Șef lucrări Dr. Dinu Laura -Dorina [629923]

UNIVERSITATEA DE ȘTIINȚE AGRONOMICE ȘI MEDICINĂ
VETERINARĂ BUCUREȘTI
FACULTATEA DE BIOTEHNLOGII
Specializarea: Biotehnologii Medical -Veterinare

LUCRARE DE DISERTAȚIE

REZISTENȚA LA ANTIBIOTICE A TULPINILOR
BACTERIENE DIN PRODUSELE LACTATE FERMENTATE

COORDONATOR ȘTIINȚIFIC:
Șef lucrări Dr. Dinu Laura -Dorina

ABSOLVENT: [anonimizat] 2020

REZUMAT

Antibioticele, alimentele procesate și metodele moderne de preparare a alimentelor elimină
bacteriile benefice din microflora intestinal ă sau ingerate în mod normal din fructe, legume și
produse lactate. Produsele chimice, poluarea și dietele sărace în nutrienți sunt alți factori care
afectează bacteriile benefice din corpul nostru iar toate acestea își pun amprenta as upra activității
microflorei, producând astfel deficiențe asupra sistemului digestiv, sistemului imunitar și asupra
rezistenței la agenții patogeni infecțioși. Probioticele, și în special produsele lactate fermentate, au
rolul de a sprijini capacitatea org anismului de a remedia aceste deficiențe.
Partea teoretică a lucrării Rezistența la antibiotice a tulpinilor bacteriene din produsele
lactate fermentate cuprinde informații referitoare la rezistența la antibiotice și efectul
antimicrobian al consorțiului de bacterii lactice din lactatele fermentate comerciale.
Cercetările efectuate în Laboratorul de Microbiologie Aplicată al Facultății de
Biotehnologii din cadrul USAMV București au avut drept scop studierea rezistenței tulpinilor
bacteriilor lactice din 1 0 produse lactate fermentate din România, la antibioticele folosite în mod
curent pentru tratarea infecțiilor cauzate de bacteriile din clasa Enterobacteriaceae și determinarea
efectului antimicrobian asupra unei tulpini -test de Enterobacteriaceae. Testare a rezistenței
bacteriilor lactice din produsele lactate fermentate s -a efectuat prin metoda difuzimetrică Kirby –
Bauer. Tulpinile de bacterii lactice prezente în produsele lactate fermentate Danone Activia și
Covalact Chefir au rezistență la antibioticele t estate : ciprofloxacin (CIP, 1 µg), trimethroprim
(STX, 25 µg), amoxacilină (AMC, 30 µg) și ampicilină (SAM, 20 µg) dar ambele lactate au efect
antimicrobian redus față de tulpina de Enterobacteriaceae testată. S-a constatat că fiecare produs
lactat comerc ial prezintă un pattern unic al rezistenței la antibiotice. Mediul de cultură influențează
rezultatele experimentelor de determinare a activității antimicrobiane a bacteriilor lactice asupra
tulpinilor de Enterobacteriaceae , cele mai clare rezultate au fos t obținute pe mediul de cultură
DGA din cele 3 medii testate (DGA, XLD, MacConkey) .
Studiile preliminare realizate oferă informații utile consumatorilor cu privire la posibilele
efecte benefice ale produselor lactate fermentate de pe piața din România.

