Șef Lucrări Dr. Gabriela POPA [311074]

UNIVERSITATEA DE ȘTIINȚE AGRONOMICE

ȘI MEDICINĂ VETERINARĂ BUCUREȘTI

FACULTATEA DE AGRICULTURĂ

SPECIALIZAREA de BIOLOGIE

LUCRARE DE LICENȚĂ

Îndrumător Științific:

Șef Lucrări Dr. Gabriela POPA

Absolvent: [anonimizat]-Cristina VOICU

BUCUREȘTI

– 2015 –

SPECIALIZAREA de BIOLOGIE

LUCRARE DE LICENȚĂ

DIAGNOSTICUL BACTERIOLOGIC

AL TUBERCULOZEI PULMONARE

Îndrumător Științific:

Șef Lucrări Dr. Gabriela POPA

Semnătura ……………………………………..

Absolvent: [anonimizat]-Cristina VOICU

BUCUREȘTI

– 2015 –

Cuprins

Pag.

INTRODUCERE

Tuberculoza (TB) continuă să reprezinte o [anonimizat]-se reactivarea pe plan larg populațional a unei infecții eronat considerată ca fiind sub control. Începând cu perioada 1983-1985, [anonimizat] a fost în continuă creștere.

Tuberculoza este o [anonimizat], rar provocată de bacilul Koch. Bacilul Koch reprezintă o [anonimizat] (UV) și sterilizarea cu produși chimici speciali. Bacilul Koch prezintă o caracteristică aparte de a reține metabolismul pe o perioadă lungă (10-20 de ani). [anonimizat], reactivându-se infecții cu microbii tuberculozei.

[anonimizat], [anonimizat]. [anonimizat], provenite de la un bolnav: [anonimizat] o [anonimizat], cântat, dar și prin intermediul alimentelor infectate.

[anonimizat] o atenție prioritară acestei probleme de sănătate deosebit de gravă. Ținând cont de condiționarea plurifactorială a [anonimizat], Ministerul Sănătății a decis să identifice și să mobilizeze toate resursele posibile pentru asigurarea unui randament optim al acestor măsuri de control al tuberculozei pentru care s-a demonstrat un raport cost / beneficiu favorabil.

[anonimizat] (PNCT), care conține recomandările generale aprobate de Comisia de Specialitate a Ministerului Sănătății și urmează să stea la baza programelor de control teritoriale.

[anonimizat], [anonimizat], a [anonimizat], conform unor standarde bine înțelese și respectate.

CAPITOLUL I

STADIUL ACTUAL AL AL CUNOAȘTERII

I.1.Scurt istoric

Robert Koch (1843-1910)

Medic german

Înființează un mic laborator la vârsta de 28 ani, deoarece atunci primește un microscop

Începe studiul microbilor în relație cu bolile infecțioase

Izolează microbul antraxului

Pe data de 24 martie 1882 este descoperit bacilul Koch (în fața Societății de Fiziologie din Berlin), și până acum la această dată sarbatorim Ziua Mondială a Tuberculozei.

În anul 1905 primește premiul Nobel

”Bacilul Koch este esențial, dar nu necesar suficiente pentru a cauza boala”.

Postulatele Koch:

”izolarea bacililor din organismul bolnav”

”creșterea lor in vitro, în culturi pure”

”inocularea bacililor din culturi la animale, cu reproducerea aceleiași condiții morbide = standardul dovezii etiologice bolilor infecțioase”

În 1940 oamenii de știință au descoperit primele medicamente impotriva tuberculozei pulmonare.

În 1964 Waksman descrie progresul tuberculozei în 5 etape istorice:

Perioada clasică din vremea lui Hipocrate

Perioada post-renascentistă (cuprinde secolele XVI-XVII) atunci dominau medicii britanici

Perioada Diagnosticului Clinic (sfârșitul secolului XVII – începutul secolului XIX) (fig. 1.1);

Perioada în care Robert Koch a constatat agentul cauzal al tuberculozei, atunci fiind identificată ca boală infecțioasă;

Perioada Diagnosticului cu acuratețe și Tratamentul (atunci s-a răspândit folosirea radiografiei toracelui, pneumotoraxul terapeutic și izolarea pacienților în spitale) (fig. 1.2).

Între anii 1985-1992 în SUA numărul cazurilor de tuberculoza a început să crească.

Figura 1.1. Rata mortalitatii pulmonare intre anii 1855 – 1964

Sursă: http://www.pneumo-iasi.ro/articole/curs1.pdf

Figura 1.2. Incidenta mortalitatii pulmonare intre anii 1900 – 1970

Sursă: http://www.pneumo-iasi.ro/articole/curs1.pdf

In tabelul de mai jos, sunt redate diferentele dintre procesul de infectie si simptomele care indica prezenta bolii.

Tabelul 1.1.

Diferențe dintre infecție și boală

Sursă: http://www.pneumo-iasi.ro/articole/curs1.pdf

1.2. Aspecte generale

În prezent un român se înbolnăvește de tuberculoza pulmonară la fiecare 20 de minut, iar un altul moare din această cauză la fiecare 6 ore, după un raport întocmit de Ministerul Sănătății Publice. În București unul din 50 de locuitori este infectat cu această boală. Există un risc foarte mare de răspândire a tuberculozei pulmonare, deoarece virusul se transmite prin aer, dacă un om sănătos stă timp de 4 ore continuu lângă un om infectat.

Tratamentul pentru tuberculoză durează între 6-18 luni, însă nici după această perioadă cel care a suferit de această boală nu este complet vindecat și poate fi în continuare contagios.

Nici în acest moment, România nu are o tehnică pentru a separa oamenii bolnavi de tuberculoză de oamenii sănătoși, până ce aceștia se vindecă, sau măcar o perioadă, până ce nu mai pot răspândi boala. Ar trebui demarată o anchetă despre felul în care sunt tratați bolnavii de tuberculoză (TBC), despre condițiile (în unele spitale, mizere) în care sunt ținute aceste persoane, dar și despre măsurile pe care statul român ar trebui să le asimileze pentru a stopa această maladie. Cel mai grav este că nu există nicio modalitate prin care medicii să poată obliga, oarecum, pacienții infestați de Tuberculoză (TBC) să se trateze și să se izoleze până la încetarea riscului de infestare și a altor persoane.

Deocamdată nu este cunoscut numărul persoanelor care suferă de Tuberculoză (TBC) din țara noastră. Spre exemplu in anii 2009-2010 dintre cei depistați cu tuberculoză (TBC) din Municipiul București nu toți au urmat tratamentul până la vindecare, au abandonat lupta cu această boală, iar alții și-au mutat domiciliul fără a anunța medicul, fie el în țară sau în străinătate. Pacienții care nu duc tratamentul până la capăt, ar trebui să fie înregistrați în baza de date a Institutului Marius Nasta, cu sprijinul Ministerului Sănătății, la fiecare să specifice ”Pierdut”, ”Abandon”,însă din păcate toți sunt înregistrați ca ”Vindecat”, asta pentru că dacă ar fi înregistrați ca ”Pierdut” sau ”Abandon” medicii ar trebui să depună tot efortul pentru a-i găsi și a-i convinge să își reia tratamentul, însă condițiile în care lucrează cadrele medicale sunt așa cum sunt, la fel și salariile de aceea preferă, unii dintre ei să falsifice registrele. Mai mult chiar dacă bolnavul ar accepta să stea închis până la terminarea tratamentului, Casa Națională de Asigurări de Sănătate nu decontează decât 40 de zile de internare, în acest fel pacientul fie plătește din buzunarul lui spitalizarea, de cele mai multe ori, cu toate că în general bolnavii de tuberculoză au o situație finainciară mai deosebită, fie medicii plătesc din bugetul spitalului o internare mai lungă, dar acest lucru nu e prea des întâlnit, deoarece spitalele nu au fonduri pentru aceste internări de lungă durată pentru bolnavii de tuberculoză (TBC). Netratată, tuberculoza nu se va vindeca niciodată. Tuberculoza se manifestă prin tuse persistentă (peste 3 săptămâni), se intensifică progresiv, fiind asociată si cu expectorație, iar la nivelul plamanilor se formeaza numeroase cavitati si eroziuni bronhiale (fig. 1.3).

Figura 1.3. Formarea cavitatilor si leziunilor bronhiale la nivelul plamanilor afectati de TBC (Sursă: http://www.romedic.ro/tuberculoza-pulmonara)

Boala se mai poate manifesta și prin febră sau stare sub-febrila, expectorație cu sânge, scăderea poftei de mâncare, slabire. De cele mai multe ori simptomele apar fără manifestări vizibile, iar bolnavii confundă boala cu o simplă răceală, de aceea amână mersul la medic crezând că o să le treacă. Trebuie precizat că în acest interval de timp, de la aparția simptomelor, înainte de prezentarea la medic, bolnavii sunt foarte contagioși. Cu cât întârzie să se prezinte la medic, cu atât mai multe persoane vor fi afectate în jurul lor.

1.2.1. Cauza tuberculozei

Este reprezentată de Bacilul Koch (bacteria Mycobacterium Tuberculosis) care se transferă interuman, dar și de la animale la om. Există 3 feluri de bacterii, de acest gen:

• Mycobacterium hominis – la om

• Mycobacterium bovis – la animale

• Mycobacterium africanum – în Africa

Mycobacterium tuberculosis sau bacilul Koch, este bacteria care cauzează cele mai multe cazuri de tuberculoză. A fost descrisă pentru prima dată de Robert Koch, în martie 1882. Este o bacterie obligatoriu aerobă (nu Gram pozitivă/negativă), care se divide la 16-20 ore (o rată mică de multiplicare, comparativ cu alte bacterii, cum ar fi E. coli, care se divide la 20 de minute) (fig. 1.4.).

