Șef lucrări dr. PODAR Dorina [617281]

LUCRARE DE LICENȚĂ

Conducător științific:
Șef lucrări dr. PODAR Dorina

Student: [anonimizat] 2018

UNIVERSITATEA “BABEȘ BOLYAI” CLUJ NAPOCA
Facultatea de Biologie și Geologie
Specializarea Biochimie

Determinanți moleculari ai rezistenței la mercur la bacterii
izolate din soluri contaminate

Conducător științific:
Șef lucrări dr. PODAR Dorina Student: [anonimizat] 2018
UNIVERSITATEA “BABEȘ BOLYAI” CLUJ NAPOCA
Facultatea de Biologie și Geologie
Specializarea Biochimie

Cuprins
Introducere …………………………………………………………………………………………………….. 1
1. Contaminarea solurilor cu Hg ……………………………………………………………………..2
2. Mecanisme de rezistență la Hg la bacteriile din sol …………………………………. …….5
2.1 Aspecte generale pentru rezistența la mercur …………………………………………5
2.1.1 Mecanismul determinanților cu spectru îngust …………….. …………..7
2.1.2 Mecanismul determinanților cu spectru larg ……………………………..8
2.2 Aplicații biotehnologice ………………………………………………………………………9
2.3 Mecanisme de rezistență la alte metale grele prezente în sol …………………..11
3. Interacțiuni între bacterii și plante la nivelul rizosferei în cazul solurilor contaminate cu H g
4.Determinanți moleculari ai rezistenței la Hg la bacterii izolate din soluri contaminate
4.1 Argument și obiective ……………………………………………………………………….13.
4.2 Materiale și metode ………………………………………………………………………….13
4.2.1 Izolarea tulpinilor bacteriene……………………… ………………………….14
4.2.2 Testarea izolatelor pe medii selective……………………………………… 14
4.2.3 Reacția în lanț a polimerazei………………………….. …………………….. .14
4.2.4 Electroforeza …………………………………………… ………………………….15
4.2.5 Purificarea produșilor de PCR……………………………………………….. 15
4.2.6 Secvențializarea și analiza bioinformatică ………………………………..16
4.3 Rezultate și discuții
4.3.1 Identificarea moleculară a speciilor de bacterii…………………………. 17
4.3.2 Identificarea determinaților moleculari care conferă bacteriilor rezistența la
Hg………………. …………………………………………………………………………………………23
Concluzii…………………………………………………………………………………………………….. ……27

1

Introducere

Impactul activității umane asupra mediului înconjurător se evidențiază din ce în ce mai mult
odată cu elaborarea unor noi metode și tehnologii menite să servească la îmbunătățirea traiului
fiecărui om. Industrializarea, exploatarea exagerată a rezervelor finite ale solului, utilizarea
monoculturilor și eficientizarea lor prin metode genetice și folosirea substanțelor chimice cu scop de
a distruge potențialii dăunători, expansiunea orașelor și construcția drumurilor. Tot odată acumularea
produșilor risipiți sau folosiți fără capacitatea de a fi reciclați, întrecerea economică și politică între
țări și construcția unor generatoare energetice poluante au înbunătățit confortul oamenilor cu prețul
alterării echilibrului ecologic de -a lungul istoriei.
În România după o perioadă sporită de activitate industrială și minieră, se ridică problema
contaminării solului cu metale grele. Acest fapt constituie o provocare costisitoare de a reintegra
solul steril în uzul agricultural sau cel puțin a neutraliza potențialii fa ctori ce ar putea periclita
sănătatea populației.
Pe suprafețele fostelor uzine și mine din regiune Transilvaniei, Copșa Mică, Baia Mare,
Târnăveni, Turda, Zona Zlatna, s -a observat o creștere sporită a unor specii de plante spontane în
solul contaminat, f apt ce indică obiectivul demarării acestui studiu de prelevare, identificare și
încadrare a speciilor de microorganisme și plante ce au dobândit prin diferite mecanisme genetice și
relații simbionte strategii de rezistență la acțiunea nocivă a metalelor gr ele existente în sol.
Este cunoscut faptul că microorganismele nu au doar capacitate de acumulare a metalelor
grele ci unele prezintă si pachete enzimatice ce pot metaboliza factorii nocivi din sol, eliberând
doverși produși de reacție, mai puțin inofensivi.
Finalitatea studiului constă în identificarea filogenetică a microorganismelor din soluri
contaminate cu metale grele atât prin metode microbiologice de pr elevare și selecție, cât și prin
metode de biologie moleculară, precum identificarea și evidențierea genelor ce oferă acelor
microorganisme rezistență. Ulterior aceste date pot să servească ca punct de plecare în cazul
acțiunilor de bioremediere ale solulu i.

2
1. Contaminarea solurilor cu Hg

Explozia industrială cauzată de creșterea economică, demografică și implicit tehnologică la
nivel global, a adus cu sine degradarea sau distrugerea mediului înconjurător nu doar prin
exterminarea florei și faunei unui ecosistem, dar și prin contaminarea solurilor, otrăvirea apelor și a
aerului. Aceste efecte negative dezechilibrează integritatea sănătății populațiilor umane (He și colab.,
2015).
Contaminarea solurilor prin acumularea metalelor grele provenite din rezidu uri industriale are un
impact devastator atât din punct de vedere ecologic, cât și economic. Poluarea solurilor este cauzată
de expansiunea zonelor industriale și a emisiilor poluante, activitatea minieră, sinteza, depozitarea și
aplicarea produșilor din i ndustria petrochimică, a vopselelor, îngrășămintelor și pesticidelor, arderea
cărbunilor sau irigarea cu ape reziduale (Wuana și colab., 2011). Acești factori antropici sunt
responsabili de contaminarea solurilor având un impact cu mult mai mare decât fact orii naturali, cum
ar fi erupțiile vulcanice sau infiltrarea apelor în roci.
Cele mai comune elemente ce se întâlnesc în siturile contaminate sunt mercurul (Hg), cromul
(Cr), plumbul (Pb), arsenic (As), zincul (Zn), cadmiul (Cd), cuprul (Cu), nichelul (Ni) , manganul
(Mn), toate acestea prezentând un nivel de toxicitate ridicată.
Una dintre cele mai periculoase problematici ale solului contaminat este absorbția și
înmagazinarea metalelor grele de către plantele cultivate (Tóth și colab., 2016), fapt ce a ridicat
întrebări privind siguranța consumului alimentelor vegetale cultivate. În acest sens, în Europa s -au
stabilit norme cantitative de apreciere a siguranței agricole din punct de vedere a contaminării solului
cu metale grele (Ministr y of Environment of Finland, 2007).
În ceea ce privește România, legislația impusă de Uniunea Europeană presupune un nou set
valori limită standar pentru încadrarea solurilor contaminate. Proprietarii de pămant folosit în
agricultură trebuie sa plătească asigurerea pentru viabilitatea solul altfel vor fi sancționați cu amenzi
între 25.000 -30.000lei (Ivaciu și colab., 2007), dar datorită exploatării miniere și a industrializării,
solurile din zona de nord și nord -vest a țării prezintă un grad crescut de con taminare cu metale grele
(Suciu și colab., 2008).

3

Figura 1. Harta Europei marcată cu procentele de contaminare ale solurilor cu metale grele din
terenurile agricole (Tóth et al., 2016).

