Șef lucrare Prof. Petruța Călina CORNEA [304428]

UNIVERSITATEA DE ȘTIINȚE AGRONOMICE

ȘI MEDICINĂ VETERINARĂ DIN BUCUREȘTI

FACULTATEA DE AGRICULTURĂ

Program de studii universitare de licență:

Biologie – IFR

LUCRARE DE LICENȚĂ

Coordonator științific:

Șef lucrare Prof. [anonimizat]: [anonimizat]

2020

UNIVERSITATEA DE ȘTIINȚE AGRONOMICE ȘI MEDICINĂ VETERINARĂ DIN BUCUREȘTI

FACULTATEA DE AGRICULTURĂ

Program de studii universitare de licență: Biologie – [anonimizat]:

Șef lucr. Prof. [anonimizat]: [anonimizat]

2020

Cuprins

Pag.

INTRODUCERE

Sindromul diareic este o [anonimizat] 3 si 5 milioane de copii în fiecare an. Sunt înregistrate între aproximativ 2,5 [anonimizat] 12% au fost copii de 5 ani sau mai mici.

[anonimizat]: [anonimizat].

Domeniul microbiologiei clinice a [anonimizat]. Aceste inovații includ teste moleculare comerciale care detectează si identifica simultan mai multi agenți patogeni asociați cu sindroame clinice. [anonimizat], [anonimizat] ([anonimizat], izolarea si tratamentul antimicrobian sau lipsa acestora) să fie luate in timp util.

[anonimizat], [anonimizat], în toate laboratoarele de microbiologie.

[anonimizat] 1 pana la 3 ore,[anonimizat] a măsurilor adecvate de prevenire si control al infecțiilor. Pentru a [anonimizat].

Tratamentul și controlul adecvat al gastroenteritei infectioase depinde de capacitatea de a detecta rapid gama largă de agenți etiologici asociați cu boala.

Laboratoarele clinice utilizează în prezent o serie de metodologii diferite pentru a [anonimizat].

CAPITOLUL I

[anonimizat] a tractului gastrointestinal

INTESTINUL SUBȚIRE

Duodenul (Duodenum)

Duodenul este prima porțiune a [anonimizat] (restul intestinului subtire este situat superficial), fixat de peretele abdominal posterior (prin intermediul fascitei lui Treitz), [anonimizat]. Are lungimea de aproximativ 25 – si calibru de 3,5 – .

Structura

In structura duodenului intra patru tunici si un strat:

tunica seroasă (Tunica serosa) reprezentată de peritoneu

stratul subseros (Tela sbserosa) format din țesutul conjunctiv lax

tunica musculara (Tunica muscularis) care este alcatuită dintr-un strat extern format din fibre longitudinale și un strat intern format din fibre circulare

tunica submucoasă (Tela submucosa) este formată din țesutul conjunctivo-elastic lax

tunica mucoasă ( Tunica mucosa) formată din epiteliu si corion

Jejunul si ileonul ( Jejunum; Ileum)

Jejunul și ileonul este portiunea intestinului subțire cuprinsă intre duoden si cec. Ocupă porțiunea sperficială a etajului submezocolic al cavitații abdomino-pelvine și este legat de peretele abdominal posterior prin intermediul mezenterului.

Structura

În structura jejunului și ileonului intră patru tunici și un strat:

tunica seroasă (Tunica serosa) formată din peritoneul visceral;

stratul subseros (Tela subserosa) este o patură de țesut conjunctiv lax situată pe fața profundă a peritoneului;

tunica musculară (Tunica muscularis), alcătuită din două straturi, extern longitudinal si intern circular;

tunica submucoasă (Tunica submucosa), alcatuită din țesut conjunctiv lax;

tunica mucoasă (Tunica mucosa), formată din epiteliu, corion si lamina musculară a mucoasei.

INTESTINUL GROS

Intestinul gros reprezintă porțiunea terminală a tubului digestiv, continuă ileonul terminal de la nivelul valvei ileocecale și se deschide la exterior prin intermediul orificiului anal.Are lungimea de 1,3 – și un calibru de la aproximativ 7 – inițial până la 3 – în porțiunea terminală. Intestinului gros i se pot descrie trei porțiuni: cecul, colonul (divizat în colonul ascebdent, colonul transvers, colonul descendent și colonul sigmoidian) și rectul.

Cecul (Caecum)

Cecul reprezintă porțiunea initială a intestinului gros, situat sub planul care trece prin locul de deschidere a ileonului la nivelul unghiului ileocolic, La nivelul feței sale mediale este situat apendicele vermiform, iar superior se continuă cu colonul ascendant. Lungimea sa este de 6 – (este mai lung la vârstnici) și înaltimea de . De obicei este situat în fosa iliacă dreaptă, dar uneori poate avea o poziție înaltă, respectiv lombară, prerenală sau subhepatică, sau o poziție joasă, în pelvis unde poate coborî până la nivelul fundului de sac .

Structura

Peretele cecului prezintă patru tunici și un strat

tunica seroasă (Tunica serosa), reprezentată de peritoneu;

stratul subseros (Tela subserosa) captușește peritoneul;

tunica musculară (Tunica muscularis) este formată din două straturi: un strat extern cu fibrele longitudinale, și un strat intern cu fibre circulare;

tunica submucoasă (Tela submucosa) conține vase sangvine și limfatice, nervi și foliculi limfatici solitari;

tunica mucoasă (Tunica mucosa), formată din epiteliu și corioni.

Apendicele vermiform (Appendix vermiformis)

Apendicele vermiform este un organ limfoid, care are forma unui tub cilindric, ce se deschide la nivelul feței mediane a cercului de aproximativ inferior de valvula ileocecala. Are lungimea de 8 – și un calibru de 6 – . Baza apendicelui este situată la locul de confluență a celor trei tenii musculare.

Structura

Peretele apendicelui prezintă patru tunici:

tunica seroasă formată de peritoneul care învelește apendicele și formează un mezoapendice care se fixează pe cec și ileon;

tunica mucoasă este formată din două straturi: un strat extern cu fibrele dispuse longitudinal și un strat intern cu fibrele dispuse circular;

tunica submucoasă, care prezintă numeroși foliculi limfatici;

tunica mucoasă formată din epiteliu si corion.

Colonul

Colonul este poțiunea intesinului gros cuprinsă intre cec și rect, are lungimea cuprinsă între și și un calibru care descrețește de la în porțiunea initială la 2,5 – în porțiunea terminală și este împărțit în patru segmente: colonul ascendant, colonul transversal, colonul descendent și colonul sigmoidian.

Structura

Peretele colonului prezintă patru tunici și un strat:

tunica seroasă care este reprezentată de peritoneu;

stratul subseros care tapetează fata profundă a stratului seros;

tunica musculară este formată din doua straturi musculare, un strat extern cu fibre dispuse longitudinal și un strat intern cu fibre dispuse circular;

tunica submucoasă care contine vase sangvine si limfatice, nervi și foliculi limfatici solitari;

tunica mucoasă este formată din epiteliu și corion.

Rectul (Rectum)

Reprezintă ultima porțiune a intestinului gros. Limita superioară o reprezintă locul unde se termină mezocolonul sigmoidian, corespunzător vertebrei S₃, fiind usor strangulată. Limita inferioară este reprezentată de orificiul anal prin intermediul căruia se deschide la exterior.

Prezintă doua porțiuni cu structră diferita: o porțiune pelvină, largă și lungă, numită ampula rectului (Ampulla recti) și o porțiune perianală, mai îngustă și mai scurtă numită canalul anal.

Structra

Peretele rectului prezintă patru tunici și un strat:

tunica seroasă este reprezentată de peritoneu;

stratul subseros tapetează fața profundă a stratului seros;

tunica musculară este formată din doua straturi musculare, un strat extern cu fibre dispuse longitudinal și un strat intern cu fibrele dispuse circular;

tunica submucoasă care contine vase și nervi;

tunica mucoasă este formată din epiteliu și corion.

Figura 1. Anatomia tractului gastrointestinal

Intestinul are 6 tipuri de celule intestinale (figura 2) cu importanță fiziopatologică:

1) Enterocitele prezintă microvili la polul luminal alcelulei. Glicocalixul de la suprafața lor conține enzime digestive și pentru absorbție. Turn overul enterocitelor e cel mai rapid din tot organismul .

