. Sensori Chimic Modificati Electrocatalitici Pentru Determinarea Dopaminei din Medii Biochimice

INTRODUCERE

Biochimia este o ramură de studiu a proprietăților și a comportamentului unor importante substanțe biochimice de tipul proteinelor, enzimelor, hormonilor, imunoglobulinelor și a acizilor nucleici. Cele mai recente cercetări în domeniul biologiei și medicinei se bazează pe dezvoltarea noilor tipuri de electrozi cu membrană ion-selectivi și a senzorilor cu membrană biocatalitici.

Lucrarea de față intenționează să exemplifice noile domenii in care electrozii chimic modificați și-au găsit utilitate precum și să prezinte o metodă amperometrică de determinare a dopaminei.

Metoda se bazează pe folosirea unui electrod chimic modificat electrocatalitic (CME) a cărui construcție și funcționare va fi prezentată în partea experimentală. Activitatea electrocatalitică a senzorului chimic modificat permite obținerea unui răspuns optim la un potențial mic fată de electrodul de Ag/AgCl. Electrodul chimic modificat prezintă o stabilitate bună pe parcursul utilizării repetate, cât și în timp.

În ultimii ani s-a demonstrat că electrozii posedând anumite grupări chimice legate în mod intenționat pe suprafața lor, prezintă anumite avantaje comparativ cu electrodul de bază. Una din proprietățile lor cele mai importante, care au făcut obiectul unor studii intensive, o reprezintă capacitatea CMEs de a cataliza oxidarea sau reducerea anumitor compuși chimici care prezintă suprapotențiale mari la nivelul electrozilor nemodificați, ei putînd fi determinați cantitativ prin intermediul metodei electrochimice tradiționale[1].

O alternativă pentru micșorarea suprapotențialului o reprezintă utilizarea CMEs conținînd mediatori redox adecvați, imobilizați pe suprafața electrozilor convenționali [2]. În scopul studierii comportării electrochimice a unor compuși se folosesc deci acești mediatori redox pentru a facilita procesele de transfer a electronilor [3]. Deoarece CMEs conduc la micșorarea potențialului formal de oxidare sau reducere a unor compuși chimici de importanță biochimică, acești electrozi au implicații directe în domeniul chimiei analitice.

În particular ei pot înbunătăți mult posibilitățile de detecție electrochimică în cadrul cromatografiei de lichide (LCEC) unde selectivitatea și sensibilitatea sunt direct dependente de potențialul impus de electrod, în scopul realizării reacției dorite [4].

În acest sens, CMEs prin caracteristicile lor, și-au găsit multiple aplicații ca detectori amperometrici în cadrul cromatografiei de lichide de înaltă performanță (HPLC).

1. ELECTROZI CHIMIC MODIFICAȚI
ELECTROCATALITICI

1.1. Principiul de construcție și de funcționare

Un electrod chimic modificat poate definit ca reprezentând o modificare rațională intenționată a structurii moleculare a suprafeței electrozilor convenționali în scopul utilizării lor în cadrul unor aplicații specifice [5-13].

Electrozii chimic modificați (CMEs) se bazează pe fixarea unui centru redox pe suprafața electrodului. Acesta funcționează ca un mediator pentru transferul rapid de electroni spre molecula de substrat, fiind oxidat sau redus lent (sau deloc în unele cazuri) la suprafaElectrozii chimic modificați (CMEs) se bazează pe fixarea unui centru redox pe suprafața electrodului. Acesta funcționează ca un mediator pentru transferul rapid de electroni spre molecula de substrat, fiind oxidat sau redus lent (sau deloc în unele cazuri) la suprafața unui electrod convențional.

Principiul de bază implicat în funcționarea unui CME electrocatalitic bazat pe un mediator redox este reprezentat în figura 1.1., pentru un process general de oxidare.

Fig 1.1.Reprezentarea schematica a unui CME si a reactiei de

electrod

În această secventă compusul de determinat difuzează din soluție spre suprafața electrodului, unde este oxidat în cadrul unei reacții chimice de către mediatorul în formă oxidată.

Potențialul electrodului este menținut la o valoare sufficient de pozitivă pentru ca forma oxidată a mediatorului să fie forma stabilă, iar forma sa redusă sa fie rapid oxidată la forma catalytic activă, în scopul reacționării în continuare cu compusul de analizat.

În principiu, mediatorul poate fi considerat că funcționează cu un transportor de electroni între electrod și compusul de analizat. Cazul discutat mai sus reprezintă unul ideal, care în practică poate fi mult mai complex.

Necesitatea unei astfel de medieri apare ori de câte ori viteza directa a transferului de electroni este mică, atunci când la nivelul unui electrod convențional este necesară aplicarea unui suprapotențial pentru a face ca reacția redox să aibe loc cu o viteză apreciabilă [14-18].

Prin utilizarea unui CME oxidarea sau reducerea compusului de analizat are loc la valoarea potențialului redox al mediatorului.

In concluzie, prin fixarea intenționată a unui mediator adecvat pe suprafața electrozilor convenționali, aceștia pot căpăta noi proprietăți, cum ar fi: mărirea vitezelor de reacție electrochimică și a selectivității, eliminarea fenomenelor de adsorbție, precum și obținerea unor caracteristici optice speciale.

Un electrod chimic modificat ideal pentru aplicații analitice, ceea ce presupune funcționarea continuă șî de durată în sisteme în flux, trebuie să prezinte următoarele caracteristici:

O bună stabilitate mecanică și chimică atât ale electrodului de bază și a grupări modificatoare, precum și a legăturii dintre electrod și acesta din urmă;

Reproductibilitatea pe o anumită perioadă și stabilitate în timp a activității grupării modificatoare față de compusul de analizat;

Flexibilitate în capacitatea de legare a grupării modificatoare;

Un domeniu larg de linearitate a păspunsului;

Curenți de bază mici și stabili pe domeniul de potențial utilizat;

Compatibilitatea cu o gamă largă de solvenți apoși și organici.

În ultima perioadă au fost folosite diferite procese de imobilizare a unor compuși chimici pe electrozi de diferite tipuri (în ceea ce privește materialul și construcția acestora), dar majoritatea proceselor au avut la bază câteva tehnici:

Adsorbția directă a modificatorului pe suprafața electrodului;

Legarea covalentă a modificatorului la un centru specific al suprafeței;

Acoperirea fizică a suprafeței cu un polimer conținând modificatorul;

Amestecarea modificatorului cu o matrice conductivă (pastă conductivă).

Dintre cele patru metode de fabricare prezentate, ultimele două par să facă cea mai posibilă obținerea unui electrod ideal.

Folosirea CMEs în chimia analitică se bucură de un success considerabil. Prin modificarea chimică a suprafeței electrozilor a fost posibilă obținerea unei varietăți de electrozi chimic modificați prin intermediul cărora pot fi determinați un număr mare de compuși chimici. Datorită selectivității și sensibilității mărite, electrozii chimic modificați sunt ideali pentru electroanalize. CMEs și-au găsit largi aplicații, dintre care în: electroanaliză, preconcentrare, permeabilitate selectivă șî recunoaștere specifică, calea fiind încă deschisă și spre alte aplicații [19-24].

1.2. Mediatori redox utilizați în construcția electrozilor chimic modificați

Mediatorii redox sunt utilizați în construcția senzorilor biochimici utilizați în diferite scopuri.

Datorită dificultăților de a realiza un transfer direct de electroni între enzyme și electrozi s-a apelat la utilizarea unor molecule mici electroactive care se numesc ˝mediatori˝, aceștia mărind viteza cu care are loc transferul de electroni.

Mediatorii redox sunt molecule chimice organice sau complecși organici care pot avea proprietăți catalitice asupra unor compuși. Compusul de analizat (substratul în forma redusă Sred) difuzează în soluție spre suprafața electrodului, unde este oxidat în urma reacției chimice cu forma oxidată a mediatorului (Mox). La nivelul electrodului se aplică un potențial sufficient de pozitiv pentru ca forma stabilă a mediatorului (Mred) rezultată în urma reacției electrochimice cu schimb de electroni să fie rapid reoxidată la forma activă catalytic.

1.3. Proprietățile mediatorilor redox

Un mediator ideal prezintă proprietățile:

stoechiometrie a reacției cu transfer de electroni bine definită.

un potențial formal E0’ cunoscut.

un transfer electronic omogen și heterogen rapid.

solubilitate mare în mediu apos la pH apropiat de 7.

stabilitate în forma oxidată cât și redusă.

să nu prezinte interferențe optice în domeniul în care se face determinarea compusului de analizat.

să nu interacționeze cu compusul de analizat într-o manieră care să altereze potențialul său redox.

În general se recomandă utilizarea mai multor mediatori redox în scopul studierii interacției dintre aceștia și biocomponentul de analizat. Este de dorit ca potențialul redox al biocomponentului să nu varieze, în caz contrar se poate presupune existența unei interacții între mediatorul redox și biocomponent. Potențialulu formal al compusului de analizat este un alt criteriu important în alegerea mediatorului. Potențialul formal al mediatorului ar trebui să fie nul la începerea studierii biocomponentului. Parametrul care urmează să fie măsurat nu trebuie să varieze la utilizarea unui variator, astfel interacția mediator-compus nu mai are loc corespunzător.

