ȘI MEDICINĂ VETERINARĂ BUCUREȘTI FACULTATEA DE BIOTEHNOLOGII TEZĂ DE DOCTORAT Conducător științific: Prof. Univ. Dr. Ing. ȘTEFANA JURCOANE Doctorand:… [610731]

1
UNIVERSITATEA DE ȘTIINȚE AGRONOMICE
ȘI MEDICINĂ VETERINARĂ BUCUREȘTI
FACULTATEA DE BIOTEHNOLOGII

TEZĂ DE DOCTORAT

Conducător științific:
Prof. Univ. Dr. Ing. ȘTEFANA JURCOANE

Doctorand: [anonimizat],
2017

TEZĂ DE DOCTORAT

SISTEME BIOLOGICE ȘI BIOCHIMICE DE
DEGRADARE ACELERATĂ A PRODUSELOR
DIN PIELE NATURALĂ

Conducător științific:
Prof. Univ. Dr. Ing. Ștefana JURCOANE

Doctorand: [anonimizat],
2017

CUPRINS

INTRODUCERE

PARTE A I STADIUL ACTUAL AL CUNOAȘTERII PRIVIND SISTEMELE BIOLOGICE
DE DEGRADARE A PRODUSELOR DIN PIELE

CAPITOLUL I SISTEME BIOLOGICE DE DEGRADARE A PRODUSELOR DIN PIELE

1.1 Aspecte privind compoziția produselor din piele naturală
1.2 Modalități de degradare biologică a produselor din piele naturală
1.3 Selecția microorganismelor capabile să degradeze blănurile naturale
1.4 Tehnologii de degradare biologică a resturilor de blănuri naturale aplicate industrial

CAPITOLUL II SISTEME BIOCHIMICE DE DEGRADARE A PRO DUSELOR DIN PIELE
NATURALĂ

2.1 Modalități de degradare biochimică a blănurilor
2.2 Mecanismul de degradare a produselor din piele naturală
2.3 Descrierea sistemului enzimatic implicat în degradarea blănurilor
2.4 Tehnologii de degradare biochimică a restu rilor din piele naturală aplicate industrial

PARTEA II PARTEA EXPERIMENTALĂ

CAPITOLUL III SCOPUL ȘI OBIECTIVELE CERCETĂRII. MATERIALE ȘI METODE
PRIVIND STABILIREA CONDIȚIILOR OPTIME DE CULTIVARE IN VITRO UNOR SPECII DE
MICROORGANISME PROTEAZICE

3.1 SCOP UL ȘI OBIECTIVELE CERCETĂRII
3.2 MATERIAL BIOLOGIC TESTAT
3.3 ANALIZE EFECTUATE ÎN LABORATOR PENTRU DETERMINAREA UNOR
ÎNSUȘIRI CALITATIVE ALE PRODUSELOR DIN PIELE ȘI BLANĂ NATURALĂ
3.3.1 Materiale utilizate în experimentele de laborator
3.3.2 Medii de cultivare a tulpinilor izolate
3.3.3 Obținerea materialului biologic

3.3.3.1 Descrierea coloniilor izolate, identificare
3.3.3.2 Sursa de azot, sursa de carbon

3.4 METODELE DE ANALIZĂ ȘI CONTROL FOLOSITE PENTRU DETERMINAREA
ÎNSUȘIRILOR CHIMICE ALE PRODUS ELOR DIN PIELE ȘI BLANĂ NATURALĂ.
3.4.1 Optimizarea pH -ului și temperaturii de dezvoltare a tulpinilor noi, izolate
3.4.2 Condiții de cultivare a tulpinilor selecționate
3.4.3 Parametrii de cultivare a tulpinilor selecționate

3.5 METODE DE ANALIZĂ ȘI CONT ROL A MATERIILOR PRIME UTILIZATE ÎN
EXPERIMENTELE DE LABORATOR
3.5.1 Metoda de determinare a glucidelor reducătoare
3.5.2 Determinarea proteinelor prin metoda Lowry (cu substrat modificat)
3.5.3 Determinarea carbonului organic în produsele de piele natural ă
3.5.4 Dozarea carbonului organic.
3.5.5 Determinarea substanței uscate

3.6 METODE DE DETERMINARE A ACTIVITĂȚII ENZIMATICE ALE PREPARATELOR
ENZIMATICE OBȚINUTE
3.6.1 Determinarea activității proteolitice
3.6.2 Determinarea α -amilazelor prin metoda Hostet tler și colab.
3.6.3 Determinarea activității lipolitice
3.6.4 Determinarea activității keratinolitice
3.6.5 Determinarea activității colagenazice
3.7 Documentație tehnică privind selectarea metodei de concentrare a preparatelor enzimatice
3.8 Identificare a tulpinilor bacteriene izolate

CAPITOLUL IV REZULTATE ȘI DISCUȚII
EXPERIMENTE PRIVIND OBȚINEREA DE BIOPREPARAT ENZIMATIC REZULTAT ÎN
URMA DEGRADĂRII UNOR PRODUSE DIN INDUSTRIA PIELARIEI PRIN UTILIZAREA DE
MICROORGANISME SPECIALIZATE

4.1 REZULTATE PRIVI ND SELECȚIA ȘI IDENTIFICAREA MICROORGANISMELOR
CAPABILE SĂ DEGRADEZE PIELEA NATURALĂ

4.1.1 Screeningul bacteriilor izolate și alegerea sistemului biologic de utilizare în degradarea
blănurilor
4.1.2 Rezultate obținute în degradarea biologică a blănurilor c u tulpinile selecționate
4.1.3 Identificarea microorganismelor selectate

4.2 REZULTATE PRIVIND DEGRADAREA ENZIMATICĂ A PRODUSELOR DIN
BLANĂ
4.2.1 Rezultate privind obținerea preparatului enzimatic utilizat în degradarea blănurilor
4.2.2 Biosinteza unui p reparat enzimatic (cu tulpinile izolate) capabil să degradeze pielea
naturală.
4.2.2.1 Dinamica acumulării în culture submerse a proteinelor
4.2.2.2 Influența sursei de carbon
4.2.3 Optimizarea biosintezei proteinelor bacteriene
4.2.3.1 Influența component elor mediului de cultivare asupra biosintezei proteazelor bacteriene
4.2.4. Determinarea activității enzimatice optime
4.2.5 Izolarea din mediul de fermentație a preparatului enzimatic obținut prin biosinteza
4.2.5.1 Separarea biomasei
4.2.5.2 Concentrarea soluției native prin evaporare sub vid
4.2.5.3 Experimete de prelucrare a mediului de cultură prin liofilizarea concentratului
4.2.6 Caracterizarea preparatului enzimatic liofilizat
4.2.7 Rezultate privind gradul de degradare al produselor din piele cu aj utorul preparatului
enzimatic obținut

4.3 EXPERIMENTĂRI PRIVIND OBȚINEREA DE BIOPREPARATE ENZIMATICE CU
APLICABILITATE ÎN AGRICULTURA ECOLOGICĂ
4.3.1 Influența adaosului de preparat enzimatic obținut asupra culturilor de graminee și
leguminoase

CAPITOLUL V – CONCLUZII ȘI RECOMADĂRI

5.1 Concluzii generale
5.2 Contribuții originale
5.3 Dezvoltarea tehnologiilor privind degradarea biologică și enzimatică a produselor din blană
naturală

Listă de tabele
Listă de figuri

REFERINȚE BIBLIOGRAFICE

REZUMAT

Cuvinte cheie : Sistem biologic, izolare bacteriană, degradarea pielăriei, proteinază, amilază,
colagenază, keratinază, lipază, carbon organic, biofertilizator, agricultură ecologică, deșeuri,
identificarea microorganismelor, hidrolizat, sistem biochimic, b iodegradare, poluare.
Industria pielăriei produce anual tone de deșeuri care sunt considerate a fi extrem de dăunătoare
pentru mediu. Resturile solide generate de industria pielăriei conțin ca element de bază proteina, dar
datorită substanțelor folosite în prelucrare, acestea devin foarte greu de degradat, rămânând ca deșeuri
sau se incinerează producând de asemenea poluarea mediului înconjurător.
În ziua de astăzi sectorul biotehnologic ne permite să utilizăm aceste deșeuri ca substrat
microbian pentru pro ducția de enzime. Enzimele obținute pot avea utilizări multiple și pot acoperi
diverse nevoi industriale. Pielea fiind un material bazat pe carbon organic, bogat în proteine poate fi
utilizată pentru îmbunătățirea solului în azot și substanțe minerale, ce poate duce la o bună creștere și
dezvoltare a recoltelor în agricultura ecologică.
Scopul prezentei lucrãri este acela de izolare a unor microorganisme capabile să degradeze
deșeurile din industria pielăriei, de optimizare a mediilor de cultură bacteriene specifice, de obținerea
enzimelor pentru biodegradarea deșeurilor din industria pielăriei și de obtinere a unui hidrolizat care
sa poată fi utilizat cu succes ca biofertilizator pentru culturile de cereale și leguminoase.
Principalelele obiective ale tezei de doctorat au urmărit:
– izolarea, selecția, caracterizarea, identificarea și testarea microorganismelor cu eficiență în
degradarea accelerată a deșeurilor din industria pielăriei;
– experimentarea biodegradabilității principalelor componente ale articolelor de blană
naturală tăbăcită cu crom;
– obtinerea enzimelor specific pentru biodegradarea deșeurilor din industria pielăriei
– obtinere a unui hidrolizat care sa poată fi utilizat cu succes ca biofertilizator pentru
culturile de cereale și leguminoase.
Experim entele s -au desfășurat în condiții de laborator, în cadrul Facultății de Biotehnologii
aparținând Universității de Științe Agronomice și Medicină Veterinară București
Pentru realizarea experimentelor de biodegradare a proteinelor au fost testate mai multe tipuri
de blană și piele tăbăcite cu crom provenite din sectoarele industriale.
S-au luat în lucru bucați de piele și blană naturală de oaie, tăbăcite cu crom, precum și bucăți de
piele și blană ecologică, materiale ce au fost puse la dispoziție de către I nstitutul de Pielărie București.
Pentru screeningul microorganismelor a fost luată în considerare izolarea acestora din mediile
naturale.
Materialul biologic testat a constat în trei tulpini bacteriene ce au fost izolate în urma degradării
unor resturi de blană și piele tăbăcite cu crom, provenite de la Institutul de Pielărie București.
Teza este structurată în două părți, după cum urmează:

Prima parte a tezei cuprinde date din literatura de specialitate cu privire la tema tezei de doctorat
prezentate și este structurată două capitole.
Capitolul I prezintă generalități privind sistemele biologice de degradare a produselor din piele,
precum și aspecte privind compoziția produselor din piele naturală. De asemenea, sunt prezentate date
referitoare la descrie rea detaliată a tehnologiilor de degradare biologică a resturilor de blănuri naturale
aplicate industrial.
Capitolul II prezintă sistemele biochimice de degradare a produselor din piele naturală precum
și descrierea sistemului enzimatic implicat în degrada rea blănurilor.
A doua parte a tezei este alcătuită din contribuțiile originale efectuate pe parcursul cercetării.
În capitolul III sunt cuprinse scopul și obiectivele datelor obținute, fiind descrise materialul
biologic folosit, metodele de lucru utilizat e în laborator pentru analiza condițiilor optime de cultivare
in vitro unor specii de microorganisme proteazice, analizele efectuate pentru determinarea unor
însușiri calitative ale produselor din piele și blană naturală precum și metodele de analiză și co ntrol
folosite pentru determinarea însușirilor chimice ale produselor din piele și blană naturală. Capitolul III
mai cuprinde metodele de analiză și control a materiilor prime utilizate în experimentele de laborator
precum și metodele de determinare a acti vității enzimatice ale preparatelor enzimatice obținute
În capitolul IV se găsesc rezultatele obținute în urma experimentării. În fiecare subcapitol,
rezultatele au fost prezentate pentru fiecare determinare în parte.
Din rezultatele experimentelor efectua te putem prezenta următoarele:
– În jurul coloniilor izolate producătoare de proteaze se observă un halou opalescent fapt ce indică
activitatea proteazică a microorganismelor
– În urma determinărilor realizate în laborator s -a concluzionat că cel mai înalt gra d de
productivitate enzimatică s -a înregistrat la temperatua de 35oC, un pH egal cu 7,2, 135rpm, unde
s-a utilizat ca unică sursă de carbon blană naturală; blană sintetică și pene în proportie de 0,6g %
la care s -au efectuat determinări ale activităților e nzimatice la 120 de ore de la cultivare.
Tulpinile bacteriene au fost crescute pe mediu minimal.
– S-au caracterizat cele trei tulpini din punct de vedere al activității enzimatice: activitatea
proteolitică, activitatea amilolitică, activitatea lipolitică, activitatea keratinolitică și activitatea
colagenazică, astfel:
– Pentru proteaze producția a fost 1,430 U/ml în cazul enzimelor obținute din hidroliza blănurilor
naturale, iar pentru enzimele obținute din hidroliza penelor este de 0,726 U/ml;
– Pentru colagen ază valoarea a fost de 0,401 U/ml pentru hidroliza blănurilor naturale, iar pentru
enzimele obținute din hidroliza penelor este de 0,418 U/ml;
– În cazul determinării amilazei în urma hidrolizei blănurilor s -a înregistrat valoarea de 0,870
U/ml iar valoarea determinată în urma utilizării penelor ca unică sursă de carbon a fost de 1,220
U/ml;
– În cazul producției de keratinază valoarea maximă a fost obținută în cazul hidrolizării penelor și
anume 0,328 U/ml față de 0,248 U/ml obținute în cazul hidrolizării blăn urilor;
– Producția maximă de lipază a fost de 140 U/ml în ambele cazuri de hidrolizat.
– Având în vedere faptul că tulpinile izolate au a manifestat o activitate enzimatică redusă, față de
blana sintetică s -a renuntat la utilizarea acesteia.

– Tulpinile B. dimi nuta (DA7) B. thuringiensis (DA10) și B. cereus (DA13) au fost identificate
prin testul Biolog și au capacitatea de a degrada produsele din piele și blană naturală tăbăcite cu
crom.
– Tulpinile nou izolate au fost cultivate pe medii de cultivare specifice, î n sistem submers, la
flacoane agitate de 500 ml, cu 200 ml mediu/flacon, astfel încât volumul final să fie de 3000 ml.
Mediul de fermentație astfel obținut s -a prelucrat prin filtrare și concentrare obținându -se un
produs microbiologic concentrat, lichid, utilizat ca adaos biofertilizant în culturi vegetale de R.
sativus. Triticum sp., S. tuberosum.
– S-a constatat efectul stimulator în creșterea plantulelor testate în condiții de seră, prin urmare
hidrolizatul obținut în cadrul tezei de doctorat poate fi ut ilizat cu succes ca biofertilizator pentru
culturile de cereale și leguminoase.
– În cazul soluției obținute în cadrul lucrării prezente se observă că cel mai bun efect asupra
îmbunătățirii calității plantulelor a fost înregistrat de tulpina B. thuringiensis (DA10) la
concentrația de 35%.
– S-a constatat o reducere a carbonului organic cu cca. 30%, ceea ce confirmă activitatea
hidrolitică a complexului enzimatic produs de tulpinile izolate.
În urma experimentărilor se poate dezvolta o tehnologie privind degrada rea biologică și
enzimatică a produselor din blană naturală, o tehnologie de obținere a hidrolizatului și utilizarea
acestuia ca biofertilizant precum și dezvoltarea tehnologiilor de identificare a blănurilor naturale.

CUVÂNT ÎNAINTE

―Dificilul est e ceea ce poți realiza imediat, imposibilul ia ceva mai mult timp..‖

În câteva rânduri voi încerca să oglindesc contribuția celor care m -au susținut în realizarea
acestei teze de doctorat.
Mărturisesc profunda mea recunoștință pe care o datorez și o voi datora întotdeauna Dnei. Prof.
Univ. Dr. Ing. Ș. Jurcoane atât pentru toate sfaturile utile pe care Domnia Sa mi le -a acordat cu o
excepțională competență, pentru noblețea spirituală și încrederea cu care m -a înconjurat pe tot
parcursul efectuării tuturor experimentelor necesare elaborării lucrării de doctorat.
În calitate de ucenic al Dnei. Jurcoane recunoștința mea este infimă, comparativ cu tot ce am
beneficiat din punct de vedere profesional și uman din partea Domniei Sale, printr -un exemplu de
perman entă rigoare științifică și extrem de elevată competență profesională.
Distinsă personalitate cu o dedicare profesională fără egal Dna. Prof. Univ. Dr. Ing. P. Cornea
mi-a călăuzit pașii în domeniul cercetării, îndrumându -mă permanent cu o infinită genero zitate, fapt
pentru care îi voi rămâne întotdeauna îndatorată.
În mod deosebit vreau să menționez întreaga mea admirație față de Dna. Prof. Dr. F. Matei
căreia nu cred că voi reuși vreodată să îi mulțumesc îndeajuns pentru contribuția sa la formarea mea
profesională încă din perioada în care eram stundentă.
Dnei. Prof. Dr. F. Israel -Roming îi adresez cele mai profunde sentimente de recunoștință pentru
remarcabila devotare și competență științifică precum și pentru sugestiile deosebit de utile în
elaborare a prezentei lucrări.
Cu deosebită stimă adresez sincere mulțumiri Dl. și Dnei. Teodorescu pentru sfaturile,
îndrumările, ajutorul, grija, căldura și susținerea morală nemărginită pe care dânșii mi le -au oferit pe
parcursul anilor mei de studii și formare profesională.
Tot pe această cale vrea să îi mulțumesc Dl. Prof. Petre Marian și Dnei. Prof. I. Deliu pentru
bazele științifice pe care mi le -au format pe vremea când eram studentă.
Doresc să îi mulțumesc Dl. Cercetător Ghe. Olteanu pentru deschiderea no ilor orizonturi
științifice printr -o competență profesională și o dedicare rar întâlnită, pentru susținerea acordată în
momente de cumpănă și pentru imensa noblețe spirituală cu care m -a coordonat și cu care a contribuit
la adăugarea pieselor puzzle în for marea mea în fascinantul univers al cercetării științifice.
Vreau să mulțumesc din suflet mamei mele, tatălui și logodnicului meu pentru întregul suport
moral și financiar, indispensabile pentru realizarea acestui vis, suportând cu stoicism toate momentel e
de cumpănă psihică și morală, acordându -mi permanent înțelegere, căldură și îndrumarea necesară.

Vreau să îi mulțumesc bunului meu prieten a cărui energie m -a călăuzit în îndeplinirea acestui
vis.
Mulțumesc sincer tuturor apropiaților mei pe care, în p ofida faptului că nu îi voi nominaliza,
doresc să îi asigur de întreaga mea gratitudine și recunoștință pentru ajutorul moral acordat în decursul
anilor care au contribuit în mod substanțial la împlinirea acestei mărețe dorințe.
Muțumesc Energiei Atotpute rnice pentru că, iată, reușesc în acest mod să adun toate piesele
formării mele profesionale și să închei o lungă, dar frumoasă, etapă din viața mea.

Namaste.

1
INTRODUCERE

Dezvoltarea și creșterea industrială dezorganizată au cauzat probleme grav e oamenilor din
întreaga lume. Este necesar, prin urmare, difuzarea de idei pentru dezvoltarea durabilă, în cazul în
care resursele naturale sunt utilizate rațional și este posibilă menținerea ecosistemelor existente acum.
Acest deziderat se realizează pri n reducerea poluării aerului, solului și apei precum si prin g ăsirea de
noi soluții pentru o industrializare eficientă fără efecte secundare asupra omului sau a mediului
ambiant.
Abordarea problematicii proceselor caracteristice poluãrii de pe poziții pas ive, de constatare a
efectelor distructive, fãrã aplicarea unor metode eficiente de prevenire a cauzelor acestui fenomen
global, genereazã amplificarea consecințelor negative, prin declanșarea unor reacții de propagare,
frecvent imprevizibile determinate d e interacțiunea permanentã dintre agenții poluanți și mediul
natural fiind cauzele principale ale încălzirii globale, a poluării apelor și solului, a extincției speciilor
și a altor dezastre naturale.
Pentru a înțelege acțiunea reciprocă dintre om și habi tatul său este necesară menținerea într -un
echilibru adecvat al ciclului ecologic al Pământului. Este necesar ca activitatea umană să rămână în
armonie cu întregul sistem, ea trebuie să se adapteze cerințelor sectorului natural, acesta fiind limitat
ca dim ensiune si ritm de activitate.
Limitarea locurilor disponibile pentru depozitarea deșeurilor a căpătat o importanță foarte mare,
devenind o problemă economică și ecologică gravă pentru tăbăcării; costurile de transport și
depozitare au crescut continuu ast fel încât se impune necesitatea găsirii unor soluții tehnice cu efecte
economice și ecologice favorabile, care să reducă atât volumul, cât și greutatea acestor deșeuri solide;
în plus, se caută o strategie activă pentru utilizarea acestor deșeuri, care să ducă chiar la obținerea de
profituri.
Conceptul modern de „economie în ciclu închis‖ presupune prevenirea impactului substanțelor
toxice și periculoase asupra mediului și integrarea proceselor industriale în cicluri ecologice;
substanțele care nu pot fi in tegrate trebuie reciclate complet în procesul de producție sau trebuie
returnate în litosferă.
Majoritatea oamenilor de știință sunt de părere ca utilizarea organismelor biologice pentru
producerea unor componente utile intereselor umane reprezintă obiectu l de bază al biotehnologiei.
Aplicarea biotehnologiilor ecologice, cu precădere în domeniul activităților industriale, ajută la
soluționarea problemelor legate de impactul antropic asupra mediului, generat prin acumularea
anumitor materiale reziduale, prin procedee și tehnici de bioremediere, utilizând în acest scop
mijloace biologice pentru transformarea lor integrală, fără efecte poluante și eficiente din punct de
vedere economic.

2
Utilizarea unor microorganisme specifice pentru degradarea blănurilor și a resturilor de piele
reprezintă o alternativă ecologică și un instrument de evaluare a biodegrabilității. Colagenul procesat
și keratina insolubilă din blănuri sunt "digerate" de către microorganisme care au capacitatea de a
produce enzime capabile să le de gradeze.
Enzimele pot avea aplicabilitate în diverse stadii ale proceselor de prelucrare a blănurilor
naturale, cum ar fi în înmuiere, leșiere, îndepartarea părului, spălare, vopsire și degresare, ca tratament
fie în faza solida sau lichidă (Kanth et al., 2009; Kanth et al., 2008; Macedo et al., 2005; Dayanandan
et al., 2003; Lutckmeier et al., 2008; Kumar et al., 2008).
În ciuda consolidărilor facute în alte aplicații industriale, utilizarea enzimelor în industria
pielăriei are nevoie de mai multe cercetăr i pentru a fi utilizate propriu -zis pe scară largă și la costuri
competitive.
Unele dintre avantajele utilizării enzimelor în industria pielăriei ar fi timpul de uscare mai scurt,
îndepartarea proteinelor, grăsimilor și carbohidraților (Thanikaivelan et al ., 2004). Enzimele mai pot
fi folosite în procesele de îndepartare a epidermei și părului, a componentelor reziduale,
îndepartarea/dispersarea componentelor adipoase și pentru reducerea grosimii pielii. (Wang et al.,
2009).
Activitățile enzimatice sunt de terminate utilizând cazeina ca substrat (BASF, 1995), în timp ce
pieile de bovine nu au aceasta proteină în compoziția lor. Prin urmare este important sa stabilim
activitațile pe colagen, componentul principal al pielii animalelor, și pe keratina în ordine a utilizării în
procesarea pielariei.
Asigurarea calitãții mediului, prin soluționarea problemelor generate de acumularea deșeurilor
din industria pielariei, utilizând mijloace biologice, farã efecte poluante și eficiente din punct de
vedere economic, prec um și utilizarea pe scarã largã a biotehnologiilor microbiene poate avea un
impact pozitiv asupra condiției de sãnãtate a populației, prin reducerea gradului de poluare a biosferei.
Alegerea acestei teme a avut în vedere izolarea unor microorganisme capabi le să degradeze
deșeurile din industria pielăriei, prin optimizarea mediilor de cultură bacteriene specifice, de obținerea
enzimelor pentru biodegradarea deșeurilor din industria pielăriei și de obtinere a unui hidrolizat care
sa poată fi utilizat cu succe s ca biofertilizator pentru culturile de cereale și leguminoase.
Tema de cercetare urmarește:
– izolarea, selecția, caracterizarea, identificarea și testarea microorganismelor cu eficiență în
degradarea accelerată a deșeurilor din industria pielăriei;
– experi mentarea biodegradabilității principalelor componente ale articolelor de blană
naturală tăbăcită cu crom;
– obtinerea enzimelor specific pentru biodegradarea deșeurilor din industria pielăriei
– obtinere a unui hidrolizat care sa poată fi utilizat cu succes c a biofertilizator pentru
culturile de cereale și leguminoase.

3
Rezultatele obținute în cadrul lucrării vor contribui la soluționarea prin mijloace biologice a
problemelor generate de acumularea deșeurilor în industria pielăriei, oferind soluții biotehnologi ce
pentru degradarea lor integralã, precum și pentru asigurarea calitãții mediului.

4
CAPITOLUL I
CHAPTER I
SISTEME BIOLOGICE DE DEGRADARE A PRODUSELOR DIN
PIELE
BIOLOGICAL SYSTEMS OF LEATHER PRODUCTS
DEGRADATION

1.1 ASPECTE PRIVIND COMPOZIȚIA PRODUSE LOR DIN PIELE
NATURALĂ

Pielea este considerată ca fiind unul dintre cele mai importante organe de depozitare a apei din
organism, în totalitate aceasta conține 7 – 11% apă din organism.
Substanțele anorganice sunt reprezentate de o serie de cationi și ani oni precum sodiu, potasiu,
calciu, magneziu, cupru, zinc, fier, sulf, fosfor, clor, fluor, iar substanțele organice sunt reprezentate
de proteine, hidrați de carbon și lipide.
Proteinele reprezintă constituentul cel mai important al organismului, datorită multiplelor și
variatelor roluri pe care le îndeplinesc.
Moleculele proteice se împart în proteinele globulare sferice sau elipsoidale (solubile în apă,
soluții apoase, acizi, baze, alcooli, cum ar fi protaminele, histonele, albuminele, globulinele) și
proteinele fibrilare , cu moleculă alungită, în general insolubile în solvenții menționați, rezistente la
digestia enzimatică proteolitică. Ele se întâlnesc în piele, păr, unghii, țesuturi de susținere și constituie
un grup de proteine eterogene, denumite scl eroproteine, din aceasta grupă facând parte colagenul,
elatina și keratina.
După compoziția chimică se împart în proteine simple , care prin hidroliză pun în libertate numai
aminoacizi și conjugate , care în afară de aminoacizi mai conțin o componentă neprot eică – grup
prostetic (acid fosforic, glucide, lipide, acizi nucleici, hem) cum este cazul fosfoproteinelor,
glicoproteinelor din țesutul conjunctiv, lipoproteinele, nucleoproteinele, cromoproteinele.
Dintre proteinele întalnite în piele, importanță prezin tă keratina și elastina.
Din punct de vedere chimic, keratina se caracterizează print -un conținut mare de diaminoacizi și
aminoacizi cu sulf (cistina, cisteina, histidina, triptofanul, leucina, izolecucina, tirozina, etc.), dintre
care predomină cisteina, care îi conferă rigiditatea prin formarea punților disulfidice.

5
Există unele diferențieri ale keratinei din componența părului și a acelei din epiderm. În primul
caz se remarcă predominența cistinei (16 -18%) și a sulfului (5,20%) pe când în epiderm cistina
reprezintă numai 2,5%, iar sulful 2 – 3 %, în schimb se găsește o cantitate mai mare de histidină.
Keratina provine din biosinteza aminoacizilor, pe de -o parte și din keratohialină, pe de alta
parte, care este considerată ca un precursor al keratinei. Gra nulele de keratohialină sunt constituite
dintr -un complex de lipoproteine și mucopolizaharide.
Studiile în domeniul difracției, cu raze X întreprinse de SWANBECK în 1959, evidențiază
participarea lipidelor în procesul de keratinizare. S -a constat că fibrel e proteice din stratul cornos
(diametrul 250 Å), sunt înconjurate de o zonă lipidică de circa 80 Å, iar orice anomalie în
metabolismul lipidic induce un proces patologic de keratinizare. Aceste argumente confirmă
participarea lipidelor în acest proces comp lex ( http://www.scrigroup.com/sanatate/cosmetica –
frumusete/Biochimia -pielii92133.php )
Structura keratinei . Cu ajutorul difracției razelor X de către proteine (î n stare cristalină sau
fibroasă), s -au pus în evidență diferite structuri spațiale ale catenelor polipeptidice. S -a constatat de
PAULING și COREY (1951), că lanțurile pot fi răsucite în spirală (helix, structura a) sau dispuse în
'foaie pliantă' (structura b).
Majoritatea cercetărilor admit astăzi modelul helicoidal cu caractere bine determinate.
Configurația α -keratinei se întâlnește în firul de păr. ASTBURY și STREET (1931) denumesc această
configurație, configurația a, iar keratina corespunzătoare α -keratina. În prezența umezelii catenele
polipeptidice se extind complet formând o nouă configurație, configurația β -keratinei, ASTBURY și
WOODS (1933). În epiderm keratina prezintă configurația a.
Keratina fiind o proteină greu solubilă, nu este hidrolizabilă de enezimele proteolitice,
proprietăți datorate rezistenței legăturilor disulfidice -S -S- din keratină, alături de care mai participă
și alte tipuri de legături (N -H+O=C), forțe de atracție Van der Vaals. Prin ruperea legăturilor -S-S- din
keratină se for mează mercaptoderivați și acid sulfuric, care pot da naștere apoi la produși de oxidare
(alcooli, aldehide, acizi). Keratina este hidrolizată de acizi și baze concentrate.
Unii cercetatori admit trecerea α – keratinei în β – keratină, datorită scindării pu nților de
hidrogen intralant. S -a constatat că α – keratina din epiderm prin încalzire la 850C poate trece în
configurația β în timp ce α – keratina din păr și unghii își păstrează configurația.
Prin calitatea sa de a reflecta, difuza și absorbi radiațiile solare, keratina constituie un ecran
alături de melanină, împotriva radiațiilor luminoase și ultraviolete.
Proteinele din derm sunt alcatuite dintr -o rețea de fibre proteice, o matrice
interfibrilară și celulele dermului.

6
Rețeaua proteică , reprezintă 15% din greutatea dermului proaspat sau 75% din cea a dermului
uscat, delipidat. Aproximativ 90% din fibrele proteice ale dermului sunt formate din colagen, 10% din
elastină și o foarte mică cantitate de reticulină (proteina fibrelor reticulate).
Aproximativ jumătate din totalitatea proteinelor existente în organismul uman (derm, ligamente,
tendoane, cartilaje și alte țesuturi conjunctive) sunt reprezentate de colagen. În compoziția colagenului
din derm se găsesc două fracțiuni: colagenul solubil și colagenul insolubil .
Colagenul solubil, denumit tropocolagen , se poate obține prin macerare (18 ore la 5oC) sub
forma unui extract vascos, cu o soluție de clorură de sodiu sau cu un tampon fosfat (pH 7,6).
Tropocolagenul are moleculă cu o lungime de 280 nm, diametru l 1,4 nm și alcatuiește fibrele de
colagen din țesutul conjunctiv.
Tropocolagenul care se formează 'in vivo' este considerat ca unitatea monomera a fibrelor de
colagen, iar precursorul tropocolagenului este procolagenul sau forma de transport a colagenulu i.
Fibra de colagen este alcatuită din trei lanțuri polipeptidice dispuse helicoidal (forma a).
Greutatea moleculară a tropocolagenului atinge 300.000 Da, la 350 – 400 resturi de aminoacizi, din
care 120 sunt resturi de lizină și hidroxilizină.
Din punct d e vedere chimic, colagenul conține cantități mari de glicoli (30%), prolină și
hidroxiprolină (25%). Acesti ultimi doi aminoacizi conferă rigiditate și stabilitate moleculei de
colagen.
Prin studiul difracției cu raze X a proteinelor fibrilare ELLIS și MC GAVIN (1970), au ajuns la
concluzia că moleculele de colagen sunt formate din helicuri înmanunchiate de polipeptide. Fiecare
mănunchi conține trei lanțuri polipeptidice PAULING și COREY (1951); fiecare lanț se rotește în
jurul axei sau formând helixul mino r (care conține 3 aminoacizi), iar cele trei lanțuri sunt ușor rotite
unul în jurul celorlalte, formate din 10 resturi de aminoacizi).
Colagenul insolubil, rezultă din colagenul matur din 'vivo' și mai poartă denumirea de
colastromin. Acesta se deosebește electronoptic, histologic și spectroscopic de cel solubil. El se poate
obține din tratarea colagenului din țesutul cutanat cu o soluție de uree 6 M.
Elastina i ntră în componența fibrelor elastice din piele, din punct de vedere morfologic se
prezintă diferi t; unele fibre au aspect neregulat cu ramificări, iar altele formează adevarate rețele. Din
punct de vedere biochimic fibrele elastice prezintă trei componente: o componentă proteică,
mucopolizaharide acide și neutre și o componentă lipidică. Reacțiile his tochimice confirmă prezența
acestor componente: reacția de reducere pentru glucide și reacțiile Schiff și cu derivați osmici, pentru
lipide.
Aceasta conține cantități mari de alanină, valină, prolină și cantități mici hidroxiprolină (1 –
6%), ceea ce le di ferențiază de colagen. În compoziția elastinei se semnalează prezența a doi
aminoacizi specifici, desmozina și izodesmozina. Culoarea galbenă a țesuturilor care conțin elastină

7
se datorează unui pigment fluorescent, numit pigment galben. Ea conferă elastic itate fibrelor elastice,
a căror proprietăți scad prin depozitarea în elastină a derivaților de colesterol.
Reticulina reprezintă o altă componentă a rețelei proteice din derm, se situează într -o poziție
intermediară între colagen și elastină din punct de vedere a compoziției chimice. În aceasta proteină s –
a găsit mai multă hidroxiprolină decât în elastină și cantități relativ mari de leucină și izoleucină,
asemănător elastinei. Principala diferență între reticulină și colagen o constituie prezența unui num ăr
mare de grupări glucidice conținute de reticulină. Fibrele de reticulină nu sunt sensibile la acțiunea
hialuronidazei, ceea ce indică lipsa mucopolizaharidelor din moleculă. Reticulina din piele posedă o
structură în care intră complexe glicoproteice cu o organizare macromoleculară care depinde de
organ.
Fibrele de colagen predomină în orice regiune a dermului, elastină și reticulină sunt mai
frecvent întalnite în stratul papilar al corionului.
Matricea interfibrilară (substanță interfibrilară, fundament ală) are consistența unui gel
imprimată de prezența unei rețele submicroscopice tridimensionale, constituită din complecși
mucopolizaharidici și proteine. Ochiurile acestei rețele conțin apă în care sunt dizolvați electroliți
(NaCl, HCO 3Na, etc.), substanț e organice cu greutate moleculară mică (glucoză, aminoacizi) și
proteine asemănătoare celor serice.
Celulele dermului ocupă un volum redus în comparație cu cel al fibrelor de colagen și a
substanței fundamentale.
Hidrații de carbon din compoziția chimică a pielii sunt constituiți din monozaharide și
polizaharide.
Monozaharidele , sunt reprezentate în special de glucoză, întalnită în celulele stratului bazal și
malpighian, iar polizaharidele , sunt produși de policondensare a monozaharidelor tipice (aldoze,
cetoze) sau din derivații acestora, acizi uronici, aminozaharuri, esteri. Rolul biologic al
polizaharidelor este acela de materiale structurale, componente plastice ale țesuturilor conjunctive sau
de depozit (glicogenul din țesuturile animale).
Dintre poliza haride, în piele sunt prezentate glicogenul și mucopoli -zaharidele. Glicogenul, ca o
mică fracțiune de rezervă, este prezent în stratul lucid și în zona generatoare bazală a epidermului; în
cantitate mai mare se găsește în foliculii piloși. Mucopolizaharid ele se întâlnesc în substanța
fundamentală care umple spațiile intercelulare și interfibrilare ale țesutului conjunctiv din derm.
Acesti compuși nu sunt utilizați de organism ca surse de energie, ele se acumulează în spațiile
intercelulare; în țesutul conj unctiv al dermului, mucopolizaharidele formează complecși
mucoprotidici cu rol funcțional.
Având în vedere metabolismul hidraților de carbon și a mucopolizaharidelor, se poate observa
cum glucoza se transformă în hexoxamină și acid glucuronic, componente c e intră în compoziția

8
acidului hialuronic și condro -itinsulfuric. Prezența L -glutaminei în epiderm explică sinteza
mucopolizaharidelor în piele.
Prezența mucopolizaharidelor în epidermul uman și în special în spațiile intercelulare a fost
pusă în evidență prin reacții histochimice, iar studiile de microscopie electronică au confirmat rolul
acestora de 'substanțe ciment' între celulele epidermului.
Mucopolizaharidele rețin cantități de apă datorită prezenței unui mare număr de grupări acide
ionizate ( -COO – și -O-SO 3-), formând soluții coloidale, geluri care realizează un ciment intercelular
flexibil.
Mucopolizaharidele, se diferențiază prin compoziția chimică și funcția lor biologică în două
clase: mucopolizaharide acide și neutre. Cele acide conțin în molec ulă acizi uronici și acid sulfuric, iar
cele neutre sunt fără resturi de acizi în moleculă. Spre deosebire de cele acide, mucopolizaharidele
neutre sunt puternic cuplate cu proteine, putând fi puse în libertate numai printr -o hidroliză severă. In
derm muco polizaharidele neutre intră în constituția majorității complexelor proteice a lichidului
interstițial.
Din grupa mucopolizaharidelor acide face parte acidul hialuronic și condroitin sulfații A, B, C.
Acidul hialuronic este un polimer cu greutate molecular ă mare, fiind constituit din unități de N –
acetil glucozamină și acid -D-glucuronic.
Acidul hialuronic se găsește în derm (0,10 – 1,0%) sub formă de sare de sodiu, rezultată din
fixarea unei cantități echivalente de ioni de sodiu din celulă. El se găsește î n cantități mai mari în
dermul papilar și la nivelul membranei bazale; prezența lui în vecinatatea dermului favorizează
schimburile între derm și epiderm.
Prin studiile efectuate cu raze X s -a demonstrat ca acidul are o structură macromoleculară
filamentoa să, filamentele de hialuronat se orientează în direcții preferențiale în substanța
fundamentală, conferindu -i acesteia o permeabilitate mărită.
Soluțiile de acid hialuronic sunt foarte vâscoase, o serie de proprietăți ale acestora, viteza de
sedimentare, viteza de difuziune, birefringența, vâscozitatea etc., variază în funcție de concentrația în
ioni de sodiu.
Acidul hialuronic se degradează în prezența enzimei specifice, hialuronidază. Drept urmare a
acestui proces are loc o scădere a gradului de polimer izare a acidului hialuronic, trecerea substanței
fundamentale din stare de gel în stare de sol și creșterea permeabilității și a difuziunii intradermice.
Hialuronidazele provin din diferite surse, dintre care se menționează cea tisulară și cea
bacteriană. Produșii de degradare în urma acțiunii hialuronidazei, sunt tetrazaharide (80%), dizaharide
(10%) și restul oligozaharide. Acidul hialuronic suferă degradări și sub acțiunea unor agenți
reducători (cistina, acid ascorbic, fier, cupru, radiații ultraviolete ), care au un efect depolimerizant
asupra macromoleculei.