2) Celulele auxiliare nu au capacitate digestivă, acționează ca receptori pentru IgA și IgM, sunt considerate sursă de ioni de clor.

3) Celulele caliciforme au rol de a secreta mucus.

4) Celulele Paneth au rol secretor și de fagocitoză.Produc criptidină și lizină.Au acțiune toxică asupra bacteriilor.

5) Celulele cromargentafine produc serotonină, catecolamine, gastrină, somatostatină, colecistokinină, entero-glucagon etc.

6) Celulele M (mezenchimale) au rol în transportul antigenilor spre țesutul

limfoid.

Figura 2. Tipuri de celule intestinale

Sursa:http://allergiesandyourgut.com/wpcontent/

uploads/2016/01/LP120ICIL046ICcfbcWhiteas0thn12r12rw2rc666666vs1d20150128T210652.png

Noțiuni de fiziologie

a) Mecanismele de transport transmembranar al apei și electroliților stau la baza mecanismelor fiziologice de secreție și absorbție la nivelul tubului digestiv.

Celula intestinală este inzestrată la polul bazal cu mecanisme enzimatice diferențiate, cunoscute sub denumirile de: pompa cuplată cu Natriu/K – ce asigură pătrunderea in celula a ionilor de K în schimbul celor de Na, schimb efectuat cu consum de energie asigurat de ATP.

Canalul de Na-K-Cl este un sistem enzimatic ce asigură pătrunderea in celula a unui cuplu de ioni pozitivi (Na si K) in echilibru cu 2 ioni de Cl negativi. Canalul selectiv de K – prin care excesul celular de K, penetrat prin cele două mecanisme precedente, este recuperat de organism și se intoarce în sânge.

In mod fiziologic, dechiderea acestui canal este reglată de sistemul adenilatciclază și AMP ciclic.

Figura 3. Mecanisme de transport transmembranar

b) Circuitul enterosistematic al apei

În condiții fiziologice trece prin intestine, într-o singură zi, mai mult de jumătate din volumul total de lichide extracelulare ale organismului. Acest flux este asigurat de: apa de aport alimentar, secreții digestive. majoritatea lichidelor se reîntorc in organism datorită mecanismelor de resorbție, acestea începând chiar din gură și stomac, dar semnificativ din duoden și jejun, scăzând apoi in ileon și sfârșind la nivelul colonului.

Căile de control ale secreției și permeablității enterocitului

Fenomenele de control ale absorbției și secreției de apă și electroliți sunt reglate prin patru mecanisme sub dependența a patru factori principali: AMPc, GMPc, calciu intracelular și proteinele citoscheletului.

CAPITOLUL II. SINDROMUL DIAREIC INFECȚIOS

Definiție

Cuvântul “diaree” este derivat din cuvântul grec “diarrhoia”, care înseamnă “pierdere de fluide” pe cale digestivă (intestinală).

Boala diareica este expresia unor dereglări majore a mecanismelor de secreție, absorbție și transport al lichidelor din tubul digestive.

Definitoriu, sindromul diareic este o entitate clinică, ce se caracterizează prin scaune frecvente (3 – 40 /24h), de consistentă redusă (uneori apoasă) însumând volume mari de pierderi lichidiene ce pot duce la dezechilibrări hidroelectrolitice însotite de tulburări hemodinamice grave.

Intestinul subțire

Pe suprafața intestinului există creste intestinale pe care sunt poziționați vilii, fiecare vil intestinal e format din numeroase enterocite care prezintă la marginea liberă microvili. Deteriorarea oricăreia dintre structurile amintite poate duce la disfuncții intestinale, cel mai adesea urmat de diaree.

Intestinul gros

Intestinul gros absoarbe apa și conține bacterii simbiotice ce ajută la eliminarea metaboliților.

Sub acțiunea enzimelor, florei și secrețiilor intestinale ingesta e descompusă în particule absorbabile, iar restul este excretat. Pe suprafața intestinului există creste intestinale pe care sunt poziționați vilii. Fiecare vil intestinal e format din numeroase enterocite care prezintă la marginea liberă microvili. Deteriorarea oricăreia dintre structurile amintite poate duce la disfuncții intestinale, cel mai adesea urmat de diaree.

Figura 4. Structura intestinului

Sursa: http://www.daviddarling.info/images/small_intestine_cross-section.jpg

Rezervorul de infecții

În tările în curs de dezvoltare, infecțiile gastrointestinale sunt considerate infecții hiperendemice. Izvorul de infecție principal este reprezentat de fermele avicole și mediul înconjurător aferent acestora (figura 5) (Kaakoush și colab., 2015).

De asemenea, un rol in diseminarea agenților patogeni il au și vectorii resprezentați de insecte precum și apa care nu este supusa unui tratament corect de clorinare, laptele nepasteurizat, animalele domestice, dar și alimentele contaminate in timpul procesării (Oorea și colab., 2005)

Figura 5: Rezervorul de infecție, căile de transmitere și manifestări clince asociate patogenilor intestinali (Kaakoush și colab., 2015).

Fiziopatologia sindromului diareic

Mucoasa digestivă are structuri diferențiate ce corespund perfect funcțiilor de: transport, digestie si resorbție.

Boala diareică este expresia unor dereglări majore a mecanismelor de secreție, absorbție și transport al lichidelor din tubul digestiv.

Factorii implicați ín mecanismele diareei acute

Apariția diareei depide de: factorii legați de organismul gazdă-țintă, factorii legați de agentul patogen.

A. Factorii legați de organismul gazdă

Lumenl este limitat de o barieră de mucoasa ce se opune pătrunderii microorganismelor, toxinelor si antigenelor.

Bariera de mucoasă este compusă din elemente ne-imunologice și elemente imunologice.

a) Bariera de mucoasa ne-imunologică

Aciditatea gastrică care este o piedică importantă în colonizarea intestinului subtire cu germeni Gram pozitivi.

Enzimele proteolitce care deteriorează constituții ai germenilor și toxinelor, scăzând diminuarea de fixare și patrundere in membrana enterocitară.

Peristaltismul intestinal. Agentul infecatant la nivelul mucoasei ce provoacă o accelerare a peristaltismlui care reduce timpul de contact cu mucoasa. În mod normal intestinul subțire, în afara prânzului este activat de complexul motor migrant.

Mucusul intestinal este linia de apărare a mucoasei intestinale, el având urmatoarele funcții: bariera fizico-chimică împotriva difuziunii micro-organismelor; bariera antibacteriană prin lizozim; bariera anionică contra penetrării germenilor prin numeroșii radicali sialați si sulfați electronegativi. Proprietățile mucusului sunt de adeziune la sprafața epitelială, vascozitate variabilă, permeabiltate selectivă, hidrofobicitate care permite creșterea stabilității și rezistenței la agresori, rezistența la proteoliză și putere antiinfecțioasă datorită IgA și a florei saprofite.

Adeziunea germenului. Puterea patogenică se exprimă după fixarea pe eritrocit. Fixarea acceptă supraviețuirea germenilor și eliberarea toxinelor la contact cu eritrocitul.

b) Bariera de mucoasă imunologica

Mecanismele imunitare de apărare sunt celulare și umorale. Intestinul are cea mai mare concentrare de celule imunologice capabile din organism, regrupate in foliculi limfoizi, bogați in limfocite B, iar atmosfera perifoliculară in limfocite T. Foliculii sunt acoperiți de un epiteliu ce conține 5-10% din celulele enterocitare, celule M. Acestea au un rol important în transmiterea informației antigenice la structurile imunitare subiacente, având capacitatea de transport a macromoleculelor sau microorganismelor la țesutul limfoid subiacent fără a le degrada.

B. Factori legați de microorganismul patogen

Pentru a fi un agent patogen enteric, microorganismul, trebuie sa fie un colonizator bun, capabil să comunice cu celulele eukariote pentru a induce secreția de apă și de electroliți.

Etapele esențiale în producerea unei infecții digestive

a) Mărimea inoculului – numărul de germeni ajunși în lumenul intestinal

b) Adezinea la mucoasă este esențială; există mai multe tipuri de mijloace de adeziune caracteristice pentru fiecare tip de microorganism

c) Multiplicarea germenilor

d) Toxigeneza – proprie unor germeni – este concomitentă cu procesul de multiplicare (exotoxine ce se elaborează în perioada de înmulțire logaritmică a germenilor)

e) Citopatogenitatea, formă de exprimare a agresivitații bacteriene, consecutive multiplicării; caracterizează germenii care penetrează și apoi se multiplicș intracelular, cu distrugerea celulei afectate.

