Șef lucr. dr. SESĂRMAN Alina [302045]

UNIVERSITATEA „BABEȘ-BOLYAI” CLUJ-NAPOCA

Facultatea de Biologie și Geologie

Specializarea Biologie Medicală

LUCRARE DE DISERTAȚIE

Conducător științific:

Șef lucr. dr. SESĂRMAN Alina

Absolvent: [anonimizat] 2017

UNIVERSITATEA ,, BABEȘ-BOLYAI’’ CLUJ -[anonimizat], ȚINTĂ ÎN TERAPIA ANTICANCEROASĂ

Conducător științific:

Șef lucr. dr. SESĂRMAN Alina

Absolvent: [anonimizat] 2017

CUPRINS

INTRODUCERE

Cancerul reprezintă una dintre cele mai necruțătoare boli din întreaga lume. În ultimii ani, s-au facut mari eforturi pentru a [anonimizat], dar și în dezvoltarea de metode eficiente de țintire anticanceroasă.

Scopul acestei lucrări reprezintă o încercare de a [anonimizat], ce roluri au aceste modificări în progresia cancerului și ce tehnologii pot fi aplicate prevenirii sau detectării clinice a cancerului, de asemenea, s-a [anonimizat]. Toate aceste abordări sunt organizate în două capitole.

[anonimizat] ,, Proteine‘’și conține o [anonimizat].

[anonimizat] ,, [anonimizat]‘’ conține o clasificare a [anonimizat] (necovalente, covalente), [anonimizat] (acetilare, fosforilare, metilare, glicozilare, nitrare și ubiquitinare) unde este prezentată natura dinamică a proceselor de semnalizare pe care celulele le manifestă în timpul transformării lor pentru a deveni celule canceroase (neoplazice). [anonimizat], dar și metodele de țintire în terapia anticanceroasă. [anonimizat] a proteinelor modificate în cancer.

În ultima parte a lucrării, s-[anonimizat], [anonimizat]. [anonimizat].

[anonimizat] 20 [anonimizat]. Acestea îndeplinesc funcții esențiale în ceea ce privesc toate procesele biologice: [anonimizat], [anonimizat], țesuturi și organe pentru a coordona procesele biologice.

[Berg și colab., 2002]

Asocierea cu cancerul

Genele controlează activitatea celulelor prin proteine specifice ce au rol de mesageri pentru celulă. Cancerul este o boală asociată cu modificări ale exprimării genelor (supraexprimări, pierderi ale exprimării) care duc la formarea de proteine anormale, care au capacitatea de a determina ca celulele să se înmulțească necontrolat și astfel să devină canceroase. Aceste modificări ale genelor pot fi declanșate de mutații ale genelor care codifică proteinele implicate în

repararea deteriorărilor ADN, semnalizarea celulară, dezvoltarea celulară, care la rândul lor sunt mutate și pot fi identificate în diferite celule canceroase, rearanjări ale cromozomilor etc.

[Sager 1997; Cooper 2000]

MODIFICĂRILE POST-SINTETICE ALE PROTEINELOR

Proteomul uman este dinamic și ca urmare acțiunii unor stimuli acesta suferă modificări, iar modificările post-sintetice au loc pentru a reglementa activitatea celulară. Aceste modificări post-sintetice modifică forma, structura, conformația, afinitatea de legare a proteinelor și sunt frecvent mediate de activitatea unor enzime precum kinaze, fosfataze, transferaze, ligaze. Proteinele pot fi modificate post-sintetic în orice etapă din ciclul celular, pentru a se determina plierea corectă a proteinelor sau pentru direcționarea proteinelor nou formate spre alte compartimente celulare (nucleu, membrană). De asemenea, pe lângă afectarea funcțiilor proteinelor, aceste modificări post-sintetice duc și la degradarea lor, prin legarea la molecule-țintă.

[www.thermofisher.com; www.uniprot.org]

Modificările post-sintetice ce apar la proteine se clasifică în modificări necovalente (ce afectează structura lor prin procesul de pliere, adăugarea de cofactori ) și modificări covalente care includ, fosforilarea, acetilarea, glicozilarea, metilarea, nitrarea, ubiquitinarea, sumoilarea, lipidarea, hidroxilarea respectiv sulfatarea.

Proteinele supuse acestor forme de modificare post-sintetice sunt implicate în aproape toate evenimentele celulare (Tabel 1) ce contribuie la diversitatea și complexitatea funcției lor biologice.

Tabel 1. Implicații ale proteinelor modificate post-sintetic în evenimentele celulare

Modificări necovalente în cancer

Plierea proteinelor

Un proces la fel de important care trebuie întreprins pentru ca funcția proteică să nu se piardă, este plierea proteinei într-o conformație tridimensională definită ce rezultă din interacțiunile dintre lanțurile laterale ale aminoacizilor constituienți ai acestora. Deși plierea și replierea proteinelor au un rol esențial în ceea ce privește funcția proteinelor, modificarea aminoacizilor și a lanțurilor lor laterale contribuie în mod semnificativ la diversitatea și funcția proteinelor.

În mediul celular, proteinele care sunt nou sintetizate prezintă un risc mare de pliere și de agregare aberantă, ce pot duce la formarea unor specii cu potențial toxic. În scopul de a preveni sau de a reduce aceste ,,efecte” negative, celulele prezintă o rețea de șaperoane, care facilitează procesul de pliere a proteinelor (Fig. 5). Șaperoanele, mai sunt denumite proteine de șoc termic (HSPs) sau proteine de stres, deoarece numărul lor crește în condiții de stres, indus de temperaturile ridicate și acționează ca niște catalizatori prin faptul că asistă la procesul de asamblare a proteinelor, însă nu fac parte din acel complex asamblat. Șaperoanele funcționează prin legarea și stabilizarea polipeptidelor nepliate sau parțial pliate, împiedicând astfel agregarea incorectă, permițând astfel lanțului polipeptidic să se plieze în conformația sa corectă. Șaperoanele stabilizează de asemenea, lanțurile polipeptidice nepliate în timpul transportului lor în organitele celulare, de exemplu, în timpul transferului proteinelor în mitocondriile din citosol (Fig. 6). Proteinele sunt transportate prin de-a lungul membranei mitocondriale în conformații parțial pliate, care mai apoi sunt stabilizate de șaperoanele din citosol. Pe urmă, șaperoanele din mitocondrie facilitează transferul lanțului polipeptidic pe membrană, după care are loc plierea în organit. [Cooper 2000]

Figura 5. Plierea proteinei cu șaperoane

www.news.berkeley.edu

Figura 6. Transportul lanțurilor polipeptidice în mitocondrie

www.ncbi.nlm.nih.gov

Superfamilia HSP este formată din mai multe subfamilii de proteine în funcție de greutatea lor moleculară : Hsp40, Hsp60, Hsp70, Hsp90, Hsp 100, iar cea mai mică este familia Hsp25 sau HSPB. Voi discuta despre Hsp implicate în cancer în capitolele următoare.

Deși aceste proteine de șoc termic sunt exprimate de căldură, genele HSP pot fi induse de inflamație, ischemie, infecții, iradiere, expunere la metale grele etc. Unele proteine HSP au activitate ATP-azică intrinsecă, prin hidroliza ATP, ce controlează procesele de pliere a proteinelor.

Pe lângă șaperoanele moleculare, celulele mai conțin cel puțin două tipuri de enzime ce au rolul de a cataliza plierea proteinelor prin ruperea și re-formarea legăturilor covalente. Un rol important în stabilizarea structurilor pliate ale multor proteine îl are formarea unor legături de natură disulfidică între resturile de cisteină, care sunt catalizate de una dintre cele două enzime, numită protein disulfid-izomeraza, care este implicată în formarea și re-aranjarea acestor legături dacă s-au format incorect. Citosolul conține agenți reducători care mențin resturile de cisteină în forma lor redusă (-SH), motiv pentru care, formarea acestor legături disulfidice sunt limitate la proteinele membranare precum și la cele secretate.

A doua enzimă, denumită peptidil prolyl izomeraza, catalizează, în schimb, izomerizarea legăturilor peptidice ce implică reziduuri de prolină; se găsește atât în celulele procariote cât și în cele eucariote, și poate cataliza replierea mai multor proteine.

[Cooper 2000]

Modificări covalente în cancer

Astfel de modificări sunt responsabile pentru reglarea expresiei genetice și a interacțiunilor ce au loc între diferite căi de transducție. Modificările covalente includ, fosforilarea, acetilarea, glicozilarea, metilarea, nitrarea respectiv ubiquitinarea, și sunt aduse de diferite enzime care recrutează diferite substraturi, cum sunt kinazele, ce utilizează ATP pentru fosforilare, acetilazele, ce utilizează acetil CoA pentru procesul de acetilare etc. Toate aceste modificări sunt echilibrate de alte tipuri de enzime cu scopul menținerii homeostaziei celulare. Dacă se pierde acest echilibru din oricare dintre aceste modificări, atunci vor rezulta semnale nedefinite în ceea ce privește proliferarea excesivă și va duce într-un final la apariția cancerului.

[Dwarakanath și colab., 2008; Hongjun și Zangar, 2009; Tejaswita și Cheema 2011]

O înțelegere a acestor modificări este esențială nu doar pentru rolul pe care îl au legat de funcțiile celulare normale, ci și pentru că au un mare potențial în ceea ce privește țintirea unor tratamente pentru diferite boli, printre care și cancerul, prin utilizarea ca markeri pentru diagnosticarea bolii sau ca ținte moleculare în dezvoltarea de terapii inovative.

Acetilarea

Proteine acetilate

Acetilarea reprezintă una dintre cele mai importante modificări post-sintetice ale proteinelor ce determină structura, funcția și localizarea intracelulară, având un rol esențial în căile de semnalizare ale celulei, atât în condiții nestimulate cât și în condiții de stres.

Acest proces are loc la restul de lizină ale proteinelor histonei la capătul N-terminal a lizinei și este facilitat de diferite enzime, acetilaze de histonă (HAT) sau deacetilaze de histonă (HDAC). Enzimele care catalizează acetilarea proteinelor a reziduurilor de lizină sunt denumite acetiltransferaze de lizină (K) și sunt notate KAT. La oameni sunt exprimate 17 gene ce codifică aceste enzime KAT. Mai există și enzime care încorporează o grupare acetil la aminoacidul de la capătul N-terminal al proteinelor umane, numiteN-acetiltransferaze (NAT); sunt identificate în celula umană ca NatA-NatF. Această familie de enzime este distinctă față de enzimele KAT. Pentru ambele familii de enzime donorul de acetil este acetil- CoA, și este implicat în reglarea metabolică. În cazul unor modificări ale concentrației de acetil CoA, au loc efecte profunde cu privire la capacitatea enzimelor de a-și îndeplinii funcțiile.

Pe lângă histone, HDACs deacetilează diferiți factori nucleari de transcripție și proteine precum CDK1, care sunt implicați în proliferarea, diferențierea și apoptoza celulară. Modificările ce apar în semnalarea procesului de acetilare care rezultă din acetilazele și deacetilazele de histonă pot duce la apariția unor modele anormale de exprimare a genelor, ce include activarea de proto-oncogene (Rb), suprimarea expresiei genelor supresoare de tumori, afectarea răspunsurilor la deteriorarea ADN, ceea ce duce la o proliferare excesivă și tumorigeneză.

Cauza de bază a acestor modele modificate poate fi un rezultat al leziunilor genetice care folosesc mecanisme epigenetice pentru a realiza un program patologic. O astfel de modificare constă în mai multe etape: a) recrutarea anormală a HDAC la locusurile greșite ( de exemplu supresoarele tumorale), b) activitatea redusă a HAT sau a HDAC datorită haploinsuficienței sau inactivării mutațiilor, având ca scop suprimarea genelor țintă (de exemplu genele supresoare de tumori) și alterarea substraturilor non-histonelor, c) creșterea activității HAT pe ,,ținte’’ greșite (de exemplu oncogenele), datorată supraexprimării aberante.

[Dwarakanath și colab., 2008; Di Cerbo și Schneider 2013; Gong și colab., 2016; Ropero și Esteller 2006]

Modalități de țintire în terapia anticanceroasă

Butiratul de sodiu a fost primul compus identificat în inducerea acetilării histonei. Mai apoi, acidul valproic (VA) și compusul Trichostatin A (TSA), care este un antibiotic fungic, au fost identificați ca inhibitori ai histon deacetilazelor (HDACi). Pentru a înțelege mai bine mecanismul HDAC, s-au utilizat compuși moleculari naturali sau sintetici, de exemplu TSA, acidul hidroxamic suberoilanilid (SAHA). Acești inhibitori au activități anticanceroase puternice și specifice prin faptul că reglează expresia supresoarelor tumorale (p53, p21) și blochează progresia ciclului celular (Fig. 7).

[Singh și colab., 2010]

Figura 7. Mecanismul de acțiune a inhibitorilor HDAC

Trichostatina A (TSA), este un inhibitor ce blochează proliferarea și declanșează apoptoza în carcinomul hepatocelular, blocheazp diferențierea celulelor în cancerul ovarian prin schimbarea genei supresoare tumorale p21 și prin legarea ADN la proteina ID1. Aplicarea unor tratamente mai multor tipuri de celule canceroase cu oricare dintre inhibitorii HDAC duc la reglarea trascripțională a acestei gene antiproliferative, care este independentă de p53. Exprimarea p21 concide cu hiperacetilarea histonelor H3 și H4 în regiunea promotorului său. Ca atare, supraexprimarea HDAC este observată în mai multe tipuri de cancer, cu scăderi ale exprimării p21. [Dwarakanath și colab., 2008]

Eficacitatea inhibitorului SAHA (acidul acidul hidroxamic suberoilanilid) ca agent anticancer a fost demonstrată pe mai multe linii celulare tumorale hematologice și solide, astfel încăt acesta a ajuns să fie utilizat în tratamentul limfomului cu celule T, o formă de limfom non-Hodgkin. [Ropero și Esteller 2007]

În cancerul de prostată, celulele canceroase supraexprimă HDAC1, carcinoamele gastrice, carcinoamele colorectale, displaziile cervicale și sarcoamele stromale endometriene supraexprimă HDAC2 în comparație cu omologii lor normali.

În terapia anticanceroasă, pe lângă SAHA și TSA, mai sunt folosiți și alți inhibitori ai HDAC, unii dintre aceștia fiind încă în stadii clinice, care sunt prezentați în Tabelul 2.

Tabel 2. Inhibitori HDAC

[Li și Seto 2016]

O nouă direcție de cercetare în ceea ce privește terapia anticanceroasă, se concentrează pe utilizarea liganzilor epigenetici multipli (epi-ML), care sunt niște compuși versatili ce poartă grupări chimice active împotriva mai multor clase de modificatori epigenetici. Produșii fenolici-psammaplinele, izolați din bureții marini, sunt compuși naturali care sunt implicați în inhibarea HDAC și a ADN metiltransferazelor și au activitate potențială împotriva cancerului uman. Prin urmare, direcționarea simultană a mai multor modificări ( de exemplu atât acetilare cât și metilare) ar putea contribui la o creștere a eficacității tratamentului.

[Gong și colab., 2016; Ropero și Esteller 2006]

Fosforilarea

Proteine fosforilate

Fosforilarea, ca modificare post-sintetică, reprezintă una dintre cele mai frecvente modificări reversibile într-o celulă. Marea majoritate a fosforilărilor apar ca un mecanism de reglare a activității biologice a unei enzime sau proteine, și ca atare sunt tranzitorii. O grupare fosfat este adaugată de o anumită kinază și apoi este îndepărtată de o fosfatază specifică (Fig. 8)

Figura 8. Mecanismul de acțiune a fosforilării

(PK-protein kinaza, PP-protein fosfataza)

www.ncbi.nlm.nih.gov

Protein kinazele (PK) sunt enzime care atașează covalent fosfații la catena laterală a resturilor de serină, treonină sau tirozină ale proteinelor specifice din interiorul celulelor. Acest proces de fosforilare a proteinelor controlează activitatea lor enzimatică, interacțiunea acestora cu alte proteine sau molecule, capacitatea lor de degradare prin intermediul proteazelor. Dacă există o perturbare a căilor de semnalizare a protein kinazelor prin diferite modificări de natură genetică- mutații, atunci va rezulta o dereglare a activității kinazei și o transformare malignă a celulelor. În genomul uman sunt identificate mai mult de 520 de protein kinaze care sunt strâns implicate în procesul de fosforilare a proteinei.

