Se spune că mierea datează din vremea în care omul preistoric a descoperit primul fagure și că reprezintă pricipalul produs din apicultură. Mierea… [302632]

CUPRINS

INTRODUCERE

Se spune că mierea datează din vremea în care omul preistoric a descoperit primul fagure și că reprezintă pricipalul produs din apicultură. Mierea este rezultatul prelucrării nectarului sau a manei, [anonimizat]. Mierea în primul rând reprezintă sursa de hrană pentru albine.

[anonimizat], au fost sumerienii. Egiptenii au fost cei care au descris modul de recoltare și utilizare al mierii de albine. De-alungul timpului mierea a căpătat o mare amploare fiind folosită în diferite domenii de către oamenii timpului. [anonimizat], îndulcitor și conservant în alimentație sau medicină a fost în continuă creștere și dezvoltare până la momentul descoperirii zahărului din trestie și sfeclă.

Anul 1871 a [anonimizat] a [anonimizat] o enzimă acceleratoare în transformarea zahărului în glucoză și fructoză.

[anonimizat] o importanță deosebită. Fiind apreciată pentru proprietățile sale nutriționale dar și terapeutice. Valoarea alimentară a [anonimizat], care sunt direct asimilate de către organismul nostru ceea ce înseamnă că nu mai trebuie să treacă prin procesul de digestie. Valoarea terapeutică a mierii de albine o [anonimizat], cardio-vasculare, [anonimizat]. .

[anonimizat] (Codex Alimentarius), europene (2001/110CE) și naționale (SR 784-1 și 2/2009) .

Deoarcece calitatea mierii este importantă și cercetările legate de sortimentele de miere sunt necesare pentru a descoperi cât mai multe caracteristici ale acesteia și a [anonimizat], Activitatea antioxidantă comparativă a unor sortimente de miere monoflorală de culoare închisă: Iarbă Neagră (România) și Hrișcă (Polonia) va fi benefică și necesară pentru știință și om.

PARTEA I – STUDIU BIBLIOGRAFIC

CAPITOLUL 1

MIEREA DE ALBINE

I.1 [anonimizat], fiind considerată cel mai vechi îndulcitor natural ce posedă valori energetice ridicate.

[anonimizat].

Componenții majori sunt glucidele și apa. Glucidele reprezintă în jur de 99% [anonimizat], glucidele reducătoare sunt preponderente. Există anumite diferențe între legislația europeană și cea națională. Astfel Directiva CE nr. 2001/110/EC din 20 Decembrie 2001 prevede un minim de 60% fructoză + glucoză pentru mierile florale în timp ce SR 784-1,2/2009 prevede această valoare pentru mierea de mană și un minim de 70% pentru cea florală. Dintre diglucide zaharoza este cea mai abundentă cu un maxim admis de 5% pentru toate mierile în afară de cea de salcâm pentru care se admite maxim 10%. [anonimizat] admisă este de 15% zaharoză.

În ceea ce privește conținutul de apă maximul admis este 20% în legislația românească dar Directiva europeană admite pentru mierea de iarba neagră un maxim de 23% iar pentru cea destinată industriei alimentare și provenită din iarbă neagră chiar un maxim de 25%.

Componenții minoritari merită acest nume doar datorită procentului matematic redus în care se găsesc și anume în jur de 2%, deoarece rolul benefic al mierii pentru sănătate li se datorează lor. În acest sens se pot aminti acizii organici, proteinele, aminoacizii liberi (prolina), enzime, sărurile minerale, vitaminele și compușii cu rol antioxidant.

Acidul organic predominant este acidul gluconic care provine din glucoză și are un important rol conservant și bactericid. Conținutul de proteine din miere este diferit și depinde de proveniența acesteia, în orice caz se încadrează sub 1%. Proteinele provin din nectar sau din mană sau din secrețiile albinelor. Aminoacidul liber predominant este prolina care se găsește mai ales în mierea de iarbă neagră.

Ca și enzime în miere se găsesc invertaza, amilaza, inhibina, oxidaza, catalaza, maltaza, fosfataza, glucozoxidaza, lipaza. Amilaza este cea mai rezistentă din punct de vedere termic motiv pentru care măsurarea activității sale este un índice al tretamentelor termice și a modului de depozitare măsurat printr-un parametru numit Índice diastazic”.

