Șef lucrări dr. ing. Ecaterina Lengyel Grigore Floriana-Claudia [305929]

UNIVERSITATEA „LUCIAN BLAGA” DIN SIBIU

FACULTATEA DE ȘTIINȚE

SPECIALIZAREA BIOLOGIE APLICATĂ

LUCRARE DE DISERTAȚIE

Coordonator științific: „„ Masterand: [anonimizat] „„„„ [anonimizat]

2017

UNIVERSITATEA „LUCIAN BLAGA” DIN SIBIU

FACULTATEA DE ȘTIINȚE

SPECIALIZAREA BIOLOGIE APLICATĂ

Monitorizarea acțiunii antibacteriene a unor tulpini lactice asupra germenilor nosocomiali

Coordonator științific: „„„„„„ „„ „„„ Masterand: [anonimizat] „ [anonimizat]

2017

Introducere

„Bolile, [anonimizat].” Claude Bernard.

[anonimizat]å decât mințile pregătite” L. Pasteur

Sute de milioane de oameni din intreaga lume dezvolta in fiecare an infectii de tip nosocomial cauzate de germeni rezistenti la substante antimicrobiene. Cel mai frecvent mod de transmitere a infectiilor nosocomiale este reprezentat de personalul medical (mainile). Statistic, din 100 [anonimizat] 7 din acestia vor dobandi o [anonimizat]/slab dezvoltate aproximativ 10 pacienti. In departamentele de Terapie intensive numarul creste până la 30 de pacienti.

Rezistența infecțiilor bacteriene este sporită de celulele fagocitare și de un sistem imunitar intact. [anonimizat]. [anonimizat]. Gradul de infecțiozitate bacteriena duce la o perturbare a echilibrului dintre virulenta bacteriană și rezistența gazdei. "Obiectivul" bacteriilor este de a [anonimizat] a provoca boli; este în interesul acestora să nu ucidă gazda.

Numeroasele atribute fizice și chimice ale organismului gazdă protejează în mod natural împotriva infecției bacteriene. Apărarea include factorii antibacterieni din secrețiile care acoperă suprafețele mucoase și rata rapidă de înlocuire a pielii și a celulelor epiteliale ale mucoasei. [anonimizat]. [anonimizat], [anonimizat], în care participă multe celule limfatice. Virulența bacteriană poate fi dată de anumiți factori: plasmidă, transpozom, [anonimizat], [anonimizat].

Scopul și obiectivele lucrării de disertație

Scopul lucrarii de disertatie este de a monitoriza acțiunea antibacteriana a [anonimizat] D, [anonimizat], E.coli.

CAPITOLUL 1

[anonimizat] (Eubacteria). Acestea au fost introduse anterior în regnul Monera alcatuit din două încrengaturi: Cyanophyta (algele albastre-verzi) și Bacteriophyta (Schizophyta). Bacteriophytele sunt cele mai vechi forme de viața de pe Terra, având o largă răspandire (apă, sol, aer, alimente, obiecte dar și organismo). De studiul bacteriilor se ocupă știința denumită bacteriologie (microbiologie).

Caracteristicile celulei bacteriene

1.1.1 Forma celulei bacteriene

Un criteriu foarte important în clasificarea și identificarea celulelor bacteriene îl reprezintă forma, aceasta variază în funcție de mediul de cultură, vârstă și factorii ereditari.

Formele principale ale celulei bacteriene:

sferică – caracteristică pentru coci, are mai multe varietăți (ovoidală, lanceolată, reniformă, sferică);

spiralat-elicoidală – aspect de virgulă, formă de resort, cu spire neregulate sau regulate sau în forma literei s;

filament – având zeci de microni lungime, fără diviziuni transversale;

cilindrică (alungită) – caracteristică bacililor dar și bacteriilor nesporulente ce pot avea capete rotunjite (Escherichia coli), ascuțite (Fusiobacterium fusiforme), sau drepte (Bacillus antracis).

Pe lângă formele principale există și forme specifice:

filamentoase neramificate

pedunculate

filamentoase pseudoramificate

filamentoase ramificate

1.1.2 Dimensiunile celulei bacteriene

Dacă vom privi în ansamblu, putem observa o largă varietate de dimensiuni, de la câțiva microni până la 10-15 microni. În funcție de dimensiunea celulei bacteriene acestea se împart în:

sub 1µ- mici (streptococcus, stafilococcus)

între 1µ-3µ – mijlocii (salmonele, coli bacillus)

peste 3µ – mari (Clostrydium)

1.1.3 Gruparea celulelor bacteriene

strepto – formațiune rezultată din gruparea în lanț a bacililor și a cocilor (Streptococcus lactis, Streptococcus temaris, Streptococcus citravorus, Streptococcus paracetivorus, Streptococcus pzogenes – patogen, Streptococcus agalactiae); (Figura 1)

Figura 1. Grupare strepto

diplo – apare atât la bacili cât și la coci, formată din două elemente (Diplococcus pneumoniae, Neiseria gonorhoeae);( Figura 2)

Figura 2. Grupare diplo

tetrada- și sarcina – reprezentative pentru coci, alcătuită din 4 și 8 bacterii; înmulțirea într-un singur plan dar două direcții la tetrade, în două planuri la gruparea sarcina (Gafkia tetragena, Sarcina lutea, Sarcina flava);( Figura 3)

Figura 3. Grupare sarcina

stafilo – reprezentativă pentru coci cu formă de grămezi neregulete de ciorchine de strugure (Staphylococccus aureus, Staphylococcus albus, Staphylococcus citrinus); (Figura 4)

Figura 4. Grupare stafilo

în palisadă cu dispunere în paralel.