[Adjei și Hidalgo 2005]

Protein tirozin kinazele (PTK) reprezintă cel mai mare grup de oncogene dominante cu omologie structurală. Mutațiile somatice din aceste gene sunt implicate în dezvoltarea mai multor tipuri de cancere umane. Tirozin kinazele sunt împărțite în două mari clase: receptori tirozin kinazici (RTK), de exemplu EGFR (receptorul pentru factorul de creștere epidermică), FGFR (receptorul pentru factorul de creștere fibroblastică), IR (receptorul pentru insulină), VEGFR (factorul vascular endotelial de creștere), PDGF (factorul de creștere derivat din plachete) și non-receptor tirozin kinazici (NRTK), de exemplu SRC, ABL, FAK (kinaza cu adeziune de focalizare), JAK (kinaza Janus).

Receptorii tirozin kinazici (RTK) sunt proteine transmembranare care au un domeniu de legare a ligandului extracelular și un domeniu kinazic intracelular catalitic. Domeniul intracelular îndepărtează o grupare fosfat prin defosforilare de la mesagerul de coenzimă ATP, iar domeniul extracelular are situsuri la care proteinele și hormonii care transmit semnale se pot lega. Mulți dintre aceștia sunt factori de creștere, de exemplu EGFR, FGFR, IR, VEGFR, PDGF. Legarea ligandului la un receptor tirozin kinazic induce dimerizarea receptorului ce implică modificări conformaționale ce duc la fosforilarea intermoleculară la resturile de tirozină la situsuri multiple.

Non-receptorii tirozin kinazici (NRTK) sunt proteine citoplasmatice care au un domeniu kinazic, și uneori pot să aibă mai multe domenii suplimentare de semnalizare sau proteine-proteine cum sunt SH2, SH3 și domeniul PH (Pleckstrin Homology).

[Manash și Mukhopadhyay 2004; Adjei și Hidalgo 2005]

Leucemia cronică mieoloidă este un sindrom al tulburării celuleor stem hematopietice mielodisplazice, datorată translocării reciproce între cromozomul 9 și cromozomul 22 (Cromozomul Philadelphia). Această translocație are ca rezultat juxtapunrea genei tirozin kinazei ABL1 (Abelson) de pe cromozomul 9 lângă gena BCR (Breakpoint Cluster Region), de pe cromozomul 22, ce duce la formarea unei gene noi, hibride, de fuziune (BCR-ABL) (Fig. 9), care codifică o oncoproteină (P210), localizată în citoplasmă. Aceasta are o activitate tirozin kinazică puternică și determină stimularea mai multor semnale descendente care transformă celulele stem hematopoietice. Celulele care prezintă BCR-ABL pozitiv, sunt instabile din punct de vedere genetic și predispuse la dezvoltarea unor anomalii genomice multiple , ce duc la transformarea leucemiei din fază cronică în fază acută, și, astfel, la progresia din faza cronică la fazele accelerată și blastică. Practic, au loc mutații punctiforme la nivelul domeniului kinazic al genei BCR-ABL, și determină rezistență la inhibitorii tirozin kinazei (ITK). [Baccarani și colab., 2012]

Figura 9. Cromozomii 9 si 22 normali – translocatia (9,22). Gena de fuziune BCR-ABL

www.synevo.ro

De-a lungul timpului, s-au studiat numeroase asociații în ceea ce privește expresia EGFR și liganzii naturali EGF și factorul de creștere transformant -α (TGF- α). Autofosforilarea EGFR duce la răspunsuri intracelulare care afectează proliferarea celulelor, angiogeneza, diferențierea celulară, inhibarea apoptozei, carcinogeneza și metastaza. Astfel de asociații ale EGFR au fost identificate în mai multe cancere umane (Tabel 3) Există diferite mecanisme de activare a EGFR în celulele maligne; au loc rearanjări genetice ce au ca rezultat un mutant activ (EGFR vIII), de exemplu în glioblastom. În glioblastomele primare, au loc pierderi ale proteinei omolog a fosfatazei și tensinei (PTEN) de pe cromozomul 10, împreună cu amplificarea și supraexprimarea EGFR.

[ Shchemelinin și colab., 2006]

Tabel 3. Exprimarea EGFR în cancerele umane

The Oncologist, 2003

În patogeneza cancerului de sân, cancerului de prostată și a cancerului pulmonar cu celule mici, a fost identificată expresia IGFR (receptorul pentru factorul de creștere a insulinei) și a ligandului său IGF I respectiv IGF II, prin creșterea autofosforilării liganzilor și a activității kinazei.

[Manash și Mukhopadhyay 2004]

Modalități de țintire în terapia anticanceroasă

Tirozin kinazele au un impact imens în patogeneza diferitelor tipuri de cancere, prin faptul că sunt potențiale ținte în medicamentele anticanceroase Inhibitorii tirozin kinazelor (ITK), reprezintă o clasă de medicamente utilizate în chimioterapie, ce au rolul de a preveni și bloca căile vitale prin direcționarea moleculelor de semnalizare care sunt necesare pentru supreviețuirea celualară. Imatinibul (Gleevec) este un inhibitor al tirozin kinazei ce blochează receptorul kinazei de a se lega de ATP, împiedicând astfel fosforilarea care ar putea aduce beneficii celulei canceroase și va promova diviziunea celulară (Fig. 10). Acesta țintește gena de fuziune BCR-ABL și este folosit în terapia leucemiei mieloide cronice.

Figura 10. Mecanismul de acțiune a inhibitorului Gleevec

(LMC-Leucemia mieloidă cronică)

www.leukd.blogspot.ro

Pe baza distribuției și a rolului moleculei țintă EGFR-TK identificată în tumorile umane, inhibitorii EGFR-TK, precum gefitinibul, au rolul de a inhiba alte tumori în plus față de cancerul pulmonar, de prostată, de colon, ovarian etc. prin faptul că împiedică semnalul să rămână activat și creează proliferarea necontrolată. Încă mai există studii de cercetare pentru a evalua inhibitorii EGFR-TK ca monoterapie sau în combinație cu radio/chimioterapia.

[Vlahovic și Crawford 2003]

Vatalanibul este un inhibitor selectiv a tirozin kinazelor VEGFR (VEGFR-1 și VEGFR-2) și acționează direct asupra mielomului multiplu. Acesta este utilizat ca agent singur sau în asociere cu chimioterapia la pacienții cu cancer colorectal, metastaze hepatice, cancerul de prostată, cancerul renal avansat.

[Arora și Scholar 2005]

Există și alți inhibitori ai tirozin kinazei care sunt utilizați în terapia anticanceroasă:

Erlotinib (OSI-774; Tarceva), ce țintește EGFR și este utilizat în cancerul de plămân;

Canertinib (CI-572016), ce țintește EGFR și este utilizat în terapia cancerului de sân sau a altor tumori solide;

Sutent (SU11248), ce țintește PDGFR și este folosit în terapia cancerului renal;

Leflunomid (SU101), țintește PDGFR și este folosit în terapia cancerului de prostată.

Astfel, prin înțelegerea ciclului celular și a căilor moleculare de semnalizare, acești inhibitori ai kinazelor reprezintă o evoluție în tratamentul molecular anticanceros, față de metodele clasice. Acest lucru permite crearea unor tratamente specifice pentru un anumit tip de cancer, cu scopul de a reduce deteriorarea celulelor sănătoase și astfel crește rata succesului tratamentului respectiv.

[Arora și Scholar 2005]

Glicozilarea

Proteine glicozilate

Glicozilarea reprezintă cel mai complex proces de modifcare a proteinelor și este definit de procesul de adăugare a lipidelor și carbohidraților la proteine , acest proces fiind reglementat de diferite enzime și proteaze ce permit diversificarea funcției proteice. Prin glicozilare se formează lanțurile oligozaharidice, cunoscute sub denumirea de glicani, și se găsesc atât în proteinele solubile cât și în cele legate de membrană. Tipurile majore de modificări ale glicozilării proteice sunt N-legate și O-legate, în funcție de locul de atașare a lanțului lateral de carbohidrați (Fig. 11).

Figura 11. Legarea lanțurilor laterale de carbohidrați la glicoproteine

The Cell: A Molecular Approach. 2nd edition

N-glicozilarea este definită prin atașarea covalentă a unei oligozaharide pe resturile de asparagină ale lanțurilor polipeptidice. Biosinteza N-glicanilor este realizată simultan atât în reticulul endoplasmic cât și în aparatul Golgi.

[Watson și colab., 2015]

O-glicozilarea are loc prin atașarea carbohidraților la resturile de serină și treonină în proteine și este inițiată prin transferul de N-acetilgalactozamină la oricare dintre resturile de serină sau treonină.Cea mai abundentă clasă de O-glicani o reprezintă mucinele. Mucinele (MUC) sunt niște glicoproteine mari cu o conformație în formă de tijă, în care sunt înglobate multe serine și treonine glicozilate, ce sunt grupate în structuri repetate în tandem. O-glicanii mucinelor legate de suprafața celulară au rolul de a modula interacțiunile cu mediul, prin legarea la lectine și antigene. Celulele epiteliale maligne pierd polaritatea corectă a mucinelor, deoarece acestea sunt exprimate pe toată membrana celulară, iar mucinii secretați pot intra în spațiul extracelular și în fluidele corpului, cum este sângele (Fig. 12)

[Tucillo și colab., 2014]

Figura 12. Exprimarea mucinelor

Glicanii sunt esențiali prin activitatea lor de liganzi pentru receptorii celulari, facilitarea recunoașterea celulelor, aderența celulă-celulă, deoarece au un rol important în determinarea antigenică și modifică imunogenitatea celulelor și a țesuturilor.

Glicozilarea modificată a glicanilor N-legați în cancer este asociată cu creșterea ramificării β1,6, proces facilitat de β1,6 acetilglucozaminiltransferaza-5 (GnT5). Glicozilarea modificată la nivelul membranei (cum ar fi la citokine, receptorii pentru factorii de creștere, integrine) și glicoproteinele secretate sunt asociate în diferite tipuri de cancer.

[Häuselmann și Borsig 2014]

S-a constatat în urma unor studii, că în celulele maligne a cancerului pulmonar a fost identificată glicozilarea diferențiată și creșterea unor glicopeptide N-legate (inclusiv apoliproteina B-100 și alfa 1-antichimiotripsina).

Între probele normale și în cele cu carcinom hepatocelular [Chen și colab., 2011] au constatat unele modificări ale concentrației în glicoproteinele N-legate, prin faptul că unele dintre aceste glicoproteine precum proteina de legare a galectinei 3, proteina 3 a factorului de creștere a insulinei și trombospondina 1, au fost asociate cu dezvoltarea acestui tip de carcinom.

O supraexprimare a glicoproteinelor N a fost identificată în cancerul de prostată, în stadiul agresiv, incluzând proteine implicate în remodelarea matricei extracelulare în metastază (catepsina L și periostina).

[Sheta și Bachvarov 2014]

În ceea ce privesc glicoproteinele O-legate, și acest tip de glicoproteine sunt implicate în carcinogeneză. Tumorile asociate cu diferite familii de mucine au prezentat modificări de glicozilare , față de celulele normale. Spre exemplu, MUC1, o glicoproteină integrată în membrana plasmatică a celulelor epiteliale, este supraexprimată în peste 90% din carcinoamele de sân și alte tipuri de cancer de origine epitelială, printre care carcinoamele ovariene, pulmonare, pancreatice și de colon.

Există glicoproteine și biomarkeri legați de glicani (glicobiomarkeri) care sunt identificați și utilizați în screeningul , diagnosticul unor tipuri de cancer. De exemplu, antigenul tumoral CA 19-9 corespunde unei structuri de carbohidrați care apar și la glicoproteine, cum sunt la mucine. Acesta se exprimă în special în cancerul pancreatic și biliar, dar mai pote fi identificat și la pacienții cu cancer ovarian. Antigenul tumoral CA 125 este o glicoproteină cu membrană de tip I glicozilată N și O, cu un domeniu extracelular lung, și a fost identificată pe MUC16. Se exprimă în cancerul ovarian. Antigenul carcinoembrionic (CEA) este o glicoproteină implicată în adeziunea celulară. Aceasta se produce în mod obișnuit în țesutul intestinal în timpul dezvoltării fetale, însă scade înainte de naștere în sângele adulților sănătoși. Totuși, nivelurile CEA pot crește din nou în cazul carcinomului colorectal, gastric, pancreatic, pulmonar, de sân și medular. Antigenul specific prostatic este de asemena o glicoproteină produsă de prostată și nivele ridicate se găsesc în diferite stări patologice ale prostatei, cum ar fi tumori beningne, prostatita și cancerul de prostată. Antigenele tumorale CA 15-3 și CA 27-29, sunt epitopi diferiți pe aceeași proteină, și anume MUC1. Expresia MUC1 este asociată cu cancerul de sân, dar și în alte tumori.

[Stowell și colab., 2015]

Din familia de glicotransferaze (GALNACT) există câteva tipuri care sunt exprimate în tumori maligne, în carcinogeneză, prin dereglările apărute în exprimarea lor. Astfel, GALNT1 este exprimat în cancerul de vezică urinară; GALNT2 este supraexprimat în carcinomul cu celule scuamoase, dar mai este implicat și în modificarea glicozilării EGFR ( receptorul pentru factorul de creștere epidermică) în HCC (carcinomul hepatocelular ), având un efect major în fenotipul său malign; GALNT3 este supraexprimat în cancerul pancreatic; GALNT6 este identificat în carcinoamele gastrice; GALNT7 este implicat în progresia cancerului de col uterin și a melanomului uman; GALNT9 este asociat cu supraviețuirea celulelor cancerose de neuroblastom; GALNT10 este exprimat în cancerul gastric și este asociat cu tipul și gradul histoloic al acestui tip de cancer; GALNT11 este identificat în leucemia limfocitară cronică iar mutațiile ce au loc în GALNT12 duc la dezvoltarea cancerului de colon.

[Sheta și Bachvarov 2014]

Dintre glicoproteinele transmembranare, CD44 aparține unei clase de receptori de adeziune celulară și sunt implicați într-o multitudine de procese celulare printre care reglarea creșterii, diferențierea, migrația, aderența și semnalizare. CD44 se leagă în mod obișnuit la ligandul său primar, acidul hialuronic (HA), acest lucru fiind responsabil de semnalizarea celulară, dar și de declanșarea răspunsului imun inflamator. Aceste glicoproteine de suprafață celulară se întâlnesc în leucocite, fibroblaști, celule epiteliale, limfocite T, în celulele stem canceroase (CSC) și metastazele lor, și pot corela cu dezvoltarea tumorală și metastază. La om, familia CD44 este codificată de o singură genă localizată pe cromozomul 11p13 și cuprinde cel puțin 20 de exoni. Cel puțin 10 exoni pot fi alternativ supuși splicing-ului și inserați în izoforma standard pentru a forma mai multe izoforme cu diferite variante (v) ale CD44 (Fig. 13), în funcție de tipul de celulă stem canceroasă. Spre exemplu, CD44v6, este exprimat în limfoamele umane non-Hodgkin, cancerul colorectal, cancerul de sân însă cel mai frecvent, CD44 este exprimat în carcinomul ovarian epitelial.

