteriană, degradarea pielăriei, proteinază, amilază, colagenază, keratinază, lipază, carbon organic, biofertilizator, agricultură ecologică, deșeuri, identificarea microorganismelor, hidrolizat, sistem biochimic, biodegradare, poluare.

Industria pielăriei produce anual tone de deșeuri care sunt considerate a fi extrem de dăunătoare pentru mediu. Resturile solide generate de industria pielăriei conțin ca element de bază proteina, dar datorită substanțelor folosite în prelucrare, acestea devin foarte greu de degradat, rămânând ca deșeuri sau se incinerează producând de asemenea poluarea mediului înconjurător.

În ziua de astăzi sectorul biotehnologic ne permite să utilizăm aceste deșeuri ca substrat microbian pentru producția de enzime. Enzimele obținute pot avea utilizări multiple și pot acoperi diverse nevoi industriale. Pielea fiind un material bazat pe carbon organic, bogat în proteine poate fi utilizată pentru îmbunătățirea solului în azot și substanțe minerale, ce poate duce la o bună creștere și dezvoltare a recoltelor în agricultura ecologică.

Scopul prezentei lucrãri este acela de izolare a unor microorganisme capabile să degradeze deșeurile din industria pielăriei, de optimizare a mediilor de cultură bacteriene specifice, de obținerea enzimelor pentru biodegradarea deșeurilor din industria pielăriei și de obtinere a unui hidrolizat care sa poată fi utilizat cu succes ca biofertilizator pentru culturile de cereale și leguminoase.

Principalelele obiective ale tezei de doctorat au urmărit:

izolarea, selecția, caracterizarea, identificarea și testarea microorganismelor cu eficiență în degradarea accelerată a deșeurilor din industria pielăriei;

experimentarea biodegradabilității principalelor componente ale articolelor de blană naturală tăbăcită cu crom;

obtinerea enzimelor specific pentru biodegradarea deșeurilor din industria pielăriei

obtinere a unui hidrolizat care sa poată fi utilizat cu succes ca biofertilizator pentru culturile de cereale și leguminoase.

Experimentele s-au desfășurat în condiții de laborator, în cadrul Facultății de Biotehnologii aparținând Universității de Științe Agronomice și Medicină Veterinară București

Pentru realizarea experimentelor de biodegradare a proteinelor au fost testate mai multe tipuri de blană și piele tăbăcite cu crom provenite din sectoarele industriale.

S-au luat în lucru bucați de piele și blană naturală de oaie, tăbăcite cu crom, precum și bucăți de piele și blană ecologică, materiale ce au fost puse la dispoziție de către Institutul de Pielărie București.

Pentru screeningul microorganismelor a fost luată în considerare izolarea acestora din mediile naturale.

Materialul biologic testat a constat în trei tulpini bacteriene ce au fost izolate în urma degradării unor resturi de blană și piele tăbăcite cu crom, provenite de la Institutul de Pielărie București.

Teza este structurată în două părți, după cum urmează:

Prima parte a tezei cuprinde date din literatura de specialitate cu privire la tema tezei de doctorat prezentate și este structurată două capitole.

Capitolul I prezintă generalități privind sistemele biologice de degradare a produselor din piele, precum și aspecte privind compoziția produselor din piele naturală. De asemenea, sunt prezentate date referitoare la descrierea detaliată a tehnologiilor de degradare biologică a resturilor de blănuri naturale aplicate industrial.

Capitolul II prezintă sistemele biochimice de degradare a produselor din piele naturală precum și descrierea sistemului enzimatic implicat în degradarea blănurilor.

A doua parte a tezei este alcătuită din contribuțiile originale efectuate pe parcursul cercetării.

În capitolul III sunt cuprinse scopul și obiectivele datelor obținute, fiind descrise materialul biologic folosit, metodele de lucru utilizate în laborator pentru analiza condițiilor optime de cultivare in vitro unor specii de microorganisme proteazice, analizele efectuate pentru determinarea unor însușiri calitative ale produselor din piele și blană naturală precum și metodele de analiză și control folosite pentru determinarea însușirilor chimice ale produselor din piele și blană naturală. Capitolul III mai cuprinde metodele de analiză și control a materiilor prime utilizate în experimentele de laborator precum și metodele de determinare a activității enzimatice ale preparatelor enzimatice obținute

În capitolul IV se găsesc rezultatele obținute în urma experimentării. În fiecare subcapitol, rezultatele au fost prezentate pentru fiecare determinare în parte.

Din rezultatele experimentelor efectuate putem prezenta următoarele:

În jurul coloniilor izolate producătoare de proteaze se observă un halou opalescent fapt ce indică activitatea proteazică a microorganismelor

În urma determinărilor realizate în laborator s-a concluzionat că cel mai înalt grad de productivitate enzimatică s-a înregistrat la temperatua de 35oC, un pH egal cu 7,2, 135rpm, unde s-a utilizat ca unică sursă de carbon blană naturală; blană sintetică și pene în proportie de 0,6g % la care s-au efectuat determinări ale activităților enzimatice la 120 de ore de la cultivare. Tulpinile bacteriene au fost crescute pe mediu minimal.

S-au caracterizat cele trei tulpini din punct de vedere al activității enzimatice: activitatea proteolitică, activitatea amilolitică, activitatea lipolitică, activitatea keratinolitică și activitatea colagenazică, astfel:

Pentru proteaze producția a fost 1,430 U/ml în cazul enzimelor obținute din hidroliza blănurilor naturale, iar pentru enzimele obținute din hidroliza penelor este de 0,726 U/ml;

Pentru colagenază valoarea a fost de 0,401 U/ml pentru hidroliza blănurilor naturale, iar pentru enzimele obținute din hidroliza penelor este de 0,418 U/ml;

În cazul determinării amilazei în urma hidrolizei blănurilor s-a înregistrat valoarea de 0,870 U/ml iar valoarea determinată în urma utilizării penelor ca unică sursă de carbon a fost de 1,220 U/ml;

În cazul producției de keratinază valoarea maximă a fost obținută în cazul hidrolizării penelor și anume 0,328 U/ml față de 0,248 U/ml obținute în cazul hidrolizării blănurilor;

Producția maximă de lipază a fost de 140 U/ml în ambele cazuri de hidrolizat.

Având în vedere faptul că tulpinile izolate au a manifestat o activitate enzimatică redusă, față de blana sintetică s-a renuntat la utilizarea acesteia.

Tulpinile B. diminuta (DA7) B. thuringiensis (DA10) și B. cereus (DA13) au fost identificate prin testul Biolog și au capacitatea de a degrada produsele din piele și blană naturală tăbăcite cu crom.

Tulpinile nou izolate au fost cultivate pe medii de cultivare specifice, în sistem submers, la flacoane agitate de 500 ml, cu 200 ml mediu/flacon, astfel încât volumul final să fie de 3000 ml. Mediul de fermentație astfel obținut s-a prelucrat prin filtrare și concentrare obținându-se un produs microbiologic concentrat, lichid, utilizat ca adaos biofertilizant în culturi vegetale de R. sativus. Triticum sp., S. tuberosum.

S-a constatat efectul stimulator în creșterea plantulelor testate în condiții de seră, prin urmare hidrolizatul obținut în cadrul tezei de doctorat poate fi utilizat cu succes ca biofertilizator pentru culturile de cereale și leguminoase.

În cazul soluției obținute în cadrul lucrării prezente se observă că cel mai bun efect asupra îmbunătățirii calității plantulelor a fost înregistrat de tulpina B. thuringiensis (DA10) la concentrația de 35%.

S-a constatat o reducere a carbonului organic cu cca. 30%, ceea ce confirmă activitatea hidrolitică a complexului enzimatic produs de tulpinile izolate.

În urma experimentărilor se poate dezvolta o tehnologie privind degradarea biologică și enzimatică a produselor din blană naturală, o tehnologie de obținere a hidrolizatului și utilizarea acestuia ca biofertilizant precum și dezvoltarea tehnologiilor de identificare a blănurilor naturale.

CUVÂNT ÎNAINTE

“Dificilul este ceea ce poți realiza imediat, imposibilul ia ceva mai mult timp..”

În câteva rânduri voi încerca să oglindesc contribuția celor care m-au susținut în realizarea acestei teze de doctorat.

Mărturisesc profunda mea recunoștință pe care o datorez și o voi datora întotdeauna Dnei. Prof. Univ. Dr. Ing. Ș. Jurcoane atât pentru toate sfaturile utile pe care Domnia Sa mi le-a acordat cu o excepțională competență, pentru noblețea spirituală și încrederea cu care m-a înconjurat pe tot parcursul efectuării tuturor experimentelor necesare elaborării lucrării de doctorat.

În calitate de ucenic al Dnei. Jurcoane recunoștința mea este infimă, comparativ cu tot ce am beneficiat din punct de vedere profesional și uman din partea Domniei Sale, printr-un exemplu de permanentă rigoare științifică și extrem de elevată competență profesională.

Distinsă personalitate cu o dedicare profesională fără egal Dna. Prof. Univ. Dr. Ing. P. Cornea mi-a călăuzit pașii în domeniul cercetării, îndrumându-mă permanent cu o infinită generozitate, fapt pentru care îi voi rămâne întotdeauna îndatorată.

În mod deosebit vreau să menționez întreaga mea admirație față de Dna. Prof. Dr. F. Matei căreia nu cred că voi reuși vreodată să îi mulțumesc îndeajuns pentru contribuția sa la formarea mea profesională încă din perioada în care eram stundentă.

Dnei. Prof. Dr. F. Israel-Roming îi adresez cele mai profunde sentimente de recunoștință pentru remarcabila devotare și competență științifică precum și pentru sugestiile deosebit de utile în elaborarea prezentei lucrări.

Cu deosebită stimă adresez sincere mulțumiri Dl. și Dnei. Teodorescu pentru sfaturile, îndrumările, ajutorul, grija, căldura și susținerea morală nemărginită pe care dânșii mi le-au oferit pe parcursul anilor mei de studii și formare profesională.

Tot pe această cale vrea să îi mulțumesc Dl. Prof. Petre Marian și Dnei. Prof. I. Deliu pentru bazele științifice pe care mi le-au format pe vremea când eram studentă.

Doresc să îi mulțumesc Dl. Cercetător Ghe. Olteanu pentru deschiderea noilor orizonturi științifice printr-o competență profesională și o dedicare rar întâlnită, pentru susținerea acordată în momente de cumpănă și pentru imensa noblețe spirituală cu care m-a coordonat și cu care a contribuit la adăugarea pieselor puzzle în formarea mea în fascinantul univers al cercetării științifice.

Vreau să mulțumesc din suflet mamei mele, tatălui și logodnicului meu pentru întregul suport moral și financiar, indispensabile pentru realizarea acestui vis, suportând cu stoicism toate momentele de cumpănă psihică și morală, acordându-mi permanent înțelegere, căldură și îndrumarea necesară.

Vreau să îi mulțumesc bunului meu prieten a cărui energie m-a călăuzit în îndeplinirea acestui vis.

Mulțumesc sincer tuturor apropiaților mei pe care, în pofida faptului că nu îi voi nominaliza, doresc să îi asigur de întreaga mea gratitudine și recunoștință pentru ajutorul moral acordat în decursul anilor care au contribuit în mod substanțial la împlinirea acestei mărețe dorințe.

Muțumesc Energiei Atotputernice pentru că, iată, reușesc în acest mod să adun toate piesele formării mele profesionale și să închei o lungă, dar frumoasă, etapă din viața mea.

Namaste.

INTRODUCERE

Dezvoltarea și creșterea industrială dezorganizată au cauzat probleme grave oamenilor din întreaga lume. Este necesar, prin urmare, difuzarea de idei pentru dezvoltarea durabilă, în cazul în care resursele naturale sunt utilizate rațional și este posibilă menținerea ecosistemelor existente acum. Acest deziderat se realizează prin reducerea poluării aerului, solului și apei precum si prin găsirea de noi soluții pentru o industrializare eficientă fără efecte secundare asupra omului sau a mediului ambiant.

Abordarea problematicii proceselor caracteristice poluãrii de pe poziții pasive, de constatare a efectelor distructive, fãrã aplicarea unor metode eficiente de prevenire a cauzelor acestui fenomen global, genereazã amplificarea consecințelor negative, prin declanșarea unor reacții de propagare, frecvent imprevizibile determinate de interacțiunea permanentã dintre agenții poluanți și mediul natural fiind cauzele principale ale încălzirii globale, a poluării apelor și solului, a extincției speciilor și a altor dezastre naturale.

Pentru a înțelege acțiunea reciprocă dintre om și habitatul său este necesară menținerea într-un echilibru adecvat al ciclului ecologic al Pământului. Este necesar ca activitatea umană să rămână în armonie cu întregul sistem, ea trebuie să se adapteze cerințelor sectorului natural, acesta fiind limitat ca dimensiune si ritm de activitate.

Limitarea locurilor disponibile pentru depozitarea deșeurilor a căpătat o importanță foarte mare, devenind o problemă economică și ecologică gravă pentru tăbăcării; costurile de transport și depozitare au crescut continuu astfel încât se impune necesitatea găsirii unor soluții tehnice cu efecte economice și ecologice favorabile, care să reducă atât volumul, cât și greutatea acestor deșeuri solide; în plus, se caută o strategie activă pentru utilizarea acestor deșeuri, care să ducă chiar la obținerea de profituri.

Conceptul modern de „economie în ciclu închis” presupune prevenirea impactului substanțelor toxice și periculoase asupra mediului și integrarea proceselor industriale în cicluri ecologice; substanțele care nu pot fi integrate trebuie reciclate complet în procesul de producție sau trebuie returnate în litosferă.

Majoritatea oamenilor de știință sunt de părere ca utilizarea organismelor biologice pentru producerea unor componente utile intereselor umane reprezintă obiectul de bază al biotehnologiei.

Aplicarea biotehnologiilor ecologice, cu precădere în domeniul activităților industriale, ajută la soluționarea problemelor legate de impactul antropic asupra mediului, generat prin acumularea anumitor materiale reziduale, prin procedee și tehnici de bioremediere, utilizând în acest scop mijloace biologice pentru transformarea lor integrală, fără efecte poluante și eficiente din punct de vedere economic.

Utilizarea unor microorganisme specifice pentru degradarea blănurilor și a resturilor de piele reprezintă o alternativă ecologică și un instrument de evaluare a biodegrabilității. Colagenul procesat și keratina insolubilă din blănuri sunt "digerate" de către microorganisme care au capacitatea de a produce enzime capabile să le degradeze.

Enzimele pot avea aplicabilitate în diverse stadii ale proceselor de prelucrare a blănurilor naturale, cum ar fi în înmuiere, leșiere, îndepartarea părului, spălare, vopsire și degresare, ca tratament fie în faza solida sau lichidă (Kanth et al., 2009; Kanth et al., 2008; Macedo et al., 2005; Dayanandan et al., 2003; Lutckmeier et al., 2008; Kumar et al., 2008).

În ciuda consolidărilor facute în alte aplicații industriale, utilizarea enzimelor în industria pielăriei are nevoie de mai multe cercetări pentru a fi utilizate propriu-zis pe scară largă și la costuri competitive.

Unele dintre avantajele utilizării enzimelor în industria pielăriei ar fi timpul de uscare mai scurt, îndepartarea proteinelor, grăsimilor și carbohidraților (Thanikaivelan et al., 2004). Enzimele mai pot fi folosite în procesele de îndepartare a epidermei și părului, a componentelor reziduale, îndepartarea/dispersarea componentelor adipoase și pentru reducerea grosimii pielii. (Wang et al., 2009).

Activitățile enzimatice sunt determinate utilizând cazeina ca substrat (BASF, 1995), în timp ce pieile de bovine nu au aceasta proteină în compoziția lor. Prin urmare este important sa stabilim activitațile pe colagen, componentul principal al pielii animalelor, și pe keratina în ordinea utilizării în procesarea pielariei.

Asigurarea calitãții mediului, prin soluționarea problemelor generate de acumularea deșeurilor din industria pielariei, utilizând mijloace biologice, farã efecte poluante și eficiente din punct de vedere economic, precum și utilizarea pe scarã largã a biotehnologiilor microbiene poate avea un impact pozitiv asupra condiției de sãnãtate a populației, prin reducerea gradului de poluare a biosferei.

Alegerea acestei teme a avut în vedere izolarea unor microorganisme capabile să degradeze deșeurile din industria pielăriei, prin optimizarea mediilor de cultură bacteriene specifice, de obținerea enzimelor pentru biodegradarea deșeurilor din industria pielăriei și de obtinere a unui hidrolizat care sa poată fi utilizat cu succes ca biofertilizator pentru culturile de cereale și leguminoase.

Tema de cercetare urmarește:

izolarea, selecția, caracterizarea, identificarea și testarea microorganismelor cu eficiență în degradarea accelerată a deșeurilor din industria pielăriei;

experimentarea biodegradabilității principalelor componente ale articolelor de blană naturală tăbăcită cu crom;

obtinerea enzimelor specific pentru biodegradarea deșeurilor din industria pielăriei

obtinere a unui hidrolizat care sa poată fi utilizat cu succes ca biofertilizator pentru culturile de cereale și leguminoase.

Rezultatele obținute în cadrul lucrării vor contribui la soluționarea prin mijloace biologice a problemelor generate de acumularea deșeurilor în industria pielăriei, oferind soluții biotehnologice pentru degradarea lor integralã, precum și pentru asigurarea calitãții mediului.

CAPITOLUL I

CHAPTER I

SISTEME BIOLOGICE DE DEGRADARE A PRODUSELOR DIN PIELE

BIOLOGICAL SYSTEMS OF LEATHER PRODUCTS DEGRADATION

1.1 ASPECTE PRIVIND COMPOZIȚIA PRODUSELOR DIN PIELE NATURALĂ

Pielea este considerată ca fiind unul dintre cele mai importante organe de depozitare a apei din organism, în totalitate aceasta conține 7 – 11% apă din organism.

Substanțele anorganice sunt reprezentate de o serie de cationi și anioni precum sodiu, potasiu, calciu, magneziu, cupru, zinc, fier, sulf, fosfor, clor, fluor, iar substanțele organice sunt reprezentate de proteine, hidrați de carbon și lipide.

Proteinele reprezintă constituentul cel mai important al organismului, datorită multiplelor și variatelor roluri pe care le îndeplinesc.

Moleculele proteice se împart în proteinele globulare sferice sau elipsoidale (solubile în apă, soluții apoase, acizi, baze, alcooli, cum ar fi protaminele, histonele, albuminele, globulinele) și proteinele fibrilare, cu moleculă  alungită, în general insolubile în solvenții menționați, rezistente la digestia enzimatică proteolitică. Ele se întâlnesc în piele, păr, unghii, țesuturi de susținere și constituie un grup de proteine eterogene, denumite scleroproteine, din aceasta grupă facând parte colagenul, elatina și keratina.

După compoziția chimică se împart în proteine simple, care prin hidroliză pun în libertate numai aminoacizi și conjugate, care în afară de aminoacizi mai conțin o componentă neproteică – grup prostetic (acid fosforic, glucide, lipide, acizi nucleici, hem) cum este cazul fosfoproteinelor, glicoproteinelor din țesutul conjunctiv, lipoproteinele, nucleoproteinele, cromoproteinele.

Dintre proteinele întalnite în piele, importanță prezintă keratina și elastina.

Din punct de vedere chimic, keratina se caracterizează print-un conținut mare de diaminoacizi și aminoacizi cu sulf (cistina, cisteina, histidina, triptofanul, leucina, izolecucina, tirozina, etc.), dintre care predomină cisteina, care îi conferă rigiditatea prin formarea punților disulfidice.

Există unele diferențieri ale keratinei din componența părului și a acelei din epiderm. În primul caz se remarcă predominența cistinei (16-18%) și a sulfului (5,20%) pe când în epiderm cistina reprezintă numai 2,5%, iar sulful 2 – 3 %, în schimb se găsește o cantitate mai mare de histidină.

Keratina provine din biosinteza aminoacizilor, pe de-o parte și din keratohialină, pe de alta parte, care este considerată ca un precursor al keratinei. Granulele de keratohialină sunt constituite dintr-un complex de lipoproteine și mucopolizaharide.

Studiile în domeniul difracției, cu raze X întreprinse de SWANBECK în 1959, evidențiază participarea lipidelor în procesul de keratinizare. S-a constat că fibrele proteice din stratul cornos (diametrul 250 Å), sunt înconjurate de o zonă lipidică de circa 80 Å, iar orice anomalie în metabolismul lipidic induce un proces patologic de keratinizare. Aceste argumente confirmă participarea lipidelor în acest proces complex (http://www.scrigroup.com/sanatate/cosmetica-frumusete/Biochimia-pielii92133.php)

Structura keratinei. Cu ajutorul difracției razelor X de către proteine (în stare cristalină sau fibroasă), s-au pus în evidență diferite structuri spațiale ale catenelor polipeptidice. S-a constatat de PAULING și COREY (1951), că lanțurile pot fi răsucite în spirală (helix, structura a) sau dispuse în 'foaie pliantă' (structura b).

Majoritatea cercetărilor admit astăzi modelul helicoidal cu caractere bine determinate. Configurația α-keratinei se întâlnește în firul de păr. ASTBURY și STREET (1931) denumesc această configurație, configurația a, iar keratina corespunzătoare α-keratina. În prezența umezelii catenele polipeptidice se extind complet formând o nouă configurație, configurația β-keratinei, ASTBURY și WOODS (1933). În epiderm keratina prezintă configurația a.

Keratina fiind o proteină greu solubilă, nu este hidrolizabilă de enezimele proteolitice, proprietăți datorate rezistenței legăturilor disulfidice -S -S- din keratină, alături de care mai participă și alte tipuri de legături (N-H+O=C), forțe de atracție Van der Vaals. Prin ruperea legăturilor -S-S- din keratină se formează mercaptoderivați și acid sulfuric, care pot da naștere apoi la produși de oxidare (alcooli, aldehide, acizi). Keratina este hidrolizată de acizi și baze concentrate.

Unii cercetatori admit trecerea α – keratinei în β – keratină, datorită scindării punților de hidrogen intralant. S-a constatat că α – keratina din epiderm prin încalzire la 850C poate trece în configurația β în timp ce α – keratina din păr și unghii își păstrează configurația.

Prin calitatea sa de a reflecta, difuza și absorbi radiațiile solare, keratina constituie un ecran alături de melanină, împotriva radiațiilor luminoase și ultraviolete.

Proteinele din derm sunt alcatuite dintr-o rețea de fibre proteice, o matrice interfibrilară  și celulele dermului.

Rețeaua proteică, reprezintă 15% din greutatea dermului proaspat sau 75% din cea a dermului uscat, delipidat. Aproximativ 90% din fibrele proteice ale dermului sunt formate din colagen, 10% din elastină și o foarte mică cantitate de reticulină (proteina fibrelor reticulate).

Aproximativ jumătate din totalitatea proteinelor existente în organismul uman (derm, ligamente, tendoane, cartilaje și alte țesuturi conjunctive) sunt reprezentate de colagen. În compoziția colagenului din derm se găsesc două fracțiuni: colagenul solubil și colagenul insolubil.

Colagenul solubil, denumit tropocolagen, se poate obține prin macerare (18 ore la 5oC) sub forma unui extract vascos, cu o soluție de clorură de sodiu sau cu un tampon fosfat (pH 7,6). Tropocolagenul are moleculă cu o lungime de 280 nm, diametrul 1,4 nm și alcatuiește fibrele de colagen din țesutul conjunctiv.

Tropocolagenul care se formează 'in vivo'  este considerat ca unitatea monomera a fibrelor de colagen, iar precursorul tropocolagenului este procolagenul sau forma de transport a colagenului.

Fibra de colagen este alcatuită din trei lanțuri polipeptidice dispuse helicoidal (forma a). Greutatea moleculară a tropocolagenului atinge 300.000 Da, la 350 – 400 resturi de aminoacizi, din care 120 sunt resturi de lizină și hidroxilizină.

Din punct de vedere chimic, colagenul conține cantități mari de glicoli (30%), prolină și hidroxiprolină (25%). Acesti ultimi doi aminoacizi conferă rigiditate și stabilitate moleculei de colagen.

Prin studiul difracției cu raze X a proteinelor fibrilare ELLIS și MC GAVIN (1970), au ajuns la concluzia că moleculele de colagen sunt formate din helicuri înmanunchiate de polipeptide. Fiecare mănunchi conține trei lanțuri polipeptidice PAULING și COREY (1951); fiecare lanț se rotește în jurul axei sau formând helixul minor (care conține 3 aminoacizi), iar cele trei lanțuri sunt ușor rotite unul în jurul celorlalte, formate din 10 resturi de aminoacizi).

Colagenul insolubil, rezultă din colagenul matur din 'vivo' și mai poartă denumirea de colastromin. Acesta se deosebește electronoptic, histologic și spectroscopic de cel solubil. El se poate obține din tratarea colagenului din țesutul cutanat cu o soluție de uree 6 M.

Elastina intră în componența fibrelor elastice din piele, din punct de vedere morfologic se prezintă diferit; unele fibre au aspect neregulat cu ramificări, iar altele formează adevarate rețele. Din punct de vedere biochimic fibrele elastice prezintă trei componente: o componentă proteică, mucopolizaharide acide și neutre și o componentă lipidică. Reacțiile histochimice confirmă prezența acestor componente: reacția de reducere pentru glucide și reacțiile Schiff și cu derivați osmici, pentru lipide.

Aceasta conține cantități mari de alanină, valină, prolină și cantități mici hidroxiprolină (1 – 6%), ceea ce le diferențiază de colagen. În compoziția elastinei se semnalează prezența a doi aminoacizi specifici, desmozina și izodesmozina. Culoarea galbenă a țesuturilor care conțin elastină se datorează unui pigment fluorescent, numit pigment galben. Ea conferă elasticitate fibrelor elastice, a căror proprietăți scad prin depozitarea în elastină a derivaților de colesterol.

Reticulina reprezintă o altă componentă a rețelei proteice din derm, se situează într-o poziție intermediară între colagen și elastină din punct de vedere a compoziției chimice. În aceasta proteină s-a găsit mai multă hidroxiprolină decât în elastină și cantități relativ mari de leucină și izoleucină, asemănător elastinei. Principala diferență între reticulină și colagen o constituie prezența unui număr mare de grupări glucidice conținute de reticulină. Fibrele de reticulină nu sunt sensibile la acțiunea hialuronidazei, ceea ce indică lipsa mucopolizaharidelor din moleculă. Reticulina din piele posedă o structură în care intră complexe glicoproteice cu o organizare macromoleculară care depinde de organ.

Fibrele de colagen predomină în orice regiune a dermului, elastină și reticulină sunt mai frecvent întalnite în stratul papilar al corionului.

Matricea interfibrilară (substanță interfibrilară, fundamentală) are consistența unui gel imprimată de prezența unei rețele submicroscopice tridimensionale, constituită din complecși mucopolizaharidici și proteine. Ochiurile acestei rețele conțin apă în care sunt dizolvați electroliți (NaCl, HCO3Na, etc.), substanțe organice cu greutate moleculară mică (glucoză, aminoacizi) și proteine asemănătoare celor serice.

Celulele dermului ocupă un volum redus în comparație cu cel al fibrelor de colagen și a substanței fundamentale.

Hidrații de carbon din compoziția chimică a pielii sunt constituiți din monozaharide și polizaharide.

Monozaharidele, sunt reprezentate în special de glucoză, întalnită în celulele stratului bazal și malpighian, iar polizaharidele, sunt produși de policondensare a monozaharidelor tipice (aldoze, cetoze) sau din derivații acestora, acizi uronici, aminozaharuri, esteri. Rolul biologic al polizaharidelor este acela de materiale structurale, componente plastice ale țesuturilor conjunctive sau de depozit (glicogenul din țesuturile animale).

Dintre polizaharide, în piele sunt prezentate glicogenul și mucopoli-zaharidele. Glicogenul, ca o mică fracțiune de rezervă, este prezent în stratul lucid și în zona generatoare bazală a epidermului; în cantitate mai mare se găsește în foliculii piloși. Mucopolizaharidele se întâlnesc în substanța fundamentală care umple spațiile intercelulare și interfibrilare ale țesutului conjunctiv din derm.

Acesti compuși nu sunt utilizați de organism ca surse de energie, ele se acumulează în spațiile intercelulare; în țesutul conjunctiv al dermului, mucopolizaharidele formează complecși mucoprotidici cu rol funcțional.

Având în vedere metabolismul hidraților de carbon și a mucopolizaharidelor, se poate observa cum glucoza se transformă în hexoxamină și acid glucuronic, componente ce intră în compoziția acidului hialuronic și condro-itinsulfuric. Prezența L-glutaminei în epiderm explică sinteza mucopolizaharidelor în piele.

Prezența mucopolizaharidelor în epidermul uman și în special în spațiile intercelulare a fost pusă în evidență prin reacții histochimice, iar studiile de microscopie electronică au confirmat rolul acestora de 'substanțe ciment' între celulele epidermului.

Mucopolizaharidele rețin cantități de apă datorită prezenței unui mare număr de grupări acide ionizate (-COO- și  -O-SO3-), formând soluții coloidale, geluri care realizează un ciment intercelular flexibil.

Mucopolizaharidele, se diferențiază prin compoziția chimică și funcția lor biologică în două clase: mucopolizaharide acide și neutre. Cele acide conțin în moleculă acizi uronici și acid sulfuric, iar cele neutre sunt fără resturi de acizi în moleculă. Spre deosebire de cele acide, mucopolizaharidele neutre sunt puternic cuplate cu proteine, putând fi puse în libertate numai printr-o hidroliză severă. In derm mucopolizaharidele neutre intră în constituția majorității complexelor proteice a lichidului interstițial.

Din grupa mucopolizaharidelor acide face parte acidul hialuronic și condroitin  sulfații A, B, C.