1.1.4 Celula bacteriană- sctructură

Bacteriile prezintă în marea majoritate un perete celular, ce servește la protecția și menșinerea echilibrului osmotic dintre celulă și mediu exterior. Pe lângă peretele celuler, bacteriile prezintă și membrană citoplasmatică, citoplasma și nucleoidul. Materialul genetic al bacteriilor este reprezentat de un cromozom, pe lângă acesta au în alcătuire și segmente circulare de ADN (plasmide).(Figura 5)

Figura 5. Structura celulei bacteriene

1.2 Fiziologia celulei bacteriene

Diversitatea metabolică a microorganismelor arată capacitatea acestora de aș asigura materiaul mutritiv ncesar din aproximativ orice; de la cele mai simple substanțe chimice până la cele mai complexe substanțe organice. Pornind de la această diversitate metabolică se expică și diversitatea sporită dar și capacitatea de a se adapta fără precedent.

1.2.1 Metabolismul bacterian

Totalitatea transformărilor biochimice enzimatice implicate în activitatea biologică, prin care sunstanțele nutritive din mediul exterior sunt transformate în constituenți proprii, produși de metabolism și energie poarta denumirea de metabolism. Căile metabolice sunt următoarele:

anabilice/asimilare – reacții de sinteză/reacții metabolice endoterme;

catabolice/dezasimilare – degradarea compușilor nutrtivi din mediu și eliberarea energiei în celulă/reacții metabolice exoterme;

anaplerotice/auxiliare – introduc diverși metaboliți în cicluri metabolice esențiale;

amfibolice/donare – reacții metabolice cito-centrale, având funcție de a elibera energie și de a furniza precursori pentru biosinteze.

Caracteristici principale ale metabolismului celulei bacteriene:

flexibilitatea, aceasta permite cresterea adapatbilității în mediul extern;

metabolism reglat genetic, acesta caractzerizează diversitatea mecanismelor enzimatice și a produșilor metabolici;

intensitatea, permite multiplicarea foarte rapidă (20-30 de minute)

eficiența maximă, mecanisme similare sau mai complexe fața de alte organisme superioare

1.2.2 Nutriția celulelor bacteriene

Nutriția reprezintă procesele prin care celulele bacteriene își iau din mediu și utilizează anumite substamțe, cu scopul de a acoperi nevoile plasmatice și energetice. Substanțele nutritive trebuie să conțină următoarele:

Fe, Ca, Mg, P, K, S, N, H, O, C – macrobioelemente;

W, Cu, Co, Se, Cl, Mo, Na, Zn, Mn – microbioelemente.

Etapa de nutriție a celulelor bacteriene corespunde cu faza de anabolism din cadrul metabolismului. Cunoașterea și înțelegerea etapei de nutriție a celulelor bacteriene este foarte importantă pentru reușita în cultivare și prepararea vaccinurilor. Faza de anabolism se realizează prin mecanisme de tip absortbiv. Creșterea, dezvoltarea dar și multiplicarea celulelor bacteriene sunt conditționate de intrarea nutrienților esențiali în învelișurile celulare dar ți eliminarea substanțelor rezultate din catabolism. În funcție de sursele de hrană utilizate bacteriile se împart în:

autotrafe – utilizeaza strict substanțe anorganice; dioxidul de carbon este utilizat pentru carbon, iar sărurile amoniacale, nitrații și nitriții sunt folosiți casursa de azot. Aceste bacterii autotrofe sunt folosite în agricultură ( îmbogățirea solulzui cu azot), sunt lipsite de patogenitate;

heterotrafe – necesită pe lângă substanțele anorganice și substanțe organice. Aici se încadrează bacteriile patogene;

mixotrofe – utilizează substanțe anorganice (dioxidul de carbon) și substanțe organice (carbon). Larga răspândire în natura și lipsa patogenității face ca bacteriili mixotrofe să fie cele mai răspândite organisme din natură.

1.2.3 Respirația celulelor bacteriene

În funcție de condițiile de mediu bacteriile respiră în mod diferit:

bacterii aerobe – folosesc oxigenul atmosferic pentru respirație;

bacterii anaerobe – activitatea lor se desfășoară în lipsa oxigenului.

1.2.4 Dezvoltatrea și reproducerea celulelor bacteriene

Dezvoltarea celulelor bacteriene se datorează constituenților celulari rezultați din procesele de biosinteză, în momentul în care creșterea s-a încheiat începe procesul de diviziune celulară. Modalitățile de multiplicare identificate la bacterii:

Diviziune – divizarea celulei mamă în două celule fiice identice în marea majoritate, se dublează toți constituenții celulari. În următoarea etapă se dublează și se separa materialul genetic nuclear, apariția unui sept transversal care ulterior va separa cele două celule fiice;( Figura 6)

Figura 6. Diviziunea celulelor bacteriene

Înmugurire – se formează pe corpul celulei mamă o protuberanță care va duce la formarea unei singure celule fiice; (Figura 7)

Figura 7. Înmulțirea prin îmnugurire

Fragmentare – dezvoltare hifală în care alungirea se face prin agăugarea de material doar la extremități dar și la locul de origine al ramificațiilor. Fragmentele rezultate sunt de dimensiuni scurte și egale(Actinomycetes);

Corpi elementari sunt structuri corpusculare ce se dezvoltă și se înmulțesc prin diviziune, viteza de multiplicare este foarte mare ( la 20 de minute apare o nouă generație).

CAPITOLUL 2

Bacteriile lactice

Bacteriile lactice sunt bacterii gram-pozitive, coci nesporulenți sau cocobacili ce au în compoziție ADN: 53mol% G+C. În general au bază non respiratorie iar catalaza lipsește. Aceste fermentează glucoza în acid lactic primar, acid lactic sau în CO2și etanol. În laborator aceste sunt crescute anaerob dar se dezvoltă și în prezența O2 fiind “anaerobi aerotoleranți”. Bacteriile lactice folosesc enzimele cu peroxidază pentru detoxifierea radicalilor de peroxid.

Generațiile de bacterii produc acidul lactic ca produs final sau secundar al procesului de fermantație, acestea generează următoarele: Lactobacillus, Leuconostoc, Pediococcus, Lactococcus și Streptococcus, dar și Carnobacterium Enterococcus, Oenococcus, Tetragenococcus, Vagococcus și Weisella.