Mecanismele sindromului diareic

Mecanisme generale in diareea acută

a) Mecanismul care interesează procesul secretor (Diaree toxigenică secretore)

Diminuarea absorbției de apă se poate datora diminuării fluxului de apă din lumen către mediul extracelular sau stimulării proceselor secretoare de apă și electroliți ale mucoasei. Enterotoxinele secretate de anumite microorganism se alătură eritrocitului, pătrunzând în citoplasmă și activând adenilat sau guanilat ciclază membranară, ducând la creșterea AMPc sau GMPc. Acestea (AMPc, GMPc) determină activitatea transportorilor de ioni (Chiotan M., Boli infectioase, 2011)

b) Mecanismul legat de leziuni ale suprafeței absorbitive (diaree invazivă)

Anumiți agenți infecțioși, în special cei virali, ajută la distrucții celulare în special la nivelul celulelor vârfurilor vilozitare, în schimb, celulele criptice au activitatea secretorie crescută.În urma distrugerii directe a mucoasei de catre agentul invaziv apare diareea invazivă. Diareea provoacă eliminarea mucusului și sangelui în scaun și este provocată de germeni precum: Shigella, Salmonella, Campylobacter jejuni, E.coli invaziv și Rotavirus. Prin afectarea procesului normal de reînnoire al epiteliului intestinal subțire, microorganismele perturbă transportul ionilor. Vizolitățile sunt populate cu celule imature care duc la lactază datorită procesului de repartiție lent (Chiotan M., Boli infectioase, 2011).

c) Mecanisme care interesează procesul osmotic și de transport ionic prin mucoasa intestinală (diaree osmotică)

Caracteristic pentru diareea prin malabsorbție este dezechilibrul osmotic, reprezentând o cauza asociată în cursul diareei secretorii sau enterotoxinice, determinând diminuarea capacitatii de absorbție a zaharurilor și electrolitilor (Chiotan M., Boli infectioase, 2011).

d) Mecanismul legat de inflamația mucoasei intestinale și fenomenele motorii

Procesul inflamator, prin intervenția sistemului imunitar digestiv regăsit în mucoasa și submucoasa intestinală este determinat de toxine și germeni. Accelerarea tranzitului este determinată de fenomenele motorii reprezentate de complexul migrator al potențialului de actiune. Tranzitul accelerat agravează simptomele afectând capacitatea de absorbție (Chiotan M., Boli infectioase, 2011).

Mecanisme specifice în diareea acută

A. Mecanisme in diareea bacteriană

Bacteriile pot provoca diaree prin mecanisme asociate:

anumite bacterii alterează peretele eritrocitar și reduc suprafața de absorbție, direct prin invazia mucoasei cu inflamație sau indirect cu ajutorul toxinelor;

altele eliberează enterotoxinele care modifică balanța hidrică fară a avea vreun impact asupra morfologiei mucoasei;

unele aderă la membrana apicală a enterocitului colonizându-l masiv, iar apoi antrenează distrucția reliefului microvilozitar cu pierderea echipamentului enzimatic .

Clasificarea bacteriilor patogene se poate face în funcție de modul de acțiune (Tabelul 1).

Intoxicația și infecția propriu-zisă sunt cele două mecanisme fiziopatogenice principale prin care se pot produce diareile bacteriene.

Tabel 1. Clasificarea bacteriilor patogene după modul de acțiune

B. Mecanisme in diareea virală

Mecanismul diareei în infecția virală este de origine invazivă și de origine secretorie.

a) Mecanismul invaziveste foarte bine cunoscut și duce la atrofie vilozitară. Vilozitațile intestinului subtire sunt infectate cu virus. Modificările histologice apar în primele 24 – 72 de ore și pot fi la nivel celular cu rotunjirea celulelor epiteliale și descuamare, precum și la nivel arhitecural general, la nivelul mucoasei.

b) Mecanismul de origine secretorieapare prin enterotoxina virală. O proteină nestructurală care se comportă ca o enterotoxină este sintetizată de unele virusuri. Este prima enterotoxină virală pusă în evidentă și actionează mobilizând calciu intracelular, fiind capabilă de a induce diareea.

Figura 6. Mecanismul infecției virale cu Rotavirus

C. Mecanisme in diareea parazitară

Aceste mecanisme nu sunt cunoscute complet, evocându-se mai multe mecanisme, adesea asociate:

unii patogeni formază o barieră mecanică a absorbției;

alții determină alterarea mucoasei intestinale, lucru care duce la accelerarea reînnoirii enterocitare;

producerea toxinelor care provoacă reacția inflamatorie și modificări ale motricității intestinale.

Fiziopatologic, diareea se explică prin:

malabsorbție;

hiperpermeabilizarea epiteliului intestinal prin inflamație și obstrucție;

secreție activă de anioni prin activarea AMP-ului ciclic;

creșterea motilității intestinale (inflamație);

înlocuirea epiteliului absorbtiv de la nivelul criptelor cu epiteliu de tip secretor (în viroze).

Aspecte clinice și etio-patogenetice

Factorii favorizanți ai bolii diareice acute:

vârsta, stare imunitară și patologia subiacentă a persoanei;

aliementația artificială sau subalimentația copiilor de vârstă fragedă;

malabsorbția lactozei sau intoleranța pentru proteinele din lapte;

infecțiile intestinale mixte persistente;

imunodepresia;

starea sanitaro-igienică defavorabilă a teritoriului și a bazinelor de apă;

asigurarea nesatisfăcătoare a populației cu apă potabilă de calitate;

nerespectarea regulilor sanitaro-igienice în obiectivele de alimentație publică și de comerț cu produse alimentare;

nerespectare regimului sanitaro-igienic în colectivele de copii (creșe, grădinițe, școli);

calamitățile naturale, precum inundațiile, cutremurele de pământ, etc.;

crizele economice grave etc.

Consideratii clinice

sindrom holeriform: diaree apoasă; scaune lichide cu aspect de „apă de orez” foarte frecvente și abundente; vome (uneori); dureri abdominale; semne de deshidratare instalate rapid – grave în cazul holerei; afebrilitate;

sindrom dizenteric: scaune numeroase, afecaloide, cu glere mucoase (mucozități), muco-purulente, uneori cu striuri sanguinolente („spută rectală”); dureri abdominale, colicative, difuze; tenesme (senzații obligatorii de defecare, false); vome; febră în shigelloze, absentă în amibiaze;

sindrom de gastro-enterită (diaree banală) scaune lichide frecvente; dureri abdominale difuze; vome și febrilitate.

Etiologia sindromului diareic infecțios

Sindromul diareic este reprezentat în patologia infecțioasă printr-o gama largă de entități clinice cu particularități simptomatice și evolutive determinate în primul rând de agentul etiologic. În tabelul 2 sunt înscrise principalele etiologii cunoscute în prezent și corespondența clinică în care sindromul diareic este numai una din manifestări.

Tabelul 2. Etiologia sindromului diareic infecțios (Buiuc D., Tratat de microbiologie clinica, 2009)

Agenți infecțioși bacterieni

Salmonella spp.

Genul Salmonella cuprinde Enterobacteriaceae mobile care fermentează glucoza cu producere de gaze.

Sursele majore responsabile pentru infecțiile cu acest microorganism sunt omul și animalele, care contribuie la poluarea solului, apelor reziduale, apelor de suprafață în care pot supraviețui luni și chiar ani.

Trei tipuri clinice de salmoneloze au fost descrise la om:

salmonelozele sistemice sau febrile enterice (febra tifoidă și paratifoidă)

salmonelozele enterice reprezintă forma comună; sunt o parte importantă a sindromlui diareic bacterian cu preponderență la copilul până la 3 ani; in conditii deficitare de apărare, pot apărea localizări secundare diverse: meningeale, pulmonare, osoase etc

septicemiile salmonelozice care sunt complicații ale formelor enterice

Figura 7. Structura Salmonellei

Yersinia enterocolitica sunt bacili gram negativi mici, nesporulați.

Y. enterocolitica se transmite prin ingerarea de apă și alimente contaminate, adesea carne gătită insuficient (cu precădere de porc).