Acidul hialuronic este un polimer cu greutate moleculară mare, fiind constituit din unități de N-acetil glucozamină și acid-D-glucuronic.

Acidul hialuronic se găsește în derm (0,10 – 1,0%) sub formă de sare de sodiu, rezultată din fixarea  unei cantități echivalente de ioni de sodiu din celulă. El se găsește în cantități mai mari în dermul papilar și la nivelul membranei bazale; prezența lui în vecinatatea dermului favorizează schimburile între derm și epiderm.

Prin studiile efectuate cu raze X s-a demonstrat ca acidul are o structură macromoleculară filamentoasă, filamentele de hialuronat se orientează  în direcții preferențiale în substanța fundamentală, conferindu-i acesteia o permeabilitate mărită.

Soluțiile de acid hialuronic sunt foarte vâscoase, o serie de proprietăți ale acestora, viteza de sedimentare, viteza de difuziune, birefringența, vâscozitatea etc., variază în funcție de concentrația în ioni de sodiu.

Acidul hialuronic se degradează în prezența enzimei specifice, hialuronidază. Drept  urmare a acestui proces are loc o scădere a gradului de polimerizare a acidului hialuronic, trecerea substanței fundamentale din stare de gel în stare de sol și creșterea permeabilității și a difuziunii intradermice.

Hialuronidazele provin din diferite surse, dintre care se menționează cea tisulară și cea bacteriană. Produșii de degradare în urma acțiunii hialuronidazei, sunt tetrazaharide (80%), dizaharide (10%) și restul oligozaharide. Acidul hialuronic suferă degradări și sub acțiunea unor agenți reducători (cistina, acid ascorbic, fier, cupru, radiații ultraviolete), care au un efect depolimerizant asupra macromoleculei.

Condroitinsulfații se diferențiază de acidul hialuronic, ei fiind alcatuiți din resturi de acid glucuronic asociate cu resturi de N-acetil-galactozamină și o grupare ester sulfurică. Există trei condroitin sulfați: A, B și C; dintre aceștia prezintă importanța condroitin sulfatul  B (dermatansulfat), care este constituent principal al țesutului conjunctiv din piele și al substanței fundamentale.

Condroitinsulfații formează complexe cu proteinele, jucând un rol important în transportul electroliților. Ei sunt degradați de condroitinază, enzima specifică care degradează macromolecula până la oligozaharide, tetrazaharide.

Lipidele sunt sintetizate în piele atât în glandele sebacee cât și în epiderm. Ele joacă un rol important în menținerea funcției de barieră și a integrității structurale ale stratului cornos.

În compoziția grăsimilor pielii se găsesc trigliceride (15 – 37%), fosfolipide (1,8 – 7,1%), acizi grași liberi (aproximativ 30%), din care mai mult de jumatate sunt acizi cu 16 și 18 atomi de carbon, saturați sau nesaturați, dar există și o cantitate apreciabilă de acizi grași cu un număr mai mic de atomi de carbon. Restul componenților sunt reprezentați de acizi esterificați, ceride (30%), squalen (18%), steroli (1,5 – 3,5%) și o mică cantitate de hidrocarburi parafinice.

Cercetarile au demonstrat ca ceridele și squalenul sunt secretate ca atare numai de glandele sebacee.

În epiderm se găsesc vitaminele A și D (provitamine), iar în derm sunt prezente vitaminele B1, B2, B6, acidul pantotenic, vitamina C, vitamina H și vitamina PP în peretele capilarelor.

1.2. MODALITĂȚI DE DEGRADARE BIOLOGICĂ A PRODUSELOR DIN BLANĂ NATURALĂ

Microorganismele își realizează activitățile metabolice prin mecanisme similare cu cele implicate în metabolismul organismelor superioare.

Acestea prezintă o capacitate unică de degradare a unor substanțe complexe din mediu și de a sintetiza anumiți metaboliți, unii folositori omului.

Luate ca grup, bacteriile își pot realiza metabolismul folosind numeorase și diverse surse de substanțe nutritive, începând cu azotul molecular și sulful, până la cele mai complexe substanțe organice. Acestea se pot dezvolta pe anumite soluții de acizi – axalic, formic, sulfuric; pe substraturi cu fenoli, proteine, țiței; pot degrada asfaltul, masele plastice, cauciucul, lemnul, parafinele, chiar și pe unele substanțe antibiotice.

Aceste particularități explică faptul că, deși au fost depuse numeorase produse de uzură și de excreție, cadavre, reziduuri, acestea nu s-au acumulat pentru că au fost descompuse de către microorganisme și reintroduse în ciclul elementelor biogene.

1.3. SELECȚIA MICROORGANISMELOR CAPABILE SĂ DEGRADEZE BLĂNURILE NATURALE

Microorganismele capabile să producă enzime proteolitice, pot fi izolate din diferite habitate: sol, aer, apă, din diferite alimente, furaje, produse vegetale. Acestea trebuie să îndeplinească calități cum ar fi producția sistemului enzimatic în cantitățile dorite, să aibe o mare stabilitate și să nu fie patogene sau sa nu producă substanțe toxice care ar putea denatura preparatul enzimatic (TAPAI M., 2009; STOICESCU A., 1999).

Cercetările pentru selecția tulpinilor bacteriene producătoare de proteaze încep prin izolarea din habitate de referință a unui număr mare de tulpini.

Cele mai cunoscute tehnici de izolare și purificare a culturilor de microorganisme sunt tehnica diluțiilor și tehnica culturilor de sol. Deseori sunt create condiții selective de cultivarea a microorganismelor pe medii solide sau lichide continând anumite principii cu ajutorul cărora se pot evidenția unele caracteristici fiziologice. După etapa de izolare și realizarea culturilor pure prin tehnici directe (de micromanipulare) sau indirecte (epuizarea ansei și diluții) se trece la screeningul tulpinilor luate în lucru după criterii cantitative și calitative, conform scopului dorit. TAPAI M. (2009)

Metodele clasice de screening al microorganismelor cu potențial proteolitic se bazează pe proprietatea enzimelor biosintetizate de a hidroliza proteinele adăugate în mod intenționat în mediul de cultură. JURCOANE Ș.et al (2009)

Pentru izolarea tulpinilor înalt producătoare de proteaze se utilizează diferite teste calitative de cultivarea microorganismelor în placi Petrii pe medii solidificate cu agar-agar, continând substratul natural al enzimelor dorite, la temperatura optimă specifică fiecărei tulpinii și determinarea zonelor de hidroliză ce apar în jurul coloniilor. După dezvoltarea coloniilor izolate, enzimele difuzează în gelul de agar-agar atacând substratul inclus în mediu. Cu cât aceasta este mai extinsă cu atat microorganismul respectiv este mai bun producător
(BURCEA MIRELA, 2001; TAPAI M., 2009).

Testele cantitative se efectuează prin determinarea precisă a activității enzimatice a extractelor sau lichidului de biosinteză prin metode spectrofotometrice, de fluorescență, titrimetrice, manometrice.

În urma acestor teste se rețin numai câteva tulpini care sunt apoi cercetate în vederea identificării și caracterizării după criterii morfologice, biochimice, fiziologice, imunologice, virulență-patogenitate, etc. (MENCINICOPSCHI GH.,1987; TAPAI M., 2009).

Într-un proces de producere a unei enzime cu ajutorul microorganismelor cel mai important lucru este alegerea unui organism producător corespuzător. Când se alege microorganismul potențial producător de enzime, trebuie să se aibă în vedere dacă enzima de interes este produsă intra- sau extacelular; avantajele și dezavantjele care derivă din localizarea enzimelor. Preferința pentru localizarea enzimei va fi dictată de stabilitatea enzimei, complexitatea mediului de producție și ușurința dezintegrării celulelor în vederea purificării enzimei de interes.

Trebuie să avut în vedere ca tupina producătoare să nu fie amenințată de produșii de sinteză și să nu fie posibilă o contaminare a preparatului enzimatic cu o tupină patogenă sau cu toxine provenite de la microorganismul producător.

Microorganismele alese trebuie să fie capabile să crească în medii de cultură simple, ieftine și care să nu necesite adăugarea de promotori de creștere scumpi, să fie stabile din punct de vedere genetic, să producă cantități mari din enzimă dorită în cel mai scurt timp, să fie ușor de separat din mediul de biosinteză la sfârșitul fermentației și, dacă este cazul, să fie ușor dezintegrabile (pentru enzime intracelulare).

1.4. TEHNOLOGII DE DEGRADARE BIOLOGICĂ A RESTURILOR DE BLANĂ APPLICATE INDUSTRIAL

Procesul de creștere a microorganismelor se desfășoară prin sinteza specifică echilibrată a constituenților celulari, pornind de la substanțe nutritive simple aflate în mediul de cultură. (ZARNEA, G. 1994)

Procesul de creștere a microorganismelor depinde în evoluția sa și de natura și concentrația substanțelor nutritive în mediu, precum și de asigurarea cu energia necesară reacțiilor de sinteză, specific, echilibrate, pornind de la substanțele nutritive din mediu, a unor compuși noi care sunt asamblați pentru a forma copii fidele ale constituenților celulari. Specificitatea procesului este determinată de intervenția unor mecanisme de control genetic. Pe de alta parte, procesul de creștere depinde în evoluția sa de natura și concentrația substanțelor nutritive din mediu și de aprovizionarea continuă a celulei cu energia necesară reacțiilor endotermice de sinteză (MENCINICOPSCHI GH.,1987; TAPAI M., 2009)

Mărirea volumului celular se face atât prin sinteza de substanță organică cât și prin mărirea conținutului în apă. Creșterea microorganismelor nu are loc indefinit, ci se întrerupe când se produce diviziunea celulară.

Activitatea normală a microorganismelor este condiționată de existența unui anumit raport între volumul celulei și suprafața ei, prin care se face absorbția substanței nutritive și eliminarea cataboliților. În cursul creșterii celulei, raportul suprafață/volum se modifică datorită faptului că, în timp ce suprafața crește cu o relație pătratică, volumul ei se modifică cu o relație cubică, ceea ce determină o diminuare relativă a suprafeței celulare, fapt ce îngreunează schimbul de substanțe și, atunci când disproporția dintre suprafață și volum atinge un anumit punct critic, se produce diviziunea celulară.

În cadrul proceselor biotehnologice, studiul creșterii și multiplicării microorganismelor producătoare are o importanță deosebită pentru eficiența tehnologiilor industriale. Viteza de multiplicare a bacteriilor este excepțional de mare. Durata unei generații este tipică pentru fiecare specie, dar poate varia la aceeași specie în funcție de condițiile de mediu. Spre deosebire de organismele pluricelulare la care multiplicarea celulelor duce la mărirea taliei individuale, la toate celelalte organisme unicelulare ea are ca rezultat creșterea numărului de indivizi.

Procesul multiplicării populațiilor bacteriene cuprinde mai multe faze. Prima faza este faza de lag sau latență și este cuprinsă între momentul inoculării microorganismului și momentul în care celulele acestuia încep să se multiplice, perioadă care durează în medie câteva ore. În această fază, numărul bacteriilor din inocul rămâne neschimbat sau chiar scade temporar. Faza de latență apare ca o perioadă de adaptare în noile condiții de cultivare în această perioadă bacteriile viabile din inocul își acumulează în celulă metaboliții esențiali și sistemele enzimatice necesare creșterii.

La transvazarea inoculului într-un mediu nutritiv inoculul bacterian care provine dintr-o cultură aflată în curs de multiplicare și se transvazează un mediu nutritiv cu aceeași compoziție, multiplicarea bacteriilor își menține în continuare ritmul, iar dacă bacteriile provin dintr-o cultură tot în fază exponențială de multiplicare, dar se transvazează un mediu nutritiv cu altă compoziție, atunci ele au o perioadă de adaptare. Durata perioadei de lag variază, în funcție de noile condiții de mediu pe care microorganismele le găsesc la transvazare. Cu cât aceste condiții sunt mai apropiate de cele anterioare, cu atât perioada de lag este mai scurtă.

Faza de multiplicare exponențială sau de creștere logaritmică este precedată de o perioadă scurtă de accelerare a ritmului de creștere, în care multiplicarea se produce cu o viteză progresivă mărită. După această perioadă, diviziunile sunt bine sincronizate, astfel încât numărul celulelor viabile se dublează brusc și la intervale regulate.

Capacitatea de creștere exponențială se manifestă numai o scurtă perioadă de timp. Tendința de multiplicare rapidă scade progresiv, datorită epuizării substanțelor nutritive din mediu și acumulării în el a produselor de catabolism în concentrații cu efect inhibitor.

În faza de log, celulele considerate a fi de tip embrionar au dimensiuni mai mari decât cele specifice speciei de care aparțin, citoplasma lor este omogenă, nu conține materiale de rezervă și are o mare afinitate pentru coloranții bazici, datorită conținutului ridicat în ARN. Perioada în care celulele se afla în faza de multiplicare exponențială corespunde unor transformări permanente.

Spre sfârșitul fazei de multiplicare logaritmică apare perioada de postlog, în care are loc încetinirea și sincronizarea creșterii populației bacteriene. În această perioadă cultura tinde spre un echilibru între diviziune și mortalitate.

Faza staționară reprezintă faza în care numărul celulelor viabile este maxim și rămâne constant o perioadă de timp care durează de la câteva ore, la câteva zile, în funcție de sensibilitatea bacteriilor la condițiile de mediu.

Intrarea culturii în faza staționară este determinată, de obicei, de epuizarea substanțelor nutritive din mediu sau de acumularea unor produși toxici. În această fază, celulele nu se mai multiplică, iar numărul total al indivizilor populației este constant și egal cu numărul celulelor viabile. Celulele bacteriene sunt considerate mature, având caracteristici morfologice specifice speciei: dimensiuni mai mici decât în faza de creștere exponențială, citoplasma mai puțin omogenă datorită apariției de incluzii și acumulării unor substanțe de rezervă, afinitate normală pentru coloranți și prezența sporilor la speciile sporogene.

Faza de declin este reprezentată de scăderea progresivă a numărului celulelor viabile. Celulele din această fază sunt bătrâne, apărând fenomene de involuție: celulele mici, sferice, deformate, gigante sau ramificate, care se colorează slab, etc. În unele cazuri se produc fenomene de autoliză, ceea ce determină scăderea numărului total de celule din mediu.

Creșterea unui microorganism se poate aprecia prin determinarea substanței uscate a masei celulare a concentrației sursei de carbon din mediu; a numărului total de celule; a gradului de turbiditate al suspensiei bacteriene într-un mediu lichid, în raport cu o scară etalon sau la fotocolorimetru (D.O.).

De regulă, pentru fiecare bacterie se determină creșterea densității optice (D.O.) pe parcursul ciclului de dezvoltare și se reprezintă grafic în funcție de timp.

Biosinteza proteazelor bacteriene se realizează în mai mulți pași în contextul în care factorii de mediu implicați în creșterea optimă a microorganismului pot fi diferiti față de cei solicitați în producerea enzimei. Acești parametrii includ suplimentarea cu nutrienți, pH-ul mediului, relația osmotică, gradul de aerare, temperatura și controlul contaminării în timpul fermentației, mai ales când fermentația are loc în condiții aerobe.

Microorganismele sunt capabile să sintetizeze toți aminoacizii de care au nevoie folosind pentru aceasta elementele nutritive sau diferiți intermediari metabolici. Aminoacizii pot fi elaborați pornind de la anumiți precursori ce reprezintă intermediari ai unor căi metabolice. Reacțiile de transaminare în cursul cărora un grup amino este transferat de la un compus la altul reprezintă una dintre modalitățile de producere a aminoacizilor. Căile de biosinteză a aminoacizilor sunt variate și complexe, presupunând mai multe etape intermediare, iar aminoacizi produși, întotdeauna sunt utilizati, deoarece căile respective sunt reglate eficient prin două modalități: represie la nivel genetic și retroinhibiție enzimatică.

În cazul represiei, produsul final al căii metabolice, aminoacidul, interacționează cu o proteină represoare inactivă pe care o activează și, în felul acesta blochează transcrierea genelor ce codifică enzimele implicate în calea de biosinteză. Procesul de blocare durează până când nivelul produsului final, aminoacidul, scade sub o anumită valoare, moment în care transcrierea este reluată. În privința retroinhibiției enzimatice, aceasta este o modalitate de reglare mult mai rapidă și mai economică pentru celulă, ea constând în blocarea căii de biosinteză prin inactivarea primei enzime a căii respective în urma interacțiunii cu produsul finit al acesteia. Aminoacizii produși de celule sunt apoi folosiți pentru sinteza unor proteine specifice, pe baza informației genetice proprii organismului respective (JURCOANE Ș.et al 2009)

Deși detaliile cu privire la procesul de fermentație adoptat de diferiți cercetători variază, rămân două metode principale pentru producerea proteazelor: procedeul fermentației submerse și procedeul culturii de suprafață. (EL-SAFEY, E. M, 1994; TAPAI M., 2009)

Procedeul culturilor submerse s-a generalizat în prezent datorită faptului că la aceeași capacitate de producție necesită ulilaje mai simple și o exploatare mai ușoară.

Utilizarea pe scară largă a proteazelor microbiene a determinat creșterea progresivă a interesului față de aceste enzime. Numeroase cercetări au condus la obținerea acestora în stare de puritate avansată, stabilirea parametrilor optimi de activitate și stabilitate, precizarea mecanismelor lor de acțiune și la stabilirea structurii lor.

O serie de proteaze, cu precădere cele de origine bacteriană sunt obținute și comercializate ca preparate enzimatice utilizate în diferite sectoare industriale. Aria largă de utilizare practică este determinată de avantajele pe care le oferă acest tip de preparate, respectiv viteze ridicate de cataliză, specificitate, acțiune în condiții de pH, temperatură, presiune etc. aproape normale.

Obținerea cu regularitate a șarjelor de cultură cu conținut ridicat în proteaze depinde de starea fiziologică a microorganismului utilizat ca inocul și de parametrii de biosinteză: pH, temperatură, agitare, rată de aerare, durata cultivării, caracteristicile fizico-chimice ale mediului nutritiv (POONAM N., DALEL S., 1995)

Variațiile temperaturii au efect asupra randamentului de transformare a substratului în produsul dorit, asupra cerințelor nutritive ale microorganismului și compoziției biomasei obținute precum și asupra vitezei de creștere microbiană.

Efectul temperaturii asupra creșterii microorganismelor se explică prin faptul că aceasta afectează multe procese metabolice din celulă, precum și compoziția biomasei în proteine, lipide și conținutul de ARN al celulei. Este posibil ca structura lipidică a membranei celulare să se modifice continuu în funcție de variațiile de temperatură, astfel încât membrana să-și mențină funcția reglatoare. Valoarea pH-ului este, alături de temperatură, un parametru important în procesele de biosinteză.

Microorganismele au un domeniu optim de pH pentru dezvoltare, în care viteza specifică de creștere atinge valoarea maximă. Valoarea pH-ului influențează randamentul de conversie a substratului la un anumit produs. Formarea produsului dorit în urma procesului de biosinteză poate să fie legată de desfășurarea bioprocesului într-un domeniu foarte strict de pH.

În timpul dezvoltării unei culturi microbiene apar deviații ale pH-ului de la valoarea considerată optimă, care pot avea urmări nedorite asupra procesului de biosinteză. Aceste modificări se pot datora fie consumării unui nutrient – sursa de carbon sau azot, fie producerii unui acid organic de către microorganism. PH-ul acționează asupra caracteristicilor suprafeței celulei, modificând proprietățile ei de aderare la diferite materiale (sticlă, metale) precum și cele de floculare.

CAPITOLUL II

CHAPTER II

SISTEME BIOCHIMICE DE DEGRADARE A PRODUSELOR DIN PIELE NATURALĂ

BIOCHEMICAL SYSTEM OF LEATHER PRODUCTS DEGRADATION

2.1 MODALITĂȚI DE DEGRADARE BIOCHIMICĂ A BLĂNURILOR

Enzimele catalizează reacțiile biochimice din organism, având un rol esențial în biosinteza și degradarea substanțelor din materia vie, întâlnindu-se în toate organismele vii, mai fiind denumite din această cauză biocatalizatori, având rol în descompunerea macromoleculelor, de accelerarea proceselor metabolice și coordonarea unor etape ale ciclului metabolic.

Acestea sunt substanțe de natură proteică și reprezintă macromolecule, compuse din lanțuri polipeptidice, având o masă moleculară între 10.000 – 1.000.000 Da.

Enzima formează cu substratul un produs intermediar reactiv, cu o viață scurtă. Sub această formă intermediară, substratul intrat în reacție suferă modificări electronice sub acțiunea centrilor activi ai enzimei, rezultând produsul de reacție.

Enzimele proteolitice de origine microbiană sunt printre cele mai importante enzime obținute folosind biotehnologii moderne, și au o deosebită semnificație datorită unei largi arii de aplicabilitate în divese procese industriale.

Proteazele microbiene constituie un grup complex de enzime hidrolitice, care diferă prin specificitatea de substrat, mecanismul de reacție, dependența activității enzimatice și stabilității de pH și temperatură. Acțiunea lor poate fi blocată, activată, sau inhibată într-o anumită proporție de agenți fizici, chimici sau biologici. Producția și caracteristicile acestora pot fi influențate prin selecția tulpinii producătoare și alegerea condițiilor de cultivare ale acesteia.

Enzimele din această categorie hidrolizează majoritatea proteinelor comune, cum ar fi: cazeina, hemoglobina, gelatina, albumina de ou, glutenul, proteina din soia și alte proteine vegetale și animale. Condițiile de hidroliză precum și randamentul operației în sine depind, însă, de natura, caracteristicile și gradul de puritate al preparatului enzimatic utilizat.

Numeroasele utilizări ale enzimelor proteolitice, în cele mai diferite domenii au determinat demararea cercetărilor în vederea obținerii acestora pe cale biotehnologică, ținând seama în același timp de avantajele pe care le oferă utilizarea microorganismelor ca sursă biologică, precum și de proprietățile enzimelor microbiene

Peptidhidrolazele cunoscute și sub denumirea generală de enzime proteolitice, au capacitatea de a cataliza scindarea hidrolitică a legăturilor -CO-NH- peptidice din proteine, polipeptide și oligopeptide până la peptide de diferite mase moleculare sau chiar la aminoacizi, cu fixarea componentelor apei.

În funcție de provienența lor, hidrolazele peptidice pot fi de origine vegetală, animală sau microbiană, produse de diferite bacterii, fungi, actinomicete, iar după locul în care își exercită acțiunea, proteazele pot fi intracelulare și extracelulare.

În ultimele decenii, aprofundarea informațiilor privind procesele și diversificarea mijloacelor tehnice de cultivare a microorganismelor la nivel industrial, pentru obținerea de aminoacizi, enzime, proteine, au determinat creșterea interesului pentru realizarea unor preparate enzimatice proteolitice din microorganisme în special din bacterii și fungi.

Multe dintre microorganismele folosite la producerea de preparate proteolitice produc aceste enzime extracelulare, ceea ce ușurează foarte mult condițiile de prelucrare industrială pentru obținerea de preparate enzimatice. Datorită acestui fapt, există în prezent tendința ca o serie de preparate proteolitice de natură vegetală sau animală să fie înlocuite cu preparate proteolitice microbiene care sunt, în general, mai ieftine și de o mai mare diversitate.

2.2 MECANISMUL DE DEGRADARE A PRODUSELOR DIN PIELE NATURALĂ

În celule reacțiile nu decurg izolat, ci organizat în secvențe multiple formând așa-numita cale metabolică, în care produsul unei reacții servește ca substrat reacției următoare. Ca urmare, diferitele căi se intersectează formând o rețea de reacții biochimice integrate și cu un scop final denumită metabolism.

Metabolismul se studiază în mod obișnuit prin examinarea componentelor acestuia. Fiecare metabolism este compus din secvențe multienzimatice și fiecare enzimă, la rândul ei, poate exercita o acțiune catalitică sau reglatoare. Harta metabolică conține căile centrale ale energeticii metabolismului. Majoritatea căilor metabolice pot fi clasificate în căi catabolice sau degradative și căi anabolice sintetice. Reacțiile catabolice degradează molecule complexe ca proteine, poliglucide și lipide, la câteva molecule simple, de exemplu CO2, NH3 și H2O. Calea anabolică formează produși finali complecși din precursorii glicoliza.

Metabolismul reprezintă totalitatea reacțiilor biochimice prin intermediul cărora microorganismele preiau din mediu energie și nutrienți pe care ii folosesc la activitățile lor fundamentale. Acești nutrienți reprezintă elemente esențiale pentru viața celulei și se numesc elemente biogene.

Substanțele din mediu sunt utilizate pentru producerea de energie, pentru sinteza de constituienți celulari, pentru creșterea celulei și desfașurarea normală a activităților sale fiziologice și pentru producerea de metaboliți.

Metabolismul bacterian este realizat printr-o serie de căi metabolice, reprezentate de secvențe și reacții chimice catalizate de enzime. Evoluția acestor căi metabolice este reprezentată de degradarea substanțelor nutritive preluate din mediu cu eliberare treptată de energie și folosirea energiei eliberate în procesele de biosinteză a constituienților celulari.

Căile metabolismului bacterian sunt reprezentate de căile catabolice care reprezintă ansamblul căilor biochimice prin care se realizează degradarea nutrienților preluați din mediu cu eliberare de energie.

Catabolismul reprezintă ansamblul de reacții de degradare ce asigură eliberarea elementelor constitutive ale moleculelor și ale macromoleculalor și recuperarea unei mari părți a energiei conținute de legăturile chimice ale compușilor folosiți. Biodegradarea microbiană constituie în plus calea prin care în natură are loc reciclarea compușilor organici și anorganici. Biodegradarea completă a unui substrat până la constituenții săi anorganici poartă denumirea de mineralizare.

În fazele reacției catabolice macromoleculele nutrienților sunt degradate până la subunitățile lor de constituție, adică de la proteine la aminoacizi, cu eliberare de aproximativ 1% din energia nutrienților, care se pierde sub forma de caldură.

Moleculele rezultate în prima fază sunt degradate în continuare cu formarea unui număr limitat de molecule mici ce reprezintă compușii intermediari ai căii centrale. Numărul acestor compuși intermediari este diferit în funcție de tulpina bacteriană utilizată. În această etapă se eliberează 1/3 din energia existentă în compușii respectivi.

Ultima fază a reacției catabolice este diferită în funcție de natura reacțiilor metabolice. În aerobioză reacțiile evoluează cu metabolizarea completă a compușilor intermediari până la dioxid de carbon și apă cu eliberare mare de energie înmagazinată apoi în ATP prin degradarea moleculelor bogate în energie. Complex se desfășoară în trei etape: hidroliza, conversia și oxidarea acetil CoA.

Reacția de hidroliză este procesul de desfacere a unei legături chimice prin combinare cu apa (H2O). Aceasta se realizează prin scindarea moleculei de apă în hidrogen și hidroxil (-OH). În acest fel sunt desfăcute în biologie prin procesele metabolice cu ajutorul enzimelor moleculele mari de proteine, polizaharahide sau lipide în molecule mai mici monomere.

În oxidarea acetil CoA ciclul acidului citric este calea comună finală a oxidării moleculelor de rezervă. Acetil CoA este oxidată la două molecule de CO2 și patru perechi de protoni (H) care sunt transferați la coenzimele NAD+ și FAD pentru producerea de NADH + H+ și FADH2. Este generată și o cantitate mare de energie din ATP, când electronii de la NADH + H+ și FADH2 sunt transferați la oxigen în fosforilarea oxidativă.

Conversia și oxidarea acetil CoA reprezintă punctul de legătură catabolică și anabolică din organism. Pornind de la acetilcoenzima A se pot sintetiza mai multe clase de biomolecule. Catabolizarea unităților structurale cum ar fi monoglucide, aminoacizi etc. rezultate prin hidroliză se face pe cale oxidativă, cu consum de oxigen. Din oxidarea acizilor grași rezultă cele mai importante cantități de energie, dar oxidarea glucidelor decurge mai rapid, fiind utilizată deseori de către organismul animal pentru nevoile imediate de energie. Dioxidul de carbon și apa reprezintă produșii finali ai oxidării acetilcoenzimei A în ciclul ATC (ciclul acizilor tricarboxilici) cuplat cu catena de respirație și fosforilare oxidativă. Dioxidul de carbon rezultă prin decarboxilarea unor acizi, de exemplu acidul α-cetoglutaric în ciclul ATC. Apa rezultă în catena de respirație pornind de la hidrogenul preluat de pe diferite substrate subformă de coenzime în stare redusă (NADH, FADH2) și oxigenul molecular. Prin cuplarea catenei de respirație cu fosforilarea oxidativă, energia care rezultă în procesulde formare al apei este înmagazinată în legăturile macroergice ale ATP.

Catabolismul generează, de asemenea, molecule care sunt convertite în cărămizi de construcție, necesare sintezei de molecule complexe. Pentru hidroliza moleculelor complexe în molecule mai mici, acestea sunt degradate în molecule simple. De exemplu, proteinele sunt degradate în aminoacizi, poliglucidele în monoglucide și trigliceridele în acizi grași liberi și glicerol.

În etapa următoare moleculele mai mici, rezultate în prima fază, sunt degradate în continuare la acetil CoA și o serie de alte molecule simple.

O altă cale a metabolismului bacterian este reprezentată de anabolism, care se desfășoară în sensul utilizării compușilor intermediari ai căii centrale pentru sinteza constituienților proprii celulei bacteriene, proces care evoluează în faze succesive. În timpul procesului de anabolism se sintetizează macromolecule de depozit, adică polimeri uniformi, formați prin legarea unor monomeri în lanțuri de diferite dimensiuni – într-o primă fază monomeri, în a doua fază diataxie – subunitățile constituie în prima fază fiind așezate într-o ordine riguroasă, dictată exact de informația genetică din genom.

