ȘI MEDICINĂ VETERINARĂ BUCUREȘTI FACULTATEA DE MEDICINĂ VETERINARĂ DOMENIUL: MEDICINĂ VETERINARĂ Drd. CRĂCIUN (MICLI) V. AGLAIA TEZĂ DE DOCTORAT… [301583]

UNIVERSITATEA DE ȘTIINȚE AGRONOMICE

ȘI MEDICINĂ VETERINARĂ BUCUREȘTI

FACULTATEA DE MEDICINĂ VETERINARĂ

DOMENIUL: MEDICINĂ VETERINARĂ

Drd. CRĂCIUN (MICLI) V. AGLAIA

TEZĂ DE DOCTORAT

Semnificația clinică și rolul glicoproteinelor în malignizarea tumorilor mamare la cățele și pisici

CONDUCĂTOR ȘTIINȚIFIC:

Prof. Univ. Dr. Ion Alin Bîrțoiu

BUCUREȘTI

2015

UNIVERSITY OF AGRONOMICAL SCIENCE
AND VETERINARY MEDICINE BUCHAREST

THE FACULTY OF VETERINARY MEDICINE

DOMAIN: VETERINARY MEDICINE

Drd. CRĂCIUN (MICLI) V. AGLAIA

DOCTORAL THESIS

The clinical significance and the role of glycoproteins in the malignancy of mammary tumors in female dogs and cats

SCIENTIFIC LEADERS:

Prof. Univ. Dr. Ion Alin Bîrțoiu

BUCHAREST

2013

Dedicație

Dedic această lucrare

fiului meu Eugeniu Adrian MICLI,

a cărei dragoste m-a [anonimizat]-[anonimizat], care a avut un rol decisiv în orientarea carierei mele pentru a deveni medic veterinar demn de onoare și înalt profesionalism;

– Domnului Prof. Univ. Dr. [anonimizat] m-a îndrumat, încurajat și sprijinit în realizarea acestei teze;

– Doamnelor Prof. Univ. Dr. Aneta Pop și Prof. Univ. Dr. Manuella Militaru care au avut disponobilitatea de a mă sprijini în realizarea cercetării în laborator;

– [anonimizat], artei și judecății pe care trebuie să-l aibă un medic veterinar.

Autoarea

CUPRINS

SUMMARY

TABLE DE MATIERES

Semnificația clinică și rolul glicoproteinelor în malignizarea tumorilor mamare la cățele și pisici

REZUMAT

Cuvinte cheie: cățele, pisici, oncopatii, tumoră, glicoproteine, lectine

Teza de doctorat intitulată „Semnificația clinică și rolul glicoproteinelor în malignizarea tumorilor mamare la cățele și pisici” este structurată în 6 capitole sistematizate în două părți: Studiu bibliografic și Cercetări proprii.

Prima parte a lucrării este compusă din 2 capitole: Capitolul 1 – Tumorile glandei mamare la cățea și pisică; [anonimizat].

Partea a doua cuprinde 4 capitole structurate astfel: [anonimizat], [anonimizat]; [anonimizat]; Capitolul V – Examenul histopatologic; [anonimizat].

Lucrarea începe cu Introducerea în care se prezintă după o consultare bibliografică importanța studiului comparativ al glicoproteinelor din serul sanguin și țesuturile tumorale în raport cu martorii prin investigarea componentei glucidice, a glicoproteinelor solubile extrase din tumori mamare de la cățea și pisică.

Câinele și pisica reprezintă o [anonimizat]. [anonimizat], [anonimizat]. [anonimizat] o [anonimizat].

Studiile de specialitate scot în evidență incidența crescută a tumorilor mamare atât la cățea cât și la pisică.

Capitolul 1 [anonimizat] a tumorilor glandei mamare, patogeneza tumorizării glandei mamare, simptomatologia tumorilor glandei mamare, diagnosticul tumorilor glandei mamare, profilaxia tumorilor glandei mamare și terapia tumorilor mamare la carnivore.

În ultimi ani tumorile spontane la carnivore au crescut într-un mod vertiginos. Statisticile raportate la 100 000 de cazuri sau la diferite perioade de timp au arătat atât creșterea numerică a cazurilor, cât și diversitatea anatomo-clinică a acestora.

În Capitolul 2 sunt descrise proteinele, heteroproteinele, structura glicoproteidelor, biosinteza glicoproteinelor, procesarea oligozaharidelor n-linkate, proteinele implicate în procesarea n-glicanilor în reticulul endoplasmatic, glicoproteinele melanosomale, clasificarea și descrierea glicoproteinelor după țesuturi și organe, semnificația biologică a glicoproteinelor, lectinele, clasificarea lectinelor, distribuția lectinelor, activități biologice și aplicații clinice ale lectinelor, procesul de translocare, componentele aparatului de translocare.

Glicoproteinele reprezintă o clasă de proteine rezultate prin legarea covalentă la lanțurile polipeptidice a unor fragmente oligozaharidice liniare sau ramificate, de dimensiuni variabile. Conținutul glucidic al glicoproteinelor variază între 1 și 60-80 % din masa moleculei. Determinarea cantitativă și calitativă a glicoproteinelor s-a realizat prin examenul biochimic din serul sanguin precum și din tumorile mamare de la cățea și pisică.

Capitolul 3 prezintă tipurile de examene folosite în cercetarea proprie pentru determinările glicoproteinelor din tumori și sânge, realizate la Clinica de Patologie Obstetricală, Catedrele de Anatomie Patologică și Biochimie Medical-Veterinară din Cadrul Facultății de Medicină Veterinară – București, și anume: examenul clinic, examenul radiologic, examenul ecografic, examenul histopatologic, examenul biochimic.

Cercetările au fost efectuate în perioada 05.01.2010 – 28.11.2012 pe un număr de 376 de animale din care 220 de cățele și 156 de pisici, de rase diferite, care au prezentat tumori mamare.

În Capitolul 4 este descris studiul epidemiologic al oncopatiilor. Studiul epidemiologic al oncopatiilor, oricare ar fi natura lor, ne orientează spre stabilirea rolului unor factori cancerigeni și cocancerigeni. Lipsa unor Centre de dioagnostic și a Registrelor unice de evidență, comparabile cu cele din institutele umane, nu permite studii zonale comparative și o analiză geografică a cazuisticii.

Cercetările efectuate au avut ca obiective stabilirea unui diagnostic rapid și exact al felului tumorii, în funcție de specie, rasă, vârstă, regiune anatomică la cățele și pisici castrate și necastrate. Din totalul de 220 de cățele, 88 cățele au fost cățele castrate, reprezentând 40 %, iar 132 cățele au fost cățele necastrate, reprezentând 60 %. Din totalul de 156 de pisici, 89 pisici au fost pisici castrate, reprezentând 57,05 %, iar 67 pisici au fost pisici necastrate, reprezentând 42,95 %.

Capitolul 5 prezintă examenul histopatologic ce constituie diagnosticul de certitudine al tumorilor mamare la cățele și pisici. Diagnosticul histopatologic este ierarhizat în funcție de etapa diagnosticului și anume: examenul citologic de puncție; examenul citologic al frotiului provenit din raclajul unei formațiuni abcedate; examenul histopatologic extemporaneu; examenul histopatologic al piesei de exereză, care este suveran și categoric în stabilirea diagnosticului definitiv.

Preparatele histopatologice pregătite au fost examinate cu ajutorul microscopului prevăzut cu cameră foto prin examinarea unor fragmente de tumori prelevate de la un eșantion reprezentativ de femele cu modificări macroscopice caracteristice, fiind reproduse imagini reprezentative ale tipurilor de tumori diagnosticate la cățea și pisică în perioada stagiului doctoral.

În Capitolul 6 sunt prezentate investigațiile realizate utilizând plasma sangvină obținută prin centrifugarea sângelui recoltat de la cățele și pisici cu tumori mamare, la care s-a realizat și examenul histopatologic. Sângele a fost recoltat în eprubete cu anticoagulant și centrifugat, separând supernatantul de depozit. O parte dintre determinările efectuate, au fost realizate pe analizorul automat de chimie uscată VetTest produs de IDEXX Laboratoires, aflat în dotarea laboratorului de Biochimie a Facultății de Medicină Veterinară București.

Examenul biochimic s-a realizat prin determinarea cantitativă și calitativă a glicoproteinelor din serul sanguin, precum și din tumorile mamare de la 8 cățele și 2 pisici, eșantion reprezentativ pe care s-a realizat și examenul histopatologic.

Rezultatele obținute sugerează faptul că glicoproteinele plasmatice investigate atât cantitativ cât și electroforetic, pot constitui markeri serici care să orienteze clinicianul către investigarea unei anumite maladii. Totuși înainte de a se introduce aceste analize în practica curentă, este necesară investigarea unui număr mult mai mare de cazuri.

În Capitolul Concluzii sunt prezentate concluziile finale obținute în urma cercetărilor proprii:

Numărul de cazuri cu tumori unice este la cățelele castrate de 42 cazuri – 47,73% din totalul de 88 cazuri, iar la cele necastrate de 55 cazuri – 41,67% din totalul de 132, ceea ce ne arată că există diferențe semnificative din punct de vedere al situației reproductive (starea fiziologică a glandei mamare). Numărul de cazuri cu tumori unice este la pisici castrate de 40 cazuri – 44,95% din totalul de 89 cazuri, iar la cele necastrate de 29 cazuri – 43,28% din totalul de 67, ceea ce ne arată că nu există diferențe semnificative din punct de vedere al situației reproductive.

În ceea ce privește tunorile multiple, avem 19 cazuri – 21,59% din totalul de 88 cazuri la cățelele castrate, iar la cele necastrate de 37 cazuri – 28,03% din totalul de 132, ceea ce ne arată că există diferențe semnificative din punct de vedere al situației reproductive. Numărul de cazuri cu tumori multiple la pisicile castrate este de 22 cazuri – 24,72% din totalul de 89 cazuri, iar la cele necastrate de 21 cazuri – 31,34% din totalul de 67, ceea ce ne arată că există diferențe semnificative din punct de vedere al situației reproductive.

Tumora unică și primară, l-a întâlnit la 19 cazuri – 21,59% din totalul de 88 cazuri la cățelele castrate, iar la cele necastrate de 25 cazuri – 18,94% din totalul de 132, ceea ce ne arată că există diferențe semnificative din punct de vedere al situației reproductive. Tumora unică și primară s-a întâlnit la pisicile castrate la 14 cazuri – 15,73% din totalul de 89 cazuri, iar la cele necastrate de 8 cazuri – 11,94% din totalul de 67, ceea ce ne arată că există diferențe semnificative din punct de vedere al situației reproductive.

Ca localizare la nivelul mamelei s-a constatat că la cățelele castrate cel mai mare număr de cazuri este la M5, 22 cazuri – 27,27%, iar la cele necastrate, tot la M5, 24 cazuri – 18,18%, ceea ce arată că există diferențe semnificative la cele două categorii de femele. La nivelul mamelei M5, avem 5 cazuri – 5,62% la pisicile castrate, iar la pisicile necastrate 3 cazuri – 4,48%, ceea ce ne arată că există diferențe nesemnificative.

Localiazarea tumorii la mamela M4 – vecină cu M5 s-a întâlnit la 12 cazuri – 13,64% în cazul cățelelor castrate și la 18 cazuri – 13,64% în cazul cățelelor necastrate, ceea ce ne face să ne gândim că procesul tumoral se extinde prin contiguitate de la țesutul bolnav la cel sănătos imediat învecinat.

O diferență semnificativă s-a constatat la localizarea M4-M5, astfel că dacă la cele castrate este doar un caz – 1,14% din cele 88, la cățelele necastrate din 132 cazuri, există 12 cazuri – 9,09%, ceea ce ne arată că procesul tumoral se extinde mai ușor la mamelele vecine ale femelelor necastrate. La pisici nu există diferențe mari la localizarea M4-M5 între cele două categorii, din totalul de 89 pisici castrate, 2 cazuri – 2,25%, iar din totalul de 67 pisici necstrate, 2 cazuri – 2,99%.

Localizarea tumorii la M1-M5 s-a întâlnit numai la cățelele necastrate, 11 cazuri – 8,33%.

Frecvența cea mai mare a tumorilor mamare la cățele apare la tranșa de vârstă 10 – 12 ani la cele castrate, 36 cazuri – 40,91%, iar la cele necastrate 42 cazuri – 31,82%. Frecvența cea mai mare a tumorilor mamare la pisici apare la aceeași tranșă de vârstă, 10 – 12 ani, la cele castrate, 21 cazuri – 23,60%, iar la cele necastrate 28 cazuri – 41,79%.

La vârsta de 2 ani, frecvența tumorilor mamare, atât la cățele cât și la pisici este cea mai mică, 1 caz – 1,14% la cățelele castrate și nici un caz la cele necastrate, iar la pisici 1 caz – 1,12% la pisicile castrate și 2 cazuri – 2,99% la cele necastrate.

În funcție de rasă, cel mai mare număr de tumori mamare s-a întâlnit la Metis cu 48 cazuri – 21,82%, Cocker cu 36 cazuri – 16,36%, urmată de Caniche cu 27 cazuri – 12,27%. La pisică, cel mai mare număr de tumori mamare s-a întâlnit la rasele europene, 108 cazuri (69,23%), urmat de rasa Birmaneză, 35 cazuri (22,44%).

Carcinomul mamar de tipul tubulo-papilar, la cățea s-a caracterizat histologic, prin prezența unui pleomorfism celular și nuclear moderat. Celulele epiteliale tumorale sunt dispuse pe tije fine fibro-vasculare, ce proemină sub forma unor papile în lumenul tubular. Acesta a fost întâlnit în procent de 6,06% la cățele necastrate, de 4,54% la cățele castrate. La pisică acest tip de carcinom a prezentat următoarele caracteristici histologice: celulele epiteliale sunt dispuse intraluminal, sub forma unor proliferari papilare, ce delimitează central o zonă anhistă cu detritus celular. Acesta a fost întâlnit în procent de 8,95% la pisicile necastrate, de 11, 23% la pisicile castrate.

Carcinom mamar, tipul cribriform, la cățea s-a caracterizat histologic, prin prezența de celule epiteliale maligne, dispuse în structuri tubulo-papilare ce formează frecvent lumene secundare cu aspectul "ochiurilor de sită". Aceste structuri delimitează central o zonă anhistă de necroză, slab-bazofilă, formată din celule inflamatorii, celule epiteliale degenerate și detritus celular. Stroma vasculo-conjunctiva moderat reprezentata. Acesta a fost întâlnit în procent de 3,03% la cățele necastrate, de 2,27% la cățele castrate. La pisică acest tip de carcinom a prezentat următoarele caracteristici histologice: celule de tip epitelial, asezate sub formӑ tubularӑ și acinarӑ, dilatate, in care se proiectează papile mici, formate din celule epiteliale cilindrice/columnare, cu nucleu rotund-ovalar, perpendicular pe membrana bazala, hipercrom, citoplasma slab eozinofila, in cantitate mica. Acesta a fost întâlnit în procent de 2,27% la pisicile necastrate, de 4,54% la pisicile castrate.

Carcinomul mamar de tip lobular, la cățea s-a caracterizat histologic, prin hiperplazie lobulară mamară (adenoză), fără elemente de malignitate; hiperplazie lobulară mamară cu slabă activitate secretorie, ectazie ductala cu produs proteic palid-bazofil, omogen și celule epiteliale degenerate intraluminal; hiperplazie lobulară mamară. Acesta a fost întâlnit în procent de 1,51% la cățele necastrate, de 2,27% la cățele castrate. La pisică acest tip de carcinom a prezentat următoarele caracteristici histologice: celulele epiteliale proliferate, așezate într-un singur strat pe o tijă fină vasculo-conjunctivă ce proemină intraluminal sub forma unor papile. Stroma bine reprezentată, frecvente vase sangvine ectaziate. Acesta a fost întâlnit în procent de 1,49% la pisicile necastrate, de 1,12% la pisicile castrate.

Carcinomul mamar de tip mixt, la cățea s-a caracterizat histologic, prin celule epiteliale tumorale, dispuse sub forma unor structuri tubulare, nucleu de proliferare a celulelor mioepiteliale, cu pleomorfism minim, întâlnit în procent de 1,51% doar la cățelele necastrate.

Carcinomul mamar la cățea s-a caracterizat histologic, prin multiple structuri papilare formate din celule epiteliale maligne dispuse pe o tijă conjunctiva fina ce proemina intraluminal; celule epiteliale maligne cu tendință de invazie stromală. Celulele tumorale prezintă anizocitoză și anizocarioză evidente, nucleoli proeminenți, rare mitoze atipice. Acesta a fost întâlnit în procent de 0,76% la cățele necastrate, de 2,27% la cățele castrate. La pisică a fost întâlnit în procent de 10,12% la pisicile necastrate și de 7,46% la pisicile castrate.

Osteosarcomul mamar la cățea s-a caracterizat histologic, prin nuclee de țesut osos, osteoblaste cu anizocitoză moderată; țesut glandular transformat chistic; teritoriu de țesut osos din structura tumorii, lacune osoase cu măduvă hematoformatoare; prezența megacariocitelor. Acesta a fost întâlnit în procent de 0,76% doar la cățele necastrate.

Carcinomul mamar la cățea s-a caracterizat histologic, prin proliferare tumorală malignă alcӑtuitӑ din celule de tip epitelial asezate sub formӑ tubularӑ, focal lumenul fiind obturat în totalitate, datoritӑ proliferӑrii excesive a celulelor epiteliale, care depășesc membarana bazală. Acesta a fost întâlnit în procent de 8,34% la cățele necastrate, de 6,82% la cățele castrate. La pisică a fost întâlnit în procent de 11,94% la pisicile necastrate și de 17,99% la pisicile castrate.

Adenocarcinomul mamar, la cățea a fost întâlnit în procent de 4,45% la cățele necastrate și în procent de 2,27% la cățele castrate. La pisică a fost întâlnit în procent de 1,49% la pisicile necastrate și de 1,12% la pisicile castrate. De asemenea la cățelele necastrate, adenocarcinomul de diferite tipuri a fost întâlnit doar la cățele necastrate, în procent de 3,03%, iar la pisicile necastrate a fost întâlnit în procent de 5,97% și la pisicile castrate în procent de 13,48%.

Adenoza de diferite tipuri a fost întâlnit în procent de 9,85% la cățele necastrate și în procent de 17,04% la cățele castrate, iar la pisicile necastrate a fost întâlnit în procent de 11,94% și la pisicile castrate în procent de 11,24%.

Carcinomul complex a fost întâlnit în procent de 23,48% la cățele necastrate și în procent de 27,27% la cățele castrate. La pisică a fost întâlnit în procent de 1,49% la pisicile necastrate și de 1,12% la pisicile castrate.

Carcinoamele de diferite tipuri a fost întâlnit în procent de 8,34% la cățele necastrate și în procent de 10,22% la cățele castrate, iar la pisicile necastrate a fost întâlnit în procent de 11,94% și la pisicile castrate în procent de 12,36%.

Carcinom/adenocarcinomul mamar a fost întâlnit în procent de 6,06% la cățele necastrate și în procent de 1,14% la cățele castrate, iar la pisicile necastrate a fost întâlnit în procent de 5,97% și la pisicile castrate în procent de 3,38%.

23). Mastoza fibro-chistică, hiperplazia ductală, ectazia ductală a fost întâlnit în procent de 11,36% la cățele necastrate și în procent de 9,09% la cățele castrate, iar la pisicile necastrate a fost întâlnit în procent de 2,99% și la pisicile castrate în procent de 4,50%.

Concentrația proteinelor în extractele tumorale a variat în funcție de tipul tumoral, obținându-se valori de la 1,07 mg/ml la 9,59 mg/ml.

Concentrația glicoproteinelor raportate la hexoze și pentoze a variat în cele 10 tipuri de tumori, astfel: de la 41 mg/ml la 650 mg/ml în cazul hexozelor și de la 9 mg/ml la 643 mg/ml pentru pentoze.

Concentrația proteinelor plasmatice a variat de la 4,74 g/dl la 5,06 g/dl la cățele și de la 4,87 g/dl la 5,06 g/dl la pisici, încadrându-se în limitele normale speciei.

Concentrația glicoproteinelor plasmatice a variat de la 1,4 mg/dl (0,14 g/dl) la 2,4 mg/dl (0,24 g/dl) la cățele și de la 1,6 mg/dl (0,16 g/dl) la 2,1 mg/dl (0,21 g/dl) la pisici.

Gradul de glicozilare a proteinelor plasmatice a variat de la 2,9 la 5% la cățele și de la 3,3 la 4,1% la pisici.

Constantele serice analizate (creatinina, ureea, fosfataza alcalină, glicemia și GPT), s-au încadrat în limitele normale speciei.

Distribuția electroforetică a glicoproteinelor este diferită în funcție de specie, tipul de tumoră, uneori diferențiindu-se și în cadrul aceluiași tip de tumoră.

Rezultatele obținute sugerează faptul că glicoproteinele plasmatice investigate atât cantitativ cât și electroforetic, pot constitui markeri serici care să orienteze clinicianul către investigarea unei anumite maladii. Totuși înainte de a se introduce aceste analize în practica curentă, este necesară investigarea unui număr mult mai mare de cazuri.

Semnificația clinică și rolul glicoproteinelor în malignizarea tumorilor mamare la cățele și pisici

SUMMARY

Cuvinte cheie: cățele, pisici, oncopatii, tumoră, glicoproteine, lectine

Teza de doctorat intitulată „Semnificația clinică și rolul glicoproteinelor în malignizarea tumorilor mamare la cățele și pisici” este structurată în 6 capitole sistematizate în două părți: Studiu bibliografic și Cercetări proprii.

Prima parte a lucrării este compusă din 2 capitole: Capitolul 1 – Tumorile glandei mamare la cățea și pisică; Capitolul II – Elemente ce caracterizează glicoproteinele.

Partea a doua cuprinde 4 capitole structurate astfel: Capitolul III – Scopul lucrării, materialul biologic studiat, metoda de lucru folosită; Capitolul IV – Studiul epidemiologic al tumorilor; Capitolul V – Examenul histopatologic; Capitolul VI – Examenul biochimic.

Lucrarea începe cu Introducerea în care se prezintă după o consultare bibliografică importanța studiului comparativ al glicoproteinelor din serul sanguin și tesuturile tumorale în raport cu martorii prin investigarea componentei glucidice, a glicoproteinelor solubile extrase din tumori mamare de la cățea și pisică.

Câinele și pisica reprezintă o părticică din biosferă, fiind specii reprezenative din categoria animalelor de companie. Statisticile actuale arată că femelele sunt mult mai preferate decât masculii, deoarece sunt mai drăgălașe, mai docile, dar ajută și la perpetuarea speciei. Femelele acestor specii sunt predispuse, chiar dacă li se acordă o atenție deosebită, la îmbolnăviri cu etiologie și epizootologie diversificată.

Studiile de specialitate scot în evidență incidența crescută a tumorilor mamare atât la cățea cât și la pisică.

Capitolul 1 cuprinde studii bibliografice privind etiologia tumorilor mamare, clasificarea histopatologică a tumorilor glandei mamare, patogeneza tumorizării glandei mamare, simptomatologia tumorilor glandei mamare, diagnosticul tumorilor glandei mamare, profilaxia tumorilor glandei mamare, terapia tumorilor mamare la carnivore.

În ultimi ani tumorile spontane la carnivore au crescut într-un mod vertiginos. Statisticile raportate la 100 000 de cazuri sau la diferite perioade de timp au arătat atât creșterea numerică a cazurilor, cât și diversitatea anatomo-clinică a acestora.

În Capitolul 2 sunt descrise proteinele, heteroproteinele, structura glicoproteidelor, biosinteza glicoproteinelor, procesarea oligozaharidelor n-linkate, proteinele implicate în procesarea n-glicanilor în reticulul endoplasmatic, glicoproteinele melanosomale, clasificarea și descrierea glicoproteinelor după țesuturi și organe, semnificația biologică a glicoproteinelor, lectinele, clasificarea lectinelor, distribuția lectinelor, activități biologice și aplicații clinice ale lectinelor, procesul de translocare, componentele aparatului de translocare.

Glicoproteinele reprezintă o clasă de proteine rezultate prin legarea covalentă la lanțurile polipeptidice a unor fragmente oligozaharidice liniare sau ramificate, de dimensiuni variabile. Conținutul glucidic al glicoproteinelor variază între 1 și 60-80 % din masa moleculei. Determinarea cantitativă și calitativă a glicoproteinelor s-a realizat prin examenul biochimic din serul sanguin precum și din tumorile mamare de la cățea și pisică.

Capitolul 3 prezintă tipurile de examene folosite în cercetarea proprie pentru determinârile glicoproteinelor din tumori și sânge, realizate la Clinica de Patologie Obstretricală, Catedrele de Anatomie Patologică și Biochimie Medical-Veterinară din Cadrul Facultății de Medicină Veterinară – București, și anume: examenul clinic, examenul radiologic, examenul ecografic, examenul histopatologic, examenul biochimic.

Cercetările au fost efectuate în perioada 05.01.2010 – 28.11.2012 pe un număr de 376 de animale din care 220 de cățele și 156 de pisici, de rase diferite, care au prezentat tumori mamare.

În Capitolul 4 este descris studiul epidemiologic al oncopatiilor. Studiul epidemiologic al oncopatiilor, oricare ar fi natura lor, ne orientează spre stabilirea rolului unor factori cancerigeni și cocancerigeni. Lipsa unor Centre de dioagnostic și a Registrelor unice de evidență, comparabile cu cele din institutele umane, nu permite studii zonale comparative și o analiză geografică a cazuisticii.

Cercetările efectuate au avut ca obiective stabilirea unui diagnostic rapid și exact al felului tumorii, în funcție de specie, rasă, vârstă, regiune anatomică la cățele și pisici castrate și necastrate. Din totalul de 220 de cățele, 88 cățele au fost cățele castrate, reprezentând 40 %, iar 132 cățele au fost cățele necastrate, reprezentând 60 %. Din totalul de 156 de pisici, 89 pisici au fost pisici castrate, reprezentând 57,05 %, iar 67 pisici au fost pisici necastrate, reprezentând 42,95 %.

Capitolul 5 prezintă examenul histopatologic ce constituie diagnosticul de certitudine al tumorilor mamare la cățele și pisici. Diagnosticul histopatologic este ierarhizat în funcție de etapa diagnosticului și anume: examenul citologic de puncție; examenul citologic al frotiului provenit din raclajul unei formațiuni abcedate; examenul histopatologic extemporaneu; examenul histopatologic al piesei de exereză, care este suveran și categoric în stabilirea diagnosticului definitiv.

Preparatele histopatologice pregătite au fost examinate cu ajutorul microscopului prevăzut cu cameră foto prin examinarea unor fragmente de tumori prelevate de la un eșantion reprezentativ de femele cu modificări macroscopice caracteristice, fiind reproduse imagini reprezentative ale tipurilor de tumori diagnosticate la cățea și pisică în perioada stagiului doctoral.

În Capitolul 6 sunt prezentate investigațiile realizate utilizând plasma sangvină obținută prin centrifugarea sângelui recoltat de la cățele și pisici cu tumori mamare, la care s-a realizat și examenul histopotologic. Sângele a fost recoltat în eprubete cu anticoagulant și centrifugat, separând supernatantul de depozit. O parte dintre determinările efectuate, au fost realizate pe analizorul automat de chimie uscată VetTest produs de IDEXX Laboratoires, aflat în dotarea laboratorului de Biochimie a Facultății de Medicină Veterinară București.

Examenul biochimic s-a realizat prin determinarea cantitativă și calitativă a glicoproteinelor din serul sanguin, precum și din tumorile mamare de la 8 cățele și 2 pisici, eșantion reprezentativ pe care s-a realizat și examenul histopatologic.

Rezultatele obținute sugerează faptul că glicoproteinele plasmatice investigate atât cantitativ cât și electroforetic, pot constitui markeri serici care să orienteze clinicianul către investigarea unei anumite maladii. Totuși înainte de a se introduce aceste analize în practica curentă, este necesară investigarea unui număr mult mai mare de cazuri.

În Capitolul Concluzii sunt prezentate concluziile finale obținute în urma cercetărilor proprii:

Numărul de cazuri cu tumori unice este la cățelele castrate de 42 cazuri – 47,73% din totalul de 88 cazuri, iar la cele necastrate de 55 cazuri – 41,67% din totalul de 132, ceea ce ne arată că există diferențe semnificative din punct de vedere al situației reproductive (starea fiziologică a glandei mamare). Numărul de cazuri cu tumori unice este la pisici castrate de 40 cazuri – 44,95% din totalul de 89 cazuri, iar la cele necastrate de 29 cazuri – 43,28% din totalul de 67, ceea ce ne arată că nu există diferențe semnificative din punct de vedere al situației reproductive.

În ceea ce privește tunorile multiple, avem 19 cazuri – 21,59% din totalul de 88 cazuri la cățelele castrate, iar la cele necastrate de 37 cazuri – 28,03% din totalul de 132, ceea ce ne arată că există diferențe semnificative din punct de vedere al situației reproductive. Numărul de cazuri cu tumori multiple la pisicile castrate este de 22 cazuri – 24,72% din totalul de 89 cazuri, iar la cele necastrate de 21 cazuri – 31,34% din totalul de 67, ceea ce ne arată că există diferențe semnificative din punct de vedere al situației reproductive.

Tumora unică și primară, l-a întâlnit la 19 cazuri – 21,59% din totalul de 88 cazuri la cățelele castrate, iar la cele necastrate de 25 cazuri – 18,94% din totalul de 132, ceea ce ne arată că există diferențe semnificative din punct de vedere al situației reproductive. Tumora unică și primară s-a întâlnit la pisicile castrate la 14 cazuri – 15,73% din totalul de 89 cazuri, iar la cele necastrate de 8 cazuri – 11,94% din totalul de 67, ceea ce ne arată că există diferențe semnificative din punct de vedere al situației reproductive.

Ca localizare la nivelul mamelei s-a constatat că la cățelele castrate cel mai mare număr de cazuri este la M5, 22 cazuri – 27,27%, iar la cele necastrate, tot la M5, 24 cazuri – 18,18%, ceea ce arată că există diferențe semnificative la cele două categorii de femele. La nivelul mamelei M5, avem 5 cazuri – 5,62% la pisicile castrate, iar la pisicile necastrate 3 cazuri – 4,48%, ceea ce ne arată că există diferențe nesemnificative.

Localiazarea tumorii la mamela M4 – vecină cu M5 s-a întâlnit la 12 cazuri – 13,64% în cazul cățelelor castrate și la 18 cazuri – 13,64% în cazul cățelelor necastrate, ceea ce ne face să ne gândim că procesul tumoral se extinde prin contiguitate de la țesutul bolnav la cel sănătos imediat învecinat.

O diferență semnificativă s-a constatat la localizarea M4-M5, astfel că dacă la cele castrate este doar un caz – 1,14% din cele 88, la cățelele necastrate din 132 cazuri, există 12 cazuri – 9,09%, ceea ce ne arată că procesul tumoral se extinde mai ușor la mamelele vecine ale femelelor necastrate. La pisici nu există diferențe mari la localizarea M4-M5 între cele două categorii, din totalul de 89 pisici castrate, 2 cazuri – 2,25%, iar din totalul de 67 pisici necstrate, 2 cazuri – 2,99%.

Localizarea tumorii la M1-M5 s-a întâlnit numai la cățelele necastrate, 11 cazuri – 8,33%.

Frecvența cea mai mare a tumorilor mamare la cățele apare la tranșa de vârstă 10 – 12 ani la cele castrate, 36 cazuri – 40,91%, iar la cele necastrate 42 cazuri – 31,82%. Frecvența cea mai mare a tumorilor mamare la pisici apare la aceeași tranșă de vârstă, 10 – 12 ani, la cele castrate, 21 cazuri – 23,60%, iar la cele necastrate 28 cazuri – 41,79%.

La vârsta de 2 ani, frecvența tumorilor mamare, atât la cățele cât și la pisici este cea mai mică, 1 caz – 1,14% la cățelele castrate și nici un caz la cele necastrate, iar la pisici 1 caz – 1,12% la pisicile castrate și 2 cazuri – 2,99% la cele necastrate.

În funcție de rasă, cel mai mare număr de tumori mamare s-a întâlnit la Metis cu 48 cazuri – 21,82%, Cocker cu 36 cazuri – 16,36%, urmată de Caniche cu 27 cazuri – 12,27%. La pisică, cel mai mare număr de tumori mamare s-a întâlnit la rasele europene, 108 cazuri (69,23%), urmat de rasa Birmaneză, 35 cazuri (22,44%).

Carcinomul mamar de tipul tubulo-papilar, la cățea s-a caracterizat histologic, prin prezența unui pleomorfism celular și nuclear moderat. Celulele epiteliale tumorale sunt dispuse pe tije fine fibro-vasculare, ce proemină sub forma unor papile în lumenul tubular. Acesta a fost întâlnit în procent de 6,06% la cățele necastrate, de 4,54% la cățele castrate. La pisică acest tip de carcinom a prezentat următoarele caracteristici histologice: celulele epiteliale sunt dispuse intraluminal, sub forma unor proliferari papilare, ce delimitează central o zonă anhistă cu detritus celular. Acesta a fost întâlnit în procent de 8,95% la pisicile necastrate, de 11, 23% la pisicile castrate.

Carcinom mamar, tipul cribriform, la cățea s-a caracterizat histologic, prin prezența de celule epiteliale maligne, dispuse în structuri tubulo-papilare ce formează frecvent lumene secundare cu aspectul "ochiurilor de sită". Aceste structuri delimitează central o zonă anhistă de necroză, slab-bazofilă, formată din celule inflamatorii, celule epiteliale degenerate și detritus celular. Stroma vasculo-conjunctiva moderat reprezentata. Acesta a fost întâlnit în procent de 3,03% la cățele necastrate, de 2,27% la cățele castrate. La pisică acest tip de carcinom a prezentat următoarele caracteristici histologice: celule de tip epitelial, asezate sub formӑ tubularӑ și acinarӑ, dilatate, in care se proiectează papile mici, formate din celule epiteliale cilindrice/columnare, cu nucleu rotund-ovalar, perpendicular pe membrana bazala, hipercrom, citoplasma slab eozinofila, in cantitate mica. Acesta a fost întâlnit în procent de 2,27% la pisicile necastrate, de 4,54% la pisicile castrate.

Carcinomul mamar de tip lobular, la cățea s-a caracterizat histologic, prin hiperplazie lobulară mamară (adenoză), fără elemente de malignitate; hiperplazie lobulară mamară cu slabă activitate secretorie, ectazie ductala cu produs proteic palid-bazofil, omogen și celule epiteliale degenerate intraluminal; hiperplazie lobulară mamară. Acesta a fost întâlnit în procent de 1,51% la cățele necastrate, de 2,27% la cățele castrate. La pisică acest tip de carcinom a prezentat următoarele caracteristici histologice: celulele epiteliale proliferate, așezate într-un singur strat pe o tijă fină vasculo-conjunctivă ce proemină intraluminal sub forma unor papile. Stroma bine reprezentată, frecvente vase sangvine ectaziate. Acesta a fost întâlnit în procent de 1,49% la pisicile necastrate, de 1,12% la pisicile castrate.

Carcinomul mamar de tip mixt, la cățea s-a caracterizat histologic, prin celule epiteliale tumorale, dispuse sub forma unor structuri tubulare, nucleu de proliferare a celulelor mioepiteliale, cu pleomorfism minim, întâlnit în procent de 1,51% doar la cățelele necastrate.

Carcinomul mamar la cățea s-a caracterizat histologic, prin multiple structuri papilare formate din celule epiteliale maligne dispuse pe o tijă conjunctiva fina ce proemina intraluminal; celule epiteliale maligne cu tendință de invazie stromală. Celulele tumorale prezintă anizocitoză și anizocarioză evidente, nucleoli proeminenți, rare mitoze atipice. Acesta a fost întâlnit în procent de 0,76% la cățele necastrate, de 2,27% la cățele castrate. La pisică a fost întâlnit în procent de 10,12% la pisicile necastrate și de 7,46% la pisicile castrate.

Osteosarcomul mamar la cățea s-a caracterizat histologic, prin nuclee de țesut osos, osteoblaste cu anizocitoză moderată; țesut glandular transformat chistic; teritoriu de țesut osos din structura tumorii, lacune osoase cu măduvă hematoformatoare; prezența megacariocitelor. Acesta a fost întâlnit în procent de 0,76% doar la cățele necastrate.

Carcinomul mamar la cățea s-a caracterizat histologic, prin proliferare tumorală malignă alcӑtuitӑ din celule de tip epitelial asezate sub formӑ tubularӑ, focal lumenul fiind obturat în totalitate, datoritӑ proliferӑrii excesive a celulelor epiteliale, care depășesc membarana bazală. Acesta a fost întâlnit în procent de 8,34% la cățele necastrate, de 6,82% la cățele castrate. La pisică a fost întâlnit în procent de 11,94% la pisicile necastrate și de 17,99% la pisicile castrate.

Adenocarcinomul mamar, la cățea a fost întâlnit în procent de 4,45% la cățele necastrate și în procent de 2,27% la cățele castrate. La pisică a fost întâlnit în procent de 1,49% la pisicile necastrate și de 1,12% la pisicile castrate. De asemenea la cățelele necastrate, adenocarcinomul de diferite tipuri a fost întâlnit doar la cățele necastrate, în procent de 3,03%, iar la pisicile necastrate a fost întâlnit în procent de 5,97% și la pisicile castrate în procent de 13,48%.

Adenoza de diferite tipuri a fost întâlnit în procent de 9,85% la cățele necastrate și în procent de 17,04% la cățele castrate, iar la pisicile necastrate a fost întâlnit în procent de 11,94% și la pisicile castrate în procent de 11,24%.

Carcinomul complex a fost întâlnit în procent de 23,48% la cățele necastrate și în procent de 27,27% la cățele castrate. La pisică a fost întâlnit în procent de 1,49% la pisicile necastrate și de 1,12% la pisicile castrate.

Carcinoamele de diferite tipuri a fost întâlnit în procent de 8,34% la cățele necastrate și în procent de 10,22% la cățele castrate, iar la pisicile necastrate a fost întâlnit în procent de 11,94% și la pisicile castrate în procent de 12,36%.

Carcinom/adenocarcinomul mamar a fost întâlnit în procent de 6,06% la cățele necastrate și în procent de 1,14% la cățele castrate, iar la pisicile necastrate a fost întâlnit în procent de 5,97% și la pisicile castrate în procent de 3,38%.

23). Mastoza fibro-chistică, hiperplazia ductală, ectazia ductală a fost întâlnit în procent de 11,36% la cățele necastrate și în procent de 9,09% la cățele castrate, iar la pisicile necastrate a fost întâlnit în procent de 2,99% și la pisicile castrate în procent de 4,50%.

Concentrația proteinelor în extractele tumorale a variat în funcție de tipul tumoral, obținându-se valori de la 1,07 mg/ml la 9,59 mg/ml.

Concentrația glicoproteinelor raportate la hexoze și pentoze a variat în cele 10 tipuri de tumori, astfel: de la 41 mg/ml la 650 mg/ml în cazul hexozelor și de la 9 mg/ml la 643 mg/ml pentru pentoze.

Concentrația proteinelor plasmatice a variat de la 4,74 g/dl la 5,06 g/dl la cățele și de la 4,87 g/dl la 5,06 g/dl la pisici, încadrându-se în limitele normale speciei.

Concentrația glicoproteinelor plasmatice a variat de la 1,4 mg/dl (0,14 g/dl) la 2,4 mg/dl (0,24 g/dl) la cățele și de la 1,6 mg/dl (0,16 g/dl) la 2,1 mg/dl (0,21 g/dl) la pisici.

Gradul de glicozilare a proteinelor plasmatice a variat de la 2,9 la 5% la cățele și de la 3,3 la 4,1% la pisici.

Constantele serice analizate (creatinina, ureea, fosfataza alcalină, glicemia și GPT), s-au încadrat în limitele normale speciei.

Distribuția electroforetică a glicoproteinelor este diferită în funcție de specie, tipul de tumoră, uneori diferențiindu-se și în cadrul aceluiași tip de tumoră.

Rezultatele obținute sugerează faptul că glicoproteinele plasmatice investigate atât cantitativ cât și electroforetic, pot constitui markeri serici care să orienteze clinicianul către investigarea unei anumite maladii. Totuși înainte de a se introduce aceste analize în practica curentă, este necesară investigarea unui număr mult mai mare de cazuri.

Semnificația clinică și rolul glicoproteinelor în malignizarea tumorilor mamare la cățele și pisici

REZUME

Cuvinte cheie: cățele, pisici, oncopatii, tumoră, glicoproteine, lectine

Teza de doctorat intitulată „Semnificația clinică și rolul glicoproteinelor în malignizarea tumorilor mamare la cățele și pisici” este structurată în 6 capitole sistematizate în două părți: Studiu bibliografic și Cercetări proprii.

Prima parte a lucrării este compusă din 2 capitole: Capitolul 1 – Tumorile glandei mamare la cățea și pisică; Capitolul II – Elemente ce caracterizează glicoproteinele.

Partea a doua cuprinde 4 capitole structurate astfel: Capitolul III – Scopul lucrării, materialul biologic studiat, metoda de lucru folosită; Capitolul IV – Studiul epidemiologic al tumorilor; Capitolul V – Examenul histopatologic; Capitolul VI – Examenul biochimic.

Lucrarea începe cu Introducerea în care se prezintă după o consultare bibliografică importanța studiului comparativ al glicoproteinelor din serul sanguin și tesuturile tumorale în raport cu martorii prin investigarea componentei glucidice, a glicoproteinelor solubile extrase din tumori mamare de la cățea și pisică.

Câinele și pisica reprezintă o părticică din biosferă, fiind specii reprezenative din categoria animalelor de companie. Statisticile actuale arată că femelele sunt mult mai preferate decât masculii, deoarece sunt mai drăgălașe, mai docile, dar ajută și la perpetuarea speciei. Femelele acestor specii sunt predispuse, chiar dacă li se acordă o atenție deosebită, la îmbolnăviri cu etiologie și epizootologie diversificată.

Studiile de specialitate scot în evidență incidența crescută a tumorilor mamare atât la cățea cât și la pisică.

Capitolul 1 cuprinde studii bibliografice privind etiologia tumorilor mamare, clasificarea histopatologică a tumorilor glandei mamare, patogeneza tumorizării glandei mamare, simptomatologia tumorilor glandei mamare, diagnosticul tumorilor glandei mamare, profilaxia tumorilor glandei mamare, terapia tumorilor mamare la carnivore.

În ultimi ani tumorile spontane la carnivore au crescut într-un mod vertiginos. Statisticile raportate la 100 000 de cazuri sau la diferite perioade de timp au arătat atât creșterea numerică a cazurilor, cât și diversitatea anatomo-clinică a acestora.

În Capitolul 2 sunt descrise proteinele, heteroproteinele, structura glicoproteidelor, biosinteza glicoproteinelor, procesarea oligozaharidelor n-linkate, proteinele implicate în procesarea n-glicanilor în reticulul endoplasmatic, glicoproteinele melanosomale, clasificarea și descrierea glicoproteinelor după țesuturi și organe, semnificația biologică a glicoproteinelor, lectinele, clasificarea lectinelor, distribuția lectinelor, activități biologice și aplicații clinice ale lectinelor, procesul de translocare, componentele aparatului de translocare.

Glicoproteinele reprezintă o clasă de proteine rezultate prin legarea covalentă la lanțurile polipeptidice a unor fragmente oligozaharidice liniare sau ramificate, de dimensiuni variabile. Conținutul glucidic al glicoproteinelor variază între 1 și 60-80 % din masa moleculei. Determinarea cantitativă și calitativă a glicoproteinelor s-a realizat prin examenul biochimic din serul sanguin precum și din tumorile mamare de la cățea și pisică.

Capitolul 3 prezintă tipurile de examene folosite în cercetarea proprie pentru determinârile glicoproteinelor din tumori și sânge, realizate la Clinica de Patologie Obstretricală, Catedrele de Anatomie Patologică și Biochimie Medical-Veterinară din Cadrul Facultății de Medicină Veterinară – București, și anume: examenul clinic, examenul radiologic, examenul ecografic, examenul histopatologic, examenul biochimic.

Cercetările au fost efectuate în perioada 05.01.2010 – 28.11.2012 pe un număr de 376 de animale din care 220 de cățele și 156 de pisici, de rase diferite, care au prezentat tumori mamare.

În Capitolul 4 este descris studiul epidemiologic al oncopatiilor. Studiul epidemiologic al oncopatiilor, oricare ar fi natura lor, ne orientează spre stabilirea rolului unor factori cancerigeni și cocancerigeni. Lipsa unor Centre de dioagnostic și a Registrelor unice de evidență, comparabile cu cele din institutele umane, nu permite studii zonale comparative și o analiză geografică a cazuisticii.

Cercetările efectuate au avut ca obiective stabilirea unui diagnostic rapid și exact al felului tumorii, în funcție de specie, rasă, vârstă, regiune anatomică la cățele și pisici castrate și necastrate. Din totalul de 220 de cățele, 88 cățele au fost cățele castrate, reprezentând 40 %, iar 132 cățele au fost cățele necastrate, reprezentând 60 %. Din totalul de 156 de pisici, 89 pisici au fost pisici castrate, reprezentând 57,05 %, iar 67 pisici au fost pisici necastrate, reprezentând 42,95 %.

Capitolul 5 prezintă examenul histopatologic ce constituie diagnosticul de certitudine al tumorilor mamare la cățele și pisici. Diagnosticul histopatologic este ierarhizat în funcție de etapa diagnosticului și anume: examenul citologic de puncție; examenul citologic al frotiului provenit din raclajul unei formațiuni abcedate; examenul histopatologic extemporaneu; examenul histopatologic al piesei de exereză, care este suveran și categoric în stabilirea diagnosticului definitiv.

Preparatele histopatologice pregătite au fost examinate cu ajutorul microscopului prevăzut cu cameră foto prin examinarea unor fragmente de tumori prelevate de la un eșantion reprezentativ de femele cu modificări macroscopice caracteristice, fiind reproduse imagini reprezentative ale tipurilor de tumori diagnosticate la cățea și pisică în perioada stagiului doctoral.

În Capitolul 6 sunt prezentate investigațiile realizate utilizând plasma sangvină obținută prin centrifugarea sângelui recoltat de la cățele și pisici cu tumori mamare, la care s-a realizat și examenul histopotologic. Sângele a fost recoltat în eprubete cu anticoagulant și centrifugat, separând supernatantul de depozit. O parte dintre determinările efectuate, au fost realizate pe analizorul automat de chimie uscată VetTest produs de IDEXX Laboratoires, aflat în dotarea laboratorului de Biochimie a Facultății de Medicină Veterinară București.

Examenul biochimic s-a realizat prin determinarea cantitativă și calitativă a glicoproteinelor din serul sanguin, precum și din tumorile mamare de la 8 cățele și 2 pisici, eșantion reprezentativ pe care s-a realizat și examenul histopatologic.

Rezultatele obținute sugerează faptul că glicoproteinele plasmatice investigate atât cantitativ cât și electroforetic, pot constitui markeri serici care să orienteze clinicianul către investigarea unei anumite maladii. Totuși înainte de a se introduce aceste analize în practica curentă, este necesară investigarea unui număr mult mai mare de cazuri.

În Capitolul Concluzii sunt prezentate concluziile finale obținute în urma cercetărilor proprii:

Numărul de cazuri cu tumori unice este la cățelele castrate de 42 cazuri – 47,73% din totalul de 88 cazuri, iar la cele necastrate de 55 cazuri – 41,67% din totalul de 132, ceea ce ne arată că există diferențe semnificative din punct de vedere al situației reproductive (starea fiziologică a glandei mamare). Numărul de cazuri cu tumori unice este la pisici castrate de 40 cazuri – 44,95% din totalul de 89 cazuri, iar la cele necastrate de 29 cazuri – 43,28% din totalul de 67, ceea ce ne arată că nu există diferențe semnificative din punct de vedere al situației reproductive.

În ceea ce privește tunorile multiple, avem 19 cazuri – 21,59% din totalul de 88 cazuri la cățelele castrate, iar la cele necastrate de 37 cazuri – 28,03% din totalul de 132, ceea ce ne arată că există diferențe semnificative din punct de vedere al situației reproductive. Numărul de cazuri cu tumori multiple la pisicile castrate este de 22 cazuri – 24,72% din totalul de 89 cazuri, iar la cele necastrate de 21 cazuri – 31,34% din totalul de 67, ceea ce ne arată că există diferențe semnificative din punct de vedere al situației reproductive.

Tumora unică și primară, l-a întâlnit la 19 cazuri – 21,59% din totalul de 88 cazuri la cățelele castrate, iar la cele necastrate de 25 cazuri – 18,94% din totalul de 132, ceea ce ne arată că există diferențe semnificative din punct de vedere al situației reproductive. Tumora unică și primară s-a întâlnit la pisicile castrate la 14 cazuri – 15,73% din totalul de 89 cazuri, iar la cele necastrate de 8 cazuri – 11,94% din totalul de 67, ceea ce ne arată că există diferențe semnificative din punct de vedere al situației reproductive.

Ca localizare la nivelul mamelei s-a constatat că la cățelele castrate cel mai mare număr de cazuri este la M5, 22 cazuri – 27,27%, iar la cele necastrate, tot la M5, 24 cazuri – 18,18%, ceea ce arată că există diferențe semnificative la cele două categorii de femele. La nivelul mamelei M5, avem 5 cazuri – 5,62% la pisicile castrate, iar la pisicile necastrate 3 cazuri – 4,48%, ceea ce ne arată că există diferențe nesemnificative.

Localiazarea tumorii la mamela M4 – vecină cu M5 s-a întâlnit la 12 cazuri – 13,64% în cazul cățelelor castrate și la 18 cazuri – 13,64% în cazul cățelelor necastrate, ceea ce ne face să ne gândim că procesul tumoral se extinde prin contiguitate de la țesutul bolnav la cel sănătos imediat învecinat.

O diferență semnificativă s-a constatat la localizarea M4-M5, astfel că dacă la cele castrate este doar un caz – 1,14% din cele 88, la cățelele necastrate din 132 cazuri, există 12 cazuri – 9,09%, ceea ce ne arată că procesul tumoral se extinde mai ușor la mamelele vecine ale femelelor necastrate. La pisici nu există diferențe mari la localizarea M4-M5 între cele două categorii, din totalul de 89 pisici castrate, 2 cazuri – 2,25%, iar din totalul de 67 pisici necstrate, 2 cazuri – 2,99%.

Localizarea tumorii la M1-M5 s-a întâlnit numai la cățelele necastrate, 11 cazuri – 8,33%.

Frecvența cea mai mare a tumorilor mamare la cățele apare la tranșa de vârstă 10 – 12 ani la cele castrate, 36 cazuri – 40,91%, iar la cele necastrate 42 cazuri – 31,82%. Frecvența cea mai mare a tumorilor mamare la pisici apare la aceeași tranșă de vârstă, 10 – 12 ani, la cele castrate, 21 cazuri – 23,60%, iar la cele necastrate 28 cazuri – 41,79%.

La vârsta de 2 ani, frecvența tumorilor mamare, atât la cățele cât și la pisici este cea mai mică, 1 caz – 1,14% la cățelele castrate și nici un caz la cele necastrate, iar la pisici 1 caz – 1,12% la pisicile castrate și 2 cazuri – 2,99% la cele necastrate.

În funcție de rasă, cel mai mare număr de tumori mamare s-a întâlnit la Metis cu 48 cazuri – 21,82%, Cocker cu 36 cazuri – 16,36%, urmată de Caniche cu 27 cazuri – 12,27%. La pisică, cel mai mare număr de tumori mamare s-a întâlnit la rasele europene, 108 cazuri (69,23%), urmat de rasa Birmaneză, 35 cazuri (22,44%).

Carcinomul mamar de tipul tubulo-papilar, la cățea s-a caracterizat histologic, prin prezența unui pleomorfism celular și nuclear moderat. Celulele epiteliale tumorale sunt dispuse pe tije fine fibro-vasculare, ce proemină sub forma unor papile în lumenul tubular. Acesta a fost întâlnit în procent de 6,06% la cățele necastrate, de 4,54% la cățele castrate. La pisică acest tip de carcinom a prezentat următoarele caracteristici histologice: celulele epiteliale sunt dispuse intraluminal, sub forma unor proliferari papilare, ce delimitează central o zonă anhistă cu detritus celular. Acesta a fost întâlnit în procent de 8,95% la pisicile necastrate, de 11, 23% la pisicile castrate.

Carcinom mamar, tipul cribriform, la cățea s-a caracterizat histologic, prin prezența de celule epiteliale maligne, dispuse în structuri tubulo-papilare ce formează frecvent lumene secundare cu aspectul "ochiurilor de sită". Aceste structuri delimitează central o zonă anhistă de necroză, slab-bazofilă, formată din celule inflamatorii, celule epiteliale degenerate și detritus celular. Stroma vasculo-conjunctiva moderat reprezentata. Acesta a fost întâlnit în procent de 3,03% la cățele necastrate, de 2,27% la cățele castrate. La pisică acest tip de carcinom a prezentat următoarele caracteristici histologice: celule de tip epitelial, asezate sub formӑ tubularӑ și acinarӑ, dilatate, in care se proiectează papile mici, formate din celule epiteliale cilindrice/columnare, cu nucleu rotund-ovalar, perpendicular pe membrana bazala, hipercrom, citoplasma slab eozinofila, in cantitate mica. Acesta a fost întâlnit în procent de 2,27% la pisicile necastrate, de 4,54% la pisicile castrate.

Carcinomul mamar de tip lobular, la cățea s-a caracterizat histologic, prin hiperplazie lobulară mamară (adenoză), fără elemente de malignitate; hiperplazie lobulară mamară cu slabă activitate secretorie, ectazie ductala cu produs proteic palid-bazofil, omogen și celule epiteliale degenerate intraluminal; hiperplazie lobulară mamară. Acesta a fost întâlnit în procent de 1,51% la cățele necastrate, de 2,27% la cățele castrate. La pisică acest tip de carcinom a prezentat următoarele caracteristici histologice: celulele epiteliale proliferate, așezate într-un singur strat pe o tijă fină vasculo-conjunctivă ce proemină intraluminal sub forma unor papile. Stroma bine reprezentată, frecvente vase sangvine ectaziate. Acesta a fost întâlnit în procent de 1,49% la pisicile necastrate, de 1,12% la pisicile castrate.

Carcinomul mamar de tip mixt, la cățea s-a caracterizat histologic, prin celule epiteliale tumorale, dispuse sub forma unor structuri tubulare, nucleu de proliferare a celulelor mioepiteliale, cu pleomorfism minim, întâlnit în procent de 1,51% doar la cățelele necastrate.

Carcinomul mamar la cățea s-a caracterizat histologic, prin multiple structuri papilare formate din celule epiteliale maligne dispuse pe o tijă conjunctiva fina ce proemina intraluminal; celule epiteliale maligne cu tendință de invazie stromală. Celulele tumorale prezintă anizocitoză și anizocarioză evidente, nucleoli proeminenți, rare mitoze atipice. Acesta a fost întâlnit în procent de 0,76% la cățele necastrate, de 2,27% la cățele castrate. La pisică a fost întâlnit în procent de 10,12% la pisicile necastrate și de 7,46% la pisicile castrate.

Osteosarcomul mamar la cățea s-a caracterizat histologic, prin nuclee de țesut osos, osteoblaste cu anizocitoză moderată; țesut glandular transformat chistic; teritoriu de țesut osos din structura tumorii, lacune osoase cu măduvă hematoformatoare; prezența megacariocitelor. Acesta a fost întâlnit în procent de 0,76% doar la cățele necastrate.

Carcinomul mamar la cățea s-a caracterizat histologic, prin proliferare tumorală malignă alcӑtuitӑ din celule de tip epitelial asezate sub formӑ tubularӑ, focal lumenul fiind obturat în totalitate, datoritӑ proliferӑrii excesive a celulelor epiteliale, care depășesc membarana bazală. Acesta a fost întâlnit în procent de 8,34% la cățele necastrate, de 6,82% la cățele castrate. La pisică a fost întâlnit în procent de 11,94% la pisicile necastrate și de 17,99% la pisicile castrate.

Adenocarcinomul mamar, la cățea a fost întâlnit în procent de 4,45% la cățele necastrate și în procent de 2,27% la cățele castrate. La pisică a fost întâlnit în procent de 1,49% la pisicile necastrate și de 1,12% la pisicile castrate. De asemenea la cățelele necastrate, adenocarcinomul de diferite tipuri a fost întâlnit doar la cățele necastrate, în procent de 3,03%, iar la pisicile necastrate a fost întâlnit în procent de 5,97% și la pisicile castrate în procent de 13,48%.

Adenoza de diferite tipuri a fost întâlnit în procent de 9,85% la cățele necastrate și în procent de 17,04% la cățele castrate, iar la pisicile necastrate a fost întâlnit în procent de 11,94% și la pisicile castrate în procent de 11,24%.

Carcinomul complex a fost întâlnit în procent de 23,48% la cățele necastrate și în procent de 27,27% la cățele castrate. La pisică a fost întâlnit în procent de 1,49% la pisicile necastrate și de 1,12% la pisicile castrate.

Carcinoamele de diferite tipuri a fost întâlnit în procent de 8,34% la cățele necastrate și în procent de 10,22% la cățele castrate, iar la pisicile necastrate a fost întâlnit în procent de 11,94% și la pisicile castrate în procent de 12,36%.

Carcinom/adenocarcinomul mamar a fost întâlnit în procent de 6,06% la cățele necastrate și în procent de 1,14% la cățele castrate, iar la pisicile necastrate a fost întâlnit în procent de 5,97% și la pisicile castrate în procent de 3,38%.

23). Mastoza fibro-chistică, hiperplazia ductală, ectazia ductală a fost întâlnit în procent de 11,36% la cățele necastrate și în procent de 9,09% la cățele castrate, iar la pisicile necastrate a fost întâlnit în procent de 2,99% și la pisicile castrate în procent de 4,50%.

Concentrația proteinelor în extractele tumorale a variat în funcție de tipul tumoral, obținându-se valori de la 1,07 mg/ml la 9,59 mg/ml.

Concentrația glicoproteinelor raportate la hexoze și pentoze a variat în cele 10 tipuri de tumori, astfel: de la 41 mg/ml la 650 mg/ml în cazul hexozelor și de la 9 mg/ml la 643 mg/ml pentru pentoze.

Concentrația proteinelor plasmatice a variat de la 4,74 g/dl la 5,06 g/dl la cățele și de la 4,87 g/dl la 5,06 g/dl la pisici, încadrându-se în limitele normale speciei.