[Basakran 2015; Martin și colab., 2013]

Figura 13. Structura CD44

(s-standard; v-variante)

www.smj.org.sa

Modalități de țintire în terapia anticanceroasă

Mecanismele epigenetice asupra glicogenilor precum metilarea ADN, modificările histonelor, asociate cu glicozilarea celulelor de suprafață în diverse tipuri de cancer, se pot dezvolta ca ținte potențiale în ceea ce privește terapia antitumorală.

[Ling-Ho și colab., 2016]

Glicozilarea aberantă a glicoproteinelor din celulele canceroase, asociate cu ratele slabe de supraviețuire, este exploatată pentru dezvoltarea unor terapii bazate pe glicani, cum ar fi, inhibitori ai glicoziltransferazei, a imunoterapiilor pentru cancer, în special prin proiectarea de vaccinuri anticanceroase complet sintetice ce vizează carbohidrații asociați tumorii respective, deoarece prin aceste vacccinuri se pot încorpora numai acele elemente necesare pentru un răspuns imun dorit, ceea ce poate revoluționa tratamentele antitumorale. De exemplu, vaccinurile pe bază de MUC1 au intrat rapid în studiile clinice, care au demonstrat faptul că imunoterapia MUC1 este benefică și protejează pacienții cu cancer de sân împotriva recidivei timp de 8 ani.

[Li și colab., 2010]

Celulele stem din celulele canceroase, cum sunt celulele progenitoare din ficat, sunt cunsocute a dobândi rezistență la chimioterapie și radioterapie, și în cele mai multe cazuri, duc la rate crescute de recurență. Ca și o altă alternativă, căile de glicozilare care implică metastazarea, proliferarea celulară și apoptoza celulară, pot fi utilizate în scopul dezvoltării de noi medicamente.

[Watson și colab., 2015]

Pentru pacienții care suferă de cancer ovarian, în stadiul avansat, s-a explorat ca țintă terapeutică glicoproteina CD44. CD44 este principalul receptor pentru acidul hialuronic și legarea HA la domeniul CD44 prin activarea semnalizării oncogenice mediată de această glicoproteină, a funcțiilor ARN și prin rezistența la chimioterapie în celulele canceroase, a dus la progresia tumorii. Prin capacitatea sa de biodegrabilitate, biocompatibilitate, de a conține reziduuri funcționale de grupări de hidroxil și acid carboxilic, prin afinitatea la CD44, acidul hialuronic este un purtător ideal în ceea ce privește administrarea specifică a agenților terapeutici pentru celulele canceroase.

[Sacks și Barbolina 2015; Yan și colab., 2015]

CD44 este, de asemenea, un factor cauzal în ceea ce privește invazia tumorală, metastază și obținerea rezistenței la apoptoză. Eliminarea CD44 prin folosirea unui ARN scurt de tipul short hairpin (ac de păr) a dus la reducerea semnificativă proliferării celulelor canceroase în cancerul de colon. Prin utilizarea acestui tip de ARN pentru a elimina CD44, cu scopul inhibării proliferării celulare și inducerii apoptozei, se poate considera ca o intervenție terapeutică împotriva cancerului de colon.

[Martin și colab. 2013]

Internalizarea HA de către celulele canceroase prin receptorii CD44, îmbunătățește eliberarea specifică a medicamentelor, inclusiv medicamente chimice, ARNi și microARN la celulele canceroase, în special la celulele stem canceroase (CSC) rezistente la CD44 și la medicamente, prin conjugarea acidului hialuronic sau prin blocarea acidului hialuronic în nanoparticule. Acest lucru duce la o creștere a eficacității terapiei cu HA, comparativ cu alți agenți antitumorali convenționali în diferite tipuri de tumori (Fig. 14).

Figura 14. Medicamente conjugate cu HA și CD44

www.hshc.com.tw/en/hdd_hacd.php

O altă peptidă, A6, care este o peptidă cu 8 aminoacizi, derivată din activatorul de plasminogen de tip urokinază și este implicată în inhibarea migrației, invaziei și metastazelor celulellor canceroase, a fost asociată cu legarea la CD44. Pe baza activităților antitumorale preclinice, A6 a fost introdus în tratamentul la pacienții cu cancer ovarian și a fost asociat cu prelungirea supraviețuirii fără progresia bolii.

[Yan și colab., 2015]

Metilarea

Proteine metilate

Metilarea proteinelor are loc în resturile de lizină și arginină și este o modificare obișnuită a proteinelor din nucleele celuleor eucariote. Această modificare post-sintetică este catalizată de o familie de enzime numite protein metiltransferaze (PMT), ce funcționează ca un activator transcripțional sau represor și utilizează S-adenozilmetionina ca donator de metil (SAM).

[Petsko și Ringe 2004]

Lizina și arginina sunt aminoacizi țintă pentru metilare; lizina este metilată în trei forme diferite: monometil-, dimetil- și trimetil-lizină (Fig. 15b). Fiecare dintre aceste forme metilate este produsă de anumite protein lizin metiltransferaze (KMT). Arginina este, de asemenea, metilată în trei forme diferite: monmetil-arginină, dimetil-arginină asimetrică și dimetil-arginină simetrică (Fig. 15a).

Figura 15. Formele metilate ale lizinei și argininei

Metiltransferazele argininei (PRMT) sunt clasificate în tip I, II și III, în funcție de tipul de metilare pe care îl catalizează. Tipul I (PRMT 1, 2, 3, 4 denumită și Carm1, 6 și 8), catalizează forma dimetil-arginină asimetrică, iar tipul II ( PRMT 5 și 9) catalizează forma dimetil-arginină simetrică, iar PRMT 7 este singura enzimă de tip III, care catalizează exclusiv formarea monometil-arginină.

[Poulard și colab., 2016]

Metilarea proteinelor are un rol important în reglările epigenetice prin metilarea histonelor, dar și o varietate de procese biologice precum reglarea ciclului celular, repararea ADN, apoptoza.

[Hamamoto și Nakamura 2016]

Reglarea epigenetică prin metilarea sau demetilarea histonelor are un rol important în controlul sintezei ARN celular și metabolismul celular. Histon metiltransferazele (HMT) sau histon lizină metiltransferazele (HKMT), catalizează în mod specific resturile de lizină în histone și sunt implicate în reglarea expresiei genei; majoritatea situsurilor de metilare au fost identificate la histonele H3 (resturile K4, K9 și K27) și H4 (restul K20). Există și metiltransferaze care catalizează resturi de lizină în proteinele non-histonice sau factori de transcripție (p53, ERα *, NFkB*, pCAF* etc.).

* ERα,- receptorul alpfa pentru estrogen; * NFkB- factorul nuclear kapa B; * pCAF- factorul coactivator transcripțional, asociat cu proteina p53

[Karve și Cheema 2011]

Dereglările apărute în procesul de metilare a proteinelor, prin diferite mutații sau expresii aberante, duc la multe afecțiuni, printre care și cancerul.

Metiltransferaza argininei 1 (PRMT1) este cea mai abundentă enzimă, aceasta modificând aproximativ 90% din resturile de arginină metilată din celule și astfel catalizează majoritatea formei dimetil-arginină asimetrică (ADMA). Dereglări ale metilării sunt specifice în mai multe tipuri de cancere, precum cancerul de vezică, leucemia limfoblastică acută la copii, cancerul de colon, iar cazul tumorilor de sân și de plămâni a fost identificat un nivel mai înalt de expresie a PRMT1 în ARN m, comparativ cu țesutul normal. Practic, o supraexpresie a PRMT1 ar putea declanșa o hipermetilare a substraturilor sale, accelerând astfel procesul de tumorigeneză.

PRMT2 este o enizmă care are o activitate mai scăzută față de PRMT1, datorită numărului limitat de substraturi identificate, și este implicată în creșterea activității receptorilor nucleari, cum este ERα, receptorii prosteronului și cei androgenici, care au rol în dezvoltarea cancerelor dependente de hormoni (cancerul de sân). Carm 1 (PRMT4) este o enzimă de tipul I, ce catalizează modificarea formei dimetil-arginină asimetrică (ADMA), modifică histona H3 la restul 17 de arginină și se exprimă aberant în tumorile dependente de hormoni, cum este cancerul de prostată, cancerul de sân, dar și alte tumori. Carm1 este esențial în progresia ciclului celular indus de estrogen în liniile celulare de cancer de sân. PRMT5, este o metiltransferază din tipul II, ce catalizează forma dimetil-arginină simetrică și este implicată în suprimarea transcripțională prin metilarea p53, cu modifcarea funcțiilor biochimice. Reziduul R110 al proteinei supresoare de tumori PDCD4 (programmed cell death protein 4) reprezintă unul dintre substraturile PRMT5. În cazul unei tumori mamare, coexpresia acestora accelerează creșterea tumorală și nivele ridicate ale expresiei PDCD4 și PRMT 5 în cancerul de sân sunt asociate cu prognostic rezervat. Enzima PRMT6 a fost identificată în celulele cancerului de vezică urinară, de plămân și în cel mamar. Metilarea genei supresoare p21 duce la inhibarea funcției de creștere, iar celulele cancerului de colon tind să devină mai rezistente la agenții citotoxici. Baldwin și colab. a observat că enzima de tipul III, PRMT7 este prezentă în cancerul mamar metastatic, prin faptul că aceasta exprimă o metaloproteinază de matrice, care este un mediator bine în metastaza cancerului de sân.

[Poulard și colab., 2016]

Modalități de țintire în terapia anticanceroasă

Rolul pe care îl au modificările epigenetice în evoluția tumorii a dus la dezvoltarea unor abordări terapeutice care vizează acest tip de modificări. Inhibitorii ADN precum azacitidină și decitabină sunt în prezent cele mai utilizate medicamente în terapiile epigenetice de cancer. Acești inhibitori de ADN metiltransferază au o bună eficiență în inhibarea genelor supresoare tumorale suprimate epigenetic.

[Young 2015]

Nitrarea

Proteine nitrate

Nitrarea proteinelor este un produs secundar al reacțiilor de oxidare a proteinelor. Această modificare post-sintetică este inițiată atunci când aminoacizii sunt expuși la agenți de nitrare sau stres oxidativ.

[Karve și Cheema 2011]

Oxidul nitric (NO), este un radical liber relativ stabil ce traversează membranele celulare și interacționează cu moleculele țintă, fără a avea nevoie de transportatori sau receptori speciali.

NO se formează din oxidarea aminoacidului l-arginină, sub activitatea catalitică a sintetazelor (NOS) care necesită NADPH și O2 ca și cosubstrate, pentru a produce NO și l-citrulină ca și produși finali (Fig. 16). Oxidul nitric este generat de trei tipuri de sintetaze: neuronal (nNOs sau NOS1), inductibil (iNOS) și endotelial (eNOS sau NOS3).

[De Sanctis și colab., 2014]

Figura 16. Formarea oxidului nitric

www.ncbi.nlm.nih.go

Dintre cele trei enzime NOS, iNOS se distinge prin faptul că generează mai mult NO decât membrii constitutivi nNOS și eNOS și este reglementat la nivelul expresiei prin citokine inflamatorii (TNF-α, IL-1β), endotoxină lipopolizaharidică, hipoxie, stres oxidativ și modulează în mod specific procesele esențiale legate de tumori, cum sunt transformarea malignă, angiogeneza și metastaza.

[Vannini și colab., 2015]

Oxidul nitric este implicat în numeroase procese biologice, printre care proliferarea celulară și angiogeneza, precum și în diverse boli, cum este cancerul, datorită unei nitroproteine numite nitrotirozina. Procesul de nitrare a tirozinei este specific pentru proteine și modifică resturile de tirozină în proteina afectată. Acest proces este influențat de mai mulți factori precum localizarea agenților de nitrare din proteină, numărul de resturi de tirozină și poziția acestora în proteină.

[Masri 2010]

Nitrarea proteinelor este asociată în cancer cu apoptoza și stresul oxidativ. Nivelurile ridicate de NO pot fi citostatice sau citotoxice pentru celulele tumorale, în timp ce nivelurile scăzute pot influența creșterea tumorilor prin evenimentele proliferative, cum sunt fosforilarea ERK (kinazele de semnalizarea extracelulare) și acumularea HIF-1α (factorul 1α inducibil al hipoxiei).

Proteina anti-apoptotică Bcl-2 (B cell lymphoma) acționează prin inhibarea citocromului C mitocondrial, care este eliberat ca răspuns la stimulii apoptotici în citoplasmă. În cazul unor tumori, această proteină este supraexprimată și este implicată în rezistența chimică în cancer prin dereglarea procesului de apoptoză.

[Manion și Hockenbery 2003]

Proteina supresoare tumorală, p53, acționează ca răspuns în deteriorarea ADN sau a altor modifcări din celulă. Activarea ei poate duce la repararea ADN, dar în cazul unor deteriorări iremediabile duce la apoptoză. Acumulările proteinei p53 sunt asociate cu proprietățile antitumorale mediate de oxidul nitric. În cazul unor concentrații ridicate de oxid nitric, p53 suferă modificări ce duc astfel la disfuncții biologice.

[Saxena 2012]

Cancerul pulmonar poate fi inițiat atunci când o celulă normală din plămân suferă mutații genetice, transformând-o astfel într-o celulă anormală. Aceste celule anormale pot forma o tumoare care poate invada vasele de sânge și se poate răspândi în alte zone din plămâni. Fumul de țigară, unul dintre factorii implicați în acest tip de cancer (Fig. 17) , și care este o sursă importantă de oxidanți exogeni, duce la inflamarea cronică a căilor respiratorii prin acumularea și activarea leucocitelor care produc nivele ridicate de specii reactive de oxigen (ROS) și NO.

[Masri 2010]

Activarea factorului nuclear NF-kB poate crea o legătură între inflmație și cancerul pulmonar. Citokinele proinflamatorii pot, de asemenea să accelereze proliferarea celulelor și metastazele. Pacienților cu cancer pulmonar, nivelele crescute de stres oxidativ au mai fost asociate și cu exprimarea crescută a factorului de creștere epidermic (EGFR), care are rolul de a promova proliferarea epitelială.

[Barnes și Celli 2009]

Figura 17. Cancerul pulmonar

www.erj.ersjournals.com

NOS a fost identificat, prin exprimare la nivel înalt și în țesuturile cancerului de sân și în liniile celulare de carcinom mamar, mai exact în grad avansat. Acest lucru indică faptul că exprimarea NOS în cancerul mamar poate fi un eveniment timpuriu în carcinogeneză. Oxidul nitric contribuie la creșterea fluxului sanguin al tumorii și promovează angiogeneza. Nitrotirozina, un biomarker a oxidului nitric, este asociată cu factorul C de creștere endotelial vascular (VEGF-C) și are un rol important în metastazarea nodulilor limfatici în cancerul mamar, dovedind astfel implicarea NO în progresia carcinomului mamar.

[Choudhari și colab., 2013]

Dintre activitățile fiziologice vitale, cum sunt vasculatura și neurotransmisia, sunt influențate de oxidul nitric, acesta fiind un mediator important al neurotoxicității. În tulburări ale sistemului nervos central, au fost identificate niveluri mari de NO, fiind folosit ca indicator pentru diferențierea tumorii cerebrale de malignități exprimarea nNOS.

Celulele cervicale și epiteliul glandular generează oxid nitric. Nivele ridicate de NO au fost depistate la pacienții cu cancer de col uterin, sugerând astfel rolul său mutagen și carcinogen în progresia cancerului de col uterin. În același timp, NO are un rol esențial în progresia carcinogenezei cervicale prin virusul papilloma (HPV), fiind asociat cu o exprimare ridicată atât a eNOS, cât și a iNOS; iNOS fiind implicat în progresia tumorii prin promovarea angiogenezei, astfel ducând la reglarea nivelului de VEGF.