Căile amfibolice sunt reprezentate de căile metabolice centrale, care îndeplinesc în același timp și funcția de eliberare de energie și funcția de furnizare a unor precursori necesari biosintezei.

Căile anaplerotice sunt cunoscute ca fiind căi auxiliare sau de reaprovizionare, deoarece compușii intermediari ai căilor centrale sunt în permanență îndepărtați din celulă, pe de-o parte în cursul degradării progresive enzimatice, cu eliberare de energie în catabolism, iar pe de alta parte prin utilizarea lor în diferite biosinteze ce au loc în celulă.

Căile metabolice auxiliare asigură completarea deficitului căilor metabolice principale, prin aprovizionarea cu diverși compuși și permit funcționarea îndelungată a acestora.

2.3 DESCRIEREA SISTEMULUI ENZIMATIC IMPLICAT ÎN DEGRADAREA BLĂNURILOR

Există reacții catalizate de o singură enzimă în celulă, însă majoritatea căilor metabolice au un număr de etape intermediare, adică între substanța inițială ce urmează a fi transformată și produsul final iau naștere o serie de produși intermediari. Fiecare etapă intermediară este catalizată de o anume enzimă, iar reacția în total este catalizată de un sistem enzimatic.

Într-un astfel de sistem nu toate enzimele au aceeași importanță funcțională; cele care au rolul principal se numesc enzime limitative sau enzime "cheie". Sistemul enzimatic este riguros coordonat, etapele se succed într-o anumită ordine în așa fel ca produsul unei reacții să servească ca substrat pentru etapa următoare. Această succesiune de reacții trebuie să fie neîntreruptă deoarece blocarea uneia conduce la blocarea întregului sistem. De asemenea, unii intermediari pot fi utilizați în alte căi metabolice. Este necesară deci o coordonare cantitativă pentru fiecare sistem enzimatic.

Asupra mecanismului catalizei enzimatice s-au facut cercetarări prin studii cinetice și de specificitate, prin analiza chimică a situsurilor active ale enzimelor și prin comparație cu ajutorul difracției de raze X, a structurii unor enzime și a complecșilor lor cu substraturi mici sau inhibitori competitivi.

Cataliza enzimatică presupune existența a trei etape cum ar fi aproprierea și orientarea substratului de situsul catalitic în așa fel încât legătura sa susceptibilă să fie în imediata vecinătate a centrului catalitic activ al enzimei și se orientează față de acesta astfel încât starea de tranziție să fie formată ușor. Enzima acționează prin încercarea de legare a substratului la centrul catalitic activ; astfel, în zona situsului se creează o concentrație de substrat de cca 10 ori mai mare decât în restul soluției și astfel viteza crește cu acest ordin de mărime.

T. C. BRUICE și colab. (1962) săi au arătat că aproprierea centrului catalitic activ de legătura susceptibilă a substratului este o reacție favorizată de asistența anchimerică. Pe de altă parte, D. R. STORM și D. E. KOSHLAND JR., 1971 au dezvoltat o teorie, postulând că funcția majoră a situsului activ al enzimei este inducerea orientării orbitalilor și anume: orbitalii substratului și ai centrului catalitic se orientează într-o dispunere specifică, astfel încât complexul enzimă-substrat să treacă mai ușor în starea de tranziție.

KOSHLAND (1972) a ajuns la concluzia că grupările funcționale ale situsului activ al enzimei nu se află în poziție optimă pentru cataliză, atunci când acesta este liber; moleculele de substrat impun acestora o conformație în care grupările catalitice au o poziție geometrică favorabilă formării stării de tranziție. Este ceea ce se numește o adaptare indusă. Moleculele de enzimă sunt instabile în forma activă și, în absența substratului, tind să revină la forma liberă.

Pentru formarea stării de tranziție unele enzime se pot combina cu substratul, formând un intermediar covalent instabil, care se transformă repede în produși de reacție. În acest caz are loc o cataliză covalentă. Având grupări funcționale capabile să doneze sau să accepte protoni, enzima poate determina o cataliză generală – acidă sau bazică.

În cazul proteazelor, s-a demonstrat formarea unui intermediar covalent reactiv, care are o mare posibilitate de a atinge starea de tranziție, permițând astfel substratului să învingă bariera energiei de activare. Aceste enzime sunt clasificate în funcție de aminoacidul cu care reacționează substratul – subclasele serinei, cisteinei, histidinei, lizinei. În subclasa serinei, gruparea hidroxil a restului de serină participă la formarea unui ester intermediar, fie cu o grupare acil, ca în cazul chimotripsinei, formând o acil-enzimă, fie cu o grupare fosforică, ca la fosfoglucomutază, pentru a forma o fosfoenzimă.

Pentru a avea loc cataliza nucleofilă, care se utilizează pe larg în sinteza compușilor biologic activi, este necesar ca substratul să reacționeze mai rapid cu catalizatorul nucleofil decât ar reacționa cu gruparea acil acceptoare finală; catalizatorul acilat astfel format trebuie, de asemenea, să reacționeze mai repede cu acceptorul acil final decât cu substratul inițial; astfel formarea intermediarului covalent poate coborî bariera energiei de activare a reacției prin implicarea transferului grupării acil.

Enzimele pot induce tensiuni și distorsiuni în legătura atacată a moleculei de substrat, făcând-o mai ușor degradabilă. Măsurătorile de rotație și cele efectuate prin metoda difracției cu raze X au demonstrat că enzimele suferă schimbări de conformație în cursul actului catalitic. RICHARD și colab. (1972) au demonstrat că lanțul polipeptidic al enzimelor este astfel pliat încât resturile de aminoacizi care formează situsul catalitic activ sunt aduse într-o poziție foarte apropiată.

Există mai multe ipoteze referitoare la diferențele de conformație între enzima liberă și forma ei combinată cu substratul. Una dintre acestea susține ca situsul catalitic activ al enzimei libere nu se potrivește exact nici cu substratul, nici cu produșii lui, ci doar cu speciile caracteristice stării de tranziție. Inducția deformează atât enzima cât și substratul, făcându-le să atingă starea de tranziție mult mai repede.

Studiile de structură și mecanisme de acțiune al enzimelor proteolitice au demonstrat că acestea urmează aceleași etape în acțiunea lor de hidroliză enzimatică a proteinelor, indiferent de complexitatea structurală a proteinelor hidrolizate.

În general, prin degradarea aerobă a principalelor categorii de macromolecule (proteine, glucide, lipide, acizi nucleici) rezultă CO2 și apă.

In unele situații, căile de degradare sunt complexe, microorganismele fiind capabile să degradeze o gamă variată de compuși naturali sau de produși rezultați prin sinteză chimică.

În catabolismul glucidelor de obicei, microorganismele sunt capabile să utilizeze o gamă foarte variată de compuși organici din mediu, între care glucidele ocupă un loc principal.

Glucidele ce pot fi degradate variază foarte mult, de la cele simple, cum sunt glucoza, lactoza, galactoza etc, până la cele complexe de tipul amidonului, celulozei, inulinei, compuși care nu sunt capabili sa pătrundă în interiorul celulelor. În cazul acestor surse de carbon, pentru a putea fi utilizate, este necesar ca microorganismele să producă și să elimine în mediul extracelular enzime specifice care să asigure degradarea compușilor pană la forme ce pot traversa învelișurile celulare. Cercetările arată că microorganismele sintetizează proteine variate, unele cu funcții de enzime, altele cu funcții de recunoaștere și legare a substratului, care interacționează între ele la nivelul suprafeței celulare și formează complexe macromoleculare, denumite celulosomi, amilosomi etc, în funcție de natura substratului complex degradat.

Amidonul și celuloza sunt cele mai răspândite poliozide din natură și sunt larg utilizate de către microorganisme. Amidonul este o substanță de rezervă și este hidrolizat de diverse specii microbiene care produc enzime de tipul amilazelor, iar celuloza este un compus cu rol structural pentru celulele vegetale la care este constituentul fundamental al peretelui celular și este degradată de microorganismele care sintetizează enzime de tipul celulelor.

Cele mai multe cercetări asupra căilor de utilizare a glucidelor, mai ales a glucozei, au fost descrise până în prezent patru căi principale diferite: calea Embden-Meyerhof-Pamas (calea glicolizei); calea hexozomonofosfatului, calea Entner-Doudoroff și calea fosfocetolazei.

Primele două căi sunt funcționale atât în cazul bacteriilor și fungilor cât și în celulele animale, în timp ce ultimele două sunt specifice doar bacteriilor.

Calea Embden-Meyerhof-Pamas (EMP) reprezintă calea majoră a metabolismului glucozei la cele mai multe microorganisme; este o cale integral anaerobă ce cuprinde o serie de reacții enzimatice prin care o moleculă de glucoză este degradată până la două molecule de piruvat, fără intervenția oxigenului molecular. Primul intermediar al căii EMP este glucozo-6-fosfatul, compus care apare și în cazul altor căi metabolice. În cursul reacțiilor biochimice ale acestei căi doar 25% din energia rezultată din degradarea glucozei este conservată în legaturi macroergice, restul fiind pierdută sub formă de căldură.

Calea Embden- Meycrhof-Pamas se întâlnește la bacteriile care produc fermentațiile homolactică, propionică, butirică, acetonobutilică, la enterobacterii și la levuri în cursul fermentației alcoolice. Unii dintre produșii finali ai fermentațiilor care se realizează pe calea EMP sunt componenți esențiali ai alimentelor și băuturilor sau solvenți industriali sau combustibili.

În general, microorganismele care folosesc exclusiv această cale pentru catabolizarea glucozei nu sunt capabile să se dezvolte pe medii de cultură simple, ele având nevoie de prezența factorilor de creștere.

Calea hexozomonofosfatului (HMP) se mai numește și calea pentozofosfatului sau calea Warbiirg-Dickens-Horecker, ea fiind folosită de microorgansime pentru utilizarea hexozelor, pentozelor și a altor glucide. Această cale are două etape principale: calea oxidativă ce asigură folosirea hexozelor și formarea ribulozo-5-fosfatului și calea neoxidativă care asigura conversia pentozofosfaților la hexozofosfați. Trebuie remarcat faptul că această cale este interconectată cu calea glicolizei, iar enzimele căii metabolice participă și la diferite reacții de biosinteză (a glucidelor, a unor aminoacizi aromatici sau a unor vitamine).

Calea Entner-Doudoroff este întâlnită doar la anumite grupuri de bacterii, fiind absentă în cazul majorității bacteriilor Gram pozitive. Din acest punct de vedere, se consideră că bacteriile ce prezintă această cale reprezintă o linie de evoluție separată față de restul bacteriilor. Si în acest caz, primul intermediar este glucozo-6-fosfatul, iar în ultima etapă se obțin piruvat și aldehida 3-fosfoglicerică.

Calea fosfocetolazei este prezentă doar la un grup limitat de bacterii, având o eficiență energetică mică (se obține 1 mol ATP/mol glucoză catabolizată). Ea asigură utilizarea hexozelor și a pentozelor de către bacteriile, fiind o variantă a căii HMP cu care are trei reacții în comun.

Cele patru căi menționate sunt strâns interconectate având în comun o serie de enzime și compuși intermediari. Calea EMP este calea majoră de eliberare de energie (ATP), în timp prin calea HMP se eliberează doar jumătate din cantitatea de ATP, comparativ cu prima. Calea ED întâlnită la microorganismele strict aerobe este conectată cu calea HMP, dar poate funcționa și independent deoarece pe parcursul său se poate forma piruvat.

Semnificația piruvatului este deosebită în cazul microorganismelor aerobe: el este oxidat enzimatic formând acetil-CoA, compus intermediar cheie al ciclului acizilor tricarboxilici (ciclul Krebs). Acest ciclu reprezintă calea de oxidare completă, aerobă, a glucozei, respectiv a acetatului produs din glicoliză, din oxidarea acizilor grași sau a unor aminoacizi.

Pe parcursul ciclului Krebs și a căii glicolizei se produce atât energie cât și o serie de precursori pentru biosinteze, motiv pentru care ele sunt incluse în categoria funcțiilor amfibolice. Deoarece reacțiile producătoare de energie și cele producătoare de precursori au loc simultan, se produc pierderi continue de acizi dicarboxilici care sunt compensate prin aportul altor căi metabolice, reacțiile respective fiind de tip anaplerotic.

În cazul proteinelor, care sunt compuși organici cu masă moleculară mare și sunt formate din aminoacizi legați între ei prin legături peptidice, degradarea lor presupune mai multe etape, cum ar fi proteoliza care este realizată prin intervenția unor enzime specifice, proteaze și peptidaze (endopeptidaze și exopeptidaze), în final rezultând aminoacizi, precum și catabolizarea aminoacizilor eliberați prin dezaminare, transaminare sau decarboxilare.

În funcție de specia microbiană examinată, echipamentul enzimatic proteolitic variază, astfel că degradarea proteinelor se poate opri în diferite stadii sau se finalizează prin descompunerea aminoacizilor. Majoritatea proteazelor acționează atât asupra proteinelor cât și a oligopeptidelor, producând fragmentarea lanțului peptidic. Enzimele proteolitice se impart în două categorii principale și anume proteinaze (numite și endopeptidaze) care scindează legăturile peptidice dintre anumiți aminoacizi fie în mod nespecific, fie specific și peptidaze (sau exopeptidaze) care clivează legăturile peptidice fie de la extremitatea amino (aminopeptidaze), fie de la cea -COOH (carboxipeptidaze).

Reacțiile de decarboxilare sunt la originea formării CO2 și a aminelor, dintre care unele, putresceina și cadaverina, sunt extrem de toxice. Compușii volatili proveniți din procesul de decarboxilare sunt responsabili de mirosul caracteristic de putrefacție. Prin procesul dezaminării se produce amoniac, reacțiile respective fiind cuplate cu reacții de decarboxilare. Reacțiile de transaminare antrenează sinteza de noi aminoacizi prin transferul unui grup amino la un acid organic.

În interacțiunea dintre enzimă și substratul său, enzima participă cu o porțiune limitată din structura sa. Pe această porțiune există grupări reacționale capabile să atragă și să fixeze molecula substratului într-o poziție privilegiată și într-un loc strict determinat; ansamblul acestor grupări chimice și al încărcărilor electrice constituie centrul activ al enzimei sau centrul catalitic. Astfel, centrul activ al unei enzime reprezintă ansamblul regiunilor funcționale ale enzimei, respectiv ansamblul grupărilor chimice active care participă efectiv la reacția catalizată. În cazul enzimelor care nu necesită pentru activitatea lor catalitică prezența unui cofactor, acest centru activ este reprezentat de o secvență de aminoacizi și este condiționat de configurația tridimensională a moleculei.

Eficacitatea centrului activ nu depinde numai de grupările funcționale ce se combină cu substratul, ci de integritatea configurației moleculei proteice care determină pozițiile spațiale relative ale acestor grupări funcționale. Acest fapt subliniază importanța structurii terțiare a proteinei pentru activitatea enzimatică. Pentru acest tip de enzime centrul activ coincide cu zona, denumită situs catalitic, unde se găsește secvența de aminoacizi implicați în activitatea catalitică. În cazul enzimelor care conțin cofactori enzimatici, centrul activ include situsul catalitic și regiunea din moleculă la care este atașat cofactorul: centru activ = situs catalitic + cofactor

Enzimele diferă de catalizatorii neproteici prin una din cele mai remarcabile și caracteristice proprietăți ale lor și anume specificitatea. Se înțelege prin specificitatea unei enzime proprietatea sa de a acționa preferențial numai asupra unui anumit substrat sau grup de substrate cu caractere chimice comune. Specificitatea enzimatică se poate manifesta la nivelul tipului de reacție catalizată de enzimă și la nivelul substratului. Specificitatea de reacție, de acțiune se manifestă asupra unui singur substrat de către mai multe enzime, fiecare catalizând o anumită reacție. De exemplu, un α – aminoacid poate constitui substratul de reacție pentru mai multe enzime care catalizează reacții diferite – însă specifice – de transformare a sa în produși de reacție diferiți:

Fiecare enzimă manifestă o anumită specificitate de acțiune, catalizând un anumit tip de reacție biochimică.

Specificitatea de substrat se referă la activitatea pe care o manifestă enzimele față de anumite substrate, iar gradul specificității de substrat variază foarte mult. Specificitatea absolută se referă la faptul că unele enzime nu acționează decât asupra unui singur substrat fiind inactive față de alte substanțe cu structură asemănătoare.

Specificitatea de grup o au enzimele care acționează asupra unei serii de substanțe apropiate ca structură chimică. Astfel, pepsina nu atacă decât proteinele, dar toate tipurile de proteine, amilaza atacă amidonul, dextrinele, glicogenul; hexokinaza catalizează fosforilarea unei serii de hexoze în prezență de ATP.

Stereospecificitatea face referire la unele enzime au stereospecificitate față de izomeria cis-trans. Astfel, fumaraza acționează numai asupra acidului fumaric și este inactivă asupra izomerului său cis, acidul maleic. În cazul substanțelor optic active, enzimele manifestă o acțiune specifică față de o anumită formă stereoizomeră a substratului; de exemplu, L-aminoacidoxidazele nu recunosc decât L-aminoacizii iar pentru transformarea D-aminoacizilor este necesară prezența D-aminoacid – oxidazelor. Unele enzime fac distincție între conformațiile α și β din legăturile glicozidice. Maltoza, de exemplu, hidrolizează numai legătura (1→ 4) α glicozidică din molecula de maltoză, și nu atacă legătura (1→ 4) β glicozidică din celobioză.

Mecanismul general de acțiune al enzimelor este cel al tuturor catalizatorilor și anume, intervin numai în acele reacții care sunt posibile din punct de vedere termodinamic, nu modifică echilibrul unei reacții, ci fac ca acest echilibru să fie atins mai repede și cantitatea lor rămâne neschimbată la sfârșitul reacției. Enzimele au și ele aceste proprietăți, la care se mai adaugă natura lor proteică care le conferă un grad mare de specificitate, activitatea enzimatică este supusă unui control și acest fapt are mare importanță pentru reglarea metabolismului celular, micșorarea energiei de activare în reacția respectivă ceea ce determină creșterea vitezei acesteia. În general, pentru ca o reacție să aibă loc cu o viteză apreciabilă, moleculele reactanților trebuie să fie activate. Energia de activare poate fi furnizată de temperatură însă, în cazul organismelor vii, utilitatea ei este limitată. Enzima are capacitatea de a coborî nivelul energetic care condiționează reacția, ceea ce permite moleculelor să reacționeze cu o viteză apreciabilă în condiții în care în absența enzimei nu ar reacționa decât cu o viteză extrem de mică.

Enzimele scad nivelul "energiei de activare" necesar ca o reacție să poată avea loc. Această scădere a energiei de activare se datorează formării unui complex activat între enzimă și substrat care apoi se transformă cu viteză mare în produși finali de reacție și enzimă, ultima fiind capabilă să se combine cu o altă moleculă de substrat. Ipoteza formării complexului intermediar a fost emisă pentru prima dată de MICHAELIS ȘI MENTEN, 1913. Reacția de formare a complexului enzimă-substrat este reversibilă, constantele de echilibru fiind K1 și K2. La formarea complexului activat, substratul se fixează pe centrul catalitic al enzimei. Între centrul catalitic și molecula substratului există complementarități conformaționale și chimice, ipoteza "lacăt-cheie", care permit asamblarea lor.

Figura 2.1 Schema modului de acțiune a enzimelor

Fig 2.1 Scheme of the enzyme action

(https://en.wikibooks.org/wiki/Principles_of_Biochemistry/Enzymes)

Fixarea substratului pe enzimă îi imprimă acestuia o stare de tensiune moleculară care are drept consecință labilizarea lui și facilitarea reacției biochimice. Deci rolul complexului enzimă-substrat în procesele de cataliză enzimatică este de a micșora energia de activare a reacției. Astfel, se consideră că un substrat se poate transforma în compus atât direct, fără enzimă, cât și prin cataliză enzimatică. Prin șocuri se poate ajunge la energia Ea necesară pentru ca X, Y să dobândească o stare activată care să-i permită trecerea în Z. Energia maximă Ea necesară transformării este energia de activare în absența enzimei. În prezența enzimei însă, prin formarea complexului enzimă-substrat este nevoie de o energie de activare mult mai mică pentru transformarea substratului. Energia eliberată în ambele reacții este însă aceeași, ΔG.

Figura 2.2. Nivelele de energie ale moleculelor în cursul unei reacții fara enzimă (negru) și cu enzimă (roșu)

Fig 2.2. Molecule energy level during reaction with enzyme (red) and without it (black)

(https://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/1/15/CatalysisScheme.png)

Studiile efectuate pe enzime proteolitice au relevat numai 4 mari tipuri de mecanisme catalitice, cele implicând serin-proteazele fiind predominante. Aceste studii de structură și mecanism de reacție au demonstrat că în cazul serin-enzimelor, indiferent de proveniența acestora fie animală sau microbiană, mecanismul catalitic este același, cu toate că resturile de aminoacizi care intră în structura situsului catalitic ocupă poziții diferite în secvența de aminoacizi în moleculele enzimelor mamifere sau în cele de natură microbiană. Structura tridimensională este total diferită și totuși situsul catalitic conține același număr și aceeași aminoacizi implicați în mecanismul de cataliză enzimatică. Similitudinea funcțională este probabil consecința unei evoluții convergente independente. Proteazele serinice și subtilizinele bacteriene, de exemplu, au ajuns la același mecanism de hidroliză, dar independent, pentru că există un număr limitat de căi eficiente în mecanismul de scindare al legăturilor peptidice.

Diferitele moduri de evoluție a procesului pot fi puse în evidență comparând structura și modul de acțiune al chimotripsinei, enzimă pancreatică, cu cel al subtilizinei, enzimă bacteriană.

Chimotripsina are o specificitate de substrat de reacție și de grup. Este selectivă pentru legăturile peptidice de la capătul carboxilic al moleculei, atacând pe cele la care participă resturile de tirosină triptofan, fenilalanină și metionină. Ea hidrolizează, de asemenea, legaturile ester.

Secvența aminoacizilor în jurul situsului catalitic activ este foarte diferită, structura tridimensională este total diferită, însă situsul catalitic al subtilizinei conține o triadă catalitică asemănătoare cu a chimotripsinei.

Resturile de aminoacizi din situsul activ au fost identificate prin metodele cunoscute: Ser-195 s-a identificat cu diizopropilfluorofosfat (DIFP) care formează cu restul de serină un complex foarte stabil. Toate proteazele aparținând acestei clase sunt inhibate de DIFP.

Figura 2.3. Reprezentarea grafică a triadei catalitice

Fig 2.3. Graphic representation of the catalytic triad

(http://static.fastbleep.com/assets/notes/image/10362_1.jpg)

Rolul catalitic al His-57 a fost demonstrat prin marcare fină cu tosyl-α- fenilalaninclorometilcetonă (TFCC):

Gruparea reactivă de clorometilcetonă produce alchilarea restului His-57, conducând la un compus complet inactiv, care poate fi izolat printr-o rupere a tuturor legăturilor peptidice ale enzimei. Există trei considerente care arată că hidroliza exhaustivă indică faptul că His-57 face parte din situsul catalitic activ:

– reacția este stereospecifică, întrucât izomerul D al TFCC este total ineficace;

– reacția este inhibată competitiv de p-fenilpropionat, care este cunoscut ca un inhibitor al chimotripsinei;

– viteza de inactivare cu TFCC variază cu pH-ul în același mod ca și reacția necatalizată.

Mecanismul reacției enzimatice catalizate de chimotripsină demarează, așa cum s-a arătat anterior, prin aproprierea și orientarea enzimei față de substrat în mod obișnuit, gruparea -CH2-OH a serinei nu este foarte reactivă și totuși în chimotripsină ea devine reactivă. La apariția substratului, protonul de la hidroxilul serinei se prinde de histidină și sarcina (+) a histidinei este contracarată de restul de aspartat care are doar rolul de a stabiliza histidină în starea de tranziții. Studiile cu raze X au stabilit că în apropierea Ser-195 există un „buzunar“ nepolar în care intră resturile aromatice și cele voluminoase, orientându-se spre legătura cu Ser-195.

Hidroliza începe cu un atac al atomului de oxigen din gruparea OH a serinei asupra atomului de carbon din gruparea carboxil a legăturii peptidice atacate a substratului. Legătura C=O se transformă în legătură simplă cu oxigenul încărcat negativ C-O. Al patrulea atom care se va lega de carbon se va aranja în tetraedru. Formarea intermediarului tetraedric dintr-o grupare de amidă plană este posibilă datorită legăturii de hidrogen formate între sarcina negativă a oxigenului și două grupări N-H din catenele principale ale enzimei.

În primul stadiu, transferul protonului de la serină la histidină este ușurat de Asp care neutralizează sarcina (+) a inelului histidinic. Protonul legat de histidină este donat grupării aminice care, în timpul stării de tranziție, este legată de histidină printr-o legătură de hidrogen, în timp ce componenta acil este legată de substrat; din acest motiv faza poartă numele de fază de acilare.

În al doilea stadiu, de acilare, o moleculă de apă ocupă locul aminei. Protonul provenit de la H2O se leagă de histidină, iar (HO) format atacă atomul C din legătura ester-enzimă, formându-se din nou intermediarul tetraedric.

Recent s-au efectuat studii privind stabilitatea intermediarului tetraedric. Prin alchilarea chimotripsinei și tripsinei cu tosilfenilalanilclormetan marcat 1-C13 fi 2-C13 și obținerea de produși de inhibiție a căror cinetică a putut fi studiată. S-a pus astfel în evidență caracterul nucleofil deschis al grupării OH din Ser-195, iar modelul prezentat explică dinamica crescută a cationului imidazolic

Tripsina și elastaza enzime digestive din clasa serinproteazelor, sunt asemănătoare chimotripsinei sub câteva aspecte:

– aproape 40% din secvențele de aminoacizi din cele trei enzime sunt identice. Gradul de identitate este chiar mai mare (60%) pentru resturile de aminoacizi situate în vecinătatea centrului catalitic activ;

– studiile cu raze X au arătat că structura lor tridimensională este similară;

– triada catalitică serină-histidină-aspartat este prezentă și în aceste serin-proteaze;

– restul de serină din triadă este modificat de DIPF și procesul de hidroliză a proteinelor este anulat. Aminoacizii din jurul situsului catalitic activ sunt aceiași;

– toate trei enzimele au un mecanism catalitic identic. Triada catalitică si oxanionul din fiecare enzimă conduc la formarea stării de tranziție tetraedrică;

– aceste enzime sunt secretate de pancreas ca precursori inactivi și se activează prin scindarea unei singure legături peptidice.

Cele trei enzime diferă doar prin specificitatea lor de substrat. Astfel, chimotripsina hidrolizează resturile aromatice și voluminoase, tripsina hidrolizează resturile de uzină și arginină, elastaza hidrolizează resturi puțin voluminoase ale unor aminoacizi monoaminocarbocilici, care nu pot disocia.

Din analiza cu raze X s-a constatat că ele diferă în ceea ce privește așezarea în „buzunarul“ de lângă restul de serină: chimotripsina are un „buzunar“ alcătuit numai din resturi mici, nepolare, în timp ce tripsina are, în locul unui rest de serină, un rest de aspartat, care poate forma cu lizina și arginina legături electrostatice, iar elastaza conține un rest de valină și treonină care nu permit intrarea în „buzunar“ a resturilor voluminoase de aminoacizi.

In categoria enzimelor intracelulare sunt incluse enzimele care rămân cu biomasa, după separarea lichidului de fermentație. Unele enzime se acumulează probabil în periplasmă, astfel încât în mediul de cultură se află cantități mici de enzime rezultate din ruperea pereților unui număr mic de celule.

Majoritatea acestor enzime acționează asupra unor substraturi cu masă moleculară mică. Aceasta se explică prin faptul că numai substraturile mici pot pătrunde în celule și funcționează astfel ca inductori ai enzimelor care le degradează. Spre deosebire de acestea, enzimele extracelulare acționează, în general, asupra substraturilor cu masă moleculară mare.

Enzimele intracelulare se împart în două categorii: unele au o poziție centrală în metabolismul organismului în creștere și se produc în cantități mari în biomasă, altele au un rol secundar, obscur și se produc în cantități mici. Pentru utilizarea acestora din urmă în scopuri industriale, este necesară imobilizarea lor, astfel încăt să fie economică și justificată folosirea lor.

Pentru ca o enzimă să fie economică, ea trebuie să aibă o activitate enzimatică minimă (de aproximativ 100 UE/ml). De aceea, unele enzime cum sunt, de exemplu, penicilinacilaza, glucozizomeraza, α-galactozidaza la care nu se atinge această valoare se imobilizează.

Producerea enzimelor intracelulare prin fermentație ridică unele probleme specifice. Bioprocesul trebuie astfel condus încât pe parcursul biosintezei să se evite spargerea celulelor. Dacă se alege un mediu de fermentație în care activitatea enzimatică este distribuită atât în celule cât și în lichidul de fermentație, izolarea și purificarea enzimei este dificilă.

Un alt aspect se referă la stabilitatea enzimelor; unele enzime sunt stabile în mediul intracelular și devin instabile în afara celulei.

Unul dintre dezavantajele procedeelor de obținere prin biosinteză a enzimelor intracelulare îl constituie necesitatea eliberării acestora din celule, prin distrugerea membranei celulare, extracție și ulterior separarea extractului de resturile celulare. În plus, enzimele sunt impurificate cu toate proteinele intracelulare, chiar dacă enzimă dorită se află în proporție mare în totalul proteinelor extrase din celule. Un avantaj tehnologic al enzimelor intracelulare îl constituie faptul că extracția se poate efectua cu un volum mic de soluție tampon, ceea ce conduce la obținerea unui extract brut cu conținut mare în enzimă și nu mai este necesară concentrarea ulterioară a acesteia. În ansamblu, însă, recuperarea enzimelor extracelulare este un proces mai avantajos și mai ieftin decât a celor intracelulare.