Concentrația glicoproteinelor plasmatice a variat de la 1,4 mg/dl (0,14 g/dl) la 2,4 mg/dl (0,24 g/dl) la cățele și de la 1,6 mg/dl (0,16 g/dl) la 2,1 mg/dl (0,21 g/dl) la pisici.

Gradul de glicozilare a proteinelor plasmatice a variat de la 2,9 la 5% la cățele și de la 3,3 la 4,1% la pisici.

Constantele serice analizate (creatinina, ureea, fosfataza alcalină, glicemia și GPT), s-au încadrat în limitele normale speciei.

Distribuția electroforetică a glicoproteinelor este diferită în funcție de specie, tipul de tumoră, uneori diferențiindu-se și în cadrul aceluiași tip de tumoră.

Rezultatele obținute sugerează faptul că glicoproteinele plasmatice investigate atât cantitativ cât și electroforetic, pot constitui markeri serici care să orienteze clinicianul către investigarea unei anumite maladii. Totuși înainte de a se introduce aceste analize în practica curentă, este necesară investigarea unui număr mult mai mare de cazuri.

INTRODUCERE

Acum când pe întreaga planetă se desfășoară acțiuni de protecție a ecosistemelor și de diminuare a suferințelor, este cazul să se acționeze și pentru sănătatea celor ce nu cuvântă, dar care prin devotamentul și moralitatea lor au dreptul la o viață ocrotită de noi.

Teza de doctorat cu titlul ”Semnificația clinică și rolul glicoproteinelor în malignizarea tumorilor mamare la cățele și pisici” abordează unele aspecte teoretice și investigații clinice și de laborator asupra rolului glicoproteinelor în procesul de tumorizare mamară dar și a cazurilor de tumori mamare la cățele și pisici, prezentate la Clinica de Obstetrică și Ginecologie a Facultății de Medicină Veterinară București în timp de aproape trei ani.

Câinele și pisica reprezintă o părticică din biosferă, ”părticică” serios reprezentată față de alte specii de animale.

Primele contacte dintre oameni și câini au avut loc în perioadele preistorice. Zeci de mii de ani câinii preistorici sălbatici și-au dus viața astfel încât au reușit printr-o selecție naturală continuarea speciei.

Pisica trăiește în strânsă legătură cu omul de cel puțin 5500 de ani, această apropiere ducând la domesticirea ei, însă nu a pierdut abilitatea de a trăi în sălbăticie, unde formează colonii.

Iată de ce câinele și pisica au ajuns să fie compania favorită de către om.

Statisticile actuale arată că femelele sunt mult mai preferate decât masculii, deoarece sunt mai drăgălașe, mai docile, dar ajută și la perpetuarea speciei.

Femelele acestor specii sunt predispuse, chiar dacă li se acordă o atenție deosebită, la îmbolnăviri cu etiologie și epizootologie diversificată.

Studiile de specialitate scot în evidență incidența crescută a tumorilor mamare atât la cățea cât și la pisică.

Tumorile mamare la cățea și pisică sunt similare cu cele ce afectează glandele mamare ale femeilor și este posibil ca cercetările efectuate de Institutul Oncologic București vor face lumină în patologia oncologică comparată.

Cancerul mamar la cățea și pisică, care de cele mai multe ori determină apariția metastazelor și a recidivelor, reprezintă o problemă serioasă pentru aceste specii.

Criteriile corecte de evaluare a duratei supraviețuirii se apreciază a fi de doi ani la cățea și un an la pisică.

Trebuie subliniat de la început faptul că ne aflăm pe un tărâm puțin cunoscut în ceea ce privește comportamentul biologic al acestor neoplasme, acestea modificându-și structura prin apariția de noi tipuri de celule cu metabolism alterat.

Dintre substanțele organice de bază, proteinele și glucidele sunt cele al căror metabolism este profund modificat, probabil cu atât mai mult cu cât în mod normal ele se combină (glicoproteine).

Ultimele cercetări în domeniul medical veterinar au arătat că la nivelul tumorilor mamare există diferențe semnificative în ceea ce privește expresia atât a glicoproteinelor normale cât și a celor asociate cu malignizarea.

Cercetările noastre au avut drept scop studiul comparativ al glicoproteinelor din serul sanguin și țesuturile tumorale în raport cu martorii. Acest deziderat s-a realizat prin investigarea componentei glucidice, a glicoproteinelor solubile extrase din tumori mamare de la cățea și pisică.

Glicoproteinele sunt foarte răspândite în sistemele biologice și îndeplinesc funcții extrem de variate. Peste 70% dintre proteinele eucariote au atașate structuri glucidice fie la atomul Nδ al unor reziduuri de Asn, în cazul N-glicozilării, fie la atomii Oδ sau Oγ al reziduurilor de Thr respectiv Ser, în cazul O-glicozilării. Practic orice tip de proteină poate fi glicozilată, de la enzime la proteine transportoare, de la receptori sau hormoni la proteine structurale.

Rolul glicozilării în proteine este departe de a fi elucidat. Studiile efectuate până acum au demonstrat o gamă variată de funcții posibile ce variază de la proteină la proteină, de la situs la situs. Glicozilarea poate interfera cu funcția proteinei și are, de asemenea implicații structurale majore. Pare a fi corelată în primul rând cu fenomene de recunoaștere intermoleculară, cum ar fi cele legate de sortarea, traficul și distribuția celulară a proteinelor.

Glicanii au fost identificați ca participând în medierea interacțiilor ligand-receptor de tip lectinic sau la creșterea sau scăderea antigenității. Glicozilarea a fost asociată în multe situații cu creșterea stabilității proteinelor sau cu mecanisme împotriva degradării proteolitice.

INTRODUCTION

Acum când pe întreaga planetă se desfășoară acțiuni de protecție a ecosistemelor și de diminuare a suferințelor, este cazul să se acționeze și pentru sănătatea celor ce nu cuvântă, dar care prin devotamentul și moralitatea lor au dreptul la o viață ocrotită de noi.

Teza de doctorat cu titlul ”Semnificația clinică și rolul glicoproteinelor în malignizarea tumorilor mamare la cățele și pisici” abordează unele aspecte teoretice și investigații clinice și de laborator asupra rolului glicoproteinelor în procesul de tumorizare mamară dar și a cazurilor de tumori mamare la cățele și pisici, prezentate la Clinica de Obstetrică și Ginecologie a Facultății de Medicină Veterinară București în timp de aproape trei ani.

Câinele și pisica reprezintă o părticică din biosferă, ”părticică” serios reprezentată față de alte specii de animale.

Primele contacte dintre oameni și câini au avut loc în perioadele preistorice. Zeci de mii de ani câinii preistorici sălbatici și-au dus viața astefel încât au reușit printr-o selecție naturală continuitatea speciei.

Pisica trăiește în strânsă legătură cu omul de cel puțin 5500 de ani, această apropiere ducând la domesticirea ei, însă nu a pierdut abilitatea de a trăi în sălbăticie, unde formează colonii.

Iată de ce câinele și pisica au ajuns să fie compania favorită de către om.

Statisticile actuale arată că femelele sunt mult mai preferate decât masculii, deoarece sunt mai drăgălașe, mai docile, dar ajută și la perpetuarea speciei.

Femelele acestor specii sunt predispuse, chiar dacă li se acordă o atenție deosebită, la îmbolnăviri cu etiologie și epizootologie diversificată.

Studiile de specialitate scot în evidență incidența crescută a tumorilor mamare atât la cățea cât și la pisică.

Tumorile mamare la cățea și pisică sunt similare cu cele ce afectează sânii femeilor și este posibil ca cercetările efectuate de Institutul Oncologic București vor face lumină în patologia oncologică comparată.

Cancerul mamar la cățea și pisică, cum de cele mai multe ori dă recidive, reprezintă o problemă serioasă pentru aceste specii.

Criteriile corecte de evaluare a duratei supraviețuirii se apreciază a fi de doi ani la cățea și un an la pisică.

Trebuie subliniat de la început faptul că ne aflăm pe un tărâm puțin cunoscut în ceea ce privește comportamentul biologic al acestor neoplasme, acestea modificându-și structura prin apariția de noi tipuri de celule cu metabolism alterat.

Dintre substanțele organice de bază, proteinele și glucidele sunt cele al căror metabolism este profund modificat, probabil cu atât mai mult cu cât în mod normal ele se combină (glicoproteine).

Ultimele cercetări în domeniul medical veterinar au arătat că la nivelul tumorilor mamare există diferențe semnificative în ceea ce privește expresia atât a glicoproteinelor normale cât și a celor asociate cu malignizarea.

Cercetările noastre au avut drept scop studiul comparativ al glicoproteinelor din serul sanguin și tesuturile tumorale în raport cu martorii. Acest deziderat s-a realizat prin investigarea componentei glucidice, a glicoproteinelor solubile extrase din tumori mamare de la cățea și pisică.

Glicoproteinele sunt foarte răspândite în sistemele biologice și îndeplinesc funcții extrem de variate. Peste 70% dintre proteinele eucariote au atașate structuri glucidice fie la atomul Nδ al unor reziduuri de Asn, în cazul N-glicozilării, fie la atomii Oδ sau Oγ al reziduurilor de Thr respectiv Ser, în cazul O-glicozilării. Practic orice tip de proteină poate fi glicozilată, de la enzime la proteine transportoare, de la receptori sau hormoni la proteine structurale.

Rolul glicozilării în proteine este departe de a fi elucidat. Studiile efectuate până acum au demonstrat o gamă variată de funcții posibile ce variază de la proteină la proteină, de la situs la situs. Glicozilarea poate interfera cu funcția proteinei și are de asemenea implicații structurale majore. Pare a fi corelată în primul rând cu fenomene de recunoaștere intermoleculară, cum ar fi cele legate de sortarea, traficul și distribuția celulară a proteinelor.

Glicanii au fost identificați ca participând în medierea interacțiilor ligand-receptor de tip lectinic sau la creșterea sau scăderea antigenității. Glicozilarea a fost asociată în multe situații cu creșterea stabilității proteinelor sau cu mecanisme împotriva degradării proteolitice.

Partea I

Studiu bibliografic

PART I
BIBLIOGRAPHIC STUDY

CAPITOLUL I

TUMORILE GLANDEI MAMARE LA CĂȚEA ȘI PISICĂ

CHAPTER I

MAMMARY TUMORS OF DOG AND CAT

În ultimi ani tumorile spontane la carnivore au crescut într-un mod vertiginos. Statisticile raportate la 100 000 de cazuri sau la diferite perioade de timp au arătat atât creșterea numerică a cazurilor, cât și diversitatea anatomo-clinică a acestora.

Prevalența cancerului la animale este în continuă creștere datorită unui număr foarte mare de factori, în strânsă legătură cu durata de viață tot mai lungă a animalelor. Din moment ce, în general, cancerul este o boală a animalelor bătrâne, consecința măririi duratei de viață fiind posibilitatea dezvoltării de cancere. Durata de viață prelungită este rezultatul unei nutriții mai bune, mai echilibrată, vaccinărilor, medicinii preventive și îmbunătățirea tehnicilor terapeutice, reglementări legislative ce privesc siguranța animalelor și atașamentul proprietarilor față de animalele lor (legătura animal-om). Ținând cont de creșterea prevalenței, medicii veterinari vor fi solicitați din ce în ce mai des să diagnosticheze și trateze animale cu cancer. Inovațiile, privind tratamentul cancerului la om, au beneficiat de o puternica mediatizare puternică prin intermediul televiziunilor, ziarelor și website-urile. Deși se progresează încet, proprietarii de animale conștientizează ce se poate obține în urma tratamentelor și apelează optimiști la serviciile medicale veterinare, iar medicii veterinari trebuie sa fie pregătiți pentru astfel de cerințe. Cancerul este o boala gravă, frecvent întâlnită la oameni. Mulți dintre proprietari au avut sau vor avea de suferit din cauza cancerului, fie că este vorba chiar de ei însuși, un membru al familiei sau un prieten apropiat. Conștientizând importanța animalului pentru proprietar, trebuie ținut cont de faptul că acesta apreciază competența medicului veterinar prin prisma abilității de a vindeca animalul bolnav de cancer. Ținând cont de acest aspect, medicul veterinar trebuie să abordeze animalul cu o atitudine pozitivă, compătimitoare și în cunoștință de cauză. În mod frecvent practica veterinară a prezentat o abordare necorespunzătoare („test and slaughter” (testează și „măcelărește”)) a cancerului. Acest tip de abordare, pe lângă faptul că nu este benefică pentru animal, va influența într-un mod negativ, fals, convingerile și teama proprietarilor legate de boala canceroasă la oameni. Medicul veterinar este dator, atât față de pacient, cât și față de proprietar, să fie bine pregătit și informat la zi cu noile metode de diagnosticare și tratament, pentru a se evita stabilirea unui prognostic grav, fără șansă de reușită.

Animalele de companie care dezvoltă cancere constituie o oportunitate importantă pentru a studia diferite aspecte ale cancerului, de la etiologia acestuia până la tratament. Astfel, în diferite țări, au fost create programe de cercetare bazate pe studiul comparativ al cancerului animalelor domestice. Realizarea acestor studii va ajuta la observarea de noi aspecte ale cancerului cât și la îmbunătățirea perspectivelor pentru această boală atât la animale cât și la om (Gillette E. L., 1982; Hahn K. A. și colab., 1994; MacEwen E. G., 1990).

Aspectele care au dus la studiul comparativ al cancerului pe animale de companie sunt: gradul de înrudire genetică scăzut (față de anumite linii de șobolani); formele naturale (spontane) prezintă o evoluție clinică diferită față de cancerele induse sau transplantate; valoarea de santinelă a animalului; evoluția mai rapidă decât la om a cancerului; posibilitatea de a testa și stabilii noi protocoale terapeutice; asemănarea dintre tipurile de cancer dezvoltate la animale și la oameni; sistemul imun intact permite efectuarea de teste imunologice; durata de viață a animalelor este suficient de mare pentru a se putea observa eventuale efecte secundare ale tratamentelor; posibilitatea necropsierii animalului; ușurința efectuării diferitelor tehnici imagistice și chirurgicale.

Oncologia oferă medicului veterinar temerar un domeniu complex și solicitant, atât pe latură clinică cât și de laborator, oferă oportunități nelimitate de cercetare și îmbunătățire a cunoștințelor, totul în beneficiul animalelor și omenirii. „Cancerul, spre deosebire de politică și religie, nu este un subiect de controverse. Nimeni nu contestă. Cancer, nu reprezintă un sinonim pentru moarte. Nu este doar o afecțiune, la care să existe un singur remediu. În schimb, acesta capătă multe forme, iar fiecare formă de cancer răspunde diferit la tratament” (Mooney S., 1989).

Prin observația clinică și tratarea animalului bolnav de cancer, activitatea medicului veterinar poate avea impact atât asupra animalului și evoluția bolii acestuia, cât și asupra tratamentului aplicat la oameni.

1.1. ETIOLOGIA TUMORILOR MAMARE

1.1. ETIOLOGY OF MAMMARY TUMORS

Factorii cauzali ai tumorilor la canine și feline, ca și la om nu sânt în totalitate cunoscuți, aceasta făcând ca incidența îmbolnăvirilor să fie foarte diferită variind cu rasa, sexul, vârsta, aria geografică, alimentația, mediul înconjurător etc.

Anchetele epidemiologice atît descriptive, cît și analitice ce înregistrează numărul de cazuri și legăturile ce se pot stabili între factorii de risc și incidența mai frecventă a maladiei canceroase la un număr mai mare de indivizi sunt considerate ca metode relevante în furnizarea de date ce pot explica cauzele carcinogenezei la canine și feline.

Rezultatele arată că numeroși factori predispozanți și de mediu joacă un rol important în etiologia diferitelor cancere. în afară de acestea, la canine s-au descris și factori specifici oncogeni cum sânt virusurile, radiațiile și unii paraziți (tabelul 1.1).

Tabel 1.1.

Posibili factori cauzali ai tumorilor canine și feline

(Harday W. D., 1976, modificat)

Table 1.1.

Possible causative factors of canine and feline tumors

(Harday W. D., 1976, modified)

1.1.1. Ereditatea

În general, este acceptată ipoteza că tumorile nu se transmit ereditar, dar ereditatea este considerată ca un factor predispozant. Teoria că maladia canceroasă poate fi considerată ca o boală genetică la nivelul celular se bazează pe posibilitățile necontrolabile mutagene la nivel cromozomial ce pot transforma o celulă normală în una tumorală.

1.1.2. Rasa

Rasa: este cunoscut faptul că tumorile se întâlnesc mai frecvent la metiși sau rase comune (MacEwen E. G., 1990).

După Harday W. D., 1976, boxerul reprezintă un exemplu clar de rasă predispusă la cancer, afecțiune ce se întâlnește de 4 ori mai frecvent decât la alte rase. La noi în tară, unii autori (Bud I., și colab., 2001) clasifică rasa Caniche pe primul loc, urmată de Cocker, dar această constatare va trebui ulterior confirmată, deoarece numărul Boxerilor la noi este mult mai mic decât al raselor menționate mai sus.

Spre deosebire de Boxer, rasa Beagle frecvent folosită în laboratoarele de medicină experimentală este foarte rar afectată de tumori spontane.

Predispoziția unei rase grele de câini (Dog german, Saint-Bernard) la osteosarcoame pare să fie mai mult de natură anatomică decât genetică (Harday W. D., 1976). O prezentare a raselor mai expuse la cancer este redată în tabelul 1.2.

Tabel 1.2.

Implicația factorului de rasă în apariția tumorilor la câine

(Preister W. A., McKay F. W., 1980 )

Table 1.2.

The implication of race factor in the emergence of tumors in dogs

(Preister W. A., McKay F. W., 1980)

1.1.3. Hormonii

Incidența mare de tumori mamare la canine și feline se pare a fi urmarea unor dereglări psiho-neuro-hormonale datorită macro- și microclimatului în care trăiesc, foarte asemănător cu cel al omului.

Dezechilibrul hormonal hipofizo-ovarian urmat de secreția în exces a hormonilor estrogeni constituie una din explicațiile faptului că femelele castrate înainte de primul ciclu au un coeficient de risc tumoral de 200 ori mai mic decât cele necastrate (Kruger J. M. și colab., 1996).

Spre deosebire de acestea, castrarea după diagnosticarea tumorii mamare nu influențează timpul de supraviețuire (Rutteman G. R. și colab., 2001). Gestația, falsa gestație, regularitatea ciclului, fecunditatea se consideră de unii autori stări fiziologice ce nu influențează factorii de risc tumoral (Rutteman G. R. și colab., 2001).

Folosirea hormonilor epifizari sau a produselor farmaceutice antiestro-genice (Tamoxifen) au efecte pozitive în întârzierea și delimitarea procesului tumoral mamar dar nici un efect asupra metastazelor produse de tumorile maligne mamare.

La masculi, titrul ridicat de testosteron se pare că este cauza tumorilor perianale și prostatice. Femelele și masculii castrați, foarte rar sânt afectate de adenocarcinoame ale glandelor perianale. Castrarea masculilor după apariția acestor tumori duce la regresia acestora (Bell F. W., și colab., 1991) și la prevenirea apariției altora.

1.1.4. Factori congenitali

Tulburări ale embriogenezei unor organe pot fi cauza apariției tumorilor. Astfel, este descris nefroblastromul la câni mai mici de 6 luni, fapt ce pledează pentru o origine congenitală a procesului tumoral ce se manifestă la o vârstă atît de tânără.

1.1.5. Traumele

Traumele repetate ce produc inflamații cronice pot fi cauzele declanșării procesului tumoral în special la animalele ce depășesc vârsta de 8—10 ani. Unii autori (Parker S. L. și colab., 1997) acordă factorilor traumatici chiar un rol important în declanșarea carcinogenezei mamare la cățea. Aceștia susțin că mamelele abdominale fiind pendulante, sunt expuse mai mult traumelor decât celelalte, fapt ce explică apariția mult mai frecventă a tumorilor la acestea din urmă. Se recunoaște că traumatismele unice nu sunt cauze carcinogenetice, spre deosebire de cele repetate care sunt unanim acceptate ca factori de stimulare a creșterii tumorale.

1.1.6. Alimentația

Se pare că incidența mare a tumorilor la canine si feline poate fi corelată cu dieta și factorii de microclimat comuni cu ai omului. Unele produse alimentare contaminate cu ciuperci ce produc mari cantități de aflatoxine (ex. Aspergillus flavus) au o puternică acțiune cancerigenă (în special hepatică) prin inhibiția polimerazelor ADN și ARN. Investigațiile efectuate privind rolul factorilor alimentari în cancerogeneză au scos în evidență că dietele bogate în proteine și grăsimi și sărace în vegetale, asociate cu sedentarism prelungit și obezitate reprezintă factori de risc tumoral (Baxter R. C., 1995).

1.1.7. Radiațiile

Expunerea prelungită la razele ultaviolete, mai ales la altitudini înalte și în zonele tropicale, a regiunilor corporale cu pielea depigmentată (nas, urechi, regiunea temporală, buze) poate cauza apariția tumorilor spontane la canine și feline (Johnson R. E. și colab., 1968).

1.1.8. Sexul

Incidența tumorilor la canine si feline este unanim acceptată ca fiind dependentă de sex. Sistemul neuroendocrin, mult mai labil și ciclic al femelelor, face ca frecvența tumorilor mamare și ale aparatului genital să fie mult mai mare decât în cazul masculilor. Masculii sunt mult mai afectați de tumori buco-faringiene și perianale al căror risc este de 7 ori mai mare decât la femele. De asemenea, tumorile vezicii urinare la femele sunt mult mai frecvente decât la masculi, fapt ce a făcut pe unii cercetători să afirme ca în urină există un factor cancerigen care în cazul femelelor a căror micțiune este mult mai rară decât a masculilor, să devină un factor de risc (Jemal A. și colab., 2011).

1.1.9. Virusurile oncogene

Virusurile oncogene de tipul Oncorna sunt considerate ca factori determinanți ai unor afecțiuni neoplazice, din care cel mai bine studiate sunt virusul leucemiei și al sarcoamelor felinelor. De asemenea, alte afecțiuni neoplazice ca eritroleucemia, limfoamele maligne și unele procese proliferative ale măduvei roșii pot avea ca etiologie diferite virusuri care se pot transmite transplacentar.

Există virusuri ARN incriminate în etiopatogeneza adenocarcinomatozei mamare, astfel că numărul proceselor neoplazice cu etiologie virală depășește până în prezent cifra de 28 (Madewell B. R. și colab., 1987).

Cu toate acestea sunt încă numeroase tumori spontane în care implicația unui factor infecțios nu poate fi demonstrată. Oncogeneza virală este explicată prin teoria virogenului oncogen a lui (Huebner R. J. și colab., 1969).

Această teorie se bazează pe presupunerea că toate celulele conțin în genomul lor informația pentru cancer; materialul genetic al virusurilor – virogenul – se găsește în toate celulele normale și se transmite ereditar. Exprimarea genomului viral se află sub controlul genelor reglatoare și în mod normal acesta este reprimat. În anumite condiții cancerigene, genomul viral este activat și, concomitent, se produce o depresie imunologică.

Teoria ereditară pornește de la susceptibilitatea genetică a unor specii, rase sau linii la anumite neoplasme.

Teoria mutației genetice implică apariția anomaliilor cromozomiale prezente în celulele tumorale. Practic aproape toți factorii oncogeni produc în final mutații genice și/sau genomice. Se cunoaște că procesul neoplazic este rezultatul modificărilor de la nivelul ADN celular. Care sunt aceste modificări, cum influențează ele expresia genică și cum se reflectă în activitatea celulară, sunt aspecte încă neelucidate, enunțându-se trei teorii:

1. Teoria genetică – sau teoria mutației somatice prin care se susține modificarea genomului;

2. Teoria epigenetică – sunt afectate sistemele de control ale creșterii și diferențierii celulare;

3. Teoria oncogenelor, prin care se susține preexistența în genomul oricărei celule a unor gene (proto-oncogene-anti-oncogene) care sub acțiunea factorilor oncogeni sunt activate sau inhibate. Problema fundamentală a carcinogenezei constă în elucidarea procesului de transformare malignă a celulei normale și a mecanismelor care stau la baza acestei transformări. Din cercetările întreprinse reiese că procesul de carcinogeneză este rezultatul unui șir de evenimente celulare și moleculare provocate de anumiți agenți fizici, chimici și/sau biologici, evenimente separate prin multiple perioade de selecție.

Astfel, cancerogeneza este un proces cu etiologie multifactorială și o evoluție multistadială.

Operațional se desfășoară în trei etape:

de inițiere, în care se produce lezarea ADN, modificarea permanentă și transmisibilă, rezultând proto-oncogene și apoi oncogene și antioncogene;

de promoție, în care are loc transformarea celulelor proneoplazice în celule neoplazice, care prezintă imperfecțiuni în controlul proliferării și diferențierii, având ca rezultat producția autocrină de factori de creștere și o sensibilitate redusă sau absența la factorii de inhibiție a creșterii;

de progresie – care cuprinde procesul complex de dezvoltare a focarului neoplazic malign.

1.2. CLASIFICAREA HISTOPATOLOGICĂ A TUMORILOR GLANDEI MAMARE

1.2. Histopathological CLASSIFICATION OF mammary gland TUMORS

Displaziile și tumorile glandei mamare sunt incomparabil mai frecvente la câine și pisică față de animalele de fermă, la care astfel de procese neoplazice sunt foarte rar întâlnite.

Diversele forme histopatologice, mai ales cele privind carcinoamele, sunt destul de asemănătoare cu aspectele patostructurale similare ale cancerului de sân la femeie (Manolescu N., 1991; Baba I., 1995). Este demn de subliniat că, sub raportul prognosticului, grading-ul histopatologic și stadialitatea clinică a tumorilor mamare are semnificații diferite: la câine, stadialitatea clinică este importantă pentru prognostic și, uneori, chiar mai semnificativă decât grading-ul histopatologic, pe când, la pisică, grading-ul histopatologic are semnificație prognostică aproape absolută.

Tipul de carcinom simplu este mai frecvent întâlnit decât carcinomul complex. Tumorile mixte ale glandei mamare au un comportament biologic asemănător cu carcinoamele de tip complex, care sunt mult mai expansive decât carcinoamele simple. Procesele de metastazare interesează pulmonul și limfonodurile.

Apariția tumorilor mamare maligne de tip mixt este mai frecventă la cățea decât la femeie și pisică. Trebuie să fie în atenție faptul că la cățea posibilitățile de transformare malignă a tumorilor benigne și a celor aparent benigne sunt o realitate. Astfel, dintr-un fibroadenom mamar se poate dezvolta, oricând, un carcinom, sarcom sau carcinosarcom, cu mențiunea că, în general, frecvența sarcoamelor și a carcinosarcoamelor în cazul glandei mamare este cu mult mai mică decât cea a carcinoamelor (Misdorp W. și colab., 1973).

Dintre displaziile benigne sau aparent benigne ale glandei mamare, mastoza, fibroscleroza și ectazia ductală sunt cele mai reprezentative pentru cățea și pisică. Adenozele sunt rare la aceste specii de animale.

Dacă, în cazul mastozelor, aspectele morfologice sunt chistice, cu sau fără structuri papilifere intrachistice, în fibroscleroza se remarcă o proliferare conjunctivă, predominant fibrilară de tip nodular, periductal sau perilobular.

Adenomul simplu este rar. Frecvente sunt adenoamele complexe, în care se remarcă hiperplazii ale celulelor epiteliale secretorii și ale celulelor mioepiteliale și care se întâlnesc mai ales sub forma unor tumori mixte: fibroadenoame, chistadenoame, fibrochistadenoame etc. Fibroadenomatoza totală apare numai la pisicile imature.

Adenocarcinoamele sunt tumori maligne ale glandei mamare, frecvent întâlnite la cățea; la pisică, poate că sunt tipurile de tumori cel mai frecvent întâlnite. Pot fi simple și complexe, în funcție de participarea unui tip și, respectiv, a ambelor tipuri de celule: celule secretorii și celule mioepiteliale și pot îmbrăca diferite forme, în raport cu aspectul de proliferare celulară: tubulare, papilifere, solide etc.

Este important de notat că o serie de tumori care s-au înregistrat la cățea nu au fost deloc semnalate la pisică: adenocarcinomul tubular tipul complex, adenocarcinomul papilifer chistic tipul complex, carcinomul solid tipul complex, mioepiteliomul malign, carcinomul anaplazic (Hampe J. F. și colab., 1974).

Sarcoamele, de regulă, sunt destul de rare și exprimă proliferarea de tip malign a celulelor mezenchimale din structura glandei mamare, adeseori fiind mixte: fibrocondrosarcoame, osteocondrosarcoame etc.

Carcinosarcoamele evidențiază aspecte structurale variate în care sunt angrenate componente celulare mixte de tip epitelial secretor, mioepitelial și conjunctiv, proliferate malign. Clasificarea histologică și nomenclatura tumorilor și displaziilor glandei mamare după Hampe J. F. și colab., 1974, este prezentată în tabelul 1.3.

Tabel 1.3.

Clasificarea histologică a tumorilor mamare

(Hampe J. F. și colab., 1974)

Table 1.3.

Histological classification of mammary tumors

(Hampe J. F. et all, 1974)

1.3. PATOGENEZA TUMORIZĂRII GLANDEI MAMARE

1.3. PATHOGENESIS OF TUMORAL PROCESS IN MAMMARY GLAND

Neoplasmele, tumorile sau cancerele sunt neoformații tisulare care iau naștere printr-o proliferare celulară ce se sustrage mecanismelor homeostazice ale multiplicării normale, conferindu-le treptat o independență biologică față de substratul în care se dezvoltă. Spre deosebire de proliferările inflamatorii, regenrative sau cicatriceale, care au caracter reactiv și se integrează în mecanismele homeostazice implicate în morfogeneza, apărarea și adaptarea țesuturilor, proliferarea tumorală este primitivă, anarhică, nelimitată și nocivă.

Definitoriu pentru tumori este faptul că multiplicarea nu este controlată și persistă până la moartea gazdei.

În principiu, celulele tumorale se divid în progresie geometrică (creșterea exponențială sau logaritmică). Această progresie este liniară în stadiul incipient deoarece, o dată cu creșterea masei tumorale crește și timpul necesar pentru dublarea ei, progresia urmând o curbă.

De la debutul procesului neoplazic celular până la apariția tumorii și apoi a bolii neoplazice există un drum relativ lung. O mare parte din focarele neoplazice sunt estompate de organism încă din stadiile de debut. Mecanismul acestei estompări este complex și încă puțin cunoscut. Pentru apatiția unei tumori sau a unui foar neoplazic vizibil este necesar să se ajungă la o populație mare de celule patologice (109). În locurile accesibile unui examen clinic direct (piele, mucoasă bucală, conjunctivală, vulvară etc.) aceste focare pot fi observate în stadii inițiale, în timp ce în organele interne numai atunci când ating mărimi care atrag după ele tulburări funcționale.

În unele cazuri focarul tumoral poate să parcurgă perioade de inactivitate „dormant”, sau de aparentă stagnare a proliferării celulare, în timp ce în alte cazuri pot exista perioade de creștere explozivă numite pusee evolutive. Aprecierea ritmului de proliferare se face după „timpul de dublare” a masei celulare tumorale. Acest timp de dublare, realizat prin diviziunea mitotică a generațiilor succesive de celule, este inconstant și supus influenței unor factori specifici de inhibare a mitozei celulelor neoplazice, denumiți generic „halone”.

În cazul tumorilor benigne, creșterea este lentă, cu perioade de stagnare și uneori de regresie; focarul proliferativ este net delimitat, dezvoltându-se prin dislocare tisulară, fără distrucție; nu diseminează în organism și nu influențează funcțiile acestuia decât prin acțiuni indirecte (compresiuni, ocluzii, etc.).

În cazul tumorilor maligne, creșterea este în general rapidă, cu caracter invaziv-distructiv și infiltrant în țesutul în care se dezvoltă și în cele adiacente; metastazează și recidivează; are efect toxic specific și nespecific, cu evoluție letală. În evoluția dezvoltării tumorale transferul de celule și proliferarea acestora la distanță de locul de origine constituie evenimentul cel mai dramatic, de trecere de la categoria patologică de „focar tumoral” sau „focar neoplazic local” la categoria de „boală neoplazică” sau „canceroasă”.

Momentul de trecere la etapa de vascularizare este apreciat ca decisiv pentru convertirea masei de celule tumorale aberante, dar în stare „dormant” într-o masă malignă cu creștere invaziv-infiltrativă. Sub influența factorului de angiogeneză tumorală (FAT) procesul de neocapilarogeneză se accelerează, se formează muguri capilari care converg spre focarul tumoral din toate direcțiile, tumora devine „roșie”, și celulele tumorale se infiltrează între cele endoteliale, creându-se astfel condiția diseminării în spațiul sangvin și limfatic.

Rezultă de aici că o dată cu vascularizarea crește rata proliferării, iar tumora comprimă, invadează și distruge țesuturile învecinate.

Rolul decisiv al vascularizării a determinat îndreptarea atenției spre găsirea unor mijloace sau căi de inhibare a neovascularizării focarului tumoral.

Creșterea invaziv-infiltrativă, caracteristică pentru tumorile maligne, se consideră că are la bază următoarele procese esențiale:

– neovascularizarea;

– proliferarea rapidă și continuă și, consecutiv, creșterea presiunii intratisulare locale;

– scăderea adezivității care le secretă, sunt capabile să degradeze matricea extracelulară, creând astefl posibilitatea invaziei infiltrative.

Țesuturile normale din vecinătatea tumorii maligne nu rămân indiferente, deși tumora proliferează autonom. Acestea reacționează, punând în libertate factori biochimici asemănători cu cei din inflamație. Comportamentul diferă de la un țesut la altul. Spre exemplu, invazia cartilajelor articulare în osteosarcom la om și câine este împiedicată de un factor antiinvaziv.

Metastazarea este un proces complex în care celulele dintr-un focar tumoral diseminează regional sau la distanță unde se multiplică, dând noi focare tumorale independente, denumite metastaze. Acest proces se desfășoară în mai multe etape, începând cu desprinderea de celule din tumora primară, penetrarea lor activă sau pasivă prin structurile adiacente (membrane bazale, matrice intercelulare), invadarea vaselor limfatice sau sangvine, a unor cavități naturale sau spații intertisulare, continuând cu diseminarea lor la distanță în alte țesuturi sau organe, unde se fixează și se multiplică, păstrând, în general, biologia caracteristică tumorii primare.

Metastazarea, fiind o caracteristică a malignității, presupune existența unor subpopulații de celule tumorale cu potențial de invazie crescut, capabile să utilizeze mijloacele homeostazice ale gazdei în scopul propriei lor supraviețuiri și creșteri.

Procesul de metastazare se poate realiza pe mai multe căi: limfogenă, hematogenă, cavitară, canaliculară, prin spații interstițiale, prin implantare sau prin inoculare spontană sau accidental în timpul unor explorări sau al intervențiilor chirurgicale.

Dinamica procesului neoplazic corespunde intervalului de timp de la apariția și derularea fenomenelor succesive de la normal spre malign:

Etapa I: displazia epitelială simplă, recunoaște următoarele aspecte:

a). clinic – procesul incipient de chistizare;

b). citologic – interesează celulele sub raportul dimensiunilor, formei, dispunerii nucleului și raportului nucleo-citoplasmatic;

c). histopatologic – procesul incipient de proliferare a epiteliului hiperplaziat intralumenal, atât în lumenul acinilor nechistizați cât și în structurile chistizate.

Etapa a II-a: stadiul de displazie agravată

Corespondentul clinic este mastoză chistică. Creșterea în volum a chiștilor și proliferarea intrachistică de tip compact a epiteliului, tinde să invadeze lumenul sub formă de papile, această stare presupune existența unor mitoze.

Etapa a lll-a: carcinom „ in situ " – stadiul O, recunoaște următoarele modificări:

a). Elementele maligne nu depășesc membrana bazală a epiteliului acinar (ea fiind intactă).

b). Celulele pavimentoase ale polului excretor devin globuloase.

c). Celulele cubice și cilindrocubice ductale sunt pluristratificate (denaturare a citoarhitectonicii epiteliului unistratificat).

d). Cheratinizarea celulelor epiteliale superficiale și profunde.

e). în toată grosimea epiteliului apar rare celule cu mitoze având aspect malign.

Etapele IV –V: carcinomul microinvaziv și carcinomul invaziv – stadiul TNM1-4.

Stadializarea clinică a tumorilor la câine și pisică după sistemul TNM, adoptat de Uniunea Internațională Contra Cancerului (UICC), se pot stadializa peste 26 de localizări tumorale.

Sistemul TNM are marele avantaj că poate fi aplicat la toate tumorile maligne care sunt explorabile prin metode clinice (inspecție, palpație, măsurare), operatorii, radiologice și endoscopice, suplimentare și de alte metode care furnizează date asupra prezenței și dimensiunilor tumorii primare și a raporturilor acesteia cu țesuturile adiacente, notate cu inițiala „T”, asupra implicării nodulilor limfatici regionali „N” și asupra prezenței metastazelor „M”.

Toate cazurile trebuie să fie confirmate histopatologic, iar cele care nu au această confirmare vor fi înregistrate și raportate separat.

Clasificarea clinică preterapeutică, desemnată prin simbolurile TNM este bazată pe constatările făcute anterior deciziei terapeutice definitive, aceste constatări fiind rezultatul examinărilor clinice, radiologice, endoscopice ș.a. În anumite cazuri se pot folosi și informațiile suplimentare obținute cu ajutorul explorării chirurgicale prealabile deciziei terapeutice definitive.

Clasificarea postoperatorie și histopatologică, desemnată prin simbolul  pTNM, este bazată pe datele obținute anterior deciziei asupra tratamentului definitiv, îmbogățite sau modificate prin constatările adiționale, făcute cu ocazia intervenției chirurgicale definitive sau rezultate din examinarea piesei extirpate în scop terapeutic. Atunci când actul chirurgical definitiv a fost precedat de alte tratamente, se adaugă prefixul „y” înaintea simbolului  pTNM respectiv.

Mastita carcinomatoasă se caracterizează prin următoarele aspecte:

a). Clinic – prin prinderea tuturor stațiilor limfonodale aferente și eferente glandei mamare, ca și infiltrarea dermului (aspectul pielii este de „coajă de portocală");

b). Histopatologic – diferă în funcție de unul sau altul dintre caracterele predominante: de tip compact, coloid, schirogen, anaplazic, alveolar, trabecular, proliferări ductale sau acinare care depășesc membrana bazală și produc invadarea țesuturilor adiacente.

Biochimic – capitalul cunoștințelor acumulate pănâ în prezent despre glicoproteine relevă implicarea acestora în procesele extrem diverse și de complexe al mecanismului tumoral.

Dintre glicoproteine, un rol important revine lectinelor care recunosc și leagă specific într-o manieră reversibilă anumite structuri glucidice în procesul de transformare (Drikamer K și colab., 1988).

Tot lectinele au fost instrumente de studiu cu ajutorul cărora s-a arătat că există diferențe senmificative între distribuția și natura grupărilor prostetice ale glicoproteidelor de la suprafața celulelor normale și a celor canceroase (Neuberger A., 1984).

Celulele normale își încetează creșterea când se ating una pe cealaltă, fenomen denumit ”inhibiție de contact”. Celulele canceroase nu se află sub un asemenea control și de aceea continuă să se dezvolte formând tumori magline (Curto M. și colab., 2007).

1.4. SIMPTOMATOLOGIA TUMORILOR GLANDEI MAMARE

1.4. SYMPTOMATOLOGY MAMMARY GLAND TUMORS

1.4.1. Simptomatologia locală

Tumorile solide au un polimorfism extrem de variat, în funcție de tipul tumoral (benign sau malign), de localizare, de funcția și ierarhia biologică a țesutului sau organului afectat, de stadiul evolutiv și uneori de particularitățile etiopatogenice. Creșterea tumorală apare de cele mai multe ori spontan, fără a se putea identifica o cauză anume sau simptome de debut, fapt pentru care boala nu este sesizată de proprietar sau îngrijitor decât într-un stadiu clinic evoluat, când, fie că proliferarea este morfoclinic evidentă, fie că aceasta determină tulburări funcționale ce impun examinarea animalului. Spre deosebire de alte tipuri de proliferări (inflamatorii, cicatriceale), proliferarea tumorală are caracter de persistență și de creștere evolutivă de tip benign sau malign.

Tumorile benigne în general, au un comportament morfoclinic caracterizat prin creștere lentă și bine delimitată de o barieră tisulară care, în cazul tumorilor țesuturilor de acoperire, este reprezentată de membrana bazală, iar în cazul tumorilor dezvoltate în parenchimul sau în profunzimea țesutuilor, de o capsulă conjunctivă, prin intermediul căreia tumora dislocă, comprimă sau deplasează țesuturile învecinate, dar niciodată nu le distruge și nu le invadează. Aspectul lor variază considerabil, de asemenea, în raport cu locul de formare. Astfel, cele ce se dezvoltă în parenchime au aspectul de noduli sperifici, ovoizi, și pot fi uni sau polilobate, iar cele ce se dezvoltă pe piele sau mucoase au aspectul papiloamelor, vegetațiilor, polipilor etc. O parte din tumorile benigne păstrează culoarea, textura și consistența țesutului de origine. Procesul tumoral nu afectează limfonodulii regionali, cu excepția situațiilor în care apar complicații inflamatorii specifice.

Tumorile benigne, indiferent de volumul lor, nu afectează direct starea generală (nu au acțiune de spoliere sau toxică), dar pot stingheri prin comprimare, dislocare, ocluzie etc. organe esențiale (creier, măduvă, vase mari, canale secretorii sau excretorii etc.), iar atunci când afectează glande endocrine sau sistemul endocrin difuz, pot produce cantități patologice de hormoni, cu repercusiuni specifice asupra stării generale.

Tumorile maligne se caracterizează printr-o proliferare variabilă ca ritm de creștere, de regulă mult mai rapid în stadiul evolutiv clinic, puțin sau deloc delimitată, cu tendința de invadare și infiltrare în țesuturile adiacente, asupra cărora au evidentă acțiune distructivă. Sub aspect morfoclinic au contur neregulat și greu precizabil, deoarece invadarea se realizează în toate direcțiile, anarhic, fără a ține cont de existența unor delimitări anatomice, afectând aproape în egală măsură toate formațiunile, indiferentde structura lor histologică. Polimorfismul este și mai variat decât în cazul tumorilor benigne, putându-se totuși diferenția câteva trăsături generale. Astfel, carcinoamele tubulare au forme vegetante, cu bază largă de implantare și cu tendința evidentă de invadare a peretelui, și ulcerante, rezultate în urma procesului de necroză și de eliminare a unei părți din masa tumorală. În raport cu gradul de afectare pot fi superficiale, când interesează numai mucoasa și profunde, infiltrative, când pătrund în grosimea peretelui, modificându-i volumul și consistența. Sunt cu aspect organoid formate din epiteliu neoplazic și țesut conjunctiv puternic vascularizat. În concordanță cu stroma colagenică acestea se împart în

carcinoame schiroase, cu stromă foarte bogată,

carcinoame simple, cu stromă moderată,

carcinoame medulare cu puțină stromă.

Sarcoamele îmbracă forme diferite, în general, au consistență și aspect comparabil cu cel al cărnii de pește nefiert, aspect ce suferă uneori modificări date de necroză sau de procesele distrofice.

1.4.2. Simptomatologia generală

Tumorile maligne, spre deosebire de cele benigne, pe lângă simptomele locale induc tulburări sistemice, a căror gravitate crește progresiv o dată cu evoluția, ducând inevitabil la moarte în toate formele generalizate. Și în prezent, din punct de vedere clinic, se mai utilizează sistematizarea evoluției în cele trei faze:

locală  (infraclinică și clinică),

de extensie loco-regională

de generalizare, care presupune apariția de tumori multiple, în cazul celor benigne,

metastazarea, în cazul tumorilor maligne, dând starea de boală neoplazică sau canceroasă, cu denumiri diferite în raport cu tipul tumoral, ca de exemplu papilomatoză, carcinomatoză, limfomatoză etc.

1.4.3. Sindroamele paraneoplazice

Au fost sistematizate în: manifestări endocrine, neurologice, hematologice, imunologice, renale, gastrointestinale, cutanate. Aceste manifestări se consideră că au ca substrat patogenic producerea de polipeptide cu activitate biologică asemănătoare sau identică cu a unor hormoni și de prostaglandine, imunoglobuline, enzime sau proteine fetale. La acestea se adaugă și alte mecanisme patogenice ca: modificări ale imunității (autoagresiune, producerea de complexe imune, imunodepresive); producerea de receptori ectopici sau blocarea receptorilor obișnuiți prin ocuparea competitivă a acestor receptoride către like-hormoni biologic inactivi, produși de tumoră; invazia și vascularizația anormală cu posibilitatea trecerii în circulația sangvină a unor enzime (de exemplu fosfataza alcalină placentară) sau a altor substanțe care determină fenomene toxice sau alte stări fiziopatologice mai mult sau mai puțin specifice bolii canceroase.

Manifestările endocrinologice paraneoplazice sunt datorate posibilității ca anumite tumori să producă substanțe asemănătoare cu hormonii naturali, biologic inactivi sau activi, care într-o situație pot prezenta importanță pentru diagnostic, iar în cealaltă pentru tratament, fiind vorba de un exces de hormoni cu consecințele sindromului clinic specific. Posibilitatea de hormonogeneză a tumorilor neendocrine este bine cunoscută, iar în ultimii ani s-au făcut studii și la animale, bazate pe dozări radio-imunologice cu scopul de a realiza un screening al tumorilor hormonogeneratoare.

Manifestările hematologice sunt cel mai frecvent întâlnite, îndeosebi în tumorile maligne care afectează sistemul hematopoetic.

Aceste manifestări sunt reprezentate prin:

eritrocitoză  (în tumori renale, hepatice și ale glandei suprarenale, hemangioblastoame etc),

anemie (însoțesc stările terminale ale evoluției bolii canceroase), granulocitoză (în tumorile gastrice, pancreatice, melanoame etc.),

granulocitopenie (mai rară, apare ca o complicație a tratamentului chimio-radiologic, cât și în tumorile evolutive care prin metastaze distrug măduva osoasă;

eozinofilia  și bazofilia (în limfosarcoame, melanoame);

trombocitoza (însoțesc frecvent carcinoamele, leucemiileși limfoamele);

trombocitopenia (adenocarcinoame mamare și testiculare, limfoblastoame, sarcoame imunoblastice, complicație a chimio- și radioterapiei)

coagularea diseminată intravasculară (însoțește stările canceroase grave, care afectează, fie direct, echilibrul dintrecoagulare și fibrinoliză prin eliberarea unor mari cantități de substanțe tromboplastice, fie indirect, prin dezechilibrele homeostazice generale caracteristice stărilor de șoc).

Manifestările metabolice, mai constant întâlnite, sunt reprezentate de acidoza lactică: hiperlipemia, hiperamilazenia, amiloidoza, disproteinemia în toate cancerele evoluate.

Manifestările renale paraneoplazice sunt determinate de leziunile glomerulare și de obstrucția dată de procesul tumoral. Clinic se manifestă prin proteinurie și sindrom nefrotic.

Manifestările gastrointestinale sunt reprezentate de enteropatiile cu pierdere proteică, malabsorbția (în tumorile hepato-biliare și gastrice), de anorexie (în majoritatea tumorilor în fază generalizată) și de o serie de alte tulburări determinate de modificările de tranzit în cazul localizărilor tumorale din sfera tubului digestiv.

Cașexia canceroasă este starea evolutivă finală a bolii canceroase, la care se ajunge în mod excepțional, deoarece animalele de abator se vor sacrifica atunci când se stabilește diagnosticul de incurabilitate, iar la animalele de companie (câine, pisică și uneori cal) se recurge, din considerente umanitare, la eutanasie. Cașexia se manifestă clinic prin slăbirea progresivă, uneori fără a fi însoțită de anorexie; treptat animalul devine adinamic, cu musculatura puternic emaciat, cu evidențierea proeminențelor osoase. Este mai des întâlnită la câini și pisici și îndeosebi atunci când localizările tumorale sunt la tubul digestiv și ficat. În aceste cazuri la spolierea energo-proteică și mai ales toxică neoplazică se adaugă lipsa de aport nutritiv sau hidric, fiind împiedicată ingerarea sau digerarea furajelor.

1.5. DIAGNOSTICUL TUMORILOR GLANDEI MAMARE

1.5. BREAST TUMOR DIAGNOSIS

Boala canceroasă este cea mai răspândită maladie, ocupând locul doi ca frecvență la om, după afecțiunile cardiovasculare. Reprezintă o problemă social-medicală greu de abordat datorită evoluției de foarte multe ori incontrolabile a bolii și a rezultatelor inconstante sau contradictorii, cu numeroase efecte terapeutice secundare negative. Diagnosticul oncologic reprezintă procesul prin care se stabilește cu certitudine prezența bolii canceroase într-un organism și presupune o serie de etape obligatorii și succesive, corelând tehnici de investigație multidisciplinare. În comparație cu alte stări patologice, în cazul bolii canceroase nu este suficient să se certifice prezența bolii, deoarece în stabilirea unui protocol terapeutic trebuie să se țină cont de aspectul multidisciplinar al tratamentului. Obiectivele urmărite în activitatea de diagnosticare a cancerului sunt:

Localizarea procesului tumoral;

Evaluarea extensiei tumorale;

Determinarea tipului de tumoră (histologic) și stadializarea clinică;

Decelarea unor afecțiuni coexistente cu procesul tumoral.

În stabilirea diagnosticului este obligatorie parcurgerea a trei etape. Prima etapă este reprezentată de strângerea tuturor datelor clinice (anamneză, examene clinice generale și speciale), a doua etapă, de verificare, prelucrare și analiza datelor culese și ultima, etapa concluziilor, ce echivalează cu diagnosticul pozitiv, această etapă hotărăște terapia ce va fi aplicată și prognosticul.

1.5.1. Examenul clinic

La baza examenului clinic al animalului canceros stă anamneza, care decurge din dialogul purtat cu proprietarul, precum și din semnele clinice observate de către medicul veterinar oncolog la animalul suspect. Prin examenul clinic tumorile se vor diferenția față de alte procese proliferative (inflamatorii sau cicatriceale) și se vor avea în vedere afecțiunile precancerigene care, de asemenea, trebuie diferențiate prin examen cito-histologic. Prezența cancerului la animale este semnalată de o serie de leziuni după cum urmează:

 Proliferări anormale cu dezvoltare continuă și care afectează în special nodulii limfatici;

 Inflamații și răni persistente;

 Sângerări sau supurații repetate din nas, gură, uretră, vagin sau rect;

 Miros neplăcut al aerului expirat;

 Tulburări de masticație și deglutiție;

 Dificultăți respiratorii, de urinare sau de defecare;

 Ezitarea mișcării și oboseala;

 Reducerea apetitului și a greutății corporale;

 Șchiopături persistente sau rigiditatea în mișcări;

 Umflături în zona mamară;

1.5.1.1. Anamneza sau ancheta clinică reprezintă o etapă cheie în stabilirea diagnosticului oncologic, fiind prima fază obligatorie a examenului clinic obiectiv. Reprezintă o anchetă prin care sunt adunate informații privind momentul depistării de către proprietar a formațiunii suspecte sau a simptomelor funcționale determinate de ea, ritmul modificării formei, dimensiunilor sau agravării stării animalului, ce fenomene clinice au însoțit evoluția clinică, care sunt antecedentele familiale ale animalului. O anamneză corect luată furnizează informații importante cu privire la vechimea și evoluția tumorii și mai ales cu privire la factorii și condițiile cancerigene. În luare anamnezei trebuie avute în vedere mai multe elemente:

1. Stabilirea momentului apariției formațiunii suspecte (tumori superficiale) sau a tulburărilor funcționale (tumori profunde): rareori momentul depistării procesului tumoral corespunde cu cel real, aceasta fiind vizibilă macroscopic doar când populația celulară minimă de 109 celule la examenul clinic direct (Crânganu D., 2009).

2. Timpul de dublare a masei tumorale.

3. Ritmul de creștere al formațiunii: constantă sau variabilă în timp.

În stabilirea diagnosticului trebuiesc luate în vedere și câteva aspecte epidemiologice oncologice, cum ar fi date legate de alimentație, microclimat, igienă sau efort, dacă a mai fost bolnav și de ce a suferit, eventual ce tratamente a făcut, dacă în familia proprietarului sau la subiecți înrudiți au evoluat sau evoluează forme tumorale și ce tipuri sau dacă au decedat și după cât timp.

1.5.1.2. Inspecția constă în observarea vizuală a semnelor de boală pe toată suprafața corpului și a cavităților accesibile. Este imperios necesar de a efectua examenul în poziție statică cât și în mișcare, de aproape și de la distanță. Prin inspecție se urmărește culegerea semnelor clinice manifestate de animal și a oricărei modificări structurale anatomice, topografice, de zgomot (tuse, strănut) sau miros; furnizează informații în cazul unor formațiuni externe (examinarea zonei în care a fost depistată, forma, aspectul și culoarea acesteia). Se poate observa prezența sau absența necrozelor superficiale, a vaselor de neoformație, mai ales la animalele depigmentate. Tot la inspecție se poate observa culoarea formațiunii, cum este cazul tumorilor pigmentate: melanom, melanosarcom, mastocitom. Anemia demonstrată de paliditatea mucoaselor este un sindrom asociativ al bolii canceroase, ușor vizibil la inspecție. Tot la inspecție se mai poate observa prezența unei colorații icterice sau cianotice, se apreciază și frecvența respiratorie amplitudinea și ritmul dacă este constant.

1.5.1.3. Palpația presupune perceperea tactilă a semnelor clinice; asigură obținerea datelor legate de temperatură, sensibilitate, elasticitate, forma și dimensiunea unei formațiuni sau structuri, mobilitatea și consistența. Se efectuează metodic, sistematic, urmărindu-se punerea în evidență la nivelul unor formațiuni suspecte și în zonele din imediata vecinătate (țesut, limfocentru) a unor aspecte precum prezența sau lipsa durerii, consistența fermă sau elastică, uniformă sau nu, cu sau fără fluctuație, imposibilitatea mobilizării datorită aderenței la planurile superficiale sau profunde (se impune diagnostic diferențial față de inflamație). Trebuie avut în vedere faptul că în cazul unor modificări posibil neoplazice, palpația se v-a efectua superficial, de cât mai puține animale și mai ales de la periferie spre centru (în caz contrar se poate grăbi diseminarea celulelor, implicit metastazarea).

Deși diagnosticul palpatoriu implică o manoperă cu un oarecare grad de risc, este totuși o etapă absolut necesară a examenului clinic urmărind punerea în evidență la nivelul formațiuni suspecte și în cele din imediata vecinătate (țesut, limfocentru) a următoarelor aspecte și colectarea unor date foarte importante în stabilirea diagnosticului în cazul unei neoplazii: sensibilitatea locoregională, prezența sau absența durerii locoregionale, consistenta tumorii maligne, prezența sau imposibilitatea mobilizării datorită aderenței (la planurile superficiale (piele și țesut conjunctiv subcutanat) sau profunde necesitând diagnostic diferențial fata de inflamație), topografia tumorii primare, forma tumorii și dimensiunile tumorii primare.

1.5.1.4. Percuția permite interpretarea stării fizice a zonelor percutate, pe baza sunetelor rezultate prin vibrarea țesuturilor (sonul de percuție se v-a aprecia pe baza câtorva caracteristici precum înălțime, amplitudine, timbru, durată). Percuția se efectuează sistematic din aproape în aproape pentru a acoperi întreaga zona cu modificări. Sonurile pot fi înalte sau joase (în raport cu numărul de vibrații pe unitatea de timp), ample sau slabe, scurte sau lungi. Percuția topografică permite stabilirea modificărilor suferite de un țesut, cât și localizarea sau dimensiunea modificării. De aceea percuția se execută sistematic și comparativ de pildă în cazul tumorilor la nivel renal, hepatic sau la nivel de ganglioni mezenterici. Percuția palpatorie ajută la aprecierea sensibilității unei zone sau perceperea unor senzații tactile de rezistență.

1.5.1.5. Ascultația implică recepționarea acustică cu ajutorul stetoscopului a zgomotelor produse în corpul animalului atât în condiții normale cât și patologice (la nivel pulmonar, cord sau aparat digestiv), important este însă ca în timpul ascultației în spațiul unde se realizează examinarea să fie liniște, iar animalul să fie cât mai puțin agitat (la nevoie se poate recurge la tranchilizare) pentru a nu se înregistra sunete eronate care ar putea duce la derutarea celui care examinează animalul.

1.5.1.6. Termometria. Temperatura corporală poate fi apreciată subiectiv pe baza semnelor clinice exprimate de animal specifice sindromului febril, cât și prin palparea diferitelor arii corporale. Importantă este însă aprecierea obiectivă prin termometrarea animalului: temperatura corporală normală la câine oscilează între 38°C și 39°C, iar la pisică 38,5°C și 39,2°C, aceasta depinzând de vârsta animalului, știindu-se că la pui temperatura corporală în mod fiziologic este mai ridicată în comparație cu adulții. Pe lângă aceasta se poate aprecia palpatoriu temperatura locală la nivelul anumitor formațiuni. Sindroamele paraneoplazice, cu forme infectate, sunt însoțite de sindromul de hipertermie asociat cu stări de abatere, tahipnee, tahicardie, anorexie, tremurături musculare, horipilație.

1.5.2. Investigațiile paraclinice neinvazive

Diagnosticul imagistic joacă un rol important în managementul pacienților cu cancer. Diagnosticul prezumtiv, stadializarea clinică, chirurgia oncologică, radioterapia și eficiența tratamentului implică la un moment dat o evaluare imagistică, indiferent de metoda aplicată. În oncologia veterinară, radiografierea, ultrasonografierea, medicina nucleară și imagistica sub formă de secțiune transversală (tomografia computerizată (CT) și tomografia prin rezonanță magnetică (RMN)), reprezintă tehnici de rutină în diagnosticarea și controlul bolii canceroase. Alegerea uneia dintre metode este influențată de mai mulți factori, în primul rând de rezultatul scontat. Doi dintre factorii care determină alegerea unei metode sunt tipul tumorii și agresivitatea acesteia, factori ce ajută și la stadializarea clinică, tehnica imagistică fiind un real ajutor în realizarea biopsiilor, realizate pe parcursul tratamentului. Complexitatea și gradul de detaliere ale tehnicilor imagistice cunosc o creștere exponențială. Fiecare metodă prezintă avantaje și dezavantaje legate de costuri, disponibilitate, sensibilitate, specificitate sau detaliile (informațiile) oferite (anatomice și fiziologice).