Sărurile minerale conținute de miere variază în limite foarte largi”diferite la mierea florală (maximum 0,35%) și la mierea de mană, pentru care valoarea tinde spre 1%. Cele mai bine reprezentate elemente în miere, pe langă potasiu care reprezintă aproape jumătate din substanțele minerale, sunt fosforul, clorul, sulful, calciul, magneziul, fierul, manganul și siliciul. Conținutul de elemente minerale este legat direct ca și parametru de calitate cu valoarea conductivitățății, evident cu valori impuse mai mari la mierea de mană față de cea florală.

Mierea este săracă în vitamine. Astfel ea nu conține vitaminele liposolubile A și D, conține puține vitamine din grupa B (tiamina, riboflavina, pirodizina, acidul pantothenic, acidul nicotinic, biotina și acidul folic) și vitamina C.

Ca și compuși cu rol antioxidant se pot enumera în primul rând compușii fenolici care vor fi prezentați pe larg în capitolul II dar și alți compuși cum sunt vitamina C și enzyme ca peroxidaza și catalaza. Unii cercetători (Meda et al, 2005) atribuie și prolinei un rol în activitatea antioxidantă a mierii de albine.

Mierea de albine este un aliement funcțional natural deoarece:

poate fi consumată în cadrul unei diete normale

are componente biologice active

potențial de ameliorare a sănătății

reducere a riscului de boală. Pe lângă aportul energetic imediat datorat conținutului de glucoză și fructoză, direct asimilabile, ceea ce o recomandă în toate acțiunile ce necesită efort fizic și intelectual intens, mierea de albine are și însușiri terapeutice prin conținutul în enzime, vitamine, săruri, minerale și acizi organici.

Mierea de albine este indicată în:

Afecțiuni ale aparatului digestiv :
– ulcere gastro-duodenale 
– gastrite hiperacide 
– constipații 
Se recomandă doze de 150g/zi în trei reprize cu două ore înainte de masă, însoțite de ceaiuri ușor călduțe, în nici un caz reci.

Afecțiuni hepato-biliare, atât în hepatită toxică, cât și în cea infecțioasă; grație acțiunii bactericide și conținutului în glucide, mierea ameliorează funcțiile hepato-celulare și mărește rezistența organismului. Mierea se administrează ca atare sau asociată cu ceaiurile indicate în aceste afecțiuni.

Afecțiuni cardio-vasculare 
Mierea are o acțiune favorabilă asupra mușchiului cardiac și a circulației coronariene și periferice prin prezența acetil colinei (în special în mierea de floarea soarelui) dar și prin conținutul bogat în vitamine și glucide și nu în clorura de sodiu. 
Datorită îmbunătățirii circulației periferice, mierea favorizează activitățile intelectuale și atenuează efectele îmbătrânirii.

Afecțiuni ale aparatului respirator, laringite, bronșite, datorită acțiunii antimicrobiene și antiinflamatorii a mierii; se administrează ca atare sau cu lapte călduț.

Afecțiuni ale pielii, răni, eczeme, furunculoze, datorită acțiunii antimicotice și antimicrobiene; se folosește prin aplicarea directă pe suprafața rănii; dar mierea este și o hrană prețioasă pentru piele, astfel că, sub acțiunea ei, pielea devine moale și elastică; se poate folosi ca atare, sau în amestec cu albus de ou sau glicerină.

Afecțiuni ale sistemului nervos, neuroastenii. Mierea hrănește și fortifică celulele nervoase (prin conținutul în glucoză și fructoză), iar prezența vitaminelor și a sărurilor minerale ajută la intreținerea echilibrului ionilor în organism și, ca urmare, nervozitatea scade, somnul devine mai liniștit, apare senzația de vigoare. 
Dar, atenție, toate proprietățile terapeutice sunt diminuate de timp, iar prin încălzire componentele active, de valoare iți încetează activitatea, mierea transformându-se intr-un simplu depozit de zaharuri și săruri minerale cu valoare redusă, de fapt un aliment dulce fără a mai fi și un medicament prețios.