AUNSTRUP (1980) a făcut o recenzie completă a enzimelor de fermentație extracelulare, cu aplicații industriale.

Cele mai importante enzime microbiene extracelulare sunt, în general, hidrolazele care acționează asupra substraturilor cu masă moleculară mare. Pentru microorganisme, este normal, din punct de vedere fiziologic, să producă nutrienți din polimerii biologici disponibili în mediul înconjurător celulelor. Pentru a ataca mai ușor substraturile, microorganismele își produc singure enzimele necesare hidrolizei acestora și uneori această producție de enzime este optimă chiar la tulpinile sălbatice.

Enzimele hidrolitice produse prin fermentație și utilizate în cantități mari în industrie sunt proteazele, amilazele și celulazele. Acestea sunt comercializate și utilizate în industria: detergenților, alimentară și textilă.

Majoritatea enzimelor extracelulare comerciale sunt utilizate la temperaturi de până la 100°C, chiar dacă acestea, în general, sunt instabile în timp. Ele au, de asemenea, o toleranță limitată la pH. La temperatura camerei sunt, în general, instabile dacă nu sunt condiționate în mod specific. Păstrarea la 4°C conferă enzimelor o stabilitate în timp mult mai mare.

Pentru că producția unei enzime extracelulare utilizează în cea mai mare parte resursele disponibile ale celulei, biosinteza și secreția unei astfel de enzime sunt supuse unui complex de factori reglatori. În general, producția acestor enzime este indusă de niveluri reduse ale produșilor de reacție ai polimerilor, iar uneori polimerii înșiși funcționează ca inductori. Alteori, compușii care nu sunt substraturi pentru enzime, dar sunt înrudiți ca structură cu acestea, pot funcționa ca inductori. De exemplu, producția de celulaze este indusă atât de lactoză cât și de celobioză. Producția acestor enzime este, de asemenea, supusă represiei prin cataboliți. Atâta timp cât nutrienții cu masă moleculară mică sunt disponibili, celulele cresc fără să producă hidrolaze și abia la epuizarea nutrienților începe biosinteza enzimelor hidrolitice extracelulare. Astfel, inducția și represia biosintezei enzimelor sunt fenomene complexe ce au loc în concordanță cu condițiile de mediu în care se găsesc celulele.

2.4 TEHNOLOGII DE DEGRADARE BIOCHIMICĂ A RESTURILOR DIN PIELE NATURALĂ APLICATĂ INDUSTRIAL

Biosinteza proteazelor bacteriene este un proces intens aerob, microorganismul utilizat ca producător al enzimelor are necesitați fiziologice deosebite pentru oxigen. Oxigenul insuflat odată cu aerul sterilizat nu poate fi utilizat direct în faza gazoasă, ci numai ca oxigen solvit. Necesarul de oxigen solvit depinde de microorganism și mai ales de faza de dezvoltare în care se află, intensitatea maximă de respirație remarcându-se în timpul fazei logaritmice.

Aerația reprezintă un factor foarte important. Concentrația oxigenului dizolvat în mediu influențând viteza și nivelul sintezei proteazelor la bacteriile aerobe. Pentru o sinteză maximă a enzimelor proteolitice de către bacterii este nevoie de o aerație intensă. Necesarul de oxigen crește în faza de lag din care cauză în această perioadă se mărește cantitatea de aer admisă în mediu. Regimul optim de aerație pentru fiecare microorganism se stabilește experimental.

Compoziția mediului de cultură, necesitățile nutriționale precum și parametrii de biosinteză se stabilesc pentru fiecare microorganism în parte.

Inducerea sintezei enzimelor proteolitice în culturi de microorganisme este determinată nu numai de compoziția mediului nutritiv, ci și de parametrii tehnologiei de cultivare (pH-ul mediului, temperatură, conținutul oxigenului dizolvat în mediu, calitatea și cantitatea materialului biologic). PH-ul mediului de cultură poate schimba direcția proceselor metabolice, sinteza și acumularea enzimelor în culturi de microorganism.

Procesele aerobe microbiene necesită un continuu transfer al oxigenului dizolvat în mediul de cultură. Problemele concomitente ale transferului de masă și energie sunt de obicei, neglijate în fermentatoarele de capacitate mică și cu densități joase ale celulelor microbiene, însă în procesele de microbiologie industrială care utilizează bioreactoare, cu volumele între 20 și 200 l, și cu densități mari de celule, transferul de oxigen trebuie luat în considerație. Productivitatea enzimatică cea mai mare posibilă se obține într-un bioreactor, la o capacitate maximă de transport de oxigen, aceasta fiind reflectată prin concentrații mici ale oxigenului dizolvat în timpul fermentației.

În bioreactor agitarea și injectarea aerului din compresor sunt utilizate pentru amestecarea conținutului din vas și pentru transferul de gaze.

Agitarea este de asemenea un factor ce prezintă o anumită influență asupra biosintezei proteazelor bacteriene. Valori diferite ale agitării determină o distribuție un transfer diferit al aerului și nutrienților către celulă.

Calitatea și cantitatea inoculului au un rol important în obținerea unor metaboliți cu viteze și randamente mari de biosinteză. Starea fiziologică a microorganismelor ce formează inoculul ca și cantitatea acestuia influențează productivitatea enzimatică, fiind astfel necesară utilizarea unui inocul standardizat.

Celulele vegetative bacteriene folosite ca inocul produc de patru ori mai multă protează decât materialul sporulat. Există valori limită de vârstă și număr de celule care pot fi utilizate ca inocul la însămânțarea mediilor de cultură pentru a produce enzime proteolitice cu activități mari. La depășirea acestor limite se acumulează biomasă multă într-un timp scurt, dar neproductivă. Cantitatea de inocul are influență asupra stadiilor ulterioare ale culturii, determinând diferite stări fiziologice ale celulelor, funcție de care variază capacitatea de biosinteză a proteazei. Masa minimă de inocul care permite dezvoltarea culturii bacteriene depinde însă de compoziția substratului. Utilizarea unui inocul „mic” duce la prelungirea fazei de lag, în ciuda prezenței celulelor viabile, făcând ineficient bioprocesul. In general, masa de inocul pentru biosinteză proteazelor este de maximum 5% față de mediul de cultură, cu aproximativ 105 cel/ml.

Unii autori recomandă introducerea în trepte a inoculului. Prin inocularea în trepte se scurtează durata cultivării cu aproximativ 5 ore, iar activitatea proteolitică crește cu 50%.

Biosinteză proteazelor neutre și alcaline este realizată de colonii care sporulează intens. De remarcat este faptul că, interdependență între natura proteazelor biosintetizate pe parcursul fermentației și profilul de pH al mediului. Ținând cont de acest fapt pentru a obținere purificarea proteazelor neutre, fermentația a fost întreruptă în momentul în care valoarea pH-ului a scăzut la 5,5 (de obicei după 48 de ore de cultivare).

CAPITOLUL III

CHAPTER III

EXPERIMENTE PRIVIND STABILIREA CONDIȚIILOR OPTIME DE CULTIVARE IN VITRO UNOR SPECII DE MICROORGANISME PROTEAZICE

PURPOSE AND OBJECTIVES OF RESEARCH. MATERIALS AND METHODS FOR ESTABLISHING THE OPTIMUM CULTIVATION IN VITRO CONDITIONS FOR PROTEASES MICROORGANISM SPECIES

3.1 SCOPUL ȘI OBIECTIVELE CERCETĂRII

Scopul prezentei lucrãri este acela de izolare a unor microorganisme capabile să degradeze deșeurile din industria pielăriei, de optimizare a mediilor de cultură bacteriene specifice, de obținerea enzimelor pentru biodegradarea deșeurilor din industria pielăriei și de obtinere a unui hidrolizat care sa poată fi utilizat cu succes ca biofertilizator pentru culturile de cereale și leguminoase.

Obiectivele propuse în această lucrare se referă la:

izolarea, selecția, caracterizarea, identificarea și testarea microorganismelor cu eficiență în degradarea accelerată a deșeurilor din industria pielăriei;

experimentarea biodegradabilității principalelor componente ale articolelor de blană naturală tăbăcită cu crom;

obtinerea enzimelor specific pentru biodegradarea deșeurilor din industria pielăriei

obtinere a unui hidrolizat care sa poată fi utilizat cu succes ca biofertilizator pentru culturile de cereale și leguminoase.

Experimentele s-au desfășurat în condiții de laborator, în cadrul Facultății de Biotehnologii aparținând Universității de Științe Agronomice și Medicină Veterinară București

3.2 MATERIAL BIOLOGIC TESTAT

Materialul biologic testat a constat în trei tulpini bacteriene ce au fost izolate în urma degradării unor resturi de blană și piele tăbăcite cu crom, provenite de la Institutul de Pielărie București.

3.3 ANALIZE EFECTUATE ÎN LABORATOR PENTRU DETERMINAREA UNOR ÎNSUȘIRI CALITATIVE ALE PRODUSELOR DIN PIELE ȘI BLANĂ NATURALĂ

Pentru realizarea experimentelor de biodegradare a proteinelor au fost testate mai multe tipuri de blană și piele tăbăcite cu crom provenite din sectoarele industriale.

S-au luat în lucru bucați de piele și blană naturală de oaie, tăbăcite cu crom, precum și bucăți de piele și blană ecologică, materiale ce au fost puse la dispoziție de către Institutul de Pielărie București.

3.3.1 Materiale utilizate în experimentele de laborator

Pentru screeningul microorganismelor a fost luată în considerare izolarea acestora din mediile naturale.

3.3.2 Medii de cultivare a tulpinilor izolate

În vederea screeningului a fost utilizat un mediu minimal în care au fost adăugate ca unică sursă de carbon 1cm2 blană/piele de ovină.

NH4Cl 0,5 g/l

NaCl 0,5 g/l

K2HPO4 0,3 g/l

KH2PO4 0,4 g/l

MgCl∙6H2O 0,1 g/l

ph-ul mediului a fost ajustat la 7,2.

Pentru pregătirea inoculului de microorganisme a fost utilizat apă distilată, sterilizat timp de 20 minute la 121°C.

Microorganisme utilizate au fost izolate din mediu natural.

Au fost recoltate probe reprezentative din sol în care a fost lasate la descompus bucați de blană și piele naturale și sintetice.

Inoculul din proba de sol a fost preparat din 10 g de sol în amestec cu 90 ml apă distilată.

Testarea biodegradabilității s-a făcut în baloane Erlenmayer în care au fost repartizate 50 ml de mediu minimal în care s-a adăugat ca unică sursă de carbon 1% blană / piele de ovină. Mediul a fost inoculat cu 1 ml inocul din proba de sol.

Probele de sol și bacteriile au fost cultivate la 35oC timp de 7 zile la 135 rpm.

A fost urmărită calitativ (vizual) și microscopic degradarea celor două componente (blana și pielea).

În procesele biotehnologice mediul de cultură are o mare importanță asupra reproductibilității și eficientei tehnologiei. Marirea capacitații de producere a enzimelor proteolitice folosind tulpini înalt producătoare se poate îmbunătăți prin studierea compoziței mediului de cultură a parametrilor de cultivare.

În ceea ce privește compoziția mediului de cultură se poate spune că nu întodeauna un mediu care asigură o dezvoltare a microorganismului este favorabil și pentru sinteza enzimei sau a sistemului enzimatic dorit.

Compoziția optimă a mediului de cultură se stabilește pornind de la un mediu de bază, de obicei sintetic, care servește ca martor și la care se variază apoi diferitele componente – sursa de carbon, sursa de azot, fosfor, factorii de creștere și microelemente (TAPAI M., 2009)

Dintre substanțele care intră în compoziția mediului nutritiv acțiunea cea mai eficace asupra sintezei proteazelor o manifestă glucidele. Acestea pot fi folosite atât sub formă de polizaharide cât și ca monozaharide. Concentrația amidonului și a produselor de hidroliză din mediu poate varia de la 0,1 la 15%, în funcție de specia microorganismului.

În ceea ce privește sursa de azot, pentru cultivarea tulpinilor producătoare de proteaze se folosesc azotul din proteine și produsele lor de hidroliză – peptide și aminoacizi. O serie de autori au stabilit că introducerea în mediu a aminoacizilor favorizează dezvoltarea microorganismelor și induce biosinteză proteazelor. Astfel, efectul cel mai puternic inductiv îl posedă leucina, pe când asparagina reprimă complet biosinteza, iar arginina, serina, prolina induc parțial sinteza enzimei. O acțiune stimulatoare asupra sintezei proteazelor o au și vitaminele tiamină, biotină, acid folic, nicotinamidă.

Pe lângă sursele de carbon, azot, aminoacizi, vitamine și microelementele, cum ar fi Ca, P, Mn, Fe, K, Mg, introduse în mediu sub formă de săruri în diferite concentrații pot influența biosinteza proteazelor. Astfel, calciul joacă rol de tampon și stabilizează enzimele proteolitice la temperaturi ridicate. Se presupune că ionii de calciu favorizează și sinteza enzimelor proteolitice alcaline, înlesnesc eliminarea acestora din celule și joacă un rol important în formarea sporilor.

În afara compoziției mediului nutritiv un rol important îl joacă și condițiile de cultivare a microorganismelor: pH-ul influențează procesele metabolice, sinteza și acumularea diferitelor enzime, unde producătorii de proteaze neutre și alcaline se dezvoltă bine la valori neutre și slab alcaline de pH, temperatura s-a dovedit foarte importantă pentru creșterea și dezvoltarea microorganismelor mezofile, temperatura variază între 35 și 40°C, iar pentru cele termofile între 45 și 60°C, aerația și proporția materialului de însămânțare. Condițiile acestea sunt strict specifice fiecărui microorganism, iar studiul lor permite dirijarea biosintezei enzimelor proteolitice.

Alți factori importanți pentru procesul de biosinteză enzimatică sunt: fiziologia producătorilor, formula de mediu nutritiv și condițiile de cultivare.

Pentru biosinteza proteazelor procedeul de cultivare submers este cel mai mult folosit. Acest procedeu necesită instalații care permit o amestecare perfectă a componentelor solide, lichide și gazoase ale mediului de biosinteză, o alimentare adecvată cu aer, fiind echipate cu aparatură de măsură și control.

O sinteza cu randament mare a unei enzime proteolitice are loc atunci când în mediu de cultură se găsesc în concentrații optime toate componentele care participa la sinteza enzimei.

În cazul enzimelor induse, prezența inductorului în mediul de cultură este absolut necesară pentru obținerea unei activități enzimatice crescute. Ca inductor funcționează substratul, dar aceasta funcție poate să o îndeplinească și alte substanțe înrudite cu acesta. Formarea și acumularea în cantități mari a proteazei în mediul de cultură este conditionat de prezenta cazeinei care, în afara de funcția de sursă de carbon, îndeplinește și funcția de inductor (WOLFGANG GERHARTZ, 1990).

O substanță poate să îndeplinească funcția de inductor al unei enzime, numai atunci când difuzează prin membrana microorganismului pentru a putea participa la biosinteza enzimei.

3.3.3 Obținerea materialului biologic

Pentru a obține o tulpină activă pentru producătoare de proteaze, o primă etapă o reprezintă izolarea și, ulterior, identificarea unor specii de micoorganisme cu o capacitate ridicată de biosinteză a enzimelor proteolitice. Indiferent de genurile sau speciile cărora le aparțin, microorganismele izolate și identificate trebuie să posede anumite caracteristici generale, care să permită desfășurarea ritmică și, mai ales, reproductibilă a acestor procese de biosinteză enzimatică.

Etapa de izolare a microorganismelor proteolitice s-a efectuat prin compostarea unor fragmente de piele și blană tăbăcită cu crom provenite de la Institutul de Pielărie București.

Pentru izolarea și identificarea bacteriilor cu activitate proteolitică, bucăți de blană cu piele tăbăcită cu crom, provenind de la diferite tipuri de animale au fost lasate la compostat în sol cu pH 7.2 timp de 3 luni.

Ziua 1 Ziua 30

Ziua 60 Ziua 90

3.3.1.Evoluția procesului de compostare pentru blana naturală

3.3.1.The evolution of natural fur degradation

Ziua 1 Ziua 30

Ziua 60 Ziua 90

3.3.2 Evoluția procesului de compostare pentru blana sintetică

3.3.2 The evolution of synthetic fur degradation

Mediul de cultivare utilizat a fost un mediu simplu format din NaCl 0.5%, CaCO30.5%, K2HPO4 0.35%, având un pH 7.2. Mediul obținut a fost sterilizat timp de 20 de minute la 121oC și o presiune de 1.1 atm.

În pahare Erlenmeyer de 100ml au fost introduse câte 40 ml mediu simplu și 1 cm2 de blană compostată din fiecare tip.

Probele au fost incubate 24h la temperatură de 35oC și o agitare de 135 rpm. După incubare, în același mediu fragmentele de blană compostată au fost înlocuite cu fragmente de blană necompostată, tăbăcită cu crom și lasate la incubat timp de 7 zile la 135 rpm și o temperatură de 35oC.

După perioada de incubare s-a făcut o diluție de 10-1, apoi s-au inoculat prin inundare plăci Petri cu geloză agarizată (peptonă 1g%, extract de carne 1g%, NaCl 0,5g%, agar 2g%).

Punctul de plecare al metodologiei de selecție a microorganismelor în stare pură, îl reprezintă metoda izolării preliminare a microorganismului respectiv, prin prelevarea unei probe de analiză și inocularea acesteia pe o suprafață bine delimitată a unui mediu nutritiv solidificat. Pentru realizarea diseminării acestor celule se procedează diferențiat, în funcție de consistența probei respective, precum și de densitatea celulelor prezente în proba de cercetat (M. PETRE, 2001).

Pentru izolarea coloniilor s-a utilizat metoda diluțiilor successive.

Astfel, probele cu densitate celulară mare se diluează, în mod adecvat, în timp ce restul probelor, care prezintă o densitate mică de celule, sunt diseminate prin tehnica "epuizării" ansei sau prin tehnica diseminării pe suprafața mediului nutritiv sau, chiar, prin încorporare în masa acestuia. Coloniile, rezultate după o anumită perioadă de incubare sunt inoculate în mediul nutritiv lichid sau solid, cu respectarea precauților modului de lucru aseptic (ZARNEA, 1994).

Pentru izolarea speciilor de microorganism proteolitice a fost utilizat mediul tip PCA (plate count agar), numit și SMA (standard method agar), MAP (milk agar plates), mediu cu amidon, CMC și mediu cu Tween 80.

Testarea izolatelor pentru producția de protează a fost facută pe placi Petri ce conțineau mediu (g%) cu PCA (triptonă 0.5%, glucoză 0.1%, extract de drojdie 0,25%, agar 2%, pH 7.2, cu adaos de 1% caseină), pentru amilaze 1% amidon (triptonă 0.5%, amidon 1%, extract de drojdie 0.25%, agar 2%, pH 7.2), pentru celulaze cu CMC (carboximetilceluloză), (triptonă 0.5%, CMC 0.1% extract de drojdie 0.25%, agar 2%, pH 7.2) și geloză agarizată cu Tween 80 (peptonă 2%, extract de carne 1%, NaCl 0.5%, agar 2% și Tween 80 0.1%).

În jurul coloniilor testate a fost observat un halou opalescent.

Din cele 90 de tulpini bacteriene izolate au fost selectate 3 dintre acestea și anume DA7, DA10, DA13. Coloniile cu cel mai bun potential (diametrul haloului mai mare) au fost trecute pe geloză agarizată și depozitate la 4oC.

Figura 3.3.3. Testarea microorganismelor selectate, producătoare de enzime proteolitice

Fig. 3.3.3. Testing the selected microorganisms that produce proteolitic enzymes

În urma izolarii s-a utilizat un loop inoculat în mediu minimal (NaCl 1g/L, CaCl 0.05 g/L, KH2PO4 0.7g/L, MgSO4 0.9g/L, K2HPO4 2,38 g/L, sucroză 3g/L, 0.6 g piele marunțită) în pahare Erlenmyer de 200 ml, incubate timp de 7 zile la 35oC, la 135 rpm, observandu-se activitatea microbiană la 600 nm (valorile fiind cuprinse intre 0.183 și 1,213 µmoli față de martor 0.179 µmoli).

În urma acestui proces a fost determinată activitatea proteolitică, lipolitică, colagenazică, amilolitică și keratinolitică.

Tulpinile izolate au fost repartizate în eprubete în mediu înclinat și în plăci Petri în care a fost repartizat în prealabil mediu cu geloza agarizată.

Pentru întreținerea culturilor pure, astfel izolate, s-a utilizat mediul cu geloză agarizată, având următoarea formulă:

– peptonă 1g%

– extract de carne 1g%

– NaCl 0.5g%

– Apă distilată 100ml

– Agar 2g%

Selecția tulpinilor bacteriene izolate care au prezentat un potențial proteolitic ridicat, fost efectuată prin cultivarea coloniilor izolate pe medii nutritive care au prezentat următoarea compoziție:

Mediu minimal:

– NaCl 1g/l

– CaCo3 0.05g/l

– K2HPO4 2.38g/l

– KH2PO4 0.7g/l

– MgSO4 0.9g/l

– Glucoză 3g/l

– Piele 0.6g/l

– pH 7.2

Mediul Luria Bertani:

– Triptonă 10g/l

– Extract de drojdie 5g/l

– NaCl 10g/l

– pH 7,2

Tulpinile astfel izolate s-au întreținut prin trecere la intervale de 1 lună prin cultivarea pe medii solidificate în placi Petri, utilizând medii de tip CMC, PCA, MAP și geloză agarizată și au fost utilizate ulterior la testarea biodegradabilității produselor din blană naturală.

Din fiecare tulpină selectată s-a preparat un inocul folosit la degradarea probelor de blană mărunțită folosind ca unică sursa de carbon și azot bucățile de blană.

Culturile au fost menținute timp de 24-48 de ore la o temperatură de 35oC, pH de 7,2.

S-au făcut experimentări pentru stabilirea perioadei optime de cultivare a tulpinilor microbiene selecționate.

În etapa selecționării tulpinilor microbiene a fost evidențiată degradarea accelerată a eșantioanelor de blană utilizate, pentru care s-a determinat cea mai activitate proteazică.

Pentru a obține rezultate cât mai bune în ceea ce privește capacitatea de acțiune a complexelor enzimatice sintetizate de tulpinile microbiene a fost realizat un experiment pentru stabilirea unei perioade optime de cultivare a acestora, astfel încât să prezinte randamentul maxim.

Tulpinile microbiene constând în tulpini bacteriene nou izolate, notate DA7, DA10, DA13 au fost cultivate pe mediu minimal, în care sursa de carbon și azot a fost reprezentată doar de eșantioane de piele și blană naturală.

Compozitia mediului de cultura (exprimata in g/L) utilizat a fost urmatoarea: NaCl 1 g; CaCl2 0,05 g; KH2PO4 0,7 g; Sucroza 3 g; MgSO4 0,9 g; K2HPO4 2,38 g.

Activitatea complexului enzimatic a fost testata periodic, timp de 7 zile.

3.3.3.1 Descrierea coloniilor izolate identificare

Coloniile formate au fost majoritatea de culoare alb lăptos, punctiforme, cu un diametru cuprins între 0,1-10 mm, cu formă regulată la suprafața mediului și colonii galbene, punctiforme cu margini neregulate, având un diametru cuprins între 0.1- 0.5 mm, la suprafața mediului.

3.3.3.2 Sursa de azot și carbon

Mediile de cultură utilizate pentru biosinteza enzimelor proteolitice trebuie sa conțină în diferite raporturi optime sursa de carbon și sursa de azot care pot juca rol de inductor al enzimei, precum și precursori, cofactori și microelemente.

Pentru îmbunatățirea creșterii culturii și sporirea producției de enzimă este necesară prezența în mediul de fermentație și a altor elemente cum ar fi calciu, magneziu, potasiu, sodiu, precum si a unor oligoelemente magneziu și zinc.

Proprietățile fizico-chimice ale mediului de cultură care pot influența biosinteza proteazelor bacteriene, randamentul și calitatea enzimelor recuperate sunt vascozitatea mediului de cultură influențează consumul de energie necesar agitării mecanice, capacitatea de tamponare, viteza de flitrare.

Substanțele proteice conferă mediului de cultură o capacitate tampon ridicată excluzând necesitatea corectării pH-ului la valori optime în timpul biosintezei.

Creșterea vâscozității mediului de cultură are ca efect o scădere accelerată a ratei transferului de oxigen, producând perturbări importante ale procesului de biosinteza în condițiile utilizării germenilor aerobi.

Viteza de filtrare a mediilor de cultură după biosinteza enzimelor este un alt factor important în faza de prelucrare pentru obținerea preparatelor enzimatice purificate. Însăși calitatea enzimelor recuperate este condiționată de compoziția mediului de biosinteză

Celula microbiană, datorită volumului ei redus, este extrem de sensibilă la variațiile locale ale parametrilor procesului de biosinteză, în special la variațiile concentrației de substrat. Mărirea concentrației de substrat în mediul de cultură poate conduce la sporirea numărului de celule microbiene, dar numai până la anumite limite, multiplicarea acestora fiind încetinită de procese de inhibiție care au loc la nivelul celulei.

Acțiunea unui factor inhibitor asupra celulei microbiene se poate exercita prin modificarea potențialului chimic al substratului, intermediarilor metabolici sau a produsului finit; a permeabilității peretelui celular și reducerea transportului substanțelor nutritive; a activității enzimelor implicate în procesul metabolic; poate duce la disocierea agregatelor metabolice; la modificarea parametrilor funcționali ai celulei microbiene, capacitatea de multiplicare, mobilitatea, biosinteză unor metaboliți, iar mecanismele prin care se realizează inhibiția sunt reacția chimică cu una sau mai multe componente celulare; adsorbția sau complexarea unor enzime sau coenzime; intervenția în secvențe a reacțiilor biochimice; intervenția în disocierea complexelor enzimatice; modificarea parametrilor fîzico-chimici ai mediului de biosinteză, pH, tărie ionică, constanță dielectrică, capacitate de solvatare și intervenția în funcțiile celulare de control.

Datorită acestor fenomene, concentrații mari de substrat inhibă dezvoltarea microorganismelor într-un anumit grad ajungând chiar la inhibiție totală. Din acest motiv, pentru un sistem de biosinteză se stabilește concentrația optimă a substratului atât în momentul inițial cât și pe parcurs.

3.4 METODELE DE ANALIZĂ ȘI CONTROL FOLOSITE PENTRU DETERMINAREA ÎNSUȘIRILOR CHIMICE ALE PRODUSELOR DIN PIELE ȘI BLANĂ NATURALĂ.

3.4.1 Optimizarea pH-ului și temperaturii de dezvoltare a tulpinilor izolate

Studiul cineticii unei enzime reprezintă studiul activității ei catalitice realizat prin determinări cantitative ale vitezei de reacție. Dintre factorii care influentează comportarea cinetica a enzimelor amintim pH-ul și temperatura mediului de reacție, prezența unor activatori sau inhibitori în mediul de reacție.

Activitatea enzimelor depinde foarte mult de activitatea termodinamică a ionilor de hidrogen, adică de pH-ul soluției. Cele mai multe enzime au un pH optim la care activitatea lor este maximă; deasupra sau sub acestui pH, activitatea lor scade.

În general viteza reacțiilor catalizate enzimatic crește cu temperatura, în intervalul de temperatură în care enzima este stabilă și își păstrează întreaga activitate. Temperatura optimă nu poate fi însă exact definită, căci ea variază în limite largi, cu concentrația enzimei, cu concentrația ionilor de hidrogen și cu prezența diferitelor impurități ale preparatului enzimatic sau ale substratului.

Tulpinile bacteriene utilizate în experimentări au fost testate la diferite valori de pH între 5,5 și 8,5 și temperatură între 10 și 70oC pentru stabilirea ecologiei tulpinilor bacteriene isolate și optimizarea proceselor biotehnologice.

3.4.2 Condiții de cultivare a tulpinilor selecționate

Studii recente referitoare la monitorizarea proceselor de degradare a blănurilor naturale, sub acțiunea microorganismelor cu potențial proteolitic ridicat, au relevat importanța interacțiunilor dintre factorii biotici și abiotici, aparținând unui anumit ecosistem de tip predominant microbiotic. Astfel, uriașa diversitate a comunităților de microorganisme, existente într-un anumit habitat, poate fi explicată, îndeosebi prin acțiunea selecției determinate de compoziția anumitor substraturi, precum și de concentrația acestora (ZARNEA, 1994).

Spre deosebire de alte organisme superioare din punct de vedere evolutiv, care posedă o capacitate limitată de adaptabilitate și care nu suportă modificări ale condițiilor de mediu, ce depășesc anumite limite de toleranță pentru temperatură, pH, concentrație de nutrienți și săruri minerale, speciile de microorganisme se acomodează, cu mare ușurință, la condiții de mediu nou create, foarte diferite de cele existente inițial, fără modificări semnificative ale vitezei și ratei lor de creștere și multiplicare (ZARNEA, 1994)

3.4.3 Parametrii de cultivare a tulpinilor selecționate

Raport de inoculare 1:10

Temperatură 35oC

pH-inițial 7,2

Agitare 135 rpm

Timp 120 ore

Variația parametrilor biochimici pe parcursul bioprocesului

Pe toata durata procesului tehnologic au fost recoltate probe din 24 in 24 de ore în condiții aseptice și s-au determinat:

Menținerea purității culturii microbiene de dezvoltare a acesteia

Acumularea biomasei microbiene (D.O. 600 nm)

Substanța uscată

Carbonul organic

Biomasa a fost centrifugată și liofilizată. Produsul a fost caracterizat prin următoarele analize:

Determinarea proteinelor

Determinarea lipidelor

Determinarea keratinei

Determinarea colagenului

Determinarea amidonului

3.5 METODE DE ANALIZĂ ȘI CONTROL A MATERIILOR PRIME UTILIZATE ÎN EXPERIMENTELE DE LABORATOR

Metoda inoculării pe un mediu minimal poate fi aplicată pentru selecția naturală a tulpinilor cu potential specific.