1.4. Aplicațiile mediatorilor redox

Dintre mediatorii cu proprietăți catalitice se menționează: ftalocianinele, porfirinele, compușii fenantrolinici. Dintre cei mai bine cunoscuți mediatori putem menționa Co-ftalocianinele (depuse pe un electrod de pasta de cărbune) și polimerul de ruteniu organic, electrodepus pe electrodul de Pt sau de cărbune sticlos.

Aceștia au fost frecvent folositi datorită activității lor catalitice pentru o mare varietate de analiți și datorită solubilității limitate, care le permit să fie stabili după depunerea pe suprafața electrodului.

Compușii asupra cărora au acțiune o-ftalocianinele depuse pe electrod sunt: hidrazinele, tiolii, acidul uronic. În procesul redox ce are loc, se realizează electrooxidarea Co(II) din centrul catalytic activ, la Co(III). Baldwin și colaboratorii săi [25-29] au descries metode pentru determinarea hidrazinei, cisteinei, glutationului, carbohidraților și polialcoolilor.

Alți mediatori sunt complecșii cu Mn(III) și Fe(III) depuși pe electrodul de pastă de cărbune. Ei pot cataliza reducerea oxigenului.

Recent, complecșii de Fe(II)-fenantrolină au fost introduși ca mediatori pentru electrozii de pastă de cărbune în scopul oxidării sau reducerii catalitice a oxizilor de azot, SO2 , cloraților și H2S, în sisteme speciale în flux.

Albastrul de Prusia prezintă activitate catalitică față de reducerea oxigenului sau a compușîlor peroxidici în medii acide și a fost utilizat ca mediator depus pe electrod de Au.

A fost menționat și un grup de electrozi pe care se depun straturi de oxizi metalici. Deși din punct de vedere ethnic nu puteau fi considerați CMEs, ei ei se asemănau cu aceștia datorită aplicațiilor numeroase în cromatografia de lichide. Dintre matalele folosite pot fi amintite Pt, Au, Ni, Cu, Ru. La folosirea metalelor nobile ca Au sau Pt stratul de oxid a dovedit o activitate catalitică capabilă să medieze reacții de dehidrogenare sau oxidare a unui număr important de compuși. Întotdeauna produși de reacție ai procesului anodic sunt puternic adsorbiți pe metal, ceea ce conduce la întreruperea semnalului, datorită blocării sistemelor active de pe suprafață, necesare pentru noi procese de oxidare.

Alți compuși foarte importanți detectați cu acești electrozi sunt: carbohidrații, derivați ai acestora, aminoacizi. Electrozii de pastă de cărbune care conțineau eteri coroană, tropolone și fenantroline, au fost folosiți la determinarea Co și Pb. Unii electrozi au fost modificați prin folosirea la suprafața lor a unui film polymeric care conține compuși de tip violagenic, chinone și bipiridin ruteniu legat de polivinil-piridina.

O serie de mediatori redox au fost utilizați în construcde mediatori redox au fost utilizați în construcția electrozilor chimic modificați cu enzyme: ferocenii, O-fenilendiamine, chinone, fenoxazinnii, O-fenilendiamine, chinone, fenoxazine, fenazine, tetrahidrofulvene (TFF), tetraciano-quiodimetan. Dintre aceștia, ferocenii și derivații lor au fost cel mai des folosiți. Ferocenilor li s-a acordat o atenție deosebită datorită proprietăților lor legate de hidrofobicitate, proprietăți electrochimice, posibilității de a fi modificați structural inducîndu-se astfel o modificare a potențialului lor redox. Hidrofobicitatea este un factor important deoarece previne desprinderea mediatorului de suprafața electrodului când acesta este utilizat în sisteme apoase.

Electrozii enzimatici amperometrici pentru glucoză, acid lactic și acid glutamic au fost construiți utilizând glucozo-oxidaza (GOX), lactatoxidaza și glutam-oxidaza imobilizați pe un electrod cărbune sticlos modificat cu polianilinometilferocen. În acești biosenzori enzimatici H2O2 formată în reacția enzimatică a glucozei, acidului lactic și acidului glutamic cu O2 în reacția enzimei corespunzătoare a fost detectată la –50mV (v.s. Ag/AgCl).

Datorită detecției la potential mic aplicat, compuși electroactivi ca acidul ascorbic, acidul uric nu interferă în analiză.

Un ferocen substituit mediază transportul de electroni dintre glucozoxidazaimobilizată Si un electrod de grafit. Acest sistem este independent de oxygen; ionii de fericiniu înlocuiesc O2, drept cofactor al GOX. Odată reduși, acești ioni pot fi generați la suprafața electrodului.

Biosenzorii care au la bază enzyme din clasa oxido-reductazelor utilizează O2 ca acceptor de electroni, având rolul de a reduce enzima în starea redox inițială. În tabelul 1.1. sunt redate o serie de enzyme electroactive din clasa oxido-reductazelor.

Tab. 1.1. Oxidoreductaze electrocatalitic active

O problemă care se ridică în cazul utilizării oxidoreductazelor este aceea că O2 este un factor limitative în condițiile operării biosenzorilor la concentrații mari de substrt. De asemenea, H2O2 rezultat în urma reacției enzimatice conduce la inactivarea multor enzyme.

Dehidrogenazele sunt folosite mai rar în construcția unor astfel de electrozi comparativ cu oxidorectazele, deoarece cofactorul enzymatic NAD+/NADH este mult mai dificil de a fi redus în mod reproductibil la suprafața electrozilor.

În majoritatea cazurilor de construire a unor senzori bazați pe dehidrogenaze este aplicată reacția de oxidare. La nivelul electrozilor metalici această reacție apare le o valoare de suprapotențial de ≡ 1 V și decurge printr-un mecanism radicalic, fapt care ridică o serie de probleme legate de acoperirea suprafeței electrodului și interferențele posibile datorită unor specii în solu posibile datorită unor specii în soluția de analizat. Toate acestea fac ca metoda de regenerare a NAD+ să nu fie cea mai adecvată în cazul electrozilor enzimatici ampermetrici.

Un număr de cercetători au căutat să găsească suprafețe de electrod catalitice la care reacția să apara rapid la valori mici de potențial. Aceste studii au avut la bază electrozi chimic modificați (CMEs). În cazul CMEs, un mediator redox este modificat pentru o metodă oarecare la suprafața electrodului iar transferul de electroni dintre speciile de determinat din soluție, NADH și electrod are loc prin intermediul acestuia.

În general un mediator trebuie să combine o cinetică omogenă a reactivilor cu molecula de interes cu o cinetică de electrod rapiă.

Cercetările inițiale au fost axate pe studiul ortochinonelor ca mediatori pentru oxidarea NADH-ului, dar electrozii obținuți nu ar fi putut fi folosiți cu success în construcția biosenzorilor datorită stabilității lor reduse.

1.5. Electrozi chimic modificați bazați pe enzime

Unul din factorii care limitează aplicațiile practice în chimia analitică a senzorillor chimici este selectivitatea. Folosirea enzimelor imobilizate, pe lângă mediatorul redox (M) , la construcția electrozilor rezolvă problema selectivității. Apărând astfel și o nouă clasă de detectori numiți electrozi chimic modificați bazați pe enzime imobilizate (IECMEs).

Studile privind IECMEs au luat amploare mai ales în ultimii ani, IECMEs fiind instrumente analitice care combină selectivitatea, specificitatea și capacitatea catalitică a enzimelor pentru substratul lor natural cu avantajele detecției electrochimice.

În ultima decadă electrozii chimic modificați și-au găsit largi aplicații în construcția biosenzorilor, care sunt electrozi chimic modificați bazați pe enzime,ce combină specificitatea, selectivitatea Si capacitatea catalitică a enzimelor față de substratul lor natural cu avantajele detecției electrochimice.

Biosenzorii bazați pe enzime pot fi folosiți în mod selective în cadrul analizei unor compuși diverși. Un factor care limitează atingerea întregului potențial de proiectare și realizare a acestor senzori este legat de proprietățile enzimei ca atare.

În ultimii ani o atenție deosebită s-a acordat unei noi clase de enzyme, quinoproteinel, care prezintă diferite activități enzimatice asupra unor substanțe de importanță biologică.

Se presupune că prin utilizarea acestor quinoproteine în construcția biosenzorilro se poate realiza un transfer direct între centrul activ al enzimei și electrod eliminându-se utilizarea mediatorilor redox. Schimbul de electroni direct ( fără mediatori) între o grupare redox a proteinei șî suprafața electrodului a fost studiată pentru un număr de proteine ca: citocromul, plastocianina, azurine, glucoz-oxidaza.

