Șef lucrări dr. farm. Sebastian NEMETH [309991]

UNIVERSITATEA DIN ORADEA
FACULTATEA DE MEDICINĂ ȘI FARMACIE
SPECIALIZAREA FARMACIE

CROCUS SATIVUS

ANALIZĂ FARMACOgNOSTICĂ

Coordonator:

Șef lucrări dr. farm. Sebastian NEMETH

Student: [anonimizat]

2020

Partea I – Partea generală

I.1. INTRODUCERE

I.1.1. [anonimizat], cele mai cunoscute dintre acestea fiind: antioxidantă, aromatizantă, antiinflamatoare, antibiotică, cardio-protectoare, hepatoprotectoare și afrodisiacă.

Această lucrare este compusă din parte generală și contribuții personale.

[anonimizat], [anonimizat], [anonimizat], produse farmaceutice.

Partea a II-a, [anonimizat] (Bihor), respectiv a stigmatelor provenite de la o specie achiziționată de la Sc.Tomiris.SRL, import Spania. Etapele analizei cuprinzând: [anonimizat], analiza preliminară a [anonimizat] , [anonimizat].

Fitoterapia este terapia ce folosește plantele ca mijloc de tratament și este cea mai veche dintre toate. Încă din timpuri străvechi omul a apelat la darurile naturii pentru a-și alina suferința și o [anonimizat].

[anonimizat], astfel că în zilele noastre beneficiile acestora au devenit certe ajutând ca fitoterapia să recâștige teritoriul pierdut.

[anonimizat], [anonimizat] (fie că e vorba de planta întreagă sau de o anumită parte a ei: rădăcină, frunze, flori), [anonimizat]. [anonimizat], fito­terapia a rămas de-a lungul timpului cea mai curată.

Șofranul este o [anonimizat] o culoare distinctivă. Acesta conține compuși antioxidanți care contribuie la reducerea riscului anumitor afecțiuni cronice care apar din cauza stresului oxidativ.

Cercetările și îndelunga utilizare de-a [anonimizat]. Șofranul este în general sigur pentru majoritatea oamenilor și este foarte simplu să îl introduci în dietă.

I.1.2. Scurt istoric

Istoria cultivării șofranului datează de peste 3.000 de ani. Planta sălbatică de la care provine șofranul (Crocus sativus) se numea Crocus cartwrightianus. Oamenii de știință consideră că primul document care menționează șofranul este o [anonimizat] î.Hr., scrisă pe vremea Ashurbanipalului (Fig.I.1).

De atunci, s-au găsit dovezi pentru utilizarea șofranului în tratamentul a aproximativ 90 de boli. [3] Papirusul Ebers (cca 1550 î.Hr.) menționează șofranul ca ingredient într-o cură pentru problemele renale[44], a fost recomandat ca adaos la fiecare masă ca „un medicament cardiac înveselitor” dar cu un avertisment potrivit căruia cantitățile excesive au acționat ca deprimant al apetitului[45], deși o cantitate rezonabilă ar stimula pofta de mancare și ar diminua durerile de cap și mahmureala, ca remediu pentru infecțiile catarale, stările ușor anxioase, tratamentul hepatomegalia[46], carminativ, diaforetic și emenagog [47].

Fig.I.1. [https://saffronwaldenmuseum.swmuseumsoc.org.uk/saffron/ – This entry was posted in Collections, Human History, Natural History on November 14, 2017 by Museum Editor.]

În Europa, cultivarea șofranului a scăzut semnificativ în urma căderii Imperiului Roman și a fost reintrodus atunci doar când civilizația islamică „Al-Andalus” s-a răspândit în Spania, Franța și Italia. [31] În secolul al XIV-lea, perioada „Morții Negre” cererea de preparate medicinale pe bază de șofran s-a ridicat, astfel acesta s-a din țările sudice și mediteraneene [32], cum ar fi Rodos.

Cultivarea și comerțul s-au extins rapid iar falsificarea pulberii de șofran a adus la apariția „codului Safranschou”, în baza căruia falsificatorii erau amendați, închiși sau chiar executați. [34] Imediat după aceea, cultivarea șofranului s-a răspândit în toată Anglia, în special Norfolk și Suffolk. Orașul Essex din Saffron Walden, numit pentru noua sa cultură de specialitate, a apărut ca principal centru de creștere și comercializare a acestuia pe teritoriul Angliei.

Europenii au adus șofranul în America când membrii imigranți ai Bisericii Schwenkfelder au părăsit Europa[38]. Până în 1730, olandezii din Pennsylvania cultivau șofranul în tot estul regiunii, iar coloniile spaniole din Caraibe au cumpărat cantități mari din acest nou șofran american, iar cererea mare a asigurat ca prețul de listă al șofranului la schimbul de mărfuri din Philadelphia să fie egal cu cel al aurului [39].

I.2. DATE BOTANICE ASUPRA SPECIEI Crocus sativus

I.2.1. Încadrare sistematică

I.2.2. Caractere morfologice

Bulbo-tubercul globulos (Fig.I.3.A), aplatizat la bază; cu diametrul aproximativ de 5cm, prezintă tunici fibroase cu fibrele zvelte și fin reticulate, extinse la vârful acestuia până la 5cm lungime cu un număr de 3–5 catafile albe, membranoase.

Secțiunea transversală a bulbo-tuberculului prezintă la exterior teci uscate (teci protectoare) și în interior celule parenchimatice de depozitare ce conțin numeroase granule de amidon.

Frunzele (Fig.I.3.B) sunt aciculare, având o lungime de 5-11cm, 1,5-2,5 mM lățime, verzi, erecte și glabre. Examinate microscopic, acestea, prezintă: un strat de ceară pe ambele fețe ale frunzei menită a împiedica pierderile de apă în urma procesului de transpirație, stomate așezate în palisadă și cloroplaste cu rol în fotosinteză.

Florile (Fig.I.3.C) sunt pubescente apar toamna, din septembrie până în noiembrie, cu o lungime de 1-4cm , de culoare albastru-violet, cu vene mai închise, având un parfum penetrant. Bracteele sunt prezente, foarte inegale, de culoare albă, membranoase, cu vârfuri îndepărtate. Tubul periant este lung de 4-5(–8)cm; segmente inegale, de 3,5–5cm lungime, 1–2cm lățime, oblanceolate sau obovate, obtuze. Filamente de 7–11 mM lungime, purpurii, glabre; antere de 15-20 mM lungime, galbene. Stilul împărțit în 3 ramuri claviforme, roșu închis, fiecare ramură lungă de 25–32 mM, care depășește mult anterele și cel puțin jumătate din lungimea segmentelor de periant, care apare într-un punct mult sub baza anterelor din gâtul florii.

Florile sunt sterile și nu produc semințe fertile datorită formei triploide ceea ce înseamnă că trei seturi omoloage de cromozomi alcătuiesc complementul genetic al fiecărui specimen; C. sativus poartă opt corpuri cromozomiale pe set, reprezentând 24 în total.

(bibliografie- drive, carte sofran)

I.2.3. Date fitochimice asupra speciei Crocus sativus

Pot fi definite ca tetraterpenoide alcătuite din 8 unități de izopren (40 atomi de carbon.

Denumirea lor a fost stabilită de Tvet (1911) și derivă de la numele plantei Daucus carota și sufixul specific lanțurilor polienice „en”. [FCZ]

Sunt pigmenți vegetali cu rol de absorbție și transmisie a energiei luminoase (450-500nm) în procesul de fotosinteză, precum și în protecția foto – oxidativă a clorofilelor, enzimelor, citocromilor, vitaminelor sau a altor pigmenți.

Se regăsesc cu exclusivitate în regnul vegetal dispersate în diferite organe (flori, frunze, fructe, rădăcini), la nivelul cloro și cromoplastelor: Calendula officinalis, Arnica montana, Tagetes patula, Verbascum sp, Urtica dioica, Capsicum annuum, Solanum lycopersicum, Hippophae rhamnoides, Daucus carota.

Biosinteză – Primul pas și totodată cel mai important în biosinteza carotenoidelor îl reprezintă cel al formării fitoenelor.

Fig.I.4

Șofranul se caracterizează printr-o combinație tipică între culoarea roșu-portocalie intensă (carotenoide), gustul amar (picrocrocina) și mirosul aromatic (safranal).

Pigmenții carotenoidici reprezintă o clasă a pigmenților grași solubili care se găsesc în principal în plante, alge și bacterii fotosintetice, unde ei au un rol critic în procesul de fotosinteză. De asemenea, ei apar la unele bacterii nefotosintetice, drojdii si mucegaiuri, unde pot să efectueze o funcție de protecție împotriva daunelor de lumină și oxigen. Deși animalele par a fi incapabile de a sintetiza carotenoide, multe animale încorporează carotenoide din hrana lor. În interiorul animalelor, carotenoidele asigură colorarea favorabilă, care servește ca antioxidanți, și poate fi o sursă pentru activitatea vitaminei A.

Aceștia sunt reprezentați de crocine (Fig.I.5) (carotenoide solubile în apă), glicozide ale carotenoidei crocetină (α-crocetină sau crocetina-I) esterificată cu diverse oze (gențiobioză, glucoză, gențioglucoză și diglucoză). Pe lângă derivații de crocină, șofranul mai conține și alte carotenoide minore (α-caroten, β-caroten, licopen, zeaxantină și mangicrocina un conjugat glicozidic xanton-carotenoid).