Figura 1.4. Colonii de Mycobacterium tuberculosis

http://www.asbmb.org/asbmbtoday/asbmbtoday_article.aspx?id=14933

Spre deosebire de alți germeni, datorită continutului mare de mureină din peretele celular, se colorează foarte greu și, ulterior, rezistă la decolorarea cu alcool si acizi minerali diluați. Sunt așadar, bacili acid-alcoolorezistenti. Se pun in evidență prin colorația Ziehl-Neelsen (fig. 1.5).

Figura 1.5. Bacilul Koch pus in evidenta prin colorația Ziehl-Neelsen

http://www.nature.com/news/2010/100609/images/news

Pe frotiurile colorate după această metodă, bacilul tuberculos apare colorat în roșu aprins, datorită fucsinei, în timp ce restul de germeni, celule sau alte elemente, sunt decolorate de acizi sau alcool, fiind ulterior recolorate cu albastru de metilen.

Se mai poate identifica prin microscopie fluorescentă, sau prin colorare cu rodamină-auramină (fig. 1.6).

Figura 1.6. Microscopie fluorescentă, în care Mycobacterium este colorat datorită auraminei (http://ro.wikipedia.org/wiki/Mycobacterium_tuberculosis)

De asemenea se dezvoltă lent și numai pe medii speciale, cum ar fi mediul Lowenstein-Jensen, însă mai nou s-au obținut rezulate excelente de cultură folosind mediul de cultură Middlebrook.

Bacilul este rezistent la acțiunea majorității antibioticelor, acest lucru fiind în mare parte explicat prin faptul că infecția este intracelulară; este sensibil la streptomicină, hidrazida acidului izonicotinic (H.I.N.), cicloserină și labacteriofagi. Virulența se pare că este dată de existența unei substanțe lipidice numită cord-facto. Reacția sistemului imunitar la Mycobacterium tuberculosis este predominant de natură celulară. Rezistența specifică față de infecția tuberculoasă poate fi obținută cu germenii vii atenuați.

Prin vaccinare, în special a copiilor, cu B.C.G. (bacilul Calmette-Guerin), se obține o scădere importantă a cazurilor noi de tuberculoză. Acest vaccin conține bacili tuberculoși bovini care, prin treceri repetate pe mediul de cultură cu cartof biliat și glicerinat, și-au pierdut virulența și capacitatea de a produce tuberculoza, dar și-au păstrat proprietățile antigenice.

1.2.3. Factori de risc

Persoane sărmane, fără un adăpost;

Bolnavii de HIV;

Persoane care consumă droguri și alcool în exces;

Oamenii cu imunitatea foarte scăzută din cauza unor transplanturi de organe sau care prezintă boli care deranjează mecanismele de imunitate;

Oamenii care prezintă afecțiuni cronice precum diabetul zaharat necontrolat, ciroză, hemodializă;

Există și factori de mediu precum războaie , cataclisme sau migrațiile.

Principala cale de transmitere este cea aeriană și mai există și câteva căi mai rar întâlnite precum transplacentare (de la mamă la făt), cutanată, dgestivă – prin consumul de lapte de la animale infectate de Mycobacterium Bovis.

1.3. Analize radioimagistice și de laborator

La tuberculoza latentă trebuie făcute 2 tipuri de teste, și anume:

Testul cutanat – IDR la tuberculină. Se introduce în piele, în dreptul antebrațului o cantitate mica de fluid conținând tuberculină și apoi citind rezultatul după 72 ore. Dacă rezultatul este pozitiv, la locul injectării apare o umflătură roșie cu diametrul mai mic de 10 mm.

Testul de sânge – TB test quantiferon. Se evaluează răspunsul sistemului imunitar la bacteriile tuberculozei.

În ambele cazuri rezultatul poate fi negativ – lipsa infecției sau pozitiv – bolnavul este

infectat cu tuberculoză latentă.

La tuberculoza activă trebuie urmate 3 etape:

Radiografia (tomografia computerizată toracică) – pentru tuberculoza pulmonară se accentuează diverse leziuni de tip adenopatii hilare sau mediastinale, pleurezie sau atelectazii (în tuberculoza primară la copii) și leziuni infiltrative, cavitare, fibrotice (în tuberculoza secundară a adultului), condensări de tip pneumonic sau bronhopneumonic (fig. 1.7).

Figura 1.7. Radiografia plamanilor unui pacient infectati cu Mycobacterium tuberculosis

http://www.bio.davidson.edu/people/sosarafova/assets/bio307/emrivard/Pathogen%20Life%20Cycle.html

Examenul bacteriologic al sputei (secreție de mucus din bronhii eliminată prin tuse) – reprezintă investigația care scoate în evidență bacteriile. Rezultatul microscopic poate fi citit între 48-72 ore, iar cultura la circa 2 luni, atunci se efectuează și antibiograma pentru testarea sensibilității bacteriilor la medicamentele antituberculoase. Examenul bacteriologic al sputei este foarte important pentru diagnostic, pentru urmărirea evoluției sub tratament și evaluarea vindecării

Bronhoscopia – se utiliează în cazul persoanelor care nu pot expectora. Se realizează aspirat bronsic sau lavaj bronhioloalveolar, care se analizează bacteriologic.

Diagnosticul de tuberculoză. Există 2 tipuri de tuberculoză, și anume:

Tuberculoza primară:

este des întâlnită la copii;

apare atunci când copilul are contact cu un bolnav de tuberculoză;

IDR la tuberculină pozitiv;

această boală se manifestă prin : tuse care durează peste 3 săptămâni, scădere ponderală, febră mică;

aspect radiologic: adenopatii hilare, miliară tuberculoasă, condensări, reactii pleurale;

examen bronhoscopic: inflamația bronhiilor, stenoze, secreții, compresiuni bronșice și ulcerații;

examen bacteriologic pozitiv: se extrage din aspirat bronșic sau aspirat gastric matinal.

Tuberculoza secundară:

este cea întalnită numai la adulți;

această tuberculoză se manifestă prin: tuse care durează cel puțin 3 săptămâni, acesta fiind simptomul dominant, se întâlnește și tuse cu sânge, febră, scădere în greutate și lipsă de aer;

aspect radiologic: leziuni caviare și infiltrative;

examen bacteriologic: se extrage din spută sau aspirat bronșic;

diagnoza tuberculozei extrapulmonare: este complicată și se face îndeosebi din organul infectat, prin examen histopatologic. Este în răspunderea medicului specialist în organul respectiv.

Cele mai des întâlnite locuri sunt: meningita TB, TB cutanată, TB endocrină, TB otică, TB oculară, larinigita TB, TB gastro-intestinală, TB peritoneaă, ascita TB, pericardita TB, TB uro-genitală, TB osteo-articulară, pleurezia TB, limfadenita TB.

Pentru ca această boală să se vindece, trebuie urmat un tratament. Acest tratament este gratuit și se începe în spital, în secții special amenajate pentru separarea bolnavilor până ce sputa va fi negativă, ca să nu se răspândească infecția, apoi tratamentul se continuă de acasă, prin dispensarul zonal, din care face parte.

Au apărut tratament moderne care presupun unirea a mai multor medicamente pentru o perioadă mai lungă de timp: 6 luni pentru tuberculoza chimiosensibilă la tratament de linia I și 12-18 luni sau chiar mai mult pentru tuberculoza chimiorezistentă unde se folosesc medicamente de linia II cu efecte secundare mult mai agresive.

Tratamentul

Tratamentul se face în trei etape, de la caz la caz, folosind, la început, trei antibiotice, apoi două și în final un singur antibiotic, cel mai putin toxic. Eșecul vindecării apare mai ales din cauza neglijenței pacientului, care, la un moment dat renunță la tratament, crezând ca s-a vindecat. În SUA, chiar se dau bani la pacienți pentru a-și lua medicamentul. O variantă foarte dură de TBC apare în închisorile rusești, unde lipsa finanțelor duce la nevindecarea bolnavilor; ulterior ei fiind eliberați, vor constitui surse de infecție extrem de periculoase.

Tratamentul se realizează sub observarea personalului medical pentru a urmări efectele secundare (dacă este cazul). Tratamentul începe imediat ce rezulttul microscopic al sputei constată prezența bacteriilor (dupa 48-72 ore). Bacteriile având un ritm lent de diviziune, pentru a crește în cultură, este necesar un timp mai îndelungat, rezultatul culturii fiind gata în aproximativ 2 luni, însă în acest timp pacientul primește deja tratamentul. Din această cultură se face si antibiograma, care accenuează prezența răspunsului bacterian la tratament. Dacă răspunsul este favorabil – apariția tuberculozei chimiosensibilă – se va continua tratamentul cu regim specific. Dacă apare rezistență la tratamentul uzual – tuberculoza chimiorezistentă – se vor efectua diferite scheme cu mai multe medicamente, însă este obligatoriu un tratament injectabil și de lungă durată.

Cazurilor noi diagnosticate li se aplică Regimul I de tratament, care durează 6 luni: în primele 2 luni se vor lua 4 medicamente zilnic, în următoarele 4 luni se vor lua 2 medicamente, din care doar 3 zile pe săptămână. Pentru persoanele care au fost tratate de tuberculoză și sunt diagnosticate cu recidivă tuberculoasă, eșec sau abandon terapeutic, se aplică Regimul II de tratament, care durează 8 luni. Pentru pacienții cu reacții secundare severe și la cei cu tuberculoză rezistentă la medicamentele de linia I (cele folosite în regimul I sau II), se utilizează medicamente de linia II, uneori fiind nevoie de rezecție chirurgicală a zonei pulmonare afectate, acesta se numește Regim individual.

Pe parcursul tratamentului se efectuează periodic monitorizarea evoluției bolii prin radiografii pulmonare, examene de spută și analize de sânge mai ales la ficat pentru că tratamentul este hepatotoxic.