În ultimii ani au fost realizați biosenzori amperometrici și potențiometrici, care pe lângă mediatorul redox include Si biomolecule, rezultând o nouă clasa de detectori numiți electrozi chimic modificați bazați pe enzime imobilizate. În literature de specialitate există o serie de revievuri [30-39] prezentând principiul de construcție șî funcționare, precum și principalele caracteristici și aplicațiile electrozilor chimic modificați bazați pe enzyme imobilizate.

Sunt doua căi de cuplare a procesului de electrod cu reacția enzimatică. Prima aproximare este bazată pe utilizarea mediatorilor de mărime moleculară mică. În acest caz reacția de transfer de electroni are loc fără mediatori. Regenerarea mediatorului are loc pe suprafața electrodului.

Tehnicile de imobilizare constau în metode fizice și chimice de imobilizare cât și în combinații ale acestora.

Principalele metode fizice sunt adsorbția pe matrici insolubile și entraparea în geluri insolubile.

Imobilizarea chimică este efectuată prin legarea covalentă pe suporturi derivatizate sau legarea încrucișată intermoleculară a biomoleculelor.

Procedeele de imobilizare a enzimelor sunt prezentate sistematizat în tabelul 1.2.

Tab. 1.2. Procedee de imobilizare a enzimelor.

1.5.1. Bioelectrocataliza

Bioelectrocataliza se preocupă cu utilizarea materialelor biologice drept catalizatori pentru procesele electrochimice de oxidare și reducere[40]. Bioelectrocataliza se referă la transferul direct de electroni fără mediatori.

În 1978 a fost demonstrat că enzime ca lacaza au capacitatea de a cataliza electroreducerea.O2. a fost arătat că O2 este redus la electrod în prezența lactazei print-un mecanism direct (fără mediatori) [41].

O2 + 4H+ + e- 2H2O

Tot în același an s-a descoperit că citocrom b2 (FMN) și hemul său conținând lactat dehidrogenaza catalizează electro-oxidarea lactatului.

Lactat citocrom piruvat + 2H+ + 2e-

Electro-oxidarea lactatului a fost studiată pe un electrod de cărbune modificat cu o sare organică conductivă. Mecanismul de reacție al oxidării lactatului implică transferul direct de elecroni între enzimă și electrod. Mecanismului de transfer de electroni pentru sistemul enzime-catalizatori nu a fost elucidat. Ipoteza sugerând transferul de electroni mediat de grupările active de le suprafața electrodului a fost propusă de unii autori. S-a descries electroreducerea H2O2 cu peroxidaza inclusă în matrice polypyrrol pe suprafața electrodului. Enzima accelerează electroreducerea H2O2, fiind mediată de grupările active de la suprafața electrodului.

Proprietățile electrocatalitice ale enzimelor redox au fost observate pe o varietate de electrozi incluzând : cărbune sticlos, electrod pastă de cărbune, electrozi chimic modificați cu polimer organic[42-44]. Studii ale transferului redox ale grupărilor prostetice ale enzimei indică următoarele: posibilitatea sau imposibilitatea de a obține transferul electrochimic a grupării prostetice ale enzimei, nu indică prezența proprietăților electrocatalitice ale enzimei; gruparea prostetica a enzimei nu poate fi considerată ca un mediator redox intramolecular.

Cercetări ale cineticii formale ale enzimelor-catalizatori ale reacțiilor de electrod sunt valabile pentru lacază, hidrogenază și peroxidaze. Modelele cinetice ale peroxidazei ( catalizator al reducerii H2O2 ) au fost studiate amănunțit și comparate cu datele experimentaledin care reiese că 42% din cantitatea totală de enzyme adsorbite pe suprafața electrodului sunt accesibile pentru transferul direct de elctroni. Aceste studii sunt esențiale pentru înțelegerera proceselor de electrocataliză.

În general, mecanismele catalizei enzimatice a reacțiilor de electrod nu au fost încă cercetate în detaliu. Încă nu este clar ce parametric determina posibilitatea enzimelor redox de a cataliza reacțiile de electrod.

Există o serie de nelămuriri în ceea ce privește:

rolul grupărilor prostetice ale enzimei în electrocataliză;

rolul moleculelor de proteină în procesul de transfer de elctroni;

influența orientării moleculelor de enzime pe suprafața electrodului în procesul de bioelectrocataliză;

influența naturii materialului din care este realizat electrodul și structura suprafeței electrodului în bioelectrocataliză;

relațiile dintre mecanismul catalitic de acțiune a enzimei și manifestarea capacității electrocatalitice.

2. APLICAȚIILE ELECTROZILOR CHIMIC MODIFICAȚI

Folosirea electrozilor chimic modificați în chimia analitică se bucură de un success considerabil. Prin modificarea chimică a suprafeței electrozilor a fost posibilă obținerea unei mari varietăți de electrozi chimic modificați prin intermediul cărora pot fi determinați un număr mare de compuși chimici. Datorită selectivității și sensibilității mărite, electrozii chimic modificați sunt ideali pentru electroanalize. Electrozii chimic modificați și-au găsit largi aplicații și anume în: electrocataliză, preconcentrare, permeabilitate selectivă și recunoaștere specifică. Datorit proprietăților lor deosebite electrozii chimic modificați își vor găsi în continuare largi aplicații în domeniul chimiei analitice.

În tabelul 2.1 sunt prezente diferite aplicații ale electrozilor chimic modificați în cadrul analizei chimice și biochimice.

Metalo-ftalocianinele reprezintă o clasă de compuși care a fost foarte bine studiată datorită activității sale catalitice.

Cobalt-ftalocianinele au o eficiență dosebită în reacțiile în care sunt implicați compușii : N2H4 , acidul oxalic, alpfa-cetoacizi, compuși tiolici, cisteina, homocisteina, glutation, tiopurine [45-49].

Tab. 2.1. Aplicatiile electrozilor chimic modificati

În ultima decadă electrozii chimic modificați și-au găsit largi aplicații în construcția biosenzorilor, care sunt electrozi chimic modificați bazați pe enzyme, ce combină specificitatea, selectivitatea și capacitatea catalitică a enzimelor față de substratul lor natural cu avantajele detecției electrochimice.

Biosenzorii bazați pe enzime pot fi folosiți în mod selective în cadrul analizei unor compuși diverși, un factor care limitează atingerea întregului potențial de proiectare și realizare a acestor senzori este legat de proprietățile enzimei ca atare.

În ultimii ani o atenție deosebită s-a acordat unei noi clase de enzime, quinoproteinele, care prezintă diferite activități enzimatice asupra unor substanțe de importanță biologică.

Se presupune că prin utilizarea acestor quinoproteine în construcția biosenzorilor se poate realiza un transfer direct între centrul activ al enzimei și electrod eliminându-se utilizarea mediatorilor redox.

În ultimii ani, interesul chimiștilor și biochimiștilor analiști s-a axat pe realizarea și caracterizarea IECMEs care oferă o alternativă amperometrică de studiu și determinare a multor compuși chimici de importanță biochimică:proteine redox, enzyme, diferite substrate, utilizând mediatori fie liberi în soluție, fie fixați pe suprafața electrozilor. Datorită proprietăților acestora studiile bioelectrochimice au fost canalizate în câteva direcții [20-24, 50].

Una dintre acestea a fost legată de folosirea CMEs în studiile bioelectrochimice în scopul unei mai bune înțelegeri a reacției cu transfer de electroni în cadrul sistemelor biologice. Prin folosirea CMEs a fost posibil studiul compușilor biochimici care prezintă un transfer heterogen de electroni ce se desfășoară cu o viteză mică la nivelul electrozilor convenționali, presupune în consecință, o comportare electrochimică ireversibilă. S-a demonstrat că electrozii chimic modificați reprezintă o alternativă reală pentru transferul omogen de electroni cu ajutorul mediatorilor în soluție , ei putând fi utilizați pentru determinarea cantitativă a proteinelor și enzimelor.

Cercetarea caracteristicilor de oxido-reducere a sistemelor biologice este importantă în înțelegerea principalelor procese biologice. Tehnicile electrochimiei convenționale ca de exemplu: titrarea potențiometrică și titrarea coulometrică, voltametria ciclică și polarografia au fost utilizate în studiul biocomponentelor electroactive. Câteodată, multe specii biologice urmează un mecanism heterogen de electroni cu viteza mică șî în consecință perzintă un comportament electrochimic ireversibil. Studii intense au fost realizate pentru a obține o reacție de electrod reversibilă sau cvasireversibilă. De exemplu, electroliza reversibilă sau cvasireversibilă a citocromului a fost realizată utilizând oxidul de indiu. Utilizarea oxidului de ruteniu a fost cercetată pentru a ușura reacțiile de electrod ale câtorva proteine : citocrom c, azurin, rubredoxin, feredoxin și plastocianin.

O alternativă accesibilă care a fost aplicată cu succes la obținerea informațiilor electrochimice provind enzimele și proteinele a fost folosirea mediatorilor. Aceste specii care au o comportare reversibilă ideală sunt adăugate la soluția de proteină șî sunt utilizați ca intermediary ai transferului de electroni în oxidarea sau reducerea macromoleculei. [52-55].