Din categoria componentelor chimice importante ale șofranului, responsabile de gustul său amar și aroma specifică sunt monoterpenele, picrocrocina (Fig.I.6.A) și derivatul ei deglicozilat, safranalul (dehidro-β-ciclocitral) (Fig.I.6.B), format în șofran în timpul uscării și depozitării prin hidroliza picrocrocinei, ambele cu importanță farmacologică semnificativă.

Alături de componentele menționate produsul vegetal conține o serie de flavonoide (kaempferol), taninuri, antociani, alcaloizi, saponine, vitamine (în special riboflavină și tiamină), aminoacizi, proteine, amidon, minerale, gume, grăsimi, ceară, uleiuri esențiale și alți compuși chimici. (articol-medicinal uses and pharmacological properties of crocus sativusfarmacologie)

I.2.4. Metode analitice utilizate

I.2.4.1. Extracția Soxhlet

Extracția Soxhlet se aplică, de regulă, probelor solide sau „semisolide”, probe precum plante sau părți din ele, țesuturi animale, sol, cărbune și șisturi sunt mai întâi mărunțite și aduse într-o formă de pulbere foarte fină pentru a mări suprafața de contact în procesul de extracție. Analiții extrași se vor concentra în balonul în care se află solventul de extracție. Această metodă se bazează pe o diferență mare dintre punctele de fierbere ale solventului și cele ale analiților extrași. Pe baza acestei proprietăți extrasul este adus la o temperatură de fierbere a solventului, care va condensa într-un refrigerent și va reveni în cartușul care conține proba de extras. Prin realizarea mai multor cicluri de extracție, randamentul procesului poate fi controlat astfel încât randamentul de extracția să fie maxim.

Fig.I.7. – Aparat Soxhlet

Practic, procedurile de extracție Soxhlet trebuie să cuprindă următoarele etape: uscarea corespunzătoare a probei, dar astfel încât să nu se piardă din cantitatea de analit din probă; mărunțirea acesteia (de obicei prin mojarare) pentru asigurarea unui contact cât mai bun între matricea probei și solvent; estimarea volumului probei (în mL); alegerea cartușului de extracție (se pot folosi cartușe mici, intermediare și cu volum mare de extracție); alegerea solventului potrivit pentru extracție, astfel încât acesta să dizolve cât mai selectiv analiții de interes față de alți componenți din matricea probei; estimarea volumului de solvent utilizat pentru extracție, la care se ține cont și de volumul probei extrase; estimarea timpului de fierbere și de extracție; efectuarea procedurii propriu-zise de extracție, care are o durată funcție de numărul ciclurilor de extracție și a timpului unui ciclu; stoparea procedurii se face atunci când analiții sunt extrași cantitativ, iar o parte a solventului evaporat va rămâne condensat în cartuș (în felul acesta concentrarea este asigurată printr-un volum mai mic de solvent în balonul în care se culege acesta); analiza conținutului extrasului printr-o tehnică analitică adecvată.

(folder licenta carotenoide- Extractie soxhlet)

I.2.4.2. Cromatografia

Cromatografia este o metodă fizică de separare bazată pe distribuția componentelor dintr-un amestec între două faze: una fixă, denumită fază staționară și alta mobilă, ce străbate faza staționară. Faza staționară poate fi un adsorbant solid (cromatografie de adsorbtie), un lichid depus pe suprafața unui suport solid (cromatografie de repartiție), un schimbător de ioni (cromatografie prin schimb ionic) sau un gel (cromatografie prin excluziune sterică).[5]

Termenul de cromatografie, care înseamnă scriere în culori (chrom=culoare în limba greacă) a fost dat de Tvet (1906), cu ocazia separării coloranților din frunze verzi (clorofile, carotenoide), prin adsorbție lichid-solid. Principiul metodei Tvet constă în stabilirea unui echilibru într-un proces cinetic de adsorbție-desorbție între faza solidă fixă și faza lichidă mobilă.

Cromatografia în strat subțire este o tehnică foarte utilizată în separarea și purificarea carotenoidelor. Tehnica de bază a acestei metode a fost descrisă de diferiți autori.[8] gradul de purificare prin această metodă este mult mai mare, comparativ cu cromatografia pe coloană. În funcție de natura carotenoidului se vor alege faza staționară, precum și faza mobilă și sistemul de eluare din plăci.

Materialele biologice ce conțin carotenoide sau soluțiile lor trebuie ferite de acțiunea luminii deoarece prin expunerea carotenoidelor la lumină, în mod deosebit la lumina solară directă sau la lumina UV, se realizează fotoizomerizarea cis-trans. Multe carotenoide sunt termolabile, în special xantofilele, încălzirea lor realizându-se doar în situația când este absolut necesar acest lucru. Separarea carotenoidelor trebuie realizată la temperatura camerei, până la 20℃ și la întuneric. În cazul saponificării la cald, soluțiile trebuie protejate prin utilizarea solvenților cu puncte de fierbere nu foarte ridicate (30-60℃). În prezenta oxigenului (aer) sau a peroxizilor, multe carotenoide pot fi oxidate, ele fiind foarte sensibile la oxigen în stare adsorbită (în cromatograme, pe coloană și pe strat subțire), prin urmare în cromatografia în strat subțire a carotenoidelor trebuie luate anumite precauții și anume: aplicarea rapidă a probei; aplicarea probei la lumina slabă; developarea imediată a cromatogramei; developarea la întuneric a cromatogramei; utilizarea unei atmosfere de azot.

Alegerea solventului

Solvenții utilizați în separarea carotenoidelor prin cromatografie în strat subțire sunt eluanți slabi, cum ar fi eter etilic, benzenul, precum și amestec de solvenți acetona-eter etilic, etanol-eter etilic, acetat de etil-benzen etc. Solvenții care dau o înaltă rezolutie, datorită proprietăților lor, sunt alcoolii terțiari. Cloroformul este în general omis datorită urmelor de acid clorhidric pe care le conține și care pot conduce la transformări ale carotenoidelor. Acidul acetic este utilizat doar în cazul carotenoidelor puternic adsorbite pe adsorbant.

Adsorbanți utilizați pentru cromatografia în strat subțire a carotenoidelor (tabelul I.1.):

Tabel I.1. – Strat adsorbant CSS carotenoide

Detectarea carotenoidelor

Datorită faptului că acești pigmenți sunt colorati, se poate realiza și identificarea vizuală a lor (se poate detecta vizual până la 0,05 g – caroten). Carotenoidele, însă, se decoloreaza rapid pe placa cromatografică, din acest motiv fiind necesară stropirea cromatoplăcii cu o soluție de parafină în eter de petrol [8]. Unele carotenoide carbonilice sau produșii de descompunere oxidativă pot fi identificați cu o soluție de rodamina 1% în acetonă [9] sau prin stropirea cu o soluție de SbCl3 în cloroform. Cea mai sensibilă metodă rămâne totuși identificarea cu vapori de iod, când se formează spoturi de culoare brună, prin această metodă identificandu-se și eventualele impurități. Compușii incolori pot fi detectați prin vizualizarea fluorescenței verde caracteristică la absorbție în ultraviolet. (folder licenta carotenoide Articol METODE DE EXTRACTIE SI SEPARARE A CAROTENOIDELOR DIN PLANTE)

I.2.4.3. Spectrofotometria

Spectrometria în UV-VIS se aplică în domeniul spectral 180-1100nm, deci între ultravioletul apropiat, domeniu în care se obțin mai puține informații structurale (mai ales pentru compușii nesaturați), dar se obțin date importante pentru analiza cantitativă a compușilor organici medicamentoși a unor complecși metalici ai acestora etc. Domeniul UV-VIS este alcătuit de fapt din trei zone spectrale și anume: ultravioletul apropiat, cuprins între 180 și 400 nm; vizibilul, cuprins între 400 și 700nm și infraroșu foarte apropiat, cuprins între 700 și 1100 nm.

Determinările spectrometrice în acest domeniu se bazează pe fenomenul de absorbție a radiațiilor cuprinse în acest domeniu spectral, de către speciile chimice analizate. Prin urmare, determinările în acest domeniu au la bază măsurători de absorbanță (sau transmitanță), cu ajutorul spectrofotometrelor automatizate, inclusiv pentru analiza multicomponent.

Spectrometria UV-VIS este utilizată mai ales pentru determinări cantitative bazate pe absorbția radiațiilor din domeniile menționate mai sus, absorbție care este proporțională cu concentrația analitului, într-un domeniu de concentrații dat, în care există o relație liniară între absorbanță și concentrație. O substanță moleculară aflată într-o soluție, expusă la acțiunea unor radiații din regiunea spectrală UV-VIS, poate absorbi anumite lungimi de undă, când are loc un transfer parțial de energie către moleculele de analit,concomitent cu scăderea intensității radiației incidente(I0). Dacă este absorbită o radiație din domeniul vizibil, soluția devine colorată.

I.2.4.4. Voltametria

Aceasta este o metodă electroanalitică ce necesită o sursă de energie externă care impune soluției de analizat un curent pentru a determina desfășurarea unei reacții electrochimice deoarece aceasta nu are loc spontan,de la sine. Prin aceasta voltametria se deosebește de potențiometrie .