Tuberculoza, dacă este tratat corect, cu respectarea medicației și a duratei, se poate vindeca. Însă pot apărea și complicații dacă este diagnosticată tardiv sau dacă nu s-a respectat tratamentul cum trebuie:

hemoptizie: se caracterizează prin tuse cu sânge. Cantitatea de sânge este foarte mică, amestecată cu sputa, însă dispare după inițierea tratamentului. Rar, putem întâlni hemoptizie masivă, aceasta poate pune viața în pericol, uneori necesită chiar intervenție chirurgicală pentru oprirea sângerării.

pneumotorax : se caracterizează prin pătrunderea aerului între foițele pleurale, care învelesc plămânul, având senzație de respirație dificilă. Aceasta apare din cauza ruperii unei cavități tuberculoase localizată la periferia plămânului. Mai poate apărea și empiem pleural, prin drenarea de puroi din plămâni în pleură, cu legătură printr-o fistula pleuro-pulmonară. Tratamentul constă în medicație antituberculoză, drenaj pleural ori intervenție chirurgicală pentru fistula pleurală.

bronsiectazii : se caracterizează prin dilatații bronșice provocate de fenomenele de inflamație și fibroză, care provoacă efecte de tracțiune asupra bronhiilor. De multe ori, din cauza dilatării vaselor de sânge, care se pot rupe ușor, în zonele afectate, apar bronsiectaziile asociate cu apariția de hemoptizii.

distrucție pulmonară extinsă : se definește prin afectarea extensivă și progresivă a unui plămân în întregime, a ambilor plămâni sau a unei zone pulmonare. Apare în cazul evoluției cronice la adulți în absența tratamentului corespunzător, dar și în tuberculoza primară la copii. Se caracterizează prin scăderea în greutate, tuse cu sânge, respirație grea, având o capacitate foarte mare de deces, radiologic mai apar cavități mari grupate cu fibroză extinsă. Forma acută de distrucție cu necroză pulmonară transplantată de mortalitate crescuta, o reprezintă gangrena pulmonară.

1.6. Profilaxie

vaccinarea BCG: În România această vaccinare se face în mod obligatoriu la toți nou-născuții, înainte de externarea din maternitate, fără nevaccinare ulterioară. Aceasta este o metodă de protecție antituberculoasă, nu evită infectarea, însă previne apariția de meningită și miliară tuberculoasă la copilul mic.

Chimioprofilaxia : la persoanele care au avut contact cu alte persoane infectate de tuberculoză, această metodă împiedică dezvoltarea unei tuberculoze active.

Controlul transmiterii tuberculozei : pentru a nu fi infectate și alte persoane de această boală trebuie să urmăm următorii pași: izolarea, tratarea corespunzătoare și strictă a persoanelor deja infectate; pentru prevenirea răspândirii bacililor în atmosferă trebuie respectată o anumită ”igienă a tusei”; pentru ca micșorarea densității bacililor în aerul din spațiile restrânse, trebuie să avem în vedere: ventilația eficace, lumina naturală, precum și lămpi cu radiații ultraviolete (UV).

CAPITOLUL II

MATERIALE ȘI METODE

2.1. OBIECTIVE

Studiile efectuate in cadrul Laboratorului de bacteriologie al Spitalului de Pneumoftiziologie „Izvoru” au vizat incidenta bolii de tuberculoza pe parcursul a 5 ani (2009, 2010, 2012, 2013, 2014) pe baza datelor inregistrate in aceasta perioada.

2.2. MATERIALE

Pentru efectuarea experimentelor au fost necesare urmatoarele materiale si reactivi:

eprubete cu capac filetat, de 16/100-120 mm sau tuburi Falcon de 15-50 ml, sterile;

pipete de 1 ml, 2 ml, 3 ml cu pară;

pipete Pasteur de unică folosință;

termostat;

frigider;

mediu de cultură tip Löwestein Jensen;

mănuși.

Reactivi

soluție sterilă de hidroxid de sodiu (NaOH) 4%;

solutie sterilă de acid clorhidric (HCl) 8%;

soluție sterilă de albastru de bromtimol;

centrifugă cu sistem de securitate biologică și cu răcire;

eprubete (cuve) de centrifugă din material plastic cu capac filetat, cu capacitate minimă de 10 ml;

pipete de 1 ml, 2 ml și 5 ml cu pară;

pipete Pasteur de unică folosință;

termostat;

frigider;

mediu de cultură tip Löwestein Jensen;

mănuși de protecție.

Soluție sterilă de hidroxid de sodiu 4%;

se topește 4 g de hidroxid de sodiu (NaOH) în 100 ml apă distilată;

se dezinfectează prin autoclavare 30 de minute la 121°C.

Soluție sterilă de acid clorhidric (HCl) 8%;

se pune 8 ml acid clorhidric (HCl) concentrat în 92 ml apă distilată (niciodată invers);

se dezinfectează prin autoclavare 30 de minute la 121°C.

Soluție de albastru bromtimol (indicator);

se amestecă 0,1 g albastru bromitol cu 3,2 ml soluție de hidroxid de sodiu (NaOH) N/2 (1 ml soluție hidroxid de sodiu (NaOH) 4% + 19 ml apă distilată) și cu 250 ml apă distilată;

se dezinfectează prin autoclavare 30 de minute la 121°C;

se menține în sticlă brună.

Soluție de hidroxid de sodiu (NaOH) 4% cu indicator de pH (gata de lucru);

se amestecă 92,5 ml soluție de hidroxid de sodiu (NaOH) 4% dezinfectată cu 7,5 ml soluție albastru bromtimol dezinfectată;

Soluțiile se mențin în sticle brune; se tipărește pe sticle denumirea soluției și concentrația, data preparării și a expirării (dezinfectarea durează 8 săptămâni).

Reactivii se mențin în flacoanele originale. Nu se combină reactivi din flacoane diferite, chiar dacă producătorul este același.

Recipientele în care se găsesc reactivi și coloranți trebuie să aibă tipărită data recepției în laborator și data deschiderii.

Orice reactiv verificat necorespunzător trebuie consemnat ca atare și scos imediat din laborator (Proces verbal de casare).

Stocurile trebuie să ajungă pe o perioada de 3 luni și se utilizează în ordinea primirii și datei de expirare.

Flacoanele cu soluții de lucru se numesc clar, având scrisă denumirea completă, concentrația soluției, data preparării și data expirării

b)Medii de cultură

Mediile de cultură trebuie să ofere condiții foarte bune creșterii micobacteriilor, nu contează dacă produsul este paucibacilar. Se utilizează mediul Löwestein Jensen, fiind cea mai bună alegere pentru că:

garantează creșterea micobacteriilor;

se poate menține în frigider căteva săptămâni;

stopează germenii de contaminare prin verdele malachite conținut;

este ieftin.

Are și dezavantaje:

perioada de timp necesară pentru a obține o cultură pozitivă este de 4-8 săptămâni în cazul produselor paucibacilare.

c)Produse patologice pentru diagnosticul tuberculozei pulmonare

Sputa reprezintă produsul patologic de selecție (alegere) în analizarea tuberculozei pulmonare (dacă este bănuită o tuberculoză extrapulmonară, sputa va fi recoltată în completarea examenului produsului patologic extrapulmonar la pacienții cu manifestări respiratorii simultane). Alte materiale biologice utilizate in diagnosticul tuberculozei : urina si lichide care au fost recoltate în mediu corespunzător prin puncții, fragmentele de țesut extrase intraoperator. Probele s-au trimis laboratoruluiunde au fost prelucrate imediat. Dacă volumul de material este mic, recomandat este să fie transferat pe loc din seringă într-un balon steril cu mediu lichid, în cantitate de 5-10 ori mai mare. Volumele mai mari de produse se vor trimite către laborator, unde se vor concentra, prin centrifugare.

Fragmentele de țesut extrase intraoperator se pun în recipiente sterile, fără soluții de conservare, de asemenea se vor trimite imediat la laborator.

2.3. METODE

2.3.1. Recoltarea, transportul și conservarea produselor biologice

Analizele bacteriologice au o deosebită importanță atât în diagnostic și în monitorizarea cazurilor de tuberculoză cât și în evaluarea Programului Național de Control al Tuberculozei (PNCT), din acest motiv toate stadiile acesteia – de la pregătirea pacientului și recoltarea patologică până la citirea și interpretarea rezultatelor – trebuie tratate cu mare atentie.

Recoltarea. Calitatea produselor patologice este imprtantă pentru obținerea unor rezultate cât mai corecte. În acest scop trebuie urmați pașii corespunzători, precum:

Recoltarea și manipularea produselor patologice se realzează astfel :

evitarea contaminării cu bacterii și fungi a produsului patologic;

evitarea diseminării germenilor în mediul ambient;

evitarea infectării personalului medical.

Recoltarea și manipularea produselor patologice se face sub supravecherea unui cadru medical care are competență privind scăderea riscului de contaminare a produselor și trebuie să știe sigur că s-a recoltat un produs expectorat din focarul lezional, de la un pacient identificat corect și în cantitate optimă pentru prelucrarea în laborator.

Respectarea următoarelor norme de recoltare :

În cazul persoanelor bănuite de tuberculoză, produsele se recoltează înainte să înceapă tratamentului antituberculos.

În cazul bolnavilor care deja au început tratamentul se recoltează produse patologice numai după sistarea tratamentului timp de 3 zile.

Repetarea examenului bacteriologic în zile consecutive (la pacienții care sunt suspectați de tuberculoză pulmonară se recoltează pana la 9 spute, în cazul în care primele examinări au fost negative, iar suspiciunea de tuberculoză se menține.

Caracteristicile flacoanelor pentru recoltarea sputei:

fabricarea din material plastic, incasabil, transparent – pentru a vedea cantitatea și calitatea produsului patologic fără a deschide recipientul;

cu deschiderea largă (minim 35 mm diametru) – pentru împiedicarea contaminării pereților externi ai flaconului;

capacitatea de 30-50 ml pentru spută și adecvatăpentru fiecare tip de produs patologic;

cu capac cu filet care închide ermetic flaconul;

cu posibilitatea de a fi inscripționatecu ușurință.

