Șef lucr. dr. SESĂRMAN Viorica Alina [302044]

UNIVERSITATEA „BABEȘ-BOLYAI” CLUJ-NAPOCA

Facultatea de Biologie și Geologie

Specializarea Biologie Medicală

LUCRARE DE DIZERTAȚIE

Conducător științific:

Șef lucr. dr. SESĂRMAN Viorica Alina

Absolvent: [anonimizat] 2017

UNIVERSITATEA ,, BABEȘ-BOLYAI’’ CLUJ -[anonimizat], ȚINTĂ ÎN TERAPIA ANTICANCEROASĂ

Conducător științific:

Șef lucr. dr. SESĂRMAN Viorica Alina

Absolvent: [anonimizat] 2017

CUPRINS

LISTĂ ABREVIERI 4

INTRODUCERE 8

1. PROTEINELE 9

1.1. Definiție și funcții 9

1.2. Asocierea cu cancerul 9

2. [anonimizat] 14

2.1. Modificări necovalente în cancer 14

2.1.1. Plierea proteinelor 14

2.1.2. Modalități de țintire în terapia anticanceroasă 16

2.2. Modificări covalente în cancer 16

2.2.1. Acetilarea 17

2.2.1.1. Proteine acetilate 17

2.2.1.2. Modalități de țintire în terapia anticanceroasă 17

2.2.2. Fosforilarea 21

2.2.2.1. Proteine fosforilate 21

2.2.2.2. Modalități de țintire în terapia anticanceroasă 23

2.2.3. Glicozilarea 25

2.2.3.1. Proteine glicozilate 25

2.2.3.2. Modalități de țintire în terapia anticanceroasă 28

2.2.4. Metilarea 30

2.2.4.1. Proteine metilate 30

2.2.4.2. Modalități de țintire în terapia anticanceroasă 32

2.2.5. Nitrarea 34

2.2.5.1. Proteine nitrate 34

2.2.5.2. Modalități de țintire în terapia anticanceroasă 36

2.2.6. Ubiquitinarea 40

2.2.6.1. Proteine ubiquitinate 40

2.2.6.2. Modalități de țintire în terapia anticanceroasă 43

2.2.7. Lipidarea 46

2.2.7.1. Proteine lipidate 46

2.2.7.2. Țintire în terapia anticanceroasă 47

3. METODE DE ANALIZĂ ȘI IDENTIFICARE A [anonimizat] A PROTEINELOR ÎN CANCER 50

3.1. Spectrometria de masă 50

3.1.1. Principiu 50

3.1.2. [anonimizat] 51

3.2. Imunohistochimia 53

3.2.1. Principiu 53

3.2.2. [anonimizat] 53

3.3 Tehnologia microarray 54

3.3.1. Principiu 54

3.3.2. [anonimizat] 55

3.4. Analiza SILAC 56

3.4.1. Principiu 56

3.4.2. [anonimizat] 56

CONCLUZII 58

BIBLIOGRAFIE 59

LISTĂ ABREVIERI

5-FU- 5- [anonimizat]- [anonimizat]- [anonimizat]

B100- apoliproteina B100

BARD1- (Breast Cancer 1 associated Ring domain)

Bcl2- celula B [anonimizat]- proteina de fuziune (BCR- breakpoint cluster region; ABL-Abelson)

BRCA- oncogena pentru cancerul de sân

CA- (antigen cancer)- [anonimizat]44-molecula de adeziune CD44

CDK- kinaza ciclin dependentă

c-Myc- [anonimizat] A

Co-cobalt

COX2- ciclooxigenaza 2

Domeniu HECT- (Homology to E6AP carboxy terminus)- domeniu proteic din ubiquitin ligaze

Domeniu RING-(Really Interesting New Gene)- [anonimizat]- enzime de dezubiquitinare

E1- enzime de activare

E2- enzime de conjugare

E3- enzime de legare (ligaze)

ECM- [anonimizat]-[anonimizat]- sintetaza oxidului nitric (forma endotelială)

Epi-ML- liganzi epigenetici multipli

FDA- (Food and Drug Administration)- agenție responsabilă cu reglementarea alimentației (umană și animală), a [anonimizat]lor (umane și animale), cosmeticelor, dispozitivelor medicale (umane și animale) și a dispozitivelor care emit radiații (sunt incluse dispozitivele non-medicale), biologice, și a produselor pentru sânge

FGFR- receptorul pentru factorul de creștere al fibroblastelor

GALNACT- glicotransferaze

GDP- guanozin difosfat

GrB2- proteină adaptoare

GTP- guanozin trifosfat

HA- acid hialuronic

HAT-histon acetilaze

HDAC- histon deacetilaze

HDACI- inhibitori ai histon deacetilazelor

Hdm2- (human double minute 2)- protein ligază

HER2- receptorul epidermal 2

HIF- factorul inductibil al hipoxiei

HMG-CoA- hidroxi metilglutaril coenzima A

HPV- virusul papilloma uman

Hsp- proteine de șoc termic

IAP- inhibitori ai proteinelor implicate în apoptoză

ID1- proteină inhibitoare ce se leagă de ADN

IHC- imunohistochimia

IL-10- interleukina 10

iNOS- sintetaza oxidului nitric (forma inductibilă)

IR- receptorul pentru insulină

ITK- inhibitori ai tirozin kinazelor

KAT- lizin acetiltransferaze

K-lizină

KMT- lizin metiltransferaze

Lip- lipozom

LMC- leucemia mieloidă acută

MALDI- ionizarea prin desorbție laser asistată de o matrice

MAPK/ERK- protein kinaza activată de mitogen

Mdm2- (murine double minute 2)- protein ligază

MMP-metaloproteine de matrice

MS- spectrometria de masă

MUC- mucine

NADPH- nicotinamid adenin dinucleotid fosfat

NFkb- factorul nuclear kapa B

Ni-nichel

NK- natural killer (celule ucigașe naturale)

nNOs- sintetaza oxidului nitric (forma neuronală)

NO- oxid nitric

NOS- sintetazele oxidului nitric

NOX-oxizi de azot

NP- nanoparticule

NRTK-non-receptori tirozin kinazici

NSCLC- cancer pulmonar fără celule mici

p21-proteina 21

p300-proteina 300

p53-proteina 53

PAT- protein aciltransferaza

pCAF- factorul coactivator transcripțional asociat cu p53

PDGF- factorul de creștere derivat plachetar

PDGFR- receptorul pentru factorul de creștere derivat plachetar

PEG- poli-etilen glicol

PI3K- fosfoinozitol 3 kinaza

PK- protein kinaza

PKC-protein kinaza C

PKD- protein kinaza D

PLGA- acid poli lactic și glicolic

PMT- protein metiltransferaze

PPSu- poli- propilen succinat

PRMT- arginin metiltransferaze

PTK- protein tirozin kinaze

Rb- proteina pentru retinoblastom

RNS- specii recative de azot

ROS- specii reactive de oxigen

RTK- receptori tirozin kinazici

SAHA- acidul hidroxamic suberoilanilid

SAM- S-adenozil metionină

SDS-PAGE- Electroforeză pe gel de poliacrilamid cu dodecil disulfat

SILAC- marcarea stabilă a izotopilor cu aminoacizi în culturi de celule

SOS- (son of seveless)

Src- proto-oncogena pentru sarcom

TFC- factorul complex de transcriere

TGFα și β- factorul de transformare și creștere alfa și beta

TNFα- factorul de necroză tumorală alfa

TSA- Trichostatin A

UB-ubiquitină

UV- radiații ultraviolete

VA-acid valproic

VEGF- factorul de creștere endoteliului vascular

VEGFR- receptorul pentru factorul de creștere endoteliului vascular

VHL- von Hippel-Lindau

INTRODUCERE

Cancerul reprezintă una dintre cele mai necruțătoare boli din întreaga lume. În ultimii ani, s-au facut mari eforturi pentru a putea înțelege cancerul, cum se declanșează acesta la nivel molecular, dar și în dezvoltarea de metode eficiente de țintire anticanceroasă.

Lucrarea are ca scop trecerea în revistă a principalelor aspecte legate de modificările post-sintetice la care sunt supuse proteinele precum și abordările terapeutice care vizează inhibarea modificărilor aberante în diferite tipuri de cancere.

Lucrarea de față este organizată în trei capitole după cum urmează:

Capitolul întâi, intitulat ,, Proteine” și conține o scurtă prezentare generală a proteinelor, a funcțiilor acestora, precum și a implicațiilor în apariția cancerului.

Al doilea capitol, intitulat ,,Modificările post-sintetice ale proteinelor” conține o clasificare a tipurilor de modificări post-sintetice întâlnite la proteine (necovalente, covalente), după care se abordează strict modificările post-sintetice covalente ale proteinelor (fosforilarea, acetilarea, glicozilarea, metilarea, nitrarea, ubiquitinarea, respectiv lipidarea ) unde este prezentată natura dinamică a proceselor de semnalizare pe care celulele le manifestă în timpul transformării lor pentru a deveni celule canceroase (neoplazice). De asemenea, sunt exemplificate tipurile de cancer în care apare modificarea respectivă, dar și metodele de țintire în terapia anticanceroasă.

În cel de-al treilea capitol sunt prezentate câteva metode proteomice de detecție a modificărilor post-sintetice ale proteinelor în cancer.

PROTEINELE

Definiție și funcții

Proteinele sunt cele mai instabile macromolecule din sistemele vii și sunt constituite dintr-un set de 20 de aminoacizi diferiți, legați prin legături peptidice. Acestea îndeplinesc funcții esențiale în ceea ce privesc toate procesele biologice: funcționează ca și catalizatori, sunt implicate în transportul și stocarea altor molecule precum oxigenul, conferă protecție imună și suport mecanic, transmit semnale în diferite celule, țesuturi și organe pentru a coordona procesele biologice. [Berg și colab., 2002]

Asocierea cu cancerul

Cancerul este o boală asociată cu modificări ale exprimării genelor (supraexprimări, pierderi ale exprimării) care duc la formarea de proteine anormale, care au capacitatea de a determina ca celulele să se înmulțească necontrolat, să devină canceroase și să formeze tumori.

Dezvoltarea celulelor canceroase este determinată de modificări în genele implicate în proliferarea celulară, apoptoza etc. Este esențial păstrarea echilibrului în ceea ce privește controlul diviziunii celulare, pentru o bună funcție a țesutului normal, însă cancerul este asociat cu pierderea controlului ciclului celular și a instabilității genetice.

În procesele asociate dezvoltării tumorale, sunt implicate multe gene și molecule, ca genele supresoare de tumori, diferite proteine, care sunt implicate în procese celulare (Tabel 1) ca expresia genică, repararea ADN, transducția semnalului, metabolismul celular etc., și funcționează anormal și datorită unor modificări post-sintetice, care se manifestă fie prin supraexprimare, fie prin supraactivare (enzime implicate în căile de semnalizare a unor oncogene).

Tabel 1. Proteine implicate în procesele celulare ce suferă modificări post-sintetice

și sunt asociate cu dezvoltarea cancerului

De exemplu, proteinele p53, BRCA1, c-Myc, prin supraexprimări/activări sunt implicate în promovarea invaziei celulelor tumorale și metastază. Proteinele RAS, prin funcția lor de a regla interacțiuni proteine-proteine, dacă sunt supraexprimate/activate contribuie la proliferarea celulară, creșterea tumorală. Receptorii EGFR, ER, TGFR, VEGFR, care sunt implicați în reglarea semnalizării celulare, prin supraexprimări contribuie la proliferarea celuleor canceroase, ce duce la invazia și migrarea celulelor tumorale; VEGFR, iNOS, prin supraexprimări stimulează formarea de noi vase de sânge (angiogeneza), și contribuie la migrarea celulelor canceroase și metastazare. De asemenea, nitrotirozina, mucinele, enzimele de conjugare E2, ligaza Mdm2, implicate în comunicarea între mediul celular intern și cel extern sau în interacțiunile celulă-celulă, prin supraexprimări/activare sunt asociate în inflamație, și contribuie la migrarea celulelor tumorale spre alte compartimente celulare. Molecula CD44 este asociată cu reglarea comunicării celulare prin reglarea semnalului receptorului factorului de creștere epidermal uman (HER), iar ca receptor de adeziune pentru acidul hialuronic, contribuie prin degradarea HA, la migrarea celulelor tumorale, invazie și metastazare.

Unul dintre factorii implicați în dezvoltarea tumorilor este inflamația cronică. Aceasta apare ca urmare a unor deteriorări la nivelul țesutului prin proliferarea celulară indusă dar și de repararea țesutului. Micromediul inflamației este compus din celule tumorale proliferative, vase de sânge, celule inflamatorii și alte celule asociate cu acestea.

Celulele sistemului imun asociate cu tumorile sunt acelea implicate în imunitatea adaptativă, ca limfocitele T, celulele dendritice, dar și cele implicate în imunitatea înnăscută, cum sunt macrofagele, leucocitele, celulele NK(natural killer), fiindcă acționează ca promotori ai tumorilor.

Macrofagele au rolul de a inhiba funcțiile limfocitelor prin faptul că acestea eliberează citokine inhibitoare ca IL-10, prostaglandine, iar împreună cu acestea, generează specii reactive de oxigen în scopul combaterii infecției/inflamației. [Cooper 2000; Lu și colab., 2006; Nahoum 2006]

Stresul oxidativ reprezintă un dezechilibru în ceea privește producerea de specii reactive de oxigen și alți metaboliți, care afectează celulele și anumiți compuși din organism, prin modificări ale structurii și funcțiilor celulare. Acesta este asociat cu inițierea și dezvoltarea cancerului prin mutațiile ce afectează ADN, proteine, prin modificări post-sintetice, fosfolipide, ce duc la transformarea celulelor în celule neoplazice, prin faptul că ROS promovează proliferarea celulară, angiogeneza, metastaza. Speciile reactive de oxigen sunt generate fie din mediul extern (radiații UV, substanțe chimice, inflamații etc.) fie din mediul intern, celular, din produșii lanțului respirator ca enzimele NOX ale oxidazei NADPH din membrana plasmatică, mieloperoxidazele din fagocite.

Speciile reactive de oxigen acționează direct sau indirect asupra ADN prin mutații genetice la nivelul genelelor supresoare tumorale țintă, de ex. p53 și genele implicate în ciclul celular, prin modificări ale exprimării genelelor și a legării ADN de factorii de transcriere ale căilor de semnalizare celulare. [Sager 1997; Cooper 2000; Halliwell 2007; Bedard și Krause 2007; Reuter și colab., 2010; Sosa și colab., 2012]

Pe măsură ce celulele canceroase se divid necontrolat, tumoarea necesită formarea de noi vase de sânge (angiogeneza), datorită nevoii de oxigen și nutrienți, dar și pentru a putea eliminia compușii care nu mai sunt folositori (,,deșeuri’’). Procesul de angiogeneză are loc atunci când țesutul este lezat și este deprivat de oxigen, astfel se declanșează hipoxia, iar celulele trebuie să activeze răspunsul la stresul generat de hipoxie. Acest răspuns este activat la nivel celular prin factorul de transcriere HIF, care are funcția de a reduce efectele cauzate de hipoxie la nivel celular. Pe urmă, celulele endoteliale sunt activate de factorii angiogenenici ca VEGF,TGFα și β (factorul de transformare și creștere alfa și beta), PDGF (factorul de creștere derivat plachetar),TNFα (factorul de necroză tumorală alfa ) etc., prin faptul că aceștia transmit semnale celulelor endoteliale să migreze, să se dividă și să formeze noi vase de sânge. (Fig. 1)

Figura 1. Procesul de formare a vaselor noi de sânge (angiogeneza)

mct.aacrjournals.org

Prin formarea vaselor noi de sânge, celulele canceroase pot astfel să migreze, să invadeze țesuturile din apropiere prin pătrunderea în sistemul lor circulator, proces numit metastază, prin care se pot divide noi celule canceroase, pentru a forma o nouă tumoră (tumoră secundară). (Fig. 2). Această migrare a celulelor canceroase se datorează mutațiilor genelor ce controlează proteinele care leagă în mod normal celulele din țesuturile din apropiere, dar și dereglarea enzimatică contribuie la acest lucru, prin faptul că, conexiunile dintre celule și țesuturi se degradează.