9
Condroitinsulfații se diferențiază de acidul hialuronic, ei fiind alcatuiți din resturi de acid
glucuronic asociate cu resturi de N -acetil -galactozamină și o grupare ester sulfurică. Există trei
condroitin sulfați: A, B și C; dintre aceștia prezintă importanța condroitin sulfatul B (dermatansulfat),
care este constituent principal al țesutului conjunctiv din piele și al substanței fundamentale.
Condroitinsulfații formează complexe cu protein ele, jucând un rol important în transportul
electroliților. Ei sunt degradați de condroitinază, enzima specifică care degradează macromolecula
până la oligozaharide, tetrazaharide.
Lipidele sunt sintetizate în piele atât în glandele sebacee cât și în epide rm. Ele joacă un rol
important în menținerea funcției de barieră și a integrității structurale ale stratului cornos.
În compoziția grăsimilor pielii se găsesc trigliceride (15 – 37%), fosfolipide (1,8 – 7,1%), acizi
grași liberi (aproximativ 30%), din care mai mult de jumatate sunt acizi cu 16 și 18 atomi de carbon,
saturați sau nesaturați, dar există și o cantitate apreciabilă de acizi grași cu un număr mai mic de atomi
de carbon. Restul componenților sunt reprezentați de acizi esterificați, ceride (30%), squalen (18%),
steroli (1,5 – 3,5%) și o mică cantitate de hidrocarburi parafinice.
Cercetarile au demonstrat ca ceridele și squalenul sunt secretate ca atare numai de glandele
sebacee.
În epiderm se găsesc vitaminele A și D (provitamine), iar în derm sunt prezente vitaminele B1,
B2, B6, acidul pantotenic, vitamina C, vitamina H și vitamina PP în peretele capilarelor.

1.2. MODALITĂȚI DE DEGRADARE BIOLOGICĂ A PRODUSELOR
DIN BLANĂ NATURALĂ

Microorganismele își realizează activitățile metabolice prin meca nisme similare cu cele
implicate în metabolismul organismelor superioare.
Acestea prezintă o capacitate unică de degradare a unor substanțe complexe din mediu și de a
sintetiza anumiți metaboliți, unii folositori omului.
Luate ca grup, bacteriile își pot r ealiza metabolismul folosind numeorase și diverse surse de
substanțe nutritive, începând cu azotul molecular și sulful, până la cele mai complexe substanțe
organice. Acestea se pot dezvolta pe anumite soluții de acizi – axalic, formic, sulfuric; pe substra turi
cu fenoli, proteine, țiței; pot degrada asfaltul, masele plastice, cauciucul, lemnul, parafinele, chiar și
pe unele substanțe antibiotice.
Aceste particularități explică faptul că, deși au fost depuse numeorase produse de uzură și de
excreție, cadavr e, reziduuri, acestea nu s -au acumulat pentru că au fost descompuse de către
microorganisme și reintroduse în ciclul elementelor biogene.

10

1.3. SELECȚIA MICROORGANISMELOR CAPABILE SĂ DEGRADEZE
BLĂNURILE NATURALE

Microorganismele capabile să producă enzime proteolitice, pot fi izolate din diferite habitate:
sol, aer, apă, din diferite alimente, furaje, produse vegetale. Acestea trebuie să îndeplinească calități
cum ar fi producția sistemului enzimatic în cantitățile dorite, să aibe o mare stabilitate și să nu fie
patogene sau sa nu producă substanțe toxice care ar putea denatura preparatul enzimatic (TAPAI M.,
2009; STOICESCU A., 1999).
Cercetările pentru selecția tulpinilor bacteriene producătoare de proteaze încep prin izolarea din
habitate de referință a unui număr mare de tulpini.
Cele mai cunoscute tehnici de izolare și purificare a culturilor de microorganisme sunt tehnica
diluțiilor și tehnica culturilor de sol. Deseori sunt create condiții selective de cultivarea a
microorganismelor pe medii solide sau lichide continând anumite principii cu ajutorul cărora se pot
evidenția unele caracteristici fiziologice. După etapa de izolare și realizarea culturilor pure prin
tehnici directe (de micromanipulare) sau indirecte (epuizarea ansei și diluții) se trece la screeningul
tulpinilor luate în lucru după criterii cantitative și calitative, conform scopului dorit. TAPAI M. (2009)
Metodele clasice de screening al microorganismelor cu potențial proteolitic se bazează pe
proprietatea enzimelor biosintetizate de a h idroliza proteinele adăugate în mod intenționat în mediul
de cultură. JURCOANE Ș.et al (2009)
Pentru izolarea tulpinilor înalt producătoare de proteaze se utilizează diferite teste calitative de
cultivarea microorganismelor în placi Petrii pe medii solidif icate cu agar -agar, continând substratul
natural al enzimelor dorite, la tem peratura optimă specifică fiecărei tulpinii și determinarea zonelor de
hidroliză ce apar în jurul coloniilor. După dezvoltarea coloniilor izolate, enzimele difuzează în gelul
de a gar-agar atacând substratul inclus în mediu. Cu cât aceasta este mai extinsă cu atat
microorganismul respectiv este mai bun producător
(BURCEA MIRELA, 2001 ; TAPAI M., 2009) .
Testele cantitative se efectuează prin determinarea precisă a activității enzimat ice a extractelor
sau lichidului de biosinteză prin metode spectrofotometrice, de fluorescență, titrimetrice,
manometrice.
În urma acestor teste se rețin numai câteva tulpini care sunt apoi cercetate în vederea
identificării și caracterizării după criterii morfologice, biochimice, fiziologice, imunologice, virulență –
patogenitate, etc. ( MENCINICOPSCHI GH.,1987; TAPAI M., 2009).
Într-un proces de producere a unei enzime cu ajutorul microorganismelor cel mai important
lucru este alegerea unui organism producăt or corespuzător. Când se alege microorganismul potențial

11
producător de enzime, trebuie să se aibă în vedere dacă enzima de interes este produsă intra – sau
extacelular; avantajele și dezavantjele care derivă din localizarea enzimelor. Preferința pentru
localizarea enzimei va fi dictată de stabilitatea enzimei, complexitatea mediului de producție și
ușurința dezintegrării celulelor în vederea purificării enzimei de interes.
Trebuie să avut în vedere ca tupina producătoare să nu fie amenințată de produșii de s inteză și
să nu fie posibilă o contaminare a preparatului enzimatic cu o tupină patogenă sau cu toxine provenite
de la microorganismul producător.
Microorganismele alese trebuie să fie capabile să crească în medii de cultură simple, ieftine și
care să nu n ecesite adăugarea de promotori de creștere scumpi, să fie stabile din punct de vedere
genetic, să producă cantități mari din enzimă dorită în cel mai scurt timp, să fie ușor de separat din
mediul de biosinteză la sfârșitul fermentației și, dacă este cazul, să fie ușor dezintegrabile (pentru
enzime intracelulare).

1.4. TEHNOLOGII DE DEGRADARE BIOLOGICĂ A RESTURILOR DE
BLANĂ APPLICATE INDUSTRIAL

Procesul de creștere a microorganismelor se desfășoară prin sinteza specifică echilibrată a
constituenților celu lari, pornind de la substanțe nutritive simple aflate în mediul de cultură.
(ZARNEA, G. 1994)
Procesul de creștere a microorganismelor depinde în evoluția sa și de natura și concentrația
substanțelor nutritive în mediu, precum și de asigurarea cu energia n ecesară reacțiilor de sinteză,
specific, echilibrate, pornind de la substanțele nutritive din mediu, a unor compuși noi care sunt
asamblați pentru a forma copii fidele ale constituenților celulari. Specificitatea procesului este
determinată de intervenția unor mecanisme de control genetic. Pe de alta parte, procesul de creștere
depinde în evoluția sa de natura și concentrația substanțelor nutritive din mediu și de aprovizionarea
continuă a celulei cu energia necesară reacțiilor endotermice de sinteză ( MENCI NICOPSCHI
GH.,1987; TAPAI M., 2009)
Mărirea volumului celular se face atât prin sinteza de substanță organică cât și prin mărirea
conținutului în apă. Creșterea microorganismelor nu are loc indefinit, ci se întrerupe când se produce
diviziunea celulară.
Activitatea normală a microorganismelor este condiționată de existența unui anumit raport între
volumul celulei și suprafața ei, prin care se face absorbția substanței nutritive și eliminarea
cataboliților. În cursul creșterii celulei, raportul suprafață/vol um se modifică datorită faptului că, în
timp ce suprafața crește cu o relație pătratică, volumul ei se modifică cu o relație cubică, ceea ce
determină o diminuare relativă a suprafeței celulare, fapt ce îngreunează schimbul de substanțe și,

12
atunci când dis proporția dintre suprafață și volum atinge un anumit punct critic, se produce diviziunea
celulară.
În cadrul proceselor biotehnologice, studiul creșterii și multiplicării micro organismelor
producătoare are o importanță deosebită pentru eficiența tehnologi ilor industriale. Viteza de
multiplicare a bacteriilor este excepțional de mare. Durata unei generații este tipică pentru fiecare
specie, dar poate varia la aceeași specie în funcție de condițiile de mediu. Spre deosebire de
organismele pluricelulare la ca re multiplicarea celulelor duce la mărirea taliei individuale, la toate
celelalte organisme unicelulare ea are ca rezultat creșterea numărului de indivizi.
Procesul multiplicării populațiilor bacteriene cuprinde mai multe faze. Prima faza este faza de
lag sau latență și este cuprinsă între momentul inoculării microorganismului și momentul în care
celulele acestuia încep să se multiplice, perioadă care durează în medie câteva ore. În această fază,
numărul bacteriilor din inocul rămâne neschimbat sau chiar s cade temporar. Faza de latență apare ca o
perioadă de adaptare în noile condiții de cultivare în această perioadă bacteriile viabile din inocul își
acumulează în celulă metaboliții esențiali și sistemele enzimatice necesare creșterii.
La transvazarea inocu lului într -un mediu nutritiv inoculul bacterian care provine dintr -o cultură
aflată în curs de multiplicare și se transvazează un mediu nutritiv cu aceeași compoziție, multiplicarea
bacteriilor își menține în continuare ritmul, iar dacă bacteriile provin d intr-o cultură tot în fază
exponențială de multiplicare, dar se transvazează un mediu nutritiv cu altă compoziție, atunci ele au o
perioadă de adaptare. Durata perioadei de lag variază, în funcție de noile condiții de mediu pe care
microorganismele le găse sc la transvazare. Cu cât aceste condiții sunt mai apropiate de cele
anterioare, cu atât perioada de lag este mai scurtă.
Faza de multiplicare exponențială sau de creștere logaritmică este precedată de o perioadă scurtă
de accelerare a ritmului de creștere , în care multiplicarea se produce cu o viteză progresivă mărită.
După această perioadă, diviziunile sunt bine sincronizate, astfel încât numărul celulelor viabile se
dublează brusc și la intervale regulate.
Capacitatea de creștere exponențială se manifest ă numai o scurtă perioadă de timp. Tendința de
multiplicare rapidă scade progresiv, datorită epuizării substanțelor nutritive din mediu și acumulării în
el a produselor de catabolism în concentrații cu efect inhibitor.
În faza de log, celulele considerate a fi de tip embrionar au dimensiuni mai mari decât cele
specifice speciei de care aparțin, citoplasma lor este omogenă, nu conține materiale de rezervă și are o
mare afinitate pentru coloranții bazici, datorită conținutului ridicat în ARN . Perioada în care celulele
se afla în faza de multiplicare exponențială corespunde unor transformări permanente.
Spre sfârșitul fazei de multiplicare logaritmică apare perioada de postlog, în care are loc
încetinirea și sincronizarea creșterii populației bacteriene. În ace astă perioadă cultura tinde spre un
echilibru între diviziune și mortalitate.

13
Faza staționară reprezintă faza în care numărul celulelor viabile este maxim și rămâne constant
o perioadă de timp care durează de la câteva ore, la câteva zile, în funcție de s ensibilitatea bacteriilor
la condițiile de mediu.
Intrarea culturii în faza staționară este determinată, de obicei, de epuizarea substanțelor nutritive
din mediu sau de acumularea unor produși toxici. În această fază, celulele nu se mai multiplică, iar
numărul total al indivizilor populației este constant și egal cu numărul celulelor viabile. Celulele
bacteriene sunt considerate mature, având caracteristici morfologice specifice speciei: dimensiuni mai
mici decât în faza de creștere exponențială, citoplasma mai puțin omogenă datorită apariției de
incluzii și acumulării unor substanțe de rezervă, afinitate normală pentru coloranți și prezența sporilor
la speciile sporogene.
Faza de declin este reprezentată de scăderea progresivă a numărului celulelor viabile. Celulele
din această fază sunt bătrâne, apărând fenomene de involuție: celulele mici, sferice, deformate,
gigante sau ramificate, care se colorează slab, etc. În unele cazuri se produc fenomene de autoliză,
ceea ce determină scăderea numărului total de ce lule din mediu.
Creșterea unui microorganism se poate aprecia prin determinarea substanței uscate a masei
celulare a concentrației sursei de carbon din mediu; a numărului total de celule; a gradului de
turbiditate al suspensiei bacteriene într -un mediu lic hid, în raport cu o scară etalon sau la
fotocolorimetru (D.O.).
De regulă, pentru fiecare bacterie se determină creșterea densității optice (D.O.) pe parcursul
ciclului de dezvoltare și se reprezintă grafic în funcție de timp.
Biosinteza proteazelor bacter iene se realizează în mai mulți pași în contextul în care factorii de
mediu implicați în creșterea optimă a microorganismului pot fi diferiti față de cei solicitați în
producerea enzimei. Acești parametrii includ suplimentarea cu nutrienți, pH -ul mediului, relația
osmotică, gradul de aerare, temperatura și controlul contaminării în timpul fermentației, mai ales când
fermentația are loc în condiții aerobe.
Microorganismele sunt capabile să sintetizeze toți aminoacizii de care au nevoie folosind pentru
aceast a elementele nutritive sau diferiți intermediari metabolici. Aminoacizii pot fi elaborați pornind
de la anumiți precursori ce reprezintă intermediari ai unor căi metabolice. Reacțiile de transaminare în
cursul cărora un grup amino este transferat de la un compus la altul reprezintă una dintre modalitățile
de producere a aminoacizilor. Căile de biosinteză a aminoacizilor sunt variate și complexe,
presupunând mai multe etape intermediare, iar aminoacizi produși, întotdeauna sunt utilizati, deoarece
căile resp ective sunt reglate eficient prin două modalități: represie la nivel genetic și retroinhibiție
enzimatică.
În cazul represiei, produsul final al căii metabolice, aminoacidul, interacționează cu o proteină
represoare inactivă pe care o activează și, în felu l acesta blochează transcrierea genelor ce codifică

14
enzimele implicate în calea de biosinteză. Procesul de blocare durează până când nivelul produsului
final, aminoacidul, scade sub o anumită valoare, moment în care transcrierea este reluată. În privința
retroinhibiției enzimatice, aceasta este o modalitate de reglare mult mai rapidă și mai economică
pentru celulă, ea constând în blocarea căii de biosinteză prin inactivarea primei enzime a căii
respective în urma interacțiunii cu produsul finit al acesteia. Aminoacizii produși de celule sunt apoi
folosiți pentru sinteza unor proteine specifice, pe baza informației genetice proprii organismului
respective ( JURCOANE Ș.et al 2009)
Deși detaliile cu privire la procesul de fermentație adoptat de diferiți cercetăt ori variază, rămân
două metode principale pentru producerea proteazelor: procedeul fermentației submerse și procedeul
culturii de suprafață. (EL-SAFEY, E. M, 1994; TAPAI M., 2009)
Procedeul culturilor submerse s -a generalizat în prezent datorită faptului c ă la aceeași capacitate
de producție necesită ulilaje mai simple și o exploatare mai ușoară.
Utilizarea pe scară largă a proteazelor microbiene a determinat creșterea progresivă a interesului
față de aceste enzime. Numeroase cercetări au condus la obținere a acestora în stare de puritate
avansată, stabilirea parametrilor optimi de activitate și stabilitate, precizarea mecanismelor lor de
acțiune și la stabilirea structurii lor.
O serie de proteaze, cu precădere cele de origine bacteriană sunt obținute și com ercializate ca
preparate enzimatice utilizate în diferite sectoare industriale. Aria largă de utilizare practică este
determinată de avantajele pe care le oferă acest tip de preparate, respectiv viteze ridicate de cataliză,
specificitate, acțiune în condiț ii de pH, temperatură, presiune etc. aproape normale.
Obținerea cu regularitate a șarjelor de cultură cu conținut ridicat în proteaze depinde de starea
fiziologică a microorganismului utilizat ca inocul și de parametrii de biosinteză: pH, temperatură,
agitare, rată de aerare, durata cultivării, caracteristicile fizico -chimice ale mediului nutritiv
(POONAM N., DALEL S., 1995)
Variațiile temperaturii au efect asupra randamentului de transformare a substratului în produsul
dorit, asupra cerințelor nutritive al e microorganismului și compoziției biomasei obținute precum și
asupra vitezei de creștere microbiană.
Efectul temperaturii asupra creșterii microorganismelor se explică prin faptul că aceasta
afectează multe procese metabolice din celulă, precum și compoz iția biomasei în proteine, lipide și
conținutul de ARN al celulei. Este posibil ca structura lipidică a membranei celulare să se modifice
continuu în funcție de variațiile de temperatură, astfel încât membrana să -și mențină funcția
reglatoare. Valoarea pH -ului este, alături de temperatură, un parametru important în procesele de
biosinteză.
Microorganismele au un domeniu optim de pH pentru dezvoltare, în care viteza specifică de
creștere atinge valoarea maximă. Valoarea pH -ului influențează randamentul de co nversie a

15
substratului la un anumit produs. Formarea produsului dorit în urma procesului de biosinteză poate să
fie legată de desfășurarea bioprocesului într -un domeniu foarte strict de pH.
În timpul dezvoltării unei culturi microbiene apar deviații ale p H-ului de la valoarea considerată
optimă, care pot avea urmări nedorite asupra procesului de biosinteză. Aceste modificări se pot datora
fie consumării unui nutrient – sursa de carbon sau azot, fie producerii unui acid organic de către
microorganism. PH -ul acționează asupra caracteristicilor suprafeței celulei, modificând proprietățile ei
de aderare la diferite materiale (sticlă, metale) precum și cele de floculare.

16
CAPITOLUL II
CHAPTER II

SISTEME BIOCHIMICE DE DEGRADARE A PRODUSELOR DIN
PIELE NATURALĂ
BIOCHEMICAL SYSTEM OF LEATHER PRODUCTS
DEGRADATION

2.1 MODALITĂȚI DE DEGRADARE BIOCHIMICĂ A BLĂNURILOR

Enzimele catalizează reacțiile biochimice din organism, având un rol esențial în biosinteza și
degradarea substanțelor din materia vie, înt âlnindu -se în toate organismele vii, mai fiind denumite din
această cauză biocatalizatori, având rol în descompunerea macromoleculelor, de accelerarea
proceselor metabolice și coordonarea unor etape ale ciclului metabolic.
Acestea sunt substanțe de natură proteică și reprezintă macromolecule, compuse din lanțuri
polipeptidice, având o masă moleculară între 10.000 – 1.000.000 Da.
Enzima formează cu substratul un produs intermediar reactiv, cu o viață scurtă. Sub această
formă intermediară, substratul intrat în reacție suferă modificări electronice sub acțiunea centrilor
activi ai enzimei, rezultând produsul de reacție.
Enzimele proteolitice de origine microbiană sunt printre cele mai importante enzime obținute
folosind biotehnologii moderne, și au o deosebit ă semnificație datorită unei largi arii de aplicabilitate
în divese procese industriale.
Proteazele microbiene constituie un grup complex de enzime hidrolitice, care diferă prin
specificitatea de substrat, mecanismul de reacție, dependența activității enz imatice și stabilității de pH
și temperatură. Acțiunea lor poate fi blocată, activată, sau inhibată într -o anumită proporție de agenți
fizici, chimici sau biologici. Producția și caracteristicile acestora pot fi influențate prin selecția tulpinii
producăto are și alegerea condițiilor de cultivare ale acesteia.
Enzimele din această categorie hidrolizează majoritatea proteinelor comune, cum ar fi: cazeina,
hemoglobina, gelatina, albumina de ou, glutenul, proteina din soia și alte proteine vegetale și animale.
Condițiile de hidroliză precum și randamentul operației în sine depind, însă, de natura, caracteristicile
și gradul de puritate al preparatului enzimatic utilizat.

17
Numeroasele utilizări ale enzimelor proteolitice, în cele mai diferite domenii au determinat
demararea cercetărilor în vederea obținerii acestora pe cale biotehnologică, ținând seama în același
timp de avantajele pe care le oferă utilizarea microorganismelor ca sursă biologică, precum și de
proprietățile enzimelor microbiene
Peptidhidrolazele cun oscute și sub denumirea generală de enzime proteolitice, au capacitatea de
a cataliza scindarea hidrolitică a legăturilor -CO-NH- peptidice din proteine, polipeptide și
oligopeptide până la peptide de diferite mase moleculare sau chiar la aminoacizi, cu fi xarea
componentelor apei.
În funcție de provienența lor, hidrolazele peptidice pot fi de origine vegetală, animală sau
microbiană, produse de diferite bacterii, fungi, actinomicete, iar după locul în care își exercită
acțiunea, proteazele pot fi intracelu lare și extracelulare.
În ultimele decenii, aprofundarea informațiilor privind procesele și diversificarea mijloacelor
tehnice de cultivare a microorganismelor la nivel industrial, pentru obținerea de aminoacizi, enzime,
proteine, au determinat creșterea i nteresului pentru realizarea unor preparate enzimatice proteolitice
din microorganisme în special din bacterii și fungi.
Multe dintre microorganismele folosite la producerea de preparate proteolitice produc aceste
enzime extracelulare, ceea ce ușurează foa rte mult condițiile de prelucrare industrială pentru obținerea
de preparate enzimatice. Datorită acestui fapt, există în prezent tendința ca o serie de preparate
proteolitice de natură vegetală sau animală să fie înlocuite cu preparate proteolitice microbi ene care
sunt, în general, mai ieftine și de o mai mare diversitate.

2.2 MECANISMUL DE DEGRADARE A PRODUSELOR DIN PIELE
NATURALĂ

În celule reacțiile nu decurg izolat, ci organizat în secvențe multiple formând așa -numita cale
metabolică, în care produsul unei reacții servește ca substrat reacției următoare. Ca urmare, diferitele
căi se intersectează formând o rețea de reacții biochimice integrate și cu un scop final denumită
metabolism.
Metabolismul se studiază în mod obișnuit prin examinarea componentelo r acestuia. Fiecare
metabolism este compus din secvențe multienzimatice și fiecare enzimă, la rândul ei, poate exercita o
acțiune catalitică sau reglatoare. Harta metabolică conține căile centrale ale energeticii
metabolismului. Majoritatea căilor metaboli ce pot fi clasificate în căi catabolice sau degradative și căi
anabolice sintetice. Reacțiile catabolice degradează molecule complexe ca proteine, poliglucide și
lipide, la câteva molecule simple, de exemplu CO 2, NH 3 și H 2O. Calea anabolică formează produș i
finali complecși din precursorii glicoliza.

18
Metabolismul reprezintă totalitatea reacțiilor biochimice prin intermediul cărora
microorganismele preiau din mediu energie și nutrienți pe care ii folosesc la activitățile lor
fundamentale. Acești nutrienți r eprezintă elemente esențiale pentru viața celulei și se numesc
elemente biogene.
Substanțele din mediu sunt utilizate pentru producerea de energie, pentru sinteza de constituienți
celulari, pentru creșterea celulei și desfașurarea normală a activităților s ale fiziologice și pentru
producerea de metaboliți.
Metabolismul bacterian este realizat printr -o serie de căi metabolice, reprezentate de secvențe și
reacții chimice catalizate de enzime. Evoluția acestor căi metabolice este reprezentată de degradarea
substanțelor nutritive preluate din mediu cu eliberare treptată de energie și folosirea energiei eliberate
în procesele de biosinteză a constituienților celulari.
Căile metabolismului bacterian sunt reprezentate de căile catabolice care reprezintă ansamblul
căilor biochimice prin care se realizează degradarea nutrienților preluați din mediu cu eliberare de
energie.
Catabolismul reprezintă ansamblul de reacții de degradare ce asigură eliberarea elementelor
constitutive ale moleculelor și ale macromoleculalor și recuperarea unei mari părți a energiei
conținute de legăturile chimice ale compușilor folosiți. Biodegradarea microbiană constituie în plus
calea prin care în natură are loc reciclarea compușilor organici și anorganici. Biodegradarea completă
a unui subst rat până la constituenții săi anorganici poartă denumirea de mineralizare.
În fazele reacției catabolice macromoleculele nutrienților sunt degradate până la subunitățile lor
de constituție, adică de la proteine la aminoacizi, cu eliberare de aproximativ 1% din energia
nutrienților, care se pierde sub forma de caldură.
Moleculele rezultate în prima fază sunt degradate în continuare cu formarea unui număr limitat
de molecule mici ce reprezintă compușii intermediari ai căii centrale. Numărul acestor compuși
intermediari este diferit în funcție de tulpina bacteriană utilizată. În această etapă se eliberează 1/3 din
energia existentă în compușii respectivi.
Ultima fază a reacției catabolice este diferită în funcție de natura reacțiilor metabolice. În
aerobioză re acțiile evoluează cu metabolizarea completă a compușilor intermediari până la dioxid de
carbon și apă cu eliberare mare de energie înmagazinată apoi în ATP prin degradarea moleculelor
bogate în energie . Complex se desfășoară în trei etape: hidroliza, conve rsia și oxidarea acetil CoA.
Reacția de hidroliză este procesul de desfacere a unei legături chimice prin combinare
cu apa (H2O). Aceasta se realizează prin scindarea moleculei de apă în hidrogen și hidroxil ( -OH). În
acest fel sunt desfăcute în biologie prin procesele metabolice cu ajutorul enzimelor moleculele mari
de proteine , polizaharahide sau lipide în molecule mai mici monomere.

19
În oxidarea acetil CoA ciclul acidului citric este calea comună finală a oxidării moleculelor de
rezervă. Acetil CoA este oxidată la două molecule de CO 2 și patru perechi de protoni (H) care sunt
transferați la coenzimele NAD+ și FAD pentru producerea de NADH + H+ și FADH 2. Este generată și
o cantitate mare de energie din ATP, când electronii de la NAD H + H+ și FADH 2 sunt transferați la
oxigen în fosforilarea oxidativă.
Conversia și oxidarea acetil CoA reprezintă punctul de legătură catabolică și anabolică din
organism. Pornind de la acetilcoenzima A se pot sintetiza mai multe clase de
biomolecule. Catabolizarea unităților structurale cum ar fi monoglucide, aminoacizi etc. rezultate prin
hidroliză se face pe cale oxidativă, cu consum de oxigen. Din oxidarea acizilor grași rezultă cele mai
importante cantități de energie, dar oxidarea glucidelor decurge m ai rapid, fiind utilizată deseori de
către organismul animal pentru nevoile imediate de energie. Dioxidul de carbon și apa reprezintă
produșii finali ai oxidării acetilcoenzimei A în ciclul ATC (ciclul acizilor tricarboxilici) cuplat cu
catena de respirați e și fosforilare oxidativă. Dioxidul de carbon rezultă prin decarboxilarea unor acizi,
de exemplu acidul α -cetoglutaric în ciclul ATC. Apa rezultă în catena de respirație pornind de la
hidrogenul preluat de pe diferite substrate subformă de coenzime în sta re redusă (NADH, FADH 2) și
oxigenul molecular. Prin cuplarea catenei de respirație cu fosforilarea oxidativă, energia care rezultă
în procesulde formare al apei este înmagazinată în legăturile macroergice ale ATP.
Catabolismul generează, de asemenea, molec ule care sunt convertite în cărămizi de construcție,
necesare sintezei de molecule complexe. Pentru hidroliza moleculelor complexe în molecule mai
mici, acestea sunt degradate în molecule simple. De exemplu, proteinele sunt degradate în aminoacizi,
poliglu cidele în monoglucide și trigliceridele în acizi grași liberi și glicerol.
În etapa următoare moleculele mai mici, rezultate în prima fază, sunt degradate în continuare la
acetil CoA și o serie de alte molecule simple.
O altă cale a metabolismului bacteria n este reprezentată de anabolism, care se desfășoară în
sensul utilizării compușilor intermediari ai căii centrale pentru sinteza constituienților proprii celulei
bacteriene, proces care evoluează în faze succesive. În timpul procesului de anabolism se sin tetizează
macromolecule de depozit, adică polimeri uniformi, formați prin legarea unor monomeri în lanțuri de
diferite dimensiuni – într-o primă fază monomeri, în a doua fază diataxie – subunitățile constituie în
prima fază fiind așezate într -o ordine rigu roasă, dictată exact de informația genetică din genom.
Căile amfibolice sunt reprezentate de căile metabolice centrale, care îndeplinesc în același timp
și funcția de eliberare de energie și funcția de furnizare a unor precursori necesari biosintezei.
Căile anaplerotice sunt cunoscute ca fiind căi auxiliare sau de reaprovizionare, deoarece
compușii intermediari ai căilor centrale sunt în permanență îndepărtați din celulă, pe de -o parte în
cursul degradării progresive enzimatice, cu eliberare de energie în catabolism, iar pe de alta parte prin
utilizarea lor în diferite biosinteze ce au loc în celulă.

20
Căile metabolice auxiliare asigură completarea deficitului căilor metabolice principale, prin
aprovizionarea cu diverși compuși și permit funcționarea îndelu ngată a acestora.

2.3 DESCRIEREA SISTEMULUI ENZIMATIC IMPLICAT ÎN
DEGRADAREA BLĂNURILOR

Există reacții catalizate de o singură enzimă în celulă, însă majoritatea căilor metabolice au un
număr de etape intermediare, adică între substanța inițială ce urme ază a fi transformată și produsul
final iau naștere o serie de produși intermediari. Fiecare etapă intermediară este catalizată de o anume
enzimă, iar reacția în total este catalizată de un sistem enzimatic.
Într-un astfel de sistem nu toate enzimele au ac eeași importanță funcțională; cele care au rolul
principal se numesc enzime limitative sau enzime "cheie". Sistemul enzimatic este riguros coordonat,
etapele se succed într -o anumită ordine în așa fel ca produsul unei reacții să servească ca substrat
pentr u etapa următoare. Această succesiune de reacții trebuie să fie neîntreruptă deoarece blocarea
uneia conduce la blocarea întregului sistem. De asemenea, unii intermediari pot fi utilizați în alte căi
metabolice. Este necesară deci o coordonare cantitativă pentru fiecare sistem enzimatic.
Asupra mecanismului catalizei enzimatice s -au facut cercetarări prin studii cinetice și de
specificitate, prin analiza chimică a situsurilor active ale enzimelor și prin comparație cu ajutorul
difracției de raze X, a struc turii unor enzime și a complecșilor lor cu substraturi mici sau inhibitori
competitivi.
Cataliza enzimatică presupune existența a trei etape cum ar fi aproprierea și orientarea
substratului de situsul catalitic în așa fel încât legătura sa susceptibilă să fie în imediata vecinătate a
centrului catalitic activ al enzimei și se orientează față de acesta astfel încât starea de tranziție să fie
formată ușor. Enzima acționează prin încercarea de legare a substratului la centrul catalitic activ;
astfel, în zona situsului se creează o concentrație de substrat de cca 10 ori mai mare decât în restul
soluției și astfel viteza crește cu acest ordin de mărime.
T. C. BRUICE și colab. (1962) săi au arătat că aproprierea centrului catalitic activ de legătura
susceptibilă a substratului este o reacție favorizată de asistența anchimerică. Pe de altă parte, D. R.
STORM și D. E. KOSHLAND JR., 1971 au dezvoltat o teorie, postulând că funcția majoră a situsului
activ al enzimei este inducerea orientării orbitalilor și anume: orb italii substratului și ai centrului
catalitic se orientează într -o dispunere specifică, astfel încât complexul enzimă -substrat să treacă mai
ușor în starea de tranziție.
KOSHLAND (1972) a ajuns la concluzia că grupările funcționale ale situsului activ al enzimei
nu se află în poziție optimă pentru cataliză, atunci când acesta este liber; moleculele de substrat impun
acestora o conformație în care grupările catalitice au o poziție geometrică favorabilă formării stării de

21
tranziție. Este ceea ce se numește o adaptare indusă. Moleculele de enzimă sunt instabile în forma
activă și, în absența substratului, tind să revină la forma liberă.
Pentru formarea stării de tranziție unele enzime se pot combina cu substratul, formând un
intermediar covalent instabil, care se transformă repede în produși de reacție. În acest caz are loc o
cataliză covalentă. Având grupări funcționale capabile să doneze sau să accepte protoni, enzima poate
determina o cataliză generală – acidă sau bazică.
În cazul proteazelor, s -a demonstrat formarea unui intermediar covalent reactiv, care are o mare
posibilitate de a atinge starea de tranziție, permițând astfel substratului să învingă bariera energiei de
activare. Aceste enzime sunt clasificate în funcție de aminoacidul cu care reacționează substratul –
subclasele serinei, cisteinei, histidinei, lizinei. În subclasa serinei, gruparea hidroxil a restului de
serină participă la formarea unui ester intermediar, fie cu o grupare acil, ca în cazul chimotripsinei,
formând o acil -enzimă, fie cu o gr upare fosforică, ca la fosfoglucomutază, pentru a forma o
fosfoenzimă.
Pentru a avea loc cataliza nucleofilă, care se utilizează pe larg în sinteza compușilor biologic
activi, este necesar ca substratul să reacționeze mai rapid cu catalizatorul nucleofil decât ar reacționa
cu gruparea acil acceptoare finală; catalizatorul acilat astfel format trebuie, de asemenea, să
reacționeze mai repede cu acceptorul acil final decât cu substratul inițial; astfel formarea
intermediarului covalent poate coborî bariera en ergiei de activare a reacției prin implicarea
transferului grupării acil.
Enzimele pot induce tensiuni și distorsiuni în legătura atacată a moleculei de substrat, făcând -o
mai ușor degradabilă. Măsurătorile de rotație și cele efectuate prin metoda difracț iei cu raze X au
demonstrat că enzimele suferă schimbări de conformație în cursul actului catalitic. RICHARD și
colab. (1972) au demonstrat că lanțul polipeptidic al enzimelor este astfel pliat încât resturile de
aminoacizi care formează situsul catalitic activ sunt aduse într -o poziție foarte apropiată.
Există mai multe ipoteze referitoare la diferențele de conformație între enzima liberă și forma ei
combinată cu substratul. Una dintre acestea susține ca situsul catalitic activ al enzimei libere nu se
potrivește exact nici cu substratul, nici cu produșii lui, ci doar cu speciile caracteristice stării de
tranziție. Inducția deformează atât enzima cât și substratul, făcându -le să atingă starea de tranziție
mult mai repede.
Studiile de structură și mecanisme de acțiune al enzimelor proteolitice au demonstrat că acestea
urmează aceleași etape în acțiunea lor de hidroliză enzimatică a proteinelor, indiferent de
complexitatea structurală a proteinelor hidrolizate.
În general, prin degradarea aerobă a principalelo r categorii de macromolecule (proteine, glucide,
lipide, acizi nucleici) rezultă CO 2 și apă.