Prin voltametrie și în cadrul acesteia prin polarografie (care este o metodă voltametrică) se pot determina toți cationii, anionii și speciile organice care pot fi oxidați sau reduși electrochimic. În unele cazuri polarografia este preferată spectrometriei de absorbție atomică, deși polarografia este considerată ca fiind puțin demodată. Polarografia rămâne totuși o metodă voltametrică mult utilizată, cu rezultate exacte și precise, în analiza substanțelor medicamentoase.

Voltametria utilizată în analiza cantitativă și numită din acest motiv „voltametrie de dozaj” are ca principiu aplicarea unei diferențe de potențial variabil între un microelectrod indicator (sau de lucru) și un electrod de referință, adesea de Ag/AgCl, introduși în soluția probei în care se produce reacția generală următoare:

Ox+ne- ↔Red

La un moment dat, în timpul reacției, electrodul indicator dobândește un potențial a cărui valoare determină reducerea sau oxidarea analitului (care este un depolarizant).

În acest moment are loc o creștere bruscă a intensității curentului care trece prin circuitul dintre electrozi. Trebuie însă, evitată trecerea oricărui curent prin electrodul de referință, de aceea se utilizează de regulă un al treilea electrod, care este un electrod auxiliar,confecționat din carbon sau un metal nobil. Concomitent se introduce în celula de lucru un electrolit suport care asigură conductivitatea mediului. În aceste condiții se produce microelectroliză de durată scurtă și ea modifică în mică măsură concentrația analitului din probă. Practic se urmărește obținerea unei curbe “ intensitate-potențial”, necesar baleiajului unei tensiuni într-un domeniu de potențial potrivit pentru reducerea sau oxidarea analitului în cauză.

În voltametrie nu se lucrează cu montaje de doi electrozi, caz în care curentul trece prin electrodul de referință, ci cu montaje de trei electrozi și tensiune continuă, caz în care prin electrodul de referință nu trece nici un curent.

În voltametrie se utilizează de regulă următorii electrozi de lucru (indicatori) mai importanți, pentru care se dau și domeniile de potențial potrivite( față de electrodul de referință Ag/AgCl):

– platină, Pt, în domeniul de la 0 la +1,3 V;

– aur, Au, în domeniul de la -0,2 la +1,0 V;

– mercur, Hg, în domeniul de la +0,6 la -1,3 V;

– carbon vitros, în domeniul de la +1,5 la -0,52 V;

Curbele intensitate-potențial permit identificarea analiților prezenți și determinarea concentrațiilor lor, deci dozarea multor metale.

Trebuie menționat faptul că electrozii și mai ales microelectrozii de Pt, Hg și carbon vitros (grafit vitros) sunt cei mai utilizați în prezent. De asemenea trebuie subliniat că domeniile de potențial în care acești electrozi pot funcționa corect depind de electrodul de referință, de electrolitul suport și de pH.

Dintre cei patru electrozi indicatori menționați mai sus, electrodul picătură de mercur este cel mai studiat și mai utilizat. Este vorba în acest caz de micropicături de mercur care constituie partea activă a electrodului, el fiind utilizat în polarografie, tehnică electroanalitică descoperită de Heyrovsky(Premiul Nobel, 1956).

Voltametria puls diferențială

Această tehnică se deosebește de voltametria cu impulsuri normale prin aceea că se fac două măsurători asupra unei picături de mercur-electrod, una înaintea aplicării unui impuls de 50 mV și alta chiar înaintea căderii (desprinderii de capilară) a picăturii

Voltametria impulsională este utilizată ca mijloc de detecție în cromatografia de lichide de înaltă performanță (HPLC) și în electroforeza capilară de înaltă performanță (ECHP) , pentru identificarea mai ales a fenolilor, aminelor aromatice și a tiolilor. Se pot detecta evident numai speciile chimice electroactive.

Pentru detectorii voltametrici au fost concepute și realizate celule miniaturizate pentru a nu dilua separați prin HPLC și ECHP, în care se găsesc trei electrozi și anume un electrod indicator metalic sau de carbon vitros, un electrod de referință (ESC) și un electrod auxiliar.

Acest detector voltametric are o mare sensibilitate față de câteva clase de compuși organici (amine, fenoli, eteri, cetone, olefine, hidrocarburi).

În voltametrie se mai pot utiliza și unii biosenzori cu enzime, care nu sunt de fapt electrozi selectivi, ci „captori”, deoarece se captează oxigen.

(Analiza și controlul medicamentelor Vol.2- Marius Bojiță, Liviu Roman, Robert Săndulescu, Radu Oprean) trimite la Florin Banică

I.2.4.5. Metode de determinare a activității antioxidante

Metoda Follin-Ciocâlteu

Principiul metodei – Determinarea conținutului de polifenoli totali din surse vegetale prin măsurarea densității optice a unui extract primar care prin complexare cu reactivul Folin-Ciocalteu absoarbe în domeniul VIS la lungimea de undă λ = 750 nm.

Pregătire probe – Proba de laborator preluată este păstrată astfel încât să se evite alterarea sau modificarea compoziției. Proba de laborator este pregătită pentru încercare astfel: materialul se cântărește la balanța analitică cu o precizie de 4 zecimale. Se adaugă solvent de extracție 1%HCl în metanol sau etanol 40%. Probele sunt supuse vortexării 5 minute, sonicării 30 minute, centrifugării 15 minute cu 3000 rot/min și filtrării prin hârtie de filtru calitativă. Extractele obținute se etichetează și se păstrează la congelator în vederea determinării.

Calculul și interpretarea rezultatelor – Cantitatea totală de polifenoli se exprimă în raport cu o curbă de etalonare cu standard de acid galic. Pe baza absorbanțelor citite la diferitele concentrații a soluției standard,se construiește curba de etalonare exprimată în mg/100 mL. Pe baza ecuației curbei se determină concentrația de polifenoli din probe.

Y = AX + B

Y = absorbanța citită la spectrofotometru

X = concentratia

A, B = constantele dreptei

Metoda DPPH (http://cercetare.usa mVcluj.ro/ISV/wp-content/uploads/2017/03/PO-1-%E2%80%93-CDS-1-Activiatea-antioxidanta-DPPH.pdf – 23.07.2020)

Principiul metodei – DPPH este o prescurtare comună pentru compusul chimic organic 2,2-difenil-1-picril-hidrazil. Este o pulbere cristalină de culoare închisă compusă din molecule stabile de radicali liberi

Metoda se bazează pe decolorarea radicalului stabil DPPH (2,2-difenil-1-picril-hidrazil), colorat puternic în roșu-purpuriu și având absorbția la 515nm de către substanțe cu caracter antioxidant.

Pregatire probe – Proba de laborator preluată este păstrată astfel încât să se evite alterarea sau modificarea compoziției. Proba de laborator este pregătită pentru încercare astfel: Materialul se cântărește la balanța analitică cu o precizie de 4 zecimale. Se adaugă solvent de extracție 1%HCl în metanol sau etanol 40% . Probele sunt supuse vortexării 5 minute, sonicării 30 minute, centrifugării 15 minute cu 3000 rot/min și filtrării prin hârtie de filtru calitativă. Extractele obținute se etichetează și se păstrează la congelator în vederea determinării.

Calculul și interpretarea rezultatelor – Activitatea antioxidantă se exprimă în raport cu o curbă de etalonare cu standard de trolox. Pe baza absorbanțelor citite la diferitele concentrații a soluției standard,se construiește curba de etalonare cu factorul echivalent µM Trolox. Pe baza ecuației curbei se determină activitatea antioxidantă a probelor.

Y = AX + B

Y = absorbanța citită la spectrofotometru

X = concentrația

A, B = constantele dreptei

I.2.5. Acțiunea farmacologică și utilizări

Al-Snafi, A.E. – The pharmacology of Crocus sativus – A review – IOSR Journal Of Pharmacy (e)-ISSN: 2250-3013, (p)-ISSN: 2319-4219 Volume 6, Issue 6 Version. 3 (June 2016), PP. 08-38

Stanescu U., Hancianu M., Cioanca O., Aprotosoaie A.C., Miron A. – Plante medicinale de la A la Z (editia a III-a) – Editura Polirom, ISBN:9789734672400, 2018

Având ca punct de plecare utilizarea în medicina tradițională a șofranului ca antidepresiv și anticarcinogen, în ultimele decenii s-au intensificat cercetările asupra proprietăților farmacologic ale principiilor active din compoziția acestei plante.

Studiile farmacologice moderne (vivo, vitro), în special pe modele animale, au demonstrat că extractul de șofran sau constituenții săi au următoarele efecte: antidepresive (crocină, safranal – Crocina acționează probabil prin inhibarea recaptării de dopamină și norepinefrină, în timp ce safranalul inhibă repreluarea serotoninei la nivelul sinapsei)[51], antiinflamatorii[10], antitumorale (crocetina, inhibând rata de creștere tumorală la concentrații micromolare și fără afectarea celulelor sănătoase), hepatoprotectoare, asupra afecțiunilor coronariene (scăderea difuzivității oxigenului cauzată de proteina plasmatică crescută și a nivelul de colesterol, reducând severitatea aterosclerozei) [49], antibacteriene (crocetină, safranal)[50], anticonvulsivante[59], tulburări ale metabolismului intermediar (sursă importantă de riboflavină, cu aproximativ 100γ/g.[48]), tonice asupra SNC (îmbunătățire a memoriei) [52-54].