Figura 2. Migrarea celulelor tumorale și formarea metastazelor

www.app64bits.com

Migrarea și invazia celulelor canceroase pot fi diferite, în funcție de tipul tumorii și de modificările la nivel celular în celulele tumorale, și implică reorganizarea structurilor de adeziune, care leagă celulele la ECM (matricea extracelulară). Structurile de adeziune ce influențează migrația celulelor canceroase sunt cadherinele, implicate în legarea celulară și sunt dependente de calciu, selectinele, ce se găsesc în celulele sanguine și în celulele endoteliale și sunt implicate în adeziunea leucocitară în timpul răspunsului inflamatoriu în cazul unor leziuni, integrinele, asociate mai ales în metastază, datorită funcției lor de a media interacțiunile dintre celule și matricea extracelulară.

Celulele stromale au un rol important în dezvoltarea cancerului, deoarece conțin multe proteine, care acționează asupra celulelor tumorale, favorizând astfel creșterea și dezvoltarea tumorilor.

Foarte importante în invazie și migrare sunt metaloproteinele de matrice (MMP), o familie de endopeptidaze dependente de zinc, care au rolul de a degrada proteine și alte molecule de adeziune celulară în matricea extracelulară, prin îndepărtarea membranei bazale și a matricei stromale, care duce implicit la degradarea interacțiunilor dintre celule și matricea extrcelulară. Supraexprimarea lor este influențată atât de celulele canceroase, prin secreția de interleukine, factori de creștere ca IGF, EGFR, TGF, cât și de celulele stromale; acest lucru contribuind la proliferarea celulelor canceroase și implicit în invazia tumorală în diferite tipuri de cancere, ca și cancerul de colon, carcinomul gastric, cancerul de plămâni, cancerul esofagian etc.

Astfel, dacă matricea celulară este afectată, structurile de adeziune pot influența răspunsul migrației. [Nishida și colab., 2006; Prager și Poettler 2012; Pezzella și colab., 2015; Martin și colab., 2013; Duffy și colab.,2000; Kessenbrock și colab., 2010 ]

.

MODIFICĂRILE POST-SINTETICE ALE PROTEINELOR

Proteomul uman este complex și ca urmare acțiunii unor stimuli, acesta suferă modificări, iar modificările post-sintetice, ce au loc la unul sau mai mulți aminoacizi dintr-o proteină după ce proteina a fost tradusă de ribozom, sunt necesare pentru a reglementa activitatea celulară. Aceste modificări post-sintetice modifică structura și funcția proteinelor prin adiția de grupări funcționale, interacțiunea cu alte molecule/proteine, diviziunea celulară și sunt frecvent mediate de activitatea unor enzime precum kinaze, fosfataze, transferaze, ligaze. [Karve și Cheema 2011; Duan și Walther 2015]

Modificările post-sintetice ce apar la proteine se clasifică în modificări necovalente (ce afectează structura lor prin procesul de pliere, adăugarea de cofactori ) și modificări covalente care includ, fosforilarea, acetilarea, glicozilarea, metilarea, nitrarea, ubiquitinarea, lipidarea.

Modificări necovalente în cancer

Plierea proteinelor

Un proces la fel de important care trebuie întreprins pentru menținerea funcției proteinelor, este plierea acestora într-o conformație tridimensională. Deși plierea și replierea proteinelor au un rol esențial în ceea ce privește funcția proteinelor, modificarea aminoacizilor contribuie în mod semnificativ la diversitatea și funcția proteinelor.

În mediul celular, proteinele care sunt nou sintetizate prezintă un risc mare de pliere și de agregare greșită, ce pot duce la formarea unor specii cu potențial toxic. În scopul de a preveni sau de a reduce aceste ,,efecte” negative, celulele prezintă o rețea de șaperoane, care facilitează procesul de pliere a proteinelor (Fig. 3).

Șaperoanele, mai sunt denumite proteine de șoc termic (HSPs) sau proteine de stres; concentrația lor crește în condiții de stres, indus de temperaturile ridicate și acționează ca niște catalizatori prin faptul că asistă la procesul de asamblare a proteinelor, însă nu fac parte din acel complex asamblat. Șaperoanele funcționează prin legarea și stabilizarea polipeptidelor nepliate sau parțial pliate, împiedicând astfel agregarea incorectă, permițând astfel lanțului polipeptidic să se plieze în conformația sa corectă. Șaperoanele stabilizează de asemenea, lanțurile polipeptidice nepliate în timpul transportului lor în organitele celulare, de exemplu, în timpul transferului proteinelor în mitocondriile din citosol (Fig. 4).

Proteinele sunt transportate prin membrana mitocondrială în conformații parțial pliate, care mai apoi sunt stabilizate de șaperoanele din citosol. Pe urmă, șaperoanele din mitocondrie facilitează transferul lanțului polipeptidic pe membrană, după care are loc plierea în organit. [Cooper 2000]

Figura 3. Plierea proteinei cu șaperoane

www.news.berkeley.edu

Figura 4. Transportul lanțurilor polipeptidice în mitocondrie

www.ncbi.nlm.nih.gov

Dintre proteinele de șoc termic, cele din familia Hsp27, Hsp40, Hsp60 și Hsp90 au fost identificate ca urmare a implicării lor în diferite tipuri de cancer (cancerul de sân, cancerul ovarian osteosarcomul, cancerul endometrial, leucemia, adenocarcinom pulmonar, cancerul de piele, cancerul de colon, gliomul, carcinomul hepatocelular, leucemia mieloidă acută, limfom Hodgkin, carcinoame esofagiene cu celule scuamoase). Aceste proteine sunt fosforilate de kinaze (MAPK, PKD, PKC) ca răspuns la stresul oxidativ, la citokinele inflamatorii, dar și la diferiți factori ca și factorul de necroză tumorală α (TNF- α), factorul de transformare și creștere (TGF- β). Proteinele de șoc termic sunt implicate în funcțiile celulare esențiale care promovează creșterea celulară, proliferarea celulelor tumorale, procese care de asemenea sunt implicate în dezvoltarea cancerului.

[Ciocca și Calderwood 2005; Jego și colab., 2013, Zoubeidi și Gleave 2012; Mitra și colab., 2009; Capello și colab., 2008; Murphy 2013]

Modalități de țintire în terapia anticanceroasă

Inhibitorul proteasomului, Velcade (PS-341), utilizat în tratamentul de mielomu multiplu, induce apoptoza, pentru a inhiba țintit Hsp27.

Compuși precum geldanamicina, radicicol, curcuminul, au arătat faptul că că inhibă invazia celulelor canceroase și metastazele prin reglarea expresiei Hsp40.

Prin utilizarea de flavonide, au fost reduse nivelurile ridicate de Hsp60 în celulele tumorale unor anumite tipuri de cancer ca și leucemia mieloidă acută, carcinoame esofagiene, carcinomul colorectal, carcinomul hepatocelular, carcinomul de prostată, carcinoame ovariene. iar prin folosirea cadmiului, au fost induse exprimări ale genei hsp60 în celulele de hematom. De asemenea, pentru terapia antitumorală s-au dezvoltat vaccinuri, în care Hsp60 au rol de adjuvanți; de exemplu vaccinurile care codifică Hsp60 legate la HPV16 E6 și E7 pentru terapia împotriva cancerului de col uterin asociat cu virusul papiloma uman.

Pentru inhibarea Hsp70, s-au dezvoltat terapii cu inhibitori ai autofagiei, cum este hidroxiclorochina, utilizată în diverse tipuri de cancere ca și cancerul de sân, în cancerul pulmonar, de colon, de prostată, de ficat.

În ceea ce privește țintirea Hsp90, se folosesc inhibitori HDAC, dar și antibioticul Novobiocin, care spre deosebire de ceilalți inhibitori, acesta are activitate mai specifică de țintire a Hsp90, prin faptul că acesta destabilizează diverse proteine client ale Hsp90 (Her2, p53 mutantă, Bcr-Abl etc), și inhibă astfel creșterea celuleor tumorale în cancerul de prostată, leucemie, limfom etc. [Jego și colab., 2013; Zoubeidi și Gleave 2012; Capello și colab., 2008; Murphy 2013]

Modificări covalente în cancer

Modificările covalente ale proteinelor sunt responsabile pentru reglarea expresiei genetice, repararea ADN, diviziunea celulară, interacțiunile ce au loc între diferite căi de semnalizare în procesul de transformare a celulelor pentru a deveni canceroase. Astfel de modificări includ fosforilarea, acetilarea, glicozilarea, metilarea, nitrarea, ubiquitinarea, sumoilarea, lipidarea, hidroxilarea respectiv sulfatarea și sunt catalizate enzimatic de către kinaze, acetilaze etc.

Aceste modificări sunt importante nu doar pentru rolul pe care îl au legat de funcțiile celulare normale, ci și pentru că au un mare potențial în ceea ce privește țintirea unor tratamente pentru diferite boli, printre care și cancerul, prin utilizarea ca markeri pentru diagnosticarea bolii sau ca ținte moleculare în dezvoltarea de terapii inovative. [Dwarakanath și colab., 2008; Jin și Zangar, 2009]

Acetilarea

Proteine acetilate

Acetilarea este una dintre modificările post-sintetice covalente ale proteinelor, având o mare importanță în ceea ce privește structura, funcția și localizarea intracelulară.

Acest proces are loc la capătul N-terminal a lizinei din histonă, este asociat cu menținerea stabilității proteinei și este facilitat de diferite enzime, histon acetilaze (HAT) sau histon deacetilaze (HDAC). Enzimele care catalizează acetilarea proteinelor (adăugarea de grupări acetil) a reziduurilor de lizină sunt denumite lizin (K) acetiltransferaze și sunt notate KAT.. Pentru aceste tipuri de enzime, este necesar acetil- CoA, ca donor de grupări acetil, fiind implicat în reglarea metabolică. În cazul unor modificări ale concentrației de acetil-CoA, au loc schimbări cu privire la capacitatea enzimelor de a-și îndeplinii funcțiile.

Pe lângă histone, HDAC deacetilează și non-histone, care sunt diferiți factori nucleari de transcriere (factorul nuclear kB), și proteine (p53, CDK1, Hsp90, Myc, proteina de fuziune bcr-Abl etc)., care sunt implicate în proliferarea, diferențierea și apoptoza celulelor canceroase.

Modificările ce apar în semnalarea procesului de acetilare care rezultă din histon acetilaze și deacetilaze, pot duce la exprimări aberante ale genelor, ce includ activarea de proto-oncogene, suprimarea expresiei genelor supresoare de tumori, ceea ce duce la dezvoltarea cancerului. Cauza acestor exprimări aberante poate fi un rezultat al leziunilor genetice care folosesc mecanisme epigenetice ce afectează expresia genetică și exprimarea proteinelor. [Dwarakanath și colab., 2008; Kuo 2011; Narayan și colab., 2016; Singh și colab., 2010; Culf și Culf 2014]

Modalități de țintire în terapia anticanceroasă

Butiratul de sodiu a fost primul inhibitor utilizat în terapia anticanceroasă, datorită rolului său de a induce acetilarea histonelor. Alți inhibitori ca și, acidul valproic (VA), compusul Trichostatin A (TSA), care este un antibiotic fungic, și SAHA (acidul hidroxamic suberoilanilid) au fost identificați ca inhibitori ai histon deacetilazelor (HDACi). Acești inhibitori au activități anticanceroase puternice și specifice prin faptul că reglează nivelul de exprimare a genelor supresoarelor tumorale (p53, p21), scade nivelul de exprimare a diferitelor proteine apoptotice ca și Bcl-2 și blochează progresia ciclului celular (Fig. 5). [Singh și colab., 2010; Marchion și Münster 2007; Lakshmaiah și colab., 2014]

Figura 5. Mecanismul de acțiune a inhibitorilor HDAC

Trichostatina A (TSA), este un inhibitor HDAC ce blochează proliferarea și declanșează apoptoza în carcinomul hepatocelular, blochează diferențierea celulelor în cancerul ovarian prin schimbarea genei supresoare tumorale p21 și prin legarea ADN la proteina ID1. Acest inhibitor acționează asupra acetilării prin faptul că induce acetilarea histonelor, modifică interacțiunea dintre HDAC și histon acetiltransferazele, interacțiune ce are un rol esențial în ceea ce privește structura cromatinei și exprimarea genelor. [Dwarakanath și colab., 2008; Tóth și colab., 2004; Kim și colab., 2010]

Eficacitatea inhibitorului SAHA (acidul acidul hidroxamic suberoilanilid)/Vorinostat ca agent anticancer a fost demonstrată pe mai multe linii celulare tumorale, astfel încât acesta a ajuns să fie utilizat în tratamentul limfomului cu celule T, o formă de limfom non-Hodgkin. Funcția acestui inhibitor este aceea de a inhiba metastaza celulelor canceroase.

În ceea ce privește modul de administrare a acestui medicament antitumoral, s-au creat nanoparticule lipidice (conțin surfactanți lipidici ca Precirol și Capryol, dar și lecitină) solide încapsulate cu Vorinostat (Fig. 6a), după care au fost administrate intravenos la șoareci ce prezentau diferite tumori. Rolul acestor nanoparticule lipidice este de a putea fi mai bine absorbite în celule, pentru a elibera medicamentul în celula canceroasă respectivă, cu scopul de a le distruge, fără a afecta într-un anumit fel, celulele sănătoase, datorită toxicității reduse. În urma acestui studiu, prin administrarea Vorinostatului sub formă încapsulată, s-a constat o reducere eficientă a tumorilor (Fig. 6b), prin scăderea nivelului de exprimare a histon deacetilazelor HDAC1 și HDAC3. Prin această formă încapsulată, eficacitatea Vorinostatului este mai mare decât prin administrarea în formă liberă, datorită faptului că aceste nanoparticule lipidice sunt mai bine reținute în organism, și astfel timpul de eliberare în celule este mai mare. [Halsall și Turner 2016; Ropero și Esteller 2007; Sawant și Shegokar 2014; Tran și colab., 2014; Kwak și colab., 2015]

Figura 6. Nanoparticule lipidice cu Vorinostat

www.media.springernature.com

În terapia anticanceroasă, pe lângă SAHA și TSA, mai sunt folosiți și alți inhibitori ai HDAC, unii dintre aceștia fiind încă în stadii clinice, care sunt prezentați în Tabelul 2.