22
In unele situații, căile de degradare sunt complexe, microorganismele fiind capabile să
degradeze o gamă variată de compuși naturali sau de produși rezultați prin sinteză chimică.
În catabolismul glucidelor de obicei, microorganismele sunt capabile să utilizeze o gamă foarte
variată de compuși organici din mediu, între care glucidele ocupă un loc principal.
Glucidele ce pot fi degradate variază foarte mult, de la ce le simple, cum sunt glucoza, lactoza,
galactoza etc, până la cele complexe de tipul amidonului, celulozei, inulinei, compuși care nu sunt
capabili sa pătrundă în interiorul celulelor. În cazul acestor surse de carbon, pentru a putea fi utilizate,
este nece sar ca microorganismele să producă și să elimine în mediul extracelular enzime specifice
care să asigure degradarea compușilor pană la forme ce pot traversa învelișurile celulare. Cercetările
arată că microorganismele sintetizează proteine variate, unele c u funcții de enzime, altele cu funcții de
recunoaștere și legare a substratului, care interacționează între ele la nivelul suprafeței celulare și
formează complexe macromoleculare, denumite celulosomi, amilosomi etc, în funcție de natura
substratului compl ex degradat.
Amidonul și celuloza sunt cele mai răspândite poliozide din natură și sunt larg utilizate de către
microorganisme. Amidonul este o substanță de rezervă și este hidrolizat de diverse specii microbiene
care produc enzime de tipul amilazelor, iar celuloza este un compus cu rol structural pentru celulele
vegetale la care este constituentul fundamental al peretelui celular și este degradată de
microorganismele care sintetizează enzime de tipul celulelor.
Cele mai multe cercetări asupra căilor de uti lizare a glucidelor, mai ales a glucozei, au fost
descrise până în prezent patru căi principale diferite: calea Embden -Meyerhof -Pamas (calea
glicolizei); calea hexozomonofosfatului, calea Entner -Doudoroff și calea fosfocetolazei.
Primele două căi sunt func ționale atât în cazul bacteriilor și fungilor cât și în celulele animale, în
timp ce ultimele două sunt specifice doar bacteriilor.
Calea Embden -Meyerhof -Pamas (EMP) reprezintă calea majoră a metabolismului glucozei la
cele mai multe microorganisme; este o cale integral anaerobă ce cuprinde o serie de reacții enzimatice
prin care o moleculă de glucoză este degradată până la două molecule de piruvat, fără intervenția
oxigenului molecular. Primul intermediar al căii EMP este glucozo -6-fosfatul, compus care ap are și în
cazul altor căi metabolice. În cursul reacțiilor biochimice ale acestei căi doar 25% din energia
rezultată din degradarea glucozei este conservată în legaturi macroergice, restul fiind pierdută sub
formă de căldură.
Calea Embden – Meycrhof -Pamas s e întâlnește la bacteriile care produc fermentațiile
homolactică, propionică, butirică, acetonobutilică, la enterobacterii și la levuri în cursul fermentației
alcoolice. Unii dintre produșii finali ai fermentațiilor care se realizează pe calea EMP sunt com ponenți
esențiali ai alimentelor și băuturilor sau solvenți industriali sau combustibili.

23
În general, microorganismele care folosesc exclusiv această cale pentru catabolizarea glucozei
nu sunt capabile să se dezvolte pe medii de cultură simple, ele având n evoie de prezența factorilor de
creștere.
Calea hexozomonofosfatului (HMP) se mai numește și calea pentozofosfatului sau calea
Warbiirg -Dickens -Horecker, ea fiind folosită de microorgansime pentru utilizarea hexozelor,
pentozelor și a altor glucide. Aceast ă cale are două etape principale: calea oxidativă ce asigură
folosirea hexozelor și formarea ribulozo -5-fosfatului și calea neoxidativă care asigura conversia
pentozofosfaților la hexozofosfați. Trebuie remarcat faptul că această cale este interconectată c u calea
glicolizei, iar enzimele căii metabolice participă și la diferite reacții de biosinteză (a glucidelor, a unor
aminoacizi aromatici sau a unor vitamine).
Calea Entner -Doudoroff este întâlnită doar la anumite grupuri de bacterii, fiind absentă în caz ul
majorității bacteriilor Gram pozitive. Din acest punct de vedere, se consideră că bacteriile ce prezintă
această cale reprezintă o linie de evoluție separată față de restul bacteriilor. Si în acest caz, primul
intermediar este glucozo -6-fosfatul, iar în ultima etapă se obțin piruvat și aldehida 3 -fosfoglicerică.
Calea fosfocetolazei este prezentă doar la un grup limitat de bacterii, având o eficiență
energetică mică (se obține 1 mol ATP/mol glucoză catabolizată). Ea asigură utilizarea hexozelor și a
pentozelor de către bacteriile, fiind o variantă a căii HMP cu care are trei reacții în comun.
Cele patru căi menționate sunt strâns interconectate având în comun o serie de enzime și
compuși intermediari. Calea EMP este calea majoră de eliberare de energie (A TP), în timp prin calea
HMP se eliberează doar jumătate din cantitatea de ATP, comparativ cu prima. Calea ED întâlnită la
microorganismele strict aerobe este conectată cu calea HMP, dar poate funcționa și independent
deoarece pe parcursul său se poate form a piruvat.
Semnificația piruvatului este deosebită în cazul microorganismelor aerobe: el este oxidat
enzimatic formând acetil -CoA, compus intermediar cheie al ciclului acizilor tricarboxilici (ciclul
Krebs). Acest ciclu reprezintă calea de oxidare completă , aerobă, a glucozei, respectiv a acetatului
produs din glicoliză, din oxidarea acizilor grași sau a unor aminoacizi.
Pe parcursul ciclului Krebs și a căii glicolizei se produce atât energie cât și o serie de precursori
pentru biosinteze, motiv pentru care ele sunt incluse în categoria funcțiilor amfibolice. Deoarece
reacțiile producătoare de energie și cele producătoare de precursori au loc simultan, se produc pierderi
continue de acizi dicarboxilici care sunt compensate prin aportul altor căi metabolice, reacțiile
respective fiind de tip anaplerotic.
În cazul proteinelor, care sunt compuși organici cu masă moleculară mare și sunt formate din
aminoacizi legați între ei prin legături peptidice, degradarea lor presupune mai multe etape, cum ar fi
proteoliza c are este realizată prin intervenția unor enzime specifice, proteaze și peptidaze

24
(endopeptidaze și exopeptidaze), în final rezultând aminoacizi, precum și catabolizarea aminoacizilor
eliberați prin dezaminare, transaminare sau decarboxilare.
În funcție de specia microbiană examinată, echipamentul enzimatic proteolitic variază, astfel că
degradarea proteinelor se poate opri în diferite stadii sau se finalizează prin descompunerea
aminoacizilor. Majoritatea proteazelor acționează atât asupra proteinelor cât ș i a oligopeptidelor,
producând fragmentarea lanțului peptidic. Enzimele proteolitice se impart în două categorii principale
și anume proteinaze (numite și endopeptidaze) care scindează legăturile peptidice dintre anumiți
aminoacizi fie în mod nespecific, f ie specific și peptidaze (sau exopeptidaze) care clivează legăturile
peptidice fie de la extremitatea amino (aminopeptidaze), fie de la cea -COOH (carboxipeptidaze).
Reacțiile de decarboxilare sunt la originea formării CO 2 și a aminelor, dintre care unele,
putresceina și cadaverina, sunt extrem de toxice. Compușii volatili proveniți din procesul de
decarboxilare sunt responsabili de mirosul caracteristic de putrefacție. Prin procesul dezaminării se
produce amoniac, reacțiile respective fiind cuplate cu reac ții de decarboxilare. Reacțiile de
transaminare antrenează sinteza de noi aminoacizi prin transferul unui grup amino la un acid organic.
În interacțiunea dintre enzimă și substratul său, enzima participă cu o porțiune limitată din
structura sa. Pe această porțiune există grupări reacționale capabile să atragă și să fixeze molecula
substratului într -o poziție privilegiată și într -un loc strict determinat; ansamblul acestor grupări
chimice și al încărcărilor electrice constituie centrul activ al enzimei sau c entrul catalitic. Astfel,
centrul activ al unei enzime reprezintă ansamblul regiunilor funcționale ale enzimei, respectiv
ansamblul grupărilor chimice active care participă efectiv la reacția catalizată. În cazul enzimelor care
nu necesită pentru activitat ea lor catalitică prezența unui cofactor, acest centru activ este reprezentat
de o secvență de aminoacizi și este condiționat de configurația tridimensională a moleculei.
Eficacitatea centrului activ nu depinde numai de grupările funcționale ce se combină cu
substratul, ci de integritatea configurației moleculei proteice care determină pozițiile spațiale relative
ale acestor grupări funcționale. Acest fapt subliniază importanța structurii terțiare a proteinei pentru
activitatea enzimatică. Pentru acest tip de enzime centrul activ coincide cu zona, denumită situs
catalitic, unde se găsește secvența de aminoacizi implicați în activitatea catalitică. În cazul enzimelor
care conțin cofactori enzimatici, centrul activ include situsul catalitic și regiunea din mo leculă la care
este atașat cofactorul: centru activ = situs catalitic + cofactor
Enzimele diferă de catalizatorii neproteici prin una din cele mai remarcabile și caracteristice
proprietăți ale lor și anume specificitatea. Se înțelege prin specificitatea un ei enzime proprietatea sa de
a acționa preferențial numai asupra unui anumit substrat sau grup de substrate cu caractere chimice
comune. Specificitatea enzimatică se poate manifesta la nivelul tipului de reacție catalizată de enzimă
și la nivelul substratu lui. Specificitatea de reacție, de acțiune se manifestă asupra unui singur substrat
de către mai multe enzime, fiecare catalizând o anumită reacție. De exemplu, un α – aminoacid poate

25
constitui substratul de reacție pentru mai multe enzime care catalizează reacții diferite – însă specifice
– de transformare a sa în produși de reacție diferiți:
Fiecare enzimă manifestă o anumită specificitate de acțiune, catalizând un anumit tip de reacție
biochimică.
Specificitatea de substrat se referă la activitatea pe c are o manifestă enzimele față de anumite
substrate, iar gradul specificității de substrat variază foarte mult. Specificitatea absolută se referă la
faptul că unele enzime nu acționează decât asupra unui singur substrat fiind inactive față de alte
substanțe cu structură asemănătoare.
Specificitatea de grup o au enzimele care acționează asupra unei serii de substanțe apropiate ca
structură chimică. Astfel, pepsina nu atacă decât proteinele, dar toate tipurile de proteine, amilaza
atacă amidonul, dextrinele, g licogenul; hexokinaza catalizează fosforilarea unei serii de hexoze în
prezență de ATP.
Stereospecificitatea face referire la unele enzime au stereospecificitate față de izomeria cis –
trans. Astfel, fumaraza acționează numai asupra acidului fumaric și este inactivă asupra izomerului
său cis, acidul maleic. În cazul substanțelor optic active, enzimele manifestă o acțiune specifică față
de o anumită formă stereoizomeră a substratului; de exemplu, L -aminoacidoxidazele nu recunosc
decât L -aminoacizii iar pentru transformarea D -aminoacizilor este necesară prezența D -aminoacid –
oxidazelor. Unele enzime fac distincție între conformațiile α și β din legăturile glicozidice. Maltoza,
de exemplu, hidrolizează numai legătura (1→ 4) α glicozidică din molecula de maltoză , și nu atacă
legătura (1→ 4) β glicozidică din celobioză.
Mecanismul general de acțiune al enzimelor este cel al tuturor catalizatorilor și anume, intervin
numai în acele reacții care sunt posibile din punct de vedere termodinamic, nu modifică echilibrul
unei reacții, ci fac ca acest echilibru să fie atins mai repede și cantitatea lor rămâne neschimbată la
sfârșitul reacției. Enzimele au și ele aceste proprietăți, la care se mai adaugă natura lor proteică care le
conferă un grad mare de specificitate, acti vitatea enzimatică este supusă unui control și acest fapt are
mare importanță pentru reglarea metabolismului celular, micșorarea energiei de activare în reacția
respectivă ceea ce determină creșterea vitezei acesteia. În general, pentru ca o reacție să aib ă loc cu o
viteză apreciabilă, moleculele reactanților trebuie să fie activate. Energia de activare poate fi furnizată
de temperatură însă, în cazul organismelor vii, utilitatea ei este limitată. Enzima are capacitatea de a
coborî nivelul energetic care co ndiționează reacția, ceea ce permite moleculelor să reacționeze cu o
viteză apreciabilă în condiții în care în absența enzimei nu ar reacționa decât cu o viteză extrem de
mică.
Enzimele scad nivelul "energiei de activare" necesar ca o reacție să poată avea loc. Această
scădere a energiei de activare se datorează formării unui complex activat între enzimă și substrat care
apoi se transformă cu viteză mare în produși finali de reacție și enzimă, ultima fiind capabilă să se

26
combine cu o altă moleculă de substr at. Ipoteza formării complexului intermediar a fost emisă pentru
prima dată de MICHAELIS ȘI MENTEN, 1913. Reacția de formare a complexului enzimă -substrat
este reversibilă, constantele de echilibru fiind K1 și K2. La formarea complexului activat, substratu l
se fixează pe centrul catalitic al enzimei. Între centrul catalitic și molecula substratului există
complementarități conformaționale și chimice, ipoteza "lacăt -cheie", care permit asamblarea lor.

Figura 2.1 Schema modului de acțiune a enzimelor
Fig 2 .1 Scheme of the enzyme action
(https://en.wikibooks.org/wiki/Principles_of_Biochemistry/Enzymes )

Fixarea substratului pe enzimă îi imprimă acestuia o stare de tensiune molec ulară care are drept
consecință labilizarea lui și facilitarea reacției biochimice. Deci rolul complexului enzimă -substrat în
procesele de cataliză enzimatică este de a micșora energia de activare a reacției. Astfel, se consideră
că un substrat se poate tr ansforma în compus atât direct, fără enzimă, cât și prin cataliză enzimatică.
Prin șocuri se poate ajunge la energia Ea necesară pentru ca X, Y să dobândească o stare activată care
să-i permită trecerea în Z. Energia maximă Ea necesară transformării este e nergia de activare în
absența enzimei. În prezența enzimei însă, prin formarea complexului enzimă -substrat este nevoie de
o energie de activare mult mai mică pentru transformarea substratului. Energia eliberată în ambele
reacții este însă aceeași, ΔG.

27

Figura 2.2. Nivelele de energie ale moleculelor în cursul unei reacții fara enzimă (negru) și cu enzimă
(roșu)
Fig 2.2. Molecule energy level during reaction with enzyme (red) and without it (black)
(https://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/1/15/CatalysisScheme.png )

Studiile efectuate pe enzime proteolitice au relevat numai 4 mari tipuri de mecanisme catalitice,
cele implicând serin -proteazele fiind predominante. Aceste studii de structură și mecanism de reacție
au demonstrat că în cazul serin -enzimelor, indiferent de proveniența acestora fie animală sau
microbiană, mecanismul catalitic este același, cu toate că resturile de aminoacizi care intră în structura
situsulu i catalitic ocupă poziții diferite în secvența de aminoacizi în moleculele enzimelor mamifere
sau în cele de natură microbiană. Structura tridimensională este total diferită și totuși situsul catalitic
conține același număr și aceeași aminoacizi implicați în mecanismul de cataliză enzimatică.
Similitudinea funcțională este probabil consecința unei evoluții convergente independente. Proteazele
serinice și subtilizinele bacteriene, de exemplu, au ajuns la același mecanism de hidroliză, dar
independent, pentru că există un număr limitat de căi eficiente în mecanismul de scindare al
legăturilor peptidice.
Diferitele moduri de evoluție a procesului pot fi puse în evidență comparând structura și modul
de acțiune al chimotripsinei, enzimă pancreatică, cu cel al sub tilizinei, enzimă bacteriană.
Chimotripsina are o specificitate de substrat de reacție și de grup. Este selectivă pentru
legăturile peptidice de la capătul carboxilic al moleculei, atacând pe cele la care participă resturile de
tirosină triptofan, fenilal anină și metionină. Ea hidrolizează, de asemenea, legaturile ester.

28
Secvența aminoacizilor în jurul situsului catalitic activ este foarte diferită, structura
tridimensională este total diferită, însă situsul catalitic al subtilizinei conține o triadă cata litică
asemănătoare cu a chimotripsinei.
Resturile de aminoacizi din situsul activ au fost identificate prin metodele cunoscute: Ser -195 s –
a identificat cu diizopropilfluorofosfat (DIFP) care formează cu restul de serină un complex foarte
stabil. Toate pr oteazele aparținând acestei clase sunt inhibate de DIFP.

Figura 2.3. Reprezentarea grafică a triadei catalitice
Fig 2.3. Graphic representation of the catalytic triad
(http://stat ic.fastbleep.com/assets/notes/image/10362_1.jpg )

Rolul catalitic al His -57 a fost demonstrat prin marcare fină cu tosyl -α-
fenilalaninclorometilcetonă (TFCC):
Gruparea reactivă de clorometilcetonă produce alchilarea restului His -57, conducând la un
compu s complet inactiv, care poate fi izolat printr -o rupere a tuturor legăturilor peptidice ale enzimei.
Există trei considerente care arată că hidroliza exhaustivă indică faptul că His -57 face parte din situsul
catalitic activ:
– reacția este stereospecifică, întrucât izomerul D al TFCC este total ineficace;
– reacția este inhibată competitiv de p -fenilpropionat, care este cunoscut ca un inhibitor al
chimotripsinei;
– viteza de inactivare cu TFCC variază cu pH -ul în același mod ca și reacția necatalizată.
Meca nismul reacției enzimatice catalizate de chimotripsină demarează, așa cum s -a arătat
anterior, prin aproprierea și orientarea enzimei față de substrat în mod obișnuit, gruparea -CH 2-OH a
serinei nu este foarte reactivă și totuși în chimotripsină ea devine reactivă. La apariția substratului,
protonul de la hidroxilul serinei se prinde de histidină și sarcina (+) a histidinei este contracarată de
restul de aspartat care are doar rolul de a stabiliza histidină în starea de tranziții. Studiile cu raze X au

29
stabilit că în apropierea Ser -195 există un „buzunar― nepolar în care intră resturile aromatice și cele
voluminoase, orientându -se spre legătura cu Ser -195.
Hidroliza începe cu un atac al atomului de oxigen din gruparea OH a serinei asupra atomului de
carbon din gruparea carboxil a legăturii peptidice atacate a substratului. Legătura C=O se transformă
în legătură simplă cu oxigenul încărcat negativ C -O. Al patrulea atom care se va lega de carbon se va
aranja în tetraedru. Formarea intermediarului tetraedric di ntr-o grupare de amidă plană este posibilă
datorită legăturii de hidrogen formate între sarcina negativă a oxigenului și două grupări N -H din
catenele principale ale enzimei.
În primul stadiu, transferul protonului de la serină la histidină este ușurat de Asp care
neutralizează sarcina (+) a inelului histidinic. Protonul legat de histidină este donat grupării aminice
care, în timpul stării de tranziție, este legată de histidină printr -o legătură de hidrogen, în timp ce
componenta acil este legată de substra t; din acest motiv faza poartă numele de fază de acilare.
În al doilea stadiu, de acilare, o moleculă de apă ocupă locul aminei. Protonul provenit de la
H2O se leagă de histidină, iar (HO) format atacă atomul C din legătura ester -enzimă, formându -se din
nou intermediarul tetraedric.
Recent s -au efectuat studii privind stabilitatea intermediarului tetraedric. Prin alchilarea
chimotripsinei și tripsinei cu tosilfenilalanilclormetan marcat 1 -C13 fi 2 -C13 și obținerea de produși
de inhibiție a căror cinetică a putut fi studiată. S -a pus astfel în evidență caracterul nucleofil deschis al
grupării OH din Ser -195, iar modelul prezentat explică dinamica crescută a cationului imidazolic
Tripsina și elastaza enzime digestive din clasa serinproteazelor, sunt asemănăt oare
chimotripsinei sub câteva aspecte:
– aproape 40% din secvențele de aminoacizi din cele trei enzime sunt identice. Gradul de
identitate este chiar mai mare (60%) pentru resturile de aminoacizi situate în vecinătatea centrului
catalitic activ;
– studiil e cu raze X au arătat că structura lor tridimensională este similară;
– triada catalitică serină -histidină -aspartat este prezentă și în aceste serin -proteaze;
– restul de serină din triadă este modificat de DIPF și procesul de hidroliză a proteinelor este
anulat. Aminoacizii din jurul situsului catalitic activ sunt aceiași;
– toate trei enzimele au un mecanism catalitic identic. Triada catalitică si oxanionul din fiecare
enzimă conduc la formarea stării de tranziție tetraedrică;
– aceste enzime sunt secreta te de pancreas ca precursori inactivi și se activează prin scindarea
unei singure legături peptidice.

30
Cele trei enzime diferă doar prin specificitatea lor de substrat. Astfel, chimotripsina hidrolizează
resturile aromatice și voluminoase, tripsina hidroli zează resturile de uzină și arginină, elastaza
hidrolizează resturi puțin voluminoase ale unor aminoacizi monoaminocarbocilici, care nu pot disocia.
Din analiza cu raze X s -a constatat că ele diferă în ceea ce privește așezarea în „buzunarul― de
lângă rest ul de serină: chimotripsina are un „buzunar― alcătuit numai din resturi mici, nepolare, în
timp ce tripsina are, în locul unui rest de serină, un rest de aspartat, care poate forma cu lizina și
arginina legături electrostatice, iar elastaza conține un rest de valină și treonină care nu permit intrarea
în „buzunar― a resturilor voluminoase de aminoacizi.
In categoria enzimelor intracelulare sunt incluse enzimele care rămân cu biomasa, după
separarea lichidului de fermentație. Unele enzime se acumulează proba bil în periplasmă, astfel încât
în mediul de cultură se află cantități mici de enzime rezultate din ruperea pereților unui număr mic de
celule.
Majoritatea acestor enzime acționează asupra unor substraturi cu masă moleculară mică.
Aceasta se explică prin f aptul că numai substraturile mici pot pătrunde în celule și funcționează astfel
ca inductori ai enzimelor care le degradează. Spre deosebire de acestea, enzimele extracelulare
acționează, în general, asupra substraturilor cu masă moleculară mare.
Enzimele intracelulare se împart în două categorii: unele au o poziție centrală în metabolismul
organismului în creștere și se produc în cantități mari în biomasă, altele au un rol secundar, obscur și
se produc în cantități mici. Pentru utilizarea acestora din urmă în scopuri industriale, este necesară
imobilizarea lor, astfel încăt să fie economică și justificată folosirea lor.
Pentru ca o enzimă să fie economică, ea trebuie să aibă o activitate enzimatică minimă (de
aproximativ 100 UE/ml). De aceea, unele enzime c um sunt, de exemplu, penicilinacilaza,
glucozizomeraza, α -galactozidaza la care nu se atinge această valoare se imobilizează.
Producerea enzimelor intracelulare prin fermentație ridică unele probleme specifice.
Bioprocesul trebuie astfel condus încât pe p arcursul biosintezei să se evite spargerea celulelor. Dacă
se alege un mediu de fermentație în care activitatea enzimatică este distribuită atât în celule cât și în
lichidul de fermentație, izolarea și purificarea enzimei este dificilă.
Un alt aspect se re feră la stabilitatea enzimelor; unele enzime sunt stabile în mediul intracelular
și devin instabile în afara celulei.
Unul dintre dezavantajele procedeelor de obținere prin biosinteză a enzimelor intracelulare îl
constituie necesitatea eliberării acestora din celule, prin distrugerea membranei celulare, extracție și
ulterior separarea extractului de resturile celulare. În plus, enzimele sunt impurificate cu toate
proteinele intracelulare, chiar dacă enzimă dorită se află în proporție mare în totalul protein elor
extrase din celule. Un avantaj tehnologic al enzimelor intracelulare îl constituie faptul că extracția se
poate efectua cu un volum mic de soluție tampon, ceea ce conduce la obținerea unui extract brut cu

31
conținut mare în enzimă și nu mai este necesar ă concentrarea ulterioară a acesteia. În ansamblu, însă,
recuperarea enzimelor extracelulare este un proces mai avantajos și mai ieftin decât a celor
intracelulare.
AUNSTRUP (1980) a făcut o recenzie completă a enzimelor de fermentație extracelulare, cu
aplicații industriale.
Cele mai importante enzime microbiene extracelulare sunt, în general, hidrolazele care
acționează asupra substraturilor cu masă moleculară mare. Pentru microorganisme, este normal, din
punct de vedere fiziologic, să producă nutrienți d in polimerii biologici disponibili în mediul
înconjurător celulelor. Pentru a ataca mai ușor substraturile, microorganismele își produc singure
enzimele necesare hidrolizei acestora și uneori această producție de enzime este optimă chiar la
tulpinile sălba tice.
Enzimele hidrolitice produse prin fermentație și utilizate în cantități mari în industrie sunt
proteazele, amilazele și celulazele. Acestea sunt comercializate și utilizate în industria: detergenților,
alimentară și textilă.
Majoritatea enzimelor ext racelulare comerciale sunt utilizate la temperaturi de până la 100°C,
chiar dacă acestea, în general, sunt instabile în timp. Ele au, de asemenea, o toleranță limitată la pH.
La temperatura camerei sunt, în general, instabile dacă nu sunt condiționate în m od specific. Păstrarea
la 4°C conferă enzimelor o stabilitate în timp mult mai mare.
Pentru că producția unei enzime extracelulare utilizează în cea mai mare parte resursele
disponibile ale celulei, biosinteza și secreția unei astfel de enzime sunt supuse unui complex de factori
reglatori. În general, producția acestor enzime este indusă de niveluri reduse ale produșilor de reacție
ai polimerilor, iar uneori polimerii înșiși funcționează ca inductori. Alteori, compușii care nu sunt
substraturi pentru enzime , dar sunt înrudiți ca structură cu acestea, pot funcționa ca inductori. De
exemplu, producția de celulaze este indusă atât de lactoză cât și de celobioză. Producția acestor
enzime este, de asemenea, supusă represiei prin cataboliți. Atâta timp cât nutrien ții cu masă
moleculară mică sunt disponibili, celulele cresc fără să producă hidrolaze și abia la epuizarea
nutrienților începe biosinteza enzimelor hidrolitice extracelulare. Astfel, inducția și represia
biosintezei enzimelor sunt fenomene complexe ce au loc în concordanță cu condițiile de mediu în care
se găsesc celulele.

2.4 TEHNOLOGII DE DEGRADARE BIOCHIMICĂ A RESTURILOR DIN
PIELE NATURALĂ APLICATĂ INDUSTRIAL

Biosinteza proteazelor bacteriene este un proces intens aerob, microorganismul utilizat ca
producător al enzimelor are necesitați fiziologice deosebite pentru oxigen. Oxigenul insuflat odată cu

32
aerul sterilizat nu poate fi utilizat direct în faza gazoasă, ci numai ca oxigen solvit. Necesarul de
oxigen solvit depinde de microorganism și mai ales de faza de dezvoltare în care se află, intensitatea
maximă de respirație remarcându -se în timpul fazei logaritmice.
Aerația reprezintă un factor foarte important. Concentrația oxigenului dizolvat în mediu
influențând viteza și nivelul sintezei proteazelor la bacteriile aerobe. Pentru o sinteză maximă a
enzimelor proteolitice de către bacterii este nevoie de o aerație intensă. Necesarul de oxigen crește în
faza de lag din care cauză în această perioadă se mărește cantitatea de aer admisă în mediu. Regi mul
optim de aerație pentru fiecare microorganism se stabilește experimental.
Compoziția mediului de cultură, necesitățile nutriționale precum și para metrii de biosinteză se
stabilesc pentru fiecare microorganism în parte.
Inducerea sintezei enzimelor proteoliti ce în culturi de microorganisme este determinată nu
numai de compoziția mediului nutritiv, ci și de parametrii tehnologiei de cultivare (pH -ul mediului,
temperatură, conținutul oxigenului dizol vat în mediu, calitatea și cantitatea materialului biologic). PH-
ul mediului de cultură poate schimba direcția proceselor metabolice, sinteza și acumularea enzimelor
în culturi de microorganism.
Procesele aerobe microbiene necesită un continuu transfer al oxigenului dizolvat în mediul de
cultură. Problemele concomite nte ale transferului de masă și energie sunt de obicei, neglijate în
fermentatoarele de capacitate mică și cu densități joase ale celulelor microbiene, însă în procesele de
microbiologie industrială care utilizează bioreactoare, cu volumele între 20 și 200 l, și cu densități
mari de celule, transferul de oxigen trebuie luat în considerație. Productivitatea enzimatică cea mai
mare posibilă se obține într -un bioreactor, la o capacitate maximă de transport de oxigen, aceasta fiind
reflectată prin concentrații mici ale oxigenului dizolvat în timpul fermentației.
În bioreactor agitarea și injectarea aerului din compresor sunt utilizate pentru amestecarea
conținutului din vas și pentru transferul de gaze.
Agitarea este de asemenea un factor ce prezintă o anumită i nfluență asupra biosintezei
proteazelor bacteriene. Valori diferite ale agitării determină o distribuție un transfer diferit al aerului și
nutrienților către celulă.
Calitatea și cantitatea inoculului au un rol important în obținerea unor metaboliți cu vi teze și
randamente mari de biosinteză. Starea fiziologică a microorganismelor ce formează inoculul ca și
cantitatea acestuia influențează productivitatea enzimatică, fiind astfel necesară utilizarea unui inocul
standardizat.
Celulele vegetative bacteriene folosite ca inocul produc de patru ori mai multă protează decât
materialul sporulat. Există valori limită de vârstă și număr de celule care pot fi utilizate ca inocul la
însămânțarea mediilor de cultură pentru a produce enzime proteolitice cu activități ma ri. La depășirea
acestor limite se acumulează biomasă multă într -un timp scurt, dar neproductivă. Cantitatea de inocul

33
are influență asupra stadiilor ulterioare ale culturii, determinând diferite stări fiziologice ale celulelor,
funcție de care variază cap acitatea de biosinteză a proteazei. Masa minimă de inocul care permite
dezvoltarea culturii bacteriene depinde însă de compoziția substratului. Utilizarea unui inocul „mic‖
duce la prelungirea fazei de lag, în ciuda prezenței celulelor viabile, făcând inef icient bioprocesul. In
general, masa de inocul pentru biosinteză proteazelor este de maximum 5% față de mediul de cultură,
cu aproximativ 105 cel/ml.
Unii autori recomandă introducerea în trepte a inoculului. Prin inocularea în trepte se scurtează
durata c ultivării cu aproximativ 5 ore, iar activitatea proteolitică crește cu 50%.
Biosinteză proteazelor neutre și alcaline este realizată de colonii care sporulează intens. De
remarcat este faptul că, interdependență între natura proteazelor biosintetizate pe p arcursul
fermentației și profilul de pH al mediului. Ținând cont de acest fapt pentru a obținere purificarea
proteazelor neutre, fermentația a fost întreruptă în momentul în care valoarea pH -ului a scăzut la 5,5
(de obicei după 48 de ore de cultivare).

34
CAPITOLUL III
CHAPTER III

EXPERIMENTE PRIVIND STABILIREA CONDIȚIILOR OPTIME
DE CULTIVARE IN VITRO UNOR SPECII DE
MICROORGANISME PROTEAZICE

PURPOSE AND OBJECTIVES OF RESEARCH. MATERIALS AND
METHODS FOR ESTABLISHING THE OPTIMUM CULTIVATION
IN VITRO CONDIT IONS FOR PROTEASES MICROORGANISM
SPECIES

3.1 SCOPUL ȘI OBIECTIVELE CERCETĂRII

Scopul prezentei lucrãri este acela de izolare a unor microorganisme capabile să degradeze
deșeurile din industria pielăriei, de optimizare a mediilor de cultură bacterien e specifice, de obținerea
enzimelor pentru biodegradarea deșeurilor din industria pielăriei și de obtinere a unui hidrolizat care
sa poată fi utilizat cu succes ca biofertilizator pentru culturile de cereale și leguminoase.
Obiectivele propuse în această l ucrare se referă la:
– izolarea, selecția, caracterizarea, identificarea și testarea microorganismelor cu eficiență în
degradarea accelerată a deșeurilor din industria pielăriei;
– experimentarea biodegradabilității principalelor componente ale articolelor de blană
naturală tăbăcită cu crom;
– obtinerea enzimelor specific pentru biodegradarea deșeurilor din industria pielăriei
– obtinere a unui hidrolizat care sa poată fi utilizat cu succes ca biofertilizator pentru
culturile de cereale și leguminoase.

Experiment ele s -au desfășurat în condiții de laborator, în cadrul Facultății de Biotehnologii
aparținând Universității de Științe Agronomice și Medicină Veterinară București

35
3.2 MATERIAL BIOLOGIC TESTAT

Materialul biologic testat a constat în trei tulpini bacteri ene ce au fost izolate în urma degradării
unor resturi de blană și piele tăbăcite cu crom, provenite de la Institutul de Pielărie București.

3.3 ANALIZE EFECTUATE ÎN LABORATOR PENTRU
DETERMINAREA UNOR ÎNSUȘIRI CALITATIVE ALE PRODUSELOR DIN
PIELE ȘI BLANĂ NATURALĂ

Pentru realizarea experimentelor de biodegradare a proteinelor au fost testate mai multe tipuri
de blană și piele tăbăcite cu crom provenite din sectoarele industriale.
S-au luat în lucru bucați de piele și blană naturală de oaie, tăbăcite cu cro m, precum și bucăți de
piele și blană ecologică, materiale ce au fost puse la dispoziție de către Institutul de Pielărie București.

3.3.1 Materiale utilizate în experimentele de laborator

Pentru screeningul microorganismelor a fost luată în considerare i zolarea acestora din mediile
naturale.

3.3.2 Medii de cultivare a tulpinilor izolate

În vederea screeningului a fost utilizat un mediu minimal în care au fost adăugate ca unică sursă
de carbon 1cm2 blană/piele de ovină.
NH 4Cl 0,5 g/l
NaCl 0,5 g/l
K2HPO 4 0,3 g/l
KH 2PO 4 0,4 g/l
MgCl∙6H 2O 0,1 g/l
ph-ul mediului a fost ajustat la 7,2.

Pentru pregătirea inoculului de microorganisme a fost utilizat apă distilată, sterilizat timp de 20
minute la 121°C.
Microorganisme utilizate au fost izolate din mediu natural .

36
Au fost recoltate probe reprezentative din sol în care a fost lasate la descompus bucați de blană
și piele naturale și sintetice.
Inoculul din proba de sol a fost preparat din 10 g de sol în amestec cu 90 ml apă distilată.
Testarea biodegradabilității s -a făcut în baloane Erlenmayer în care au fost repartizate 50 ml de
mediu minimal în care s -a adăugat ca unică sursă de carbon 1% blană / piele de ovină. Mediul a fost
inoculat cu 1 ml inocul din proba de sol.
Probele de sol și bacteriile au fost cultivate la 35oC timp de 7 zile la 135 rpm.
A fost urmărită calitativ (vizual) și microscopic degradarea celor două componente (blana și
pielea).
În procesele biotehnologice mediul de cultură are o mare importanță asupra reproductibilității și
eficientei tehnologi ei. Marirea capacitații de producere a enzimelor proteolitice folosind tulpini înalt
producătoare se poate îmbunătăți prin studierea compoziței mediului de cultură a parametrilor de
cultivare.
În ceea ce privește compoziția mediului de cultură se poate spu ne că nu întodeauna un mediu
care asigură o dezvoltare a microorganismului este favorabil și pentru sinteza enzimei sau a sistemului
enzimatic dorit.
Compoziția optimă a mediului de cultură se stabilește pornind de la un mediu de bază, de obicei
sintetic, care servește ca martor și la care se variază apoi diferitele componente – sursa de carbon,
sursa de azot, fosfor, factorii de creștere și microelemente ( TAPAI M., 2009)
Dintre substanțele care intră în compoziția mediului nutritiv acțiunea cea mai eficace asupra
sintezei proteazelor o manifestă glucidele. Acestea pot fi folosite atât sub formă de polizaharide cât și
ca monozaharide. Concentrația amidonului și a produselor de hidroliză din mediu poate varia de la 0,1
la 15%, în funcție de specia microorgani smului.
În ceea ce privește sursa de azot, pentru cultivarea tulpinilor producătoare de proteaze se
folosesc azotul din proteine și produsele lor de hidroliză – peptide și aminoacizi. O serie de autori au
stabilit că introducerea în mediu a aminoacizilor f avorizează dezvoltarea microorganismelor și induce
biosinteză proteazelor. Astfel, efectul cel mai puternic inductiv îl posedă leucina, pe când asparagina
reprimă complet biosinteza, iar arginina, serina, prolina induc parțial sinteza enzimei. O acțiune
stimulatoare asupra sintezei proteazelor o au și vitaminele tiamină, biotină, acid folic, nicotinamidă.
Pe lângă sursele de carbon, azot, aminoacizi, vitamine și microelementele, cum ar fi Ca, P, Mn,
Fe, K, Mg, introduse în mediu sub formă de săruri în difer ite concentrații pot influența biosinteza
proteazelor. Astfel, calciul joacă rol de tampon și stabilizează enzimele proteolitice la temperaturi
ridicate. Se presupune că ionii de calciu favorizează și sinteza enzimelor proteolitice alcaline,
înlesnesc elim inarea acestora din celule și joacă un rol important în formarea sporilor.

37
În afara compoziției mediului nutritiv un rol important îl joacă și condițiile de cultivare a
microorganismelor: pH -ul influențează procesele metabolice, sinteza și acu mularea dife ritelor enzime,
unde producătorii de proteaze neutre și alcaline se dezvoltă bine la valori neutre și slab alcaline de pH,
temperatura s -a dovedit foarte importantă pentru creșterea și dezvoltarea microorganismelor
mezofile, temperatura variază între 35 ș i 40°C, iar pentru cele termofile între 45 și 60°C, aerația și
proporția mate rialului de însămânțare. Condițiile acestea sunt strict specifice fiecărui micro organism,
iar studiul lor permite dirijarea biosintezei enzimelor proteolitice.
Alți factori impo rtanți pentru procesul de biosinteză enzimatică sunt: fiziologia producătorilor,
formula de mediu nutritiv și condițiile de cultivare.
Pentru biosinteza proteazelor procedeul de cultivare submers este cel mai mult folosit. Acest
procedeu necesită instalați i care permit o amestecare perfectă a componentelor solide, lichide și
gazoase ale mediului de biosinteză, o alimentare adecvată cu aer, fiind echipate cu aparatură de
măsură și control.
O sinteza cu randament mare a unei enzime proteolitice are loc atunci când în mediu de cultură
se găsesc în concentrații optime toate componentele care participa la sinteza enzimei.
În cazul enzimelor induse, prezența inductorului în mediul de cultură este absolut necesară
pentru obținerea unei activități enzimatice crescut e. Ca inductor funcționează substratul, dar aceasta
funcție poate să o îndeplinească și alte substanțe înrudite cu acesta. Formarea și acumularea în
cantități mari a proteazei în mediul de cultură este conditionat de prezenta cazeinei care, în afara de
funcția de sursă de carbon, îndeplinește și funcția de inductor ( WOLFGANG GERHARTZ, 1990).
O substanță poate să îndeplinească funcția de inductor al unei enzime, numai atunci când
difuzează prin membrana microorganismului pentru a putea participa la biosintez a enzimei.