Șofranul ca pigment – pigmentul principal al șofranului este α-crocina, o carotenoidă solubilă în apă se folosea în histologie drept colorant pentru țesutul conjunctiv.[60]

Șofranul ca parfum – Un compus plăcut mirositor, safranalul, [61] se dezvoltă în timpul procesul de uscare[62], prin proces enzimatic [61] sau disocierea termică [63] a compusului amar, picrocrocina.

Șofranul condiment – Acesta oferă preparatelor culinare un aspect delicat, o aromă plăcută și culoarea galbenă, menite a îmbunătăți gustul.[64,65]

I.2.6. Toxicitate

De secole, șofranul se utilizează ca plantă medicinală și culinară. LD50 la administrarea intraperitoneală este de 1,6 g(stigmat) și respectiv 6 g(petale)/kg [75]. Consumul până la 1,5 grame de șofran zilnic este sigur, dar consumul excesiv poate fi toxic. De exemplu, 5 grame sunt considerate toxice pentru organism, iar o doză de 20 g/zi poate fi fatală. O intoxicație ușoară cu șofran provoacă amețeli, greață, vărsături și diaree, în timp ce una mai severă poate provoca amorțeală, furnicături la nivelul mâinilor, picioarelor, colorarea în galben a pielii și ochilor sau sângerare spontană [76].

I.3. CONCLUZII – STADIUL CUNOAȘTERII

Șofranul este o plantă erbacee ce aparține familiei Iridaceae, cu bulbo-tubercul globulos, frunze aciculare și flori de culoare albastru-violet.

Principalii compuși carotenoidici prezenți în stigmatele de șofran sunt: safranal și picrocrocină.

Șofranul este cel mai valoros produs alimentar medicamentos datorită importanței sale în dezvoltarea durabilă a zonelor de producție ale acestui condiment.

Stigmatele uscate ale plantei Crocus sativus (Iridaceae) sunt utilizate ca un condiment binecunoscut, care are o altă semnificație în industria farmaceutică, textilă și în special, produsele cosmetice; în prezent, acesta din urmă este omniprezent și se bazează pe încorporarea unor ingrediente naturale sănătoase și naturale.

Recent, informațiile despre activitatea farmacologică a acestei plante i-au acordat un loc proeminent în Codex, unde mai multe preparate farmaceutice conțineau celebrele stigmate. Mai recent, șofranul a atras un interes de reînnoire pentru utilizarea sa în produse cosmetice. Pe lângă proprietățile antioxidante bine descrise și răspândite, șofranul prezintă interese multiple pentru aplicațiile cosmetice, cum ar fi activitățile anti-solare, anti-pigmentare, anti-îmbătrânire și ar putea fi, de asemenea, utilizat ca pigment sau în parfumuri. Cu toate acestea, sensibilitatea sa în ce privește cultivarea, randamentul scăzut legat în principal de culesul și tăierea manuală și numeroasele falsificări ale cărora este victimă, generează o utilizare redusă care nu este accesibilă nici unui consumator din cauza unui preț excesiv.

Toxicitatea redusă (5 g) a șofranului permite ca acesta din urmă să fie utilizat în terapie, singura contraindicație fiind la femei în timpul sarcinii.

Partea a II-a – Contribuții personale

II.1. CERCETĂRI MACRO ȘI MICROSCOPICE

II.1.1. Analiză macroscopică

Material și metodă

Bulbii de șofran au fost achiziționați de pe site-ul www.pestre.ro având ca țară de origine Olanda și certificați de Dutch Acreditation Council ISO 17020 (număr de înregistrare 1085) și ISO 17025 (număr de înregistrare L285) – Anexa 1 [ ]. Aceștia au fost plantați în august 2019 și s-au recoltat în luna octombrie a aceluiași an.

(https://www.pestre.ro/continut/upload/certificatbulbi%20sofran%20abac%20holland%20b.v.%202019_15360_15360.jpg)

Fig.II.1. Crocus sativus – cultură proprie

Analiza macroscopică reprezintă un prim stadiu de investigare al produselor vegetale permițând stabilirea caracterelor morfologice detectabile cu ochiul liber sau la lupă, precum și a celor organoleptice percepute prin gust sau miros. Examenul macroscopic se efectuează în ordinea precizării următoarelor elemente:[FR.X ]

Aspect – Se observă cu ochiul liber sau la lupă comparându-se cu o mostră cunoscută. Se stabilește aspectul exterior și inferior, fața superioară și inferioară, consistența, duritatea, aspectul la pipăit, iar la unele produse tipul secțiunii transversale și raporturi dintre țesuturi.

Dimensiune – Se determină pe hârtie milimetrică sau cu o riglă gradată (lungimea, lățimea și grosimea).Se apreciează în cm pentru majoritatea produselor (folosind rigla), în mM pentru fructele și semințele mici (folosind hârtia milimetrică).

Culoarea – Se determină de obicei la produsul uscat la lumina zilei, pe cele două fețe.

Mirosul – Se percepe pe produsul ca atare, zdrobit între degete (frunze, flori) sau pulverizat (rădăcină, scoarță). Mai rar se încearcă prin umectare cu apă.

gustul – Se stabilește pe produsul ca atare sau pe decoct. Datorită conținutului de substanțe toxice, în unele cazuri, produsul nu se înghite, se elimină și se clătește gura cu apă.

Rezultate

În urma analizei macroscopice s-a constat o lungime totală a plantei de 40 cm, 8,5 cm rădăcini adventive, diametrul bulbo-tuberculului de aproximativ 2 cm și aproximativ 18 cm frunzele.

Fig.II.2. Plantă șofran

Bulbo-tubercul globulos, aplatizat la bază, cu diametrul de 2 cm, prezintă tunici fibroase cu fibrele zvelte și fin reticulate, extinse la vârful acestuia; culoare maronie la exterior, albă la interior cu gust și miros specific. (Fig.II.3.A și B)

A B

Fig.II.3.A și B

Frunzele (Fig.II.4) sunt aciculare, având o lungime de aproximativ 12,6 -18cm, 1,5-2,5 mm lățime, verzi, erecte și glabre.

Fig.II.4 C.sativus folium

Florile (Fig.II.5.A) sunt pubescente cu o lungime de 1-4cm , de culoare albastru-violet, cu vene mai închise, având un parfum penetrant. Bracteele sunt prezente, foarte inegale, de culoare albă, membranoase, cu vârfuri îndepărtate. Tubul periant este lung de 4-8cm; segmente inegale, de 3,5–5cm lungime, 1–2cm lățime, oblanceolate sau obovate, obtuze. Filamente de 7–11 mm lungime, purpurii, glabre; antere de 15-20 mm lungime , galbene.

Stilul (Fig.II.5.B) împărțit în 3 ramuri claviforme, roșu închis, fiecare ramură lungă de 25–32 mm, care depășește mult anterele și cel puțin jumătate din lungimea segmentelor de periant, care apare într-un punct mult sub baza anterelor din gâtul florii.

A B

Fig.II.5.A și B

Concluzii

În urma analizei macroscopice efectuate asupra plantei recoltate am constatat că aceasta aparține speciei Crocus sativus, familia Iridaceae. Caracteristicile morfologice vizibile cu ochiul liber, precum și cele organoleptice corespund datelor din literatură.

II.1.2. Analiză microscopică

Material și metodă

Plantă obținută din cultură proprie (august 2019) și recoltată în luna octombrie a aceluiași an.

Examenul microscopic reprezintă o fază mai avansată a analizei calitative a produselor vegetale, urmărește stabilirea țesuturilor și elementelor anatomice caracteristice ale secțiunilor și preparatelor clarificate din pulberi sau produse fragmentate.

Un produs vegetal poate fi supus examenului microscopic în urma unei anumite prelucrări în vederea obținerii unor preparate ce pot fi analizate la microscop. Preparatele microscopice se realizează prin metode diferite în funcție de natura, starea produsului (întreg, fragmentat sau pulverizat), după consistența și chiar compoziția sa chimică. Tehnica pregătirii preparatelor microscopice este foarte variată și depinde de grupa morfologică în care se încadrează produsul vegetal respectiv (frunze, ierburi, flori, semințe, fructe rădăcini, scoarțe etc.). [ F.R.X.]

Rezultate

Analiza microscopică a bulbo-tuberculului

Fig.II.6 Granule de amidon

În secțiunea transversală a bulbo-tuberculului de Crocus sativus se observă granulele de amidon de formă ovoidală (1).

Analiza microscopică a frunzei

Fig.II.7

În secțiunea transversală, se observă limbul foliar, în forma literei T, reprezentat de două epiderme: epiderma superioară(1) și cea inferioară(2). Cele două epiderme sunt formate dintr-un singur strat de celule în care peretele extern este acoperit cu o cuticulă(3). Sub epidermă, se distinge un singur strat de celule parenchimatice palisadice(4) și un parenchim țesut lacunar alcătuit din 3-4 straturi de celule(5). Între celulele epidermei inferioare se găsesc și stomate(6) de tip anomocitic.

Nu prezintă peri tectori sau glandulari.

Între cele două epiderme se află mezofilul frunzei, diferențiat într-un parenchim palisadic alcătuit din celule strâns unite între ele, iar în interiorul acestora se găsesc numeroase grăuncioare de clorofilă.