Tabel 2. Inhibitori HDAC

[Li și Seto 2016]

De asemenea, în tratamentul cancerului, se mai utilizează și inhibitori ai histon acetilazelor care pot fi naturali sau sintetici, precum curcumina, acidul anacardic din alunele de caju sau diferiți compuși conjugați cu CoA. Funcția acestor inhibitori naturali ai HAT este aceea de a împiedica dezvoltarea celulelor canceroase, prin faptul că generează specii reactive de oxigen care inhibă exprimarea genei p300 în diferite tipuri de cancere (leucemie, limfomul Hodgkin), blochează procesul de hiperacetilare a histonelor și induc astfel apoptoza în celulele canceroase. [Zhang și colab., 2015; Folmer și colab., 2010; Haery și colab., 2015]

O altă abordare în ceea ce privește terapia anticanceroasă (ex. cancerul de sân, mielomul multiplu etc.) este, pe lângă utilizarea inhibitorilor HAT și HDAC, terapia epigenetică, care implică utilizarea unor liganzi epigenetici multiplii (epi-ML) care acționează împotriva mai multor tipuri de modificări de natură epigenetică, cum sunt modificări ce afectează ADN, structura cromatinei, prin modificări ale histonelor, ce implică activarea/ inactivarea unor gene, sau nivelul de exprimare a acestora, în asociere cu diferite tipuri de cancer.

Funcția acestor liganzi multipli este de a acționa simultan asupra mai multor modificări de natură epigenetică și de a induce apoptoza în celulele canceroase. Astfel de compuși epigenetici sunt compușii chimici naturali care se găsesc în bureții de mare, specia Pseudoceratina purpurea, care s-au dovedit a fi eficienti în distrugerea celulelor cancerigene, în special compusul chimic Psammaplin A (Bisprasin), ce acționează ca inhibitori ai enzimelor modificărilor epigenetice (ex. HDAC1) în diferite tipuri de cancere (ex. cancerul ovarian, cancerul de plămâni etc.). [Di Cerbo și Schneider 2013; Issa și colab., 2017; Reuter și colab., 2011; Kanwal și Gupta 2012; Medina 2016; Charkie 2014]

Fosforilarea

Proteine fosforilate

Fosforilarea, ca modificare post-sintetică, reprezintă una dintre cele mai frecvente modificări reversibile într-o celulă și constă în adăugarea unei grupări fosfat de către o anumită kinază după care este îndepărtată de o fosfatază specifică (Fig. 7)

Figura 7. Mecanismul de acțiune a fosforilării

(PK-protein kinaza, PP-protein fosfataza)

www.ncbi.nlm.nih.gov

Protein kinazele (PK) sunt enzime care fosforilează resturi de serină, treonină și tirozină ale proteinelor specifice din celule. Prin fosforilare, este astfel reglată activitatea enzimatică a proteinelor, interacțiunea acestora cu alte proteine sau molecule, modul în care acestea sunt degradate prin intermediul proteazelor. Modificările ce au loc în căile de semnalizare a protein kinazelor, prin afectarea funcției kinazei, au ca și efect transformarea malignă a celulelor.

Protein tirozin kinazele (PTK) reprezintă o categorie de oncogene, sunt implicate în proliferarea celulară, ciclul celular, apoptoză, iar prin dereglări ale exprimării lor, duc la dezvoltarea mai multor tipuri de cancere umane. Tirozin kinazele sunt împărțite în două mari clase: receptori tirozin kinazici (RTK), de exemplu EGFR (receptorul pentru factorul de creștere epidermal), FGFR (receptorul pentru factorul de creștere fibroblastic), IR (receptorul pentru insulină), VEGFR (receptorul pentru factorul de creștere endoteliului vascular), și non-receptori tirozin kinazici (NRTK), de exemplu SRC, ABL etc. [Adjei și Hidalgo 2005; Vlahovic și Crawford 2002]

Leucemia cronică mieoloidă este un sindrom al tulburării celuleor stem hematopietice mielodisplazice, datorată translocării între cromozomul 9 și cromozomul 22 (Cromozomul Philadelphia) (Fig. 8) Această translocație are ca rezultat juxtapunrea genei tirozin kinazei ABL1 (Abelson), care este implicată în reglarea ciclului celular, de pe cromozomul 9 lângă gena BCR (Breakpoint Cluster Region), de pe cromozomul 22, ce duce la formarea unei gene noi de fuziune (BCR-ABL) rezultând o creștere a fosfotirozinei (activitate kinazică mare), ce transformă celulele stem hematopoietice și este asociată cu gradul de dezvoltare a bolii; ATP se leagă de buzunarul de legare al Abl și este fosforilat. (Fig. 9) [Baccarani și colab., 2012; Shchemelinin și colab., 2006]

Figura 8. Juxtapunerea genei ABL lângă gena BCR,

cu formarea genei de fuziune BCR-ABL

www.synevo.ro

Figura 9. Proteina codificată de gena de fuziune BCR-ABL- activitatea kinazică

www.docplayer.com

Modalități de țintire în terapia anticanceroasă

Tirozin kinazele au un impact în ceea ce privește patogeneza diferitelor tipuri de cancere, prin faptul că sunt potențiale ținte în medicamentele anticanceroase. Inhibitorii tirozin kinazelor (ITK), reprezintă o clasă de medicamente utilizate în chimioterapie, ce au rolul de a preveni și bloca căile vitale prin direcționarea moleculelor de semnalizare care sunt necesare pentru supreviețuirea celualară. Imatinibul (Gleevec) este un inhibitor al tirozin kinazei ce blochează receptorul kinazei de a se lega de ATP, împiedicând astfel fosforilarea care ar putea aduce beneficii celulei canceroase și favorizând astfel diviziunea celulară (Fig. 10). Acesta țintește proteina de fuziune BCR-ABL și este folosit în terapia leucemiei mieloide cronice, dar și alte tipuri de cancere (ex. cancerul de sân, glioblastom etc.)

Figura 10. Mecanismul de acțiune a inhibitorului Gleevec

(LMC-Leucemia mieloidă cronică)

www.leukd.blogspot.ro

Pentru creșterea eficienței agenților terapeutici, pentru combaterea cât mai eficientă a tumorilor canceroase, s-au dezvoltat sisteme biodegradabile mici (de ex. nanoparticule/microsfere) care înglobează agentul terapeutic. Aceste nanoparticule sunt mai apoi eliberate în organism, preluate de celulele tumorale care recunosc liganzii țintă specifici, iar în urma eliberării agentului chimioterapeutic celulele sunt distruse, fără efecte secundare pentru celulele normale. Printre agenții chimioterapeutici care sunt încapsulați în astfel de sisteme, este și agentul terapeutic Imatinib, ce inhibă proteina de fuziune BCR-ABL din fosforilarea altor proteine în leucemia mieloidă acută, sau în alte tipuri de cancer (ex. cancerul de sân, glioblastom etc.).

Imatinib, este încapsulat în nanocapsule (Fig. 11 ) formate din acizi poli lactici și glicolici (PLGA), după care au fost administrate intravenos șoarecilor. S-a constat faptul că, prin administrarea de nanoparticule cu Imatinib, a fost inhibată proliferarea celulelor canceroase și angiogeneza (în cazul tumorilor craniene), dar și o scădere a gradului de toxicitate a agentului atunci când este administrat liber. [Marslin și colab., 2015; Ylmaz și colab., 2012]

Figura 11. Microsfere cu Imatinib

www.researchgate.net

Vatalanibul este un inhibitor selectiv al angiogenezei și acționează direct asupra mielomului multiplu, prin faptul că blochează exprimarea tirozin kinazelor VEGFR (VEGFR-1 și VEGFR-2), implicate în creșterea tumorală și metastază. Acesta este utilizat ca agent singur sau în asociere cu chimioterapia, la pacienții cu cancer colorectal, metastaze hepatice, cancerul de prostată, cancerul renal avansat.

Există și alți inhibitori ai tirozin kinazei care sunt utilizați în terapia anticanceroasă, prezentați în următorul tabel. [Arora și Scholar 2005; Bari și colab., 2012; Dervisis și Klahn 2016, Focosi 2016]

Tabel 3. Inhibitori tirozin kinazici

Glicozilarea

Proteine glicozilate

Glicozilarea reprezintă cel mai complex proces de modificare a proteinelor și este definit de procesul de adăugare a lipidelor și carbohidraților la proteine; astfel se formează lanțurile oligozaharidice, cunoscute sub denumirea de glicani, și se găsesc atât în multe proteine. Glicozilarea se poate face prin atașări de resturi oligoglucidice prin legături O- sau N-glicozidice. (Fig. 12).

Figura 12. Legarea lanțurilor laterale de carbohidrați la glicoproteine

The Cell: A Molecular Approach. 2nd edition

Glicozilarea prin legături N-glicozidice presupune atașarea covalentă a unei oligozaharide la resturile de asparagină din lanțurile polipeptidice și este implicată în procesele de pliere a proteinelor, dezvoltare și migrare a tumorilor. Astfel de proteine glicozilate prin legături N-glicozidice sunt apoliproteina B-100, α-1-antichimiotripsina, ceruloplasmina, iar supraexprimări sau modificări ale structurii acestora sunt identificate în mai multe tipuri de cancere, de exemplu, cancerul de sân, cancerul pancreatic, cancerul de plămân, cancerul de colon etc. [Watson și colab., 2015; Vasconcelos dos Santos și colab. 2015; Sheta și Bachvarov 2014]

Glicozilarea prin legături O-glicozidice implică atașarea de N-acetilgalactozamină la oricare dintre resturile de serină sau treonină din proteine. Cea mai abundentă clasă de O-glicani o reprezintă mucinele (MUC), niște glicoproteine mari, în care sunt înglobate multe resturi de serină și treonină, iar modificări în structura lor sunt asociate cu diferite tipuri de cancere (gastric, ovarian, pancreatic, de sân etc.) (Fig. 13) [Tucillo și colab., 2014]

Figura 13. Exprimarea mucinelor

Prin dereglările apărute în exprimare, există câteva tipuri de glicotransferaze (GALNACT), care sunt exprimate în diferite tumori maligne, prezentate în următorul tabel. [Sheta și Bachvarov 2014; Dall'Olio și Trinchera 2017; Ho și colab. 2016]

Tabel 4. Tipuri de glicotransferaze implicate în cancer

Dintre glicoproteinele transmembranare, CD44H aparține unei clase de receptori de adeziune celulară și este implicată în metastază. CD44H se leagă de acidul hialuronic (HA), fiind responsabil de semnalizarea celulară, dar și de declanșarea răspunsului imun inflamator.

La om, familia CD44 este codificată de o singură genă și prezintă mai multe izoforme cu diferite variante (v) (Fig. 14) și este glicozilat prin legături O- și N-glicozidice, în funcție de tipul de celulă canceroasă. Spre exemplu, CD44v6, este exprimat în limfoamele umane non-Hodgkin, cancerul colorectal, cancerul de sân însă cel mai frecvent, CD44 este exprimat în carcinomul ovarian epitelial. [Basakran 2015; Martin și colab., 2013; Misra și colab., 2011]

Figura 14. Structura CD44

(s-standard; v-variante)

www.smj.org.sa

Modalități de țintire în terapia anticanceroasă

Glicozilarea aberantă a glicoproteinelor din celulele canceroase, este abordată pentru dezvoltarea unor terapii bazate pe glicani, cum ar fi, inhibitori ai glicoziltransferazei, crearea de vaccinuri anticanceroase complet sintetice pe bază de glicani împotriva mai multor tipuri de cancer, de exemplu, vaccinurile pe bază de glicopeptide MUC1 cu diferite molecule (peptid T helper, receptor Toll-like etc.) sunt utilizate în tratarea cancerului de sân. [Li și colab., 2010; Ho și colab., 2016]

Prin capacitatea sa de biodegrabilitate și prin afinitatea la CD44, acidul hialuronic, poate fi utilizat pentru administrarea specifică de agenți terapeutici (doxorubicină, paclitaxel, mitomicina, 5-fluoroacil etc.) celulelor canceroase ce supraexprimă CD44, prin diferite nanoformulări, ce pot fi administrate eficient organelor și celulelor canceroase țintă, cu scopul de a îmbunătăți eliberarea specifică a medicamentelor antitumorale dar și a proprietăților lor.

În terapia cancerului hepatic, este utilizat doxorubicina, un antibiotic cu toxicitate mare. De aceea, pentru a reduce gradul de toxicitate a doxorubicinei și pentru a crește eficiența sa, s-au realizat studii asupra unor șoareci ce prezentau diferite tumori cu supraexprimări a CD44, prin încapsularea doxorubicinei în lipozomi cu HA, urmând ca acești lipozomi să fie injectați. Conform studiilor, concentrația antibioticului a crescut, decât dacă era injectat liber, acest lucru având o eficiență mai mare prin faptul că, acele tumori au scăzut în volum. (Fig. 15) [Watson și colab., 2015; Lu și colab., 2016; Rivankar 2014, Eliaz și Szoka 2001]

Figura 15. Terapia cu doxorubicină în lipozom

www.sciencedirect.com

www.researchgate.net

Agentul chimioterapeutic, 5-fluoroacil a fost încărcat în nanoparticule din chitosan, care au fost conjugate cu acid hialuronic, ceea ce a dus modificarea dimensiunilor acestor nanoparticule (nanoparticulele s-au mărit) (Fig. 16b). Mai apoi, nanoparticulele cu HA au fost injectate în coada șoarecilor. Prin faptul că, nanoparticulele au fost conjugate cu HA, 5-fluoroacil a fost eliberat în celulele canceroase în concentrații mai mari, decât administrat liber, datorită gradului mare de toxicitate, dar și a timpului redus de eliberare, pe care îl are acest agent terapeutic. Totodată, s-a constat o diminuare considerabilă a tumorilor, prin inducerea apoptozei în celulele canceroase ale gliobastomului, ale plămânilor.