1.5.2.1. Radiografierea

Radiologia convențională a stat la baza diagnosticului imagistic al cancerului foarte mulți ani, datorită accesibilității și costurilor reduse de operare. Oricum, în mod obișnuit, radiografierea este utilizată ca metodă de screening, adesea fiind asociată cu alte metode imagistice care pot diferenția și detecta mai bine extinderile și metastazelor tumorale, mai ales la nivel pulmonar. Principiul care stă la baza producerii imaginii radiografice este reprezentat de capacitatea țesuturilor de a absorbii în mod diferit radiația „X”, atunci când organismul este străbătut de un fascicul de raze „X”. În momentul expunerii o parte din radiație (fotoni) este reținută de organism, iar restul trece prin organism, neafectată. Nivelul radiației reținute este influențat de grosimea țesuturilor, densitatea acestora cât și de numărul atomilor din țesuturile pacientului. Razele „X” care nu sunt absorbite de organism sunt captate pe un film radiografic, determinând modificări chimice în structura acestuia, iar în urmă developării și procesării se va obține imaginea radiografică. Punctele forte ale radiografierii sunt reprezentate de imaginea în ansamblu oferită și remarcabila utilitate în diagnosticul afecțiunilor osoase. De asemenea radiografiile toracice și abdominale sunt folosite în screeningul limfoamelor la câini și pisici, determinând gradul de răspândire și acaparare a limfonodurilor pulmonare, inclusiv pulmonul, hepatice, splenice și abdominale. Marele dezavantaj al radiografierii îl reprezintă imposibilitatea diferențierii clare între structurile ce se suprapun. Acest neajuns este suplinit de utilizarea tomografierii computerizate sau a rezonanței magnetice, metode ce ofere imagini mai clare și cu un grad de detaliere ridicat, în cazul diagnosticului imagistic din zona capului.

1.5.2.2. Tomografia computerizată

Asemenea radiografierii, tomografia computerizată se bazează pe același principiu, diferența de densitate dintre țesuturile ce alcătuiesc organismul. Comparativ cu radiografierea, tomografierea computerizată produce imagini sub forma unor secțiuni prin corpul pacientului, eliminându-se inconvenientul suprapunerii organelor. Fiind o imagine generată digital, gradul de detaliere și diferențiere este net superior unei radiografii. Radiografierea este utilizată în mod curent în screeningul tumorilor primare cât și a metastazelor pulmonare, mediastinale sau ale coastelor, deși calitatea imaginilor obținute prin TC este superioară, din considerente financiare cât și din indisponibilitate. TC este extrem de utilă atât terapiei chirurgicale cât și planificarea radioterapiei. Deși RMN-ul realizează o mai bună diferențiere tisulară, TC este modalitatea des utilizată în planificarea radioterapiei, datorită simplului fapt că prin această metodă nu se produce distorsionarea imaginii și se poate determina precis densitatea unui țesut, valoare necesară computerelor pentru a determina dozele și categoria de raze utilizată. Comparativ cu radiografierea, TC este mai sensibilă, identificându-se cu ușurință nodulii pulmonari, limfadenopatiile mediastinale sau diferite neoformații la nivel mediastinal sau pleural. Din acest considerent este recomandată utilizarea TC diagnosticarea tumorilor pulmonare primare și evaluarea extinderii metastatice intratoracice și a limfadenopatiilor traheobronșice. Utilizarea substanțelor de contrast mărește aria vizibilității extinderii tumorale. Imaginile obținute prin asocierea TC cu substanțe de contrast prezintă o importanță deosebită în detectarea extinderilor tumorale mai ales atunci când sunt asociate cu sarcoame ale țesuturilor moi, mai ales la pisici unde pot apare sarcoame ca reacție postvaccinală.

1.5.2.3. Ultrasonografia

Este o tehnică neinvazivă și nedistructivă, bazată pe ecogenitate, capacitatea țesuturilor de a reflecta în mod diferit, în funcție de densitate, impulsurile sonore cu lungime de undă ultrascurtă. Impulsurile sonore reflectate sunt preluate de componenta traductoare a sondei, prelucrate, apoi afișate ca imagini ale organului investigat. Imaginile obținute prin ultrasonografie sunt net superioare radiografiilor, mai ales în cazul efuziunilor de la nivel pleural sau peritoneal, când lichidele compresează organele. Metoda poate fi utilizată de nenumărate ori, nefiind adjuvantă în fenomenul invaziei sau metastazării tumorale, dar nu poate da informații privind natura histopatologică a tumorii, putându-se orienta doar puncție biopsică. Permite, totuși, diagnosticul diferențial față de chisturi, hematoame sau abcese. Îmbunătățirile aduse atât echipamentelor cât și substanțelor de contrast au determinat o creștere a specificității ultrasonografiei. Utilizând tehnica Doppler, este pusă în evidență vascularizația formațiunii tumorale, care, în general, este mai sinuoasă și cu o viteză mai mare de curgere a sângelui, comparativ cu vascularizația țesuturilor normale.

1.5.2.4. Rezonanța magnetică nucleară (RMN)

Asemenea TC, RMN produce imagini sub formă de secțiuni transversale, sagitale sau dorsale. În cazul TC imaginile secțiunilor sagitale și dorsale sunt produse prin reconstituite pe baza imaginilor transversale, în timp ce, în cazul RMN imaginile sunt obținute în timp real pentru oricare din planurile de secțiune, fără a fi nevoie de reconstituire. RMN-ul este o metodă imagistică tridimensională. RMN este o metodă imagistică avansată ce se bazează pe capacitatea atomilor de Hidrogen de a elibera energie, sub formă de fotoni, sub acțiunea unui câmp magnetic puternic. În medicina veterinară RMN este folosită, în special, în investigațiile ce vizează sistemul nervos central, furnizând imagini ale formațiunilor anatomice, mult mai detaliate decât cele obținute prin TC. RMN se pretează excelent investigării țesuturilor moi, utilă în investigările articulațiilor, tendoanelor, mușchilor și a măduvei osoase.

1.5.2.5. Medicina nucleară

Medicina nucleară de diagnostic sau scintigrafia, este o tehnică imagistică medicală bazată pe detectarea radiațiilor, cu ajutorul unui detector de radiații, emise de o substanță radioactivă (radionuclid) introdusă în organism, prezentând o afinitate deosebită pentru un organ sau un țesut. Identificarea formațiunilor tumorale se bazează pe adsorbția excesivă și diferențiată la acest nivel datorită metabolismului accentuat, ținându-se cont în alegerea radionuclidului de afinitatea lui pentru un anumit organ sau țesut. Imaginea scintigrafică oferă informații în primul rând funcționale și apoi anatomice; nu oferă detaliile structurale pe care le oferă radiografiile, motiv pentru care cele două metode sunt complementare. Sunt situații când scintigrafia este preferabilă și din punct de vedere al inofensivității, în practica oncologică se folosește curent pentru diagnosticul tumorilor tiroidiene, cerebrale, pulmonare, hepatice, suprarenale, renale, limfatice și osoase.

Cei mai utilizați radionuclizi sunt Technitium-99 (99Tc), trimidina tritiată și C14-leucina; radionuclizi cu proprietăți imagistice excelente și timp de înjumătățire scurt (6 ore pentru 99Tc). Medicina nucleară este o tehnică ideală pentru depistarea leziunilor interne, deși nu oferă informații clare despre etiologia bolii sau despre natura acesteia, de exemplu, formațiunile maligne și benigne pot prezenta aceeași imagine scintigrafică. Utilizând scintigrafia, metastazele osoase pot fi detectate în stadiu incipient, înaintea apariției semnelor clinice sau a depistării radiografice, se poate stabilii cu ușurință locul de elecție pentru efectuarea biopsiei. După identificarea leziunii se poate recurge la alte metode imagistice de investigare (ultrasonografie, radiografie).

1.5.2.6. Tomografia prin emisie de pozitroni

Tehnică de imagistică medicală bazată pe detecția radiațiilor asociate pozitronilor (particule elementare ușoare, de aceeași masă cu electronii dar cu încărcătură pozitivă) emiși de o substanță radioactivă, introdusă în organism, care permite obținerea de imagini în secțiune (tomografii) ale unor organe. În engleză, Positrons Emission Tomography (PET). Tomografia prin emisie de pozitroni (T.E.P.) permite obținerea în câteva secunde a unei imagini în secțiune, ceea ce face din ea un instrument deosebit de adecvat pentru observarea fenomenelor fiziologice ca: debitul sau volumul sangvin, metabolismul glucozei sau al oxigenului, sinteza proteinelor, etc. Această tehnică este utilizată, în principal pentru examinarea inimii și creierului, dar sunt posibile și examinările oaselor, rinichilor și plămânilor.

Comparând celule tumorale cu celulele normale, se observă că celula canceroasă utilizează glucoză în cantități mai mari, ceea ce face ca glucoza sa fie o moleculă-candidat ideală pentru modificare și marcare cu un radionuclid emițător de pozitroni. Satisfacerea necesarului de energie al unei formațiuni tumorale se face prin creșterea cantității de hexoz-monofosfat, a proteilor membranare de transport a glucozei și a hexokinazei. Un anaolog al glucozei, fluorodeoxiglucoza (18-FDG), se comportă asemănător moleculei de glucoză, este legat și transportat de proteinele membranare și este supus fosforilării sub acțiunea hexokinazei la nivel celular. Orișicum, FDG fosforilată nu intră în circuitul glicolitic și rămâne blocată la nivel celular unde se acumulează, celule tumorale fiind deficitare în glucoz-6-fosfatază, enzimă necesară transformărilor ulterioare. Acumularea diferențiată de FDG a celulelor tumorale constituie una din metodele de obținere a imaginilor TEP. Tehnologia TEP-FDG a fost folosită pe scară largă în medicina umană, în special pentru depistarea metastazelor la distanță.

1.5.2.7. Tomografia de emisie prin foton unic

În engleză „Single photon emission computed tomography” (SPECT), este o formă a imagisticii medicinii nucleare tomografice ce utilizează raze gamma. Este asemănătoare medicinii nucleare convenționale, însă se obține o imagine tridimensională. Imaginile furnizate sunt sub formă de secțiuni prin corpul pacientului, ce pot fi rapid manipulate și reorganizate după cerințe.

1.5.3. Investigațiile paraclinice de depistare a tumorilor maligne și a metastazelor

În această categorie de investigații intră acele metode care în general au la bază examenul citologic direct și care de fapt completează examenul clinic indirect. În prezent se dispune de o varietate foarte largă de mijloace paraclinice, cum ar fi citodiagnosticul exfoliativ (pe material provenit din produse de secreție) sau citodiagnosticul prin puncție tumorală. Citodiagnosticul nu se substituie biopsiei, ci ambele metode se completează reciproc și trebuie să se asocieze între ele.

1.5.3.1. Examenul citopatologic

Examenul citologic presupune examinarea individuală a celulelor dintr-o probă, fără a se raporta la aspectul structural al țesuturilor din care provin. Deși examenul citologic nu înlocuiește biopsia excizională sau examenul histopatologic, servește ca o metodă rapidă, cu costuri reduse, de a stabilii un diagnostic, în unele cazuri putând fi superioară examinării histologice (măduva osoasă sau în anumite condiții chiar și limfonodulii). Probele folosite în examinarea citologică provin din formațiuni cutanate sau subcutanate, fluide cavitare, exsudate, limfonoduli, măduva osoasă, mucoase (mucoasa tractusului respirator, conjunctivală, rectală, vaginală), urină și, cea mai frecventă sursă, sângele venos. Echipamentul necesar efectuării examenului citologic este minimal fiind necesare câteva ace de seringă, seringi, lame pentru microscop, substanțe pentru fixare și colorare (kit-uri rapide), ulei de imersie și un microscop cu obiectiv de imersie; scopul acestei tehnici este de a obține preparate rapid, corect etalate, în strat subțire, fără a distruge (sparge) celulele sau a le aglomera.

Recoltarea probelor Tehnica utilizată pentru recoltarea probelor în vederea executării examenului citologic este aleasă în funcție de zona corporală din care se face recoltarea și tipul de proba recoltată. Tehnici utilizate:

– puncția aspirativă cu ac fin; tehnică recomandată în cazul tumorilor inaccesibile biopsiei sau când aceasta este contraindicată (exsudate cavitare, tumori mamare, hepatice, pulmonare, splenice sau limfonodulare);

– raclarea este utilizată pentru obținerea probelor de pe suprafețe ferme, cum ar fi în cazul mucoasei conjunctivale sau leziunilor cutanate. Se realizează cu lame de bisturiu sau cu spatule, iar raclatul este etalat pe lame de microscop. Preparatele obținute prezintă numeroase celule distruse, însă rămân numeroase celule pentru a putea stabili un diagnostic.

– tamponarea (tampoane sau bețișoare cu vată) este utilizată pentru obținerea probelor de pe mucoase (nazală, rectală, vaginală). După tamponarea mucoaselor, tamponul este trecut și răsucit pe lama de microscop.

– amprentarea este utilizată pentru leziunile cutanate și țesuturile îndepărtate chirurgical sau la necropsie. Amprentările din leziunile cutanate au valoare de diagnostic mică pentru ca acestea conțin celule inflamatorii și contaminanți.

Examinarea frotiurilor. Inițial preparatele trebuie examinate cu un obiectiv de putere mică, astfel cel care examinează poate evalua cu ușurință densitatea celulară, tipul celulelor din câmp, stadiul acestora și identifica zonele de interes pentru studierea la puteri mai mari. Preparatele tisulare (lamele) trebuie examinate pe întreagă suprafață a lamei, astfel încât nici o celulă să nu rămână neexaminată, inclusiv cele din zonele cu strat gros cu celule aglomerate dar corect colorate și întregi. Când este folosit obiectivul de imersie poate fi identificat exact tipul celular, caracteristicele celulelor (cum ar fi prezența nucleolilor) pot fi ușor identificate și se pot căuta și observa diferite microorganisme. Examinarea este urmată de o descriere completă și interpretare a preparatului. Descrierea ar trebui sa includă informații despre densitatea celulară, tipul celular predominat și caracterele morfologice ale fiecărui tip de celulă, structură și microorganism examinate. Prin interpretarea trebuie să se decidă dacă este vorba de un proces inflamator sau de unul neoplazic și în cele din urmă tipul acestuia.

Celularitatea obișnuită a preparatelor citologice. Eritrocitele: hematiile din preparatele citologice sunt asemănătoare celor din frotiurile cu sânge periferic, deși pot prezenta alterare morfostructurală. Hematiile apar ca urmare a distrugerii vaselor capilare secundar manoperelor de obținere, contaminării cu saânge proaspăt (prezența trombocitelor) sau datorită hemoragiilor tisulare, acestea fiind depistate prin prezența macrofagelor, ce au fagocitat eritrocitele sau conțin. Celule inflamatorii În majoritatea cazurilor, cu cât numărul celulelor inflamatorii este mai mare, cu atât șansele ca leziunea să fie de tip neoplazic sunt mai mici. Ca excepție de la această regulă o reprezintă carcinomul cu celule scuamoase, care prin evoluție determină procese inflamatorii.

Neutrofilele din procesele non-inflamatorii sunt prezente într-un număr redus și prezintă aceleași caracteristici cu cele din sângele periferic.

Limfocitele sunt prezente într-un număr mic în majoritatea preparatelor citologice cu excepția probelor prelevate din țesuturile limfoide și din leziuni ale vaselor limfatice sau neoplazice (limfoame).

Celulele plasmatice sunt specifice inflamațiilor cronice. Prezența acestora sugerează producerea de anticorpi ca urmare a stimulării antigenice.

Macrofagele tisulare

Eozinofilele apar în preparatele de pe mucoase, din leziuni ce apar ca reacții alergice și într-un număr foarte mare în aspiratele din tumorile mastocitare.

Mastocitele sunt aproape întotdeauna celulele majoritare în preparatele citologice din tumorile mastocitare.

Celule non-inflamatorii și necanceroase: din această categorie fac parte tipuri de celule ce intră în structura normală a țesuturilor organismului (celule epiteliale, celule mezenchimale).

Descrierea și interpretarea formelor celulare observate. Pentru a putea interpreta corect rezultatele examenului citologic este important a se stabili mai întâi dacă este vorba de un proces neoplazic sau unul inflamator și tipul neoplaziei sau inflamației prezente. Stabilirea diagnosticului de tumoare se bazează pe identificarea celulelor cu caracteristici maligne sau a altor tipuri de celule decât cele normal găsite în țesuturile analizate. Spre exemplu, în aspiratele limfonodale nu ar trebui să se găsească celule epiteliale. Dacă morfologia celulară sugerează că este un proces neoplazic, atunci putem vorbi de o tumoare cu aspect difuz, o tumoră cu origine epitelială sau o tumoare cu origine conjunctivală. Neoplaziile, în special carcinoame cu celule scuamoase, pot induce și un proces inflamator, astfel în preparatele citologice se pot identifica atât procese neoplazice, cât și inflamatorii.

Criterii celulare ale malignității. Prezența unuia dintre caracterele neoplazice, nu atestă existență unei tumori, cum nici toate tumorile nu prezintă toate tipurile de modificări tumorale ce pot apare. Unele criterii de malignitate sunt specifice doar anumitor tipuri tumorale. Ca regulă generală, este necesară identificarea doar câtorva criterii ale malignității pentru a se stabilii diagnosticul de proces neoplazic.

1. Modificări nucleare: creșterea activității nucleare (creșterea replicării), anizocarioză, raport nucleu-citoplasmă crescut, anormalități de condensare a cromatinei, numeroși nucleoli măriți și cu forme neregulate;

2. Criterii citoplasmatice: creșterea bazofiliei și vacuolizare (apare în tumorile epiteliale, atestând o creștere rapidă și degenerare celulară);

3. Criterii morfologice: unele celule neoplazice pot devenii foarte mari; în unele situații celulele neoplazice epiteliale în timpul procesului de replicare nu se mai divid, rezultând un lanț lung de celule interconectate.

1.5.3.2. Examenul histopatologic

Diagnosticul de certitudine al unei tumori, ca de altfel al oricărei modificări de structură a unui organ sau țesut, se face prin examinarea la microscop a unui fragment din organul examinat, sau din tumora supusă examinării, examen numit examen histopatologic (sau examen anatomopatologic). Pentru aceasta este nevoie de un fragment din tumoră, (sau organ) obținut prin puncție biopsică sau din întreaga tumoră ce a fost extirpată chirurgical (biopsie excizională). Acest fragment este secționat în felii foarte subțiri de țesut, de ordinul micronilor, etalate pe o lamă de sticlă, colorate special și examinate la microscop, astfel încât prin analizarea aspectului celulelor ce alcătuiesc țesutul examinat se poate afirma cu certitudine diagnosticul: modificări benigne (necanceroase) sau maligne (cancer). De asemenea și aceste două clasificări pot fi și mai mult împărțite în diverse grade de modificare a structurii tisulare. Întreg procesul de diagnosticare histopatologică presupune prezența unei aparaturi speciale: microtom, criomicrotom, procesor de țesuturi, termostat, s.a.. Fără un examen histopatologic nu se poate pune un diagnostic de certitudine și nu se poate începe tratamentul.

Biopsia. Pentru executarea biopsiei sunt disponibile mai multe tehnici, alegerea uneia dintre metode depinde de localizarea anatomică a formațiunii, starea generală a pacientului, rezultatele testelor efectuate până la momentul biopsiei și, bineînțeles, preferințele medicului. Tehnicile de biopsie sunt grupate în două categorii: biopsia premedicativă (furnizează informații ce ajuta la stabilirea unui scheme terapeutice) și biopsia excizițională (se referă la procesul de obținere de informații histopatologice consecutiv îndepărtării formațiunii tumorale). Utilizarea biopsiei exciziționale este recomandată atunci când se dorește o imagine completă a procesului tumoral (grading, subtip histologic, grad de necrozare, nivel de răspândire, etc.) și este o oportunitatea de a evalua corectitudinea exciziei. Deși mulți medici veterinari preferă biopsia excizițională pentru că obțin într-un singur pas materialul pentru examenul histopatologic și tratarea pacientului, adesea se întâmplă ca tumora să nu fie îndepărtată complet, tumora recidivează, fiind necesar tratament adjuvant (radioterapie, chimioterapie) sau o altă intervenție chirurgicală pentru o excizare mai mare, ceea ce va duce la sechele și costuri mai mari. Astfel de situații pot fi evitate prin efectuarea unei biopsii premedicative, astfel obținându-se informații ce vor orienta medicul către un protocol eficient. Există situații când biopsia premedicativă este contraindicată (tumori testiculare, splenice, ale măduvei osoase, Sticker), fiind preferată biopsia excizițională.

Metode de executare a biopsiei:

Biopsia cu ac-trocar este utilizată pentru obținerea probelor din țesuturile moi. Acele utilizate sunt acționate manual, mecanic (arcuri atașate) sau pneumatic. Această tehnică este utilizată cu preponderență în tumorile cu localizare externă și cele care pot fi palpate de la exterior.

Biopsia țintită (punch biopsy): utilizează instrumente asemănătoare unei dalte, cu porțiunea tăietoare în formă cilindrică. Această tehnică furnizează probe subțiri de pe o suprafață mare, putând fi utilizată în tumorile situate superficial (la nivelul pielii, perianal), sub pielea intactă sau în cavitatea bucală. În tumorile situate sub pielea intactă este necesară practicarea unei incizii. Locul de elecție este pregătit în mod asemănător biopsiei cu ac-trocar.

Biopsia incizițională: această tehnică este utilizată mai ales în formațiunile tumorale exofitice (localizare externă, vegetante, fără tendințe de pătrundere în profunzime), ulcerate sau necrozate, furnizând probe suficient de mari, adesea efectuându-se fără o anestezie locală sau sedare, zona de interes fiind slab sau deloc inervată. Tehnici biopsice specializate: biopsia endoscopică, biopsia laparoscopică și toracoscopicăși biopsia ghidată imagistic.

Biopsia excizițională este recomandată atunci când protocolul terapeutic nu ar diferii dacă s-ar cunoaște exact timpul tumorii (benignă sau malignă (tumori ale pielii, tumori solitare pulmonare, splenice sau tumori ale testiculelor)), aceasta se află în stadii incipiente, este de dimensiuni mici și poate fi exciziționată fără să compromită planurile tisulare profunde. Trebuie să fie urmată rapid, ulterior diagnosticului histopatologic, de excizia largă cu limfadenectomie satelită, dacă aceasta se impune. Este o metodă care reduce considerabil costurile medicale, realizându-se concomitent tratarea și obținerea probelor pentru diagnostic.

Fixarea. Fixarea reprezintă un complex de reacții chimice, care blochează procesele enzimatice, respectiv autolitice și previn invazia microbiană. Fixarea are rolul de a conserva starea țesutului în momentul recoltării. Fixarea se fac cu ajutorul fixatorilor fizici (prin inghețare), chimici simpli sau compuși (preparați după rețete speciale). Cel mai frecvent fixator chimic utilizat este soluția de formaldehidă 10%, care păstrează structura preparatelor, are o penetrabilitate buna și formează puține precipitate. Dacă piesele nu pot fi fixate prin metodele amintite, se poate recurge la refrigerarea lor (40C) timp de 24 de ore.

1.5.4. Examenul biochimic

Constă în determinarea unor parametri biochimici din sânge și celulele tumorale.

Dintre parametri biochimici investigați în diagnosticarea tumorilor, un rol important îl au glicoproteinele plasmatice care prin determinrile calitative și cantitative pot constitui markeri serici care să ajute specialistul la orientarea unei decizii în ceea ce privește tumorile mamare.

Antigenele tumorale nu sunt prezente de la început în toate celulele tumorale, iar celula nu devine malignã, fãrã sã dobândeascã markerii distinctivi de malignitate.

Translocarea glicoproteinelor este un proces care joacă un rol foarte important în transformarea celulelor normale în celule tumorale cu caracter malign, deoarece proteinele chaperoni din catenele polipeptidice nou sintetizate nu se pliază corespunzător, suferind un proces de rearanjare.

Rearanjările incorecte pot conduce la modificări moleculare cu tendință de transformare celulară (Alitalo K., 1987).

1.6. PROFILAXIA TUMORILOR GLANDEI MAMARE

1.6. PREVENTION MAMMARY GLAND TUMORS

Tumorile sunt foarte greu de eliminat în totalitate si se raspandesc rapid in organism.

Printre măsurile de profilaxie cele mai în măsură să reducă incidența tumorile glandei mamare la cățea și pisică sunt:

să se evită pe cît posibil achiziția de pui proveniți din împerecheri incestuoase sau din părinți care au suferit de diferite oncopatii;

evitarea expunerii prelungite la radiațiile ultraviolete;

asigurarea unei alimentații corecte adaptată rasei, vârstei, sexului și diversificată din punct de vedere cantitativ și calitativ pentru a preîntâmpina obezitatea;

combaterea sedentarismului;

eviatrea folosirii contraceptivelor, ele fiind doar o soluție de moment, dar complică întotdeauna situația mai târziu;

eviatrea tratamentelor hormonale de întrerupere a ciclului estral precum și a excesului de estrogeni;

evitarea medicației progestative, utilizată pe termen lung, pentru inhibarea estrului sau pentru tratamentul unor probleme de comportament care mărește semnificativ riscul de apariție a tumorilor glandei mamare;

controale periodice pentru fiecare femelă care a depășit vârsta de 6 ani pentru a depista din timp eventualele formațiuni tumorale;

sterilizarea chirurgicală a pisicuțelor și a cățelușelor; castrarea efectuată după diagnosticul tumorii nu influențează timpul de supraviețuire.

Soluția ”să facă pui măcar o dată …” este doar o anecdotă, nu are baze științifice și este contraproductivă (Horvath A., http://www.doctor-horvath.ro/ ).

1.7. TERAPIA TUMORILOR MAMARE LA CARNIVORE

1.7. THERAPY IN MAMMARY TUMORS OF CARNIVORES

Lupta contra cancerului a devenit, și pentru medicina veterinară, o realitate. Tratamentul în cancer trebuie considerat ca o componentă a luptei contra cancerului și nu ca o atitudine în sine.

Terapia anticanceroasă are drept scop scăderea incidenței maladiei, precum și a morbidității și mortalității asociate, făcând apel la 4 principale metode de abordare: prevenire, identificare precoce, tratament și îngrijiri paleative.

Proiectată inițial după coordonatele oferite de medicina umană, oncologia clinică veterinară din România își dezvoltă astăzi o strategie și un cadru metodologic propriu, definindu-se în baza practicii și experiențelor acumulate. Iată de ce prezentul capitol se referă doar la o mică parte a problematicii terapiei cancerului la animale, urmând a ne adresa celor interesați cu noi date bazate pe aceleași principii. De ce cancerul mamar la cățea și pisică? Pentru că animalele de companie și-au câștigat un loc deosebit în viața noastră de zi cu zi, având nevoie de o îngrijire atentă și corectă, și pentru că boala canceroasă este la fel de misterioasă, perfidă și frecventă ca și în cazul omului.

Lipsa unei experiențe largi în domeniul terapiei tumorilor solide, precum și necunoașterea în amănunt a răspunsului la terapie, ne-au determinat să dezvoltăm modalități optime de abordare terapeutică a tumorilor mamare la carnivore. În tratamentul cancerului mamar, prima metodă instituită și evaluată în ordine istorică a fost metoda chirurgicală, mastectomia, fiind modalitatea considerată „etalonul de aur" pentru formele cancerului mamar invaziv primar.

Recunoașterea faptului că boala canceroasă reprezintă o boală sistemică, adesea diseminată în momentul diagnosticului, a dus la modificarea modalității de abordare terapeutică și a limitat aplicarea metodei chirurgicale la cazurile cu boala loco-regională. Astăzi, în terapia cancerului, se vorbește de „trial clinic" de terapie, întrucât nici una din modalitățile de luptă împotriva cancerului, chirurgia, radioterapia, chimioterapia sau imunoterapia, luate singular, nu pot oferi un control corespunzător al bolii.

1.7.1. Chirurgia oncologică

Și la animale exereza chirurgicală rămâne și în prezent terapeutica cea mai eficace și cel mai mult verificată pentru multe oncopatii tumorale benigne și maligne. Chirurgia ocupă locul prioritar în istoria tratării bolii canceroase, rolul și locul pe care-l ocupă în prezent, în complexul terapeutic, evident s-a schimbat radical, atribuindu-se scopuri și obiective tot mai precise, după care se poate clasifica în: chirurgie oncologică preventivă, curativă, de diagnostic, paleativă și citoreductivă.

Chirurgia preventivă

Are două categorii de indicații:

extirparea leziunilor (ulcere, calozități, cicatrice cheloide etc.) care intră în categoria stărilor  precancerigene, a tumorilor benigne și a celor premaligne “in situ”, prevenind astfel malignizarea lor.

extirparea unui țesut sau organe care, prin funcția lor perturbată, pot favoriza apariția unei tumori, ca de exemplu ovario-histerectomia pentru prevenirea cancerului mamar la cățea sau sunt susceptibile la cancerizare.

Chirurgia curativă

Are ca obiectiv extirparea totală a tumorii. Se aplică la cazurile cu tumori accesibile chirurgical și fără metastaze. După timpul în care este aplicată, poate fi primară și secundară (după iradiere sau chimioterapie). Se mai vorbește de o chirurgie a recidivelor (când se aplică la cazurile cu recidive) și a complicațiilor după iradiere. Este cea mai complexă și se individualizează ca tehnică la fiecare caz.

Chirurgia paleativă

Se rezumă la prevenirea, ameliorarea sau înlăturarea simptomelor ce apar consecutiv prezenței tumorii și la prelungirea fără suferință a vieții animalului. Acest scop s-a urmărit la pisică și cățea ce prezintă tumori mamare, sângerânde sau supurante, la care proprietarul nu a acceptat eutanasia.

Chirurgia exploratoare și diagnostică

Este de importanță deosebită pentru precizarea diagnosticului și uneori a stadiului evolutiv. Se execută preoperator sau preterapeutic, când constă în efectuarea biopsiilor tumorale și a unor căi de acces pentru explorare.

Chirurgia citoreductivă

Are ca scop reducerea masei tumorale pentru a ușura aplicarea și a mări eficiența altor mijloace terapeutice.

1.7.2. Chimioterapia

În oncologia veterinară clinică chimioterapia este limitată la ultimele 3-4 decenii, interesând aproape în exclusivitate câinele și pisica. Motivul acestei limitări este în primul rând de ordine conomic, deoarece majoritatea chimioterapicelor sunt scumpe, și în al doilea rând este generat de atitudinea proprietarilor față de animalul bolnav de cancer, concretizată prin dorința de a se recurge la eutanasie sau la sacrificare, atunci când nu se poate trata chirurgical și vindeca într-un timp scurt. O relativă actualizare a chimioterapiei, este datorată descoperirii unor noi produse mai eficiente și mai puțin toxice, și de creșterea cazurilor diagnosticate cu oncopatii pretabile la tratamentul chimioterapic. Desigur că la această actualizare a contribuit, poate în cea mai mare măsură, și educația proprietarilor, lărgirea orizontului lor de cunoaștere a problemei. Trebuie recunoscut faptul că, deși există multă literatură veterinară cu privire la utilizarea în clinică a chimioterapiei, nu există studii temeinice cu privire la evaluarea rezultatelor pe trialuri de cazuri și, de asemenea, nu există metodologii proprii, cele existente în majoritate au fost extrapolate de la om.

Principalele tipuri de citostatice și mecanismul general de acțiune

Citostaticele fac parte din categoria medicamentelor care, administrate la câțea și pisică, împiedică proliferarea celulelor tumorale. Se recunoaște că nu există nici un produs cu activitate selectivă numai asupra celulelor tumorale, efectul citostatic fiind datorat doar particularităților  biologice ale acestor celule față de cele normale. Mecanismul de acțiune al tuturor citostaticelor este la nivel celular și molecular, unde fie că intervin în metabolismul celular și produc blocarea diviziunii, fie că intervin direct în oprirea sintezei de proteine și de acizi nucleici, și ca urmare se împiedică proliferarea neoplazică și/sau se distrug celule tumorale.

Citostaticelor se împart în două mari grupe:

cu mecanism de acțiune molecular

cu mecanism de acțiune celular

Citostaticele cu mecanism de acțiune molecular la rândul lor se împart în:

a. citostatice care interferează cu biosinteza de ADN, ARN și de proteine.

b. citostatice care interferează cu replicarea, transcrierea și translația, fără a afecta sinteza denucleotide, reprezentate în principal de agenți alchilanți și de o parte din antibioticele antitumorale.

c. agenți care interferează cu fusul mitotic, reprezentați prin alcaloizi din plante și derivații lor.

Citostatice cu mecanism de acțiune celular la rândul lor se împart în:

a. ciclodependente, care acționează distructiv asupra celulelor pe toată durata ciclului celular, fără să acționeze asupra celulelor aflate în faza de repaus;

b. fazodependente, acționează numai asupra celulelor dintr-o anumită fază a ciclului celular.

Un al treilea criteriu de clasificare are în vedere slectivitatea acțiunii, care din păcate nu estenumai atributul citostaticelor hormonale naturale sau sintetice (glucocorticoizii, estrogenii, compușii sintetici progestativi, androgenii și antihormonii). Baza biologică a sensibilității sporite la acțiunea chimioterapicelor a celulelor tumorale este dată de faptul că acestea, spre deosebire de celelalte țesuturi au în permanență o mare populație celulară aflată în ciclu.

1.7.3. Imunoterapia

Este definită ca o modalitate terapeutică realizată prin stimularea activității mecanismelor imune ale organismului gazdă în vederea sistării, respingerii sau regresiei pe cale imunologică a procesului neoplazic. Actualizarea imunoterapiei cancerului este determinată de noile progrese realizate înimunologia oncologică și de rezultatele optimiste obținute în tratamentul mai multor tumori la animale. La acestea se adaugă și faptul că cele trei modalități clasice de tratament (chirurgia, radioterapia, chimioterapia) au ajuns la o limită de la care, cel puțin acum, nu se mai întrevăd progrese. Tratamentele clasice chirurgicale sau iradiante nu au reușit să atingă rata scontată devindecări, decât în fazele incipiente ale cancerului, recunoscut fiind faptul că prin exereză sau iradiere nu se poate realiza o „sterilizare a cancerului”, aceasta deoarece peste 50% dn formele clinice manifestate sunt cu metastaze.

Chimioterapia este toxică și, de asemenea, cu eficiență limitată; în majoritatea neoplaziilor se instituie alterarea imunocompetenței, care crește proporțional cu creșterea masei tumorale, iar modalitățile terapeutice clasice, mai ales radio și chimioterapia, sunt imunodepresive. De asemenea, rezultatele obținute cu o serie de imunostimulatori chimici sintetizați, precum și cu interferonul, factorul de necroză al tumorii și cu anticorpii factorului de creștere tumorală determină intensificarea cercetărilor în acest domeniu. Recent s-a introdus în practică imunoabsorbția de complexe imune circulante de la pacienți cu tumori progresive, care s-a dovedit eficientă în refacerea echilibrului imunologic. Ontogeneza imunității și interacțiunile imunologiei între procesul tumoral și organismul gazdă sunt complexe, implicând o serie de mecanisme celulare specifice. În prezent sunt dovezi clare că tumorile se comportă ca elemente străine de organismul gazdă, elaborând antigeni cu o specificitate particulară, capabili de a declanșa reacții imunologice. Acești antigeni tumorali au putut fi identificați și se încearcă utilizarea lor pentru diagnostic și terapie.

În ultimele două decenii s-au adus importante clarificări cu privire la mecanismul imunoterapiei active nepecifice și s-au introdus și definit termeni noi. S-au identificat un număr mare de „agenți imunostimulatori nespecifici” care, datorită efectelor bivalente de stimulare sau supresie în raport de doză, de condițiile de administrare și a ariei lor de acțiune, au fost denumiți „imunomodulatori” sau „modulatori ai răspunsurilor imune”.

În ultimii ani s-a introdus și termenul de „modificatori ai răspunsului biologic”, termen cu sens mult mai larg care „cuprinde totalitatea agenților terapeutici care modifică raporturile dintre tumoră și organismul gazdă, în special prin modificarea răspunsului biologic al gazdei față de celulele tumorale în scopul obținerii unui rezultat terapeutic benefic. În această categorie intră agenții terapeutici care (după Chirigos M. A., Talmadge J. E., 1985, Herberman R.B., 1985) au următoarele acțiuni:

a. creșterea răspunsului antitumoral al organismului gazdă prin augmentarea și/sau refacerea mecanismelor efectoare de apărare;

b. scăderea acelor reacții ale organismului care suprimă activitatea antitumorală (reacții supresoare);

c. creșterea directă a activității antitumorale prin administrarea unor efectori antitumorali sau a unor substanțe care ordonă intrarea în funcțiune a mecanismelor efectoare (mediatori);

d. creșterea sensibilității celulelor tumorale la mecanismele endogene de distingere sau de control al proliferării;

e. creșterea capacității organismului de a suporta mai ușor efectele de trimetale toxice ale tratamentelor oncovenționale, mai ales ale chimioterapiei și iradierii;

f. scăderea sau prevenirea transformării celulelor (malignizarea celulelor) și/sau creșterea reversiei, adică a diferențierii, a maturării celulelor canceroase, pentru a deveni benigne. Folosirea unor antigene puternice care să crească răspunsul imun al organismului față de alte antigene neînrudite a dus la introducerea termenului de „imunoadjuvanți” sau „adjuvanți ai imunității” și a termenului de „imunopotențializator” atribuit acelor agenți care potențează efectele imunologice ale altor agenți imunostimulatori sau imunogeni.

În prezent imunoterapia în cancer, după modalitățile de aplicare poate fi clasificată astfel: activă, pasivă, adoptivă și restaurativă.

Imunoterapia activă

Cuprinde procedeele terapeutice prin care se activează sau se stimulează sistemul imun al animalului bolnav. Pentru a se obține rezultate sunt necesare condiții imunologice specifice:

– tumora trebuie să fie antigenică și consecutiv să declanșeze reacții imunogene minime;

– organismul gazdă să fie imunocompetent, capabil să răspundă la încercările de stimulare sau de reactivare a mecanismelor de apărare imunologică. Imunocompetența este dependentă de masa tumorală existentă în momentul începerii tratamentului (cu cât aceasta este mai redusă, cu atât reacțiile imune antitumorale sunt mai eficiente) și de prezența factorilor imunodepresori generați de tumoră.

Imunoterapia pasivă

Cuprinde modalitățile de transfer de la un animal la care există sau sunt induse prin mijloace specifice, componentele imunității față de antigenele tumorale. Transferul imun se poate realiza fie prin ser sau anticorpi izolați din ser (seroterapie), fie prin celule imune efectoare (imunoterapie adoptivă). Seroterapia, deși a constituit promotorul ideii de imunoterapie, ea nu a intrat în practica curentă datorită, în primul rând, faptului că în multe cazuri s-a constatat o exacerbare a proliferării tumorale, la animalul tratat și, în al doilea rând, datorită dificultăților de obținere a serurilor cu anticorpi specifici antigenelor tumorale.

Imunoterapia adoptivă

Este o variantă a imunoterapiei pasive în care se recurge la transferarea de celule imune (limfocite, monocite) sau de produși celulari, molecule informaționale sau mesageri (factori detransfer, interferoni, ARN imun, interleukina-2, factorul de necrozare tumorală etc.) care transmit informația imună sau mesajul de activare celulelor efectoare ale organismului.

Imunoterapia restaurativă

Are ca scop restaurarea funcțiilor imunogene prin îndepărtarea factorilor supresori solubili, inhibarea celulelor supresoare (monocite, macrofage, limfocite T supresoare) și prin utilizarea unor agenți imunorestauratori naturali (hormonii și factorii timici), sintetici sau prin alte substanțe cu acțiuni similare hormonilor timici.

1.7.4. Radioterapia

Radioterapia, ramură bine definită a oncologiei terapeutice, se bazează pe utilizarea radiațiilor ionizante, care absorbite de țesuturi interacționează activitatea celulară, provocând fenomene citodistructive, care în mod contorlat pot fi folosite în scop terapeutic. În medicina veterinară utilizarea ei este încă relativ limitată, deși sub aspect istoric au același trecut.

Inițiatorul radioterapiei este considerat Eberlein R., care între anii 1906-1912 a publicat primele lucrări asupra utilizării ei la animale. Au urmat lucrările lui Little M. P. (1927) care a utilizat radioterapia în sarcomul țesuturilor moi și a adenocarcinomului la câine și cal. Cu toatea cestea, bazele științifice și practice ale radioterapiei în oncologie s-au pus în ultimii 30 de ani. În acest sens, pentru medicina veterinară o contribuție de seamă o aduc cercetările lui Pommer (1958) cu privire la cunoașterea efectelor biologice ale iradierii și se stabilesc adevărate protocoale de radioterapie a tumorilor la animale. Actualizarea radioterapiei în medicina veterinară este determinată, pe de o parte, de producerea unor izotopi radioactivi mai manevrabili, atât sub aspectul securității, cât și sub aspectul economic și, pe de altă parte, de succesul obținut în tratamentul unor neoplazii. În general, în ultimii ani tot mai multă atenție este acordată radiobiologiei, care are tot mai multe aplicații și în medicina veterinară.

Iradierea unui mediu biologic, indiferent de natura radiațiilor, se manifestă prin mecanisme de ionizare și de excitare moleculară ce interesează structurile critice ale sistemului biologic respectiv ale ADN-ului și ale membranei celulare, având consecințe directe asupra performanțelor de proliferare și de viabilitate. Leziunile pot fi directe, ca urmare a interacțiunii radiației cu moleculele biologic importante, sau indirecte, prin produșii de radioliză a apei, ducând în ambele cazuri la modificările de grade diferite (letale, subletale sau reparabile) ale structurii ADN-ului. Leziunile celulare rezultate după iradiere se manifestă prin fenomenul de inhibiție și de întârziere a mitozelor, de modificare cromozomială și de diferențiere și moarte celulară. Efectul letal este dat în primul rând, de pierderea capacității reproductive, ceea ce înseamnă sterilizare sau moarte reproductivă și, în al doilea rând, de distrucția sau necroza celulară propriu-zisă. Moartea celulară se produce de regulă în timpul mitozei și, excepțional, la doze mari de iradiere, în timpul interfazei, fiind afectate doare limfocitele și timocitele, a căror radiosensibilitate este foarte crescută. Mecanismul intim al morții celulare prin iradiere nu este încă pe deplin elucidat. Se știe că se produce ruperea lanțurilor de ADN, și consecutiv nu poate avea loc o repartizare egală a cromatinei nucleare la celulele fiice fapt ce explică apariția aberațiilor cromozomiale (cromozomi dicentrici sau acentrici, micronuclei etc.). De aici rezultă că moartea celulară are loc în mitoză, necesitând un oarecare interval de la iradiere (moarte întârziată).

Răspunsul la iradiere este complex și dependent de mai mulți factori ca: radiosensibilitatea, capacitatea de vindecare-reparare a leziunilor radioinduse, oxigenarea celulară, structura populației celulare în raport de fazele ciclului celular etc.

Răspunsul tumorilor la iradiere este aproape identic cu cel al țesuturilor normale, difernțierile, în principal, se datorează particularităților vasculare și stărilor de hipoxie celulară.

CAPITOLUL II

Elemente ce caracterizează GLICOPROTEINELE

CHAPTER II

eLEMeNTS THAT ChARACTERIZEd Glycoproteins

2.1. PROTEINE

2.1. PROTEIN

Proteinele sunt constituienți chimici ai organismelor vii cu cel mai înalt grad de complexitate, varietate moleculară și care prezintă specificitate de specie, de organ. Denumirea lor derivă de la cuvântul ”proteios” care înseamnă, de prim rang, cel dintâi.

Proteinele, macromoleculele specifice materiei vii, determină forma și structura celulelor, servind în același timp ca instrumente de recunoaștere celulară și catalizatori.

Sunt substanțe macromoleculare de natură polipeptidică. La construcția proteinelor participă 20 de aminoacizi fundamentali, aceiași la toate viețuitoarele, de la cea mai simplă bacterie până la om. Prin legare în lanțuri polipeptidice, variate ca lungime și succesiune a unităților, se poate obține un număr nesfârșit de combinații. Cu toată multiplicitatea posibilităților de combinare a aminoacizilor în lanțuri polipeptidice, la un anumit organism nu se realizează decât anumite secvențe, acelea care sunt specificate de materialul genetic, de ADN-ul parental. Proteinele sunt macromolecule informaționale, cu secvențe specifice de aminoacizi, sunt expresiaepigenetică a genomului celular.

Aceste substanțe îndeplinesc funcții fundamentale, specifice organismelor vii. Prezintă un rol structural major, constituind materialul din care sunt construite toate structurile celulare, membrane, organite celulare, ca și materialul intercelular al țesuturilor și organelor.

Există într-o varietate moleculară foarte mare, asigurând diversitatea și specificitatea de formă a tuturor ființelor vii.

Exercită acțiuni catalitice- toate enzimele sunt proteine- determinând varietatea nesfârșită de reacții biochimice și specificul transformărilor chimice din organismele vii.

Proteinele contractile sunt instrumentele cu ajutorul cărora organismele vii îndeplinesc activitatea contractilă și locomotorie; îndeplinesc funcții de transport și de depozitare a unor compuși chimici ca ioni metalici, vitamine, oxigen, dioxid de carbon. Ele au sarcina de a apăra organismul împotriva unor corpi străini, macromolecule, virusuri, bacterii. Reacțiile imunologice sunt mediate de o clasă de proteine specializate-imunoglobulinele.

Proteinele constituie aparatul fizic care execută programul complex înscris în memoria celulară reprezentată de acizii nucleici. O asemenea complexitate funcțională a proteinelor ar fi imposibilă în absența unei mari heterogenități moleculare și structurale, reflectată prin capacitatea de a lega o mare varietate de compuși chimici, printre care dominante sunt heteroproteinele.

Heteroproteidele reflectă un asemenea principiu de organizare structurală și reprezintă proteine conjugate care rezultă din asocierea unei componente proteice cu o componentă neproteică, denumită componentă sau grupare prostetică (Șerban M. și colab., 1981).

Heteroproteidele în care gruparea prostetică este reprezentată de un fragment glucidic se numesc GLICOPROTEIDE.

Multă vreme, glucidele au fost privite și studiate ca principalul furnizor de energie, rezervor al combustibilului metabolic și ca elemente ale structurilor de rezistență celulare, nefiind considerate apte pentru nici un fel de „inteligență biologică".

În ultimii 15 ani, datorită progreselor realizate în abordarea fizică, chimică și enzimatică a acestor molecule, s-au acumulat numeroase date care dovedesc marile disponibilități informaționale ale oligoglucidelor, cele din structura glicoproteinelor fiind considerate a avea un rol important în procesele sofisticate de recunoaștere intracelulară și intercelulară.

Glicoproteinele reprezintă o clasă de proteine rezultate prin legarea covalentă la lanțurile polipeptidice a unor fragmente oligozaharidice liniare sau ramificate, de dimensiuni variabile. Conținutul glucidic al glicoproteinelor variază între 1 și 60-80 % din masa moleculei.

Monozaharidele care intră în structura glicoproteinelor sunt galactoza, manoza, fucoza, acidul sialic, galactozamina, glucozamina, arabinoza și xiloza. De asemenea, în structura lor există rezidii, care se regăsesc în cantități foarte mici ce se pot extrage prin mai multe metode ca: dializă, electroforeză, cromatografie de afinitate. Numărul de rezidii monozaharidice în fragmentele oligozaharidice variază între minimum 3 și maximum 15.

Legăturile dintre fragmentele oligozaharidice și proteine sunt legături de tip N- sau O-glicozidic și se stabilesc fie prin azotul amidic al asparaginei, fie prin grupările hidroxil ale serinei, treoninei, hidroxilisinei, hidroxiprolinei.

La formarea legăturii N- sau O-glicozidice participă cu precădere N- acetilglucozamina și N-acetil-galactozamina. Cealaltă extremitate a lanțului oligozaharidic este reprezentată în special de acidul sialic. Legătura N-glicozidică este cea mai frecventă și utilizează ca monozaharid de legătură N-acetilglucozamina (NAc Glc)

Există două tipuri principale de oligozaharide N-glicozidice:

Simple- conținând exclusiv N-acetil-glucozamină (NAc Glc) și un număr relativ mare de unități manoxil;

Complexe- care pe lângă N-acetil-glucozamină și manoză conțin acid sialic, galactoză, N-acetil-galactozamină (NAc Gal).

În timp ce în oligozaharidele simple, bogate în manoză, ramificațiile sunt constituite dintr-un număr variabil de unități manozil, în cele complexe ramificațiile externe constau, cel mai adesea, din unitatea trizaharidică sialic-galatoză-N acetil glucozamină. Un rest fucozil se leagă uneori la restul N-acetil glucozamină din ,,miezul” oligozaharidic.

Glicoproteidele conțin în molecula lor, pe lângă acizii aminați, și diferite glucide sau derivați glucidici. Deoarece prezența acestora este constantă, dar mică, în numeroase proteine (de exemplu, serumalbumine, ovalbumine etc.) s-a convenit să se considere ca glicoproteine numai proteinele care conțin cel puțin 5% glucide, limită peste care ele manifestă evident proprietățile caracteristice glucidelor.

Structura părții glucidice. Moleculele de glucide implicate în glicoproteide sunt foarte variate. Dintre oze apar: D-xiloza, mai frecvent manoza și galactoza, rar glucoza, și foarte rar fructoza, ramnoza și fucoza; dintre derivații aminați ai ”-ozelor” apar foarte frecvent glucozamina, mai ales sub formă acetilată (de obicei apare numai una); dintre acizii uronici, în special acidul D-glucuronic.

Un component prezent în unele glicopeptide este acidul neuraminic sau nonulosoaminic (cu 9 atomi de carbon și cu grupare carboxilică, aminică și carbonilică) și derivatul său acetilat, acidul sialic. Enzima neuramidinază (din vibrionul cholerei și diverse virusuri: al gripei, oreionului etc.) este o α-acetozidază capabilă să hidrolizeze legătura ozidică a N-acetilului din acidul sialic, cu micșorarea vâscozității glicoproteidei care înconjoară bacteria sau virusul, ușurând astfel pătrunderea acestora în celulă.

Legăturile dintre partea proteică și polizaharidică. Pentru a înțelege aceste legături este necesar să amintim că termenul mucopolizaharid definește ,,mucopolizaharidele de origine animală conținând ozamine și care se găsesc fie pure, fie în stare de combinații saline cu proteinele”(Meyer D. I. și colab., 1980) și mucopolizaharide acide ,,heteroglicani ce conțin unități dizaharidice ce alternează regulat și care sunt constituite dintr-o hexozamină și un acid uronic” (Jeanloz R. W., 1962). Se știe astăzi, însă, că procedeele de extracție și fracționare elimină scheletul polipeptidic legat de lanțurile heteroglicozidelor prin legături O-glicozidice-alcali-labile. Aceste lanțuri de polizaharide nu reprezintă deci decât o parte a structurii mucopolizaharidei acide; progresul metodelor preparative a permis ca în prezent să se realizeze o definire globală a moleculei (Jardillier J. C, și colab, 1970).

În sensul celor menționate apare de ineres legătura O-glicozidică, dintre gruparea reducătoare a glucidelor și funcția –OH a aminoacizilor hidroxilați: Ser, Tre, hidroxi-Liz sau HiPro din lanțul peptidic. Rolul esențial al Ser în legătura peptidă-glucidă (Muir H., 1958) a fost susținut pe baza constatării că „Ser” este singurul aminoacid a unei mucopolizaharide a cărui conținut nu variază după proteoliză și care se găsește în fragmentele peptidice mici din zona de legătură neafectată de proteaze (Anderson N. H. și colab., 1995) și care nu se mai regăsesc în legătura O-glicozidică. Această particularitate se poate explica prin mecanismul β-eliminării, în care sunt notate prin litere (a-d) diferitele etape ale procesului (Fig. 2.1).

Fig. 2.1. Schema mecanismului β-eliminării

Fig.2.1. β -elimination mechanism scheme

La baza β-eliminării stă un mecanism de dublă inducție electrofilă (Montreuil J. și colab., 1967) care se aplică legăturilor glicozidice cu OH plasat în β față de carbonil; dacă există o funcție carboxilică aceasta trebuie să fie conjugată. Schematizând legătura O glicozidică (a), în primul stadiu se consideră polarizarea sa ce conferă Cβ o încărcare pozitivă parțială permanentă (b). În mediul alcalin, are loc enolizarea grupării carbonilice; aceste două etape duc la slăbirea legăturii Cα către Cβ(d) conducând la ruperea legăturii O-glicozidice, cu formarea glicozilatului și dehidroagliconului. Dacă în această legătură a fost angajat ca aglicon serina, prin β-eliminare se va produce dehidroalanina; din treonină, acidul α-amino-crotonic.

Pentru ilustrarea structurilor posibile ale complecșilor cu greutate moleculară mare s-au propus diferite formulări (Fig. 2.2.)

Fig. 2.2. Schema structurilor posibile ale complexelor glucoproteidelor

(Jardillier J. C, și colab, 1970)

Fig. 2.2. Possible structures of a glucoproteide complex scheme

(Jardillier J.C. et all, 1970)

Ipoteza lui Partridge (1961) consideră că pe un lanț proteic sunt grefate, la o extremitate, un polizaharid bogat în glucozamină și galactoză și că pe toată lungimea sa se repartizează aproximativ 20 resturi de condroitinsulfați. Această structură presupune că extremitățile reducătoare ale condroitinsulfaților sunt libere, ceea ce nu corespunde realității.

Structura în rețea a lui Luscombe admite un lanț proteic cu gr. mol. 120.000-140.000 pe care se grefează aproximativ 20 lanțuri de condroitinsulfați și o glicoproteină; condroitinsulfatul reprezintă 85% din partea glucidică a complexului total (cu gr. mol. de 2.-3.000.000), orientat spre exterior.

Hoffman P. (1967) pledează pentru un schelet glicoproteic unic, pe care se grefează condroitinsulfații într-o regiune bogată în „Ser” și „Gli”, și keratansulfații într-o regiune bogată în „Glu” și „Pro”. Condroitinsulfații s-ar grefa mai ales pe ramificațiile scurte ale lanțului proteic.

Structura părții proteice pare a nu avea organizare secundară, fiind lipsită de legăturile disulfidice și de legăturile saline intermoleculare (Eyring E. J. și colab., 1968).

2.2. HETEROPROTEINE

2.2. HETEROPROTEINE

Heteroproteinele sau proteinele conjugate care conțin pe lângă componenta proteică (alcătuită din aminoacizi) și o parte nonproteică, denumită parte prostetică, pe baza căreia se clasifică în diferite grupe: glicoproteide, fosfoproteide, nucleoproteide, cromoproteide.

2.3. STRUCTURA GLICOPROTEIDELOR

2.3. STRUCTURE GLYCOPROTEINS

2.3.1. Structura domeniului protidic al glicoproteinelor

Domeniul protidic al glicoproteidelor respectă regulile generale de structură și organizare a proteinelor, fiind constituit din aminoacizi legați prin legături peptidice.

În afara celor 20-22 de aminoacizi întâlniți în structura tuturor proteinelor, glicoproteidele mai conțin hidroxilizina și hidroxiprolina, în structura primară a domeniului protidic al acestor molecule fiind de asemenea semnalată o frecvență ridicată a anumitor aminoacizi ca asparagina, serina și treonina (Montreuil J., 1984).

Cei cinci aminoacizi menționați sunt denumiți aminoacizi receptori ai grupării prostetice, în jurul cărora au fost identificate secvențe peptidice specifice, denumite secvențe peptidice cheie sau „sequon" (Marshall R. D. și colab., 1968).

Un exemplu în acest sens îl constituie tripeptidul Asn – x -Ser (Thr), în care x poate fi orice alt aminoacid cu excepția prolinei și hidroxiprolinei (Sharon H. L., 1981), la nivelul căruia se atașează gruparea prostetică. Totuși, în structura primară a unor glicoproteide s-au identificat astfel de secvențe peptidice cheie neglicozilate.

Această descoperire a dus la concluzia că doar prezența structurii receptoare a grupării prostetice în catena polipeptidică a heteroproteidei nu este suficientă. Recent s-a demonstrat că există și o a doua cerință impusă domeniului protidic, de a-l face apt pentru legarea glucidelor (Chow P. J. și colab., 1974).

Aceasta presupune asocierea secvențelor polipeptidice cheie din structura primară la o structură secundară specifică, intermediară între tipurile clasice de structuri secundare. În cadrul acestui tip de structură secundară se observă o schimbare bruscă a orientării catenei polipeptidice, cu 180° față de orientarea inițială, formând bucle (loops) care de obicei cuprind 4 aminoacizi. Aminoacizii receptori ai grupării prostetice se află în interiorul buclei (Montreuil J., 1984; Sharon H. L., 1981; Băuse E. și colab., 1982).

Conformația buclei este menținută prin legăturile de hidrogen stabilite între gruparea-CO a primului aminoacid și gruparea -NH a celui de-al patrulea aminoacid din buclă.

Un asemenea model conformațional prezintă aminoacizii susceptibili de a fi glicozilați localizați la suprafața proteinelor globulare, făcându-i accesibili glicoziltransferazelor implicate în aceste procese.

Această supoziție este în deplin acord cu dovezile obținute ulterior, care evidențiază componenta glucidică la suprafața moleculelor glicoproteice.

Modelul conformațional prezentat este în concordanță și cu rolul de semnale de recunoaștere jucat de numeroase glucide, ca și cu posibila implicare a învelișului glucidic în protecția glicoproteidelor față de atacul proteolitic.

2.3.2. Structura domeniului glucidic al glicoproteidelor

Unitățile glucidice care participă frecvent la alcătuirea componentei prostetice a glicoproteidelor sunt:

pentoze: xiloza, arabinoza;

hexoze: glucoza, manoza, galactoza;

hexozamine: glucozamina, galactozamina;

derivați acetilați ai hexozaminelor: N-acetilglucozamina,

N-etilgalactozamina;

acizi uronici;

acidul neuraminic;

acidul sialic.

Fragmentele glucidice din glicoproteine sunt clasificate în funcție de tipul de legătură prin care se atașează la scheletul peptidic, legături N-glicozidice și O-glicozidice.

După același criteriu, glicoproteidele sunt grupate în două mari familii, N-glicoproteide și O-glicoproteide.

2.3.2.1. N-glicoproteine – legătura N-glicozidică

N-acetilglucozaminil-N-asparaginil este considerată tipul ancestral de legătură glicozidică Kornfeld K. și colab., 1980).

Amintim câteva exemple de structuri ale unor N-glicoproteide ca:

glicoforina A umană (Yoshima H. și colab., 1980);

glicoproteina din membrana timocitelor de cal (Yoshima H. și colab., 1980);

glicoproteina din capsida virusului stomatitei veziculare (Reading C. L. și colab., 1978)

În toate cele trei cazuri prezentate, ca de altfel în cazul tuturor N-glicoproteinelor, aminoacidul receptor al grupării prostetice este asparagina.