Severitatea bolii este dată de serotipul tulpinii care cauzează infecția și variază de la gastroenterita auto-limitata la ileita terminală și limfadenita mezenterică. Simptomele bolii sunt similare cu cele ale apendicitei și pot determina intervenții chirurgicale care nu sunt necesare, de unde importanța identificării corecte a acestui microorganism atunci când este prezent în eșantioanele de scaun (Buiuc D., Tratat de microbiologie clinica, 2009).

Figura 8. Yersinia

Escherichia coli/Shigella diareigen

E. coli/Shigellapatogen reprezintă o cauză semnificativă a bolilor diareice din întreaga lume. Există o serie de patotipuri ale E. coli/Shigella diareigen, care diferă din punctul de vedere al mecanismelor și locului de colonizare, precum și din punctul de vedere al manifestărilor clinice, progresiei și severității bolii pe care o cauzează. Unele dintre aceste diferențe pot fi atribuite producției unor factori cu virulență specifică, inclusiv adezinele, invazinele și toxinele.

Genele care codifică acești factori de virulență sau regulatorii acestora sunt vizate ca markeri genetici prin testele moleculare, în scopul detectării și diferențierii acestor patogeni. Cele cinci patotipuri majore de E. coli/Shigella diareigen sunt E. coli enteroagregativ (EAEC), E. coli enteropatogen (EPEC), E. coli enterotoxicogen (ETEC), E. coli producător de toxină Shiga (STEC) și Shigella/E. coli enteroinvaziv (EIEC). Mai jos, este prezentat fiecare patotip, alături de markerii genetici caracteristici (Buiuc D., Tratat de microbiologie clinica, 2009).

Shigella/E. coli enteroinvaziv (EIEC).

Există patru subgrupuri ale speciei Shigella: subgrupul A (S. dysenteriae), subgrupul B (S. flexneri), subgrupul C (S. boydii) și subgrupul D (S. sonnei). Toate tipurile de Shigella sunt bacili imobili, gram negativi, care, în general, se transmit prin contact cu o persoană infestată sau prin ingerarea de apă sau alimente contaminate (omul și alte primate sunt singurele rezervoare animale cunoscute). Infecțiile apar cel mai frecvent în condiții de igienă precară, cum ar fi în instituții (grădinițe, creșe) și pot deveni endemice în societățile în curs de dezvoltare, fără apă curentă și sistem sanitar interior. Shigella este responsabilă pentru numeroase boli, inclusiv shigeloza și dizenteria bacilară care poate cauza diareea cu sau fără sânge.

E. coli enteroinvaziv (EIEC), spre deosebire de majoritatea tipurilor de E. coli, nu decarboxilează lizina și nu fermentează lactoza. Determina un sindrom diareic dizenteriform. Procesul invaziei, ca si la Shigella, are patru faze:

penetrarea EIEC in celulele M din mucoasa colonului

atasarea de suprafata bazolaterala a celulei intestinale, care le endociteaza

multiplicarea la nivel intra si inter cellular si raspandirea in submucoasa prin intermediul fagocitelor in care supravietuiesc

moartea celulei intestinale ca urmare a blocare a sintezei proteice (Buiuc D., Tratat de microbiologie clinica, 2009).

E. coli enteroagregativ (EAEC) este definit prin modelul de aderență agregativă sub formă de „cărămizi stivuite”. Deși prezintă un număr mare de factori de virulență care nu sunt conservați la toate tulpinile, majoritatea EAEC sunt purtători ai plasmidei de aderență agregativă (pAA). Tulpinile care conțin aggR pe plasmida pAA au fost clasificate drept EAEC tipic, în timp ce cele care nu conțin acest marker sunt considerate EAEC atipic. EAEC cauzează o boală diareică inflamatorie caracterizată prin scaun apos și uneori hemoragic, însoțit de febră ușoară, vomă și dureri abdominale.Infecțiile cu EAEC pot fi și asimptomatice (Buiuc D., Tratat de microbiologie clinica, 2009).

E. coli enteropatogen (EPEC) a fost incriminat în etiologia unor pusee epidemicede diaree malignă la copii sub varsta de un an. Nu produce enterotoxine. EPEC conțin factori suplimentari de virulență: proteina de aderență, intimina, este codificată de gena eae din locusul LEE și este considerată drept marker decisiv pentru EPEC.

Boala cauzată de EPEC tipic este asociată cu diareea acută, în timp ce EPEC atipic induce scaune diareice prelungite, fără hemoragii, cu vomă și febră. Dacă nu este tratată, în cazul copiilor, boala indusă de EPEC poate duce la malnutriție și retard de creștere asociat (Buiuc D., Tratat de microbiologie clinica, 2009).

E. coli enterotoxigen (ETEC)este agentul frecvent al unui sindrom diareic holeriform la copii în țările subdezvoltate și determină “diareea călătorilor” la adulții din țările dezvoltate.

Prezența enterotoxinelor termolabile (lt) și/sau termostabile (st) definește E. coli enterotoxigen (ETEC).Aceste toxine se leagă de celulele epiteliale intestinale cauzând pierderea de electroliți și, prin urmare, instalarea scaunelor diareice apoase. ETEC se transmit pe calea fecal-orală și sunt recunoscuți, din ce în ce mai frecvent, drept patogeni alimentari (Buiuc D., Tratat de microbiologie clinica, 2009).

E. coli producător de toxină Shiga (STEC), inclusiv E. coli O157. Există două tipuri de toxine Shiga principale: toxina Shiga 1 (Stx1) și toxina Shiga 2 (Stx2) (cunoscute și ca verotoxine). E. coli producător de toxină Shiga (STEC) poate conține fie una, fie ambele gene stx. STEC reprezintă una dintre cauzele principale ale diareii hemoragice și poate progresa până la o stare potențial fatală cunoscută drept sindrom hemolitic uremic, cu precădere în rândul copiilor foarte mici și al persoanelor în vârstă.

STEC sunt patogeni alimentari importanți. Infecțiile pot fi transmise și prin apă, de la o persoană la alta sau prin contactul cu animalele (cu precădere bovine, care sunt rezervoare pentru STEC) (Croxen, M. A. et al. Recent Advances in Understanding Enteric Pathogenic Escherichia coli. Clinical Microbiology Reviews 26, 822–880 2013, Buiuc D., Tratat de microbiologie clinica, 2009).

Figura 9. E. coli

Vibrio (V. parahaemolyticus/V. vulnificus/V. cholerae) Vibrio sunt bacterii mobile, gram negative, cu aspect de virgulă, care se regăsesc, în general, în medii marine. Mai multe specii pot cauza boli la om, atât extraintestinale (infecție a țesuturilor moi, septicemie, infecții oculare și auriculare), cât și intestinale.

Bolile gastrointestinale cel mai frecvent asociate cu V. cholerae, V. parahaemolyticus, V. vulnificus, V. fluvialis, V.mimicus sau V. alginolyticus și infecțiile sunt asociate cu consumul de alimente contaminate, cu precădere în regiunile costiere. V. cholerae este singura specie Vibrio care cauzează holera endemică, epidemică și pandemică. Există trei sub-grupuri majore ale V. cholerae: V. cholerae O1, V. cholerae O139 și V. cholerae non-O1/non-O139.

Campylobacter (C. jejuni/C. coli/C. upsaliensis) Campylobacter grup de bacterii gram negative, neproducătoare de spori, în formă de „s” sau spiralate, în general mobile.

Majoritatea infecțiilor sporadice se contactează prin ingerarea de carne de pui gătită insuficient sau ca urmare a contaminării încrucișate a altor alimente. Focarele au fost asociate cu produsele lactate nepasteurizate, apa contaminată, carnea de pui, legumele și fructele proaspete.

C. jejuni și C. coli sunt speciile cel mai frecvent asociate cu boala diareică.

Speciile din genul Campylobacter au fost considerate patogeni exclusiv ai animalelor pană în 1938 până când Levy a izolat din fecalele și sângele bolnavilor în cursul unei epidemii enterice transmisă prin lapte, bacterii cu morfologie caracteristică campylobacteriilor. În prezent, acestea alături de salmonele, sunt considerate cei mai importanți agenți etiologici ai gastroenteritelor la om (Cróinín, și Backert, 2012).

Clostridium difficile sunt bacili obligat anaerobi, gram pozitivi capabili să formeze spori rezistenți și sunt răspândiți în natură. Aceste bacterii pot fi contactate din mediu sau transmise pe calea fecal-orală. Unele tulpini de C. difficile produc două enterotoxine, toxina A și toxina B, care afectează intestinul gros al persoanei infectate.