Datorită administrării de medicamente antitumorale prin diferite nanoformulări, și datorită interacțiunii dintre CD44 și HA, face ca această glicoproteină să fie potrivită pentru țintirea antitumorală a cancerelor care exprimă CD44. [Yadav și colab., 2010; Wang și colab., 2017]

Figura 16. Nanoparticule cu acid hialuronic

www.researchgate.net

Metilarea

Proteine metilate

Metilarea proteinelor este o modificare post-sintetică covalentă ce implică transferul unei grupări metil la resturile de lizină și arginină și este catalizată de o familie de enzime numite protein metiltransferaze (PMT) care utilizează S-adenozilmetionina ca donor de resturi metil (SAM). [Petsko și Ringe 2004; Poulard și colab., 2016]

Lizina și arginina sunt supuse procesului de metilare în mod diferit, astfel, lizina este metilată ca monometil-, dimetil- și trimetil-lizină (Fig. 17b); fiecare fiind metilată de anumite protein lizin metiltransferaze (HMT/KMT). Arginina este, de asemenea, metilată în trei forme diferite: monmetil-arginină, dimetil-arginină asimetrică și dimetil-arginină simetrică (Fig. 17a) și sunt metilate de arginin metiltransferaze (PRMT). Supraexprimării ale arginin metiltransferazelor au fost identificate în diferite tipuri de cancer. (Tabel 5) [Bedford și Richard 2005; Zhang și colab., 2012; Poulard și colab., 2016; Hamamoto și Nakamura 2016]

Figura 17. Formele metilate ale lizinei și argininei

Tabel 5. Exprimări ale PRMT în cancerul uman

Există și metiltransferaze care catalizează resturi de lizină în proteinele non-histonice sau factori de transcripție (p53, ERα, NFkB, pCAF, Rb, VEGFR), care sunt esențiale pentru modificările epigenetice ce au loc în cromatină, și pot fi implicate în cancer. [Zhang și colab., 2012; Karve și Cheema 2011]

ADN genomic este supus metilării, prin intermediul unor enzime, denumite ADN metiltransferaze (ADNMTS). Mutațiile epigenetice apărute în procesul de metilare a proteinelor, ce afectează ADN prin gradul de metilare al proteinelor (hipo/hipermetilări) dar și exprimări aberante ale unor proteine, sunt identificate în mai multe tipuri de cancer, de exemplu, cancerul ovarian, de sân, colon, pancreatic,gastric etc. (Fig. 18) [Lewandowska și Batoszek 2011; ]

Figura 18. ADN metilat în cancer

www.nccri.ncc.go.jp

Modalități de țintire în terapia anticanceroasă

Rolul pe care îl au dereglările epigenetice în dezvoltarea cancerului a dus la crearea de terapii ce vizează acest tip de modificări. Inhibitorii arginin metiltransferazelor, ca alantodapsonă, stilbamdină și ai ADNMT ca azacitidină, decitabină și zebularină sunt în prezent cele mai utilizate medicamente în terapia cancerelor (ex. leucemie, cancer de sân) ca urmare a modificărilor epigenetice, prin faptul că inhibă genele supresoare tumorale. Pentru ca acești agenți terapeutici să poată acționa ca și inhibitori ai ADNMT, trebuie să fie integrați în ADN în timpul sintezei. Această integrare implică faptul că, acești agenți terapeutici suferă modificări chimice, înglobează ADN metiltransferaza, înlocuiește citozina și creează un complex între ADN metiltransferază și ADN-ul înlocuit de substanța respectivă, unde acestea sunt degradate. (Fig. 19) [Kim 2015; Lewandowska și Bartoszek 2011; Gnyszka și colab., 2013; Morettin și colab., 2015]

Figura 19. Acțiunea azacitadinei în terapia cancerului

www.vidaza.net

Deși marea majoritate a acestor tip de sisteme de înglobare a agenților terapeutici (lipozomi, nanoparticule, nanocapsule et.) sunt administrați intravenos, există studii care au încercat să schimbe modul de administrare a acestora. Un exemplu, sunt nanoparticulele ce înglobează agentul terapeutic decitabina, un inhibitor al ADNMT, utilizat în tratamentul leucemiei cronice și acute, cancerul de sân, cancere declanșate de gene care sunt suprimate de metilarea aberantă a ADN. Administrarea nanoparticulelor a fost pe cale orală, pe șoareci, cărora le-a fost indusă leucemia. (Fig. 20). Aceste nanoparticule sunt formate din acizi poli lactici și glicolici (PLGA), pentru a proteja decitabina de degradarea acizilor din stomac, și pentru a putea străbate mai ușor prin circulația sanguină. Scopul administrării orale a medicamentelor antitumorale prin formă încapsulată, este de a îmbunătății calitatea vieții pacientului, dar și o creștere a eficienței tratamentelor chimioterapeutice, dat fiind faptul că decitabina este instabilă administrat oral și este degradat rapid în ficat. S-a constatat o scădere a proliferării celulelor canceroase în leucemie, comparativ cu administrarea medicamentului liber sau în combinație cu alte medicamente antitumorale. [Jain și colab., 2016; Neupane și colab., 2014]

Figura 20. Nanoparticule încărcate cu decitabină

www.rjpbcs.com

Nitrarea

Proteine nitrate

Nitrarea proteinelor face parte din modificările oxidative ale proteinelor, la contactul cu agenți de nitrare (peroxinitrit) sau în cazul unor nivele crescute de stres oxidativ, și constă în atașarea de grupări de nitriți (-NO2), la resturile de tirozină din proteine de către speciile reactive de azot. [Karve și Cheema 2011; Vannini și colab. 2015]

Oxidul nitric (NO), este un compus liber ce străbate membranele celulare și interacționează cu moleculele țintă, fără a avea nevoie de transportatori sau receptori speciali.

NO se formează din oxidarea aminoacidului l-arginină, sub activitatea catalitică a sintetazelor (NOS) care necesită NADPH și O2 ca și cosubstrate, pentru a produce NO și l-citrulină ca și produși finali (Fig. 21). Oxidul nitric este generat de trei tipuri de sintetaze: neuronală (nNOs sau NOS1), inductibilă (iNOS) și endotelială (eNOS sau NOS3). Dintre cele trei enzime NOS, iNOS produce mai mult NO decât celelalte enzime și este implicat în transformarea malignă, angiogeneza și metastază. [De Sanctis și colab., 2014;Vannini și colab., 2015]

Figura 21. Formarea oxidului nitric

www.ncbi.nlm.nih.go

Pe lângă implicația sa în diferite procese biologice (traducere, procesarea ARNm etc.), oxidul nitric în asociere cu speciile reactive de oxigen și azot, mai este implicat și în dezvoltarea unor tipuri de cancer, prin modificările ce au loc în genele supresoare tumorale (deteriorări/ supraexprimări), dar și prin modificarea nivelului de stres oxidativ.

Cancerul pulmonar poate fi inițiat atunci când o celulă normală din plămân suferă mutații genetice, astfel se formează tumorile, care se pot răspândi în alte zone din plămâni. Fumul de țigară, unul dintre factorii declanșatori al acestui tip de cancer (Fig. 22), conține diferiți compuși cancerigeni (nitrozamine, hidrocarburi), care, în exces, pot inflama căile respiratorii prin acumularea de specii reactive de oxigen și azot (ROS/RNS), în urma stresului oxidativ. [Wiseman și Halliwell, 1996; Masri 2010]

Figura 22. Cancerul pulmonar, ca urmare a acumulării

de specii reactive de oxigen și azot din fumul de țigară

www.erj.ersjournals.com

Concentrații mari de oxid nitric au fost identificate și în țesuturile cancerului de sân, dar și în celulele carcinomului mamar. Exprimările NOS sunt asociate cu tipurile de hormoni secretați (estrogen, progesteron), dovedind implicarea NOS, ca și compuși liberi, în dezvoltarea cancerului de sân.

Celulele cervicale produc oxid nitric. Nivele crescute de NO au fost depistate la pacienții cu cancer de col uterin, indicând astfel implicația sa în progresia cancerului de col uterin. De asemenea, NO este asociat cu acest tip de cancer și prin infecțiile cu virusul papilloma (HPV), în condițiile în care au loc supraexprimări ale izoformelor eNOS și iNOS, și astfel, este stimulată dezvoltarea celulară a celulelor infectate cu acest tip de virus. [Vahora și colab., 2016; Choudhari și colab., 2013]

Modalități de țintire în terapia anticanceroasă

Oxidul nitric, prin cele trei tipuri de sintetaze, este implicat în dezvoltarea anumitor tipuri de cancer. De aceea, pentru a încetini dezvoltarea tumorală, pentru a îmbunătății eficiența terapiilor convenționale (chimio/radioterapia), se cercetează diferite metode de dezvoltare de inhibitori NOS (în funcție de tipul de cancer și gradul de evoluție), dar și de potențiali compuși cu activitate anticanceroasă care generează și donează NO. [Choudhari și colab., 2013; Hickok și Thomas 2010]

Statinele (de exemplu simvastatină, fluvastatină, pravastatină, lovastatină) sunt agenți de scădere a concentrației colesterolului, care inhibă HMG-CoA reductaza (3- hidroxi-3-metilglutaril coenzima A). Aceasta, la rândul său, catalizează conversia HMG-CoA în mevalonat și astfel este limitată biosinteza colesterolului (Fig. 23). Statinele au dovedit a avea activitate antitumorigenă și apoptotică care este mediată de inducerea iNOS, împotriva multor tipuri de cancer, ca și carcinomul de sân, cancerul ovarian, cancerul de prostată, melanom.

www.medscape.org

Figura 23. Acțiunea statinelor

În terapia anticanceroasă cu statine, au fost dezvoltate sisteme de dimensiuni mici (lipozomi, micelii, nanoparticule etc.) care înglobează acești agenți și o transportă la locul țintă, în celula canceroasă și astfel este limitată acumularea agenților terapeutici în celulele/țesutul sănătos. [Pandey și colab., 2016; Romana și colab., 2014]

O abordare nouă în terapie, este utilizarea statinelor sub formă de nanocristale, deoarece, comparativ cu celelalte tipuri de sisteme, acestea nu au nevoie de alți compuși (substanțe polimerice etc.), astfel sub această formă, pot avea o eficiență mai mare în terapie, pentru că se pot dizolva mai rapid în organism, decât administrate oral. (Fig. 24 )

Figura 24. Cristale de simvastatină

www.innovareacademics.in

Un alt tip de sistem utilizat în terapia cu statine, sunt nanoparticulele, care apar sub formă de nanocapsule, care prezintă o membrană realizată din polimeri, care limitează eliberarea medicamentului la locul țintă. De exemplu, agenții terapeutici fluvastatină și simvastatină, au fost înglobați într-un astfel de sistem, realizat din PPSu (poli-propilen-succinat). Scopul realizării de astfel de sisteme, este de a se reduce doza de fluvastatină în cazul administrării orale, dar și a posibilelor efecte adverse ce pot apărea în cazul unor supradozaje. (Fig. 25)

Figura 25. Nanoparticule de simvastatină

www.researchgate.net

Datorită proprietăților antiinflamatoare a statinelor, s-a cercetat activitatea acestora în celule canceroase, prin înglobarea agentului terapeutic, pravastatina, în lipozomi. Cercetările in vivo, pe șoareci, au demonstrat faptul că, în cazul administrării de lipozomi cu pravastatină, eficiența în tratarea tumorilor a fost mai mare, comparativ cu tratamentul clasic de pravastatină, datorită capacității de a inhiba proteinele care sunt implicate în declanșarea inflamației.

Statinele administrate sub formă de nanocristale, nanoparticule, lipozomi sunt utilizate în tratamentul diferitelor forme de cancer, cum este cancerul de sân, cancerul ovarian, cancerul de prostată, melanom. [Romana și colab., 2014; Wu și colab., 2015; Kotamraju și colab., 2007]

S-a încercat o abordare mai atentă cu privire la identificarea de agenți naturali chimio-preventivi ai cancerului (Tabel 6). Anumite substanțe de origine alimentară sunt asociate cu mecanisme antiinflamatorii, în scopul inhibării nivelelor crescute de NO, dar și a genelor implicate în dezvoltarea de tumori, reducând astfel tumorigeneza. Prin utilizarea de astfel de compuși alimentari naturali s-ar putea îmbunătăți sau înlocui metodele terapeutice clasice. [Vahora și colab., 2016; Award și Bradford 2005]

Tabel 6. Agenți chimio-preventivi din alimentație

Cel mai cunoscut agent chimioterapeutic 5-fluorouracil (5-FU) a indus iNOS și apoptoza în celulele canceroase hepatice, datorită compusului l-arginină, care a îmbunătățit sensibilitatea celulelor la 5-FU. De asemenea, medicamentele antiinflamatoare nesteroidiene dononare de NO , precum aspirina și ibuprofenul, au demonstrat a avea funcții anti-proliferative, anti-apoptotice în celulele canceroase (ale cancerului de sân, de prostată), prin faptul că au activitate inhibitorie a ciclooxigenazei 2 (COX-2), care se găsește supraexprimată în diferite tipuri de cancer, dar și împotriva prostaglandinelor, care se produc în cazul inflamațiilor. [Vannini și colab., 2015; Rayburn și colab., 2009; Roxburgh și McMillan 2014]

Ubiquitinarea

Proteine ubiquitinate

Ubiquitinarea este o modificare post-sintetică ce este coordonată și catalizată enzimatic și vizează proteinele pentru degradare și reciclare. Acest tip de modificare are un rol important în celulă, fiind implicată în ciclul celular, transcriere, diferențiere celulară, răspunsul la deteriorarea ADN și dezvoltarea cancerului. [Wei și Lin 2012; Shi și Grossman 2010]

Proteinele care sunt supuse degradării sunt marcate de o atașare covalentă a unei proteine reglatoare la resturi de lizină, denumită ubiquitină (Ub) și implică activarea acesteia cu ajutorul unor enzime cu diferite funcții: enzime de activare (E1), de conjugare (E2), ligaze (E3) ce recunosc substratele țintă, dar și enzime de dezubiquitinare (DUB), ce au rolul de înlătura ubiquitina din substratele țintă și o reciclează în citosol. (Fig. 26)

Figura 26. Procesul de ubiquitinare a proteinelor

www.ncbi.nlm.nih.gov

Prin faptul că multe proteine implicate în ciclul celular, proliferare celulară, apoptoză sunt ubiquitinate, de cele mai multe ori, astfel de evenimente celulare sunt modificate în cancer, prin exprimări aberante ale enzimelor ubiquitinării, acestea fiind asociate ca oncogene sau supresoaare tumorale în diverse tipuri de cancer.

Enzimele de conjugare (E2), au funcția de a transfera ubiquitina diferitelor substrate ale proteinelor țintă, rata transferului fiind mai mare atunci când sunt asociate cu o ligază de tipul E3, sunt implicate în reglarea progresiei ciclului celular, a inflamației și sunt supraexprimate în mai multe tipuri de cancer. De exemplu, enzima de conjugare a ubiquitinei E2N (UBE2N), este supraexprimată în diverse tumori, precum cea de sân, pancreas, prostată etc. iar cofactorul ei, UBE2V1 (varianta 1), se găsește în concentrație ridicată în cancerul de sân și cel colorectal, și este asociată cu creșterea migrării celulor canceroase în ambele tipuri de cancer dar și cu creșterea tumorală. [Gallo și colab., 2017; Kar și colab., 2013]

Ligazele E3 sunt implicate în reglarea proliferării celulare, oprirea ciclului celuar și apoptoză. Acestea pot fi supresoare tumorale sau oncogene, în funcție de capacitatea lor de a degrada fie oncogena, fie proteina supresoare tumorală. Ubiquitin ligazele de tip 3 sunt de mai multe tipuri, în funcție de domeniul catalitic conservate: RING- contribuie la transferul direct al ubiquitinei la substratul proteinei țintă, HECT (Homology to E6AP Carboxy Terminus)- se leagă de ubiquitină înainte să fie transferată ulterior și contribuie la degradarea proteinei supresoare p53 și familia de proteine omoloage UFD2 (U-box). [Shi și Grossman 2010; Sun 2006]

Ligaza Mdm2 (murine double minute 2, HDM2 la om) este o ligază de tip E3-RING și este responsabilă de ubiquitinarea și degradarea proteinei supresoare tumorale p53, care prin rolurile sale de a promova invazia celuleor canceroase, metastaza, etc., este implicată în declanșarea cancerului. Această ligază acționează prin faptul că se leagă direct de p53, inhibând astfel din funcțiile p53( apoptoza, deteriorări ADN etc.), reglând nivelul acesteia. (Fig. 27) [Shi și Grossman, 2010; Huang și Dixit 2016; Micel și colab., 2013]

Mdm2, prin nivele crescute, inactivează funcția p53 și contribuie la progresia metastazelor în diferite tipuri de cancer precum cancerul de sân, cancerul pulmonar, tumori ( limfomul Hodgkin), osteosarcoame. [Sane și Rezvani, 2017]