Obținerea energiei bacteriilor lactice se realizeză prin metabolismul zaharurilor. Preferate sunt mediile bogate în aminoacizi, purine, pirimidine, vitamine. Majoritatea bacteriilor lactice se găsesc libere sau trăiesc ăn asociații inofensive sau benefice cu alte organisme, dar există și agenți patogeni oportuniști. Cel mai adesea se găsesc în lapte, produse lactate, și in procesul de descompunere al materalelor vegetale. Joacă un rol importat în constituirea florei cavității bucale, tractului intestinal, vagin, iar în sănătatea unama joacă rol de beneficiu.

Unele specii de bacterii lactice sunt considerate patogene pentru specia umană; dintre speciile patogene pentru om sunt enumerate următoarele: Streptococcus pneumoniae cauzează pneumonia lobară, meningita și otita medie; Streptococcus pyogenes este o cauză majora a bolilor (pneumonie, infectii piogenice, scarlatină); streptococii orali nonhemolitici joacă un rol important in dezvoltatea cariilor dentare.

Printre cele mai importante grupuri de microorganisme utilizate în fermentațiile alimentare sunt bacteriile lactice, acestea dau textura produselor alimentare fermentate dar au rol și în a inhiba bacteriile dăunătoare cu ajutorul substanțelor inhibitoare. Bacteriile lactice de fermentație au impicare în acțiunea de a face iaurtul, brânza, untul de cultură, smântâna, cârnați, murăturile (castraveti, măsline și varză), unele specii pot să distrugă producțiile de bere, vin și carne prelucrată.

În ceea ce privește laptele există STAS-uri la nivel european din 2010:

ISO 6887-5: 2010 specifică regulile pentru prepararea probelor de lapte și produse lactate și suspensia lor pentru examinarea microbiologică atunci când eșantioanele necesită un preparat diferit față de metodele generale specificate în ISO 6887-1. ISO 6887-1 definește regulile generale pentru prepararea suspensiei inițiale și a diluțiilor zecimale pentru examinarea microbiologică.

ISO 6887-5: 2010 exclude pregătirea eșantioanelor atât pentru metodele de enumerare, cât și pentru cele de detectare, unde detaliile de pregătire sunt specificate în standardele internaționale relevante.

ISO 6887-5: 2010 se aplică: laptelui și produselor lactate lichide; Produse lactate uscate; brânză; Cazeină și cazeinați; unt; inghetata; Cremă, deserturi și smântână dulce; Lapte fermentat și smântână; Și alimentele pentru sugari pe bază de lapte.

2.1 Metabolismul bacteriilor lactice

Cea mai importantă caracteristică a metabolismului bacteriilor lactice este fermentarea carbohidraților eficient cuplați la fosforilările de la nivelul substratului. ATP-ul (adenozin trifosfat) generează rezultatul utilizat ulterior în biosinteză. Bacteriile lactice prezintă o capacitate imensă în a degrada carbohidrați și compușii înrudiți, produsul final rezultat este acidul lactic (<50% carbon zahăr). Bacteriile lactice se adaptează foarte ușor la diferitele condiții de mediu și îți schimbă metabolismul în mod corespunzător. Bacteriile lactice se împart în două categorii metabolice:

Homofermentative – enterococi, lactococci, pediococci, streptococi, tetragenococci și vagococci, pe langă aceștia include și unii lactobacili;

Heterofermentative – leuconostocs, oenococci și speciile Weissella, unii lactobacili.

Diferența între cele două categorii este la nivelul enzimei, prezența sau absența acesteia constiuiie două căi de scindare: calea E-M ( fructoză 1,6-difosfat) sau calea PK (phosphoketolasa).

Fermentarea homolactică

În condiții de oxigen limitat și exces de glucoză se catalizează 1 mol de glucoză pe calea E-M (Embden-Meyerhof) cu scopul de a obține 2 moli de piruvat. Echilibrul intracelular este menținut prin oxidarea de NADH, în acelaș timp se reduce piruvatul la acid lactic. În acest proces rezultă 2 molecule de ATP/glucoza consumată. Pentru acest tip de fermantație sunt reprezentative următoarele specii: Lactobacillus, Lactococcus, Enterococcus, Streptococcus și Pediococcus. Fosforilarea și transportul zaharurilor apar prin transportul glucozei libere iar fosforilarea cu o hexoz-kinază dependentă de ATP sau prin phosphoenolypyruvate (PEP), sistemul de fosfotransferază pentru zahar (PTS), donatorul fosforil este PEP și utilizat pentru absorbția zahărului. Câteva sepcii de bacterii lactice utilizează PTS doar pentru transportul de galactoză; alte specii bacterii lactice PTS pentru toate categoriile de zaharuri.( Figura 8)

Figura 8. Calea fermentatiei homolactice a bacteriei lactice

Fermentația heterolactică

Fermentația heterolactică utilizează pentru disimilarea zaharurilor calea phosphoketolazei (fosfat pentoză). Bacteriile lactice heterofermentative includ: Oenococcus, Weissella, Leuconostoc și anumiți lactobacili. (Figura 9)

Figura 9. Calea fermentatiei heterolactice a bacteriei lactice

Bacteriile lactice prezintă capacitatea limitată de a sintetiza aminoacizii utilizând diferite surse anorganice de azot. Necesitatea animoacizilor este diferita între specii sau chiar între tulpinile din aceeaș specie, unele specii pot necesita între 13-15 aminoacizi în timp ce altele sunt prototrofice.

Cantitățile de aminoacizi liberi nu sunt suficiente pentru a susține o dezvoltare cu densitate mare de cellule, bacteriile lactice necesită un sistem proteolitic ce poate hidroliza cu usurință proteinele și peptidele în obținerea aminoacizilor esențiali. Activitatea proteolitică a bacteriilor lactice contribuie în mod suplimentar la dezvoltatrea texturii și aromei pentru produsele fermentate. În crearea diferitelor soiuri de brânzeturi (cheddar, elvețian) în dorința obținerii asa numitelor “tonuri de aroma” provenite din proteoliză.