Alte studii legate de acest domeniu au demonstrat posibilitatea unui transfer direct de electroni între gruparea redox a unei proteine și suprafața electrodului . aceste studii dezvoltă o bază electrochimică pentru cercetarea structurii proteinelor, mecanismul transformărilor redox al proteinelor și proceselor metabolice implicând transformarea redox [55-60].

Studiile existente până la ora actuală au indicat faptul că viteza schimbului de electroni între centrul activ al enzimei și electrod este determinată de natura enzimei șî materialul de electrod. Astfel, găsirea unor noi materiale de electrod care ar putea conduce la un transport eficace de electroni este de interes theoretic și practice.

Un alt domeniu de interes pentru studiile electroanalitice bazate pe CME îl reprezintă construcția și caracterizarea electrozilor modificați bazați pe enzyme imobilizate (IECMEs) care combină specificitatea, selectivitatea și capacitatea catalitică a enzimei față de substratul ei natural cu avantajele oferite de detecția electrochimică. Cercetările în domeniul tehnologiei biosenzorilor se dezvoltă foarte rapid; descoperirile recente în studiul moleculelor și proceselor biochimice au un impact deosebit în diferite domenii ale electrochimiei, dintre care unul din cele mai importante îl reprezintă electroanaliza.

În tabelul 2.2 sunt prezente o parte din aplicațiile CMEs în domeniul compușilor chimici de importanță biochimică.

Realizarea și caracterizarea IECMEs se află încă la început șî este de așteptat ca datorită proprietăților menționate, aceștia să devină în perspectivaă instrumente analitice foarte utile în determinările de interes chimic și biochimic [61-66].

Tab. 2.2. Aplicațiile CMEs bazați pe enzime

3. IMPORTANȚA DETERMINARII DOPAMINEI

Dopamina face parte din grupa unor importante substanțe numite catecolamine sau hormoni medulosuprarenalieni. Este un intermediar important în biosinteza adrenalinei și a noradrenalinei, principalele secreții ale acestor hormoni. Principalul effect fiziologic al catecolaminelor este cel asupra sistemului circulator. În același timp sunt efectori ai stării nervoase și au rol important în transmiterea fluxului nervos simpatic.

Rolul biochimic al catecolaminelor constă în implicațiile lor în circuitul hidromineral. Reglarea secrețiilor hormonale se face cu ajutorul influxurilor nervoase transmise cu ajutorul neurotran-smițătorilor. Secreția de hormoni medulosuprarenali este provocată de excitarea căilor nervoase transmise cu ajutorul dopaminei, noradrenalinei și serotoninei.

Totodată, s-a demonstrat faptul că dopamine este un factor de inhibiție al prolactinei, care este hormonal lactogen sau lactotrop ce acționează asupra secreției glandei mamare prin mărirea atât a cantității de țesut glandular, cât și a producției de lapte.

Cu ajutorul tehnicii de histofluorescență s-a putut alcătui o “hartă” a conexiunilor dopaminei. Dopamine este unul dintre cei mai interesanți neurotransmițători pentru că este implicată în câteva funcții interesante cum este mobilitatea , atenția și capacitatea de învățare.

Degenerarea neuronilor dopaminergici ce conectează substanță cenușie în circuitul nervos cu nucleul căutat provoacă boala lui Parkinson, caracterizată prin tremurul și rigiditatea extremităților, lipsa de echilibru și dificultate în inițierea mișcărilor. Dopamine este implicată ca și substanță neurotransmițătoare în schizofrenie, o dereglare mentală serioasă, caracterizata prin halucinații, deziluzii și întreruperea procesului normal logic, de gândire.

Prin descompunerea dopaminei se obține melanina, care este pigmentul pielii. Scăderea cantității de dopamină poate avea loc prin inhibiția unor enzyme ca tirozinhidroxilaza, DOPA-decarboxilaza prin dereglarea acumulării de dopamină și acid homovanilic, metabolitul principal al dopaminei în organismul uman. Obținerea efectului scontat în tratamentele ce folosesc medicamente ce provoacă stări antidepresive se bazează pe buna funcționare a sistemului dopaminergic. Funcțiile terminațiilor nervoase ale sistemului dopaminergic pot fi studiate în figura 3.1., în care:

Fig. 3.1. Schema functiilor terminatiilor nervoase dopaminergice: DA=dopamina; DOPA –DC = DOPA – decarboxilaza; M=mitocondrie; MAO= monoaminooxidaza; COMPT= catecol-O-metiltransferaza; DOPAC= acid dihidroxifenilacetic; HVS= acid homovanilic; Tyr=tirozinaza;

Totdată , datorită implicării în sistemul circulator, dopamine se folosește în tratarea afecțiunulor cardiace și în cazurile de edem pulmonar.

Având în vedere importanța sa clinică și biochimică, în literature de specialitate sunt prezentate o serie de procedee de determinare a acesteia.

3.1. Metode de determinare

Una din metodele de determinare a dopaminei a fost cea folosind tehnica perfuziei “ push-pull “ care constă din două tuburi concentrice prin care lichidul fiziologic este în același timp infuzat ( push) și scos (pull) [67].

Sensibilitatea ridicată a tehnicii cromatografiei de lichide cu detecți electrochimică, face ca această tehnică cuplată cu tehnica “ push-pull “ să devină ideală pentru aceste analize. Astfel, compusul de analizat din sistemul nervos este scos și analizat prin orice metodă folosită pentru cantități mici de probă.

Tot datorită prezenței în cantități mici a dopaminei în sistemul nervos s-au folosit markeri radioactivi.

Această metodă seamănă cu cea amintită înainte, doar că lichidul de perfuzie trece prin membrana de dializă. Moleculele mici prezente în mediul extern pot difuza prin membrană și îndepărtate din sistemul nervos.

Experimentele “ in vivo “ necesită folosirea unor aparate foarte sensibile și în același timp de dimensiuni mici. Electrozii voltametrici îndeplinesc aceste condiții și cu timpul au devenit din ce în ce mai specializați [68-71].

Pentru a îndeplini cerințele de mărime, cercetătorii au adoptat tehnica folosirii unui electrod cu fibră de carbon. Fibra de carbon se închide într-o capilară de sticlă și I se lasă un vârf ascuțit la exterior. Aria sensibilă a acestui vârf are o rază minimă de 5 μm și maxima de 35 μm.

Pentru a se crește selectivitate pentru catecolamine, se fixează pe suprafața elctrodului o membrană perfluorinată schimbătoare de ioni ( Nafion).

Folosirea membranelor schimbătoare de ioni este o tehnică des adoptată de cercetători, simplicitatea metodei fiind un avantaj valoros.

Polimerii folosiți ca membrane sunt diferiți, având fiecare avantajele și dezavantajele lor, dar toți își pastrează caracteristica de bază, adică lasă să treacă dopamine care este protonată la pH fiziologic, celelalte substanțe fiind excluse. Pentru a se putea crește timpul de rezoluție al acestei tehnici, s-au dezvoltat câteva tehnici electrohimice rapide.

O astfel de tehnică este cronoamperometria, tehnică în care se aplică un potențial asupra unui electrod, sufficient pentru electroliza speciei care ne interesează [72-76].

Voltameria ciclică și îmbunătățirile aduse acestei metode sunt o tehnică folosită în mod current pentru determinarea dopaminei. Se fac comparații între metodele de amperometrie la potențial constant și voltametria ciclică de scanare rapidă ca tehnici de monitorizare “ in vivo “.

Datorită potențialului constant, prima metodă este pițin afectată de schimbarea de current. Acest avantaj situează metoda, a doua după cromatografoa de lichide, ca metodă uzuală.

Determinările de dopamină se realizează și enzymatic prin intermediul unor preparate enzimatice obținute prin extracția enzimelor din diferite țesuturi ale plantelor.

Folosind un sistem de injecție în flux se poate determina dopamine cu soluția de enzimă folosită ca purtător. Pentru acest sistem s-a determinat că soluția de enzimă obținută din frunze de spanac este mai adecvată decât cea obținută din pulpă de banană [76-80].

Acest sistem de injecție în flux poate fi combinat cu folosirea de microelectrozi ca și detectori amperometrici. Ca mediator redox se folosește tetratiofulvalena tetracianochinodimetanul ( TTF-TC) care se amestecă cu clorură de polivinil ( PVC) în raport de 13: 1 și se suspendă într-o soluție de tetrahidrofuran (THF).

Concluziile acestor determinări sunt acelea că, datorită unei cinetici de o rapiditate rezonabilă, dopamină prezintă o sensibilitate mai mare decât acidul ascorbic și hidrochinonă, la diferențe relativ mici în fracțiunile ariei active a suprafeței investigate, astfel încât sensibilitatea de detecție a dopaminei este mai mare.

“ In vivo “, determinările sunt mult mai dificile decât “ in vitro “. De aceea determinările de acest tip trebuie să fie mult perfecționate.