Produsele patologice se transportă către laborator cu formularele de solicitare (conform celor recomandate de către Programul Național de Control al Tuberculozei (PNCT)), având aceleași date de identificare pe flacon cât și pe formular.

Transportul produselor către laborator se face imediat după recoltare sau, dacă nu este posibil, în cel mai scurt timp de la recoltare, acestea păstrându-se la frigider (4°C), maxim 72 de ore.

2.3.2. Examenul microscopic

Examenul microscopic conturează bacili acido-alcoolo rezistenți (BAAR) din produsele patologice. Diagnosticul microscopic trebuie sistematic confirmat prin cultură, deoarece aspectul germenilor nu dă indicații asupra speciei și nici asupra viabilității lor. Din acest motiv, în laboratoarele specializate, același produs patologic este examinat atât microscopic, cât și după cultivare, pe când în laboratoarele nespecializate (acolo unde microscopia este realizată direct pe lamă) este folosită fără cultură concomitentă, drept mijloc de separare al bolnavilor, cu simptome corespunzătoare tuberculozei pulmonare.

2.3.2.1. Examenul microscopic al sputei

Efectuarea frotiurilor

a. Etalarea. Se folosesc lame noi, curate și degresate cu numere complete luate din registrul de laborator, utilizând de exemplu un marker rezistent la ștergere, insolubil în alcool, cu creion de grafit dacă lamele au capătul mătuit. Se așează în ordine flacoanele cu produsele patologice. Sterilizăm ansa bacteriologică în flacara de bec de gaz și așteptăm până se răcește.

Cu ansa bacteriologică (pipeta Pasteur sau bețișoare de lemn de unică folosință) se selecționează porțiuni purulente, opace din spută sau se prelevă o ansă din sedimentul rezultat după centrifugare (aproximativ 10-20 µl), etalându-se în porțiunea centrală a lamei pe o arie de aproximativ 1×2 cm, fără să ajungă la marginile lamei, apoi vom verifica încă o dată identitatea sputei.Se întinde produsul uniform pe lamă, în strat subțire, astfel încât să se realizeze un frotiu prin care să se vadă literele unui text tipărit, atunci când este uscat. Daca frotiul este prea gros, se poate desprinde de pe lamă în timpul colorării. De asemenea, pe un frotiu prea gros, bacilii acido-alcoolo rezistenți (BAAR) sunt foarte greu de vizualizat, putând fi acoperiți de elemente celulare. Până să sterilizăm ansa, se vor descărca resturile de spută prin rotirea ansei în nisipul acoperit cu alcool medicinal sau cu o substanță dezinfectantă cu efect bactericid asupra M. Tuberculosis, din flaconul Erlenmeyer.

b) Uscarea. Lamele se vor lăsa la uscat la temperatura camerei sau pe o platină încălzitoare. Niciodata nu se va usca la flacară.

c) Fixarea. Se ține lama cu pensa, trecându-se partea opusă frotiului prin flacara becului de gaz de 3 ori. Trebuie realizată fixarea, dar să nu aibă loc carbonizarea frotiului. Se va aștepta răcirea lamelor.

d) Colorarea

Colorațiile care sunt folosite trebuie să pună în evidență caracterul acido-alcoolo rezistent al micobacteriilor. Colorația folosită cel mai des pentru evidențierea bacilului acido-alcoolo rezistent (BAAR) este colorația Ziehl-Neelsen. În afară de aceasta și diversele ei variante, pentru evidențierea bacilului acido-alcoolo rezistent (BAAR) se pot folosi și substanțe fluorescente.

1) Colorația Ziehl-Neelsen

Colorarea. Se vor așeaza lamele cu frotiurile fixate pe suportul de colorare fără a se atinge între ele. Se vor acoperi complet frotiurile cu soluție 0,3 % de fucsină fenicată proaspăt filtrată. Se va trece pe sub lame flacara unui bec de gaz până la apariția vaporilor, fără ca acestea să fiarbă. Se va repeta acțiunea de 3-4 ori în primele 3 minute. Se va completa cu fucsină, dacă aceasta s-a uscat sau s-a scurs de pe lamă. Se lasă până la 10 minute. Se va spala cu jet slab de apă de robinet și se va scurge apa.

Decolorarea. Se va acoperi frotiul cu acid-alcool 3 % și se va lăsa pentru decolorare maxim 3 minute. Se va repeta decolorarea, până când frotiul va fi roz pal sau alburiu. O decolorare mai îndelungată nu reprezintă neapărat o greșeală, pentru că bacilul acido-alcoolo rezistent (BAAR) aparține complexului M. Tuberculosis, fiind intens rezistenți la decolorare.

Se va spăla din nou cu jet slab de apă de robinet și se va scurge apa.

Recolorarea. Se va acoperi frotiul cu albastru de metilen 0,3 % timp de 30 de secunde, maximum 1 minut. Dacă timpul de contact cu albastru de metilen este prelungit, fondul frotiului poate fi prea închis la culoare, asta face dificilă vizualizarea bacilului acido-alcoolo rezistent (BAAR). Se va spăla încet sub jet de apă la robinet. Se va usca frotiurile în poziție înclinată pe suport de lame.

Analiza frotiurilor colorate Ziehl-Neelsen se va face la microscopul optic, folosind obiectivul cu imersie și oculare 10 x sau 7 x, în niciun caz nu se vor utiliza ocularele de 5 x.

2) Colorația cu auramină și rhodamină

Colorarea. Se va acoperi frotiul fixat cu soluție 0,1 % auramină – 0,01 % rhodamină.

Se va lăsa 5 minute la temperatura camerei, fără încălzire. Se va spăla încet cu apă distilată.

Decolorarea. Se va acoperi frotiul cu acid-alcool 3 % și se va lăsa pentru decolorare 2 minute. Se va spăla încet cu apă distilată și se va scurge excesul de apă.

Recolorarea (pentru eliminarea fluorescenței nespecifice a fondului). Se va acoperi frotiul cu potasiu 0,5 % sau acridin orange 0,01 % ori albastru de metilen 0,3 % timp de 2 minute. Dacă contactul cu permanganatul de potasiu se prelungește peste 4 minute provoacă micșorarea fluorescenței bacilului acido-alcoolo rezistent (BAAR). Se va spăla cu apă distilată și se va scurge excesul de apă. Se va lăsa la uscat în suportul de lame. Pentru colorația cu fluorocromi, în toate etapele de spălare, se va utiliza numai apă distilată. Nu se utilizează apă de la robinet deoarece clorul permite interferența cu fluorescența.Frotiurile care sunt pozitive cu bacilul acido-alcoolo rezistent (BAAR) în fluorescență se recoltează Ziehl-Neelsen, pentru a confirma rezultatele. Pentru că Mycobacterium tuberculosis poate primi o întreagă varietate de produse patologice, precum fluide de la nivelul seroaselor, țesuturi, puroi sau urină și în laborator, deoarece poate leza aproape orice organ. Beneficiul examenului microsocpic al acestor produse este restrâns, de aceea diagnosticul tuberculozei extrapulmonare se va baza mai curând pe cultivarea probelor.

e) Examinarea la microscop

Examinarea frotiului. Se va folosi, de preferință microscop binocular, cu obiectiv de imersie (100 x) și ocular (80 x sau 10 x) și sursă de lumină electrică.

Tehnica. Se va controla dacă sursa de lumină este reglată și focalizată, precum și condensatorul ridicat, cu diafragmul deschis. Se va pune o picătură de ulei de cedru pe frotiu cu o bagheta de sticla , iar lama se va așeaza pe platoul microscopului. Nu se va atinge frotiul cu bagheta cu ulei de imersie (uleiul se poate contamina cu bacilul acido-alcoolo rezistent (BAAR). Se va coborî obiectivul cu imersie până va atinge picătura de ulei de pe lamă. Vom privi prin ocular , manevrând viza macrometrică, apoi vom ridica lent obiectivul până când apare imaginea cu ajutorul vizei micrometrice. În cursul analizei se folosește mereu viza micrometrică pentru a avea o imagine clară. Bacilii acido-alcoolo rezistenti (BAAR) arată ca nște bastonașe fine de culoare roșie, ușor curbate, de cele mai multe ori granulate, izolate sau grupate în perechi ori grămezi. Se va distanța pe fondul albastru al frotiului (grămezile strânse de bacili se va studia fiecare un singur bacil acido-alcoolo rezistent (BAAR).

Se străbate frotiul în lungime de 1-3 ori, pe trasee diferite. Se analizează câmp după câmp, separate (nu în mișcare continuă) căutând bacilii de la centrul spre periferia câmpului. După densitatea bacililor pe frotiul, se citesc între 25-300 câmpuri. Pentru a declara un frotiu negativ se analizează minimum 300 câmpuri la mărirea x 1000, 150 la x 650, 70 la x 450, 30 la x 250. Până să trecem la analizarea altui frotiu vom șterge lentila obiectivului de imersie cu tifon curat.

Cauze de eroare în microscopie

Situații apărute în cursul procesului de prelevare a produsului patologic.

Prelevatul calității sau în cantitate necorespunzătoare (mai mari ori mai mici).

Dacă recipientele reutilizabile nu sunt spalate suficient de bine.

Sa nu apară greșeli în numerotarea recipientelor de recoltare – acestea trebuie numerotate pe corp nu pe capac.

Situații apărute în timpul efectuării frotiului.

Sa nu avem erori de identificare a lamelor.

Sa nu efectuam prea multe frotiuri deodată. Este recomandat să nu se facă mai mult de 12 frotiuri o dată.

Sa nu reutilizăm lamele, mai ales cele pozitive, din punct de vedere al prezenței bacilului acido-alcoolo rezistent (BAAR), această practică este inacceptabilă.

Sa nu utilizăm lame vechi care să prezinte zgârieturi, recomandarea este să folosim lame noi.

Contaminarea prelevatului din cauza folosirii incorecte a anselor și a pipetelor.