Pentru izolatele selecționate, inocularea s-a realizat în baloane Erlenmeyer de 200 ml conținând mediu minimal, sterilizat în prealabil la 121oC având următoarea compoziție:

– NaCl 1g/l

– CaCo3 0.05g/l

– K2HPO4 2.38g/l

– KH2PO4 0.7g/l

– MgSO4 0.9g/l

– Glucoză 3g/l

– Piele 0.6g/l

– pH 7.

În cadrul experimentului au fost utilizate cele trei tulpini bacteriene izolate din sol și anume: DA7, DA10, DA13.

Inocularea tulpinilor a fost realizată sub nișă, cu ajutorul unei anse cu buclă de 5 mm diametru, iar apoi au fost incubate la 35oC, 135 rpm, timp de 7 zile.

A fost efectuat un studiu comparativ privind acțiunea acestor tulpini bacteriene asupra blănurilor naturale și sintetice. În acest scop, tulpinile au fost cultivate pe mediu minimal, a cărui compoziție a fost menționată anterior, având ca sursa de carbon și azot eșantioane de piele naturală și sintetică în proporție de 0,6 %, după cum urmează:

– blană sintetică;

– blană naturală de ovine (piele și păr)

– piele naturală de bovine;

Cultivarea tulpinilor bacteriene s-a realizat la 35oC în condiții de agitare (135 rpm).

După perioada de incubare, se observă o tulburare a mediului și o fragmentare a bucăților de blană din mediu, ceea ce indică faptul că bacteriile au utilizat ca sursă de carbon blana, realizând hidroliza enzimatică.

Probele au fost analizate din punct de vedere al activității enzimatice a proteazei, keratinazei colagenazei, amilazei.

S-a măsurat activitatea proteolitică printr-o metoda de screening cu ajutorul spectofotometrului, la 578 nm.

3.5.1 Metoda de determinare a glucidelor reducătoare

Principiul metodei:

Determinarea activității enzimatice a amilazei se efectuează printr-o metodă spectofotometrică, bazată pe determinarea maltozei rezultate în urma acțiunii enzimei asupra substratului său specific, printr-o reacție de culoare caracteristică acestuia.

Reactivul folosit pentru evidențierea produsului reacției enzimatice este acidul 3,5-dinitrosalicilic, care formează cu maltoza un compus colorat a cărei absorbție în vizibil se determina spectofotometric.

Mod de lucru:

0,5 ml soluție probă

0,5 ml soluție tampon citrat 0,05M pH=4,8

3,0 ml DNS

Incubare de 5 minute la 100oC

Diluare cu 20 ml apă distilată

Citire D.O. la 540 nm

3.5.2 Determinarea proteinelor prin metoda Lowry

Principiul metodei

Dozarea proteinelor (domeniu 25 – 500 µg) se bazează pe reducerea fosfomolibdaților și fosfowolframaților din reactivul Folin-Ciocâlteu de către compușii fenolici din proteină (tirozină) (LOWRY, 1959).

Reactivi

1.      Soluție enzimatică.

2.      Soluție alcalină A. Se dizolvă 4 g NaOH, 10 g Na2CO3, 0,2 g tartrat dublu de sodiu și potasiu în apa distilată și se aduce la 1 litru în balon cotat.

3.      Soluție B. Soluție CuSO4 0,5%.

4.      Reactiv alcalin de cupru. Înainte de folosire se amestecă 50 mL soluție alcalină A cu 1 mL soluție CuSO4 0,5% B.

5.      Reactiv Folin-Ciocâlteu diluat cu apă 1:2 înainte de utilizare.

6.      Soluție etalon de albumină serică bovină (BSA) în apă distilată (1 mg/mL).

Trasarea curbei de etalonare

Se iau cote parte din soluția etalon de BSA și se completează cu apă distilată la 0,2 mL. Se adaugă în ordine 5 mL reactiv alcalin de cupru și 0,5 mL reactiv Folin. Se lasă la temperatura camerei 30 minute, apoi se citește extincția în funcție de un martor obținut în aceleași condiții, dar cu înlocuirea soluției de BSA cu apă distilată.

Reacția de culoare

Se pipeteaza în ordine:

0,1 mL probă (soluție enzimatică);

0,1 mL apă distilată;

5 mL sol A+B;

0,5 mL reactiv Folin-Ciocâlteu (1:2).

Se realizează un martor, înlocuind soluția enzimatică cu apa distilată. Se lasă 30 de minute la temperatura camerei și se citeste extincția la 660 nm față de martor.

3.5.3 Determinarea carbonului organic în produsele de piele naturală

Pricipiul metodei

Carbonul organic este oxidat de către anhidrida dicromică (Cr2O7 2- ) în exces, în prezența acidului sulfuric, oxidare facilitată de căldura produsă prin diluarea unui volum de soluție normală de bicromat de K cu două volume de acid sulfuric concentrat și menținerea probei la temperatura de 1000 C timp de 20 de minute.

Reactivi

1) Bicromat de potasiu, soluție 1N. Se dizolvă în apă distilată 49,04g bicromat de potasiu (K2Cr2O7), uscat la 105oC într-un balon cotat de 1000 ml și se adăugă la semn.

2)Acid sulfuric concentrat (H2SO4 d=1,48)

Modul de lucru

Se cântăresc la balanța analitică 0,2 – 1g materie organică mărunțita și se trece cantitativ într-un vas Erlenmeyer de 200-300 ml. Se adaugă 10 ml soluție 1N de bicromat de potasiu (picătură cu picătură). Se adăugă apoi 20 ml acid sulfuric concentrat. Adăugarea celor 2 reactivi se va face astfel încât eventualele particule de materie organică existente pe pereții vasului să fie antrenate în soluția de oxidare. Se agită apoi vasele cu grijă pentru a se realiza o amestecare intimă între materia de analizat și soluțiile adăugate și se acoperă cu sticle de ceas. Imediat după amestecare și acoperire se pun vasele pe o baie de apă adusă în prealabil la fierbere, unde se țin 20 de minute.

Proba martor va conține cei 2 reactivi fără materie organică.

După trecerea perioadei de încălzire, se iau vasele și se lasă să se răcească la temperatura camerei, apoi li se adăugă fiecăruia câte 100-200 ml apă distilată, se acoperă și se lăsă în continuare să se răcească.

3.5.4 Dozarea carbonului organic.

Principiul metodei

Conținutul de carbon organic este calculat după cantitatea de anhidridă dicromică consumată pentru oxidarea lui. Excesul de anhidridă dicromică se titrează cu o soluție de sare Mohr 0,2N în prezența unui indicator de oxireducere.

Indicatorul folosit la titrarea excesului de oxidant poate fi: difenilamina sau difenilaminosulfonatul de bariu al căror viraj este de la albastru-violaceu la verde murdar sau ortofenantrolina al cărei viraj este cel mai ușor de urmărit (de la albastru la roșu).

Modul de lucru

Se trece cantitativ conținutul din vasul conic într-o capsulă de porțelan (după transvazarea conținutului se spală vasul de 2-3 ori cu apă distilată și se toarnă în aceeași capsulă). Se adăugă 5-6 picături de indicator și se titrează cu soluția de sare Mohr, până la virajul indicatorului.

Calculul rezultatelor

Unde:

a= volumul soluției de sare Mohr 0,2N folosită la titrarea probei martor, în ml;

b= volumul soluției de sare Mohr 0,2N folosită la titrarea probei de analizat, în ml;

f= factorul soluție 0,2N de sare Mohr (1);

0,0006= g C organic echivalent consumului de 1ml sare Mohr;

1,16= coeficient de corecție a conținutului de C;

100= factor pentru raportarea procentuală;

n= cantitate de materie organică analizată (g).

În cazul determinării carbonului organic s-au utilizat:

– o probă martor fără material organic;

– o probă în care a fost introdusă 0,02g blană cu piele nedegradată;

– o probă în care a fost introdusă 0,06g blană cu piele ținută în extractul enzimatic produs de tulpina DA7 timp de 24h la o temperatură de 370 C, aflată sub agitare.

3.5.5 Determinarea substanței uscate

Pentru determinarea substanței uscate, fragmentele de blană luate în experiment au fost spălate sub jet de apă și uscate la temperatura de 105oC, timp de 24 de ore și cântărite.

3.6 METODE DE DETERMINARE A ACTIVITĂȚII ENZIMATICE ALE PREPARATELOR ENZIMATICE OBȚINUTE

3.6.1 Determinarea activității proteolitice

Activitatea proteolitică se determină după metoda Anson, modificată pe substrat de cazeină.

Principiul metodei

Enzimele proteolitice catalizează hidroliza cazeinei permițând formarea unor compuși solubili în acid tricloracetic. Conținutul de tirozină din acești compuși, este determinat spectofotometric cu reactivul Folin-Ciocâlteu.

Reactivi și soluții

Tampon fosfat 0.2 M, pH 7.0 (39,0 ml soluție Na2HPO4 0,2 M + 61.0 ml soluție Na2HPO4 0.2 M)

Soluție de cazeină 1%. 1g de cazeină se dizolvă pe un agitator magnetic în cca. 30 ml NaOH 1N. Se neutralizează cu H3PO4 10%, adăugat în picături sub agitare continuă. Se aduce la pH-ul dorit și se completează cu tampon fosfat (pH 7 în cazul proteazelor neutre).

Soluția de L-tirozină 1 nM (se dizolvă 181,19 mg tirozină în 1000 ml HCl soluție 0.2N)

Soluție de HCl 0.01 N – 0.06 N – 0.2 N

Soluție de NaOH 0.5 N

Soluție acid tricloracetic 5%

Reactiv Folin-Ciocâlteu (se dizolvă 10 g Na2WO4 x 2 H2O + 2.5 g Na2MoO4 x 2 H2O + 15 g LiSO4 + 10 ml HCl conc. + 5 ml H3PO4 conc. și se aduce la 100ml cu apă distilată). Înainte de utilizare se diluează o parte din aceasta cu două părți de apă distilată.

Soluție enzimatică.

Metoda de lucru

Amestecul de reacție format din 0.5 ml soluție enzimatică (mediu de cultură separate de biomasa) și 1 ml soluție de cazeină 1% în tampon fosfat 0.2 M (pH 7) se incubează la 37oC timp de 10minute. Reacția enzimatică se stopează cu 2 ml acid tricloracetic 5%. Amestecul de reacție se menține 30 de minute la temperatura camerei și apoi se filtrează. La 0.5 ml filtrat se adaugă 0.5 ml HCl 0.2 N, 2 ml NaOH 0,5 N și 0,6 ml reactiv Folin-Ciocâlteu diluat 1:2. Se lasă 30 de minute la temperatura camerei și se măsoara extincția la 578 nm față de martor. La proba martor se lucrează asemănător, cu excepția că în amestecul de reacție se introduce acid tricloracetic imediat peste soluția de cazeină, se lasă în reapaus 30 de minute la temperatura camerei și apoi se introduce soluția enzimatică. În continuare se lucrează identic la proba de determinat.

Se construiește un grafic cu extincția citită la 578 nm pe ordonată și µmoli α-tyr pe abcisă.

Calculul rezultatelor

Din curba de etalonare se determină µmoli tirozină corespunzător extincției măsurate. Valorile citite pe grafic vor fi introduse în următoarea formulă:

= micromoli tyr/ml/min.

Unde:

3.5 – volum total amestec de reacție

1/10 – factor de transformare pentru un minut de activitate enzimatică;

0,5 – volum de lichid cu activitate proteolitică luat în lucru

0.5 – volum de lichid filtrat luat în lucru.

O unitate de activitate proteazică este definită ca fiind cantitatea de enzimă care în condițiile de reacție indicate eliberează 1 µmoli tyr pe minut.

3.6.2 Determinarea α-amilazelor prin metoda Hostettler și colab.

Principiul metodei

Amidonul este hidrolizat, sub acțiunea catalitică a α-amilazei la fragmente ale căror grupări reducătoare semiacetalice pot fi determinate cu acid 3,5-dinitrosalicilic. Concentrația de acid nitroaminosalicilic format, măsurată colorimetric, corespunde activității enzimatice.

Reactivi și soluții

1. Soluție tampon Na2 HPO4 – KH2PO4 20 mM, pH 6,9 ce conține și NaCl 10 mM;

2. Soluție amidon 1 %, preparată în tampon;

3. Reactiv 3,5 – dinitrosalicilic (se dizolvă la cald 10 g acid 3,5-dinitrosalicilic în aproximativ 300 ml apă distilată, se adaugă 400 ml NaOH 1 N și 300 g tartrat de sodiu și potasiu – după dizolvare se aduce la un volum final de 1:l).

4. Soluție standard de maltoză (100 mg %).

Mod de lucru

Amestecul de reacție care constă din:

ml soluție 1;

ml soluție 2;

0,5 ml soluție cu activitate enzimatică, este incubat la 25oC timp de 10 minute după care reacția este stopată cu 2 ml reactiv dinitrosalicilic

Probele sunt iucubate 5 minute pe baie de apă fierbinte, răcite sub jet de apă și după 20-60 minute sunt colorimetrate la 546 nm față de apa distilată.

Pentru determinarea glucidelor reducătoare preexistente în mediul de reacție la timpul 0, se prepară un martor cu același conținut ca proba, în care, însă, soluția enzimatică trebuie introdusă după reactivul dinitrosalicilic. Se colorimetrează și martorul față de apa distilată. Dacă D.O.probă – D.O.martor este mai mare de 1,5 se procedează la diluarea soluției enzimatice.

Construirea curbei etalon

Din soluția de maltoză (100 mg %) se prepară diluții după cum urmează:

Tabelul 3.1

Table 3.1

. Curba etalon pentru amilaze.

Calibration curve for amylases.

În fiecare din cele 6 eprubete se mai adaugă 1 ml soluție substrat și 2 ml reactiv dinitrosalicilic, apoi se incubează 5 min pe o baie de apă la fierbere. După răcirea probelor se așteaptă 20-60 min și apoi se colorimetrează la 546 nm față de apă distilată. Se trasează o curba etalon, indicând pe abscisă µmoli maltoză în mediul de reacție, iar pe ordonată – densitatea optică.

Calculul rezultatelor

Se transformă densitatea optică citită pentru probe și martori în µmoli maltoză cu ajutorul curbei etalon – iar rezultatele obținute sunt exprimate, astfel:

m = µmoli de maltoză, determinați din curba de etalonare ca fiind diferența dinte µmoli de maltoză din probă și µmoli de maltoză din martor;

D – factor de diluție a probei luat în lucru,

V – volum (ml) de soluție probă luată în lucru;

10 – timp de incubare

3.6.3 Determinarea activității lipolitice

Principiul metodei

Pentru determinarea activității lipolitice tulpinile au fost inoculate pe mediu minimal ce conține: NaCl 1g/l, CaCo3 0.05g/l, K2HPO4 2.38g/l, KH2PO4 0.7g/l, MgSO4 0.9g/l, Glucoză 3g/l, Piele 0.6g/l, pH 7,2, incubate la 35oC, timp de 7 zile la 135 rpm.

Determinarea activitatii lipazice se efectueaza titrimetric, prin dozarea acizilor grași eliberați în mediul de reacție în urma acțiunii enzimei asupra subratului, uleiul de măsline. Cantitatea de acizi grași formată se determină prin titrare cu o soluție diluată și standardizată de NaOH, în prezența fenolftaleinei (viraj incolor , pH 8,2 – 10) ca indicator. Volumul soluției de NaOH necesar pentru neutralizarea acizilor grași eliberați este proportional cu activitatea lipazică.

Reactivi:

Substrat: ulei de măsline preparat sub formă de emulsie în soluție apoasă de gumă arabică

Se dizolvă 16.5 g gumă arabică în 130 ml apă distilată.

După solubilizarea completă se diluează până la 165ml cu apă distilată

Se adaugă 20 ml ulei de măsline și 15 g gheața sfărâmată

Amestecul obținut se omognizeaza bine pe agitator

Observație: substratul se prepară proaspăt, înainte de utilizare.

Soluție tampon citrat 0.2 M, pH 7

Soluție de clorură de calciu 0.6%

Preparatul enzimatic: lichid de fermentație

Reactiv pentru stoparea reacției amestec etanol:acetonă (1:1)

Soluție de NaOH 0.1 M cu factor determinat, preparată cf FR X

Soluție indicator de fenolftaleină, preparată cf FR X.

Modul de lucru:

Reacția enzimatică a fost efectuată într-un pahar Erlenmeyer de 100 ml, comparativ cu o probă martor.

Pentru determinarea probei s-au utilizat 10 ml emulsie substrat, 2 ml soluție CaCl2, 5 ml soluție tampon citrat, 1-5 ml lichid de fermentație. Se incubează 60 de minute la 37oC sub agitare la 170 rpm, apoi se adaugă 20 ml reactiv de stopare. Se realizează titrarea acidității cu soluție NaOH 0.1 N în prezența fenolftaleinei (0.4 ml fenolftaleină la 40 ml soluție de titrat).

Proba martor se realizează asemănator, numai că reactivul de stopare se adaugă inainte de incubare.

Calculul activității

A (U/h) = (Vp – VM) x F x 100/V

Vp – volumul de soluție de NaOH 0.1 N cu care s-a titrat proba (ml)

VM – volumul de soluție de NaOH 0.1 N cu care s-a titrat martorul (ml)

F – factorul soluției de NaOH

100 – factorul care include transformarea volumului de soluție NaOH 0.1 N în µmoli acizi grași corespunzători.

v – volumul de lichid de fermentație luat în analiză (ml)

O unitate de activitate lipazică este definită ca fiind cantitatea de enzimă care eliberează prin hidroliza trigliceridelor din uleiul de măsline 1µmol de acid gras, în condițiile analizei (37oC, pH7, timp de reacție 60 de minute).

3.6.4 Determinarea activitații keratinolitice

Înainte de determinarea activității keratinolitice a fost făcut un screening al tulpinilor izolate pentru a se observa dacă microorganismele au activitate keratinolitică.

Screeningul a fost realizat pe mediu BMKA, un mediu bazal care contine (g/l): NH4Cl 0.5, NaCl 0.5, KH2PO4 0.4, K2HPO4 0.3, MgCl2x6H2O 0.1 și keratin-azur (Sigma), tăiat mărunt și sterilizat separat în concentrație de 3 mg/ml. Testul se bazează pe capacitatea microorganismelor de a consuma keratină din substanța keratin-azur, cu eliberare de colorant azur care determină albastrirea mediului.

Microorganismele testate au fost însămânțate pe mediu BMKA și ținute timp de 7 zile la 35oC, în condiții de agitare (135 rpm). În funcție de intensitatea culorii tulpinile/probele testate au fost. Densitatea microbiana a probelor incubate timp de 7 zile fost determinată spectrofotometric la lungimea de undă de 600nm.

În urma screeningului s-a determinat activitatea keratinolitică.

Pentru determinarea activității keratinolitice tulpinile bacteriene au fost inoculate pe mediu minimal ce conține: NaCl 1g/l, CaCo3 0.05g/l, K2HPO4 2.38g/l, KH2PO4 0.7g/l, MgSO4 0.9g/l, Glucoză 3g/l, Piele 0.6g/l, pH 7,2. Incubarea s-a realizat la 35oC, timp de 7 zile la 135 rpm.

Principiul metodei

– se iau 2 ml probă și se centrifughează la 10.000 rpm;

– se taie mărunt 80 mg de keratin azur;

– 0,5 ml supernatant din proba centrifugată + 1,5 ml Tris;

– se incubează proba la 50oC timp de 60minute;

– se citește la 595 nm.

Reactivi

Reactivii utilizați pentru determinarea activității keratinolitice:

– 80 mg keratin azur (0,8g)

– 2 ml suspensie (1,5 ml Tris; 0,5 ml supernatant din proba centrifugată)

Metoda se bazează pe reacția de hidroliză a substratului (keratin azur) sub acțiunea keratinazei. Spectrofotometric se determină modificarea absorbanței la 595nm ca urmare a intensificării colorației prin hidroliza substratului.

Rezultatele determinărilor au fost exprimate în U/ml. O unitate keratinazică reprezintă cantitatea de enzimă ce determină o creștere a absorbanței la 595 nm de 0.01 după o ora de reacție, la 60oC, cu agitare 135rotatii/min.

3.6.5 Determinarea activității colagenazice

Metoda se bazează pe reacția de hidroliză a colagenului sub acțiunea colagenazei, în urma căreia se pun în libertate peptide. Gradul de proteoliză se măsoară spectrofotometric în prezența ninhidrinei la 600 nm.

Rezultatele determinărilor au fost exprimate în U/ml. O unitate colagenazică reprezintă cantitatea de enzimă ce eliberează peptidele din colagen echivalent în intensitate de culoare determinată spectrofotometric cu ninhidrina cu 1,0 µmol de leucină în 5 ore, la pH 7,2 și temperatura 37oC în prezenta ionilor de calciu.

Pentru evidențierea activității colagenazice s-a folosit un mediu mineral, în care sursa de azot a fost reprezentată de bucăți de piele de ovine. Mediul conține (g/L):

NaCl 1 g

CaCl2 0,05 %

KH2PO4 0,7 g

Sucroză 3 g

MgS04 0,9 g

K2HPO4 2,38 g

Sursa de carbon 0,6 % piele

Principiul metodei

Aminoacizii liberi eliberați în urma degradării colagenului, au fost determinați utilizând o modificare a metodei MOORE și STEIN (1948), metodă colorimetrică ce folosește ninhidrina, transferând 0,2 ml din monstră în eprubetă. Eprubeta conține un amestec de 2 ml de ninhidrin-etilenă, glicol-monoetil, eter. După fierbere timp de 30 minute într-o baie de apă și după răcire, mostrele sunt diluate cu 10 ml soluție n- propanol de concentrație 50%. Absorbanța a fost determinată la 600 nm după 15 minute. O curbă etalon α-leucină, a fost folosită pentru a determina cantitatea de µmoli de aminoacizi echivalentă leucinei eliberate.

Concentrația proteinei solubile totală a fost determinată utilizând metoda LOWRY și COLAB. (1951), utilizând albumina serică bovină (BSA) ca etalon.

Testul de degradare a pielii cu ajutorul enzimelor a fost realizat utilizând 2 mg/ml soluție stoc de colagenază bacteriană tip IA. Experimentele au fost desfășurate aupra unor mostre pe piele de oaie de 2 cm2 în tampon Tris- HCl 50 mM, pH 7,2, la 35oC, cu agitare de 135rpm. Determinarea aminoacizilor eliberați a fost realizată la următoarele intervale de timp: 24, 48, 72, 96 și 120 de ore.

3.7 Documentație tehnică privind selectarea metodei de concentrare a preparatelor enzimatice

Cultivarea tulpinilor bacteriene selectate (DA7, DA10, DA13) s-a realizat pe mediu minimal, în care sursa de carbon și azot a fost reprezentată doar de eșantioane de piele și blană naturală, la 35oC în condiții de agitare (135 rpm), timp de 7 zile. Compoziția mediului de cultură a fost (g/L): NaCl 1 g; CaCl2 0,05 g; KH2PO4 0,7 g; Sucroza 3 g; MgSO4 0,9 g; K2HPO4 2,38 g și s-a folosit un preinocul din piele cu blană tăbăcită cu crom.

În vederea obținerii unor preparate enzimatice mai eficiente au fost testate două metode de concentrare în scopul selectării metodei care conservă cel mai bine activitatea complexelor enzimatice sintetizate de tulpinile bacteriene utilizate:

– concentrarea mediului de cultură la rotaevaporator;

– liofilizare; preparatul liofilizat a fost resolubilizat pentru analiză.

Pentru concentrare, mediul de cultură a fost filtrat, utilizându-se apoi un concentrator cu rotaevaporare sub vid Heildolph. Operația de concentrare s-a realizat la 40oC.

În vederea creșterii stabilității preparatului enzimatic de origine microbiană s-a recurs la procedeul de liofilizare.

• Probe recepționate: 50 ml suspensie din tulpinile DA7, DA10, DA13

• Pregătirea probelor pentru liofilizare:

– repartizare probe (câte 25 ml în vasul de liofilizare)

– adaos crioprotector: 10% trehaloză

– congelarea probelor

• Liofilizarea propriu-zisă:

– echipament: liofilizator Labconco cu capacitate maximă de 6 litri

– condiții de liofilizare: presiunea de 0,04 mbar; temperatura de – 40oC, timp de liofilizare 20 ore.

Reconsitituirea liofilizatului s-a realizat utilizand apă distilată sterilă.

3.8 Identificarea tulpinilor bacteriene isolate

Pentru identificarea tulpinilor bacteriene izolate s-a folosit sistemul

BIOLOG – Microbial Identification system:

Au fost utilizate trei tulpini bacteriene, notate DA7, DA10, DA13, ce au fost izolate în etapele precedente. Tulpinile au fost însămânțate pentru identificare pe geloză simplă și pe mediul BUG.

Etapele identificării cu sistemul Biolog – Microbial Identification system:

Tulpinile bacteriene au fost însămânțate pe mediul agarizat BUG și incubate 24 ore la 330C;

Etalonarea aparatului:

calibrarea densitometrului folosind etalonul de 65%;

calibrarea densitometrului folosind etalonul de 85%;

verificarea densității mediului de inocul IF-A;

Inocularea mediului IF-A cu o colonie bacteriană până la densitatea de 84 – 89%;

Inocularea plăcilor GEN III cu 100 µl de inocul;

Incubare la 330C, timp de 20 – 22 ore;

Citirea rezultatelor la spectrofotometrul Biolog.

Figura 3.2 Anatomia unei placi GEN III

Figure 3.2 The anatomy of a GEN III plate

CAPITOLUL IV

CHAPTER IV

REZULTATE OBȚINUTE

RESULTS OBTAINED

4.1 REZULTATE PRIVIND SELECȚIA ȘI IDENTIFICAREA MICROORGANISMELOR CAPABILE SĂ DEGRADEZE PIELEA NATURALĂ

În continuare va fi descrisă metoda de izolare și selecție a unor microorganisme cu potențial degradativ.

4.1.1 Screeningul bacteriilor izolate și alegerea sistemului biologic de utilizare în degradarea blănurilor

Pentru găsirea unor soluții biotehnologice care să stea la baza degradării celor două componente ale blănii, se impune screeningul și izolarea unor microorganismelor care să posede echipamentele enzimatice necesare.

Experimentele au debutat cu izolarea tulpinilor bacteriene în urma compostării resturilor de blană tăbăcită cu crom, provenită de a Institutul de Pielărie, București.

Pentru obținerea tulpinilor bacteriene înalt producătoare de proteaze s-a utilizat 40 grame sol cu un pH de 7,2, în care au fost introduse bucățile de blană naturală, masurând 4 cm2, timp de 3 luni.

După compostarea bucăților de blană, fragmente din aceasta au fost introduse într-un mediu simplu (a se vedea Capitolul III – Materiale și metode) sterilizat în prealabil la 120oC, 1.1 atm. și incubate 48 ore, la 135 rpm, la temperatura de 35oC. După incubare fragmentele au fost înlăturate și au fost introduse alte fragmente de blană naturală cu dimensiunea de 1 cm2, care au fost incubate timp de 120 ore, la 135 rpm la o temperature de 35oC.

Pentru obținerea coloniilor izolate s-a realizat o diluție de 10-1 și prin tehnica inundării 1 ml soluție a fost însămânțat pe plăci Petri cu geloză agarizată (a se vedea Capitolul III – Materiale și metode) și incubate timp de 24 ore, la temperatura de 35oC.

Coloniile izolate formate sunt de culoare alb laptos, punctiforme, cu margini regulate, la suprafața mediului, bombate, masurând un diametru cuprins între 0.1-10 mm, precum și colonii galbene, punctiforme, cu margini neregulate, având un diametru cuprins între 0.1-0.5 mm. După selecționare, acestea au fost trecute pe geloză agarizată în plan înclinat.

S-a realizat un screening de laborator în care au fost utilizate 90 de tulpini bacteriene isolate, în scopul selecționării tulpinilor înalt producătoare de proteaze, folosind procesul de cultivare pe medii de cultura specifice. Astfel s-au utilizat placi Petri cu mediu de tip PCA (plate count agar), numit și SMA (standard method agar), MAP (milk agar plates), mediu cu amidon, CMC și mediu cu Tween 80 (a se vedea Capitolul III – material și metode).

În jurul coloniilor testate producătoare de proteaze a fost observat un halou opaleșcent, după 24 ore de incubare, la o temperatură de 35oC.

Din cele 90 de tulpini bacteriene isolate și testate, au fost selectate 3 dintre acestea și anume DA7, DA10, DA13, care apoi au fost trecute și întreținute pe geloză agarizată și depozitate la 4oC.

Screeningul a continuat cu inocularea tulpinilor selectate pe 40 ml mediu minimal (NaCl 1g/lCaCo3 0.05g/l, K2HPO4 2.38g/l, KH2PO4 0.7g/, MgSO4 0.9g/l, Glucoză 3g/l, având un pH de 7.2) ce conținea ca unică sursă de carbon și azot blană tabacită în proporție de 0.6 %, iar apoi au fost incubate pe agitator la 135rpm, timp de 120 ore (h), la o temperatură de 35oC. Pe parcursul procesului de fermentație s-au recoltat probe la 24h, 48h,72h, 96h, 120h față de momentul inițierii creșterii culturii respective și s-au efectuat determinări ale activității enzimatice proteolitice și activității enzimatice specifice, după o diluție de 1:10 conform metodelor prezentate în Capitolul III – Materiale și metode.

Tabel 4.1

Table 4.1

Rezutatele obținute în urma screeningului activității proteazice la 578nm

Results of the proteolithic activity screening at 578 nm

A fost realizat și un screening al tulpinilor selecționate pentru a se observa toleranța pentru diferite temperaturi și diferite valori pH.