Figura 27. Interacțiunea Mdm2-p53

www.researchgate.net

Inhibitorii proteinelor implicate în apoptoză (IAP), fac parte din tipul E3 de ligaze și sunt active în diferite cancere. Aceștia intervin în degradarea mai multor substrate implicate în apoptoză, reglează diferiți factori nucleari (NF-kB) și căi de semnalizare care controlează exprimarea genelor implicate în inflamație, supraviețuirea celulară. IAP sunt exprimați în cancerele hepatice, pulmonare, carcinoamele ovariene, tumori limfoide. [Shi și Grossman 2010; Owens și colab., 2013]

Proteina BRCA1 este la rândul său o ligază E3; are activitate supresoare tumorală și este implicată în procesul de reparare a ADN. Această proteină este exprimată în mod aberant în cele mai multe cazuri de cancer mamar, dar și în cancerul ovarian. Pentru a avea activitate de tip ligază E3, BRCA1 formează un complex prin asocierea cu o altă proteină numită BARD1, cu domeniu RING, și duce astfel la creșterea activității ubiquitin ligazei pentru suprimarea tumorii. [Shi și Grossman 2010; Wu și colab., 2008]

O altă ligază E3 implicată în ubiquitinare și degradarea mediată de proteasom, este complexul VHL (von Hippel-Lindau)- cu o proteină cu un domeniu catalitic de tip RING, care este exprimată aberant în sindromul cu aceeași von Hippel-Lindau. Boala este caracterizată prin dezvoltarea unor tumori la nivelul celulelor renale, dar și la pancreas ( se formează chisturi). Unul dintre substratele ligazei VHL este HIF-1α (factorul 1α inductibil al hipoxiei) (Fig. 28), care reglează răspunsul celular atunci când nivelul de oxigen este scăzut și reglator al genelor în angiogeneză. În condiții de hipoxie, se pierde interacțiunea dintre HIF-1α și VHL pentru degradare, și astfel se induc gene ca factorul de creștere endotelial vascular (VEGF) sau alte gene inductibile de hipoxie. [Shi și Grossman 2010; Kamura și colab., 2000; Robinson și Ardley 2004]

Figura 28. Mecansimul ligazei VHL

www.wikiwand.com

Proteina asociată cu E6 (E6-AP) face parte din familia de ligaze HECT E3 și are funcția de a cataliza ubiquitinarea și de a contribui la degradarea genei supresoare p53 de către proteasom în infecțiile cu papilomavirusuri umane (HPV), în funcție de tipul de HPV. Tipurile de HPV de mare risc, cum sunt cele de tip 16, 18, 31 sunt asociate cu cancerul de col uterin, împreună cu cancerele genitale dar și cele de gât și cap. [Kar și colab., 2013; Micel și colab., 2013; Spataro și colab., 1998]

Enzimele de dezubiquitinare (DUB) sunt și ele implicate în degradarea proteasomului, în procesele reparatorii ale ADN. Supraexprimarea acestor enzime este asociată cu cancerele umane. De exemplu, USP7/HAUSP este implicată în reglarea funcției genei supresoare p53 dar și în înlăturarea ubiquitinei din Mdm2; este superexprimată în carcinomul de plămâni fără celule mici, cancerul de prostată. O altă enzimă de dezubiquitinare este USP28, care are funcția de a controla activitatea genei c-Myc, care este implicată în dezvoltarea celulelor canceroase, și este exprimată în cancerele de colon și sân. [Shi și Grossman 2010; Kar și colab., 2013]

Modalități de țintire în terapia anticanceroasă

Se încearcă dezvoltarea de agenți care vizează inhibarea activităților ligazelor E2, E3 și DUB., prin crearea de inhibitori ai enzimelor de dezubiquitinare, pentru țintirea USP7 (Fig. 29), sau inhibitori ca Nutlin-3, cu activitate antitumorală puternică în mai multe tipuri de cancere, printre care osteosarcomul și cancerul de prostată, care stabilizează concentrațiile celulare ale Mdm2, suprimă activitatea complexului Mdm2-p53 prin eliminarea ubiquitinei., astfel s-ar induce apoptoza în celulele canceroase (Fig. 30) [Gallo și colab., 2017; Shangary și Wang 2008]

Figura 29. Potențialul terapeutic în țintirea USP7

www.cumc.columbia.edu

Figura 30. Acțiunea inhibitorilor (Nutlin-3) în complexul

Mdm2-p53

www.pnas.org

În prezent, se utilizează în terapia antitumorală inhibitori ai proteasomului, care intervin în căile de semnalizare implicate în procesul de formare a tumorilor, precum delanzomib, carfilzomib, oprozomib, moarizomib. Primul inbitor proteasomic utilizat în scop clinic este bortezomib, în tratarea cancerului de prostată, pancreatic, mielom etc.; un compus care mediază degradarea proteică și are un efect citotoxic asupra celulelor mielomului.

Pentru a reduce toxicitatea în celule, și pentru a avea o eficiență mai bună în tratatarea mielomului, inhibitori ai proteasomului sunt înglobați în lipozomi, în combinație cu alți agenți terapeutici; în acest caz au fost înglobați doi agenți terapeutici (carfilzomib și doxorubicina).

Pentru realizarea lipozomilor s-a folosit ca polimer poli-etilen-glicol (PEG), datorită proprietăților sale în raport cu mărimea nanoparticulei, compatibilitatea cu agenții terapeutici, ușurința cu care aceștia pot fi înglobați. (Fig. 31). În acest studiu realizat pe șoareci, s-a constatat prin această combinație de medicamente, încetinirea dezvoltării tumorii mielomului, decât în cazul în care agenții terapeutici ar fi fost administrați singular și liber. [Weathington și Mallampalli 2014; Ashley și colab., 2016]

mct.aacrjournals.org

Figura 31. Nanoparticule ce înglobează carfilzomib și doxorubicină

în tratarea mielomului multiplu

încărcarea cu doxorubicină; b. încărcarea cu carfilzomib;

c. nanoparticula ce ambii agenți terapeutici

2.2.7. Lipidarea

2.2.7.1. Proteine lipidate

Lipidarea, cazul particular al palmitoilării, este o modificare covalenta post-sintetică ce implică adăugarea de acizi grași cu 16 atomi de carbon la resturile de cisteină din membrana celulară și sunt catalizate de către protein aciltransferaze (PAT). Acest tip de modificare este reversibilă, proteinele pot fi și depalmitolate, și are un rol important în asocierea și interacțiunea proteinelor membranare. Mutațiile în aceste enzime sunt asociate cu declanșarea cancerului.

Dintre proteinele care suferă modificări lipidice sunt cele din familia RAS. Aceste proto-oncogene sunt frecvent mutate în cancerele umane și sunt codificate de trei gene : KRAS(cea mai frecventă în cancer), HRAS și NRAS. RAS aparțin familiei de proteine mici G, și sunt implicate în creșterea, proliferarea și supraviețuirea celulară. Proteinele RAS sunt lipidate de către anumite protein aciltransferaze (DHH9, DHH11, DHH17), enzime ce au funcție oncogenică, dereglează căile de semnalizare din cancer și prin acestă lipidare, este afectată interacțiunea membranară a izoformelor RAS. Mutații în căile de semnalizare ale genei RAS (RAS-MAPK) blochează proteina, ceea ce duce la exprimarea aberantă a acesteia și este asociată în multe cancere (Tabel 7). [Guan și Fierke 2011; Azmi 2016; Planey 2013; Rajasekharan și Raman 2013]

Calea de semnalizare MAPK (protein kinaze activate de mitogen) este inițiată de legarea factorilor de creștere (TGF-α, EGF, VEGF, PDGF-α) de receptorii proteinei tirozin kinazei, care activează tirozin kinaza. Prin fosforilarea tirozinei, factorii activatori ai RAS, numiți SOS (son sof sevenless) din membrana plasmatică, se atașează la fosfotirozină prin intermediul proteinelor adaptoare Grb2, care facilitează îndepărtarea GDP de la RAS; RAS se leagă de GTP și fosforilează RAF, MEK și ERK. (Fig. 32). [Santarpia și colab., 2012; Roberts și Der 2007; Cristea și Sage 2016]

Tabel 7. Tipuri cancere asociate cu RAS

Midgley și Kerr 2002

Figura 32. Calea Ras/Mapk

www.journals.prous.com

Țintire în terapia anticanceroasă

O strategie alternativă în terapia antitumorală ar fi utilizarea unei combinații de inhibitori ai căii de semnalizare Ras/Mapk, de exemplu cu inhibitori RAF, pentru tratamentul melanomului, și tratamentul cu inhibitori ai receptorului de creștere epidermal (EGFR), pentru cancerul pulmonar, fără celule mici (NSCLC) (Fig. 33), sau inhibitori ai histon deacetilazelor (HDAC), ca apicidina; inhibitori ce au funcția de a deregla exprimări ale RAS, dar și a de încetini proliferarea celulelor canceroase. [Mattingly 2013; Ahronian și Corcoran 2017; Rajasekharan și Raman 2013]

În scopul țintirii terapeutice a oncogenelor RAS, o metodă este încapsularea agenților antitumorali în nanovezicule (ex. lipozomi), pentru a crește eficacitatea lor, dar și pentru a reduce gradul de toxicitate a acestora împotriva celulelor normale. Prin utilizarea de astfel de nanoparticule, șansele ca țesuturile tumorale sau celulele canceroase să fie țintite de către agentul terapeutic este mai mare, față de acțiunea liberă a acestuia.

S-a cercetat acțiunea antitumorală a arsenicului, prin trioxidul de arsen, un compus ce induce apoptoza, inhibă creșterea tumorală și reglează exprimarea K-Ras în diferite tipuri de cancer ( carcinoame pancreatice, cancerul de prostată, leucemie etc.), în care K-Ras este mutant. Nanoveziculele (lipozomi) au fost realizate din polimeri de tip PEG (poli-etilen-glicol). Trioxidul de arsen (ATO) este înglobat în lipozomi, care au fost încărcați în prealabil cu săruri metalice cum sunt acetatul de nichel, cobalt, cupru, zinc etc. cu care trioxidul de arsen fomrează complexe.(Fig. 34). Lipozomii încărcați cu trioxidul de arsen sunt pe urmă injectați, ajung în circulația sangvină unde sunt preluați de către celulele tumorale, nanoparticulele de arsen fiind astfel eliberate din lipozomi, în tumori, la un pH scăzut. Trioxidul de arsen poate fi înglobat în lipozomi ca agent singular, sau mai poate fi asociat și cu alți agenti antitumorali, în funcție de eficiența lor dar și de tipul de cancer în care aceștia sunt utilizați.

S-a constatat prin această metodă eficacitatea terapeutică a arsenului, studiu realizat pe șoareci, prin încetinirea dezvoltării celulelor canceroase, creșterii tumorale în diferite tipuri de cancer (pancreatic, colorectal, leucemie etc.), decât în cazul în care agenții terapeutici/ trioxidul de arsen ar fi fost administrați singular și liber, caz în care gradul de toxicitate ar fi fost prea puternic pentru celulele normale și eficacitatea lor prea scăzută. [Ahn și colab., 2010; Akhtar și colab., 2017; Printz 2010; Chen și colab., 2006; Antman 2001; Baláz și Sedlák 2010]

Figura 33 . Inhibitori RAS

(ALK-kinaza limfomului anaplazic; PI3K-fosfoinozitol 3 kinaza)

www.genomemedicine.biomedcentral.com

Figura 34. a. nanoparticule de arsen; b. lipozomi cu arsen în săruri de nichel

lipozomi de arsen în săruri de cobalt

www.spandidos-publications.com

www.researchgate.net

METODE DE ANALIZĂ ȘI IDENTIFICARE A MODIFICĂRILOR POST-SINTETICE A PROTEINELOR ÎN CANCER

În diagnosticul și tratamentul cancerului este deosebit de important identificarea modificărilor post-sintetice a proteinelor în cancer, fiindcă acest lucru îmbunătățește șansele de supraviețuire. Cu toate acestea, diagnosticarea inadecvată nu permite detectarea anumitor tipuri de cancer decât în stadii finale.

Proteomica este un domeniu care avansează rapid, datorită evoluțiilor în ceea ce privește spectrometria de masă și tehnologiile asociate cu aceasta. Scopul acestor tehnologii este detectarea precoce a proteinelor modificate post-sintetic,dar și a siturilor lor în cancer și, dacă este posibil, dezvoltarea de terapii. [Lu și colab., 2007]

În prezent, s-au dezvoltat metode de analiză și identificare a proteinelor modificate covalent, cum sunt cele bazate pe imunohistochimie (IHC), analiza imunoenzimatică (ELISA), spectrometria de masă, SILAC.

Spectrometria de masă

Spectrometria de masă este utilizată ca instrument de identificare a modificărilor post-sintetice în funcție de abundența, schimbarea masei moleculare a proteinelor modificate.. Identificarea proteinelor se poate realiza din soluții ce conțin proteine purificate și uneori din amestecuri complexe. [Van der Merwe și colab., 2007]

Principiu

Pentru a identifica proteina de interes, pentru o anumită modificare post-sintetică, este necesară digestia enzimatică a acesteia cu anumite enzime (tripsină sau alte proteaze), ca să fie în fragmente peptidice mici pentru a facilita procesul de analiză, după ce proteinele au fost izolate și separate prin electroforeză pe gel SDS-PAGE. Spectrometria de masă MALDI (MALDI-MS- ionizarea prin desorbție laser asistată de o matrice) presupune generarea de ioni protonați care se separă la un moment dat, pe baza raportului dintre masa proteomică și încarcarea electrică (m/z) și compararea maselor peptidice măsurate din spectrele obținute cu masele peptidice existente în bazele date specifice. [Powers și Palecek 2012; Sickmann și colab., 2002; Larsen și colab., 2006; Cheng și Zhang 2008]

Modificări post-sintetice identificate

Datorită faptului că, unele fosfopeptide, se găsesc în cantități reduse, pentru a se putea identifica proteinele fosforilate prin MS s-a încercat îmbogățirea acestora din probele de analiză prin utilizarea de anticorpi specifici împotriva fosfoserinei, fosfotreoninei,fosfotirozinei, enzime specifice ca fosfataza, sau asocierea cu alte metode, de exemplu, cromatografia lichidă de înaltă performanță (HPLC), care implică utilizarea de metale ca zinc, fier etc., pentru care fosfoproteinele au afinitate. Situsurile proteinelor fosforilate pot fi identificate datorită modificărilor ce au loc în masa moleculară a ionilor generați prin fragmentarea fosfopeptidelor.

Spectrometria de masă nu poate identifica tot timpul situsuri cu proteine fosforilate doar prin digestia enzimatică cu o singură protează. Dacă este identificat un anumit situs de interes și se dorește o analiză mai amănunțită pentru a detecta proteine fosforilate, proba de analiză se mai poate scinda enzimatic cu o altă enzimă, care poate îmbunătăți detectarea.