Situații apărute în cursul colorării frotiurilor

Folosirea de fucsină nefiltrată.

Încălzirea exagerată a fucsinei pe lamă, deoarece poate determina cristalizarea colorantului.

Decolorarea insuficientă.

Lamele sa nu fie lipite unele de altele în timpul procesului de colorare.

Situații apărute în cursul examinării microscopice

Lentila frontală a microscopului nu a fost curățată între examinări.

Prezența bacililor în uleiul de cedru, prin atingerea frotiurilor cu aplicatorul.

Înregistrarea eronată a rezultatelor.

Examinarea superficială a frotiurilor.

În laboratoarele care fac examen microscopic pentru diagnosticul bacteriologic al tuberculozei se ține obligatoriu, evidența scrisă a controlului calității, indiferent de nivelul de competență și responsabilitățile laboratorului implicat.

2.3.3. Însămânțarea pe medii de cultură, incubarea la termostat și controlul creșterii

Metoda de contaminare cu hidroxid de sodiu 4 % efectuează un echilibru acceptabil între numărul de micobacterii distruse (aproximativ 50-60 %) și rata de contaminare a culturilor (circa 2-5 %). Se admite o rată de contaminare de 2-3 % pentru laboratoarele care pregătesc produsele în aceeași zi și o rată de contaminare de maxim 5-10 %, atunci când pregătirea se face după câteva zile de la recoltare. O rată de contaminare mai mică de 2 % demostrează o tehnică agresivă de decontaminare, care omoară prea mulți bacili acido-alcoolo rezistenți (BAAR). Hidroxidul de sodiu (NaOH) este cel mai des folosit ca și agent de omogenizare / decontaminare. Pot fi aplicate două variante tehnice (cu centrifugare și cu picătură).

Avantaje:

metoda este ușoară, ieftină și garantează un control corect și eficient al contaminării;

soluția de hidroxid de sodiu (NaOH) sterilizată poate fi ținută câteva săptămâni;

comasarea micobacteriilor din produsul prelucrat (în varianta tehnică cu centrifugare).

Dezavantaje:

risc de eroare dacă timpul de contact nu este strict respectat și controlat (nu mai mult de 20 de minute);

risc de eroare dacă parametrii centrifugării nu sunt adecvați (forța aproximativă de centrifugare de 3000 xg, cu o durată de 15-20 de minute, în centrifuga de răcire);

prin această metodă se omoară 60 % dintre bacili, chiar dacă este îndeplinită cu exactitate tehnica standardizată; această distrugere inițială nu depinde de alți factori adiționali (căldura care crește în timpul centrifugării, neutralizarea incorectă).

Metoda cu hidroxid de sodiu și centrifugare. Din eșantionul de spută se transmite cu pipeta 2-3 ml într-o eprubetă de centrifugă de 10-12 ml;

se pune un volum egal de soluție de hidroxid de sodiu (NaOH) 4% cu indicator de pH;

se strânge capacul și se agită;

se lasă în repaus 15 minute la temperatura camerei, cu 1-2 agitări;

se neutralizează cu acid clorhidric (HCl) 8% la pH neutru (galben-verzui);

se completează până la capacitatea eprubetei cu apă distilată;

se centrufughează la 3000 xg timp de 15 minute;

se decantează supernatantul reținând 2 ml;

se resuspendă sedimentul în lichidul rămas omogenizând cu pipeta Pasteur.

Atenție: Barbotarea stârnește aerosoli infecțioși!

se însămânțează cu pipeta dezinfectată mediile de cultură cu câte 0,2 ml sau 4 picături din omogenat;

fiecare produs refăcut se însămânțează pe trei tuburi cu mediu Löwestein Jensen ori 1-2 tuburi cu mediu Löwestein Jensen și 1 flacon cu mediu lichid.

Metoda cu hidroxid de sodiu fără centrifugare (metoda cu picătura)

Se propune mai mult în laboratoarele în care nu există o centrifugă potrivită. Absența centrifugii reduce sensibilitatea metodei, performanțele acestuia fiind puternic influențate de corectitudinea selectării particulelor purulente din produs. Ca urmare, această metodă constituie o soluție de necesitate.

Tehnica:

din recipientul în care s-a recoltat sputa se selecționează, cu o pipeta Pasteur cu orificiul larg (picurătoare) ori cu o pipeta cu pară, particule purulente (2-3 ml) care se așează pe o eprubetă mare, sterilă, cu capac filetat, (de 16/100-120 mm sau tub Falcon de 15-50 ml);

peste sputa din eprubetă se pune cu o pipetă sterilă o cantitate de soluție de hidroxid de sodiu (NaOH) 4% la fel cu indicator de pH – se strânge capacul înainte de agitare;

se agită manual (1minut) ori mecanic (cu agitatorul mecanic 10-15 secunde);

se lasă în repaus la temperatura camerei 15 minute, cu 1-2 agitări energice în acest interval, în cazul probelor agitate manual;

se neutralizează cu acid clorhidric (HCl) 8% până când apare culoarea galben-verzui (pH neutru);

se însămănțează mediile cu pipeta sterilă cu pară ori cu pipeta de unică folosință.

Se poate neutraliza cu fosfat monopotasic soluție 15%. Această variantă de neutralizare este importantă atunci când este urmată de centrifugare (15 g fosfat monopotasic și apă distilată până la 100 ml).

Însămânțarea mediilor

Pregătirea eprubetelor cu mediu:

se va scoate mediul de cultură, din frigider cu cel puțin 30 de minute înainte de a se utiliza;

se etichetează tuburile de mediu astfel: numărul din registrul de laborator împreună cu indicativul produsului patologic și cu data însămânțării pe fiecare tub (se prepară câte trei tuburi pentru fiecare produs patologic efectuat).

Tehnica însămânțării:

se însămânțează 3 tuburi de mediu Löwestein Jensen pentru fiecare produs;

se însămânțează câte 4 picături (0,2ml) din sedimentul eșantionului de produs prelucrat în fiecare tub cu mediu de cultură, utilizând o pipetă Pasteur;

se apleacă fiecare tub pentru ca toată suprafața mediului să fie inundată de inocul;

tuburile însămânțate se pun în poziție aplecată (unghi de 25-30°) pe tăvițe speciale, astfel încât lichidul însămânțat să inunde suprafața mediului, însă nu trebuie să ajungă la capac;

capacul rămâne semiînchis, deci nu se va închide complet;

se filtrează, în funcție de indicațiile producătorului, 2-5 zile în poziție aplecată, la 37°C la termostat, pentru ca să se evapore excesul de lichid;

se închide capacul complet (unii din producători precizează faptul că pe întreaga durată de incubare capacul trebuie sa stea semiînchis);

se pune capacul în poziție verticală (cutii cu locașuri din materiale ce pot fi sterilizate – aluminiu, plastic rezistent);

apoi se elimină tuburile contaminate

se trece în registrul de laborator contaminarea și se transmite solicitantului.

Incubarea culturilor și controlul creșterii bacteriilor:

se filtrează culturile până la 2 luni de la însămânțare în termostat, la 36,5-37 °C.

se așează culturile în termostat în ordine cronologică;

primul control se realizează la ridicarea tuburilor în poziție verticală, permițând identificarea mediilor rapid și integral contaminate (toate cele 3 tuburi). Rezultatul se transmite imediat medicilor care au cerut examenul.

în continuare, culturile vor fi verificate săptămânal, până la împlinirea a 8 săptămâni de incubare (60 de zile).

Verificarea tuburilor cu mediul de cultură:

culoarea mediului Löwestein Jensen este verde luminos, rar poate avea particule punctiforme cauzate de prezența lipidelor din ouă. Se pot vede mici bule apărute spontan în timpul coagulării, dar acestea nu vor afecta calitatea mediului.

suprafața mediului trebuie să fie lucioasă, netedă;

să aibă lichid de condensare în partea de jos a eprubetei;

eprubetele cu mediu nu trebuie expuse la lumină foarte mult, pentru că mediul va dobândi o culoare albastră și își va schimba proprietățile nutritive ajungând inutilizabil.

Notarea și interpretarea rezultatelor. Tuburile cu mediu solid se analizează la intervale de timp fixe. Rezultatele se prezintă semnificativ, conform scalei exprimate în tabelul următor:

Tabelul 2.1.

Exprimarea semnificativă a rezultatelor culturii pe mediul solid tip Löwestein Jensen

Sursă: ”Îndrumar de tehnici de laborator de bacteriologie BK” – Daniela Homorodean, Olga Moldovan, Daniela Diculencu, Grațiela Chiriac, Ionela Muntean, 2005, pag. 29.

După identificarea anticipată a micobacteriilor din complexul M. tuberculosis se eliberează rezultatele culturilor:

coloniile de bacili tuberculoși se vor face vizibile în cultura primară după cel puțin 3-4 săptămâni de la însămânțare.

coloniile au aspect conopidiform, culoarea lor va fi crem galbui-palid, rugoase;

bacteriile nu se formează în soluția salină fiziologică în timpul efectuării frotiului (se va zări un aspect granular);

în preparatul microscopic, frotiul efectuat din cultură permite, uneori, accentuarea unei distribuții în corzi-serpentine, având diferite lungimi, bacilii izolați cu lungime de 3-4 µm fiind în număr mic; pentru cercetarea microscopică a culturilor se utilizează numai colorația Ziehl-Neelsen, permițând atât accentuarea bacililor acido-alcoolo rezistenți (BAAR) cât și observarea altor microorganisme (bacterii, fungi) de contaminare.