CUPRINS

REZUMAT ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………………….. …. 1
INTRODUCERE ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………………… 4
1. Rezisten ța la antibiotice a bacteriilor lactice ………………………….. ………………………….. …………. 6
1.1. Bacteriile lactice utilizate în procesele de obținere a derivatelor lactate ………………………… 6
1.2. Determinan ți ai rezistenței la antibiotice în Lactobacillus ………………………….. ……………… 8
1.3. Rezisten ța la antibiotice a bifidobacteriilor ………………………….. ………………………….. ……. 11
2. Efectul antimicrobian al bacteriilor lactice ………………………….. ………………………….. …………… 12
3. Materiale și metode ………………………….. ………………………….. ………………………….. …………… 14
3.1. Produse lactate fermentate utilizate și tulpina microbiană utilizată ………………………….. .. 14
3.2. Determinarea pH -ului produselor lactate fermentate utilizate ………………………….. ………. 15
3.3. Determinarea spectrofotometrică a concentrației tulpinii microbiene test …………………… 16
3.4. Testarea rezistenței la antibiotice a tulpinilor de bacterii lactice din produsele lactate
fermentate comerciale ………………………….. ………………………….. ………………………….. ……….. 16
3.5. Testarea activității antimicrobiene a produselor lactate fermentate comerciale ……………. 18
3.6. Medii de cultură și materiale folosite ………………………….. ………………………….. …………… 19
4. Rezultate și discuții ………………………….. ………………………….. ………………………….. …………….. 23
4.1. Rezistența la antibiotice a tulpinilor de bacterii lactice din produsele lactate fermentate
comerciale ………………………….. ………………………….. ………………………….. ……………………….. 23
4.2. Testarea activității antimicrobiene a produselor lactate fermentate comerciale ……………. 27
4.3. Efectul mediului de cultu ră asupra activității antimicrobiene a produselor lactate fermentate
………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………….. 29
CONCLUZII ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………………….. . 30
BIBLIOGRAFIE ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………………. 31

INTRODUCERE

Timp de secole s -a considerat că, prin consumul de produse lactate acide, se îmbunătățește
starea de sănătate, ceea ce ar conduce la creșterea longevității. Această afirmație a fost susținută
științific, în secolul XX, de către Eli Metchnikoff, câștigător al premiului “Nobel” pentru medicină
(1908), al cărui studiu demonstra că lactobacilii ar putea împiedica efectele bacteriilor de alterare
din tractul gastrointestinal.(Matei, 2011)
Prezența probioticelor în lactatele fermentate este menită să conserve lap tele prin
producerea de acid lactic și a anumitor componente antimicrobiene, să crească valoarea
nutrițională a respectivelor alimente (spre exemplu prin eliberarea anumitor aminoacizi sau sinteza
unor vitamine), dar și să ofere anumite proprietăți de gust specifice acestor produse.
Antibioticele nu fac, uneori, distincția între bacteriile dăunătoare și cele benefice, putând
distruge și bacteriile care sunt utile în exercitarea diferitelor funcții în organism, precum flora
digestivă. Astfel, anumite tulpini de bacterii din tubul digestiv sunt esenț iale pentru a digera
alimentele și pentru a produce vitamine. Atunci când aceste bacterii sunt eliminate, se ajunge la
pierderea de vitamine, diaree, infecții parazitare, precum și dezvoltarea unor alergii. Așadar, chiar
dacă antibioticele sunt proiectate să ajute pe termen scurt, utilizarea excesivă poate afecta sistemul
imunitar pe termen lung.
În fața bolilor răspândite și a societăților în curs de îmbătrânire, utilizarea cunoștințelor
privind microbiocenoza tractului gastro -intestinal și efectul benefic al bacteriilor probiotice devine
din ce în ce mai importantă. Probioticele sunt adăugate în mod convențional la produsele lactate
cum ar fi iaurt, dahi și alte produse lactate fermentate care le fac alimente funcționale.
Cercetările realizate în Laborato rul de Microbiologie Aplicată al Facultății de
Biotehnologii , București, au avut drept scop testarea rezistenței la antibiotice a bacteriilor lactice

din diferite produse lactate fermentate comerciale și testarea efectului antimicrobian asupra unei
tulpini de Enterobacteriaceae. Prezenta lucrare este structurată în două părți:
● Partea teoretică prezintă o amplă documentare referitoare la bacteriile lactice, rezistența
la antibiotice și efectul antimicrobian al consorțiului de bacterii lactice din lactatele fermentate
comerciale;
● Partea practică a investigat rez istența la antibiotice a tulpinilor de bacterii lactice izolate
din 10 produse lactate, acțiunea antimicrobiană a 4 produse lactate fermentate comerciale asupra
unei tulpini de Enterobacteriaceae și s-a testat influența mediului de cultură utilizat pentru a
determina activitatea antimicrobiană.