[Vahora și colab., 2016]

Modalități de țintire în terapia anticanceroasă

Se încearcă exploatarea din punct de vedere terapeutic a caracteristicilor NO (creșterea tumorală, oprirea căilor apoptotice), în vederea încetinirii creșterii tumorii și a spori eficiența chimioterapiei și a radioterapiei. Se investighează diferite metode pentru manipularea producerii in vivo și a eliberării moleculei de oxid nitric, prin terapia genelor iNOS, inducerea iNOS și administrarea de medicamente donoare de NO, totul în scop terapeutic. Acest tip de medicamente sunt capabile să inducă eliberarea de NO cu o varietate mare de timpi de înjumătățire și cu doze estimate previzibil. Practic acestea au activitate anticanceroasă, sunt implicate în creșterea stimulilor apoptotici, inhibă procesele de metastazare, angiogeneză și hipoxie, în funcție de concentrația donorului de NO, dar și de tipul și stadiul cancerului în care se află pacientul respectiv.

[Choudhari și colab., 2013]

Statinele (de exemplu simvastatin, fluvastatin, pravastatin, lovastatin) sunt agenți de scădere a colesterolului care inhibă HMG-CoA reductaza (3- hidroxi-3-metilglutaril coenzima A), care la rândul său catalizează conversia HMG-CoA în mevalonat și astfel este limitată biosinteza colesterolului (Fig. 18). Acestea au dovedit a avea activitate tumoricidă și apoptotică care este mediată de inducerea iNOS, împotriva multor tipuri de cancer, inclusiv carcinomul de sân.

Figura 18. Acțiunea statinelor

www.medscape.org

Agenții chimio-preventivi de cancer (Tabel 4) care au activitate antitumorală au fost cercetați în scopul inducerii și inhibării iNOS. Inducerea producerii de iNOS din fenretinidă, un derivat al vitaminei A a demonstrat inhibarea creșterii și a promovat apoptoza celulelor canceroase de sân, în fază de metastază. Cel mai cunoscut agent chimioterapeutic 5-fluorouracil (5-FU) a indus iNOS și apoptoza în celulele canceroase hepatice, datorită compusului l-arginină, care a îmbunătățit sensibilitatea celulelor la 5-FU. De asemenea, medicamentele antiinflamatoare nesteroidiene dononare de NO , precum aspirina și ibuprofenul, au demonstrat reducerea exprimării iNOS, prin inhibarea proliferării celulelor cancerului colorectal.

[Vannini și colab., 2015]

Tabel 4. Agenți chimio-preventivi din alimentație

[Vahora și colab., 2016]

Astăzi, medicina modernă încearcă să revoluționeze prin instrumente ale nanotehnologiei, metode actuale de diagnostic cu sensibilitate, specificitate, validitate și tratament încă din fază moleculară. Nanomedicina utilizează dispozitive precum nanoparticule, create în scopul îmbunătățirii biodisponibilității diverselor forme medicamentoase, prin realizarea de noi medicamente mai eficiente. Nanoparticulele, fiind foarte mici, pot pătrunde ușor în celule, și fiind un ,,vehicol ‘’ pentru diferite medicamente, acestea pot fi direcționate către anumite celule țintă, eliminând astfel pericolul toxicității și crește eficacitatea terapiei medicamentoase.

De asemenea, mai sunt utilizate în medicină și nanocristalele QD (quantum dots) denumite și nanocristale fluorescente cu proprietăți cuantice, ce pot fi legate de moleculele donoare de NO. Aceste nanocristale sunt mult mai strălucitoare comparativ cu substanțele de contrast și necesită doar o sursă de lumină pentru excitarea particulelor; au capacitatea de a lega numeroase substanțe (molecule donoare de NO, etc.), ce pot fi transportate cu ușurință la nivelul tumorii, și având astfel o dimensiune mică (10-100nm) se pot acumula la nivelul acesteia, lucru facilitat de drenajul limfatic. Practic, prin aceste nanoparticule, s-ar înlocui metodele clasice de chimio- și radioterapie, care pe lângă celulele canceroase le afectează și pe cele sănătoase, distrugându-le.

În terapia cancerului un exemplu este terapia Kanzius, ce folosește nanoparticule din carbon sau aur, care se fixează la nivelul celulelor tumorale, iar prin intermediul undelor radio, nanoparticulele ca și celulele ce le sunt atașate sunt încălzite, astfel tumora este distrusă în interiorul organismului. (Fig. 19).

[Ciutan și colab., 2010]

Figura 19. Terapia Kanzius

www.nanowerk.com

În ceea ce privește chirurgia oncologică, se utilizează nanoparticule din cadmiu sau seleniu, care injectate în organism, pătrund în tumori, iar la expunerea la lumina UV le face strălucitoare, favorizând astfel excizia tumorală cu mare precizie (Fig. 20).

[Ciutan și colab., 2010]

Figura 20. Nanoparticule QD strălucitoare

www.researchgate.net

Ubiquitinarea

Proteine ubiquitinate

Ubiquitinarea este o modificare post-sintetică ce este coordonată și catalizată enzimatic și vizează proteinele pentru degradare și reciclare (Fig. 21) Acest tip de modificare are un rol important, fiind implicată în reglarea semnalizării, stabilitatea proteinelor și reglarea transcripției, participând totodată și în diferite procese biologice precum migrația celulară, proliferarea și diferențierea celulară, răspunsul la deteriorarea ADN, apoptoză, neurodegenerare și cancer.

[Wei și Lin 2012]

Proteinele care sunt supuse degradării sunt marcate de o atașare covalentă a unei proteine reglatoare, denumită ubiquitină (Ub). Proteina este alcătuită din 76 de aminoacizi, prezintă un grad mare de conservare, este exprimată în toate tipurile de celule și are șapte resturi de lizină (K6, K11, K27, K29, K33, K48 și K63).

[Gallo și colab., 2017]

Ubiquitinarea are loc printr-o cale enzimatică, ce implică activarea ubiquitinei cu ajutorul unor enzime ce acționează într-o anumită ordine: enzime de activare (E1), de conjugare (E2), ligaze (E3) ce recunosc substratele țintă, dar și niște enzime, numite enzime de dezubiquitinare (DUB), ce au rolul de înlătura ubiquitina din substratele țintă și o reciclează în citosol. (Fig. 21)

[Kar și colab., 2013; Gallo și colab., 2017 ]

Figura 21. Procesul de ubiquitinare a proteinelor

www.ncbi.nlm.nih.gov

Deoarece cele mai multe proteine sunt supuse procesului de ubiquitinare ca și modificare post-sintetică, celulele canceroase tind să intervină în calea de semnalizare a acestui proces prin exprimarea aberantă a compușilor ubiquitinării, ducând astfel la progresia cancerului și metastaze.

Enzimele de conjugare (E2), sunt implicate în reglarea progresiei ciclului celular, a inflamației și a mecanismelor prin care acestea modulează metastazele cancerului. Aceste enzime au un nulceu cu 150 de aminoacizi și un domeniu conjugat de ubiquitină (UBC), care este direct responsabil de ubiquitinare. Enzima de conjugare a ubiquitinei E2N (UBE2N), este supraexprimată în diverse tumori, precum cea de sân, pancreas, colon, prostată, limfom și carcinoame ovariene, iar cofactorul ei, UBE2V1 (varianta 1), se găsește la nivel ridicat în cancerul de sân, și este asociată cu creșterea invazivității și migrării celulor cancerului de sân.

[Gallo și colab., 2017]

Ligazele E3 sunt implicate în reglarea proliferării celulare, oprirea ciclului celuar și apoptoza. Acestea pot fi supresoare tumorale sau oncogene, în funcție de capacitatea lor de a degrada fie oncogena, fie proteina supresoare tumorală. Dereglarea acestor ligaze și a rețelei lor de ubiquitină apare în boli umane, în special în cancer și bolile neurodegenerative. Mecanismul de ubiquitinare a substratelor țintă a ligazelor depinde de domenii catalitice conservate: RING, HECT (Homology to E6AP Carboxy Terminus) și familia de proteine omoloage UFD2 (U-box).

Celulele canceroase profită de supraexprimarea STUB1, o ligază care funcționează ca un șaperon în controlul calității proteinelor și promovează ubiquitinarea. Această ligază, STUB1, în cancerul pancreactic, are rol de supresor tumoral, și modulează stabilitatea receptorului factorului de creștere epidermal prin degradarea receptorului tirozin kinazei.

Ligaza Mdm2 (murine double minute) are un domeniu catalitic de tip deget RING și este implicată în medierea ubiquitinării proteinei supresoare tumorale p53. Aceasta se exprimă în cancerele umane, precum cancerul de sân, cancerul pulmonar și multe alte tipuri de tumori.

Inhibitorii proteinelor de apoptoză (IAP), fac parte din tipul E3 de ligaze și sunt active în diferite boli. Aceștia intervin în degradarea mai multor substrate implicate în apoptoză și semnalizare, și sunt exprimați în cancerele hepatice, pulmonare, carcinoamele ovariene, tumori limfoide.

Proteina BRCA1 este la rândul său o ligază E3; are activitate supresoare tumorală și este implicată în procesul de reparare a ADN și de control a ciclului celular. Această proteină este exprimată în mod aberant în cele mai multe cazuri de cancer mamar, dar și în cancerul ovarian. BRCA1 se asociază cu o altă proteină cu domeniu RING, se formează BARD1, și duce astfel la creșterea activității ubiquitin ligazei.

O altă ligază E3 este VHL (von Hippel-Lindau), care este exprimată aberant în sindromul de susceptibilitate la cancer, numit sindromul von Hippel –Lindau. Acest sindrom este caracterizat prin dezvoltarea unor tumori angiogenice, cum ar fi carcinomul celulelor renale, chisturile pancreactice. Unul dintre cele mai cunoscute substrate ale ligazei VHL este HIF-1α (factorul 1α inducibil al hipoxiei) (Fig. 22), care este un mediator esențial al homeostaziei oxigenului și reglator al genelor în angiogeneză. În condiții normale, HIF-1α este hidroxilat la prolină, ducând la recunoașterea sa prin VHL, la ubiquitinare de către complexul VCB și la degradarea proteasomului. În condiții de hipoxie, HIF-1α scapă de degradarea indusă de VHL și induce gene ca și factorul de creștere endotelial vascular (VEGF) care stimulează angiogeneza și metabolismul în favoarea vascularizării tumorale.

[Shi și Grossman 2010]

Figura 22. Mecansimul ligazei VHL

www.wikiwand.com

Proteina asociată cu E6 (E6-AP) face parte din familia de ligaze HECT E3 a ubiquitin ligazei și are funcția de a cataliza ubiquitinarea și degradarea genei supresoare p53 în infecțiile cu papilomavirusuri umane. (HPV). Tipurile de HPV 16 și 18 sunt asociate cu cancerul de col uterin, împreună cu cancerele genitale și cele de gât și cap.

[Kar și colab., 2013]

Enzimele de dezubiquitinare (DUB) sunt și ele implicate în degradarea proteasomului, în transcripție, repararea ADN. Supraexprimarea acestor enzime este asociată cu cancerele umane. USP7 (protează specifică ubiquitinei), cunoscută și sub denumirea de HAUSP (ubiquitin protează asociată cu virusul Herpes), este implicată în reglarea genei supresoare p53 și este superexprimată în carcinomul de plămâni fără celule mici, și în metastazele nodulilor limfactici.

[Shi și Grossman 2010]

Modalități de țintire în terapia anticanceroasă

Se încearcă dezvoltarea de agenți care vizează inhibarea activităților ligazelor E2, E3 și DUB. Agenții care suprimă interacțiunea p53 cu ligazele E3, Mdm2, au ca și rezultat acumularea de p53, declanșând astfel moartea celulelor canceroase apoptotice, ceea ce le oferă un statut important în dezvoltarea de astfel de medicamente. O altă variantă ar fi crearea de inhibitori ai DUB USP7, care stabilizează concentrațiile celulare ale Mdm2 prin eliminarea ubiquitinei.

USP7 (protează specifică ubiquitinei), cunoscută și sub denumirea de HAUSP (ubiquitin protează asociată cu virusul Herpes) are un rol esențial în reglarea genei supresoare p53. Inhibitori ai acestei molecule mici de USP7, ar duce la desubiquitinarea p53 și astfel s-ar induce apoptoza în carcinomul de colon, sugerând potențialul terapeutic în țintirea USP7 (Fig. 23)

[Gallo și colab., 2017]

Figura 23. Potențialul terapeutic în țintirea USP7

www.cumc.columbia.edu

Produse naturale precum lactacystin-l (extras din Streptomyces lactacysnarius) sau epoxomicin țintesc în mod specific proteasomul. Datorită succesului pe care îl au inhibitorii naturali ai proteasomului de a induce apoptoza celulară, s-au făcut eforturi în descoperirea de inhibitori ai proteasomului de natură sintetică. În prezent se utilizează în terapia antitumorală inhibitori ai proteasomului precum delanzomib, carfilzomib, oprozomib, moarizomib. Primul inbitor proteasomic utilizat în scop clinic este bortezomib, un compus proiectat special care mediază degradarea proteică, are un rol important în reglarea sintezei proteice intracelulare și homeostazia celulei. Inhibă activitatea proteasomului și are un efect citotoxic asupra celulelor mielomului prin inducerea apoptozei după acumularea de proteină excesivă. De asemenea, acest medicament suprimă semnalele inflamatorii, incluzând secreția de interleukine 6 (IL-6) și factori de necroză tumorală (TNF).

[Weathington și Mallampalli 2014]

Un alt agent cu aplicabilitate în terapie este fulvestrant, un antagonist pur al estrogenului, care este utilizat la pacienții cu cancer de sân pozitivi la estrogen, care a progresat în urma altor terapii anti-estrogen. Acest medicament acționează prin faptul că intensifică degradarea dependentă a receptorului estogenului α (ER- α).

[Orlowski și Dees 2002]

Sunt disponibili inhibitori puternici și specifici cu molecule mici cu proprietăți farmaceutice dorite, cum ar fi Nutlin-3 (Fig. 24) și MI-219. Acești inhibitori, prin activarea p53, ar putea determina o mare varietate de răspunsuri celulare în celulele normale, dar și în cele tumorale. În celulele normale, activarea p53 de către inhibitorii MDM2 induce oprirea ciclului celular, dar nu și moartea celulară, în timp ce, în celulele tumorale, activarea p53 induce atât oprirea ciclului celular cât și moartea celulară. Nutlin-3 și MI-219 prezintă o activitate antitumorală puternică în mai multe tipuri de cancere, printre care osteosarcomul și cancerul de prostată.

[Shangary și Wang 2008]

Figura 24. Acțiunea MDM2 (Nutlin-3)

www.pnas.org

Metode de analiză și identificare a proteinelor modificate în cancer

În diagnosticul și tratamentul cancerului este deosebit de important detectarea precoce

fiindcă acest lucru îmbunătățește șansele de supraviețuire. Cu toate acestea, diagnosticarea inadecvată nu permite detectarea anumitor tipuri de cancer decât în stadii finale.

În prezent, în clinici, există o varietate de teste de analiză a proteinelor , cum sunt cele bazate pe imunohistochimie (IHC), analiza enzimatică legată de imuno-absorbție (ELISA), spectrometria de masă etc.

[Powers și Palecek 2012]

Proteomica este un domeniu care avansează rapid, datorită evoluțiilor în ceea ce privește spectrometria de masă și tehnologiile asociate cu aceasta. Practic, este permisă detectarea rapidă și sigură a proteinelor. Măsurătorile se pot face din soluții în stare lichidă sau solidă și uneori din amestecuri complexe. Scopul acestor tehnologii este detectarea precoce și, dacă este posibil, terapia individualizată a bolii respective.

[Lu și colab., 2007]

Spectrometria de masă

Informații generale

Spectrometria de masă este utilizată în domeniul diagnosticării cancerului în două moduri diferite, în primul rând, pentru descoperirea de noi biomarkeri în cancer și în al doilea rând, ca instrument de diagnosticare și imagistică în cancer.