Notarea rezultatelor. Rezultatul culturii se consemnează în registrul de laborator, pentru fiecare din tuburile examinate. Pentru că din fiecare produs patologic se însămânțează 3 tuburi, rezultatul culturii se înregistrează astfel:

dacă numărul de colonii avansate este sub 30 se imprimă suma coloniilor numărate pe

toate tuburile, împreuna cu numărul de tuburi pe care s-au dezvoltat;

dacă numărul de colonii avansate este mai mare de 30, rezultatul final al unei culturi va fi marcat de tubul cu creșterea cea mai puternică;

dacă se află 2 tuburi cu microbi de contaminare, iar pe cel de-al treilea tub se găsesc colonii de micobacterii, rezultatul culturii va fi dat de creșterea pe acel tub, cu mențiunea ”/1 tub”;

dacă toate cele 3 tuburi au mediile contaminate; rezultatul de cultură contaminată la data de … și se notează cu C. (C/dată);

dacă 1-2 tuburi au mediile contaminate, se precizează data contaminării (C. și data pentru fiecare tub);

dacă mediile pe care s-au dezvoltat coloniile, rezultatul este pozitiv, cu interpretarea lui.

Se vor nota în registru, la fiecare control, toate rezultatele (tabelul 2.2).

Tabelul 2.2

Exprimarea semnificativă a rezultatelor examenului microscopic

Sursă: ”Îndrumar de tehnici de laborator de bacteriologie BK” – Daniela Homorodean, Olga Moldovan, Daniela Diculencu, Grațiela Chiriac, Ionela Muntean, 2005, pag. 18

Notarea rezultatelor parcurgerii culturilor trebuie să se facă în mod standardizat. Rezultatul pozitiv trebuie să fie notat cu pix rosu:

trebuie să se noteze, la începutul fiecărei pagini din registru data controlului la 21, 30, 45 și 60 de zile și o săgeată trasată cu pixul să arăte controalele realizate (această săgeată se prelungește pe măsură ce se mai realizează o citire);

nu vor exista spații necompletate;

se menționează creșterea la data controlului notând pentru fiecare tub în parte, în dreptul săgeții corespunzătoare;

tubul care este contaminat se va nota cu C/data contaminării, pentru cele care nu sunt contaminate se va trasa săgeți care va indica faptul că se incubează în continuare.

Se scrie NEGATIV doar la citirea la 60 de zile. Până la data citirii de la 60 de zile cultura va fi ”în observație” (tabelul 2.3).

Tabelul 2.3.

Exemple de interpretare a rezultatelor culturii

Sursă: ”Îndrumar de tehnici de laborator de bacteriologie BK” – Daniela Homorodean, Olga Moldovan, Daniela Diculencu, Grațiela Chiriac, Ionela Muntean, 2005, pag. 31.

CAPITOLUL III

CONDIȚIILE GENERALE ÎN CARE S-AU EFECTUAT CERCETĂRILE

3.1. AMPLASAREA EXPERIENȚELOR

Studiile au fost efectuate in cadrul Laboratorului de bacteriologie al Spitalului dePneumoftiziologie „Izvoru”.

DESCRIERE Spital

3.2. CONDIȚII DE PRELEVARE A PROBELOR

3.2.1. Condiții speciale de recoltare și păstrare a diferitelor tipuri de produse patologice.

Zona de recoltare va fii amenajată specific (camere ori boxe de recoltare), bine ventilată (fereastră ori exhaustor), dotată cu lămpi cu raze ultraviolete și prevăzută cu grup de aerosoli. Este obligatoriu ca acest spațiu să existe atât în spitale cât și în afara acestora. În locurile în care nu este prevăzută camera de recoltare corespunzătoare specificațiilor de mai sus, este preferabil ca recoltarea să se efectueze în aer liber.

Cea mai bună este recoltarea matinală, înainte de masă sau luării medicamentelor, acestea dând cea mai înaltă rată de pozitivitate în diagnosticul tuberculozei pulmonare, chiar și la pacienții care tușesc și expectorează puțin.

Șansa depistării bacilului acido-alcoolo rezistent (BAAR) crește dacă se examinează 2-3 eșantioane de spută recoltate pe o perioadă de 24-48 ore.

Dintr-un material recent eliminat din arborele bronșic se alcătuiește un produs patologic adecvat , în cantitate minimă de secreție orală sau nazală. O calitate satisfăcătoare necesită prezența unui material mucopurulent sau mucoid în cantitate de minim 1-3 ml.

Transportul către laborator trebuie să se facă imediat după recoltare. Sputa subtire, clară sau secrețiile nazo-faringiene reprezintă o valoare diagnostică scăzută. Aceste produse se prelucrează doar în situații speciale, atunci când există suspiciune mare pentru tuberculoză sau când pacientul nu poate expectora, asta se face doar la cererea clinicianului.

Procedura corectă de recoltare a sputei:

Pacientului i se explică motivul recoltării sputei.

Pacientul trebuie să își clătească gura cu apă înainte de a expectora (pentru îndepărtarea resturilor de mâncare sau a bacteriilor infectate).

Pacientul trebuie să inspire adânc de 2 ori, să-și țină respirația câteva secunde după fiecare inspir și după aceea să expire lent. După al treilea inspir va expira cu forță și va încerca să tușească. Din această manevră va ieși un produs patologic din profunzimea plămânilor. Bolnavul poate acum să expectoreze, colectând cu foarte mare grijă sputa în recipientul special.

Dacă sputa este insuficientă cantitativ, pacientul trebuie să expectoreze din nou până ce se obține rezultatului dorit (la unii pacienți este nevoie de timp mai îndelungat să se facă această manevră).

Chiar dacă nu se obține nici o probă, recipientul este deșeu infecțios.

Dacă recoltarea s-a făcut corect, se asigură că recipientul este bine închis și se etichetează corect (pe corpul recipientului și nu pe capac), cu datele complete ale pacientului.

La sfârșitul acțiunii se spală bine mâinile cu apă și săpun.

Se va da un alt recipient pacientului în care acesta a doua zi, imediat după trezirea de dimineață, trebuie să își recolteze singur încă o spută.

Pacientului trebuie învățat cum se închide ermetic recipientul.

Se învață pacientul să aducă proba cât mai repede la laborator.

Variante de recoltare acceptate:

Sputa matinală, se face în primele 1-2 ore de la trezire – procedeu de elecție în staționare sau la domiciliul pacientului (recoltarea va fi supravegheată de personalul medical);

Sputa se colectează în interval de 12-24 de ore;

Sputa va fi expectorată pe loc cu ocazia consultului medical (fig. 3.1).

Figura 3.1. Recoltarea sputei

Sursă: http://www.sfatulmedicului.ro/galerii-foto/tuberculoza-infectie-cauzata-de-bacilul-koch_227

Cele 3 eșantionane de spută necesare la momentul ”0” pot fi recoltate în una dintre variantele următoare:

3 spute matinale în 3 zile consecutive;

2 spute matinale recoltate sub supraveghere medicală în zile consecutive + o spută colectată in 12-24 de ore;

2 spute recoltate pe loc (la 1-2 ore interval una de alta) + o spută colectată in 12-24 de ore;

3 spute în aceeași zi la interval de 3-4 ore.

Alte tehnici de recoltare a sputei

Tubajul gastric – este recomandat la persoanele suspecte de tuberculoză, dar cu examen negativ al sputei, precum și la persoanele care nu pot expectora sau posibil, sa înghită sputa (copii, femei).

Sonde Nelaton (la copii) sau sonde Einhorn (la adulți) – se mai numește și aspirat gastric – se aspiră conținutul stomacului dimineața, dacă volumul de lichid recoltat este redus, se introduc în sondă 5-10 ml ser fiziologic la copii, dar în cazul adulților 20-30 ml ser fiziologic. Este recomandată utilizarea sondelor de unică folosință.

Aspiratul bronșic , precum și lavajul bronho-alveolar – sunt aplicate numai în spitalele care dispun de o competență medicală corespunzătoare, precum și instrumentele necesare.

Recoltarea urinii

Înainte de recoltare cu 24-48 ore se va utiliza un regim hiposodat, adică se va reduce cantitatea lichidurilor ingerate, precum și suspendarea administrării de antibiotice, vitamina C și aspirină;

Înainte de recoltare cu 48-72 ore se va întrerupe tratamentul anti-tuberculoză.

Urina eliminată dimineața se recoltează. Se procedează astfel: după igiena riguroasă a organelor genitale, se aruncă primul jet de urină, apoi se colectează toată urina într-un balon steril de 250 ml, care se pune în frigider, la temperatura de 4°C (fig. 3.2).

Figura 3.2. Pahar de urina steril

Sursă: http://www.montigen.ro/?attachment_id=20949

La fel se va proceda și în dimineața zilei următoare, apoi ambele baloane sterile vor fi transportate, în cel mai scurt timp către laborator pentru a fi prelucrate. La bărbații care sunt suspecți de tuberculoză genitală, în afară de tehnica recoltării a urinii, se poate recolta în eprubete sterile lichidul spermatic după masaj prostatic. La femeile care sunt suspectate de tuberculoză genitală, se folosesc produsele recoltate de medicul ginecolog, precum sânge menstrual (recoltat în cantitate de 5-10 ml la care se va adăuga 2 ml apă distilată), secreție vaginală, exudate prelevate prin puncție de parametru, produs de reclaj uterin.

Toate produsele, fie că sunt făcute pentru femeile sau pentru bărbații suspectati cu tuberculoză genitală, vor fi trimise imediat către laborator, unde vor fi prelucrate fără întârziere.

Metode speciale de prelevare: Aceste moduri de prelevare se folosesc doar în cazul în care pacientul nu expectorează corect, însă el este suspect de tuberculoză pulmonară activă.

3.2.2. Transportul și conservarea produselor patologice

Șansele evidențierii micobacteriilor din produsele biologice sunt reduse de prelungirea intervalului recoltare-prelucrare. Riscul uscării produsului crește cu cât intervalul este mai lung, compromițându-se viabilitatea bacililor (culturi fals negative) și colorabilității lor (pierderea acido-alcoolo-rezistenței), precum și contaminarea lor cu germeni din microbiota indigenă cu proliferare rapidă (fiind prezenți constant în unele produse ca și sputa sau urina), fie cu germenii din mediul extern. Închiderea imperfectă a recipientelor poate duce la o degradare prelungită, expunerea la lumina solară sau la raze ultraviolete (UV), temperatura ridicată a mediului ambiant (în sezonul cald). Dacă prelucrarea produsului patologic nu este făcută imediat după recoltare , acesta se menține la frigider. Nu se acceptă păstrarea la termostat. Se admite cel mult menținerea la temperatura camerei, la întuneric, pentru cel mult câteva ore.