4.1.2 Rezultate obținute în degradarea biologică a blănurilor cu tulpinile selecționate

Temperatura la care se efectuează biosinteza proteazelor bacteriene este un factor esențial pentru formarea și acumularea în cantiate maximă a enzimei. Temperatura influențează viteza de dezvoltare a microorganismelor, viteza de formare, dar și de inactivare a enzimelor.

Temperatura stabilită pentru cultivarea tulpinilor izolate a fost de 35oC în funcție de datele din literatura de specialitate s-au stabilit o serie de valori de temperatură la care s-au efectuat determinări ale activităților enzimatice 120 de ore de la cultivare. Tulpinile bacteriene au fost crescute pe mediu minimal.

În tabelele 4.2 – 4.4 sunt prezentate rezultatele obținute privind influența diferitelor valori de temperatură asupra acumularii enzimelor proteolitice specifice pentru tulpinile izolate.

Tabel 4.2

Table 4.2

Rezutatele pentru tulpina DA7 în urma screeningului la diferite temperaturi, față de martor 0,181

DA7 screening readings for different temperatures, against the blank 0.181

Tabel 4.3

Table 4.3

Rezutatele pentru tulpina DA10 în urma screeningului la diferite temperaturi, față de martor 0.181

DA10 screening readings for different temperatures, against the blank 0.181

Tabel 4.4

Table 4.4

Rezutatele pentru tulpina DA13 în urma screeningului la diferite temperaturi, față de martor 0.181

DA13 screening readings for different temperatures, against the blank 0.181

Pe baza analizei rezultatelor prezentate în tabele se poate concluziona că cele trei tulpini izolate au prezentat cea mai bună activitate proteolitică la temperatura de 35oC și la un pH egal cu 7, dintre care cea mai ridicată activitate a fost înregistrată de tulpina DA10 și anume 1,203U/ml

Deoarece enzimele sunt proteine funcționale, proprietățile și biosinteza lor sunt puternic influențate de valorile pH-ului mediului de cultivare. S-a constatat că pe mediile naturale la un pH de 7.0-7.5 se limiteaza fenomenul de disociere, astfel încât acumularea enzimei proteolitice este maximă.

S-au stabilit o serie de valori pH la care s-au efectuat determinări ale activității enzimatice și activitatii enzimatice specifice la 120 de ore de la cultivare. Tulpinile bacteriene au fost crescute pe mediul minimal.

Rezultatele privind efectele diferitelor valori de pH asupra activității enzimatice sunt prezentate în tabelele 4.5 – 4.7

4.1.3 Identificarea microorganismelor selectate-denumire proprie a tulpinilor selectate

BIOLOG – Microbial Identification system este un sistem avansat pentru identificarea și caracterizarea microorganismelor, care ofera posibilitatea de identificare rapidă a peste 1900 de specii de bacterii aerobe și anaerobe, bacterii patogene, fungi filamentosi și drojdii, dar și analiza unor comunități microbiene. Sistemul BIOLOG GENIII se bazează pe analiza paternului metabolic rezultat din metabolizarea de către celulele microbiene a principalelor clase de produși biochimici și determinarea unor proprietăți fiziologice importante cum ar fi pH-ul, toleranța la salinitate, aciditate, dar și testarea sensibilității la diferite substanțe chimice.

Folosind sistemul BIOLOG – Microbial Identification system au fost identificate cele trei tulpini bacteriene, notate DA7, DA10, DA13,rezultatele fiind prezentate în tabelul 4.8 și în figurile 4.1 – 4.3.

Tabel 4.8

Table 4.8

Rezultatele obtinute la identificarea tulpinilor bacteriene folosind sistemul BIOLOG

The results of the bacterial strains identification, using the BIOLOG system

Pentru identificarea tulpinilor se iau în considerare:

– valoarea indicelui de similaritate (SIM) care reprezintă o comparație între rezultatele caracteristicilor biochimice ale tulpinii bacteriene testate și rezultatele testelor biochimice obținute cu tulpina de colectie (ATCC) folosită la obținerea bazei de date BIOLOG;

– Valoarea distanței (DIST) care reprezintă o comparație între primele două rezultate obținute.

Pentru o identificarea concludenta este necesar ca SIM > 0.5 iar DIST sa fie de cel putin 2 puncte (tabel 4.8).

Figura 4.1. Identificarea tulpinii Brevundimonas diminuta (DA7) cu sistemul BIOLOG – Microbial Identification system

Figure 4.1 Identification of Brevundimonas diminuta (DA7) stain using the BIOLOG – Microbial Identification system

Figura 4.2. Identificarea tulpinii Bacillus thurigiensis (DA10) cu sistemul BIOLOG – Microbial Identification system

Figure 4.2 Identification of Bacillus thurigiensis (DA10) stain using the BIOLOG – Microbial Identification system

Figura 4.3 Identificarea tulpinii Bacillus cereus (DA13) cu sistemul BIOLOG – Microbial Identification system

Figure 4.3 Identification of Bacillus cereus (DA13) stain using the BIOLOG – Microbial Identification system

4.2 REZULTATE PRIVIND DEGRADAREA ENZIMATICĂ A PRODUSELOR DIN BLANĂ

4.2.1 Rezultate privind obținerea preparatului enzimatic utilizat în degradarea blănurilor

Tulpinile bacteriene izolate selecționate (DA7, DA10, DA13) au fost folosite în experimentările ulterioare în vederea obținerii unui preparat enzimatic cu activitate proteolitică crescută, utilizate în hidroliza resturilor de blană tăbăcită.

Figura 4.4 Influența temperaturii asupra curbei etalon pentru determinarea proteazelor 578nm pentru tulpina DA7

Fig. 4.4. Temperature influence on the etalon curve of proteolytic activity at 578nm, DA7 strain

Figura 4.5 Influența temperaturii asupra curbei etalon a producției de protează 578nm pentru tulpina DA10

Fig. 4.5. Temperature influence on the etalon curve of proteolytic activity at 578nm, DA10 strain

Figura 4.6 Influența temperaturii asupra curbei de etalonare a producției de protează 578nm pentru tulpina DA13

Fig. 4.6. Temperature influence on the etalon curve of proteolytic activity at 578nm, DA13 strain

În figurile 4.4 – 4.6 sunt prezentate date referitoare la determinarea turbiditații și producției de protează bacteriană pentru tulpinile luate în experiment.

Figura 4.7 Influența temperaturii asupra producției de colagenază 600 nm pentru tulpina DA7

Figure 4.7 The influence of temperature above colagenasis production at 600 nm for DA7 strain

Figura 4.8 Influența temperaturii asupra producției de colagenază 600 nm pentru tulpina DA10

Figure 4.8 The influence of temperature above colagenasis production at 600 nm for DA10 strain

Figura 4.9 Influența temperaturii asupra producției de colagenază 600 nm pentru tulpina DA13

Figure 4.9 The influence of temperature above colagenasis production at 600 nm for DA13 strain

Pe baza rezultatelor prezentate în figurile de mai sus se poate concluziona că producția de colagenază cea mai ridicată se realizează în cazul cultivării tulpinii DA10 și anume o activitate enzimatică de 0,401 U/ml.

Rezultatele obținute sunt conforme cu datele din literatura de specialitate potrivit cărora temperatura de 35oC este cea mai benefică pentru creșterea bacteriană și producția de colagenază.

Figura 4.10 Influența temperaturii asupra producției de amilază 546nm

Figure 4.10 The influence of temperature above amilases production at 546 nm

Experimentările au continuat cu determinarea temperaturii pentru producția de amilază, masurând o producție enzimatică de 0,815 U/ml în cazul tulpinii DA10 pentru temperatura de 35oC, observându-se o scădere a turbidității la temperaturi mai crescute de 40oC.

Figura 4.11 Influența temperaturii asupra producției de keratinază 595 nm

Figure 4.11 The influence of temperature above keratinases production at 595 nm

Determinarea activității keratinolitice și a activităților enzimatice specifice s-a realizat la 120 de ore față de momentul inițierii culturii respective, moment al acumulării maxime a enzimelor în mediu și în care concentrația celulară este foarte ridicată.

Figura 4.12 Influența temperaturii asupra producției de lipază pentru tulpina DA 7

Figure 4.12 The influence of temperature above lipases production for DA7 strain

Figura 4.13 Influența temperaturii asupra producției de lipază pentru tulpina DA 10

Figure 4.13 The influence of temperature above lipases production for DA10 strain

Figura 4.14 Influența temperaturii asupra producției de lipază pentru tulpina DA 13

Figure 4.14 The influence of temperature above lipases production for DA13 strain

Pe baza figurilor 4.12 – 4.14 putem concluziona că temperatura are o mare influență asupra producției de lipază. Producția maximă a fost obținută cu tulpina DA10, la temperatura de 35oC, după o perioadă de incubare de 120 de ore.

Pe baza rezultatelor prezentate în figurile de mai sus se poate concluziona că determinările efectuate au fost extrem de utile în aflarea valorii optime de temperatură și pH a fiecărei tulpini.

Astfel pentru tulpinile izolate valorile optime sunt cuprinse între 30 și 40oC, cele mai bune rezultate fiind obținute la temperature de 35oC, iar pH optim a fost cuprins între 7.0 – 7.5.

Cele mai bune activități au fost înregistrate de tulpina DA10, la temeratură de 35oC și un pH de 7.2

Figura 4.15 Influența pH-ului asupra producției de protează pentru tulpina DA 7

Figure 4.15 The influence of pH on proteases production for DA7 strain

Figura 4.16 Influența pH-ului asupra producției de protează pentru tulpina DA 10

Figure 4.16 The influence of pH on proteases production for DA10 strain

Figura 4.17 Influența pH-ului asupra producției de protează pentru tulpina DA 13

Figure 4.17 The influence of pH on proteases production for DA13 strain

Datele din literatura de specialitate relevă eforturile cercetătorilor îndreptate în sensul aprofundării căilor ce au ca finalitate sporirea producției de protează bacteriană.

Astfel, cea mai importantă sursă pentru dezvoltarea optimă a culturilor bacteriene este cea de carbon. Preferințele pentru anumiți componenți variază de la o tulpină la alta precum și a diferitelor săruri ce intră în compoziția mediului de cultivare.

Pentru testarea rezistenței bacteriene la diferite valori pH, s-a utilizat un mediu minimal având o scală pH cuprinsă între 5,5 și 8,5 unitați. Tulpinile bacteriene au fost incubate la valorile normale de 135 rpm și 35oC. Au fost realizate experimentări privind turbiditatea bacteriană, precum și influența pH-ului asupra productivității enzimelor specifice.

Figura 4.18 Influența pH-ului asupra producției de lipază pentru tulpina DA 7

Figure 4.18 The influence of pH on lipases production for DA7 strain

Figura 4.19 Influența pH-ului asupra producției de lipază pentru tulpina DA 10

Figure 4.19 The influence of pH on lipases production for DA10 strain

Figura 4.20 Influența pH-ului asupra producției de lipază pentru tulpina DA 13

Figure 4.20 The influence of pH on lipases production for DA13 strain

În figurile 4.18 – 4.20 se observă influența pH-ului asupra productivității enzimelor lipolitice. Cea mai bună productivitate a fost obținută de tulpina DA 10 și DA 13 ambele înregistrând 160 U/ml, urmată de tulpina DA7 cu o productivitate de 100 U/ml.

Figura 4.21 Influența pH-ului asupra producției de amilază pentru tulpina DA 7

Figure 4.21 The influence of pH on amylases production for DA7 strain

Figura 4.22 Influența pH-ului asupra producției de amilază pentru tulpina DA 10

Figure 4.22 The influence of pH on amylases production for DA10 strain

Figura 4.23 Influența pH-ului asupra producției de amilază pentru tulpina DA 13

Figure 4.23 The influence of pH on amylases production for DA13 strain

Pentru studiul influenței pH-ului asupra producției de amilază bacteriană s-a pornit de la mediu minimal menționat în Capitolul III – Materiale și Metode, variindu-se valoarea pH între 5,5 și 8,5.

Astfel s-au obținut cele mai bune rezultate pentru tulpina DA10. La pH-ul de 5,5 unități aceasta a obținut 0,510 U/ml, iar pentru mediu minimal bazic de 8,5 aceasta a înregistrat valoarea de 0,660 U/ml. Valoarea cea mai bună a fost egală cu 1,115 U/ml, valoare obținută la pH-ul de 7,0 unități.

În cazul celor trei tulpini bacteriene luate în experiment se constată o creștere a numărului de indivizi, odată cu creșterea valorii pH până la 7,0 unități, după care urmează o scădere a masei bacteriene în mediu bazic.

Se observă de asemenea că tulpinile bacteriene luate în experiment au o rată de producție enzimatică mai bună în mediul bazic decât în cel acid.

Figura 4.24 Influența pH-ului asupra producției de colagenază pentru tulpina DA 7

Figure 4.24 The pH influence on colagenasis production for DA7 strain

Figura 4.25 Influența pH-ului asupra producției de colagenază pentru tulpina DA 10

Figure 4.25 The pH influence on colagenasis production for DA10 strain

Figura 4.26 Influența pH-ului asupra producției de colagenază pentru tulpina DA 13

Figure 4.26 The pH influence on colagenasis production for DA13 strain

Din analiza figurilor prezentate mai sus se poate constata ca valoarea optima a pH-ului în producția de colagenază este de 7,7 unități. Activitatea enzimatică cea mai crescută a fost obținută de tulpina DA10 și anume 0,399 U/ml, după 120 de ore de incubare, urmată de DA13 cu 0,396 U/ml.

Figura 4.27 Influența pH-ului asupra producției de keratinază pentru tulpina DA 7

Figure 4.27 The pH influence on keratinasis production for DA7 strain

Figura 4.28 Influența pH-ului asupra producției de keratinază pentru tulpina DA 10

Figure 4.28 The pH influence on keratinasis production for DA10 strain

Figura 4.29 Influența pH-ului asupra producției de keratinază pentru tulpina DA 13

Figure 4.29 The pH influence on keratinasis production for DA13 strain

Pe baza analizei rezultatelor prezentate în figurile 4.27 – 4.29 se poate constata că tulpinile izolate la valoarea de pH 7,0 a mediului au determinat o valoare a activității enzimatice mai mare decât cele înregistrate la alte valori de pH.

Deoarece enzimele sunt proteine funcționale, proprietățile lor sunt puternic influențate de valorile pH-ului mediului de cultivare. S-a constatat că pe mediile naturale la un pH de 5,5 – 8,5 se limitează fenomenul de disociere, astfel încât acumularea enzimei proteolitice este maximă.

Procesul de agitare al mediului de cultură permite o eficientă disponibilitate a nutrienților pentru celulele microorganismelor, însă la valori de agitare prea mari se poate instala un stres intens al culturii, având consecințe grave în producția de enzime.

Pentru a se determina influența agitării asupra biosintezei de proteaze s-au efectuat determinari ale activității enzimatice și activității enzimatice specifice utilizând un mediu minimal inoculat tulpinile izolate la diferite valori de agitare (100 rpm, 135 rpm și 170 rpm) pentru 120 h.

Figura 4.30 Influența agitării asupra producției de protează 578nm pentru tulpina DA 7

Figure 4.30 The influence of shaking on proteasis production at 578nm for DA7 strain

Figura 4.31 Influența agitării asupra producției de protează 578nm pentru tulpina DA 10

Figure 4.31 The influence of shaking on proteasis production at 578nm for DA710 strain

Figura 4.32 Influența agitării asupra producției de protează 578nm pentru tulpina DA 13

Figure 4.32 The influence of shaking on proteasis production at 578nm for DA13 strain

In tabelele 4.30 – 4.32 sunt prezentate rezultatele obținute privind influența diferitelor valori de agitare asupra acumulării enzimelor proteolitice pentru tulpinile izolate.

Figura 4.33 Influența agitării asupra producției de lipază la 100 rpm

Figure 4.33 The influence of shaking on lipasis production at 100 rpm

Figura 4.34 Influența agitării asupra producției de lipază la 135 rpm

Figure 4.34 The influence of shaking on lipasis production at 135 rpm

Figura 4.35 Influența agitării asupra producției de lipază la 170 rpm

Figure 4.35 The influence of shaking on lipasis production at 170 rpm

În urma determinărilor efectuate se constată că producția maximă de lipază este la 135 rpm și anume de 100 U/ml pentru tulpina DA10, determinare foarte utilă în stabilirea parametrilor optimi de producție enzimatică.

Figura 4.36 Influența agitării asupra producției de keratinază 595nm la 100 rpm

Figure 4.36 The influence of shaking on keratinasis production at 100 rpm, 595nm

Figura 4.37 Influența agitării asupra producției de keratinază 595nm la 135 rpm

Figure 4.37 The influence of shaking on keratinasis production at 135 rpm, 595nm

Figura 4.38 Influența agitării asupra producției de keratinază 595nm la 170 rpm

Figure 4.38 The influence of shaking on keratinasis production at 170 rpm, 595nm

Se constată că se obțin valori diferite pentru tulpinile izolate luate în calcul. Datele corelează cu cele din literatură care prezintă o agitare optimă în jurul valorii de 135 rpm. Valoarea cea mai bună în producția de keratinază a fost obținută de tulpina DA10 și anume 0,254 U/ml. O valoare bună a fost inregistrată si la 170 rpm, unde s-au înregistrat 0,238 U/ml pentru tulpina DA10, 0,187 U/ml pentru tulpina DA13, iar pentru izolata DA7, valoarea a fost de 0,179 U/ml.

Figura 4.39 Influența agitării asupra producției de amilază 546nm la 100 rpm

Figure 4.39 The influence of shacking on amylazis production, 546 nm, 100 rpm

Figura 4.40 Influența agitării asupra producției de amilază 546nm la 135 rpm

Figure 4.40 The influence of shacking on amylazis production, 546 nm, 135 rpm

Figura 4.41 Influența agitării asupra producției de amilază 546nm la 170 rpm

Figure 4.41 The influence of shacking on amylazis production, 546 nm, 170 rpm

Se observă că cele mai bune valori ale producției de amilază se obțin în jurul valorii de 135 rpm. Potențialul maxim al acestei valori este de 0,186 U/ml/min pentru tulpina DA7, 0,233 U/ml/min pentru tulpina DA10, iar pentru tulpina DA13 valoarea productivității maxime este de 0,212 U/ml/min., după 120 de ore de incubare. La celelalte valori se constată o ușoară scădere a activităților enzimatice.

Figura 4.42 Influența agitării asupra producției de colagenază 600nm la 100 rpm

Figure 4.42 The influence of shacking on colagenasis production, 600nm, 100rpm

Figura 4.43 Influența agitării asupra producției de colagenază 600nm la 135 rpm

Figure 4.43 The influence of shacking on colagenasis production, 600nm, 135 rpm

Figura 4.44 Influența agitării asupra producției de colagenază 600nm la 170 rpm

Figure 4.44 The influence of shacking on colagenasis production, 600nm, 170 rpm

Pe baza rezultatelor prezentate în tabelele 4.42 – 4.44 se poate concluziona că determinările efectuate au fost utile în aflarea valorii optime de agitare pentru producția de colagenază cu ajutorul tulpinilor izolate.

4.2.2 Biosinteza unui preparat enzimatic (cu tulpinile izolate) capabil să degradeze pielea naturală.

4.2.2.1 Dinamica acumulării în culturi submerse a proteazelor produse cu tulpini izolate.

Cele trei tulpini bacteriene selectate în urma screeningului au fost utilizate în urmatoarele experimentări privind dinamica acumularii în culturi submerse a proteazelor bacteriene.

Pentru experimentări se folosește ca mediu de cultivare un mediu minimal a cărui compoziție este prezentată în Capitolul III – Materiale și metode.

Condițiile de cultivare sunt similare cu cele de la screening, iar pe parcursul procesului de biosinteză se iau probe la 24h, 48h, 72h, 96, 120h, față de proba martor, momentul inițierii creșterii culturii respective. Acestea sunt analizate din punct de vedere al activității enzimatice proteolitice și activității enzimatice specifice, cum ar fi activitatea lipolitică, keratinolitică, colagenazică si activitatea amilolitică.

Culturile de bacterii isolate prezintă valori diferite ale acumulării de enzime proteolitice în mediul de cultivare, în funcție de componentele acestuia.

În figura 4.45 este prezentată dinamica acumulării proteazei în cazul cultivării pe mediul minimal a tulpinii DA7, iar in figurile 4.46 și 4.47 dinamica acumulării proteazei în cazul cultivării tulpinii DA10 și respectiv DA13 față de martor 0.118.

Figura 4.45 Dinamica acumulării proteazelor bacteriene pentru tulpina DA 7

Figure 4.45 The dynamic of bacterial proteasis accumulation for DA 7

Figura 4.46 Dinamica acumulării proteazelor bacteriene pentru tulpina DA 10

Figure 4.46 The dynamic of bacterial proteasis accumulation for DA 10

Figura 4.47 Dinamica acumulării proteazelor bacteriene pentru tulpina DA 13

Figure 4.47 The dynamic of bacterial proteasis accumulation for DA 13

Pe baza rezultatelor prezentate în figurile de mai sus se poate concluziona că cea mai ridicată producție de protează se realizează în cazul cultivării tulpini DA10 pe mediul minimal egală cu 0,988U/ml/min, urmată de activitatea enzimatica tulpinii DA13 de 0,900U/ml/min și o activitate proteolitică de 0,899U/ml/min înregistrată de tulpina DA7, în condițiile date; 35oC si 135 rpm.

Rezultatele obținute în urma experimetelor, sunt conforme cu datele din literatura de specialitate potrivit cărora o concentrație mai mare de substrat (blană) induce formarea unor cantități mai mari de enzimă (efectul inductor al substratului asupra capacității de biosinteză al enzimei de către microorganism).

Experimentările au continuat cu optimizarea biosintezei proteazelor bacteriene. În cadrul acestor experimentări s-au folosit cele trei tulpini isolate, selectate în urma screeningului, iar în ceea ce privește optimizarea mediului de cultură s-a plecat de la mediu minimal, având ca unică sursă de carbon blană tăbăcită, și s-a încercat obținerea unei formule a mediului de cultură care să determine obținerea unei cantități sporite de enzime proteolitice.

4.2.2.2 Influența sursei de carbon

Pentru studiul influenței sursei de carbon s-a pornit de la mediul minimal care a fost menținut constant, ce conținea în compoziția sa 0.6 g blană naturală și sintetică, care reprezintă unica sursa de carbon. Din analizele efectuate este vizibilă diferența de producție enzimatică proteolitică dintre probele care au conținut blană naturală și probele care au conținut blană sintetică. Datele obținute în urma experimentărilor sunt prezentate în figura 4.48, figura 4.49, figura 4.50.

Datele obținute au indicat existența în probele conținând eșantioane de piele sintetică a unei mici cantitatăți de proteine, deoarece microorganismele nu pot utiliza materialul sintetic drept sursă nutritivă. Totuși, acest conținut proteic nu poate fi explicat doar prin prezența accidentală a proteinelor pe blană, provenind din condițiile de manipulare a materialelor.

În probele conținând piele și blană naturale au fost determinate cantități de proteină cuprinse între 0,800 – 0,793 mg/ml, ceea ce indică faptul că microorganismele își sintetizează cantitatea de proteină necesară pornind de la sursele de carbon și azot oferite.

Și în probele care au utilizat drept substrat blana sintetică a fost detectată o activitate enzimatică, ceea ce poate fi explicată prin activitatea reziduală provenită din inocul (inoculul fiind reprezentat de suspensie bacteriană cultivată pe blana naturală) și de creșterea încă o anumită perioadă de timp a bacteriilor utilizând drept substrat componentele nutritive din inocul sau din celulele bacteriene moarte. O alta posibilă explicație ar fi ca esantioanele utilizate în acest experiment să conțină un adaos de fibre naturale.

Determinarea activității enzimatice proteolitice și a activității enzimatice specifice s-a realizat la 120 ore față de momentul inoculării, moment al acumulării maxime a enzimelor în mediu și în care concentrația celulară este foarte ridicată, față de martor 0,179.

Figura 4.48 Determinarea activității proteolitice pentru tulpina DA10 folosind ca sursă de carbon blană naturală și blană sintetică.

Figure 4.48 Determination of proteolytic activity for DA10 strain unsing as unique souce of carbon natural and syntetic fur

Figura 4.49 Determinarea activității proteolitice pentru tulpina DA7 folosind ca sursă de carbon blană naturală și blană sintetică.

Figure 4.49 Determination of proteolytic activity for DA7 strain unsing as unique souce of carbon natural and syntetic fur

Figura 4.50 Determinarea activității proteolitice pentru tulpina DA13 folosind ca sursă de carbon
blană naturală și blană sintetică.

Figure 4.50 Determination of proteolytic activity for DA13 strain unsing as unique souce of carbon natural and syntetic fur

Din analiza datelor prezentate în tabelele de mai sus, se poate concluziona că blana naturală este cea mai potrivită sursă de carbon, înregistrându-se valori semnificative de producție proteazică în cazul tulpinilor izolate DA7, DA10, DA13.

Pe baza rezultatelor prezentate în figurile de mai sus se poate concluziona că valoarea concentrației de proteină stabilita initial (0.6 g) în conformitate cu datele din literatura de specialitate, pentru mediul minimal, s-a dovedit a fi cea mai potrivită pentru producerea unei cantități maxime de protează.

Cele 3 culturi au prezentat o dinamică asemanătoare a acumulării de protează, în care la concentrații mai mari de 0.6% a proteinelor în mediu, producția de enzimă este în scadere, deoarece când concentrația de proteină este prea mică (de exemplu 0.1%) cantitatea de biomasă dezvoltată este mai mică și ca urmare cantitatea de enzimă biosintetizată este mai mică, iar când concentrația substratului este prea mare (de exemplu 1%) are loc fenomenul inhibiției microorganismului prin concentrația de substrat.

Tot ca influența a sursei de carbon, s-a studiat și efectul penelor asupra creșterii microorganismelor și producerii de protează bacteriană.

S-au făcut determinări pentru cele 3 tulpini bacteriene pe mediul minimal, înlocuindu-se blana cu sursele de carbon mentionate mai sus.

Ca și în cazul testării activității enzimatice folosind blana ca sursă de carbon, am realizat un screening al tulpunilor izolate pentru obținerea de enzime utilizând penele ca unică sursa de azot și carbon, menținând aceiași parametrii de cultivare, respectiv, 135 rpm, 35oC, mediu minimal cu un pH de 7,2 unități.

Figura 4.51 Influențele sursei de carbon asupra producției de proteaza la 578 nm pentru tulpina DA7

Figure 4.51 The carbon souces influence on proteasis production at 578 nm for DA7 strain

Figura 4.52 Influențele sursei de carbon asupra producției de proteaza la 578 nm pentru tulpina DA10

Figure 4.52 The carbon souces influence on proteasis production at 578 nm for DA10 strain

Figura 4.53 Influențele sursei de carbon asupra producției de proteaza la 578 nm pentru tulpina DA13

Figure 4.53 The carbon souces influence on proteasis production at 578 nm for DA13 strain

Pentru determinarea temperaturii optime de acțiune s-a determinat activitatea enzimatică proteolitică în intervalul de temperature 10oC – 70oC. Pentru toate variantele testate condițiile experimentale au fost identice – timpul de incubare, rotațiile per minut, pH-ul, concentrația substratului, singurul element care a variat fiind valoarea temperaturii.

Experimentele au continuat cu determinarea activităților enzimatice specifice, urmărindu-se aceeași parametrii ca și în cazul determinarilor realizate anterior.

Tabel 4.9

Tabel 4.9

Rezutatele obținute pentru tulpina DA7 în urma screeningului la diferite temperaturi

The screening results for DA7 strain at different temperatures

Tabel 4.10

Tabel 4.10

Rezutatele obținute pentru tulpina DA10 în urma screeningului la diferite temperaturi

The screening results for DA10 strain at different temperatures

Tabel 4.11

Tabel 4.11

Rezutatele obținute pentru tulpina DA13 în urma screeningului la diferite temperaturi

The screening results for DA13 strain at different temperatures

În urma screenigului de temperatură se observă că cea mai bună creștere a înregistrat-o, în continuare, tulpina DA10, urmată de tulpina DA13, ambele având randamentul maxim la temperaturi cuprinse intre 30oC și 40oC.

Tabel 4.12

Tabel 4.12

Influența temperaturii asupra producției de protează pentru tulpina DA7

The temperature influence on proteasis production for DA7 strain

Tabel 4.13

Tabel 4.13

Influența temperaturii asupra producției de protează pentru tulpina DA10

The temperature influence on proteasis production for DA10 strain

Tabel 4.14

Tabel 4.14

Influența temperaturii asupra producției de protează pentru tulpina DA13

The temperature influence on proteasis production for DA13 strain

În urma testării temperaturii am determinat producția de protează bacteriană, obținută utilizând metoda Anson (1938). Din experimentări se constată că producția de protează creste până la temperatura de 35oC, dupa care urmează o scadere a productivității enzimatice.

Figura 4.54 Influența temperaturii asupra producției de lipază

Figure 4.54 The temperature influence on lipases production

Pe baza rezultatelor prezentate în graficul din figura 4.54 se poate constata ca enzima are o temperatură optimă de acțiune în jurul valorii de 35oC. Ca și in cazul celorlalte determinări se observă o usoară scadere a productivității enzimelor lipolitice, producția bacteriană fiind stabilă până la temperatura de 40oC când își menține activitatea enzimatică. La temperatura de 70oC tulpina înregistrează o valoare enzimatică mai mica ca la temperatura de 10oC.