Infecția cu C. difficile (CDI) este cauza principală a diareii intraspitalicești și este responsabilă pentru peste 300000 de cazuri de boală diareică și 14000 de decese înregistrate anual în SUA. Manifestările clinice ale infecției cu C. difficile variază de la purtători asimptomaticipână la colita pseudomembranoasă, cu simptome cum ar fi scaunul diareic cu sânge, dureri abdominale severe și febră (Bauer, M. P. et al. Clostridium difficile infection in Europe: a hospital-based survey. Lancet 377, 63–73 (2011).

Plesiomonas shigelloides esteun bacil gram negativ, membru al familiei Enterobacteriaceae, este izolat dintr-un număr mare de surse din mediu, inclusiv apa proaspătă, dar și numeroase animale sălbatice și domestice.

Gastroenterita cu P. shigelloides survine deseori ca urmare a consumului de fructe de mare, dar și de apă contaminată folosită pentru băut sau la prepararea alimentelor fără foc. În general, simptomele includ diareea apoasă, scaune dizenterice afecaloide și prelungirea infecțiilor (>2 săptămâni), însă, de cele mai multe ori, sunt autolimitate (Wong, T. Y. et al. Plesiomonas shigelloides infection in Hong Kong: retrospective study of 167 laboratory-confirmed cases. Hong Kong Med J 6, 375–380 (2000).

Agenti infectiosi virali

Adenovirus F 40/41. Adenovirusurile sunt virusui ADN dublu-catenari din familia Adenoviridae care pot cauza o varietate de boli, inclusiv afecțiuni respiratorii și boli gastrointestinale.

Există șapte specii de Adenovirusuri (A-G) care se împart în aproximativ 57 de serotipuri; cu toate acestea, boala diareica este asociată cu precădere cu serotipul F (formată din serotipurile 40 și 41). Adenovirusul F 40/41 este responsabil pentru 5% până la 15% dintre bolile diareice acute la copii (cu precădere cei sub doi ani).

Calea principală de transmitere este cea fecal-orală, iar focarele au fost raportate în spitale și grădinițe. Deși infecțiile cu Adenovirus apar cel mai frecvent în rândul copiilor, adulții sunt afectați în egală măsură. Boala este, în general, ușoară, dar de relativ lungă durată (5–12 zile). În cazul pacienților imunocompromiși, simptomele pot include scaune diareice cronice, prelungite și alte complicații. Virusul poate fi diseminat prin scaun timp de mai multe săptămâni sau chiar luni după forma acută a bolii; prin urmare, identificarea persoanelor infectate poate fi importantă pentru izolarea pacientului și controlarea contagiozității bolii (Buiuc D., Tratat de microbiologie clinica, 2009).

Astrovirus.Astrovirusurile (virusuri ARN din familia Astroviridae) își regăsesc explicația pentru denumirea atribuită în structura lor caracteristică sunt formă de asteroid și pot fi întâlnite la mai multe animale, inclusiv păsări și mamifere.

Există opt serotipuri ale Astrovirusului uman (HAstv 1–8) asociate gastroenteritei la copii și adulți.

Calea de transmitere este cea fecal-orală, iar populațiile de risc includ copiii, adulții imunocompromiși, cei care se ocupă de îngrijirea copiilor infestați, trupele militare și personalul din aziluri. Simptomele sunt raportate a fi mai puțin severe decât în cazul altor virusuri enterice și includ diareea, voma, durerile abdominale și febra cu o durată de 72 de ore (Utagawa, E. T. et al. Astrovirus as a cause of gastroenteritis in Japan. J. Clin. Microbiol. 32, 1841–1845 (1994).

Norovirus GI/GII.Norovirusurile sunt membrii extrem de contagioși ai familiei Caliciviridae de virusuri ARN și pot fi împărțiți în cinci genogrupuri (GI – GV). GI, GII și GIV au fost identificați cel mai frecvent la om (deși GIV este foarte rar), cauzează gastroenterită moderată spre severă, constând în primul rând din greață, vomă și diaree însoțită de febră.

Virusul se transmite pe calea fecal-orală sau prin vomă aerosolizată, doza infecțioasă putând fi chiar și de nu mai mult de 18 particule.Simptomele infecției durează, în general, 24–48 de ore, boala fiind autolimitata. Cu toate acestea, pacienții imunocompromiși pot prezenta diaree cronică, în timp ce în cazul unor copii s-a raportat colita necrotizantă. Focarele sunt frecvente în comunități închise, cum ar fi vasele de croazieră, spitalele, grădinițele, școlile și centrele militare. Lunile de iarnă reprezintă sezonul de vârf al infecției. Imunitatea specifica castigata dupa infectia Norovirus este de scurtă durată, întrucât reinfestarea este posibilă în 6 luni, chiar și în prezența unor titruri ridicate de anticorpi (Ahmed, S. M., Lopman, B. A. & Levy, K. A systematic review and meta-analysis of the global seasonality of norovirus. PLoS ONE 8, e75922 (2013).

Rotavirus A.Rotavirusurile sunt virusuri ARN dublu catenar din familia Reoviridae și sunt agenții etiologici cheie în diferite tipuri de afecțiuni diareice în rândul sugarilor și copiilor mici din întreaga lume. Dintre cele șapte grupe de Rotavirusuri (A până la G), Rotavirusurile A, B și C se transmit la om, Rotavirusul A fiind responsabil pentru majoritatea infecțiilor.

Simptomele infecției pot fi ușoare și pot dura câteva zile, însă persistența bolii poate cauza deshidratare severă la copiii <2 ani, iar infecțiile cu Rotavirusul A sunt o cauză importantă a mortalității infantile din țările în curs de dezvoltare. Sezonul de vârf al îmbolnăvirilor este iarna/primăvara, în zone cu climă temperată (Pediatric ROTavirus European CommitTee PROTECT. The paediatric burden of rotavirus disease in Europe. Epidemiol. Infect. 134, 908–916 2006).

Figura 10. Structura Rotavirusului

Sapovirus (Genogrupurile I, II, IV și V). Sapovirusul face parte din familia Calciviridae și este similar cu Norovirusul, atât din punct de vedere genetic, cât și din punctul de vedere al simptomelor bolii. Există cinci genogrupuri (GI–GV); grupurile GI, GII, GIV și GV afectează omul, în timp ce GIII cauzează boala diareică la porcine.

Sapovirusul cauzează cel mai frecvent îmbolnăviri în rândul copiilor, deși și adulții sunt susceptibili, focarele fiind raportate în grădinițele cu program prelungit, penitenciare, vase de croazieră și spitale. Asemeni Norovirusului, Sapovirusul se transmite pe calea fecal-orală, cu sezonul de vârf în lunile de iarnă. Simptomele includ voma și diareea cu greață și febră timp de 5 până la 10 zile (Johansson, P. J. H. et al. A nosocomial sapovirus-associated outbreak of gastroenteritis in adults. Scand. J. Infect. Dis. 37, 200–204 2005 BioFire).

Agenti infectiosi parazitari

Cryptosporidium este un gen de protozoare care poate cauza infecții la nivelul stomacului uman, al intestinelor și al căilor biliare ca urmare a ingerării unor oochisturi cu toleranță la clor diseminate în materiile fecale și care pot contamina apa potabilă, piscinele sau alimentele.

Cryptosporidium se înscriu printre cei mai frecvenți factori declanșatori parazitari ai diareii în țările dezvoltate. Cel puțin 10 specii se transmit la om, însă C. hominis și C. parvum sunt cele mai frecvente. Boala este, în general, caracterizată prin gastroenterita de scurtă durată, eliminată prin tratament. Cu toate acestea, îmbolnăvirea severă este posibilă la pacienții imunocompromiși, cu precădere cei cu SIDA, unde vindecarea survine lent sau chiar deloc, boala putând fi fatală (Buiuc D., Tratat de microbiologie clinica, 2009).

Cyclospora cayetanensis sunt protozoare parazite care cauzează gastroenterita la om, singura gazdă cunoscută. Oochisturile cu spori sunt diseminate prin fecale. După o perioadă de maturare (care poate varia de la zile la săptămâni), oochisturile devin infecțioase și pot cauza îmbolnăviri dacă sunt ingerate prin alimente sau apă contaminată.