Remedierea solurilor contaminate necesită, în general, costuri ri dicate, doar în Europa,
sumele ajungând până la 17.3 bilioane de euro/an (CEC. 2006). Datorită faptului că remedierea
chimică este mult prea costisitoare și ineficientă, studierea microorganismelor ce prezintă mecanisme
de adaptare și de transformare a com pușilor nocivi din sol în compuși inofensivi a devenit prioritară.
Microorganismele prezintă și funcția de susținere a ecosistemelor prin capacitatea lor de sinteză,
metabolizare și prin relațiile lor cu alte organisme. Datorită variabilității mari și a ca pacității de
diviziune rapidă, ele sunt primele ce dobândesc un pachet genetic ce asigură integritatea celulară și
mecanismele de rezistență la acțiunea unor factori toxici din mediu. Bioremedierea folosind
microorganisme este o abordarea eficientă în dec ontaminarea siturilor poluate ce nu implică
modificări asupra ecosistemelor.
Studierea formelor rezistente, înțelegerea și manipularea materialului genetic responsabil de
rezistența microorganismelor la acțiunea nocivă a metalelor grele reprezintă un pas m ajor în
implementarea strategiilor de bioremediere. Iar identificarea microorganisme care posedă pachetul
genetic prin care să realizeze îndepărtarea contaminanților din sol, cu eliberarea unor compuși mai
inofensivi, fără a deranja echilibrul ecosistemelo r, reprezintă temelia bioremedierii (Tóth et al.,
2016).

4
Mercurul este unul dintre cele mai toxice metale, acumulat cu ușurință de către viețuitoare.
Disponibilitatea sa este extrem de ridicată, fiind transportat sub formă gazoasă pe întreg globul, sub
formă ionică în ape și legat de acizi organici în sol. Trecerea dintr -o stare în altă stare este mediată nu
numai de potențialul său de oxido -reducere cât și de concentrația sa ((Xu și colab., 2015).
Acest metale rezultat din activitățile antropice este dep ozitat în mediu, iar cuplat cu emisiile
naturale creează un bazin de mercur global. Principalele activități antropice ce au consolidat emisiile
de mercur anchetate recent sunt reprezentate de activitățile miniere în extragerea aurului (38%),
arderea combu stibililor fosili (25%), industria metalurgică a metalelor non -feroase (10%), industria
cimentului (9%), eliberarea produșilor industriali sau al pesticidelor ce conțin mercur în mediu (5%)
și (8%) din alte surse (Xu și colab., 2015). Alte studii statistic e, prezintă că în timpul unui an, se
eliberează și re -emit în mediu, la nivel global, 3000 tone de compuși ce conțin mercur ( Branch,
2008).
Mercurul poate s ă fie întâlnit sub forma de săruri cu Cl-, sau cu S-2 formând complexe
anorganice sau întâlnit datorită afinității mari pentru unele grupări funcționale în complexe organice
de tipul hidroxil, carboxil, aromatic, sau în special compuși ce conțin grupare funcțională cu sulf
(Schuster E., 1991).
În ceea ce pri vește bioacumularea mercurului de către bacterii, absorbția sa nu este
îndeplinită de către proteinele transmembranare de tip canal, ca și în cazul cadmiului sau a zincului,
ci printr -un transportor proteic MerT specializat în transportul cationului bivale nt Hg+2 .Reducerea
mercurului de la Hg+2 la Hg0 sau metilarea cationilor de mercur are loc sub catabolism enzimatic si
face parte din procesele numite biotransform ări. Eliberarea CO 2, H 2O și NH 4+ ca produși metabolici
se numește mineralizare. În ceea ce prive ște bioacumularea m ercurului la nivel celular acesta poate
interacționa cu activarea enzimelor, cu procesele de transcriere și translație și cu sinteza
macromoleculelor, deoarece mercurul are afinitatea foarte mare pentru grup ările tiol și sulfhidril din
compoziția proteinelor (Morel și colab., 1998).
În funcție de concentrația absorbită, intoxicarea cu mercur poate duce la afecțiuni psihologice
minore temporare, tremurat, gingivită, acrodinie la copii sub 6 ani, dar și la avort spontan sau boli
neuro nale degenerative și mai presus are un mare potențial cancerigen (Singh și colab., 2011).

5
2. Mecanisme de rezistență la Hg la bacteriile din sol

2.1 Aspecte generale de rezistență la Hg

Pentru a supraviețui, bacteriile fie aerobe sau anaerobe, Gram -pozitive sau Gram -negative au
achiziționat datorită versatilității și variabilității lor, o serie de strategii de toleranță la diverse
concentrații și forme ale mercurului din sol (Xu și colab. , 2015). Aceste mecanisme sunt de mai
multe tipuri și includ fie împiedicarea ionilor de mercur să pătrundă în celulă printr -o barieră
permeabilă, sau prin sintetizarea compușilor cu sulf care se vor lega de mercurul ionic, diminuândui
toxicitatea, fie pri n utilizarea metalotioneinelor și polifosfaților sau fie prin metabolizarea mercurului
în compuși mai puțin nocivi sau inofensivi care pot fi eliberați în mediu (Hintelmann și colab, 2010).
Dintre aceste mecanisme, operonul Mer, localizat plasmidial de obi cei, dar poate să fie
localizat și în ADN -ul genomic sau în diferiți transposoni, reprezintă un pachet genetic foarte
folositor ce oferă o gamă variată de mecanisme cu rol în dobândirea toleranței bacteriilor din solurile
contaminate cu mercur (Das, 2016). Operonul mer, este format din mai multe gene funcționale și
reglatoare: merA, merB, merP, merT, merD, merR, merC, merF, merG, merE (Tabel 1).
Operonul mer a fost studiat intens în anii 90 și se consideră ca find unul dintre cele mai antice
mecanisme exist ente în bacteriile gram -negative, aerobe ce trebuiau să supraviețuiască mercurului
produs din activitățile vulcanice intense. Transferul orizontal de gene, transferul plasmidial și
existența operonului pe transpozomi reprezintă mecanismele de propagare a a cestor gene.
Modificarea operonul mer antic în complexul genetic de astăzi este rezultatul unor inserții, du plicații,
fuziuni de gene și reduceri regăsindu -se și evidențiindu -se în structura unor transposoni din familia
Tn21, Tn501 și pKLH2 (Osborne și colab., 1997).
Determinanții mer sunt de două tipuri: determinanții Mer -ului spectrului îngust conferă
rezistență numai față de sarea de mercur, în timp ce determinanții Mer -ului spectrului larg conferă
rezistență la organomercur cum ar fi metilmercur și f enilmercur, precum și sărurilor anorganice de
mercur. Operonul Mer este un operon reglator pozitiv. Pe lângă existența genelor operatoare,
promotoare și reglatoare, operonul posedă gene funcționale cum ar fi merP, merT, merD, merA,
merF, merC și opțional m erB în trenuri cu spectru larg. Toate aceste gene codifică o proteină ce
îndeplinește funcții specifice în rezistența la mercur. Fiecare proteină are un rol aparte și
funcționează alături de celelalte formând un complex funcțional prin care bacteriile sup raviețuiesc în
solurile contaminate (Das, 2016). Din punct de vedere al factorului nociv, mercurul poate să fie
clasificat ca

6
fiind anorganic, dacă formează săruri anorganice sau organomercur dacă se regăsește în compoziția
unei substanțe organice și prezi ntă legătură de tip C -Hg. În acest caz, mecanismele de toleranță
prezintă gene ce vor oferi răspunsuri diferite în funcție de combinația chimică în care se regăsește
mercurul.
În funcție de compoziția în care se regăsește mercurul în sol, microorganisme le pot răspunde
prin două mecanisme. În cazul în care în sol este prezent mercur anorganic, r ăspunsul este unul de
spectru îngust deoarece este specific doar pentru cationii liberi de mercur rezultați din solubilizarea
sărurilor mercurice. Cel de al doilea mecanism presupune un răspuns de spectru larg deoarece
implică recunoașterea și metabolizarea unor game variate de compuși organici care conțin mercur.
Cele două mecanisme prezintă atât componente comune, enzimele MerP, MerT, MerA și MerR cât și
enzime sp ecifice cum ar fi, MerB, MerC, MerE, MerF, MerD, (Mathema și colab., 2011).
Gena Proteina codificată Locația Funcțiile

merA Reductaza mercurică Citoplasma Reduce Hg2+ la Hg0

merB Liaza organomercurică Citoplasma Lizează legătura C -Hg+

merP Proteina de legare a Hg la Periplasma Transferă Hg+ la proteinele
periplasmă membranare integrale

merT Proteina de transport a Membrana internă Transportă ionul de mercur
ionului Hg

merD Proteina reglatoare Citoplasma Reglează negativ operonul mer

merR Proteina reglatoare Citoplasma Reglează pozitiv operonul mer

merC Proteina de transport a Membrana internă Transportă ionul de mercur
ionului Hg

merF Proteina de transport a Membrana internă Transportă ionul de mercur
ionului Hg

merG
Proteina cu rol în rezistența la
fenil-mercur
Periplasma

Rezistența la fenil -mercur este dată
de mecanismele de eflux

merE
Proteina de transport al metil –
mercurului
Proteina interna
Preia organo -mercurul in citoplasmă