Figura 4.55 Influența temperaturii asupra producției de keratinază pentru tulpina DA7

Figure 4.55 The temperature influence on ketratinase production for DA7 strain

Figura 4.56 Influența temperaturii asupra producției de keratinază pentru tulpina DA10

Figure 4.56 The temperature influence on ketratinase production for DA10 strain

Figura 4.57 Influența temperaturii asupra producției de keratinază pentru tulpina DA13

Figure 4.57 The temperature influence on ketratinase production for DA13 strain

Din figurile 4.55 – 4.57 se constată că temperatura are o mare influență asupra producției de keratinază, având productivitatea cea mai crescută în jurul valorii de 35oC, respectiv 0,328 U/ml obținută cu tulpina DA10, apoi urmând o scădere a producțivității enzimatice după temperatura de 50oC.

Figura 4.58 Influența temperaturii asupra producției de amilază 546nm pentru tulpina DA7

Figure 4.58 The temperature influence on amilase production for DA7 strain, 546nm

Figura 4.59 Influența temperaturii asupra producției de amilază 546nm pentru tulpina DA10

Figure 4.59 The temperature influence on amilase production for DA10 strain, 546nm

Figura 4.60 Influența temperaturii asupra producției de amilază 546nm pentru tulpina DA13

Figure 4.60 The temperature influence on amilase production for DA13 strain, 546nm

Pe baza rezultatelor prezentate în figurile de mai sus se poate concluziona că producția de amilază cea mai ridicată se realizează în cazul cultivării tulpinii DA10, pe mediu minimal,la o temperatură de 35oC la un pH egal cu 7,2 unități, și anume 1,220 U/ml/min, urmată de tulpina DA13 cu 1,180 U/ml/min. În cazul temperaturilor de 70oC, producția amilolitică este foarte slabă, respective 0,060 U/ml/pentru tulpina DA13, 0,070 U/ml pentru tulpina DA10, iar tulpina DA7 a înregistrat valoarea de 0,055U/ml.

Figura 4.61 Influența temperaturii asupra producției de colagenază 600nm

Figure 4.61 The temperature influence on colagenasis production at 600nm

În urma screeningului turbidității se observă în tabelele 4.15 – 4.17 că agitarea are o influență asupra producției de biomasă bacteriană.

În figurile 4.62 – 4.68 este relatată activitatea enzimatică specifică, rezultată în urma testării tulpinilor isolate la diferite rotații per minut.

Figura 4.62 Influența agitării asupra producției de protează 578nm la 100 rpm

Figure 4.62 The shaking influence on proteasis production, 578 nm, 100 rpm

Figura 4.63 Influența agitării asupra producției de protează 578nm la 135 rpm

Figure 4.63 The shaking influence on proteasis production, 578 nm, 135 rpm

Figura 4.64 Influența agitării asupra producției de protează 578nm la 170 rpm

Figure 4.64 The shaking influence on proteasis production, 578 nm, 170 rpm

Figura 4.65 Influența agitării asupra producției de lipază

Figure 4.65 The shaking influence on lipases production

Figura 4.66 Influența agitării asupra producției de keratinază 595nm

Figure 4.66 The shaking influence on ketratinases production, 595 nm

Figura 4.67 Influența agitării asupra producției de amilază 546nm

Figure 4.67 The shaking influence on amilases production, 546 nm

Figura 4.68 Influența agitării asupra producției de colagenază 600nm

Figure 4.68 The shaking influence on cloagenase production, 600nm

S-a realizat un screening al influenței pH-ului asupra dezvoltării biomasei, (Tabelele 4.18 – 4.20) precum și testări asupra producției de enzime specifice (Figurile 4.69 – 4.79).

În urma testărilor se constată că cea mai bună activitate a fost înregistrată de tulpina DA10, urmată de tulpina DA13.

Figura 4.69 Influența pH-ului asupra producției de protează 578nm pentru tulpina DA7

Figure 4.69 The pH influence on DA7 strain proteases production, 578 nm

Figura 4.70 Influența pH-ului asupra producției de protează 578nm pentru tulpina DA10

Figure 4.70 The pH influence on DA10 strain proteases production, 578 nm

Figura 4.71 Influența pH-ului asupra producției de protează 578nm pentru tulpina DA13

Figure 4.71 The pH influence on DA13 strain proteases production, 578 nm

Figura 4.72 Influența pH-ului asupra producției de lipază pentru tulpina DA7

Figure 4.72 pH influence on lipases production for DA7 strain

Figura 4.73 Influența pH-ului asupra producției de lipază pentru tulpina DA10

Figure 4.73 pH influence on lipases production for DA10 strain

Figura 4.74 Influența pH-ului asupra producției de lipază pentru tulpina DA13

Figure 4.74 pH influence on lipases production for DA13 strain

Figura 4.75 Influența pH-ului asupra producției de keratinază la 595nm pentru tulpina DA7

Figure 4.75 pH influence on keratinases production at 595 nm for DA7 strain

Figura 4.76 Influența pH-ului asupra producției de keratinază 595 pentru tulpina DA10

Figure 4.76 pH influence on keratinases production at 595 nm for DA10 strain

Figura 4.77 Influența pH-ului asupra producției de keratinază 595 pentru tulpina DA13

Figure 4.77 pH influence on keratinases production at 595 nm for DA13 strain

Figura 4.78 Influența pH-ului asupra producției de amilază la 546nm

Figure 4.78 pH influence on amilases production at 546 nm

Figura 4.79 Influența pH-ului asupra producției de colagenază la 600nm măsurată după 120h

Figure 4.79 pH influence on colagenasis production at 600 nm after 120 h

În experimentările următoare s-a realizat testarea agitării asupra dezvoltării biomasei, precum și a productivității enzimatice specifice.

Tulpinile selecționate au fost incubate timp de 120 de ore, la un pH 7,0 și o temperatură de 35oC, la 100 rpm, 135 rpm și 170 rpm.

Figura 4.80 Influența agitării asupra producției de lipază

Figure 4.80 The shaking influence on lipases production

Figura 4.81 Influența agitării asupra producției de keratinază la 595nm

Figure 4.81 The shaking influence on keratinases production at 595 nm

Figura 4.82 Influența agitării asupra producției de amilază la 546 nm

Figure 4.82 The shaking influence on amilases production at 546 nm

Figura 4.83 Influența agitării asupra producției de colagenază 600 nm, masurată la 100 rpm

Figure 4.83 The shaking influence on collagenases production at 600 nm, 100 rpm

Figura 4.84 Influența agitării asupra producției de colagenază 600 nm, masurată la 135rpm

Figure 4.84 The shaking influence on collagenases production at 600 nm, 135 rpm

Figura 4.85 Influența agitării asupra producției de colagenază 600 nm, masurată la 170rpm

Figure 4.85 The shaking influence on collagenases production at 600 nm, 170 rpm

Ca și în cazul testarii producției enzimatice bacteriene utilizând blana ca unică sursă de carbon, randamentul maxim al producției a fost inregistrat la 135 rpm.

Figura 4.86 Dinamica acumulării în culturi submerse a proteazelor pentru tulpina DA7

Figure 4.86 The dynamic accumulation of proteases in submerse fermentation for DA7 strain

Figura 4.87 Dinamica acumulării în culturi submerse a proteazelor pentru tulpina DA10

Figure 4.87 The dynamic accumulation of proteases in submerse fermentation for DA10 strain

Figura 4.88 Dinamica acumulării în culturi submerse a proteazelor pentru tulpina DA13

Figure 4.88 The dynamic accumulation of proteases in submerse fermentation for DA13 strain

Rezultatele experimentărilor prezentate în figurile arată că cea mai ridicată producție de protează se realizează în cazul cultivării tulpini DA10 pe mediul minimal, la un pH 7,0, egală cu 0,677U/ml/min, urmată de activitatea enzimatica tulpinii DA13 de 0,648U/ml/min și o activitate proteolitică de 0,621U/ml/min înregistrată de tulpina DA7, în condițiile date; 35oC si 135 rpm.

4.2.3 Optimizarea biosintezei proteazelor bacteriene

4.2.3.1 Influența componentelor mediului de cultivare asupra biosintezei proteazelor bacteriene

Datele din literatura de specialitate relevă atenția cercetătorilor îndreptată în sensul aprofundării căilor ce au ca finalitate sporirea producției de protează utilizând ca substrat materii provenite din diferite sectoare industriale.

Astfel, cele mai importante surse pentru dezvoltarea optimă a culturilor bacteriene sunt cele de carbon și azot. Preferințele pentru un anumit component sunt diferite de la o tulpina la alta, astfel s-a efectuat o testare ce a cuprins surse naturale și sintetice, provenite din Industria Pielăriei.

O nouă serie de cercetări s-au axat pe obținerea unei cantități sporite de proteaze bacteriene care sa poata fi utilizată ca biopreparat aplicat în agricultură.

4.2.4. Determinarea activității enzimatice optime

Trei dinte tulpinile bacteriene izolate și testate au fost selectate, și anume DA7, DA10, DA13, acestea prezentând cea mai buna activitate proteolitică pe mediu PCA. Zonele clare de hidroliză din jurul coloniilor testate reflectă existența unei activități proteolitice extracelulare (HABIB et al., 2012)

Analiza datelor obținute arată o creștere a activității complexului enzimatic proporțional cu perioada de timp în care au fost cultivate tulpinile microbiene. De remarcat faptul că, drept inocul a fost utilizată suspensie bacteriană, corespunzătoare tulpinilor folosite, cultivate anterior, timp de 7 zile, pe același substrat, asociat cu agitarea (135 rpm) conducând la o creștere a activității enzimatice.

Figura 4.89. Tulpinile izolate și testate pe blană intr-un mediu minimal după 48 de ore de la incubare.

Figure 4.89. The isolated strains tested on fur and skin into minimal media, after 48 h of incubation.

Tulpinile bacteriene au fost incubate timp de 120 de ore în suspensie pe un mediu minimal la temperature de 35oC, 135 rpm, la un pH de 7.2

Parametrii au fost obținuți în experimetele de fermentație utilizând pahare Erlenmeyer de 100 ml și 40 ml mediu minimal.

Figura 4.90. Ritmul de creștere al tulpinilor izolate și rata de producție proteazică la 120 ore de incubare și o diluție de 1:25

Figure 4.90. Growth behavior of isolated bacterial strain and rate of extracellular protease production during 120h, after 1:25 dilution

O creștere a masei celulare și a activității lipolitice a fost observată (Figura 4.91) ca rezultat al unei puternice aerații (activitatea lipolitică a înregistrat 80 U/ml). Astfel activitatea lipolitică s-a dovedit a fi destul de ridicată în condițiile de cultivare date (Capitolul III – Materiale și metode).

Figura 4.91. Activitatea lipolitică în mediul de fermentație (U/h)

Figure 4.91. Lipase activity in fermentation media (U/h)

În vederea studierii biodegradabilității blănurilor naturale trebuie luate în considerare cele două componente majore ale acestora, respectiv pielea și blana propriu-zisă. Pentru degradarea celei dintâi, pielea, este necesară prezența complexului enzimatic colagenazic, iar pentru blană, a complexului keratinolitic.

Fiind utilizată metoda de screening preliminar se constată că microorganismele izolate selectate prezintă potențial biodegradativ în ceea ce privește activitatea keratinolitică și colagenazică.

Cea mai ridicată activitate de producție keratinolitică de catre tulpinile izolate a fost de 0.223 U/ml față de martor, produsă de tulpina DA10 în condițiile de cultivare date (Figura 4.92)

Figura 4.92. Activitatea keratinolitică determinate la 595 nm

Figure 4.92. The keratinolitic activity determination at 595 nm

Figura 4.93. Activitatea amilolitică a tulpinilor izolate după 120 h de cultivare

Figure 4.93. Amylolitic activity of isolates after 120 h of incubation

În fermentația submersibilă producția de amilază a înregistrat maximum de 0.198 U/ml produsă de tulpina DA10, la 120 de ore de incubare, unde a aratat o creștere semnificativă a ratei de producție (figura 4.93)

Figura 4.94. Determinarea activității colagenazice la 600 nm, după 120 h de incubare în mediu minimal.

Figure 4.94. Determination of collagenase activity at 600 nm, after 120 hours of incubation on minimal media

Activitatea colagenazică a înregistrat producția maximă de 0.373 U/ml, obținută cu tulpina DA10 în mediul de fermentație cu 0.6 g blană ca unică sursă de carbon și azot.

Tabel 4.24

Table 4.24

Determinarea carbonului organic, după 24 ore de incubare a fragmentelor de blană în soluția enzimatică.

Organic carbon determined, after 24 h of incubation of fur and skins in enzymatic solution.

Sursa de carbon organic are potențialul de a induce sinteza de protează la un nivel optim, și a fost determinat prin testarea componentelor organice, acestea fiind utilizate ca resurse individuale.

4.2.5 Izolarea din mediul de fermentatie a preparatului enzimatic obtinut prin biosinteza

4.2.5.1 Separarea biomasei

Preparatul enzimatic proteolitic obținut prin cultivarea tulpinilor izolate pe mediu minimal, în urma optimizării parametrilor de cultivare, este supus inițial operațiuni de separare grosieră a fazei solide care se realizează prin centrifugare la 9000 rpm, timp de 20 de minute. Supernatantul obținut constituie extractul proteic total (EPT), care este folosit în experimentările ulterioare privind aplicabilitatea enzimelor proteolitice.

Pentru etapa de concentrare a soluției enzimatice supernatantul obținut a fost concentrat de 10 ori cu ajutorul rotavaporului (prezentat în Capitolul III – Materiale și metode) procedeu care s-a realizat la o temperatură de 35oC și 135 rpm.

4.2.5.2 Concentrarea solutiei native prin evaporare sub vid

Cu fiecare tulpină s-au produs 3000 ml soluție enzimatică ce a fost concentrată de 10 ori cu ajutorul rotavaporului la o temperatură a băii de 70oC și 980 mbar, rezultând 300 ml soluție enzimatică concentrată. Soluția obținută a fost aplicată peste semințele luate în experiment în proporție de 1.0%, 1.5%, 2.0%, 2.5%, 3.0%, 3.5% si respective 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%.

Figura 4.95. Grâu fertilizat cu soluție enzimatică produsă de tulpina DA10, după 6 zile de creștere la concentrații între 35% (stânga) și 10% (dreapta)

Figure 4.95 Fertilized wheat with enzymatic solution produced by DA10 strain, after 6 days of growing, having concentration between 35% (left) and 10% (right)

Figura 4.96. Soluție enzimatică produsă de tulpina DA13 și aplicată ca biofertilizator la diferite concentrații între 35% (stanga) și 10% (dreapta), după 6 zile de creștere

Figure 4.96 Enzymatic solution produce by DA13 strain and applied as biofertilizer at different concentration between 35% (left) and 10% (right), after 6 days of growing.

Figura 4.97 Grâu după 6 zile de creștere, după ce a fost aplicat concentratul enzimatic produs de tulpina DA7

Figure 4.97 Wheat after 6 days of growing, after the enzymatic concentrate produce by DA7 was applied

Figura 4.98 Comparație a creșterii grâului după 6 zile de la adăugarea soluției enzimatice în diferite concentrații produse de către tulpinile bacteriene izolate

Figure 4.98. Compared wheat growth after 6 days with added concentrated enzymatic solution in different concentration produced by isolated strain

Figura 4.99 Creșterea grâului după 6 zile de la aplicarea concentratului enzimatic

Figure 4.99. The wheat growth after 6 days at different enzymatic concentrations

În testări s-au utilizat ca materii prime sol cu pH neutru, seminte ecologice și soluția enzimatică obținută în cadrul tezei de doctorat.

Preparatul enzimatic de protează bacteriană obținut a avut în momentul utilizării o activitate enzimatică de 1.117 U/ml pentru tulpina DA7, 1.329 U/ml pentru tulpina DA10 și 1.215 U/ml pentru tulpina DA13.

S-au realizat probe prin care s-a determinat influența adaosului de preparat enzimatic de protează bacteriană obținut în cadrul tezei de doctorat asupra indicatorilor de calitate a plantulelor obținute în urma experimentelor.

Metoda de lucru a fost cea de aplicare directă a preparatului enzimatic peste semințele luate in lucru.

4.2.5.3 Experimete de prelucrare a mediului de cultura prin liofilizarea concentratului

Liofilizarea, procedeul de concentrare a unui preparat, care presupune eliminarea apei prin sublimare în vid, cu aport controlat de căldură, daca presiunea este sub cea corespunzatoare punctului triplu (PT), mai mică de 4,579 mm Hg (0,006 bar).

Soluția enzimatică obținută cu ajutorul bacteriilor izolate rezultate din compostarea bucăților de blană, a fost concentrată de 10 ori cu ajutorul rotavaporului la o temperatură a băii de 70oC și 980 mbar.

4.2.6 Caracterizarea preparatului enzimatic liofilizat

S-au facut determinări enzimatice, după o diluție de 1:10 precum și determinarea carbonului organic după liofilizarea preparatului obținut cu ajutorul bacteriilor izolate.

Figura 4.100 Determinarea proteazelor după liofilizarea preparatului enzimatic obținut

Figure 4.100 Proteases determination after the lyophilization of obtained enzymatic preparation

Figura 4.101 Determinarea activității colagenazice după liofilizarea preparatului enzimatic obținut, screening la 600nm

Figure 4.101 Determination of collagenase activity after lyophilization of the enzymatic solution, screening at 600 nm

Figura 4.102 Determinarea activității keratinolitice după liofilizarea preparatului enzimatic obținut, screening la 595nm

Figure 4.102 Determination of keratinolytic activity after the lyophilization of the enzymatic solution, screeneing at 595 nm

Figura 4.103 Determinarea activității amilolitice după liofilizarea preparatului enzimatic obținut,

screening la 546 nm

Figure 4.103 Determination of amylolytic activity after the lyophilization of the enzymatic solution, screening at 546 nm

Figura 4.104 Determinarea activității lipolitice după liofilizarea preparatului enzimatic obținut

Figure 4.104 Determination of lipolytic activity after the lyophilization of the enzymatic solution that have been obtained

Figura 4.105 Determinarea cantității de carbon organic după liofilizarea preparatului enzimatic obținut

Figure 4.105 Determination of the organic carbon quantity after the lyophilization of the enzymatic solution that have been obtained

Figura 4.106 Determinarea activității microbiene la 600 nm după liofilizarea preparatului enzimatic obținut

Figure 4.106 Determination of bacterial activity at 600 nm after the enzymatic solution lyophilization

4.2.7 Rezultate privind gradul de degradare al produselor din piele cu ajutorul prepartului enzimatic obținut

După liofilizarea preparatului enzimatic s-a realizat o determinare privind gradul de degradare a produselor din blană naturală. Astfel, bucați de blană tăbăcită cu crom de 1 cm2 a fost introdusă în 40 de ml soluție enzimatică liofilizată și incubate timp de 48 de ore la 135 rpm și 35oC.

Figura 4.107 Activitatea microbiană rezultată în urma degradării bucaților de blană după

incubarea acestora în soluția enzimatică liofilizată

Figure 4.107 Microbiological activity resulted after leather decomposition into lyophilisate

enzymatic solution

4.3 EXPERIMENTĂRI PRIVIND OBȚINEREA DE BIOPREPARATE ENZIMATICE CU APLICABILITATE ÎN AGRICULTURA ECOLOGICĂ

4.3.1 Influența adaosului de preparat enzimatic obținut asupra culturilor de graminee și leguminoase

În 40 grame sol au fost adaugate 4 grame de semințe ecologice de cereale și respectiv leguminoase. Soluția enzimatică concentrată a fost adăugată în diferite concentrații pentru a se obține o doză optimă față de martor pentru aplicabilitatea acesteia ca fertilizator organic în agricultura ecologică.

Influența adaosului de preparat enzimatic obținut în cadrul tezei de doctorat asupra dezvoltării și calității plantelor. S-au realizat analize de laborator la care s-a determinat influența adaosului de preparat enzimatic de protează bacteriană obținută în cadrul tezei asupra proprietăților ecologice a plantelor tratate.

Figura 4.108 Grâu fertilizat cu soluția enzimatică obținută în cadrul tezei de doctorat la diferite concentrații față de martor.

Figure 4.108 Fertilized wheat with the enzymatic solution obtained in the doctorate work, at different concentration against the blank

Figura 4.109. Grâu fertilizat cu soluțiile enzimatice de concentrație 35%, obținute cu ajutorul tulpinilor isolate

Figure 4.109 Fertilized wheat with the enzymatic solution, having 35% concentration, obtained by using the isolate strains

Figura 4.110 Comparație între soluțiile enzimatice produse cu ajutorul tulpinilor izolate obținute în cadrul tezei de doctorat utilizate ca biofertilizator, la concentrația de 15% față de martor.

Figure 4.110 Comparation between enzymatic solutions obtained by using isolate strains, used as biofertilizer at 1.5% concentration against the blank

Analiza comparativă a acțiunii preparatului enzimatic asupra dezvoltării plantelor testate.

Rezultatele obținute în urma experimentelor au permis reprezentarea grafică a influenței adaosului preparatului enzimatic asupra plantulelor luat in experiment.

Figura 4.111 Comparație între diferite concentrații ale soluției enzimatice produse cu ajutorul tulpinii DA13 obținute în cadrul tezei de doctorat utilizate ca biofertilizator

Figure 4.111 Comparation between different concentration of the enzymatic solution obtained by DA13 strain, used as biofertilizer

Figura 4.112 Comparație între soluțiile enzimatice concentrate produse cu ajutorul tulpinilor izolate obținute în cadrul tezei de doctorat utilizate ca biofertilizator, la concentrația de 2,5% față de martor.

Figure 4.112 Comparation between enzymatic solutions at 2.5% concentrations obtained using the isolated strains, used as biofertilizer

Figura 4.113 Comparație între diferite concentrații ale soluției enzimatice produse cu ajutorul tulpinii DA13 obținute în cadrul tezei de doctorat utilizate ca biofertilizator pe plantule de R. sativus

Figure 4.113 Comparation between enzymatic solutions at different concentrations obtained using DA13 strains, used as biofertilizer for R. sativus

Figura 4.114. Comparație între soluțiile enzimatice concentrate produse cu ajutorul tulpinilor izolate obținute în cadrul tezei de doctorat utilizate ca biofertilizator, la concentrația de 3,5% față de martor.

Figure 4.114 Comparation between enzymatic solutions at 3.5% concentrations obtained using the isolated strains, used as biofertilizer against the blank

Figura 4.115. Comparație între soluțiile enzimatice concentrate produse cu ajutorul tulpinilor izolate obținute în cadrul tezei de doctorat utilizate ca biofertilizator, la concentrația de 2,5% față de martor pe seminte de R. sativus.

Figure 4.115 Comparation between enzymatic solutions at 2.5% concentrations obtained using the isolated strains, used as biofertilizer against the blank on R. sativus seeds

Figura 4.116. R. sativus fertilizat cu soluțiile enzimatice de concentrație 3,5%, obținute cu ajutorul tulpinilor isolate

Figure 4.116 Fertilized R. sativus with the enzymatic solution obtained using the isolate strains, at the 3.5% concentration

Figura 4.117 Comparație între soluțiile enzimatice concentrate produse cu ajutorul tulpinilor izolate obținute în cadrul tezei de doctorat utilizate ca biofertilizator, la concentrația de 1,5% față de martor.

Figure 4.117 Comparation between enzymatic solutions at 1.5% concentrations obtained using the isolated strains, used as biofertilizer against the blank

Figura 4.118. Comparație între diferite concentrații ale soluției enzimatice produse cu ajutorul tulpinii DA10 obținute în cadrul tezei de doctorat utilizate ca biofertilizator pe plantule de R. sativus

Figure 4.118 Comparation between different concentration of enzymatic solution, obtained using DA10 strain, used as biofertilizer on R. sativus plants

Analizând datele prezentate în figura 4.108 și 4.118 se constată că atât concentrația de 3.5% cât și concentrația de 35% au avut un efect benefic asupra creșterii și dezvoltării plantulelor testate față de martor.

În ceea ce privește plantulele obținute tratate cu diferite concentrații a soluției enzimatice se remarcă un efect de îmbunătățire a calității aspectului și dezvoltării acestora.

În cazul soluției obținute în cadrul lucrării prezente se observă că cel mai bun efect asupra îmbunătățirii calității plantulelor a fost înregistrat de tulpina DA10 la concentrația de 35%.

Figura 4.119 Soluțiile enzimatice obținute din tulpinile izolate, testate pe S.tuberosum ssp. Christian și Roclas, la diferite concentrații

Figure 4.119 The enzymatic solution obtained using the isolate strains, tested on S. tuberosum ssp. Christian and Roclas at different concentration

Figura 4.120. Soluțiile enzimatice obținute din tulpinile izolate, testate pe S.tuberosum ssp. Christian și Roclas la diferite concentrații

Figure 4.120 Enzymatic solution obtained using the isolate strains, tested on S.tuberosum ssp. Christian and Roclas at different concentration

F

Figura 4.121 Soluțiile enzimatice obținute din tulpinile izolate, testate pe S.tuberosum ssp. Christian și Roclas la diferite concentrații

Figure 4.121 Enzymatic solution obtained using the isolate strains, tested on S.tuberosum ssp. Christian and Roclas at different concentration

Figura 4.122 Soluțiile enzimatice obținute din tulpinile izolate, testate pe S.tuberosum ssp. Christian și Roclas la diferite concentrații

Figure 4.122 Enzymatic solution obtained using the isolate strains, tested on S.tuberosum ssp. Christian and Roclas at different concentration

Figura 4.123 Soluțiile enzimatice obținute din tulpinile izolate, testate pe S.tuberosum ssp. Christian și Roclas la diferite concentrații

Figure 4.123 Enzymatic solution obtained using the isolate strains, tested on S.tuberosum ssp. Christian and Roclas at different concentration

Figura 4.124.Comparație între S.tuberosum ssp. Christian și S. tuberosum ssp Roclas. Soluție enzimatică obținută cu ajutorul tulpinilor izolate, la diferite concentrații

Figure 4.124 Comparation between S.tuberosum ssp. Christian and S. tuberosum ssp. Roclas. Enzymatic solution obtained by using the isolate strains, at different concentration

CAPITOLUL V

CHAPTER V

CONCLUZII ȘI RECOMANDĂRI

CONCLUSIONS AND RECOMANDATION

Cercetările efectuate în vederea realizării prezentei teză de doctorat, permit formularea următoarelor concluzii:

În jurul coloniilor izolate producătoare de proteaze se observă un halou opalescent fapt ce indică activitatea proteazică a microorganismelor

Experimentul realizat pentru stabilirea perioadei optime de cultivare a tulpinilor microbiene a indicat o creștere a activității complexului enzimatic proporțional cu perioada de cultivare, valorile determinate după 120 de ore fiind cele mai ridicate. Ca urmare, pentru experimentele următoare s-a stabilit o perioada de cultivare de 120 de ore pentru tulpinile microbiene testate.

Pe baza rezultatelor obținute se poate constata ca enzima are o temperatură optimă de acțiune în jurul valorii de 35oC. Ca și in cazul celorlalte determinări se observă o usoară scadere a productivității enzimelor, producția bacteriană fiind stabilă până la temperatura de 40oC când își menține activitatea enzimatică. La temperatura de 70oC tulpina înregistrează o valoare enzimatică mai mica ca la temperatura de 10oC.

La testarea pH-ului s-au obținut cele mai bune rezultate la o valoare de 7,2 unitați (1,115 U/ml). La pH-ul de 5,5 tulpinile izolate au avut o activitate în jurul valorii de 0,510 U/ml, iar pentru mediu minimal bazic de 8,5 acestea au avut activitate enzimatică în jurul valorii de 0,660 U/ml.

S-a determinat influența agitării asupra activității enzimatice utilizând un mediu minimal inoculat cu tulpinile izolate la diferite valori de agitare 100 rpm, 135 rpm și respectiv 170 rpm, în urma rezultatelor concluzionându-se că cea mai bună activitate s-a înregistrat la valoarea de 135 rpm.

Screeningul activității proteazice a fost facut pentru blană naturală, blană sintetică și pene în proporție de 0,6%. În urma determinărilor se constată că tipul sursei de carbon are un mare impact asupra producției de enzime. Blana sintetică nefiind bogată în proteine înregistrează o productivitate enzimatică foarte scăzută de 0,315 U/ml față de 0,800 U/ml pentru blana naturală la 135rpm, 120 ore și pH 7,0 pentru tulpina DA10.

Cantitatea de carbon organic este vizibil redusă, rezultat al activității microbiene ce a utilizat carbonul din bucățile de blană pentru producția enzimatică

S-au caracterizat cele trei tulpini din punct de vedere al activității enzimatice: activitatea proteolitică, activitatea amilolitică, activitatea lipolitică, activitatea keratinolitică și activitatea colagenazică, astfel:

Pentru proteaze producția a fost 1,430 U/ml în cazul enzimelor obținute din hidroliza blănurilor naturale, iar pentru enzimele obținute din hidroliza penelor este de 0,726 U/ml;

Pentru colagenază valoarea a fost de 0,401 U/ml pentru hidroliza blănurilor naturale, iar pentru enzimele obținute din hidroliza penelor este de 0,418 U/ml;

În cazul determinării amilazei în urma hidrolizei blănurilor s-a înregistrat valoarea de 0,870 U/ml iar valoarea determinată în urma utilizării penelor ca unică sursă de carbon a fost de 1,220 U/ml;

În cazul producției de keratinază valoarea maximă a fost obținută în cazul hidrolizării penelor și anume 0,328 U/ml față de 0,248 U/ml obținute în cazul hidrolizării blănurilor;

Producția maximă de lipază a fost de 140 U/ml în ambele cazuri de hidrolizat.

Având în vedere faptul că tulpinile izolate au a manifestat o activitate enzimatică redusă, față de blana sintetică s-a renuntat la utilizarea acesteia.

Tulpinile B. diminuta (DA7) B. thuringiensis (DA10) și B. cereus (DA13) au fost identificate prin testul Biolog și au capacitatea de a degrada produsele din piele și blană naturală tăbăcite cu crom.