3.3.3 Obținerea materialului biologic

Pentru a obține o tulpină activă pentru producătoare de proteaze, o primă etapă o reprezintă
izolarea și, ulterior, identificarea unor specii de micoorganisme cu o capacitate ridicată de biosinteză a
enzim elor proteolitice. Indiferent de genurile sau speciile cărora le aparțin, microorganismele izolate
și identificate trebuie să posede anumite caracteristici generale, care să permită desfășurarea ritmică
și, mai ales, reproductibilă a acestor procese de bio sinteză enzimatică.
Etapa de izolare a microorganismelor proteolitice s -a efectuat prin compostarea unor fragmente
de piele și blană tăbăcită cu crom provenite de la Institutul de Pielărie București.
Pentru izolarea și identificarea bacteriilor cu activit ate proteolitică, bucăți de blană cu piele
tăbăcită cu crom, provenind de la diferite tipuri de animale au fost lasate la compostat în sol cu pH 7.2
timp de 3 luni.

38

Ziua 1 Ziua 30

Ziua 60 Ziua 90
3.3.1.Evoluția pro cesului de compostare pentru blana naturală
3.3.1.The evolution of natural fur degradation

Ziua 1 Ziua 30

Ziua 60 Ziua 90
3.3.2 Evoluția procesului de compostare pentru blana sintetică
3.3.2 The evolution of synthetic fur degradation

39

Mediul de cultivare utilizat a fost un mediu simplu format din NaCl 0.5%, CaCO 30.5%,
K2HPO 4 0.35%, având un pH 7.2. Mediul obținut a fost sterilizat timp de 20 de minute la 121oC și o
presiune de 1.1 atm.
În pahare Erlenmeyer de 100ml au fost introduse câte 40 ml mediu simplu și 1 cm2 de blană
compostată din fiecare tip.
Probele au fost incubate 24h la temperatură de 35oC și o agitare de 135 rpm. După incubare, în
același mediu fragmentele de blană compostată au fost înlocuite cu fragmen te de blană necompostată,
tăbăcită cu crom și lasate la incubat timp de 7 zile la 135 rpm și o temperatură de 35oC.
După perioada de incubare s -a făcut o diluție de 10-1, apoi s -au inoculat prin inundare plăci Petri
cu geloză agarizată (peptonă 1g%, extrac t de carne 1g%, NaCl 0,5g%, agar 2g%).
Punctul de plecare al metodologiei de selecție a microorganismelor în stare pură, îl reprezintă
metoda izolării preliminare a microorganismului respectiv, prin prelevarea unei probe de analiză și
inocularea acesteia pe o suprafață bine delimitată a unui mediu nutritiv solidificat. Pentru realizarea
diseminării acestor celule se procedează diferențiat, în funcție de consistența probei respective,
precum și de densitatea celulelor prezente în proba de cercetat (M. PETRE , 2001).
Pentru izolarea coloniilor s -a utilizat metoda diluțiilor successive.
Astfel, probele cu densitate celulară mare se diluează, în mod adecvat, în timp ce restul
probelor, care prezintă o densitate mică de celule, sunt diseminate prin tehnica "epui zării" ansei sau
prin tehnica diseminării pe suprafața mediului nutritiv sau, chiar, prin încorporare în masa acestuia.
Coloniile, rezultate după o anumită perioadă de incubare sunt inoculate în mediul nutritiv lichid sau
solid, cu respectarea precauților modului de lucru aseptic (ZARNEA, 1994).
Pentru izolarea speciilor de microorganism proteolitice a fost utilizat mediul tip PCA (plate
count agar), numit și SMA (standard method agar), MAP (milk agar plates), mediu cu amidon, CMC
și mediu cu Tween 80.
Testarea izolatelor pentru producția de protează a fost facută pe placi Petri ce conțineau mediu
(g%) cu PCA (triptonă 0.5%, glucoză 0.1%, extract de drojdie 0,25%, agar 2%, pH 7.2, cu adaos de
1% caseină), pentru amilaze 1% amidon (triptonă 0.5%, amidon 1%, extract de drojdie 0.25%, agar
2%, pH 7.2), pentru celulaze cu CMC (carboximetilceluloză), (triptonă 0.5%, CMC 0.1% extract de
drojdie 0.25%, agar 2%, pH 7.2) și geloză agarizată cu Tween 80 (peptonă 2%, extract de carne 1%,
NaCl 0.5%, agar 2% și Tween 80 0.1%).
În jurul coloniilor testate a fost observat un halou opalescent.
Din cele 90 de tulpini bacteriene izolate au fost selectate 3 dintre acestea și anume DA7, DA10,
DA13. Coloniile cu cel mai bun potential (diametrul haloului mai mare) au fost trecute pe geloză
agarizată și depozitate la 4oC.

40

Figura 3.3.3. Testarea microorganismelor selectate, producătoare de enzime proteolitice
Fig. 3.3.3. Testing the selected microorganisms that produce proteolitic enzymes

În urma izolarii s -a utilizat un loop in oculat în mediu minimal (NaCl 1g/L, CaCl 0.05 g/L,
KH 2PO 4 0.7g/L, MgSO 4 0.9g/L, K 2HPO 4 2,38 g/L, sucroză 3g/L, 0.6 g piele marunțită) în pahare
Erlenmyer de 200 ml, incubate timp de 7 zile la 35oC, la 135 rpm, observandu -se activitatea
microbiană la 600 nm (valorile fiind cuprinse intre 0.183 și 1,213 µmoli față de martor 0.179 µmoli).
În urma acestui proces a fost determinată activitatea proteolitică, lipolitică, colagenazică,
amilolitică și keratinolitică.
Tulpinile izolate au fost repartizate în eprubete în mediu înclinat și în plăci Petri în care a fost
repartizat în prealabil mediu cu geloza agarizată.
Pentru întreținerea culturilor pure, astfel izolate, s -a utilizat mediul cu geloză agarizată, având
următoarea formulă:
– peptonă 1g%
– extract de carne 1g%
– NaCl 0.5g%
– Apă distilată 100ml
– Agar 2g%

Selecția tulpinilor bacteriene izolate care au prezentat un potențial proteolitic ridicat, fost
efectuată prin cultivarea coloniilor izolate pe medii nutritive care au prezentat următoarea compoziție:

41
Mediu minimal:
– NaCl 1g/l
– CaCo3 0.05g/l
– K2HPO 4 2.38g/l
– KH 2PO 4 0.7g/l
– MgSO 4 0.9g/l
– Glucoză 3g/l
– Piele 0.6g/l
– pH 7.2

Mediul Luria Bertani:
– Triptonă 10g/l
– Extract de drojdie 5g/l
– NaCl 10g/l
– pH 7,2

Tulpinile astfel izolate s -au întreți nut prin trecere la intervale de 1 lună prin cultivarea pe medii
solidificate în placi Petri, utilizând medii de tip CMC, PCA, MAP și geloză agarizată și au fost
utilizate ulterior la testarea biodegradabilității produselor din blană naturală.
Din fiecare tulpină selectată s -a preparat un inocul folosit la degradarea probelor de blană
mărunțită folosind ca unică sursa de carbon și azot bucățile de blană.
Culturile au fost menținute timp de 24 -48 de ore la o temperatură de 35oC, pH de 7,2.
S-au făcut experim entări pentru stabilirea perioadei optime de cultivare a tulpinilor microbiene
selecționate.
În etapa selecționării tulpinilor microbiene a fost evidențiată degradarea accelerată a
eșantioanelor de blană utilizate, pentru care s -a determinat cea mai activi tate proteazică.
Pentru a obține rezultate cât mai bune în ceea ce privește capacitatea de acțiune a complexelor
enzimatice sintetizate de tulpinile microbiene a fost realizat un experiment pentru stabilirea unei
perioade optime de cultivare a acestora, as tfel încât să prezinte randamentul maxim.
Tulpinile microbiene constând în tulpini bacteriene nou izolate, notate DA7, DA10, DA13 au
fost cultivate pe mediu minimal, în care sursa de carbon și azot a fost reprezentată doar de eșantioane
de piele și blană n aturală.
Compozitia mediului de cultura (exprimata in g/L) utilizat a fost urmatoarea: NaCl 1 g; CaCl 2
0,05 g; KH 2PO 4 0,7 g; Sucroza 3 g; MgSO 4 0,9 g; K 2HPO 4 2,38 g.
Activitatea complexului enzimatic a fost testata periodic, timp de 7 zile.

42
3.3.3.1 Descri erea coloniilor izolate identificare

Coloniile formate au fost majoritatea de culoare alb lăptos, punctiforme, cu un diametru cuprins
între 0,1 -10 mm, cu formă regulată la suprafața mediului și colonii galbene, punctiforme cu margini
neregulate, având un diametru cuprins între 0.1 – 0.5 mm, la suprafața mediului.

3.3.3.2 Sursa de azot și carbon

Mediile de cultură utilizate pentru biosinteza enzimelor proteolitice trebuie sa conțină în diferite
raporturi optime sursa de carbon și sursa de azot care pot juc a rol de inductor al enzimei, precum și
precursori, cofactori și microelemente.
Pentru îmbunatățirea creșterii culturii și sporirea producției de enzimă este necesară prezența în
mediul de fermentație și a altor elemente cum ar fi calciu, magneziu, potasiu , sodiu, precum si a unor
oligoelemente magneziu și zinc.
Proprietățile fizico -chimice ale mediului de cultură care pot influența biosinteza proteazelor
bacteriene, randamentul și calitatea enzimelor recuperate sunt vascozitatea mediului de cultură
influen țează consumul de energie necesar agitării mecanice, capacitatea de tamponare, viteza de
flitrare.
Substanțele proteice conferă mediului de cultură o capacitate tampon ridicată excluzând
necesitatea corectării pH -ului la valori optime în timpul biosintezei .
Creșterea vâscozității mediului de cultură are ca efect o scădere accelerată a ratei transferului de
oxigen, producând perturbări importante ale procesului de biosinteza în condițiile utilizării germenilor
aerobi.
Viteza de filtrare a mediilor de cultură după biosinteza enzimelor este un alt factor important în
faza de prelucrare pentru obținerea preparatelor enzimatice purificate. Însăși calitatea enzimelor
recuperate este condiționată de compoziția mediului de biosinteză
Celula microbiană, datorită vol umului ei redus, este extrem de sensibilă la variațiile locale ale
parametrilor procesului de biosinteză, în special la variațiile concentrației de substrat. Mărirea
concentrației de substrat în mediul de cultură poate conduce la sporirea numărului de celu le
microbiene, dar numai până la anumite limite, multiplicarea acestora fiind încetinită de procese de
inhibiție care au loc la nivelul celulei.
Acțiunea unui factor inhibitor asupra celulei microbiene se poate exercita prin modificarea
potențialului chimi c al substratului, intermediarilor meta bolici sau a produsului finit; a permeabilității
peretelui celular și reducerea transportului substanțelor nutritive; a activității enzimelor implicate în
procesul metabolic; poate duce la disocierea agregatelor meta bolice; la modificarea parametrilor

43
funcționali ai celulei microbiene, capacitatea de multiplicare, mobilitatea, biosinteză unor metaboliți,
iar m ecanismele prin care se realizează inhibiția sunt reacția chimică cu una sau mai multe
componente celulare; adsorbția sau complexarea unor enzime sau coenzime; intervenția în secvențe a
reacțiilor biochimice; intervenția în disocierea complexelor enzimatice; modificarea parametrilor
fîzico -chimici ai mediului de biosinteză, pH, tărie ionică, constanță dielectrică, capacitate de solvatare
și intervenția în funcțiile celulare de control.
Datorită acestor fenomene, concentrații mari de substrat inhibă dezvoltarea microorganismelor
într-un anumit grad ajungând chiar la inhibiție totală. Din acest motiv, pentru un siste m de biosinteză
se stabilește concentrația optimă a substratului atât în momentul inițial cât și pe parcurs.

3.4 METODELE DE ANALIZĂ ȘI CONTROL FOLOSITE PENTRU
DETERMINAREA ÎNSUȘIRILOR CHIMICE ALE PRODUSELOR DIN PIELE
ȘI BLANĂ NATURALĂ.

3.4.1 Optimizarea pH-ului și temperaturii de dezvoltare a tulpinilor izolate

Studiul cineticii unei enzime reprezintă studiul activității ei catalitice realizat prin determinări
cantitative ale vitezei de reacție. Dintre factorii care influentează comportarea cinetica a e nzimelor
amintim pH -ul și temperatura mediului de reacție, prezența unor activatori sau inhibitori în mediul de
reacție.
Activitatea enzimelor depinde foarte mult de activitatea termodinamică a ionilor de hidrogen,
adică de pH -ul soluției. Cele mai multe e nzime au un pH optim la care activitatea lor este maximă;
deasupra sau sub acestui pH, activitatea lor scade.
În general viteza reacțiilor catalizate enzimatic crește cu temperatura, în intervalul de
temperatură în care enzima este stabilă și își păstrează întreaga activitate. Temperatura optimă nu
poate fi însă exact definită, căci ea variază în limite largi, cu concentrația enzimei, cu concentrația
ionilor de hidrogen și cu prezența diferitelor impurități ale preparatului enzimatic sau ale substratului.
Tulpinile bacteriene utilizate în experimentări au fost testate la diferite valori de pH între 5,5 și
8,5 și temperatură între 10 și 70oC pentru stabilirea ecologiei tulpinilor bacteriene isolate și
optimizarea proceselor biotehnologice.

3.4.2 Condiții de cultivare a tulpinilor selecționate

Studii recente referitoare la monitorizarea proceselor de degradare a blănurilor naturale, sub
acțiunea microorganismelor cu potențial proteolitic ridicat, au relevat importanța interacțiunilor dintre

44
factorii biotici și abiotici, aparținând unui anumit ecosistem de tip predominant microbiotic. Astfel,
uriașa diversitate a comunităților de microorganisme, existente într -un anumit habitat, poate fi
explicată, îndeosebi prin acțiunea selecției determinate de compoziția an umitor substraturi, precum și
de concentrația acestora (ZARNEA, 1994).
Spre deosebire de alte organisme superioare din punct de vedere evolutiv, care posedă o
capacitate limitată de adaptabilitate și care nu suportă modificări ale condițiilor de mediu, ce depășesc
anumite limite de toleranță pentru temperatură, pH, concentrație de nutrienți și săruri minerale,
speciile de microorganisme se acomodează, cu mare ușurință, la condiții de mediu nou create, foarte
diferite de cele existente inițial, fără modifică ri semnificative ale vitezei și ratei lor de creștere și
multiplicare (ZARNEA, 1994)

3.4.3 Parametrii de cultivare a tulpinilor selecționate

– Raport de inoculare 1:10
– Temperatură 35oC
– pH-inițial 7,2
– Agitare 135 rpm
– Timp 120 ore

Variația parametrilor bioc himici pe parcursul bioprocesului
Pe toata durata procesului tehnologic au fost recoltate probe din 24 in 24 de ore în condiții
aseptice și s -au determinat:
o Menținerea purității culturii microbiene de dezvoltare a acesteia
o Acumularea biomasei microbiene (D .O. 600 nm)
o Substanța uscată
o Carbonul organic
Biomasa a fost centrifugată și liofilizată. Produsul a fost caracterizat prin următoarele analize:
o Determinarea proteinelor
o Determinarea lipidelor
o Determinarea keratinei
o Determinarea colagenului
o Determinarea am idonului

45
3.5 METODE DE ANALIZĂ ȘI CONTROL A MATERIILOR PRIME
UTILIZATE ÎN EXPERIMENTELE DE LABORATOR

Metoda inoculării pe un mediu minimal poate fi aplicată pentru selecția naturală a tulpinilor cu
potential specific.
Pentru izolatele selecționate, inoc ularea s -a realizat în baloane Erlenmeyer de 200 ml conținând
mediu minimal, sterilizat în prealabil la 121oC având următoarea compoziție:
– NaCl 1g/l
– CaCo3 0.05g/l
– K2HPO4 2.38g/l
– KH2PO4 0.7g/l
– MgSO4 0.9g/l
– Glucoză 3g/l
– Piele 0.6g/l
– pH 7.

În cadrul experimentului au fost utilizate cele trei tulpini bacteriene izolate din sol și anume:
DA7, DA10, DA13.
Inocularea tulpinilor a fost realizată sub nișă, cu ajutorul unei anse cu buclă de 5 mm diametru,
iar apoi au fost incubate la 35oC, 135 rpm, t imp de 7 zile.
A fost efectuat un studiu comparativ privind acțiunea acestor tulpini bacteriene asupra blănurilor
naturale și sintetice. În acest scop, tulpinile au fost cultivate pe mediu minimal, a cărui compoziție a
fost menționată anterior, având ca su rsa de carbon și azot eșantioane de piele naturală și sintetică în
proporție de 0,6 %, după cum urmează:
– blană sintetică;
– blană naturală de ovine (piele și păr)
– piele naturală de bovine;

Cultivarea tulpinilor bacteriene s -a realizat la 35oC în con diții de agitare (135 rpm).
După perioada de incubare, se observă o tulburare a mediului și o fragmentare a bucăților de
blană din mediu, ceea ce indică faptul că bacteriile au utilizat ca sursă de carbon blana, realizând
hidroliza enzimatică.
Probele a u fost analizate din punct de vedere al activității enzimatice a proteazei, keratinazei
colagenazei, amilazei.

46
S-a măsurat activitatea proteolitică printr -o metoda de screening cu ajutorul spectofotometrului,
la 578 nm.

3.5.1 Metoda de determinare a gluci delor reducătoare

Principiul metodei:
Determinarea activității enzimatice a amilazei se efectuează printr -o metodă spectofotometrică,
bazată pe determinarea maltozei rezultate în urma acțiunii enzimei asupra substratului său specific,
printr -o reacție de culoare caracteristică acestuia.

Reactivul folosit pentru evidențierea produsului reacției enzimatice este acidul 3,5 –
dinitrosalicilic, care formează cu maltoza un compus colorat a cărei absorbție în vizibil se determina
spectofotometric.

Mod de lucru :
– 0,5 ml soluție probă
– 0,5 ml soluție tampon citrat 0,05M pH=4,8
– 3,0 ml DNS
– Incubare de 5 minute la 100oC
– Diluare cu 20 ml apă distilată
– Citire D.O. la 540 nm

3.5.2 Determinarea proteinelor prin metoda Lowry

Principiul metodei
Dozarea proteinelor (domeniu 2 5 – 500 µg) se bazează pe reducerea fosfomolibdaților și
fosfowolframaților din reactivul Folin -Ciocâlteu de către compușii fenolici din proteină (tirozină)
(LOWRY, 1959).

Reactivi
1. Soluție enzimatică.
2. Soluție alcalină A. Se dizolvă 4 g NaOH, 10 g Na 2CO 3, 0,2 g tartrat dublu de sodiu și
potasiu în apa distilată și se aduce la 1 litru în balon cotat.
3. Soluție B. Soluție CuSO 4 0,5%.

47
4. Reactiv alcalin de cupru. Înainte de folosire se amestecă 50 mL soluție alcalină A cu 1 mL
soluție CuSO4 0,5% B.
5. Reactiv Folin -Ciocâlteu diluat cu apă 1:2 înainte de utilizare.
6. Soluție etalon de albumină serică bovină (BSA) în apă distilată (1 mg/mL).

Trasarea curbei de etalonare
Se iau cote parte din soluția etalon de BSA și se completează cu apă distilată la 0,2 mL. Se
adaugă în ordine 5 mL reactiv alcalin de cupru și 0,5 mL reactiv Folin. Se lasă la temperatura camerei
30 minute, apoi se citește extincția în funcție de un martor obținut în aceleași condiții, dar cu
înlocuire a soluției de BSA cu apă distilată.

Reacția de culoare
Se pipeteaza în ordine:
 0,1 mL probă (soluție enzimatică);
 0,1 mL apă distilată;
 5 mL sol A+B;
 0,5 mL reactiv Folin -Ciocâlteu (1:2).
Se realizează un martor, înlocuind soluția enzimatică cu apa disti lată. Se lasă 30 de minute la
temperatura camerei și se citeste extincția la 660 nm față de martor.

3.5.3 Determinarea carbonului organic în produsele de piele naturală

Pricipiul metodei
Carbonul organic este oxidat de către anhidrida dicromică (Cr 2O7 2- ) în exces, în prezența
acidului sulfuric, oxidare facilitată de căldura produsă prin diluarea unui volum de soluție normală de
bicromat de K cu două volume de acid sulfuric concentrat și menținerea probei la temperatura de 1000
C timp de 20 de minute.

Reactivi
1) Bicromat de potasiu, soluție 1N. Se dizolvă în apă distilată 49,04g bicromat de potasiu
(K2Cr2O7), uscat la 105oC într -un balon cotat de 1000 ml și se adăugă la semn.
2)Acid sulfuric concentrat (H 2SO 4 d=1,48)

48

Modul de lucru
Se cântăresc la balanța analitică 0,2 – 1g materie organică mărunțita și se trece cantitativ într -un
vas Erlenmeyer de 200 -300 ml. Se adaugă 10 ml soluție 1N de bicromat de potasiu (picătură cu
picătură). Se adăugă apoi 20 ml acid sulfuric concentrat. Adăugarea celor 2 r eactivi se va face astfel
încât eventualele particule de materie organică existente pe pereții vasului să fie antrenate în soluția de
oxidare. Se agită apoi vasele cu grijă pentru a se realiza o amestecare intimă între materia de analizat
și soluțiile adău gate și se acoperă cu sticle de ceas. Imediat după amestecare și acoperire se pun vasele
pe o baie de apă adusă în prealabil la fierbere, unde se țin 20 de minute.
Proba martor va conține cei 2 reactivi fără materie organică.
După trecerea perioadei de înc ălzire, se iau vasele și se lasă să se răcească la temperatura
camerei, apoi li se adăugă fiecăruia câte 100 -200 ml apă distilată, se acoperă și se lăsă în continuare să
se răcească.

3.5.4 Dozarea carbonului organic.

Principiul metodei
Conținutul de carb on organic este calculat după cantitatea de anhidridă dicromică consumată
pentru oxidarea lui. Excesul de anhidridă dicromică se titrează cu o soluție de sare Mohr 0,2N în
prezența unui indicator de oxireducere.
Indicatorul folosit la titrarea excesului de oxidant poate fi: difenilamina sau
difenilaminosulfonatul de bariu al căror viraj este de la albastru -violaceu la verde murdar sau
ortofenantrolina al cărei viraj este cel mai ușor de urmărit (de la albastru la roșu).

Modul de lucru
Se trece ca ntitativ conținutul din vasul conic într -o capsulă de porțelan (după transvazarea
conținutului se spală vasul de 2 -3 ori cu apă distilată și se toarnă în aceeași capsulă). Se adăugă 5 -6
picături de indicator și se titrează cu soluția de sare Mohr, până la virajul indicatorului.

49
Calculul rezultatelor

( )

Unde:
a= volumul soluției de sare Mohr 0,2N folosită la titrarea probei martor, în ml;
b= volumul soluției de sare Mohr 0,2N folosită la titrarea probei de analizat, în ml;
f= factorul soluție 0,2N de sare Mohr (1);
0,0006= g C organic echivalent consumului de 1ml sare Mohr;
1,16= coeficient de corecție a conținutului de C;
100= factor pentru raportarea procentuală;
n= cantitate de materie organică analizată (g).

În cazul determinării carbonului organic s -au utilizat:
– o probă martor fără material organic;
– o probă în care a fost introdusă 0,02g blan ă cu piele nedegradată;
– o probă în care a fost introdusă 0,06g blan ă cu piele ținută în extractul enzimatic produs de
tulpina DA 7 timp de 24h la o temperatură de 370 C, aflată sub agitare.

3.5.5 Determinarea substanței uscate

Pentru determinarea substanței uscate, fragmentele de blană luate în experiment au fost spălate
sub jet de apă și us cate la temperatura de 105oC, timp de 24 de ore și cântărite.

3.6 METODE DE DETERMINARE A ACTIVITĂȚII ENZIMATICE ALE
PREPARATELOR ENZIMATICE OBȚINUTE

3.6.1 Determinarea activității proteolitice
Activitatea proteolitică se determină după metoda Anson, mo dificată pe substrat de cazeină.

50
Principiul metodei
Enzimele proteolitice catalizează hidroliza cazeinei permițând formarea unor compuși solubili
în acid tricloracetic. Conținutul de tirozină din acești compuși, este determinat spectofotometric cu
reactivul Folin -Ciocâlteu.
Reactivi și soluții
1. Tampon fosfat 0.2 M, pH 7.0 (39,0 ml soluție Na 2HPO 4 0,2 M + 61.0 ml soluție Na 2HPO 4 0.2
M)
2. Soluție de cazeină 1%. 1g de cazeină se dizolvă pe un agitator magnetic în cca. 30 ml NaOH
1N. Se neutralizează cu H 3PO 4 10%, adăugat în picături sub agitare continuă. Se aduce la pH –
ul dorit și se completează cu tampon fosfat (pH 7 în cazul proteazelor neutre).
3. Soluția de L -tirozină 1 nM (se dizolvă 181,19 mg tirozină în 1000 ml HCl soluție 0.2N)
4. Soluție de HCl 0.01 N – 0.06 N – 0.2 N
5. Soluție de NaOH 0.5 N
6. Soluție acid tricloracetic 5%
7. Reactiv Folin -Ciocâlteu (se dizolvă 10 g Na 2WO 4 x 2 H2O + 2.5 g Na2MoO4 x 2 H2O + 15 g
LiSO4 + 10 ml HCl conc. + 5 ml H3PO4 conc. și se aduce la 100ml cu apă distilată). Înainte
de utilizare se diluează o parte din aceasta cu două părți de apă distilată.
8. Soluție enzimatică.

Metoda de lucru
Amestecul de reacție format din 0.5 ml soluție enzimatică (mediu de cultură separate de
biomasa) și 1 ml soluție de cazeină 1% în tampon fosfat 0.2 M (pH 7) se incubează la 37oC timp de
10minute. Reacția enzimatică se stopează cu 2 ml acid tricloracetic 5%. Amestecul de reacție se
menține 30 de minute la temperatura camerei și apoi se filtrează. La 0.5 ml filtrat se adaugă 0.5 ml
HCl 0.2 N, 2 ml NaOH 0,5 N și 0,6 ml reactiv Folin -Ciocâlteu diluat 1:2. Se lasă 30 de minute la
temperatura camerei și se măsoara extincția la 578 nm față de martor. La proba martor se lucrează
asemănător, cu excepția că în amestecul de reacție se introduce acid tricloracetic imedi at peste soluția
de cazeină, se lasă în reapaus 30 de minute la temperatura camerei și apoi se introduce soluția
enzimatică. În continuare se lucrează identic la proba de determinat.
Se construiește un grafic cu extincția citită la 578 nm pe ordonată și µ moli α -tyr pe abcisă.

Calculul rezultatelor
Din curba de etalonare se determină µmoli tirozină corespunzător extincției măsurate. Valorile
citite pe grafic vor fi introduse în următoarea formulă:

51
( – )

= micromoli tyr/ml/min.
Unde:
3.5 – volum total amestec de reacție
1/10 – factor de transformare pentru un minut de activitate enzimatică;
0,5 – volum de lichid cu activitate pr oteolitică luat în lucru
0.5 – volum de lichid filtrat luat în lucru.

O unitate de activitate proteazică este definită ca fiind cantitatea de enzimă care în condițiile de
reacție indicate eliberează 1 µmoli tyr pe minut.

3.6.2 Determinarea α -amilazelor prin metoda Hostettler și colab.

Principiul metodei
Amidonul este hidrolizat, sub acțiunea catalitică a α -amilazei la fragmente ale căror grupări
reducătoare semiacetalice pot fi determinate cu acid 3,5 -dinitrosalicilic. Concentrația de acid
nitroaminosal icilic format, măsurată colorimetric, corespunde activității enzimatice.
Reactivi și soluții
1. Soluție tampon Na 2 HPO 4 – KH 2PO 4 20 mM, pH 6,9 ce conține și NaCl 10 mM;
2. Soluție amidon 1 %, preparată în tampon;
3. Reactiv 3,5 – dinitrosalicilic (se dizol vă la cald 10 g acid 3,5 -dinitrosalicilic în
aproximativ 300 ml apă distilată, se adaugă 400 ml NaOH 1 N și 300 g tartrat de sodiu și potasiu –
după dizolvare se aduce la un volum final de 1:l).
4. Soluție standard de maltoză (100 mg %).

Mod de lucru
Ames tecul de reacție care constă din:
 ml soluție 1;
 ml soluție 2;
 0,5 ml soluție cu activitate enzimatică, este incubat la 25oC timp de 10 minute după
care reacția este stopată cu 2 ml reactiv dinitrosalicilic
Probele sunt iucubate 5 minute pe baie de apă fie rbinte, răcite sub jet de apă și după 20 -60
minute sunt colorimetrate la 546 nm față de apa distilată.
Pentru determinarea glucidelor reducătoare preexistente în mediul de reacție la timpul 0, se
prepară un martor cu același conținut ca proba, în care, îns ă, soluția enzimatică trebuie introdusă după

52
reactivul dinitrosalicilic. Se colorimetrează și martorul față de apa distilată. Dacă D.O. probă – D.O. martor
este mai mare de 1,5 se procedează la diluarea soluției enzimatice.

Construirea curbei etalon
Din so luția de maltoză (100 mg %) se prepară diluții după cum urmează:

Tabelul 3.1
Table 3.1
. Curba etalon pentru amilaze.
Calibration curve for amylases.
Nr
. Crt. ml soluție
maltoză ml apă distilată µmoli maltoză
1 0 1,05 0
2 0,2 0,85 0,5
3 0,4 0,65 1,0
4 0,6 0,45 1,5
5 0,8 0,25 2,0
6 1,0 0,05 2,5

În fiecare din cele 6 eprubete se mai adaugă 1 ml soluție substrat și 2 ml reactiv dinitrosalicilic,
apoi se incubează 5 min pe o baie de apă la fierbere. După răcirea probelor se așteaptă 20 -60 min și
apoi s e colorimetrează la 546 nm față de apă distilată. Se trasează o curba etalon, indicând pe abscisă
µmoli maltoză în mediul de reacție, iar pe ordonată – densitatea optică.

Calculul rezultatelor
Se transformă densitatea optică citită pentru probe și martori în µmoli maltoză cu ajutorul curbei
etalon – iar rezultatele obținute sunt exprimate, astfel:

m = µmoli de maltoză, determinați din curba de etalonare ca fiind diferența dinte µmoli de
maltoză din probă și µmoli de maltoză din martor;
D – factor de diluție a probei luat în lucru,
V – volum (ml) de soluție probă luată în lucru;
10 – timp de incubare

53
3.6.3 Determinarea activității lipolitice

Principiul metodei
Pentru determinarea activității lipolitice tulpinile au fost inocula te pe mediu minimal ce
conține: NaCl 1g/l, CaCo3 0.05g/l, K 2HPO 4 2.38g/l, KH 2PO 4 0.7g/l, MgSO 4 0.9g/l, Glucoză
3g/l, Piele 0.6g/l, pH 7,2, incubate la 35oC, timp de 7 zile la 135 rpm.
Determinarea activitatii lipazice se efectueaza titrimetric, prin dozare a acizilor grași
eliberați în mediul de reacție în urma acțiunii enzimei asupra subratului, uleiul de măsline.
Cantitatea de acizi grași formată se determină prin titrare cu o soluție diluată și standardizată de
NaOH, în prezența fenolftaleinei (viraj inco lor → , pH 8,2 – 10) ca indicator. Volumul
soluției de NaOH necesar pentru neutralizarea acizilor grași eliberați este proportional cu
activitatea lipazică.
Reactivi:
1. Substrat: ulei de măsline preparat sub formă de emulsie în soluție apoasă de gumă arabică
a. Se dizolvă 16.5 g gumă arabică în 130 ml apă distilată.
b. După solubilizarea completă se diluează până la 165ml cu apă distilată
c. Se adaugă 20 ml ulei de măsline și 15 g gheața sfărâmată
d. Amestecul obținut se omognizeaza bine pe agitator
Observație: substratul se prepară proaspăt, înainte de utilizare.
2. Soluție tampon citrat 0.2 M, pH 7
3. Soluție de clorură de calciu 0.6%
4. Preparatul enzimatic: lichid de fermentație
5. Reactiv pentru stoparea reacției amestec etanol:acetonă (1:1)
6. Soluție de NaOH 0.1 M cu factor determinat, preparată cf FR X
7. Soluție indicator de fenolftaleină, preparată cf FR X.

Modul de lucru:
Reacția enzimatică a fost efectuată într -un pahar Erlenmeyer de 100 ml, comparativ cu o
probă martor.
Pentru determinarea probei s -au utilizat 10 m l emulsie substrat, 2 ml soluție CaCl 2, 5 ml
soluție tampon citrat, 1 -5 ml lichid de fermentație. Se incubează 60 de minute la 37oC sub agitare
la 170 rpm, apoi se adaugă 20 ml reactiv de stopare. Se realizează titrarea acidității cu soluție
NaOH 0.1 N în prezența fenolftaleinei (0.4 ml fenolftaleină la 40 ml soluție de titrat).
Proba martor se realizează asemănator, numai că reactivul de stopare se adaugă inainte de
incubare.

54

Calculul activității
A (U/h) = (Vp – VM) x F x 100/V
Vp – volumul de soluție de NaOH 0.1 N cu care s -a titrat proba (ml)
VM – volumul de soluție de NaOH 0.1 N cu care s -a titrat martorul (ml)
F – factorul soluției de NaOH
100 – factorul care include transformarea volumului de soluție NaOH 0.1 N în µmoli acizi
grași corespunzători.
v – volumul de lichid de fermentație luat în analiză (ml)

O unitate de activitate lipazică este definită ca fiind cantitatea de enzimă care eliberează
prin hidroliza trigliceridelor din uleiul de măsline 1µmol de acid gras, în condițiile analizei
(37oC, pH7, timp de reacție 60 de minute).

3.6.4 Determinarea activitații keratinolitice

Înainte de determinarea activității keratinolitice a fost făcut un screening al tulpinilor
izolate pentru a se observa dacă microorganismele au activitate keratinolitică.

Screeningul a fost realizat pe mediu BMKA, un mediu bazal care contine (g/l): NH 4Cl 0.5,
NaCl 0.5, KH 2PO 4 0.4, K 2HPO 4 0.3, MgCl 2x6H 2O 0.1 și keratin -azur (Sigma), tăiat mărunt și
sterilizat separat în concentrație de 3 mg/ml. Testul se bazează pe capacita tea microorganismelor
de a consuma keratină din substanța keratin -azur, cu eliberare de colorant azur care determină
albastrirea mediului.
Microorganismele testate au fost însămânțate pe mediu BMKA și ținute timp de 7 zile la
35oC, în condiții de agitare (135 rpm). În funcție de intensitatea culorii tulpinile/probele testate
au fost. Densitatea microbiana a probelor incubate timp de 7 zile fost determinată
spectrofotometric la lungimea de undă de 600nm.
În urma screeningului s -a determinat activitatea kera tinolitică.
Pentru determinarea activității keratinolitice tulpinile bacteriene au fost inoculate pe mediu
minimal ce conține: NaCl 1g/l, CaCo 3 0.05g/l, K 2HPO 4 2.38g/l, KH 2PO 4 0.7g/l, MgSO 4 0.9g/l,
Glucoză 3g/l, Piele 0.6g/l, pH 7,2. Incubarea s -a realizat la 35oC, timp de 7 zile la 135 rpm.
Principiul metodei
– se iau 2 ml probă și se centrifughează la 10.000 rpm;

55
– se taie mărunt 80 mg de keratin azur;
– 0,5 ml supernatant din proba centrifugată + 1,5 ml Tris;
– se incubează proba la 50oC timp de 60minute ;
– se citește la 595 nm.

Reactivi
Reactivii utilizați pentru determinarea activității keratinolitice:
– 80 mg keratin azur (0,8g)
– 2 ml suspensie (1,5 ml Tris; 0,5 ml supernatant din proba centrifugată)

Metoda se bazează pe reacția de hidroliză a subst ratului (keratin azur) sub acțiunea
keratinazei. Spectrofotometric se determină modificarea absorbanței la 595nm ca urmare a
intensificării colorației prin hidroliza substratului.
Rezultatele determinărilor au fost exprimate în U/ml. O unitate keratinazică reprezintă
cantitatea de enzimă ce determină o creștere a absorbanței la 595 nm de 0.01 după o ora de
reacție, la 60oC, cu agitare 135rotatii/min.

3.6.5 Determinarea activității colagenazice

Metoda se bazează pe reacția de hidroliză a colagenului sub ac țiunea colagenazei, în urma
căreia se pun în libertate peptide. Gradul de proteoliză se măsoară spectrofotometric în prezența
ninhidrinei la 600 nm.
Rezultatele determinărilor au fost exprimate în U/ml. O unitate colagenazică reprezintă
cantitatea de enzi mă ce eliberează peptidele din colagen echivalent în intensitate de culoare
determinată spectrofotometric cu ninhidrina cu 1,0 µmol de leucină în 5 ore, la pH 7,2 și
temperatura 37oC în prezenta ionilor de calciu.
Pentru evidențierea activității colagenazi ce s-a folosit un mediu mineral, în care sursa de
azot a fost reprezentată de bucăți de piele de ovine. Mediul conține (g/L):
– NaCl 1 g
– CaCl 2 0,05 %
– KH 2PO 4 0,7 g
– Sucroză 3 g
– MgS0 4 0,9 g
– K2HPO 4 2,38 g
– Sursa de carbon 0,6 % piele

56

Principiul metodei
Aminoaci zii liberi eliberați în urma degradării colagenului, au fost determinați utilizând o
modificare a metodei MOORE și STEIN (1948), metodă colorimetrică ce folosește ninhidrina,
transferând 0,2 ml din monstră în eprubetă. Eprubeta conține un amestec de 2 ml d e ninhidrin –
etilenă, glicol -monoetil, eter. După fierbere timp de 30 minute într -o baie de apă și după răcire,
mostrele sunt diluate cu 10 ml soluție n – propanol de concentrație 50%. Absorbanța a fost
determinată la 600 nm după 15 minute. O curbă etalon α -leucină, a fost folosită pentru a
determina cantitatea de µmoli de aminoacizi echivalentă leucinei eliberate.
Concentrația proteinei solubile totală a fost determinată utilizând metoda LOWRY și
COLAB. (1951), utilizând albumina serică bovină (BSA) ca etalo n.
Testul de degradare a pielii cu ajutorul enzimelor a fost realizat utilizând 2 mg/ml soluție
stoc de colagenază bacteriană tip IA. Experimentele au fost desfășurate aupra unor mostre pe
piele de oaie de 2 cm2 în tampon Tris – HCl 50 mM, pH 7,2, la 35oC, cu agitare de 135rpm.
Determinarea aminoacizilor eliberați a fost realizată la următoarele intervale de timp: 24, 48, 72,
96 și 120 de ore.