Fosforilarea poate fi observată prin pierderea grupării fosfat (-PO3H, ce are masa de 80 Da) din timpul fragmentării peptidelor (Fig. 35) În funcție de numărul de grupări fosfat pierdute, peptidele fosforilate la resturile de serină și treonină sunt mai repede detectate față de cele fosforilate la resturile de tirozină, deoarece gruparea fosfat este pierdută mai ușor. [Parker și colab., 2010; Seo și Lee 2004; Sickmann și colab., 2002; Johnson 2012; Witze și colab., 2007; Roboz 2002]

Figura 35. Identificarea fosfopeptidelor prin schimbarea de masă indusă de digestia enzimatică cu fosfatază prin spectrometria de masă

what-when-how.com/proteomics/protein-phosphorylation-analysis

Prin spectrometria de masă, pentru detectarea maselor peptidelor ubiquitinate și implicit a peptidelor cu situsurile de ubiquitinizare la aminoacizii modificați, este necesară digestia enzimatică cu tripsină, care are produce o peptidă ce conține –GG, ca și "etichetă de identificare" la resturile de lizină ce sunt modificate (Fig. 36). Pentru a identifica cu precizie peptidele modificate, se analizează proteina nemodificată, pentru a stabili cu exactitate peptidele noi identificate în proteina ubiquitinată. [Parker și colab., 2010; Kirkpatrick și colab., 2005; Xu și Jaffrey 2013; Xu și Peng 2006]

Figura 36. Identificarea proteinelor ubiquitinate cu eticheta –GG

prin spectrometria de masă

www.ncbi.nlm.nih.gov

Prin spectrometria de masă, tip MALDI sunt astfel detectate și alte tipuri de modificări post-sintetice, cu proteinele lor țintă. În Tabelul 8, sunt prezentate câteva tipuri de modificări post-sintetice și țintele lor, detectate prin spectrometria de masă, în cancerul de sân. [Kriegsmann și colab., 2015; Powers și Palecek 2012]

Tabel 8. Modificări post-sintetice identificate prin MS în cancerul de sân

[Jin și Zangar 2009]

Imunohistochimia

Principiu

Imunohistochimia (IHC) este o metodă ce utilizează anticorpi specifici pentru detectarea și analiza unor proteine modificate dintr-o probă sau țesut, ce pot fi vizualizați prin colorarea cu fluorofor (imunoflorescență) sau cu anumite enzime (peroxidază, fosfatază alcalină).

Prin această metodă se pot determina tipurile de celule canceroase, clasifica tipul de cancer și posibila origine a celulei canceroase respective. [Duraiyan și colab., 2012; Idiko 2010; Matos și colab., 2010]

Modificări post-sintetice identificate

Pentru detectarea proteinelor fosforilate țintă este necesară utilizarea unor anticorpi fosfo-specifici. Astfel, va face posibilă identificarea situsurilor de activare de pe anumiți receptori fosforilați care sunt implicați în diferite cancere, ca receptorul hormonilor pentru estrogen și progesteron, markerul Her2 (Fig. 37) la pacienții cu cancer mamar, proteina p16 ca marker de substituție în infecția cu virusul papilloma (HPV) și cancerul asociat cu acest virus, și proteina p63 asociată cu cancerul de prostată.

Dacă sunt utilizați anticorpi împotriva unui anumit situs de fosforilare dintr-un țesut, este necesar eliminarea grupărilor fosfat prin digestia cu fosfatază, pentru a nu se detecta colorația în secțiunea tratată cu fosfatază. În cazul utilizării de anticorpi care sunt specifici pentru un anumit receptor tirozin kinazic (de ex. Her2), prin aplicarea tehnologiei Western blot, va fi posibilă identificarea reacției dintre tirozin kinazele fosforilate și anticorpii respectivi. [Duraiyan și colab., 2012; Mandell 2003]

Figura 37. Identificarea prin imunohistochimie a Her2

negativ; b. neconcludent; c. pozitiv

www.nature.com/modpathol/journal

Tehnologia microarray

Prin această tehnologie este posibilă detectarea diferitelor modificări post-sintetice, atunci când detectarea lor este neclară sau imposibilă prin alte tehnici (ex. IHC, MS etc.)

3.3.1. Principiu

Tehnologia microarray reprezintă sisteme de analiză care conțin compuși cu densitate mare (anticorpi, enzime, proteine, gene etc.) ce permit detecția simultană a mai multor compuși de interes din cantități destul de mici de probă printr-o singură analiză.

Există mai multe tipuri de microarray: (Fig. 38)

ADN microarray în care ADN genomic este tăiat în fragmente mici prin utilizarea unor endonucleaze de restricție, și marcat cu markeri fluorescenți. Identificarea se face prin colorația fluorescentă emisă, prin care se poate se poate detecta prezența sau amplificarea genelor supresoare de tumori, din diferite tipuri de cancer ca melanom, cancer de sân, carcinom gastric etc.

Protein microarray în care anticorpii microarray sunt utilizați în scopul detectării proteinelor modificate post-sintetic ce sunt implicate în cancer, a interacțiunii dintre aceste proteine, dar și a identificării substratelor protein kinazelor. De asemenea, mai sunt utilizați diferiți compuși ca lectine pentru detectarea glicoproteinelor modificate, peptide pentru a evalua activitatea enzimatică a unor enzime implicate în căile de semnalizare ale acestor modificări post-sintetice. [Powers și Palecek 2012; Uzoma și Zhu 2013; Jin și Zangar 2009; Govindarajan și colab., 2012]

Figura 38. Tipuri de tehnologii microarray

www.cell.com

3.3.2. Modificări post-sintetice identificate

Prin metoda ELISA microarray, pentru identificarea proteinelor fosforilate, se utilizează un anticorp de captare, pentru proteina țintă, după care este adăugat un alt anticorp care are specificitate pentru situl de fosforilare a proteinei care este supusă analizei. Detectarea proteinei fosforilate de interes se face prin chemiluminiscența și analiza intensității spoturilor de pe filmele autoradiografice care exprimă gradul de concentrație al proteinei de interes în probă. Astfel, se pot detecta modificări la nivelul situsului de fosforilare ale proteinelor (ex. Bcr-Abl, EGFR), care sunt asociate cu diferite tipuri de cancer ca și cancerul pancreatic, leucemia cronică mieloidă, cancerul de prostată etc. [Merbl și Kirschner 2010; Gembitsky și colab., 2004; Atak și colab., 2016]

O altă modificare post-sintetică, în care aceste tehnici de array de proteine sunt aplicate este glicozilarea. Pentru identificarea proteinelor glicozilate modificate, sunt utilizate compuși ca autoanticorpi împotriva unor glicopeptide și lectine, cu afinitate pentru glicoproteine, care ar facilita astfel detecția glicoproteinelor modificate în cancer sau a unor antigene (CA 19-9, CA 15-3, CA-125), care ar putea fi utilizate ca biomarkeri în diagnostic. Astfel, se pot detecta modificări la nivelul situsului de glicozilare ale proteinelor (ex. mucine- MUC1, MUC5, MUC16, alfa fetoproteina), care sunt asociate cu diferite tipuri de cancer ca și cancerul de piele, cancerul hepatocelular, cancerul pancreatic, cancerul colorectal etc. [ Atak și colab., 2016; Jacob și colab., 2011; Patwa și colab., 2010; Powers și Palecek 2012]

Analiza SILAC

Principiu

SILAC (marcarea aminoacizilor cu izotopi stabili în culturi de celule) este o metodă de analiză bazată pe marcarea chimică/metabolică a unor aminoacizi cu N15, C13 (care nu sunt radioactivi) și pe spectrometria de masă ce permite identificarea diferitelor modificări post-sintetice ale proteinelor, prin compararea maselor moleculare a peptidelor modificate sau nemodificate detectate, care încorporează aminoacizii ,,grei”, cu masa moleculară standard. Metoda presupune marcarea a două tipuri de culturi de celule, una cu aminoacizi mai ușori cu izotopi 12 C și 14N și cealaltă cu aminoacizi marcați în prealabil cu izotopi grei ca 13C și 15N. De regulă, aminoacizii utilizați pentru această metodă sunt leucina, lizina și arginina pentru că, după ce celulele se divid și încoporează toți aminoaicizii cu izotopi, și sunt mai apoi degradate cu enzime proteolitice ca tripsina, acești aminoacizi generează peptide cu masă moleculară ridicată care poate fi detectată și cuantificată prin spectrometria de masă. [Ong și colab., 2002; Mann 2006; Chaube 2014; Dephoure și colab., 2013]

Modificări post-sintetice identificate

O modificare post-sintetică în care metoda SILAC este aplicată, este fosforilarea, pentru a studia fosfoproteomul pentru identifica situsurile modificate de fosforilare ale proteinelor implicate în cancer, precum și abundența relativă a acestora. S-au realizat studii pe receptorii sau non-receptorii activați de kinază (de ex. Her2, receptorii celulelor T, EGF, PDGF etc.) pentru a identifica care dintre aceștia prin căile lor de semnalizare, sunt activați în cancer. Culturile celulare au fost marcate cu aminoacizi, după care, s-au utilizat anticorpi împotriva fosfotirozinei pentru a izola fosfoproteomul, iar proteinele astfel precipitate au fost analizate prin spectrometria de masă. Practic, prin SILAC au fost identificate situsurile proteinelor fosforilate, prin modificările apărute în urma fosforilării. (Fig. 39) [Zhang și Neubert 2009; Woods și Darie 2014; Ibarrola și colab., 2003; Dephoure și colab., 2013]

Figura 36. Monitorizarea modificărilor în fosforilarea proteinelor prin

Metoda SILAC

www.researchgate.net

Cromatografie ionică analizată prin MS. Picurile reprezintă semnalul ionic al peptidelor individuale

Scanări MS al unei peptide nefosforilate și a unei peptide fosforilate. Spectrul din stânga prezintă mediul normal ( arg 12C) și cel marcat cu arginină 13C pentru peptida nefosofrilată, cu raportul de 588 (m/z) pentru mediul normal și 591( m/z) pentru mediul marcat.

Spectrul din dreapta prezintă mediul normal și cel marcat cu arginină 13C pentru fosofopeptide, cu raportul de 628 (m/z) pentru mediul normal și 632 (m/z) pentru mediul marcat.

Mediu normal cu arginină 12C; – mediu marcat cu arginină 13C

CONCLUZII

În această lucrare de disertație s-a urmărit prezentarea principalelor aspecte privind modificările post-sintetice întâlnite la proteine în cancer.

Metodele tehnologice avansate precum spectrometria de masă, imunohistochimia, tehnologia array și analiza SILAC sunt disponibile din ce în ce mai mult pentru identificarea și caracterizarea acestor tipuri de modificări post-sintetice.

S-a încercat evidențierea cât mai precisă a modificărilor post-sintetice (acetilare, fosforilare, metilare, glicozilare, nitrare, ubiquitinare și lipidare) și rolul pe care îl au proteinele modificate în transcrierea genetică, activitățile enzimatice, procesele de semnalizare celulară pe care celulele le manifestă în timpul transformării lor pentru a deveni celule neoplazice, prin utilizarea de figuri, scheme și tabele.

Datorită rolului pe care îl au proteinele modificate în patologia bolii și prin înțelegerea mecanismelor de acțiune în progresia cancerului, acestea devin obiective pentru dezvoltarea de medicamente/terapii antitumorale.

BIBLIOGRAFIE

Adjei A.A., Hidalgo M., 2005, Intracellular signal transduction pathway proteins as targets for cancer therapy, J. Clin. Oncol., 23(23), pp. 5386-5403.

Ahn R.W., Chen F., Chen H., Stern S.T., et al., 2010, A novel nanoparticulate formulation of arsenic trioxide with enhanced therapeutic efficacy in a murine model breast cancer, Clin. Cancer Res., 16(14), pp. 3607-3617.

Ahronian L.G., Corcoran R.B., 2017, Strategies for monitoring and combating resistance to combination kinase inhibitors for cancer therapy, Genome Medicine, 9(37), pp. 1-12.

Akhtar A., Wang S.X., Ghali L., et al., 2017, Recent advances in arsenic trioxide encapsulated nanoparticles as drug delivery agents to solid cancers, J. Biomed. Res., 31(3), pp. 177-188.

Antman K.H., 2001, Introduction: The history of arsenic trioxide in cancer therapy, The Oncol., 6(2), pp. 1-2.

Arora A., Scholar E.M., 2005, Role of tyrosine kinase inhibitors in cancer therapy, Perspectives in Pharmacol., 315(3), pp. 971-979.

Ashley J.D., 2016, Dual Carfilzomib and Doxorubicin loaded liposomal nanoparticles for synergistic efficacy in multiple myeloma, Mol. Cancer. Ther., 15(7), pp. 1452-1459.

Atak A., Mukherjee S., Jain R., Gupta S., et al., 2016, Protein microarray applications: Autoantibody detection and postranslational modification, Proteomics, 16(19), pp. 2557-2569.

Award A.B., Bradford P.G., 2005, Dietary compounds that protect froma cancer: Polyphenols, Nutrition and cancer prevention, Editura CRC Press, pp. 140-141.

Azmi A.S., 2016, Activation of RAS by post-translational modifications, Conquering RAS: From biology to cancer therapy, 1st edition, Editura Academic Press, Oxford, pp. 104-105.

Baccarani M., Pileri S., Steegmann J.L., Muller M., Soverini S., Dreyling M., 2012, Chronic myeloid leukemia: ESMO Clinical Guidelines for diagnosis, treatment and follow-up, Ann. Oncol., 23(7), pp. 72-77.

Baláz P., Sedlák J., 2010, Arsenic in cancer treatment: Challenges for application of realgar nanoparticles (a minireview), Toxins, 2, pp. 1568-1581.

Bari S.B., Surana S.J., 2012, Tyrosine kinase receptor inhibitors: A new target for anticancer drug development, J. Phar. SciTech., 1(2), pp. 36-45.

Basakran N.S., 2015, CD44 as a potential diagnostic tumor marker, Saudi Med. J., 36(3), pp. 273-279.

Bedard K., Krause K.H., 2007, The NOX familly of ROS-generating NADPH oxidases: Physiology and pathophysiology, Physiol Rev, 87, pp. 245-313.

Bedford M.T., Richard S., 2006, Arginine methylation: An emerging regulator of protein function, Molec. Cell, 18, pp. 263-272.

Berg J.M., Tymoczko J.L., Stryer L., 2002, Protein structure and function, Biochemistry, 5th edition, Editura W.H. Freeman and Company, New York.

Capello F., Conway de Macario E., Marasà L., Zummo G., Macario A.J.L., 2008, Hsp60 expression, new locations, functions and perspectives for cancer diagnosis and therapy, Cancer Biol. & Ther., 7(6), pp. 801-809.

Charkie J., 2014, Psammaplin A: A putative adjuvant for DNA damaging therapies, J. Cancer. Sci.Ther., 6(2), pp. 505-509.

Chaube R., 2014, Absolute quantitation of post-translational modifications, Front. Chem., 2(58), pp. 1-3.

Chen H., MacDonald R.C., Li S., Krett N.L., et al., 2006, Lipid encapsulation of arsenic trioxide attenuates cytoxicity and allows for controlled anticancer drug release, J. Am. Chem. Soc., 128(41), pp. 13348-13349.

Cheng L., Zhang D.Y., 2008, Introduction to clinical proteomics, Molecular genetic pathology, Editura Humana Press, pp. 232-238.

Choudhari S.K., Chaudhari M., Bagde S., et al., 2013, Nitric oxide and cancer: a review, World J. Surgical Oncol., 11(118), pp. 1-11.

Ciocca D.R., Calderwood S.K., 2005, Heat shock proteins in cancer: diagnostic, prognostic, predictive, and treatment implications, Cell Stress & Chaperones, 10(2), pp. 86-103.

Cooper G.M., 2000, Protein folding and processing, The Cell: A molecular approach, 2nd edition, Editura Sinauer Associates, Sunderland (MA).

Cooper G.M., 2000, The development and causes of cancer, The Cell: A molecular approach, 2nd edition, Editura Sinauer Associates, Sunderland (MA).