Mediul de fermentație obținut prin cultivarea tulpinilor izolate având ca unică sursă de carbon piele și blană naturală provenită de la Institutul de Pielărie București, s-a prelucrat prin filtrare și concentrare obținându-se un produs microbiologic concentrat, lichid, utilizat ca adaos biofertilizant în culturi vegetale de R. sativus, Triticum sp. și S. tuberosum.

Adaosul de preparat enzimatic s-a dovedit a fi eficient în creșterea și dezvoltarea culturilor de graminee și leguminoase

În cazul fertilizării S. tuberosum se observă că și specia are o mare influență asupra dezvoltării în prezența fertilizantului.

B. thurigiensis s-a dovedit a avea cea mai bună producție enzimatică, ce a dat rezultate satisfacătoare în testarea invitro ca biofertilizator de concentrație 35% asupra culturilor de graminee și leguminoase.

În urma experimentărilor se poate dezvolta o tehnologie privind degradarea biologică și enzimatică a produselor din blană naturală, o tehnologie de obținere a hidrolizatului și utilizarea acestuia ca biofertilizant precum și dezvoltarea tehnologiilor de identificare a blănurilor naturale.

Cercetările au fost susținute în cadrul proiectului Eureka – BIOFUR E5770/2012

5.2 CONTRIBUȚII ORIGINALE

Prezenta teză de doctorat cu titlul Sisteme biologice și biochimice de degradare acelerată

a produselor din piele naturală, conține următoarele aspecte originale:

În cadrul tezei s-au selecționat două tulpini de Bacillus sp. și una de Brevundimonas sp. capabile să hidrolizeze resturile de blană naturală tăbăcită cu crom: tulpina DA7, tulpina DA10 și tulpina DA13

Pentru selecționarea tulpinilor s-a utilizat metoda îngropării resturilor de blană în pământ de florărie, urmată de compostare timp de 3 luni.

S-au caracterizat cele trei tulpini din punct de vedere al activității enzimatice: activitatea proteolitică, activitatea amilolitică, activitatea lipolitică, activitatea keratinolitică și activitatea colagenazică.

S-au identificat tulpinile izolate utilizând testul Biolog; s-a constatat că două tulpini aparțin genului Bacillus sp. și una genului Brevundimonas sp.

Tulpinile nou izolate au fost cultivate pe medii de cultivare specifice, în sistem submers, la flacoane agitate de 500 ml, cu 200 ml mediu/flacon, astfel încât volumul final să fie de 3000 ml. Mediul de fermentație astfel obținut s-a prelucrat prin filtrare și concentrare obținându-se un produs microbiologic concentrat, lichid, utilizat ca adaos biofertilizant în culturi vegetale de R. sativus. Triticum sp., S. tuberosum.

S-a constatat efectul stimulator în creșterea plantulelor testate în condiții de seră.

Un alt aspect original a constatat în testarea lichidului concentrat pentru degradarea blănurilor tăbăcite cu crom.

S-a constatat o reducere a carbonului organic cu cca. 30%, ceea ce confirmă activitatea hidrolitică a complexului enzimatic produs de tulpinile izolate.

5.3 DEZVOLTAREA TEHNOLOGIILOR PRIVIND DEGRADAREA BIOLOGICĂ ȘI ENZIMATICĂ A PRODUSELOR DIN BLANĂ NATURALĂ

Se poate dezvolta o tehnologie de obținere a hidrolizatului și utilizarea acestuia ca biofertilizant

Utilizarea hidrolizatului în degradarea resturilor de piele și blană din industria pielăriei

Dezvoltarea tehnologiilor de identificare a blănurilor naturale

Lista de figuri

LISTA DE TABELE

BIBLIOGRAFIE

Adriano B., (2008), Bacterial keratinases:Useful enzymes for bioprocessing agroindustrial wastes and beyond. Food Bioprocess Technol 1:105–116

Aftab M.N., Hameed A., Ikram-ul-Haq, C. Run-sheng, (2006), Biodegradation of Leather Waste by Enzymatic Treatment, The Chinese Journal of Process Engineering, 6 (3), pp. 462-465

Albu M.G., (2009), Geluri și matrici colagenazice cu grade diferite de hidratare și structură cvasisolidă pentru aplicații biomedicale, Rezumatul tezei de doctorat, Universitatea din București, Facultatea de Chimie, paginile 6,7,8.

Alexander M., (1996), Bioremediation technologies in Biodegradation and Bioremediation (Alexander M., ed.), Acad. Press, London, pp.248-270

Anson M.L., (1938), J. Gen. Physiol. 22, 79-89

Anson, M. L., (1940), Journal of General Physiology. 23, 695

Asdormithee S., Akiyama K., Sasaki T., Takata R., (1994), Isolation and characterisation of a collagenolytic enzyme from Bacillus licheniformis N22, J. Fermen Bioengi., 78:283, pg.7.

Astbury W. T. și Street A., (1931), Phil. Trans. Roy. Soc., A, 230, 75. The structure of proteins; two hydrogen-bonded helical configurations of the polypeptide chain” Fundamentals of fibre structure.

Astbury W. T. și Woods H. J., (1933), NATURE, 126, 913 (1930); Phil. Trans. Roy. Soc., A, 232, 333;

Aunstrup K., (1980), Proteinases in microbial enzymes and bio conversions, Economics Microbiology. Ed. Rose, A.H. 5, 50-114.

Baehaki M., Suhartono D., Syah A., Sitanggang Siswa Setyahadi, Meinhardt F., (2012), Purification and characterization of collagenase from Bacillus licheniformis F11.4 African Journal of Microbiology Research, 6 (10), pp. 2373-2379

Baker J.O., Adney W.S., Thomas S.R, Nives R.A., (1995), Synergism between purified bacterial and fungal celluases. ACS Symp. Series, 618:114 – 141.

Banga I., (1966), Structure and function of elastin and collagen, Akad, Kiado, Budapesta.

Böckle B., Galunsky B., Müller R., (1995), Characterization of a keratinolytic serine proteinase from Streptomyces pactum DSM 40530. Appl Environ Microbiol 61:3705–3710

Böckle B., Müller R., (1997), Reduction of disulfide bonds by Streptomyces pactum during growth on chicken feather. Appl Environ Microbiol 63:790–792

Braikova D., Vasileva-Tonkova E., Gushterova A., Nedkov P., (2007), Enzyme Mixtures and Complex Biosynthesis edited by Sanjoy K, Bhattacharya

Bressollier P., Letourneau F., Urdaci M., Verneuil B., (1999), Purification and characterization of a keratinolytic serine protease from Streptomyces albidoflavus. Appl Environ Microbiol 65:2570–2576

Brigitte B., Galunsky B., și Muller R., (1995), Characterization of a keratinolytic serine proteinase from streptomyces pactum DSM 40530. Applied and environmental microbiology, p. 3705–3710.

Bruice T.C., Fife T.H., Bruno J. J., Brandon N.E., (1962), Hydroxyl Group Catalysis. II. The Reactivity of the Hydroxyl Group of Serine. The Nucleophilicity of Alcohols and the Ease of Hydrolysis of Their Acetyl Esters as Related to Their pKa' Biochemistry, 1 (1), pp 7–12

Bruice T.C., Sturtevant Julian M., (1959), Imidazole Catalysis. V. The Intramolecular Participation of the Imidazolyl Group in the Hydrolysis of Some Esters and the Amide of γ-(4-Imidazolyl)-butyric Acid and 4-(2'-Acetoxyethyl)-imidazole2 J. Am. Chem. Soc., 81 (11), pp 2860–2870

Burcea Mirela, (2001), Microbiologie general – Manual de laborator, Editura Piatra Craiului București.

Carey E.E., W. H. Allaway, O.E. Olson, (1977), Control of Chromium Concentration in Food Plants. 2. Chemistry of Chromium in soils and its availability to Plants. J Ag. Food Chem. Vol 25(2) p. 305-309.

Cârsteanu M., Vlădescu C., (1982), Colagenul Biochimie și fiziologie, Ed. Academiei Republicii Socialiste Române România, pg. 8-74.

Chirița G., (1981), Colagenul și utilizările lui, Ed. Tehnică, București, pp.114-120.

Ciavetta C. and P. Sequi, (1989), Evaluation of chromium release during the decomposition of leather meal fertilizers applied to the soil. Fert Reearch 19: 7-11.

Dayanandan A., Kanagaraj J., Sounderraj Lesley, Govindaraju R., Suseela G. Rajkumar, (2003), Application of an alkaline protease in leather processing: an ecofriendly approach. Journal of Cleaner Production, Volume 11, Issue 5, Pages 533- 536

Dayanandan J., Kanagaraj L., Sounderraj R., Govindaraju G.S. Rajkumar, (2003), Application of an alkaline protease in leather processing: an ecofriendly approach, J. of Cleaner Production, 11, pp. 533-536

Dettmer M.A.Z., Ayub M. Gutterres, (2011), Hide unhairing and characterization of commercial enzymes used in leather manufacture, Braz. J. Chem. Eng., 28 (3)

Dozie I.N.S., Okeke C.N., Unaeze N.C., (1994), A thermostable, alkaline-active keratinolytic proteinase from Chrysosporium keratinophilum. World J Microbiol Biotechnol 10:563–567

Ellis D.O., McGavin S, (1970), The structure of collagen–an X-ray study. J Ultrastruct Res.  Aug; 32(3):191–211.

El-Safey E.M., (1994), Production of microbial a-amylases under solid-state incubation conditions in the open air, Sci. A thesis, Bot. and Microbiol. Dept., Fac Sci, Al-Azhar Univ., Cairo, Egypt.

Galarza B.C., Cavello I., Greco C.A., Hours R., Schuldt M.M., Cantera C.S., (2009), Alternative Technologies for adding value to bovine hair waste, J. Soc. Leather Technol. Chem., 94, pp. 26-32.

Giongo L.J., Lucas S.F., Casarin F., Heeb P., Brandelli A., (2007), Keratinolytic proteases of Bacillus species isolated from the Amazon basin showing remarkable de-hairing activity. World J Microbiol Biotechnol 23:375–382

Godfrey T., West S., (1996), Industrial enzymology. 2nd ed., Macmillan Publishers Inc., New York, N.Y, p. 3

Gousterova A., Brailkova D., Goshev I., Christov P., Tishinov K., Tonkova V.E., Haertle T., Nedlkov P., (2005), Degradation of keratin and collagen containing wastes by newly isolated Thermoactinomycetes for alkaline hydrolysis. Lett Appl Microbiol 40:335–340

Gradišar H., Friedrich J., Križaj I., Jerala R., (2005), Similarities and specificities of fungal keratinolytic proteases: comparison of keratinases of Pacecilomyces marquandii and Doratomyyces microsporus to some known proteases. Appl Environ Microbiol 71:3420–3426

Gradišar H., Kern S., Friedrich J., (2000), Keratinase of Doratomyces microsporus. Appl Microbiol Biotechnol 53:196–200

Gupta R., Ramnani P., (2006), Microbial keratinases and their prospective applications: An overview. Appl Microbiol Biotechnol 70:21–33

Habib S.M.A., Fakhruddin A.N.M., Begum S., Ahmed M.M., (2012), Isolation and screening of thermostable extracellular alkaline protease producing bacteria from tannery effluents. J. Sci. Res. 4: 515-522

Harkness R.D., Marko A.M., Muir H.M., (1954), Biochem J., pg. 56, 558.

Hisano T., Abe S., Wakashiro M., Kimura A., Murata K., (1989), Isolation and properties of a collagenase with caseinolytic activity from a Pseudomonas sp. J. Fermen, Bioeng., 68:399, pg.403.

Holt J.G., Krieg N.R., Sneath P.H.A., Staley J.T., (1994), Bergey’s manual of determinative bacteriology, 9th edition. Williams and Wilkins, Baltimore, pp 559–562

Hostettler F., Borel E., Deuel H., (1951), Über die Reduktion der 3,5-Dinitrosalicylsäure durch Zucker, Helvetica Chimica Acta ,Volume 34, Issue 6, Pages 2132–2139

Israel-Roming F., Cornea P.C., Gherghina E., Luța G., Bălan D., (2014), Bacterial proteolytic enzymes tested on keratin and collagen based material, Scientific Bulletin. USAMV București, series F. Biotechnologies, vol. XVIII, pp. 169-173.

Israel-Roming F., Luța G., Bălan D., Gherghina E. , Cornea C.P., Matei F., (2015), Time and Temperature Stability of Collagenase Produced by Bacillus licheniformis, Agriculture and Agricultural Science Procedia Volume 6, Pages 579-584

Jain R., Jain P.C., (2010), Production and partial characterization of collagenase of Streptomyces exfolyantus CFS 1068 using poultry feather, Indian Journal of Experimental Biology, volume 48, pg.174, 177.

Janssen P.H., Peek K., Morgan H.W, (1994), Effect of culture condition on the production of an extracellular proteinase by Thermus Sp Rt 41 A. Appl Microbiol Biotechnol 41:400–406

Joo H.S., Kumar C.G., Park G.C., Kim K.T., Paik S.R., Chang C.S., (2002), Optimization of the production of an extracellular alkaline protease from Bacillus horikoshii. Process Biochem 38:155–159

Jurcoane Ș. et al., Tratat de biotehnologie, vol.I, editura tehnică, București, 2009.

Jurcoane Ș., Israel-Roming F., (2003), Lucrări practice: Biotehnologia Enzimelor și Proteinelor, București.

Jurcoane Ș., Popa O., și colab., (1995), Biochimia și biotehnologia obținerii proteinelor și enzimelor, Partea I – Proteine – curs litografiat U.S.A.M.V. Timișoara

Jurcoane Ș., Sasarman E., Roșu A., Banu A., Lupescu I., Tamba-Berehoiu R., Rădoi F., (2004), Tratat de Biotehnologie, Ed. Tehnică, București.

Kanth S.V., Venba R., Madhan B., Chandrababu N.K., Sadulla S., (2008), Studies on the influence of bacterial collagenase in leather dyeing, Dyes and Pigments, 76, pp. 338-347

Kanth S.V., Venba R., Madhan B., Chandrababu N.K., Sadulla S., (2009), Cleaner tanning practices for tannery pollution abatement: Role of enzymes in eco-friendly vegetable tanning,J. of Cleaner Production, 17, pp. 507-515

Kato T., Yamagata Y., Aria T., Ichishima E., (1992), Purification of a new extracellular 90-kDa serine proteinase with isoelectric point 3.9 from Bacillus subtilis nattoo and elucidation of its distinct mode of action. Biosci Biotechnol Biochem 56:1166–1168

Korkmaz H., Hür H., Dinçer S., (2004), Characterization of alkaline keratinase of B. licheniformis strain HK1 from poultry waste, Annals of Microbiology 54 (2), 201-211.

Koshland D.E. Jr., (1972), The catalytic power of enzymes, Proc. Robert A. Welch Found Conf. Chem. Res. 15, 53-91

Ku G., Kronenberg M., Peacock D.J., et al., (1993), Prevention of experimental autoimmune arthritis with a peptide fragment of type II collagen, Eur. J. Immunol., 23, pp. 591-599

Kumar A.Ganesh, Swarnalatha S., Sairam B., Sekaran G., (2008), Production of alkaline protease by Pseudomonas aeruginosa using proteinaceous solid waste generated from leather manufacturing industries, Bioresource Technology, Volume 99, Issue 6, Pages 1939-1944

Lin X., Lee C.G., Casale E.S., Shih J.C.H., (1992), Purification and characterization of a keratinase from a feather—degrading Bacillus licheniformis strain. Appl Environ Microbiol 58:3271–3275

Liu L., Ma M., Cai Z., Yang X., Wang W., (2010), Purification and proprieties of a collagenolytic protease produced by Bacillus cereus MBL13 strain, Food technol. Biotechnol., 48, pg 151, 152.

Lowry O.H., Rosebrough N.J., Farr A.L., Randall R.J., (1951), Protein measurement with the Folin phenol reagent, J. Biol. Chem., 193 (1), pg 265-275.

Lowry O.H., Rosenbrough N.J., Farr A.L., Randall R.J., (1951), Protein measurement with the Folin phenol reagent, J. Biol. Chem., 193, pp. 267-275

Lupescu I., Groposila-Constantinescu D., Jurcoane S., Diguta C., Cozea A., Tcacenco L., (2007), Production of lipases by strain of the non-conventional yeast Yarrowia lipolytica and isolation of crude enzyme, Roumanian Biotechnology letter, Vol 12, No3, pp 3261-3268.

Lutckmeier C., Amaral L., Gutterres M., Marcílio N., (2008), Dechroming of wet-blue leather wastes, XVII FLAQTIC Congress, Rio de Janeiro.

Macedo A. J., Silva W. O. B., Gava R., Driemeier D., Henriques J. A. P., Termignoni C., (2005), Novel keratinase from Bacillus subtilus S14 exhibiting remarkable dehairing capabilities. Applied and Environmental Microbiol, 594-596 Jan.

Macedo A.J., da Silva W.O.B.D, Gava R., Driemeier D., Henriques J.A.P., Termignoni C., (2005) Novel keratinase from Bacillus subtilis S14 exhibiting remarkable dehairing capabilities. Appl Environ Microbiol 71:594–596

Macedo A.J., da Silva W.O.B.D., Gava R., Driemeier D., Henriques J.A.P., Termignoni C., (2005), Novel keratinase from Bacillus subtilis S14 exhibiting remarkable dehairing capabilities. Appl Environ Microbiol 71:594–596

Mandl J.D., MacLennan E.L., Howes R.H., DeBellis A. Sohler, (1953), Journal of Clinical Investigation, 32, pp. 1323-132

Mencinicopschi Gh., (1987), Biotehnologii în prelucrarea produselor agroalimentare, Editura Ceres.

Michaelis L., Menten M.L., (1913), Die Kinetik der Invertinwirkung. Biochemische Zeitschrift. 49:333–369.

Miller J. M. Și Rhoden D. L., (1991), Preliminary evaluation of Biolog, a carbon source utilization method for bacterial identification, J. Clin. Microbiol, vol. 29 no. 6 1143-1147

Moore S., și Stein W.A., (1954), A modified ninhydrin reagent for photometric determination of amino acids and related compounds, J. Biol. Chem. 211, pg. 907-913.

Moore S., Stein W.H., (1948), Photometric ninhydrin method for use in the chromatography of amino acids, J. Biol. Chem. 176: 367-388.

Moore S., Stein W.H., (1948), J. Biol.Chem, 176, pp. 367-388

Nam G.W., Lee D.W., Lee H.S., Lee N.J., Kim B.C., Choe E..A, Hwang J.K., Suhartono M.T., Pyun Y.R., (2002), Native-feather degradation by Fervidobacterium islandicum AW-1, a newly isolated keratinase-producing thermophilic anaerobe. Arch Microbiol 178:538–547

Okamoto M., Yonejima Y., Tsujimoto Y., Suzuki Y., Watanabe K., (2001), A thermostable collagenolytic protease with very large molecular mass produced by thermophilic Bacillus sp. strain MO-1, Appl. Microbiol. Biotech., 57, pp. 103-108

Onafide A.A., Sane N.A., Musallam A.A., Zarban S., (1998), A review: potentials for biotechnological application of keratin-degrading microorganisms and their enzymes for nutritional improvement of feather and other keratins as livestock feed resources. Bioresour Technol 66:1–11

Ozgunay H., Colak S., Mutlu M.M., Akyuz F., (2007), Characterization of Leather Industry Wastes, Polish J. of Environ. Stud., 16 (6), pp. 867-873

Papadopoulos M.C., (1986), The effect of enzymatic treatment on amino acid content and nitrogen characteristics of feather meal. Anim Feed Sci Technol 16:151–156

Pauling și Corey, (1951), Proc Natl Acad Sci U S A. 1951 Apr; 37(4):205-11.

Petre M., (2001), Utilizarea microorganismelor imobilizate în hidrogeluri radiopolimerizate în degradarea și conversi a unor constituenți vegetali, Teza de doctorat

Petre M., Teodorescu A., (2009), Biotehnologia protecției mediului Vol. I, Ediția a 2-a revizuită și adăugită, Editura CD Press, București (ISBN: 978-606-528- 040-3; 978-606-528-041-0)

Poonam N., Dalel S., (1995), Enzyme and microbial systems involved in starch processing, Enzyme Microb. Technol. 17: 770-778

Priya S., Rajaram A., Rajaram R., Ramasami T., (2008), Depilation of skins by pure enzymes, J. of the Society of Leather Technologists and Chemists, 92, pp. 214-221

Puri S., Beg Q.K., Gupta R., (2002), Optimization of protease production from Bacillus sp. using surface response methodology. Curr Microbiol 44:286–290

Ramnani P., Singh R., Gupta R., (2005), Keratinolytic potential of Bacillus licheniformis RG 1: structural and biochemical mechanism of feather degradation. Can J Microbiol 51:191–196

Rao M.B., Tanksale A.M., Ghatge M.S., Deshpande V.V., (1998), Molecular and biotechnological aspects of microbial proteases. Microbiol Mol Biol Rev 62:597–635

Ravanti L., Kahari V.M., (2000), Matrix metalloproteinases in wound repair, Int. J. Mol. med., 6, pp. 391-407

Reichard U., Buttner S., Eiffert H., Staind H., (1990), Purification and characterization of an extracellular serine protease from Aspergilus fumigatusand its detection in tissue, J. Med. Microbiol., 33 pp. 243-251

Riffel A., Lucas F., Heeb P., Brandelli A., (2003), Characterization of a new keratinolytic bacterium that completely degrades native feather keratin. Arch Microbiol 179:258–265

Robertus J.D., Kraut J., Richard A. Alden, și Birktoft Jens J., (1972), Subtilisin. Stereochemical mechanism involving transition-state stabilization Biochemistry, 11 (23), pp 4293–4303

Rui R., Zhiqiang L., Min C., (2009), Isolation and purification of caseinase and collagenase from commercial Bacillus subtilis AS1.398 enzyme by affinity chromatography, J. Soc. Leather. Tech. Chem., 93, pp. 8-11

S.V. Kanth, R. Venba, B. Madhan, N.K. Chandrababu, S. Sadulla, (2009), Cleaner tanning practices for tannery pollution abatement: Role of enzymes in eco-friendly vegetable tanning J. of Cleaner Production, 17, pp. 507-515

S.V. Kanth, R. Venba, B. Madhan, N.K. Chandrababu, S. Sadulla, (2008), Studies on the influence of bacterial collagenase in leather dyeing, Dyes and Pigments, 76, pp. 338-347

Sambrook J., Russell D.W., (2001), Molecular cloning a laboratory manual, 3rd edn. Cold Spring Harbour Laboratory, New York

Saravanabhavan S., Aravindhan R., Thanikaivelan P., Rao J.R., Nair B.U., Ramasami T., (2004), A source reduction approach: integrated bio-based tanning methods and role of enzymes in dehairing and fiber opening. Clean Technol Environ Policy 7:3–14

Schrooyen P.M.M., Dijkstra P.J., Oberthur R.C., Bantjes A., Feijen J., (2001), Partially carboxymethylated feather keratins. 2. Thermal and mechanical properties of films. J Agric Food Chem 49:221–230

Shivaji S., Bhanu V.N., Aggarwal R.K., (2000), Identification of Yersinia pestis as a causative organism of plague in India as determined by 16S rDNA sequencing and RAPD-based genomic finger printing. FEMS Microbiol Lett 189:247–252

Stoicescu A., (1999), Manualul inginerului de industrie alimentară, vol. II, Editura Tehnică București

Storm D. R. și Koshland D. E. Jr., The importance of orientation factors in enzymatic reaction, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol 36, 13-20 (1971)

Suzuki Y., Tsujimoto Y., Matsui H. și Watanabe K., (2006), Decomposition of extremely hard-to-degrade animal proteins by thermophilic bacteria. JOURNAL OF BIOSCIENCE AND BIOENGINEERING Vol. 102, No. 2, 73–81.

Suzuki Y., Tsujimoto Y., Matsui H., Watanable K., (2006), Decomposition of extremely hard-to-degrade animal proteins by thermophilic bacteria. J Biosci Bioeng 102:73–81

Suzuki Y., Tsujimoto Z., Matsui H., Watanabe K., (2006), Decomosition of extremely hard-to-degrade animal proteins by thermophilic bacteria, Journal of Bioscience and Bioengineering vol. 102, pg.74-76.

Tapai (Stoica) Mihaela, (2009), Biosinteza unor amilaze utilizate în hidroliza unor materii prime agricole, Teza de Doctorat, p.65-66, Bucuresti.

Tapai M., (2009), Biosinteza unor amilaze utilizate în hidroliza unor materii prime agricole – Teză de doctorat, București

Thanikaivelan P., Rao J. R., Nair B. U., Ramasami T., (2004), Progress and recent trends in biotechnological methods for leather processing, Trends in Biotechnol., 22.

Thanikaivelan P., Rao J.R., Nair B.U., Ramasami T., (2004), Progress and recent trends in biotechnological methods for leather processing, Trends in Biotechnol.  p. 22

Thanikavelan P., Rao J.R., Nair B.U., Ramasami T., (2004), Progress and recent trends in biotechnological methods for leather processing. Trends Biotechnol 22:181–186

Thys R.C.S., Lucas F.S., Riffel A., Heeb P., Brandelli A., (2004), Characterization of a protease of a feather—degrading Microbacterium species. Lett Appl Microbiol 39:181–186

Tork S., Aly M.M., Nawar L., (2010), Biochemical and molecular characterization of a new local keratinase producing Pseudomomanas sp., MS 21. Asian Journal of Biotechnology 2 (1): 1-13

Tran L.H., Nagano H., (2002), Isolation and characterization of Bacillus subtilis CN2 and its collagenase production, J. Food. Sci., 67, pp. 1184-1187

Trandafir V., Demetrescu I., Vișan S., Albu M., (2013), Managementul deșeurilor provenite din industria pielăriei, pg. 102-103.

Varela H., Ferrari M.D., Belobrajdic L., Vasquez A., Loprena M.D., (1997), Skin dehairing proteases of Bacillus subtilis: production and partial characterization. Biotechnol Lett 19:755–758

Voet D., Voet J.G., (2004), Biochemistry, 3rd edn. Wiley, New York

Waldvogel F.A. și Swartz N.M., (2004), Collagenolytic activity of bacteria, Journal of Bacteriology, pg. 662, 666.

Wang, R., Min, C., Haiming, C., Li, Z., (2009), Enzyme unhairing – an eco-friendly biotechnological process. J. Soc. Leather Technol. Chem., 93, 51-55.

Williams C.M., Richter C.S., Mackenzie J.M., Shih J.C.H., (1990), Isolation, identification and characterization of a feather degrading bacterium. Appl Environ Microbiol 56:1509–1515

Yamagata Y., Abe R., Fugita Y., Ichishima E., (1995), Molecular cloning and nucleotide sequence of the 90k serine protease gene hspK from Bacillus subtilis (natto) No. 16. Curr Microbiol 31:340–344

Yamamura S., Morita Y., Hasan Q., Yokoyama K., Tamiya E., (2002), Keratin degradation: a co-operative action of two enzymes from Stenotrophomonas sp. Biochem Biophys Res Commun 294:1138–1143

Zarnea G., Mencin1copschi Gh, Brăgărea S. T. (1980), Bioingineria preparatelor enzimatice microbiene, Editura Tehnică București.

Zerdani I., Faid M., Malki A., (2004), Digestion of solid tannery waste by strains of Bacillus sp. isolated from compost in Morocco, International Journal of Agriculture and Biology, pg. 758, 759, 761.

Zerdani I., Faidi M., și Malki A., (2004), Digestion of solid tannery wastes by strains of Bacillus sp. isolated from compost in Morocco. INTERNATIONAL JOURNAL OF AGRICULTURE & BIOLOGY. 2004 /06–5–758–761.

Zerdani M., Faid A. Malki, (2004), Digestion of solid tannery wates by strains of Bacillus spp. isolated from compost in Morocco, Internat. J. Agric. Biol., 6 pp. 758-761

WEB:

https://www.fastbleep.com/biology-notes/40/1184

http://static.fastbleep.com/assets/notes/image/10362_1.jpg

https://en.wikibooks.org/wiki/Principles_of_Biochemistry/Enzymes

https://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/1/15/CatalysisScheme.png

http://www.scrigroup.com/sanatate/cosmetica-frumusete/Biochimia-pielii92133.php

Lista de publicații

Mioara Ancu​​ța Dumitru*, Gabriel Corbu*, Ștefana Jurcoane** The International Conference of the University of Agronomic Sciences and Veterinary Medicine of Bucharest, Agriculture for life, life for agriculture, June 9-11, 2016, Bucharest, Romania; "Leather hydrolisate evaluated as bioactive potato fertilizer​"​ Scientific Bulletin. Series F. Biotechnologies, Vol. XX, 2016 ISSN 2285-1364, CD-ROM ISSN 2285-5521, ISSN Online 2285-1372, ISSN-L 2285-1364

Mioara Ancuța Dumitru*, Ștefana Jurcoane** The International Conference of the University of Agronomic Sciences and Veterinary Medicine of Bucharest, Agriculture for life, life for agriculture, June 4-6, 2015, Bucharest, Romania; "Leather hydrolyses evaluated as organic nitrogen soil input" Scientific Bulletin. Series F. Biotechnologies, Vol. XIX, 2015 ISSN 2285-1364, CD-ROM ISSN 2285-5521, ISSN Online 2285-1372, ISSN-L 2285-1364

Mioara Ancuța Dumitru*, Ștefana Jurcoane** The International Conference of the University of Agronomic Sciences and Veterinary Medicine of Bucharest, Agriculture for life, life for agriculture, June 4-6, 2015, Bucharest, Romania; "Characterization of bacterial enzymatic complex used in leather waste degradation" Scientific Bulletin. Series F. Biotechnologies, Vol. XIX, 2015 ISSN 2285-1364, CD-ROM ISSN 2285-5521, ISSN Online 2285-1372, ISSN-L 2285-1364