3.7 Documentație tehnică privind selectarea metodei de concentrare a
preparatelor enzimatice

Cultivarea tulpinilor bacteriene selectate (DA7, DA10, DA13) s -a realizat pe mediu
minimal, în care sursa de carbon și azot a fost reprezentată doar de eșantioane de piele și blană
naturală, la 35oC în condiții de agitare (135 rpm), timp de 7 zile. Compoziția mediului de cultu ră
a fost (g/L): NaCl 1 g; CaCl 2 0,05 g; KH 2PO 4 0,7 g; Sucroza 3 g; MgSO 4 0,9 g; K 2HPO 4 2,38 g
și s-a folosit un preinocul din piele cu blană tăbăcită cu crom.
În vederea obținerii unor preparate enzimatice mai eficiente au fost testate două metode de
conc entrare în scopul selectării metodei care conservă cel mai bine activitatea complexelor
enzimatice sintetizate de tulpinile bacteriene utilizate:
– concentrarea mediului de cultură la rotaevaporator;
– liofilizare; preparatul liofilizat a fost resolubiliza t pentru analiză.
Pentru concentrare, mediul de cultură a fost filtrat, utilizându -se apoi un concentrator cu
rotaevaporare sub vid Heildolph. Operația de concentrare s -a realizat la 40oC.
În vederea creșterii stabilității preparatului enzimatic de origine microbiană s -a recurs la
procedeul de liofilizare.
• Probe recepționate: 50 ml suspensie din tulpinile DA7, DA10, DA13

57
• Pregătirea probelor pentru liofilizare:
– repartizare probe (câte 25 ml în vasul de liofilizare)
– adaos crioprotector: 10% trehaloză
– congelarea probelor
• Liofilizarea propriu -zisă:
– echipament: liofilizator Labconco cu capacitate maximă de 6 litri
– condiții de liofilizare: presiunea de 0,04 mbar; temperatura de – 40oC, timp de liofilizare
20 ore.
Reconsitituirea liofilizatului s -a realizat utilizand apă distilată sterilă.

3.8 Identificarea tulpinilor bacteriene isolate

Pentru identificarea tulpinilor bacteriene izolate s -a folosit sistemul
BIOLOG – Microbial Identification system:
Au fost utilizate trei tulpini bacteriene, nota te DA7, DA10, DA13, ce au fost izolate în
etapele precedente. Tulpinile au fost însămânțate pentru identificare pe geloză simplă și pe
mediul BUG.
Etapele identificării cu sistemul Biolog – Microbial Identification system:
1. Tulpinile bacteriene au fost îns ămânțate pe mediul agarizat BUG și incubate 24 ore la
330C;
2. Etalonarea aparatului:
– calibrarea densitometrului folosind etalonul de 65%;
– calibrarea densitometrului folosind etalonul de 85%;
– verificarea densității mediului de inocul IF -A;
3. Inocularea mediulu i IF-A cu o colonie bacteriană până la densitatea de 84 – 89%;
4. Inocularea plăcilor GEN III cu 100 µl de inocul;
5. Incubare la 330C, timp de 20 – 22 ore;
6. Citirea rezultatelor la spectrofotometrul Biolog.

58

Anatomy of a GEN IIIIdentification
71 Carbon Source Assays + 23 Chemical Sensitivity Assays
Sugars
Hexose -PO4’s
Amino acids
Hexose acids
Carboxylic acids, esters,
and fatty acidsAcidic pH
NaCl
Lactic acid
Reducing power
GN-GP
Figura 3.2 Anatomia u nei placi GEN III
Figure 3.2 The anatomy of a GEN III plate

59
CAPITOLUL IV
CHAPTER IV
REZULTATE OBȚINUTE
RESULTS OBTAINED

4.1 REZULTATE PRIVIND SELECȚIA ȘI IDENTIFICAREA
MICROORGANISMELOR CAPABILE SĂ DEGRADEZE PIELEA
NATURALĂ

În continuare va fi desc risă metoda de izolare și selecție a unor microorganisme cu
potențial degradativ.

4.1.1 Screeningul bacteriilor izolate și alegerea sistemului biologic de utilizare în
degradarea blănurilor

Pentru găsirea unor soluții biotehnologice care să stea la baza degradării celor două
componente ale blănii, se impune screeningul și izolarea unor microorganismelor care să posede
echipamentele enzimatice necesare.

Experimentele au debutat cu izolarea tulpinilor bacteriene în urma compostării resturilor de
blană tăbă cită cu crom, provenită de a Institutul de Pielărie, București.
Pentru obținerea tulpinilor bacteriene înalt producătoare de proteaze s -a utilizat 40 grame
sol cu un pH de 7,2, în care au fost introduse bucățile de blană naturală, masurând 4 cm2, timp de
3 luni.
După compostarea bucăților de blană, fragmente din aceasta au fost introduse într -un
mediu simplu (a se vedea Capitolul III – Materiale și metode) sterilizat în prealabil la 120oC, 1.1
atm. și incubate 48 ore, la 135 rpm, la temperatura de 35oC. Dup ă incubare fragmentele au fost
înlăturate și au fost introduse alte fragmente de blană naturală cu dimensiunea de 1 cm2, care au
fost incubate timp de 120 ore, la 135 rpm la o temperature de 35oC.
Pentru obținerea coloniilor izolate s -a realizat o diluție de 10-1 și prin tehnica inundării 1
ml soluție a fost însămânțat pe plăci Petri cu geloză agarizată (a se vedea Capitolul III –
Materiale și metode) și incubate timp de 24 ore, la temperatura de 35oC.

60
Coloniile izolate formate sunt de culoare alb laptos, p unctiforme, cu margini regulate, la
suprafața mediului, bombate, masurând un diametru cuprins între 0.1 -10 mm, precum și colonii
galbene, punctiforme, cu margini neregulate, având un diametru cuprins între 0.1 -0.5 mm. După
selecționare, acestea au fost tre cute pe geloză agarizată în plan înclinat.
S-a realizat un screening de laborator în care au fost utilizate 90 de tulpini bacteriene
isolate, în scopul selecționării tulpinilor înalt producătoare de proteaze, folosind procesul de
cultivare pe medii de cult ura specifice. Astfel s -au utilizat placi Petri cu mediu de tip PCA (plate
count agar), numit și SMA (standard method agar), MAP (milk agar plates), mediu cu amidon,
CMC și mediu cu Tween 80 (a se vedea Capitolul III – material și metode).
În jurul colonii lor testate producătoare de proteaze a fost observat un halou opaleșcent,
după 24 ore de incubare, la o temperatură de 35oC.
Din cele 90 de tulpini bacteriene isolate și testate, au fost selectate 3 dintre acestea și
anume DA7, DA10, DA13, care apoi au fos t trecute și întreținute pe geloză agarizată și
depozitate la 4oC.
Screeningul a continuat cu inocularea tulpinilor selectate pe 40 ml mediu minimal ( NaCl
1g/lCaCo 3 0.05g/l, K 2HPO 4 2.38g/l, KH 2PO 4 0.7g/, MgSO 4 0.9g/l, Glucoză 3g/l,
având un pH de 7.2 ) ce c onținea ca unică sursă de carbon și azot blană tabacită în proporție
de 0.6 %, iar apoi au fost incubate pe agitator la 135rpm, timp de 120 ore (h), la o temperatură de
35oC. Pe parcursul procesului de fermentație s -au recoltat probe la 24h, 48h,72h, 96h, 120h față
de momentul inițierii creșterii culturii respective și s -au efectuat determinări ale activității
enzimatice proteolitice și activității enzimatice specifice, după o diluție de 1:10 conform
metodelor prezentate în Capitolul III – Materiale și met ode.
Tabel 4.1
Table 4.1
Rezutatele obținute în urma screeningului activității proteazice la 578nm
Results of the proteolithic activity screening at 578 nm

Tulpină Diluție 24 h 48 h 72 h 96 h 120 h Media
DA 13 1:10 0.231 0.415 0.586 0.938 0.993 0.633
DA 10 1:10 0.556 0.630 0.815 0.906 0.987 0.779
DA 7 1:10 0.183 0.139 0.426 0.506 0.616 0.374

61
A fost realizat și un screening al tulpinilor selecționate pentru a se observa toleranța pentru
diferite temperaturi și diferite valori pH.

4.1.2 Rezultate obț inute în degradarea biologică a blănurilor cu tulpinile selecționate

Temperatura la care se efectuează biosinteza proteazelor bacteriene este un factor esențial
pentru formarea și acumularea în cantiate maximă a enzimei. Temperatura influențează viteza de
dezvoltare a microorganismelor, viteza de formare, dar și de inactivare a enzimelor.
Temperatura stabilită pentru cultivarea tulpinilor izolate a fost de 35oC în funcție de datele
din literatura de specialitate s -au stabilit o serie de valori de temperatu ră la care s -au efectuat
determinări ale activităților enzimatice 120 de ore de la cultivare. Tulpinile bacteriene au fost
crescute pe mediu minimal.
În tabelele 4.2 – 4.4 sunt prezentate rezultatele obținute privind influența diferitelor valori
de tempera tură asupra acumularii enzimelor proteolitice specifice pentru tulpinile izolate.

Tabel 4.2
Table 4.2
Rezutatele pentru tulpina DA7 în urma screeningului la diferite temperaturi, față de martor 0,181
DA7 screening readings for different temperatures, aga inst the blank 0.181

oC
Timp 24 h 48 h 72 h 96 h 120 h
10 0C 0,199 0,225 0,316 0,430 0,512
15 0C 0,202 0,278 0,393 0,488 0,689
20 0C 0,208 0,310 0,420 0,536 0,700
25 0C 0,216 0,311 0,425 0,581 0,893
30 0C 0,229 0,401 0,561 0,898 0,930
35 0C 0,233 0,417 0,576 0,925 0,999
40 0C 0,230 0,411 0,551 0,736 0,895
45 0C 0,212 0,315 0,498 0,597 0,696
50 0C 0,206 0,309 0,436 0,575 0,676
55 0C 0,203 0,298 0,340 0,448 0,616
60 0C 0,198 0,256 0,367 0,438 0,573
65 0C 0,194 0,241 0,344 0,419 0,537
70 0C 0,183 0,195 0,262 0,357 0,480

62
Tabel 4.3
Table 4.3
Rezutatele pentru tulpina DA10 în urma screeningului la diferite temperaturi, față de martor
0.181
DA10 screening readings for different temperatures, against the blank 0.181

oC
Timp 24 h 48 h 72 h 96 h 120 h
10 0C 0,188 0,291 0,321 0,470 0,509
15 0C 0,217 0,302 0,415 0,511 0,618
20 0C 0,251 0,311 0,473 0,592 0,772
25 0C 0,273 0,374 0,494 0,600 0,881
30 0C 0,309 0,447 0,604 0,870 1,008
35 0C 0,311 0,515 0,704 0,880 1,203
40 0C 0,286 0,340 0,498 0,615 0,838
45 0C 0,259 0,307 0,400 0,538 0,616
50 0C 0,240 0,298 0,387 0,439 0,505
55 0C 0,202 0,260 0,302 0,419 0,448
60 0C 0,198 0,255 0,362 0,399 0,436
65 0C 0,191 0,230 0,326 0,384 0,424
70 0C 0,182 0,190 0,238 0,341 0,359

63

Tabel 4.4
Table 4. 4
Rezutatele pentru tulpina DA13 în urma screeningului la diferite temperaturi, față de martor
0.181
DA13 screening readings for different temperatures, against the blank 0.181

Pe baza analizei rezultatelor prezentate în tabele se poate conc luziona că cele trei tulpini
izolate au prezentat cea mai bună activitate proteolitică la temperatura de 35oC și la un pH egal
cu 7, dintre care cea mai ridicată activitate a fost înregistrată de tulpina DA10 și anume
1,203U/ml

Deoarece enzimele sunt prot eine funcționale, proprietățile și biosinteza lor sunt puternic
influențate de valorile pH -ului mediului de cultivare. S -a constatat că pe mediile naturale la un oC
Timp 24 h 48 h 72 h 96 h 120 h
10 0C 0,189 0,208 0,272 0,381 0,500
15 0C 0,197 0,216 0,299 0,469 0,608
20 0C 0,202 0,227 0,351 0,573 0,736
25 0C 0,277 0,352 0,480 0,663 0,818
30 0C 0,303 0,425 0608 0,792 0,991
35 0C 0,320 0,526 0,683 0,824 1,102
40 0C 0,291 0,415 0,586 0,792 0,896
45 0C 0,233 0,404 0,600 0,702 0,613
50 0C 0,221 0,343 0,431 0,484 0,506
55 0C 0,216 0,270 0,336 0,411 0,433
60 0C 0,202 0,256 0,321 0,398 0,430
65 0C 0,197 0,215 0,236 0,289 0,315
70 0C 0,183 0,190 0,231 0,294 0,309

64
pH de 7.0 -7.5 se limiteaza fenomenul de disociere, astfel încât acumularea enzimei proteolitic e
este maximă.
S-au stabilit o serie de valori pH la care s -au efectuat determinări ale activității enzimatice
și activitatii enzimatice specifice la 120 de ore de la cultivare. Tulpinile bacteriene au fost
crescute pe mediul minimal.
Rezultatele privind e fectele diferitelor valori de pH asupra activității enzimatice sunt
prezentate în tabelele 4.5 – 4.7

Tabel 4.5
Tabel 4.5
Evoluția producției enzimatice cu tulpina DA7 în funcție de valorile pH, față de martor 0,180
The evolution of enzymatic production o f DA7 strain at different pH scale against 0.180 blank
pH
Timp 24 h 48 h 72 h 96 h 120 h
5.5 pH 0,181 0,186 0,189 0,200 0,219
6.0 pH 0,186 0,190 0,197 0,215 0,279
6.5 pH 0,201 0,263 0,298 0,315 0,391
7.0 pH 0,217 0,317 0,400 0,595 0,733
7.5 pH 0,218 0,366 0,471 0,669 0,729
8.0 pH 0,199 0,219 0,273 0,303 0,386
8.5 pH 0,183 0,202 0,211 0,263 0,285

65

Tabel 4.6
Tabel 4.6
Evoluția producției enzimatice cu tulpina DA10 în funcție de valorile pH, față de martor 0,180
The evolution of enzymatic prod uction of DA10 strain at different pH scale against 0.180 blank
pH
Timp 24 h 48 h 72 h 96 h 120 h
5.5 pH 0,184 0,191 0,198 0,213 0,225
6.0 pH 0,189 0,200 0,217 0,236 0,251
6.5 pH 0,195 0,209 0,231 0,266 0,287
7.0 pH 0,256 0,309 0,402 0,599 0,772
7.5 pH 0,253 0,300 0,397 0,534 0,735
8.0 pH 0,201 0,276 0,301 0,333 0,482
8.5 pH 0,195 0,209 0,300 0,327 0,354
Tabel 4.7
Tabel 4.7
Evoluția producției enzimatice cu tulpina DA13 în funcție de valorile pH, față de martor 0,180
The evolution of enzymat ic production of DA13 strain at different pH scale against 0.180 blank
pH
Timp 24 h 48 h 72 h 96 h 120 h
5.5 pH 0,185 0,193 0,215 0,241 0,247
6.0 pH 0,188 0,196 0,213 0,226 0,267
6.5 pH 0,195 0,202 0,228 0,226 0,285
7.0 pH 0,230 0,302 0,396 0,505 0,769
7.5 pH 0,221 0,301 0,398 0,500 0,721
8.0 pH 0,200 0,269 0,297 0,373 0,480
8.5 pH 0,188 0,207 0,261 0,290 0,303

66
4.1.3 Identificarea microorganismelor selectate -denumire proprie a tulpinilor
selectate

BIOLOG – Microbial Identification system este un sistem avansat pentru identificarea și
caracterizarea microorganismelor, care ofera posibilitatea de identificare rapidă a peste 1900 de
specii de bacterii aerobe și anaerobe, bacterii patogene, fungi filamentosi și drojdii, dar și analiza
unor comunit ăți microbiene. Sistemul BIOLOG GENIII se bazează pe analiza paternului
metabolic rezultat din metabolizarea de către celulele microbiene a principalelor clase de produși
biochimici și determinarea unor proprietăți fiziologice importante cum ar fi pH -ul, toleranța la
salinitate, aciditate, dar și testarea sensibilității la diferite substanțe chimice.

Folosind sistemul BIOLOG – Microbial Identification system au fost identificate cele trei
tulpini bacteriene, notate DA7, DA10, DA13,rezultatele fiind preze ntate în tabelul 4.8 și în
figurile 4.1 – 4.3.
Tabel 4.8
Table 4.8
Rezultatele obtinute la identificarea tulpinilor bacteriene folosind sistemul BIOLOG
The results of the bacterial strains identification, using the BIOLOG system
Acronim Tulpina Similaritat e Distanța
DA7 Brevundimonas diminuta 0,878 1,628
DA10 Bacillus thurigiensis 0,570 5,153
DA13 Bacillus cereus 0,554 4,965

Pentru identificarea tulpinilor se iau în considerare:
– valoarea indicelui de similaritate (SIM) care reprezintă o comparație î ntre rezultatele
caracteristicilor biochimice ale tulpinii bacteriene testate și rezultatele testelor biochimice
obținute cu tulpina de colectie (ATCC) folosită la obținerea bazei de date BIOLOG;
– Valoarea distanței (DIST) care reprezintă o comparație înt re primele două rezultate
obținute.
Pentru o identificarea concludenta este necesar ca SIM > 0.5 iar DIST sa fie de cel putin 2
puncte (tabel 4.8).

67

Figura 4.1. Identificarea tulpinii Brevundimonas diminuta (DA7) cu sistemul BIOLOG –
Microbial Identifi cation system
Figure 4.1 Identification of Brevundimonas diminuta (DA7) stain using the BIOLOG –
Microbial Identification system

68

Figura 4.2. Identificarea tulpinii Bacillus thurigiensis (DA10) cu sistemul BIOLOG – Microbial
Identification system
Figure 4.2 Identification of Bacillus thurigiensis (DA10) stain using the BIOLOG – Microbial
Identification system

69

Figura 4.3 Identificarea tulpinii Bacillus cereus (DA13) cu sistemul BIOLOG – Microbial
Identification system
Figure 4.3 Identification of Bacill us cereus (DA13) stain using the BIOLOG – Microbial
Identification system

4.2 REZULTATE PRIVIND DEGRADAREA ENZIMATICĂ A
PRODUSELOR DIN BLANĂ

4.2.1 Rezultate privind obținerea preparatului enzimatic utilizat în degradarea
blănurilor

Tulpinile bacteriene izolate selecționate (DA7, DA10, DA13) au fost folosite în
experimentările ulterioare în vederea obținerii unui preparat enzimatic cu activitate proteolitică
crescută, utilizate în hidroliza resturilor de blană tăbăcită.

70

Figura 4.4 Influența temperatu rii asupra curbei etalon pentru determinarea proteazelor 578nm
pentru tulpina DA7
Fig. 4.4. Temperature influence on the etalon curve of proteolytic activity at 578nm, DA7 strain

Figura 4.5 Influența temperaturii asupra curbei etalon a producției de pro tează 578nm pentru
tulpina DA10
Fig. 4.5. Temperature influence on the etalon curve of proteolytic activity at 578nm, DA10
strain
0.512, 0.711
0.508, 0.711
0.579, 0.816 0.712, 0.996
0.749, 1.048 0.818, 1.145 0.714, 0.999
0.515, 0.721 0.495, 0.693
0.435, 0.609 0.392, 0.548
0.356, 0.498 0.299, 0.418
0.0000.2000.4000.6000.8001.0001.2001.400
0.000 0.100 0.200 0.300 0.400 0.500 0.600 0.700 0.800 0.900µmol Tyr
Extincție DA 7
0.328, 0.459 0.437, 0.611 0.591, 0.827 0.700, 0.980
0.827, 1.157 1.022, 1.430 0.657, 0.919
0.435, 0.609
0.324, 0.453
0.267, 0.373 0.255, 0.357
0.243, 0.340 0.178, 0.249
0.0000.2000.4000.6000.8001.0001.2001.4001.600
0.000 0.200 0.400 0.600 0.800 1.000 1.200µmol Tyr
Extincție DA 10

71

Figura 4.6 Influența temperaturii asupra curbei de etalonare a producției de protează 578nm
pentru tulpina DA13
Fig. 4 .6. Temperature influence on the etalon curve of proteolytic activity at 578nm, DA13 strain

În figurile 4.4 – 4.6 sunt prezentate date referitoare la determinarea turbiditații și producției
de protează bacteriană pentru tulpinile luate în experiment.

Figura 4.7 Influența temperaturii asupra producției de colagenază 600 nm pentru tulpina DA7
Figure 4.7 The influence of temperature above colagenasis production at 600 nm for DA7 strain
0.319, 0.446 0.427, 0.597 0.555, 0.777 0.637, 0.891 0.810, 1.134 0.921, 1.289
0.645, 0.903
0.432, 0.604
0.325, 0.455
0.252, 0.352 0.249, 0.348
0.134, 0.187 0.128, 0.179
0.0000.2000.4000.6000.8001.0001.2001.400
0.000 0.100 0.200 0.300 0.400 0.500 0.600 0.700 0.800 0.900 1.000µmol Tyr
Extincție DA 13
0.211 0.269 0.302 0.354 0.372 0.380 0.373 0.350 0.319 0.277 0.252 0.200 0.192
0.000 0.050 0.100 0.150 0.200 0.250 0.300 0.350 0.40010152025303540455055606570
U /ml Temperatura DA 7

72

Figura 4.8 Influența temperaturii asupra producției de colagenază 600 nm pentru tulpina DA10
Figure 4.8 The influence of temperature above colagenasis production at 600 nm for DA10 strain

Figura 4.9 Influența temperaturii asupra producției de colagenază 600 nm pentru tulpina DA13
Figure 4.9 The influence of temperature a bove colagenasis production at 600 nm for DA13 strain

Pe baza rezultatelor prezentate în figurile de mai sus se poate concluziona că producția de
colagenază cea mai ridicată se realizează în cazul cultivării tulpinii DA10 și anume o activitate
enzimatică de 0,401 U/ml.
Rezultatele obținute sunt conforme cu datele din literatura de specialitate potrivit cărora
temperatura de 35oC este cea mai benefică pentru creșterea bacteriană și producția de
colagenază. 0.244 0.273 0.317 0.361 0.388 0.401 0.390 0.372 0.349 0.300 0.271 0.235 0.199
0.000 0.050 0.100 0.150 0.200 0.250 0.300 0.350 0.400 0.45010152025303540455055606570
U/ml Temperatura DA 10
0.219 0.249 0.321 0.354 0.377 0.394 0.375 0.352 0.320 0.281 0.260 0.211 0.195
0.000 0.050 0.100 0.150 0.200 0.250 0.300 0.350 0.400 0.45010152025303540455055606570
U/ml Temperatura DA 13

73

Figura 4.10 Influența temperaturii asupra producț iei de amilază 546nm
Figure 4.10 The influence of temperature above amilases production at 546 nm

Experim entările au continuat cu determinarea temperaturii pentru producția de amilază,
masurând o producție enzimatică de 0,815 U/ml în cazul tulpinii DA10 pentru temperatura de
35oC, observându -se o scădere a turbidității la temperaturi mai crescute de 40oC.

Figura 4.11 Influența temperaturii asupra producției de keratinază 595 nm
Figure 4.11 The influence of temperature above keratinases production at 5 95 nm
10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70
DA 7 0.225 0.430 0.585 0.695 0.780 0.815 0.755 0.580 0.480 0.295 0.135 0.115 0.025
DA 10 0.360 0.500 0.630 0.720 0.810 0.870 0.805 0.695 0.600 0.510 0.420 0.250 0.080
DA 13 0.295 0.470 0.600 0.705 0.790 0.825 0.770 0.605 0.510 0.365 0.190 0.131 0.0400.0000.1000.2000.3000.4000.5000.6000.7000.8000.9001.000Influența temperaturii asupra producției de amilază 546nm
10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70
DA 7 0.113 0.121 0.153 0.169 0.177 0.180 0.179 0.166 0.161 0.155 0.130 0.119 0.109
DA 10 0.119 0.154 0.178 0.202 0.215 0.248 0.244 0.229 0.200 0.173 0.158 0.120 0.111
DA 13 0.117 0.135 0.179 0.192 0.204 0.223 0.220 0.194 0.165 0.158 0.137 0.118 0.1070.0000.0500.1000.1500.2000.2500.300Influența temperaturii asupra producției de keratinaz ă
595nm

74
Determinarea activității keratinolitice și a activităților enzimatice specifice s -a realizat la
120 de ore față de momentul inițierii culturii respective, moment al acumulării maxime a
enzimelor în mediu și în care concentrația celulară este foarte ridicată.

Figura 4.12 Influența temperaturii asupra producției de lipază pentru tulpina DA 7
Figure 4.12 The influence of temperature above lipases production for DA7 strain

Figura 4.13 Influența temperaturii asupra producției de lipază pentru tulpina DA 10
Figure 4.13 The influence of temperature above lipases production for DA10 strain
40 40 60 60 80 100
80
60 60
40 40
20 20
020406080100120
0 10 20 30 40 50 60 70 80U/ml
Temperatură DA 7
40 60 80 80 100 140
120
80
60
40 40 40 40
020406080100120140160
0 10 20 30 40 50 60 70 80U/ml
Temperatură Da 10

75

Figura 4.14 Influența temperaturii asupra producției de lipază pentru tulpina DA 13
Figure 4.14 The influence of temperature above lipases production for DA13 strain

Pe baza figurilor 4.12 – 4.14 putem concluziona că temperatura are o mare influență asupra
producției de lipază. Producția maximă a fost obținută cu tulpina DA10, la temperatura de 35oC,
după o perioadă de incubare de 120 de ore.
Pe baza rezultatelor pr ezentate în figurile de mai sus se poate concluziona că determinările
efectuate au fost extrem de utile în aflarea valorii optime de temperatură și pH a fiecărei tulpini.
Astfel pentru tulpinile izolate valorile optime sunt cuprinse între 30 și 40oC, cele mai bune
rezultate fiind obținute la temperature de 35oC, iar pH optim a fost cuprins între 7.0 – 7.5.
Cele mai bune activități au fost înregistrate de tulpina DA10, la temeratură de 35oC și un
pH de 7.2

20 20 80 100 120 140
120
80 80
40 40 40
20
020406080100120140160
0 10 20 30 40 50 60 70 80U/ml
Temperatură DA 13

76

Figura 4.15 Influența pH -ului asupra producție i de protează pentru tulpina DA 7
Figure 4.15 The influence of pH on proteases production for DA7 strain

Figura 4.16 Influența pH -ului asupra producției de protează pentru tulpina DA 10
Figure 4.16 The influence of pH on proteases production for DA10 s train
0.039, 0.054 0.099, 0.138 0.211, 0.295 0.553, 0.774
0.549, 0.768
0.206, 0.288
0.105, 0.147
0.0000.1000.2000.3000.4000.5000.6000.7000.8000.900
0.000 0.100 0.200 0.300 0.400 0.500 0.600 0.700µmol Tyr
Extincție DA 7
0.063, 0.045 0.099, 0.071 0.149, 0.107 0.828, 0.592
0.777, 0.555 0.422, 0.302
0.243, 0.174
0.0000.1000.2000.3000.4000.5000.6000.700
0.000 0.200 0.400 0.600 0.800 1.000µmol Tyr
Extincție DA 10

77

Figura 4.17 Influența pH -ului asupra producției de protează pentru tulpina DA 13
Figure 4.17 The influence of pH on proteases production for DA13 strain

Datele din literatura de specialitate relevă eforturile cercetătorilor îndreptate în sensul
aprofundării căilor ce au ca finalitate sporirea producției de protează bacteriană.
Astfel, cea mai importantă sursă pentru dezvoltarea optimă a culturilor bacteriene este
cea de carbon. Preferințele pentru anumiți componenți variază de la o tulpină la a lta precum și a
diferitelor săruri ce intră în compoziția mediului de cultivare.
Pentru testarea rezistenței bacteriene la diferite valori pH, s -a utilizat un mediu minimal
având o scală pH cuprinsă între 5,5 și 8,5 unitați. Tulpinile bacteriene au fost incubate la valorile
normale de 135 rpm și 35oC. Au fost realizate experimentări privind turbiditatea bacteriană,
precum și influența pH -ului asupra productivității enzimelor specifice.

Figura 4.18 Influența pH -ului asupra producției de lipază pe ntru tulpina DA 7
Figure 4.18 The influence of pH on lipases production for DA7 strain 0.093, 0.067 0.121, 0.087 0.147, 0.105 0.824, 0.589
0.757, 0.541 0.420, 0.300
0.172, 0.123
0.0000.1000.2000.3000.4000.5000.6000.700
0.000 0.200 0.400 0.600 0.800 1.000µmol Tyr
Extincție DA 13
20 40 60 100 80 40 20
0 20 40 60 80 100 1205.56.06.57.07.58.08.5DA 7 – U/ml

78

Figura 4.19 Influența pH -ului asupra producției de lipază pentru tulpina DA 10
Figure 4.19 The influence of pH on lipases production for DA10 strain

Figura 4.20 I nfluența pH -ului asupra producției de lipază pentru tulpina DA 13
Figure 4.20 The influence of pH on lipases production for DA13 strain

În figurile 4.18 – 4.20 se observă influența pH -ului asupra productivității enzimelor
lipolitice. Cea mai bună producti vitate a fost obținută de tulpina DA 10 și DA 13 ambele
înregistrând 160 U/ml, urmată de tulpina DA7 cu o productivitate de 100 U/ml.
60 80 120 160 140 80 60
0 20 40 60 80 100 120 140 160 1805.56.06.57.07.58.08.5DA 10 – U/ml
20 80 120 160 140 80 60
0 20 40 60 80 100 120 140 160 1805.56.06.57.07.58.08.5DA 13 – U/ml

79

Figura 4.21 Influența pH -ului asupra producției de amilază pentru tulpina DA 7
Figure 4.21 The influence of pH on amyla ses production for DA7 strain

Figura 4.22 Influența pH -ului asupra producției de amilază pentru tulpina DA 10
Figure 4.22 The influence of pH on amylases production for DA10 strain

0.120 0.450 0.565 0.720 0.840
0.755
0.670
0.580
Martor 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5 8.0 8.5 546NM – DA 7 – 120H
0.120 0.510 0.720 0.905 1.115
0.975
0.785
0.660
Martor 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5 8.0 8.5 546NM – DA 10 – 120H

80

Figura 4.23 Influența pH -ului asupra producției de amilază pentru tu lpina DA 13
Figure 4.23 The influence of pH on amylases production for DA13 strain

Pentru studiul influenței pH -ului asupra producției de amilază bacteriană s -a pornit de la
mediu minimal menționat în Capitolul III – Materiale și Metode, variindu -se val oarea pH între
5,5 și 8,5.
Astfel s -au obținut cele mai bune rezultate pentru tulpina DA10. La pH -ul de 5,5 unități
aceasta a obținut 0,510 U/ml, iar pentru mediu minimal bazic de 8,5 aceasta a înregistrat
valoarea de 0,660 U/ml. Valoarea cea mai bună a f ost egală cu 1,115 U/ml, valoare obținută la
pH-ul de 7,0 unități.
În cazul celor trei tulpini bacteriene luate în experiment se constată o creștere a numărului
de indivizi, odată cu creșterea valorii pH până la 7,0 unități, după care urmează o scădere a masei
bacteriene în mediu bazic.
Se observă de asemenea că tulpinile bacteriene luate în experiment au o rată de producție
enzimatică mai bună în mediul bazic decât în cel acid.

0.120 0.500 0.665 0.780 0.870 0.815
0.705
0.545
Martor 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5 8.0 8.5 546NM – DA 13 – 120H

81

Figura 4.24 Influența pH -ului asupra producției de colagenază pentru tulpi na DA 7
Figure 4.24 The pH influence on colagenasis production for DA7 strain

Figura 4.25 Influența pH -ului asupra producției de colagenază pentru tulpina DA 10
Figure 4.25 The pH influence on colagenasis production for DA10 strain

0.183 0.216 0.259 0.316 0.375 0.341 0.301 0.227
Martor 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5 8.0 8.5 600NM – DA 7 – 120H
0.183 0.231 0.305 0.353 0.399 0.371 0.296 0.225
Martor 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5 8.0 8.5 600NM – DA 10 – 120H

82

Figura 4.26 Influ ența pH -ului asupra producției de colagenază pentru tulpina DA 13
Figure 4.26 The pH influence on colagenasis production for DA13 strain

Din analiza figurilor prezentate mai sus se poate constata ca valoarea optima a pH -ului în
producția de colagenază est e de 7,7 unități. Activitatea enzimatică cea mai crescută a fost
obținută de tulpina DA10 și anume 0,399 U/ml, după 120 de ore de incubare, urmată de DA13
cu 0,396 U/ml.

Figura 4.27 Influența pH -ului asupra producției de keratinază pentru tulpina DA 7
Figure 4.27 The pH influence on keratinasis production for DA7 strain
0.183 0.222 0.302 0.362 0.396 0.377 0.321 0.283
Martor 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5 8.0 8.5 600NM – DA 13 – 120H
0.106 0.120 0.135 0.151 0.167 0.163
0.150
0.139
martor 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5 8.0 8.5
pH 595NM – DA7 – 120H

83

Figura 4.28 Influența pH -ului asupra producției de keratinază pentru tulpina DA 10
Figure 4.28 The pH influence on keratinasis production for DA10 strain

Figura 4.29 Influența pH -ului asupra producției de keratinază pentru tulpina DA 13
Figure 4.29 The pH influence on keratinasis production for DA13 strain

Pe baza analizei rezultatelor prezentate în figurile 4.27 – 4.29 se poate constata că tulpinile
izolate la valoarea de pH 7,0 a mediului au determinat o valoare a activității enzimatice mai mare
decât cele înregistrate la alte valori de pH .
0.106 0.161 0.205 0.247 0.289 0.274
0.231
0.199
martor 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5 8.0 8.5
pH 595NM – DA 10 – 120H
0.106 0.121 0.153 0.191 0.219
0.201
0.185 0.177
martor 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5 8.0 8.5
pH 595NM – DA 13 – 120H

84
Deoarece enzimele sunt proteine funcționale, proprietățile lor sunt puternic influențate de
valorile pH -ului mediului de cultivare. S -a consta tat că pe mediile naturale la un pH de 5,5 – 8,5
se limitează fenomenul de disociere, astfel încât acumularea enzimei proteolitice este maximă.
Procesul de agitare al mediului de cultură permite o eficientă disponibilitate a nutrienților
pentru celulele mi croorganismelor, însă la valori de agitare prea mari se poate instala un stres
intens al culturii, având consecințe grave în producția de enzime.
Pentru a se determina influența agitării asupra biosintezei de proteaze s -au efectuat
determinari ale activită ții enzimatice și activității enzimatice specifice utilizând un mediu
minimal inoculat tulpinile izolate la diferite valori de agitare (100 rpm, 135 rpm și 170 rpm)
pentru 120 h.

Figura 4.30 Influența agitării asupra producției de protează 578nm pentru tulpina DA 7
Figure 4.30 The influence of shaking on proteasis production at 578nm for DA7 strain
0.300, 0.420 0.618, 0.865 0.306, 0.428
0.0000.1000.2000.3000.4000.5000.6000.7000.8000.9001.000
0.000 0.100 0.200 0.300 0.400 0.500 0.600 0.700µmol Tyr
Extincție DA7

85

Figura 4.31 Influența agitării asupra producției de protează 578nm pentru tulpina DA 10
Figure 4.31 The influence of shaking on proteasis production at 578 nm for DA710 strain

Figura 4.32 Influența agitării asupra producției de protează 578nm pentru tulpina DA 13
Figure 4.32 The influence of shaking on proteasis production at 578nm for DA13 strain

In tabelele 4.30 – 4.32 sunt prezentate rezultatele obțin ute privind influența diferitelor
valori de agitare asupra acumulării enzimelor proteolitice pentru tulpinile izolate. 0.488, 0.683 0.731, 1.023
0.519, 0.726
0.0000.2000.4000.6000.8001.0001.200
0.000 0.100 0.200 0.300 0.400 0.500 0.600 0.700 0.800µmol Tyr
Extincție DA10
0.306, 0.428 0.696, 0.974
0.324, 0.453
0.0000.2000.4000.6000.8001.0001.200
0.000 0.100 0.200 0.300 0.400 0.500 0.600 0.700 0.800µmol Tyr
Extincție DA13

86

Figura 4.33 Influența agitării asupra producției de lipază la 100 rpm
Figure 4.33 The influence of shaking on lipasis production at 100 rpm

Figura 4.34 Influența agitării asupra producției de lipază la 135 rpm
Figure 4.34 The influence of shaking on lipasis production at 135 rpm

20 80 40
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90DA7DA10DA13100 rpm
40 100 60
0 20 40 60 80 100 120DA7DA10DA13135 rpm

87

Figura 4.35 Influența agitării asupra producției de lipază la 170 rpm
Figure 4.35 The influence of shak ing on lipasis production at 170 rpm

În urma determinărilor efectuate se constată că producția maximă de lipază este la 135 rpm
și anume de 100 U/ml pentru tulpina DA10, determinare foarte utilă în stabilirea parametrilor
optimi de producție enzimatică.