2.2 Fermentația alimentelor cu ajutorul bacteriilor lactice

Alimentele utilizate de societatea umană au la baza fermentația lactică , deoarece bacteriile lactice prezintă proprietăți ce beneficiază producția alimentelor sau conversia acestora. Proprietățile organoleptice dar și acide ale alimentelor fermentate, sunt rezultatele activităților metabolice ale bacteriilor lactice. Brânzeturile maturate, varza și murăturile dar și cârnații fermentați prezintă odurată de viață cu mult mai mare față de materiile prime din care provin, în plus aroma și gustul sunt modificat direct sau indirect de către bacteriile lactice.

Misterul produselor lactate fermentate a pus bazele microbiologie, acesta a fost descoperit abia în ultimul secol când au fost descoperite bacteriile lactice responsabile de fermentația lactică. Cu mult înaintea disponibilității culturilor starter, fermentația lactică era bazată în mod natural pe laptele crud. Apariția culturilor starter de tip comercial a fost realizată din amestecuri de microbi necunoscuți din laptele crud (prima data în Danemarca), în anii 1930 și 40 ideea culturilor starter pure provenite dintr-o singură tulpină a evoluat.

Popularitatea crescută de care se bucură produsele lactate fermentate se datorează calității nutritive, stabilității naturale pe care o au alimentele sănătoase.

Principalele organisme implicate în fabricarea brânzeturilor, iaurtului, laptelui bătut dar și pentru brânza de vaci, smântâna sau untul cultivat; responsabile sunt bacteriile lactice. Unele produse lactate fermentate au în alcatuire microfloră secundară (bacterii suplimentare), adăugate pentru producerea de dioxid de carbon, ce modifică textura și influențează aroma produsului finit.

Dintre produsele din carne ce trec prin procese de procesare de timp îndelungat se regăsesc și cârnații. Vechii egipteni au lasat moștenire prin scrierile lor rețeta de conservare a cărnii prin sărare si ulterior uscare la soare. Alte civilizații precum romanii, babilonienii sau grecii foloseau ca provizii pe timp de război cârnații.

Importanța microorganismelor în producția cârnaților a fost recunoscută abia în anul 1921. Între anii 1940 și 1950 au devenit disponibile culturile starter pure, însă s-au utilizat la scară larga la începutul anilor 1980.

Conservarea produselor leguminoase își are originea în Orient acum mai bine de 2000 de ani. În timpul construcției Marelui Zid Chinezesc, în secolul al treilea î.Hr. legumele (ridichi, napi, castraveți, varza) fermentate erau consumate la scară largă de către chinezi. Statele unite se bucură de disponibilitatea celor mai comune legume în stare fermentată: măsline, varză, murături. Ca produs fermentat se mai găsesc și următoarele legume: țelină, ceapă, morcovi, conopidă, okra, ardei.

Bacteriile lactice în general sunt importante pentru societatea umană pentru că ajută la fermentarea produselor alimentare (carne, legume, lapte, băuturi dar și fructe), aceste includ doar anumite specii precum: Lactobacillus genurile, Lactococcus, Streptococcus, Leuconostoc și Pediococcus, dintre acestea unele sunt menmbrii ai florei normale ale mamiferelor (gură, intestin, vagin). (Tabel 1)

Tabel 1. Implicarea bacteriilor lactice în fabricarea produselor lactate fermentate

2.3 Lactobacilii

Eterogenitatea genului Lactobacillus este reprezentată de numărul foarte mare de specii cu o varietate fenotipică ridicată, dar și proprietățile biochimice și fiziologice sunt de asemenea foarte variate.

Majoritatea speciilor de lactobacili sunt homofermentative dar exisă și excepții, acestea sunt heterofermentative. Divizarea genului s-a realizat în trei subgrupe majore cu peste 70 de specii recunoscute. Din primul grup fac parte lactobacili obigatoriu homofermentativi ce au ca produs finit glucoza (>85%), se dezvoltă la 45°C, reprezentatie sunt speciile L. delbrueckii și L. acidophilus. Cea de-a doua grupă prezintă lactobacili ce de dezvoltă la 15°C (creștere variabilă la 45°C), produsul fermentației este mai oxidat (acetat) în cazul în care oxigenul este prezent, reprezentativă este specia: L. plantarum Casei. Cea de-a treia grupa de lactobacili este heterofermentativă, produc din glucoză acid lactic împreună cu etanolul și dioxidul de carbon, dintre speciile reprezentative: L. fermentum, L. brevis și L. keferi. Exemple în utilizarea lactobacililor:

L. delbrueckii ssp bulgaricus – iaurt; (Figura 10)

Figura 10. L. delbrueckii ssp bulgaricus

L. acidophilus – lapte ”acid”; (Figura 11)

Figura 11. L. acidophilus

L. helveticus (Figura 12), L. delbrueckii ssp bulgaricus- brânzeturi (mozzarella, Provolone, Romano, parmezan, brânza elvețiană)

Figura 12. L. helveticus

L. brevis (Figura 13)și L. plantarum-murături

Figura 13. L. brevis

Rezistența în condițiile acide ajută lactobacilii să se dezvolte la valori ale pH-ului de 4, astfel sunt capabili să crească în timpul fermentației naturale și sunt responsabili de etapele terminale ale fermentației acidului lactic.