1. Rezisten ța la antibiotice a bacteriilor lactice

Bacteriile lactice reprezintă un grup de bacterii Gram -pozitive ce au drept caracteristică
producerea de acid lactic. Membrii tipici ai acestui grup sunt organisme Gram -pozitive, facultative
anaerobe, catalaza -negative, ce au un conținut scăzut de G+C, din genurile Lactobacillus ,
Lactococcus , Leuconostoc și Pediococcus.
Au fost utilizate în practica industrială din 1930, la inducerea fermentației lactice (Matei,
2011). Lactobacilii sunt prezenți în mod natural sau în mod deliberat adăugați ca și culturi inițiale
în lapte nepasteurizat și produse lactate, cum ar fi brânzeturile, iaurturile și laptele
fermentat.( Coeuret V. et al, 2004 )

1.1. Bacteriile lactice utilizate în procesele de obținere a derivatelor lactate

➢ Lactococcus lactis ssp.lactis var diacetylactis
Este utilizat în combinație cu alte culturi starter pentru producerea brânzeturilor cu
mucegai în pastă, maturate: Gouda, Edam și brânzeturile cremă. Aceste microorganisme sunt
capabile să producă dioxid de carbon, diacetil, acetați din citrații prezenți în lapte.
➢ Lactococcus lactis ssp.cremoris (Figura 1. 1.)
Amestecuri de lactococi sunt utilizate drept culturi starter pentru brânza Cheddar, Colby
și Cottage, atunci când nu sunt de dorit producerea gazului și a texturii deschise. (Matei, 2011)
➢ Streptococcus thermophillus
Sunt microorganisme Gram -pozitive, a naerobe, grupate sub formă de streptococi (Figura
1.1.), care sunt utilizate la fabricarea iaurtului și a brânzei Mozzarella. Acestea nu cresc la

temperaturi de 10°C, dar se dezvoltă bine între 40 -45°C, iar majoritatea tulpinilor pot supraviețui
timp de 30 minute la temperaturi de 60°C. Bacteria este foarte sensibilă la prezența antibioticelor.
(Matei, 2011)

➢ Enterococcus
Enterococii (Figura 1.1.) se găsesc pretutindeni în mediu fiind asociați în principal cu
tractul gastrointestinal, iar din această cauză, prezența lor în produsele alimentare este percepută
ca un indicator al igienei necorespunzătoare. Enterococii fac part e din principalele populații
bacteriene folosite în producția brânzeturilor în Italia, Franța, Portugalia, Spania, Grecia, Turcia și
Egipt. Speciile izolate cel mai des sunt Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium și
Enterococcus durans. (Matei,2011)
➢ Leuconostoc
Genul Leuconostoc (Figura 1.1.) include bacterii heterofermentative sub formă de coci,
diplococi, care produc prin fermentație acid lactic, alcool etilic, și dioxid de carbon. Aceste bacterii
sunt importante în formarea aromei, datorită abilită ții de a descompune citrații și formarea
diacetilului din piruvatul produs. (Matei, 2011)
➢ Pediococcus
Sunt bacterii Gram -pozitive, catalazo -negative sau slab pozitive, cresc în 6,5% NaCl, la
45°C și produc amoniac din arginine. Pediococii au fost identific ați prima dată în Noua Zeelandă
și mai târziu în Anglia și s -a considerat că îmbunătățesc aroma (apar în brânza Cheddar). (Matei,
2011)
➢ Lactobacillus
Sunt bacterii Gram -pozitive, anaerobe, ce fermentează carbohidrații cu producere de acid
lactic. Lactobaci llus acidophilus (Figura 1.1.) este prezent în flora intestinală și vaginală normală
și este folosit ca probiotic pentru refacerea florei vaginale sau florei intestinale, în cursul și după
tratamente cu antibiotic. ( https://ro.wikipedia.org/wiki/Lactobacil )
➢ Bifidobacterium

Bifidobacteriile (Figura 1.1.) constituie un grup de bacterii Gram -pozitive, strict anaerobe,
care nu formeaza spori și nu sunt patogene (Jurcoane et al., 2009). Reprezintă 90% din microbiota
sugarilor alimentați natural, având un rol benefic în intestinul uman și acționează în colon asupra
bacteriilor de putrefacție (antagonism competitiv).
Principalele specii sunt: Bifidobacterium bifidum biovar a (Lactobacillus bifidii);
Bifido bacterium longum biovar a și b; Bifidobacterium breve; Bifidobacterium infantis. (Matei,
2011)
Figura 1.1. Bacterii lactice utilizate în procesele de obținere a derivatelor lactate
(Sursa: https://ro.wikipedia.org )