Figura 4.36 Influența agitării asupra producției de keratinază 595nm la 100 rpm
Figure 4.36 The influence of shaking on keratinasis production at 100 rpm, 595nm
20 60 40
0 10 20 30 40 50 60 70DA7DA10DA13170 rpm
0.107 0.177 0.191 0.183
0.0000.0500.1000.1500.2000.250
Martor DA7 DA10 DA13100 rpm – 120h

88

Figura 4.37 Influența agitării asupra producției de keratinază 595nm la 135 rpm
Figure 4.3 7 The influence of shaking on keratinasis production at 135 rpm, 595nm

Figura 4.38 Influența agitării asupra producției de keratinază 595nm la 170 rpm
Figure 4.38 The influence of shaking on keratinasis production at 170 rpm, 595nm

Se constată că se obțin valori diferite pentru tulpinile izolate luate în calcul. Datele
corelează cu cele din literatură care prezintă o agitare optimă în jurul valorii de 135 rpm.
Valoarea cea mai bună în producția de keratinază a fost obținută de tulpina DA10 și anume 0, 254
U/ml. O valoare bună a fost inregistrată si la 170 rpm, unde s -au înregistrat 0,238 U/ml pentru 0.106 0.192 0.254
0.232
0.0000.0500.1000.1500.2000.2500.300
Martor DA7 DA10 DA13135 rpm – 120h
0.103 0.179 0.238
0.187
0.0000.0500.1000.1500.2000.250
Martor DA7 DA10 DA13170 rpm – 120h

89
tulpina DA10, 0,187 U/ml pentru tulpina DA13, iar pentru izolata DA7, valoarea a fost de 0,179
U/ml.

Figura 4.39 Influența agitării asupra producției de amilază 546nm la 100 rpm
Figure 4.39 The influence of shacking on amylazis production, 546 nm, 100 rpm

Figura 4.40 Influența agitării asupra producției de amilază 546nm la 135 rpm
Figure 4.40 The influence of shacking on amylazis production, 546 nm, 135 rpm

0.111 0.168 0.184 0.171
0.000 0.020 0.040 0.060 0.080 0.100 0.120 0.140 0.160 0.180 0.200MartorDA7DA10DA13100 rpm – amilază 546nm
0.114 0.186 0.233 0.212
0.000 0.050 0.100 0.150 0.200 0.250MartorDA7DA10DA13135 rpm – amilază 546nm

90

Figura 4.41 Influența agitării asupra producției de amilază 546nm la 170 rpm
Figure 4.41 The influence of shacking on amylazis production, 546 nm, 170 rpm

Se observă că cele mai bune valori ale producției de amilază se obțin în jurul valorii de 135
rpm. Potențialul maxim al acestei valori este de 0,186 U/ml/min pentru tulpina DA7, 0,233
U/ml/min pentru tulpina DA10, iar pentru tulpina DA13 valoarea productivității maxime este de
0,212 U/ml/min., după 120 de ore de incubare. La celelalte valori se constată o ușoară scădere a
activităților enzimatice.

Figura 4.42 Influența agitării asupra producției de colagenază 600nm la 100 rpm
Figure 4.42 The influence of shacking on colagenasis production, 600nm, 100rpm
0.112 0.170 0.218 0.186
0.000 0.050 0.100 0.150 0.200 0.250MartorDA7DA10DA13170 rpm – amilază 546nm
0.180 0.308 0.346
0.316
0.0000.0500.1000.1500.2000.2500.3000.3500.400
Martor DA7 DA10 DA13100 rpm – 120h – colagenază 600nm

91

Figura 4.43 Influența agitării asupr a producției de colagenază 600nm la 135 rpm
Figure 4.43 The influence of shacking on colagenasis production, 600nm, 135 rpm

Figura 4.44 Influența agitării asupra producției de colagenază 600nm la 170 rpm
Figure 4.44 The influence of shacking on colagen asis production, 600nm, 170 rpm

Pe baza rezultatelor prezentate în tabelele 4.42 – 4.44 se poate concluziona că
determinările efectuate au fost utile în aflarea valorii optime de agitare pentru producția de
colagenază cu ajutorul tulpinilor izolate.
0.182 0.385 0.415
0.391
0.0000.0500.1000.1500.2000.2500.3000.3500.4000.450
Martor DA7 DA10 DA13135 rpm – 120h – colagenază 600nm
0.185 0.312 0.351 0.342
0.0000.0500.1000.1500.2000.2500.3000.3500.400
Martor DA7 DA10 DA13170 rpm – 120h – colagenază 600nm

92
4.2.2 Biosinteza unui preparat enzimatic (cu tulpinile izolate) capabil să degradeze
pielea naturală.

4.2.2.1 Dinamica acumulării în culturi submerse a proteazelor produse cu tulpini
izolate.

Cele trei tulpini bacteriene selectate în urma screeningului au f ost utilizate în urmatoarele
experimentări privind dinamica acumularii în culturi submerse a proteazelor bacteriene.
Pentru experimentări se folosește ca mediu de cultivare un mediu minimal a cărui
compoziție este prezentată în Capitolul III – Materiale și metode.
Condițiile de cultivare sunt similare cu cele de la screening, iar pe parcursul procesului de
biosinteză se iau probe la 24h, 48h, 72h, 96, 120h, față de proba martor, momentul inițierii
creșterii culturii respective. Acestea sunt analizate din pu nct de vedere al activității enzimatice
proteolitice și activității enzimatice specifice, cum ar fi activitatea lipolitică, keratinolitică,
colagenazică si activitatea amilolitică.
Culturile de bacterii isolate prezintă valori diferite ale acumulării de en zime proteolitice în
mediul de cultivare, în funcție de componentele acestuia.
În figura 4.45 este prezentată dinamica acumulării proteazei în cazul cultivării pe mediul
minimal a tulpinii DA7, iar in figurile 4.46 și 4.47 dinamica acumulării proteazei în cazul
cultivării tulpinii DA10 și respectiv DA13 față de martor 0.118.

Figura 4.45 Dinamica acumulării proteazelor bacteriene pentru tulpina DA 7
Figure 4.45 The dynamic of bacterial proteasis accumulation for DA 7
0.213 0.397 0.486 0.737 0.899
24 48 72 96 120DA7 – 578 nm

93

Figura 4.46 Dinamica acumulării prot eazelor bacteriene pentru tulpina DA 10
Figure 4.46 The dynamic of bacterial proteasis accumulation for DA 10

Figura 4.47 Dinamica acumulării proteazelor bacteriene pentru tulpina DA 13
Figure 4.47 The dynamic of bacterial proteasis accumulation for DA 13

Pe baza rezultatelor prezentate în figurile de mai sus se poate concluziona că cea mai
ridicată producție de protează se realizează în cazul cultivării tulpini DA10 pe mediul minimal
egală cu 0,988U/ml/min, urmată de activitatea enzimatica tulpinii DA 13 de 0,900U/ml/min și o
activitate proteolitică de 0,899U/ml/min înregistrată de tulpina DA7, în condițiile date; 35oC si
135 rpm.
Rezultatele obținute în urma experimetelor, sunt conforme cu datele din literatura de
specialitate potrivit cărora o concent rație mai mare de substrat (blană) induce formarea unor
0.396 0.566 0.701 0.811 0.988
24 h 48 h 72 h 96 h 120 hDA10 – 578 nm
0.291 0.399 0.517 0.766 0.900
24 h 48 h 72 h 96 h 120 hDA13 – 578 nm

94
cantități mai mari de enzimă (efectul inductor al substratului asupra capacității de biosinteză al
enzimei de către microorganism).
Experimentările au continuat cu optimizarea biosintezei proteazelor bacteriene. În cadrul
acestor experimentări s -au folosit cele trei tulpini isolate, selectate în urma screeningului , iar în
ceea ce privește optimizarea mediului de cultură s -a plecat de la mediu minimal, având ca unică
sursă de carbon blană tăbăcită, și s -a încercat obținerea unei formule a mediului de cultură care
să determine obținerea unei cantități sporite de enzime proteolitice.

4.2.2.2 Influența sursei de carbon

Pentru studiul influenței sursei de carbon s -a pornit de la mediul minimal care a f ost
menținut constant, ce conținea în compoziția sa 0.6 g blană naturală și sintetică, care reprezintă
unica sursa de carbon. Din analizele efectuate este vizibilă diferența de producție enzimatică
proteolitică dintre probele care au conținut blană natural ă și probele care au conținut blană
sintetică. Datele obținute în urma experimentărilor sunt prezentate în figura 4.48, figura 4.49,
figura 4.50.
Datele obținute au indicat existența în probele conținând eșantioane de piele sintetică a
unei mici cantitată ți de proteine, deoarece microorganismele nu pot utiliza materialul sintetic
drept sursă nutritivă. Totuși, acest conținut proteic nu poate fi explicat doar prin prezența
accidentală a proteinelor pe blană, provenind din condițiile de manipulare a material elor.
În probele conținând piele și blană naturale au fost determinate cantități de proteină
cuprinse între 0,800 – 0,793 mg/ml, ceea ce indică faptul că microorganismele își sintetizează
cantitatea de proteină necesară pornind de la sursele de carbon și a zot oferite.
Și în probele care au utilizat drept substrat blana sintetică a fost detectată o activitate
enzimatică, ceea ce poate fi explicată prin activitatea reziduală provenită din inocul (inoculul
fiind reprezentat de suspensie bacteriană cultivată pe blana naturală) și de creșterea încă o
anumită perioadă de timp a bacteriilor utilizând drept substrat componentele nutritive din inocul
sau din celulele bacteriene moarte. O alta posibilă explicație ar fi ca esantioanele utilizate în
acest experiment să conțină un adaos de fibre naturale.
Determinarea activității enzimatice proteolitice și a activității enzimatice specifice s -a
realizat la 120 ore față de momentul inoculării, moment al acumulării maxime a enzimelor în
mediu și în care concentrația celular ă este foarte ridicată, față de martor 0,179.

95

Figura 4.48 Determinarea activității proteolitice pentru tulpina DA10 folosind ca sursă de carbon
blană naturală și blană sintetică.
Figure 4.48 Determination of proteolytic activity for DA10 strain unsing a s unique souce of
carbon natural and syntetic fur

Figura 4.49 Determinarea activității proteolitice pentru tulpina DA7 folosind ca sursă de carbon
blană naturală și blană sintetică.
Figure 4.49 Determination of proteolytic activity for DA7 strain unsin g as unique souce of
carbon natural and syntetic fur
0.179 0.266 0.494 0.617 0.695 0.800
0.184 0.199 0.228 0.269 0.315
0.0000.1000.2000.3000.4000.5000.6000.7000.8000.900
Martor 24 48 72 96 120DA10 – 120 h, pH 7.0, 135 rpm
DA10 DA10
0.179 0.231 0.415 0.586 0.638 0.793
0.180 0.196 0.220 0.267 0.299
0.0000.1000.2000.3000.4000.5000.6000.7000.8000.900
Martor 24 48 72 96 120DA7 – 120 h, pH 7.0, 135 rpm
DA7 DA7

96

Figura 4.50 Determinarea activității proteolitice pentru tulpina DA13 folosind ca sursă de carbon
blană naturală și blană sintetică.
Figure 4.50 Determination of proteolytic activity for DA13 strain unsing as unique souce of
carbon natural and syntetic fur

Din analiza datelor prezentate în tabelele de mai sus, se poate concluziona că blana
naturală este cea mai potrivită sursă de carbon, înregistrându -se valori semnificative de producție
proteazic ă în cazul tulpinilor izolate DA7, DA10, DA13.
Pe baza rezultatelor prezentate în figurile de mai sus se poate concluziona că valoarea
concentra ției de proteină stabilita initial (0.6 g) în conformitate cu datele din literatura de
specialitate, pentru medi ul minimal, s -a dovedit a fi cea mai potrivită pentru producerea unei
cantități maxime de protează.
Cele 3 culturi au prezentat o dinamică asemanătoare a acumulării de protează, în care la
concentrații mai mari de 0.6% a proteinelor în mediu, producția de enzimă este în scadere,
deoarece când concentrația de proteină este prea mică (de exemplu 0.1%) cantitatea de biomasă
dezvoltată este mai mică și ca urmare cantitatea de enzimă biosintetizată este mai mică, iar când
concentrația substratului este prea mare (de exemplu 1%) are loc fenomenul inhibiției
microorganismului prin concentrația de substrat.
Tot ca influența a sursei de carbon, s -a studiat și efectul penelor asupra creșterii
microorganismelor și producerii de protează bacteriană.
S-au făcut determin ări pentru cele 3 tulpini bacteriene pe mediul minimal, înlocuindu -se
blana cu sursele de carbon mentionate mai sus.
Ca și în cazul testării activității enzimatice folosind blana ca sursă de carbon, am realizat
un screening al tulpunilor izolate pentru obț inerea de enzime utilizând penele ca unică sursa de 0.179 0.251 0.388 0.450 0.598 0.796
0.182 0.191 0.238 0.341 0.395
0.0000.1000.2000.3000.4000.5000.6000.7000.8000.900
Martor 24 48 72 96 120DA13 – 120 h, pH 7.0, 135 rpm
DA13 DA13

97
azot și carbon, menținând aceiași parametrii de cultivare, respectiv, 135 rpm, 35oC, mediu
minimal cu un pH de 7,2 unități.

Figura 4.51 Influențele sursei de carbon asupra producției de proteaza la 578 nm pentru tulpina
DA7
Figure 4.51 The carbon souces influence on proteasis production at 578 nm for DA7 strain

Figura 4.52 Influențele sursei de carbon asupra producției de proteaza la 578 nm pentru tulpina
DA10
Figure 4.52 The carbon souces influence on proteasis production at 578 nm for DA10 strain

0.177 0.216 0.264 0.315 0.410 0.479
Martor 24 48 72 96 120
Ore DA7
0.177 0.360 0.402 0.464 0.512 0.615
Martor 24 48 72 96 120
Ore DA10

98

Figura 4.53 Influențele sursei de carbon asupra producției de proteaza la 578 nm pentru tulpina
DA13
Figure 4.53 The carbon souces influence on proteasis production at 578 nm for DA13 strain

Pentru det erminarea temperaturii optime de acțiune s -a determinat activitatea enzimatică
proteolitică în intervalul de temperature 10oC – 70oC. Pentru toate variantele testate condițiile
experimentale au fost identice – timpul de incubare, rotațiile per minut, pH -ul, concentrația
substratului, singurul element care a variat fiind valoarea temperaturii.
Experimentele au continuat cu determinarea activităților enzimatice specifice, urmărindu –
se aceeași parametrii ca și în cazul determinarilor realizate anterior.

0.177 0.313 0.396 0.430 0.499 0.533
Martor 24 48 72 96 120
Ore DA13

99
Tabe l 4.9
Tabel 4.9
Rezutatele obținute pentru tulpina DA7 în urma screeningului la diferite temperaturi
The screening results for DA7 strain at different temperatures

oC
Timp 24 h 48 h 72 h 96 h 120 h
10 0C 0,189 0,215 0,319 0,378 0,401
15 0C 0,197 0,251 0,298 0,393 0,431
20 0C 0,205 0,299 0,375 0,419 0,496
25 0C 0,232 0,294 0,381 0,422 0,506
30 0C 0,293 0,384 0,417 0,500 0,598
35 0C 0,301 0,396 0,453 0,575 0,686
40 0C 0,295 0,379 0,441 0,495 0,581
45 0C 0,240 0,288 0,317 0,402 0,499
50 0C 0,215 0,263 0,308 0,379 0,474
55 0C 0,213 0,255 0,303 0,368 0,395
60 0C 0,206 0,242 0,278 0,316 0,351
65 0C 0,198 0,223 0,266 0,280 0,302
70 0C 0,183 0,189 0,194 0,197 0,201

100
Tabel 4.10
Tabel 4.10
Rezutatele obținute pentru tulpina DA10 în urma scr eeningului la diferite temperaturi
The screening results for DA10 strain at different temperatures

oC
Timp 24 h 48 h 72 h 96 h 120 h
10 0C 0,207 0,300 0,372 0,435 0,490
15 0C 0,278 0,317 0,388 0,445 0,493
20 0C 0,307 0,396 0,415 0,463 0,499
25 0C 0,331 0,398 0,425 0,481 0,502
30 0C 0,384 0,421 0,484 0,525 0,618
35 0C 0,407 0,487 0,554 0,602 0,697
40 0C 0,388 0,435 0,496 0,549 0,606
45 0C 0,320 0,402 0,445 0,503 0,529
50 0C 0,299 0,331 0,367 0,391 0,422
55 0C 0,275 0,321 0,351 0,382 0,412
60 0C 0,219 0,285 0,316 0,379 0,393
65 0C 0,200 0,241 0,292 0,328 0,354
70 0C 0,189 0,195 0,206 0,217 0,238

101
Tabel 4.11
Tabel 4.11
Rezutatele obținute pentru tulpina DA13 în urma screeningului la diferite temperaturi
The screening results for D A13 strain at different temperatures

În urma screenigului de temperatură se observă că cea mai bună creștere a înregistrat -o, în
continuare, tulpina DA10, urmată de tulpina DA13, ambele având randamentul maxim la
temperaturi cuprinse intre 30oC și 40oC.

oC
Timp 24 h 48 h 72 h 96 h 120 h
10 0C 0,203 0,226 0,284 0,350 0,454
15 0C 0,241 0,297 0,348 0,415 0,473
20 0C 0,289 0,315 0,370 0,425 0,487
25 0C 0,223 0,328 0,400 0,461 0,498
30 0C 0,361 0,413 0,462 0,498 0,521
35 0C 0,399 0,475 0,532 0,602 0,672
40 0C 0,372 0,421 0,487 0,515 0,600
45 0C 0,311 0,369 0,407 0,448 0,518
50 0C 0,277 0,313 0,344 0,380 0,405
55 0C 0,251 0,298 0,337 0,376 0,402
60 0C 0,211 0,272 0,302 0,339 0,374
65 0C 0,193 0,231 0,275 0,304 0,351
70 0C 0,185 0,191 0,200 0,210 0,219

102
Tabel 4.12
Tabel 4.12
Influența temperaturii asupra producției de protează pentru tulpina DA7
The temperature influence on proteasis production for DA7 strain

Temperatură Extincție µmol Tyr
10 0C 0,223 0,312
15 0C 0,253 0,354
20 0C 0,318 0,445
25 0C 0,328 0,459
30 0C 0,420 0,588
35 0C 0,508 0,711
40 0C 0,403 0,564
45 0C 0,321 0,449
50 0C 0,296 0,414
55 0C 0,217 0,303
60 0C 0,173 0,242
65 0C 0,124 0,173
70 0C 0,023 0,032

103
Tabel 4.13
Tabel 4.13
Influența temp eraturii asupra producției de protează pentru tulpina DA10
The temperature influence on proteasis production for DA10 strain

Temperatură Extincție µmol Tyr
10 0C 0,312 0,436
15 0C 0,315 0,441
20 0C 0,321 0,449
25 0C 0,324 0,453
30 0C 0,440 0,616
35 0C 0,519 0,726
40 0C 0,428 0,599
45 0C 0,351 0,491
50 0C 0,244 0,341
55 0C 0,234 0,327
60 0C 0,215 0,301
65 0C 0,176 0,246
70 0C 0,060 0,084

104
Tabel 4.14
Tabel 4.14
Influența temperaturii asupra producției de protează pentru tulp ina DA13
The temperature influence on proteasis production for DA13 strain

În urma testării temperaturii am determinat producția de protează bacteriană, obținută
utilizând metoda Anson (1938). Din experimentări s e constată că producția de protează creste
până la temperatura de 35oC, dupa care urmează o scadere a productivității enzimatice.

Temperatură Extincție µmol Tyr
10 0C 0,276 0,386
15 0C 0,295 0,413
20 0C 0,309 0,432
25 0C 0,320 0,448
30 0C 0,343 0,480
35 0C 0,494 0,691
40 0C 0,422 0,590
45 0C 0,340 0,476
50 0C 0,224 0,317
55 0C 0,227 0,313
60 0C 0,225 0,316
65 0C 0,173 0,242
70 0C 0,041 0,057

105

Figura 4.54 Influența temperaturii asupra producției de lipază
Figure 4.54 The temperature influence on lipases productio n

Pe baza rezultatelor prezentate în graficul din figura 4.54 se poate constata ca enzima are o
temperatură optimă de acțiune în jurul valorii de 35oC. Ca și in cazul celorlalte determinări se
observă o usoară scadere a productivității enzimelor lipolitic e, producția bacteriană fiind stabilă
până la temperatura de 40oC când își menține activitatea enzimatică. La temperatura de 70oC
tulpina înregistrează o valoare enzimatică mai mica ca la temperatura de 10oC.

Figura 4.55 Influența temperaturii asupra pro ducției de keratinază pentru tulpina DA7
Figure 4.55 The temperature influence on ketratinase production for DA7 strain
10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70
DA7 40 40 60 80 100 120 100 80 80 60 40 40 20
DA10 60 60 60 80 100 140 120 100 60 60 60 40 20
DA13 40 60 60 60 80 100 80 60 60 40 40 40 20020406080100120140160Influența temperaturii asupra producției de lipază
0.123 0.145 0.178 0.192 0.213 0.254 0.250
0.231
0.215 0.201
0.184
0.135
0.120
0.0000.0500.1000.1500.2000.2500.300
0 10 20 30 40 50 60 70 80
Temperatura DA7

106

Figura 4.56 Influența temperaturii asupra producției de keratinază pentru tulpina DA10
Figure 4.56 The temperature influence on ketra tinase production for DA10 strain

Figura 4.57 Influența temperaturii asupra producției de keratinază pentru tulpina DA13
Figure 4.57 The temperature influence on ketratinase production for DA13 strain

Din figurile 4.55 – 4.57 se constată că temperatura are o mare influență asupra producției
de keratinază, având productivitatea cea mai crescută în jurul valorii de 35oC, respectiv 0,328
U/ml obținută cu tulpina DA10, apoi urmând o scădere a producțivității enzimatice după
temperatura de 50oC. 0.136 0.171 0.199 0.241 0.289 0.328
0.307
0.281
0.243
0.220
0.201
0.183
0.134
0.0000.0500.1000.1500.2000.2500.3000.350
0 10 20 30 40 50 60 70 80
Temperatura DA10
0.129 0.166 0.183 0.205 0.261 0.292 0.284
0.262
0.228
0.208
0.186
0.160
0.129
0.0000.0500.1000.1500.2000.2500.3000.350
0 10 20 30 40 50 60 70 80
Temperatura DA13

107

Figura 4.5 8 Influența temperaturii asupra producției de amilază 546nm pentru tulpina DA7
Figure 4.58 The temperature influence on amilase production for DA7 strain, 546nm

Figura 4.59 Influența temperaturii asupra producției de amilază 546nm pentru tulpina DA10
Figure 4.59 The temperature influence on amilase production for DA10 strain, 546nm

0.205 0.430 0.670 0.750 0.855 0.935
0.880
0.795
0.690
0.450
0.225
0.110
0.055
10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70
Temperatura DA7
0.350 0.495 0.765 0.860 1.010 1.220
1.130
0.955
0.800
0.480
0.280
0.150
0.070
10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70
Temperatura DA10

108

Figura 4.60 Influența temperaturii asupra producției de amilază 546nm pentru tulpina DA13
Figure 4.60 The temperature influence on amilase production for DA13 strain, 546 nm

Pe baza rezultatelor prezentate în figurile de mai sus se poate concluziona că producția de
amilază cea mai ridicată se realizează în cazul cultivării tulpinii DA10, pe mediu minimal,la o
temperatură de 35oC la un pH egal cu 7,2 unități, și anume 1,2 20 U/ml/min, urmată de tulpina
DA13 cu 1,180 U/ml/min. În cazul temperaturilor de 70oC, producția amilolitică este foarte
slabă, respective 0,060 U/ml/pentru tulpina DA13, 0,070 U/ml pentru tulpina DA10, iar tulpina
DA7 a înregistrat valoarea de 0,055U/ml.

0.315 0.500 0.740 0.800 1.000 1.180
0.995
0.850
0.735
0.565
0.255
0.115 0.060
10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70
Temperatura DA13

109

Figura 4.61 Influența temperaturii asupra producției de colagenază 600nm
Figure 4.61 The temperature influence on colagenasis production at 600nm

10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70
DA7 0.192 0.217 0.288 0.312 0.368 0.399 0.386 0.361 0.322 0.308 0.266 0.213 0.181
DA10 0.211 0.232 0.296 0.327 0.391 0.418 0.413 0.396 0.338 0.315 0.284 0.226 0.197
DA13 0.208 0.221 0.290 0.318 0.384 0.404 0.389 0.372 0.329 0.310 0.275 0.219 0.1850.0000.0500.1000.1500.2000.2500.3000.3500.4000.450Influența temperaturii asupra producției de colagenaz ă
600nm
DA7 DA10 DA13
Tabel 4.15
Tabel 4.15
Influența agitării asupra producției de biomasă bacteriană, 100 rpm
The shackin g influence on bacterial biomass production, 100 rpm
Tulpina
Timp 24 h 48 h 72 h 96 h 120 h
DA 7 0,281 0,352 0,393 0,474 0,498
DA 10 0,306 0,384 0,407 0,491 0,554
DA 13 0,294 0,375 0,401 0,483 0,548
Tabel 4.16
Tabel 4.16
Influența agitării asupra producției de biomasă bacteriană, 135 rpm

110

În urma screeningului turbidității se observă în tabelele 4.15 – 4.17 că agitarea are o
influență asupra producției de biomasă bacteriană.
În figurile 4.62 – 4.68 este relatată activitatea enzimatică s pecifică, rezultată în urma
testării tulpinilor isolate la diferite rotații per minut.
The shacking influence on bacterial biomass production, 135 rpm
Tulpina
Timp 24 h 48 h 72 h 96 h 120 h
DA 7 0,341 0,399 0,469 0,517 0,588
DA 10 0,384 0,409 0,487 0,536 0,596
DA 13 0,360 0,402 0,476 0,523 0,593
Tabel 4.17
Tabel 4.17
Influența agitării asupra producției de biomasă bacteriană, 170 rpm
The shacking influence on bacterial biomass production, 170 rpm
Tulpina
Timp 24 h 48 h 72 h 96 h 120 h
DA 7 0,299 0,340 0,391 0,428 0,470
DA 10 0,313 0,389 0,417 0,439 0,493
DA 13 0,309 0,348 0,396 0,428 0,486

111

Figura 4.62 Influența agitării asupra producției de protează 578nm la 100 rpm
Figure 4.62 The shaking influence on proteasis production, 578 nm, 100 rpm

Figura 4. 63 Influența agitării asupra producției de protează 578nm la 135 rpm
Figure 4.63 The shaking influence on proteasis production, 578 nm, 135 rpm

0.290 0.324 0.381 0.414 0.482
0.395 0.460 0.502 0.599 0.670
0.301 0.329 0.395 0.424 0.488
0.000 0.100 0.200 0.300 0.400 0.500 0.600 0.700 0.80024487296120100 rpm
DA 13
DA 10
DA 7
0.387 0.471 0.500 0.579 0.802
0.461 0.502 0.564 0.701 0.915
0.405 0.490 0.515 0.689 0.880
0.000 0.200 0.400 0.600 0.800 1.00024487296120135 rpm
135rpm

112

Figura 4.64 Influența agitării asupra producției de protează 578nm la 170 rpm
Figure 4.64 The shaking influen ce on proteasis production, 578 nm, 170 rpm

Figura 4.65 Influența agitării asupra producției de lipază
Figure 4.65 The shaking influence on lipases production

0.304 0.329 0.392 0.424 0.487
0.397 0.431 0.519 0.604 0.700
0.311 0.353 0.398 0.431 0.505
0.000 0.100 0.200 0.300 0.400 0.500 0.600 0.700 0.80024487296120170 rpm
170rpm
20 40
20 80 100
60
40 60
40
020406080100120
100 135 170
rpm Influența agit ării asupra producției de lipază
DA7
DA10
DA13

113

Figura 4.66 Influența agitării asupra producției de keratinază 595nm
Figure 4.66 The shaki ng influence on ketratinases production, 595 nm

Figura 4.67 Influența agitării asupra producției de amilază 546nm
Figure 4.67 The shaking influence on amilases production, 546 nm

100 135 170
DA7 0.177 0.192 0.179
DA10 0.191 0.254 0.238
DA13 0.183 0.232 0.187
Martor 0.107 0.106 0.1030.0000.0500.1000.1500.2000.2500.300Influența agitării asupra producției de keratinază 595
DA7
DA10
DA13
Martor
0.168 0.186 0.170
0.184 0.233 0.218
0.171 0.212 0.186
0.111 0.114 0.112
0.000 0.050 0.100 0.150 0.200 0.250100135170Influența agitării asupra producției de amilază 546
Martor
DA13
DA10
DA7

114

Figura 4.68 Influența agitării asupra producției de colagenază 600nm
Figure 4.68 The shaking influence on cloagenase production, 600nm

100 135 170
DA7 0.308 0.385 0.312
DA10 0.346 0.415 0.351
DA13 0.316 0.391 0.342
Martor 0.180 0.182 0.1850.0000.0500.1000.1500.2000.2500.3000.3500.4000.450Influența agitării asupra producției de colagenază
600nm
Tabel 4.18
Tabel 4.18
Evoluția producției de protează cu tulpina DA7 în funcție de valorile pH, față de martor 0,179
.The evolution of DA7 strains proteinase production, about the pH scale against the 0.179 blank
pH
Timp 24 h 48 h 72 h 96 h 120 h
5.5 pH 0,180 0,187 0,193 0,198 0,215
6.0 pH 0,183 0,189 0,196 0,200 0,221
6.5 pH 0,194 0,253 0,297 0,354 0,387
7.0 pH 0,213 0,319 0,398 0,509 0,535
7.5 pH 0,212 0,304 0,393 0,441 0,575
8.0 pH 0,203 0,262 0,309 0,375 0,414
8.5 pH 0,200 0,212 0,237 0,283 0,302

115

S-a realizat un screening al influenței pH -ului asupra dezvoltării biomasei, (Tabelele 4.18 –
4.20) precum și testări asupra producției de enzime specifice (Figu rile 4.69 – 4.79).
În urma testărilor se constată că cea mai bună activitate a fost înregistrată de tulpina DA10,
urmată de tulpina DA13.
Tabel 4.19
Tabel 4.19
Evoluția producției de protează cu tulpina DA10 în funcție de valorile pH, față de martor 0,179
The evolution of DA10 strains proteinase production, abo ut the pH scale against the 0.179 blank
pH
Timp 24 h 48 h 72 h 96 h 120 h
5.5 pH 0,189 0,197 0,203 0,219 0,237
6.0 pH 0,193 0,199 0,211 0,228 0,286
6.5 pH 0,199 0,257 0,300 0,368 0,395
7.0 pH 0,230 0,329 0,408 0,515 0,641
7.5 pH 0,226 0,318 0,399 0,487 0,584
8.0 pH 0,210 0,271 0,318 0,380 0,419
8.5 pH 0,205 0,224 0,257 0,303 0,355
Tabel 4.20
Tabel 4.20
Evoluția producției de protează cu tulpina DA13 în funcție de valorile pH, față de martor 0,179
The evolution of DA13 strains proteinase producti on, about the pH scale against the 0.179 blank
pH
Timp 24 h 48 h 72 h 96 h 120 h
5.5 pH 0,183 0,190 0,198 0,205 0,217
6.0 pH 0,189 0,197 0,209 0,222 0,273
6.5 pH 0,198 0,255 0,304 0,354 0,390
7.0 pH 0,216 0,324 0,399 0,428 0,597
7.5 pH 0,221 0,313 0,383 0,422 0,580
8.0 pH 0,206 0,259 0,302 0,366 0,417
8.5 pH 0,201 0,233 0,259 0,283 0,321

116

Figura 4.69 Influența pH -ului asupra producției de protează 578nm pentru tulpina DA7
Figure 4.69 The pH influence on DA7 strain proteases production, 578 nm

Figura 4.70 Influența pH -ului asupra producției de protează 578nm pentru tulpina DA10
Figure 4.70 The pH influence on DA10 strain proteases production, 578 nm

0.036, 0.050
0.042, 0.058 0.208, 0.291 0.406, 0.568
0.396, 0.554 0.235, 0.329
0.123, 0.172
0.0000.1000.2000.3000.4000.5000.6000.700
0.000 0.050 0.100 0.150 0.200 0.250 0.300 0.350 0.400 0.450µmol Tyr
Extincție DA7
0.058, 0.081
0.107, 0.149 0.216, 0.302 0.462, 0.646
0.405, 0.567 0.240, 0.336
0.176, 0.246
0.0000.1000.2000.3000.4000.5000.6000.700
0.000 0.100 0.200 0.300 0.400 0.500µmol Tyr
Extincție DA10

117

Figura 4.71 Influența pH -ului asupra producție i de protează 578nm pentru tulpina DA13
Figure 4.71 The pH influence on DA13 strain proteases production, 578 nm

Figura 4.72 Influența pH -ului asupra producției de lipază pentru tulpina DA7
Figure 4.72 pH influence on lipases production for DA7 strain 0.038, 0.053
0.094, 0.131 0.211, 0.295 0.418, 0.585
0.401, 0.561 0.238, 0.333
0.142, 0.198
0.0000.1000.2000.3000.4000.5000.6000.700
0.000 0.100 0.200 0.300 0.400 0.500µmol Tyr
Extincție DA13
40 60 80 140 120 100 60
5.5 6.0 6.5 7.0 7.5 8.0 8.5 pH DA 7 – U/ML

118

Figura 4.73 Influența pH -ului asupra producției de lipază pentru tulpina DA10
Figure 4.73 pH influence on lipases production for DA10 strain

Figura 4.74 Influența pH -ului asupra producției de lipază pentru tulpina DA13
Figure 4.74 pH influence on lip ases production for DA13 strain

60 120 140 160 140 120 100
5.5 6.0 6.5 7.0 7.5 8.0 8.5 pH DA 10 – U/ML
20 80 100 120 100 80 60
5.5 6.0 6.5 7.0 7.5 8.0 8.5 pH DA 13 – U/ML

119

Figura 4.75 Influența pH -ului asupra producției de keratinază la 595nm pentru tulpina DA7
Figure 4.75 pH influence on keratinases production at 595 nm for DA7 strain

Figura 4.76 Influența pH -ului asupra producției d e keratinază 595 pentru tulpina DA10
Figure 4.76 pH influence on keratinases production at 595 nm for DA10 strain

0.125 0.221 0.253 0.276 0.318
0.291
0.263 0.245
Martor 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5 8.0 8.5
pH DA 7 – U/ml
0.125 0.232 0.284 0.310 0.356 0.341
0.297
0.269
Martor 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5 8.0 8.5
pH DA 10 – U/ml

120

Figura 4.77 Influența pH -ului asupra producției de keratinază 595 pentru tulpina DA13
Figure 4.77 pH influence on keratinases production at 595 nm for DA13 strain

Figura 4.78 Influența pH -ului asupra producției de amilază la 546nm
Figure 4.78 pH influence on amilases production at 546 nm
0.125 0.229 0.263 0.296 0.344 0.326
0.277
0.250
Martor 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5 8.0 8.5
pH DA 13 – U/ml
5.5 6.0 6.5 7.0 7.5 8.0 8.5
DA 7 0.100 0.155 0.245 0.405 0.340 0.265 0.160
DA 10 0.125 0.200 0.255 0.435 0.400 0.335 0.180
DA 13 0.110 0.180 0.230 0.415 0.365 0.305 0.1650.0000.0500.1000.1500.2000.2500.3000.3500.4000.4500.500Influența pH -ului asupra producției de amilază 546 nm
DA 7 DA 10 DA 13

121

Figura 4.79 Influența pH -ului asupra producției de colagenază la 600nm măsurată după 120h
Figure 4.7 9 pH influence on colagenasis production at 600 nm after 120 h

În experimentările următoare s -a realizat testarea agitării asupra dezvoltării biomasei,
precum și a productivității enzimatice specifice.
Tulpinile selecționate au fost incubate timp de 120 d e ore, la un pH 7,0 și o temperatură de
35oC, la 100 rpm, 135 rpm și 170 rpm.

Martor 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5 8.0 8.5
DA 7 0.154 0.172 0.197 0.210 0.286 0.265 0.201 0.193
DA 10 0.154 0.187 0.239 0.280 0.317 0.299 0.251 0.203
DA 13 0.154 0.181 0.215 0.276 0.303 0.281 0.244 0.2090.0000.0500.1000.1500.2000.2500.3000.350Influența pH -ului asupra producție de colagenază 600nm –
120h
Tabel 4.21
Table 4.21
Influența agitării asupra producției de protează, 100 rpm
The shakning influence on proteasis production at 100 rpm
Tulpina
Timp 24 h 48 h 72 h 96 h 120 h
DA 7 0,281 0,352 0,393 0,474 0,498
DA 10 0,306 0,384 0,407 0,491 0,554
DA 13 0,294 0,375 0,401 0,483 0,548

122

Tabel 4.22
Table 4.22
Influența agitării asupra producției de protează, 135 rpm
The shakning influence on proteasis production at 135 rpm
Tulpina
Timp 24 h 48 h 72 h 96 h 120 h
DA 7 0,341 0,399 0,469 0,517 0,588
DA 10 0,384 0,409 0,487 0,536 0,596
DA 13 0,360 0,402 0,476 0,523 0,593
Tabel 4.23
Table 4.23
Influența agitării asupra producției de protează, 170 rpm
The shakni ng influence on proteasis production at 170 rpm
Tulpina
Timp 24 h 48 h 72 h 96 h 120 h
DA 7 0,299 0,340 0,391 0,428 0,470
DA 10 0,313 0,389 0,417 0,439 0,493
DA 13 0,309 0,348 0,396 0,428 0,486

123

Figura 4.80 Influența agitării asupra producți ei de lipază
Figure 4.80 The shaking influence on lipases production

Figura 4.81 Influența agitării asupra producției de keratinază la 595nm
Figure 4.81 The shaking influence on keratinases production at 595 nm

20 60 40
60 120 80
20 80 40
0 20 40 60 80 100 120 140DA7DA10DA13Influența agitării asupra producției de lipază
170 rpm
135 rpm
100 rpm
DA7 DA10 DA13 Martor
100 rpm 0.181 0.205 0.193 0.110
135 rpm 0.240 0.274 0.261 0.108
170 rpm 0.199 0.215 0.196 0.1130.0000.0500.1000.1500.2000.2500.300Influența agitării asupra producției de keratinază 595
100 rpm 135 rpm 170 rpm

124

Figura 4.82 Influența agitării asupra producției de amilază la 546 nm
Figure 4.82 The shaking influence on amilases production at 546 nm

Figura 4.83 Influența agitării asupra producției de colagenază 600 nm, masurată la 100 rpm
Figure 4.83 The shaking influence on collagenases production at 600 nm, 100 rpm
0.250 0.365 0.330 0.700 0.890
0.830
0.465 0.655
0.585
0.0000.1000.2000.3000.4000.5000.6000.7000.8000.9001.000
DA7 DA10 DA13Influența agitării asupra producției de amilază 546
100 rpm 135 rpm 170 rpm
0.236 0.314 0.299
0.188
DA7 DA10 DA13 Martor 100 RPM

125

Figura 4.84 Influența agitării asupra producției de colagenază 600 nm, masurată la 135rpm
Figure 4.84 The shaking influence on collagenases production at 600 nm, 135 rpm

Figura 4.85 Influența agitării asupra producției de colagenaz ă 600 nm, masurată la 170rpm
Figure 4.85 The shaking influence on collagenases production at 600 nm, 170 rpm

Ca și în cazul testarii producției enzimatice bacteriene utilizând blana ca unică sursă de
carbon, randamentul maxim al producției a fost inregis trat la 135 rpm.