Voltametria cu electrozi sufficient de mici pentru a putea fi introduși într-o celulă, asigură un mijloc de monitorizare cantitativă a substanțelor ușor oxidabile, atunci când concentrația lor se schimbă în citoplasma celulei. Această metodă se bazează pe o diferență de potențial între electrodul voltametric și electrodul de referință, ce duce la reacția de oxidare, result intensitate mâsurabil în picoamperi.

Electroforeza capilară este o metodă de înaltă eficiență, ce folosește volume foarte mici ( picolitri), pentru separarea moleculelor ionice, metoda ce se bazează pe mobilitatea electroforetică [81-83]. Cu ajutorul electroforezei capilare s-a determinat pentru prima dată cantitatea relativă de neurotransmițător liber, respective vascularizat, din corpul cellular al unei cellule nervoase singulare din Planorbis corneus.

Sensibilitatea și selectivitatea unei tehnici depinde de cele mai multe ori de natura electrozilor. S-a demonstrat că , electrozii modificați chimic prezință o mai mare stabilitate și selectivitate în determinările bioanalitice.

Un exemplu de astfel de electrod chimic modificat, este electrodul din pasta de cărbune modificat cu stearat ( SMes). Modificările de bază aduse de acest nou tip de electrod sunt acelea ca prezintă pe SMEs aresturilor carboxilice neprotonate la pH fiziologic întârzie electrooxidarea speciilor anionice, că ascorbatul și DOPAC, astfel încât speciile cationice de dopamină pot fi determinate în prezența lor [84,85].

Cu toate avantajele metodei amperometrice , cercetătorii au găsit o altă metodă mai eficientă combinând detecția electrochimică cu tehnica cromatografiei de lichide.

S-a descries o metodă de microcromatografie de lichide cu detecție electrochimică folosind un nou tip de electrod. Acest tip de electrod se obține , în principiu, prin comprimarea și încălzirea a două bucăți de polimer umplute cu cărbune pe un fir metallic introdus în două capilare din silice care se alipesc. Obiectul obținut seamănă mai mult sau mai puțin cu un cip folosit în electronică și de aceea a fost denumit electrodul “Chip”. Firul se scoate când cipul este cald. Cele două capilare silicioase conduc fluxul lichidului cromatografic de-a lungul electrodului, parte a cipului. Volumul celulei de analiză este determinat de dimensiunile firului și a capilarelor silicioase folosite [86]. Această metodă s-a folosit pentru determinarea catecolaminelor din urină și dintr-un amestec preparat.

O metodă foarte recentă și spectaculoasă în același timp, presupune folosirea unor lentile termice pentru determinarea spectrometrică (TLS) a catecolaminelor după oxidarea acestora la aminocromi. În această derminarea se folosește o tehnică laser foarte sensibilă [87]. Substanțele cu un spectru larg de absorbție molară la o lungime de undă a pompei de radiație pot fi determinate prin TLS; substanțele cu o absorbanță mică pot fi determinate, deasemenea, prin această metodă, chiar la o concentrație foarte mică. TLS permite determinarea dopaminei la nivelul de concentrație găsit în probele fiziologice cu o sensibilitate și reproductibilitate satisfăcătoare. La concentrații foarte mici, oxidarea dă soluții stabile de aminocromi. Stabilitatea ridicată permite ca oxidarea să poată avea loc la valori mari de pH, având loc cu o viteză foarte mare.

Sensibilitatea asemănătoare obținută pentru toate catecolaminele constituie un avantaj dacă se compară cu majoritatea metodelor fluorimetrice [89].

Caracteristicile analitice indică faptul că detecția TLS poate constitui o alternativă valoroasă în determinarea catecolaminelro folosind HPLC ( high performance liquid chromatography).

Determinarea dopaminei din urina umană prin HPLC constă din trei etape: prepurificarea catecolaminelor, separarea catecolaminelor prin cromatografia perechilor de ioni sau prin schimb de ioni și detecția prin metoda electrochimică sau fluorimetrică. Aceste procese pot fi automatizate și rezultatele obținute asigură utilizarea cu rezultate bune a acestei metode pentru determinările directe ale catecolaminelor din urină[90-91].

Construcția, caracterizarea și aplicațiile electrozilor modificați chimic posedând suprafețe funcționalizate specifice, reprezintă un nou domeniu de cercetare electrochimică, care în principiu poate deschide o serie de posibilităând suprafețe funcționalizate specifice, reprezintă un nou domeniu de cercetare electrochimică, care în principiu poate deschide o serie de posibilități analitice unice în domeniul electrochimiei [91-96].

Recent, pretatarea electrochimică a electrozilor de grafit realizată prin ciclizarea potențialului între valori anodice și catodice extreme a permis daterminarea selectivă “ in vivo” a doapminei și acidului ascorbic.

Până în present, în literature de specialitate sunt prezentate numeroase exemple de ECM [91-96]. În majoritatea cazurilor, în literature de specialitate sunt prezentate numeroase exemple de ECM [91-96]. În majoritatea cazurilor electrozii chimic modificați au fost proiectați pentru a mima la nivel heterogen sistemele redox observate în soluprezentate numeroase exemple de ECM [91-96]. În majoritatea cazurilor electrozii chimic modificați au fost proiectați pentru a mima la nivel heterogen sistemele redox observate în soluții ( medii omogene).

În mod obișnuit, gruparea modificatoare selectată și legată pe suprafața electroduuli este o moleculă electrolizabilă reversibilă, capabilă să medieze un process de oxidare sau reducere care în condiții normale are loc la valori mari de potențial datorită vitezei mici de transfer a electronilor între compușii de analizat și electrodul nemodificat.

În această lucrare se examinează posibilitatea utilizării analitice a electrozilor chimic modificați electrocatalitici, având la bază TMPD ( N,N,N’,N’- tetrametil fenilendiamină), pentru determinarea dopaminei. Electrozii utilizați au fost ECM pe bază de pastă de cărbune, realizați prin includerea directă a TMPD în pasta de cărbune.

S-au studiat atât proprietățule catalitice ale acestor ECM față de dopamină, cât și caracteristicile de răspuns.

3.2. Reactivi și soluții

N,N,N’,N’- tetrametil fenilendiamină ( TMPD) și dopamine s-au obținut de la firma Aldrich Co și au fost folosite ca atare, fără o purificare ulterioară în apă deionizată.

Toate soluțiile au fost proaspăt preparate pentru fiecare experiment în parte și deoxigenate prin barbotare de azot. Experiențele s-au realizat în soluții tampon fosfat-acid azotic de diferite pH-uri.

3.3. Aparatura

In cazul determinărilor s-a utilizat drept electrod inicator, electrodul pe bază de pastă de cărbune modificat cu TMPD.

Electrozii construiți din materiale pe bază de pastă de cărbune prezintă curenti de bază mici, ceea ce asigură un raport semnal/zgomot mic și de aceea sunt des utilizați în cazul determinărilor electroanalitice.

Electrodul pe bază de pastă de cărbune s-a preparat prin amestecarea într-un mojar a 5 grame de pulbere de grafit ( de puritate spectrală Fluka) cu 3 mL de ulei de Nujol ( obținut de la firma Mccarthy Scientific Co, Fullerton CA).

Electrozii chimic modificați s-au obținut în mod similar cu diferenta că, inițial, mediatorul se amestecă cu pulberea de grafit în cantitatea dorită, apoi se amestecă cu eter rezultând un amestec eteric; ulterior se lasă eterul să se evapore. Acest amestec, pulbere de grafit/mediator. Se introduce în ulei de Nujol, se mojarează și se introduce într-un tub de seringă de unică folosință. Contactul se realizează cu ajutorul unui fir de platină.

s-au observat variații mici ale curentului pentru diferite sarje de pastă de cărbune modificat, conținând aceeași cantitate de mediator.

Din acestă cauză este necesară realizarea unor noi curbe de calibrare ori de câte ori se utilizează o nouă sarjă de pastă.

Curbele de calibrare redate corespund la media a trei voltamograme diferite realizate pentru trei suprafețe de electrod, diferite pentru fiecare concentrație. Curenții obținuți pentru dopamină au fost corectați prin scăderea curentului de bază datorat oxidării TMPD.

Varianta de obținere a electrozilor chimic modificați prin includerea mediatorului redox în pasta de cărbune reprezintă metoda cea mai simplă de fabricare a acestuia. Ea oferă posibilitatea obținerii unui electrod a cărui suprafață modificată poate fi regenerată rapid și reproductibil. Se pot obține cantități mari de pastă de cărbune modificat într-un timp scurt ( câteva minute) prin simpla amestecare normală a unor propotții adecvate de pulbere de grafit, mediator și liant organic.

Utilizarea acestor electrozi în practică este limitată de folosirea lor în mediu apos ( pentru menținerea intactă a suprafeței electrodului) și de fabricarea unor mediatori care să prezinte o solubilitate redusă în apă. Electrodul de referință utilizat a fost cel de Ag/AgCl , iar cel auxiliar a fost de Pt. În figura 3.2. se redă montajul voltametric utilizat în cadrul determinărilor. Viteza de baleiere a potențialului a fost de 20 mV/s. Componenta principală a echipamentuuli, necesară pentru controlul potențialului electrodului indicator și pentru măsurarea simultană a curentului, este reprezentată de analizorul voltametric (potențiostat).