Pe măsură ce sângele trece într-un organ afectat, profilul proteinelor serice este modificat datorită proceselor patologice care au loc. Aceste procese includ proteine supraexprimate, proteine modificate sau eliminate ca urmare a activării anormale a căilor de degradare, care lasă o ,, amprentă’’ unică în sânge. Fluidele sau extractele de țesut sunt analizate prin spectrometria de masă și sunt identificate vârfurile exprimate diferențial.

[Van der Merwe și colab., 2007]

MALDI MS (dezabsorbția/ionizarea laserului asistată de matrice prin spectrometria de masă) de imagistică, denumită și MS MALDI, este o metodă care permite vizualizarea și distribuția spațială a compușilor în secțiunile de țesuturi. Această metodă poate detecta molecule în intervalul 1kDa-50kD, nu necesită anticorpi specifici, permițând astfel o abordare directă a analizei țesuturilor. Procedura implică ca mostrele prelevate dintr-o bucată de țesut subțire de-a lungul unei rețele 2D să fie generate de o serie de concentrații de ioni în fiecare punct al rețelei. Se obțin apoi o serie de spectre, ce conțin imagini ionice, fiecare reprezentând o moleculă diferită de interes în aceeași secțiune tisulară. (Fig. 25). Țesutul/celula de interes este pusă într-o placă de sticlă acoperită cu oxid de indiu. Se aplică o matrice pe țesut/celulă și se obțin astfel spectre. Distribuția spațială a ionilor este 2D.

Procedura MALDI, are ca scop descoperirea biomarkerilor, însă poate detecta molecule care de regulă nu ar putea fi detectate în omogenatele tisulare.

[Powers și Palecek 2012]

Figura 25. Procesul de imagistică prin spectrometrie de masă MALDI

www.spandidos-publications.com/ijo

Proteine modificate identificate în cancer

Metoda MALDI este utilizată în detectarea modificărilor post-sintetice în scopul diagnosticării unei varietăți de cancere, printre care cancerul de sân cu modificări ale p53, BRCA1 și BRCA2, HER2, ER, carcinomul colorectal cu modificări ale BRAF, RAS, EGFR, cancerul hepatocelular și carcinomul renal.

[Kriegsmann și colab., 2015; Powers și Palecek 2012]

Majoritatea modificărilor post-sintetice sunt prezente la niveluri scăzute în celule și țesuturi, iar detectarea lor prin spectrometria de masă este uneori dificilă.

În Tabelul 5, sunt prezentate câteva tipuri de modificări post-sintetice detectate prin spectrometria de masă, în cancerul de sân.

Tabel 5. Modificări post-sintetice în cancerul de sân

[Hongjun și Zangar 2009]

Imunohistochimia

Informații generale

Imunohistochimia (IHC) este o metodă utilizată pentru detectarea unei proteine sau a unui antigen de interes cu un anticorp specific, prin vizualizarea pe secțiune a unui țesut, cu ajutorul microscopiei. Această metodă poate fi aplicată pe probe de țesut ce au fost imersate în parafină sau înghețate, după ce acestea au fost secționate în felii subțiri și montate pe diapozitive pentru a fi analizate. Colectarea, conservarea și fixarea țesuturilor poate varia în funcție de ținta de interes.

Printre metodele de colorare a secțiunilor ce urmează a fi analizate în scopul detectării proteinelor sau a altor molecule din celule, se numără marcarea anticorpilor cu fluorofor (imunoflorescență) și a enzimelor (imunoperoxidază). Imunohistologia este utilizată pe scară largă în patologia chirurgicală în vederea determinării tipurilor de celule canceroase, clasificării tipului de cancer și posibila origine a celulei canceroase respective.

[Idiko 2010]

Pe scurt, protocolul IHC (Fig. 26) presupune: secțiuni de țesut, urmate de recuperarea antigenului sau demascarea antigenului, proces în care epitopii sunt demascați și sunt accesibili anticorpilor primari prin utilizarea anumitor enzime proteolitice (tripsină, pepsină etc.). sau de tampoane (citrat de sodiu și EDTA), aplicarea de anticorpi secundari, dezvoltarea cromogenică, după care are loc captarea imaginii și analiza propriu-zisă a probei de țesut.

[Shi și Stack 2015]

Figura 26. Protocol de imunohistochimie

www.abnova.com

Proteine modificate identificate în cancer

Imunohistochimia este o metodă foarte des utilizată în evaluarea modificărilor post-sintetice în cancerul de sân, în scopul catalogării acestor modificări ca potențiali markeri ai tumorii.

Prin această metodă au fost detectate modificări ale subunității β a prolil-4 –hidroxilazei și a anexinei A2, modificări ale nivelurilor de nitrotirozină dar și ale receptorului de estrogen și progesteron, markerul Her2 (Fig. 27) la pacienții cu cancer mamar, gena p16 ca marker surogat în infecția cu virusul papilloma (HPV) și cancerul asociat cu acest virus, și gena p63 asociată cu cancerul de prostată.

[Hongjun și Zangar 2009; Shi și Stack 2015]

Figura 27. Testul de imunohistochimie pentru Her2

negativ; b. neconcludent; c. pozitiv

www.nature.com/modpathol/journal

ELISA microarray

Informații generale

ELISA microarray este o tehnică analitică care poate măsura cu acuratețe concentrațiile de proteine la un intervalul scăzut de pg/ml probă. Anticorpii microarray sunt utilizați în scopul identificării proteinelor implicate în cancer, dar și ca diagnostice potențiale pentru cancer. Proteinele care utilizează anticorpi ce conțin un fragment variabil cu un singur lanț (scFV) au fost dezvoltate pentru diagnosticarea, monitorizarea și prognosticul cancerului mamar și cel de pancreas.

Într-un test ELISA (Fig. 28), proteinele sunt imobilizate pe o suprafață și marcate cu enzime (HRP-peroxidază de hrean) ce catalizează o reacție ce are ca și rezultat modificarea culorii. Se pot analiza simultan mai mulți markeri cu sensibilitate și specificitate ridicată.

[Powers și Palecek 2012]

Această tehnică folosește în mod obișnuit perechi complementare de anticorpi de captare și detecție, pentru a putea identifica/ măsura antigeni în fluidele biologice. Există, însă, câteva nevoi în ceea ce privește analiza ELISA și anume existența unor anticorpi foarte specifici, deoarece comercial vorbind, sunt limitați cei care sunt implicați în modificările post-sintetice.

[Jin și Zangar 2009]

Figura 28. Testul ELISA în cancer

www.isogen-lifescience.com

Proteine modificate identificate în cancer

ELISA microarray a fost dezvoltată pentru cuantificarea rapidă și eficientă a mai multor fluide biologice pentru diferite antigene, dovedite a fi asociate cu diferite tipuri de cancer atunci când acestea sunt exprimate în nivele foarte mari. În Tabelul 6 sunt prezentați biomarkeri, care au suferit modificări, pentru ca aceștia să poată detecta diferite tipuri de cancer.

[Powers și Palecek 2012]

Tabel 6. Biomarkeri în diferite tipuri de cancer

[Powers și Palecek 2012]

Alte proteine implicate în cancer și țintirea lor în terapia anticanceroasă

Hsp27

Hsp27, denumite și HspB1, au proprietăți anti-apoptotice și tumorigene, și sunt asociate cu formarea oligomerilor mari. Aceste proteine sunt fosforilate de multe kinaze (MAPK, PKD, PKC) ca răspuns la multe tipuri de stres, precum stresul oxidativ, citokinele inflamatorii ca și factorul de necroză tumorală α (TNF- α), interleukina 1-β, factorul transformant de creștere (TGF- β), factorul de creștere asemănător insulinei (IGF-1) și hormoni steroizi. Supraexprimarea Hsp27 este detectată la o serie de tipuri de cancer, cum este cancerul de sân (Hsp27 este în corelație cu receptorii pentru estrogen), cancerul ovarian (exprimarea Hsp27 crește odată cu stadiul tumorii), osteosarcomul, cancerul endometrial și leucemia.

[Jego și colab., 2013, Zoubeidi și Gleave 2012]

Țintire în terapia anticanceroasă

În mai multe linii de celule canceroase, oligonucleotidele antisens ale Hsp27 au intensificat apoptoza și a întârziat dezvoltarea tumorii. Inhibitorul proteasomului, Velcade (PS-341), a demonstrat în studiile clinice ce implică mielomul multiplu, că induce apoptoza în mai multe linii celulare canceroase.

[Jego și colab., 2013]

S-a încercat blocarea Hsp27 prin asocierea cu ASO (ologonucleotide antisens) cu scopul inducerii apoptozei și a inhibării creșterii tumorale cu un singur agent, precum și a intensificării activității hormon- chimioterapie, atunci când sunt folosite în combinație. Hsp27-ASO induce apoptoza și întârzie progresia tumorii la cancerul de prostată și chimio-sensibilizează cancerul de vezica urinară, cancerul de prostată, cancerul ovarian și cel uterin la paclitaxel (citostatic), cancerul colorectal la irinotecan (citostatic) și linia celulară de cancer gastric rezistent la vincristin (citostatic).

O abordare interesantă în terapie, pentru a inhiba țintit Hsp27, reprezintă folosirea de aptameri peptidici. Practic se inseră 15-20 aminoacizi într-o proteină-model cu configurație variabilă; sunt considerați anticorpi simplificați în miniatură. Pentru ca acești aptameri să fie stabili și să poată fi utilizați în terapie, au fost conjugați cu polietilenglicol (PEG), care mărește masa moleculară și prelungește timpul de înjumătățire a apatamerilor prin încetinirea filtrării renale. Aptamerii peptidici au capacitatea de a interacționa cu Hsp27 și de a promova apoptoza indusă de medicamentele chimioterapeutice, lucru similar cu suprimarea Hsp27.

[Zoubeidi și Gleave 2012]

Hsp40

Hsp40 sau DnaJ, sunt definite ca un grup de proteine care sunt ortologi ai proteinei Hsp40 de la E.coli, proteină bacteriană procariotă. Aceste proteine sunt importante în traducerea, plierea, trnslocarea și degradarea proteinelor, prin stimularea activității ATP-azei proteinelor Hsp70. Deoarece hidroliza ATP este esențială pentru activitatea Hsp70, proteinele DnaJ/Hsp40 deteremină de fapt activitatea Hsp70 prin stabilizarea interacțiunii lor cu proteinele substratului. Membrii ai familiei de proteine Hsp40, precum hTid, HLJ1 sunt implicați în modularea creșterii tumorale. A fost cercetat rolul HLJ1 în suprimarea tumorii la cancerul pulmonar fără celule mici (NSCLC); exprimarea HLJ1 a inhibat activitatea agresivă a celulelor adenocarcinomului pulmonar, cum este proliferarea, tumorigeneza, motilitatea și invazia. În urma studiilor s-a constatat faptul că pacienții cu acest tip de cancer care au exprimat un nivel mai mare a HLJ1 au redus recidiva tumorii și au crescut rata de supraviețuire față de cei care au exprimat un nivel mai scăzut al HLJ1.

Un alt membru a familiei Hsp40, hTid1 a fost asociat cu cancerul de piele, cancerul de colon și gliom. Tid1 are două izoforme hTid-1 (L) și hTid-1 (S), care au rol în reglarea activității proteinelor Hsp70. Izoforma hTid-1 (L) promovează apoptoza, în timp ce izoforma și hTid-1 (S) o suprimă. Studiile arată că Tid1 reglează în mod negativ potențialul migrator al celulelor canceroase prin inhibarea producției de interleukină 8 (Il-8) și supraexprimarea acestuia a dus la inhibarea proliferării celulare și la apoptoză în cazul osteosarcomului uman, precum și în cazul celulelor mielomului uman A375.

[Mitra și colab., 2009]

Țintire în terapia anticanceroasă

În ceea ce privește terapia anticanceroasă, compuși precum geldanamicina, radicicol și celastrol au arătat faptul că amplifică exprimarea DnaJ/Hsp40. Curcuminul, o componentă activă a turmericului, care are proprietăți antitumorale, este utilizat în terapie, prin faptul că inhibă invazia celulelor canceroase și metastazele prin reglarea expresiei HLJ1. DnaJ/HLJ1 este considerat, pe lângă unsupresom tumoral și o țintă potențială pentru medicamente în cazul cancerului pulmonar fără celule mici. Prin utilizarea unei regiuni ce conține un promotor de amplificare, prin platforma de screening pentru medicamente pentru DnaJ/HLJ1, Lai și colab au identificat numeroși compuși din plante ( de exemplu Andrographis paniculata), care au sporit activitatea promotorului DnaJ/HlJ1 și au suprimat creșterea tumorală și invazia celulelor canceroase în cancerul pulmonar fără celule mici.

[www.hsp40.com/drug-discovery/]

Hsp60

Hsp60 au un potențial mare în ceea ce privesc domeniile de diagnosticare-prognostic, prevenire și tratamentul diferitelor forme de cancer. În mod normal, acest tip de proteine se găsesc în mitocondrii și interacționează cu Hsp10, însă mai interacționează și cu Hsp70, p53, prin participarea la procesul de apoptoză. Nivelele Hsp60 mitocondriale sunt reglate prin mecanisme complexe, care implică o protein kinază dependentă de ADN, ce are rol protector împotriva apoptozei indusă de medicamente.

Aceste proteine se găsesc și în celulele tumorale din diverse forme de cancer. Nivele crescute de Hsp60 sunt considerate a fi un pericol pentru sistemul imunitar, care duce la activarea și maturarea celulelor dar și la generarea unui răspuns antitumoral a celulelor T. Hsp60 se găsesc în diferite tipuri de cancer, cum este leucemia mieloidă acută, limfon Hodgkin, carcinoame esofagiene cu celule scuamoase, carcinomul colorectal, carcinomul hepatocelular, carcinomul de prostată, carcinoame ovariene. [Capello și colab., 2008]

Țintire în terapia anticanceroasă

Hsp60 fie că este utilizat în terapia anticanceroasă ca genă sau ca proteină, are un mare potențial prin mecanisme antitumorale cum este stoparea supraviețuirii celulare, inducerea de Hsp60 în spațiul extracelular cu activarea unui răspuns imunitar antitumoral. Terapeutic vorbind, prin utilizarea de flavonide, se pot reduce nivelurile ridicate de Hsp60 în celulele tumorale unor anumite tipuri de cancer, iar prin folosirea cadmiului, se induc exprimări ale genei hsp60 în celulele de hematom. Suprimarea acestei gene cu ARN interferent mic în celulele adenocarcinomului mamar și în cel a colonului a dus la disfuncții în mitocondrii și dereglări în complexul Hsp60-p53.

De asemenea, pentru terapia anticanceroasă s-au dezvoltat vaccinuri, în care Hsp60 au rol de adjuvanți; de exemplu vaccinurile care codifică Hsp60 legate la HPV16 E6 și E7 pentru terapia împotriva cancerului de col uterin asociat cu virusul papiloma uman.

[Capello și colab., 2008]

Hsp70

În condiții normale, proteinele Hsp70 funcționează ca șaperoane moleculare dependente de ATP, care ajută la plierea polipeptidelor nou sintetizate, la procesul de asamblare a complexelor de proteine și la transportul acesteia în membranele celulare.

Aceste proteine se găsesc și în celulele tumorale din diverse forme de cancer. Hsp70-1 este o proteină relevantă pentru cancer, având un rol esențial în procesele de inițiere a cancerului. Aceasta este supraexprimată în tumorile maligne a mai multor tipuri de cancer, iar exprimarea sa este asociată cu proliferarea necontrolată a celulelor canceroase, și cu metastazele nodulilor limfatici (în carcinomul colorectal).