Se evidențiază de asemenea similitudinea regiunilor din imediata vecinătate a aminoacidului receptor, legătura N-glicozidică fiind precedată de o secvență pentaglucidică comună tuturor N-glicoproteidelor, constituită din trei resturi de manoză și două de N-acetilglucozamină, la care se atașează celelalte oze, în diferite moduri, realizând o mare varietate de configurații.

Prezența unei secvențe glucidice comune tuturor N-glicoproteidelor este susținută de datele experimentale obținute prin interacțiunea unora dintre acestea cu lectine, experiențele realizate cu izotopi radioactivi, cu tunicamicină (un inhibitor al N- glicozilării), studiile de difracție în raze X, ca și alte observații experimentale.

În funcție de zonele atașate miezului glucidic comun, N-glicoproteidele au fost clasificate în două grupe:

N-glicoproteine înalt manozilate;

N-glicoproteine complexe, care conțin în structura lor și alte glucide, cum sunt galactoza, N-acetilgalactozamina, acidul sialic.

2.3.2.2. O-glicoproteine

Spre deosebire de tipul N-glicozilat, O-glicozilarea oferă o mai mare varietate de legare, determinată de numărul mai mare de aminoacizi receptori ai grupării prostetice: serina, treonina, 5-hidroxilizina, hidroxiprolina.

Proteinele O-glicozilate se clasifică în următoarele grupe:

tipul MUCINA, în care legătura glicozidică se stabilește între N-acetilgalactozamină și serina sau treonină;

tipul PROTEOGLICAN, în care legătura N-glicozidică se stabilește între xiloză și serina;

tipul COLAGEN, legătura fiind stabilită între galactoza și 5-hidroxilizină;

tipul EXTENSINĂ, cu legătura glicozidică între arabinoză și hidroxiprolina (Montreuil J., 1984).

Glicoproteidele din fiecare clasă menționată prezintă o serie de proprietăți comune.

De exemplu, cele de tipurile mucină și proteoglican sunt instabile în soluții alcaline, spre deosebire de cele de tipurile extensină sau colagen care sunt stabile în mediu bazic.

Glicoproteidele de tipul extensină sunt specifice plantelor.

Ca și în cazul N-glicoproteidelor, s-a evidențiat prezența unei structuri interne comune tuturor proteinelor O-glicozilate.

Pentru aceste glicoproteide au fost identificate mai multe tipuri de structuri comune, în funcție de grupa din care face parte: A, B, C.

Glicoproteidele care conțin o secvență internă comună de tipurile A și B au ca aminoacid receptor al grupării prostetice fie serina, fie treonina, care se leagă de N-acetilgalactozamină.

Deosebirea între cele două tipuri constă în faptul că tipul A conține legat de N-acetilgalactozamină un radical de galactoză în poziția 4, iar tipul B conține doi radicali de N-acetilglucozamină în pozițiile 3 și 6. Glicoproteidele care conțin secvențe glucidice interne comune A și B sunt de tipul mucină.

Modelul C de secvență glucidică internă comună conține ca prim radical glucidic legat de aminoacidul serina, o pentoză, xiioză urmat de o succesiune de doi radicali galactozil.

Acest model este specific proteoglicanilor. Pe aceste regiuni glucidice invariabile sunt atașate grupările glucidice extrem de variate, specifice fiecărei molecule.

2.3.3. Conformația regiunii glucidice

Aspectele prezentate în capitolul anterior relevă faptul că regiunile responsabile pentru funcțiile biologice extrem de diverse ale glicoproteinelor sunt asociate cu domeniile variabile ale grupărilor prostetice. Mai mult, elucidarea modului în care glicoproteidele funcționează în domenii atât de diverse, de la elemente de structură, de rezistență și până la acțiuni extrem de dinamice cum sunt mecanismele de recunoaștere intercelulară, nu se poate face numai pe baza structurii primare a regiunii glucidice, ci se impune a avea în vedere conformația pe care aceasta o adoptă.

Rezultatele obținute prin explorarea conformației glicoproteidelor cu metode fizice ca difracția în raze X, rezonanța magnetică nucleară, rezonanță electronică de spin au condus la elaborarea mai multor modele conformaționale ale domeniului glucidic.

Primele modele elaborate au fost de „antenă" sau de litera „Y" (Montreuil J., 1984). Ulterior, pentru a se realiza o mai bună corelare între conformația spațială a regiunii glucidice și funcția biologică a glicoproteinelor purtătoare s-au enunțat și alte modele conformaționale:

conformația literei „T" (Montreuil J., 1984);

conformația „aripă frântă" (Montreuil J.,1984);

conformația de „pasăre" (Montreuil J.,1984).

Aceste ultime modele conformaționale care prezintă regiunea glucidică cu o conformație extinsă sunt foarte potrivite pentru a explica atât biosinteza părții glucidice, deoarece grupările hidroxi substituibile sunt plasate la suprafața moleculelor, deci sunt ușor accesibile glicoziltransferazelor implicate în aceste procese (Montreuil J., 1984), dar și efectul protector al părții glucidice asupra domeniului protidic, împotriva acțiunii proteazelor.

Studii recente au demonstrat că aceste modele conformaționale sunt interconvertibile, că nu sunt rigide, ci extrem de flexibile față de brațul penta- sau triglucidic prin care se leagă de catena polipetidică.

De exemplu, legătura N-acetilglucozamină-asparagină conferă rigiditate doar secvenței glucidice invariabile, prevenind astfel rotirea întregii molecule (Montreuil J., 1984). În acest fel se poate explica de ce gluco-asparaginele sunt inhibitori mai puternici ai activității hemaglutinante a unor lectine, cum este lectina din Vicia faba, pentru care concentrația de glucid inhibitor este de opt ori mai mare decât cea de glucoasparagină necesară pentru un efect egal.

Acest caracter dual al grupării prostetice glucidice, de structură rigidă și flexibilă în același timp, poate avea un rol esențial în exercitarea funcțiilor biologice ale glicoproteidelor.

2.4. BIOSINTEZA GLICOPROTEINELOR

2.4. BIOSYNTHESIS OF GLYCOPROTEINS

2.4.1. Etapele biosintezei glicoproteinelor

Biosinteza glicoproteinelor presupune următoarele etape:

formarea unui oligozaharid precursor;

transferul oligozaharidului pe proteina acceptoare;

prelucrarea oligozaharidului precursor din molecula glicoproteinelor, cu formarea glicoproteinelor ,, mature”, conținând un fragment glicozaharidic specific.

Primele două etape ale biosintezei se desfășoară la nivelul reticulului endoplasmatic, în timp ce ultima are loc în complexul Golgi.

Formarea unui oligozaharid precursor. Monozaharidele iau parte la biosinteza oligozaharidelor, atât a celui precursor, cât și a celor ,,mature”, în stare activată. Ca și în cazul biosintezei glicogenului, forma activă este reprezentată de nucleozid-difosfat-monozaharid.

Manozaharidele arată oarecare specificitate față de nucleozid-trifosfatul cu care reacționează. Astfel α-glucoza și α-galactoza, ca și N-acetil-ozaminele corespunzătoare, se leagă de CMP.

Oligozaharidul precursor este un oligozaharid simplu (conținând exclusiv N-acetil-glucozamină și manoză) ce rezultă prin trasferul succesiv al ozelor activate pe un alcool gras care poartă numele de dolicol. Molecula de dolicol, care este un poliizoprenol, este puternic hidrofobă și are o lungime de aproximativ 10 mm, ceea ce-i permite să străbată de mai multe ori dublul strat lipidic al membranei reticulului endoplasmic (fața luminală) în care este ancorat. Dolicolul este fosforilat în prezența ATP formând dolicol fosfat care devine acceptorul resturilor glicozidice ce constituie ,,miezul” precursor. La ,, miezul” comun se adaugă un număr variabil de unități manozil cedate fie de GDP-manoză, fie de dolicol-fosfat-manoză. Se edifică astfel oligozaharidul precursor, având structura oligozaharidelor simple, bogate în manoză.

În celulele mamaliene, dolicol fosfatul aparține unei familii fosforilate a poliizoprenolului, care conține 17-21 grupări izoprenil și are gruparea izoprenil saturată.

Această structură oligozaharidică comună este mai întai asamblată pe un purtător lipidic, dolicol fosfatul și apoi transferată unui rest de asparagină din secvența Asn-X-Ser (Thr), unde X nu poate fi prolină, a peptidului nascent (Sharon S. K.,1994). Sinteza dolicol fosfatului, asamblarea oligozaharidului precursor (Glc3Man9GlcNAc2), pe purtătorul lipidic și transferul oligozaharidului la proteină implică peste șase pași enzimatici.

Primii pași ai sintezei dolicol fosfatului sunt identici cu cei ai sintezei colesterolului. Odată cu sinteza farnesil fosfatului, calea de sinteză a dolicol fosfatului se separă de calea colesterolului. Prin adăugarea secvențială cap la coadă, în cis a unitaților de izopren activate (izoprenil pirofosfat), la farnesil fosfat se sintetizează poliprenil pirofosfatul. Ordinea pașilor ce convertesc poliprenil pirofosfatul la dolicol fosfat nu este clară, dar conversia implică o reducere a unitaților izoprenil finale și defosforilarea până la forma monofosforilată (Petrescu A. J., și colab., 2004).

De remarcat că oligozaharidul se leagă de dolicol printr-o legătură pirofosfat care îl activează, facilitând transferal său ulterior pe proteină. Proteinele ce urmează a fi glicozilate pentru a da naștere glicoproteinelor sunt sintetizate, ca toate proteinele secretorii, pe ribozomii ancorați pe reticulul endoplasmic (RE). Ancorarea la un moment dat a unui ribozom implicat în sinteza unei proteine secretorii pe reticulul endoplasmic este decisă de prezența la capătul aminoterminal al acesteia a unei secvențe semnal, complementară unui domeniu din molecula riboforinelor, proteine transmembranare ale reticulului endoplasmic.

Tansferul oligozaharidului pe proteina acceptoare.

Transferul oligozaharidului precursor pe restul asparagină al proteinei este catalizat de o oligozaharid transferază, enzimă membranară având centrul activ orientat spre fața luminală a membranei reticulului endoplasmatic, acolo unde are loc glicozilarea (Fig. 2.3.).

Fig. 2.3. Glicozilarea unei proteine născânde în lumenul reticulului endoplasmic

Fig. 2.3. Glycosylation of nascent proteins in the lumen of the endoplasmic reticulum

Această orientare spațială a enzimei de transfer face ca glicozilarea să fie atributul exclusiv al proteinelor ce intră în lumenul reticulului endoplasmic, respectiv al proteinelor de export și al celor destinate a fi proteine ale membranelor intracelulare (lizozomale, nucleare, ale reticulului endoplasmic) și plasmatice. Glicozilarea se efectuează numai pe rezidii de asparagină integrate secvențelor Asn-Aa-Ser sau Asn-Aa-Threo, secvențe rar întâlnite în glicoproteine, tocmai pentru a se evita glicozilări multiple, care ar crea dificultăți în organizarea spațială a proteinelor.

Prelucrarea glicoproteinelor purtătoare ale unui oligozaharid precursor constă în remodelarea acestuia cu formarea oligozaharidelor complexe. Acest proces se produce în complexul Golgi unde glicoproteinele ,,imature” sunt aduse de către microveziculele ce se detașează din capetele reticulului endoplasmic. Prelucrarea oligozaharidului presupune înlăturarea unor resturi glicozol și adăugarea altora, operație efectuată de glicozidaze (esențial manozidaze) și glicozil transferaze (galactozil trasferaze, fucozil transferaze, sialil trasferaze).

În fig. 2.4. este reprezentată prelucrarea unui oligozaharid precursor cu formarea unei glicoproteine ,,mature”. Variabilitatea fragmentului oligozaharidic în diferite glicoproteine ,,mature” sugerează că celula adoptă un ,,program de prelucrare“ diferit al oligozaharidului precursor, în general același, în funcție de lanțul polipeptidic de care este legat. Glicoproteinele ,,mature” în complexul Golgi sunt transportate de pe fața concavă a acestuia spre membranele plasmatice, lizozomale, nucleare, de către veziculele secretorii golgiene (coated vesicles). Orientarea glicoproteinelor spre membranele intracelulare sau spre cea plasmatică este probabil decisă de o unitate monozaharidică variabilă.

Fig. 2.4. Prelucrarea oligozaharidului precursor și obținerea

glicoproteinei mature

Fig.2.4. Precursor oligosaccharide processing and obtaining mature glycoprotein

Asamblarea oligozaharidului legat la dolicol.

Dolicol fosfatul servește ca purtător pentru asamblarea oligozaharidului, prin convertirea lui la derivați monoglicozilați fosforilați, ca de exemplu manozil-fosforil-dolicol sau glucozil-fosforil-dolicol. GlcNAc-PP-dolicol este alungit prin adiția de GlcNAc și Man din donori nucleotidici de zaharuri, pentru a sintetiza Man5GlcNAc2-PP-dolicol. Adiția Man și Glc de la manozil-fosforil-dolicol și glucozil-fosforil-dolicol completează asamblarea oligozaharidului și se obține Glc3Man9GlcNAc2-PP-dolicol. Transferul acestui oligozaharid la proteina nascentă, regenerează dolicol pirofosfatul care este apoi convertit la dolicol fosfat pentru a începe alt ciclu.

Dolicol fosfatul este de asemenea regenerat când zaharurile sunt transferate de la manozil-fosforil-dolicol sau glucozil-fosforil-dolicol (Parodi A. J. și colab., 1983).

2.5. Procesarea oligozaharidelor N-linkate

2.5. N-LINKED OLIGOSACCHARIDES PROCESSING

Oligozaharidele mature atașate de Asn în proteină, pot exista într-o varietate de structuri. Reacțiile implicate în generarea acestor structuri diverse includ scindarea oligozaharidului precursor de către α-glucozidaze, α-manozidaze în reticulul endoplasmatic și complexul Golgi și elaborarea lanțurilor oligozaharidice ramificate de către glicoziltransferaza din aparatul Golgi (Parodi A. J. și colab., 1983).

Lanțul polipeptidic nascent translocat în reticulul endoplasmatic suferă cotranslațional și postranslațional, modificări ce includ N-glicozilare, formare de punți disulfurice, oligomerizare etc. Glicanii N-linkați sunt atașati cotranslațional la Asn din secvența Asn-X-Thr, sub forma unui miez format din 14 resturi monozaharidice (Glc3Man9GlcNAc2) (Sharon S. K., 1994).

Cele trei resturi de glucoză sunt situate la capătul brațului 1-3 al miezului oligozaharidic. Structura de ansamblu a acestui braț este extinsă și numărul conformerilor redus, cum arată analizele statistice ale legăturii glicozidice, pe mari baze de date (Ellgaard L. și colab., 1999).

Recent s-a demonstrat că la capătul 3-glc se formează o buclă strânsă care expune legătura 1-2 între primele două glucoze, pentru o scindare rapidă de către α-glucozidaza I (fig. 2.5 A). α-glucozidaza II hidrolizează următoarele două legături glicozidice (Glc1-3Glc si Glc1-3Man). Analize conformaționale indică faptul că aceste două legături pot avea un epitop comun pornind de la C6 al primului monozaharid până la C3 al celui de-al doilea.

Pentru aceste două legături diferite, epitopul este prezent pe părți opuse ale oligozaharidului (fig. 2.5. B). În contrast chaperoanele (calnexina și calreticulina) recunosc specific legătura Glc1-3Man și nu Glc1-3Glc. Cum singura diferență majoră între cele două dizaharide constă în epimerizarea carbonului din poziția 2 a restului interior, rezultă că C2 de la Man este implicat în interacțiunea cu lectina. De aici rezultă că α-glucozidaza II și calnexina/calreticulina se apropie de substratul comun din direcții opuse (fig. 2.5. C). Acest model suportă faptul că glicoproteina nascentă poate forma un complex terțiar cu calnexina/calreticulina și glucozidaza II. De vreme ce elementele de recunoaștere ale oligozaharidului sunt situate la distanța de 28Å, bine depărtate de miezul polipeptidic, acestea formează un ”cârlig” ideal pentru complexul terțiar.

Fig. 2.5. Modelul molecular al Glc3Man9GlcNAc2 și situsurile de recunoaștere propuse pentru α- glucozidază I (A) , α-glucozidază II (B), în cazul Glc3Man9GlcNAc2 și pentru calnexină, calreticulină și α- glucozidază II în cazul Glc1Man9GlcNAc2 (C).

Fig. 2.5. The Glc3Man9GlcNAc2 and molecular recognition sites proposed to

α-glucosidase I (A), α-glucosidase II (B), in the case of Glc3Man9GlcNAc2 and calnexină, calreticulin, and α-glucosidase II where Glc1Man9GlcNAc2 (C).

Glicoproteinele monoglucozilate care leagă calnexina/calreticulina se formează nu doar ca rezultat al digestiei cu α-glucozidaza II, ci și prin reglucozilarea oligozaharidului deglucozilat de către UDP-Glc:glicoprotein glucoziltransferază (Platt F. M., și colab., 1992).

UDP-Glc este transferată din citosol în reticulul endoplasmatic, unde servește ca donor de glucoză în reacția de reglucozilare catalizată de glucoziltransferază. S-a arătat că transferaza catalizează glucozilarea glicanilor atașați la proteine incomplet pliate. Existența reacțiilor de deglucozilare și reglucozilare dă indicii despre un ciclu care este implicat în asocierea/desprinderea glicoproteinelor de chaperon, care durează atâta timp cât glicoproteinele sunt incomplet pliate. În acest ciclu GT acționeză ca senzor de pliere.

Eliberarea finală din ciclul calnexina/-glucozidaza II/glucoziltransferaza are loc când polipeptidul a atins conformația complet pliată (Ivessa E. N. și colab., 1992). Are loc apoi transportul din reticulul endoplasmatic în complexul Golgi, facilitat în multe cazuri de lectinele manozice.

Încă se discută dacă calnexina/calreticulina acționează doar ca lectine sau recunosc și miezul polipeptidic. Studiile recente arată că calreticulina funcționează ”in vitro” ca, chaperon molecular atât pentru proteinele glicozilate cât și pentru cele neglicozilate. În contrast, experimente ”in vivo”, au arătat că proteina calnexină acționează exclusiv ca lectină, legarea sa nefiind independentă de conformația proteinei.

Inhibitori ai α-glucozidazelor (castanospermine, deoxinojirmicina, Nbutildeoxinojirmicina) au fost folosiți pentru a întrerupe procesarea N-glicanilor în reticulul endoplasmatic. În prezența inhibitorilor α-glucozidazei I, scindarea glucozei este inhibată. S-a prezis că inhibarea interacțiilor calnexinei cu glicoproteinele duce la plierea greșită a acestora, reținerea lor în reticulul endoplasmatic și degradarea.

Paradoxal mulți inhibitori ai α-glucozidazelor au efecte minime asupra viabilității celulelor și liniile celulare deficiente în α-glucozidaze au un fenotip relativ normal. Pare probabil ca mecanisme alternative să existe în celule pentru a permite plierea corectă a multor glicoproteine, când este separată interacțiunea lor cu chaperoanele. Aceasta ar explica de ce efectele inhibiției α- glucozidazelor asupra glicoproteinelor celulare este selectiv. De exemplu, receptorul pentru 32 transferină, necesită procesarea corectă a oligozaharidelor, pentru expresia la suprafața celulei pe când alte glicoproteine de suprafață, în aceeași linie celulară, sunt exprimate normal în prezența inhibitorilor (Silberstei S. și colab., 1992).

Se observă că în sistemele mamaliene, în prezența inhibitorilor unele glicoproteine se pliază normal, altele pot fi secretate chiar dacă sunt pliate parțial incorect, iar a treia categorie nu se pliază complet și sunt reținute în reticulul endoplasmatic iar apoi degradate.

2.6. Proteine implicate în procesarea N-glicanilor în reticulul endoplasmatic

2.6. PROTEINS INVOLVED IN THE PROCESSING OF N-GLYCANS IN THE ENDOPLASMIC RETICULUM

2.6.1. Complexul oligozahariltransferaza

Oligozahariltransferaza este un complex heterooligomeric alcătuit din trei subunitați, cu mase moleculare aparente: 66, 63/64 si 48 Kda. Polipeptidul de 66 Kda conține oligozaharide N-linkate și corespunde riboforinei I. Subunitatea 63/64 Kda corespunde formelor neglucozilate și glucozilate ale riboforinei II. Subunitatea neglicozilată de 48 Kda (OST 48), a fost mai puțin caracterizată.

Enzima necesită pentru activare metale bivalente (Mn2+ sau Mg2+). Donorul oligozaharid legat de lipid, utilizat preferențial de oligozahariltransferaza, este Glc3Man9GlcNAc2-PP-dolicol. Se observă o scadere de 10 ori în rata transferului când substratul nu are resturi de glucoză.

2.6.2. Riboforinele I și II

Compararea gelurilor de SDS-PAA a microsomilor rugoși și netezi de șobolan, mai înâti, relevă existența unor deosebiri compoziționale între membrana reticulului endoplasmatic rugos și cel neted. Microsomii rugoși purificați conțin două glicoproteine transmembranare de tip I, care nu există în microsomii netezi. Acestea sunt riboforinele I si II. Ele pot face parte din aparatul de translocare și participă la N-glicozilarea lanțurilor polipeptidice nascente.

Aceast aparat pare a fi parte a rețelei proteice din membrana reticulului endoplasmatic care previne difuzia situsului de translocare în regiunea netedă a acestui organit. Existența unei astfel de rețele, pare evidentă când se observă că tratamentul ficatului de șobolan cu anumiți detergenți neutri, determină solubilizarea fosfolipidelor și a multor proteine de membrană, dar nu solubilizează un subset de alte proteine membranare.

Riboforina I: preriboforina umană conține 607 aminoacizi iar riboforina matură are 584 aminoacizi. Analizele de hidrofobicitate sugerează existența unui domeniu transmembranar de 18 aminoacizi, un domeniu citoplasmatic de 150 aminoacizi și un domeniu lumenal de 415 sau 416 resturi. Din trei situsuri potențiale de glicozilare doar unul este utilizat. Riboforina I nu prezintă omologie de secvență semnificativă cu riboforina II.

Domeniul transmembranar al riboforinei I la om și șoarece este identic (95% omologie), sugerând că acest segment are o funcție importantă.

Riboforina II: secvența primară este constituită din 631 amonoacizi. Prezintă o secvență semnal de 22 aminoacizi, un domeniu carboxi-terminal citoplasmatic de aproximativ 70 aminoacizi, un domeniu transmembranar de 23 aminoacizi și un oligozaharid N-linkat (la Asn 84).

Funcții posibile: ambele riboforine sunt sintetizate cu peptide semnal clivabile și oligozaharidele N-linkate conținute în fiecare polipeptid, rămân sensibile la endoglicozidaza H, de-a lungul vieții moleculelor respective. Ambele proteine sunt stabile și timpul de injumătățire este mai mare de 25 ore (Fujimot K. și colab., 1991).

Riboforinele sunt implicate în translocarea și N-glicozilarea cotranslațională a polipeptidelor nascente. Domeniul carboxi-terminal al riboforinelor este în apropierea situsurilor de translocare și pare că joacă un rol important în etapele inițiale ale translocării.

Se pare că riboforinele mediază direct interacția ionică dintre subunitatea mare ribosomală și reticulul endoplasmatic rugos. Riboforinele I și II împreună cu proteina membranară de 48 Kda (OST 48) au fost izolate ca un complex heterotrimeric. Acest complex este capabil să transfere oligozaharidul de la dolicol-PP-oligozaharid, la tripeptidul Asn-X-Ser (Thr).

2.6.3. OST48

Este o proteină membranară de tip I de 48 Kda, fiind cea mai mică subunitate a complexului oligozahariltransferază la mamifere. Conține 445 aminoacizi; primele 31 resturi seamană unei secvențe semnal tipice, necesară inițierii translocării în reticulul endoplasmatic.

Între resturile 417-436 există o secvență hidrofobă corespunzătoare segmentului transmembranar. Nu prezintă situsuri de glicozilare (Saunier B. și colab., 1982).

2.6.4. α-glucozidaza I

Faza de scindare în procesarea N-glicanilor, în celulele eucariote, este inițiată de α- glucozidaza I, care îndepărtează glucoza terminală din oligozaharidul precursor, atașat la proteinele nou-sintetizate în reticulul endoplasmatic. Enzima este inhibată de castanospermine, 1-deoxijirmicina (dNJ), N-metil-deoxinojirmicina și compuși înrudiți.

pH-ul optim de acțiune al enzimei este 6,4-6,8. Enzima este un tetramer de subunități de 85 Kda, insensibilă la digestia cu tripsină dar susceptibilă la clivare proteolitică la un miez de 39 Kda, catalitic activ.

Acțiunea inhibitorilor α-glucozidazei I previne maturarea lanțurilor laterale oligozaharidice înalt manozilate la structuri complexe, interferând deci cu secreția și localizarea subcelulară a unora dar nu la toate glicoproteinele. Inhibarea procesării oligozaharidelor la structuri complexe este însă incompletă, în parte datorită abilității anumitor celule de a transfera oligozaharide neglucozilate la proteine și în parte datorită acțiunii endo-manozidazelor (Băuse E. și colab., 1991).

2.6.5. α-glucozidaza II

Procesarea glicanilor este inițiată de α-glucozidaza I și continuată de α-glucozidaza II, care îndepărtează ambele resturi de glucoză de la oligozaharidul Glc2Man9GlcNAc2, atașat la proteina nou sintetizată în reticulul endoplasmatic. Enzima este o glicoproteină membranară de 123 Kda și este puternic inhibată de dNJ, N-metil-dNJ, castanospermine, etc.

Îndepărtarea restului de glucoză din interior este mai lentă decât a glucozei terminale. Resturile de Man din brațul 1-6 al oligozaharidului sunt necesare pentru activitatea enzimei (Ellgaard L. și colab., 2003). Și în acest caz inhibiția procesării oligozaharidelor la structuri complexe este incompletă. α-glucozidaza II este o glicoproteină care a fost imunolocalizată în reticulul endoplasmatic rugos, neted, în anvelopa nucleară, aparatul Golgi.

2.6.6. α-1,2 manozidaza

Este o proteină legată de membrană cu masa moleculară de 65 Kda, care îndepărtează Man legată 1-2 din structura glicoproteinelor și oligozaharidelor. Enzima este activată de Ca2+ și este inhibată de dNJ. Studii de imunolocalizare localizează enzima în reticulul endoplasmatic rugos, neted și în membranele netede corespunzătoare veziculelor de transport între reticulul endoplasmatic și aparatul Golgi. S-au identificat diferite activități 1-2 manozidazice. Distincția dintre aceste enzime se face în funcție de substratul oligozaharidic folosit, localizarea intracelulară, necesitățile pentru cationi.

Distribuția acestei enzime este mai restrictivă decât cea a α-glucozidazei II, care este uniform distribuită, indicând compartimentarea reacției de procesare în reticulul endoplasmatic (Leitzgen K. și colab., 1998).

2.7. Glicoproteine melanosomale

2.7. GLYCOPROTEINS MELANOSOMALE

Melanogeneza este o cale metabolică complexă controlată de o familie de enzime denumite proteine înrudite cu tirozinaza (tyrosinase-related-proteins TRPs). TRPs au mai multe proprietăți structurale comune, inclusiv un domeniu citoplasmatic și un domeniu transmembranar, un domeniu lumenal glicozilat care include motivul EGF (epidermal growth factor) bogat în cisteină și două situsuri de legare a ionilor metalici care intră în structura situsului catalitic activ (Negroiu G. și colab., 1999).

Funcțiile melanogenice ale proteinelor înrudite cu tirozinaza sunt localizate în domeniul amino-terminal situat în lumenul melanosomului iar sortarea și orientarea (targetingul) acestor proteine sunt mediate de semnale din domeniul citoplasmatic (Liu T. F. și colab., 2001).

2.7.1. Tirozinaza (EC1.14.18.1).

Este o enzimă critică pentru formarea melaninei datorită abilitații sale de a cataliza primele reacții din secvența biosintetică, hidroxilarea tirozinei la DOPA. Aceasta este cea mai critică reacție, deoarece rata cu care tirozina se hidrolizează spontan este neglijabilă și acesta reprezintă mecanismul de reglare a ratei de sinteză. DOPA se poate apoi autooxida spontan la DOPA-chinonă în absența tirozinazei (deși cu rate mai mici decât în prezența enzimei) și mai departe se vor forma inelele indolice prezente în LDOPAcrom și în DOPAcrom. Fără activitate catalitică DOPAcrom se va decarboxila spontan pentru a produce 5,6-dihidroxiindol (DHI) care se oxidează rapid la indol-5,6-quinonă. Cercetări mai vechi sugerau că melanina este polimer homogen de indol-5,6-quinonă dar studii mai recente arată că melanina este mult mai heterogenă și probabil este constituită din mai mulți intermediari ai căii biosinteză.

Sinteza melaninei va avea loc spontan in vitro după ce s-a format DOPA, dar apar și alte constrângeri. Un număr de factori adiționali care reglează calea de sinteză au fost caracterizați, incluzând alte enzime (DOPAcrom tautomeraza), disponibilitatea grupărilor sulfhidril reactive, inhibitorii melanogenici și probabil alți factori reglatori. Tirozinaza este produsul locusului “c” la șoarece și produsul locusului “TYR” la om.

Fig. 2.6. Reprezentarea schematică a structurilor tirozinazei și TRP1.

Fig. 2.6. Schematic representation of the structures of tyrosinase and TRP1

Se observă domeniile de legare a cuprului (Cu2+), domeniile bogate în cisteină (CYS), domeniile transmembranare (T.M.) si cele șase potențiale situsuri de N-glicozilare. Numărătoarea se face de la capătul amino-terminal al lanțului incluzând și secvența semnal.

Este o enzimă cupru-dependentă și este deosebită prin faptul că prezintă trei funcții catalitice. Cea mai importantă este hidroxilarea tirozinei. Tirozinaza utilizează de asemenea DOPA si DHI ca substrate pentru reacții de oxidare. S-a sugerat pe criterii cinetice, că activitățile diferite ale tirozinazei sunt localizate în situsuri diferite ale enzimei. O altă caracteristică a tirozinazei mamaliene este necesitatea stereospecifică crescută pentru DOPA ca și cofactor pentru hidroxilarea tirozinei, DOPA fiind de asemenea și produsul reacției. Rata de hidroxilare a tirozinei în absența cofactorului DOPA este neglijabilă ceea ce ridică întrebări în privința originii cofactorului DOPA inițial, de vreme ce acesta nu este un aminoacid normal prezent în celulă.

Tirozinaza este melanocit specifică și studii ce implică diferite tehnici de determinare a tirozinazei sau a mRNA-lui său, arată că gena tirozinazei este exprimată doar în melanocite.

Enzima este sintetizată ca o proteină nascentă de aproximativ 60 Kda, care este glicozilată în drum spre melanosom, ajungînd la o mărime aproximativă de 75 Kda.

Enzima are 533 aminoacizi, patru situsuri de N-glicozilare ocupate, 17 cisteine grupate în două domenii bogate în Cys și două domenii de legare a cuprului. Tirozinaza și TRP1 au un grad înalt de omologie în mai multe regiuni, inclusiv la nivelul centrului catalitic activ și situsurilor potențiale de N-glicozilare. Activitatea enzimatică a tirozinazei este dependentă de legarea a doi atomi de cupru în situsurile cupru A și cupru B.

La fiecare dintre acestea, trei histidine coordinează atomul de cupru și ambii atomi de cupru coordinează o moleculă de oxigen (Görlich D. și colab., 1993). Tirozinaza este o proteină extrem de stabilă, rezistentă la căldură sau la proteaze și are un timp de înjumătățire neobișnuit de lung (aproximativ zece ore in vitro). Are un punct izoelectric relativ scăzut (pH 4,3) și se găsește predominant legată de membrana melanosomului (Petrescu A. J. și colab., 2001).

2.7.2. Tyrozinase related protein 1 (TRP 1)

TRP1 (fig.2.6.) este o enzimă specifică melanocitelor, implicată în sinteza eumelaninei.

Mutații în gena TRP1 umană sunt asociate cu albinismul oculocutanat de tip 3 (OCA3) (Sarangarajan R. și colab., 2001).

S-a arătat că melanosomii de șoarece conțin două izoenzime electroforetic distincte denumite tirozinaza cu mobilitate electroforetică mică (low electrophoretic mobility tyrosinase-LEMT sau TRP1) și tirozinaza cu mobilitate electroforetică mare (high electroforetic mobility tyrosinase-HEMT, care corespunde tirozinazei).

TRP1 este o glicoproteină transmembranară de 75 Kda localizată în melanosom. Aceasta este capabilă să catalizeze hidroxilarea L-tirozinei și oxidarea L-DOPA, dar cu o eficiență mult mai mică decât tirozinaza. Această enzimă are însă capacitatea de a converti DHICA (acid 5,6-dihidroxiindol-2-carboxilic) într-un compus instabil și de a promova formarea melaninei de culoare maro. În schimb tirozinaza oxidează DHICA cu o eficiență foarte mică.

Se pare că tirozinaza este implicată în reglarea cantității de L-tirozină care intră în calea de sinteză a melaninei, în timp ce TRP1 ca și TRP2 sunt implicate în reglarea calității melaninei prin reglarea cantității de unități indol carboxilate încorporate în polimer, participă deci la reacțiile distale ale melanogenezei. Cantitatea de unități derivate din DHICA, din structura melaninei se reflectă în proprietățile pigmentului.

Melaninele DHICA sunt mai puțin închise la culoare și au o greutate moleculară mai mică decât melaninele DHI. Astfel, diferențele subtile de culoare în pigmentație la mamifere ar fi legate de nivelurile de activitate ale TRP1 si TRP2 în melanocitele din epidermă și rădăcina firului de păr.

TRP1 este cea mai abundentă glicoproteină exprimată în melanocite. Cu toate că în melanocitele murine principala activitate a TRP1 este oxidarea DHICA la acid indol-5,6- quinon-carboxilic, această activitate nu a fost confirmată în cazul TRP1 uman, în ciuda omologiei de aproximativ 98% dintre enzimele celor două specii. Rolul acestei enzime în melanocitele umane ramâne încă neclar.

În ciuda similarității de aproximativ 40% dintre TRP1 și tirozinază, există diferențe între N-glicanii acestor proteine. Spre deosebire de tirozinază, în TRP1 doar 16 % din glicani sunt de tip înalt manozilat, 16% sunt biantenari si 65% reprezintă structuri tri- și tetra-antenare. TRP1 prezintă un amestec de structuri înalt manozilate și complexe (Petrescu A. J. și colab., 2001).

Gradul de procesare a N-glicanilor depinde de disponibilitatea glicozidazelor din complexul Golgi și de capacitatea lor de a accesa situsurile de procesare. De vreme ce accesibilitatea este aceeași pentru ambele glicoproteine, rezultă că diferențele de glicozilare se datorează deosebirilor în structura tridimensională a tirozinazei și TRP1.

Procesul de pliere al TRP1 este mult mai rapid decât în cazul tirozinazei și este definitivat posttranslațional prin formarea punților disulfurice. Timpul necesar TRP1 pentru a fi procesat la forma complet glicozilată este de o oră. S-a observat că spre deosebire de tirozinază, conformația TRP1 în vecinătatea situsului activ nu este prea mult afectată de dereglări în procesarea normală a N-glicanilor.

Există încă o serie de discuții referitor la adevăratul rol al TRP1 în melanocite. Abundența acestei proteine sugerează că are rol stuctural fiind implicată în menținerea integrității melanosomilor sau în stabilitatea tirozinazei și modularea activității sale precum și în proliferarea melanocitelor și în moartea celulară a melanocitelor.

2.7.3. Tyrosinase related protein 2 (TRP2)

Una dintre proteinele implicate în reglarea melanogenezei este TRP2 numită și DOPAcrom tautomerază (DCT). TRP2 catalizează conversia L-DC la DHICA, spre deosebire de decarboxilarea spontană care duce la DHI. Este de asemenea o glicoproteină legată de membrana melanosomului (Solano F. și colab., 1994).

TRP2 este larg raspândit în rețeaua trans-Golgi (trans Golgi network-TGN), în celulele de melanom și mai puțin în melanosomi. Acest fapt coroborat cu localizarea ocazională la nivelul membranei plasmatice sugerează că TRP2 face parte dintr-o cale de reciclare, care poate include sau nu melanosomii (Negroiu G. și colab., 2003).

DCT precum și alte glicoproteine melanosomale (TRP1, GP100, etc) ajung în melanosomii de ordin I unde sunt clivate si inactivate. Clivarea proteolitică este esențială pentru replierea proteinei în mediul melanosomal și reorganizarea ulterioară a melanosomilor amorfi de tip I, în melanosomi de ordin II fibrilari, ovoizi și înalt organizați, ceea ce permite melanogeneza (Kushimoto T. și colab., 2001).

TRP2 există în două glicoforme distincte cu sensibilitați diferite la endoglicozidaze.

Această enzimă se găsește sub forma unui homotrimer, contactul între subunitățile sale fiind realizat prin regiuni beta-sheet. Prezintă un rest de prolină la capătul N-terminal, localizată la baza unei cavități încărcate pozitiv. Acest rest de prolină este esențial pentru activitatea DCT.

Aceste trăsături structurale sunt legate de rolul fiziologic și activitatea enzimatică a TRP2 (Sugimoto H., 1999).

A fost postulată existența în structura acestei proteine a două situsuri de legare a cuprului.

În timp ce existența celor doi atomi de cupru este bine documentată pentru tirozinază, în cazul TRP2 (DCT), lucrurile nu sunt foarte clare. Bazat pe inhibarea specifică a acestei enzime de chelatori ai metalelor cu afinitate pentru fier, a fost propusă implicarea ionilor de fier în situsul activ. Mai nou însă există dovezi care arată că de fapt ionul metalic implicat în activitatea DCT este zincul. De asemenea TRP2 necesită cantitați mici de fier pentru activitatea catalitică.

Prezența zincului în situsul activ al TRP2 corespunde reacției de tautomerizare catalizată de TRP2, spre deosebire de reacțiile de oxidare catalizate de ceilalți doi membri ai familiei tirozinazei (tirozinaza și TRP1). În aceste enzime legarea oxigenului și transferul de electroni ulterior la ionul metalic din situsul activ alternează ionii cupric și cupros în timpul ciclului catalitic. În acest fel cuprul este mediatorul în transferul electronilor de la un substrat (oxigenul) la al doilea substrat DOPA în reacția de oxidare a DOPA. Similar TRP1 catalizează oxidarea DHICA la indolchinona carboxilată corespunzătoare.

În cazul DCT, ionul metalic în situsul activ trebuie să aibă o singură stare de oxidare, Zn(II). Acest ion nu poate transfera electroni și nu este implicat în reacții de oxidare. Legarea unui substrat (L-DC) la enzimă duce la un rearanjament al dublelor legături în inelul indolchinonic și are loc tautomerizarea L-DC la DHICA. Prezența zincului implică faptul că oxigenul nu este legat în timpul ciclului catalitic, sau cel puțin faptul că metalul nu este oxidat, enzima fiind astfel pregatită să catalizeze tautomerizarea substratului (Solano F. și colab., 1994).

Așa cum am menționat TRP2 este implicat alături de TRP1 în reglarea calității melaninei (Sugimoto H., 1999). Funcția exactă și mecanismul de funcționare ale TRP2 nu se cunosc însă suficient.

Dovezi recente sugerează că proteinele din familia tirozinazei (tirozinaza, TRP1 și TRP2) se pot asocia in vivo pentru a forma un complex multienzimatic. Însa nici compoziția precisă a complexului, nici interacțiile specifice dintre componente nu au fost suficient caracterizate (Jimenez-Cervantes C. și colab., 1998).

2.8. CLASIFICAREA ȘI DESCRIEREA GLICOPROTEINELOR DIN ȚESUTURI ȘI ORGANE

2.8. CLASSIFICATION AND DESCRIPTION GLYCOPROTEINS IN TISSUES AND ORGANS

Glicoproteinele se pot împărți în două grupe:

Glicoproteine acide, în care gruparea prostetică este reprezentată prin mucopolizaharidele acide: acidul mucoitinsulfuric în mucoproteide; acidul condroitinsulfuric în condroproteide; acidul hialuronic în hialoproteine. Ele predomină în țesutul conjuctiv și se caracterizează printr-o vâcozitate mare și precipitarea cu acizi sau la cald.

Glicoproteine neutre, răspândite în organism (plasma sanguină, tractul gastrointestinal,

urină); aici aparțin și unii hormoni: hipofizari, care joacă rol important în reglarea funcțiilor ca secreția de hormoni tiroidieni ce stimulează creșterea organismului, iar prin intermediul hormonilor gonadotropi – GTH (FSH și LH) ajută la reglarea funcției de reproducție (Nussey S. și colab., 2001).

Glicoproteinele țesutului conjuctiv cuprind, în special, acidul hialuronic, acizii condroitinsulfurici și keratosulfurici, și se obțin sub formă de complexe stabile, cu legături ,,saline”.

Acidul hialuronic este prezent în umoarea apoasă, cordonul ombilical, lichidul sinovial și pleural, în tumorile mezenchimatoase, streptococii hemolitici din grupul A, C, etc. Complexul acid hialuronic-proteină se obține prin precipitare cu acid acetic (pH4); izolat din lichidul sinovial este omogen la ultracentrifugare și conține 27% proteine de tip serumalbumine. Complexul disociază cu acetat de Na la pH 9 și poate fi eliberat de proteine. Acidul hialuronic ca atare este alcătuit din încatenarea unui mare număr de molecule de acid hialobiuronic până la dimensiuni de 4800- și gr.mol.200.000-1.000.000; complexul cu proteina are gr. mol. în jur de 8000000 (Ogston A. G. și colabo, 1950).

Importanța biologică a acidului hialuronic și a complecșilor săi cu proteinele este legată de rolul lor de ,,lubrefiant” sau ,,matrice gelatinoasă” ce protejează celulele. Acest rol apare în strânsă dependență de hialuronidază, care depolimerizează acidul hialuronic și scade astfel vâscozitatea și protecția realizată de ,,barierele” hialuronice.

Acizii condroitinsulfurici, sub forma de complecși cu proteinele, au fost izolați din cartilaje, tendoane, piele, cordon ombilical și au fost denumiți după originea lor: condromucoid, orosomucoid, tendomucoid, chorionmucoid; greutațile lor moleculare variază mult după metoda de extracție, situându-se între 14000 și 260000.

După structura lor se denumesc A, B, C. Tipul A reprezintă constituentul principal al cartilajelor; tipul B lipsește din cartilaje dar se găsește în piele, tendoane, aortă. În privința legăturii cu proteinele, tipul A manifestă legături stabile, în timp ce tipurile B și C nu se leagă stabil.

Deși rolul lor biologic nu este complet elucidat, se consideră totuși, importanți ca ,,elemente structurale” ale țesuturilor și prin participarea în procesele fiziologice, de exemplu, calcifiere, controlul și repartizarea apei și electroliților în diferite lichide, inclusiv în cele oculare etc.

Glicoproteinele din mucoase. Celulele cavității bucale, a tractului gastointestinal, urogenital etc. produc o secreție filantă-vâscoasă (mucus) a cărui aspect s-a atribuit unor substanțe numite ,,mucine”. Extinderea studiilor și asupra altor secreții din nas, trahee, bronhii, esofag, vezica biliară, trompele uterine etc. a făcut ca termenul de ,,mucus” să-și piardă semnificația. În prezent se recomandă clasificarea în mucoproteide, formate din asocierea acidului mucoitinsulfuric cu proteinele și mucoide, constituite din oze aminate, galactoză, glucoză, fucoză, acid sialic.

În grupul mucoproteidelor apar diferențe între proprietățile fizico-chimice și comportarea față de hialuronidază și unele caractere comune: prezența galactozei, fucozei și hexozaminelor (în proporții variabile) și conținutul ridicat, în partea proteică, a serinei și treoninei. Mucina secretată de glandele submaxilare conțin 42% glucide (inclusiv acidul sialic) și 58% acizi aminați; cea din uter are 80% glucide (din care 25% acid neuraminic) iar cea stomacală conține acid mucoitinsulfuric.

După natura lor chimică se pot grupa în două categorii:

Glicoproteide cu conținut ridicat de fucoză (sub formă de mucopolizaharid) denumite și fucomucine, din tractul gastrointestinal. Tot aici se pot încadra și substanțele care caracterizează grupele sanguine și din unii chiști ovarieni (chiști pseudomucoși);

Sialomucine, foarte vâscoase, cu conținut ridicat în acid sialic, prezente în salivă.

Glicoproteine urinare. În urinele deproteinizate în prealabil cu acid sulfosalicilic se pot evidenția mucoproteide și acidul sialic (prin metoda colorimetrică – Dische cu difenilamină). Din urina normală, prin fracționare alcoolică și precipitare la pH=3, s-a izolat mucoidul lui Tabs și Horsfall, cu gr. mol. de aproximativ 7 000 000, ce conține acid sialic (9%) și galactoză, manoză, fucoză, hexazamine (în raport molecular de 6:3:1:8), cu proprietăți biologice, fiind un inhibitor puternic al hemaglutinării produse de virusuri.

O altă glicoproteidă este mucoidul urinar responsabil de ,,fenomenul de obstacol al lui Donaggio” (Donaggio M., 1931), caracteristic stării de oboseală. Reacția Dinaggio constă în tratarea urinei cu tionină și molibdat de amoniu, când apare, după o anumită perioadă de timp, un precipitat violet înconjurat de un lichid incolor. Substanța responsabilă de acest ,,fenomen de obstacol” denumită „mucoproteida lui Donaggio” a fost obținută din urină prin acidifiere cu acid acetic, fierbere, filtrare, dializă și precipitare cu alcool la rece și are următoarea compoziție: Gli (14,2 %), Glu (14 %), Asp (11 %), Val (9,6%), Ala (7,3 %), Ser (7,3 %), Tre (6,8 %), Pro ( 5,9 %), Val (5,1 %) și glucide:galactoză, glucoză, manoză, fucoză, hexazamine, în raport molecular de: 10:2:7:7:11.

Glicoproteidele din lapte. Laptele mamiferelor conține diferite tipuri de glicoproteide; din laptele de femeie s-a obținut ginolactomucoidul, cu 10% N, 19,5% hexoze și 10% hexozamine.

Glicoproteidele din ou. Din albușul de ou s-au obținut o serie de glicoproteide: ovalbumina, cu o parte de natură glucidică ce nu poate fi separată de partea proteică prin metodele uzuale. Ovomucoidul, omogen la ultracentrifugare dar heterogen la electroforeză, are gr.mol.27-29.000 (cu 22-26% glucide) este termostabil și manifestă o activitate antitripsinică. Ovomucina sau ovomucoidul β este puțin solubil în apă, de aceea apare sub forma unei substanțe foarte vâscoase atunci când se diluează mult albușul de ou cu apă. Are gr. mol. minimă de 7.600.000, prezintă heterogenitate la ultracentrifugare și efecte de inhibiție a hemaglutinării (Javillier M. și colab., 1959).

Tot din grupa glicoproteidelor fac parte ,,substanțele specifice grupelor sanguine”, glicoproteidele din plasma sanguină, mucoproteidele bacteriene, unele enzime (enterochinaza cu 30 % glucide, colinesteraza etc.) hormonii glicoproteici etc. (tabel 2.1.).

Tabelul 2.1.

Exemple de glicoproteide, după clasificarea biologică

(Spiro R. G., 1970)

Table 2.1.

Examples of glycoproteins as biological classification

(Spiro R. G., 1970)

2.9. SEMNIFICAȚIA BIOLOGICĂ A GLICOPROTEINELOR

2.9. BIOLOGICAL SIGNIFICANCE OF GLYCOPROTEINS

Colagenul, este componenta principală a țesuturilor conjunctive, tendoanelor, ligamentelor, cartilajelor, pielii, oaselor, solzilor de pește. Există numeroase varietăți de colagen. Colagenul are o compoziție deosebită de a keratinei și fibroinei, căci este bogat în glicol, prolină si hidroxiprolină, nu conține cistină și triptofan. Prin incălzire prelungită cu apă, colagenul intâi se imbibă, apoi se dizolvă transformându-se în gelatină sau clei.

Elastina constituie țesutul fibros, cu o elasticitate comparabilă cu a cauciucului, a arterelor și a unora din tendoane. Elastina nu se transformă în gelatină la fierbere cu apă și este digerată de tripsină. Ca și colagenul, fibrele de elastină sunt compuse din aminoacizi simpli, mai ales leucina, glicocolul și prolina.

Keratinele. Proteinele din epidermă, păr, pene, unghii, copite și coarne se disting printr-un conținut mare de sulf. Keratinele sunt insolubile în apă atât rece cât și caldă, precum și în soluții saline. Din cauza aceasta keratinele prezintă o mare inerție față de agenții chimici, precum și față de enzime.

Fibroina, componenta fibroasă din mătasea naturală, se găsește în acest material înconjurată cu o componentă amorfă, cleioasă, sericina, care reprezintă cca. 30 % din greutatea totală. În cele două glande ale viermelui de mătase, proteinele sunt conținute sub formă de soluție concentrată, vâscoasă.

În regnul vegetal nu se găsesc proteine fibroase; funcția lor este îndeplinită în plante de celuloză. Proteinele fibroase se dizolvă numai în acizi și baze concentrate, la cald, dar această dizolvare este însoțită de o degradare a macromoleculelor; din soluțiile obținute nu se mai regenerează proteina inițială. Proteinele fibroase nu sunt hidrolizate de enzimele implicate în digestie și deci nu au valoare nutritivă.

Interferonii. Interferonii sunt o categorie specialã de citochine, a cãror sintezã este indusã de diferiți agenți chimici sau biologici. Funcțiile lor se caracterizeazã printr-un spectru larg de activități nespecifice, cea mai importantã fiind inducția stãrii antivirale.

Interferonul a fost descoperit de Isaacs A și colab., în l957. Ei au observat cã injectarea membranei corioalantoice a embrionului de găinã, cu virus influenza inactivat (denumit virus inductor sau interferent), blocheazã replicarea ulterioarã a virusului influenza infecțios (virus revelator al interferenței). Autorii au arătat că inhibiția replicării virale (interferența) se datoreazã unui factor inhibitor, pe care l-au denumit interferon (IFN).

Elucidarea naturii chimice și a modului de acțiune a interferonilor a constituit o problemă de interes major a biologiei moleculare și a virologiei în ultimele decenii.

Inducerea stării antivirale este cea mai importantă funcție a interferonilor, dar ei au și alte activitãți biologice majore:

– inhibiția multiplicãrii celulelor normale și tumorale;

– reglarea proceselor de diferențiere celularã;

– reglarea funcției imunitare.

Natura interferonilor. Diferitele variante moleculare de interferoni au fost grupate în douã tipuri: interferoni de tip I și de tip II.

Interferonul de tip I cuprinde variantele α, β și τ. Interferonul de tip II include varianta molecularã γ. Interferonul α este produs de leucocite și este reprezentat de o varietate largã de molecule, codificate de un numãr mare de gene. Interferonul β este sintetizat de variate celule nehematopoetice (de exemplu, fibroblaste), după infecția cu virus sau dupã ce sunt stimulate cu ARN dublu catenar. Sinteza sa este codificatã de o singură genă. Interferonul τ, s-a identificat la bovine și la ovine și este sintetizat în cantitãți mari în epiteliul uterin, în perioada care precede implantarea embrionului și de aceea s-a denumit interferon trofoblastic. Interferonul γ este produs de limfocitele activate sub acțiunea antigenului specific sau a substanțelor mitogene și reprezintã interferonul de tip II. Deoarece, in vivo, este sintetizat de limfocitele T activate, de limfoblastele seriei B și de limfocitele granulare mari (celulele NK), interferonul γ este considerat a fi de tip  imun.

Distribuția interferonilor în cele două tipuri și subtipuri se bazeazã pe proprietãțile lor antigenice individuale. Antiserul specific față de moleculele de interferon ale unui tip nu precipită și nu neutralizează acțiunea interferonilor celuilalt tip.

În general, moleculele de interferoni sunt glicoproteine. Interferonii β și γ au resturi glucidice legate la asparagina 80 și respectiv 25 și 97. Majoritatea interferonilor α nu sunt glicozilați. Glicozilarea nu este esențială pentru exprimarea activităților biologice, ceea ce explică faptul că interferonii sintetizați în celulele bacteriene, de genele codificatoare clonate, au activitate biologică.

Interferonii α și β sunt stabili chiar la pH 2 și își pãstreazã activitatea în prezența SDS, ultima fiind o proprietate foarte importantă pentru purificare.

Carbohidrații se găsesc în cantitate mare la suprafața celulelor, într-o peliculă ce înconjoară plasmalema, peliculă ce a primit denumirea de glicocalix. Recent s-a ajuns la concluzia că acest înveliș este prezent în jurul tuturor tipurilor de celule din organismul vertebratelor și că este deosebit de bogat în carbohidrați (Rambour S. și colab., 1965).

Glicocalixul reprezintă învelișul glucidic al celulelor, constituit din structuri oligozaharidice inserate pe lipide, sau proteine. Din punct de vedere al structurii biochimice globale, trei sunt componentele membranare ce participă la structurarea glicocalixului: glicolipidele, glicoproteinele și proteoglicanii. Grosimea glicocalixului este, în medie, între 20 și 50 nm, variind de la un tip de celulă, la altul, dar și pentru aceiași celulă de la un domeniu membranar, la altul (spre exemplu la celulele epiteliilor unistratificate între polul apical și cel latero-bazal). O regulă care se aplică în înțelegerea grosimii glicocalixului este că acesta are o grosime cu atât mai mare, cu cât celulele sunt mai puțin implicate în interacțiuni cu alte celule, sau cu substrate din matricea extracelulară. Aplicând această regulă vom intui că glicocalixul cel mai gros îl prezintă celulele sanguine. Pe de altă parte, la celulele epiteliilor monostratificate, polul apical are un glicocalix mai abundent, față de polul latero-bazal.

În structura glicocalixului nu participă toate monozaharidele existente în natură. Numai nouă intră în alcătuirea lanțurilor oligozaharidice ale glicolipidelor și glicoproteinelor, dintre care șapte mai abundent. Acestea sunt, într-o ordine lipsită de o anumită semnificație: glucoza (Glc), galactoza (Gal), manoza (Man), fucoza (Fuc), Nacetil-glucozamina (GlcNAc), N-acetil-galactozamina (GalNAc) și acizii sialici (SA).

Se discută despre acizi sialici (la plural) și nu se folosește singularul deoarece se referă la o clasă de glucide ce derivă din structura de bază a acidului neuraminic, un glucid cu 9 atomi de carbon în moleculă, cel din poziția 1 aflându-se într-o grupare carboxil, de unde și numele de acid. De la acesta derivă primii reprezentanți a două serii: acidul N-acetilneuraminic (NANA), cel mai răspândit și acidul N-glicolil-neuraminic. Dar diversitatea acizilor sialici nu se oprește aici, deoarece reprezentanții de bază pot fi O-acetilați la hidroxilii de la atomii de carbon 4, 7, 8 și/sau 9.

Ținând cont că pot fi mono-, di-, sau chiar triacetilați se face o idee mai exactă asupra diversității entităților moleculare incluse în clasa acizilor sialici.

În afară de cele șapte tipuri de monozaharide amintite în proteoglicani se întâlnește și xiloza (monozaharidul prin care se leagă structura glucidică de o serină din partea proteică), ca și acizi uronici (acid glucuronic și acid iduronic). Dintre monozaharidele menționate numai Fuc este din seria L, toate celelalte aparținând seriei D.

Din enumerarea monozaharidelor ce participă la structurarea lanțurilor oligo- sau polizaharidice ce organizează glicocalixul se face o primă idee asupra heterogenității structurale a acestuia. Dar lucrurile nu se opresc doar la acest nivel. Pentru substanțierea caracterului eterogen al structurării membranelor (indus de lipide și amplificat de proteine) se subliniază că înșiruirea glucidelor în lanțurile oligozaharidice nu este aceeași, între glicolipide și glicoproteine și nici între divesele glicolipide.

Legarea monozaharidelor între ele se poate face în mai multe moduri, întrucât există mai multe grupări hidroxil disponibile. E drept că nu toate aceste posibilități sunt utilizate de celule.

Acestea sunt limitate de tipurile de glicoziltransferaze (enzimele ce acționează în biosinteza structurilor glucidice) pe care o anumită celulă le are în reticulul endoplasmic și în complexul Golgi, organitele unde oligo(poli)zaharidele din glicolipide, glicoproteine, sau proteoglicani sunt produse. Aceste enzime sunt stereospecifice, astfel că legarea pas cu pas a glucidelor unul de altul nu este întâmplătoare.

Între glicolipide, glicoproteine și proteoglicani există însemnate diferențe structurale la nivelul componentei glucidice. Glicolipidele, care constituie 10 % (procente moleculare) dintre lipidele membranare, conțin un singur lanț oligozaharidic, de regulă neramificat. Lanțurile glucidice din glicolipide conțin, în general, mai puține monozaharide (rar peste 13-15). Pentru a avea o imagine corectă a organizării spațiale a lanțurilor, vom menționa că acestea nu au traiect liniar ci sunt “contorsionate”, tocmai datorită orientării grupărilor hidroxil utilizate la lungirea oligomerului glucidic (rezultat al stereospecificității glicoziltransferazelor). Glicoproteinele conțin uzual mai multe lanțuri oligozaharidice grefate pe lanțul polipeptidic. Inserarea se poate face la azotul amidic al unei asparagine, aflate întotdeauna într-o secvență consens , sau la hidroxilul dintr-o serină, ori dintr-o treonină (Haselbeck A., și colab., 1993).

În primul caz structurile glucidice se numesc N-glicozidice, în cel de-al doilea O-glicozidice. Structurile O-glicozidice (legate la serină sau treonină) sunt abundente în glicoproteinele de tip mucinic. Structurile N-glicozidice conțin Man, cele O-glicozidice nu.

Lanțurile oligozaharidice ale glicoproteinelor sunt ramificate. Ramificarea se face după principiul dihotomic (adică din fiecare punct de ramificare pleacă numai două ramuri). De regulă, din câte se cunoaște până în prezent, există unul sau două puncte de ramificare, astfel încât fiecare structură oligozaharidică din glicoproteine poate fi biantenară sau triantenară (Berg J. M., 2007).

Structurile oligozaharidice ale glicoproteinelor conțin un număr semnificativ mai mare de monozaharide, în comparație cu cele ale glicolipidelor.