7
Tabel 1. Genele incluse în operonul mer cu localizare și funcția enzimatică tradusă; tabel
adaptat din articolul lui Mathema și colab., 2011

Fiecare componentă a operonul mer are un rol important în reducerea cationului de mercur cu
formarea de mercur elementar. Componentele se pot clasifica în funcție de rolul pe care îl
îndeplinesc dar și după localizarea citologică unde se regăsesc. Astfel există proteine cu ro l în
imobilizarea și transportul mercurului, enzime care pot metaboliza mercurul și proteine care pot regla
expresia genică responsabilă pentru traducerea enzimelor necesare combaterii contaminării
(Mathema și colab., 2011).

2.1.1. Mecanismul de rezistenț ă la mercur prin determinanți cu spectru îngust

Determinanții cu spectru îngust au rolul de a converti prin reacția de reducere cationul
mercurului Hg+2 care este nociv deoarece atacă enzimele și materialul genetic, în mercur elementar
Hg0, volatil și ino fensiv.

Figura 2 : Mecanismul propus pentru rezistența la mercur cu determinanți de spectru îngust
(preluată și modificată din Dash și colab., 2012)

Cationii de mercur, sunt rezultați din solubilizarea sărurilor anorganice care conțin atomi de
mercur. E i pătrund prin membrana plasmatică externă a celulelor iar în spațiul periplastic se leagă de
proteina transcrisă din gena merP, care conține legături de cisteină în structura sa și pe baza afinității

8
mari a mercurului pentru resturi tiolice, aceasta va fo rma legătură de tipul Hg -S cu proteina MerP
find imobilizat și transportat spre membrana internă. La nivelul membranei interne, există trei tipuri
de proteine canal cu rol de a prelua mercurul imobilizat de MerP și de -l transporta în spațiul
citosolic. Cei trei transportori intermembranari posibili sunt transcriși din genele merT,merC și merF
și sunt proteine omoloage ce vor reține mercurul legat de MerP și îl vor elibera în citosol (Willson și
colab., 2000). Mercurul odată ajuns în citosol, pe baza afinită ții pentru cisteină din structura enzimei
reductaza mercurică transcrisă din gena merA, se va lega de aceasta reducându -se de la Hg+2 la Hg0.
Pentru a decurge reacția de reducere a mercurului este necesar un aport de electroni oferiți de
NADPH+H+ care se va oxida și va ceda electronii proteinei MerA integrându -i în cationul de mercur,
rezultând mercur elementar care poate să fie expulzat în mediu (Dash și colab., 2012).
Reglarea mecanismului are loc sub acțiunea unei proteine reglatoare MerR, cu origine
diferită față de genele din operon și care în prezența mercurului în celulă inițiază transcrierea genelor
necesare dobândirii rezistenței (Hobman și colab., 2007).

2.1.2 Mecanismul de rezistență la mercur prin determinanți cu spectru larg

În ceea ce privește mecanismul de rezistență la mercur prin determinanți cu spectru larg,
întâlnim pe lângă proteinele responsabile de răspunsul rezistenței prin determinați cu spectru îngust,
o serie de proteine specifice pentru acest mecanism.

Figura 3 : Mecanis mul propus pentru rezistența la mercur cu determinanți de spectru larg
(preluată și modificată din Dash și colab., 2012)

9
Organomercurul reprezintă compusul format din legarea atomilor de mercur prin legătură
covalentă cu carbonul. Există mai multe clase d e organomercur în funcție de tipul de grupare
funcțională la care se leagă cum ar fi metil -,dimetil -, etil -, acizi organici, adiție la alchene sau
compuși aromatici (Hintelmann H., 2010). Ei pot trece prin membrana celulară externă direct sau
prin transpor tori nespecifici, iar odată ajunși în spațiul periplastic se leagă de proteina MerP datorită
afinității pentru cisteina din structura proteinei, imobilizând organomercurul. Din spațiul periplastic
este transportat ulterior în citosol prin intermediul unei proteine transportor intermembranară. MerT
și MerE sunt transportori omologi pentru transportul metilmercur iar, MerG pentru transportul fenil –
mercurului. Organomercurul în spațiul citosolic va suferi o reacție de scindare a legăturii C -Hg
transformând or ganomercurul (R -Hg) în cationi de mercur (Hg+2), reacție realizată de enzima Liaza
organomercurică, transcrisă de pe gena merB (Pitts și colab., 2002). Ajuns în stadiul de cation,
mercurul este redus de către Reductaza mercurică, transcrisă din gena merA, reacție dependentă de
NADPH+H+, care se oxidează și cedează electronii în scopul reducerii mercurului (Dash și colab.,
2012). Reglarea mecanismului de rezistență prin determinanți cu spectru larg este asigurată de
proteina MerR care odată ce intră în conta ct cu organomercurul, va activa transcrierea genelor de pe
operonul mer prin inducție pozitivă. Opus genei merR și inclusă în operonul mer, merD este o genă
ce va codifica proteina MerD care are scop reglarea fină a activit ății transcrierii, jucând rolul d e
represor pozitiv deși prezintă o afinitate pentru regiunea operațională a operonului mult mai mică
decât MerA (Nucifora și colab., 1989).

2.2 Aplicații biotehnologice

Organomercurul este foarte periculos nu doar pentru mediul înconjurător, ci și pentru
sănătatea publică. Bioacumularea mercurului este un fenomen în amploare și nu reprezintă doar
fixarea mercurului în sol sau ape, ci un proces dinamic prin care mercurul este acumulat de plante
sau de plancton care sunt ulterior consumate de consumatori pr imari și acumulează exponențial
cantitatea de mercur. La rândul lor consumatorii primari sunt consumați de consumatori secundari
sau de top, care de asemenea, acumulează mercurul exponențial cu cantitatea contaminată
consumată. Astfel riscul de otrăvire cu mercur prin consumul alimentelor de natură vegetală sau
animală crește direct proporțional cu gradul de poluare. Procesul de acumulare exponențială, direct
proporțională între concentrația de mercur și acumularea sa în diferite verigi ale lanțului trofic se
numește biomagnificare și reprezintă una dintre cele mai mari consecințe a poluării cu mercur a
mediului (Lavoie și colab., 2013).