1.2. Determinan ți ai rezistenței la antibiotice în Lactobacillus

Conform OMS ( www.who.int/mediacentre/factsheets/fs194/en/ ),
rezistența antimicrobiană (AMR) este "rezistența unui microorganism la un medicament
antimicrobian la care era inițial sensibil". Genele care codifică rezistența sunt componente ale
populațiilor microbiene naturale și expunerea la antibiotice exercită o presiune selectivă,

favorizând capacitatea de supraviețuire a microorganismelor (Davies J. și Davies D., 2010).

Oamenii încurajează răspândirea tulpinilor rezistente prin utilizarea greșită a medicamentelor
antimicrobiene și practici slabe de control ale infecțiilor.
(www.who.int/mediacentre/factsheets/fs194/en/ )
Mecanismele cunoscute de rezistență la antibiotice pot fi în mare parte clasificate în patru
clase:
1. Lipsa sau scăderea permeabilității peretelui celular;
2. Eflux;
3. Dezactivarea enzimatică;
4. Modificarea mecanismelor țintă. ( Lancini G. și Parenti F., 1982 )
Anumite mecanisme, cum ar fi lipsa permeabilității peretului celular sau absența totală a
situsului țintă, sunt mai susceptibile de a fi inerente unei specii bacteriene sau unui g en; prin
urmare, acest tip de rezistență este clasificat drept intrinsec sau dobândit (Figura 1.2.).

Figura 1.2. Mecanisme majore de rezistență intrinsecă și dobândită
(Sursa: https://ro.wikipedia.org )

Cercetătorii din ultimul deceniu au descoperit prezența unor gene de rezistență la
antibiotice în bacteriile lactice din diferite surse. Herreros et al. (2005 ) au constatat rezistență
Rezistența intrinsecă

Rezistența dobândită

•Absența țintei
•Afinitatea scăzută
a țintei
•Permeabilitate
scăzută
•Eflux
Mutații
Gene adăugate

Modificarea țintei

•Inactivarea
medicamentelor
•Modificarea
țintei
•Eflux

multiplă la medicamente din brânză Armada, o brânză spaniolă din lapte de capră. Masco et al.
(2006 ) au descoperit genele tet(W), responsabile de rezistența la tetraciclină, în 15 tulpini de
Bifidobacterium, inclusiv 7 tulpini probiotice. Este important să se facă distincția între rezistența
intrinsecă și cea dobândită. De exemplu, enterococii sunt rezistenți intrinsec la cefalosporine și
niveluri scăzute de aminoglicozide, în timp ce lactobacilii, pediococii și Leuconostoc spp . au o
rezistență natural ridicată la vancomicină.
Genul Lactobacillus este cel mai mare grup d intre bacteriile producătoare de acid lactic
(LAB) și probabil cel mai utilizat pe scară largă ca probiotic într -o varietate de produse alimentare,
în special carne și produse lactate fermentate.
În ceea ce privește rezistența la antibiotice, fenotipul rez istent la vancomicină al unor
lactobacilli este probabil cea mai bună rezistență intrinsecă caracterizată în LAB. Vancomicina
intră în contact cu precursorii peptidoglicanului de pe partea peretelui celular al membranei
citoplasmice și se leagă de terminal ul d -alanină / d -alanină al pentapeptidei, prevenind
polimerizarea precursorilor de peptidoglican. La câteva specii de LAB, reziduul d -alanin terminal
este înlocuit cu d -lactat sau d -serină în muramilpentapeptidă, prevenind legarea de vancomicină
(Delcour et al., 1999) și, prin urmare, devenind rezistente la antibiotic. În plus, mutațiile
cromozomiale care duc la fenotipuri de rezistență la antibiotice au fost, de asemenea, descrise în
lactobacili. Flórez et al. (2007) a identificat o singură mutație în gen a 23S rRNA care reduce
afinitatea eritromicinei pentru ribozom. Această mutație a conferit rezistență la macrolide într -o
tulpină de L. rhamnosus. Cu toate acestea, cunoașterea fenotipurilor de rezistență la antibiotice
poate fi încă importantă, chiar și î n absența rezistenței transferabile; deoarece lactobacilii sunt
utilizați în mod obișnuit în produsele alimentare și hrana pentru animale, rezistența intrinsecă ar
putea fi încă relevantă pentru tratamentul bacteremiei legate de Lactobacillus (Cannon et al .,
2005).
Un pas major în diferențierea rezistenței intrinseci și dobândite la antibiotice la bacteriile
probiotice este determinarea și compararea modelelor de susceptibilitate la antibiotice ale unui
număr reprezentativ de tulpini diferite de la fiecare specie. Deși s -au făcut unele eforturi în acest
scop, au fost efectuate lucrări numai pentru anumite antibiotice și specii de Lactobacillus . Acestea
includ speciile probiotice cele mai frecvent utilizate, cum ar fi L. casei , L. acidophilus , L. reuteri
sau L. rhamnosus , printre altele, sau bacteriile starter de iaurt L. delbrueckii (Ammor et al., 2008b;
Korhonen et al., 2008; Mayrhofer et al., 2010). Cu toate acestea, având în vedere complexitatea