Caracteristica principală a analizoarelor voltametrice moderne constă în controlul potențiostatic al potențialului electrodului inducator.

Fig. 3.2. Schema montajului voltametric: 1- solutia probei; 2- electrodul indicator; 3- electrodul de referinta; 4- electrodul auxiliar

Circuitul este astfel realizat încât este posibil controlul potențialului dintre electrodul indicator și electrodul de referință în timp ce curentul care circulă între electrodul indicator și cel auxiliar este măsurat. Un astfel de potențiostat este cuplat cu un înregistrator x-y , obținându-se voltamogramele ciclice. Volumul celulei electrochimice este de 10 mL. Soluțiile au fost deaerate prin barbotare de azot. Potențialul electrodului indicator s-a fixat la o valoare sufficient de pozitivă comparativ cu potențialul formal de oxido-reducere al mediatorului ( Ef =0,10 v ), astfel încât forma oxidată a acestuia să fie cea stabilă la suprafața electrodului.

3.4. Rezultate și discuții

Cataliza în soluție

Voltamograma ciclică tipică obținută pentru oxidarea TMPD la nivelul electrozilor de pastă de cărbune este redată în figura 3.3:

Fig. 3.3. Voltamogramele ciclice obtinute la nivelul electrozilor de pasta de carbune pentru solutii ce contin: 2×10-4M TMPD, 1x 10-3 dopamina

Din toate punctele de vedere, comportarea anodică obsevată este similară cu cea prezentată în cadrul studiilor electrochimice existente în literature de specialitate.

La pH-uri acide TMPD prezintă două oxidări bine definite implicând un electron. Prima prezintă un pic de potențial la +0,10 V față de Ag/AgCl, este reversibilă și poate fi ciclizată un timp indefinit, ce-a de a doua apărând la +0,40 V care devine ireversibilă datorită unei reacții chimice ulterioare, probabil hidroliza produsului de reacție.

S-a evidențiat faptul că TMPD poate cataliza oxidarea dopaminei la nivelul primei unde și cea a NADH-ului la nivelul celei de a doua unde. În ambele cazuri a fost evidenevidențiat faptul că TMPD poate cataliza oxidarea dopaminei la nivelul primei unde și cea a NADH-ului la nivelul celei de a doua unde. În ambele cazuri a fost evidețiată prin creșterea dramatică a curentului anodic observat la nivelul undelor de oxidare ale TMPD implicate în process și scăderea corespunzătoare a curentului catodic observat pentru aceste unde prin baleierea în sens invers a potențialului. În cadrul lucrării s-a studiat sistemul electrocatalitic în mediu omogen (soluție) la nivelul electrozilor de pastă de cărbune nemodificați. Dopamine, ca atare a fost oxidată, prezentând o serie de unde anodice având potenând potențialul de pic la 0,26 V față de Ag/AgCl. Voltamograma ciclică tipică ( comportarea electrochimică ) observată pentru soluții conținând compusul de analizat ( dopamine) și catalizatorul (TMPD) în concentrație de 1×10-4 M este redată in figura 3.3.

Secventa de reacție urmează binecunoscutul mecanism “ catalitic EC” :

P Q + ne-

Q + A P + B

Unde: P = forma redusă a TMPD; Q = forma oxidată; A = corespunde substratului ( dopamina).

De notat este faptul că terminologia utilizată este inversă față de cea convențională, folosită de electrochimiști pentru a descrie un mecanism. Din punct de vedere al unui process de elctrod primar, termenul de “ catalizator “ ar trebui utilizat pentru a ne referi la speciile A. Totuși, deoarece reacția de interes final este cea de-a doua, procesul redox chimic, TMPD este privită a cataliza oxidarea dopaminei.

Electrozi chimic modificați conținând TMPD

În principiu este posibil să se realizeze aceleași procese catalitice la nivelul ECM conținând TMPD.

ECM utilizați în acest studiu au fost electrozii pe bază de pastă de cărbune modificați chimic prin simpla adăugare a cantității dorite de TMPD în pulberea de grafit înaintea realizării pastei de cărbune. Ăcest tip de ECM a fost ales datorită simplității construcției a posibilității de variere a concentrației de electrocatalizator și a ușurinței de generare a suprafețelor noi de electrod, prezentând o reproductibilitate cantitativă.

Electrodul chimic modificat cu TMPD este stabil și reproductibil. Prin baleierea potențialului în sens anodic, pe bază de pastă de cărbune ce conține TMPD ca mediator, se observă apariția unei unde de oxidare în domeniul de potențiale asemănător cu cel la care are loc oxidarea TMPD în soluție( figura 3.4.).

Fig. 3.4. Voltamograma ciclica obtinuta la suprafata ECM – PC continand 0,25% TMPD: (A) scanare initiala; (B) scanare obtinuta dupa 15 minute de ciclizare continua intre –0,1V si 0,28V vs Ag/AgCl

ECM poate fi ciclizat repetitive înspre prima undă de oxidare pe o perioadă de 15-20 minute, fără să se observe o scădere notebilă a intensității curentului obținut. Totuși, scanarea potențialului înspre cea de-a doua undă a TMPD face electrodul inutilizabil.

Electrodul poate fi inactivat fie prin menținerea acestuia în soluție timp de câteva ore, sau prin aplicarea continuă a potențialului corespunzător picului anodic timp de câteva minute. În ambele cazuri inactivarea are loc datorită trecerii în soluție a mediatorului. Activitatea electrodului poate fi ușor refăcută prin refacera suprafeței prin polișare, îndepărtându-se stratul extern și generându-se o suprafață nouă electrochimic activă. Elctrozii reînnoiți prin această metodă prezintă o comportare electrochimică stabilă și reproductibilă pe o perioadă definită de timp ( câteva săptămâni), funcție de numărul de determinări effectuate. Suprafețele noi de electrod pot fi ușor regenerate cu o reproductibilitate a picului anodic de 5-10%.

Influența față de pH

În ambel cazuri (TMPD în soluție și fixată în pasta de cărbune), potențialele picurilor anodice și catodice au fost influențate în mod identic de modificarea vitezei de baleiere a potenÎn ambel cazuri ( TMPD în soluție și fixată în pasta de cărbune), potențialele picurilor anodice și catodice au fost influențate în mod identic de modificarea vitezei de baleiere a potențialului. Pentru valori de până la 50 mV/s potențialele de pic au fost independente de viteza de baleiere, în timp ce pentru valori mai mari, atât procesele de fază omogenă cât și heterogenă, au fost deplasate spra valori mai mari de potențial. În plus, variațiile potențialelor de pic cu pH-ul , au fost identice pentru ambele sisteme. În ambele cazuri graficul Ep-pH (figura 3.5.) a prezentat un salt de 59 mV/unitate de pH la valori de pH mai mici decât 6,0, curbele aplatizându-se peste această valoare de pH.

Fig. 3.5. Influenta pH-ului asupra picului de potential pentru un ECM continand 0,25% TMPD: (A) unda anodica; (B) unda catodica

Acest tip de dependență față de pH sugerează faptul că grupările electroactive din ECM-PC se comportă ca adevărate center active de suprafață, influențate de condițiile din soluție, ele nefiind ascunse în interior, ECM nu prezintă o comportare ideală corespunzătoare unui monostrat (un singur strat de grupări modificatoare fixate pe suprafața electrodului).

Criteriile experimentale utilizate în caracterizarea comportării unui ECM sunt separarea picului anodic de cel catodic, și dependența curenților anodici și catodici asociați Ipa și Ipc pentru astfel de elctrozi variază direct proporțional cu rădăcina pătrată a vitezei de baleiere a potențialului, specific electrozilor controlați de difuzie (figura 3.6.).

Fig. 3.6. Variatia intensitatii de curent functie de viteza de baleiere a potentialului.

Așa cum rezultă din figurile 3.3 și 3.4. pentru Ecm-PC folosind în acest studiu, forma și separarea picurilor anodice și catodice observate pentru primul transfer electronic TMPD sunt asemănătore cu cele obținute pentru TMPD în soluție la suprafața unui sensor nemodificat de pastă de cărbune; această comportare persistă și pentru valori mici de baleiere a potențialului.

În final, au fost construiți și comparați diferiți ECM conținând concentrații diferite de TMPD în amestecul inițial de pastă de cărbune. Așa cum se observă din tabelul 3.1., pentru ECM fabricați din amestecuri de pastă conținând 0,25% până la 1% TMPD în greutate, curenții obținuți au fost proporționali cu concentrația de TMPD.

Tab. 3.1. Caracteristicile ECM funcție de concentrația modificatorului

Concentrațiile mai mari de 1% nu au fost folosite datorită curenților necontrolați care se obțin. Încercările de a folosi concentrații de 0,1% TMPD sau mai mici nu au fost încununate de success în privința obținerii unor ECM care să genereze unde semnificative.

Cataliza prin intermediarul ECM

Voltamogramele ciclice obținute pentru ECM-TMPD în soluții conținând 1×10-3M dopamină, sunt redate în figura 3.7.