De-a lungul timpului s-a observat că întârzierea prelucrării produselor patologice, influențează rezultatul examenului de laborator după o perioadă de 3-5 zile. Nu se va recurge la măsuri de prevenire a degradării produselor decât atunci când se prevede că transportul se va desfășura pe o perioada de mai multe zile, în special în sezonul cald.

Conform cerintelor legislației în vigoare, transportul probelor biologice este responsabilitatea celui care organizează expedierea.

Pentru a nu se produce scurgeri, probele biologice trebuie ambalate corespunzător, pentru a rezista la șocuri, schimbări de presiune sau alte incidente ce pot apărea în cursul manevrării lor, în timpul transportului. Pentru aceasta se utilizează cutii de transport confecționate special, poziționate vertical, cu o capacitate de 20-30 de recipiente. Capacul cutiei să fie bine fixat și să aibă un mecanism de închidere (încuiere). În timpul transportului, probele trebuie menținute la rece și la adăpost de lumină, pe cât posibil.

Formularele de solicitare a examenului bacteriologic însoțesc cutia, însă nu se introduc în interiorul ei. În afara de formularele de solicitare, cutiile pentru transportul produselor sunt însoțite de o listă care să permită identificarea pacienților și a probelor acestora.

Înainte ca produsele să fie expediate, trebuie să ne asigurăm că sunt respectate următoarele conditii:

numărul de probe biologice din cutie să corespundă cu cel de pe lista de identificare;

numărul de identificare de pe fiecare recipient să corespundă cu numărul de identificare de pe lista de însoțire;

lista trebuie să conțină datele necesare pentru fiecare pacient, data expedierii și datele despre unitatea sanitară expeditoare.

Dacă transportul durează mai multe zile, în special în sezonul cald, este indicat să se adauge peste produsul patologic proaspăt, un volum egal de soluție apoasă 1% de clorură cetyl-piridinium – 1 g + NaCl – 2 g + apă distilată – 100 ml.

Mycobacterium tuberculosis supraviețuiește în aceste condiții cel puțin 7 zile. Dacă produsul este prelucrat la interval scurt după prelucrare nu este necesară adăugarea de conservant.

3.3. STUDII EFECTATE ÎN CADRUL LABORATORULUI DE BACTERIOLOGIE AL SPITALULUI DE PNEUMOFTIZIOLOGIE „IZVORU”

În diagnosticul bacteriologic al tuberculozei, cultivarea este o metodă de bază. Prin cultură se poate determina viabilitatea microorganismelor. Cultivarea permite atât identificarea bacililor tuberculoși, cât și izolarea lor, confirmând etiologia și activitatea bolii. De asemenea, testarea chimiosensibilității germenilor este premisa prin obținerea coloniilor izolate. Este o metodă destul de sensibilă, cu o limită de 10-100 bacili/ml produs (față de 5.000-10.000 în cazul frotiului direct), dar în același timp o metodă complexă și laborioasă care nu poate fi corect și eficient aplicată numai în laboratoarele de specializare.

Prin detectarea cazurilor cu microscopie negativă crește numărul de cazuri confirmate bacteriologic cu 30-50%, cele cu o cultură pozitivă, însă trebuie să avem în vedere că rezultatul este obținut destul de târziu (circa 3-8 săptămâni).

Necesitatea de a se pregăti principalul produs patologic, reprezintă un dezavantaj al culturii, prin omogenizare/decontaminare, în partea atenuată, printr-o tehnică exactă și procedee speciale are loc pierderea micobacteriilor viabile. Un dezavantaj în cultura clasică, reprezintă întârzierea de câteva săptămâni (3-8) pentru a se obține rezultatul.

Izolarea microbacteriilor din spută, prototip al produselor patologice infectate cu flora microbiană ingienă și neomogene, necesită următoarele etape:

Omogenizarea/decontaminarea urmată sau nu de concentrarea germenilor prin centrifugare (pretratarea sputei);

Însămânțarea pe medii de cultură, incubarea la termostat și controlul creșterii;

Notarea și interpretarea rezultatelor.

S-au utilizat agenții chimici care uniformizează sputa prin separarea structurilor sale organice (mucus, fibrină, detritus) și simultan, distrug flora microbiană asociată prin produs. O bună parte dintre microbacterii sunt distruse, deci efectul bactericid al substanțelor decontaminate nu este strict selectiv. Acest efect se schimbă în funcție de agentul chimic utilizat, intervalul contactului cu germenii și condițiile centrifugării.

CAPITOLUL IV

REZULTATE OBȚINUTE

Studiile efectuate in cadrul Laboratorului de bacteriologie al Spitalului de Pneumoftiziologie „Izvoru” au vizat incidenta bolii de tuberculoza pe parcursul a 5 ani (2009, 2010, 2012, 2013, 2014). Izolarea microbacteriilor s-a realizat din spută, prototip al produselor patologice infectate cu flora microbiană ingienă și neomogene prin:

Omogenizarea/decontaminarea urmată sau nu de concentrarea germenilor prin centrifugare (pretratarea sputei);

Însămânțarea pe medii de cultură, incubarea la termostat și controlul creșterii;

Notarea și interpretarea rezultatelor.

In urma examenului bacteriologic a probelor biologice rezultatele au fost dupa cum urmeaza:

Bacilii acido-alcoolo rezistenți (BAAR) au o lungime aproximativă de 1-10 µm și apar ca bacili subțiri drepți ori curbați. În colorația Ziehl-Neelsen, bacilii acido-alcoolo rezistenți (BAAR) apar ca bacili roșii, drepți ori puțin curbați, uneori cu structură granulară, izolați, în perechi sau grupați, remarcându-se clar pe fondul albastru al frotiului (fig. 4.1).

Figura 4.1. Mycobacterium tuberculosis într-un produs patogen (spută)

În unele cazuri bacteriile pot avea zone colorate foarte intens care apar ca mărgelele sau pot avea zone mai colorate și zone mai puțin colorate alternând, conferind un aspect dungat.

În colorația cu fluorocromi, dacă s-a folosit auramina-rhodamina, bacilii apar colorați în galben strălucitor pe fondul întunecat al preparatului. Unele microorganisme, altele decât micobacteriile, pot avea diverse grade de acido-alcoolo rezistență. Între acestea se numără Rhodococcus spp., Nocardia spp., Legionella spp. și chisturile de Criptosporidium și Isospora spp. .Micobacteriile care se multiplică rapid pot prezenta variații în ceea ce privește rezistență la decolorarea cu o soluție de acid-alcool.

În fiecare zi s-au colorat cate 2 frotiuri de control, unul negativ pentru bacilul acido-alcoolo rezistent (BAAR) și unul pozitiv (fig. 4.2), cu atăt mai mult dacă în laborator se prelucrează mai puțin de 10 produse patologice pe zi.

Figura 4.2. Bacili acido-alcoolo rezistenti (BAAR), examen microscopic pozitiv

Pentru evaluarea incidentei bolii de tuberculoza pe parcursul a 5 ani s-au utilizat frotiuri colorate Ziehl-Neelsen si au fost examinate culturile obtinute pe medii culturi de mediu Löwestein Jensen si culturi BK. Astfel, in perioada ianuarie-iunie a anului 2009 au fost investigate un număr total de 3426 de produse patologice din care, la examenul direct, au fost pozitive 565 (16,4%), iar în cultura B.K. au fost pozitive 798 (23,29%) (fig. 4.3).

Figura 4.3. Procentul de probe pozitive in anul 2009

Figura 4.4. Cultura BK – martor negativ (stanga) si proba pozitiva (dreapta)

S-a constatat de asemenea, o creștere a numărului pacienților cu tuberculoză pulmonară (tabelul 4.1).

Tabelul 4.1

Frotiuri pozitive obtinute pe mediul BK, examinate în cursul anului 2009

În aceeași perioadă a anului 2010 la examenul microscopic au fost examinate un total de 2993 frotiuri din care 596 (20%) au fost pozitive (fig. 4.2).

Figura 4.2. Procentul de probe pozitive in anul 2010

Dintr-un număr de 2993 culturi de mediu Löwestein Jensen 704 (23,52%) au fost pozitive (tabelul 4.2).

Tabelul 4.2.

Frotiuri pozitive obtinute prin coloratia Ziehl-Neelsen și examinate în cursul anului 2010

În perioada ianuarie-decembrie 2012 în cadrul laboratorului de bacteriologie al Spitalului de Pneumoftiziologie Izvoru, la examenul microscopic s-au realizat un total de 5703 frotiuri, din care 935 (16,3%) au fost pozitive.

Dintr-un număr de 5703 culturi de mediu Löwestein Jensen 1155 (20,2%) au fost pozitive.

Tabelul 4.3.

Frotiuri colorate Ziehl-Neelsen și examinate în cursul anului 2012

Figura 4.3. Frotiuri pozitive

Tabelul 4.3.

Probe pozitive obtinute pe mediul BK, examinate în cursul anului 2012

Figura 4. 4. Culturi BK pozitive

În perioada Ianuarie-Decembrie 2013 în cadrul laboratorului de bacteriologie al Spitalului de Pneumoftiziologie Izvoru, la examenul microscopic s-au efectuat un total de 4839 frotiuri, din care 746 (15,4%) au fost pozitive. Dintr-un număr de 4839 culturi de mediu Löwestein Jensen 1050 (21,6%) au fost pozitive.

Tabelul 4.4.