2.4 Lactococi și Streptococi

Notă privind clasificarea streptococilor. În 1985 genul Streptococcus, datorită divertității a fost reclasificat în funcție de caracteristicile biochimice dar si de analiza ssARN în Lactococcus, Vagococcus, Enterococcus, Streptococcus. Clasificat din punct de vedere istoric, genul Streptococcus poate fi împărțit în grupele serologice în care agenții carbohidrați specifici sunt prezenți. Grupările Lancefield (grupări antigenice) sunt desemnate de litera A, prin intermediul grupurilor O. Streptococul β-hemolitic identificat la om conține gruparea A, streptococi fecali conțin gruparea D, grupa B este reprezentată cu precădere de streptococi prezenți la animale, cauzează mastita la vaci. Streptococii lactici ( streptococi și lactococi) prezintă antigenul N nepatogen, totuși genul Lactococcus este considerat separat de genul Streptococcus. Cu toate acestea speciile Lactococcus lactis și Streptococcus thermophilus sunt considerate ca fiind baza în fabricarea brânzei.

Capitolul 3

Infecția nosocamială

Apariția medicinei, dar mai ales dezvoltarea chirurgiei a favorizat și apariția infecției nosocomiale (de spital). Acest tip de infecție este caracterizată de gradul ridicat de mortalitate favorizat de posibilitățile de tratament dar și de spectrul etiologic.

Infecția de tip nosocomial este infecția cotractată în serviciul de urgență, ambulator,spital de către pacient. Infecțiile ce apar sporadic sau debutreza în spital un sunt considerate ca fiind infecții nosocomiale.

Flora microbiană de spital este alcătuită de bacteriile din apă, aer sau de pe instrumente, tot aici se încadrează și microbiota indigenă a personalului de spial și a pacienților. Particularitatea microbilor este dezvoltarea unei rezistențe sporite la antibiotice datorata contactului frecvent cu substanțe antibacteriene.

3.1 Infecția nosocomială în Romania și Europa

În Romania, antibioticele sunt utilizate în mod eronat la scară largă, acest lucru este demonstrat prin utilizare cu preferință a categoriilor de antibiotice cu spectru larg de acțiune în dezavantajul celor cu spectru îngust. Consumul exagerat de antibiotice plus lacunele programelor de control al infecțiilor se reflectă în nivelul ridicat al rezistenței bacteriilor. Comparativ cu alte țări din Europa, în Romania nivelul de rezistență al bacteriilor este cel mai ridicat.

In Europa, studiul de prevalenta organizat in 2012, la care au participat 30 de tari peste 1000 de unitati spitalicesti, a estimeat ca aproximativ 80.000 pacienti sufera o infectie nosocomiala. Se doreste realizarea unui nou studiu europea de prevalunta in toata Uniunea Europeana inte 2016-2017. Decesele survenite ca o consecinta a infectiei nosocomiale sunt estimate la 37.000 in mod direct, in mod indirect numarul acestora pe durata unui an ajunge la 110.000. Intre 20-30% dinte cazurile de infectie nosocomiala pot fi prevenite.

Frecventa de izolare cea mai mare o au urmatoarele specii: Staphylococcus aureus (12,3%), Enterococcus spp. (9,6%), Klebsiella spp. (8,7%), Candida spp. (6,1%), Clostridium difficile (5,4%), Enterobacter spp. (4,2%), Proteus spp. (3,8%) și Acinetobacter spp. (3,6%), Pseudomonas aeruginosa (8,9%), E.coli (15,9%), stafilococi coagulazo- negativi (7,5%).

Un impact major îl au infecțiile sanguine asupra morbidității și mortalității în societatea umana, încadrându-se între primele șapte cauze de deces în Europa și America de Nord. Patologia nosocomiala din Romania reprezinta o problema importanta pentru Sanatate Publica din cauza subraportarii, compliantei scazute a personalului medical, lipsei acute de peronal dar si din causa reducerii bugetului alocat pentru preventie si control al infectiilor nosocomiale.

3.2 Modul de transmitere

Transmiterea infecțiilor se face cu ajutorul instrumentelor (nesterile, insuficient sterilizate, nedezinfectate). Gravitatea infecțiilor este data de modul în care interacționează cu organizmul gazdă, cele mai grave sun considerate cele din timpul operațiilor, gravitate redusă o au infecțiile ce se produc cu ajutorul instrumentelor (electrozi, termometru, stetoscop) ce intră în contact cu pielea sau mucoasele. O altă modalitate de contractare a unei infecții nosocomiale se poate face prin folosirea în comun a grupurilor sanitare (dezinfectare insuficientă), sau contactul cu mâinile cadrelor medicale.

3.3 Gradul de rezistență al celulelor bacteriene

Antibioticele, antisepticele sau dezinfectantele sunt substanțele ce distrug microbii. Aceste substanțe sunt utilizate în spitale cu scopul de a dezinfecta dar utilizarea frecventă duce la dezvoltarea unor tulpini bacteriene rezistente la condițiile rezultate. Cele mai dăunătoare celule bacteriene sunt cele ce au capacitatea de a se multiplica în frigidere, medii scăzute în nutrienți sau chiar la temperatura camerei, procesul de multiplicare se realizează în prezența substanțelor antiseptice.

Pacienții și personalul spitalicesc prezintă colonii ale tulpinilor periculoase din spital dar infecția nu se manifestă tot timpul, în schimb se transformă într-un rezervor al celulelor bacteriene. Mobilitatea pacienților de la o secție la alta imbogățește fondul bacterian, în acest mod se selectează tulpinile cu rezistență sporită.

In 2014 s-a elaborat la nivel mondial primul raport OMS ce priveste rezistenta la antibiotice denumit „Rezistenta antimicrobiana: raport mondial de supraveghere”, acesta contine toate datele din 114 tari, din toate regiunile. Timpul prelungit de spitalizare determina o rezistenta la antibiotice ce creste riscul de deces al pacientilor dar si costurile ingrijirii sanatatii acestora. La nivel european cresterea rezistentei este intalnita mai ales in sud si sud-estul continentului. Majoritatea tarilor prezinta procente de rezistenta combinata pentru K. pneumonie dar si pentru E. coli, P. aeruginosa . Potentialul de virulență, omniprezența, rezistența intrinsecă si suplimentara dobandita contribuie la situarea acestor specii printre patogenii problema din cadrul spitalelor.