10
Bioremedierea reprezintă o soluție promițătoare ce susține redobândirea unui echilibru
ecologic și diminuarea consecințelo r poluării sporite. Cu ajutorul în țelegerii mecanismelor genetice
ce stau în spatele speciilor spontane care au achiziționat o anumită strategie pentru toleranța lor în
zonele contaminate și cu ajutorul ingineriei genetice, astăzi se pot realiza specii tra nsgenice ce pot
aduce un aport semnificativ în reducerea poluării și detoxifierea solurilor și a apelor. Atenția
cercetătorilor asupra acestei problematici constă în identificarea, iar apoi adăugarea unor specii
bacteriene rezistente neinvazive în siturile contaminate de sol și ape cu scopul detoxifierii factorilor
nocivi și redobândirea proprietăților unui habitat viabil. O altă strategie pe lângă utilizarea
microorganismelor este aceea de utilizare a plantelor transgenice ce prezintă în genomul lor, genel e
implicate în răspunsuri de rezistență întâlnite la microorganismele tolerante. În condiții de laborator
se folosesc numeroase metode prin care să rezulte plante transgenice cu diferite strategii de rezistență
la soluri contaminate cu metale grele. Purifi carea genelor microorganismelor rezistente, integrarea
lor într -un vector plasmidial sau viral iar apoi inserția lor în nucleul zigotului sau embrionului
timpuriu a plantelor reprezintă o tehnică principală prin care o plantă poate să dobândească artificia l
rezistență. Iar genele utilizate din microorganisme oferă plantei mai multe tipuri de mecanisme fie
prin adiția unor noi transportori proteici care pot expulza factorii nocivi înafara plantei sau prin
construcția unor bariere care să oprească pătrunderea metalelor în organele plantelor, sau prin
dobândirea unor pachete enzimatice care pot detoxifia factorii nocivi din mediu, eliberând factori
inofensivi. Încă din finalul anilor 1990 s -au încercat obținerea plantelor transgenice cu toleranță la
anumite con centrați de mercur folosind plante model, de exemplu Arabidopsis thaliana , și incluzând
genele preluate din bacteriile rezistente la mercur ce exprimau merA iar rezultatele au fost
satisfăcătoare (Rugh și colab., 1996).
O altă strategie este utilizarea bacteriilor anaerobe sulf -oxidante, de exemplu Clostridium sp.
care prin reacțiile de oxido -reducere a sulfului pentru obținerea de energie, prezintă etape de
precipitare a metalelor din mediu înconjurător. Prin obținerea de H 2S ca produs final din ciclul
metabolic al bacteriilor anaerobe sulf -oxidante, aceasta se leagă de mercurul din sol sau ape,
imobilizând -ul datorită afinității mari a mercurului pentru sulf (Das și colab., 2016).
Tot din clasa strategiilor de imobilizare a mercurului fac parte și proteinele din familia
metalotioneinelor care sunt bogate în resturi de cisteină și prezintă o greutate moleculară foarte mică.
Prezente nu numai la bacterii ci și la fungi, plante și animale, metalotioneinele prezintă numeroase
roluri în controlul concentrațiilor de metale grele citosolice dar și în controlul stresului oxidativ, mai
mult s -au observat legături între metalotioneine și apariția cancerului sau autismului (Wong și colab.,
2017). De asemenea, utilizarea polifosfaților, p olimeri ortofosfați încărcați negativ, produși de către
polifosfat kinază, pot lega ionii de mercur transformându -i în factori inofensivi iar în bacteriile

11
transgenice s -au observat o performanță de rezistență a până 16 μM mercur în soluție (Das și colab.,
2016).
Studierea speciilor și mecanismelor ce conferă rezistență prin ecologie moleculară,
proteomică, genomică, inginerie genetică împing bioremedirea spre noi frontiere atrăgând cât mai
mulți simpatizați din lumea științifică care contribuie la transfor marea Pământului într -un loc mai
curat și mai sănătos.

2.3 Mecanisme de rezistență și la alte metale grele din sol

Înafară de contaminarea cu mercur discutată anterior, bacteriile posedă pachete genetice de
răspuns la acțiunea unei game largi de contaminanți din speța metalelor grele cum ar fi rezistență la
acțiunea cationilor cromul (Cr), plumbul (Pb), arsenic (As), z incul (Zn), cadmiul (Cd), cuprul (Cu),
nichelul (Ni), manganul (Mn) din solul contaminat. Pentru fiecare metal există un alt tip de
mecanism dar toate acestea urmăresc un scop comun acela de precipitare a metalelor și acumularea
sau expulzia lor în afarea celulei (Figura 4)

Figura 4 . Prezentarea generală a mecanismelor ce conferă rezistența la acțiunea metalelor
grele din solurile contaminate (preluat și modificat din Das și colab, 2016)

12

● Genele pentru rezistența la cupru sunt CusF, cu rol în reținerea cuprului în celulă iar
gena CueO codifică o proteină detoxificatore ce va oxida Cu+1 la Cu+2, mai puțin toxic
(Das și colab, 2016).
● Genele pentru rezistența la cadmiu CadB și CadD care codifi că o proteine cu rol în
sechestrarea cadmiului pătruns în celule, proces ajutat și de metalotionine (Das și
colab, 2016).
● Rezistența la nichel este realizată de proteine intermembranare care vor expulza
cationii de nichel în mediu extracelular (Das și cola b, 2016).
● Iar rezistența pentru plumb este dată de gene PbrD care codifică o proteină cu rol în
sechestrarea plumbului intracelulară reducandu -i toxicitatea(Wong și colab, 2016 )

3. Interacțiuni între bacterii și plante la nivelul rizosferei în cazul solur ilor contaminate
cu Hg

Relația dintre microorganisme și plante este una de simbioză prin care atât plantele cât si
bacteriile din sol beneficiază de “serviciile” oferite de către celălalt partener. Conviețuirea și
simbioza dintre plante și bacterii oferă posibilitatea de supraviețuire mult mai mare și șansa de
dezvoltare mult mai bună. Dar mecanismele de funcționare sunt independente, rolul bacteriilor din
rizosferă este specific și nu poate să fie întâlnit un astfel de mecanism și la plante, iar plantele posedă
capacități metabolice mult mai avansate în obținerea compușilor necesari supraviețuirii. Însă
majoritatea bacteriilor sunt mult mai independente decât plantele, există plante care nu pot
supraviețui sau nu au productivitate sporită dacă nu prezintă simbioze cu rizobacterii (Bizily și colab,
1999). Bacteriile prin metabolismul lor, formează atât un circuit de azot sau de carbon între mediu
extracelular și intracelular cât și au capacitatea de a mineraliza unii nutrienți menținând solul fertil,
pot ind uce secreția unor fitohormoni și protejează planta de un anumit patogen bacterian direct prin
competiție interbacteriană sau indirect prin inducerea unui răspuns imun adaptativ la plantă
simbiontă, prin inducerea sintezei de citokine sau gibellerine (Khan, 2005). Din această cauză
întâlnim la numeroase plante, structuri în rădăcini sau tulpini subterane adaptate pentru sechestrarea
bacteriilor benefice în dezvoltarea lor, de exemplu prezența nodozităților în rădăcinile plantelor
leguminoase. În zonele de sa vană, bacteriile fixatoare de azot rețin azotul în procente de 8 -20% iar în
zonele temperate pot reține până la 80% azotul atmosferic ( Heijden și colab., 2008).
În ceea ce privește contaminarea cu mercur a solurilor, sistemul simbiont rizobacterii și
plante pot juca un rol imens în detoxifierea siturilor contaminate, proces ce se numește fitoremediere.

13
Principalul mecanism constă în capacitatea bacteriilor de a reduce cati onii metalici în ioni
mai inofensivi, de exemplu Fe+3 la Fe+2, Mn+6 la Mn+ sau Hg+2 la Hg0 sau prin procese cuplate de
reducere a PH -ului solului, formarea biosulfactanților, a acizilor organici și de cărăuși pentru fier
numiți siderofori. Ace ști compuși f ormează un complex care ajută în procesele de chelatare a
metalelor grele din mediu și transformarea lor în forme solubile care pot să fie acumulate ulterior de
plantă. Aceste bacterii fac parte din grupul de rizobacterii care poartă denumirea de bacterii care
promovează creșterea plantei (în engleză: P lant Growth Promoting Bacteria). Cuplajul dintre
bacteriile capabile de detoxifierea solului și plantele care pot acumula o concentrație mare de metal
solubilizat, a condus la o nouă metodă de remediere a sol ului, numită fitoremediere (Ullah și colab.,
2015).
4. Determinați moleculari ai rezistenței la Hg la bacterii izolate din soluri cotaminate

4.1 Argument și obiective
Scopul lucrării este identificarea determinanților moleculari care conferă rezistență bacteriilor
în soluri contaminate cu mercu r.
Obiectivel e lucrării constau în prelevarea și izolarea bacteriilor din solul contaminat cu
mercur, identificarea speciilor tolerante prin testarea viabilității lor pe medii selective, identificarea
filogenetică a speciilor tolerante folosind markerul molecular ARNr 16S și evidențierea genelor
pentru rezistență.