Concluzii

În concluzie, în urma analizei microscopice produsul vegetal luat în lucru a fost identificat corect, iar caracteristicile sale morfologice corespund datelor înscrise în literatura de specialitate.

II.1.3. Concluzii macro și microscopice

În urma analizei macroscopice și microscopice produsul vegetal luat în lucru a fost identificat corect, iar caracteristicile sale morfologice corespund datelor înscrise în literatura de specialitate.

În concluzie, în urma analizei microscopice produsul vegetal luat în lucru a fost identificat corect, iar caracteristicile sale morfologice corespund datelor înscrise în literatura de specialitate.

II.2. ANALIZĂ FITOCHIMICĂ PRELIMINARĂ

II.2.1. Material și metodă

Obținerea soluție de analizat

Stigmatele utilizate pentru determinarea principiilor active au fost achiziționate de la Sc.Tomiris.SRL, import Spania. Extracția s-a realizat folosind tehnica Soxhlet timp de 5 ore și având ca solvent MeOH p.a.Soluția folosită în vederea identificării compușilor chimici s-a concentrat la 20 mL cu ajutorul unui Rotavapor (-400mBari, 40oC).

A B

Fig.II.8.A și B

În vederea realizării reacților de identificare a compușilor fitochimici prezenți în pulberea de șofran, am utilizat 7 eprubete de 20 mL și reactivii: Fehling, Molish, Dragendorff, Mayer, FeCl3, NH4OH, HClconc. și Mg.

Reacții pentru oze:

În eprubeta P1 se iau 2 mL extract metanolic peste care se adaugă R. Fehling (2 mL R.Fehling 1+ 2 mL R.Fehling 2) în urma reacției se constată apariția culorii roșu-brune specifică oxidului cupros Cu2O (carere se datorează reducerii Cu2+ la Cu metalic).

În eprubeta P2, celor 2 mL extract se adaugă 3 mL R. Molish și se observă formarea unui inel violet.

Reacții pentru alcaloizi:

În 2 eprubete se iau 2 mL extract metanolic peste care în eprubeta P3 se adaugă 2 mL R.Dragendorff, iar în eprubeta P4 se adaugă 2 mL R.Mayer. Precipitatul format în urma reacțiilor relevă prezența cantităților mici de alcaloizi în extractele obținute din stigmatele de Crocus sativus.

Reacții pentru antracenozide:

Se iau 2 mL extract metanolic în eprubeta P5 peste care se adaugă 3 mL NH4OH. Culoarea rubinie formată,rezultată în urma reacției indică prezența antracenozidelor.

Reacții pentru flavonozide: Reacția Shibata (Reacția cianidolului)

Metoda se bazează pe proprietatea flavonozidelor sau a agliconilor acestora să își reducă gruparea ceto în prezența hidrogenului nativ. La 3 mL extract metanolic am adăugat câteva fragmente de magneziu metalic și 1 mL acid clorhidric concentrat. Reacția este însoțită de efervescență, iar modificarea culorii (roșu-brun) în decurs de câteva minute confirmă prezența acestora.

Reacții pentru Rezine

Se iau 2 mL extract metanolic peste care se adaugă 3 mL FeCl3. În urma reacției se obține o soluție de culoare albastră verzuie ceea ce indică prezența rezinelor.

II.2.2. Rezultate

A

B

Fig.II.8. A- soluție extractivă B-Soluții după reacții

Tab.II.1 – Centralizator reacții fitochimice

II.2.3. Concluzii – Analiză fitochimică preliminară

În uma analizei fitochimice preliminare în extractul metanolic obținut din stigmatele de C.sativus s-a identificat prezența ozelor, alcaloizilor, antracenozidelor, flavonozidelor și a rezinelor.

II.3. ANALIZA CROMATOgRAFICĂ A COMPUȘILOR CAROTENOIDICI

II.3.1. Material și Metodă

Fig.II.9-Rotavapor

Soxhlet MeOH si Eter de Petrol

Stigmatele utilizate pentru determinarea principiilor active au fost achiziționate de la Sc.Tomiris.SRL, import Spania.

S-au realizat doua extracții folosind tehnica Soxhlet timp de 5 ore, utilizând doi solvenți diferiți MeOH p.a. respectiv eter de petrol p.a. Soluția folosită în vederea identificării compușilor chimici s-a concentrat la 20 mL cu ajutorul unui Rotavapor (-400mBari, 40oC).

Sereshti H., Poursorkh Z., Aliakbarzadeh g., Zarre S., Ataolahi S., – An image analysis of TLC patterns for quality control of saffron based on soil salinity effect: A strategy for data (pre)-processing, Food Chemistry, Volume 239, pp831-839, ISSN 0308-8146, 2018

S-a luat în lucru 30µL din fiecare extract (MeOH și Eter de petrol) care s-au adus la linia de start pe o placă activată de silicagel gF254. Faza mobilă utilizată a fost un amestec de 1-butanol – acid acetic – apă distilată (4:1:1 V/V) Temperatură – 25oC, timp de saturare – 35min.Revelator lumină VIS/ UV 254nm/UV 365nm.

Fig.II.10 – Cromatoplaca cu probe (PMeOH PEter de Petrol) și Vas cromatografic (Faza mobilă)

II.3.2. Rezultate

Distanța de migrare a fazei mobile a fost 8,4 cm. În figura Fig.II.11 A, B, C sunt prezentate rezultatele analizei, în care se observă aspectul general al cromatogramei realizat pentru carotenoidele din Croci stigma, în lumină VIS, UV 365 și 254nm.

Fig.II.11 – Cromatograma Crocus A-Vis, B-UV365nm, C-UV254nm – PMeOH, PEter de petrol

Tab.II.2 – Rezultate interpretare cromatogramă

II.3.3. Concluzii analiză cromatografică

În urma interpretării cromatogramei am developat 8 spoturi din care pe baza Rf- ului și culorii din literatura de specialitate, am identificat 6 compuși carotenodici: Crocina (Rf-0,178), Crocetina (Rf-0,380), Picrocrocina (Rf-0,654), Cis-crocina 4 (Rf-0,785), Cis-crocina 2 (Rf-0,916) și unul flavonozidic cu un Rf-0,964 (gențiobiozil-kaempferol).

În ambele extracte (MeOH și Eter de petrol) s-au identificat același număr de compuși carotenoidici

Compuslui cu Rf-0,619 nu i-am găsit echivalent în tabelele citate în literatura de specialitate, prin urmare a rămas neidentificat.

Cea mai bună vizualizare a spoturilor s-a realizat în luminăUV cu lungimea de undă 365nm.

II.4. Determinarea totalului polifenolic

Stigmatele utilizate pentru determinarea principiilor active au fost achiziționate de la Sc.Tomiris.SRL, import Spania. Extracția s-a realizat folosind tehnica Soxhlet timp de 5 ore și având ca solvent MeOH. Soluția folosită în vederea identificării compușilor chimici s-a concentrat la 10 mL cu ajutorul unui Rotavapor (-400mBari, 40oC).

Aparatură: Computer, Spectrofotometru

Reactivi: alcool metilic (producător), R Folin-Ciocâlteu.

Metoda Folin-Ciocâlteu

Principiul metodei

Determinarea conținutului de polifenoli totali din surse vegetale prin măsurarea densității optice a unui extract primar care prin complexare cu reactivul Folin-Ciocalteu absoarbe în domeniul VIS la lungimea de undă λ = 750nm.

Pregătire probe

Proba de laborator preluată este păstrată astfel încât să se evite alterarea sau modificarea compoziției. Proba de laborator este pregătită pentru încercare astfel: materialul se cântărește la balanța analitică cu o precizie de 4 zecimale. Se adaugă solvent de extracție 1% HCl în metanol sau etanol 40%. Probele sunt supuse vortexării 5 minute, sonicării 30 minute, centrifugării 15 minute cu 3000 rot/min și filtrării prin hârtie de filtru calitativă. Extractele obținute se etichetează și se păstrează la congelator în vederea determinării.

Mod de lucru

Pentru preparea standardului se cântăresc cu exactitate, la balanța analitică, 25 mg acid galic și se introduce într-un balon cotat de 25 mL. Se adaugă 15 mL etanol 40 % și se sonichează până l

a dizolvare completă. Se lasă soluția la temperatura camerei și apoi se completează cu solvent pana la 25 mL, rezultand o soluție de concentratie 1 mg/ mL. Aceasta reprezintă soluția standard mamă din care se prepară 5 dilutii: 1 mg/100 mL; 0,5 mg/100 mL; 0,25 mg/100 mL; 0,125 mg/ mL si 0,0625 mg/ mL.

Se ia 1 mL soluție standard mama și se introduce într-un balon cotat de 100 mL, se adaugă 60-70 mL apa distilată, se agită, apoi se adaugă 5 mL reactiv Folin-Ciocalteu și se omogenizează. După 1 minut și înainte de 8 minute se adaugă 15 mL soluție carbonat de sodiu 7,5 %. Se notează acest moment ca fiind momentul “0” și se omogenizează din nou. Se aduce totul la volum de 100 mL cu apă distilată. Se obține astfel diluția soluție standard de 1 mg/ 100 mL. După 2 ore se citește absorbanta la λ = 750 nm față de martor (blank). Martorul se prepară în același mod, înlocuind 1 mL soluție standard cu 1 mL etanol 40 %. Pentru probe se înlocuiește standardul cu proba ce urmează a fi determinată, urmărindu-se protocolul descris mai sus. Se citește absorbanța λ = 750 nm pentru fiecare proba .