3.4 Etiologia infecțiilor nosocomiale

Rezistența la antibiotice este o problemă globală în ceea ce privește îngrijirea sănătății, din cauza utilizării antibioticelor ca tratament esențial în orice infecție. De la această utilizare frecventă a antibioticelor pornește lipsa eficienței și chiar progresia bolilor. În nenumărate cazuri antibioticele sunt administrate pe bază empirică, în lipsa unei existențe clare a unei infecții bacteriene. Cel mai frecvent sunt prescrise antibioticele din clasa penicilinelor, urmate de cefalosporine, cele cu utilizare minimă sunt metronidazolul și cloranfenicolul.

În producerea infecțiilor nosocomiale sunt implicate bacterii precum: enterococi, stafilococi, pseudomone, coloformi, Clostridium dificile, câteva dintre aceste se găsesc în mod natural în cadrul microbiotei organismului uman, sunt eliminate în mediul înconjurător în mod constant.

Genul Enterococcus a devenit cunoscut prin intermediul a două tulpini: E. faecalis și E. faecium. Aceste două tulpini au o rezistență ridicată la acțiunea antibioticelor uzuale, recent s-a descoperit și rezistența la antibioticele de rezervă. Există semnalări a unor tulpini complet rezistente la orice antibiotic folosit.

Speciile din genul Staphylococcus sunt localizate pe piele, mâini, în nări, viabilitatea în mediul extern în anumite condiții este de până la trei luni. De popularitatea cea mai mare din acest gen se bucură specia Staphylococcus aureus, care, după apariția antibioticelor a provocat cu mult mai puține infecții. După anul 1970 s-au dezvoltat tulpni rezistente iar ăn acest moment este pe cale de a ocupa primul loc în dezvoltarea infecțiilor nosocomiale gram-negative.

Speciile genului Pseudomonas sunt cauza frecventă a infecțiilor instalate după arsuri sau intervenții chirurgicale în majoritatea cazurilor este implicat bacilul piocianic. Aceste specii se dezvoltă în apă, fie și apă distilată, în soluțiile folosite pentru dezinfecție sau soluții medicamentoase. Sunt prezente în disbioze; disbiozele apar după un consum pe durată mare de timp sau un consum „orb” al antibioticelor.

Enterocolitele pseudomembranoase sunt determinate de prezența în colon a speciei Clostridium difficile după consumarea îndelungată a antibioticelor cu spectru larg. Modalitatea prin care C. difficile se transmite fecal-oral, iar în ceea ce privește persoanele vârstnice boala evoluează grav.

Bacterii precum Streptococcus pyogenis sau Microbacterium tuberculosis provoacă de asemenea infecții nosocomiale, frecvența acestora s-a diminuat în țările dezvoltate, însă au apărut viroze nosocomiale al căror tratament este limitat. Situații grave pot apărea în momentul în care pacientul se află sub tratament cu iminosupresoare (SIDA), este învârstă sau nou-născut pentru că antibioticele se dovedesc a fi ineficiente dar și ineficiența sistemului imun contribuie la aceată ineficiență.

Infecțiile nosocomiale își pot face simțită prezența fie la spital sau la domiciliul pacientului, caracteristica principală este ieficiența tratamentelor datorată rezistenței tulpinilor la substanțele antibacteriene. Asocierea acestor infecții grave cu alte afecțiuni precum cancerul sau diabetul este frecvent mortală.

3.5 Tulpini nosocomiale utilizate

1. Salmonella spp.

Speciile genului Salmonella cuprinde celule cu diametru între 0,7 și 1,5 pm, iar lungimea flagelului este între 2 și 5 pm. Bacteriile genului Salmonella sunt chemotrofe, își obțin energia din reacții de oxido-reducere din varii surse organice, pot fi de asemenea facultativ anaerobe.

Este un gen de bacterii Gram-negative din familia Enterobacteriaceae, împărțit în două specii S. enterica si S. bongori.. S. enterica are în alcatuire șase subspecii cu peste 2.500 de serotipuri. S. enterica se găsește la nivel mondial în mediul înconjurător și în animalele cu sânge cald, S. bongori se limitează la reptile. Tulpinile de Salmonella pot provoca boli precum: febra tifoidî și paratifoidî dar și intoxicații alimentare (salmoneloze). (Figura 14)

Figura 14. Salmonella spp.

2. Staphylococcus aureus

Este un coc Gram-pozitiv, necapsulat, aerob care la microscop apare sub forma unor aglomări asemenătoare unui ciorchine, iar cultivat pe agar-agar produce colonii mari, rotunde de culoare galben-aurie.

Staphylococcus aureus este considerat ca fiind unul dintre principalii colonizatori ai organismului uman, in anumite situatii poate deveni patogen cauzand infectii localizate sau sistemice. Evolutia infectiilor cu Staphylococcus aureus poate fi uneori nefavorabila din cauza agresivitatii sporite si a unui mecanism de aparare pe care il are tulpina bacteriana. Patogenitatea ridicată este dată de o serie de factori precum: leucocidina coagulaza, hemolizina, enterotoxine. Datorită heterogenității prezente la nivelul antigenelor de suprafață, stafilococii sunt clasificați în fogotipuri. (Figura 15)

Figura 15. Staphylococcus aureus

3. Streptococcus pyogenes

Streptococcus pyogenes este un patogen uman responsabil pentru o varietate mare de boli comparatic cu oricare alt microorganism. Streptococcus pyogenes face parte din tulpinile din grupa A, subdivizată în funcție de prezența unei proteine de suprafață numită proteină M (datorită aspectului mat al acesteia în formațiuni de colonii) în diferite tipuri antigenice. Ulterior au fost identificate peste 200 de tipuri M. Proteima M este de asemenea un factor de virulență al Streptococcus pyogenes pentru că posedă proprietăți antifagocitare. Bacteriile genului Streptococcus pyogenes sunt responsabile de boli precum faringita, impetigo, celulita, fasciita necrotizantă, scarlatina și sindromul șocului toxic (STSS), dar și sechelele reumatice. Pe lângă acestea pot provoca așa numitele boli secundare sau sechele (febră și glomerulonefrită poststreptococică acută). ( Figura 16)

Figura 16. Streptococcus pyogenes

4. Pseudomonas aeruginosa

Pseudomonas aeruginosa, este bacilul Gram-negativ considerat „nonfermentativ” ubicuitar, este cunoscut ca fiind un agent etiologic al infectiilor nosocomiale prezente la pacienti cu o afectare severa a barierelor de aparare antiinfectioasa dar si la pacienti cu spitalizari cu durata prelungita. Este considerat ca una din cauzele principale de pneumonie nosocomiala (asociata cu ventilatie mecanica), infectii sistemice, infectii urinare nosocomiale, infectii ale partilor moi (arsuri pe suprefete intinse) dar si a bronsitelor cronice sau a otitelor externe.