Infecțiile apar cel mai frecvent în regiunile cu climă tropicală, subtropicală sau caldă.Boala se prezintă ca diaree fără sângerare care poate avea o durată de până la câteva luni (Legua, P. & Seas, C. Cystoisospora and cyclospora. Curr. Opin. Infect. Dis. 26, 479–483 (2013).

Entamoeba histolyticasunt protozoare patogene răspândite în întreaga lume, cu o prevalență crescută în regiunile tropicale și subtropicale. Formele chistice ale E. histolytica sunt, în general, ingerate din materiale contaminate cu fecale, cum ar fi alimentele și apa, însă infecția poate fi transmisă și pe cale sexuală. Omul este rezervorul principal.

Majoritatea infecțiilor cu E. histolytica par a fi asimptomatice, însă unele infecții cauzează amebiază invazivă, care cauzează colita sau dizenteria ce poate îmbrăca forme severe include abcesele hepatice amibiene. Epidemiologia E. histolytica este incertă, întrucât standardul clinic de referință curent (microscopie) nu permite diferențierea sa de E. dispar nepatogen (Fotedar, R. et al. Laboratory diagnostic techniques for Entamoeba species. Clin. Microbiol. Rev. 20, 511–532, table of contents 2007).

Giardia lamblia (numit și G. duodenalis și G. intestinalis) sunt paraziți flagelari intestinali răspândiți în întreaga lume.

Giardia sunt cei mai frecvenți paraziți intestinali izolați în SUA și UE și reprezentă o cauza principală a parazitozei în întreaga lume.Rata infecțiilor atinge prevalența maximă în lunile de vară.

Majoritatea infecțiilor cu G. lamblia sunt asimptomatice, însă pacienții cu simptome se confruntă cu greață, febră și diaree apoasă.În general, infecțiile sunt autolimitate; cu toate acestea, însă, simptomele sunt de durată și unii pacienți dezvoltă forma cronică, putând duce la complicații (DuPont, H. L. Giardia: both a harmless commensal and a devastating pathogen. J. Clin. Invest. 123, 2352–2354 2013).

CAPITOLUL 3 – PARTEA PRACTICĂ

Scop si obiective

Scopul: evaluarea prevalenței principalelor specii patogene implicate în etiologia sindomului diareic, la copiii din secția de gastroenterologie a SCUC.

Obiective: detectarea simultană, în cadrul aceluiași test, a agenților patogeni implicați în etiologia sindromului diareic.

Materiale si metode

Recoltarea și transportul produsului patologic

Recoltarea probei de materii fecale trebuie să se facă înainte de începerea unui tratament cu antibiotice și cât mai aproape de debutul bolii diareice. Proba se recoltează din materii fecale emise spontan sau în urma administrării unu purgativ salin, din 2-3 locuri diferite sau din regiunile ce conțin mucus sau sânge. Cantitatea minimă este de 5g. Proba trebuie adusă în cel mai scurt timp la laborator (2 h), sau în cazul în care nu este posibil acest lucru, se folosește coprocultor cu mediu de transport Carry- Blair.

Diagnosticul molecular prin tehnica PCR (BIOFIRE)

FilmArray reprezintă un sistem de diagnosticare automat in vitro, care are drept principiu reacția PCR și analiza curbei HRM (Figura 11). Proudușii de reacție ai reacției PCR sunt evaluați folosind analiza curbei de topire ADN, iar rezultatele sunt generate automat (Spina, și colab., 2015).

Figura 11. Sistem automatPCR (BIOFIRE)

FilmArray Gastrointestinal (GI) Panel este un test in vitro calitativ pe bază de acid nucleic de tip multiplex destinat utilizării cu sistemele FilmArray. FilmArray GI Panel poate detecta și identifica simultan acizii nucleici pentru diferite bacterii, virusuri și paraziți, direct din probele de scaun în mediu de transport Cary Blair, recoltate de la persoane cu semne și/sau simptome de infecție gastrointestinală.

Următoarele tipuri de bacterii (inclusiv o serie de patotipuri diareigene E. coli/Shigella), paraziți și virusuri pot fi identificate folosind FilmArray GI Panel:

Bacterii

• Campylobacter (C. jejuni/C. coli/C. upsaliensis)

• Clostridium difficile (C. difficile) toxina A/B

• Plesiomonas shigelloides

• Salmonella

• Vibrio (V. parahaemolyticus/V. vulnificus/V. cholerae), inclusiv identificarea specifică a Vibrio cholerae

• Yersinia enterocolitica

• Escherichia coli enteroagregativ (EAEC)

• Escherichia coli enteropatogen (EPEC)

• Escherichia coli enterotoxigen (ETEC) lt/st

• Escherichia coli producător de toxină Shiga (STEC) stx1/stx2 (inclusiv identificarea specifică a serogrupului E. coli O157 din STEC)

• Shigella/Escherichia coli enteroinvaziv (EIEC)

Paraziți

• Cryptosporidium

• Cyclospora cayetanensis

• Entamoeba histolytica

• Giardia lamblia (cunoscută și sub denumirea de G. intestinalis și G. duodenalis)

Virusuri

• Adenovirus F 40/41

• Astrovirus

• Norovirus GI/GII

• Rotavirus A

• Sapovirus (Genogrupurile I, II, IV și V)

Sistemul FilmArray este un dispozitiv automat destinat utlizării în combinație cu pungile cu reactivi specifici pentru test, pentru a detecta mai mulți agenți patogeni pe baza reacției PCR. Dispozitivul FilmArray interacționează cu punga atât pentru purificarea materialului genetic, cât și pentru amplificarea acestuia. Dispozitivul este conectat la un computer pe care rulează softul FilmArray, care controlează dispozitivul, colectează, analizează și stochează datele generate de dispozitiv (Piralla,și colab., 2017).

Fiecare pungă este o componentă în sitem închis, izolată, de unică folosință, ce include toți reactivii necesari reacțiilor de izolare, purificare și amplificare a materialului genetic (figura 12. Acest lucru se face concomitent pentru mai multe microorganiseme (bacterii, virusuri, paraziți) (Hitchcock, și colab., 2018).

Figura 12: Imagine pungă de reacție. (A) recipiente cu reactivii liofilizați, (B) filmul de plastic împărțit în blistere, care prin interacțiunea cu dispozitivele de acționare și cu senzorii dispozitivului FilmArray asigură procesele biochimice: (C) Extracția și purificarea acizilor nucleici din proba brută, prin liza mecanică cu ajutorul sferelor magnetice, (D) PCR de tip multiplex dacă este cazul (are loc everstranscrierea), (E) PCR de tip singlet și analiza curbei de topire în cadrul unei testări multicanal.

Etapele reacției PCR

În reacția PCR are loc procesul de multiplcare din care rezultă miliarde de copii ale ADN-ului. Acestea sunt obținute prin separarea și folosirea fiecărei secvențe drept matriță pentru generarea de noi catene.Pentru identificarea agenților patogeni specifici, primeii sunt incluși în reacția PCR pentru a ținti fragmente unice ale genomului patogen. În cazul în care organismul de interes are ARN, se face rtPCR, care conține o etapă suplimentară de reverstranscriere înainte de analiza propriu-zisă de PCR pentru a converti secvența ARN în ADN (Bermingham, și Luettich, 2003).

În prima etapă are loc denaturarea ADN-ului. Proba este încălzită la aproximativ 94˚C pentru a transforma ADN-ul dublu catenar în ADN monocatenar. În a doua etapa are loc anelarea primerilor specific. Proba este răcită la aproximativ 60˚C, permițând primerilor să se lege la secvența ADN țintă. În a treia etapă are loc extensia catenei de ADN cu ajutorul unei ADN polimeraze, care în acest caz este o Taq polimerază (Lorenz, 2012).

Analiza PCR internă de tip multiplex (nmPCR) include două etape ale analizei PCR. În prima etapă, are loc atașarea unor primeri externi mai puțin specifici. În a doua etapă, are loc atașarea unor primeri interni, mai specifici, care se leagă la secvențele obținute în prima reacție cu primerii externi (Amar, și colab., 2007).