4.2 Materiale și metode

4.2.1 Izolarea tulpinilor bacteriene

Studiile de microbiologie încep printr -o primă etapă de izolare a comunităților bacteriene
întâlnite în diverse probe, fie de sol, apă, aer etc. Această etapă presupune utilizarea unor medii
nutritive care să corespundă necesităților metabolice și nutritiv e ale diferitelor tipuri de bacterii. Cel
mai adesea, se folosește mediu nutritiv agarzat, întrucât permite o creștere neselectivă a bacteriilor.
Probele de sol se prelucrează, cel mai frecvent, prin realizarea unor diluții seriale succesive.
Inocularea di luțiilor seriale succesive se realizează în cutii Petri, pe mediu solid. Ulterior, se lasă la
incubat plăcile Petri timp de 24h în condiții clar definite (temperatură, umiditate, pH etc) pentru a
permite creșterea și multiplicarea bacteriilor. În urma inoc ulării pe mediu solid se obțin colonii pure,
care pot fi folosite în etapele următoare.
În această etapă, e foarte importantă menținerea unei zone sterile întrucât se doresc a fi
evitate contaminări care pot da rezultate negative. În acest caz, se lucrea ză atât la nișa sterilă sub flux

14
de aer continuu, cât și cu materiale sterilizate în prealabil (mediu de creștere, eprubete, etc). De
asemenea, ansa cu care se inoculează trebuie sterilizată la flacără după fiecare utilizare.

4.2.2 Testarea izolatelor pe medii selective

Utilizarea unor medii selective presupune introducerea în mediul de creștere a unor substanțe
de selecție. Această metodă este utilizată pentru a permite creșterea și multiplicarea numai anumitor
bacterii, bacterii care conți n anumite proprietăți de interes în studii. În această etapă, de regulă, se
reinoculează culturi pure bacteriene pe medii selective pentru a selecta numai acele izolate care
prezintă un anumit fenotip. Din acest fapt reiese că bacteria posedă în materialu l său genetic un
determinant molecular responsabil de acel fenotip. Așadar, această metodă este indispensabilă când
se dorește investigarea unor microorganisme cu proprietăți de bioremediere.
Fiind o metodă care face parte din sfera analizelor de microbio logie, este necesară menținerea
sterilității zonei și a ustensilelor cu care se lucrează. Creșterea bacteriilor pe mediu selectiv, de
regulă, necesită un timp mai îndelungat (până la 5 zile), pentru a se observa și înregistra întreg
procesul de selecție și creștere. Parametrii necesari creșterii se mențin și în acest caz (temperatură,
umiditate, pH etc).

4.2.3 Reacția în lanț a polimerazei

Reacția în lanț a polimerazei (PCR) este o tehnică re lativ rapidă și e xtrem de precisă care
permite amplificarea unor fragmente dorite de acid dezoxiribonucleic (ADN). Această tehnică constă
în trei etape: i) denaturarea, ii) alinierea și iii) elongarea, repetate într -un mod ciclic și nu reprezintă
altceva decât mimarea control ată a replicării ADN -ului in tube. În pr ima etapă a PCR -ului, reacția este
expusă la temperaturi de până la 9 4-96℃. Temperatura ridicată ajută la separarea celor două catene ale
matriței ADN prin ruperea legăturilor de hidrogen, care țin împreună cele două catene. Această
topire a duplexului ADN se numește denaturare. A doua etapă a PCR -ului se numește aliniere sau
hibridizare și necesită secvențe scurte de ADN cu o singură catenă numite amorse (”primers”) .
Reacția utilizează do uă amorse , câte una complementară la fiecare catenă a duplexului ADN

15
original. Amorsele se leagă la secvențele lor complementare pe ADN -ul matriță și asigură gruparea
3'OH (hidroxil) liberă, de care ADN -Polimeraza are nevoie pentru a copia molecula de ADN. Acest
lucru stabilește trecerea pentru ultima etapă a PCR -ului, exte nsia sau elongarea. În timpul extensiei,
ADN polimeraza utilizează dezoxiribonucleotide (dNTP) pentru a construi catena complementară pe
ADN -ul matriță. Setul anterior a celor trei procese (care formează un ciclu) se repetă în mod tipic de
mai multe ori, a proximativ 20 până 35 de cicluri, pentru a permite o creștere exponențială a copiilor
genei țintă. O reacție PCR necesită următoarele: matrița ADN sau gena țintă, primeri, dNTP, ADN
polimeraza și tamponul Tris (pH 8,0). De asemenea, o reacție PCR necesită MgCl 2 (clorură de
magneziu), care este un cofactor pentru ADN polimeraza. ADN polimeraza utilizată în PCR este
unică prin faptul că poate rezista temperaturilor ridicate, cum ar fi cele utilizate pentru topirea ADN –
ului în timpul etapei de denaturare.

4.2.4 Electroforeza

Electroforeza reprezintă tehnica de laborator prin care moleculele migrează și se separă în
câmp electric într -un gel poros în funcție de greutatea lor moleculară și de sarcina lor electrică.
Întruc ât, molecula de ADN prezintă încărcăt ură negativă datorită grupărilor fosfat din structura
acesteia,migrarea moleculelor în câmp electric are loc de la polul negativ (catod) spre polul pozitiv
(anod). Datorită dimensiunii moleculelor de ADN, acestea se vor separa. Moleculele mai mici vor
migr a deci mai rapid prin gelul de agaroză. În gelul de agaroză, de regulă se adaugă un compus
fluorescent care să permită și vizualizarea probelor ADN în timpul migrării acestora și ulterior,
pentru fotografiere. În acest sens, există câțiva astfel de compu și: bromura de etidiu , un mutagen
puternic, sau alternativele mai puțin toxice (RedSafe, Midori Green) utilizați în mod obișnuit în
gelurile de electroforeză. Acești co mpuși se intercalează între catenele de ADN permițând
vizualizarea lor în gelul de agaro ză. Gelurile se introdu c într-o cuvă care conține soluție tampon și,
în general, se aplică o tensiune de 100 mV iar . După migrare, gelul se introduce într -o cameră
protejată și sub acțiunea razelor UV se pot observa benzile de ADN și se pot fotografia. P entru
determinarea lungimii genelor este folosit un marker molecular care conține ADN de diferite lungimi
cunoscute și astfel se poate stabili o scară de măsură.

4.2.5 Purificarea produșilor de PCR

Purificarea produșilor de PCR este o etapă care precede reacția de PC R. În această etapă se
urmărește izolarea fragmentelor amplificate anterior. De regulă, în mixul de reacție, încă există
nucleotide neatașate și amorse, reactivi care pot fi acționa ca și contaminanți în experimentele

16
următoare. Așadar, scopul unei etape de purificare este de a scăpa de acești reactivi și de a izola o
cantitate cât mai mare de ADN. După etapa de purificare, se cuantifică cantitativ și caltitativ
fragmentele de ADN.
Pentru aceasta, se verifică puritatea ș i concentrația moleculelor de ADN prin tehnic a
specifică de spectrofotometrie, NanoDrop. Această metodă este extrem de precisă și rapidă întrucât
necesită utilizarea unui singur microlitru de probă. Concentrația va fi așadar, exprimată în ng/µl.
Puritatea moleculei de ADN va fi indicată de cele două rapoarte: 260/280, respectiv 260/230. Cel
dintâi indică prezența unor proteine în probă, iar raportul 260/230 indică prezența etanolului, unor
fenoli etc. O concentrație considerată satisfăcătoare trece peste 50 ng/µl, iar rapoartele 260/280 și
260/230 trebuie să se încadreze în intervalul 1.90 -2.00.