Cristea S., Sage J., 2016, Is the canonical RAF/MEK/ERK signaling pathway a therapeutic target in SCLC?, J. Thorac. Oncol., 11(8), pp. 1233-1241.

Culf M., Culf A., 2014, Protein acetylation as an integral part of metabolism in cancer development and progression, Am. J. Cancer Rev., 2(1), pp. 1-23.

Dall’Olio F., Trinchera M., 2017, Epigenetic bases of aberrant glycosylation in cancer, Int. J. Mol. Sci., 18(998), pp. 1-19.

De Sanctis F., Sandri S., Ferrarini G., Pagliarello I., et al., 2014, The emerging immunological role of post-translational modifications by reactive nitrogen species in cancer microenvironment, Front. Immunol., 5(69), pp. 1-12.

Dephoure N., Gould K.L., Gygi S.P., Kellogg D.R., 2013, Mapping and analysis of phosphorylation sites: a quick guide for cell biologists, Mol. Biol. Cell., 24(5), pp. 535-542.

Dervisis N., Klahn S., 2016, Therapeutic innovations: Tyrosine kinase inhibitors in cancer, Vet. Sci., 3(4), pp. 1-11.

Di Cerbo V., Schneider R., 2013, Cancers with wrong HATs: the impact of acetylation, Briefings in Functional Genomics, 12(3), pp. 231-243.

Duan G., Walther D., 2015, The roles of post-translational modifications in the context of protein interaction networks, PloS Comput. Biol., 11(2), pp. 1-23.

Duraivan J., Govindaraian R., Kalivappan K., Palanisamy M., 2012, Applications of immunohistochemistry, J. Pharm. Bioallied. Sci., 4(2), pp. 307-309.

Dwarakanath B.S., Verma A., Bhatt A.N., Parmar V.S., Raj H.G., 2008, Targeting protein acetylation for improving cancer therapy, Ind. J. Med. Res., 128, pp. 13-21.

Eliaz R.E., Szoka C.Jr., 2001, Liposome encapsulated Doxorubicin targeted to CD44: A strategy to kill CD44 overexpressing tumor cells, Cancer Res., 61, pp. 2592-2601.

Focosi D., 2016, Resistance to tyrosine kinase inhibitors in different types of solid cancer Resistance to tyrosine kinase inhibitors, Editura Springer, Italia, pp. 45-47.

Folmer F., Orlikova B., Schnekenburger M., Dicato M., Diederich M., 2010, Naturally occurring regulators of histone acetylation/deacetylation, Current Nutr.& Food Sci., 6, pp. 78-99.

Gallo L.H., Ko J., Donogue D.J., 2017, The importance of regulatory ubiquitination in cancer and metastasis, Cell Cycle, 16(7), pp. 634-648.

Gembitsky D.S., Lawlor K., Jacovina A., Yaneva M., Tempst P., 2004, A prototype antibody microarray platform to monitor changes in protein tyrosine phosphorilation, Molec. & Cell. Proteomics, 3(11), pp. 1102-1118.

Gnyszka A., Jastrzębski Z., Flis S., 2013, DNA methyltransferase inhibitors and their emerging role in epigenetic therapy of cancer, Anticancer Res., 33, pp. 2989-2996.

Govindarajan R., Duraivan J., Kalivappan K., Palanisamy M., 2012, Microarray and it’s applications, J. Pharm. Bioallied. Sci., 4(2), pp. 310-312.

Guan X., Fierke C.A., 2011, Understanding protein palmitoylation: Biological significance and enzymology, Sci. China Chem., 54(12), pp. 1888-1897.

Haery L., Thompson R.C., Gilmore T.D., 2015, Histone acetyltransferases and histone deacetylases in B- and T-cell development, physiology and malignancy, Genes&Cancer, 6(5-6), pp. 184-213.

Halliwell B., 2007, Oxidative stress and cancer: Have we moved forward?, Biochem. J., 401, pp. 1-11.

Halsall J.A., Turner B.M., 2016, Histone deacetylase inhibitors for cancer therapy: An evolutionarily ancient resistance response may explain their limited success, Bioessays, 38, pp. 1102-1110.

Hamamoto R., Nakamura Y., 2016, Dysregulation of protein methyltransferases in human cancer: An emerging target class for anticancer therapy, Cancer Sci., 107, pp. 377-384.

Hickok J.R., Thomas D.D., 2010, Nitric oxide and cancer therapy: The emperor has no clothes, Curr. Pharm. Des., 16(4), pp. 381-391.

Ho L.W., Hsu W.M., Huang M.C., Kadomatsu K., Nakagawara A., 2016, Protein glycosylation in cancers and its potential therapeutic applications in neuroblastoma, J. Hematol. Oncol., 9(1), pp. 1-15.

Huang X., Dixit V.M., 2016, Drugging the undruggables: exploring the ubiquitin system for drug development, Cell Res., 26, pp. 484-498.

Ibarrola N., Kalume D.E., Gronborg M., Iwahori A., Pandei A., 2003, A proteosomic approach for quantitation of phosphorylations using Stable Isotope Labelling in Cell Culture, Anal. Chem., 75(22), pp. 6043-6049.

Idikio H.A., 2009, Immunohistochemistry in diagnostic surgical pathology: contributions of protein life-cycle, use of evidence-based methods and data normalization on interpretations of immunohistochemical stains, Int. J. Clin. Exp. Pathol., 3(2), pp. 169-176.

Issa M.E., Takhsha F.S., Chirumamilla C.S., Perez-Novo C., et al., 2017, Epigenetic strategies to reverse drug resistance in heterogenous multiple myeloma, Clin. Epig., 9(17), pp. 1-13.

Jacob F., Goldstein D.R., Bovin N.V., Pochechueva T., et al., 2012, Serum antiglycan antibody detection of nonmucinous ovarian cancers by usig a printed glycan array, Int. J. Cancer, 130, pp. 138-146.

Jain P., Tiwari M., kumar N., Rao J.V., Udupa N., 2016, Orally delivered decitabine loaded PLGA nanoparticles combined with docetaxel supress solid tumors: an in vitro investigation, Res. J. Pharm. Biol.&Chem. Sci., 7(5), 417-424.

Jego G., Hazoumé A., Seigneuric R., Garrido C., 2013, Targeting heat shock proteins in cancer, Cancer Letters, 332, pp. 275-285.

Jin H., Zangar R.C., 2009, Protein modifications as potential biomarkers in breast cancer, Biomarker Insights, 4, pp. 191-200.

Johnson M., 2012, Protein modification research methods, Mater Methods, 2(118), pp. 1-12.

Kamura T., Sato S., Iwai K., Czyzyk-Krzeska M., et al., 2000, Activation of HIF1α ubiquitination by a reconstituted von Hippel-Landau (VHL) tumor supressor complex, Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 97(19), pp. 10430-14035.

Kaneal R., Gupta S., 2012, Epigenetic modifications in cancer, Clin Genet., 81(4), pp. 303-311.

Kar G., Keskin O., Fraternali F., Gursoy A., 2013, Emerging role of the ubiquitin-protesome system as drug targets, Current Pharmaceutical Design, 19(00), pp. 1-15.

Karve T.M., Cheema A.K., 2011, Small changes huge Impact: The role of protein post-translational modifications in cellular homeostasis and disease, J. Amino Acids, 2011, pp. 1-13.

Kim S.H., Kang H.J., Na H., Lee M.O., 2010, Trichostatin A enhances acetylation as well as protein stabililty of Erα through induction of p300 protein, Cancer Res., 12(2), pp. 1-8.

Kim Y.Z., 2015, Protein methylation and demethylation in cancer, Int. J. Neurol. Research, 1(3), 129-140.

Kirkpatrick D.S., Denison C., Gygi S.P., 2005, Weighing in on ubiquitin: The expanding roles of mass spectrometry based proteomics, Nat. Cell. Biol., 7(8), pp. 750-757.

Kotamraju S., Willams C.L., Kalyanaraman B., 2007, Statin induced breast cancer cell death: Role of inducible nitric oxide and arginase dependent pathways, Cancer Res., 67(15), pp. 7386-7394.

Kriegsmann M., Arens N., Endris V., Weichert W., Kriegsmann J., 2015, Detection of KRAS, NRAS, BRAF by mass spectrometry- a sensitive, reliable, fast and cost-effective technique, Diagnostic Pathology, 10(132), pp. 1-11.

Kwak T.W., Kim D.H., Jeong Y.I., Kang D.H., 2015, Antitumor activity of vorinostat- incorporated nanoparticles against human cholangiocarcinoma cells, J. Nanobiotechnol., 13(60), pp. 1-11.

Lakshmaiah K.C., Jacob L.A., Aparna S., Lokanatha D., Saldanha S.C., 2014, Epigenetic therapy of cancer with histone deacetylase inhibitors, J. Cancer Res.&Ther., 10(3), pp. 469-478.

Larsen M.R., Trelle M.B., Thingholm T.E., Jensen O.N., 2006, Analysis of posttranslational modifications of proteins by tandem mass spectrometry, Biotechniques, 40(6), pp. 790-798.

Lewandowska J., Bartoszek A., 2011, DNA methylation in cancer development, diagnosis and therapy- multiple opportunities for genotoxic agents to act as methylome disruptors or remediators, Mutagenesis, 26(4), pp. 475-487.

Li M., Song L., Qin X., 2010, Glycan changes: cancer metastasis and anti-cancer-vaccines, J. Biosci., 35, pp. 665-673.

Li Y., seto E., 2016, HDACs and HDAC inhibitors in cancer development and therapy, Cold Spring Harb. Prospect Med., 6, pp. 1-34.

Lu B., Huang X., Mo J., Zhao W., 2016, Drug delivery using nanoparticles for cancer stem-like cell targeting, Front. Pharmacol., 7(84), pp. 1-12.

Lu H., Ouyang W., Huang C., 2006, Inflammation, a key event in cancer development, Mol. Cancer Res., 4(4), pp. 221-233.

Lu M., Faull K., Whitelegge J.P., He J., et al., 2007, Proteomics and mass spectrometry for cancer biomarker discovery, Biomarker Insights, 2, pp. 347-360.

Mandell J.W., 2003, Phosphorylation state-specific antibodies. Applications in investigative and diagnostic pathology, Am. J. Path., 163(5), pp. 1687-1698.

Mann M., 2006, Functional and quantitive proteomics using SILAC, Nat. Rev. Mol. Cell Biol., 7(12), pp. 952-958.

Marchion D., Münster P., 2007, Development of histone deacetylase inhibitors for cancer treatment, Expert Rev. Anticancer Ther., 7(4), pp. 583-598.

Marslin g., Revina A.M., Megraj V.K., Balakumar K.K., Prakash J., et al., 2015, Delivery as nanoparticles reduces imatinib mesylate-induced cardiotoxicity and improves anticancer activity, Int. J. Nanomed., 10, pp. 3163-3170.

Martin T.A., Ye L., Sanders A.J., Lane J., Jiang W.G., 2013, Cancer invasion and metastasis: Molecular and cellular perspective, Madame Curie Bioscience Database, Editura Landes Bioscience, Austin (TX), pp. 1-54.

Masri F., 2010, Role of nitric oxide and its metabolites as potential markers in lung cancer, Ann. Thoracic Medicine, 5(3), pp. 123-127.

Matos L., Trufelli D.C., Matos M.G., Pinhal A.S., 2010, Immunohistochemistry as an important tool in biomarkers detection and clinical practice, Biomark Insights, 5, pp. 9-20.

Mattingly R.R., 2013, Activated Ras as a therapeutic target: constraints on directly targeting Ras isoforms and wild-type versus mutated proteins, ISRN Oncology, 2013, pp. 1-14.

Medina F.J., 2016, The road ahead of the Epi-informatics fiels, Epi-informatics: Discovery and development of small molecule epigenetic drugs and probes, 1st edition, Editura Academic Press, Oxford, pp. 411-413.

Merbl Y., Kirschner M.W., 2011, Protein microarrays for genome-wide posttranslational modification analysis, Wiley Interdiscip. Rev. Syst. Biol. Med., 3(3), pp. 347-356.

Micel N.L., Tentler J.J., Smith P.G., Eckhardt S.G., 2013, Role of ubiquitin ligases and the proteasome in oncogenesis: Novel targets for anticancer therapies, J. Clin. Oncol., 31, pp. 1231-1238.

Midgley R.S., Kerr D.J., 2002, Ras as a target in cancer therapy, Critical Rev. Oncol. Hematol., 44(2), pp. 109-120.

Misra S., Heldin P., Hascall V.C., Karamanos N.K., Skandalis S.S., et al., 2011, HA/CD44 interactions as potential targets for cancer therapy, FEBS. J., 278(9), pp. 1429-1443.

Mitra A., Shevde L.A., Samant R.S., 2008, Multi-faced role of HSP40 in cancer, Clin. Exp. Metastasis, 26, pp. 559-567.

Morettin A., Baldwin R.M., Côté J., 2015, Arginine methyltransferases as novel therapeutic targets for breast cancer, Mutagenesis, 30, pp. 177-189.

Murphy M.E., 2013, The HSP70 family and cancer, Carcinogenesis, 34(6), pp. 1181-1188.

Nahoum S.R., 2006, Why cancer inflammation?, Yale J. Biol. Med., 79(3-4), pp. 123-130.

Narayan S., Bader G.D., Reimand J., 2016, Frequent mutations in acetylation and ubiquitination sites suggest novel driver mechanisms of cancer, Gen. Med., 8(55), pp. 1-13.

Neupane R.Y., Srivastava M., Gyenwalee S., Ahmad N., et al., 2014, Solid lipid nanoparticles for oral delivery of decitabine: Formulation optimization, characterization, stability and ex-vivo gut permeation studies, Sci. Adv. Mater., 6, pp. 1-13.

Nishida N., Yano H., Nishida T., Kamura T., Kojiro M., 2006, Angiogenesis in cancer, Vasc. Health Risk Manag., 2(3), pp. 213-219.

Ong S.E., Blagoevt B., Kratchmarovat I., Kristensen D.B., et al., 2002, Stable Isotope Labbeling by Aminoacids in Cell Culture, SILAC, as a simple and accurate approach to expression proteomics, Moll. Cell. Proteomics, 1(5), pp. 376-386.

Owens W.T., Gilmore P.A., Streuli C.H., Foster F.M., 2013, Inhibitor of apoptosis proteins: Promising targets for cancer therapy, J. Carcinog. Mutagen, 14, pp. 1-9.

Pandey H., Rani R., Agarwal V., 2016, Liposome and their applications in cancer therapy, Braz. Arch. Biol. Technol., 59, pp. 1-10.

Parker C.E., Mocanu V., Mocanu M., Dicheva N., Warren M.R., 2010, Mass spectrometry for post-translational modifications, Neuroproteomics, Editura CRC Press/Taylor&Francis, Boca Raton (FL).

Patwa T., Li C., Simeone D.M., Lubman D.M., 2010, Glycoprotein analysis using protein microarrays and mass spectrometry, Mass Spectrom. Rev., 29(5), pp. 830-844.

Petsko G.A., Ringe D., 2004, Protein Structure and Function, Editura New Science Press Ltd., London, pp. 126-127.

Pezzella F., Harris A.L., Tavassoli M., Gatter K.C., 2015, Blood vessels and cancer much more than angiogenesis, Cell Death Discov.,1, pp. 1-2.

Planey S.L., 2013, Discovery of selective and potent inhibitors of plamitoylation, Drug discovery, Editura Intech, pp. 251-276.