DE LUAT DE LA ALEX

Calculul și interpretarea rezultatelor

Cantitatea totală de polifenoli se exprimă în raport cu o curbă de etalonare cu standard de acid galic. Pe baza absorbanțelor citite la diferitele concentrații a soluției standard,se construiește curba de etalonare exprimată în mg/100 mL. Pe baza ecuației curbei se determină concentrația de polifenoli din probe.

Y = AX + B

Y = absorbanța citită la spectrofotometru

X = concentratia

A, B = constantele dreptei

II.5. IDENTIFICAREA COMPUȘILOR CAROTENOIDICI PRIN METODA VOLTAMETRICĂ

II.5.1. Material și metodă

Obținerea soluție de analizat

Stigmatele utilizate pentru determinarea principiilor active au fost achiziționate de la Sc.Tomiris.SRL, import Spania. Extracția s-a realizat pentru 2g stigmate C.sativus folosind tehnica Soxhlet timp de 5 ore și având ca solvent MeOH. Soluția folosită în vederea identificării compușilor chimici s-a concentrat la 10 mL cu ajutorul unui Rotavapor (-400mBari, 40oC). 1 mL din această soluție se adaugă peste 10 mL soluție electrolit întregistrându-se voltamograma puls diferentiala.

Aparat

Metoda folosită este voltametria puls diferențială, lucrând la aparatul Polarograf Stand TraceLab 150, iar rezultatele sunt obținute cu ajutorul algoritmului de calcul TraceMaster 5 Software.

Electrozi: Electrodul de lucru este folosit într-un sistem electrochimic pentru măsurarea și caracterizarea unor reacții chimice de interes. Un electrod de lucru este utilizat în combinație cu electrozi auxiliari și electrozi de referință, formând împreună un sistem de măsură tri-electrod. În funcție de natura reacției examinate, se deosebesc electrozi catodici și elecrozi anodici, după cum reacția este de reducere sau de oxidare. Electrodul de lucru folosit a fost un electrod de carbonul sticlos, de proveniență Metrohm cu suprafață electroactivă 7 mm2.

Reactivii (sigma):

Soluțiile etalon de crocină, respectiv crocetină au fost preparate astfel:

-soluția de crocină de concentrație 0,5 mM a fost obținută prin dizolvarea a 4.884 mg crocină (Sigma-Aldrich) în apă într-un balon cotat de 10 mL;

– soluția de crocetină de concentrație 0,5 mM a fost obținută prin dizolvarea a 1.642 mg crocetină (Supleco) în dimetilsulfoxid într-un balon cotat de 10 mL;

Soluție electrolit tampon fosfat pH 7,4 (PBS 0,1M) : 0,228 g NaH2PO4 și 0,9146 g Na2HPO4 se dizolvă în 50 mL apă proaspăt fiartă și răcită și se completează cu același solvent la 100 mL, într-un balon cotat.

II.5.2. Rezultate

Au fost înregistrate voltamogramele puls diferențiale (Dpv) pentru soluția eletrolit (blank) și un amestec de trei soluții de crocină și crocetină de concentrații diferite.

––––––––

Din Fig.II.12 se observă apariția picurilor de oxidare la potențiale de aporximativ 170 mV pentru crocină, respectiv 1055 mV pentru crocetină.

Intensitățile picurilor de oxidare corespunzătoare substanțelor analizate, calculate ca și base line, se regăsesc în tabelul urmator:

Tab.II….-Valorile intensităților picurilor de oxidare

Pentru determinarea substanțelor active (crocină și croccetină) din extractul metanolic de șofran s-a adăugat 1 mL peste 10 mL PBS înregistrându-se voltamograma puls diferențială.

Intensitatile picurilor de oxidare care apar la potențiale asemănătoare cu soluțiile etalon sunt de 25,42 µA pentru crocină, respectiv 16,39 µA pentru crocetină.

Din dreaptele de calibrare pentru crocină, respectiv crocetină s-a înlocuit valoarea lui y cu intensitatea picului de oxidare, calculându-se concentrațiile corespunzatoare. Ținând cont că s-a pornit de la 2g de șofran care s-a extras în 10 mL metanol din care s-a luat în lucru 1 mL extract, în urma calculelor efectuate s-au determinat cantități de 10,23 mg crocină/g șofran, respectiv 1,79 mg crocetină/g șofran.

II.5.3. Concluzii

În concluzie, în urma analizei voltametrice asupra extractului matanolic de C.sativus, am identificat și dozat crocina, respectiv crocetina în soluția de analizat.

II.6. DETERMINARE ACTIVITĂȚII ANTIOXIDANTE

II.6.1. Prin metoda DPPH

Material și metodă

Stigmatele utilizate pentru determinarea principiilor active au fost achiziționate de la Sc.Tomiris.SRL, import Spania. Extracția s-a realizat folosind tehnica Soxhlet timp de 5 ore și având ca solvent MeOH. Soluția folosită în vederea identificării compușilor chimici s-a concentrat la 10 mL cu ajutorul unui Rotavapor (-400mBari, 40oC).

Aparatură: Computer, Spectrofotometru

Reactivi: alcool metilic (producător), R. DPPH.

Metoda DPPH

Analiza conținutului de compuși fenolice și flavonoide a extractelor de șofran (apă fiartă, etanolică și metanolică) a dezvăluit că diferiți solvenți au un conținut diferit de compuși fenolici și total flavonoidic. Conținutul fenolic și flavonoidic a fost semnificativ mai mare

în extractul metanolic; cu toate acestea, activitatea antioxidantă a fost afectată de natura solventului utilizat.Extractul metanolic a activitate puternică de epurare a radicalilor liberi (prin testul de epurare a radicalilor DPPH) decât extractele cu apă fiartă și cu etanol. Acest lucru s-ar putea datora prezenței mai mari a compușilor fenolici și a flavonoidelor, care joacă un rol major în capacitățile antioxidante. Acidul galic ca principal compus fenolic și pirogalolul ca principal compus flavonoidic în extractul metanolic a fost de asemenea identificat (Karimi et al. 2010). Potențialul antioxidant al extractului etanolic de C.sativus a fost, de asemenea, analizat de Chen și colab. (2008) care a confirmat activitățile antioxidante ale acestui extract alcoolic folosind antioxidanți in vitro moduri, inclusiv anti-hemoliză, epurare a radicalilor DPPH, analiza peroxidării lipidelor și metoda fosfomoldenului. Ei au demonstrat că crocinele din extractul de șofran au efecte antioxidante puternice și aceste proprietăți sunt influențate de ozele atașate la partea de crocetină. S-a demonstrat că activitatea antioxidantă atât a extractului metanolic, cât și a extractului de apă-metanol din șofran a fost mai mare decât cea din extractele de tomate și morcovi (Papandreou și colab. 2006; Assimopoulou și colab., 2005). Referindu-ne la Ordoudi și colab. (2009), rezultatele au consolidat percepția bioactivității șofranului prin mecanismul de acțiune antioxidant. Ei au subliniat că extractele metanolice de șofran prezintă o activitate antioxidantă intracelulară remarcabilă prin utilizarea unui model unicelular sistem (monocit uman) la fel de eficient ca cel selectat.Antioxidanți fenolici, cum ar fi acidul rosmarinic, curcumina și Trolox.

Efectele de eupurare ale crocinelor, din extractelor analizate asupra radicalilor DPPH, sunt prezentate în Fig. 3 și Tabelul 1. Toate eșantioanele au prezentat proprietăți de scindare apreciabile împotriva radicalilor DPPH, iar procentul de inhibiție a fost proporțional cu concentrațiile fiecărui eșantion. Se poate observa că gRF(gardenia resin fraction) s-a dovedit din nou a fi cel mai puternic antioxidant, inhibarea acestuia fiind semnificativ distinctivă de cel al oricărui alt extract. Dintre toate eșantioanele examinate, gRF a prezentat 1229 mg atocopherol / g activitate de cicatrizare a radicalilor DPPH. Deși s-a observat un potențial mai mic la compararea gE(gardenia extract) (421 mg a-tocoferol / g) cu gRF, gE a prezentat încă o eficiență semnificativ mai mare decât SE(sofran extract) (107 mg a-tocoferol / g). Cu toate acestea, crocinele au arătat cea mai slabă activitate și activități de scindare a radicalilor DPPH de 98,3, 90,8 și 33,1 mg a-tocoferol / g, respectiv, pentru crocin-1, crocin2 și crocin-3.

Principiul metodei

DPPH este o prescurtare comună pentru compusul chimic organic 2,2-difenil-1-picril-hidrazil. Este o pulbere cristalină de culoare închisă compusă din molecule stabile de radicali liberi. DPPH are două aplicații majore, ambele în cercetarea de laborator: una este un monitor al reacțiilor chimice care implică radicali, în special este o analiză antioxidantă comună și alta, este un standard al poziției și intensității semnalelor de rezonanță paramagnetice electronice.

Metoda se bazează pe decolorarea radicalului stabil DPPH (2,2-difenil- 1 -picril-hidrazil), colorat puternic în roșu-purpuriu și având absorbția la 515 nm de către substanțe cu caracter antioxidant.