Fig. 3.7. Voltamograma ciclica obtinuta la suprafata unui ECM continand 0,25% TMPD pentru o solutie de 10-3 domanina

Evident, comportarea catalitică a ECM este similară cu cea a TMPD în soluție față de dopamină, cataliză fiind evinențiată printr-o creștere semnificativă a curentului anodic. În plus, funcție de concentrațiile de dopamină prezente în soluție, unda de reducere se micșorează sau dispare total în cazul scanării în sens invers a potențialului.

Dependența de pH a procesuuli catalytic a fost studiat și a fost similară cu cea anterioară observată pentru oxidarea TMPD.

În continuare au fost studiate două aspecte legate direct de aplicațiile analitice ale catalizei prin intermediul ECM și anume: depandența de concentrație și mărimea selectivității.

În figura 3.8. se redă curba de calibrare corectată pentru curenții de bază, pentru un electrod de ECM-TMPD conținând modificatorul în cantitate de 1% în condițiile în care în probă nu există nici un interferent.

Fig. 3.8. Curba de calibrare a ECM continand 0,25% TMPD

Curbele de calibrare obținute pentru ECM conținând diferote concentrații de TMPD și corectate pentru curenții rezultați în absența compusului de analizat au prezentat domenii mari de liniaritate. Domeniul cel extins de liniaritate s-a obținut pentru electrodul conținând cantitatea cea mai mare de TMPD.

La concentraTii mici de dopamină răspunsul electrodului a fost limitat de curentul de bază existent datorat însăși oxidării TMPD, în timp ce la concentrații mari de dopamină, principala sursă de interferențe a constituit-o curentul de bază generat de oxidarea directă necatalizată a dopaminei care apare la o valoare de potențial de +0,26 V vs. Ag/AgCl (aceeași cu cea de la nivelu unui electrod de pastă de cărbune nemodificat).

Determinarea unor concentații mici de dopamină a fost limitată de primul effect și favorizată de utilizarea unor concentrații minime de TMPD în pastă de cărbune. Deci sensibilitatea maximă s-a obținut la un electrod conținând concentrații de 0,25% TMPD în pastă de cărbune. Limita de detecție folosind acest electrod a fost de 5×10-5 M dopamină, comparabilă cu cea obținută la nivelul unor electorzi nemodificați.

Domeniul de liniaritate pentru acest electrod a fost cuprins între 0,05-5,0 mM. Reproductibilitatea măsurătorilor picurilor de current pe domeniul menționat realizate cu diferite suprafețe de electrod a fost de 5-10%.

În general rezultatele obținute cu ajutorul ECM au fost comparabile ca precizie și reproductibilitate cu cele obținute la nivelul electrozilor de pastă de cărbune. Prin folosirea ECM , totuși curentul este urmărit la +0,1 V vs. Ag/AgCl valoare corespunzătoare oxidării dopaminei la suprafața electrodului de pastă de cărbune. Cel mai important aspect al performanțelor Ecm-TMPD a fost această deplasare a potențialului care oferă posibilitatea determinării acestui compus în prezența altor specii care la nivelul electrozilor nemodificați apar la aceeași valoare de potențial. Un exemplu în acest sens îl reprezintă dopamine și acidul ascorbic care se oxidează pe suprafața electrozilor de pastă de cărbune la potențiale de +0,26 V și respective 0,28 V. de fapt, determinarea separată a acestor doi compuși este de importanță practică deoarece discriminarea acestor specii în țesutul nervos a făcut obiectul multor studii publicate în literatură, de cercetătorii interesați în chimia proceselor de neurotransmitere.

Voltamogramele pentru o soluție conținând un amestec echimolecular de dopamină și acid ascorbic obținute la suprafața unui electrod de pastă de cărbune și a unuia CM-TMPD 0,25% sunt redate în figura 3.9. Apar în mod clar două unde anodice separate numai pentru ECM, dopamine apărând la prima oxidare a TMPD și acidul ascorbic la potențialul obișnuit de 0,28 V. deoarece voltamograma ciclică a fost trasată până la valoarea de 0,35 V cea de-a doua undă pentru TMPD nu apare.

Fig 3.9. Voltamogramele ciclice pentru solutii continand 1×10-3M dopamina si 1×10-3 M acid ascorbic obtinute la suprafata unui electrod nemodificat (A) si cu un ECM continand 0,25% TMPD (B)

Avantajul oferit de ECM pentru determinarea a doi compuși în amestec este redată în tebelul 3.2., în care picul de current obținut pentru o soluție de concentrație 1×10-3 M este constant în prezența unor concentrații diferite de acid ascorbic.

Tabel 3.3. curentul pentru dopamină în prezența acidului ascorbic

Unde: a=rezultă la +0,10 V vs. Ag/AgCl

Curba de calibrare obținută pentru diferite concentrații de dopamină în prezența unei concentrații constante de acid ascorbic. 1×10-3 a fost liniară pe domeniul 0,05-5,0 mM (coeficientul de corelație 0.991).

În prezența acidului ascorbic, curba de calibrare prezintă o pantă mai mare comparativ cu cea observată anterior pentru dopamină. Mult mai dificil dar, în același timp mult mai realistic, este cazul în care compusul de analizat apare la cea de-a doua undă și inteferentul în exces la prima, este simultan de situația inversă implicând determinarea unor urme de acid ascorbic în prezența unui exces de dopamină.

Gradul mai mare de dificultate analitică rezultă din faptul că, în aceste condiții cele două unde apar încă la potențiale distincte, cea de-a doua undă corespunzătoare acidului ascorbic se suprapune pe “coadă” porțiunea finală dar semnificativă a oxidării dopaminei. Aceasta depășește cu mult selectivitatea obținută la nivelul electrozilor de pasta de cărbune nemodificați.

Interesant este de comparat rezultatele obținute cu cele ale lui Cheng pentru un electrod de grafit/epoxi electrochimic pretratat prin ciclizarea inițială a electrodului între +0,7 și –0,2 V înaintea determinării.

În general, electrozii noștri chimic modificați nu au fost capabili să conducă la o discriminare mare între oxidările dopaminei și ale acidului ascorbic, cum este cazul electrozilor electrochimic pretratați. Unul dintre motive este acela că oxidarea dopaminei nu este catalizată cu eficiență de TMPD încorporat făcând ca oxidarea acesteia să fie separată de cea necatalizată a acidului ascorbic și să fie de numai 0,18 V.

CONCLUZII

S-a proiectat și construit un electrod chimic modificat bazat pe includerea directă în pasta de cărbune a N,N,N’,N’- tetrametil p-fenilendiamină. Proprietățile acestuia au fost caracterizate prin voltametrie ciclică.

Electrozii astfel construiți au prezentat două unde de oxidare (două oxidări) dependente de pH la +0,1 V și +0,4 V vs. Ag/AgCl la fel ca și soluția de TMPD.

Curenții obsrvați (rezultați) au fost dependenți, direct proporționali cu concentrația de TMPD adăugată în pasta de cărbune; suprafețe noi de electrod pot fi generate în câteva minute cu o reproductibilitate de 5-19%. Electrozii chimic modificați pe bază de TMPD pot cataliza electrooxidarea dopaminei la nivelul primei unde anodice. Domeniul de liniaritate a fost cuprins la nivelul primei unde anodice. Domeniul de liniaritate a fost cuprins între 5×10-3 M și 5×10-5 M dopamină.

Din punctul de vedere al simplității, flexibilității și reproductibilității ECM pe bază de pastă de cărbune posedă în mod clar proprietăți attractive. Procesul de modificare utilizat este unul din cele mai generale.

BIBLIOGRAFIE

R.W. Murray, A.G Eewing and R.A. Durst, Anal. Chem. , 1987, 59, 379

E. Wang, H. Hou, Electroanalysis, 1991, 3, 1

P.T. Kissinger, Laboratory Techniques in Electroanalytical Chemistry, P.T. Kissinger and W.R. Heineman, Eds., Dekker, New York, 1984, pp. 611-635

D.S. Austin – Harrison and D.S. Johnson, Electroanalysis, 1989, 1, 189

H. Lee, L. J. Kepley, H.G. Hong and T.E. Mallouk, J. Am. Chem. Soc. , 1988, 110, 618

L.L. Miller and M.R. Van de Mark, J. Am. Chem. Soc. , 1978, 100, 3223

A. Merz and A.J. Bard, J. Am. Chem. Soc. , 1978, 100, 3222

A.N.K. Lau and L.L. Miller, J. Am. Chem. Soc. , 1983, 105, 5271

J.M. Kalvert, R.H. Schmel, B.P. Sullivan, J.S. Facci, T.J. Meyer and R.W. Murray, Inorg. Chem. , 1983, 22, 2151

R.N. Dominey, N.S. Lewis, J.A. Bruce, D.C. Bookbinder and M.S. Wrighton, J. Am. Chem. Soc. , 1982, 104, 467