4.2.6 Secvențializare și analiza bioinformatică

Secvențializarea este o tehnică extrem de utilă deoarece redă secvența n ucleotidică a
fragmentului de interes. Tehnica de secvențializare cel mai utilizată pentru determinarea unor
secvențe relativ mici (până la 1000 perechi de baze) este cea chimică, de sinteză, secvențializarea de
tip Sanger.
În urma secvențializării, rezul tatele obținute trebuie prelucrate și interpretate. Printre
rezultatele așteptate regăsim o cromatogramă (Figura 5) și secvența nucleotidică. În primul rând,
acestea trebuie verificate pentru a nu conține urme de contaminanți. Apoi, interpretarea rezultate lor
se face utilizând funcția BLAST (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) pentru a identifica
secvențele nucleotidice pe baza similarităților cu secvențe din baze de date internaționale. Ultima
etapă presupune alinierea secvențelor de interes cu secve nțele similare și identificarea acestora.
Figura 5. O parte din cromatogramă în urma reacției de secvențializare

17

4.3 Rezultate și discuții

4.3.1 Identificarea moleculară a speciilor de bacterii

Coloniile bacteriene izolate și stocate la -80℃ sunt inoculate pe mediu Nutrient Agar
(ForMedium,UK), preparat conform rețetei, sterilizat prin autoclavare la 121℃ și turnat în cutii
Petri supuse ulterior sterilizării prin UV. Fiecare placă este împărărțită egal pentru delimitarea
spațiului între coloniile bacteriene de pe aceeași placă. Se mai notează codul de indentificare a
tubului care conține izolatul, data și tipul de mediu.
Coloniile bacteriene înghețate în mediu lichid cu glicerol sunt t recute în plăci folosind varfuri
serile, sub nișă . Cutiile Petri inoculate sunt incubate la 37℃ în etuvă timp de o zi .

Figura 6. Colonii bacteriene pure izolate pe mediu Nutrient Agar

După incubarea cutiilor Petri timp de 24 de ore la 37℃, sunt prelevate o parte din coloniile
bacteriene crescute de pe mediu nutritiv și inoculate pe medii selective care conțin Nutrient Agar și
concentrații de mercur de 0,075mM. Timp de 5 zile se urmăreș te evoluția dezvoltării lor și ulterior,
în cazul în care prezintă o creștere semnificativă pe suprafața mediului, sunt prelevate și
resuspendate în tuburi Eppendorf de 1,5ml care conține apă distilată sterilă.
Coloniile bacteriene pure morfologic urmează să fie inoculate în nișă în apropierea unui bec
de gaz pe mediu selectiv care prezintă mediu nutrient agar și concentrație cunoscută de mercur
solubilizat în mediu și se etalează uniform. Pe lângă cutiile Petri care conțin mediu cu metal, se

18
inoculează pen tru fiecare izolat și cutii Petri care nu conțin metal în mediu, servind drept control
negativ. Următoarea etapă este reprezentată de incubarea cutiilor Petri, la 25℃ timp de 5 zile. Se
verifică creșterea și dezvoltarea bacteriilor în ziua 2 și respectiv î n ziua 5. Cuantificarea creșterii
bacteriilor pe mediu cu metal este realizată printr -un sistem de asociere față de controlul negativ care
este și etalon de creștere, astfel coloniile bacteriene care nu au crescut pe mediu cu metal vor primi
calificativul minus ( -), iar cele care prezintă creștere vor primi între unul sau 3 calificative plus (+),
în funcție de gradul de creștere față de etalon.

Figura 7. Fenotiparea coloniilor bacteriene pe mediu control Nutrient Agar și pe mediu
Nutrient Agar cu concentrație de mercur de 0,075 mM.

Prin observarea și compararea suprafețelor ocupate de către coloniile bacteriene după 5 zile
de incubare la 25℃ se pot disti nge coloniile care prezintă rezistență la concentrația de mercur din
mediu. Pe suprafața cutiilor Petri care servesc drept control negativ,se remarcă coloniile bacteriene
care au cresuct și astfel se poate stabili prin compararea vizuală cu probele din pl acile cu mercur
existența coloniilor rezistente. Dacă există asemănare între gradul de creștere pe controlul negativ A
și pe placa cu mercur B pentru aceeași probă, atunci ea este notată ca find colonie bacteriană cu
rezistență, iar în cazul în care crește rea este limitată sau a fost inhibată total, coloniile bacteriene
respective nu prezintă rezistență la mercur. În figura 7 este evidențiată comparația dintre plăcile cu

19
nutriet agar ( A ), unde probele a,b,c,d,e, au crescut și plăcile cu nutrient agar ș i mercur ( B ), unde
se consideră doar probele h,i,j ca find rezistente deoarece există asemănare între ele și c,d,e. Probele
f și g le este inhibată creșterea, deci nu prezintă rezistență.
Din totalitatea probelor fenotipate, un număr impresionant au prez entat rezistențe la medii cu
contaminate cu diferinte concentrații de metale grele.
Dintre care majoritatea au prezentat de asemenea și rezistență la mediile selective cu mercur
de 0,075 mM.

Figura 8. Numărul probelor care prezintă rezistență la merc ur din
totalitatea probelor cu rezistență la metale grele.

Gena de pe ARN -ul ribosomal 16S este o genă ce prezintă atât regiuni variate cât și
regiuni conservate. Odată cunoscută secvența fiecarei probe, aceasta poate sa fie comparată cu bazele
de date unde sunt înregistrate secvențele speciilor cunoscute și astfel se pot indetifica speciile
bacteriene necunoscute (Weisburg și colab., 1991). Analiza PCR s -a realizat cu setul de amorse 27F
și 1492R ( și 27F ),
care amplifica o structură de 1496 pb. (Hongoh și colab. 2013). În tabelul 2 este prezentată
cantitatea necesară pentru obținerea produsului PCR pentru o singură probă. Cantitatea de amorse
este distribuită la fel indiferent de tipul de amorsă prezentat. Pe lâ ngă tuburile PCR cu probe, mai
este adăugat un tub care conține toți reactanții mai puțin probele (matrița), aceasta find controlul
negativ ( -H2O) ce verifică existența unei posibile contaminări. Aparatul utilizat este un therocycler
Eppendorf MasterCycle r, care prezintă 96 de godeuri pentru tuburile de PCR. Timpul estimat
pentru decurgerea reacției este 3 ore.

20

Nr.
probe H2O
ultrapur
ă MasterMi
x
(2x) Amorsa
Forward Amorsa
Reverse Matrița/
proba Volum
final
1x 16,7 μl 25 μl 2,4 μl 2,4 μl 3,5 μl 50 μl

Tabel 2. Cantitațile necesare de reactivi pentru realizarea unei reacții PCR
Etape Denaturar
e inițială Denaturar
e
(35x) Aliniere
(35x) Elongare
(35x) Elongare
finală Păstrare
Temperatură 94-95 ℃ 94 ℃ 54-56 ℃ 72 ℃ 72 ℃ 15 ℃
Timp 10-12
minute 40 secunde 40 secunde 1 minut
10-12
minute ∞
Tabel 3. Condițiile PCR ARNr 16S

Amorsele 27F 1492R
Secvențele 5'AGAGTTTGATCMTGGCT
CAG 3’ 5'TACGGYTACCTTGTTA
CGACTT 3’
Tabel 4. Secvențele amorselor 27F și 1492R pentru PCR ARNr16S