Frotiuri colorate Ziehl-Neelsen și examinate în cursul anului 2013

Figura 4. 5. Frotiuri pozitive

Tabelul 4.5.

Frotiuri pozitive obtinute pe mediul BK, examinate în cursul anului 2013

Figura 4.6.

În perioada Ianuarie-Decembrie 2014 în cadrul laboratorului de bacteriologie al Spitalului de Pneumoftiziologie Izvoru, la examenul microscopic s-au realizat un total de 5091 frotiuri, din care 813 (15,9%) au fost pozitive. Dintr-un număr de 5091 culturi de mediu Löwestein Jensen 982 (19,2%) au fost pozitive.

Tabelul 6.7.

Frotiuri colorate Ziehl-Neelsen și examinate în cursul anului 2014

Figura 6.7. Frotiuri pozitive

Tabelul 6.8.

Figura 6.8. Culturi BK pozitive

A SE TRECE nr. Figurilor si tabelelor in text. Pana in 2010 le-am pus eu, cu explicatiile de rigoare pentru fiecare figura si tabel – asa cum trebuie, dupa care nu am mai inteles cate figuri si tabele sunt pentru fiecare an!!!!

Tuberculoza reprezintă o boală provocată de un microb (bacilul Koch). În principiu afectează plămânii, dar există riscul de a afecta și alte organe, precum ganglioni, rinichi, oase ori meninge. Tuberculoza este una dintre bolile cele mai vechi cunoscute. Când medicamentele antituberculoase au fost descoperite, evoluția tuberculozei s-a schimbat radical, devenind o boală infecțioasă vindecabilă. Bacilul Koch a fost descoperit în data de 24 martie 1882, de către Robert Koch, așadar de aceea în fiecare an, pe data de 24 martie sărbatorim Ziua Mondială a Tuberculozei. Tuberculoza este întâlnită mult mai frecvent în România decât în alte țări Europene, iar cel mai des întâlnim tineri bărbați afectați. Calea de transmitere este cea aeriană : pacientul bolnav de tuberculoză pulmonară transmite microbul prin tuse către persoanele din jurul său. Se spune că tuberculoza este boala cu efect întârziat, deoarece cei care inhalează acest microb nu se îmbolnăvesc peste noapte, ci după luni-ani de zile, pentru că în plămâni, bacilii sunt înconjurați de o ”barieră”de protecție care oprește dezvoltarea bolii, după o perioadă de timp acea ”barieră” poate dispărea, datorită scăderii imunității (organism slăbit), abia atunci bacilul provoacă tuberculoza, pe când copii se pot îmbolnăvi direct, fără o astfel de perioadă de timp.

CAPITOLUL V

CONCLUZII

Tuberculoza este întâlnită mult mai frecvent în România decât în alte țări Europene, iar cel mai des întâlnim tineri bărbați afectați.

In urma studiului efectuat la Spitalului de Pneumoftiziologie „Izvoru”, privind incidenta bolii de tuberculoza pe parcursul a 5 ani (2009, 2010, 2012, 2013, 2014), utilizand tehnicile de izolare si metodele de coloratie specifice, concluziile au fost urmatoarele:

in perioada ianuarie-iunie a anului 2009 au fost investigate un număr total de 3426 de produse patologice din care, la examenul direct, au fost pozitive 565 (16,4%), iar în cultura B.K. au fost pozitive 798 (23,29%). Dintr-un număr de 5703 culturi de mediu Löwestein Jensen 1155 (20,2%) au fost pozitive.;

În aceeași perioadă a anului 2010 la examenul microscopic au fost examinate un total de 2993 frotiuri din care 596 (20%) au fost pozitive. Dintr-un număr de 2993 culturi de mediu Löwestein Jensen 704 (23,52%) au fost pozitive;

În perioada ianuarie-decembrie 2012 în cadrul laboratorului de bacteriologie al Spitalului de Pneumoftiziologie Izvoru, la examenul microscopic s-au realizat un total de 5703 frotiuri, din care 935 (16,3%) au fost pozitive;

in perioada ianuarie-decembrie 2013 în cadrul laboratorului de bacteriologie al Spitalului de Pneumoftiziologie Izvoru, la examenul microscopic s-au efectuat un total de 4839 frotiuri, din care 746 (15,4%) au fost pozitive. Dintr-un număr de 4839 culturi de mediu Löwestein Jensen 1050 (21,6%) au fost pozitive;

În perioada ianuarie-decembrie 2014 în cadrul laboratorului de bacteriologie al Spitalului de Pneumoftiziologie Izvoru, la examenul microscopic s-au realizat un total de 5091 frotiuri, din care 813 (15,9%) au fost pozitive. Dintr-un număr de 5091 culturi de mediu Löwestein Jensen 982 (19,2%) au fost pozitive.

Sputa a reprezentat produsul patologic pentru analiza tuberculozei pulmonare.

Examenul prin cultură – pentru diagnosticul bacteriologic al tuberculozei, cultivarea pe medii specifice a fost metoda de bază. Ea este necesară pentru evidențierea viabilității organismelor. Prin această metodă se pot evidenția bacilii tuberculoși, precum și izolarea lor, confirmându-se etiologia și activitatea lor.

ANEXE

REȚELE DE COLORANȚI

Colorația Ziehl-Neelsen

Fucsina

Soluția 1

Fucsina bazică ………………………………………………………….3g

Etanol 95% ……………………………………………………………..100ml

Se topește fucsina în etanol.

Soluția 2

Fenol cristalizat ………………………………………………………..5g

Apă distilată …………………………………………………………….100ml

Se topește fenolul în apa distilată (iar dacă este nevoie se va încălzi usor).

Se utilizează numai fenol de culoarea albă. Fenolul care are culoare brună nu mai poate fi utilizat.

Pentru a evita dizolvarea repetată a fenolului se pregătește fenol lichefiat astfel:

se va încălzi în baie de apă, până la dizolvarea completă, 1 kg fenol cristale;

se va adauga 100 ml apă distilată;

se va menține la temperatura camerei;

1 ml fenol lichefiat cuprinde 1 g fenol.

Fucsina fenolată, soluție de lucru – se va combina 10 ml din soluția 1 cu 90 ml din soluția 2 și se va strânge într-o sticlă brună la culoare. Sticla se va eticheta cu numele reactivului, data preparării și data expirării. Poate fi menținută la temperatura camerei timp de 6-12 luni.

Amestecul decolorant

Acid clorhidric concentrat ………………………………………….3ml

Etanol ………………………………………………………………………97ml

Se pune încet acidul peste alcool. Niciodată nu vom proceda invers, adică niciodata nu se pune alcoolul peste acid ! Amestecul va răspândi căldură.

Se pune într-o sticlă de culoare brună.

Sticla se notează cu numele reactivului, data preparării și data expirării.

Poate fi menținută la temperatura camerei timp de 6-12 luni.

Albastru de metilen

Albastru de metilen ……………………………………………..0,3g

Apă distilată ……………………………………………………….100ml

Se topește albastru de metilen în apa distilată și se menține în sticla brună la culoare.

Sticla se notează cu numele reactivului, data preparării și data expirării. Poate fi menținută la temperatura camerei timp de 6-12 luni.

Colorația cu aurină-rhodamină

Soluția de auramină-rhodamină

Auramină …………………………………………………………………0,1g

Rhodamină ………………………………………………………………0,01g

Apă distilată …………………………………………………………….100ml

Se topește auramina și rhodamina în apa distilată.

Soluția se menține într-o sticlă de culoare brună, dar mai întâi se filtrează prin hârtie de filtru.

Sticla se notează cu numele reactivului, data preparării și data expirării.

Poate fi menținută la temperatura camerei timp de 1 lună.

Amestecul decolorant – la fel ca și Colorația Ziehl-Neelsen

Permanganat de potasiu

Permanganat de potasiu …………………………………………… 0.5g

Apă distilată ……………………………………………………………. 100ml

Se topește permanganatul de potasiu în apa distilată și se menține în sticla de culoare brună. Sticla se notează cu numele reactivului, data preparării și data expirării. Poate fi menținută la temperatura camerei timp de 1 lună.

Pentru înlăturarea fluorescenței preparatului poate fi utilizată soluția de albastru de metilen pregătită după rețeta de la colorația Ziehl-Neelsen, însă utilizarea acestei alternative ridică costul examinării.

BIBLIOGRAFIE

Cornelia Diaconescu, Daniela Homorodean, M. I. Popa, Dorina Bănică, O. Bercea, 1998, „Ghid de diagnostic bacteriologic al tuberculozei”, 1-120, Atelierul Tiografic al Centrului de Calcul și Statistică Sanitară și Documentare Medicală, Ministerul Sănătății, ISBN 973-0-00655-5.

Popa L.G., Popa M.I., 1999, „Identificarea bacililor acido-alcoolo rezistenți” în tratat de Microbiologie Clinică, D. Buiuc M. Neguț, ed., Ed. Medicală, 861-876, ISBN 973-39-0398-1.

Popa L.G., Popa M.I., Ștefan M., 2004, „Diagnosticul de laborator în infecțiile produse de microorganisme din genul Mycobacterium, în Diagnosticul de laborator în microbiologie”, Mircea Ioan Popa, ed., Ed. Infomedica, 208-210, ISBN 973-7912-37-3.

„Programul National de Control al Tuberculozei 2001” – 2005

”Îndrumar de tehnici de laborator de bacteriologieB.K”., Daniela Homorodean, Olga Moldovan, Daniela Diculescu, Grațiela Chiriac, Ionela Muntean, Revizie tehnică de specialitate conferențiar Dr. Mircea Ioan Popa.

”Ghid de Diagnostic Bacteriologic al Tuberculozei” – Cornelia Diaconecu, dr. Daniela Hormorodean, dr. Mircea Ioan Popa București: Ministerul Sănătății – 1998

http://ro.wikipedia.org/wiki/Tuberculoza

http://www.pneumo-iasi.ro/articole/curs1.pdf

A se trece restul surselor online!!