Privind succesiunea monozaharidelor în lanțurile oligozaharidice din glicolipide și glicoproteine, se pot face următoarele afirmații cu caracter de regulă:

glucoza, atunci când participă, nu se găsește niciodată în poziție terminală a lanțului;

acizii sialici, atunci când se află (și de regulă se află), se găsesc întotdeauna în poziția terminală a lanțului. Regula nu este încălcată nici atunci când o moleculă de acid sialic se află subterminal. Aceasta înseamnă că lanțurile se pot termina cu acizi sialici legați unul de altul (Weikert S. și colab., 1999).

Deși proteoglicanii sunt slab reprezentați la nivelul membranelor celulare, contribuția lor la structurarea glicocalixului nu poate fi neglijată, din cel puțin două motive. În primul rând încărcătura lor glucidică depășește cu mult componenta proteică (90-95 % de masă glucide, 5-10 % maxim proteină în structura proteoglicanilor) și, în al doilea rând, structurile glucidice sunt cele mai lungi dintre toate cele întâlnite la nivelul glicocalixului.

Tabel 2.2.

Principalele tipuri de glicozaminoglicani

(Sasisekharan R. și colab., 2008)

Table 2.2.

The main types of glycosaminoglycans

(Sasisekharan R. et all., 2008)

Lanțurile polizaharidice ale proteoglicanilor poartă denumirea de glicozaminoglicani.

În tabelul 2.2. sunt prezentate principalele grupe de glicozaminoglicani.

Glicozaminoglicanii sunt structuri polizaharidice neramificate, formate din unități dizaharidice repetitive alcătuite dintr-un zahăr, sau aminozahăr și un acid uronic (acid glucuronic, sau iduronic). Excepția de la această descriere de principiu a compoziției moleculare o prezintă keratan sulfații în care unitățile dizaharidice repetitive conțin Gal (un zahăr) și GlcNAc (derivat de aminozahăr). Trebuie subliniat faptul că proteoglicanii posedă o puternică încărcătură negativă provenită atât de la acizii uronici conținuți cât și de la grupările sulfat (esterificate la diferiți hidroxili) pe care le pot conține zaharurile, sau amino zaharurile prezente în moleculele glicozaminoglicanilor.

Rolul glicocalixului. Prin asemănare cu rolul protector al părții glucidice din glicoproteine împotriva acțiunii proteazelor, se poate afirma că glicocalixul protejază structura membranei celulare împotriva agresiunilor fizico-(bio) chimice. Lucrul acesta nu este departe de realitatea biologică. Modul în care el este structurat, conferă membranei rezistență mecanică, controlând accesul către straturile profunde ale sale, deci către bistratul lipidic și către componentele proteice ale acesteia. Rolul acesta este cu atât mai important cu cât accesibilitatea factorilor agresivi aste mai mare. Aceasta este o motivație pentru care celulele sanguine sau polii apicali ai celulelor epiteliale dispuse în monostrat au glicocalixul abundent. Mai mult, în anumite situații în care agresiunile pot fi mai accentuate, membranele sunt protejate de secreții glicoproteice (mucinice) abundente, cum se întâmplă, de exemplu, în mucoasele gastrice și intestinale. Dar glicocalixul nu este, nici pe departe, important numai pentru acest aspect (Kornfeld K. și colab., 1980).

În componența carbohidrată a glicocalixului se găsește acid sialic, legat de glicoproteine, care pare să fie responsabil de proprietățile electrokinetice ale acestuia. Îndepărtarea lui prin sialidază nu produce însă modificări în activitatea respiratorie și lipolitică a celulei, ceea ce arată că acest carbohidrat este inclus mai degrabă în glicocalix decât în structura membranei. În afară de acidul sialic, în glicocalix au mai fost identificate reziduri de galactoză-galactozamină.

La microscopul electronic, glicocalixul apare sub formă de filamente orientate predominant radiar, puternic atașate de suprafața membranei (Benga Gh., 1985)

Glicocalixul este mai gros și mai bine structurat la suprafața celulelor epiteliale, ale pancreasului exocrin și ale tubilor renali (în special în zona microvililor) și mai subțire în jurul celulelor conjunctive, sanguine și ale glandelor endocrine (Lopez J. A., 1994).

Rolul principal al glicocalixului este acela de a interveni în fenomenele de imunitate, deoarece, s-a văzut că anticorpii fluorescenți injectați se combină cu suprafața celulei, probabil în pozițiile în care este localizat materialul antigenic. Se știe că acest material antigenic este asociat cu ATP-aza, enzimă care la microscopul electronic apare în aceleași localizări cu antigenul (Riley M. V. și colab., 1981).

Prezența glicocalixului la suprafața celulelor (în afara joncțiunilor strânse unde lipsește) determină o permeabilitate mai scăzută la ioni și o rezistență electrică mai mare decât la nivelul zonei occludentes. Glicocalixul are un rol important și în adezivitatea celulară (Benga Gh., 1985).

oligoglucide

glicocalix glicoproteine

glicolipide

plasmalemă

Fig. 2.7. Reprezentare schematică a glicocalixului

(Darnell J. și colab., 1988)

Fig. 2.7. Schematic representation of glicocalixului

(Darnell J. and all, 1988)

Glicoproteinele de pe suprafața celulelor diferă ca structură și compoziție chimică de la o plasmalemă la alta și chiar în cadrul aceleiași membrane. Cele din membrana eritrocitelor conțin puțină sau deloc manoză, dar au un raport mai ridicat de galactozamină-glicozamină decât glicoproteinele plasmatice (Maxfield F. R., 2002).

Glicoproteinele din membrane prezintă o predominanță a legăturilor de serină și treonină cu carbohidrații, mai mult decât cu asparagina. Pe baza acestor observații s-a sugerat că în celulă există mecanisme diferite de sinteză a celor două tipuri de glicoproteine (Evans W. H. și colab., 1989).

2.10. lectine

2.10. lectins

O dată cu descoperirea acum peste 100 de ani, de către Stillmark H. în proprietății extractului din semințe de ricin de a aglutina eritrocitele, s-a deschis o nouă era în domeniul biochimiei moleculare: lectinele.

Aceste extracte din plante au deschis apetitul și altor cercetători care le-au utilizat pentru proprietatea de a aglutina diverse celule, astfel descoperindu-se în 1940 că aceste aglutinine pot selecta diferite tipuri de celule în funcție de specificitatea de grup sangvin.

Prin termenul de lectină este definită o clasă de proteine sau glicoproteine, cu proprietăți aglutinante față de alte celule, care pot lega reversibil hidrați de carbon, fără a le modifica structura.

Boyd a denumit aglutininele lectine de la latinescul „legere” ce înseamnă a selecta, a alege, pentru a sublinia proprietățile acestei biomolecule de a discerne diferite celule, legându-se specific doar de anumite tipuri.

Părintele imunologiei, Erlich P. 1909, a descoperit că iepurii hrăniți cu cantități mici de semințe ce conțin lectine, pe lângă toxicitatea caracteristică a unora, au căpătat o imunitate parțială, demonstrând că lectinele au proprietăți antigenice prin inducerea de reacții antigen anticorp.

Cercetarea asiduă a acestor molecule, a proprietăților acestora și a mecanismelor de acțiune a determinat ca în 1980 Golstein I. J. și colab. să formuleze o definiție a lectinelor acceptată mai apoi de Comitetul de nomenclatură al Uniunii Internaționale de Biochimie, în 1981, care precizează următoarele: lectinele sunt proteine de origine neimună care se leagă de glucide, aglutinează celulele și glicoconjugați. Însă din această categorie de substanțe mai fac parte și alte molecule precum enzimele care prezintă un singur situs de legare cu glucidele, intervenind prin desfacerea legăturilor covalente din structura glucidelor sau chiar prin disocierea unui întreg complex glucidic dar fără a avea și capacitatea de a aglutina celule.

Astfel s-a impus o extindere a noțiunii de lectine prin precizarea faptului că lectinele pot fi proteine sau glicoproteine, de origine neimună, capabile de o legare specifică a glucidelor, legare reversibilă, fără a altera structură covalentă a acestora.

Originea neimună impusă de definiție este necesară pentru a nu include lectinele în categoria anticorpilor, de care acestea se deosebesc major prin faptul că legarea antigen-anticorp este una ireversibilă rezultând complexe antigen-anticorp, iar legarea lectinei de un substrat glucidic se face cu conservarea structurii și conformației ambilor parteneri, fiind reversibilă.

Cea mai recentă și completă definiție a lectinelor este cea propusă de Pneumans W. J. și colab. (1994) care precizează că lectinele sunt proteine sau glicoproteine multivalente, de origine neimună, cu cel puțin unul sau mai multe situsuri de legare reversibilă a glucidelor, deci fără activitate catalitică precum enzimele sau funcție de anticorpi. Această definiție a fost unanim acceptată, ea permițând includerea tuturor lectinelor, chiar și a celor multivalente precum cea obținută din germeni de grâu sau din urzică ce prezintă proprietăți enzimatice (chitinaze) sau a ricinei; cea mai veche lectină descoperită care este de fapt enzima ARN-N-glicozidază, a galectinei-10 (proteina cristalină Charchot-Lenyden) care este o fosfolipază, iar sialoadezina este o lectină inclusă în familia imunoglobulinelor (Charchot J. M., 1853; Lenyden E. V., 1872).

Cu cât știința a putut descoperi și izola noi lectine cu origine vegetală, animală, bacteriană sau virală, conceptul de lectine s-a lărgit și noi proteine au putut fi clasate ca aparținând acestei familii, exemplu fiind citokinele care sunt molecule lectin-like, implicate în modularea răspunsului imun.

Suprafața oricărei celule este compusă din lipide și proteine. De acestea se leagă fragmente oligoglucidice, acestea fiind importante în desfășurarea proceselor celulare ce include recunoașterea și dezvoltarea celulară sau răspunsul la anumite semnale.

Lectinele se leagă specific și reversibil de structurile glucidice precum o „cheie într-o broască”, putând uneori aglutina celulele, aglutinare care poate fi inhibată cu ajutorul mono sau oligozaharidelor, precipita glicoconjugații sau induce mitoza.

2.11. CLASIFICAREA LECTINELOR

2.11. CLASSIFICATION LECTINS

Clasificarea clasică a lectinelor se bazează pe specificitatea de glucid manifestată de acestea, în funcție de cel mai eficient inhibitor glucidic al proprietăților descrise pentru o anumită lectină (tabel 2.3).

Tabel 2.3.

Clasificarea lectinelor pe baza specificității de glucid

(Miyake K. și colab., 2007)

Table 2.3.

Classification of lectins on the specificity of sugar

(Miyake K. et all., 2007)

Perfecționarea metodelor de investigație asupra lectinelor și a genelor care le codifică a condus la un alt tip de clasificare (Van Damme E. J. M., și colab., 1998):

Merolectine – proteine cu dimensiune moleculară redusă, constând dintr-o singură catenă polipeptidică, cu un singur domeniu de legare al glucidelor. Datorită structurii monovalente nu precipită glicoconjugații și nu aglutinează celule. Din această familie fac parte haveina din arborele de cauciuc (Hevea brasiliensis) și concavalina succinilat.

Hololectinele – conțin două sau mai multe catene polipeptidice cu mai multe domenii de legare identice precum ConA, sau diferite precum PHA.

Himerolectinele – oligopeptide compuse din două sau mai multe domenii, dintre care cel puțin unul este un domeniu specific de legare al glucidelor, celălalt domeniu putând avea proprietăți biologice, catalitice, hormonale, care funcționează independent de domeniul de legare al glucidelor, putându-se comporta ca niște merolectine sau hololectine exercitând și o activitate biologică.

Superlectinele – un tip special de himerolectine ce conțin mai multe domenii de legare a glucidelor, descrisă fiind superlectina izolată din bulbii de lalea.

Cea mai recentă clasificare a lectinelor este cea propusă de cercetătorii japonezi care le ordonează în funcție de origine și familia de proteine din care fac parte astfel:

Galectinele – lectine de origine animală descoperite recent și la unele nevertebrate, la nematode, insecte și chiar în ciuperci, care prezintă specificitate pentru galactoză;

Lectine tip C – lectine de origine animală calciu dependente ce prezintă un domeniu de cunoaștere a glucidelor (CDR) important în diferite funcții biologice.

Lectinele tip C se împart în:

Selectine L, E, P responsabile de aderarea leucocitelor la celulele endoteliale în cazul apariției unui focar inflamator, ca răspuns la acțiunea unor citokine precum interleukina 1 și factorul de necroză tumorală (TNF)

Colectinele joacă un rol important în sistemul de apărare al organismului prin legarea de structurile glucidice de pe suprafața unor microorganisme precum bacterii, virusuri, fungi, protozoare și exercită o activitate antibacteriană prin promovarea fagocitozei sau activarea sistemului complementului.

Anexinele izolate din țesuturi vegetale, animale, cu afinitate pentru lipide și glicozaminoglicani.

Siglecs sunt lectine care recunosc glicanii ce conțin acid sialic fiind implicate în inducerea de semnale celulelor responsabile cu apărarea organismului.

2.12. DISTRIBUȚIA LECTINELOR

2.12. DISTRIBUTION LECTINS

Lectinele sunt răspândite ubicvitar, izolarea lor fiind posibilă din aproape orice sursă de viață, incluzând plante, alge, fungi, microorganisme precum bacterii, virusuri, nevertebrate și vertebrate. Distribuția acestora este însă diferită, concentrația depinzând în mare măsură de localizarea acesteia în diferite părți componente ale sursei.

O concentrație mare de lectine, începând cu prima lectină izolată din planta ricin (Ricinus communis), se află în plante și anume în anumite părți componente ale acestora.

Astfel a luat naștere conceptul de lectină vegetală care se găsește din abundență în semințele (cotiledoanele) unor plante leguminoase, mai precis în corpii proteici și însumează aproximativ 10 % din proteina solubilă a extractelor din aceste semințe. În semințele de Phaseolus vulgaris, Griffonia simplicifolia, Ulex europeaus se găsesc mai multe tipuri de lectine cu specificitate de glucid diferită.

Lectinele pot fi izolate și din alte părți ale plantelor precum frunze, tulpini, scoarță, rădăcini, fructe, flori, noduli, bulbi, rizomi, muguri, însă în cantități mult mai mici de aproximativ 0,05% din proteina totală a plantei. Utilizând extracte de lectine din soia s-a putut evidenția că unele plante nu dețin lectine decât în semințe, pe când altele posedă cantități mari de peste 50 % din totalul protidic în țesuturile de depozit asemeni usturoiului, cepei sau vâscului.

Localizarea lectinelor pe membranele celulare ale unor țesuturi de la mamifere sau ale bacteriilor și virusurilor a inițiat un nou concept de lectină membranară sau transmembranară.

Astfel lectinele bacterine (prezente în pili) se leagă de manoză sau de alte celule ca în cazul E coli K88, Salmonella choleraesuis, iar lectinele izolate de la Pseudomonas aeruginosa, PA-IL și PA-IIL, ce sunt asociate factorilor de virulență se leagă de manoză și fucoză.

Galectinele au fost izolate din membranele celulare aparținând unor țesuturi recoltate de la păsări, bovine, om, șobolani, iar collectinele (collagen-like lectin) au fost izolate din serul bovin și din surfactant.

Lectinele s-au putut identifica și izola pe suprafața granulocitelor, monocitelor, macrofagelor, celulelor NK, limfocitelor B sau celulelor secretoare de mielină cum este cazul Siglecs care sunt considerate lectine transmembranare.

Alte lectine au putut fi izolate din echinodermul unor nevertebrate sau din fluidele care circulă prin corpul acestora sau chiar din veninul unor șerpi.

Această distribuție largă a lectinelor a permis izolarea și utilizarea acestora în diferite scopuri de cercetare, tratament, diagnostic.

2.13. ACTIVITĂȚI BIOLOGICE ȘI APLICAȚII CLINICE ALE LECTINELOR

2.13. BIOLOGICAL ACTIVITIES AND CLINICAL APPLICATIONS OF LECTINS

Pornind de la proprietatea comună a lectinelor de a se lega specific de un glucid, se poate afirma că acestea îndeplinesc roluri variate și complexe în diferite organisme.

Unele lectine se pot lega doar de anumite structuri precum manoză, galactoză, glucoză, altele necesită pentru legare ca glucidul să se afle în poziția nereducătoare a oligoglucidului sau să necesite doar structura corectă a nanomerului α sau β.

Aceste particularități determină lectinele să fie extrem de specifice în activitatea lor.

Mecanismul de acțiune al lectinelor este simplu de explicat, la bază stând principiul „cheie – broască”, lectina reprezentând cheia care are o anumită afinitate pentru o broască, care o dată deschisă determină o cascadă de procese în celulă.

Interacțiunea lectină – celulă se datorează prezenței pe suprafața acestora a unui înveliș glicoproteic sau glicolipidic, lectina cuplându-se specific de un anumit glucid și inducând în celulă diverse semnale care inițiază anumite căi de metabolizare.

Orice celulă, microorganism prezintă pe suprafață receptori care conțin molecule de glucide care au afinitate pentru anumite substraturi.

Lectina intervine și se interpune între microorganism și substratul țintă al acestora ocupând, fie receptorii glucidici ai celulelor, fie legându-se de situsurile substratului țintă, fie legându-se de amândouă. (fig. 2.8.)

Capacitatea aglutinantă este atribuită unui număr mare de lectine de origine vegetală dar și animală (din corpul unor nevertebrate marine), însă nu este o caracteristică impusă pentru și de către lectine, de vreme ce s-a observat că o serie de lectine nu pot avea activitate aglutinantă asupra celulelor și că această proprietate poate fi utilizată pentru a evalua cantitativ și calitativ o lectină.

Fig.2.8. Interacțiunea celulă-lectină

(Gabius H. J., și colab., 2011)

Fig. 2.8. Cell-lectin interaction

(Gabius H. J., et all, 2011)

De exemplu o lectină recent descoperită la crabul de mare (Tachypleus tridentatus) și la castravetele de mare (Cucumaria echinata) cu specificitate pentru acidul sialic prezintă activitate hemolitică directă asupra eritrocitelor. În practică această proprietate este utilizată în arhetiparea grupelor sangvine sau în diferențierea unor celule maligne de cele normale prin liza acestora.

Fig. 2.9. Capacitatea hemaglutinantă și opsonizantă a lectinelor

(Mihăescu G., 2001)

Fig.2.9. Haemagglutinating and opsonizantă capacity of lectins

(Mihăescu G., 2001)

Capacitatea de a induce mitoza în anumite celule (activitate mitogenică) care în mod normal nu se divid a fost descoperirea lui Nowell (1960) a mitogenezei mediate de lectinele din WGA (wheat germ aglutinin) și Datura Sp.

Efectele mitogenice cele mai explorate ale lectinelor au fost asupra stimulării mitogenice a limfocitelor.

Lectinele mitogene PWM (pokeweed-Phytoloca americana), WGA, ConA se presupune că se leagă de receptorii limfocitelor T și induc semnale ce costimulează sinteza de interleukine IL2 și a receptorilor pentru IL2, fiind și un inductor al blastogenezei limfocitare la 60-90 % din celulele unor culturi celulare.

Urtica dioca conține lectine ce prezintă activitate mitotică asupra limfocitelor T, diferențiindu-se de celelalte lectine cu efecte asemănătoare prin capacitatea de a distinge populații de CD4+ și CD8+ și de a activa în mod normal, original, limfocitele T și producerea de citokine (D’Adamo C., 2007).

În funcție de calea de administrare a lectinelor mitogene, de doză, momentul și durata administrării (minim 10 zile) s-a observat că prin administrarea orală aceste lectine sunt absorbite și prezentate macrofagelor de care se leagă, care mai apoi le prezintă limfocitelor competente și care încep secretarea de imunoglobuline. PNA este un puternic imunogen oral și care administrat la bovine determină creșterea titrului de IgG. S-a observat că PWM stimulează atât limfocitele T spre proliferare și limfocitele B spre sinteză, Con A stimulează doar limfocitele T atât la om cât și la mamifere, lectinele din Vicia sativa, Homarus americanus, Dictyoselium purpureum stimulează doar limfocitele B, iar PHA (aglutinina din Phaseolus vulgaris) stimulează doar limfocitele umane nu și cele bovine. Citotoxicitatea unor celule animale mediată de lectine este o altă funcție a acestora și se referă la celulele T citotoxice – o subpopulație a limfocitelor T și a macrofagelor.

În anumite condiții și în prezența Con A celulele neînrudite antigenic sunt lizate de celulele ucigașe, unde lectina se interpune și se leagă specific atât de celulele care urmează a fi lizate cât și de cele citotoxice. Uciderea de către macrofage a celulelor tumorale este o alta formă de citotoxicitate mediată de lectine.

Capacitatea de a induce apoptoza asupra unor celule este utilizată în tratamentul și diagnosticarea unor celule tumorale după cum se poate observa în tabelul 2.4.

Tabel 2.4.

Tratamentul și diagnosticarea unor celule tumorale

Table 2.4.

Treatment and diagnosis of tumor cells

ANOIKIA (în limba greacă înseamnă fără casă) este termenul folosit pentru o apoptoză particulară a celulelor care nu se pot atașa substratului ce le permite dezvoltarea, deoarece situsurile de legare sunt ocupate. Noile descoperiri științifice au promovat lectinele (galectinele) pentru a inhiba atașarea la endoteliul vascular al celulelor metastazice (Leffler H. și colab., 2004)

Efectele produse de lectine asupra organismului diferă în funcție de calea de administrare și se observă atât local cât și sistemic, în intreg organismul animal.

Efectele lectinelor asupra intestinului. S-a observat că administrarea orală a unor lectine precum PHA, GNA acționează ca un factor de stimulare a creșterii epiteliului intestinal prin scăderea turn-over-ului enterocitelor de la 72h la 12h. PHA, WGA se leagă de glicoproteinele prezente pe marginea în perie a enterocitelor stimulând înlocuirea epiteliului de suprafață, lectinele rezistând la degradarea proteolitică impusă de stomac unde pH-ul este acid.

O altă acțiune a lectinelor în intestinul subțire este aceea de a interacționa cu microflora intestinală fie prin a influența înmulțirea microorganismelor cu lectine precum WGA, PHA, Robinia lectin sau inhibarea dezvoltării cu GNA, producând o serie de dezechilibre în asimilarea nutrienților.

Prin consumul unei cantități crescute de lectine din plantele ce le conțin se pot produce efecte antinutritive asupra organismului, prin scăderea asimilării nutrienților datorită blocării permeabilității mucoasei digestive sau prin interacțiunea sinergică sau competitivă cu microflora digestivă. Se pot produce reacții alergice, prin creșterea permeabilității vasculare datorită degranulării mastocitelor din submucoasa intestinală de către PHA.

Efectele toxice au fost observate și la ingerarea de plante precum Ricinus communis ce conține ricina, lectină dar si toxină, Abrus precatorius-abrina, Phaseolus vulgaris, de către rumegătoare. Acestea pot produce manifestări clinice de tipul vomei, inapetență, diaree, dizenterie, dispnee ducând în final și la moartea animalelor.

Pancreas. O dată cu acțiunea de stimulare a creșterii epiteliului intestinal, o serie de lectine precum PHA și SBA (soya bean aglutinin) produc și asupra pancreasului exocrin modificări trofice. Efectul trofic exercitat de lectine asupra pancreasului este mediat de colecistokinină care este eliberată când PHA acționează asupra celulelor enteroendocrine ale intestinului. Ca aplicație clinică este administrarea unor doze mici de lectine care pot determina hipertrofia pancreasului în afecțiunile cronice, atunci când secreția de enzime digestive este redusă.

Ficat. După administrarea de PHA la șobolani, timp de 10 zile, s-a observat o ușoară reducere a greutății ficatului datorită pierderilor de lipide și glicogen.

Splina. S-au constatat modificări atrofice în urma administării de lectine PHA la șoareci.

Inima. S-au observat reduceri ale greutății și a ratei de sinteză a proteinelor.

Rinichi. S-a observat o ușoare mărire în volum.

Mușchi. PHA și alte lectine pot mima, ”in vitro”, efectul biologic al insulinei. PHA se cuplează de receptorii insulinici din mușchi, dar nu stimulează sinteza de proteine în acest țesut. La o doză de 0,5g lectine/ kg greutate vie s-a constatat o pierdere a 30% din masa musculară a șobolanilor hrăniți cu extracte din fasole.

Astfel atrofia musculară este o consecință a blocării efectului stimulator al insulinei asupra sintezei proteice, deoarece receptorii pentru insulină sunt blocați de PHA (Putzai A., 1993).

Hormoni – PHA interferează cu secreția de insulină a pancreasului endocrin determinând variații ale nivelului insulinei în organism. S-a observat o scădere a concentrației de insulină la șobolanii hrăniți cu PHA dar nu s-au observat modificări ale nivelului glucozei ce puteau să indice dacă animalul este sau nu diabetic. Pentru compensarea nivelurilor scăzute de insulină se presupune că PHA activează procesele homeostazice din organism ce implică modificări ale concentrațiilor de glucagon sau glucocorticoizi. Lectinele mai exercită și un efect lipolitic, reducând concentrațiile plasmatice ale grăsimilor din organism.

Activitate antivirală. O serie de lectine de origine vegetală, PNA (peanut aglutinin), GNA (Galanthus nivalis agglutinin-lectina din bulbi de ghiocel) și animală, aparținând familiei tipului C, și anume collectinele, din care fac parte MBL (manose-binding-lectin), bovine conglutinin (Bkg), SP-A proteina A surfactant și SP-B lectina izolată din lichidul amniotic, CL-L1 colectina din ficat și CL-P1 colectina placentara (Kawasaki T., 1980), exercită 3 tipuri de activități antivirale ”in vitro”:

1) neutralizează antigenele și blochează atașarea virusului sau dezvoltatea acestuia în celulă;

2) se atașază de glicoproteinele sau lipidele de pe suprafața virionului sau a celulelor infectate și activează sistemul complementului pentru distrugerea lor;

3) distrugerea virionului prin opsonizare.

Fig. 2.10. Mecanismul de acțiune a collectinelor

(Williams R. L. și colab., 1987)

Fig. 2.10. The mechanism of action of collectine

(Williams R. L., et all., 1987)

Activitate antitumorală. S-a demonstrat că pe suprafața celulelor tumorale pot fi prezente lectine ce sunt capabile să cupleze molecule ce conțin glucide exogene (ex. D-galactoza) și să le inițializeze prin endocitoză. Un exemplu în acest sens sunt galectinele implicate în activitatea anticanceroasă sau WGA ce produce o citotoxicitate mediată de macrofage cu rezultate în cancerul vezical.

O altă modalitate de acțiune a lectinelor asupra celulelor tumorale este de a induce modificări ale distribuției receptorilor de pe suprafața acestora. De notat este faptul că în cazul grupării receptorilor, la celula normală acest lucru este uniform și aglomerat în grupuri la celula tumorală, ajutând în diagnosticul celulelor tumorale de cele sănătoase.

În ultimii ani, cercetătorii au introdus un nou instrument de luptă împotriva cancerului: imunotoxinele. Acestea au la bază folosirea de toxine-lectine ce sunt definite ca molecule chimerice artificiale, alcătuite din molecule toxine legate de un cărăuș (anticorpi monoclonali) care recunosc celula țintă, ce este mai apoi anihilată.

Lectine utilizate în acest scop au fost cele din Viscum album – MLI, cu proprietăți anticanceroase evidente prin stimularea imunității și prin inducerea apoptozei celulare. Alte lectine utilizate sunt ricina, PNA ce izolează celulele mezoteliale dintre celulele adenocarcinoamelor.

Activitate antibacteriană și antiparazitară. Bacteriile prezintă pe suprafața lor diferite structuri ce le conferă anumite proprietăți.

E. coli face parte din categoria bacteriilor ce conțin fimbrii cu specificitate pentru manoză. Receptorii ce conțin manoză în lanțul lor sunt prezenți pe marginea în perie a enterocitelor, iar prin administrarea de lectine extrase din alge roșii sau de tipul GNA, se ocupă situsurile ce conțin manoză, intrând în competiție cu bacteriile comensale/saprofite din tubul digestiv, inhibându-le dezvoltarea (probioza chimică cu aplicații în nutriția rumegătoarelor).

Lectinele prezente pe suprafața unor helminți pot fi de tip C sau S și sunt responsabile de modularea răspunsului imun al gazdei în prevenirea descoperirii parazitului de către gazdă sau având proprietăți anticoagulante pentru nematodele hematofage de tipul Haemonchus contortus.

Lectinele parazitului se leagă de glucidele prezente pe membranele substratului căutat și împiedică transmiterea de semnale către organism, care nu se mai poate apăra.

Prin administrarea de lectine exogene cu afinitate pentru diferite glucide (manoză, galactoză) concomitent sau în compoziția unor medicamente antiparazitare, acestea pot interacționa asupra paraziților, fie prin competiție cu substratul glucidic, fie prin legarea de glucidele membranare ale acestuia, producând tulburări în dinamica și dezvoltarea acestuia (Takeya H. și colab., 1992).

Lectinele aglutinează și neutralizează microbii; lectinele blochează atașarea patogenilor de celulele gazdă; lectinele induc semnale letale în interiorul microbilor.

Fig. 2.11. Mecanismul de acțiune al lectinelor asupra microbilor

(Wu A. M., 2003)

Fig. 2.11. Mechanism of action of lectins on microbes

(Wu A. M., 2003)

Aplicații clinice

Hematologie. Datorită activității hemaglutinante, lectinele s-au utilizat în tipizarea sângelui. Astfel lectinele din Ulex europaeus identifică tipul O, Dolichos biflorus tipul A, Helix pomatia, Griffonia simpliciflora 1 tipul B, Griffonia simpliciflora B tipul AB, iar GNA este implicată în procesul hematopoiezei la șobolan.

Transplantul de măduvă osoasă. Lectinele din soia (SBA) pot diferenția limfocitele B și T din splina de șoarece, având aplicații în transplanturi, prin îndepărtarea celulelor limfocite imunocompetente din măduva osoasă, prin cuplarea lor cu anticorpi monoclonali legați de o lectină toxică-ricina.

Reproducție. Determinarea microheterogenității -fetoproteinelor din lichidul amniotic, fie prin cromatografie de afinitate cu ConA, fie prin imunoelectroforeză afină cu lectina din linte – test auxiliar pentru diagnosticul prenatal al malformațiilor. O altă nouă utilizare a lectinelor este în laboratoarele de fertilizare în vitro pentru cercetarea statusului acrozomilor.

Oncologie. Diagnosticul cancerului de sân cu ajutorul HPA (aglutinina din Helix pomatia) folosit ca marker. Tot cu HPA se poate prevede comportamentul agresiv al adenocarcinomului în stomac, prostată și colon, fiecare fază a procesului malign fiind caracterizată prin prezența unor glicoconjugați specifici, care sunt recunoscuți și legați de lectine. Alte lectine precum, PNA (lectina din arahide-Arachis hypogaea), DSA (Datura stramonium), PHA sunt utilizate în diagnosticul diferențial al leziunilor benigne de cele maligne ale cavității bucale, uterine, tiroidă sau în boli trofoblastice. Ele mai pot preciza și radiosensibilitatea tumorilor. WGA (aglutinina din germenii de grâu-Triticum spp) poate studia colangiocarcinomul, PMW identifică carcinomul papilar.

O problemă întâlnită în histopatologia chirurgicală este identificarea locului adenomului primar. De exemplu adenocarcinomul pulmonar se leagă puternic de WGA, PNA, RCA (aglutinina din Ricinus communis), iar cel metastatic din zona extrapulmonară reacționează cu aceste lectine în proporție de 70 %.

Terapie anticanceroasă poate fi aplicată prin utilizarea lectinelor ca:

imunomodulatori – MLI este lectina cea mai utilizată, ca preparat injectabil, pentru reducerea tumorilor recurente și metastazate;

pentru obținerea de imunotoxine;

stimulator al macrofagelor pentru eliberarea de citotoxine (galectinele).

Histologie, histopatologie. Datorită selectivității pentru țesuturile ce prezintă glicoconjugați, lectina din Ulex europaeus-UEA-I este utilizată în diagnosticul histopatologic pentru urmărirea vaselor de sânge, ea legându-se de celulele endoteliale și având aplicații în tumorile vasoformatoare, precum angiosarcomul sau în invazia vaselor de sânge în carcinomul folicular al tiroidei.

Boli infecțioase. Diagnosticul rapid al unor boli infecțioase, datorită interacțiunii lectinelor SBA cu Bacilus anthracis și a WGA cu Neisseria gonorrhoeae (Doyle M. P., 1994).

Tratamentul cu lectine poate fi utilizat în unele boli bacteriene datorită proprietăților antibacteriene ale acestora, care vor înlocui antibioticele în lupta împotriva colibacilozelor sau salmonelozelor la animale.

Recent a apărut un vaccin pe bază de lectine împotriva infecției cu Porphyromonas gingivalis (Katz J. și colab., 1999).

Parazitologie. Cercetările din cadrul USAMV București au demonstrat că lectinele pot fi agenți antiparazitari prin administrarea de lectine la șobolanii infectați cu Trichinella spiralis, determinând scăderea numărului de larve dezvoltate în mușchi. Alte experimente s-au realizat prin administrarea de lectine la șoareci infestați cu Toxoplasma gondii, obținându-se rezultate satisfăcătoare (Lungu T. și colab., 1982).

Lectinele se pot utiliza și ca excipienți în unele medicamente antiparazitare, ajutând la menținerea acestora în organism mai mult timp, sau prin modularea proprietăților directe ale medicamentului.

2.14. PROCESUL DE TRANSLOCARE

2.14. PROCESS TRANSLOCATION

Translocarea reprezintă un proces prin care proteinele se pliază incorect, scapă acțiunii chaperonilor, iar 1/3 din catenele polipeptidice nou sintetizate sunt selectate pentru degradare. Astfel în cazul unor glicoproteine pliate necorespunzător, ele suferă translocarea în citosol unde sunt îndepărtate oligozaharidele sub acțiunea unei N-glicanze.

Multe tipuri de proteine sunt transportate prin sau integrate în membrana reticulului endoplasmatic. Procesul este extrem de complex și poate fi divizat în două faze: faza de orientare (targeting) și faza de transfer propriu-zis.

Faza de targeting este relativ bine caracterizată pentru sistemele mamaliene.

Primul pas în secreția majorității proteinelor mamaliene este transportul lor în lumenul reticulului endoplasmatic (Görlich D. și colab., 1993). Transportul proteinelor în RE necesită prezența peptidelor semnal în precursorii proteici și o protein translocază în membrana reticulului endoplasmatic. De asemenea pentru translocare sunt necesare și proteine din lumenul reticulului endoplasmatic (Meacock S. L. și colab., 2000).

Orientarea co-translațională a unei polipeptide de secreție nascente, către membrana reticulului endoplasmatic, este inițiată de legarea cu mare afinitate a particulei de recunoaștere a semnalului (signal recognition particle-SRP), la secvența semnal amino-terminală, pe măsură ce aceasta iese din subunitatea mare a ribosomului.

SRP este un complex ribonucleoproteic citosolic, care leagă secvența semnal, ribosomul și o proteină receptor specifică – receptorul pentru SRP (docking protein). Elongarea lanțului polipeptidic este întârziată, chiar oprită până când complexul ribosom-lanț polipeptidic nascent-SRP, leagă receptorul pentru SRP. Acesta este o proteină integrată în membrana RE, formată din două subunități.

Într-o reacție GTP-dependentă secvența semnal este ulterior îndepărtată de SRP și integrată în membrană. Simultan ribosomul este ancorat la membrana reticulului endoplasmatic.

Legarea SRP la receptorul pentru SRP promovează două evenimente ulterioare: formarea unei interreacții stabile, mediată de receptor, între ribosom și membrana reticulului endoplasmatic, eliberarea lanțului nascent de SRP și inserția în membrana reticulului endoplasmatic.

In vitro absența uneia din cele două componente poate duce la inhibarea translocării. Ciclul de orientare a lanțului polipeptidic nascent către membrana reticulului endoplasmatic, mediat de SRP-docking protein, este nucleotid dependent. Docking protein (receptorul de SRP) trebuie să lege GTP pentru disocierea secvenței semnal de pe SRP, în timp ce disocierea ulterioară a SRP și docking protein, necesită hidroliza GTP la GDP (Oubridge C. și colab., 2002)

Necesarul de GTP pentru orientarea proteinelor către reticulul endoplasmatic se consideră că este un fel de mecanism de proofreding (citire corectă) molecular, care asigură asocierea corectă a polipeptidului cu membrana reticulului endoplasmatic (Nakano A., și colab., 1988)

Transferul propriu-zis al polipeptidului (faza de translocare); se presupune că procesul este mediat de canale care conduc proteinele, teorie susținută de datele electrofiziologice.

S-au propus mai mulți candidați ca și componente ale acestor canale. Dintre aceștia un rol important se acordă proteinei Sec61p, o proteină cu mai multe segmente transmembranare din membrana reticulului endoplasmatic (Ferreia D. și colab., 2003).

Câteva din segmentele transmembranare ale Sec61p conțin aminoacizi hidrofili chiar încărcați electric, sugerând că acestea pot contribui la realizarea unui interior hidrofil al canalului membranar. Această proteină la mamifere este strâns asociată cu ribosomii legați la membrană, sugerând că lanțul polipeptidic nascent este direct transferat de la ribosom în canalul ce include Sec61p. Faptul că Sec61p este strâns asociat cu ribosomii, arată că această proteină este implicată în atașarea ribosomilor la membrana reticulului endoplasmatic.

Un alt candidat la rolul de acceptor pentru ribosomi era considerată proteina p180 (Schuwirth B. S., și colab., 2005).

Ultimele studii au dovedit însă că p180 nu este esențială pentru legarea ribosomilor la membrana reticulului endoplasmatic. Studii cu microzomi reconstituiți din care s-a extras complet proteina p180 arată că activitațile de legare a ribosomilor și de translocare au ramas aproximativ nemodificate (Görlich D. și colab., 1993).

Sistemele majore care transportă proteinele prin membrană au următoarele componente: o secvență semnal amino-terminală în cadrul proteinei translocate, un sistem de orientare pe fața cis a membranei, un canal transmembranar hetero-oligomeric, un motor de translocare proteic situat la periferia membranei care funcționează prin hidroliza nucleozid trifosfaților și un sistem de pliere a proteinelor situat pe fața trans a membranei (Meyer D. I. și colab., 1980).

Diferite abordări au oferit dovezi directe ale implicării proteinelor din membrana reticulului endoplasmatic în translocarea polipeptidelor. Interacția ribosomilor cu componentele aparatului de translocare poate juca un rol în reglarea deschiderii și închiderii canalului de translocare în timpul inserării co-translaționale a proteinelor.

Altă componentă a aparatului de translocare poate fi proteina TRAM (translocating chain associating membrane protein). Aceasta interacționează cu polipeptidele doar în etapa timpurie de penetrare a membranei, pe când interacția cu Sec61p are loc în stadii târzii ale transferului (Nicchitta C. V., și colab., 1995).

Se consideră că în translocare sunt implicate și proteine rezidente în lumenul reticulului endoplasmatic. Printre acestea se numără proteinele de stress BiP/GRP78, GRP 94, disulfid izomeraza (PDI), calreticulina, peptidil cis-trans izomeraza etc. Rolul acestor componente în translocare este însă puternic disputat.

Modificarea și plierea polipeptidelor nascente are loc concomitent cu translocarea lor prin membrana reticulului endoplasmatic. Clivarea secvenței semnal amino-terminale este realizată de peptidaza semnal, purificată ca parte a unui complex de cinci polipeptide. Adiția covalentă a lanțurilor laterale carbohidrate N-legate, implică participarea enzimei oligozaharil-transferaza, un complex de trei polipeptide (OST 48, riboforina I și riboforina II).

Glicanii sunt grupări glucidice cu masă moleculară variată care sunt legate de proteine (proteoglicani), peptide (peptidoglicani) sau lipide (lipidoglicani).

Glicanii (poliglucide) sunt glucide macromoleculare cu structură liniară sau ramificată, formate prin policondensarea unui mare număr de oze sau derivați ai acestora (aminoglucide, acizi uronici), între care se stabilesc legături glicozidice. Gradul de polimerizare variază de la zece până la mii de unități monoglucidice. La baza structurii poliglucidelor stau unele diglucide reducătoare (maltoza, izomaltoza, celobioza) care prin polimerizare formează poliglucidul macromolecular respectiv. Prin hidroliza parțială sau totală a poliglucidelor se eliberează diglucidele sau ozele corespunzătoare. Poliglucidele sau glicanii se clasifică în homopoliglucide (homoglicani) și heteropoliglucide (heteroglicani). Homoglicanii eliberează prin hidroliză un singur tip de oză (sau derivat), iar heteroglicanii eliberează 2 – 4 tipuri de oze sau derivați ai acestora (Trincă L. și colab., 2003).

Glicanii sunt procesați cu ajutorul enzimelor din reticulul endoplasmatic și proteina se pliază sub acțiunea proteinelor chaperon. Proteina chaperonă este o proteină a cărei funcție este de a asista (ajuta) alte proteine în maturarea lor, asigurând o pliere tridimensională adecvată a lor. Multe proteine chaperone sunt proteine de șoc termic (Heat shock proteins: Hsp), adică proteine care se manifestă ca răspuns la variațiile de temperatură (stresul celular, etc). (Wu C., 1995).

Proteinele chaperone pot fi implicate în: împachetarea corectă a proteinelor; oligomerizarea proteinelor; “repararea” proteinelor alterate; translocarea proteinelor în diferite compartimente celulare (Szebeni A. și colab., 1999).

Fig. 2.12. Rolul proteinelor “Chaperone”

(Szebeni A. și colab., 1999)

Fig. 2.12. Role of protein "Chaperone"

(Szebeni A. et all., 1999)

Cazul special al proteinelor care se integrează în membrana reticulului endoplasmatic pune probleme speciale în legătură cu aparatul de translocare. Se știe puțin despre integrarea proteinelor în membrană cu excepția faptului că sunt de asemenea direcționate către membrana reticulului endoplasmatic de SRP și receptorul de SRP și sunt translocate în proximitatea lui Sec61p. Se presupune că acel canal prin care sunt conduse proteinele, se deschide la un moment dat în lateral și eliberează segmentele transmembranare hidrofobe ale polipeptidului, numite secvențe stop-transfer, în bistratul lipidic (White S. H. și colab., 2005).

Proteinele care sunt complet translocate în lumenul reticulului endoplasmatic și majoritatea proteinelor integrale de membrană de tip I, conțin de obicei o peptidă semnal amino-terminală hidrofobă. În aceste proteine transmembranare de tip I, urmează o secvență de aminoacizi hidrofobi (secvență stop-transfer) care ancorează polipeptidul în membrana reticulului endoplasmatic, cu domeniul amino-terminal în lumen.

În proteinele transmembranare de tip II, în lumenul reticulului endoplasmatic se găsește domeniul carboxi-terminal. Distribuția sarcinilor din jurul peptidului semnal, pare să fie primul determinant al orientării proteinei în membrana reticulului endoplasmatic, dar nu este suficient pentru a genera o topologie uniformă. Starea de pliere a segmentului amino terminal, care va fi translocat posttranslațional și lungimea regiunii hidrofobe a secvenței semnal, sunt criterii adiționale care determină orientarea proteinelor. O combinație de peptide semnal de ancorare și secvențe stop-transfer, se consideră că sunt necesare orientării proteinelelor transmembranare (Görlich D. și colab.,1993). Există încă o serie de întrebări legate de procesul de translocare din membrana RE.

Principala direcție de cercetare are la bază reconstituirea aparatului de translocare din membrana RE, în proteoliposomi, cu proteine purificate.

Fig. 2.13. Modelul translocării proteinelor în reticulul endoplasmatic la mamifere: componente care mediază orientarea, inserția și maturarea polipeptidelor

(Mingarro I. și colab., 2000)

Fig. 2.13. The translocation of proteins in the endoplasmic reticulum in mammals:

components that mediate targeting, insertion and polypeptide maturation.

(Mingarro I. et all, 2000)

2.15. COMPONENTELE APARATULUI DE TRANSLOCARE

2.15. APPLIANCE PARTS TRANSLOCATION

2.15.1. Particula de recunoaștere a semnalului (SRP)

Particula de recunoaștere a semnalului (SRP), la mamifere este o ribonucleoproteină citoplasmatică mică, necesară pentru translocarea proteinelor prin membrana RE. Aceasta servește ca adaptor între aparatul citoplasmatic de sinteză a proteinelor și aparatul de translocare a proteinelor legate de membrană. Astfel este localizată atât în citoplasma cât și la suprafața citoplasmatică a membranei RE. SRP și receptorul său legat de membrana reticulului endoplasmatic, reprezintă un sistem de orientare a proteinelor larg răspândit, în sistemele procariote și eucariote (Stirling C.I. și colab., 1992).

Structura. SRP conține o moleculă de ARN 7S (300 nucleotide) și șase polipeptide distincte. Unitatea funcțională minimă a SRP este constituită dintr-o proteină de recunoaștere a secvenței semnal și o moleculă de ARN.

Polipeptidele din structura SRP suferă un complex proces de asambare. Cele șase lanțuri sunt organizate în patru proteine SRP: doi monomeri (o polipeptidă de 19 Kda si alta de 54 Kda) și doi heterodimeri- p9/14 (format dintr-un polipeptid de 9 Kda și unul de 14 Kda) și p 68/72 (format dintr-un polipeptid de 68 Kda si altul de 72 Kda).

ARN 7S străbate lungimea particulei SRP, care, văzută la microscopul electronic are o formă de tijă, o structură alungită. SRP poate fi disecat biochimic în două domenii structurale și funcționale. Unul conține proteina p9/14 legată la ARN 7S în regiunea care conține secvențe Alu și celălalt (domeniul S) conține restul proteinelor și ARN.

Funcție. Peptidele semnal direcționează orientarea co-translațională a polipeptidului nascent către reticulul endoplasmatic. SRP mediază această orientare, mai întâi prin legarea secvenței semnal și apoi prin direcționarea complexului ribosom/lanț nascent/SRP către receptorul de SRP din membrană. Legarea SRP la secvența semnal duce fie la o arestare completă, fie la o întârziere cinetică a elongării, până ce lanțurile nascente sunt aduse la membrană. Această activitate de arestare a elongării este mediată de domeniile Alu ale particulei, iar recunoașterea secvenței semnal și orientarea către reticulul endoplasmatic sunt mediate de domeniul S.

Specificitatea orientării este obținută printr-o interacție a SRP, legat de ribosom, cu receptorul de SRP, o proteină din membrana RE, heterodimeră numită și docking protein. La nivelul membranei RE, ribosomul este înmânat altor componente membranare care facilitează mișcarea transmembranară a lanțurilor nascente. Deci, SRP și proteina receptor de SRP funcționează concertat pentru a iniția formarea unei joncțiuni ribosom- membrană (Stub K. și colab., 1991).

Pentru interacțiunea între SRP și receptorul său, ribosom, secvența semnal și membrană este necesar GTP. Hidroliza GTP-ului, eliberează proteina SRP după ce ribozomul se leagă la membrană. Se pare că o componentă ribosomală promovează legarea GTP la subunitatea SRP54 a complexului. GTP legat de SRP54 este esențial pentru interacțiunea de mare afinitate dintre SRP și receptorul său din membrana reticulului endoplasmatic. Aceasta intracțiune induce eliberarea secvenței semnal de SRP, inserția polipeptidului nascent în canalul de translocare și hidroliza GTP. Hidroliza este realizată de trei GTP-aze (Meyer D.I. și colab., 1980).

Localizare. Proteina SRP se găsește egal distribuită între o stare asociată membranei reticulului endoplasmatic (38%) și liberă sau asociată cu ribozomii (47%). ARN 7S: conține aproximativ 300 de nucleotide, două secvențe cu aproximativ 80% omologe cu familia de secvențe repetitive Alu de la mamifere, una în capătul 5. (100 de nucleotide) și una la capătul 3. (50 de nucleotide). ARN-ul 7S are o structură secundară cu multe baze împerecheate care poate fi împărțită în patru domenii.

SRP 68/72: se leagă ca heterodimer la ARN 7S și participă la funcția de orientare realizată de SRP. Proteina SRP 68 conține 622 de aminoacizi. În regiunea amino-terminală există o secvență bogată în glicină caracteristică unor proteine ce leagă ARN. SRP 54: conține situsul de recunoaștere a secvenței semnal și de legare a SRP.

Determinarea structurii primare a SRP54 arată că proteina conține două domenii: unul amino-terminal ce leagă GTP-ul (domeniul G) și domeniul carboxi-terminal, foarte bogat în resturi de metionină (domeniul M). Această structură pe domenii se reflectă în structura terțiară a proteinei, domeniile G și M fiind legate de o regiune sensibilă la proteaze. Disecția proteolitică a demonstrat că regiunea de legare a secvenței semnal se încadrează în domeniul M. Același domeniu leagă SRP54 la restul particulei.

SRP 19: este deasemenea o proteină bazică, care se poate lega la ARN 7S.

Legarea proteinei SRP19 la ARN 7S produce o modificare conformațională a ARN-ului ce permite proteinei SRP54 să se lege la particulă (Meyer D.I. și colab., 1980). SRP 9/14: este necesar pentru funcția de arestare a elongării a proteinei SRP. În procesul de arestare a elongării un rol important îl are domeniul COOH-terminal al SRP14. Se leagă la ARN 7S exclusiv la domeniul Alu (Görlich D. și colab., 1994).

Există doi pași în recunoașterea peptidelor semnal în timpul translocării. Primul pas este recunoașterea de către SRP, care duce la arestarea elongării și al doilea pas este interacțiunea între peptida semnal și canalul de translocare situat în membrana reticulului endoplasmatic. Ambele etape sunt influențate de regiunile hidrofobe din structura secvenței semnal. Hidrofobicitatea totală este determinantă pentru recunoașterea atât de către SRP cât și de aparatul de translocare din membrană, deși specificitatea celor doi pași de recunoaștere este diferită.

În cazul celui de-al doilea pas de recunoaștere a secvenței semnal, este esențială și suficientă prezența în membrană a complexului Sec61p. Se formează o joncțiune strânsă între complexul ribosom-lanț nascent și Sec61p și are loc inserția eficientă a proteinei în situsul de translocare (Tazawa S. și colab., 1991).

2.15.2. Proteina receptor de SRP (docking protein)

Această proteină este un receptor din membrana reticulului endoplasmatic rugos, specific pentru SRP. Mediază atașarea secvenței semnal a polipeptidei nascente împreună cu ribosomul, ARNm și SRP la membrana RE. Docking protein reprezintă, deci, interfața între evenimentele din citosol și membrană.

Structura. Este o proteină alcătuită din 638 de aminoacizi, cu o masă moleculară relativă de 69,7 Kda. Regiunea carboxi-terminală de 300 aminoacizi are un grad foarte mare (>85%) de conservare între toate speciile examinate, sugerând că această regiune reprezintă un domeniu funcțional important, coroborat cu faptul că în jumătatea carboxi-terminală a moleculei există secvențe consensus pentru legarea GTP-ului. Structura primară relevă, de asemenea, două regiuni amino-terminale de aminoacizi hidrofobi, presupuse a fi ancore membranare. De asemenea în jumătatea amino-terminală a moleculei există trei regiuni extrem de hidrofile, în care 50% din resturi sunt încărcate electric, aproximativ două treimi din ele fiind bazice. S-a sugerat că legarea docking protein la SRP se produce pe calea unei interacțiuni între aceste regiuni și ARN-ul din molecula de SRP.

Localizare. Receptorul de SRP este o proteină integrală de membrană. Studii utilizând anticorpi anti-receptori de SRP în conjugare cu fracții subcelulare, au demonstrat localizarea lui primară în domeniile rugoase ale RE, unde reprezintă aproximativ 0,1% din totalul proteinelor membranare. În anumite cazuri receptorul de SRP a fost observat în cantități mult mai mici în fracții de reticul endoplasmatic neted. Majoritatea celor 638 de aminoacizi, din structura proteinei, sunt expuși pe fața citosolică a RE rugos (Voigt S. și colab., 1996).

Docking protein este o componentă esențială a mașinăriei care mediază orientarea lanțurilor nascente către reticulul endoplasmatic. Se pare că, în cazul translocării receptorului de SRP, orientarea acestei proteine către membrana reticulului endoplasmatic, se realizează

printr-un mecanism deosebit. Nu se inseră în membrană printr-un proces clasic mediat de SRP/docking protein, nici prin inserția secvențelor hidrofobe în membrana reticulului endoplasmatic. În schimb, asamblarea membranară a docking protein este mediată de receptori, necesitând prezența anumitor proteine membranare sau de alt tip.

2.15.3. Proteina TRAM (translocating chain associating membrane protein)

Proteina TRAM este o proteină integrală de membrană cu mai multe secvențe transmembranare, prezentă în reticulul endoplasmatic rugos la mamifere. Este localizată în proximitatea lanțului polipeptidic nascent, în faza timpurie a trecerii acestuia prin membrană. Ea este stimulatoare și necesară pentru procesul de translocare.

Structura. Este o proteină integrală de membrană glicozilată, cu 373 aminoacizi, cu o greutate moleculară aparentă de 36 Kda. Străbate bistratul lipidic de opt ori și are o coadă carboxi-terminală de aproximativ 60 resturi. Conține un lanț carbohidrat N-linkat. Proteina TRAM este prezentă în RE rugos în cantități cel puțin echivalente cu ale ribosomilor legați de membrană.

Funcția. Translocarea proteinelor prin membrana reticulului endoplasmatic necesită pe lângă receptorul de SRP și Sec61p, prezența proteinei TRAM, a carei funcție este încă destul de puțin înțeleasă. S-a constatat că proteina TRAM este în proximitatea lanțurilor nascente în etapa timpurie a translocării lor prin membrana reticulului endoplasmatic.

Într-un sistem intern, folosind proteoliposomi reconstituiți, proteina TRAM este stimulatoare sau necesară pentru translocarea unora, dar nu tuturor proteinelor de secreție (Prinz W. A. și colab., 2000). Structura secvenței semnal determină dacă TRAM este sau nu necesară. Trăsăturile care deosebesc secvențele semnal dependente de TRAM de cele independente sunt: lungimea regiunilor încărcate, regiunea amino-terminală și structura miezului hidrofob.

În cazurile în care proteina TRAM este necesară, nu este nevoie de ea pentru interacțiunea dintre complexul ribosom-lanț nascent și membrana reticulului endoplasmatic, ci pentru o etapă ulterioară în care lanțul polipeptidic este inserat în situsul de translocare într-o manieră rezistentă la proteaze. Deci TRAM funcționează într-o manieră dependentă de secvența semnal, într-o etapă timpurie, critică pentrul procesul de translocare.

S-a arătat că proteina TRAM contactează porțiunea amino-terminală a secvenței semnal a lanțului polipeptidic nascent (Görlich D. și colab., 1992).

2.15.4. Proteina Sec 61p

Este o proteină omoloagă cu SecYp bacterian și Sec61p de la Sacharomyces cerevisiae și se găsește în membrana reticulului endoplasmatic la mamifere. Are mai multe segmente transmembranare și este localizată în proximitatea lanțului polipeptidic în timpul procesului de traversare a membranei reticulului endoplasmatic. La mamifere, Sec61p este strâns asociat cu ribosomii legați de membrană (Morgan D. G., 2002) și face parte din canalul ce conduce lanțul polipeptidic nascent.

Structura. Este o proteină integrală de membrană, neglicozilată, cu 476 aminoacizi, cu o greutate aparentă în geluri SDS de 40 Kda. Aproximativ 55% din aminoacizi sunt identici cu cei ai Sec61p de la S. cerevisiae. Mai multe regiuni ale proteinei au similaritate semnificativă cu SecYp de la eubacterii și archaebacterii.

Toate proteinele acestei clase se presupune că traversează membrana de zece ori și au capetele amino-terminal și carboxi-terminal în citosol (Menetret J. F. și colab., 2000).

Rolul în translocare. Sec61p formează componenta principală a complexului de translocare a proteinelor (transloconul) din membrana reticulului endoplasmatic rugos.

Ribosomii se leagă cu afinitate mare la liposomii care conțin Sec61p purificat, deci proteina este strâns legată de ribosomii atașați la membrană. S-a dovedit apropierea proteinei Sec61p de lanțurile nascente în toate etapele transferului lor prin membrana reticulului endoplasmatic. Aceasta sugerează că Sec61p este un constituent major al unui canal din membrana reticulului endoplasmatic, prin care trec proteinele în cadrul procesului de translocare. Interacțiunea nu se produce exclusiv prin intermediul lanțurilor polipeptidice nascente (Menetret J. F. și colab., 2000).

Recent s-a sugerat că proteina Sec61p (numită in ultimul timp Sec61α), împreună cu două polipeptide mai mici, Sec61β și Sec61γ, formează canalul conducător al polipeptidelor nascente.

Sec61α se găsește în apropierea lanțurilor polipeptidice nascente în timpul translocării.

Este o proteină integrală de membrană, politopică, componentă majoră a canalului transmembranar de translocare. Această subunitate este implicată în transferul polipeptidului nascent din complexul ribosom-lanț nascent în canalul de translocare, prin desprinderea polipeptidului de SRP. Atunci când proteina Sec61α este inactivată sau lipsește, disocierea lui SRP54 de secvența semnal nu are loc. Deci nu se produce transferul polipeptidului nascent în canalul de translocare.

Aceasta sugerează că Sec61α este implicat și în reglarea ciclului de hidroliză a GTP de către complexul SRP-receptor de SRP, în etapa disocierii SRP54 de peptida semnal. Sec61β: subunitatea β a complexului, realizează contacte cu ribosomii. Activitatea de legare a ribosomilor a Sec61β este sensibilă la concentrații mari de sare și nu se bazează pe interacțiunea electrostatică nespecifică între Sec61β, proteină relativ bazică și ARN ribosomal. Sec61β se leagă în special la subunitatea mare a ribosomilor. Studii anterioare sugerau că Sec61β nu este necesar pentru legarea ribosomilor și pentru translocare.

Procesul de translocare este însă împiedicat de absența lui Sec61p. Astfel s-a propus ca ipoteză faptul că această proteină asistă la inserția polipeptidelor nascente în canalul de translocare. S-a demonstrat că în timpul inserției în membrană a proteinelor nascente, Sec61β se găsește în proximitatea acestora.

Sec 61γ intră, de asemene,a în structura canalului de translocare. Are rol în stabilirea contactelor cu ribosomii.