Infecțiile cu Pseudomonas aeruginosa multirezistentă sunt o importantă cauză de morbiditate dar și mortalitate la pacienți în urma transplantul de celule stem hematopoietice alogene. Mediile umede sunt considerate drept sursă și rezervor de infecție cu acest agent patogen. (Figura 17)

Figura 17. Pseudomonas aeruginosa

5. Escherichia coli

E. coli este un bacil Gram-negativ implicat frecvent in infectiile sistemice. Colonizeaza tractul digestiv inferior iar prezența sa poate fi utilizată ca indicator al contaminării fecale. E. coli se poate răspândi prin intermediul apei și alimentelor contaminate sau prin contactul cu o persoană contaminată. E. coli poate provocă cel mai frecvent gastroenterită, peritonită, infecții ale rănilor, meningite sindrom hemolitic uremic, infecții ale tractului urinar, insuficiență renală.

De asemenea E. coli cauzează frecvent diareea călătorului, ce poate apărea în urma consumului de apă și alimente contaminate. Tratamentul cu antibiotice este aplicat doar în stadii grave ale infecțiilor cu E. coli, dar în general infecțiile cu E.coli sunt auto-limitative și durează doar cîteva zile. (Figura 18).

Figura 18. Escherichia coli

CAPITOLUL 4

Parte experimentala

Medicina contemporana prezinta anumite bariere in tratarea anumitor afectiuni. Una din barierele actuale este antibioticorezintenta dezvoltata in ultimi ani de catre bacteriile capabile de a-si dezvolta rezistenta fata de actiunea agentilor antimicrobieni. Concluzia studiilor este alarmanta, datorita faptului ca mecanismele de rezistenta indica o tendinta de crestere progresiva a rezistentei in sensul augumentarii acesteia.

Antibioticorezistenta constituie o problema importanta pentru medicina umana si veterinara. Literatura de specialitate contine descrise tehnici si metode de evaluare a activitatii antimicrobiene, din pacate nu prezinta sensibilitate constanta si comparabila.

Lipsa unui protocol de standardizare a screening-ului antimicrobian a dus la dezvoltarea numeroaselor variante de tehnici si metode modificare in fucntie de conditiile de lucru. Din aceasta cauza, metoda aleasa influenteaza rezultatele obtinute.

4.1 Materiale si metode

In cadrul acestei lucrari s-a monitorizat actiunea unor bacterii lactice asupra germenilor nosocomiali.

Materialele și aparatura utilizată:

termostat – aparat electric pentru dezvoltarea microbiană

autoclav – realizeaza sterilizarea prin incalzire cu vapori prin presiune pentru: medii de cultura, produse patologice obiecte de cauciuc. Temperatura este de 121oC timp de 20-30 minute

balanta analitica – balanta electronica cu reglare automata functie de temperatura camerei

cutii Petri sterile din material plastic cu diametrul de 90-100 mm

pipete gradate sterile de 1 ml+– 0,02 ml

pipete plastic sterile – pentru fiecare tulpina nosocomială

dischete de hîrtie pentru agentul patogen

Tehnica utilizata este asemanatoare cu tehnica denumită Kirby-Bauer: metoda cu discuri și respectiv, godeuri. Principuil metodei difuzimetrice se bazeaza pe capacitatea diferitelor solutii de a difuza in mediul de cultura pe distante diferite fata de punctul de aplicare.

S-a utilizat ca mediu de cultura M.R.S BROTH (de Man, Rogosa, Sharpe Broth), 10 grame mediu plus 100 ml apa distilată. Mediul de cultura se autoclaveaza la 121°C timp de 30 de minute. (Figura 19)

Figura 19. Mediul de cultura utilizat (M.R.S. Broth)

Tulpinile patogene utilizate pentru lucrarea de disertatie sunt urmatoarele:

Streptococcus pyogenes,

Salmonella spp.,

Staphilococcus aureus,

Pseudomonas aeruginosa

Escherichia coli (E. coli).

In cadrului lucrarii de disertatie s-au utilizat 2 complexe de bacterii lactide liofilizate. Primul complex denumit sugestiv “roz” contine urmatoarele bacterii lactice: (Figura 20)

Lactobacillus acidophilus,

Leuconostoc lactis,

Acitobacter aceti,

Saccharomyces unisporus,

Streptococcus salivarius subsp. thermophilus,

Lactoccus lactis subsp. lactis,

Lactoccus lactis subsp. diacetilactis,

Lactobacillus delbruccki subsp. bulgaricus,

Lactobacillus casei.

Figura 20. Complexul ”roz” utilizat

Al doilea complex notat cu “portocaliu” contine: (Figura 21)

Acetobacter aceti,

Bifidobacterium bifidum,

B. longum,

B. adolescentes,

B. animalis,

Lactobacillus acedophilus,

Lactococcus lactis subsp. cremoris,

Propiani bacterium frudenreichii.