Poulard C., Corbo L., Le Romancer M., 2016, Protein arginine methylation/demethylation and cancer, Oncotarget, 7(41), pp. 67532-67550.

Powers A.D., Palecek S.P., 2012, Protein analytical assays for diagnosing, monitoring, and choosing treatment for cancer patient, J. Healthc. Eng., 3(4), 503-534.

Prager G.W., Poettler M., 2012, Angiogenesis in cancer. Basic mechanisms and therapeutic advances, Hamostaseologie, 32(2), pp. 105-114.

Printz C., 2010, Arsenic nanoparticle holds promise in blocking agressive breast cancer, Cancer, 116(24), pp. 5567.

Rajasekharan S.K., Raman T., 2013, Ras and Ras mutations in cancer, Cen. Eur. J. Biol., 8(7), pp. 609-624.

Rayburn E.R., Ezell S.J., Zhang R., 2009, Anti-inflamatory agents for cancer therapy, Mol Cell Pharmacol., 1(1), pp. 29-43.

Reuter S., Gupta S.C., Chaturvedi M.M., Aggarwal B.B., 2010, Oxidative stress, inflammation, and cancer: How are they linked?, Free Radic. Biol. Med., 49(11), pp. 1603-1616.

Reuter S., Gupta S.C., Park B., Aggarwal B.B., 2011, Epigenetic changes induced by curcumin and other natural compounds, Genes Nutrs., 6(2), pp. 93-108.

Rivankar S., 2014, An overview of doxorubicin formulations in cancer therapy, J. Cancer Res.& Ther., 10(4), pp. 853-858.

Roberts P.J., Der C.J., 2007, Targeting the RAF-MEK-ERK mitogen-activated protein kinase cascade for the treatment of cancer, Oncogene, 26, pp. 3291-3310.

Robinson P.A., Ardley H.C., 2004, Ubiquitin-protein ligases, J. Cell Sci., 117, pp. 5191-5194.

Roboz J., 2002, Mass spectrometry in cancer research, Editura CRC Press, pp. 387-388.

Romana B., Batger M., Prestidge C., Colombo G.,Sonvico F., 2014, Expanding the therapeutic potential of statins by means of nanotechnology enabled drug delivery systems, Curr. Topics Med. Chem., 14, pp. 1182-1193.

Ropero S., Esteller M., 2007, The role of histone deacetylases (HDACs) in human cancer, Molec. Oncol., 1, pp. 19-25.

Roxburgh C.S.D., McMillan D.C., 2014, Cancer and systemic inflammation: treat the tumor and treat the host, Br. J. Cancer., 110(6), pp. 1409-1412.

Sager R., 1997, Expression genetics in cancer: Shifting the focus from DNA to RNA, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94, pp. 952-955.

Sane S., Rezvani K., 2017, Essential Roles of E3 Ubiquitin ligases in p53 regulation, Int. J. Mol. Sci., 18(2), pp.1-20.

Santarpia L., Lippman S.L., El-Naggar A., 2012, Targeting the mitogen-activated protein kinase RAS-RAF signaling pathway in cancer therapy, Expert Opin. Ther. Targets, 16(1), pp. 103-119.

Sawant S., Shekogar R., 2014, Cancer research and therapy: Where are we today?, Int. J. Cancer Ther.& Oncol., 2(4), pp.1-18.

Seo J., Lee K.J., 2004, Post-translational modifications and their biological functions: Proteomic analysis and systematic approaches, J. Biochem.& Molec. Biol., 37(1), pp. 35-44.

Shangary S., Wang S., 2008, Targeting the MDM2–p53 interaction for cancer therapy, Clin. Cancer Res., 14(17), pp. 5318-5324.

Shchemelinin I., Šefc L., Nečas E., 2006, Protein kinases, their function and implication in cancer and other diseases, Folia Biologica (Praha), 52, pp. 81-101.

Sheta R., Bachvarov D., 2014, Role of aberrant glycosylation in ovarian cancer dissemination, Biomed. Reviews, 25, pp. 83-92.

Shi D., Grossman S.R., 2010, Ubiquitin becomes ubiquitinous in cancer. Emerging roles of ubiquitin ligases and deubiquitinases in tumorigenesis and as therapeutic targets, Cancer Biology & Therapy, 10(8), pp. 737-747.

Sickmann A., Mreyen M., Meyer H.E., 2002, Identification of modified proteins by mass spectrometry, I.U.B.M.B. Life, 54(2), pp. 51-57.

Singh B., Zhang G., Hwa Y.L. Li J., et al., 2010, Nonhistone protein acetylation as cancer therapy targets, Expert Rev. Anticancer Ther., 10(6), pp. 935-954.

Sosa V., Moliné T., Somoza R., Paciucci R., et al., 2012, Oxidative stress and cancer: an overview, Ageing Res. Rev., 12(1), pp. 376-390.

Spataro V., Norbury C., Harris A.L., 1998, The ubiquitin-proteasome pathway in cancer, Brit. J. Cancer, 77(3), pp. 448-455.

Sun Y., 2006, E3 ubiquitin ligases as cancer targets and biomarkers, Neoplasia, 8(8), pp. 645-654.

Tóth K.F., Knoch T.A., Wachsmuth M., Frank-Stöhr M., et al., 2004, Trichostatin A-induced histone acetylation causes decondensation of interphase chromatin, J. Cell Sci., 117(18), pp. 4277-4287.

Tran T.H., Chu D.T., Truong D.H, Tak J.W., et al., 2016, Development of lipid nanoparticles for a histone deacetylases inhibitor as a promising anticancer therapeutic, Drug delivery, 23(4), pp. 1335-1343.

Tucillo F.M., Laurentiis A., Palmieri C., Fiume G. et al., 2014, Aberrant glycosylation as biomarker for cancer: Focus on CD43, BioMed Research Int., 2014, pp. 1-14.

Uzoma I., Zhu H., 2013, Interactome Mapping: Using protein microarray technology to reconstruct diverse protein networks, Genom. Proteom. Bioinf., 11(1), pp, 18-28.

Vahora H., Khan M.A., Alalami U., Hussain A., 2016, The potential role of nitric oxide in halting cancer progression through chemoprevention, J. Cancer Prevention, 21(1), pp. 1-12.

Van der Merwe D.E., Oikonomopoulu K., Marshall J., Diamandis E.P., 2007, Mass spectrometry: uncovering the cancer proteome for diagnostics, Adv. Cancer Res., 96, pp. 23-50.

Vannini F., Kashfi K., Nath N., 2015, The dual role of iNOS in cancer, Redox Biol., 6, pp. 334-343.

Vasconcelos-dos Santos A., Oliveira I.A., Lucena M.C., Mantuano N.R, et al., 2015, Biosynthetic machinery involved in aberrant glycosylation: promising targets for developing of drugs against cancer, Front. Oncol., 5(138), pp. 1-23.

Vlahovic G., Crawford J., 2003, Activation of tyrosine kinases in cancer, The Oncol., 8, pp. 531-538.

Wang T., Hou J., Su C., Zhao L., Shi Y., 2017, Hyaluronic acid-coated chitosan nanoparticles induce ROS-mediated tumor cell apoptosis and enhance antitumor efficiency by targeted drug delivery via CD44, J. Nanobiotechnol., 15(7), pp. 1-12.

Watson M.E., Diepeveen L.A., Stubbs K.A., Yeoh G.C., 2015, Glycosylation-related diagnostic and therapeutic drug target markers in Hepatocellular Carcinoma, J. Gastrointestin Livers Dis., 24(3), pp. 349-357.

Weathington N.M., Mallampalli R.K., 2014, Emerging therapies targeting the ubiquitin proteasom system in cancer, J. Clin. Invest., 124(1), pp. 6-12.

Wei W., Lin H.K., 2012, The key role of ubiquitination and sumoylation in signaling and cancer: a research topic, Front. Oncol., 2(187), pp. 1-2.

Wiseman H., Halliwell B., 1996, Damage to DNA by reactive oxygen and nitrogen species: role in inflammatory disease and progression to cancer, Biochem. J., 313, pp. 17-29.

Witze E.S., Old W.M., Resing K.A., Ahn N.G., 2007, Mapping protein post-translational modifications with mass spectrometry, Nat. Methods, 4(10), pp. 798-806.

Woods A.G., Darie CC., 2014, Satbile Isotope Labeling by Amino acids for quantitive proteomics, Advancements of Mass spectrometry in Biomedical research, Editura Springer, pp. 96-97.

Wu W., Koike A., Rakeshita T., Ohta T., 2008, The ubiquitin E3 ligase activity of BRCA1 and its biological functions, Cell Division, 3(1), pp. 1-10.

Wu Y., Wang Z., Liu G., Wang X., et al., 2015, Novel Simvastatin-loaded nanoparticles based of cholic acid core star shaped PLGA for breast cancer treatment, J. Biomed. Nanotechnol., 11(7), pp. 1247-1260.

Xu G., Jaffrey S.R., 2013, Proteomic identification of protein ubiquitinatin events, Biotechnol. Genet. Eng. Rev., 29(1), pp. 73-109.

Xu P., Peng J., 2006, Dissecting the ubiquitin pathway by mass spectrometry, Biochim. Biophys. Acta., 1764(12), pp. 1940-1947.

Yadav A.K., Agarwal A., Rai G., Mishra P, Jain S., et al., 2010, Development and characterization of hyaluronic acid decorated PLGA nanoparticles for delivery of 5-fluorouracil, Drug delivery, 17(8), pp. 561-572.

Ylmaz O.K., Ozkan A., Akgun E., Kukut M., et al., 2012, Controlled release of imatinib mesylate from PLGA microspheres inhibit craniopharyngioma mediated angiogenesis, J. Mater. Sci.: Mater Med., 24(1), pp. 147-153.

Zhang C., Zhong J.F., Stucky A., Chen X.L., et al., 2015, Histone acetylation: novel target for the treatment of acute lymphoblastic leukemia, Clin. Epigen., 7, 1-10.

Zhang G., Neubert T.A., 2009, Use of Stable Isotope Labeling by Amino acids in Cell Culture (SILAC), for phosphotyrosine protein identification and quantitation, Methods Mol. Biol., 527, pp. 79-92.

Zhang X., Wen H., Shi X., 2012, Lysine methylation: beyond histones, Acta Biochim. Biophys. Sin., 44(1), pp. 14-27.

Zoubeidi A., Gleave M., 2012, Small heat shock proteins in cancer therapy and prognosis, Int. J. Biochem. & Cell Biol., 44(2012), pp. 1646-1656.

Duffy MJ., Maguire T.M., Hill A., et al., 2000, Metaloproteinases: Role in breast cancer carinogenesis, invasion and metastatsis, Breast Cancer Res., 2(4), pp. 252-257.

Kessenbrock K., Plaks V., Werb Z., 2010, Matric metalloproteinases: Regulators of the tumor microenvironment, Cell, 141(1), pp. 52-67.

Linkuri

161.https://www.researchgate.net/figure/311502657_fig1_Figure-2-sTeM-images-of-simvastatin-crystals-A-sVT-lcNs-B-and-sVT-lcN_Mailab-C

162. https://www.researchgate.net/figure/6763171_fig1_Figure-2

163.https://www.researchgate.net/figure/6869411_fig3_Fig-3-Mdm2-p53-interaction-Mdm2-translocates-from-the-nucleolus-to-the-nucleoplasm-and

164. http://www.nccri.ncc.go.jp/en/divisions/08epigenomics/14carc03_1.html

165. httpmedia.springernature.com/full/springerstatic/image/art%3A10.1186%2Fs12951-015-0122-4/MediaObjects/12951_2015_122_Figa_HTML.gif

166.https://www.researchgate.net/publication/301685835_Hyaluronic_acid conjugated_liposome_nanoparticles_for_targeted_delivery_to_CD44_overexpressing_glioblastoma_cells

167. http://news.berkeley.edu/2014/10/16/new-front-in-war-on-alzheimers-other-protein-folding-diseases/

168. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK9843/figure/A1202/?report=objectonly

169. http://www.nature.com/nrc/journal/v1/n3/fig_tab/nrc1201-194a_F2.html

170. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC1074718/figure/F1/

171. https://www.synevo.ro/gena-de-fuziune-bcr-abl1-detectie-cantitativa/

172. http://leukd.blogspot.ro/p/ignorance-is-torture.html

173. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK9843/figure/A1213/?report=objectonly

174. http://www.nature.com/nrm/journal/v8/n4/fig_tab/nrm2143_F1.html

175. http://www.nature.com/nrc/journal/v4/n1/fig_tab/nrc1251_F4.html

176. https://www.smj.org.sa/index.php/smj/article/view/smj.2015.3.9622/7107

177.https://www.ncbi.nlm.nih.gov/core/lw/2.0/html/tileshop_pmc/tileshop_pmc_inline.html?title=Click%20on%20image%20to%20zoom&p=PMC3&id=4819660_jcp-21-001f1.jpg

178. http://erj.ersjournals.com/content/erj/33/5/1165/F2.large.jpg

179. http://www.medscape.org/viewarticle/416521_13

180.https://www.ncbi.nlm.nih.gov/core/lw/2.0/html/tileshop_pmc/tileshop_pmc_inline.html?title=Click%20on%20image%20to%20zoom&p=PMC3&id=3306611_nihms362025f1.jpg

181. http://www.wikiwand.com/en/Von_Hippel%E2%80%93Lindau_disease

182. http://www.pnas.org/content/103/6/1659/F1.expansion.html

183.http://www.nature.com/modpathol/journal/v21/n2s/fig_tab/modpathol200834f3.html#figure-title

184.https://journals.prous.com/journals/servlet/xmlxsl/pk_journals.xml_summary_pr?p_JournalId=2&p_RefId=712566&p_IsPs=N

185. https://genomemedicine.biomedcentral.com/articles/10.1186/s13073-017-0431-3

186. http://www.cumc.columbia.edu/publications/in-vivo/Vol1_no8_apr29_02/

187.https://www.researchgate.net/figure/232230468_fig1_Fig-1-Scanning-electron-microscopy-micrographs-of-imatinib-mesylate-loaded-PLGA

188. http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1742706115002883

189. http://www.vidaza.net/wp-admin/install.php

190. https://innovareacademics.in/journals/index.php/ijpps/article/view/13086/6727

191. http://www.rjpbcs.com/pdf/2016_7(5)/[52].pdf

192. http://mct.aacrjournals.org/content/molcanther/15/7/1452/F2.large.jpg

193. https://www.spandidos-publications.com/10.3892/etm.2015.2651

194.http://www.sigmaaldrich.com/technical-documents/articles/life-science-innovations/mission-shrna-library.html

195. http://docplayer.com.br/9870957-Farmacoterapia-oncologica.html

196.https://www.researchgate.net/figure/43342153_fig1_Fig-1-Schematic-structure-of-self-organized-nanogels-with-low-molecular-hyaluronic-acid

197.http://what-when-how.com/proteomics/protein-phosphorylation-analysis-a-primer-proteomics/

198. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3937853/figure/F6/

199. http://www.cell.com/trends/biotechnology/fulltext/S0167-7799(00)00006-8

200. http://mct.aacrjournals.org/content/11/3/538

201.http://www.app64bits.com/scientists-discover-gene-which-could-alter-cancers-metastasis/

202. https://www.researchgate.net/figure/7595815_fig1_Figure-1-Monitoring-changes-in-protein-phosphorylation-by-the-SILAC-method-a