Translocarea co-translațională a proteinelor necesită legarea ribosomilor la canalul format de Sec61p la nivelul membranei reticulului endoplasmatic. Pentru a determina structura complexelor ribosom-canal s-a folosit criomicroscopia electronică, în prezența și în absența polipeptidului nascent. Surprinzător, structurile sunt similare și conțin 3-4 conexiuni între ribosomi și canal, care lasă o deschidere laterală înspre citosol. Deci joncțiunea ribosom-canal poate permite transferul direct al polipeptidului în canal și furnizează o cale de ieșire a unor lanțuri nascente în citosol (Suzuki M. și colab., 2003). Complexele solubilizate din celulele mamaliene, conțin o proteină adițională din membrana reticulului, care are un domeniu lumenal mare și este intercalată în peretele canalului. Deci, canalul nativ conține și o componentă care nu este esențială pentru translocare.

Proteinele secretorii și transmembranare pliate greșit sunt reținute în reticulul endoplasmatic și ulterior degradate. Degradarea este dependentă de proteasomi citosolici, deci este necesar transportul retrograd din reticul înapoi în citosol. Canalul de conducere a proteinelor, format de Sec61p este responsabil atât pentru transportul în reticulul endoplasmatic, cât și pentru transportul retrograd.

În cazul proteinelor transmembranare, transportul retrograd poate fi privit ca o reversie a procesului de integrare a proteinei în membrana reticulului. În cazul proteinelor solubile, transportul retrograd, după clivarea secvențelor semnal, este diferit de importul mediat de peptida-semnal (Migliaccio E. și colab., 1992).

2.15.5. Complexul proteic asociat transloconului (TRAP)

Complexul TRAP este format din patru polipeptide (TRAPα, TRAPβ, TRAPγ și TRAPδ) și este o componentă abundentă a membranei reticulului endoplasmatic la vertebrate. Mai este numit și signal sequence receptor (SSR).

Dupa atașarea SRP la receptorul său, peptida semnal se desprinde atât de ribosom cât și de SRP. Ulterior această secvență semnal se va lega la proteina TRAP (de unde și denumirea de signal sequence receptor).

Componentele minime ale aparatului de translocare se pare ca sunt complexul Sec61p, proteina TRAM și receptorul de SRP. Cu toate acestea, unele proteine, cum sunt proteinele prion (PrP), sunt ineficient sau incorect translocate folosind doar aceste componente. S-a identificat un factor necesar translocării acestor proteine, acesta fiind complexul proteic asociat transloconului (translocon-associated protein complex) sau TRAP. Surprinzător TRAP stimulează și translocarea altor substrate, într-o manieră influențată de secvențele semnal.

Analiza comparativă a mai multor secvențe semnal naturale, sugerează că dependența translocării de complexul TRAP, nu se datorează unui singur parametru fizic, cum ar fi hidrofobicitatea secvenței semnal. În schimb, o proprietate funcțională a semnalului, eficiența rolului său în inițierea translocării substratului, este invers proporțională cu dependența față de TRAP.

Deci, translocarea maximă, independent de proteina TRAM, poate fi obținută doar cu o secvență semnal a cărei interacțiune puternică cu transloconul mediază trecerea prin membrană la scurt timp după orientarea substratului către reticulul endoplasmatic.

Aceste rezultate identifică complexul TRAP ca o componentă funcțională a transloconului și demonstrează că acționează într-o manieră substrat-specifică, pentru a iniția translocarea (Evans E.A. și colab., 1986).

Proteinele din complexul TRAP: toate cele patru subunități sunt proteine integrale de membrană. Acestea se găsesc în raport stoichiometric în membrana reticulului.

Subunitățile α, β, γ traversează o dată membrana, cu capătul carboxi-terminal în citoplasmă și capătul amino-terminal în lumenul reticulului endoplasmatic. Subunitatea β traversează membrana de patru ori. Subunitațile α și β conțin doi carbohidrați. Subunitatea α poate fi fosforilată la capatul carboxi-terminal în vivo sau în vitro și poate lega Ca2+, probabil datorită capătului amino-terminal încărcat negativ. Subunitatea δ traversează membrana o singură dată și are cea mai mare parte situată în lumen.

Subunitațile α, β și δ sunt sintetizate cu secvențe semnal clivabile și inserate în membrana reticulului endoplasmatic într-o manieră dependentă de SRP/ receptorul de SRP.

Localizare. Complexul TRAM este localizat în porțiunea rugoasă a membranei reticulului endoplasmatic. Complexul este prezent în cantități cel puțin echivalente cu ribosomii legați de membrană.

Funcția. Cercetările au demonstrat că TRAP este adiacent diferitelor lanțuri polipeptidice translocate. Este o proteină majoră a membranei reticulului endoplasmatic rugos și se localizează în vecinătatea ribosomilor legați de membrană. Anticorpi anti-TRAPα și fragmentele Fab produse din anticorpi blochează translocarea in vitro a unor proteine secretorii. Aceste proprietați indică faptul că TRAP este localizat în situsul de translocare. Cu toate acestea este foarte probabil să nu aibă un rol esențial în translocare în majoritatea cazurilor (Tyedmers J. și colab., 2003).

Peptidaza semnal. După cum am menționat, majoritatea precursorilor proteinelor secretorii conțin o secvență semnal amino-terminală, care este clivată de enzima peptidază semnal, în timpul procesului de translocare.

Peptidaza semnal este localizată exclusiv în reticulul endoplasmatic rugos. Este o proteină integrală de membrană cu situsul catalitic activ proziționat pe partea lumenală a membranei reticulului endpolasmatic.

Peptidaza semnal a fost purificată sub forma unui complex constituit din cinci proteine cu mase moleculare 12, 18, 21, 22/23 si 25 KDa. Dubletul 22/23 KDa reprezintă două forme ale aceleiași proteine, care conține lanțuri oligozaharidice înalt manozilate, procesate diferit (Kornfeld R. și colab.,1985).

2.15.6. Proteina BiP

Este una din proteinele lumenale abundente din reticulul endoplasmatic. Proteina de legare a lanțurilor grele ale imunoglobulinelor (immunoglobulin heavy chain binding protein) sau BiP, poate substitui întregul set de proteine lumenale implicate în translocare. Deci BiP este o proteină lumenală cu rol important în translocarea eficientă a lanțurilor polipeptidice nascente în reticulul endoplasmatic (Reynolds E.S. și colab., 1984).

În procesul de translocare sunt implicate și alte proteine din lumenul reticulului endoplasmatic. Printre acestea se numără GRP94, calreticulina calnexina, disulfidizomeraza, peptidil cis-trans izomeraza, oligozahariltransferaza etc.

PARTEA A II-A

CERCETĂRI PROPRII

SECOND PART

PERSONAL RESEARCHES

CAPITOLUL III

SCOPUL LUCRĂRII, MATERIALUL BIOLOGIC STUDIAT, METODA DE LUCRU FOLOSITĂ

CHAPTER III
PURPOSE OF WORK, THE BIOLOGICAL MATERIAL STUDIED, THE WORK METHOD USED

3.1. Scopul lucrării

Câinele și pisica, ca animale de companie, beneficiază astăzi de un statut privilegiat, împărțind cu omul mediul habitant, hrana și îngrijirea atentă a acestuia, factori ce fac să atingă vârste apreciabile și deci riscul de a contracta o afecțiune tumorală.

Studiul a urmărit incidența tumorilor mamare după specie, vârstă, rasă, stare reproductivă, localizarea și diagnosticarea acestora prin examen histopatologic și examen biochimic.

Examenul biochimic s-a realizat prin determinarea cantitativă și calitativă a glicoproteinelor din serul sanguin, precum și din tumorile mamare de la cățea și pisică.

Determinârile glicoproteinelor din tumori și sânge s-au realizat la Clinica de Patologie Obstretricală, Catedrele de Anatomie Patologică și Biochimie Medical-Veterinară din Cadrul Facultății de Medicină Veterinară – București, unde am desfășurat cercetarea.

3.2. Materialul biologic studiat

Cercetările au fost efectuate în perioada 05.01.2010 – 28.11.2012 pe un număr de 376 de animale din care 220 de cățele și 156 de pisici, de rase diferite, care au prezentat tumori mamare.

3.3. EXAMENUL CLINIC

3.3. CLINICAL EXAMINATION

Examenul clinic are o importanță deosebită în diagnosticul afecțiunilor glandelor mamare, datorită faptului că acestea sunt organe ușor accesibile investigațiilor uzuale: inspecție, palpație, precum și observației constante în cazul unui control periodic de sănătate al animalului.

Examenul clinic a fost însoțit obligatoriu de o anamneză corectă privind istoricul bolii, evoluția ei și eventual circumstanțele de apariție. Examenul clinic a putut diferenția, într-o primă etapă, un proces tumoral de un proces inflamator și poate orienta etapele ulterioare ale diagnosticului.

Principalii parametri urmăriți în cadrul examenului clinic au fost:

• Localizarea topografică – care a identificat existența unei tumori singulare sau a localizării multiple. Localizarea, ținând cont de perechea sau mamela implicată, nu este indiferentă, datorită, în principal, circulației limfatice. Cea mai frecventă localizare și cea mai perfidă se consideră că este localizarea la perechea mamară inghinală.

• Diametrul tumorii: a fost un alt parametru urmărit în cadrul examenului clinic. Acesta poate varia între 0,5-10 cm la pisică și 0,5-20 cm la canide. El este greu de apreciat în cazul tumorilor multiple, care confluează, formând o rnasă tumorală compactă.

• Conturul tumorii: a fost apreciat prin inspecție și palpație. Acesta constituie caracteristica macroscopică cea mai importantă pentru definirea malignității, în contrast cu tumorile benigne, care prezintă un contur net și o delimitare precisă față de țesuturile adiacente, respectiv încapsulate, tumorile maligne au contur neregulat stelat, cu proiecții radiale în țesuturile limitrofe și sunt neîncapsulate, lipsa încapsulării macroscopice corespunzând și unei lipse de delimitări histologice.

• Consistența tumorii a fost corelată cu conturul acesteia și cu particularitățile suprafeței de secțiune. Astfel, o consistență moale, cu substanță mucoidă pe suprafața de secțiune, se asociază frecvent tumorilor bine delimitate. Retracția în zona centrală a tumorii, cu o densitate mai mare, se asociază, de regulă, cu cazurile cu rară delimitare macroscopică. O grupă aparte o constituie sarcoamele, prin criteriile macro- și microscopice. Ele se pot prezenta ca formațiuni nodulare, de dimensiuni variate și consistență diferită (densă în cadrul fibrosarcoamelor și condrosarcoamelor și moale în cazul angiosarcoamelor). Sarcomul reproduce pe suprafața de secțiune aspectul semnalat frecvent la majoritatea tumorilor cu origine în țesuturi moi respectiv suprafața lucioasă cu arii hemoragice și necrotice. Cele dezvoltate la nivelul mamelonului pot fi leiomiosarcoame de tip ulcerativ.

Macroscopic, examenul clinic poate semnala și alte aspecte caracteristice tumorilor maligne: modificări tegumentare, pigmentare, edem, ulcerații superficiale sau profunde, aderente la piele sau la planurile profunde. Tumora poate adera, astfel, la fascia profundă sau la planul muscular, pe care le invadează și dilacerează.

Un element foarte important al examenului clinic a fost aspectul macroscopic al limfoganglionilor care variază în raport cu gradul de invazie. În aprecierea limfocentrilor s-a avut în vedere:

• Topografia: celulele tumorale din structura carcinoamelor pătrund predominant pe cale limfatică și ajung, în primul rând, în limfocentrii regionali.

De la un grup ganglionar, fluxul limfatic poartă adesea celule tumorale către grupul ganglionar următor, în interiorul limfocentrilor, procesul malign poate prolifera extensiv; în asemenea cazuri, calea limfatică respectivă este blocată, limfa urmând o cale deviată și face posibilă invadarea unui grup ganglionar situat relativ depărtat. De aceea, procesul de metastazare îmbracă, în unele cancere o topografie proprie, inclusiv în cancerele mamare.

• Dimensiunea: limfocentrii cu metastaze sunt, de regulă, măriți în volum. Ei pot atinge, în majoritatea cazurilor, dimensiunile din limfoamele maligne, din actinomicoză și din tuberculoza cazeificată. Totuși, adenomegalia poate fi apreciabilă, în stadiile de început ale bolii sau chiar în condițiile invadării totale, cu toate acestea ei pot rămâne aproape de limitele normale.

• Forma: deseori limfocentrii metastatici au o formă rotunjită și pot prezenta o suprafață neregulată, datorită invadării capsulei și a aderențelor consecutive. Suprafața limfoganglionilor ingvinali, prescapulari, precum și a celorlalți ganglioni regionali, poate fi neregulată.

• Consistența s-a apreciat prin palpare: puncția este ușor de efectuat, datorită consistenței crescute a limfocentrilor afectați de metastaze. Ei au o consistență fermă, uneori chiar deosebit de tare (lemnoasă). Gradul de consistență este un indiciu al proceselor de proliferare conjunctivă ce au loc în structura acestora, în cazuri de boală avansată, în care se produc necroze ale limfocentrilor și perilimfagite întinse, limfocentrii își pierd individualitatea, contopindu-se într-o masă dură. Foarte rar, consistența este mai moale, asociindu-se cu o distrucție necrotică centrală.

• Mobilitatea: care a fost apreciată prin palpare are importanță semiologică, fiind un criteriu de apreciere a gradului de invadare a capsulei și al țesuturilor din jur. Pielea rămâne de obicei liberă și se poate deplasa deasupra masei limfocentrului.

• Sensibilitatea: a fost apreciată prin palpare superficială și profundă. Limfocentrii cuprinși de metastaze nu sunt dureroși, în mod obișnuit. Atunci când există sensibilitate sau durere, aceasta se explică prin topografia deosebită a ganglionilor, compresiunea limfocentrilor asupra unor formațiuni nervoase din vecinătate, fiind responsabilă de hiperestezia întregii regiuni.

Datele semiologice complete, furnizate de examenul clinic, examenele paraclinice, ecografice și radiografice au permis clasificarea subiecților cu cancer pe baza extinderii bolii printr-o metodă unică de evaluare și comparare, în care principiile fundamentale sunt aplicate tuturor localizărilor.

Acest sistem este cunoscut ca sistemul de stadializare clinică a tumorilor maligne (TNM). El furnizează comunicări și informații esențiale, schimbă planurile terapeutice și constituie un ghid util pentru prognostic și tratament.

Sistemul TNM evaluează:

• extinderea tumorii primare = T;

• starea limfocentrilor regionali = N;

• absența sau prezența metastazelor la distanță = M.

La toate aceste notații se adaugă numerele 0, 1,2, 3, 4, care indică extinderea procesului malign; notațiile a, b și c care furnizează date legate de mobilitatea sau aderența tumorii; notația x care indică prezența tumorii fără ca aceasta să poată fi evidențiată. Stadializarea clinică TNM a tumorilor mamare la canide și feline este prezentată în tabelul 3.1.

Tabel 3.1.

Stadializarea clinică a tumorilor mamare la canide și feline

(Harday W. D., 1976, modificat)

Table 3.1.

Clinical staging of canine and feline mammary tumors

(Harday W. D., 1976, modified)

3.4. EXAMENUL radiologic

3.4. RADIOLOGICAL EXAMINATION

Este o metodă de vizualizare larg răspândită în medicina veterinară, care furnizează detalii cu privire la mărimea formațiunii tumorale, arhitectură, contur, densitate, poziție și funcție.

Examenul radiologic s-a efectuat cu aparatul Röntgen cu raze X.

O metodă frecvent folosită de explorare radiologică este tomografia computerizată. Aceasta constă în computerizarea și reconstituirea datelor rezultate din diferențele de densitate ale fracțiunilor tumorale traversate de curente extrem de fine de radiații X. Examinarea a constat în expunerea regiunii corporale la un fascicul îngust de raze X, care se rotește încet.

Date obținute au fost prelucrare de computer și imaginile redate pe un tub catodic.

3.5. EXAMENUL ECOGRAFIC

3.5. ULTRASOUND

Ultrasonografia sau ecografia este o metodă de vizualizare care se bazează pe reflexia de către corp a impulsurilor sonore, care sunt preluate din nou de emițător și care prin prelucarea specială, reproduce imaginea organului reflectorizant pe un ecran. Este metodă superioară de vizualizare deoarece nu are efecte distructive, putând fi aplicată repetat, și oferă detalii de apreciare a structurii țesutului examinat.

Folosind această metodă, am comparat imaginea țesutului mamar sănătos cu cea a țesutului mamar cu tumoră, dar nu am putut preciza tupul tumoral (malign sau benign).

3.6. EXAMENUL HISTOPATOLOGIC

3.6. HISTOPATHOLOGY

Este esențial în stabilirea caracterului benign sau malign al tumorii, a contuitei terapeutice ulterioare, cât și al prognosticului.

Examenul histopatologic s-a efectuat prin examinarea microscopică a preparatelor histopatologice efectuate din fragmentele tumorale de la cățele și pisici.

Modul de efectuare și datele obținute de la acest examen sunt detaliate în această lucare, într-un capitol distinct.

3.7. EXAMENUL BIOCHIMIC

3.7. BIOCHEMISTRY

Acest examen s-a efectuat din sângele și tumorile mamare de la cățele și pisici.

Prin examenul biochimic s-au evidențiat atât cantitativ cât și calitativ glicoproteinele care constituie principalul obiectiv al prezentei cercetări.

CAPITOLUL IV

STUDIUL EPIDEMIOLOGIC AL TUMORILOR

CHAPTER IV
EPIDEMIOLOGICAL STUDY OF TUMORS

4.1. MATERIAL ȘI METODĂ

4.1. MATERIALS AND METHODS

Cercetările au fost efectuate în perioada 05.01.2010 – 28.11.2012 pe un număr de 376 de animale din care 220 de cățele și 156 de pisici, de rase diferite, care au prezentat tumori mamare.

Din totalul de 220 de cățele, 88 cățele au fost cățele castrate, reprezentând 40 %, iar 132 cățele au fost cățele necastrate, reprezentând 60 %.

Din totalul de 156 de pisici, 89 pisici au fost pisici castrate, reprezentând 57,05 %, iar 67 pisici au fost pisici necastrate, reprezentând 42,95 %.

Cercetările efectuate au avut ca obiective stabilirea unui diagnostic rapid și exact al felului tumorii, în funcție de specie, rasă, vârstă, regiune anatomică la cățele și pisici castrate și necastrate.

Observațiile clinice completate de investigațiile complexe de laborator ne-au permis să apreciem influența dezvoltării asupra gazdei, a reacției uneori extrem de individuale a femelelor efectate.

Studiul epidemiologic al oncopatiilor, oricare ar fi natura lor, ne orientează spre stabilirea rolului unor factori cancerigeni și cocancerigeni. Lipsa unor Centre de dioagnostic și a Registrelor unice de evidență, comparabile cu cele din institutele umane, nu permite studii zonale comparative și o analiză geografică a cazuisticii.

Investigațiile epidemiologice efectuate la Facultatea de Medicină Veterinară, Catedrele de Patologie Chirurgicală, Anatomie Patologică și Biochimie Medicală veterinară, din cadrul Facultății de Medicină Veterinară, București au căutat să stabilească corelația eventuală dintre factorii cancerigeni aparținând mediului înconjurător și cei individuali ce reprezintă factori de risc în dezvoltarea procesului canceros.

Datorită statutului de animal de companie, carnivorele domestice, beneficiază, în general, de o îngrijire atentă, ceea ce le permite să atingă vârsta la care patologia tumorală se manifestă în plenitudine. Majoritatea factorilor incriminați în generarea tumorilor mamare la om, sunt luați în considerare pentru speciile canină și felină datorită faptului că ele împart același habitat cu omul și sunt expuse unor factori de risc apropiați.

Înregistrarea și prelucrarea datelor privind epidemiologia tumorilor mamare la cățea și pisică reprezintă o etapă a studiului în cadrul oncologiei comparate. De aceea oncologia mamară veterinară trebuie privită în contextul oncologiei speciei.

În urma aplicării metodelor de diagnostic prezentate în capitolul anterior au fost diagnosticate mai multe tipuri de tumori și s-a stabilit frecvența acestora. Aceste date au fost corelate cu o serie de factori posibili cancerigeni sau co-cancerigeni

4.2. REZULTATE ȘI CONCLUZII

4.2. RESULTS AND CONCLUSIONS

În acest context, cercetările efectuate în cadrul Facultății de Medicină Veterinară București evidențiază existența unor diferențe, așa cum rezultă din tabelel 4.1. și 4.2

Tabel 4.1.

Frecvența relativă a tumorilor la carnivorele domestice în perioada

05.01.2010 – 28.11.2012

Table. 4.1.

Relative frequency of mammary tumors in dogs and cats during

05.01.2010 – 28.11.2013

Analiza datelor înscrise în tabelul 4.1. ajută la formarea unei imagini privind frecvența tumorilor la carnivorele domestice pe o perioadă de 3 ani.

Datorită perioadei relativ mari în care s-au efectuat cercetările putem observa care este prevalența acestei boli, considerată ca fiind una din cele mai păgubitoare din punct de vedere vital.

Din numărul total de cazuri prezentate la clinică, în această perioadă, se constată incidența afecțiunilor luate în studiu în proporție mai mare 220 (aproximativ 58,5%) la cățele, față de 156 (aproximativ 41,5%) la pisici.

La cățele s-a înregistrat o frecvență mai mare (132 de cazuri – 60%) la cele necastrate, față de cele castrate 88 de cazuri – 40%.

Prin comparație, la pisici s-au depistat mai multe tumori (89 de cazuri – 57 %) la cele castrate față de cele 67 de cazuri (43%) necastrate.

Așa cum s-a menționat anterior, factorii individuali sau intrinseci dețin un rol important în epidemiologia oncopatiilor. Cercetările executate au reliefat importnața vârstei și rasei în funcție de statusul reproductiv asupra frecvențai tumorilor mamare. Au fost analizate aspectul și localizarea acestor tumori în corelație cu statusul aparatului genital (castrate/necastrate).

Vârsta este unul din cei mai importanți parametri care trebuie luati în calcul și trebuie comparat cu cel al unei populații de referință. La cățea și pisică clasa de vârstă sub un an este puțin reprezentată și nu include tumori mamare. Pe ansamblul patologiei tumorale se relatează o frecvență relativă a tumorilor ce crește progresiv de la 6 ani până la 10 ani la câine, frecvența rămânând ridicată la vârsta de 12 ani (Tănase A., 1999).

La această specie procentajul tumorilor benigne este semnificativ ridicat în raport cu cele maligne până la 3 ani și acest procentaj se inversează începând de la vârsta de 7 ani (Bolte S. și colab. 1995; Burtan L.C., 2004; Miclăuș I. și colab., 1989).

Ferguson, 1985 consideră vârsta de 10 – 11 ani ca cea mai propice pentru cancer mamar.

În tabelul 4.2. se evidențiază corelația dintre vârsta animalului ca factor cocancerigen și prezența tumorii mamare la populația de cățele consultate.

Tabel 4.2.

Frecvența tumorilor mamare în funcție de vârstă la cățele

Table 4.2.

The frequency of mammary tumors at bitches by age

Fig. 4.1. Frecvența tumorilor mamare în funcție de vârstă la cățele

Fig. 4.1. The frequency of mammary tumors at bitches by age

Din totalul de 220 cazuri de cățele cu tumori mamare rezultă următoarea statistică:

La vârsta de 2 ani procentul este 0,45% (1 caz);

Între 2 – 4 ani procentul este de 0,91% (2 cazuri);

Între 4 – 6 ani procentul este de 4,55% (10 cazuri);

Între 6 – 8 ani procentul este de 11,82% (26 cazuri);

Între 8 – 10 ani procentul este de 23,64% (52 cazuri);

Între 10 – 12 ani procentul este de 35,45% (78 cazuri)

Între 12 – 14 ani procentul este de 20,00% (44 cazuri);

Peste 14 ani procentul este de 3,18% (7 cazuri).

Din cele prezentate mai sus se constată că frecvența cea mai mare a tumorilor mamare a fost între 10-12 ani (78 cazuri – 35,45% din totalul acestora, urmată de tranșa de vârstă 8-10 ani (52 cazuri – 23,64% și 12-14 ani (44 cazuri – 20%) ..
la polul opus se situează tranșele de vârstă: <2 ani (1 caz – 0,45%), 2-4 ani (2 cazuri – 0,91%) și peste 14 ani (7 cazuri – 3,18%).

Tabel 4.3.

Frecvența tumorilor mamare în funcție de vârstă la cățele castrate

Table 4.3.

The frequency of mammary tumors by age at castrated bitches

Fig. 4.2. Frecvența tumorilor mamare în funcție de vârstă la cățele castrate

Fig. 4.2. The frequency of mammary tumors by age at castrated bitches

Frecvența tumorilor mamare în funcție de vârstă, la cățele necastrate

Tabel 4.4.

Frecvența tumorilor mamare în funcție de vârstă, la cățele necastrate

Table 4.4.

The frequency of mammary tumors by age at intact bitches

Fig. 4.3. Frecvența tumorilor mamare în funcție de vârstă, la cățele necastrate

Fig. 4.3. The frequency of mammary tumors by age at intact bitches

Date comparative privind frecvența tumorilor mamare pe grupe de vârstă în funcție de starea fiziologică, sunt redate în figura de mai jos:

Fig. 4.4. Date comparative privind frecvența tumorilor mamare

pe grupe de vârstă în funcție de starea fiziologică

Fig. 4.4. Comparative data on the frequency of breast tumors

by age according to the physiological status

Din datele prezentate în figura 4.4. se constată că la cățelele castrate frecvența tumorilor mamare este mai crescută la vârste mai mici comparativ cu cele necastrate (2-4 ani – 1,14% cățele castrate comparativ cu cele necastrate – 0,76% %, 4-6 ani – 7,95% cățele castrate comparativ cu cele necastrate – 2,27%). La vârste mai înaintate >14 ani, tumorile mamare sunt absente la cățelele castrate în timp ce la cele necastrate acestea apar cu o frecvență de 5,3%. Este posibil ca în această situație castrarea cățelelor să se fi realizat mai târziu, după apariția primelor cicluri sexuale, deaorece noi am luat ca punct de reper faptul că aceste cățele erau castrate în momentul prezentării la consultație, fără a cunoaște momentul în care s-a realizat această intervenție. Este posibil ca în acest caz, la vârste tinere să fi intervenit alți factori inductori ai apariției tumorilor mamare, care au acționat cu o intensitate mai mare, pe lângă influența hormonilor estrogeni.

Tot din acest grafic se constată că la ambele categorii de cățelele frecvența cea mai mare a tumorilor mamare este prezentă la grupele de vârstă mari (8-10 ani, 10-12 ani și 12-14 ani).

Incidența mare de tumori mamare la cățele și pisici se pare a fi urmarea unor dereglări psiho-neuro-hormonale din cauza macro și microclimatului în care trăiesc.

Tumorile mamare sunt în strânsă legătură cu statusul hormonal al femelei aflate sub influența hormonilor sexuali femeli (estrogeni/progesteron).

Dezechilibrul hormonal hipofizo-ovarian urmat de secreția în exces a hormonilor estrogeni constituie una din explicațiile faptului că femelele castrate înainte de primul cilclul de călduri au un coeficient de risc tumoral de 200 de ori mai mic decât cele necastrate.

Este posibil ca la cațelele castrate ca ovariectomia sau ovariohisterectomia să fi fost executată la vârste mai mari ceea ce a permis hormonilor estrogeni să fi acționat o anumită perioadă, destul cât să inducă apariția tumorilor.

În ceea ce privește rolul rasei ca factor oncoinductor mamar, studiile efectuate au evidențiat procente ușor crescute în favoarea unor rase așa cum reiese din tabelul 4.5.

Tabel 4.5.

Frecvența relativă a tumorilor mamare la cățea în raport cu rasa

Table 4.5.

Relative frequency of mammary tumors at bitch in relation to race

Fig. 4.5. Frecvența relativă a tumorilor mamare la cățea în raport cu rasa

Fig. 4.5. Relative frequency of mammary tumors at bitch in relation to race

Interpretând aceste rezultate s-a constatat că, în perioada luată în studiu, cele mai multe cazuri de tumori mamare s-au întâlnit la cățele Metis (48 de cazuri – 21,82%), urmate în ordine descrescătoare de rasele:

Cocker (36 cazuri – 16,36%)

Caniche (27 cazuri – 12,27%)

Peckinez (18 cazuri – 8,18%)

Bichon (16 cazuri – 7,27%)

Ciobănesc german (13 cazuri – 5,91%)

Teckel (9 cazuri – 4,09%)

Din datele prezentate mai sus se observă că tumorile mamare studiate s-au întâlnit mai frecvent la unele rase mici și mijlocii comparativ cu indivizi din rase mari, ceea ce este în concordanță cu date anterioare din literatura de specialitate (Harday W. D., 1976).

În ceea ce privește numărul de localizări a tumorilor mamare la cățea în funcție de integritatea genitală rezultatele sunt prezentate în tabelele 4.6. și 4.7 și respectiv în figurile 4.6.și 4.7.

Tabel 4.6.

Clasificarea tumorilor mamare în funcție de numărul

de localizări și rang la cățelele castrate

Table 4.6.

The classification of breast tumors based on the number

rank tracking at castrated bitches

Fig. 4.6. Clasificarea tumorilor mamare în funcție de numărul

de localizări și rang la cățelele castrate

Fig. 4.6. The classification of breast tumors based on the number

rank tracking at castrated bitches

Din analiza datelor prezentate mai sus se constată că din cele 88 cazuri cățele castrate care au prezentat tumori mamare, 42 cazuri (47,37%) au prezentat tumori unice, 19 cazuri (21,59%) au fost tumori multiple, iar cazuri cu tumori unice și primare au fost 19 (21,59%). Cele mai puține au fost 3 cazuri (3,41%) tumori unice și recidive, urmate de 2 cazuri (2,27%) unice și metastaze, 2 cazuri (2,27%) tumori multiple și metastaze și 1 caz (1,14%) tumoră primară.

Tabel 4.7.

Clasificarea tumorilor mamare în funcție de numărul de localizări

și rang la cățelele necastrate

Table 4.7.

Classification of breast tumors based on the number of locations

and rank at uncastrated bitches

La cățelele necastrate s-a constatat prezența tumorilor unice la 55 cazuri (41,67%), 37 cazuri (28,03%) tumori multiple, 25 cazuri (18,93%) tumori unice și primare, 7 cazuri (5,30%) multiple și metastaze, 4 cazuri (3,03%) multimple și recidive, 3 cazuri (2,27%) multiple și primare și 1 caz (0,76%) unică și recidivă.

Fig. 4.7. Clasificarea tumorilor mamare în funcție de

numărul de localizări și rang la cățelele necastrate

Fig. 4.7. Classification of breast tumors based on

the number of locations and rank at uncastrated bitches

Date comparative privind numărul de localizări a tumorilor mamare la cățea în funcție de integritatea genitală sunt prezentate în tabelul 4.8.

Tabel 4.8.

Distribuția tumorilor mamare în funcție de numărul de localizări

și rang la cățelele necastrate și la cățelele castrate

Table 4.8.

Distribution of mammary tumors depending on the number of locations

and rank at uncastrated and spayed bitches

În figura 4.8. sunt reprezentate comparativ frecvența tumorilor mamare în funcție de rang la cățelele castrare și necastrate.

Fig. 4.8. Grafic comparativ privind frecvența tumorilor mamare

în funcție de rang la cățelele castrare și necastrate

Fig. 4.8. Graphic compared the frequency of mammary tumors  according

to rank at uncastrated and spayed bitches

În urma analizei frecvenței tumorilor în funcție de grad și integritatea aparatului genital s-a constatat o frecvență mai mare a tumorilor mamare cu metastaze la cățelele necastrate (5,30%) comparativ cu cele castrate (2,27%), frecvența tumorilor primare a fost mai mică la cățelele castrate (1,41%) comparativ cu cele necastrate (2,27%)., în timp ce frecvența tumorilor recidivante a fost mai mare la cățelele necastrate (3,03%) comparativ cu cele castrate (0,0%).

În figura 4.9. sunt reprezentate comparativ frecvența tumorilor mamare unice și multiple la cățelele castrate și necastrate.

Fig. 4.9. Grafic comparativ privind frecvența tumorilor mamare unice și multiple

la cățele necastrate și la cățelele castrate

Fig. 4.9. Frequency graph on single and multiple mammary tumors in female dogs and spayed and uncastrated bitches

Frecvența mai mare a tumorilor unice a fost la cățelele castrate (76,14%), comparativ cu cele necastrate (61,37%). Frecvența mai mică a tumorilor multiple a fost la cățelele castrate (23,86%), comparativ cu cele necastrate (38,63%). Frecvența mai mare a tumorilor mamare primare la cățelele castrate poate fi corelată cu momentul castrării.

Este foarte posibil că ovariectomia sau ovariohisterectomia să fi fost executată după debutul apariției tumorilor. Frecvența mai crescută a metastazelor și recidivelor la cățelele necastrate poate fi pusă pe seama existenței proceselor tumorale specifice (metastazare, recidivare) dar cu o influență marcantă din partea hormonilor estrogeni prezenți la acestea

Date comparative privind frecvența tumorilor mamare în funcție de numărul de localizări, rang și integritate a aparatului genital, la cățele, sunt redate în figura de mai jos:

Fig. 4.10. Grafic comparativ privind frecvența tumorilor mamare în funcție de

numărul de localizări, rang și integritate a aparatului genital, la cățelele

Fig. 4.10. Graphic comparing the frequency of breast tumors according to

number of locations, rank and genital integrity at bitches

Frecvența mai mare a tumorilor unice a fost la cățelele castrate (76,14%), comparativ cu cele necastrate (61,37%). Frecvența mai mică a tumorilor multiple a fost la cățelele castrate (23,86%), comparativ cu cele necastrate (38,63%). În urma analizei frecvenței tumorilor în funcție de grad și integritatea aparatului genital s-a constatat o frecvență mai mare a tumorilor mamare cu metastaze la cățelele necastrate (5,30%) comparativ cu cele castrate (2,27%), frecvența tumorilor primare a fost mai mică la cățelele castrate (1,41%) comparativ cu cele necastrate (2,27%)., în timp ce frecvența tumorilor recidivante a fost mai mare la cățelele necastrate (3,03%) comparativ cu cele castrate (0,0%).

Tabel 4.9.

Localizarea topografică a tumorilor mamare, la cățele castrate

Table 4.9.

Topographic localization of mammary tumors in castrated bitches

În figura 4.11. este redată localizarea topografică a tumorilor mamare, la cățele castrate.

Fig. 4.11. Localizarea topografică a tumorilor mamare, la cățele castrate

Fig. 4.11. Topographic localization of mammary tumors at castrated bitches

S-a constatat că cele mai multe cazuri au fost localizate la M5 cu 24 cazuri (27,27%) urmate de M3 cu 21 cazuri (23,87%). Localizarea unică cu cel mai redus număr de cazuri a fost la M4 12 cazuri (13,64%). Localizarea la M1 a fost de 16 cazuri (18,18%), iar la M2 a fost de 14 cazuri (15,90%). În ceea ce privește localizarea multiplă, aceasta a fost întâlnită la un singur caz (1,14%) la care au fost afectate mamelele M4 și M5.

Tabel 4.10.

Localizarea topografică a tumorilor mamare, la cățele necastrate

Table 4.10.

Topographic localization of mammary tumors in intact bitches

În figura 4.12. este redată localizarea topografică a tumorilor mamare, la cățele necastrate.

Fig. 4.12. Localizarea topografică a tumorilor mamare, la cățele necastrate

Fig. 4.12. Topographic localization of mammary tumors at intact bitches

La cățelele necastrate s-a constatat, în cazul localizării unice că cea mai mare frecvență a tumorilor mamare a fost la nivelul mamelei M5 cu 24 cazuri (18,18%), iar în cazul localizărilor multiple asocierile M4+M5 cu 12 cazuri (9,09%), M1+M5 cu 11 cazuri (8,33%) și M3+M4 cu 11 cazuri (8,33%). Cea mai redusă frecvență a tumorilor mamare la cățelele necastrate a fost constatată în cazul localizării unice la M3 cu 12 cazuri (9,09%) și M2 cu 13 cazuri (9,85%). În situația tumorilor multiple cele mai reduse frecvențe au fost întâlnite la următoarele asocieri: M1+M4 și M2+M4 câte un caz (0,76%).

Localizarea tumorilor, ținând cont de perechea sau mamela implicată, este un alt element extrem de important pentru supraviețuirea femelelor, datorită în principal circulației limfatice. Cea mai frecventă localizare și cea mai perfidă este localizarea la perechea inghinală.

Date comparative privind frecvența (%) localizării tumorilor mamare, la cățea, în funcție de integritatea aparatului genital, sunt redate în figura de mai jos:

Fig. 4.13. Grafic comparativ privind frecvența (%) localizării tumorilor mamare,

la cățea, în funcție de integritatea aparatului genital

Fig. 4.13. Graph comparing the frequency (% )of breast tumor localization,

at bitch, according to genital integrity

Analizând datele prezentate în graficul comparativ privind frecvența (%) localizării tumorilor mamare, la cățea, în funcție de integritatea aparatului genital (fig. 4.13.) se constată, la ambele categorii de cățele, o frecvență crescută a tumorilor mamare unice, la M5 (27,27% la cățele castrate 18,18% la cățele necastrate), diferența procentuală fiind dată de repartizarea mai întinsă, la mai multe grupe de mamele, în cazul cățelelor necastrate. Cea mai scăzută frecvență a tumorilor unice la cățelele castrate a fost întâlnită la mamela M4 (13,64%) pe când la cele necastrate, la mamela M3 (9,09%). În ceea ce privește localizarea multiplă a tumorilor mamare la cățea se constată că există o plajă mult mai largă de apariție a acestora comparativ cu cățelele castrate la care a fost întâlnită un singur caz cu localizare la două mamele. Toate aceste date vin să confirme încă o dată că executarea ovariectomiei sau ovariohisterectomiei la cățea poate contribui la reducerea gravității tumorilor mamare.

În continuare vor fi prezentate rezultatele obținute în urma studiului clinic al tumorilor mamare la pisici.

În tabelul 4.11. se evidențiază corelația dintre vârsta animalului ca factor cocancerigen și prezența tumorii mamare la pisicile consultate.

Tabel 4.11.

Frecvența tumorilor mamare în funcție de vârstă la pisicile castrate/necastrate

Table 4.11.

The frequency of mammary tumors by age at spayed / uncastrated cats

În figura 4.14. este redată frecvența tumorilor mamare în funcție de vârstă la pisicile castrate/necastrate, la cățele necastrate.

Fig. 4.14. Frecvența tumorilor mamare în funcție de vârstă la pisicile castrate/necastrate

Fig. 4.14. The frequency of mammary tumors by age at spayed / uncastrated cats

S-a constatat că tumorile mamare la pisici apar începând cu vârsta de 2 ani (3 cazuri – 1,92%), incidența lor crește progresiv atingând maximul la vârsta de 10 – 12 ani (49 cazuri – 31,41%), înregistrând o ușoară scădere la vârsta peste 12 ani (34 cazuri – 21,79%) și peste 14 ani (16 cazuri – 10,26%).

Tabel 4.12.

Frecvența tumorilor mamare în funcție de vârstă la pisicile castrate

Table 4.12.

The frequency of mammary tumors according to age at spayed / uncastrated cats

În figura 4.15. este redată frecvența tumorilor mamare în funcție de vârstă la pisicile castrate.

Fig. 4.15. Frecvența tumorilor mamare în funcție de vârstă la pisicile castrate

Fig. 4.15. The frequency of mammary tumors according to age at spayed / uncastrated cats

La pisicile castrate, tumorile mamare apar foarte rar la vârste mici, respectiv 2 ani (un caz – 1,12%). Frecvența cea mai mare a tumorilor mamare la aceste pisici a fost observată în intervalul 12-14 ani (23 cazuri – 25,84%), urmată de intervalul 8-10 ani (22 cazuri – 24,72%) și 10-12 ani (21 cazuri – 23,60%). În intervalele 2-10 ani se constată o creștere liniară a frecvenței tumorilor mamare la pisicile castrate. După vârsta de 14 ani, frecvența tumorilor mamare, la pisicile castrate scade (>14 ani – 11 cazuri – 12,36%).

Tabel 4.13.

Frecvența tumorilor mamare în funcție de vârstă la pisicile necastrate

Table 4.13.

The frequency of mammary tumors according to age at uncastrated cats

În figura 4.16. este redată frecvența tumorilor mamare în funcție de vârstă la pisicile necastrate.

Fig. 4.16. Frecvența tumorilor mamare în funcție de vârstă la pisicile necastrate

Fig. 4.16. The frequency of mammary tumors according to age at uncastrated cats

Din 67 de cazuri examinate de tumori mamare apărute la pisicile castrate, frecvența cea mai mare a fost la grupa de vârstă de 10-12 ani (28 cazuri – 41,79%), urmată de grupa de vârstă 12-14 ani (11 cazuri – 16,42%). Cele mai puține cazuri au fost înregistrate la grupa de vârstă 2-4 ani (1 caz – 1,49%).

Date comparative privind frecvența tumorilor mamare la pisică în funcție de vârstă și starea fiziologică, sunt redate în figura de mai jos:

Fig. 4.17. Grafic comparativ privind frecvența tumorilor mamare

la pisică în funcție de vârstă și starea fiziologică

Fig. 4.17. Graphic comparing the frequency of mammary tumors

at cat according to age and physiological status

Analizând comparativ valorile procentuale obținute s-a constatat că până la vârsta de 6 ani numărul cazurilor este relativ uniform la cele două grupe fiziologice, 5 cazuri (7,46%) la pisicile necastrate și 5 cazuri (5,62%) la pisicile castrate. Începând cu grupa 6-8 ani a crescut frecvența cazurilor, creșterea fiind mai mare la pisicile necastrate, respectiv 9 cazuri (13,43%) comparativ cu cele castrate, 7 cazuri (7,87%). La grupa de vârstă de 8-10 ani frecvența cazurilor a fost mai mare la pisicile castrate, 21 cazuri (23,60%) comparativ cu cele necastrate, 9 cazuri (13,43%), iar la următoarea grupă de vârstă, 10-12 ani, frecvența tumorilor mamare a fost aproape dublă, 28 cazuri (41,79%) la pisicile necastrate, comparativ cu cele castrate, 21 cazuri (23,60%), urmând ca apoi frecvența să fie mai mică la pisicile necastrate comparativ cu cele castrate. La grupa de vârstă 12-14 ani frecvența cazurilor a fost mai mică la pisile necastrate, 11 cazuri (16,42%) comparativ cu cele castrate, 23 cazuri (25,84%).

La pisică frecvența tumorilor estrogeno-dependente este posibil să fie mai mare decât a tumorilor mamare estrogeno-independente, ceea ce poate explica frecvența mare a acestor tumori la pisici castrate. De asemenea, un rol deosebit, îl poate avea momentul (vârsta) la care s-a realizat castrarea, aceasta putând avea loc după declanșarea procesului tumoral, ceea ce ar putea explica frecvența oarecum asemănătoare a acestora la grupele mici de vârstă (2 ani, 2-4 ani și 4-6 ani), urmată de creșterea rapidă a frecvenței acestora la grupele de vârstă mai mari (8-10 ani, 12-12 ani, 12-14 ani și peste 14 ani).

Tabel 4.14.

Frecvența relativă a tumorilor mamare la pisici în raport cu rasa

Table 4.14.

The relative frequency of mammary tumors at cats according to race

În figura 4.18. este redată frecvența relativă a tumorilor mamare la pisici în raport cu rasa.

Fig. 4.18. Frecvența relativă a tumorilor mamare la pisici în raport cu rasa

Fig. 4.18. The relative frequency of mammary tumors at cats according to race

În funcție de rasă, cel mai mare număr de tumori mamare l-am întâlnit la rasele europene, 108 cazuri (69,23%), urmat de rasa Birmaneză, 35 cazuri (22,44%). În studiul nostru cele mai reduse frecvențe au fost întâlnite la rasele Norvegiană de pădure, 1caz (0,64%) și Siameză (2 cazuri (1,28%). Analizând acest aspect s-a observat că cele mai mari frecvențe s-au întâlnit la rasele la care există un număr mare de indivizi crescuți în România și este posibil ca această frecvență să fie influențată de numărul mai mare al acestor indivizi. Pe de altă parte la unele rase cum este rasa Siameză care are un procent crescut de consangvinizare și de boli genetice, totuși frecvența tumorilor mamare a fost mai redusă.

Tabel 4.15.

Clasificarea tumorilor mamare în funcție de numărul de localizări

și rang la pisicile castrate

Table 4.15.

Classification of breast tumors based on the number of locations

and rank at stayed cats

În figura 4.19. este redată clasificarea tumorilor mamare în funcție de numărul de localizări și rang la pisicile castrate.

Fig. 4.19. Clasificarea tumorilor mamare în funcție de

numărul de localizări și rang la pisicile castrate

Fig. 4.19. Classification of breast tumors based on the number of locations

and rank at stayed cats

S-a constată că cele mai mari frecvențe de tumori s-au întâlnit la pisicile castrate, ele fiind tumori unice 40 cazuri (44,95%), urmate de tumori multiple cu 22 cazuri (24,72%), apoi tumori unice și primare cu 14 cazuri (15,73%) și tumori multiple și metastaze cu 6 cazuri (6,74%), comparativ cu tumorile multiple și recidive, precum și cele unice și recidive, câte 2 cazuri (2,25%) și tumori multiple și primare, unică și primară, metastaze, câte 1 caz (1,12%).

Tabel 4.16.

Clasificarea tumorilor mamare în funcție de numărul de localizări

și rang la pisicile necastrate

Table 4.16.

Classification of breast tumors based on the number of locations

and rank at uncastrated cats

În figura 4.20. este redată clasificarea tumorilor tumorilor mamare în funcție de numărul de localizări și rang la pisicile necastrate.

Fig. 4.20. Clasificarea tumorilor mamare în funcție de numărul

de localizări și rang la pisicile necastrate

Fig. 2.20. Classification of breast tumors based on the number of locations

and rank at uncastrated cats

La pisicile necastrate frecvența cea mai mare a fost întâlnită în cazul tumorilor unice 29 cazuri (43,28%), cea a tumorilor multiple 21 cazuri (31,43%), urmate de unice și primare 8 cazuri (11,94%). Cele mai mici frecvențe s-au întâlnit la tumorile unice și recivide 3 cazuri (4,48%), multiple și metastaze 3 cazuri (4,48%), multiple și primare 2 cazuri (2,99%), unice și multiple 1 caz (1,49%).

Date comparative privind frecvența tumorilor mamare primare și secundare la pisici cu diferite stări fiziologice, sunt redate în figura de mai jos:

Fig. 4.21. Grafic comparativ privind frecvența tumorilor mamare primare

și secundare la pisici cu diferite stări fiziologice

Fig. 4.21. Graphic comparing the frequency of mammary tumors at cats with primary and secondary different physiological states

Din cele prezentate mai sus se constată că diferențele între frecvența tumorilor unice, a tumorilor unice și multiple sunt foarte mici, ceea ce ne permite să arătăm că la pisici castrarea nu are influență asupra frecvenței celor două tipuri de tumori. Este adevărat că niciuna din aceste pisici nu au fost ovariectomizate sau ovariohisterectomizate înainte de primul estru ci mai târziu (după un estru, două sau trei faze estrale, ceea ce a permis acțiunea estrogenilor asupra glandei mamare cu posibilitatea inducerii apariției tumorilor mamare.

Date comparative privind frecvența tumorilor mamare în funcție de numărul de localizări, rang și integritate a aparatului genital, la pisici, sunt redate în figura de mai jos:

Fig. 4.22. Grafic comparativ privind frecvența tumorilor mamare în funcție de

numărul de localizări, rang și integritate a aparatului genital, la pisici

Fig. 4.22. Graphic comparing the frequency of mammary tumors depending on the number of locations, rank and genital integrity at cats

Din cele prezentate în graficul anterior s-a constatat că tumorile unice prezintă frecvența cea mai mare la ambele grupe (castrate 44,95% și necastrate 43,28%), dar în timp ce frecvența tumorilor unice primare este mai mare cu 3,79 % la pisicile castrate (15,73%) comparativ cu cele necastrate (11,94%), ceea ce ne îndreptățește să considerăm că totuși integritatea și funcționarea ciclică a aparatului genital, prin secreția de hormoni poate induce creșterea frecvenței și localizarea multiplă a acestora. De asemenea, frecvența metastazelor a fost mai mare la pisicile castrate cu tumori multipe și metastaze (6,74%) comparativ cu frecvența acestora la pisicile necastrate (4,48%).

Tabel 4.17.

Localizare topografică a tumorilor mamare la pisici castrate

Table 4.17.

Topographic location of mammary tumors at spayed cats

În figura 4.23. este redată localizare topografică a tumorilor mamare la pisici castrate.

Fig. 4.23. Localizare topografică a tumorilor mamare la pisici castrate

Fig. 4.23. Topographic locaon of mammary tumors at spayed cats

În ceea ce privește localizarea topografică a tumorilor mamare la pisicile castrate s-a constatat că acestea au fost localizate, în cea mai mare proporție, la M4 (21 cazuri -23,60%) urmată de localizarea la M2 (3 cazuri – 14,61%), în timp ce localizarea M1-M4 a fost întâlnită la cel mai mic număr de cazuri (1 caz – 1,12%). Din cele prezentate mai sus se constată că un număr destul de mare de cazuri au localizare unică la această grupă de pisici.

Tabel 4.18.

Localizarea topografică a tumorilor mamare la pisici necastrate

Table 4.18.

Topographic location of mammary tumors at uncastrated cats

În figura 4.24. este redată localizare topografică a tumorilor mamare la pisici necastrate.

Fig. 4.24. Localizarea topografică a tumorilor mamare la pisici necastrate

Fig. 4.24. Topographic location of mammary tumors at uncastrated cats

La pisicile necastrate s-a constatat în cazul localizărilor unice, cea mai mare frecvență a tumorilor mamare la mamela M4 (17 cazuri – 25,37%) urmată de localizarea la mamela M2 (9 cazuri – 13,43%). Frecvența cea mai redusă a fost identificată în cazul localizărilor multiple la mamelele M1-M3, M2-M3-M4, M3-M5 și M3-M4-M5 (1 caz – 1,49%). Frecvența cea mai mare a localizărilor multiple a tumorilor mamare la cățele necastrate a fost identificată la mamelele M1-M5 (6 cazuri – 8,96%).

Date comparative privind frecvența (%) localizării tumorilor mamare, la pisică, în funcție de integritatea aparatului genital, sunt redate în figura de mai jos:

Fig. 4.25. Grafic comparativ privind frecvența (%) localizării tumorilor mamare,

la pisică, în funcție de integritatea aparatului genital

Fig. 4.25. Graphic comparing the frequency ( % )of breast tumor location, at cat,

depending on the integrity of the genital apparatus

În urma analizei comparative a frecvenței localizărilor tumorilor mamare în funcție de intergritatea aparatului genital, la pisică s-a constatat că cea mai frecventă localizare a fost la M4 atât la pisicile castrate (23,6%) cât și necastrate (25,37%) urmată de M2 la ambele categorii de pisici (14,61% la pisicile castrate/13,43% la cele necastrate). La pisicile castrate a fost întâlnită o frecvența mai mare a localizărilor la M1 (11,24%) comparativ cu pisicile necastrate (5,97%), pe când la pisicile necastrate a fost întâlnită o frecvență mai mare la M3 (11,94%) pe când la pisicile castrate frecvența la nivelul M3 a fost mai redusă (8,99%). La polul celălalt cea mai redusă frecvență a tumorilor mamare la cățelele castrate a fost decelată în cazul localizării la M1-M4 (1,12%) în timp ce la pisicile necastrate nu au fost decelate localizări la acest nivel. La cățelele necastrate cea mai redusă frecvență a fost constatată în cazul localizărilor la nivelul mamelelor M1-M3, M2-M3-M4, M3-M5 și M3-M4-M5 (1,49%) în timp ce la cățelele castrate la M2-M3-M4, M3-M5 nu au fost decelate localizări la aceste niveluri.

În concluzie, din datele prezentate mai sus se constată că nu au existat diferențe majore în ceea ce privește frecvența maximă a localizărilor topografice a tumorilor mamare la pisici castrate comparativ cu cele necastrate.

4.3. CONCLUZII PARȚIALE

Examenul clinic coroborat cu anamneza corectă privind istoricul bolii, evoluția și eventual circumstanțele de apariție, n-au ajutat să concluzionăm următoarele aspecte:

1). Numărul de cazuri cu tumori unice este la cățelele castrate de 42 cazuri – 47,73% din totalul de 88 cazuri, iar la cele necastrate de 55 cazuri – 41,67% din totalul de 132, ceea ce ne arată că există diferențe semnificative din punct de vedere al situației reproductive (starea fiziologică a glandei mamare). Numărul de cazuri cu tumori unice este la pisici castrate de 40 cazuri – 44,95% din totalul de 89 cazuri, iar la cele necastrate de 29 cazuri – 43,28% din totalul de 67, ceea ce ne arată că nu există diferențe semnificative din punct de vedere al situației reproductive.

2). În ceea ce privește tunorile multiple, avem 19 cazuri – 21,59% din totalul de 88 cazuri la cățelele castrate, iar la cele necastrate de 37 cazuri – 28,03% din totalul de 132, ceea ce ne arată că există diferențe semnificative din punct de vedere al situației reproductive. Numărul de cazuri cu tumori multiple la pisicile castrate este de 22 cazuri – 24,72% din totalul de 89 cazuri, iar la cele necastrate de 21 cazuri – 31,34% din totalul de 67, ceea ce ne arată că există diferențe semnificative din punct de vedere al situației reproductive.

3). Tumora unică și primară, l-a întâlnit la 19 cazuri – 21,59% din totalul de 88 cazuri la cățelele castrate, iar la cele necastrate de 25 cazuri – 18,94% din totalul de 132, ceea ce ne arată că există diferențe semnificative din punct de vedere al situației reproductive. Tumora unică și primară s-a întâlnit la pisicile castrate la 14 cazuri – 15,73% din totalul de 89 cazuri, iar la cele necastrate de 8 cazuri – 11,94% din totalul de 67, ceea ce ne arată că există diferențe semnificative din punct de vedere al situației reproductive.

4). Ca localizare la nivelul mamelei s-a constatat că la cățelele castrate cel mai mare număr de cazuri este la M5, 22 cazuri – 27,27%, iar la cele necastrate, tot la M5, 24 cazuri – 18,18%, ceea ce arată că există diferențe semnificative la cele două categorii de femele. La nivelul mamelei M5, avem 5 cazuri – 5,62% la pisicile castrate, iar la pisicile necastrate 3 cazuri – 4,48%, ceea ce ne arată că există diferențe nesemnificative.

5). Localiazarea tumorii la mamela M4 – vecină cu M5 s-a întâlnit la 12 cazuri – 13,64% în cazul cățelelor castrate și la 18 cazuri – 13,64% în cazul cățelelor necastrate, ceea ce ne face să ne gândim că procesul tumoral se extinde prin contiguitate de la țesutul bolnav la cel sănătos imediat învecinat.

6). O diferență semnificativă s-a constatat la localizarea M4-M5, astfel că dacă la cele castrate este doar un caz – 1,14% din cele 88, la cățelele necastrate din 132 cazuri, există 12 cazuri – 9,09%, ceea ce ne arată că procesul tumoral se extinde mai ușor la mamelele vecine ale femelelor necastrate. La pisici nu există diferențe mari la localizarea M4-M5 între cele două categorii, din totalul de 89 pisici castrate, 2 cazuri – 2,25%, iar din totalul de 67 pisici necstrate, 2 cazuri – 2,99%.

7). Localizarea tumorii la M1-M5 s-a întâlnit numai la cățelele necastrate, 11 cazuri – 8,33%.

8). Frecvența cea mai mare a tumorilor mamare la cățele apare la tranșa de vârstă 10 – 12 ani la cele castrate, 36 cazuri – 40,91%, iar la cele necastrate 42 cazuri – 31,82%. Frecvența cea mai mare a tumorilor mamare la pisici apare la aceeași tranșă de vârstă, 10 – 12 ani, la cele castrate, 21 cazuri – 23,60%, iar la cele necastrate 28 cazuri – 41,79%.

9). La vârsta de 2 ani, frecvența tumorilor mamare, atât la cățele cât și la pisici este cea mai mică, 1 caz – 1,14% la cățelele castrate și nici un caz la cele necastrate, iar la pisici 1 caz – 1,12% la pisicile castrate și 2 cazuri – 2,99% la cele necastrate.

10). În funcție de rasă, cel mai mare număr de tumori mamare s-a întâlnit la Metis cu 48 cazuri – 21,82%, Cocker cu 36 cazuri – 16,36%, urmată de Caniche cu 27 cazuri – 12,27%. La pisică, cel mai mare număr de tumori mamare s-a întâlnit la rasele europene, 108 cazuri (69,23%), urmat de rasa Birmaneză, 35 cazuri (22,44%).

CAPITolul V

EXAMENUL HISTOPATOLOGIC

CHAPTER V
HISTOPATHOLOGICAL EXAMINATION

5.1. MATERIALE ȘI METODE

Preparatele histopatologice pregătite au fost examinate cu ajutorul microscopului prevăzut cu cameră foto.

Cu toate investigațiile clinice și a examenelor paraclinice laborioase, diagnosticul de certitudine se stabilește în urma examenului histopatologic. Diagnosticul histopatologic este și el ierarhizat în funcție de etapa diagnosticului și anume:

examenul citologic de puncție;

examenul citologic al frotiului provenit din raclajul unei formațiuni abcedate;

examenul histopatologic extemporaneu;

examenul histopatologic al piesei de exereză, care este suveran și categoric în stabilirea diagnosticului definitiv.

5.1.1. Realizarea preparatelor histologice permanente

Principalele etape ale tehnicii de efectuare a unui preparat histologic permanent au fost:

5.1.1.1. Recoltarea

Recoltarea reprezintă o etapă importantă pentru tehnica hispatologică, de ea depinzând în foarte mare măsură stabilirea diagnosticului. Din acest motiv se realizează (în cazul cadavrelor) imediat după sacrificare (se evită astfel instalarea modificărilor postmortem), cu foarte mare atenție, deoarece țesuturile sunt fragile și se distrug ușor.

Instrumentarul care se folosește trebuie să fie foarte bine ascuțit, cu lama cât mai fină pentru a nu produce strivirea piesei. Se evită folosirea foarfecelor sau a penselor întrucât acestea compresează țesuturile. Locul recoltării este tot atât de important pentru stabilirea diagnosticului. Se aleg cele mai reprezentative cazuri cu leziuni caracteristice, tipice pentru boala suspicionată. Leziunile chiar localizate nu sunt identice morfologic, ele putând fi caracteristice în unele porțiuni și lipsite de specificitate în altele. De aceea, recoltarea nu se face niciodată la întâmplare, ci după o evaluare prealabilă a celor mai corespunzătoare zone. Piesa recoltată trebuie să cuprindă o porțiune cât mai mare din leziune (eventual leziunea în totalitate) cu o parte din țesuturile sănătoase înconjurătoare.