Figura 21. Complexul ”portocaliu” utilizat

Modul de lucru pentru prima faza a lucrarii se refera la pregatirea mediului de cultura îmbogățit cu tulpinile lactice. Mediul de cultura M.R.S. BROTH se separă în două pahare Erlenmeyer, într-unul se pune complexul “roz” iar în celălalt complexul “portocaliu”. Cele doua pahare se incubează la 37°C timp de 24 de ore. (Figura 22)

Figura 22. Materiale utilizate

A doua parte se desfasoara in etuvă, unde se asează toate materialele necesare: bec de gaz, dischetele de hartie, pipetele sterile, pipeta mecanica, paharele Erlenmeyer cu mediul de cultura, cele 5 eprubete cu cele 5 tulpini nosocomiale si 5 cutii Petri in care se va urmari actiunea bacteriilor lactice asupra celor 5 tulpini nosocomiale.( Figura 23)

Figura 23. Complexele lactice și bacteriile nosocomiae utilizate.

În interiorul etuvei, in presenta becului de gaz se pregatesc cele 5 placi Petri, in care se pune prima data din eprubetele ce contin tulpinile nosocomiale, se intind pe placa cu ajutorul pipetelor sterile.

Imaginar se imparte fiecare cutie Petri pe jumatate, in fiecare jumatate se pune o discheta de hartie.(Figura 24)

Figura 24. Dispunerea elementelor în placa Petri înainte de însămânțare

Cu ajutorul pipetei mecanice, in fiecare cutie peste dischete se va pune mediul ce contine tulpinile lactice, 1 ml din complexul “roz” și 1 ml din complexul “portocaliu”. Se incubează timp de 24-48 de ore.( Figura 25)

Figura 25. Plăcile pregătite pentru incubare.

4.2 Rezultate și discuții

În urma incubarii în toate cele 5 plăci s-au dezvoltat agenții patogeni însămânțați. Diferențele între cele 5 plăci constau în modul de dezvoltare al coloniilor,culoarea coloniilor, suprafața de placă pe care se dezvoltă și zona de inhibiție în cazul în care complexele lactice au sau nu actiune înpotriva agenților patogeni. (Figura 26)

Figura 26. Dezvoltarea agenților nosocomiali după incubare.

4.3 Concluzii

Capitolul 5

Concluzii finale și perspective de continuare a cercetărilor

Bibliografie

Analiză de situație – campania anuală mondială „salvează vieți : igiena mâinilor!”, 5 mai 2015

Bytyqi HQ1, Hoxha R1, Bahtiri E1, Krasniqi V1, Krasniqi S1., Antibiotic Utilization in Pediatric Hospitalized Patients – A Single Center Study., Open Access Maced J Med Sci. 2017 Mar 24;5(2):256-260. doi: 10.3889/oamjms.2017.045. eCollection 2017 Apr 15.

Consumul de antibiotice, Rezistența microbiană și Infecții Nosocomiale în România – 2014, Gabriel Adrian Popescu, Roxana Șerban, Adriana Pistol București,2016

Curs : Microbiologie generala – Licenta 2013, Conceptul modern de microorganism

Donnenberg M.S. and Kaper J.B. (1992) Enteropathogenic Escherichia coli. Am Soc Microbiol. 60(10): 3953-3961.

Jerry Chao,ab Gideon M. Wolfaardt,a Michael T. Artsb., Characterization of Pseudomonas aeruginosa fatty acid profiles in biofilms and batch planktonic cultures., 4 December 2010.

Joseph Ferretti, PhD and Werner Köhler, Prof. dr. med. Habil. Dr. rer. Nat. Dr. med. h. c., Streptococcus pyogenes : Basic Biology to Clinical Manifestations., History of Streptococcal Research., February 10, 2016.

Kossow A1, Kampmeier S1, Willems S1, Berdel WE2, Groll AH3, Burckhardt B3, C R3, Groth C2, Idelevich EA4, Kipp F1, Mellmann A1, Stelljes M2., Control of multidrug-resistant Pseudomonas aeruginosa in allogeneic hematopoietic stem cell transplant recipients by a novel bundle including remodeling of sanitary and water supply systems., Clin Infect Dis. 2017 May 18. doi: 10.1093/cid/cix465.

Mellies J.L., Barron A.M.S. and Carmona A.M. (2007) Enteropathogenic and enterohemorrhagic Escherichia coli virulence gene regulation. 75(9): 4199-4210.

Microbiologie, caiet de lucrări practice asist. Univ. Dr. Adriana Tarean, Universitatea de Vest „Vasile Goldis” Facultatea de Medicină, Farmacie și Medicină Dentară

Raquel Astacio Jun 8th 2015, Most Beneficial Bacterial Strains for Your Dog

Salman A1, Sharaha U2, Rodriguez-Diaz E3, Shufan E1, Riesenberg K4, Bigio IJ5, Huleihel M6., Detection of antibiotic resistant Escherichia Coli bacteria using infrared microscopy and advanced multivariate analysis., 2017 May 18. doi: 10.1039/c7an00192d.

Spears K.J., Roe A.J. and Gally D.L. (2006) A comparison of enteropathogenic and enterohaemorrhagic Escherichia coli pathogenesis. FEMS Microbiol Lett. 255(2): 187-202.

http://psihologic.blogspot.ro/2010/12/teoria-bolilor-in-citate.html

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK8526/

http://www.scientia.ro/biologie/corpul-omenesc/3603-infecia-nosocomial-de-spital.html

https://ro.wikipedia.org/wiki/Bacterie

http://textbookofbacteriology.net/lactics.html

https://www.cdc.gov/salmonella/

https://en.wikipedia.org/wiki/Salmonella

http://www.afaceri-agricole.net/2011/07/determinarea-stafilococului-aureus/

https://www.iso.org/standard/50306.html

https://www.cdc.gov/salmonella/general/index.html

http://www.scritub.com/biologie/INTRODUCERE-in-biologia-microo71526.php

Documentaţie BIOLOGIE

Diviziunea celulara

http://genome.jgi.doe.gov/lacbr/lacbr.home.html

http://www.mysticalbiotech.com/portfolio/lactobacillus-helveticus-ls-108-mtcc-5463/