0.387 0.401 0.392
0.183
DA7 DA10 DA13 Martor 135 RPM
0.320 0.384 0.365
0.181
DA7 DA10 DA13 Martor 170 RPM

126

Figura 4.86 Dinamica acumulării în culturi submerse a proteazelor pentru tulpina DA7
Figure 4.86 The dynamic accumulation of proteases in submerse fermentation for DA7 strain

Figura 4.87 Dinamica acumulării în culturi submerse a pr oteazelor pentru tulpina DA10
Figure 4.87 The dynamic accumulation of proteases in submerse fermentation for DA10 strain

0.200 0.367 0.424 0.503 0.621
24 48 72 96 120 DA7
0.293 0.385 0.488 0.569 0.677
24 48 72 96 120 DA10

127

Figura 4.88 Dinamica acumulării în culturi submerse a proteazelor pentru tulpina DA13
Figure 4.88 The dynamic accumulation of prot eases in submerse fermentation for DA13 strain

Rezultatele experimentărilor prezentate în figurile arată că cea mai ridicată producție de
protează se realizează în cazul cultivării tulpini DA10 pe mediul minimal, la un pH 7,0, egală cu
0,677U/ml/min, urma tă de activitatea enzimatica tulpinii DA13 de 0,648U/ml/min și o activitate
proteolitică de 0,621U/ml/min înregistrată de tulpina DA7, în condițiile date; 35oC si 135 rpm.

4.2.3 Optimizarea biosintezei proteazelor bacteriene

4.2.3.1 Influența componentel or mediului de cultivare asupra biosintezei proteazelor
bacteriene

Datele din literatura de specialitate relevă atenția cercetătorilor îndreptată în sensul
aprofundării căilor ce au ca finalitate sporirea producției de protează utilizând ca substrat mater ii
provenite din diferite sectoare industriale.
Astfel, cele mai importante surse pentru dezvoltarea optimă a culturilor bacteriene sunt
cele de carbon și azot. Preferințele pentru un anumit component sunt diferite de la o tulpina la
alta, astfel s -a efec tuat o testare ce a cuprins surse naturale și sintetice, provenite din Industria
Pielăriei.
O nouă serie de cercetări s -au axat pe obținerea unei cantități sporite de proteaze bacteriene
care sa poata fi utilizată ca biopreparat aplicat în agricultură.

0.271 0.371 0.454 0.532 0.648
24 48 72 96 120 DA13

128
4.2.4. Determinarea activității enzimatice optime

Trei dinte tulpinile bacteriene izolate și testate au fost selectate, și anume DA7, DA10,
DA13, acestea prezentând cea mai buna activitate proteolitică pe mediu PCA. Zonele clare de
hidroliză din jurul colon iilor testate reflectă existența unei activități proteolitice extracelulare
(HABIB et al., 2012)
Analiza datelor obținute arată o creștere a activității complexului enzimatic proporțional cu
perioada de timp în care au fost cultivate tulpinile microbiene. De remarcat faptul că, drept
inocul a fost utilizată suspensie bacteriană, corespunzătoare tulpinilor folosite, cultivate anterior,
timp de 7 zile, pe același substrat, asociat cu agitarea (135 rpm) conducând la o creștere a
activității enzimatice.

Figura 4.89. Tulpinile izolate și testate pe blană intr -un mediu minimal după 48 de ore de la
incubare.
Figure 4.89. The isolated strains tested on fur and skin into minimal media, after 48 h of
incubation.

Tulpinile bacteriene au fost incubate timp de 120 d e ore în suspensie pe un mediu minimal
la temperature de 35oC, 135 rpm, la un pH de 7.2
Parametrii au fost obținuți în experimetele de fermentație utilizând pahare Erlenmeyer de
100 ml și 40 ml mediu minimal.

129

Figura 4.90. Ritmul de creștere al tulpinilo r izolate și rata de producție proteazică la 120 ore de
incubare și o diluție de 1:25
Figure 4.90. Growth behavior of isolated bacterial strain and rate of extracellular protease
production during 120h, after 1:25 dilution

O creștere a masei celulare și a activității lipolitice a fost observată (Figura 4.91) ca
rezultat al unei puternice aerații (activitatea lipolitică a înregistrat 80 U/ml). Astfel activitatea
lipolitică s -a dovedit a fi destul de ridicată în condițiile de cultivare date (Capitolul III –
Materiale și metode).

Figura 4.91. Activitatea lipolitică în mediul de fermentație (U/h)
Figure 4.91. Lipase activity in fermentation media (U/h)
În vederea studierii biodegradabilității blănurilor naturale trebuie luate în considerare cele
două compone nte majore ale acestora, respectiv pielea și blana propriu -zisă. Pentru degradarea
0 20 40 60 80DA7DA13DA10Blank
U/h
NaOH 0.1N

130
celei dintâi, pielea, este necesară prezența complexului enzimatic colagenazic, iar pentru blană, a
complexului keratinolitic.
Fiind utilizată metoda de screening preliminar se constată că microorganismele izolate
selectate prezintă potențial biodegradativ în ceea ce privește activitatea keratinolitică și
colagenazică.
Cea mai ridicată activitate de producție keratinolitică de catre tulpinile izolate a fost de
0.223 U/ml față de martor, produsă de tulpina DA10 în condițiile de cultivare date (Figura 4.92)

Figura 4.92. Activitatea keratinolitică determinate la 595 nm
Figure 4.92. The keratinolitic activity determination at 595 nm

Figura 4.93. Activitatea amilolitică a tulp inilor izolate după 120 h de cultivare
Figure 4.93. Amylolitic activity of isolates after 120 h of incubation 0.151 0.223
0.192
0.104
DA7 DA10 DA13 Blank595nm
595nm
DA7 0,114 DA10 0,198
DA13 0,104
00.050.10.150.20.25
DA7 DA10 DA13546nm

131

În fermentația submersibilă producția de amilază a înregistrat maximum de 0.198 U/ml
produsă de tulpina DA10, la 120 de ore de incubare, unde a a ratat o creștere semnificativă a ratei
de producție (figura 4.93)

Figura 4.94. Determinarea activității colagenazice la 600 nm, după 120 h de incubare în mediu
minimal.
Figure 4.94. Determination of collagenase activity at 600 nm, after 120 hours of incu bation on
minimal media

Activitatea colagenazică a înregistrat producția maximă de 0.373 U/ml, obținută cu tulpina
DA10 în mediul de fermentație cu 0.6 g blană ca unică sursă de carbon și azot.

Tabel 4.24
Table 4.24
Determinarea carbonului organic, dup ă 24 ore de incubare a fragmentelor de blană în soluția
enzimatică.
Organic carbon determined, after 24 h of incubation of fur and skins in enzymatic solution.
Nr.Crt. Probă %
1 Martor 51.68
2 DA7 24.63
3 DA10 24.82
4 DA13 25.75

DA7 DA10 DA13 Blank0.351 0.373 0.344
0.118 600nm

132
Sursa de car bon organic are potențialul de a induce sinteza de protează la un nivel optim, și
a fost determinat prin testarea componentelor organice, acestea fiind utilizate ca resurse
individuale.

4.2.5 Izolarea din mediul de fermentatie a preparatului enzimatic obt inut prin
biosinteza

4.2.5.1 Separarea biomasei

Preparatul enzimatic proteolitic obținut prin cultivarea tulpinilor izolate pe mediu minimal,
în urma optimizării parametrilor de cultivare, este supus inițial operațiuni de separare grosieră a
fazei solide care se realizează prin centrifugare la 9000 rpm, timp de 20 de minute. Supernatantul
obținut constituie extractul proteic total (EPT), care este folosit în experimentările ulterioare
privind aplicabilitatea enzimelor proteolitice.
Pentru etapa de concent rare a soluției enzimatice supernatantul obținut a fost concentrat de
10 ori cu ajutorul rotavaporului (prezentat în Capitolul III – Materiale și metode) procedeu care
s-a realizat la o temperatură de 35oC și 135 rpm.

133
4.2.5.2 Concentrarea solutiei native prin evaporare sub vid

Cu fiecare tulpină s -au produs 3000 ml soluție enzimatică ce a fost concentrată de 10 ori cu
ajutorul rotavaporului la o temperatură a băii de 70oC și 980 mbar, rezultând 300 ml soluție
enzimatică concentrată. Soluția obținută a fo st aplicată peste semințele luate în experiment în
proporție de 1.0%, 1.5%, 2.0%, 2.5%, 3.0%, 3.5% si respective 10%, 15%, 20%, 25%, 30%,
35%.

Figura 4.95. Grâu fertilizat cu soluție enzimatică produsă de tulpina DA10, după 6 zile de
creștere la concent rații între 35% (stânga) și 10% (dreapta)
Figure 4.95 Fertilized wheat with enzymatic solution produced by DA10 strain, after 6 days of
growing, having concentration between 35% (left) and 10% (right)

134

Figura 4.96. Soluție enzimatică produsă de tulpin a DA13 și aplicată ca biofertilizator la diferite
concentrații între 35% (stanga) și 10% (dreapta), după 6 zile de creștere
Figure 4.96 Enzymatic solution produce by DA13 strain and applied as biofertilizer at different
concentration between 35% (left) and 10% (right), after 6 days of growing.

135

Figura 4.97 Grâu după 6 zile de creștere, după ce a fost aplicat concentratul enzimatic produs de
tulpina DA7
Figure 4.97 Wheat after 6 days of growing, after the enzymatic concentrate produce by DA7 was
applied

136

Figura 4.98 Comparație a creșterii grâului după 6 zile de la adăugarea soluției enzimatice în
diferite concentrații produse de către tulpinile bacteriene izolate
Figure 4.98. Compared wheat growth after 6 days with added concentrated enzymatic solution in
different concentration produced by isolated strain

Figura 4.99 Creșterea grâului după 6 zile de la aplicarea concentratului enzimatic
Figure 4.99. The wheat growth after 6 days at different enzymatic concentrations

În testări s -au utilizat ca materi i prime sol cu pH neutru, seminte ecologice și soluția
enzimatică obținută în cadrul tezei de doctorat.
Preparatul enzimatic de protează bacteriană obținut a avut în momentul utilizării o
activitate enzimatică de 1.117 U/ml pentru tulpina DA7, 1.329 U/ml p entru tulpina DA10 și
1.215 U/ml pentru tulpina DA13.

137
S-au realizat probe prin care s -a determinat influența adaosului de preparat enzimatic de
protează bacteriană obținut în cadrul tezei de doctorat asupra indicatorilor de calitate a
plantulelor obținute în urma experimentelor.
Metoda de lucru a fost cea de aplicare directă a preparatului enzimatic peste semințele
luate in lucru.

4.2.5.3 Experimete de prelucrare a mediului de cultura prin liofilizarea
concentratului

Liofilizarea, procedeul de concentrare a unui preparat, care presupune eliminarea apei prin
sublimare în vid, cu aport controlat de căldură, daca presiunea este sub cea corespunzatoare
punctului triplu (PT), mai mică de 4,579 mm Hg (0,006 bar) .
Soluția enzimatică obținută cu ajutorul bacteriil or izolate rezultate din compostarea
bucăților de blană, a fost concentrată de 10 ori cu ajutorul rotavaporului la o temperatură a băii
de 70oC și 980 mbar.

4.2.6 Caracterizarea preparatului enzimatic liofilizat

S-au facut determinări enzimatice, după o diluție de 1:10 precum și determinarea
carbonului organic după liofilizarea preparatului obținut cu ajutorul bacteriilor izolate.

Figura 4.100 Determinarea proteazelor după liofilizarea preparatului enzimatic obținut
Figure 4.100 Proteases determination after the lyophilization of obtained enzymatic preparation

DA7 DA10 DA13 Martor
120 h 1.31 1.975 1.587 0.1831.31 1.975
1.587
0.183
00.511.522.5578 NM

138

Figura 4.101 Determinarea activității colagenazice după liofilizarea preparatului enzimatic
obținut, screening la 600nm
Figure 4.101 Determination of collagenase activity after lyophilization of the enzymatic solution,
screening at 600 nm

Figura 4.102 Determinarea activității keratinolitice după liofilizarea preparatului enzimatic
obținut, screening la 595nm
Figure 4.102 Determination of keratinolytic activity after the lyophilization of th e enzymatic
solution, screeneing at 595 nm

DA7 DA10 DA13 Martor
120 h 0.918 1.275 0.993 0.18100.20.40.60.811.21.4600 NM
DA7 DA10 DA13 Martor
120 h 0.715 0.911 0.833 0.17900.10.20.30.40.50.60.70.80.91120 h

139

Figura 4.103 Determinarea activității amilolitice după liofilizarea preparatului enzimatic obținut,
screening la 546 nm
Figure 4.103 Determination of amylolytic activity after the lyophilization of the enzymat ic
solution, screening at 546 nm

Figura 4.104 Determinarea activității lipolitice după liofilizarea preparatului enzimatic obținut
Figure 4.104 Determination of lipolytic activity after the lyophilization of the enzymatic solution
that have been obtaine d

DA7 DA10 DA13 Martor
120 h 3.48 4.35 4.05 0.1800.511.522.533.544.55546 NM
DA7 DA10 DA13
120 h 40 80 600102030405060708090U/ml

140

Figura 4.105 Determinarea cantității de carbon organic după liofilizarea preparatului enzimatic
obținut
Figure 4.105 Determination of the organic carbon quantity after the lyophilization of the
enzymatic solution that have been obtained

Figura 4.106 Determinarea activității microbiene la 600 nm după liofilizarea preparatului
enzimatic obținut
Figure 4.106 Determination of bacterial activity at 600 nm after the enzymati c solution
lyophilization
DA7 DA10 DA13 Martor
120 h 34.4 31.9 33.9 43.105101520253035404550120 h
DA7 DA10 DA13 Martor
120 h 1.125 1.616 1.399 0.17800.20.40.60.811.21.41.61.8120 h

141
4.2.7 Rezultate privind gradul de degradare al produselor din piele cu ajutorul
prepartului enzimatic obținut

După liofilizarea preparatului enzimatic s -a realizat o determinare privind gradul de
degradare a produselor din blan ă naturală. Astfel, bucați de blană tăbăcită cu crom de 1 cm2 a
fost introdusă în 40 de ml soluție enzimatică liofilizată și incubate timp de 48 de ore la 135 rpm
și 35oC.

Figura 4.107 Activitatea microbiană rezultată în urma degradării bucaților de blan ă după
incubarea acestora în soluția enzimatică liofilizată
Figure 4.107 Microbiological activity resulted after leather decomposition into lyophilisate
enzymatic solution

4.3 EXPERIMENTĂRI PRIVIND OBȚINEREA DE BIOPREPARATE
ENZIMATICE CU APLICABILITATE ÎN AGRICULTURA ECOLOGICĂ

4.3.1 Influența adaosului de preparat enzimatic obținut asupra culturilor de graminee
și leguminoase

În 40 grame sol au fost adaugate 4 grame de semințe ecologice de cereale și respectiv
leguminoase. Soluția enzimatică concentrat ă a fost adăugată în diferite concentrații pentru a se
obține o doză optimă față de martor pentru aplicabilitatea acesteia ca fertilizator organic în
agricultura ecologică.
Influența adaosului de preparat enzimatic obținut în cadrul tezei de doctorat asup ra
dezvoltării și calității plantelor. S -au realizat analize de laborator la care s -a determinat influența DA7 DA10 DA13 Martor
120 h 1.217 1.443 1.298 0.17100.20.40.60.811.21.41.6120 h

142

adaosului de preparat enzimatic de protează bacteriană obținută în cadrul tezei asupra
proprietăților ecologice a plantelor tratate.

Figura 4.108 Grâu fertilizat cu soluția enzimatică obținută în cadrul tezei de doctorat la diferite
concentrații față de martor.
Figure 4.108 Fertilized wheat with the enzymatic solution obtained in the doctorate work, at
different concentration against the blank

143

Figura 4.109. Grâu fertilizat cu soluțiile enzimatice de concentrație 35%, obținute cu ajutorul
tulpinilor isolate
Figure 4.109 Fertilized wheat with the enzymatic solution, having 35% concentration, obtained
by using the isolate strains

144

Figura 4 .110 Comparație între soluțiile enzimatice produse cu ajutorul tulpinilor izolate obținute
în cadrul tezei de doctorat utilizate ca biofertilizator, la concentrația de 15% față de martor.
Figure 4.110 Comparation between enzymatic solutions obtained by usi ng isolate strains, used as
biofertilizer at 1.5% concentration against the blank

Analiza comparativă a acțiunii preparatului enzimatic asupra dezvoltării plantelor testate.
Rezultatele obținute în urma experimentelor au permis reprezentarea grafică a inf luenței
adaosului preparatului enzimatic asupra plantulelor luat in experiment.

145

Figura 4.111 Comparație între diferite concentrații ale soluției enzimatice produse cu ajutorul
tulpinii DA13 obținute în cadrul tezei de doctorat utilizate ca biofertilizat or
Figure 4.111 Comparation between different concentration of the enzymatic solution obtained by
DA13 strain, used as biofertilizer

146
Figura 4.112 Comparație între soluțiile enzimatice concentrate produse cu ajutorul tulpinilor
izolate obținute în cadru l tezei de doctorat utilizate ca biofertilizator, la concentrația de 2,5% față
de martor.
Figure 4.112 Comparation between enzymatic solutions at 2.5% concentrations obtained using
the isolated strains, used as biofertilizer

Figura 4.113 Comparație într e diferite concentrații ale soluției enzimatice produse cu ajutorul
tulpinii DA13 obținute în cadrul tezei de doctorat utilizate ca biofertilizator pe plantule de R.
sativus
Figure 4.113 Comparation between enzymatic solutions at different concentrations o btained
using DA13 strains, used as biofertilizer for R. sativus

147

Figura 4.114. Comparație între soluțiile enzimatice concentrate produse cu ajutorul tulpinilor
izolate obținute în cadrul tezei de doctorat utilizate ca biofertilizator, la concentrația de 3,5% față
de martor.
Figure 4.114 Comparation between enzymatic solutions at 3.5% concentrations obtained using
the isolated strains, used as biofertilizer against the blank

148

Figura 4.115. Comparație între soluțiile enzimatice concentrate produse cu ajutorul tulpinilor
izolate obținute în cadrul tezei de doctorat utilizate ca biofertilizator, la concentrația de 2,5% față
de martor pe seminte de R. sativus .
Figure 4.115 Comparation between enzymatic solutions at 2.5% concentrations obtained using
the isolated strains, used as biofertilizer against the blank on R. sativus seeds

149

Figura 4.116. R. sativus fertilizat cu soluțiile enzimatice de concentrație 3,5%, obținute cu
ajutorul tulpinilor isolate
Figure 4.116 Fertilized R. sativus with the enzymatic solution obtained using the isolate strains,
at the 3.5% concentration

150

Figura 4.117 Comparație între soluțiile enzimatice concentrate produse cu ajutorul tulpinilor
izolate obținute în cadrul tezei de doctorat utilizate ca biofertilizator, la concentr ația de 1,5% față
de martor.
Figure 4.117 Comparation between enzymatic solutions at 1.5% concentrations obtained using
the isolated strains, used as biofertilizer against the blank

151

Figura 4.118. Comparație între diferite concentrații ale soluției enzi matice produse cu ajutorul
tulpinii DA10 obținute în cadrul tezei de doctorat utilizate ca biofertilizator pe plantule de R.
sativus
Figure 4.118 Comparation between different concentration of enzymatic solution, obtained using
DA10 strain, used as biofert ilizer on R. sativus plants

Analizând datele prezentate în figura 4.108 și 4.118 se constată că atât concentrația de
3.5% cât și concentrația de 35% au avut un efect benefic asupra creșterii și dezvoltării
plantulelor testate față de martor.
În ceea ce pr ivește plantulele obținute tratate cu diferite concentrații a soluției enzimatice
se remarcă un efect de îmbunătățire a calității aspectului și dezvoltării acestora.
În cazul soluției obținute în cadrul lucrării prezente se observă că cel mai bun efect asu pra
îmbunătățirii calității plantulelor a fost înregistrat de tulpina DA10 la concentrația de 35%.

152

Figura 4.119 Soluțiile enzimatice obținute din tulpinile izolate, testate pe S.tuberosum ssp.
Christian și Roclas , la difer ite concentrații
Figure 4.119 The enzymatic solution obtained using the isolate strains, tested on S. tuberosum
ssp. Christian and Roclas at different concentration

153
Figura 4.120 . Soluțiile enzimatice obținute din tulpinile izolate, testate pe S.tubero sum ssp.
Christian și Roclas la diferite concentrații
Figure 4.120 Enzymatic solution obtained using the isolate strains, tested on S.tuberosum ssp.
Christian and Roclas at different concentration

154
F

Figura 4.121 Soluțiil e enzimatice obținute din tulpinile izolate, testate pe S.tuberosum ssp.
Christian și Roclas la diferite concentrații
Figure 4.121 Enzymatic solution obtained using the isolate strains, tested on S.tuberosum ssp.
Christian and Roclas at different concentr ation

155
Figura 4.122 Soluțiile enzimatice obținute din tulpinile izolate, testate pe S.tuberosum ssp.
Christian și Roclas la diferite concentrații
Figure 4.122 Enzymatic solution obtained using the isolate strains, tested on S.tuberosum ssp.
Christian and Roclas at different concentration

156

Figura 4.123 Soluțiile enzimatice obținute din tulpinile izolate, testate pe S.tuberosum ssp.
Christian și Roclas la diferite concentrații
Figure 4.123 Enzymatic solution obtained using the isolate strains, tested on S.tuberosum ssp.
Christian and Roclas at different concentration

157

Figura 4.124.Comparație între S.tuberosum ssp. Christian și S. tuberosum ssp Roclas . Soluție
enzimatică obținută cu ajutorul tulpinilor izolate, la dife rite concentrații
Figure 4.124 Comparation between S.tuberosum ssp. Christian and S . tuberosum ssp. Roclas.
Enzymatic solution obtained by using the isolate strains, at different concentration

158

CAPITOLUL V
CHAPTER V
CONCLUZII ȘI RECOMANDĂRI
CONCLUSIO NS AND RECOMANDATION

Cercetările efectuate în vederea realizării prezentei teză de doctorat, permit formularea
următoarelor concluzii:
– În jurul coloniilor izolate producătoare de proteaze se observă un halou opalescent fapt ce
indică activitatea proteazic ă a microorganismelor
– Experimentul realizat pentru stabilirea perioadei optime de cultivare a tulpinilor
microbiene a indicat o creștere a activității complexului enzimatic proporțional cu perioada
de cultivare, valorile determinate după 120 de ore fiind c ele mai ridicate. Ca urmare,
pentru experimentele următoare s -a stabilit o perioada de cultivare de 120 de ore pentru
tulpinile microbiene testate.
– Pe baza rezultatelor obținute se poate constata ca enzima are o temperatură optimă de
acțiune în jurul valor ii de 35oC. Ca și in cazul celorlalte determinări se observă o usoară
scadere a productivității enzimelor, producția bacteriană fiind stabilă până la temperatura
de 40oC când își menține activitatea enzimatică. La temperatura de 70oC tulpina
înregistrează o valoare enzimatică mai mica ca la temperatura de 10oC.
– La testarea pH -ului s -au obținut cele mai bune rezultate la o valoare de 7,2 unitați (1,115
U/ml). La pH -ul de 5,5 tulpinile izolate au avut o activitate în jurul valorii de 0,510 U/ml,
iar pentru me diu minimal bazic de 8,5 acestea au avut activitate enzimatică în jurul valorii
de 0,660 U/ml.
– S-a determinat influența agitării asupra activității enzimatice utilizând un mediu minimal
inoculat cu tulpinile izolate la diferite valori de agitare 100 rpm, 135 rpm și respectiv 170
rpm, în urma rezultatelor concluzionându -se că cea mai bună activitate s -a înregistrat la
valoarea de 135 rpm.
– Screeningul activității proteazice a fost facut pentru blană naturală, blană sintetică și pene
în proporție de 0,6%. În urma determinărilor se constată că tipul sursei de carbon are un
mare impact asupra producției de enzime. Blana sintetică nefiind bogată în proteine
înregistrează o productivitate enzimatică foarte scăzută de 0,315 U/ml față de 0,800 U/ml
pentru blana nat urală la 135rpm, 120 ore și pH 7,0 pentru tulpina DA10.
– Cantitatea de carbon organic este vizibil redusă, rezultat al activității microbiene ce a
utilizat carbonul din bucățile de blană pentru producția enzimatică
– S-au caracterizat cele trei tulpini din pu nct de vedere al activității enzimatice: activitatea
proteolitică, activitatea amilolitică, activitatea lipolitică, activitatea keratinolitică și
activitatea colagenazică, astfel:
– Pentru proteaze producția a fost 1,430 U/ml în cazul enzimelor obținute din hidroliza
blănurilor naturale, iar pentru enzimele obținute din hidroliza penelor este de 0,726 U/ml;
– Pentru colagenază valoarea a fost de 0,401 U/ml pentru hidroliza blănurilor naturale, iar
pentru enzimele obținute din hidroliza penelor este de 0,418 U/m l;

159
– În cazul determinării amilazei în urma hidrolizei blănurilor s -a înregistrat valoarea de
0,870 U/ml iar valoarea determinată în urma utilizării penelor ca unică sursă de carbon a
fost de 1,220 U/ml;
– În cazul producției de keratinază valoarea maximă a fo st obținută în cazul hidrolizării
penelor și anume 0,328 U/ml față de 0,248 U/ml obținute în cazul hidrolizării blănurilor;
– Producția maximă de lipază a fost de 140 U/ml în ambele cazuri de hidrolizat.
– Având în vedere faptul că tulpinile izolate au a manif estat o activitate enzimatică redusă,
față de blana sintetică s -a renuntat la utilizarea acesteia.
– Tulpinile B. diminuta (DA7) B. thuringiensis (DA10) și B. cereus (DA13) au fost
identificate prin testul Biolog și au capacitatea de a degrada produsele din piele și blană
naturală tăbăcite cu crom.
– Mediul de fermentație obținut prin cultivarea tulpinilor izolate având ca unică sursă de
carbon piele și blană naturală provenită de la Institutul de Pielărie București, s -a prelucrat
prin filtrare și concentrare o bținându -se un produs microbiologic concentrat, lichid, utilizat
ca adaos biofertilizant în culturi vegetale de R. sativus, Triticum sp. și S. tuberosum.
– Adaosul de preparat enzimatic s -a dovedit a fi eficient în creșterea și dezvoltarea culturilor
de gram inee și leguminoase
– În cazul fertilizării S. tuberosum se observă că și specia are o mare influență asupra
dezvoltării în prezența fertilizantului.
– B. thurigiensis s-a dovedit a avea cea mai bună producție enzimatică, ce a dat rezultate
satisfacătoare în t estarea invitro ca biofertilizator de concentrație 35% asupra culturilor de
graminee și leguminoase.
– În urma experimentărilor se poate dezvolta o tehnologie privind degradarea biologică și
enzimatică a produselor din blană naturală, o tehnologie de obținer e a hidrolizatului și
utilizarea acestuia ca biofertilizant precum și dezvoltarea tehnologiilor de identificare a
blănurilor naturale.

Cercetările au fost susținute în cadrul proiectului Eureka – BIOFUR E5770/2012

5.2 CONTRIBUȚII ORIGINALE
Prezenta teză de doctorat cu titlul Sisteme biologice și biochimice de degradare acelerată
a produselor din piele naturală, conține următoarele aspecte originale:

– În cadrul tezei s -au selecționat două tulpini de Bacillus sp. și una de Brevundimonas sp.
capabile să hid rolizeze resturile de blană naturală tăbăcită cu crom: tulpina DA7, tulpina
DA10 și tulpina DA13
– Pentru selecționarea tulpinilor s -a utilizat metoda îngropării resturilor de blană în pământ
de florărie, urmată de compostare timp de 3 luni.
– S-au caracteriza t cele trei tulpini din punct de vedere al activității enzimatice: activitatea
proteolitică, activitatea amilolitică, activitatea lipolitică, activitatea keratinolitică și
activitatea colagenazică.
– S-au identificat tulpinile izolate utilizând testul Biolog ; s-a constatat că două tulpini
aparțin genului Bacillus sp. și una genului Brevundimonas sp.
– Tulpinile nou izolate au fost cultivate pe medii de cultivare specifice, în sistem submers,
la flacoane agitate de 500 ml, cu 200 ml mediu/flacon, astfel încât vo lumul final să fie de
3000 ml. Mediul de fermentație astfel obținut s -a prelucrat prin filtrare și concentrare

160
obținându -se un produs microbiologic concentrat, lichid, utilizat ca adaos biofertilizant în
culturi vegetale de R. sativus. Triticum sp., S. tub erosum .
– S-a constatat efectul stimulator în creșterea plantulelor testate în condiții de seră.
– Un alt aspect original a constatat în testarea lichidului concentrat pentru degradarea
blănurilor tăbăcite cu crom.
– S-a constatat o reducere a carbonului organi c cu cca. 30%, ceea ce confirmă activitatea
hidrolitică a complexului enzimatic produs de tulpinile izolate.

5.3 DEZVOLTAREA TEHNOLOGIILOR PRIVIND DEGRADAREA
BIOLOGICĂ ȘI ENZIMATICĂ A PRODUSELOR DIN BLANĂ
NATURALĂ
– Se poate dezvolta o tehnologie de obținer e a hidrolizatului și utilizarea acestuia ca
biofertilizant
– Utilizarea hidrolizatului în degradarea resturilor de piele și blană din industria pielăriei
– Dezvoltarea tehnologiilor de identificare a blănurilor naturale

161
Lista de figuri

Capitol Figura Pag
II 2.1 Schema modului de acțiune a enzimelor
II 2.2. Nivelele de energie ale moleculelor în cursul unei reacții fara enzimă
(negru) și cu enzimă (ro șu)
II 2.3. Reprezentarea grafica a triadei catalitice
III 3.3.1 Evoluția proce sului de compostare pentru blana naturală
III 3.3.2 Evoluția procesului de compostare pentru blana sintetică
III 3.3.3. Testarea microorganismelor selectate, producătoare de enzime
proteolitice
III 3.2 Anatomia unei placi GEN III
IV Figura 4.1. Ide ntificarea tulpinii Brevundimonas diminuta (DA7) cu sistemul
BIOLOG – Microbial Identification system
IV Figura 4.2. Identificarea tulpinii Bacillus thurigiensis (DA10) cu sistemul
BIOLOG – Microbial Identification system
IV Figura 4.3 Identificarea tu lpinii Bacillus cereus (DA13) cu sistemul
BIOLOG – Microbial Identification system
IV Figura 4.4 Influența temperaturii asupra curbei etalon pentru determinarea
proteazelor 578nm pentru tulpina DA7
IV Figura 4.5 Influența temperaturii asupra curbei et alon a producției de
protează 578nm pentru tulpina DA10
IV Figura 4.6 Influența temperaturii asupra curbei de etalonare a producției de
protează 578nm pentru tulpina DA13
IV Figura 4.7 Influența temperaturii asupra producției de colagenază 600 nm
pentr u tulpina DA7
IV Figura 4.8 Influența temperaturii asupra producției de colagenază 600 nm
pentru tulpina DA10
IV Figura 4.9 Influența temperaturii asupra producției de colagenază 600 nm
pentru tulpina DA13
IV Figura 4.10 Influența temperaturii asupra producției de amilază 546nm
IV Figura 4.11 Influența temperaturii asupra producției de keratinază 595 nm
IV Figura 4.12 Influența temperaturii asupra producției de lipază pentru tulpina
DA 7

162
IV Figura 4.13 Influența temperaturii asupra producți ei de lipază pentru tulpina
DA 10
IV Figura 4.14 Influența temperaturii asupra producției de lipază pentru tulpina
DA 13
IV Figura 4.15 Influența pH -ului asupra producției de protează pentru tulpina
DA 7
IV Figura 4.16 Influența pH -ului asupra prod ucției de protează pentru tulpina
DA 10
IV Figura 4.17 Influența pH -ului asupra producției de protează pentru tulpina
DA 13
IV Figura 4.18 Influența pH -ului asupra producției de lipază pentru tulpina DA
7
IV Figura 4.20 Influența pH -ului asupra produ cției de lipază pentru tulpina DA
13
IV Figura 4.21 Influența pH -ului asupra producției de amilază pentru tulpina
DA 7
IV Figura 4.22 Influența pH -ului asupra producției de amilază pentru tulpina
DA 10
IV Figura 4.23 Influența pH -ului asupra producț iei de amilază pentru tulpina
DA 13
IV Figura 4.24 Influența pH -ului asupra producției de colagenază pentru tulpina
DA 7
IV Figura 4.25 Influența pH -ului asupra producției de colagenază pentru tulpina
DA 10
IV Figura 4.26 Influența pH -ului asupra pr oducției de colagenază pentru
tulpina DA 13
IV Figura 4.27 Influența pH -ului asupra producției de keratinază pentru tulpina
DA 7
IV Figura 4.28 Influența pH -ului asupra producției de keratinază pentru tulpina
DA 10
IV Figura 4.29 Influența pH -ului as upra producției de keratinază pentru tulpina
DA 13
IV Figura 4.30 Influența agitării asupra producției de protează 578nm pentru
tulpina DA 7

163
IV Figura 4.31 Influența agitării asupra producției de protează 578nm pentru
tulpina DA 10
IV Figura 4.32 I nfluența agitării asupra producției de protează 578nm pentru
tulpina DA 13
IV Figura 4.33 Influența agitării asupra producției de lipază la 100 rpm
IV Figura 4.34 Influența agitării asupra producției de lipază la 135 rpm
IV Figura 4.35 Influența agit ării asupra producției de lipază la 170 rpm
IV Figura 4.36 Influența agitării asupra producției de keratinază 595nm la 100
rpm
IV Figura 4.37 Influența agitării asupra producției de keratinază 595nm la 135
rpm
IV Figura 4.38 Influența agitării asupra producției de keratinază 595nm la 170
rpm
IV Figura 4.39 Influența agitării asupra producției de amilază 546nm la 100 rpm
IV Figura 4.40 Influența agitării asupra producției de amilază 546nm la 135 rpm
IV Figura 4.41 Influența agitării asupra produ cției de amilază 546nm la 170
rpm
IV Figura 4.42 Influența agitării asupra producției de colagenază 600nm la 100
rpm
IV Figura 4.43 Influența agitării asupra producției de colagenază 600nm la 135
rpm
IV Figura 4.44 Influența agitării asupra producți ei de colagenază 600nm la 170
rpm
IV Figura 4.45 Dinamica acumulării proteazelor bacteriene pentru tulpina DA 7
IV Figura 4.46 Dinamica acumulării proteazelor bacteriene pentru tulpina DA
10
IV Figura 4.47 Dinamica acumulării proteazelor bacteriene pentru tulpina DA
13
IV Figura 4.48 Determinarea activității proteolitice pentru tulpina DA10
folosind ca sursă de carbon blană naturală și blană sintetică.
IV Figura 4.49 Determinarea activității proteolitice pentru tulpina DA7 folosind
ca sursă de c arbon blană naturală și blană sintetică.
IV Figura 4.50 Determinarea activității proteolitice pentru tulpina DA13
folosind ca sursă de carbon blană naturală și blană sintetică.