[Daugaard și colab., 2007]

Supraexprimarea Hsp70 are rolul de marker în cancerul timpuriu de prostată sau cel hepatocelular, dar și al bolilor avansate. Hsp70 sunt asociate cu proteina Ki67 în cancerul pulmonar, sunt markeri pentru cancerul ovarian nediferențiat și au rol în proliferarea crescută și în mărirea tumorii la pacienții cu cancer de col uterin. De asemenea, niveluri crescute ale Hsp70 sunt asociate cu creșterea stadiului cancerului de vezică urinară, dar și cu scăderea ratei de supraviețuire pentru acest tip de cncer.

[Murphy 2013]

Țintire în terapia anticanceroasă

Pentru terapia împotriva diverselor tipuri de cancer în care Hsp70 sunt implicate, s-au cercetat inhibitori ai Hsp70, printre care o moleculă mică numită 2-feniletin sulfonamidă (PES), care interacționează cu capătul C-terminal al Hsp70. Această interacțiune duce la agregarea proteinelor greșit pliate, destabilizarea memebranelor lizozomice, determinaând astfel o moarte celulară autofagică. Inhibitorul peptidic VER-155008, este un compus derivat din adenozină care se găsește în domeniul ATP-azei Hsp70 și are rolul de a inhiba activitatea acestor proteine. Este utilizat în terapia cancerului de sân ți în cancerul de colon, prin inducerea apoptozei în celulele canceroase. [Jego și colab., 2013]

S-a mai studiat suprimarea Hsp70 cu ARN antisens pentru inducerea morții celulare autofagice în cancerul de sân, acest lucru neafectând celulele epiteliale mamare, în cancerul pulmonar, de colon, de prostată, de ficat. Autofagia este o cale critică de supraviețuire pentru celulele canceroase, iar inhibitorii de autofagie, cum este hidroxiclorochina, pot inhiba progresia tumorii în diferite tipuri de cancer.

[Murphy 2013]

Hsp90

Proteinele Hsp90 sunt șaperoane moleculare abundente care se găsesc supraexprimate sau activate în celulele canceroase. În consecință, proteinele Hsp90 ar putea fi reglatoare în procesele de creștere și proliferare a celulelor tumorale, în facilitarea transformării maligne, astfel fiind critice pentru dezvoltarea malignităților solide. Activitatea Hsp90 în celulele canceroase este relaționată cu capacitatea de proliferare a celuleor maligne, și a fost demonstrat faptul că aceste proteine permit celulelor tumorale să scape de moartea apoptotică.

[Moser și colab., 2009]

În tumorigeneză, asocierea Hsp90 este importantă în vederea menținerii stabilității și funcțiilor a numeroase proteine, denumite proteine client. Multe din aceste proteine client sunt implicate în funcțiile celulare esențiale care promovează creșterea celulară, proliferarea și supraviețuirea celulară, procese care de asemenea sunt implicate în dezvoltarea cancerului. Proteinele client Hsp90 care sunt implicate în cancer includ mediatorii apoptotici (Bcl-2), proteine de reglare a celulelor (CDK4), supresori tumorali (p53). Dacă activitatea ATP-azică a Hsp90 este inhibată, atunci are loc destabilizarea, ubiquitinarea și degradarea proteasomului proteinei client, care pot duce la superexprimări ale Hsp90 în celulele canceroase. În cancerul de sân, nivelele crescute de Hsp90 sunt asociate cu exprimarea receptorilor de estrogen și Her2 iar în cancerul pulmonar sunt asociate cu mutațiile la nivelul receptorului factorului de creștere epidermal.

[Jego și colab., 2013]

Hsp90 și Hsp70 sunt necesare în stabilizarea factorului de trascriere H1F1-α, implicat în hipoxia celulelor canceroase. De asemenea, Hsp90 reglează proliferarea și motilitatea celulelor vasculare prin inducerea exprimării factorului de creștere endotelial vascular (VEGF) și a exprimării oxidului nitric în celulele endoteliale, motiv pentru care supraexprimarea Hsp90 duce la intensificarea angiogenezei tumorale.

[Soo și colab., 2008]

Țintire în terapia anticanceroasă

Datorită rolului său central în semnalizarea oncogenică, Hsp90 reprezintă o potențială țintă în dezvoltarea unor terapii împotriva cancerului. Inhibarea funcției Hsp90 are ca rezultat întreruperea simultană a mai multor căi de semnalizare, care sunt esențiale pentru progresia tumorii, dar și pentru supraviețuire, de aceea s-a încercat dezvoltarea de molecule inhibitorii ale Hsp90 pentru celulele canceroase, deoarece acești inhibitori interferează cu activitatea Hsp90, rezultând în direcționarea proteinelor client la proteasom, unde acestea sunt degradate.

[Neckers 2007]

Inhibitori naturali precum radicicol, geldanamicina și derivații săi (imatinib etc) au proprietăți antitumorale. Hiperacetilarea Hsp90 cu inhibitori HDAC a demonstrat acțiunea antitumorală, în cancerul de prostată și leucemie. Un alt inhibitor natural al Hsp90 este antibioticul Novobiocin, care sper deosebire de ceilalți inhibitori naturali, acesta are activitate mai specifică pentru Hsp90, prin faptul că acesta destabilizează diverse proteine client ale Hsp90 (Her2, p53 mutantă, Bcr-Abl etc), și inhibă astfel creșterea celuleor tumorale.

O altă strategie în terapia anticanceroasă este inhibarea Hsp70 în combinație cu inhibitori ai Hsp90. Prin suprimarea Hsp70, s-ar induce astfel o degradare dependentă de proteasom a proteinelor client ale Hsp90.

[Jego și colab., 2013]

Proteinele RAS

Proteinele RAS, identificate inițial ca oncogene retrovirale din genomul rozătoarelor, au devenit ulterior legate de cancerul uman. Aceste proto-oncogene sunt frecvent mutate în cancerele umane și sunt codificate de trei gene : KRAS(cea mai frecventă în cancer), HRAS și NRAS. RAS aparțin familiei de proteine mici G, ce au activitate GTP-azică, și funcționează ca niște întrerupători moleculari fiind implicate în reglarea căilor responsabile de creșterea, diferențierea, proliferarea și supraviețuirea celulară. Anumite mutații din gena RAS blochează proteina într-o stare constitutiv activă, ceea ce duce la semnalizarea aberantă a acesteia, ducând astfel la cancer.

[Rajasekharan și Raman 2013]

Calea de semnalizare activă RAS-MAPK este raportată în numeroase cancere, incluzând carcinoamele foliculare sau nediferențiate ale tiroidei, hepatocarcinomul, adenocarcinoamele pancreatice, cancerul colorectal, cancerul pulmonar, cancerul ovarian, cancerul de prostată, cancerul mamar, cancerul renal , melanom etc., în care apar defecte ale genelor HRAS, KRAS și NRAS.

[Midgley și Kerr 2002]

Activarea căii MAPK (protein kinaze activate de mitogen) implică legarea factorilor de creștere (TGF-α, EGF, VEGF, PDGF-α) după primirea unor semnale externe, de receptorii proteinei tirozin kinazei, care dimerizează și activează tirozin kinaza prin autofosforilarea resturilor de tirozină. Fosforilarea tirozinei recrutează SOS (son sof sevenless) care se atașează la fosfotirozină prin intermediul proteinelor adaptoare Grb2, care facilitează îndepărtarea GDP de la RAS. În plus, RAS se leagă de GTP și fosforilează RAF, MEK și ERK. Mutațiile din gena RAS blochează proteina în starea sa activă, ducând astfel la activarea constitutivă a căii MAPK.

(Fig. 29 ).

[Rajasekharan și Raman 2013]

Figura 29. Calea Ras/Mapk

www.journals.prous.com

Țintire în terapia anticanceroasă

O strategie alternativă ar fi utilizarea unei combinații de inhibitori ai căii de semnalizare RAS, de exemplu tratamentul cu inhibitori RTK, urmat de tratamentul cu inhibitori RAF, pentru melanomul metastatic, și tratamentul cu inhibitori ai receptorului de creștere epidermal (EGFR), pentru cancerul pulmonar, fără celule mici (NSCLC) (Fig. 30 ).

[Mattingly 2013; Ahronian și Corcoran 2017]

Figura 30 . Inhibitori RAS

(ALK-kinaza limfomului anaplazic; PI3K-fosfoinozitid 3 kinaza;

www.genomemedicine.biomedcentral.com

Pentru țintirea mutațiilor oncogene, inclusiv cele ale KRAS, se cercetează conceptul de letalitate sintetică, care se referă la pierderea viabilității, care rezultă dintr-o combinație a două mutații separate neletale. În cazul genei KRAS mutantă, letalitatea sintetică a fost utilizată în scopul uciderii selective a celulelor mutante KRAS, ca rezultat al altei mutații, a unui tratament cu un agent farmacologic, o schimbare a expresiei genei sau alte perturbații. (Fig. 31 )

[Knickelbein și Zhang 2015]

Figura 31. Conceptul de letalitate la KRAS

www.sciencedirect.com

Proteina c-Myc

Proto-oncogena Myc a fost descoperită pentru prima dată ca agent etiologic în tumorigeneza mediată retroviral. Myc funcționează ca un factor de transcriere care coordonează multe procese celulare, iar dereglări ale acesteia duc la declanșarea cancerului. Deși Myc este una dintre cele mai frecvente oncogene exprimate în patogeneza cancerelor umane, nu este clar dacă supraexprimarea ei, ca oncogenă singură, poate induce proliferarea celulară sau transformarea neoplazică a mai multor celule umane normale, sau poate este nevoie și de activitatea altor oncogene (p53, BCL-2 etc) pentru a iniția tumorigeneza, culminând cu încetarea proliferării, senescență și/sau apoptoză. (Fig. 32)

[Gabay și colab., 2014]

Mecanismul prin care c-Myc induce apoptoza nu este foarte bine elucidat, însă poate fi înțeles prin două metode de căi de semnalizare paralele ca răspuns la stimularea oncogenică a c-Myc. O metodă este aceea că la raspunsul unui stres, mai multe proteine ribozomale leagă Mdm2 și inhibă funcția ligazei E3, ducând astfel la stabilizarea și activarea p53 (Fig. 32A). Cealaltă metodă este ca oncogena c-Myc induce exprimarea proteinei supresoare de tumori ARF, care este transcrisă dintr-un cadru de citire alternativ. Atunci când P19Arf se leagă de Mdm2, proteina tumorală p53 este activată și promovează apoptoza prin activarea genelor preapoptotice și a mediatorilor ciclului celuar (Fig. 32B).

[Chen și colab., 2014]

Figura 32 . Exprimarea c-Myc în cancer

www.ncbi.nlm.nih.gov

De asemenea, c-Myc poate să fie supraexprimată și datorită modificărilor post-sintetice, prin mutații în regiunea de codificare a c-Myc, ce au loc la situsul de fosforilare 58 a treoninei (Thr58) în cazul limfomelor umane. C-Myc stimulează genele implicate în biosinteza proteinelor, stimulează glicoliza, reglează expresia multor enzime metabolice, factorii de transcriere (MAX), genele ciclului celular și unii miARN, în timp ce inhibă exprimarea altor miARN și genele supresoare tumorale.

[Miller și colab., 2012]

Ca și factor reglator al transcrierii, c-Myc are un rol foarte important în reglarea multor procese celulare, cum este controlul ciclului celular, apoptoza, sinteza și adeziunea proteinelor. Exprimările aberante ale acestei oncogene se datorează unor modificări genetice directe, care sunt asociate cu tumorigeneza și apar într-o mare varietate de malignități, cum este carcinomul de sân, carcinomul de colon, carcinomul de col uterin, leucemia mieloidă, glioblastomul și carcinomul pulmonar cu celule mici.

[Chen și colab., 2014]

Țintire în terapia anticanceroasă

Datorită faptului ca oncogena c-Myc este implicată în numeroase tumori umane, acest lucru face ca aceasta să reprezinte o țintă terapeutică în dezvoltarea de strategii în terapia anticanceroasă. O strategie este țintirea transcrierii c-Myc prin interferarea cu transducția semnalului dependentă de cromatină, în cazul leucemiei limfoblastice acută de celule B și T și la carcinomul pulmonar cu celule mici, prin utilizarea unui inhibitor selectiv cu molecule mici al proteinelor BET (bromodomain), care se asociază cu cromatina acetilată și crește concentrația activatorilor al transcrierii care o și activează.

[Miller și colab., 2012]

O altă strategie este dezvoltarea unor inhibitori moleculari mici c-Myc/Max/ADN care blocheaza transcrierea indusă de c-Myc. Compuși precum MYRA-A (Fig. 33 ) și NSC308848, au arătat faptul că au o selectivitate mai ridicată în ceea ce privește domeniul de legare a ADN cu cMyc/Max, astfel pot suprima exprimarea c-Myc și induce apoptoza.

[Chen și colab., 2014]

Figura 33. Blocarea legării Myc/Max la ADN cu Myra

(Lz- motivul fermoar-leucină; TAD-domneniul de transactivare a Myc)

www.dovepress.com

S-au cercetat terapiile pe bază de oligonucleotide antisens (ASO), în care s-a încercat inhibarea exprimării Myc. Prin folosirea ASO s-a determinat reducerea proliferării, inducerea diferențierii, blocarea progresiei celulelor leucemiei și inhibarea proliferării celulelor T. De asemenea, acizii nucleici peptidici (PNAs) reprezintă o strategie pentru terapia anticanceroasă, deoarece aceștia au o perioadă mai mare de acțiune comparativ cu ASO. Un exemplu este tratamentul celulelor neuroblastomului uman cu acești acizi peptidici, care au fost conjugați cu o peptidă ce conține un semnal de localizare nucleară (NLS) împotriva c-Myc, care a dus la scăderea ARNm, reducerea proliferării celulare și încetarea creșterii tumorii. (Fig. 34 )

[Vita și Henriksson 2006]

Figura 34. Terapia cu oligonucleotide antisens

www.pharmamirror.com

Proteinele Claudin

Proteinele Claudin sunt joncțiuni strânse (TJ) care, împreună cu joncțiunile de aderare și desmosomii formează complexe joncționale apicale. Familia de proteine claudin este alcătuite din 24 de proteine transmembranare. Gradul ridicat de organizare celular care apare, în mod obișnuit în țesuturile diferențiate, de cele mai multe ori se pierde în cancer. În celulele tumorale joncțiunile strânse au o funcție anormală, cu scăderea diferențierii și polarității celulelor.

[Ouban și Ahmed 2010]

Prin pierderea integrității a joncțiunilor strânse, este posibilă difuzia nutrienților și a altor factori esențiali supraviețuirii și proliferării celulelor tumorale. În același timp, prin scăderea polarității și diferențierii celulare, elemente importante pentru metastază, celulele individuale trebuie să părăsească situsul primar și să pătrundă în vasele de sânge pentru a putea ajunge la situsurile mai îndepărtate. Distrugerea joncțiunilor funcționale strânse în cancer poate avea un mare impact în ceea ce privește controlul creșterii tumorilor.

[Morin 2005]

Exprimarea proteinelor claudin este frecvent modificată în mai multe tipuri de cancer, de exemplu, în cancerul de sân și de colon, prin modificări ale proteinei claudin 1, în cancerul de sân invaziv, cancerele ale capului și gâtului, prin modificări ale proteinei claudin 7. Totodată, se mai întâlnesc modificări ale proteinelor claudin și în cazul cancerului de ovar și de prostată, prin supraexprimări ale proteinelor claudin 3 și 4.