21
Figura 9. Migrare genei A6SRNr1 în gel de agaroză 1%. Lungimea așteptată 1250pb

Figurai 1. Migrare genei A6SRNr1 în gel de agaroză 1%. Lungimea așteptată 1250pb
Produsul PCR ARNr 16S obținut a fost migrat în câmp electric de 100mV în gel de agaroză
1% . Primul godeu a fost eliberat markerul de lungime în care există fragmende de ADN de lungie
cunoscută și care oferă scala de măsură pentru lugimile probeor. Ampliconii ARNr 16S migrează
între lungimil e de 1000pb și 1500pb, lungimea așteptată find de 1400 pb. În fiecare godeu a fost
expulzat o cantitate de produs PCR și existența benzilor evidente la lungimea așteptată confirmă că
ampliconul aparține genei ARNr 16S. În ultimul godeu, care reprezintă con trolul negativ nu există
bandă ceea ce admite că nu există contaminare cu alte gene ce ar putea interfera cu replicarea genei
de interes. Însă nu toate probele au prezentat bandă, figura 6, proba T5_4b și figura 7, III29, ceea
ce ar putea să însemne ca int egritatea genei a fost compromisă.
Toate probele care au fost pozitive pentru ARNr 16S, se vor purifica pentru a obține doar
fragmentele de ADN de inters. Purificarea produșilor de PCR este realizată prin utilizarea unui kit
GeneJet (ThermoScintific #K0702 ) care prezintă reactanții necesari și tuburi speciale formate din
tuburi colectoare și coloane cu filtru în care sunt reținuți ampliconii și eliminte dNTP -urile,
proteinele și ceilalți reactanți.. În tuburile de PCR se adaugă apa ultra pură pentru a se atinge
volumul necesar enunțat în protocol, ulterior se trece produsul în coloane, se folosește un tampon
de legare (Binding Buffer) pentru ca ampliconul să nu treacă de filtru, se centrfughează și
componentele care au trecut de filtru în tubul colector se aruncă, apoi se spală cu un alt tampon
(Washing Buffer), pentru a elimina resturile proteice și alte fragmente de ADN,se centrifughează și
se aruncă componetele și tubul colector, acesta find înlocuit cu un tub Eppendorf steril. Apoi se

22
folosește un tampo n de eluare (Elution Buffer) care eliberează ampliconul de proteinele de legare
din filtru și acestea trec într -un tubul Eppendorf.
Pentru verificarea purității și concetrației necesare pentru ca ampliconii să fie trimiți la
secvențializat, fiecare probă e ste citită la nanodrop. Nanodrop -ul este un spectofotometru iar citirea
probelor implică utilizarea unei cantități reduse de produs purificat, 1 microlitru și care afișează
precis valorile asociate lungimii de undă specifice proteinelor sau acizilor nuclei ci. Pe lângă
valorile precise oferite, se pot discrimina probele care prezintă contaminare cu proteine prin
utilizarea raportului între lungimine de undă absorbite de amplicon și proteine, 260/280. Un alt
raport, 260/230 indică prezența etanolului, unor fe noli etc. Valoarea raporturilor trebuie să fie între
1,90 și 2.00 ca proba să fie considerată pură și să fie trimisă la secvențializat iar concentrație
considerată necesară pentru ca secvențierea să fie cu succes este mai sus de pragultrece de 50
ng/µl.
Id ng/ul 260/280 260/230
III 28 159.18 1.91 1.65
III27 100.1 1.86 0.8
II33 10.24 1.76 0.37
Tabel 5. Reprezentare a probelor și raportri nanodrop.
Tabelul 5 reprezintă valorile citite la nanodrop și raportul calculat din care rezultă daca există
contaminare fie cu proteine sau alcooli, fenoli etc. Primele două probe prezintă concentrație de
amplicon pur mai mare de 50 ng/ul și indicii rapoartelor sunt aproape de valoarea ideală ( 2 ), în
schimb ultima valoare prezintă concentrație sub limită și nu poate să fie trimisă la secvențializat.
În urma secvențializării se obțin cromatogramele care ne oferă formatul electronic al
ampliconului, acesta poate să fie rulat în BLAST și comparat cu toate amplicoanele aflate în bazele
de date. Dacă similaritatea dintre ampliconul probă și cel cunoscut în bazele de date este de peste
97% atunci se consideră că încadrarea filogenetică este una reușită.

23

.Figura 11. Identificarea filogenetică a coloniilor bacteriene testate.
Din totalitatea produșilor de PCR obținuți s -a constatat indentitatea filogenetică prin rularea
programului BLAST și stabilirea unor valori procentual care atestă incidența speciilor bacteriene
prelevate din situsurile contaminate. Pe primul loc bacteriile din genul Bacillus au cea mai mare
incidență urmate de genul Pseudomonas ș, celălalte având o incidență cu mult mai mică solul
contaminat din care s -au extras.
4.3.2 Identificarea determinanților moleculari care conferă bacteriilor rezistența la Hg

Analiza prin PCR pentru gena merA reprezintă validarea că bacteriile rezistente la mercur posedă
gena merA. Amorsele folosite sunt amorsa forward, mer A2n_F și amorsa reverse, mer A5n_R, care
amplifica o structură de 1250 pb (L ui și colab., 2012), dar amplificarea lor pentru merA este
nespecifică pentru aceste amorse și din aceste motive se apelează la folosirea unei bacterii ce
prezintă în genomul ei gena merA șă care se poate comanda de la furizori. Ac eastă bacterie joacă
rolul de control pozitiv, denumită CH34, denumirea ștințifică find Ralstonia metallidurans . Pe lângă
conrolul pozitiv, este necesar si prezența unui control negativ ( -H2O) care nu prezintă
matriță. Aparatul utilizat este un therocycler Eppendorf MasterCycler, care prezintă 96 de godeuri
pentru tuburile de PCR Timpul estimat pentru decurgerea reacției este 3 ore.

24
Nr.
probe H2O
ultrapur
ă MasterMi
x
(2x) Amorsa
Forward Amorsa
Reverse Matrița/
proba Volum
final
1x 3,8 μl 6 μl 0,6 μl 0, 6 μl 1,5 μl 12 μl
1x 15,8 μl 104,1 μl
2,5 μl 2,5 μl 6,25 μl 50 μl

Tabel 6. Cantitațile necesare de reactanți petru o probă în PCR merA

Etape Denaturare
inițială Denaturare
(35x) Aliniere
(35x) Elongare
(35x) Elongare
finală Păstrare
Temperatură 94-95 ℃ 94 ℃ 54-56 ℃ 72 ℃ 72 ℃ 15 ℃
Timp 12 minute 40 secunde 40 secunde 1 minut 5 minute ∞
Tabel 7. Condiții PCR mer A
Amorsele A2_nF A5_nR
Secvențele 5’CCATCGGCGGCWCYTG
CGTSAA 3’
5’ACCATCGTCAGRTARG
GRAAVA 3’
Tabel 8. Secvențele amorselor PCR merA
Prin efectuarea reacției de PCR pentru evidențierea existenței genei merA care codifică
enzima mercur reductază, responsabilă pentru reducerea cationilor de mercur bivalenți la mercur
elementar. Produsul PCR s -a migrat în camp electric printr -un gel de aga roză 1% la tensiunea de
100mV. Amorsele sunt unele nespecifice pentru această genă, de aceea există și amplificări
nespecifice. Din acest motiv se foloseste o tulpină bacteriană care prezintă merA și ea joacă rolul
de control pozitiv, denumită CH34 sau Ralstonia metallidurans. În primul godeu a fost eliberat
marker -ul ladder, care conține un mix de fragmente de ADN cu lungime cunoscută pentru stabilirea
scalei de lungime. Urmatorul godeu este reprezentat de CH34, care ne confirmă lungimea așteptată
a genelo r. Următoarele godeuri sunt puse probele iar ultimul godeu este controlul negativ care nu
prezintă matriță bacteriană.

25

Figura 12. Migrare genei merA în gel de agaroză 1%. Lungimea așteptată 1250pb

Figura 13. Migrare genei merA în gel de agaroză 1%. Lungimea așteptată 1250pb

În figura 8 se poate observa amplificarea nespecifică a genelor care prezintă benzi evidente,
însă numai benzile mai slabe situate pe aceeiaș dreaptă cu banda celui de al doilea godeu unde se află
ampliconul CH34, reprezintă benzile pentru gena merA. În gelul reprezentat în figura 8 numai patru
probe au exprimat merA utilizând aceste amorse,III32, V32,V31 și II64 iar în figura 9 doar trei probe
s-au amplificat I27,I17,I16. Toate aceste probe au fost probe fenotipat e pe mediu nutrient agar cu

26
mercur și au primit calificativul maxim pe mediu selectiv,,ceea ce înseamă ca există un alt mecanism
care să le confere rezistență sau amorsele folosite nu au fost suficient de specifice pentru realizarea
reacției de PCR.
Ca și în cazul produșilor PCR ARNr16S, probele au fost purificate folosind kit -ul GeneJet și
supuse verificării nanodrop. Valorile care nu prezentau indicii pentru contaminare mult prea extremi
și aveau concentrații de amplicon pur peste limită au fost trimiși l a secvențializat iar utilizând
programele de aliniere pentru cromatogramele primite s -au obținut alinieri pentru verificarea
similarității genelor.