Pregatire probe

Proba de laborator preluată este păstrată astfel încât să se evite alterarea sau modificarea compoziției. Proba de laborator este pregătită pentru încercare astfel: Materialul se cântărește la balanța analitică cu o precizie de 4 zecimale. Se adaugă solvent de extracție 1%HCl în metanol sau etanol 40% . Probele sunt supuse vortexării 5 minute, sonicării 30 minute, centrifugării 15 minute cu 3000 rot/min și filtrării prin hârtie de filtru calitativă. Extractele obținute se etichetează și se păstrează la congelator în vederea determinării.

Modul de lucru

Pentru preparea standardului se cântăresc cu exactitate, la balanța analitică, 2,5029 mg trolox și se introduc într-un balon cotat de 10 mL. Se adaugă 5-6 mL etanol 40 % și se sonichează până la dizolvare completă , apoi se completează cu solvent pana la 10 mL, rezultând o soluție de concentratie 1 mM. Aceasta reprezintă soluția stoc din care se prepară diferite diluții: 500 µM; 250 µM, 125 µM pînă la 3,95 µM . Reactivul DPPH utilizat are o concentratie de 80 µM și se prepară astfel: se cântăresc la balanța analitică 0,0032 mg , se introduc într-un balon cotat de 100 mL ,se completează cu 50-60 mL etanol 40% , se sonichează până la dizolvare completă , apoi se completează cu solvent pana la 100 mL . Soluția de DPPH se prepară proaspătă și se păstrează la întuneric la temperatura camerei. Se iau 250 µl proba și 1750 µl soluție DPPH , se adaugă pe plăcuța de lucru cu 24 de locuri. După 30 min la întuneric se citește absorbanța la 515 nm pt fiecare . Proba martor conține 1750 µl DPPH și 250µl etanol 40% . Soluția DPPH se decolorează de la violet la galben în prezența unui donor de hidrogen, stabilindu-se gradul de inhibare a radicalilor liberi (I%).

Calculul și interpretarea rezultatelor

Activitatea antioxidantă se exprimă în raport cu o curbă de etalonare cu standard de trolox. Pe baza absorbanțelor citite la diferitele concentrații a soluției standard,se construiește curba de etalonare cu factorul echivalent µM Trolox. Pe baza ecuației curbei se determină activitatea antioxidantă a probelor.

Y = AX + B

Y = absorbanța citită la spectrofotometru

X = concentrația

A, B = constantele dreptei

II.6.2. Voltametrie

Material și metodă

1 mL din soluția extractivă, se adaugă peste 10 mL soluție electrolit întregistrându-se voltamograma puls diferentiala.

Aparat

Metoda folosită este voltametria puls diferențială, lucrând la aparatul Polarograf Stand TraceLab 150, iar rezultatele sunt obținute cu ajutorul softului de calcul TraceMaster 5.

Reactivii folosiți au fost:

Acid ascorbic (AA) 40.10-3 M: într-un balon cotat de 10 mL s-a cântărit 0,0704 g acid ascorbic care s-a dizolvat în apă distilată.

Acid galic (Ag) 40.10-3 M: : într-un balon cotat de 5 mL s-a cântărit 0,0340 g acid galic care s-a dizolvat în apă distilată.

II.5.2. Rezultate

1.Verificarea liniarității metodei cu soluții de acid ascorbic și acid galic

1.1. Acid ascorbic

Soluția de acid ascorbic 40.10-3 mM a fost adaugată în celula voltametrică peste 10 mL soluție PBS 0,1M în pași de câte 0,1 mL cu înregistrare de voltamogramă puls diferentială după fiecare adăugare.

Intensitățile picurilor de oxidare pentru solutia de AA ce apar la 420 ± 15 mV sunt calculate in functie de baseline si sunt prezentate în continuare în funcție de concentratia soluției de acid ascorbic:

Dreapta de calibrare este de forma I( µA) = 0,3601 + 0,0484 C( µM) avand o proportionalitate buna intre puncte cu R2 = 0,97655.

2.2.Acid galic

Soluția de acid galic 40.10-3 M a fost adăugată în celula voltametrică peste 10 mL soluție PBS 0,1M în pași de câte 0,1 mL cu înregistrare de voltamogramă puls diferențială după fiecare adăugare.

Din dreapta de calibrare se observă o bună liniaritate a punctelor pentru cele două valori de potențial (la 440 ± 25 mV respectiv la 840 ± 30 mV) ceea ce înseamnă că metoda respectivă este bună pentru a se folosi la dozarea acidului galic din diferite produse.

Fig.II.18-Voltamograma puls diferențială pentru extractul metanolic de șofran

Avem doua picuri corespunzatoare crocinei (172,65 mV) respectiv crocetinei (1055,03 mV) avand intensitate de 20,364 µA respectiv 14,053 µA pe baza cărora se vor face calculele de determinare a capacității antioxidante raportată la AA, respectiv Ag.

Capacitatea antioxidantă a crocinei raportată la AA

Din ecuația dreptei de calibrare se calculează cantitatea echivalentă de AA din extract.

I( µA) = 0,3601 + 0,0484 C( µM)

20,364 = 0,3601 + 0,0484 C sau C = 413.30 µM = 0,413 mM (concentrația corespunztoare AA pt sol analizata)

Calculam masa de AA din cei 11 mL solutie analizata:

1000 mL sol……………………………0,413.10-3 . 178 g AA

11 mL……………………………………….x = 8,092.10-4 g AA = 0,8092 mg AA in 11 mL sol sau 1 mL extract sofran

1 mL extract…………………………………..0,8092 mg AA

10 mL extract (sol preparata)…………y = 8,092 mg AA

2g Sofran…………………………….8,092 mg AA

1g Sofran………………………………z = 4,046 mg AA/g sofran (sau produs vegetal)

Deci crocina dintr-un gram de sofran are o capacitate antioxidanta echivalenta cu 4,046 mg AA. (CAEAA)

Capacitatea antioxidantă a crocetinei raportată la AA

Din ecuația dreptei de calibrare se calculează cantitatea echivalentă de AA din extract.

I( µA) = 0,3601 + 0,0484 C( µM)

14,053=0,3601 + 0,0484 C( µM) => C=282,91 µM=0,282 mM

Calcul masă AA din cei 11 mL soluție analizată:

1000 mL………………..0,282·10-3·178g AA

11 mL…………………….x => x=5,521·10-4g AA = 0,5521mg AA în 11 mL sol/1 mL extract sofran

1 mL extract…………….0,5521mg AA

10 mL extract…………..y => y= 5,521mg AA

2g sofran………5,521mg AA

1g sofran…………z => z = 2,760mg AA/g șofran

Crocetina dintr-un gram de șofran are o capacitate antioxidantă echivalentă cu 2,760mg AA. (CAEAA)

Capacitatea antioxidantă a crocinei raportată la Ag pentru picul de oxidare de la 440 mV

Din ecuația dreptei de calibrare se calculează cantitatea echivalentă de Ag din extract.

I( µA)= 2,523 + 0,529· C( µM)

20,364= 2,523 + 0,529·· C( µM) => C=33,725 µM = 0,0337 mM

Calcul masă Ag din cei 11 mL soluție analizată:

1000 mL…………..0,0337·10-3·170,1

11 mL…………………….x => x=6,305·10-5g Ag=0,06305mg Ag în 11 mLsol/1 mL extract

1 mL extract……………..0,06305mg Ag

10 mL extract……………….y => y= 0,6305mg Ag

2g șofran…….0,6305mg Ag

1g șofran……………z => z=0,3152 mg Ag/gșofran

Crocina dintr-un gram de șofran are o capacitate antioxidantă echivalentă cu 0,315mg Ag. (CAEAg)

Capacitatea antioxidantă a crocetină raportată la Ag pentru picul de oxidare de la 440 mV

Calculele au fost făcute analog cu cazul anterior.

I( µA)= 2,523 + 0,529· C( µM)

14,053=2,523 + 0,529· C( µM) =>C = 21,795 µM = 0,0217 mM

Calcul masă Ag din cei 11 mL soluție analiză:

1000 mL……………….0,0217·10-3·170,1

11 mL…………………………x => x = 4,0602·10-5g Ag = 0,0406mg Ag în 11 mL sol/1 mL extract

1 mL extract……………….0,0406mg Ag

10 mL extract…………………….y => y= 0,406mg Ag

2g șofran……………..0,406mg Ag

1g șofran…………………….z => z =0,203 mg Ag/ g șofran

Crocetina dintr-un gram de șofran are o capacitate antioxidantă echivalentă cu 0,203mg Ag. (CAEAg)

Capacitatea antioxidantă a crocinei raportată la Ag pentru picul de oxidare de la 840 mV

I( µA)= 0,118+ 0,061· C( µM)

20,364= 0,118+ 0,061· C( µM) => C = 331,901 µM =0,331 mM

Calcul masă Ag din cei 11 mL soluție analiză:

1000 mL……………….0,331·10-3·170,1

11 mL……………………..x => x = 6,193·10-4g Ag =0,619mg Ag în 11 mLsol/1 mL extract

1 mLextract………..0,619mg Ag

10 mL extract……………y => y = 6,19mg Ag

2g șofran………….6,19mg Ag

1g șofran……………z => z = 3,095 mg Ag/g șofran

Crocina dintr-un gram de șofran are o capacitate antioxidantă echivalentă cu 3,095 mg Ag. (CAEAg)

Capacitatea antioxidantă a crocetină raportată la Ag pentru picul de oxidare de la 840 mV

I( µA)= 0,118+ 0,061· C( µM)

14,053= 0,118+ 0,061· C( µM) => C( µM)= 228,442 µM=0,2284 mM

Calcul masă Ag din cei 11 mL soluție analiză:

1000 mL………….0,2284·10-3·170,1

11 mL…………………………x => x=4,273·10-4g Ag= 0,427mg Ag în 11 mL/1 mL extract

1 mL extract……………0,427mg Ag

10 mL extract……………y => y =4,27mg Ag

2g șofran………….4,27mg Ag

1g șofran……………z => z = 2,135mg Ag

Crocetina dintr-un gram de șofran are o capacitate antioxidantă echivalentă cu 2,135mg Ag. (CAEAg)

CAEAA- capacitate antioxidanta echivalenta cu AA

CAEAg- capacitate antioxidanta echivalenta cu Ag

Tab.II…-Valorile capacității antioxidante raportată la AA, respectiv Ag

Din tabel se observă capacitatea antioxidantă superioară a crocinei comparativ cu crocetina raportată atât la acid ascorbic cât și la acid galic.