Piesele se taie în „felii”, cu fețele plane și paralele și orientate în așa fel încât să fie paralele cu viitorul plan de secționare la microtom.

Recoltarea probelor pentru studiul histoplatologic în prezenta teză s-a realizat pe piese de exereză chirurgicală după masmectomiile efectuate în clinica de Obstetrică-Ginecologie a Facultății de Medicină Veterinară București.

5.1.1.2. Fixarea

Fixarea: după moarte, corpul animalelor suferă procesul de putrefacție, care conduce treptat la modificări profunde ale structurii celulelor și țesuturilor. În condiții obișnuite, țesuturile, care constituie biopsia, suferă o serie de alterații, numite autoliză, ce pot face, imposibil un examen histopatologic. Operația care împiedică aceste procese de alterare, conservând structurile celulare din timpul vieții, este fixarea – un complex de reacții chimice care blochează procesele enzimatice, respectiv autolitice și previne invazia microbiană. Piesele trebuie fixate imediat după recoltare.

Obiectivele fixării:

– conservarea țesuturilor, omorând rapid celulele, cu prevenirea pierderii de constituenți chimici tisulari pe parcursul etapelor următoare ale tehnicii, păstrând cât mai mult posibil structurile naturale;

– creșterea diferențierii optice a structurilor celulare (modificarea indicilor de refracție) în scopul realizării unor colorații selective;

– mărirea consistenței țesuturilor moi în vederea manoperelor ulterioare, fără să le întărească exagerat.

Fixarea pieselor recoltate se face în recipiente suficient de mari astfel încât piesa să fie în contact cu fixatorul pe toate fețele iar volumul lichidului fixator să fie de 20–40 ori mai mare decât volumul piesei fixate. Pe fundul recipientului va exista un strat de vată sau hârtie de filtru care va împiedica lipirea pieselor și deci o fixare incompletă. În aceste condiții probele recoltate pot fi menținute timp de 24 ore după care, dacă nu sunt expediate la laborator, se ajustează fiecare fragment cu o lamă de ras, astfel încât să se îndepărteze părțile traumatizate și fragmentul să prezinte fețe plane și paralele păstrând o grosime uniformă de 5 mm. La această operație se schimbă lichidul fixator respectând condițiile de volum.

Temperatura înconjurătoare are o mare influență asupra fixării: o temperatură ridicată grăbește fixarea (se folosește doar foarte rar, în situațiile de extremă urgență, prin procedeul ținerii fixatorului în termostat la 40°C), iar o temperatură scăzută asigură o fixare mai bună (cele mai bune rezultate se obțin la cca 6°C) .

Fixatorii sunt de 2 tipuri: fizici și chimici.

Fixatorii fizici sunt reprezentți de:

– căldura flăcării – pentru fixarea frotiului bacteriologic;

– uscarea rapidă la aer – pentru uscarea, fixarea frotiurilor și a amprentelor de organe;

– congelarea la –70°C prin amestec de zăpadă și acetonă, iar la –160°C cu azot lichid;

– metoda freeze–substitution utilizată în citochimie și citoenzimologie.

Fixatorii chimici sunt specifici histopatologiei, fiind în general substanțe lichide clasificate, în funcție de complexitate, în fixatori simpli și amestecuri fixatoare.

Fixatorii simpli cuprind o clasă numeroasă de substanțe: formolul, acetona, alcoolul etilic, alcoolul osmic, alcoolul metilic, acidul acetic, acidul picric, acidul tricloracetic, bicromat de potasiu, clorura de mercur,ș.a.

Amestecurile fixatoare se utilizează în situații mai complexe, în care este necesară acțiunea concomitentă a unor fixatori simpli. Exemple de amestecuri fixatoare: fixatori universali (picroformolul acetic, fixator Susa, fixator Zenker, fixator Maksimov, fixator Bouin Hollande), fixatori nucleari (lichid Carnoy, lichid Flemming, lichid Regaud, lichid Țupa), fixatori pentru grăsimi (lichid Lang, etc.) ș.a.

Cel mai frecvent fixator chimic utilizat este soluția de formaldehidă 10% care păstrează structura preparatelor, are o penetrabilitate bună și formează puține precipitate. Ideală este formaldehida neutră lipsită de acizi, care este un fixator universal și se păstrează în sticlă de culoare închisă, la o temperatură a mediului mai mare de 9°C, pentru a evita polimerizarea. Formolul 10% soluție de aldehidă formică 40% (formol comercial) se prepară astfel: o parte formol și 9 părți apă de robinet.

Durata fixării este de 1–3 zile.Se recomandă schimbarea soluției de formol a doua zi.

În cercetarea prezentă fixarea țesuturilor s-a realizat folosind formaldehidă neutră 10%, durata fixării fiind de 2 zile.

5.1.1.3. Spălarea

Este un tratament prin care se oprește efectul fixării prin îndepărtarea agenților fixatori din țesuturi. Spălarea s-a realizat cu apă de robinet. După lichidele care conțin formol este obligatorie deoarece prezența acidului formic și a altor impurități poate afecta structura celulară (citoplasma).

5.1.1.4. Includerea

Este etapa prin care țesuturile fixate și spălate sunt îmbibate și incluse în substanțe care sunt în fază lichidă la 56°C în termostat și se solifică la temperatura camerei, oferind consistență și păstrând în același timp raporturile țesuturilor care constituie piesa. Piesele incluse pot fi ulterior prelucrate în vederea obținerii unor secțiuni mai mari, mai subțiri, mai uniforme.

În tehnica histologică se folosesc următoarele metode de includere:

includerea în parafină,

includerea în celoidină,

includere în parafin – celoidină,

includere în gelatină.

O alternativă la includere o constituie congelarea.

Pentru piesele examinate am folosit includerea în parafină.

Tehnica și etapele includerii în parafină

Includerea în parafină este aplicabilă oricărei piese cu dimensiuni de maxim 7 cm lungime și 3-4 cm lățime, fiind metoda cel mai des folosită în lucrările curente de histopatologie. Avantajele acestei metode sunt reprezentate de simplitate, rapiditate, păstrare foarte bună a pieselor, a blocurilor și a secțiunilor. Nu se utilizează la organe cavitare, elemente ale sistemului nervos, piese de dimensiuni mari. Metoda constă în impregnarea piesei cu parafină și apoi montarea ei în parafină. Cuprinde următorii timpi:

a). Deshidratarea: este o etapă obligatorie deoarece parafina nu este miscibilă cu apa. Se utilizează alcoolul etilic, care scoate apa din țesuturi. Se realizează prin trecerea piesei prin 5–6 băi cu alcool etilic de concentrații crescânde: 80°, 90°, 96°, în trei vase cu alcool absolut. Apa trece în alcool, diluându-l. În fiecare baie piesa va fi menținută 4–6 ore în funcție de grosime și calitate.

b). Clarificarea: urmărește îndepărtarea alcoolului etilic din piese și înlocuirea lui cu substanțe miscibile atât cu alcoolul cât și cu parafina. Substanțele clarificatoare mai des folosite sunt: alcoolul amilic, toluen, xilen, benzen. În cazul nostru pentru clarificare am folosit 3 băi de alcool amilic unde piesa a stat 2– 4 ore consecutiv, volumul clarificatorului depășind de 10 ori volumul piesei.

c). Impregnarea cu parafină: s-a realizat în termostat la 54°C unde există o baie de alcool amilic și parafină în părți egale (soluție saturată de parafină) și trei băi de parafină pură (I, II, III). Temperaturile mai mari de 54°C produc întărirea și retracția pieselor sau arderea țesuturilor. Durata menținerii piesei în aceste băi a depins de grosimea piesei fiind cuprinsă între 2-6 ore.

d). Incluzia propriu-zisă: este operația finală prin care piesa este înglobată într-o masă de incluzie lichidă, care prin răcire devine solidă. S-a turnat parafina lichidă într-o tăviță metalică, apoi cu o spatulă fierbinte s-a luat piesa din baia III de parafină, s-a introdus cu fața care trebuie tăiată în jos, spre placă și s-a aranjat secțiunile pe fundul tăviței. În jurul piesei trebuie să rămână o ramă de parafină. După solidificare s-a scos blocul de parafină din formă prin ușoară lovire.

5.1.1.5. Secționarea

S-a realizat cu ajutorul microtomului pentru parafină. Blocurile de formă paralelipipedică, fasonate, s-au fixat pe suporturi portobiect, fixate la rândul lor la microtomul pentru parafină. Prin raderea cu cuțitul microtomului s-au obținut secțiuni subțiri de 5–6 m grosime, uniforme, fără striații.

Pentru a putea fi colorate, secțiunile perfect întinse au fost ulterior lipite la cald pe lame de sticlă curate și degresate, pe care în prealabil s-a dispus într-un strat subțire ovalbumina Mayer (amestec de albuș de ou și glicerină). Pentru eliminarea cutelor din secțiuni și întinderea perfectă a parafinei s-au pus pe lamă câteva picături de apă distilată și apoi lama s-a așezat pe o platină încălzitoare (placă metalică specială încălzită de o rezistență electrică). După întinderea secțiunilor s-a notat la unul din capetele lamei numărul cazului (identitatea).

5.1.1.6. Îndepărtarea parafinei (deparafinarea)

Secțiunile ce cuprind piese incluse în parafină și etalate pe lamă, nu pot fi supuse operațiilor ulterioare de colorare decât după scoaterea parafinei care le îmbibă. Acest lucru este necesar deoarece parafina nu este miscibilă nici cu apa, nici cu cu alcoolul în care se dizolvă de obicei coloranții folosiți în histopatologie.

Deprafinarea s-a realizat prin trecerea lamelor cu secțiuni lipite printr-o baterie cu trei băi conținînd solvenți ai parafinei (benzen, toluen sau xilen). În fiecare baie piesa a stat 2-5 minute. În continuare, s-a realizat trecerea lamelor prin 3 băi de alcool etilic de concentrație 100%, 96%, 80%. După fiecare trecere prin alcool secțiunile s-au ștes bine. Dacă se folosește un colorant realizat pe bază de soluție alcoolică, din ultimul pahar preparatul histologic este trecut direct în colorant.

5.1.1.7. Colorarea

Examinarea țesuturilor pe secțiuni din piese fixate nu permite decât aprecieri nesemnificative asupra structurii lor deoarece sunt transparente și nu se pot diferenția elementele componente. Pentru a pune în evidență elementele constitutive ale țesuturilor (celule, fibre, componenți chimici) sau celulelor (nucleu, citoplasmă, componenți citoplasmatici) secțiunile trebuiesc colorate. Colorarea reprezintă o etapă din tehnica efectuării preparatelor histologice în care se realizează creșterea contrastului între diferite elemente tisulare prin modificarea indicelui de refracție a substratului morfologic cu ajutorul coloranților.

Colorantul histologic este o substanță chimică, de obicei colorată, de natură organică, care are proprietatea de a pătrunde în celule și de a se atașa de unele componente celulare, permițând diferențierea optică prin colorarea diferită a părților constitutive (Paraschiv H. și colab, 1989)

În colorațiile histologice generale substratul molecular la nivelul căruia se atașează coloranții, este reprezentat de proteinele de constituție, care pun la dispoziția colorantulului cationul amino, ce fixează coloranții acizi, sau anionul carboxil ce fixează coloranții bazici.

Coloranții se pot clasifica după origine în: naturali (hematoxilină, orceină, carmin) și sintetici (eozină, violet de crezol). După afinitatea tinctorială (elemente pe care le colorează) coloranții histologici pot fi: nucleari (colorează nucleul- albastru de metilen, violet de gențiană, hematoxilină,carmin), citoplasmatici (eozină, oranj și verde lumină, albastru de anilină, roșu de Congo, fucsină acidă), coloranți ce colorează toate elementele unui țesut (azurat de metilen, eozinat de albastru de metilen), coloranți indiferenți (Sudan III, Scharlach R.).

Colorațiile pot fi clasificate în funcție de metoda utilizată pentru colorarea unui țesut în: vitale, postvitale, simple, compuse, directe, indirecte, specifice (progresive, regresive).

5.1.1.8. Clarificarea secțiunilor

După colorare, secțiunile sunt tulburi, opace. Pentru a putea fi examinate trebuiesc clarificate, respectiv să devină clare, perfect transparente. Pentru clarificare, sunt îndepărtate atât apa (deshidratare) cât și alcoolul, îmbibând secțiunile cu xilen (toluen, benzen) care este miscibil cu substanța utilizată la montare (sirop Apathy, balsam de Canada, ulei de cedru, glicerină).

5.1.1.9. Montarea secțiunilor

După clarificare, secțiunile sunt montate între lamă și lamelă cu o substanță perfect transparentă (dintre cele amintite anterior pentru clarificare).

5.1.1.10. Etichetarea

Are drept obiectiv notarea numărului, numelui cazului și colorația executată pentru păstrarea în histotecă

5.1.2. Colorația hematoxilină–eozină–albastru de metil (HEA)

Pentru preparatele incluse în parafină, după deparafinare, etapele au fost următoarele: hidratare, colorare propriu-zisă, deshidratare, clarificare, montare și etichetare.

Reactivii și coloranții proprii metodei sunt: acid fosfomolibdenic, apă litinată, albastru de metil, eozină soluție apoasă 1%, hematoxilină Mayer, soluție apoasă (hematoxilină Harris).

a). Colorarea: preparatele deparafinate și hidratate s-au introdus în hematoxilină 5-15 minute, apoi s-au clătit cu apă distilată și apă de la robinet, după care s-au introdus în apă litinată 1-3 minute și apoi s-au clătit cu apă distilată și apă de la robinet. S-au reintrodus în eozină soluție apoasă 1% 30 secunde-2 minute, s-au clătit cu apă distilată, după care s-au introdus în acid fosfomolibdenic, 10 minute și apoi în soluție de albastru de metil 30 secunde–1 minut. Ultimele clătiri s-au făcut în apă distilată I și apă distilată II.

b). Deshidratarea: este obligatorie pentru majoritatea coloranților histologici, deoarece aceștia sunt dizolvați fie în apă distilată, fie în alcool etilic diluat.

Deshidratarea s-a realizat prin trecerea prin 3 băi de alcool etilic de concentrații crescânde (80%, 96%, 100%), ținându-se în fiecare 2–3 minute.

c). Clarificarea: este necesară pentru îndepărtarea alcoolului. Secțiunile s-a introdus în 3 băi de benzen și au fost menținute minim 5 minute în fiecare baie.

d). Montarea: este etapa care are drept scop protejarea secțiunilor histologice de eventualele deteriorări și asigurarea unui mediu optic omogen și transparent necesar examinării la microscop. Montarea s-a realizat prin așezarea pe secțiune a unui mediu de montare peste care s-a așezat o lamelă.

Mediile de montare pot fi apoase: glicerină pură sau saturată, sirop Apathy (format din apă distilată, gumă arabică, zahăr cristale, timol) sau anhidre (balsam de Canada – rășina coniferului Abies balsamea dizolvată în benzen).

Tehnica montării: s-au pus 1–2 picături de balsam de Canada pe secțiune și lamela a fost așezată la un capăt al preparatului unde balsamul s-a întins prin capilaritate pe o linie orizontală, apoi am așezat ușor lamela până când a luat contact cu picătura de balsam pe toată suprafața ei, astfel aerul existent a fost împins afară datorită înaintării balsamului. Preparatele astfel obținute au fost ținute în termostat la 37°C câteva ore.

e). Etichetarea: pentru ca preparatele să fie păstrate în histotecă au fost etichetate. Pe etichetă s-a notat: tipul celulei, țesutului sau organului, metoda de colorare și data efectuării preparatului, după care au fost așezate în sertarele histotecii (sertare speciale cu renuri pentru lame).

Rezultatul colorării: nucleii – violet închis, citoplasma roz – violet deschis, hematiile – cărămiziu, fibrele conjunctive – albastru nuanțat, substanța fundamentală – albastru deschis, țesutul muscular – roșu, hemosiderina brun – aurie, hialinul roz – roșu, alteori bazofil, amiloidul violet – deschis, fibrinoidul violet – nuanțat, incluziile virale oxifile sau bazofile, bacteriile Gram pozitive violet închis, miceții albastru violet (nuanțat).

5.2. Rezultate și discuții

Examenul histopatologic s-a axat pe examinarea unor fragmente de tumori prelevate de la un eșantion reprezentativ de femele cu modificări macroscopice caracteristice.

Leziunile suspicionate a fi tumori s-au examinat mai întâi macroscopic marcând localizarea și aspectele acestora (dimensiuni, formă, consistență, contur și aspectul unor eventuale modificări și leziuni cutanate), după care am trecut la examenul citologic prin puncție aspirativă sau prin frotiu, și apoi examen histologic și biochimic – toate din porțiunile reprezentative ale formațiunilor de examinat.

Preparatele histopatologice pregătite au fost examinate cu ajutorul microscopului prevăzut cu cameră foto.

În cele ce urmează sunt reproduse imagini reprezentative ale tipurilor de tumori diagnosticate la cățea și pisică în perioada stagiului doctoral.

În figura 5.1. sunt prezentate aspecte histologice dintr-o tumoră mamară, carcinom mamar, tipul tubulo-papilar, cu pleomorfism celular și nuclear moderat. Celulele epiteliale tumorale sunt dispuse pe tije fine fibro-vasculare, ce proemină sub forma unor papile în lumenul tubular la o cățea în vârstă de 6 ani, metis.

Fig. 5.1. A Carcinom mamar, tipul tubulo-papilar, cu pleomorfism celular și nuclear moderat. Celulele epiteliale tumorale sunt dispuse pe tije fine fibro-vasculare, ce proemina sub forma unor papile in lumenul tubular. (colorație HEA, Ob. 40)

Fig. 5.1. B. Carcinom mamar, tipul cribriform – celulele epiteliale maligne sunt dispuse în structuri tubulo-papilare ce formează frecvent lumene secundare cu aspectul "ochiurilor de sită". Aceste structuri delimitează central o zonă anhistă de necroză, slab-bazofilă, formată din celule inflamatorii, celule epiteliale degenerate și detritus celular. Stroma vasculo-conjunctiva moderat reprezentata. (colorație HEA, Ob. 20)

În figura 5.2. A, B sunt prezentate imagini histopatologice obținute de la o cățea în vârstă de 8 ani din rasa Tekel ce prezenta o tumoră de tip carcinom papilifer.

Fig. 5.2. A. Carcinom mamar, tipul complex – celule mioepiteliale cu anizocitoză și anizocarioză moderate, cu tendință de infiltrare în țesutul conjunctiv adiacent. (colorație HEA, Ob. 40)

Fig. 5.2. B Nucleu de țesut conjunctiv cu aspect lax, cu acumulare de substanță fundamentală (colorație HEA, Ob. 20)

În figura 5.3. A, B sunt prezentate carcinoame mamare, de tipul tubulo-papilar. Celulele epiteliale maligne sunt dispuse pe tije fine conjunctivo-vasculare ce proemina sub forma unor papile intraluminal.

În figura 5.3. C sunt prezentate celule epiteliale maligne, cu anizocarioză și anizocitoză moderate, nucleu rotund-ovalar, eucromatic, nucleoli proeminenți, mitoze atipice.

Toate aceste aspecte se întâlnesc la o cățea în vârstă de 7 ani metis.

Fig. 5.3. A

Fig. 5.3. B Carcinom mamar, tipul tubulo-papilar. Celulele epiteliale maligne sunt dispuse pe tije fine conjunctivo-vasculare ce proemina sub forma unor papile intraluminal. (colorație HEA, Ob. 20)

Fig. 5.3. C Celule epiteliale maligne, cu anizocarioză și anizocitoză moderate, nucleu rotund-ovalar, eucromatic, nucleoli proeminenți, mitoze atipice.

Stroma slab reprezentată. (colorație HEA, Ob. 40)

În figura 5.4. A, B, C, D sunt prezetate aspectele histologice dintr-o tumoră de tip carcinom in situ, cu hiperplazie glandulară, diagnosticată la o cățea în vârstă de 10 ani, metis, după cum urmează:

figura 5.4. A – Hiperplazie lobulară mamară (adenoză), fără elemente de malignitate

figura 5.4. B – Hiperplazie lobulară mamară cu slabă activitate secretorie, ectazie ductala cu produs proteic palid-bazofil, omogen și celule epiteliale degenerate intraluminal

figura 5.4. C – Hiperplazie lobulară mamară

figura 5.4. D – Aspect de hiperplazie lobulară mamară (adenoză).

Fig. 5.4. A Hiperplazie lobulară mamară (adenoză), fără elemente de malignitate.

(colorație HEA, Ob. 20)

Fig. 5.4. B Hiperplazie lobulară mamară cu slabă activitate secretorie, cctazie ductala cu produs proteic palid-bazofil, omogen și celule epiteliale degenerate intraluminal

(stânga pozei – colorație HEA, Ob. 20)

Fig. 5.4. C Hiperplazie lobulară mamară, detaliu fig. 9.4 A și B

(colorație HEA, Ob. 40)

Fig. 5.4. D Aspect de hiperplazie lobulară mamară (adenoză).

(colorație HEA, Ob. 40)

În figura 5.5. A, B, C, D sunt prezentate aspectele histologice într-o tumoră de tip carcinom mamar, diagnosticată la o cățea în vârstă de 7 ani, metis, după cum urmează:

figura 5.5. A – Structuri romboidale, optic goale corespunzătoare depozitelor de colesterol în amestec cu numeroase celule inflamatorii, celule epiteliale degenerate și detritus celular în lumenul unui chist ductal;

figura 5.5. B – Carcinom mamar, tipul mixt – celule epiteliale tumorale sunt dispuse sub forma unor structuri tubulare, nucleu de proliferare a celulelor mioepiteliale, cu pleomorfism minim;

figura 5.5. C – Detaliu – implicarea celulelor epiteliale secretorii și a celor mioepiteliale;

figura 5.5. D – Celule epiteliale maligne, cu anizocarioză și anizocitoză moderate, nuclei eucromatici, nucleoli evidenți.

Fig. 5.5. A Structuri romboidale, optic goale corespunzătoare depozitelor de colesterol în amestec cu numeroase celule inflamatorii, celule epiteliale degenerate și detritus celular în lumenul unui chist ductal (colorație HEA, Ob. 10)

Fig. 5.5. B Carcinom mamar, tipul mixt – celule epiteliale tumorale sunt dispuse sub forma unor structuri tubulare, nucleu de proliferare a celulelor mioepiteliale, cu pleomorfism minim. (colorație HEA, Ob. 20)

Fig. 5.5.C Detaliu – implicarea celulelor epiteliale secretorii și a celor mioepiteliale

(colorație HEA, Ob. 40)

Fig. 5.5. D Celule epiteliale maligne, cu anizocarioză și anizocitoză moderate, nuclei eucromatici, nucleoli evidenți. (colorație HEA, Ob. 40)

În figura 5.6. A și B sunt prezentate aspectele histologice dintr-o tumoră de tip carcinom mamar tubulo-papilar, diagnosticată la o cățea în vârstă de 10 ani, metis, după cum urmează:

figura 5.6. A – Carcinom mamar, tipul tubulo-papilar. Multiple structuri papilare formate din celule epiteliale maligne dispuse pe o tijă conjunctiva fina ce proemina intraluminal;

figura 5.6. B – Celule epiteliale maligne cu tendință de invazie stromală. Celulele tumorale prezintă anizocitoză și anizocarioză evidente, nucleoli proeminenți, rare mitoze atipice.

Fig. 5.6. A Carcinom mamar, tipul tubulo-papilar. Multiple structuri papilare formate din celule epiteliale maligne dispuse pe o tijă conjunctiva fina ce proemina intraluminal. (colorație HEA, Ob. 40)

Fig. 5.6. B Celule epiteliale maligne cu tendință de invazie stromală. Celulele tumorale prezintă anizocitoză și anizocarioză evidente, nucleoli proeminenți, rare mitoze atipice.

(colorație HEA, Ob. 40)

În figura 5.7 A este prezentat un aspect macroscopic a unei tumori de tip osteosarcom mamar, cu diametrul de 5 – 6 cm, dură, compactă pe secțiune, cu nuclee de țesur osos și cartilaginos, diagnosticat la o cățea în vârstă de 7 ani, rasa Tekel.

Figurile 5.7. B, C, D, evidențiază aspectele histologice ale acestui tip de tumoră, astfel:

în figura 5.7 B – Zonă de țesut glandular fără transformări tumorale, structuri acinare chistizate;

în figura 5.7 C – Nuclee de țesut osos, osteoblaste cu anizocitoză moderată; țesut glandular transformat chistic;

în figura 5.7 D – Teritoriu de țesut osos din structura tumorii, lacune osoase cu măduvă hematoformatoare; prezența megacariocitelor.

Fig. 5.7. A Aspectul macroscopic al osteosarcomului mamar la cățea

Fig. 5.7. B Zonă de țesut glandular fără transformări tumorale, structuri acinare chistizate (colorație HEA, Ob. 20)

Fig. 5.7. C Nuclee de țesut osos (săgeți), osteoblaste cu anizocitoză moderată; țesut glandular transformat chistic (colorație HEA, Ob. 20)

Fig. 5.7. D Teritoriu de țesut osos (săgeți roșii) din structura tumorii, lacune osoase cu măduvă hematoformatoare; prezența megacariocitelor (săgeți galbene).

(colorație HEA, Ob. 20)

În figura 5.8. A este prezentat un aspect macroscopic a unei tumori de tip carcinom, diagnosticată la o cățea în vârstă de 10 ani, rasă comună.

În figura 5.8. B este prezentat un aspect histologic al acestui tip de tumoră, observându-se proliferare tumorală malignă alcӑtuitӑ din celule de tip epitelial asezate sub formӑ tubularӑ, focal lumenul este obturat în totalitate, datoritӑ proliferӑrii excesive a celulelor epiteliale, care depășesc membarana bazală.

Fig. 5.8. A Aspect macroscopic tumoră mamară la cățea

Fig. 5.8. B Proliferare tumorală malignă alcӑtuitӑ din celule de tip epitelial asezate sub formӑ tubularӑ, focal lumenul este obturat în totalitate, datoritӑ proliferӑrii excesive a celulelor epiteliale, care depășesc membarana bazală. (colorație HEA, Ob. 40)

În figura 5.9. A este prezentat un aspect macroscopic al unei tumori mamare, diagnosticată la o pisică în vârstă de 8 ani, de rasă comună. Tumora a prezentat o cavitate centrală și aspect carcinomatos la periferie. La secționare s-a exprimat lichid sero-sangvinolent.

În figurile 5.9. B, C, D și E sunt prezentate aspectele histologice ale carcinomului de tip cribriform:

în figura 5.9. B – Celulele epiteliale sunt dispuse intraluminal, sub forma unor proliferari papilare, ce delimitează central o zonă anhistă cu detritus celular

în figura 5.9. C – Lobuli transformați carcinomatos și zone întinse de necroză ischemică

în figura 5.9. D – Celule de tip epitelial, asezate sub formӑ tubularӑ și acinarӑ, dilatate, in care se proiectează papile mici, formate din celule epiteliale cilindrice/columnare, cu nucleu rotund-ovalar, perpendicular pe membrana bazala, hipercrom, citoplasma slab eozinofila, in cantitate mica

Fig. 5.9. A Aspect macroscopic tumora mamară la pisică

Fig. 5.9. B Celulele epiteliale sunt dispuse intraluminal, sub forma unor proliferari papilare, ce delimitează central o zonă anhistă cu detritus celular. (colorație HEA, Ob. 20)

Fig. 5.9. C Lobuli transformați carcinomatos și zone întinse de necroză ischemică (săgeți) (colorație HEA, Ob. 20)

Fig. 5.9. D Celule de tip epitelial, asezate sub formӑ tubularӑ și acinarӑ,

dilatate, în care se proiectează papile mici, formate din celule epiteliale cilindrice/columnare, cu nucleu rotund-ovalar, perpendicular pe membrana bazala, hipercrom, citoplasma slab eozinofila, în cantitate mica. (colorație HEA, Ob. 20)

Fig. 5.9. E Proliferare tumorală malignă alcatuită din celule epiteliale cu dispunere in structuri solide, delimitate de o stromă moderat reprezentată. (colorație HEA, Ob. 20)

În figura 5.10 este prezentat un aspect histologic dintr-o tumoră mamară, diagnosticată la o pisică în vârstă de 11 ani, de rasă comună – celulele epiteliale proliferate sunt așezate într-un singur strat pe o tijă fină vasculo-conjunctivă ce proemină intraluminal sub forma unor papile. Stroma bine reprezentată, frecvente vase sangvine ectaziate.

Fig. 5.10. Celulele epiteliale proliferate sunt așezate într-un singur strat pe o tijă fină vasculo-conjunctivă ce proemină intraluminal sub forma unor papile. Stroma bine reprezentată, frecvente vase sangvine ectaziate. (colorație HEA, Ob. 20)

În urma examenelor histopatologice s-a identificat următoarea distribuție a tipurilor tumorale:

Tabel 5.1.

Distribuția tipurilor tumorale la cățele castrate

Table 5.1.

The distribution of tumor types in castrated bitches

În figura 5.11. este reprezentată distribuția tipurilor tumorale la cățele castrate.

Fig. 5.11. Distribuția tipurilor tumorale la cățele castrate

Fig. 5.11. The distribution of tumor types in castrated bitches

La cățelele castrate am constatat că din cele 88 de cazuri luate în studiu, 51 cazuri (57,95%) sunt carcinoame de diferite tipuri (tubular, lobular, simplu, complex, papilifer, etc.) și că dintre ele predomină carcinomul complex, întâlnit la 24 cazuri (27,27%) ceea ce înseamnă majoritatea.

În ordine descrescătoare, urmează 17 cazuri (19,31%) de adenocarcinoame mamare de diferite tipuri (cu nuclee de transformare cu zone de carcinom complex, cu zone de carcinom in situ, de tip papilifer, cu zone de transformare carcinomatoasă, cu zone de tumoră mixtă benignă și malignă, cu ectazie ductală), iar din cele rămase majoritatea au fost tumori benigne.

Tabel 5.2.

Distribuția tipurilor tumorale la cățele necastrate

Table 5.2.

The distribution of tumor types in intact bitches

În figura 5.12. este reprezentată distribuția tipurilor tumorale la cățele necastrate.

Fig. 5.12. Distribuția tipurilor tumorale la cățele necastrate

Fig. 5.12. The distribution of tumor types in intact bitches

La cățelele necastrate observăm de asemenea că din 132 de cazuri proporția carcinoamelor de diferite tipuri 79 cazuri (59,84%) este predominantă, urmată de adenoame în 25 cazuri (18,93%), restul fiind reprezentate de hiperplazii sau tumori benigne și maligne.

Date comparative privind distribuția tipurilor tumorale atât la la cățele castrate și cățelele necastrate, sunt redate în tabelul de mai jos:

Tabel 5.3.

Distribuția tipurilor tumorale la cățele castrate și cele necastrate

Tabel 5.3.

Distribution of tumor types encountered in bitches spayed and uncastrated

În figura 5.13. este reprezentată distribuția tipurilor tumorale întâlnite la cățele castrate și cățelele necastrate.

Fig. 5.13. Distribuția tipurilor tumorale la cățele castrate și necastrate

Fig. 5.13. Distribution of tumor types castrated and uncastrated bitches

În urma analizei distribuției tipurilor tumorale întâlnite atât la cățele castrate cât și la cățelele necastrate s-a constatat o frecvență mai mare a carcinomului complex la cățelele castrate (27,27%) comparativ cu cele necastrate (23,48%), în timp ce frecvența carcinomului simplu a fost mai mică la cățelele castrate (4,54%) comparativ cu cele necastrate (2,27%).

Tabel 5.4.

Distribuția tipurilor tumorale la pisici castrate

Table 5.4.

Distribution of tumor types castrated cats

În fig. 5.14. este reprezentată distribuția tipurilor tumorale la pisici castrate.

Fig. 5.14. Distribuția tipurilor tumorale la pisici castrate

Fig. 5.14. Distribution of tumor types castrated cats

Din totalul de 89 cazuri, 57 (64,04%) sunt carcinoame de diferite tipuri, urmate de 22 cazuri (24,71%) cu diferite forme de adenoame, iar restul tumori benigne.

Tabel 5.5.

Distribuția tipurilor tumorale la pisici necastrate

Table 5.5.

Distribution of tumor types uncastrated cats

În fig. 5.15. este reprezentată distribuția tipurilor tumorale la pisici necastrate.

Fig. 5.15. Distribuția tipurilor tumorale la pisici necastrate

Fig. 5.15. Distribution of tumor types uncastrated cats

La pisicile necastrate din totalul de 67 de cazuri, 41 (61,19%) sunt reprezentate de carcinoame de diferite tipuri, iar în ordine descrescătoare, adenoamele de diferite tipuri 13 cazuri (19,40%), restul fiind hipreplazii, metastaze chistice sau mastoza fibro-chistică, hiperplazia ductală, ectazia ductală.

Date comparative privind distribuția tipurilor tumorale la pisicile castrate și pisicile necastrate, sunt redate în tabelul de mai jos:

Tabel 5.6.

Distribuția tipurilor tumorale la pisicile castrate și cele necastrate

Table 5.6.

Distribution of tumor types castrated and uncastrated cats

În fig. 5.16. este reprezentată distribuția tipurilor tumorale la pisici castrate și necastrate.

Fig. 5.16. Distribuția tipurilor tumorale la pisici castrate și necastrate

Fig. 5.16. Distribution of tumor types castrated and uncastrated cats

În urma analizei distribuției tipurilor tumorale întâlnite atât la pisicile castrate cât și la pisicile necastrate s-a constatat o frecvență mai mare a carcinomului mamar la pisicile castrate (17,99%) comparativ cu cele necastrate (11,94), în timp ce frecvența adenozei a fost mai mică la pisicile castrate (2,25%) comparativ cu cele necastrate (5,97%).

5.3. CONCLUZII PARȚIALE

1). Carcinomul mamar de tipul tubulo-papilar, la cățea s-a caracterizat histologic, prin prezența unui pleomorfism celular și nuclear moderat. Celulele epiteliale tumorale sunt dispuse pe tije fine fibro-vasculare, ce proemină sub forma unor papile în lumenul tubular. Acesta a fost întâlnit în procent de 6,06% la cățele necastrate, de 4,54% la cățele castrate.

La pisică acest tip de carcinom a prezentat următoarele caracteristici histologice: celulele epiteliale sunt dispuse intraluminal, sub forma unor proliferari papilare, ce delimitează central o zonă anhistă cu detritus celular. Acesta a fost întâlnit în procent de 8,95% la pisicile necastrate, de 11, 23% la pisicile castrate.

2). Carcinom mamar, tipul cribriform, la cățea s-a caracterizat histologic, prin prezența de celule epiteliale maligne, dispuse în structuri tubulo-papilare ce formează frecvent lumene secundare cu aspectul "ochiurilor de sită". Aceste structuri delimitează central o zonă anhistă de necroză, slab-bazofilă, formată din celule inflamatorii, celule epiteliale degenerate și detritus celular. Stroma vasculo-conjunctiva moderat reprezentata. Acesta a fost întâlnit în procent de 3,03% la cățele necastrate, de 2,27% la cățele castrate.

La pisică acest tip de carcinom a prezentat următoarele caracteristici histologice:

celule de tip epitelial, asezate sub formӑ tubularӑ și acinarӑ, dilatate, in care se proiectează papile mici, formate din celule epiteliale cilindrice/columnare, cu nucleu rotund-ovalar, perpendicular pe membrana bazala, hipercrom, citoplasma slab eozinofila, in cantitate mica. Acesta a fost întâlnit în procent de 2,27% la pisicile necastrate, de 4,54% la pisicile castrate.

3). Carcinomul mamar de tip lobular, la cățea s-a caracterizat histologic, prin hiperplazie lobulară mamară (adenoză), fără elemente de malignitate; hiperplazie lobulară mamară cu slabă activitate secretorie, ectazie ductala cu produs proteic palid-bazofil, omogen și celule epiteliale degenerate intraluminal; hiperplazie lobulară mamară. Acesta a fost întâlnit în procent de 1,51% la cățele necastrate, de 2,27% la cățele castrate.

La pisică acest tip de carcinom a prezentat următoarele caracteristici histologice: celulele epiteliale proliferate, așezate într-un singur strat pe o tijă fină vasculo-conjunctivă ce proemină intraluminal sub forma unor papile. Stroma bine reprezentată, frecvente vase sangvine ectaziate. Acesta a fost întâlnit în procent de 1,49% la pisicile necastrate, de 1,12% la pisicile castrate.

4). Carcinomul mamar de tip mixt, la cățea s-a caracterizat histologic, prin celule epiteliale tumorale, dispuse sub forma unor structuri tubulare, nucleu de proliferare a celulelor mioepiteliale, cu pleomorfism minim, întâlnit în procent de 1,51% doar la cățelele necastrate.

5). Carcinomul mamar la cățea s-a caracterizat histologic, prin multiple structuri papilare formate din celule epiteliale maligne dispuse pe o tijă conjunctiva fina ce proemina intraluminal; celule epiteliale maligne cu tendință de invazie stromală. Celulele tumorale prezintă anizocitoză și anizocarioză evidente, nucleoli proeminenți, rare mitoze atipice. Acesta a fost întâlnit în procent de 0,76% la cățele necastrate, de 2,27% la cățele castrate. La pisică a fost întâlnit în procent de 10,12% la pisicile necastrate și de 7,46% la pisicile castrate.

6). Osteosarcomul mamar la cățea s-a caracterizat histologic, prin nuclee de țesut osos, osteoblaste cu anizocitoză moderată; țesut glandular transformat chistic; teritoriu de țesut osos din structura tumorii, lacune osoase cu măduvă hematoformatoare; prezența megacariocitelor. Acesta a fost întâlnit în procent de 0,76% doar la cățele necastrate.

7). Carcinomul mamar la cățea s-a caracterizat histologic, prin proliferare tumorală malignă alcӑtuitӑ din celule de tip epitelial asezate sub formӑ tubularӑ, focal lumenul fiind obturat în totalitate, datoritӑ proliferӑrii excesive a celulelor epiteliale, care depășesc membarana bazală. Acesta a fost întâlnit în procent de 8,34% la cățele necastrate, de 6,82% la cățele castrate. La pisică a fost întâlnit în procent de 11,94% la pisicile necastrate și de 17,99% la pisicile castrate.

8). Adenocarcinomul mamar, la cățea a fost întâlnit în procent de 4,45% la cățele necastrate și în procent de 2,27% la cățele castrate. La pisică a fost întâlnit în procent de 1,49% la pisicile necastrate și de 1,12% la pisicile castrate.

De asemenea la cățelele necastrate, adenocarcinomul de diferite tipuri a fost întâlnit doar la cățele necastrate, în procent de 3,03%, iar la pisicile necastrate a fost întâlnit în procent de 5,97% și la pisicile castrate în procent de 13,48%.

9). Adenoza de diferite tipuri a fost întâlnit în procent de 9,85% la cățele necastrate și în procent de 17,04% la cățele castrate, iar la pisicile necastrate a fost întâlnit în procent de 11,94% și la pisicile castrate în procent de 11,24%.

10). Carcinomul complex a fost întâlnit în procent de 23,48% la cățele necastrate și în procent de 27,27% la cățele castrate. La pisică a fost întâlnit în procent de 1,49% la pisicile necastrate și de 1,12% la pisicile castrate.

11). Carcinoamele de diferite tipuri a fost întâlnit în procent de 8,34% la cățele necastrate și în procent de 10,22% la cățele castrate, iar la pisicile necastrate a fost întâlnit în procent de 11,94% și la pisicile castrate în procent de 12,36%.

12). Carcinom/adenocarcinomul mamar a fost întâlnit în procent de 6,06% la cățele necastrate și în procent de 1,14% la cățele castrate, iar la pisicile necastrate a fost întâlnit în procent de 5,97% și la pisicile castrate în procent de 3,38%.

13). Mastoza fibro-chistică, hiperplazia ductală, ectazia ductală a fost întâlnit în procent de 11,36% la cățele necastrate și în procent de 9,09% la cățele castrate, iar la pisicile necastrate a fost întâlnit în procent de 2,99% și la pisicile castrate în procent de 4,50%.

Capitolul VI

EXAMENUL BIOCHIMIC

CHAPTER VI
BIOCHEMISTRY

6.1. MATERIALE ȘI METODE

6.1.1. Dozarea unor parametri biochimici în sânge prin chimie uscată

6.1.1. Measure of biochemical parameters in blood by dry chemistry

Investigațiile au fost realizate utilizând plasma sangvină obținută prin centrifugarea sângelui recoltat de la cățele și pisici cu tumori mamare, la care s-a realizat și examenul histopatologic. Sângele a fost recoltat în eprubete cu anticoagulant și centrifugat, separând supernatantul de depozit.

O parte dintre determinările efectuate, au fost realizate pe analizorul automat de chimie uscată VetTest (figura 6.1.) produs de IDEXX Laboratoires, aflat în dotarea laboratorului de Biochimie a Facultății de Medicină Veterinară București.

Fig. 6.1. Analizor chimie uscată VetTest

Fig. 6.1. VetTest dry chemistry analyzer

(sursa: www.idexx.com)

Acest tip de analizor folosește cipuri impregnate cu reactivi, produse printr-o tehnologie ce permite eliminarea interferențelor determinate de hiperlipemie, bilirubinemie și hemoliză. În figura 6.2 este prezentată în detaliu structura unui astfel de cip care, comparativ cu alte tipuri de tehnologii de chimie uscată, prezintă și un strat de filtrare destinat să elimine interferențele.

Fig. 6.2. Structura internă a unui cip VetTest

Fig. 6.2. Internal structure of a Vet Test chip

(sursa: www.idexx.com)

Utilizând acest aparat au fost determinați următorii parametri: glucoza, ureea, fosfataza alcalină, transaminaze (GPT. GGT, GOT), amilaza și proteinele totale.

6.1.2. Dozarea proteinelor și a glicoproteinelor din țesuturile tumorale

6.1.2. Measure of proteins and glycoproteins in tumor tissues

Determinările biochimice realizate pe proteinele extrase din țesuturile tumorale au fost realizate conform următoarelor etape de lucru:

Dezintegrarea țesuturilor tumorale a avut ca scop izolarea componentelor de origine celulară se realizează prin ruperea membranelor celulare urmată de solubilizarea compușilor și îndepărtarea materialului rezidual prin centrifugare sau, în cazul compușilor legați de membrane, prin tratarea fragmentelor membranare cu detergenți de tipul Triton X 100 sau cu săruri biliare de tipul deoxicolatului de sodiu.

Numeroase studii celulare necesită distrugerea membranelor celulare și separarea organitelor celulare (mitocondrii, nuclee etc.) prin procedee cunoscute sub numele de fracționare. Operația de omogenizare grosieră a țesuturilor se efectuează cu omogenizatoare mecanice sau electrice, capabile să producă o dispersie celulară însoțită și de distrugeri celulare la turații superioare. Pentru probe mici de țesut se utilizează instrumente de omogenizare prevăzute cu cilindrii rotitori care cauzează ruperea țesuturilor și distrugerea specifică a celulelor. Instrumentele echipate cu generatoare de ultrasunete s-au dovedit a prezenta o putere de distrugere a membranelor celulare incomparabil mai mare, decât cea conferită de omogenizatoarele clasice. Pentru evitarea supraîncălzirii au fost realizate dezintegratoare de presiune apte de a exercita o presiune ridicată asupra probei congelate; presiunea extrem de ridicată, exercitată pe o suprafață mică, determină ruperea membranelor celulare și implicit, deversarea conținutului celular.

b). Extracția proteinelor cu solvenți este operația de separare a componentelor dintr-un amestec omogen sau eterogen prin dizolvare selectivă în diferiți solvenți, în funcție de solubilitatea substanțelor.

După natura amestecului inițial (solid, lichid) supus extracției, operația poate fi:

– extracție solid-lichid (de exemplu extracția cu soluție salină fiziologică sau cu tampon fosfați a unor proteine dintr-un țesut mojarat);

– extracție lichid-lichid (extracția fosfolipidelor din uleiuri cu un amestec de metanol – cloroform în raport volumetric 1:2).

Medii de extracție:

Apa distilată reprezintă un mediu hipotonic care realizează și distrugerea structurilor celulare. Aceasta reprezintă un mediu eficace de extracție pentru componente polare și amestecuri complexe care necesită adăugarea în mediul de reacție a unor cofactori.

Soluțiile saline izotonice (soluția salină fiziologică, KCl 0,15M, zaharoza 0,25M etc.) reprezintă cele mai utilizate medii de extracție a proteinelor deoarece la concentrații mici de săruri neutre acestea se solubilizează generând fenomenul cunoscut sub numele de „salting-in”.

Soluțiile tampon fosfat monopotasic-fosfat disodic, citrat de sodiu – acid citric, sunt medii de extracție eficiente pentru proteinele care prezintă activitate catalitică.

Ureea și guanidina HCl au proprietatea de a disocia complexele proteice, în special nucleoproteidele; acțiunea denaturată asupra proteinelor reprezintă un impediment în utilizarea acestora în scopul extracției proteinelor cu activitate enzimatică.

Fenolul se utilizează sub formă de soluție de concentrație 90% pentru separarea lipopoliglucidelor de pe corpii bacteriilor gram-negative.

Amestecul cloroform – metanol reprezintă un excelent mediu de extracție a lipidelor polare din mojarate tisulare sau din diferite grăsimi.

Hexanul și heptanul se utilizează în laboratorul de biochimie pentru extracția lipidelor nepolare și a vitaminelor liposolubile.

Raportul de extracție este dependent de proprietățile fizico-chimice ale sursei biologice și de natură chimică a mediului de extracție.

c). Precipitarea proteinelor prin precipitarea izoelectrică se bazează pe influența pe care pH-ul mediului o exercită asupra solubilității proteinelor globulare. Deoarece la pH egal cu pH-ul izoelectric, sarcina globală a unei macromoleculei proteice este zero, macromoleculele se aglomerează formând agregate insolubile. Precipitarea izoelectrică se realizează cu soluții tampon, iar proteinele precipitate izoelectric își păstrează conformația și pot fi redizolvate într-un mediu cu un pH sau cu o concentrație salină corespunzătoare. Întrucât conținutul în aminoacizi al proteinelor diferă, fiecare proteină prezintă o valoare proprie a pH-ului izoelectric, amestecurile proteice putând fi adesea separate prin precipitare izoelectrică.

Salifierea proteinelor este una dintre metodele de studiere a componentelor calitative și cantitative a proteinelor (alături de electroforeză și dializă) și reprezintă precipitarea reversibilă a proteinelor din soluție cu soluții concentrate de electroliți și se datorează tendinței puternice a sărurilor neutre ale unor ioni monovalenți și bivalenți ca: MgCl2, (NH4 )2SO4, NaCl, NH4Cl, KCl în concentrații mici. Sărurile menționate cresc solubilitatea proteinelor, fenomen cunoscut sub numele de „salting-in”; pe măsură ce concentrația în sare neutră crește, solubilitatea proteinelor scade. La o concentrație suficient de mare o proteină poate fi complet precipitată din soluție, efectul fiind numit salifiere sau „salting-aut”. Deoarece fiecare proteină răspunde în mod diferit la fenomenul de salifiere și suplimentar, proteinele își păstrează conformația și proprietățile biochimice, salifierea este un procedeu important pentru separarea și fracționarea proteinelor.

Precipitarea cu solvenți organici neutri, miscibili cu apa (etanol, acetonă) se bazează pe scăderea gradului de ionizare al grupărilor funcționale prezente pe o macromoleculă proteică determinând agregarea acestora. Întrucât acești solvenți pot denatura proteinele din cauza proceselor exoterme care apar, temperatura amestecului trebuie păstrată la valori mici.

d). Dializa proteinelor: prin dializă se înțelege procesul de separare al moleculelor de dimensiuni mici de cele cu dimensiuni mari cu ajutorul membranelor semipermeabile (acetat de celuloză) printr-un fenomen de difuziune.

Astfel, dacă o membrană semipermeabilă delimitează un mediu care conține un amestec de molecule de dimensiuni mari (proteine) și molecule sau ioni de dimensiuni mici (ioni amoniu) de un mediu hipotonic (apă distilată, soluție tampon), componenții de dimensiuni mici ale celor două medii (pentru care membrana este permeabilă) vor trece prin membrană și vor tinde să egaleze cele două presiuni osmotice. Procesul de difuziune are loc atâta timp cât soluția din exteriorul membranei este hipotonică comparativ cu cea din interior. Deoarece la egalarea celor două presiuni osmotice procesul de difuziune încetează, este necesar ca solventul față de care se efectuează dializa să fie schimbat până când componenții de dimensiuni mici sunt complet îndepărtați din sistem. Viteza procesului de dializă crește cu scăderea vâscozității mediului și deci cu creșterea temperaturii. Pentru soluții de compuși cu activitate biologică enzime, antigene, anticorpi, hormoni, acizi nucleici, dializa se efectuează la 4°C pentru a evita denaturarea termică a acestora.

e). Filtrarea și centrifugarea proteinelor: filtrarea reprezintă operația care permite separarea fazei solide dintr-o suspensie cu ajutorul unor materiale poroase numite filtre, care pot fi constituite din : hârtie, porțelan poros, sticlă poroasă, azbest. Fracțiunea lichidă obținută în urma operației de filtrare se numește filtrat. Hârtia de filtru se deosebește prin dimensiunile porilor:

– hârtia de filtru cu pori foarte mici, cu bandă albastră, pentru precipitate foarte fine (sulfat de bariu);

– hârtia de filtru cu pori de mărime mijlocie, cu bandă galbenă, pentru precipitate de dimensiuni medii;

– hârtia de filtru cu pori mari, bandă albastră, pentru precipitate cu dimensiuni mari (proteine).

Centrifugarea este operația de separare a unui amestec eterogen, reprezentat de o suspensie alcătuită din două sau mai multe componente cu densități diferite, folosind forța centrifugă. Componentele cu densitate mai mare sub acțiunea forței centrifuge, se depun la baza tubului de centrifugă, în timp ce, componentele cu densitate mică plutesc deasupra componentelor grele constituind supernatantul. Centrifugele utilizate în mod normal în laboratorul de biochimie sunt centrifugele cu eprubete. Acestea sunt prevăzute cu eprubete de sticlă sau plastic în care se introduc suspensiile de separat și sunt acționate electric. Turația centrifugei și timpul de centrifugare se stabilește în funcție de natura componenților care se doresc a sedimenta. Astfel, pentru sedimentarea eritrocitelor dintr-o suspensie eritrocite – soluție salină fiziologică se utilizează o turație redusă (800 rot/min) timp de 3-4 minute pentru a evita ruperea membranelor celulare.

6.1.2.1. Electroforeza proteinelor în geluri de poliacrilamidă

Este o metodă de analiză ce constă în migrarea cu viteză diferită a produșilor chimici în soluții prin care circulă un curent electric, bazată pe deplasarea spre electrozi a particulelor dintr-o soluție coloidală sau în suspensie spre anod (anoforeză) sau catod (cataforeză).

Am folosit această metodă cu scopul separării glicoproteinelor din amestecul centrifugat.

Gelul de poliacrilamidă (PAA) este un gel cu excelente proprietăți mecanice și separare electroforetică. Este stabil, transparent, flexibil. Se obține prin polimerizarea acrilamidei în prezența N, N’- metilenbisacrilamidei (BIS), a N, N’- tetrametil –etilen – diaminei (TEMED) și a persulfatului de amoniu drept catalizator. Ca structură, gelul se prezintă ca o rețea tridimensională formate din catene lineare lungi de monomeri de acrilamidă legate încrucișat prin punți metilenice.

Aparatura: migrarea electroforetică s-a realizat într-un sistem format din cuvă de tip Sigma și un redresor consort (figura 6.3.).

Fig. 6.3. Aparat de electoforeză

Fig. 6.3. Electrophoresis device

Reactivi:

– soluție tampon pentru gel (pH = 8,8-9,0): se dizolvă 9,0g TRIS, 4,7 g glicocol și se aduce la un litru cu apă distilată;

– soluție tampon pentru electroforeză (pH = 8,3): se dizolvă 6g TRIS 28,8 g glicocol și se aduce la un litru cu apă distilată;

– soluție stoc pentru obținerea gelului de poliacrilamidă: acrilamidă 34 g, bis-acrilamidă 0,155 g, amestecul se aduce la 100 ml cu apă distilată;

– soluție de colorare a proteinelor: 2,16g Coomassie Brilliant Blue R 250 se dizolvă în 500 ml solvent compus din alcool metilic 225 ml, apă distilată 225 ml și 50 ml acid acetic glacial; pentru colorarea glicoproteielor s- a utilizat kit-ul Pierce.

– soluție de spălare: acid acetic 7,5%.

Kitul de colorare a glicoproteinelor Pierce „Thermo Scientific Pierce Glycoprotein Staining Kit” (figura 6.4.) este un kit de colorare practic, rapid și cu specificitate mare pentru proteinele glicozilate din geluri de poliacrilamidă.

Kit-ul conține trei reactivi esențiali și protocolul prin care sunt colorate glicoproteinele din gelul de poliacrilamidă, separate prin electroforeză (PAGE). Gelul sau membrana, ce conține proteinele separate, este tratată cu o soluție de periodat, ce oxidează grupările cis-diol de la nivelul glicoproteinelor (legăturile glican-proteină), formându-se grupări tip aldehidă. Grupările aldehidice sunt identificate prin formarea legăturilor de tip baze-Schiff, în urma reacției cu un reactiv ce determină apariția unor benzi colorate în mov-magenta. Reacția acid periodic Schiff reprezintă o metodă de colorare ușoară datorită chitului ce conține reactivii esențiali și instrucțiunile necesare efectuării acesteia. Kit-ul include și proteine de control, atât pozitive cât și negative.

Fig. 6.4. Kit-ul de colorare Pierce

Fig. 6.4. Pierce staining kit

Conținutul kit-ului – trei reactivi în sticle de 250 ml (unul sub formă de soluție și 2 pulberi ce vor fi folosite prin amestec cu apă) și două fiole cu proteine liofilizate (câte un mg din fiecare). Aceste materiale sunt suficiente pentru a realiza colorarea a 10 mini geluri sau a 20 de membrane nitrocelulozice:

– Glycoprotein stain, 250 ml;

– Reactiv oxidant, 2,5 g, suficient pentru a prepara 250 ml soluție oxidantă;

– Reactiv reducător, 1,25 g, suficient pentru a prepara 250 ml soluție reducătoare;

– Controlul pozitiv: peroxidază din hrean, 1 mg;

– Controlul negativ: inhibitor de tripsină extras din soia, 1mg.

Tehnica de lucru pentru colorarea proteinelor Coomassie Blue:

a). Prepararea gelului: între plăcile de sticlă, așezate în poziție perfect verticală, se pipetează amestecul de gel conținând 2,83 ml tampon TRIS pH 8,8, apă distilată 0,50 ml, soluție stoc de acrilamidă, TEMED 15 µl, persulfat de amoniu 1% 200 µl, se introduce spațiatorul pentru godeuri și se adaugă, cu o pipetă efilată, apă distilată la suprafața plăcuței. Polimerizarea durează 20 de minute și după gelificare se îndepărtează stratul de la suprafață.

b). Aplicarea probei: după realizarea unei premigrari, cu o micropipetă se adaugă 5µl probă în fiecare godeu. Densitatea probelor a fost mărită prin adăugarea de sucroză.

c). Migrarea: se aplică un curent cu o tensiune de 150-200 V și o intensitatea de 25 mA per placă, timpul de migrare fiind de 30-45 de minute. La sfârșitul electroforezei gelul este desprins de pe plăcile de sticlă.

d). Revelarea (colorarea): gelul este plasat într-o placă Petri și este urmat protocolul de colorare specific:

– pentru proteine Coomassie Blue: gelul este acoperit cu soluție de colorare și se așteaptă 5 minute, după care gelul este spălat cu soluție de acid acetic 7,5%, operație care se repetă până colorantul a difuzat din gel. Benzile de proteine separate electroforetic apar colorate în albastru (Tabelul 6.14).

Tehnica de lucru pentru colorarea glicoproteinelor cu kit-ul Pierce:

După electroforeză se fixează gelul prin imersie completă în 100 mL metanol 50%, timp de 30 de minute;

– Se spală gelul cu grijă prin agitare într-o soluție de acid acetic 3%, timp de 10 minute. Se repetă procedura încă o dată. În acest stadiu se poate opri lucrul, gelul putând fi lăsat peste noapte în apă;

– Gelul este transferat în 25ml soluție oxidantă și se agită timp de 15 minute;

– Se spală gelul cu 100 ml soluție acid acetic, agitând ușor timp de 5 minute. Se repetă pasul de încă două ori;

– Gelul este transferat în 25 ml soluție reactiv de colorare glicoproteine și se agită 15 minute. În cazul în care reactivul a cristalizat, acesta este centrifugat și folosit supernatantul. Nu se încălzește pentru a dizolva cristalele;

– Gelul este transferat în 25 ml soluție reducătoare și se agită timp de 5 minute;

– Se spală insistent gelul cu soluție de acid acetic 3%, apoi cu apă distilată. Glicoproteinele apar sub formă de benzi mov-magenta. Gelul poate fi depozitat în soluție de acid acetic 3%. Schema de lucru, este prezentată în figura 6.5.

Fig. 6.5. Protocolul de lucru pentru colorarea glicoproteinelor

Fig. 6.5. Working protocol for glycoproteins staining

6.1.2.2. Dozarea proteinelor din plasmă și sânge (metoda biuretului)

Metodele colorimetrice de determinare a proteinelor din plasmă se bazează pe proprietatea compușilor cu legături peptidice (-CO-NH-) de a reacționa cu ionul de cupru în soluție alcalină (metoda biuretului), dând săruri complexe de culoare violetă, a cărei intensitate este direct proporțională cu concentrația în proteine.

Materiale necesare:

– Reactiv biuret: 4,5 g tartrat dublu de sodiu și potasiu se dizolvă în 40 ml de soluție de hidroxid de sodiu 0,2 N, se adaugă 1,5 g sulfat de cupru, apoi 0,5 iodură de potasiu, se agită și se completează cu hidroxid de sodiu 2N, până la 100 ml, soluția obținută diluându-se cu cu o soluție de iodură de potasiu 0,5% în hidroxid de sodiu 0,2 N, în raport de 1:5;

– Soluție salină fiziologică;

– Soluție etalon albumină serică bovină de concentrație 10%;

– Probele de cercetat.

Tehnica de lucru:

Dozarea proteinelor se poate efectua cu o soluție etalon de albumină serică bovină sau cu o curbă etalon de albumină de concentrații cuprinse între 1 și 10 g/dl. Se realizează următoarea schemă experimentală (tabel 6.1):

Tabel 6.1.