[Ouban și Ahmed 2010]

Localizarea și funcția proteinelor claudin este influențată de diverse modificări post-sintetice, de exemplu, fosforilarea, dar și de intereacțiunile cu diferite proteine. Fosforilarea acestor proteine se presupune ca este implicată în reducerea funcției joncțiunilor strânse. De exemplu, în cazul cancerului de sân, proteina claudin 4 este fosforilată de către protein kinaza C, care a dus la translocarea proteinei claudin 4 din membrană în citoplasamă, care a culminat cu scăderea funcției joncțiunilor strânse. De asemenea, prin fosforilările proteinei claudin 3, în celulele ovariene de către protein kinaza dependentă de AMPc (PKA) și a proteinelor claudin 1, 2, 3, 4 care sunt fosforilate de serin/treonină protein kinaza (WNK4), s-au modificat activitățile funcționale ale joncțiunilor strânse.

[Valle și Morin 2010]

Țintă în terapia anticanceroasă

Supraexprimarea proteinelor claudin în multe tipuri de cancere, dar și localizarea lor în membrana plasmatică le face candidate cu un mare potențial în dezvoltarea de terapii anticanceroase. Deoarece aceste proteine transmembranare au două bucle extracelulare mari (Fig. 35 ), o strategie este crearea de anticorpi din componentele extracelulare a proteinelor claudin 3,4, care se leagă de suprafața celulară a multor celule canceroase, de exemplu, anticorpul anti-proteina claudin 3 scFv H6, care se leagă celulele canceroase ovariene și endometriale sau anticorpul anti-proteina claudin 4 , care ar putea fi un agent radioterapeutic în cancerul pancreatic.

[Valle și Morin 2010]

Proteinele claudin 3 și 4 sunt receptori ai enterotoxinei de Clostridium perfringens (CPE). CPE este o polipeptidă care, prin legarea la receptorii săi, determină citoliza, datorită efectelor pe care le are asupra permeabilității membranei. Prin supraexprimări ale proteinelor claudin 3 și 4 în cancer, se pot dezvolta terapii inovatoare care să utilizeze CPE. S-au realizat studii în care celulele de adenocarcinom de prostată, care au exprimat proteinele claudin 3 și 4, au prezentat sensibilitate la citoliza mediată de CPE. De asemenea, și celulele canceroase de sân, de ovar, celulele pancreatice au prezentat sensibilitate la tratamentul cu CPE.

[Morin 2005]

Figura 35. Structura proteinelor claudin. Țintire în terapie

www.cancerres.aacrjournals.org

Proteinele de specificitate (Sp)

Proteinele de specificitate (Sp1-9) sunt factori de transcriere ai familiei Sp/Krüppel și sunt implicate în creșterea și metastazarea multor tipuri de cancer prin reglarea exprimării genelor ciclului celular și a factorului de creștere endotelial vascular (VEGF).

Sp1 este una dintre cele mai importante proteine de specificitate, fiind implicată în diverse procese biologice, cum este tumorigeneza, prin modularea exprimrii genelor țintă, care includ genele oncogene și supresoare tumorale, angiogeneza, progresia ciclului celular, inflamația și senescența.

[Chang și Hung 2012]

Sp1 este o proteină care leagă ADN-ul specific secvenței care este importantă în transcrierea pentru multe gene care sunt esențiale pentru reglarea mai multor aspecte ale supraviețuirii celulelor tumorale, dezvoltării tumorii și angiogeneză, iar exprimări aberante ale Sp1 se întâlnesc în diferite tipuri de cancer.

[Wang și colab., 2003]

Prezența unui număr mare de situsuri de legare Sp1 explică funcția pe care o are Sp1 ca activator sau represor în creșterea celulelor, diferențierea lor, apoptoza și deteriorarea ADN. Nivele crescute de Sp1 se întâlnesc într-o varietate de cancere, printre care, cancerul de sân, de colon, de pancreas, de vezică urinară și prostată.

[Bajpai și Nagaraju 2017 ]

Sp1 este implicat în progresia și metastazarea cancerului colorectal datorită nivelelor crescute de Sp1 în țesuturile cancerului de colon. În Fig. 36 este explicată reglarea genelor prin Sp1 în cancerul colorectal. Exprimarea Sp1 poate fi dereglată prin inducerea speciilor reactive de oxigen (ROS) datorită stimulării supresoarelor Sp de transcriere (ZBTB10 și ZBTB4), prin dereglări a miARN (miR-27a, miR-20a), de asemenea și prin modificări post-sintetice (metilare, acetilare,fosforilare). Toate aceste procese ale Sp1 duc la inhibarea supresoarelor tumorale, inducerea de factori tumorali, care implicit duc la creșterea și metastazarea cancerului colorectal.

[Bajpai și Nagaraju 2017]

Figura 36. Reglarea genelor prin Sp1 în cancerul colorectal

www.croh-online.com

Țintă în terapia anticanceroasă

Tratamentul cu sulindac și metaboliții săi (sulfură de sulindac, sulfonă de sulindac) este utilizat în scopul inhibării exprimării Sp1 în cancerul de colon. De exemplu, sulfura de sulindac, a redus exprimarea mai multor gene implicate în supraviețuirea celulelor canceroase, proliferare și angiogeneză, acestea sunt BCL-2, receptorul de creștere eidermal (EGFR), ciclina D1, factorul de creștere endotelial vascular (VEGF). Totodată, acest compus a contribuit la inducerea speciilor reactive de oxigen (ROS), dar și la scăderea nivelului de miARN-27a în celulele cancerului de colon, care a culminat cu dereglări în supresorul Sp de transcriere ZBTB10. Toate aceste procese au dus la scăderea exprimării Sp1 în celulele canceroase de colon.

[Li și colab., 2015]

O altă metodă în terapia anticanceroasă este tratamentul cu penfluridol, care are ca și scop inducerea creșterii tumorale, inducerea apoptozei și inhibarea migrării celulelor canceroase în cancerul de sân. Tratamentul cu penfluridol a redus, de asemenea, factorii de transcripție Sp1,Sp 3, Sp4 prin dereglarea epigenetică miARN reglate prin c-Myc, ca miARN27a și miARN20a, dar și a represorilor transcrierii Sp ZBTB10 și ZBTB4. (Fig. 37)

[Hedrick și colab., 2016]

Figura 37. Agenți anticancer care induc ROS și dereglează exprimarea Sp

www.aimsci.org

Bacteriile- o nouă strategie în lupta împotriva cancerului

Rezistența la terapiile convenționale împotriva diferitelor forme avansate de cancer a determinat necesitatea în dezvoltarea unor terapii alternative anticanceroase. De-a lungul anilor, bacteriile au dovedit a avea un mare potențial în combaterea reușită a cancerului. Acestea, fie că sunt specii nepatogene vii, atenuate sau modificate genetic, reprezintă o sursă importantă de gene anticanceroase specifice tumorilor, toxine, polizaharide pentru sinteza de nanomedicamente, vectori de administrare a genelor și au capacitatea de a se înmulțească selectiv în tumori și astfel să inhibe creșterea lor.

[Nair și colab., 2014; Patyar și colab., 2010]

Mediul tumoral scapă de efectele sistemului imunitar al gazdei, datorită imunogenității sale scăzute, ceea ce duce la acceptarea lor ca autogene de către organism. În astfel de condiții, bacteriile pot acționa ca agenți puternici de stimulare a imunității.

Speciile de Clostridium spp. au fost considerate candidați ideali în dezvoltarea de terapii, deoarece au existat studii în care această specie au proliferat în regiunile necrotice ale tumorilor în comparație cu țesutul normal, însă datorită faptului ca prezentau toxicitate mare în celulele normale, această idee a fost abandonată. S-a încercat, în schimb, atenuarea unei tulpini de C. novyi, denumită C. novyi-NT prin eliminarea unei gene ce codifică toxina letală; astfel sporii tulpinei atenuate au germinat și au dus la liza celulelor tumorale în regiunile necrotice ale tumorii și au inițiat reacții inflamatorii care au dus la distrugerea lor.(Fig. 38 ) În același timp, inflamația poate să contribuie la distrugerea tumorii și prin eliberarea de specii reactive de oxigen, proteaze, citokine tumorale. Mai mult, datorită acestei inovații, s-a dezvoltat terapia bacteriolitică combinată (COBALT), în care sporii tulpinei atenuate de C. novyi-NT au fost combinați cu agenți chimioterapeutici, cum este mitomicina-C sau docetaxel.

[Nair și colab., 2014; Agrawal și colab., 2004]

Figura 38. Acțiunea C. novyi-NT în tumori

www.pnas.org

O altă specie studiată pentru terapia anticanceroasă este și Salmonella typhymurium. Tulpina derivată din această specie, numită VNP20009, este utilizată în tratamentul cancerului de prostată, fibrosarcomul pulmonar, cancerul de sân. Se mai cercetează și alte tulpini de bacterii, ca agenti antitumorali, cum sunt speciile de Salmonella chloreaesuis, Listeria monocytogens, Escherichia coli.

[Patyar și colab., 2010]

Chimioterapia poate reprezenta rezistența la răspunsul terapeutic în regiunea hipoxică a celulei proliferative, datorită deficienței angiogenezei. Prin urmare, o provocare a tratamentelor chimioterapeutice este furnizarea continuă de medicamente pentru celulele țintă, motiv pentru care s-a încercat dezvoltarea unui sistem de administrare de medicamente prin niște microstructuri denumite bacterioroboți (microroboți pe bază de bacterii). Bacterioboții sunt alcătuiți dintr-o combinație de granule de polistiren și bacterii flagelate cu motilitate ridicată (E.coli, Salmonella thyphimurium, Serratia marcescens etc.). Aceste bacterii permit microrobotului să se deplaseze spre tumori (cancerul de sân, cancerul colorectal), acționând ca un agent terapeutic, care furnizează cantități mari de medicamente ( ex. Paclitaxel).

În Fig. 39 este prezentat un model de bacteriobot, ce conține o tulpină din specia S. thyphyimurium, microfilamente din polietilenglicol (PEG). Bacteria a fost atașată de microstructură datorită afinității pe care o are biotina cu streptavidina. Biotina este o moleculă mică care se găsește în toate organismele vii și astfeș poate fi ușor conjugată cu alte proteine, cum este streptavidina.

[Park și colab., 2013]

Figura 39. Modelul unui bacteriobot

www.nature.com

www.researchgate.net

În prezent, în tratamentul diverselor tipuri de cancer se utiliează proteine cu greutate moleculară mică, inclusiv cele produse de către microorganisme. În Tabelul 7 sunt prezentate peptidele de bază de origine bacteriană, cu aplicabilitate în terapia anticanceroasă.

[Karpiński și Szkaradkiewicz 2013]

Tabel 7. Peptide cu aplicabilitate în terapia anticanceroasă

CONCLUZII

În această lucrare de disertație s-a urmărit prezentarea principalelor aspecte privind modificările post-sintetice întâlnite la proteine.

Metodele tehnologice avansate precum spectrometria de masă, imunohistochimia, sunt disponibile din ce în ce mai mult pentru identificarea și caracterizarea acestor tipuri de modificări ale proteinelor.

S-a încercat evidențierea cât mai precisă a modificărilor post-sintetice (acetilare, fosforilare, metilare, glicozilare, nitrare și ubiquitinare) și rolul pe care îl au proteinele modificate în transcrierea genetică, activitățile enzimatice, procesele de semnalizare celulară pe care celulele le manifestă în timpul transformării lor pentr a deveni celule neoplazice, prin utilizarea de figuri, scheme și tabele.

Datorită rolului pe care îl au proteinele modificate în patologia bolii și prin înțelegerea mecanismelor de acțiune în progresia cancerului, acestea devin obiective pentru dezvoltarea de medicamente/terapii antitumorale.

BIBLIOGRAFIE

Adjei A.A., Hidalgo M., 2005, Intracellular signal transduction pathway proteins as targets for cancer therapy, J. Clin. Oncol., 23(23), pp. 5386-5403.

Agrawal N., Bettegowda C., Cheong I., et al., 2004, Bacteriologic therapy can generate a potent immune response against experimental tumors, PNAS, 101(42), pp. 15172-15177.

Ahronian L.G., Corcoran R.B., 2017, Strategies for monitoring and combating resistance to combination kinase inhibitors for cancer therapy, Genome Medicine, 9(37), pp. 1-12.

Arora A., Scholar E.M., 2005, Role of tyrosine kinase inhibitors in cancer therapy, Perspectives in Pharmacol., 315(3), pp. 971-979.

Baccarani M., Pileri S., Steegmann J.L., Muller M., Soverini S., Dreyling M., 2012, Chronic myeloid leukemia: ESMO Clinical Guidelines for diagnosis, treatment and follow-up, Ann. Oncol., 23(7), pp. 72-77.

Bajpai R., Nagaraju G.P., 2017, Specificity protein 1: Its role in colorectal cancer progression and metastasis, Critical Rev. Oncol/Hematol., 113, pp. 1-7.

Barnes P.J., Celli B.R., 2009, Systemic manifestations and comorbidities of COPD, Eur. Respir. J., 33, pp. 1165-1185.

Basakran N.S., 2015, CD44 as a potential diagnostic tumor marker, Saudi Med. J., 36(3), pp. 273-279.

Capello F., Conway de Macario E., Marasà L., Zummo G., Macario A.J.L., 2008, Hsp60 expression, new locations, functions and perspectives for cancer diagnosis and therapy, Cancer Biology & Therapy, 7(6), pp. 801-809.

Chang W.C., Hung J.J., 2012, Functional role of post-translational modifications of Sp1 in tumorigenesis, J. Biosci., 19(94), pp. 1-7.

Chen B., Wu Y., Tanaka Y., Zhang W., 2014, Small molecules targeting c-Myc oncogene: Promising anti-cancer therapeutics, Int. J. Biol. Sci., 10(10), 1084-1096.

Chen D., Frezza M., Schmitt S., Kanwar J., Dou Q.P., 2011, Bortezomib as the first proteasome inhibitor anticancer drug: current status and future perspectives, Curr. Cancer Drug Targets, 11(3), pp. 239-253.

Choudhari S.K., Chaudhari M., Bagde S., Gadbail A.R., Joshi V., 2013, Nitric oxide and cancer: a review, World J. Surgical Oncol., 11(118), pp. 1-11.

Ciocca D.R., Calderwood S.K., 2005, Heat shock proteins in cancer: diagnostic, prognostic, predictive, and treatment implications, Cell Stress & Chaperones, 10(2), pp. 86-103.

Ciutan M., Sasu C., Skiba M., 2010, Nanomedicine-the future medicine, Management in Health, 14(1), pp. 17-22.

Daugaard M., Rohde M., Jäättelä M., 2007, The heat shock protein 70 family: Highly homologous proteins with overlapping and distinct functions, FEBS Letters, 581, pp. 3702-3710.

De Sanctis F., Sandri S., Ferrarini G., Pagliarello I., et al., 2014, The emerging immunological role of post-translational modifications by reactive nitrogen species in cancer microenvironment, Front. Immunol., 5(69), pp. 1-12.

Di Cerbo V., Schneider R., 2013, Cancers with wrong HATs: the impact of acetylation, Briefings in Functional Genomics, 12(3), pp. 231-243.

Dwarakanath B.S., Verma A., Bhatt A.N., Parmar V.S., Raj H.G., 2008, Targeting protein acetylation for improving cancer therapy, Indian J. Med. Res., 128, pp. 13-21.

Gabay M., Li Y., Felsher D.W., 2014, MYC Activation is a hallmark of cancer initiation and maintenance, Cold Spring Harb. Prospect Med., 4, pp. 1-13.

Gallo L.H., Ko J., Donogue D.J., 2017, The importance of regulatory ubiquitination in cancer and metastasis, Cell Cycle, 16(7), pp. 634-648.

Gong F., Chiu L.Y., Miller K.M., 2016, Acetylation reader protein: Linking acetylation signaling to genome maintenance and cancer, PloS Genet., 12(9), pp. 1-23.

Hamamoto R., Nakamura Y., 2016, Dysregulation of protein methyltransferases in human cancer: An emerging target class for anticancer therapy, Cancer Sci., 107, pp. 377-384.