Figura 14. Alinierea genelor mer pentru probele III32 și II64.

Pe baza alinierilor se pot deduce și folosi mai departe informații despre cât de înrudite pot sa
fie probele sau se pot observa mutații în anumite poziții care costituie principiile variabilității. În
poziția 1084 se poate observa o mutație între cele două probe ceea ce poate reprezenta o dif erență
exremă sau un eveliment neobservat .

27

Figura 15. Totalul coloniilor bacteriene cu rezistență la mercur și procentul de
exprimare a genei merA folosind amorsele A2_nF și A5_nR.
Din totalitatea coloniilor bacteriene care prezentau rezistență la mercur, numai 12% au
exprimat merA folosind amorsele A2_nF și A5_nR ceea ce ar însemna că există posibile alte
mecanisme implicate în rezistența pentru mercur a bacteriilor situate în solurile contaminate sau
amorsele nu au fo st suficient de specifice pentru a se realiza reacția PCR pentru toate probele.

5. Concluzii
În concluzie prezența coloniilor bacteriene tolerante în situsurile contaminate a fost
indentificate fenotipic lor pe mediu selectiv cu concetrație cunoscută de mercur. Speciile rezistente
au fost indentificate prin PCR ARNr16S și s -a remarcat existența genei necesare coloniilor
bacteriene pentru a dobândi rezistență în solurile contaminate cu mercur.

28
Bibliografie

1) Branch UC. 2008.The global atmospheric mercury assessment: sources, emissions and transport.
Geneva : UNEP -Chemicals.
2) Bizily S.P, Rugh L.C., Meagher R., 1999 , Phytodetoxification of hazardous organomercurials by
genetically engineered plants, Nature BIOTECHNOLOGY, vol 18.

3) Das S., Dash H.R., Chakraborty J., 2016. Genetic basis and importance of metal resistant genes
in bacteria for bioremediation of contaminated environments with toxicmetal pollutants. Appl
Microbiol Biotechnol,
4) DashHR, Das S. , 2012, Bioremediation of mercury and the importance of bacterial mer genes. Int
Biodet Biodeg 75:207 –213.
5) He Z., Shentu J.,Yang X., Baligar V.C., Zhang T., Stoffella P.J., 2015. Heavy metal
contamination of soils: sources, indicators, and assessment, Journal of Environmental Indicators ,
9:17-18.
6) Heijden M.G.A., Bardget R.D., Straalen N., 2008, The unseen majority: soil microbes as drivers
of plant diversity and productivity in terrestrial ecosystems, Ecology Letters ,11: 296 –310.
7) Hongoh Y., Moriay Y.H., Kudo O.T., 2013, Evaluation of primers and PCR conditions for the
analysis of 16S rRNA genes from a natural environment ,FEMS Microbiology Letters , (221),
299–304.
8) Hintelmann H., 2010, Organomercurials. Their Formation andPathways in the Environment,
Met. Ions Life Sci., 7, 365 –401.
Hobman J.L., 2007, MerR family transcription activators: similar designs,different specificities,
Molecular Microbiology ,63(5), 1275 –1278.
9) Khan Abdul G., 2005, Role of soil microbes in the rhizospheres of plants growing on trace metal
contaminated soils in phytoremediation, Journal of Trace Elements in Medicine and Biology
,(18) 355 –364.
10) Lavoie Raphael A, Jardine T. D., M. M. Chumchal M. M.,Kidd K.A., Campbell L.M.,2013,
Biomagnification of Mercury in Aquatic Food Webs: A Worldwide Meta -Analysis,
Enviormental Science&Tehnlogy .
11) Liu.D, Chen L., Zhang W., 2012 , Characterization of a marine -isolated mercury -resistant
Pseudomonas putida strainSP1 and its potential application in marine mercury reduction, Applied
Microbiology and Biotechnology, 93, 1305 –1314.
12) Mathema B.V., Thakuri B.C., Sillanpaa M., 2011, Bacterial mer operon -mediated detoxification
of mercurial compounds: a short review, Arch Microbiol ,193:837 –844.
13) Morel M.M.F., Krapiel A.M.L., Amyot. M. 1998. The chemical cycl e and bioaccumulation of
mercury. Annu. Rev. Ecol. Syst. , 29:543–66.
14) Nucifora G., Silver S., Misra T.K., 1989, Down regulation of the mercury resistance operon by
the most promoter -distal gene merD, Mol Gen Genet, 220:69 -72.
15) Osborne M.A., Bruce D.K., Strike P., Richie A.D., 1997, Distribution, diversity and evolution of
the bacteria mercury resistance (mer) operon, FEMS Mycrobiology Reviwes 19, 239 -262.
16) Pitts K.E., Summers A.O., 2002, The Roles of Thiols in the Bacterial Orga nomercurial Lyase
(MerB), Biochemistry , 41, 10287 -10296.

29
17) Rugh C.L., Wilde D.H., Stack M.N., Thompson M.D., Summers A.O., Meaghr R.B., 1996,
Mercuric ion reduction and resistance in transgenic Arabidopsis thaliana plants expressing a
modified bacterial mer A gene, Proc. Natl. Acad. Sci. USA Vol. 93, pp. 3182 -3187.
18) Suciu I., Cosma C., Todică M., Bolboacă S.D., Jäntschi L., 2008. Analysis of Soil Heavy Metal
Pollution and Pattern in Central Transylvania, International Journal of Molecular Sciences 9,
434-453.
19) Schuster E. 1991. The behaviour of mercury in the soil with special emphasis on complexation
and adsorption processes a review of the literature. Water Air Soil Pollut ;56(1):667 –8.
20) Singh R., Gautam N., Mishra A., Gupta. R. 2011. Heavy metals and living syst ems: An
overview.
21) Toth G., Hermann T., Da Silva M.R., Montanarella L. 2016. Heavy metals in agricultural soils
the Europen Union with implication for food safty, Environment International 88:299–309
22) Ullah A., Heng S., Munis M.F.H., Fahad S., Yang X., 2015 , Phytoremediation of heavy metals
assisted by plant growth promoting (PGP) bacteria: A review, Environmental and Experimental
Botany 117 ,28 –40.
23) Wuana. R., Okieimen F.E. 2011. Heavy Metals in contaminated coils: A review of sources,
chemistry, risks and b est available strategies for remediation, International Scholarly Research
Network Ecology , 1-20.
24) Weis J.S., Weis P., 2004, Metal uptake, transport and release by wetland plants: implications for
phytoremediation and restoration, Environment International 30 , 685 – 700.
25) Weiseburg W.G., Brans S.M., Pelletir D.A., Lane D.J.,1991,16S Ribosomal DNA Amplification
for Phylogenetic Study, American Society for Microbiology, Vol. 173, No.2, 697 -703.
26) Wilson J.R., Leang C., Morby A.P, Hobman J.L., Brown L.N., 2000, Me rF is a mercury transport
protein: diferent structures but a common mechanism for mercuric ion transporters? FEBS
Letters 472 , 78 -82.
27) Wong L.D., Merrifield -MacRae M.E., Stillman M.J., 2017, Lead(II) Binding in Metallothioneins,
Metal Ions in Life Science s, Volume 17, 242 -266.
28) Xu J., Bravo A.G. , Lagerkvist A., Bertilsson B., Sjöblom R. , Kumpiene J., 2015, Sources and
remediation techniques for mercury contaminated soil . Environment International 74, 42–53.