Analiza profilului curbei de topire este necesară pentru caracterizarea ampliconilor. Aceasta se realzează la finalul reacței de amplificare, prin creșterea temperaturii în intervalul 45˚C-90˚C. Creșterea se face din zecime de grad în zecime de grad. Această analiză se bazează pe faptul că fiecare secveță nucleotidică dublu-catenară are o temperatură de melting unică ce depinde exclusiv de sucesiunea de nucleotide. Pe măsură ce temperatura atinge Tm-ul unui amplicon, ampliconul se denaturează iar fluoresceța se reduce, eliberând fluorocromul, generîndu-se astfel o curbă de topire în care este ilustrată scăderea rapidă a fluorescenței. Peak-ul cu un TM specific este generat pentru fiecare amplicon (Tamburro și Ripabelli, 2017).

Analiza curbei HRM (high resolution melting) se face utilizând colorantul de legare ADN LCGreen Plus oferit de kit. Acest colorant este încorporat în copiile ADN create în cadrul fiecărui ciclu PCR. În momentul în care acest colorant este atașat le molecula dublucatenare, emite o lumină fluorescentă detectată de aparat. Pe măsură ce temperatura crește, iar ADN-ul trece în formă monocatenară, colorantul este eliberat și se înregistrază scăderea fluorescenței.

Conform manualului de utilizare oferit de producător, colectarea și pregătirea probei se realizează după cum umează:

Materiale și metode

Materiale:

– Pungi FilmArray GI Panel ambalate individual

– Fiole Sample Buffer (soluție tampon pentru probe) de unică folosință

– Flacoane de injecție cu soluție de hidratare de unică folosință

– Flacoane de injecție pentru probe de unică folosință

– Pipete de transfer ambalate indvidual

– Stație de încărcare pentru pungi

– FilmArray și software-ul

Etape de lucru:

– Se introduce punga în stația de încărcare

– Se introduce flaconul de injecție pentru probă

– Se introduce flaconul de injecție cu soluție de hidratare

– Se hidratează punga

– Se adaugă soluția tampon pentru probe în flaconul de injecție penru probe, evitându-se generarea de bule de aer

– Cu pipeta de transfer se extrage probă di recipientul cu mediu Cary Blair până la al doilea marcaj al pipetei

– Se transferă în flaconul de injecție pentru probe

– Se închide capacul flaconului de injecție pentru probe și se amestecă ușor

– Se reintroduce flaconul de injecție pentru probe în stația de încărcare, se desface capacul iar flaconul se introduce în portul pentru probă al pungii, se pasă ferm și se așteptă până când amestecul de probă este extras în pungă

– Se așează punga în FilmArray conform instrucțiunilor din soft

– Se urmăresc instucțiunile de pe calculator de pe calculator pentru inițierea testului

– Rezultatul este generat în mod automat

Figure 13. Rezultat pozitiv prin tehnica PCR (BIOFIRE)

CAPITOLUL 4 – Rezultate obținute

Rezultate și discuții

Rezultate privind prevalenta microorganismelor detectate

În perioada 1 iulie 2019 – 31 ianuarie 2020 în laboratorul de microbologie al SCUC au fost analizate 59 probe recoltate din materii fecale prin metoda PCR folosind FilmArray Gastrointestinal (GI) Panel.

Din totalul de 59 de cazuri, in 83% (n = 43) s-au detectat agenți infectioși; agenți bacterieni 56.5% (n = 23), virusuri 28.2% (n = 13) și paraziți 15.2% (n = 7), acest lucru evidențiindu-se în graficul 1.

Graficul 1.Prevalența speciilor detectate.

In graficul 2 se poate observa prevalența bacteriilor detectate prin metoda PCR folosind FilmArray Gastrointestinal (GI) Panel. Au dominat patotipurile diareigene de E.coli 62% (n = 16), urmate de Clostridium difficile toxin A/B 19% (n = 5), Campylobacter 11% (n = 3), Salmonella 4% (n = 1) și Yersinia enterocolitica 4% (n = 1).

Graficul 2.Prevalenta bacteriilor detectate.

In graficul 3 se poate observa prevalența virusurilor detectate prin metoda PCR folosind FilmArray Gastrointestinal (GI) Panel.Rotavirusul și Norovirusul au fost detectate într-un procent de 31% (n = 4), Adenovirusul și Sapovirusul la 15% dintre pacienții cu infecții virale (n = 2), iar Astrovirusul la 7.7 % dintre pacienți (n = 1).

Graficul 3.Prevalența virusurilor detectate.

Prevalența agenților infectioși parazitari, se poate observa în graficul 4. Speciile detectate au fost: Giardia lamblia 86% (n = 6) și Entamoeba histolytica 14% (n = 1).

Graficul 4.Prevalența paraziților detectați.

Prevalența coinfecțiilor detectate

În unele situații, au fost prezente coinfecții, FilmArray Gastrointestinal (GI) Panel oferind posibilitatea de a detecta prezența a doi sau mai mulți patogeni care au stat la baza sindromului diareic infecțios.

Din totalul de 46 de cazuri, au fost confirmate și 11 cazuri de coinfecții, fiind prezente în aceeași probă analizată atât specii bacteriene cât și specii virale și/sau parazitare.

În graficul 5, se observă că în 6,5% din cazuri (n = 3) s-au detectat coinfecții cu Norovirus/ EPEC, în 4,2% din cazuri (n = 2) Norovirus/ Giardia, 4.2 % (n = 2) cu Salmonella/ Adenovirus, 4.2% (n = 2) cu Clostridium/ Rotavirus și alte 4,2% cazuri ( n = 2) cu Clostridium/ Sapovirus/ EPEC .

Graficul 5. Prevalența coinfecțiilor detectate

Rezultate privind distribuția sezonieră a microorganismelor detectate

În ceea ce privește distibuția sezonieră a microorganismelor, s-au realizat analize comparative pentru lunile în care s-a efectuat studiul, reprezentate în graficul 6.

Graficul 6. Distribuția sezonieră

Distribuția sezonieră a cazurilor de boala diareica acuta nu are o corelație bine stabilită cu anumiți factori de mediu, însă sunt avansate câteva teorii conform cărora peak-urile bacteriene din lunile de vară sunt asociate cu schimbările în tehnicile de pregătire ale mâncării, schimbarea pattern-ului de colonizare a tractului digestiv al animalelor, precum și transmiterea patogenilor prin intermediul vectorilor (Lake, et al., 2019).

Distribuția cazurlor de boala diareica acuta pe grupe de vârstă

În graficul 7 se poate observa distribuția pe grupe de vârstă a patogenilor detectati din cele 59 de probe testate prin metoda PCR folosind FilmArray Gastrointestinal (GI) Panel.

Se observă că la grupa de varstă 0 – 2 ani, au fost detectati agenti bacterieni in 58% cazuri (n = 11) și agenti virali în 42% (n = 8); la grupa de varstă 3 – 5 ani, agenți bacterieni au fost detectați in 50% din cazuri (n = 7), agenți virali în 14.3% (n = 2) și agenți parazitari în 36% (n = 5); la grupa de varsta peste 6 ani, au fost detectați agenți bacterieni în 58.3% dintre cazuri (n = 7), agenți virali 8.3% (n = 1) și agenți parazitari 33.3% din cazuri (n = 4).

Graficul 7. Distribuția pe grupe de varste

CONCLUZII

Prezentul studiu a urmărit stabilirea etiologiei sindromului diareic la copiii din sectia de gastroenterologie a SCUC, utilizând FilmArray, un sistem automat de diagnosticare in vitro (IVD), care utilizează reacția internă de polimerizare în lanț de timp multiplex PCR (nmPCR) și analiza curbei HRM pentru a detecta si identifica ținte multiple de acid nucleic din probele clinice.

În perioada 1 Iulie 2019 – 31 Ianuarie 2020 în laboratorul de microbiologie al SCUC au fost analizate 59 de probe recoltate din materii fecale; din totalul de 59 de cauri, în 46 de cazuri (83%) s-au detectat agenți infecțiosi, agenți bacterieni (56.5%), virusuri (28.2%) și paraziți (15,2%).

Din totalul de 46 de cazuri pozitive, au fost confirmate și 11 cazuri de coinfecții, fiind prezentate în aceeași probă analizată atât specii bacteriene cât și specii virale și/sau parazitare.

Cazurile de diaree acută de etiologie bacteriană au fost mai frecvente în sezonul cald, la grupele de varstă de 0 – 2 ani și peste 6 ani, similar altor țări din Europa; cazurile de diaree acută de etiologie virală au fost mai frecvente în sezonul rece, la grupa de varstă 0 – 2 ani, similar țărilor în curs de dezvoltare.