II.5.3. Concluzii (+concluzie comparativă)

În urma calculelor efectuate s-a determinat valoarea superioară a capacității oxidante a crocinei de 4,046mgCAEAA/g C.sativus comparativ cu crocetina 0,203mgCAEAg/g C.sativus.

II.6. CUANTIFICAREA ACȚIUNII ANTIBACTERIENE A EXTRACTULUI

II.6.1. Material și metodă

Soluțiile de analizat

Probele (Crocus sativus) au fost colectate din Oradea în luna octombrie 2019. Stigmele proaspete au fost separate manual de florile întregi de șofran prin procedură tradițională. Probele au fost uscate și supuse extracției Soxhlet timp de 5 ore, luându-se în lucru 2g Crocus sativus stigma. Soluția folosită în vederea identificării activității antibacteriene s-a concentrat la 20 mL cu ajutorul unui Rotavapor (-400mBari, 40oC) și s-a păstrat la 4C în lipsa luminii până la efectuarea analizei. Toți solvenții folosiți provin de la Chempur.

Tulpinile microbiene

Tulpinile microbiene (Fig.II.17) au fost reprezentate de o bacterie gram pozitivă: Staphylococcus aureus ATCC 25923 – LOT 01302502 – 06.2021 și 2 bacterii gram negative: Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 – LOT 06500109 – 12.2020 și Escherichia coli – ATCC 25922 – LOT 00203102 – 06.2021.

Fig.II.17Tulpinile bacteriene

A- Staphylococcus aureus, B-Escherichia Coli, C-Pseudomonas aeruginosa

Metoda

Plăcile Mueller-Hinton s-au însămânțat în 15 minute de la etalonare utilizând tampoane noi, sterile. Activitatea antimicrobiană a uleiului volatil a fost cercetată prin metoda de însămânțare-difuzimetrică (Kirby-Bauer) standardizată.[49]

Suspensiile microbiene au fost preparate în soluție salină 0,9% sterilă și ajustate ca inocul la o concentrație finală de 0,5 standard McFarland. Un volum de 20 mL de agar Mueller-Hinton pentru tulpini bacteriene au fost inoculate cu 20µL de suspensie microbiană și apoi turnată într-o cutie Petri. Vasele au fost lăsate la temperatura camerei pentru 15 minute pentru a permite mediului de cultură să se solidifice.

Fiecare disc de hârtie cu diametrul de 6 mM a fost impregnat cu 1000µg din soluția probă (P1-Croci stigma MeOH; P2-Croci stigma Eter de Petrol) și apoi aplicat manual pe suprafața vaselor de agar inoculate cu microorganisme. Ciprofloxacina, Oxacilina și Colistina (30µg/disc) au fost utilizate ca standarde de referință pozitive, pentru a determina sensibilitatea speciilor bacteriene gram pozitive și gram negative. Vasele au fost ținute la 4șC pentru 2h pentru a permite difuzia și apoi incubate pentru 24h la 37șC. Activitatea antimicrobiană a fost determinată prin măsurarea diametrelor zonelor de inhibiție, incluzând diametrul discului (6 mM).

II.6.2. Rezultate

Fig. II.18 Antibiogramele rezultate

Toate experimentele au fost realizate în triplicat.

Tab.II.5 Centralizator rezultate efect antibacterian

II.6.3. Concluzii

Comparația efectelor antibacteriene ale ambelor extracte din stigmatele (MeOH, Eter de petrol) de șofran cu antibioticele, arată faptul că cele din urmă pot fi asociate sau înlocuite cu acestea și pot fi utilizate în tratamentul bolilor infecțioase manifestând un potențial semnificativ cu aplicații largi în domeniul farmaceutic.

Partea a III-a – Concluzii generale

Șofranul este o plantă erbacee ce aparține familiei Iridaceae, cu bulbo-tubercul globulos, frunze aciculare și flori de culoare albastru-violet.

Principalii compuși carotenoidici prezenți în stigmatele de șofran sunt: safranal și picrocrocină.

Șofranul este cel mai valoros produs alimentar medicamentos datorită importanței sale în dezvoltarea durabilă a zonelor de producție ale acestui condiment.

Stigmatele uscate ale plantei Crocus sativus (Iridaceae) sunt utilizate ca un condiment binecunoscut, care are o altă semnificație în industria farmaceutică, textilă și în special, produsele cosmetice; în prezent, acesta din urmă este omniprezent și se bazează pe încorporarea unor ingrediente naturale sănătoase și naturale.

Recent, informațiile despre activitatea farmacologică a acestei plante i-au acordat un loc proeminent în Codex, unde mai multe preparate farmaceutice conțineau celebrele stigmate. Mai recent, șofranul a atras un interes de reînnoire pentru utilizarea sa în produse cosmetice. Pe lângă proprietățile antioxidante bine descrise și răspândite, șofranul prezintă interese multiple pentru aplicațiile cosmetice, cum ar fi activitățile anti-solare, anti-pigmentare, anti-îmbătrânire și ar putea fi, de asemenea, utilizat ca pigment sau în parfumuri. Cu toate acestea, sensibilitatea sa în ce privește cultivarea, randamentul scăzut legat în principal de culesul și tăierea manuală și numeroasele falsificări ale cărora este victimă, generează o utilizare redusă care nu este accesibilă nici unui consumator din cauza unui preț excesiv.

Toxicitatea redusă (5g) a șofranului permite ca acesta din urmă să fie utilizat în terapie, singura contraindicație fiind la femei în timpul sarcinii.

În urma analizei macroscopice efectuate asupra plantei recoltate am constatat că aceasta aparține speciei Crocus sativus, familia Iridaceae. Caracteristicile morfologice vizibile cu ochiul liber, precum și cele organoleptice corespund datelor din literatură.

În concluzie, în urma analizei macroscopice și microscopice produsul vegetal luat în lucru a fost identificat corect, iar caracteristicile sale morfologice corespund datelor înscrise în literatura de specialitate.

În uma analizei fitochimice preliminare s-a identificat prezența de alcaloizi, flavonozide, oze și rezine. – folosesti concluzia reformulata

Comparația efectelor antibacteriene ale ambelor extracte din stigmatele (MeOH, Eter de petrol) de șofran cu antibioticele, arată faptul că cele din urmă pot fi asociate sau înlocuite cu acestea și pot fi utilizate în tratamentul bolilor infecțioase manifestând un potențial semnificativ cu aplicații largi în domeniul farmaceutic.

Bibliografie

BOTANICA

[12] Szabo I. – Botanică farmaceutică-Sistematică vegetală, Ed Universității din Oradea, 2007

[13] Annamaria Pallag – Botanică farmaceutică, Sistematică, Cormobionta, Editura

Universității din Oradea; 2015.

Dinu M., Ancuceanu R.V.,Anghel A.I. – Botanică farmaceutică baze teoretice și practice:citologie, histologie, organografie, ediția a 2-a, Editura Universitară, București; 2012.

FCZ FITOTERAPIE

Nemeth S.- Farmacognozie curs Volumul I-Editura Universității din Oradea; 2011.

[18] Horvath g., Molnar P., Bencsik T. – Pharmacognosy 2, University of Pecs 978-963-642-613-2; 2013. – acasa

[19] Anatolie Nistreanu – Farmacognozie, Tipografia Centrală, Chișinău, p. 150-159, 164,166-168, 445-449; 2001.

[20] Istudor Viorica – Farmacognozie, Fitochimie, Fitoterapie, vol.2., Editura Medicală,

București, p. 99-100; 2001.

[21] Mogoșanu g., Bejenaru Popescu L.E., Popescu L – Farmacognozie – Fitoterapie Ediția a II-a. Ed. Sitech, Craiova; 2010.

Nemeth T., Ardelean A., Szabo I., Nemeth S. – Analize farmacognostice I,II – Editura

Universitatea de Vest; 2000.

Kerry Bone, Simon Mills. Principles and Practice of Phytotherapy Modern Herbal

Medicine. Churchill Livingstone; p. 26-31; 2013.

ATLAS CSS

Wagner H., Bladt S. – Plant drug analysis – A thin layer chromatography atlas, Second

edition, Ed. Springer; 2001.

Anexa 1

Cuprins