Protocolul experimental pentru dozarea proteinelor din plasmă

Table 6.1.

Experimental protocol for dosage of plasma protein

După amestecarea reactivilor în eprubete, acestea se agită și se lasă la temperatura camerei timp de 10 minute, după care se citește extincția (absorbanța) la 540 nm.

6.1.2.3. Dozarea proteinelor din plasmă (metoda Bradford)

Metoda Bradford se bazează pe proprietatea colorantului Coomassie Blue G-250 de a se lega de proteine, ĩn special la nivelul resturilor lizil și arginil, formând un complex care prezintă maxim de absorbție la 595 nm. Este o metoda subiectivă, fiind dependentă de concentrația în aminoacizi a proteinelor cercetate.

Principiul metodei: în mediu acid, componenta roșie a colorantului Coomassie Brilliant Blue G-250 este transformată în componenta albastră, ce se va lega de proteine. În timpul formării complexului proteină – colorant, au loc două tipuri de interacțiuni: componenta roșie a colorantului Coomassie cedează un electron proteinelor, ce va determina expunerea grupărilor hidrofobe, care se vor lega non-covalent (prin legături van der Waals) de regiune nepolară a colorantului, astfel poziționând grupările amino către grupările negative ale colorantului. Aceste legături stabilizează forma albastră a colorantului Coomassie; prin urmare, cantitatea de complex proteină – colorant prezentă în soluție poate fi determinată prin măsurarea extincției (595 nm), obținându-se astfel concentrația de proteină. Dezavantajul acestei metode este acela că este eficientă până la concentrații de 2000 µg/ml, peste aceste valori fiind necesară executarea diluțiilor.

Materiale necesare:

– Albumină serică bovină;

– Colorant Coomassie Brilliant Blue;

– Soluție 0,15M NaCl;

– Spectrofotometru, cuve, micropipete.

Tehnica de lucru:

Pregătirea probelor prin realizarea de diluții seriate; pregătirea standardului, albumina serică bovină în concentrație cunoscută (1-10 µg/ml); pregătirea blank-ului, soluția de NaCl;

Se pun câte 100 µl din fiecare dintre substanțele menționate anterior în cuve separate, peste care se adaugă 900 µl souție Coomassie Blue în fiecare cuvă;

Se pornește și calibrează spectrofotometrul, folosind blank-ul;

Se determina extincția la 595 nm;

Se compară extincția standardului cu cea a probelor și dacă este nevoie se recurge la efectuarea diluțiilor. Se calculează coeficientul de extincție și concentrația proteinelor din probe.

Pentru determinarea concentrației proteice a probei este utilizată formula:

6.1.2.4. Dozarea glicoproteinelor din plasmă

Pentru dozarea glicoproteinelor am folosit „Glycoprotein Carbohydrate Estimation Kit”, produs de Thermo Scientific Ltd., aceste conținând suficienți reactivi pentru a efectua 250 de teste pe microplăci sau 60 de teste în cuve. Acest kit reprezintă o metodă rapidă și simplă de detectare a glicoproteinelor și a conținutului de carbohidrați din probele de analizat.

Principiul metodei: oxidarea glicoproteinelor folosind meta periodatul de sodiu cu formare de aldehide ce vor reacționa specific cu reactivul de detectare a glicoproteinelor, conținut de kit. În urma reacției, amestecul devine mov. Analizat spectrofotometric, la lungimi de undă de 550 nm, extincția (absorbția) luminoasă este direct proporțională cu conținutul de carbohidrați din glicoproteine. Valorile obținute sunt comparate cu valori standard ale unor glicoproteine cunoscute. Proteinele fără grupări glicanice, cum ar fi lizozima sau albumina serică bovină, determină o absorbție scăzută a luminii.

Compoziția kit-ului:

– 500 mg meta periodat de sodiu;

– 500 mg reactiv de identificare a glicoproteinelor;

– 250 ml soluție tampon pentru glicoproteine, soluție 1 % azidă sodică;

– 2,5 mg lizozimă (control negativ); albumină serică bovină;

– 2,5 mg ovalbumină; 2,5 mg apotransferină umană; 0,25 mg fetuină; 0,25 mg acid α1-glicoproteic (control pozitiv).

Alte materiale necesare:

– NaOH 1N, folosit pentru dizolvarea reactivului de detectare a glicoproteinelor;

– Microplăci sau cuve, în funcție de metoda aleasă;

– Spectrofotometru capabil să măsoare la lungimi de undă de 550 nm.

Pregătirea materialelor:

– Toate produsele au fost aduse la temperatura camerei înainte de utilizare;

– Soluția de meta periodat de sodiu: se prepară înainte de utilizare; se adaugă 21,4 mg meta periodat de sodiu peste 10 ml de tampon (glycoprotein assay buffer), soluția finală având 10 mM;

– Reactivul de detectare a glicoproteinelor:se prepară înainte de utilizare; se prepară o soluție de 0,5% prin adăugarea a 50 mg reactiv în 10 ml NaOH 1N;

– Probele au fost diluate sau dizolvate (în funcție de starea în care se află) cu soluție tampon (GAB) până la o concentrație de 0,25 sau 2,5mg/ml;

– Probele standard de proteine: în timpul transportului probele de proteine liofilizate pot fi contaminate, fiind necesară verificarea fiolelor și prezența proteinelor la baza acestora. După îndepărtarea sigiliului se introduce 1 ml de soluție tampon pentru glicoproteine, se reatașează dopul și se agită ușor până la dizolvarea liofilizatului. Probele standard pot fi depozitate la maxim o lună la 4°C.

Tehnica de lucru:

– Se introduc câte 0,05 ml din fiecare probă cât și din probele standard în cuve. Pentru martor se folosesc 0,05 ml soluție tampon (Glycoprotein Assay Buffer). Fiecare probă se testează în duplicat.

– Se adaugă 0,05 ml de soluție de meta periodat sodic în fiecare cuvă.

– Se acoperă și se lasă la incubat la temperatura camerei timp de 10 minute.

– Se adaugă 0,30 ml de soluție de reactiv de detectare a glicoproteinelor în fiecare cuvă și se agită.

– Se acoperă și se lasă la incubat la temperatura camerei timp de o oră.

– Se realizează citirea spectrofotometrică la 550 nm.

Valorile spectrofotometrice obținute la lungimi de 500 nm pot fi folosite pentru a estima conținutul de carbohidrați din probe prin compararea cu valorile probelor standard. În tabelul 6.2 sunt prezentate valorile standard pentru testele realizate în cuve.

Tabel 6.2.

Valorile probelor de proteine standard cu conținut de carbohidrați

Table 6.2.

The values of standard protein samples containing carbohydrates

(www.pierce.com)

Pentru determinarea concentrației glicoproteinelor din probe este utilizată formula:

Determinarea procentului de glicoproteine din proteinele totale ale probei se realizează folosind formula:

6.1.2.5. Testarea interacțiunii glicoproteine-lectine (metoda Ouchterlony)

S-a realizat pe extracte tumorale, acestea fiind supuse interacțiunii cu diferite lectine, folosind tehnica imunochimocă a dublei difuzii în agaroză.

Prin metoda imunochimică de dublă difuziune, adaptată pentru sistemul de reactanți lectine-glicoproteidă am urmărit vizualizarea în gel a unei posibile interacțiuni între lectinele de diferite specificități de glucid și glicoproteidele solubile din extractul de țesut tumoral pe baza difuziei lor în gel și a proprietăților lectinelor de a precipita glicoconjugați.

Principiul metodei:

Este o metodă calitativă care permite analizarea sistemelor antigen-anticorp pe baza difuziei lor în gel de agaroză și a formării de precipitate imune evidențiate sub forma unor linii în zona întâlnirii în concentrații optime a frontului celor doi reactanți. Analiza formei și poziției liniilor de precipitate permite aprecierea numărului minim de sisteme antigen-anticorp puse în contact.

Reactivi

– extracte tumorale;

– PBS (pH = 7,2);

– Agaroză;

– Extracte lectinice.

Tehnica de lucru:

a). Prepararea gelului :1-1,5g de agaroză se introduc într-un balon Erlenmeyer și se adaugă 100 ml PBS. Se introduce vasul într-o baie de apă fierbinte până la dizolvarea completă a agarozei (cca. 30 de minute). Se adaugă apoi 1ml, dintr-o soluție 0,2% mertiolat de sodiu în PBS sau de azidă de sodiu 0,02% în PBS.

Gelul se toarnă pe păci de sticlă de bună calitate, perfect degresate prin spălare cu detergent și apă distilată. Volumul de gel turnat pe o placă trebuie asfel calculat încât să se obțină un strat de 2-3 mm grosime. După întărirea gelului (10-15 min.) sub placă se introduce un tipar de hartie și, cu ajutorul unui instrument se practică godeurile și șanțurile în care urmează să fie introduși reactanții.

Godeurile se umplu cu reactivii corespunzători, după care plăcile se introduc într-o cameră umedă, pentru realizarea difuziei, timp de 24 de ore, până la stabilizarea imaginii de difuziune.

b). Prelucrarea gelului după încheierea difuziei:

Spălarea plăcilor s-a făcut cu soluții care să îndepărteze cât mai complet substanțele nereacționate sau în exces, dar care să nu afecteze precipitarea. Sunt astfel eliminate toate componentele nespecifice aduse de extractul lectinic și de mediul de cultură. Spălarea se realizează cu soluție salină fiziologică, tamponată la pH = 8,0 fosfat 0,2 M care conține 0,02% mertiolat; această soluție, schimbată de trei ori pe zi, permite îndepărtarea substanțelor nereacțioanate în maxim 2 zile. Creșterea pH-ului soluției de spălare până la valoarea 9 (tampon carbonat 0,05% M) scurtează timpul de spălare, dar determină și dizolvarea unor linii de precipitare.

După spălare, plăcile se imersează în apă distilata pentru câteva ore, pentru îndepărtarea sărurilor.

Plăcile se așază pe o suprafață orizontală, se acoperă cu o hârtie de filtru umezită, se formează o „pompă aspiratoare” care scoate din gel, odată cu lichidul, și urmele de substanțe nedorite. Uscarea durează cca. 24 de ore. Pentru o uscare rapidă, placa acoperită cu hârtie de filtru, se poate introduce la termostat la 37°C.

Placa, bine uscată, este transparentă, filmul de agaroză este aderent, iar liniile de precipitare se observă ca niște contururi translucide.

Fixarea nu este necesară pentru plăcile obținute prin difuzia lectinei și a glicoconjugatului specific, deoarece cei doi reactanți se fixează reciproc prin reacția de precipitare.

Culoarea plăcilor urmărește evidențierea netă a liniilor de precipitare. Pentru proteine, coloranții folosiți pot fi: amidoschwartz 10B, azocarmin.

Colorantul se prepară din l g colorant, minimum 3 ore, apoi se îndepărtează colorantul, se spală plăcile cu o soluție de acid acetic 2% care conține 15% glicerol. Spălarea durează până când zonele care nu conțin proteine s-au decolorat complet (cca. 1 oră cu schimbări repetate ale soluției de spălare). Plăcile spălate se scurg și se usucă în poziție verticală la temperatura camerei.

c). Extracția: proteinele solubile au fost extrase prin omogenizarea probelor cu tampon fosfat salin, pH 7.2, în raportul 1:5. Timpul de extracție a fost de 3 ore, la 4°C și s-a folosit un omogenizator de tip A.

d). Precipitarea proteinelor cu sulfat de amoniu și centrifugarea: separarea proteinelor prin precipitare cu sulfat de amoniu, s-a realizat la concentrația de 70%. Precipitatele au fost separate prin centrifugare la 10000 rpm, la 4°C, 30 minute, folosindu-se o centrifugă cu răcire Sigma.

e). Dializa este o metodă de studiere a componentelor cantitative și calitative a precipiatelor proteice separate prin centrifugare și dizolvate în tamponul inițial, PBS, și supuse dializei față de același tampon.

6.1.2.6. Dozarea glicoproteinelor din extractele tumorale cu hexoze (reacția Seliwanoff)

Principiul metodei: în prezența rezorcinei, 1,3 difenolului și a acidului clorhidric, la cald, cetozele formează compuși colorați în roșu intens iar aldozele formează compuși de culoare roz.

Se lucrează cu extractul proteic parțial purificat prin precipitare cu sulfat de amoniu, după dializă.

Reactivi:

– extract proteic din tumori;

– reactiv Seliwanoff: soluție de rezorcină 0,5% în HCl 20%;

– acid clorhidric concentrat;

– soluție etalon fructoză + glucoză, 1:1, 100 mg/ml.

Tehnica de lucru:

– proba de cercetat conține: 200 µl extract proteic, 500 µl reactiv Seliwanoff și 50 µl acid clorhidric concentrat;

– proba etalon conține: 200 µl soluție etalon, 500 µl reactiv Seliwanoff și 50 µl acid clorhidric concentrat;

– proba martor conține: 200 µl apă distilată, 500 µl reactiv Seliwanoff și 50 µl acid clorhidric concentrat.

Toate eprubetele se încălzesc pe baie de apă la fierbere timp de 10 minute, se răcesc brusc sub jet de apă și se colorimetrază față de martor la 540 nm.

Calcul:

Cp (mg hexoze/ml extract proteic) = Ep–Em/Eet-Em x 100

6.1.2.7. Dozarea glicoproteinelor din extractele tumorale cu pentoze (reacția Bial)

Principiul metodei pentozele formează cu orcinolul (5- metilrezorcina), în mediu de acid clorhidric concentrat, la cald, compuși colorați în verde. În mediul de reacție, pentozele din glicoproteine sunt hidrolizate și eliberate.

Reactivi:

– reactiv Bial: orcinol 0,2% în acid sulfuric concentrat cu clorură ferică 0,3%;

– etalon fucoză, o metil-pentoză prezentă frecvent în structura glicopreteinelor;

– extracte proteice tumorale.

Tehnica de lucru:

– proba de cercetat conține: 200 µl extract proteic, 500 µl reactiv Bial;

– proba etalon conține: 200 µl soluție etalon, 500 µl reactiv Bial;

– proba martor conține: 200 µl apă distilată, 500 µl reactiv Bial.

Toate eprubetele se încălzesc pe baie de apă la fierbere timp de 10 minute, se răcesc brusc sub jet de apă și se colorimetrază față de martor la 540 nm.

Calcul:

Cp (mg pentoze/ml extract proteic) =Ep –Em/Eet-Em x 100

6.2. Rezultate și discuții

6.2.1. Dozarea proteinelor și a glicoproteinelor din extractele tumorale

6.2.1. Determination of proteins and glycoproteins in tumor extracts

Pentru dozarea proteinelor și a glicoproteinelor din extractele tumorale, s-au ales 10 tipuri de tumori reprezentative.

Pentru determinarea proteinelor din extractele tumorale s-a utilizat metoda Bradford, determinările realizându-se pe plasma extrasă din conținutul tumorilor. Extincția probelor a fost măsurată la lungimi de undă de 550 nm, în două etape, fiind necesară diluarea probelor, utilizând apă distilată iar concentrația proteinelor a fost calculată conform formulei prezentate în capitolul de materiale și metode.

Concentrația de proteine a variat de la 1,07 mg/ml în carcinomului de tip cribriform, 1,81 mg/ml în carcinom mamar tubulo-papilar și carcinom mamar, tipul complex, 3,08 mg/ml în carcinom mamar, tipul tubulo-papilar și carcinom mamar, 3,55 mg/ml în tumoră mamară cu frecvente vase sangvine ectaziate, 3,96 mg/ml în carcinom in situ, cu hiperplazie glandulară, 5,64 mg/ml în carcinom mamar, tipul tubulo-papilar, cu pleomorfism celular și nuclear moderat, 6,84 mg/ml în carcinom mamar tubulo-papilar și 9,59 mg/ml în osteosarcom mamar.

Rezultatele obținute sunt prezentate în tabelul 6.3.

Tabel 6.3.

Concentrația de proteine din extractele tumorale

Table 6.3.

The proteins concentration in tumor extracts

În figura 6.6. este reprezentată concentrația de proteine din extractele tumorale.

Fig. 6.6. Concentrația de proteine din extractele tumorale

Fig. 6.6. The proteins concentration in tumor extracts

Metodele alese pentru dozarea glicoproteinelor urmăresc pe de o parte concentrația hexozelor din glicoproteide și pe de altă parte concentrația pentozelor din structura acestora. Dintre hexoze, cele mai importante sunt galactoza, manoza și glucoza, atât simple cât și aminate și acetilate, iar dintre pentoze fucoza, o metilpentoză.

Așa după cum s-a menționat anterior, modul de obținere și prelucrare a extractelor exclude prezența unor glucide libere sau a unor glicolipide libere, dar nu și pe aceea a unor molecule mai complexe, glicolipoproteice.

Concentrația glicoproteinelor raportate la hexoze în cazul celor 10 tipuri de tumori investigate a variat foarte mult, de la 41 mg/ml în carcinomul de tip cribriform, 55 mg/ml în carcinomul mamar, tipul complex, 91 mg/ml în carcinomul mamar, 98 mg/ml în tumoră mamară cu frecvente vase sangvine ectaziate, 106 mg/ml în carcinomul mamar, tipul tubulo-papilar, 118 mg/ml în carcinomul mamar, tipul tubulo-papilar, cu pleomorfism celular și nuclear moderat, 140 mg/ml în carcinomul in situ, cu hiperplazie glandulară, 218 mg/ml în osteosarcomul mamar, 244 mg/ml în carcinomul mamar tubulo-papilar și 650 mg/ml la carcinomul mamar, tipul mixt.

Concentrația glicoproteinelor în raport cu hexoze/proteine în cazul celor 10 tipuri de tumori investigate a variat foarte mult, de la 22 mg/ml în osteosarcomul mamar, 29 mg/ml în carcinomul mamar, 30 mg/ml în carcinomul mamar, tipul complex, 34 mg/ml în carcinomul mamar, tipul tubulo-papilar, 35 mg/ml în carcinomul mamar, tipul tubulo-papilar, cu pleomorfism celular și nuclear moderat și în carcinomul mamar tubulo-papilar, 37 mg/ml în tumoră mamară cu frecvente vase sangvine ectaziate, 38 mg/ml în carcinomul de tip cribriform, 353 mg/ml în carcinomul in situ, cu hiperplazie glandulară și 361 mg/ml în carcinomul mamar, tipul mixt.

Rezultatele obținute sunt prezentate în tabelul 6.7.

Tabel 6.7.

Concentrația glicoproteinelor raportate la hexoze prezente în extractele tumorale

Tabel 6.7.

Glycoproteins (hexose) concentration present in tumor extracts

În figura 6.4. este reprezentată variația raportului hexoze/glicoproteine în extractele tumorale.

Fig. 6.4. Variația raportului hexoze/glicoproteine în extractele tumorale

Fig. 6.4. Variation report of hexose / glycoproteins in tumor extracts

În cazul glicoproteinelor raportate la pentoze, concentrația acestora a fost mai mică, comparativ cu hexozele, variind destul de mult, în cadrul celor 10 tipuri de tumori investigate: de la 9 mg/ml în carcinomul mamar, tipul complex, 11 mg/ml în carcinomul in situ, cu hiperplazie glandulară, 23 mg/ml în osteosarcomul mamar, 77 mg/ml în carcinomul mamar, 221 mg/ml în carcinomul de tip cribriform, 293 mg/ml în carcinomul mamar, tipul tubulo-papilar, 311 mg/ml în tumora mamară cu frecvente vase sangvine ectaziate, 397 mg/ml în carcinomul mamar, tipul tubulo-papilar, cu pleomorfism celular și nuclear moderat, 487 mg/ml în carcinomul mamar tubulo-papilar și 643 mg/ml în carcinomul mamar, tipul mixt.

Concentrația glicoproteinelor în raport cu pentoze/proteine în cazul celor 10 tipuri de tumori investigate a variat de la osteosarcomul mamar, 24 mg/ml în carcinomul mamar, 27 mg/ml în carcinomul in situ, cu hiperplazie glandulară, 49 mg/ml în carcinomul mamar, tipul complex, 71 mg/ml în carcinomul mamar tubulo-papilar, 74 mg/ml în carcinomul mamar, tipul tubulo-papilar, cu pleomorfism celular și nuclear moderat, 87 mg/ml în tumoră mamară cu frecvente vase sangvine ectaziate, 94 mg/ml în carcinomul mamar, tipul tubulo-papilar, 205 mg/ml în carcinomul de tip cribriform și 354 mg/ml în carcinomul mamar, tipul mixt.

Rezultatele obținute sunt prezentate în tabelul 6.8.

Tabel 6.8.

Concentrația glicoproteinelor raportate la pentoze prezente în extractele tumorale

Tabel 6.8.

Glycoproteins (pentose) concentration present in tumor extracts

Figura 6.5. reprezintă distribuția glicoproteinelor în extractele tumorale.

Fig. 6.5. Variația raportului pentoze/glicoproteine în extractele tumorale

Fig. 6.5. Variation report of pentose / glycoproteins in tumor extracts

Valorile comparative ale glicoproteinelor raportate la conținutul în pentoze și hexoze în cele 10 extracte tumorale sunt prezentate în tabelul 6.9.

Tabel 6.9.

Valorile comparative ale glicoproteinelor determinate în extractele tumorale

Table 6.9.

Comparative values of specific glycoproteins analyzed in tumor extracts

Din datele obținute se observă că tumora – carcinom mamar, tipul mixt, prezintă concentrația cea mai ridicată de glicoproteine, sub aspectul hexozelor și pentozelor.

Figura 6.6. reprezintă variația raportului pentoze/glicoproteine în extractele tumorale.

Fig. 6.6. Distribuția glicoproteinelor în extractele tumorale

Fig. 6.6. Distribution of glycoproteins in tumor extracts

Metodele colorimetrice sunt în general folosite pentru evaluarea pentozelor și hexozelor libere. Totuși, în condițiile de reacție, monoglucidele legate de proteinele din extractele tumorale sunt eliberate și reacția de culoare decurge la fel.

Aceast mod de abordare ne-a fost sugerat de Pramod S. N. și colab. (2006), care au folosit reacția Bial pentru monitorizarea prezenței lectinei din cartof. Spre deosebire de metoda citată, am folosit în compoziția etalonului și fucoză, o metilpentoză prezentă în structura a numeroase glicoproteine la mamifere. Este necesar să se precizeze că în cadrul structurilor oligoglucidice complexe ale glicoproteidelor coexistă atât hexoze cât și fucoză.

Cuantificarea simultană a pentozelor și hexozelor în glicoproteinele tumorale reprezintă un aspect de originalitate și, după cum se vede în diagramele prezentate anterior, distribuția acestor glucide și raportul în care se află în domeniile glucidice sunt diferite în funcție de tipul tumorii.

Astfel, dacă în glicoproteinele extrase din carcinomul mamar tubulo-papilar (6), osteosarcomul mamar (7) și carcinomul mamar (8), raportul între hexoze și pentoze, respectiv fucoză, este aproximativ egal, în celelalte extracte predomină, într-o măsură mai mare sau mai mică, fucoza. Excepție fac glicoproteinele din extractul – carcinom in situ, cu hiperplazie glandulară (4) unde hexozele reprezintă partea dominantă a domeniului glucidic.

Prezența unei cantități mari de pentoze în glicoprotenele tumorale poate fi asociată și cu particularitățile metabolice ale acestor celule. Spre deosebire de celulele normale, celulele tumorale, chiar și atunci când sunt aprovizionate cu suficient oxigen, preferă utilizarea glicolizei anaerobe pentru obținerea energiei. De aceea agresivitatea unor tipuri de cancer a fost asociată cu creșterea producției de acid lactic, mai ales în tumorile solide. Mai mult decât atât, datorită cererii crescute de riboză și ulterior deoxiriboză necesare pentru biosinteza crescută de acizi nucleici, necesari pentru supraviețuirea și proliferarea celulelor tumorale concomitent cu glicoliza anaerobă se desfășoară cu intensitate foarte ridicată și calea pentozofosfaților de degradare a glucozei.

Cercetări recente (Choi J. H. și colab., 2005) demonstrază, pe de o parte că stimulatorii sintezei enzimei transcetolaza, implicată în reglarea etapelor non-oxidative ale șuntului pentozofosfaților, determină o intensificare a proliferării tumorale și o rezistență crescută a acestora față de tratamentele chemoterapeutice, iar inhibitorii acestei enzime au o acțiune opusă, suprimând creștera tumorilor și metastaza.

Rezultatele obținute de noi pot fi explicate și printr-o posibilă stocare a pentozelor sub formă de glicoproteine, mai ales în cazurile în care raportul pentoze/glicoproteine este semnificativ crescut, extractele: carcinom mamar, tipul tubulo-papilar, cu pleomorfism celular și nuclear moderat (1) și carcinom mamar tubulo-papilar (6).

Concentrația crescută a hexozelor nu este caracteristică unui anumit tip de tumoră (malignă sau benignă), însă concentrația crescută a pentozelor este caracteristică tumorilor maligne.

6.2.2. Dozarea proteinelor și a glicoproteinelor din plasmă

6.2.2. Determination of proteins and glycoproteins in plasma

Dozarea proteinelor s-a realizat prin metoda Bradford, utilizându-se plasmă obținută prin centrifugare înaltă a sângelui recoltat pe anticoagulant (Li-heparină). Extincția probelor a fost măsurată la lungimi de undă de 595 nm, iar concentrația proteinelor a fost calculată conform formulei prezentate în capitolul de materiale și metode.

Concentrația proteinelor a variat de la 4,74 g/dl la 5,06 g/dl în probele de plasmă analizate de la 7 cățele diagnosticate cu tumori mamare și de la 4,87 g/dl la 5,06 g/dl la pisici.

Valorile proteinemiei se încadrează în limite normale pentru toate cazurile analizate.

Rezultatele obținute sunt prezentate în tabelul 6.10.

Tabel 6.10.

Concentrația proteinelor din plasmă

Table 6.10.

The proteins concentration in plasma

Figura 6.7. reprezintă concentrația proteinelor din plasmă.

Fig. 6.7. Concentrația proteinelor din plasmă

Fig. 6.7. The proteins concentration in plasma

Pentru determinarea glicoproteinelor din plasmă s-a utilizat „Glycoprotein Carbohydrate Estimation Kit”, produs de Thermo Scientific Ltd., utilizându-se plasmă obținută prin centrifugare înaltă a sângelui recoltat pe anticoagulant (Li-heparină). Extincția probelor a fost măsurată la lungimi de undă de 550 nm, în două etape, fiind necesară diluarea probelor, utilizând apă distilată iar concentrația proteinelor a fost calculată conform formulei prezentate în capitolul de materiale și metode.

Concentrația glicoproteinelor din plasmă a variat de la 1,4 mg/dl (0,14 g/dl) la 2,4 mg/dl (0,24 g/dl) la cățea și de la 1,6 mg/dl (0,16 g/dl) la 2,1 mg/dl (0,21 g/dl) la pisică, observându-se o pondere mică a glicoproteinelor în compoziția plasmei sangvine.

Rezultatele obținute sunt prezentate în tabelul 6.11.

Tabel 6.11

Concentrația glicoproteinelor din plasmă

Table 6.11

The glycoproteins concentration in plasma

Figura 6.8. reprezintă concentrația glicoproteinelor din plasmă.

Fig. 6.8. Concentrația glicoproteinelor din plasmă

Fig. 6.8. The glycoproteins concentration in plasma

Procentul de glicoproteine raportat la proteinele totale a fost calculat conform formulei prezentate în capitolul de materiale și metode. Gradul de glicozilare a proteinelor plasmatice a variat de la 2,9 până la 5% în probele recoltate de la cățele și de la 3,3 la 4,1% în cele recoltate de la pisici.

Rezultatele obținute sunt evidențiate în tabelul 6.12.

Tabel 6.12.

Concentrația glicoproteinelor serice raportate la proteinele totale

Table 6.12.

The glycoproteins concentration related with total serum protein

Figura 6.9. reprezintă concentrația glicoproteinelor serice raportate la proteinele totale.

Fig. 6.9. Concentrația glicoproteinelor serice raportate la proteinele totale

Fig. 6.9. The glycoproteins concentration related with total serum protein

6.2.3. Dozarea unor parametri biochimici în sânge la femelele diagnosticate cu tumori mamare

6.2.3. Determination of biochemical parameters in blood in femels diagnosed with mammary tumors

Determinarea parametrilor biochimici (creatinina, ureea, glicemia, fosfataza alcalină și GPT) s-a realizat la 10 cazuri. În urma determinărilor, s-a constatat că parametrii biochimici s-au încadrat în limite normale.

Creatinina a variat de la 0,7 la 1,2 mg/dl la cățea și de la 1,2 la 1,5 mg/dl la pisică. Ureea a prezentat valori de la 6,9 la 9,3 cg/dl la cățea și de la 2,5 la 2,8 cg/dl la pisică. Fosfataza alcalină a prezentat valori de la 15,8 la 21,7 U/dl la cățea și de la 2,4 la 2,5 U/dl la pisică. Glicemia a furnizat valori care au variat de la 7,2 la 13,1 cg/dl la cățea și de la 8,9 la 11,7 cg/dl la pisică. GPT a prezentat valori ce au variat de la 1 la 4,7 U/dl la cățea și de la 1,1 la 2,8 U/dl la pisică.

Rezultatele examenului biochimic sunt prezentate în tabelul 6.13.

Tabel 6.13.

Valorile parametrilor biochimici din seruri recoltate de la femele cu tumori mamare

Table 6.13.

Values of serum biochemical parameters collected from females with mammary tumors

Figura 6.10. reprezintă valorile parametrilor biochimici din seruri recoltate de la femele cu tumori mamare.

Fig. 6.10. Valorile parametrilor biochimici din seruri recoltate

de la femele cu tumori mamare

Fig. 6.10. Values of serum biochemical parameters collected

from females with mammary tumors

6.2.4. Rezultate privind investigarea electroforetică a proteinelor și glicoproteinelor serice

6.2.4. Results regarding the electrophoretic investigations of serum proteins and glycoproteins

Proteinele plasmatice reprezintă constituentul principal al plasmei sangvine (aproximativ 75% din reziduul uscat al acesteia).

În plasma sangvină sunt prezente peste 100 de fracțiuni proteice de proveniență diferită și cu funcții diferite, în principal acestea sunt biosintetizate de ficat, sistemul reticuloendotelial, alte țesuturi, precum și țesuturile tumorale.

Glicoproteinele sunt macromolecule ubicvitare cu numeroase roluri în organism. Glicoproteinele din plasmă sunt reprezentate de hormoni, glicoproteine carrier, structuri moleculare cu rol în adeziune sau imunologic, multe dintre imunoglobuline fiind reprezentate de un astfel de glican.

În tabelul 6.14. sunt prezentate electroforezele pentru 6 probe recoltate de la femele diagnosticate cu tumori mamare, fiind realizate colorații atât pentru proteine, folosind colorantul Coomassie Blue, cât și pentru glicoproteine, folosind kit-ul de colorare pentru glicoproteine Pierce. În tabel sunt prezentate și observații despre migrarea fracțiunilor proteice, respectiv glicoproteice.

Tabel 6.14.

Rezultatele electroforezei în gel de poliacrilamidă

Table 6.14.

The results of polyacrylamide gel electrophoresis

Din profilul electroforetic s-a observat că la toate probele recoltate de la pisici, fracțiunile glicoproteice evidențiate sunt mai numeroase și mai evidente decât la probele recoltate de la cățele.

Comparativ cu distribuția electroforetică a proteinelor, la toate cazurile, numărul fracțiunilor proteice migrate este mult mai mare decât numărul fracțiunilor glicoproteice migrate.

Distribuția electroforetică a glicoproteinelor este diferită în funcție de specie și în cadrul aceluiași tip de tumoră, astfel: în cazul glicoproteinelor plasmatice în proba recoltatăde la pisica cu tumoră mamară se observă 5 benzi glicoproteice distincte, spre deosebire de probele provenite de la cățelele cu tumori mamare, unde glicoproteinele plasmatice se distribuie în 3 fracțiuni glicoproteice majore și prezintă un profil electroforetic asemănător în toate probele analizate

Prezența mai multor fracțiuni glicoproteice la proba de pisică poate fi determinată și de statusul hormonal, aceasta fiind gestantă.

6.3. CONCLUZII PARȚIALE

6.3. PARTIAL CONCLUSIONS

1. Concentrația proteinelor în extractele tumorale a variat în funcție de tipul tumoral, obținându-se valori de la 1,07 mg/ml la 9,59 mg/ml.

2. Concentrația glicoproteinelor raportate la hexoze și pentoze a variat în cele 10 tipuri de tumori, astfel: de la 41 mg/ml la 650 mg/ml în cazul hexozelor și de la 9 mg/ml la 643 mg/ml pentru pentoze.

3. Concentrația proteinelor plasmatice a variat de la 4,74 g/dl la 5,06 g/dl la cățele și de la 4,87 g/dl la 5,06 g/dl la pisici, încadrându-se în limitele normale speciei.

4. Concentrația glicoproteinelor plasmatice a variat de la 1,4 mg/dl (0,14 g/dl) la 2,4 mg/dl (0,24 g/dl) la cățele și de la 1,6 mg/dl (0,16 g/dl) la 2,1 mg/dl (0,21 g/dl) la pisici.

5. Gradul de glicozilare a proteinelor plasmatice a variat de la 2,9 la 5% la cățele și de la 3,3 la 4,1% la pisici.

6. Constantele serice analizate (creatinina, ureea, fosfataza alcalină, glicemia și GPT), s-au încadrat în limitele normale speciei.

7. Distribuția electroforetică a glicoproteinelor este diferită în funcție de specie, tipul de tumoră, uneori diferențiindu-se și în cadrul aceluiași tip de tumoră.

8. Rezultatele obținute sugerează faptul că glicoproteinele plasmatice investigate atât cantitativ cât și electroforetic, pot constitui markeri serici care să orienteze clinicianul către investigarea unei anumite maladii. Totuși înainte de a se introduce aceste analize în practica curentă, este necesară investigarea unui număr mult mai mare de cazuri.

CONCLUZII

Numărul de cazuri cu tumori unice este la cățelele castrate de 42 cazuri – 47,73% din totalul de 88 cazuri, iar la cele necastrate de 55 cazuri – 41,67% din totalul de 132, ceea ce ne arată că există diferențe semnificative din punct de vedere al situației reproductive (starea fiziologică a glandei mamare). Numărul de cazuri cu tumori unice este la pisici castrate de 40 cazuri – 44,95% din totalul de 89 cazuri, iar la cele necastrate de 29 cazuri – 43,28% din totalul de 67, ceea ce ne arată că nu există diferențe semnificative din punct de vedere al situației reproductive.

În ceea ce privește tunorile multiple, avem 19 cazuri – 21,59% din totalul de 88 cazuri la cățelele castrate, iar la cele necastrate de 37 cazuri – 28,03% din totalul de 132, ceea ce ne arată că există diferențe semnificative din punct de vedere al situației reproductive. Numărul de cazuri cu tumori multiple la pisicile castrate este de 22 cazuri – 24,72% din totalul de 89 cazuri, iar la cele necastrate de 21 cazuri – 31,34% din totalul de 67, ceea ce ne arată că există diferențe semnificative din punct de vedere al situației reproductive.

Tumora unică și primară, l-a întâlnit la 19 cazuri – 21,59% din totalul de 88 cazuri la cățelele castrate, iar la cele necastrate de 25 cazuri – 18,94% din totalul de 132, ceea ce ne arată că există diferențe semnificative din punct de vedere al situației reproductive. Tumora unică și primară s-a întâlnit la pisicile castrate la 14 cazuri – 15,73% din totalul de 89 cazuri, iar la cele necastrate de 8 cazuri – 11,94% din totalul de 67, ceea ce ne arată că există diferențe semnificative din punct de vedere al situației reproductive.

Ca localizare la nivelul mamelei s-a constatat că la cățelele castrate cel mai mare număr de cazuri este la M5, 22 cazuri – 27,27%, iar la cele necastrate, tot la M5, 24 cazuri – 18,18%, ceea ce arată că există diferențe semnificative la cele două categorii de femele. La nivelul mamelei M5, avem 5 cazuri – 5,62% la pisicile castrate, iar la pisicile necastrate 3 cazuri – 4,48%, ceea ce ne arată că există diferențe nesemnificative.

Localiazarea tumorii la mamela M4 – vecină cu M5 s-a întâlnit la 12 cazuri – 13,64% în cazul cățelelor castrate și la 18 cazuri – 13,64% în cazul cățelelor necastrate, ceea ce ne face să ne gândim că procesul tumoral se extinde prin contiguitate de la țesutul bolnav la cel sănătos imediat învecinat.

O diferență semnificativă s-a constatat la localizarea M4-M5, astfel că dacă la cele castrate este doar un caz – 1,14% din cele 88, la cățelele necastrate din 132 cazuri, există 12 cazuri – 9,09%, ceea ce ne arată că procesul tumoral se extinde mai ușor la mamelele vecine ale femelelor necastrate. La pisici nu există diferențe mari la localizarea M4-M5 între cele două categorii, din totalul de 89 pisici castrate, 2 cazuri – 2,25%, iar din totalul de 67 pisici necstrate, 2 cazuri – 2,99%.

Localizarea tumorii la M1-M5 s-a întâlnit numai la cățelele necastrate, 11 cazuri – 8,33%.

Frecvența cea mai mare a tumorilor mamare la cățele apare la tranșa de vârstă 10 – 12 ani la cele castrate, 36 cazuri – 40,91%, iar la cele necastrate 42 cazuri – 31,82%. Frecvența cea mai mare a tumorilor mamare la pisici apare la aceeași tranșă de vârstă, 10 – 12 ani, la cele castrate, 21 cazuri – 23,60%, iar la cele necastrate 28 cazuri – 41,79%.

La vârsta de 2 ani, frecvența tumorilor mamare, atât la cățele cât și la pisici este cea mai mică, 1 caz – 1,14% la cățelele castrate și nici un caz la cele necastrate, iar la pisici 1 caz – 1,12% la pisicile castrate și 2 cazuri – 2,99% la cele necastrate.

În funcție de rasă, cel mai mare număr de tumori mamare s-a întâlnit la Metis cu 48 cazuri – 21,82%, Cocker cu 36 cazuri – 16,36%, urmată de Caniche cu 27 cazuri – 12,27%. La pisică, cel mai mare număr de tumori mamare s-a întâlnit la rasele europene, 108 cazuri (69,23%), urmat de rasa Birmaneză, 35 cazuri (22,44%).

Carcinomul mamar de tipul tubulo-papilar, la cățea s-a caracterizat histologic, prin prezența unui pleomorfism celular și nuclear moderat. Celulele epiteliale tumorale sunt dispuse pe tije fine fibro-vasculare, ce proemină sub forma unor papile în lumenul tubular. Acesta a fost întâlnit în procent de 6,06% la cățele necastrate, de 4,54% la cățele castrate. La pisică acest tip de carcinom a prezentat următoarele caracteristici histologice: celulele epiteliale sunt dispuse intraluminal, sub forma unor proliferari papilare, ce delimitează central o zonă anhistă cu detritus celular. Acesta a fost întâlnit în procent de 8,95% la pisicile necastrate, de 11, 23% la pisicile castrate.

Carcinom mamar, tipul cribriform, la cățea s-a caracterizat histologic, prin prezența de celule epiteliale maligne, dispuse în structuri tubulo-papilare ce formează frecvent lumene secundare cu aspectul "ochiurilor de sită". Aceste structuri delimitează central o zonă anhistă de necroză, slab-bazofilă, formată din celule inflamatorii, celule epiteliale degenerate și detritus celular. Stroma vasculo-conjunctiva moderat reprezentata. Acesta a fost întâlnit în procent de 3,03% la cățele necastrate, de 2,27% la cățele castrate. La pisică acest tip de carcinom a prezentat următoarele caracteristici histologice: celule de tip epitelial, asezate sub formӑ tubularӑ și acinarӑ, dilatate, in care se proiectează papile mici, formate din celule epiteliale cilindrice/columnare, cu nucleu rotund-ovalar, perpendicular pe membrana bazala, hipercrom, citoplasma slab eozinofila, in cantitate mica. Acesta a fost întâlnit în procent de 2,27% la pisicile necastrate, de 4,54% la pisicile castrate.

Carcinomul mamar de tip lobular, la cățea s-a caracterizat histologic, prin hiperplazie lobulară mamară (adenoză), fără elemente de malignitate; hiperplazie lobulară mamară cu slabă activitate secretorie, ectazie ductala cu produs proteic palid-bazofil, omogen și celule epiteliale degenerate intraluminal; hiperplazie lobulară mamară. Acesta a fost întâlnit în procent de 1,51% la cățele necastrate, de 2,27% la cățele castrate. La pisică acest tip de carcinom a prezentat următoarele caracteristici histologice: celulele epiteliale proliferate, așezate într-un singur strat pe o tijă fină vasculo-conjunctivă ce proemină intraluminal sub forma unor papile. Stroma bine reprezentată, frecvente vase sangvine ectaziate. Acesta a fost întâlnit în procent de 1,49% la pisicile necastrate, de 1,12% la pisicile castrate.

Carcinomul mamar de tip mixt, la cățea s-a caracterizat histologic, prin celule epiteliale tumorale, dispuse sub forma unor structuri tubulare, nucleu de proliferare a celulelor mioepiteliale, cu pleomorfism minim, întâlnit în procent de 1,51% doar la cățelele necastrate.

Carcinomul mamar la cățea s-a caracterizat histologic, prin multiple structuri papilare formate din celule epiteliale maligne dispuse pe o tijă conjunctiva fina ce proemina intraluminal; celule epiteliale maligne cu tendință de invazie stromală. Celulele tumorale prezintă anizocitoză și anizocarioză evidente, nucleoli proeminenți, rare mitoze atipice. Acesta a fost întâlnit în procent de 0,76% la cățele necastrate, de 2,27% la cățele castrate. La pisică a fost întâlnit în procent de 10,12% la pisicile necastrate și de 7,46% la pisicile castrate.

Osteosarcomul mamar la cățea s-a caracterizat histologic, prin nuclee de țesut osos, osteoblaste cu anizocitoză moderată; țesut glandular transformat chistic; teritoriu de țesut osos din structura tumorii, lacune osoase cu măduvă hematoformatoare; prezența megacariocitelor. Acesta a fost întâlnit în procent de 0,76% doar la cățele necastrate.

Carcinomul mamar la cățea s-a caracterizat histologic, prin proliferare tumorală malignă alcӑtuitӑ din celule de tip epitelial asezate sub formӑ tubularӑ, focal lumenul fiind obturat în totalitate, datoritӑ proliferӑrii excesive a celulelor epiteliale, care depășesc membarana bazală. Acesta a fost întâlnit în procent de 8,34% la cățele necastrate, de 6,82% la cățele castrate. La pisică a fost întâlnit în procent de 11,94% la pisicile necastrate și de 17,99% la pisicile castrate.

Adenocarcinomul mamar, la cățea a fost întâlnit în procent de 4,45% la cățele necastrate și în procent de 2,27% la cățele castrate. La pisică a fost întâlnit în procent de 1,49% la pisicile necastrate și de 1,12% la pisicile castrate. De asemenea la cățelele necastrate, adenocarcinomul de diferite tipuri a fost întâlnit doar la cățele necastrate, în procent de 3,03%, iar la pisicile necastrate a fost întâlnit în procent de 5,97% și la pisicile castrate în procent de 13,48%.

Adenoza de diferite tipuri a fost întâlnit în procent de 9,85% la cățele necastrate și în procent de 17,04% la cățele castrate, iar la pisicile necastrate a fost întâlnit în procent de 11,94% și la pisicile castrate în procent de 11,24%.

Carcinomul complex a fost întâlnit în procent de 23,48% la cățele necastrate și în procent de 27,27% la cățele castrate. La pisică a fost întâlnit în procent de 1,49% la pisicile necastrate și de 1,12% la pisicile castrate.

Carcinoamele de diferite tipuri a fost întâlnit în procent de 8,34% la cățele necastrate și în procent de 10,22% la cățele castrate, iar la pisicile necastrate a fost întâlnit în procent de 11,94% și la pisicile castrate în procent de 12,36%.

Carcinom/adenocarcinomul mamar a fost întâlnit în procent de 6,06% la cățele necastrate și în procent de 1,14% la cățele castrate, iar la pisicile necastrate a fost întâlnit în procent de 5,97% și la pisicile castrate în procent de 3,38%.

23). Mastoza fibro-chistică, hiperplazia ductală, ectazia ductală a fost întâlnit în procent de 11,36% la cățele necastrate și în procent de 9,09% la cățele castrate, iar la pisicile necastrate a fost întâlnit în procent de 2,99% și la pisicile castrate în procent de 4,50%.

Concentrația proteinelor în extractele tumorale a variat în funcție de tipul tumoral, obținându-se valori de la 1,07 mg/ml la 9,59 mg/ml.

Concentrația glicoproteinelor raportate la hexoze și pentoze a variat în cele 10 tipuri de tumori, astfel: de la 41 mg/ml la 650 mg/ml în cazul hexozelor și de la 9 mg/ml la 643 mg/ml pentru pentoze.

Concentrația proteinelor plasmatice a variat de la 4,74 g/dl la 5,06 g/dl la cățele și de la 4,87 g/dl la 5,06 g/dl la pisici, încadrându-se în limitele normale speciei.

Concentrația glicoproteinelor plasmatice a variat de la 1,4 mg/dl (0,14 g/dl) la 2,4 mg/dl (0,24 g/dl) la cățele și de la 1,6 mg/dl (0,16 g/dl) la 2,1 mg/dl (0,21 g/dl) la pisici.

Gradul de glicozilare a proteinelor plasmatice a variat de la 2,9 la 5% la cățele și de la 3,3 la 4,1% la pisici.

Constantele serice analizate (creatinina, ureea, fosfataza alcalină, glicemia și GPT), s-au încadrat în limitele normale speciei.

Distribuția electroforetică a glicoproteinelor este diferită în funcție de specie, tipul de tumoră, uneori diferențiindu-se și în cadrul aceluiași tip de tumoră.

Rezultatele obținute sugerează faptul că glicoproteinele plasmatice investigate atât cantitativ cât și electroforetic, pot constitui markeri serici care să orienteze clinicianul către investigarea unei anumite maladii. Totuși înainte de a se introduce aceste analize în practica curentă, este necesară investigarea unui număr mult mai mare de cazuri.

CONCLUSIONS

Numărul de cazuri cu tumori unice este la cățelele castrate de 42 cazuri – 47,73% din totalul de 88 cazuri, iar la cele necastrate de 55 cazuri – 41,67% din totalul de 132, ceea ce ne arată că există diferențe semnificative din punct de vedere al situației reproductive (starea fiziologică a glandei mamare). Numărul de cazuri cu tumori unice este la pisici castrate de 40 cazuri – 44,95% din totalul de 89 cazuri, iar la cele necastrate de 29 cazuri – 43,28% din totalul de 67, ceea ce ne arată că nu există diferențe semnificative din punct de vedere al situației reproductive.

În ceea ce privește tunorile multiple, avem 19 cazuri – 21,59% din totalul de 88 cazuri la cățelele castrate, iar la cele necastrate de 37 cazuri – 28,03% din totalul de 132, ceea ce ne arată că există diferențe semnificative din punct de vedere al situației reproductive. Numărul de cazuri cu tumori multiple la pisicile castrate este de 22 cazuri – 24,72% din totalul de 89 cazuri, iar la cele necastrate de 21 cazuri – 31,34% din totalul de 67, ceea ce ne arată că există diferențe semnificative din punct de vedere al situației reproductive.

Tumora unică și primară, l-a întâlnit la 19 cazuri – 21,59% din totalul de 88 cazuri la cățelele castrate, iar la cele necastrate de 25 cazuri – 18,94% din totalul de 132, ceea ce ne arată că există diferențe semnificative din punct de vedere al situației reproductive. Tumora unică și primară s-a întâlnit la pisicile castrate la 14 cazuri – 15,73% din totalul de 89 cazuri, iar la cele necastrate de 8 cazuri – 11,94% din totalul de 67, ceea ce ne arată că există diferențe semnificative din punct de vedere al situației reproductive.

Ca localizare la nivelul mamelei s-a constatat că la cățelele castrate cel mai mare număr de cazuri este la M5, 22 cazuri – 27,27%, iar la cele necastrate, tot la M5, 24 cazuri – 18,18%, ceea ce arată că există diferențe semnificative la cele două categorii de femele. La nivelul mamelei M5, avem 5 cazuri – 5,62% la pisicile castrate, iar la pisicile necastrate 3 cazuri – 4,48%, ceea ce ne arată că există diferențe nesemnificative.

Localiazarea tumorii la mamela M4 – vecină cu M5 s-a întâlnit la 12 cazuri – 13,64% în cazul cățelelor castrate și la 18 cazuri – 13,64% în cazul cățelelor necastrate, ceea ce ne face să ne gândim că procesul tumoral se extinde prin contiguitate de la țesutul bolnav la cel sănătos imediat învecinat.

O diferență semnificativă s-a constatat la localizarea M4-M5, astfel că dacă la cele castrate este doar un caz – 1,14% din cele 88, la cățelele necastrate din 132 cazuri, există 12 cazuri – 9,09%, ceea ce ne arată că procesul tumoral se extinde mai ușor la mamelele vecine ale femelelor necastrate. La pisici nu există diferențe mari la localizarea M4-M5 între cele două categorii, din totalul de 89 pisici castrate, 2 cazuri – 2,25%, iar din totalul de 67 pisici necstrate, 2 cazuri – 2,99%.

Localizarea tumorii la M1-M5 s-a întâlnit numai la cățelele necastrate, 11 cazuri – 8,33%.

Frecvența cea mai mare a tumorilor mamare la cățele apare la tranșa de vârstă 10 – 12 ani la cele castrate, 36 cazuri – 40,91%, iar la cele necastrate 42 cazuri – 31,82%. Frecvența cea mai mare a tumorilor mamare la pisici apare la aceeași tranșă de vârstă, 10 – 12 ani, la cele castrate, 21 cazuri – 23,60%, iar la cele necastrate 28 cazuri – 41,79%.

La vârsta de 2 ani, frecvența tumorilor mamare, atât la cățele cât și la pisici este cea mai mică, 1 caz – 1,14% la cățelele castrate și nici un caz la cele necastrate, iar la pisici 1 caz – 1,12% la pisicile castrate și 2 cazuri – 2,99% la cele necastrate.

În funcție de rasă, cel mai mare număr de tumori mamare s-a întâlnit la Metis cu 48 cazuri – 21,82%, Cocker cu 36 cazuri – 16,36%, urmată de Caniche cu 27 cazuri – 12,27%. La pisică, cel mai mare număr de tumori mamare s-a întâlnit la rasele europene, 108 cazuri (69,23%), urmat de rasa Birmaneză, 35 cazuri (22,44%).

Carcinomul mamar de tipul tubulo-papilar, la cățea s-a caracterizat histologic, prin prezența unui pleomorfism celular și nuclear moderat. Celulele epiteliale tumorale sunt dispuse pe tije fine fibro-vasculare, ce proemină sub forma unor papile în lumenul tubular. Acesta a fost întâlnit în procent de 6,06% la cățele necastrate, de 4,54% la cățele castrate. La pisică acest tip de carcinom a prezentat următoarele caracteristici histologice: celulele epiteliale sunt dispuse intraluminal, sub forma unor proliferari papilare, ce delimitează central o zonă anhistă cu detritus celular. Acesta a fost întâlnit în procent de 8,95% la pisicile necastrate, de 11, 23% la pisicile castrate.

Carcinom mamar, tipul cribriform, la cățea s-a caracterizat histologic, prin prezența de celule epiteliale maligne, dispuse în structuri tubulo-papilare ce formează frecvent lumene secundare cu aspectul "ochiurilor de sită". Aceste structuri delimitează central o zonă anhistă de necroză, slab-bazofilă, formată din celule inflamatorii, celule epiteliale degenerate și detritus celular. Stroma vasculo-conjunctiva moderat reprezentata. Acesta a fost întâlnit în procent de 3,03% la cățele necastrate, de 2,27% la cățele castrate. La pisică acest tip de carcinom a prezentat următoarele caracteristici histologice: celule de tip epitelial, asezate sub formӑ tubularӑ și acinarӑ, dilatate, in care se proiectează papile mici, formate din celule epiteliale cilindrice/columnare, cu nucleu rotund-ovalar, perpendicular pe membrana bazala, hipercrom, citoplasma slab eozinofila, in cantitate mica. Acesta a fost întâlnit în procent de 2,27% la pisicile necastrate, de 4,54% la pisicile castrate.

Carcinomul mamar de tip lobular, la cățea s-a caracterizat histologic, prin hiperplazie lobulară mamară (adenoză), fără elemente de malignitate; hiperplazie lobulară mamară cu slabă activitate secretorie, ectazie ductala cu produs proteic palid-bazofil, omogen și celule epiteliale degenerate intraluminal; hiperplazie lobulară mamară. Acesta a fost întâlnit în procent de 1,51% la cățele necastrate, de 2,27% la cățele castrate. La pisică acest tip de carcinom a prezentat următoarele caracteristici histologice: celulele epiteliale proliferate, așezate într-un singur strat pe o tijă fină vasculo-conjunctivă ce proemină intraluminal sub forma unor papile. Stroma bine reprezentată, frecvente vase sangvine ectaziate. Acesta a fost întâlnit în procent de 1,49% la pisicile necastrate, de 1,12% la pisicile castrate.

Carcinomul mamar de tip mixt, la cățea s-a caracterizat histologic, prin celule epiteliale tumorale, dispuse sub forma unor structuri tubulare, nucleu de proliferare a celulelor mioepiteliale, cu pleomorfism minim, întâlnit în procent de 1,51% doar la cățelele necastrate.

Carcinomul mamar la cățea s-a caracterizat histologic, prin multiple structuri papilare formate din celule epiteliale maligne dispuse pe o tijă conjunctiva fina ce proemina intraluminal; celule epiteliale maligne cu tendință de invazie stromală. Celulele tumorale prezintă anizocitoză și anizocarioză evidente, nucleoli proeminenți, rare mitoze atipice. Acesta a fost întâlnit în procent de 0,76% la cățele necastrate, de 2,27% la cățele castrate. La pisică a fost întâlnit în procent de 10,12% la pisicile necastrate și de 7,46% la pisicile castrate.

Osteosarcomul mamar la cățea s-a caracterizat histologic, prin nuclee de țesut osos, osteoblaste cu anizocitoză moderată; țesut glandular transformat chistic; teritoriu de țesut osos din structura tumorii, lacune osoase cu măduvă hematoformatoare; prezența megacariocitelor. Acesta a fost întâlnit în procent de 0,76% doar la cățele necastrate.

Carcinomul mamar la cățea s-a caracterizat histologic, prin proliferare tumorală malignă alcӑtuitӑ din celule de tip epitelial asezate sub formӑ tubularӑ, focal lumenul fiind obturat în totalitate, datoritӑ proliferӑrii excesive a celulelor epiteliale, care depășesc membarana bazală. Acesta a fost întâlnit în procent de 8,34% la cățele necastrate, de 6,82% la cățele castrate. La pisică a fost întâlnit în procent de 11,94% la pisicile necastrate și de 17,99% la pisicile castrate.

Adenocarcinomul mamar, la cățea a fost întâlnit în procent de 4,45% la cățele necastrate și în procent de 2,27% la cățele castrate. La pisică a fost întâlnit în procent de 1,49% la pisicile necastrate și de 1,12% la pisicile castrate. De asemenea la cățelele necastrate, adenocarcinomul de diferite tipuri a fost întâlnit doar la cățele necastrate, în procent de 3,03%, iar la pisicile necastrate a fost întâlnit în procent de 5,97% și la pisicile castrate în procent de 13,48%.

Adenoza de diferite tipuri a fost întâlnit în procent de 9,85% la cățele necastrate și în procent de 17,04% la cățele castrate, iar la pisicile necastrate a fost întâlnit în procent de 11,94% și la pisicile castrate în procent de 11,24%.

Carcinomul complex a fost întâlnit în procent de 23,48% la cățele necastrate și în procent de 27,27% la cățele castrate. La pisică a fost întâlnit în procent de 1,49% la pisicile necastrate și de 1,12% la pisicile castrate.

Carcinoamele de diferite tipuri a fost întâlnit în procent de 8,34% la cățele necastrate și în procent de 10,22% la cățele castrate, iar la pisicile necastrate a fost întâlnit în procent de 11,94% și la pisicile castrate în procent de 12,36%.

Carcinom/adenocarcinomul mamar a fost întâlnit în procent de 6,06% la cățele necastrate și în procent de 1,14% la cățele castrate, iar la pisicile necastrate a fost întâlnit în procent de 5,97% și la pisicile castrate în procent de 3,38%.

23). Mastoza fibro-chistică, hiperplazia ductală, ectazia ductală a fost întâlnit în procent de 11,36% la cățele necastrate și în procent de 9,09% la cățele castrate, iar la pisicile necastrate a fost întâlnit în procent de 2,99% și la pisicile castrate în procent de 4,50%.

Concentrația proteinelor în extractele tumorale a variat în funcție de tipul tumoral, obținându-se valori de la 1,07 mg/ml la 9,59 mg/ml.

Concentrația glicoproteinelor raportate la hexoze și pentoze a variat în cele 10 tipuri de tumori, astfel: de la 41 mg/ml la 650 mg/ml în cazul hexozelor și de la 9 mg/ml la 643 mg/ml pentru pentoze.

Concentrația proteinelor plasmatice a variat de la 4,74 g/dl la 5,06 g/dl la cățele și de la 4,87 g/dl la 5,06 g/dl la pisici, încadrându-se în limitele normale speciei.

Concentrația glicoproteinelor plasmatice a variat de la 1,4 mg/dl (0,14 g/dl) la 2,4 mg/dl (0,24 g/dl) la cățele și de la 1,6 mg/dl (0,16 g/dl) la 2,1 mg/dl (0,21 g/dl) la pisici.

Gradul de glicozilare a proteinelor plasmatice a variat de la 2,9 la 5% la cățele și de la 3,3 la 4,1% la pisici.

Constantele serice analizate (creatinina, ureea, fosfataza alcalină, glicemia și GPT), s-au încadrat în limitele normale speciei.

Distribuția electroforetică a glicoproteinelor este diferită în funcție de specie, tipul de tumoră, uneori diferențiindu-se și în cadrul aceluiași tip de tumoră.

Rezultatele obținute sugerează faptul că glicoproteinele plasmatice investigate atât cantitativ cât și electroforetic, pot constitui markeri serici care să orienteze clinicianul către investigarea unei anumite maladii. Totuși înainte de a se introduce aceste analize în practica curentă, este necesară investigarea unui număr mult mai mare de cazuri.

BIBLIOGRAFIE