Häuselmann I., Borsig L., 2014, Altered tumor-cell glycosylation promotes metastasis, Front. Oncol., 4(28), pp. 1-15.

Hedrick E., Cheng Y., Jin U.H., Kim K., Safe S., 2016, Specificity protein (Sp) transcription factors Sp1, Sp3 and Sp4 are non-oncogene addiction genes in cancer cells, Oncotarget, 7(16), pp. 22245-22256.

Hedrick E., Li X., Safe S., 2017, Penfluridol represses integrin expression in breast cancer through induction of reactive oxygen species and downregulation of Sp transcription factors, Molecular Cancer Therapeutics, 16(1), pp. 205-216.

Ho W.L., Hsu W.M., Huang M.C., Kadomatsu K., Nakagawara A., 2016, Protein glycosylation in cancers and its potential therapeutic applications in neuroblastoma, J. Hematol &Oncol., 9(100), pp. 1-15.

Idikio H.A., 2009, Immunohistochemistry in diagnostic surgical pathology: contributions of protein life-cycle, use of evidence-based methods and data normalization on interpretations of immunohistochemical stains, Int. J. Clin. Exp. Pathol., 3(2), pp. 169-176.

Jego G., Hazoumé A., Seigneuric R., Garrido C., 2013, Targeting heat shock proteins in cancer, Cancer Letters, 332, pp. 275-285.

Jin H., Zangar R.C., 2009, Protein modifications as potential biomarkers in breast cancer, Biomarker Insights, 4, pp. 191-200.

Kar G., Keskin O., Fraternali F., Gursoy A., 2013, Emerging role of the ubiquitin-protesome system as drug targets, Current Pharmaceutical Design, 19(00), pp. 1-15.

Karpiński T.M., Szkaradkiewicz A.K., 2013, Anticancer peptides from bacteria, Bangladesh J. Pharmacol., 8, 343-348.

Karve T.M., Cheema A.K., 2011, Small changes huge Impact: The role of protein post-translational modifications in cellular homeostasis and disease, J. Amino Acids, 2011, pp. 1-13.

Kim Y.Z., 2015, Protein methylation and demethylation in cancer, Int. J. Neurol. Research, 1(3), 129-140.

Knickelbein K., Zhang L., 2015, Mutant KRAS as a critical determinant of the therapeutic response of colorectal cancer, Genes & Diseases, 2, pp. 4-12.

Kriegsmann M., Arens N., Endris V., Weichert W., Kriegsmann J., 2015, Detection of KRAS, NRAS, BRAF by mass spectrometry- a sensitive, reliable, fast and cost-effective technique, Diagnostic Pathology, 10(132), pp. 1-11.

Li M., Song L., Qin X., 2010, Glycan changes: cancer metastasis and anti-cancer-vaccines, J. Biosci., 35, pp. 665-673.

Li X., Pathi S.S., Safe S., 2015, Sulindac sulfide inhibits colon cancer cell growth and downregulates specificity protein transcription factors, BMC Cancer, 15(974), pp. 1-11.

Li Y., seto E., 2016, HDACs and HDAC inhibitors in cancer development and therapy, Cold Spring Harb. Prospect Med., 6, pp. 1-34.

Lu M., Faull K., Whitelegge J.P., He J., et al., 2007, Proteomics and mass spectrometry for cancer biomarker discovery, Biomarker Insights, 2, pp. 347-360.

Manash K.P., Mukhopadhyay A.K., 2004, Tyrosine kinase-role and significance in cancer, Int. J. Med. Sci., 1(2), pp. 101-115.

Manion M.K., Hockenbery D.M., 2003, Targeting Bcl-2-related proteins in cancer therapy, Cancer Biol. & Therapy, 2(4 Suppl.1), pp. 105-114.

Martin T.A., Ye L., Sanders A.J., Lane J., Jiang W.G., 2013, Cancer invasion and metastasis: Molecular and cellular perspective, Madame Curie Bioscience Database, pp. 1-54.

Masri F., 2010, Role of nitric oxide and its metabolites as potential markers in lung cancer, Ann. Thoracic Medicine, 5(3), pp. 123-127.

Mattingly R.R., 2013, Activated Ras as a therapeutic target: constraints on directly targeting Ras isoforms and wild-type versus mutated proteins, ISRN Oncology, 2013, pp. 1-14.

Midgley R.S., Kerr D.J., 2002, Ras as a target in cancer therapy, Critical Rev. Oncol/Hematol., 44(2), pp. 109-120.

Miller D.M., Thomas S.D., Islam A., Muench D., Sedoris K., 2012, c-Myc and cancer metabolism, Clin. Cancer Res., 18(20), pp. 5546-5553.

Mitra A., Shevde L.A., Samant R.S., 2008, Multi-faced role of HSP40 in cancer, Clin. Exp. Metastasis, 26, pp. 559-567.

Morin P.J., 2005, Claudin proteins in human cancer: Promising new targets for diagnosis and therapy, Cancer Res., 65(21), pp. 9603-9606.

Moser C., Lang S.A., Stoeltzing O., 2009, Heat-shock protein 90 (Hsp90) as a molecular target for therapy of gastrointestinal cancer, Anticancer Research, 29, pp. 2031-2042.

Murphy M.E., 2013, The HSP70 family and cancer, Carcinogenesis, 34(6), pp. 1181-1188.

Nair N., Kasai T., Seno M., 2014, Bacteria: prospective savior in battle against cancer, Anticancer Research, 34, pp. 6289-6296.

Neckers L., 2007, Heat shock protein 90: the cancer chaperone, J. Biosci., 32, pp. 517-530.

Orlowski R., Dees E.C., 2002, The role of the ubiquitination-proteasome pathway in breast cancer. Applying drugs that affect the ubiquitin-proteasome pathway to the therapy of breast cancer, Breast Cancer Research, 5(1), pp. 1-7.

Ouban A., Ahmed A.A., 2010, Claudins in human cancer: A review, Histol. Histopath., 25, pp. 83-90.

Park S.J., Park S.H., Cho S., Kim D.M., et al., 2013, New paradigm for tumor theranostic methodology using bacteria-based microrobot, Scie. Reports, 3(3394), pp. 1-7.

Patyar S., Joshi R., Byrav D.S.P., Prakash A., Das B.K., 2010, Bacteria in cancer therapy: a novel experimental strategy, J. Biosci., 17(21), pp. 1-9.

Petsko G.A., Ringe D., 2004, Protein Structure and Function, Editura New Science Press Ltd., London, pp. 126-127.

Poulard C., Corbo L., Le Romancer M., 2016, Protein arginine methylation/demethylation and cancer, Oncotarget, 7(41), pp. 67532-67550.

Powers A.D., Palecek S.P., 2012, Protein analytical assays for diagnosing, monitoring, and choosing treatment for cancer patient, J. Healthc. Eng., 3(4), 503-534.

Rajasekharan S.K., Raman T., 2013, Ras and Ras mutations in cancer, Cen. Eur. J. Biol., 8(7), pp. 609-624.

Ropero S., Esteller M., 2007, The role of histone deacetylases (HDACs) in human cancer, Molec. Oncol., 1, pp. 19-25.

Sacks J.D., Barbolina M.V., 2015, Expression and function of CD44 in epithelial ovarian carcinoma, Biomolecules, 5, pp. 3051-3066.

Saxena N., Lahiri S.S., Hambarde S., Tripathi R.P., 2009, RAS: Target for cancer therapy, Cancer Investig., 26(9), pp. 948-955.

Shangary S., Wang S., 2008, Targeting the MDM2–p53 interaction for cancer therapy, Clin. Cancer Res., 14(17), pp. 5318-5324.

Shchemelinin I., Šefc L., Nečas E., 2006, Protein kinases, their function and implication in cancer and other diseases, Folia Biologica (Praha), 52, pp. 81-101.

Sheta R., Bachvarov D., 2014, Role of aberrant glycosylation in ovarian cancer dissemination, Biomed. Reviews, 25, pp. 83-92.

Shi D., Grossman S.R., 2010, Ubiquitin becomes ubiquitinous in cancer. Emerging roles of ubiquitin ligases and deubiquitinases in tumorigenesis and as therapeutic targets, Cancer Biology & Therapy, 10(8), pp. 737-747.

Shi Z., Stack M.S, 2015, An update on immunohistochemistry in translational cancer research, Cancer Transl. Med., 1(4), pp. 115-122.

Singh B., Zhang G., Hwa Y.L. Li J., et al., 2010, Nonhistone protein acetylation as cancer therapy targets, Expert Rev. Anticancer Ther., 10(6), pp. 935-954.

Soo E.T.L., Yip G.W.C., Lwin Z.M., Kumar S.D., Bay B.H., 2008, Heat shock proteins as novel therapeutic targets in cancer, In Vivo, 22, pp. 311-316.

Stowell S.R., Ju T., Cummings R.D., 2015, Protein Glycosylation in Cancer, Annu. Rev. Pathol., 10, pp. 473-510.

Tucillo F.M., Laurentiis A., Palmieri C., Fiume G. et al., 2014, Aberrant glycosylation as biomarker for cancer: Focus on CD43, BioMed Research Int., 2014, pp. 1-14.

Vahora H., Khan M.A., Alalami U., Hussain A., 2016, The potential role of nitric oxide in halting cancer progression through chemoprevention, J. Cancer Prevention, 21(1), pp. 1-12.

Valle B., Morin P. J., 2010, Claudins, Current Topics in Membranes, 1st edition, 65, Editura Academic Press of Elsevier, San Diego, USA, pp. 294-318.

Van der Merwe D.E., Oikonomopoulu K., Marshall J., Diamandis E.P., 2007, Mass spectrometry: uncovering the cancer proteome for diagnostics, Adv. Cancer Res., 96, pp. 23-50.

Vannini F., Kashfi K., Nath N., 2015, The dual role of iNOS in cancer, Redox Biol., 6, pp. 334-343.

Vita M., Henriksson M., 2006, The Myc oncoprotein as a therapeutic target for human cancer, Semin. Cancer Biol., 16, pp. 318-330.

Vlahovic G., Crawford J., 2003, Activation of tyrosine kinases in cancer, The Oncologist, 8, pp. 531-538.

Watson M.E., Diepeveen L.A., Stubbs K.A., Yeoh G.C., 2015, Glycosylation-related diagnostic and therapeutic drug target markers in Hepatocellular Carcinoma, J. Gastrointestin Livers Dis., 24(3), pp. 349-357.

Weathington N.M., Mallampalli R.K., 2014, Emerging therapies targeting the ubiquitin proteasom system in cancer, J. Clin. Invest., 124(1), pp. 6-12.

Wei W., Lin H.K., 2012, The key role of ubiquitination and sumoylation in signaling and cancer: a research topic, Front. Oncol., 2(187), pp. 1-2.

Yan Y., Zuo X., Wei D., 2015, Concise Review: Emerging role of CD44 in cancer stem cells: A promising biomarker and therapeutic target, Stem Cells Transl. Med., 4(9), pp. 1033-1043.

Zoubeidi A., Gleave M., 2012, Small heat shock proteins in cancer therapy and prognosis, Int. J. Biochem. & Cell Biol., 44(2012), pp. 1646-1656.

** https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK21177/

** https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK9843/

** https://www.nature.com/scitable/topicpage/protein-structure-14122136

** http://www.particlesciences.com/docs/technical_briefs/TB_8.pdf

** http://chemistry.tutorvista.com/biochemistry/structure-of-proteins.html

**https://www.researchgate.net/figure/282790336_fig4_Figure-5-Protein-secondary-structure-showing-a-helix

**www.umfiasi.ro/masterate/Suporturi%20de%20curs/Facultatea%20de%20Bioinginerie/procese%20biocaralitice.pdf

** https://biochemianzunited.wordpress.com/2014/03/04/289/

** https://themedicalbiochemistrypage.org/protein-modifications.php#folding

**www.aun.edu.eg/molecular_biology/Final%20Protein/Korayem/Korayem_Lectures/01%20Protein%20Structure.pdf

**https://www.thermofisher.com/ro/en/home/life-science/protein-biology/protein-biology-learning-center/protein-biology-resource-library/pierce-protein-methods/overview-post-translational-modification.html

**http://news.berkeley.edu/2014/10/16/new-front-in-war-on-alzheimers-other-protein-folding-diseases/

** www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK9843/figure/A1202/?report=objectonly

** http://www.nature.com/nrc/journal/v1/n3/fig_tab/nrc1201-194a_F2.html

** www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC1074718/pdf/ijmsv01p0101.pdf

** https://www.synevo.ro/gena-de-fuziune-bcr-abl1-detectie-cantitativa/

** http://leukd.blogspot.ro/p/ignorance-is-torture.html

** www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK9843/figure/A1213/?report=objectonly

** http://www.nature.com/nrm/journal/v8/n4/fig_tab/nrm2143_F1.html

** http://www.nature.com/nrc/journal/v4/n1/full/nrc1251.html

** https://www.smj.org.sa/index.php/smj/article/view/smj.2015.3.9622/7107

** http://www.hshc.com.tw/en/hdd_hacd.php

** www.hsp40.com/drug-discovery/

**www.ncbi.nlm.nih.gov/core/lw/2.0/html/tileshop_pmc/tileshop_pmc_inline.html?title=Click%20on%20image%20to%20zoom&p=PMC3&id=4819660_jcp-21-001f1.jpg

** http://erj.ersjournals.com/content/erj/33/5/1165/F2.large.jpg

** http://www.medscape.org/viewarticle/416521_13

** http://www.nanowerk.com/spotlight/spotid=39061.php

** https://www.researchgate.net/figure/6989561_fig1_Figure-2-Multicolor-

quantum-dot-QD-capability-of-QD-imaging-in-live-animals

**www.ncbi.nlm.nih.gov/core/lw/2.0/html/tileshop_pmc/tileshop_pmc_inline.html?title=Click%20on%20image%20to%20zoom&p=PMC3&id=3306611_nihms362025f1.jpg

** http://www.wikiwand.com/en/Von_Hippel%E2%80%93Lindau_disease

** http://www.cumc.columbia.edu/publications/in-vivo/Vol1_no8_apr29_02/

** http://www.pnas.org/content/103/6/1659/F1.expansion.html

** https://www.spandidos-publications.com/ijo/46/3/893?text=fulltext

**www.abnova.com/support/resources.asp?switchfunctionid={F4AA1C9B-9EA1-4669-B9C2-305BDFB08F89}

**www.nature.com/modpathol/journal/v21/n2s/fig_tab/modpathol200834f3.html#figure-title

** http://www.isogen-lifescience.com/cancer-antigen-elisa-kits

**http://journals.prous.com/journals/servlet/xmlxsl/pk_journals.xml_summary_pr?p_JournalId=2&p_RefId=712566&p_IsPs=N

**https://genomemedicine.biomedcentral.com/articles/10.1186/s13073-017-0431-3

** http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S235230421400035X#fig2

**https://www.ncbi.nlm.nih.gov/core/lw/2.0/html/tileshop_pmc/tileshop_pmc_inline.html?title=Click%20on%20image%20to%20zoom&p=PMC3&id=4400806_nihms-231386-f0007.jpg

**https://www.dovepress.com/cr_data/article_fulltext/s60000/60495/img/fig4.jpg

**http://www.pharmamirror.com/knowledge-base/pharmaceutical-dictionary/

antisense-drugs-definition-technology-mechanism/

** http://cancerres.aacrjournals.org/content/canres/65/21/9603/F1.large.jpg

** http://www.croh-online.com/article/S1040-8428(16)30404-8/fulltext

** http://www.aimsci.org/wp-content/uploads/2016/03/fig1.png

** http://www.pnas.org/content/101/42/15172/F8.expansion.html

** https://www.nature.com/articles/srep03394/figures/1?proof=true

** https://www.researchgate.net/figure/283001635_fig1_Fig-1-Schematicdiagram

-of-a-therapeutic-liposomal-bacteria-based-microrobot-DL