K.M. Kost, D.E. Bartak, B. Kazee and T. Kuwana, Anal. Chem. , 1988, 60, 2379

M. Umaňa and J. Waller, ibid. , 1986, 58, 2979

N.C. Foulds and C.R. Lowe, ibid., 1988, 60, 2473

H.D. Arbuna, P. Denisevich, M. Umaňa, T.J. Mayer and R.W. Murray, J. Am. Chem. Soc., 1981, 103, 1

C.R. Martin and L.S. Van Dyke, In Molecular Desing of Electrod Surface, R.W. Murray, Ed., John Wiley, New York, 1992

P.G. Pickup and R.W. Murray, J. Am. Chem. Soc., 1983, 105, 4510

R.A. Bull, F.R. Fan and A.J. Bard, J. Electrochem. Soc., 1984, 131, 687

N. Oyama and F.C. Anson, J. Electrochem. Soc., 1984,106, 1606

C.A.H. Chambers and J.K. Lee, J. Electroanal. Chem., 1967, 14, 309

R.N. Adams, Anal. Chem., 1976, 48, 1128A

T. Kuwana and W.G. French, Anal. Chem., 1964, 36, 241

F.A. Schultz and T. Kuwana , J. Electroanal. Chem., 1965, 10, 95

D. Bauer and M.P. Gaillochct, Electrochim. Acta, 1974,19, 597

B.F. Walkins, R.J. Sehling, E. Karin and L.L. Miller, J. Am. Chem. Soc. , 1975, 97, 3549

D.A. Buttrey and F.C. Anson, J. Am. Chem. Soc. , 1982, 104, 4824

N. Oyama and F.C. Anson, J. Am. Chem. Soc. , 1979, 101, 739

M.N. Szentimary and C.R. Martin, Anal. Chem. , 1984, 56, 1898

A.F. Diaz and J. Batgon, In Handbook of Marcel Dekke, New York, 1986, Vol. I, pp. 81-116

M. Krishnan, J.R. White, M.A. Fox and A.J. Bard, J. Am. Chem. Soc. , 1983, 105, 7002

D.C. Bookbinder, J.A. Bruce, R.N. Dominey, N.S. Lewis and M.S. Wrighton, Proc. Nat. Acad. Sci., USA, 1980, 77, 6280

A. Fitch, Clays and Clay Minerals, 1990, 38, 391

D.R. Rollinson, Chem. Rev., 1990, 90, 867

K. Itaya, I. Uchida and V.D. Neff, Acc. Chem. Res., 1986, 19, 162

C.A. Goss, C.J. Miller and M. Majda, J. Phys. Chem., 1991, 300, 377

A. Despic and V. Parkhutik, in Modern Aspect of Electrochemistry, J. Bokris, R.E. White and B.E> Conway, Eds., Plenum, New York, 1989, chap. 6

W. Kurner, T.J. Meyer and W.R. Murry, J. Electroanal. Hem., 1985, 195, 375

J. Wang, T. Golden, K. Varughese and J. El- Rayes, Anal. Chem., 1989, 61, 508

B.R. Shaw and K.E. Creasy, ibid., 1988, 60, 1460

K.E. Creasy and B.R. Shaw, ibid., 1989, 61, 1460

R.N. Adams, Anal. Chem. , 1958, 30, 1576

R.N. Adams, Electrochemistry at Solid Electrodes, Marcel Dekker, New York, 1969

C. Olson and R.N. Adams, Anal. Chim. Acta, 1960, 22, 582

C. Olson, R.N. Adams, Anal. Chim. Acta, 1963, 29, 358

E.S. Jacobs, Anal. Chem., 1963, 35, 2112

G. Farsang, Acta Chim. Acad. Sci., Hung, 1965, 45, 163

R. Landsberg and R. Thiele, Electrochim. Acta, 1966, 11, 1243

H. Monien, H. Ipecker and K. Zinke, Fresenius Z. Anal. Chem., 1967, 225, 342

J. Lindquist, J. Electroanal. Chem., 1974, 52, 37

C.A.H. Chambers and J.K. lee, J. Electroanal. Chem., 1967, 14, 309

R.N. Adams, Anal. Chem., 1976, 48, 1128A

G.T. Cheek and R.F. Nelson, Anal. Lett., 1978, 11, 393

T. Yao and S. Musha, Anal. Chim. Acta, 1979, 110, 203

K. Ravichandran and R.P. Baldwin, J. Electroanal. Chem., 1981, 126, 293

R.N. Adams, Rev. Polarog., 1963, 11, 71

A.A. Kaplin, N.P. Pikula and E.Y. Neiman, Zh. Anal. Khim., 1990, 45, 2086

A.A. Kaplin, N.P. Pikula and E.Y. Neiman, Zh. Anal. Khim., 1991, 45, 198

M. Štulikova and Štulik, Chem. Listy, 1974, 68, 800

T.R. Mueller, C> Olson and R.N. Adams, in Advances in Polarography, J.S. Langumir, Ed., Vol. I, Pergamon, London 1960, pp. 198

F. Vydra, K. Štulik and E. Juláková, Electrochemical Stripping Analysis, Ellis Horwood, Chichester, UK 1976

J. Wang, Stripping Analysis, VCH, New York, 1985

G. Dryhust and D.L. McAllsiter, Laboratory Technique in Electroanalytical Chemistry, P.T. Kisseger and W.R. Heineman, Eds., Marcel Dekker, New York 1985, pp. 294

R.J. Foster and J.G. Vas in Wilson & Wilson`s Comprehensive Analytical Chemistry, Vol. XXVII: Analytical Voltammetry, M.R. Smish and J.G. Vos, Eds., Elsevier Amsterdam, pp. 465

K. Khalcer, J. M- Kauffmann, J. Wang, I. Svancara, K. Vytras, C. Neuhold and Z. Yang, Electroanalysis, 1995, 7, 5

J. Wang, Anal. Chim. Acta, 1990, 243, 41

G.J. Patriache and J.C. Vire, Anal. Chim. Acta, 1987, 196, 193

Kh. Z. Brainina and V.V. Ahspur, Zavod. Lab., 1979, 45, 10

Kh. Z. Brainina and M.B. Vydrevich, J. Electroanal. Chem. , 1981, 121, 1

N.A. Vlakhovich, E.P. Medyntseva and G.K. Budnikov, Zh. Anal. Khim., 1993, 48, 980

I. Svancara, K. Vytras, F. Renger and M.R. Smyth, Sb. Ved. Pr., Vys. Sk. Chemickotechnol, Padubice, 1992, 56, 21

M.E. Rice, Z. Galus and R.N. Adams, J. Electroanal. Chem., 1983, 143, 89

F.I. Cheng and C.R. Martin, Anal. Chem., 1988, 60, 2163

J. Wang and J.M. Zadeii, J. Electroanal. Chem., 1988, 249, 339

C. Urbaniczky and K. Lindstrőm, J. Electeroanal. Hem., 1984, 176, 169

J. Lindquist, Anal. Chem., 1973, 45, 1006

R. Landsberg and R. Thiele, Electrochim. Acta, 1966, 11, 1243

D.G. Davis and M.E. Everhard, Anal. Chem., 1964, 36, 38

L.S. Chulkina, S.I. Siniakova and Y.K. Vulfson, Zh. Anal. Khim., 1970,25, 1268

R.C. Engstrom, K.W. Johnson and S. Des-Jarlais, Anal. Chem., 1989, 59, 670

J. Wang, L.H. Wu and R. Li, J. Electroanal. Chem., 1989, 272, 285

J.D. McLean, Anal. Chem., 1982, 54, 1169

J. Wang, T. Martinez, D.R. Yaniv and L. McCormick, J. Electroanal. Chem., 1990, 286, 265

R. Neeb, I. Keihnast and A. Narayan, Fresenius Z. Anal. Chem., 1972, 262, 339

Z. Gabes and R.N. Baldwin, Anal. Chem., 1984, 67, 866

K. Ravinchandran and R.P. Baldwin, Anal. Chem., 1984, 56, 1744

A. Ciucu, Biosensors for Envirommental Monitoring, Niculescu Publishing House, Bucharest 2000, pp. 200-245

K.N. Thomsen and R.P. Baldwin, Electroanalysis, 1990, 2, 263

J.W. Schlager and R.P. Baldwin, J. Chromatog., 1987, 390, 379

J. Ye and R.P. Baldwin, Anal. Chem., 1988, 60, 2263

K.N. Thomsen and R.P. Baldwin, Electroanalysis, 1990, 1, 236

J. Ye, R.P. Baldwin, and J.W. Schlager, Electroanalysis, 1989, 1, 133

S.V. Pralehu and R.P. Baldwin, Anal. Chem., 1989, 61, 852

Idem, ibid., 1989, 61, 2258

P. Luo, S.V. Prabhu and R.P. Baldwin, ibid., 1990, 62, 752

X. Qi and R.P. Baldwin, Electroanalysis, 1991, 3, 119

A. Ciucu and R.P. Baldwin, Electroanalysis, 1992, 4, 515

X. Qi and R.P. Baldwin, Electroanalysis, 1993, 5, 547