BIBLIOGRAFIE

Adams, D. A. et al. Summary of Notifiable Diseases – United States, 2011. MMWR Morb. Mortal. Wkly. Rep. 60, 1–117 (2013).

Ahmed, S. M., Lopman, B. A. & Levy, K. A systematic review and meta-analysis of the global seasonality of norovirus. PLoS ONE 8, e75922 (2013).

Amoebiasis. Wkly. Epidemiol. Rec. 72, 97–99 (1997).

Bauer, M. P. et al. Clostridium difficile infection in Europe: a hospital-based survey. Lancet 377, 63–73 (2011).

Buiuc D., Tratat de microbiologie clinica, 2009

Centers for Disease Control and Prevention (CDC). Vital signs: preventing Clostridium difficile infections. MMWR Morb. Mortal. Wkly. Rep. 61, 157–162 (2012).

Chiotan M., Boli infectioase, 2011

Ciofu E., Esentialul in pediatrie, 2017

Crum-Cianflone, N. F. Salmonellosis and the gastrointestinal tract: more than just peanut butter. Curr Gastroenterol Rep 10, 424–431 (2008).

Croxen, M. A. et al. Recent Advances in Understanding Enteric Pathogenic Escherichia coli. Clinical Microbiology Reviews 26, 822–880 (2013).

Cróinín, și Backert, 2012.

Dalton, C., Mintz, E., Wells, J., Bopp, C. & Tauxe, R. Outbreaks of enterotoxigenic Escherichia coli infection in American adults: a clinical and epidemiologic profile. Epidemiology and infection 9–16 (1999).

Dubberke, E. R., Reske, K. A., Olsen, M. A., McDonald, L. C. & Fraser, V. J. Short- and long-term attributable costs of Clostridium difficile-associated disease in nonsurgical inpatients. Clin. Infect. Dis. 46, 497–504 (2008).

DuPont, H. L. Bacterial diarrhea. New England Journal of Medicine 361, 1560–1569 (2009).

DuPont, H. L. Giardia: both a harmless commensal and a devastating pathogen. J. Clin. Invest. 123, 2352–2354 (2013).

Eurosurveillance editorial team. The European Union summary report on trends and sources of zoonoses, zoonotic agents and food-borne outbreaks in 2011. Euro Surveill. 11, (2013).

European Commission. Opinion of the Scientific Committee on Veterinary measures relating to public health on Vibrio vulnificus and Vibrio parahaemolyticus. (2001).

Fischer, T. K. et al. Hospitalizations and deaths from diarrhea and rotavirus among children <5 years of age in the United States, 1993-2003. J. Infect. Dis. 195, 1117–1125 (2007).

Fotedar, R. et al. Laboratory diagnostic techniques for Entamoeba species. Clin. Microbiol. Rev. 20, 511–532, table of contents (2007).

Herikstad, H. et al. A population-based estimate of the burden of diarrhoeal illness in the United States: FoodNet, 1996–7. Epidemiology and Infection 129, 9–17 (2002).

Huang, D. B. A review of an emerging enteric pathogen: enteroaggregative Escherichia coli. Journal of Medical Microbiology 55, 1303–1311 (2006).

Johnson, P. C., Mathewson, J. J., DuPont, H. L. & Greenberg, H. B. Multiple-challenge study of host susceptibility to Norwalk gastroenteritis in US adults. J. Infect. Dis. 161, 18–21 (1990).

Johansson, P. J. H. et al. A nosocomial sapovirus-associated outbreak of gastroenteritis in adults. Scand. J. Infect. Dis. 37, 200–204 (2005). BioFire

Kyne, L., Hamel, M. B., Polavaram, R. & Kelly, C. P. Health care costs and mortality associated with nosocomial diarrhea due to Clostridium difficile. Clinical Infectious Diseases 34, 346 (2002).

Khanna, S. et al. The Epidemiology of Community-Acquired Clostridium difficile Infection: A Population-Based Study. The American Journal of Gastroenterology 107, 89–95 (2011).

Kaur, P., Chakraborti, A. & Asea, A. Enteroaggregative Escherichia coli: An Emerging Enteric Food Borne Pathogen. Interdisciplinary Perspectives on Infectious Diseases 2010, 1–10 (2010).

Koci, M. D. Immunity and resistance to astrovirus infection. Viral Immunol. 18, 11–16 (2005).

Kaplan, J. E. et al. Epidemiology of Norwalk gastroenteritis and the role of Norwalk virus in outbreaks of acute nonbacterial gastroenteritis. Ann. Intern. Med. 96, 756–761 (1982).

Lake, et al., 2019

Legua, P. & Seas, C. Cystoisospora and cyclospora. Curr. Opin. Infect. Dis. 26, 479–483 (2013).

Lee, L. E. et al. Sapovirus outbreaks in long-term care facilities, Oregon and Minnesota, USA, 2002-2009. Emerging Infect. Dis. 18, 873–876 (2012).

Liu, L. et al. Global, regional, and national causes of child mortality: an updated systematic analysis for 2010 with time trends since 2000. Lancet 379, 2151–2161 (2012).

Marcus, R. New information about pediatric foodborne infections: The view from FoodNet. Current opinion in pediatrics 20, 79 (2008).

Mead, P. S. et al. Food-related illness and death in the United States. Emerging infectious diseases 5, 607 (1999).

Moore, J. E. et al. Campylobacter. Veterinary Research 36, 351–382 (2005).

Nachamkin, I., Szymanski, C. M. & Blaser, M. J. Campylobacter. (ASM Press, 2008).

Nataro, J. P. et al. Diarrheagenic Escherichia coli infection in Baltimore, Maryland, and New Haven, Connecticut. Clinical infectious diseases 43, 402 (2006). Manual de instrucțiuni FilmArray Gastrointestinal (GI) Panel CE IVD BioFire Diagnostics, LLC 64

Pawlowski, S. W., Warren, C. A. & Guerrant, R. Diagnosis and treatment of acute or persistent diarrhea. Gastroenterology 136, 1874–1886 (2009).

Parashar, U. D., Bresee, J. S., Gentsch, J. R. & Glass, R. I. Rotavirus. Emerging infectious diseases 4, 561 (1998).

Roche, J. K., Cabel, A., Sevilleja, J., Nataro, J. & Guerrant, R. L. Enteroaggregative Escherichia coli (EAEC) Impairs Growth while Malnutrition Worsens EAEC Infection: A Novel Murine Model of the Infection Malnutrition Cycle. The Journal of Infectious Diseases 202, 506–514 (2010).

Rockx, B. et al. Natural history of human calicivirus infection: a prospective cohort study. Clin. Infect. Dis. 35, 246–253 (2002).

Scallan, E. Foodborne Illness Acquired in the United States—Major Pathogens. Emerging Infectious Diseases 17, (2011).

Schutze, G. E., Willoughby, R. E., Committee on Infectious Diseases & American Academy of Pediatrics. Clostridium difficile infection in infants and children. Pediatrics 131, 196–200 (2013).

Schmitz AM, T., RV. in Bacterial Infections of Humans 939 (Springer, 2009).

Schlenker, C. & Surawicz, C. M. Emerging infections of the gastrointestinal tract. Best Pract Res Clin Gastroenterol 23, 89–99 (2009).

Spina, și colab., (2015).

Svraka, S. et al. Epidemiology and genotype analysis of emerging sapovirus-associated infections across Europe. J. Clin. Microbiol. 48, 2191–2198 (2010).

Thiem, V. D. et al. Detection of Shigella by a PCR Assay Targeting the ipaH Gene Suggests Increased Prevalence of Shigellosis in Nha Trang, Vietnam. Journal of Clinical Microbiology 42, 2031–2035 (2004).

Utagawa, E. T. et al. Astrovirus as a cause of gastroenteritis in Japan. J. Clin. Microbiol. 32, 1841–1845 (1994).

Versalovic, J. & American Society for Microbiology. Manual of clinical microbiology. (ASM Press, 2011).

Wong, T. Y. et al. Plesiomonas shigelloides infection in Hong Kong: retrospective study of 167 laboratory-confirmed cases. Hong Kong Med J 6, 375–380 (2000).

Zamboni, A., Fabbricotti, S. H., Fagundes-Neto, U. & Scaletsky, I. C. A. Enteroaggregative Escherichia coli virulence factors are found to be associated with infantile diarrhea in Brazil. Journal of clinical microbiology 42, 1058–1063 (2004).