164
IV Figura 4.51 Influențele sursei de carbon asupra producției de proteaza la 578
nm pentru tulpina DA7
IV Figura 4.52 Influențele sursei de carbon asupra producției de proteaza la 578
nm pentru tulpina DA10
IV Figura 4.53 Influențele sursei de carbon asupra producției de proteaza la 578
nm pentru tulpina DA13
IV Figura 4.5 4 Influența temperaturii asupra producției de lipază
IV Figura 4.55 Influența temperaturii asupra producției de keratinază pentru
tulpina DA7
IV Figura 4.56 Influența temperaturii asupra producției de keratinază pentru
tulpina DA10
IV Figura 4.57 Influența temperaturii asupra producției de keratinază pentru
tulpina DA13
IV Figura 4.58 Influența temperaturii asupra producției de amilază 546nm
pentru tulpina DA7
IV Figura 4.59 Influența temperaturii asupra producției de amilază 546nm
pentru tulpi na DA10
IV Figura 4.60 Influența temperaturii asupra producției de amilază 546nm
pentru tulpina DA13
IV Figura 4.61 Influența temperaturii asupra producției de colagenază 600nm
IV Figura 4.62 Influența agitării asupra producției de protează 578nm l a 100
rpm
IV Figura 4.63 Influența agitării asupra producției de protează 578nm la 135
rpm
IV Figura 4.64 Influența agitării asupra producției de protează 578nm la 170
rpm
IV Figura 4.65 Influența agitării asupra producției de lipază
IV Figura 4. 66 Influența agitării asupra producției de keratinază 595nm
IV Figura 4.67 Influența agitării asupra producției de amilază 546nm
IV Figura 4.68 Influența agitării asupra producției de colagenază 600nm
IV Figura 4.69 Influența pH -ului asupra producți ei de protează 578nm pentru
tulpina DA7
IV Figura 4.70 Influența pH -ului asupra producției de protează 578nm pentru
tulpina DA10

165
IV Figura 4.71 Influența pH -ului asupra producției de protează 578nm pentru
tulpina DA13
IV Figura 4.72 Influența pH -ului asupra producției de lipază pentru tulpina DA7
IV Figura 4.73 Influența pH -ului asupra producției de lipază pentru tulpina
DA10
IV Figura 4.74 Influența pH -ului asupra producției de lipază pentru tulpina
DA13
IV Figura 4.75 Influența pH -ului asupra producției de keratinază la 595nm
pentru tulpina DA7
IV Figura 4.76 Influența pH -ului asupra producției de keratinază 595 pentru
tulpina DA10
IV Figura 4.77 Influența pH -ului asupra producției de keratinază 595 pentru
tulpina DA13
IV Figura 4.78 Infl uența pH -ului asupra producției de amilază la 546nm
IV Figura 4.79 Influența pH -ului asupra producției de colagenază la 600nm
măsurată după 120h
IV Figura 4.80 Influența agitării asupra producției de lipază
IV Figura 4.81 Influența agitării asupra producției de keratinază la 595nm
IV Figura 4.82 Influența agitării asupra producției de amilază la 546 nm
IV Figura 4.83 Influența agitării asupra producției de colagenază 600 nm,
masurată la 100 rpm
IV Figura 4.84 Influența agitării asupra produc ției de colagenază 600 nm,
masurată la 135rpm
IV Figura 4.85 Influența agitării asupra producției de colagenază 600 nm,
masurată la 170rpm
IV Figura 4.86 Dinamica acumulării în culturi submerse a proteazelor pentru
tulpina DA7
IV Figura 4.87 Dinam ica acumulării în culturi submerse a proteazelor pentru
tulpina DA10
IV Figura 4.88 Dinamica acumulării în culturi submerse a proteazelor pentru
tulpina DA13
IV Figura 4.89. Tulpinile izolate și testate pe blană intr -un mediu minimal după
48 de ore de la incubare.
IV Figura 4.90. Ritmul de creștere al tulpinilor izolate și rata de producție

166
proteazică la 120 ore de incubare și o diluție de 1:25
IV Figura 4.91. Activitatea lipolitică în mediul de fermentație (U/
IV Activitatea keratinolitică determ inate la 595 nm
IV Figura 4.93. Activitatea amilolitică a tulpinilor izolate după 120 h de
cultivare
IV Figura 4.94. Determinarea activității colagenazice la 600 nm, după 120 h de
incubare în mediu minimal.
IV Figura 4.95. Grâu fertilizat cu soluție enzimatică produsă de tulpina DA10,
după 6 zile de creștere la concentrații între 35% (stânga) și 10% (dreapta)
IV Figura 4.96. Soluție enzimatică produsă de tulpina DA13 și aplicată ca
biofertilizator la diferite concentrații între 35% (stanga) și 10% (dreapta),
după 6 zile de creștere
IV Figura 4.97 Grâu după 6 zile de creștere, după ce a fost aplicat concentratul
enzimatic produs de tulpina DA7
IV Figura 4.98 Comparație a creșterii grâului după 6 zile de la adăugarea
soluției enzimatice în diferit e concentrații produse de către tulpinile
bacteriene izolate
IV Figura 4.99 Creșterea grâului după 6 zile de la aplicarea concentratului
enzimatic
IV Figura 4.100 Determinarea proteazelor după liofilizarea preparatului
enzimatic obținut
IV Figura 4.1 01 Determinarea activității colagenazice după liofilizarea
preparatului enzimatic obținut, screening la 600nm
IV Figura 4.102 Determinarea activității keratinolitice după liofilizarea
preparatului enzimatic obținut, screening la 595nm
IV Figura 4.103 Determinarea activității amilolitice după liofilizarea
preparatului enzimatic obținut,screening la 546 nm
IV Figura 4.104 Determinarea activității lipolitice după liofilizarea preparatului
enzimatic obținut
IV Figura 4.105 Determinarea cantității de ca rbon organic după liofilizarea
preparatului enzimatic obținut
IV Figura 4.106 Determinarea activității microbiene la 600 nm după liofilizarea
preparatului enzimatic obținut
IV Figura 4.107 Activitatea microbiană rezultată în urma degradării bucaților

167
de blană după incubarea acestora în soluția enzimatică liofilizată
IV Figura 4.108 Grâu fertilizat cu soluția enzimatică obținută în cadrul tezei de
doctorat la diferite concentrații față de martor.
IV Figura 4.109. Grâu fertilizat cu soluțiile enzimat ice de concentrație 35%,
obținute cu ajutorul tulpinilor isolate
IV Figura 4.110 Comparație între soluțiile enzimatice produse cu ajutorul
tulpinilor izolate obținute în cadrul tezei de doctorat utilizate ca
biofertilizator, la concentrația de 15% față d e martor.
IV Figura 4.111 Comparație între diferite concentrații ale soluției enzimatice
produse cu ajutorul tulpinii DA13 obținute în cadrul tezei de doctorat
utilizate ca biofertilizator
IV Figura 4.112 Comparație între soluțiile enzimatice concentr ate produse cu
ajutorul tulpinilor izolate obținute în cadrul tezei de doctorat utilizate ca
biofertilizator, la concentrația de 2,5% față de martor.
IV Figura 4.113 Comparație între diferite concentrații ale soluției enzimatice
produse cu ajutorul tulp inii DA13 obținute în cadrul tezei de doctorat
utilizate ca biofertilizator pe plantule de R. sativus
IV Figura 4.114. Comparație între soluțiile enzimatice concentrate produse cu
ajutorul tulpinilor izolate obținute în cadrul tezei de doctorat utilizate ca
biofertilizator, la concentrația de 3,5% față de martor.
IV Figura 4.115. Comparație între soluțiile enzimatice concentrate produse cu
ajutorul tulpinilor izolate obținute în cadrul tezei de doctorat utilizate ca
biofertilizator, la concentrația de 2,5% față de martor pe seminte de R.
sativus .
IV Figura 4.116. R. sativus fertilizat cu soluțiile enzimatice de concentrație
3,5%, obținute cu ajutorul tulpinilor isolate
IV Figura 4.117 Comparație între soluțiile enzimatice concentrate produse cu
ajutorul tulpinilor izolate obținute în cadrul tezei de doctorat utilizate ca
biofertilizator, la concentrația de 1,5% față de martor.
IV Figura 4.118. Comparație între diferite concentrații ale soluției enzimatice
produse cu ajutorul tulpinii DA10 obținute în cadrul tezei de doctorat
utilizate ca biofertilizator pe plantule de R. sativus
IV Figura 4.119 Soluțiile enzimatice obținute din tulpinile izolate, testate pe
S.tuberosum ssp. Christian și Roclas , la diferite concentrații

168
IV Figura 4.120 . Soluțiil e enzimatice obținute din tulpinile izolate, testate pe
S.tuberosum ssp. Christian și Roclas la diferite concentrații
IV Figura 4.121 Soluțiile enzimatice obținute din tulpinile izolate, testate pe
S.tuberosum ssp. Christian și Roclas la diferite concen trații
IV Figura 4.122 Soluțiile enzimatice obținute din tulpinile izolate, testate pe
S.tuberosum ssp. Christian și Roclas la diferite concentrații
IV Figura 4.123 Soluțiile enzimatice obținute din tulpinile izolate, testate pe
S.tuberosum ssp. Chris tian și Roclas la diferite concentrații
IV Figura 4.124.Comparație între S.tuberosum ssp. Christian și S. tuberosum
ssp Roclas . Soluție enzimatică obținută cu ajutorul tulpinilor izolate, la
diferite concentrații

169
LISTA DE TABELE

Capit ol Titlul tabelului Pag.
III Tabelul 3.1. Curba etalon pentru amilaze.
IV Tabel 4.1 Rezutatele obținute în urma screeningului activității proteazice la
578nm
IV Tabel 4.2 Rezutatele obținute pentru tulpina DA7 în urma screeningului la
diferite tempera turi, față de martor 0,181
IV Tabel 4.3 Rezutatele obținute pentru tulpina DA10 în urma screeningului la
diferite temperaturi, față de martor 0.181
IV Tabel 4.4 Rezutatele obținute pentru tulpina DA13 în urma screeningului la
diferite temperaturi, față de martor 0.181
IV Tabel 4.5 Evoluția producției enzimatice cu tulpina DA7 în funcție de
valorile pH, față de martor 0,180
IV Tabel 4.6 Evoluția producției enzimatice cu tulpina DA10 în funcție de
valorile pH, față de martor 0,180
IV Tabel 4.7 Evolu ția producției enzimatice cu tulpina DA13 în funcție de
valorile pH, față de martor 0,180
IV Tabel 4.8 Rezultatele obtinute la identificarea tulpinilor bacteriene folosind
sistemul BIOLOG
IV Tabel 4.9 Rezutatele obținute pentru tulpina DA7 în urma scre eningului la
diferite temperaturi
IV Tabel 4.10 Rezutatele obținute pentru tulpina DA10 în urma screeningului la
diferite temperaturi
IV Tabel 4.11 Rezutatele obținute pentru tulpina DA13 în urma screeningului la
diferite temperaturi
IV Tabel 4.1 2Influența temperaturii asupra producției de protează pentru tulpina
DA7
IV Tabel 4.13Influența temperaturii asupra producției de protează pentru tulpina
DA10
IV Tabel 4.14 Influența temperaturii asupra producției de protează pentru tulpina
DA13

170
IV Tabel 4.15 Influența agitării asupra producției de biomasă bacteriană, 100
rpm
IV Tabel 4.16 Influența agitării asupra producției de biomasă bacteriană, 135
rpm
IV Tabel 4.17 Influența agitării asupra producției de biomasă bacteriană, 170
rpm
IV Tabe l 4.18 Evoluția producției de protează cu tulpina DA7 în funcție de
valorile pH, față de martor 0,179
IV Tabel 4.19 Evoluția producției de protează cu tulpina DA10 în funcție de
valorile pH, față de martor 0,179
IV Tabel 4.20 Evoluția producției de pro tează cu tulpina DA13 în funcție de
valorile pH, față de martor 0,179
IV Tabel 4.21 Influența agitării asupra producției de protează, 100 rpm
IV Tabel 4.22 Influența agitării asupra producției de protează, 135 rpm
IV Tabel 4.23 Influența agitării a supra producției de protează, 170 rpm
IV Tabel 4.24 Determinarea carbonului organic, după 24 ore de incubare a
fragmentelor de blană în soluția enzimatică

171
BIBLIOGRAFIE

1. Adriano B., (2008), Bacterial keratinases:Useful enzymes for bioproce ssing agroindustrial
wastes and beyond. Food Bioprocess Technol 1:105 –116
2. Aftab M.N., Hameed A., Ikram -ul-Haq, C. Run-sheng, (2006), Biodegradation of Leather
Waste by Enzymatic Treatment , The Chinese Journal of Process Engineering, 6 (3),
pp. 462-465
3. Albu M.G., (2009), Geluri și matrici colagenazice cu grade diferite de hidratare și
structură cvasisolidă pentru aplicații biomedicale , Rezumatul tezei de doctorat,
Universitatea din București, Facultatea de Chimie, paginile 6,7,8.
4. Alexander M., (1996), Biore mediation technologies in Biodegradation and Bioremediation
(Alexander M., ed.), Acad. Press, London, pp.248 -270
5. Anson M.L., (1938), J. Gen. Physiol. 22, 79 -89
6. Anson, M. L., (1940), Journal of General Physiology. 23, 695
7. Asdormithee S., Akiyama K., Sasaki T., Takata R., (1994), Isolation and characterisation
of a collagenolytic enzyme from Bacillus licheniformis N22 , J. Fermen Bioengi., 78:283,
pg.7.
8. Astbury W. T. și Street A., (1931), Phil. Trans. Roy. Soc. , A, 230, 75. The structure of
proteins; two hydro gen-bonded helical configurations of the polypeptide
chain ‖ Fundamentals of fibre structure .
9. Astbury W. T. și Woods H. J., (1933), NATURE , 126, 913 (1930); Phil. Trans. Roy. Soc. ,
A, 232, 333;
10. Aunstrup K., (1980), Proteinases in microbial enzymes and bio conversions , Economics
Microbiology. Ed. Rose, A.H. 5, 50 -114.
11. Baehaki M., Suhartono D., Syah A., Sitanggang Siswa Setyahadi, Meinhardt F., (2012),
Purification and characterization of collagenase from Bacillus licheniformis F11.4 African
Journal of Micro biology Research, 6 (10), pp. 2373 -2379
12. Baker J.O., Adney W.S., Thomas S.R, Nives R.A., (1995), Synergism between purified
bacterial and fungal celluases. ACS Symp. Series, 618:114 – 141.
13. Banga I., (1966), Structure and function of elastin and collagen, Ak ad, Kiado, Budapesta.
14. Böckle B., Galunsky B., Müller R., (1995), Characterization of a keratinolytic serine
proteinase from Streptomyces pactum DSM 40530. Appl Environ Microbiol 61:3705 –3710
15. Böckle B., Müller R., (1997), Reduction of disulfide bonds by Str eptomyces pactum
during growth on chicken feather. Appl Environ Microbiol 63:790 –792
16. Braikova D., Vasileva -Tonkova E., Gushterova A., Nedkov P., (2007), Enzyme Mixtures
and Complex Biosynthesis edited by Sanjoy K, Bhattacharya
17. Bressollier P., Letourneau F ., Urdaci M., Verneuil B., (1999), Purification and
characterization of a keratinolytic serine protease from Streptomyces albidoflavus . Appl
Environ Microbiol 65:2570 –2576
18. Brigitte B., Galunsky B., și Muller R., (1995), Characterization of a keratinolytic serine
proteinase from streptomyces pactum DSM 40530 . Applied and environmental
microbiology, p. 3705 –3710.
19. Bruice T.C., Fife T.H., Bruno J. J., Brandon N.E., (1962), Hydroxyl Group Catalysis. II.
The Reactivity of the Hydroxyl Group of Serine. The Nucleop hilicity of Alcohols and the
Ease of Hydrolysis of Their Acetyl Esters as Related to Their pKa' Biochemistry, 1 (1), pp
7–12

172
20. Bruice T.C., Sturtevant Julian M., (1959), Imidazole Catalysis. V. The Intramolecular
Participation of the Imidazolyl Group in the Hydrolysis of Some Esters and the Amide of
γ-(4-Imidazolyl) -butyric Acid and 4 -(2'-Acetoxyethyl) -imidazole2 J. Am. Chem. Soc., 81
(11), pp 2860 –2870
21. Burcea Mirela, (2001), Microbiologie general – Manual de laborator , Editura Piatra
Craiului București.
22. Carey E.E., W. H. Allaway, O.E. Olson, (1977), Control of Chromium Concentration in
Food Plants. 2. Chemistry of Chromium in soils and its availability to Plants. J Ag. Food
Chem. Vol 25(2) p. 305 -309.
23. Cârsteanu M., Vlădescu C., (1982), Colagenul Biochimie și fiziologie , Ed. Academiei
Republicii Socialiste Române România, pg. 8 -74.
24. Chirița G., (1981), Colagenul și utilizările lui , Ed. Tehnică, București, pp.114 -120.
25. Ciavetta C. and P. Sequi, (1989), Evaluation of chromium release during the
decomposition of le ather meal fertilizers applied to the soil. Fert Reearch 19: 7 -11.
26. Dayanandan A., Kanagaraj J., Sounderraj Lesley, Govindaraju R., Suseela G. Rajkumar,
(2003), Application of an alkaline protease in leather processing : an ecofriendly
approach . Journal of C leaner Production, Volume 11, Issue 5, Pages 533 – 536
27. Dayanandan J., Kanagaraj L., Sounderraj R., Govindaraju G.S. Rajkumar, (2003),
Application of an alkaline protease in leather processing: an ecofriendly approach , J. of
Cleaner Production, 11, pp. 533-536
28. Dettmer M.A.Z., Ayub M. Gutterres, (2011), Hide unhairing and characterization of
commercial enzymes used in leather manufacture, Braz. J. Chem. Eng., 28 (3)
29. Dozie I.N.S., Okeke C.N., Unaeze N.C., (1994), A thermostable, alkaline -active
keratinolytic p roteinase from Chrysosporium keratinophilum. World J Microbiol
Biotechnol 10:563 –567
30. Ellis D.O., McGavin S, (1970) , The structure of collagen –an X -ray study. J Ultrastruct
Res. Aug; 32(3):191 –211.
31. El-Safey E.M., (1994), Production of microbial a -amylases under solid -state incubation
conditions in the open air , Sci. A thesis, Bot. and Microbiol. Dept., Fac Sci, Al -Azhar
Univ., Cairo, Egypt.
32. Galarza B.C., Cavello I., Greco C.A., Hours R., Schuldt M.M., Cantera C.S., (2009),
Alternative Technologies for addi ng value to bovine hair waste , J. Soc. Leather Technol.
Chem., 94, pp. 26-32.
33. Giongo L.J., Lucas S.F., Casarin F., Heeb P., Brandelli A., (2007), Keratinolytic proteases
of Bacillus species isolated from the Amazon basin showing remarkable de -hairing
activ ity. World J Microbiol Biotechnol 23:375 –382
34. Godfrey T., West S., (1996), Industrial enzymology . 2nd ed. , Macmillan Publishers
Inc., New York, N.Y, p. 3
35. Gousterova A., Brailkova D., Goshev I., Christov P., Tishinov K., Tonkova V.E., Haertle
T., Nedlkov P., (2005), Degradation of keratin and collagen containing wastes by newly
isolated Thermoactinomycetes for alkaline hydrolysis. Lett Appl Microbiol 40:335 –340
36. Gradišar H., Friedrich J., Križaj I., Jerala R., (2005), Similarities and specificities of fungal
keratinolytic proteases: comparison of keratinases of Pacecilomyces marquandii and
Doratomyyces microsporus to some known proteases. Appl Environ Microbiol 71:3420 –
3426
37. Gradišar H., Kern S., Friedrich J., (2000), Keratinase of Doratomyces microsporus . Appl
Microbiol Biotechnol 53:196 –200

173
38. Gupta R., Ramnani P., (2006), Microbial keratinases and their prospective applications :
An overview. Appl Microbiol Biotechnol 70:21 –33
39. Habib S.M.A., Fakhruddin A.N.M., Begum S., Ahmed M.M., (2012), Isolation and
screening o f thermostable extracellular alkaline protease producing bacteria from tannery
effluents. J. Sci. Res. 4: 515 -522
40. Harkness R.D., Marko A.M., Muir H.M., (1954), Biochem J., pg. 56, 558.
41. Hisano T., Abe S., Wakashiro M., Kimura A., Murata K., (1989), Isolatio n and properties
of a collagenase with caseinolytic activity from a Pseudomonas sp. J. Fermen, Bioeng.,
68:399, pg.403.
42. Holt J.G., Krieg N.R., Sneath P.H.A., Staley J.T., (1994), Bergey’s manual of
determinative bacteriology , 9th edition. Williams and Wilk ins, Baltimore, pp 559 –562
43. Hostettler F., Borel E., Deuel H., (1951), Über die Reduktion der 3,5 -Dinitrosalicylsäure
durch Zucker , Helvetica Chimica Acta ,Volume 34, Issue 6, Pages 2132 –2139
44. Israel -Roming F., Cornea P.C., Gherghina E., Luța G., Bălan D., ( 2014), Bacterial
proteolytic enzymes tested on keratin and collagen based material , Scientific Bulletin.
USAMV București, series F. Biotechnologies, vol. XVIII, pp. 169 -173.
45. Israel -Roming F., Luța G., Bălan D., Gherghina E. , Cornea C.P., Matei F., (2015) , Time
and Temperature Stability of Collagenase Produced by Bacillus licheniformis, Agriculture
and Agricultural Science Procedia Volume 6, Pages 579 -584
46. Jain R., Jain P.C., (2010), Production and partial characterization of collagenase of
Streptomyces ex folyantus CFS 1068 using poultry feather, Indian Journal of Experimental
Biology, volume 48, pg.174, 177.
47. Janssen P.H., Peek K., Morgan H.W, (1994), Effect of culture condition on the production
of an extracellular proteinase by Thermus Sp Rt 41 A. Appl Mi crobiol Biotechnol 41:400 –
406
48. Joo H.S., Kumar C.G., Park G.C., Kim K.T., Paik S.R., Chang C.S., (2002), Optimization
of the production of an extracellular alkaline protease from Bacillus horikoshii. Process
Biochem 38:155 –159
49. Jurcoane Ș. et al., Tratat de biotehnologie , vol.I, editura tehnică, București, 2009.
50. Jurcoane Ș., Israel -Roming F., (2003), Lucrări practice: Biotehnologia Enzimelor și
Proteinelor, București.
51. Jurcoane Ș., Popa O., și colab., (1995), Biochimia și biotehnologia obținerii proteinelor și
enzimelor , Partea I – Proteine – curs litografiat U.S.A.M.V. Timișoara
52. Jurcoane Ș., Sasarman E., Roșu A., Banu A., Lupescu I., Tamba -Berehoiu R., Rădoi F.,
(2004), Tratat de Biotehnologie , Ed. Tehnică, București.
53. Kanth S.V., Venba R., Madhan B., Chandraba bu N.K., Sadulla S., (2008), Studies on the
influence of bacterial collagenase in leather dyeing , Dyes and Pigments, 76, pp. 338-347
54. Kanth S.V., Venba R., Madhan B., Chandrababu N.K., Sadulla S., (2009), Cleaner tanning
practices for tannery pollution abat ement: Role of enzymes in eco -friendly vegetable
tanning ,J. of Cleaner Production, 17, pp. 507-515
55. Kato T., Yamagata Y., Aria T., Ichishima E., (1992), Purification of a new extracellular
90-kDa serine proteinase with isoelectric point 3.9 from Bacillus su btilis nattoo and
elucidation of its distinct mode of action. Biosci Biotechnol Biochem 56:1166 –1168
56. Korkmaz H., Hür H., Dinçer S., (2004), Characterization of alkaline keratinase of B.
licheniformis strain HK1 from poultry waste, Annals of Microbiology 54 (2), 201 -211.
57. Koshland D.E. Jr., (1972), The catalytic power of enzymes , Proc. Robert A. Welch Found
Conf. Chem. Res. 15, 53 -91

174
58. Ku G., Kronenberg M., Peacock D.J., et al. , (1993), Prevention of experimental
autoimmune arthritis with a peptide fragment of type II collagen, Eur. J. Immunol., 23,
pp. 591-599
59. Kumar A.Ganesh, Swarnal atha S., Sairam B., Sekaran G., (2008), Production of alkaline
protease by Pseudomonas aeruginosa using proteinaceous solid waste generated from
leather manufacturing industries , Bioresource Technology, Volume 99, Issue 6, Pages
1939 -1944
60. Lin X., Lee C.G., Casale E.S., Shih J.C.H., (1992), Purification and characterization of a
keratinase from a feather —degrading Bacillus licheniformis strain. Appl Environ
Microbiol 58:3271 –3275
61. Liu L., Ma M., Cai Z., Yang X., Wang W., (2010), Purification and proprieties of a
collagenolytic protease produced by Bacillus cereus MBL13 strain, Foo d technol.
Biotechnol., 48, pg 151, 152.
62. Lowry O.H., Rosebrough N.J., Farr A.L., Randall R.J., (1951), Protein measurement with
the Folin phenol reagent , J. Biol. Chem., 193 (1), pg 265 -275.
63. Lowry O.H., Rosenbrough N.J., Farr A.L., Randall R.J., (1951), Protein measurement with
the Folin phenol reagent , J. Biol. Chem., 193, pp. 267-275
64. Lupescu I., Groposila -Constantinescu D., Jurcoane S., Diguta C., Cozea A., Tcacenco L.,
(2007), Production of lipases by strain of the non -conventional yeast Yarrowia lipolyt ica
and isolation of crude enzyme , Roumanian Biotechnology letter, Vol 12, No3, pp 3261 –
3268.
65. Lutckmeier C., Amaral L., Gutterres M., Marcílio N., (2008), Dechroming of wet -blue
leather wastes , XVII FLAQTIC Congress, Rio de Janeiro.
66. Macedo A. J., Silva W. O. B., Gava R., Driemeier D., Henriques J. A. P., Termignoni C.,
(2005), Novel keratinase from Bacillus subtilus S14 exhibiting remarkable dehairing
capabilities . Applied and Environmental Microbiol, 594 -596 Jan.
67. Macedo A.J., da Silva W.O.B.D, Gava R., Dr iemeier D., Henriques J.A.P., Termignoni C.,
(2005) Novel keratinase from Bacillus subtilis S14 exhibiting remarkable dehairing
capabilities . Appl Environ Microbiol 71:594 –596
68. Macedo A.J., da Silva W.O.B.D., Gava R., Driemeier D., Henriques J.A.P., Termign oni C.,
(2005), Novel keratinase from Bacillus subtilis S14 exhibiting remarkable dehairing
capabilities . Appl Environ Microbiol 71:594 –596
69. Mandl J.D., MacLennan E.L., Howes R.H., DeBellis A. Sohler, (1953), Journal of Clinical
Investigation, 32, pp. 1323 -132
70. Mencinicopschi Gh., (1987), Biotehnologii în prelucrarea produselor agroalimentare,
Editura Ceres.
71. Michaelis L., Menten M.L., (1913), Die Kinetik der Invertinwirkung . Biochemische
Zeitschrift. 49:333 –369.
72. Miller J. M. Și Rhoden D. L., (1991), Prelimina ry evaluation of Biolog, a carbon source
utilization method for bacterial identification, J. Clin. Microbiol, vol. 29 no. 6 1143 -1147
73. Moore S., și Stein W.A., (1954), A modified ninhydrin reagent for photometric
determination of amino acids and related com pounds, J. Biol. Chem. 211, pg. 907 -913.
74. Moore S., Stein W.H., (1948), Photometric ninhydrin method for use in the
chromatography of amino acids, J. Biol. Chem. 176: 367 -388.
75. Moore S., Stein W.H., (1948), J. Biol.Chem, 176, pp. 367-388
76. Nam G.W., Lee D.W., Lee H.S., Lee N.J., Kim B.C., Choe E..A, Hwang J.K., Suhartono
M.T., Pyun Y.R., (2002), Native -feather degradation by Fervidobacterium islandicum AW –

175
1, a newly isolated keratinase -producing thermophilic anaerobe . Arch Microbiol 178:538 –
547
77. Okamoto M., Yone jima Y., Tsujimoto Y., Suzuki Y., Watanabe K., (2001), A
thermostable collagenolytic protease with very large molecular mass produced by
thermophilic Bacillus sp . strain MO -1, Appl. Microbiol. Biotech., 57, pp. 103-108
78. Onafide A.A., Sane N.A., Musallam A.A ., Zarban S., (1998), A review: potentials for
biotechnological application of keratin -degrading microorganisms and their enzymes for
nutritional improvement of feather and other keratins as livestock feed resources.
Bioresour Technol 66:1 –11
79. Ozgunay H., Colak S., Mutlu M.M., Akyuz F., (2007), Characterization of Leather
Industry Wastes , Polish J. of Environ. Stud., 16 (6), pp. 867-873
80. Papadopoulos M.C., (1986), The effect of enzymatic treatment on amino acid content and
nitrogen characteristics of feather meal. Anim Feed Sci Technol 16:151 –156
81. Pauling și Corey, (1951), Proc Natl Acad Sci U S A. 1951 Apr; 37(4):20 5-11.
82. Petre M., (2001), Utilizarea microorganismelor imobilizate în hidrogeluri
radiopolimerizate în degradarea și conversi a unor constituenți vegetali, Teza de doctorat
83. Petre M., Teodorescu A., (2009), Biotehnologia protecției mediului Vol. I, Ediția a 2-a
revizuită și adăugită, Editura CD Press, București (ISBN: 978 -606-528- 040-3; 978 -606-
528-041-0)
84. Poonam N., Dalel S., (1995), Enzyme and microbial systems involved in starch processing ,
Enzyme Microb. Technol. 17: 770 -778
85. Priya S., Rajaram A., Rajaram R., Ramasami T., (2008), Depilation of skins by pure
enzymes , J. of the Society of Leather Technologists and Chemists, 92, pp. 214-221
86. Puri S., Beg Q.K., Gupta R., (2002), Optimization of protease production from Bacillus sp.
using surface response methodo logy. Curr Microbiol 44:286 –290
87. Ramnani P., Singh R., Gupta R., (2005), Keratinolytic potential of Bacillus licheniformis
RG 1: structural and biochemical mechanism of feather degradation. Can J Microbiol
51:191 –196
88. Rao M.B., Tanksale A.M., Ghatge M.S., De shpande V.V., (1998), Molecular and
biotechnological aspects of microbial proteases . Microbiol Mol Biol Rev 62:597 –635
89. Ravanti L., Kahari V.M., (2000), Matrix metalloproteinases in wound repair , Int. J. Mol.
med., 6, pp. 391-407
90. Reichard U., Buttner S., Eiffert H., Staind H., (1990), Purification and characterization of
an extracellular serine protease from Aspergilus fumigatus and its detection in tissue, J.
Med. Microbiol., 33 pp. 243-251
91. Riffel A., Lucas F., Heeb P., Brandelli A., (2003), Characterization of a new keratinolytic
bacterium that completely degrades native feather keratin. Arch Microbiol 179:258 –265
92. Robertus J.D., Kraut J., Richard A. Alden, și Birktoft Jens J., (1972), Subtilisin.
Stereochemical mechanism involving transition -state stabilizat ion Biochemistry, 11 (23),
pp 4293 –4303
93. Rui R., Zhiqiang L., Min C., (2009), Isolation and purification of caseinase and
collagenase from commercial Bacillus subtilis AS1.398 enzyme by affinity
chromatography, J. Soc. Leather. Tech. Chem., 93, pp. 8-11
94. S.V. Kanth, R. Venba, B. Madhan, N.K. Chandrababu, S. Sadulla, (2009), Cleaner tanning
practices for tannery pollution abatement: Role of enzymes in eco -friendly vegetable
tanning J. of Cleaner Production, 17, pp. 507-515
95. S.V. Kanth, R. Venba, B. Madhan, N.K. Chandrababu, S. Sadulla, (2008), Studies on the
influence of bacterial collagenase in leather dyeing , Dyes and Pigments, 76, pp. 338-347

176
96. Sambrook J., Russell D.W., (2001), Molecular cloning a laboratory manual , 3rd edn. Cold
Spring Harbour Laboratory, New York
97. Saravanabhavan S., Aravindhan R., Thanikaivelan P., Rao J.R., Nair B.U., Ramasami T.,
(2004), A source reduction approach: integrated bio -based tanning methods and role of
enzymes in dehairing and fiber opening . Clean Technol Environ Policy 7:3 –14
98. Schrooyen P.M.M., Dijkstra P.J., Oberthur R.C., Bantjes A., Feijen J., (2001), Partially
carboxymethylated feather keratins. 2. Thermal and mechanical properties of films . J
Agric Food Chem 49:221 –230
99. Shivaji S., Bhanu V.N., Aggarwal R.K., (2000), Identifica tion of Yersinia pestis as a
causative organism of plague in India as determined by 16S rDNA sequencing and RAPD –
based genomic finger printing. FEMS Microbiol Lett 189:247 –252
100. Stoicescu A., (1999), Manualul inginerului de industrie alimentară , vol. II, Edi tura
Tehnică București
101. Storm D. R. și Koshland D. E. Jr., The importance of orientation factors in enzymatic
reaction , Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol 36, 13 -20 (1971)
102. Suzuki Y., Tsujimoto Y., Matsui H. și Watanabe K., (2006), Decomposition of extreme ly
hard -to-degrade animal proteins by thermophilic bacteria . JOURNAL OF BIOSCIENCE
AND BIOENGINEERING Vol. 102, No. 2, 73 –81.
103. Suzuki Y., Tsujimoto Y., Matsui H., Watanable K., (2006), Decomposition of extremely
hard -to-degrade animal proteins by thermophi lic bacteria . J Biosci Bioeng 102:73 –81
104. Suzuki Y., Tsujimoto Z., Matsui H., Watanabe K., (2006), Decomosition of extremely
hard -to-degrade animal proteins by thermophilic bacteria , Journal of Bioscience and
Bioengineering vol. 102, pg.74 -76.
105. Tapai (Stoica) Mihaela, (2009), Biosinteza unor amilaze utilizate în hidroliza unor materii
prime agricole, Teza de Doctorat, p.65 -66, Bucuresti.
106. Tapai M., (2009), Biosinteza unor amilaze utilizate în hidroliza unor materii prime agricole
– Teză de doctorat, București
107. Thanikaivelan P., Rao J. R., Nair B. U., Ramasami T., (2004), Progress and recent trends
in biotechnological methods for leather processing , Trends in Biotechnol., 22.
108. Thanikaivelan P., Rao J.R., Nair B.U., Ramasami T., (2004), Progress and recent trends i n
biotechnological methods for leather processing , Trends in Biotechnol. p. 22
109. Thanikavelan P., Rao J.R., Nair B.U., Ramasami T., (2004), Progress and recent trends in
biotechnological methods for leather processing . Trends Biotechnol 22:181 –186
110. Thys R.C. S., Lucas F.S., Riffel A., Heeb P., Brandelli A., (2004), Characterization of a
protease of a feather —degrading Microbacterium species . Lett Appl Microbiol 39:181 –
186
111. Tork S., Aly M.M., Nawar L., (2010), Biochemical and molecular characterization of a
new local keratinase producing Pseudomomanas sp., MS 21. Asian Journal of
Biotechnology 2 (1): 1 -13
112. Tran L.H., Nagano H., (2002), Isolation and characterization of Bacillus subtilis CN2 and
its collagenase production, J. Food. Sci., 67, pp. 1184 -1187
113. Trandafir V., Demetrescu I., Vișan S., Albu M., (2013), Managementul deșeurilor
provenite din industria pielăriei , pg. 102 -103.
114. Varela H., Ferrari M.D., Belobrajdic L., Vasquez A., Loprena M.D., (1997), Skin
dehairing proteases of Bacillus subtilis: production and partial characterization .
Biotechnol Lett 19:755 –758
115. Voet D., Voet J.G., (2004), Biochemistry, 3rd edn. Wiley, New York

177
116. Waldvogel F.A. și Swartz N.M., (2004), Collagenolytic activity of bacteria , Journal of
Bacteriology, pg. 662, 666.
117. Wang, R., Min, C., Ha iming, C., Li, Z., (2009), Enzyme unhairing – an eco -friendly
biotechnological process . J. Soc. Leather Technol. Chem., 93, 51 -55.
118. Williams C.M., Richter C.S., Mackenzie J.M., Shih J.C.H., (1990), Isolation, identification
and characterization of a feather degrading bacterium. Appl Environ Microbiol 56:1509 –
1515
119. Yamagata Y., Abe R., Fugita Y., Ichishima E., (1995), Molecular cloning and nucleotide
sequence of the 90k serine protease gene hspK from Bacillus subtilis (natto) No. 16. Curr
Microbiol 31:340 –344
120. Yamamura S., Morita Y., Hasan Q., Yokoyama K., Tamiya E., (2002), Keratin
degradation: a co -operative action of two enzymes from Stenotrophomonas sp. Biochem
Biophys Res Commun 294:1138 –1143
121. Zarnea G., Mencin1copschi Gh, Brăgărea S. T. (1980), Bioingineri a preparatelor
enzimatice microbiene , Editura Tehnică București.
122. Zerdani I., Faid M., Malki A., (2004), Digestion of solid tannery waste by strains of
Bacillus sp. isolated from compost in Morocco , International Journal of Agriculture and
Biology, pg. 758, 759, 761.
123. Zerdani I., Faidi M., și Malki A., (2004), Digestion of solid tannery wastes by strains of
Bacillus sp. isolated from compost in Morocco. INTERNATIONAL JOURNAL OF
AGRICULTURE & BIOLOGY. 2004 /06 –5–758–761.
124. Zerdani M., Faid A. Malki, (2004), Dig estion of solid tannery wates by strains of Bacillus
spp. isolated from compost in Morocco, Internat. J. Agric. Biol., 6 pp. 758-761

WEB:
https://www.fastbleep.com/biology -notes/40/1184
http://static.fastbleep.com/assets/notes/image/10362_1.jpg
https://en.wikibooks.org/wiki/Principles_of_Bi ochemistry/Enzymes
https://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/1/15/CatalysisScheme.png
http://www.scrigroup.com/sanatate/cosmetica -frumusete/Biochimia -pielii92133.php

178
Lista de publicații

Mioara Ancu ța Dumitru*, Gabriel Corbu*, Ștefana Jurcoane** The International
Conference of the University of Agronomic Sciences a nd Veterinary Medicine of Bucharest,
Agriculture for life, life for agriculture, June 9 -11, 2016, Bucharest, Romania; " Leather
hydrolisate evaluated as bioactive potato fertilizer " Scientific Bulletin. Series F.
Biotechnologies, Vol. XX, 2016 ISSN 2285 -1364, CD -ROM ISSN 2285 -5521, ISSN Online
2285 -1372, ISSN -L 2285 -1364

Mioara Ancuța Dumitru*, Ștefana Jurcoane** The International Conference of the
University of Agronomic Sciences and Veterinary Medicine of Bucharest, Agriculture for life,
life for agricu lture, June 4 -6, 2015, Bucharest, Romania; " Leather hydrolyses evaluated as
organic nitrogen soil input " Scientific Bulletin. Series F. Biotechnologies, Vol. XIX, 2015 ISSN
2285 -1364, CD -ROM ISSN 2285 -5521, ISSN Online 2285 -1372, ISSN -L 2285 -1364

Mioara A ncuța Dumitru*, Ștefana Jurcoane** The International Conference of the
University of Agronomic Sciences and Veterinary Medicine of Bucharest, Agriculture for life,
life for agriculture, June 4 -6, 2015, Bucharest, Romania; " Characterization of bacterial
enzymatic complex used in leather waste degradation " Scientific Bulletin. Series F.
Biotechnologies, Vol. XIX, 2015 ISSN 2285 -1364, CD -ROM ISSN 2285 -5521, ISSN Online
2285 -1372, ISSN -L 2285 -1364

179