taxonomică a acestui gen microbian, există încă o lipsă de ac ord asupra punctelor de întrerupere a
sensibilității la rezistență pentru majoritatea antibioticelor. Utilizarea metodelor moleculare, cum
ar fi diferite tehnici PCR, este extrem de utilă în determinarea bazei genetice a fenotipurilor de
rezistență dobândi te. Mai mult, disponibilitatea crescândă a secvențelor genomului și reducerea
costurilor instalațiilor de secvențiere a genomului oferă noi posibilități pentru screening -ul genelor
de rezistență antimicrobiană (Bennedsen et al., 2011).
În ceea ce privește antibioticele specifice, lactobacilii sunt, de obicei, sensibili la penicilina
și beta -lactamaza care vizează peretele celular, dar sunt mai rezistenți la cefalosporine. După cum
s-a menționat anterior, multe specii de Lactobacillus prezintă un nivel ridic at de rezistență la
vancomicină. De asemenea, majoritatea inhibitorilor de sinteză a acidului nucleic par să aibă un
efect inhibitor scăzut în rândul majorității speciilor de Lactobacillus . Pe de altă parte, lactobacilii
sunt în general susceptibili la con centrații scăzute ai multor inhibitori ai sintezei proteinelor, cum
ar fi cloramfenicolul, macrolidele, lincosamidele și tetraciclina, dar rezistența lor la
aminoglicozide este adesea ridicată. Rezistența la alte antibiotice variază foarte mult în rândul
lactobacililor.
Au fost raportate mai multe gene responsabile pentru proprietățile atipice de rezistență la
antibiotice în rândul lactobacililor (Tabel 1.2.). Genele de rezistență la eritromicină, responsabile
pentru fenotipul de rezistență la macrolide, li ncosamide și streptogramini (MLS), au fost
identificate în mai multe specii de Lactobacillus ; gena erm (B), care codifică o metilază rRNA
care acționează asupra subunității ribozomale 23S, este cel mai frecvent descoperită dintre astfel
de gene, dar s -au descoperit și altele, cum ar fi erm (A), erm (C) sau erm (T) (van Hoek et al.,
2008c). Prezența genelor care codifică pompele de eflux de macrolide, cum ar fi mef (A), genele
pentru lincosamid transferaza lnu (A); (Cauwerts et al., 2006) și streptogramină A acetiltransferaze
vat (E); (Gfeller et al., 2003) au fost, de asemenea, raportate. Totuși, cei mai comuni determinanți
ai rezistenței găsiți în lactobacili sunt genele de rezistență la tetraciclină, care uneori se găsesc în
combinație (Ammor et al., 2008c ). Cel puțin 11 gene diferite de rezistență la tetraciclină au fost
detectate până în prezent în lactobacili, acestea incluzând genele care codifică proteinele de
protecție ribozomală [tet (W), tet (M), tet (S), tet (O) (36), tet (Z), tet (O / W / 32 / O / W / O), tet
(W / O)] și pompele de eflux tet (K) și tet (L). (Lahtinen et al., 2009)