I.2 Clasificarea mierii de albine

Mierea de albine se poate clasifica după mai multe criterii. Astfel:

După originea materiei prime poate proveni din:

nectar

mană

Mierea de albine provenită din nectar este de două tipuri: miere monofloră (provenită din nectarul unei singure specii de flori) și polifloră (provenită de la mai multe specii de flori). În ceea ce privește mierea de mană, ea poate fi de origine vegetală și de origine animală. Sursa vegetală este reprezentată de seva aflată la suprafata frunzelor sau a lastarilor tineri și care se colectează direct de către albine, ȋn zona de munte mai ales când nectarul este insufucient. Mana de origine animală colectată de albine este produsul de excreție a unor insecte, mai ales afide, care consumă seva plantelor (proteinele) și elimină o excreție dulce numită mană.

După modul de prezentare se poate distinge mierea:

în faguri

extrasă

Mierea în faguri rămâne ca atare și se consumă direct. Mierea extrasă se extrage din faguri prin procedee naturale și anume se lasă la scurs sau prin procedee mecanice cum este centrifugarea după ce a fost încălzită ȋn mod controlat și limitat. În funcție de această ultimă metodă mierea poate fi fluidă sau cristalizată.

I.3 Tipuri de miere de albine

Cele mai importante tipuri de miere monoflolă din Romănia sunt:

Mierea de salcâm – este un sortiment de miere fină la gust, foarte limpede și are o proprietate important atunci când este utilizată pentru a îndulci diferite produse alimentare deoarece nu influentează/schimbă gustul produsului produsului respectiv. Încă o caracteristică important a acestui tip de miere este faptul că nu cristalizează niciodată.

Mierea de tei – acest tip de miere are o aromă foarte puternică și plăcută, având o culoare galben-aurie cu nuanțe verzui cu o textură ușor densă. Acest tip de miere are proprietăți antiseptic și se recomandă a fi consumată de persoanele suferinde de stres și insomnia.

Mierea de rapiță – are o consistență, cu un miros specific plantei din care este extras nectarul și este mai puțin dulce decât alte sortimente de miere. Are proprietăți antibacteriene și ajută la ameliorarea diferitelor probleme de sănătate precum: scăderea clesterolului sau îmbunătățirea stării pereților vasculari.

Mierea de floarea soarelui – prezintă o culoare de galben auriu până la muștar, cu o dulceță specific și miros fin și plăcut. Acest tip de miere cristalizează repede precum miere de rapiță. Este bogată în flavonoizi, substanțe minerale, uleiuri volatile. Are o proprietate deosebită datorită conținutului de lecitină pură care ajută foarte mult la dezvoltarea intelectului și la întărirea memoriei. Este recomandată persoanelor care depun effort fizic, persoanelor anemice sau persoanelor cu stări de oboseală.

Mierea de castan – acest tip de miere are o fluiditate foarte ridicată datorită raportului ridicat al fructozei comparative cu glucoza. Gustul este pronunțat și amar. Acest sortiment de miere este foarte rar întâlnit în România și de aceea costul acesteia este mai ridicat.

Miere de zmeură – este un tip de miere aparte, având o culoare ușor rozie cu un gust dulce și eferveșcent și miros parfumat.

Mierea de mană – mai poartă și denumirea de miere de pădure, este un sortiemnt de miere care nu provine din nectarul florilor ci este culeasă de către albine de pe frunzele de fag, frasin, arțar, ștejar sau de pe conifere. Este benefică în afecțiunile tubului digestive avâd un rol important în detoxifierea organismului.

Mierea polifloră – este cel mai complex tip de miere având acțiune terapeutică și este constituită din nectarul a cel puâin zeci de specii de plante medicinale până la sute. Astfel ea capătă din proprietățile fiecărei plante din care este cules nectarul ceea ce înseamnă că este cu adevărat un medicament oferit de natură.

Mierea de mentă – este una dintre cele mai bogate tipuri de mieri în vitamina C. Este benefică în tratarea problemelor digestive ușurând procesul de digestive.

I.4 Prezentarea sortimentelor de miere testate: Iarbă Neagră și Hrișcă

I.4.1 Mierea de Iarbă Neagră.

Mierea de Iarbă Neagră are o istorie veche, s-au descoperit scrieri cum că era folosită de către faraoni ca și medicament. Acest sortiment de miere este obținută din nectarul plantei Calluna Vulgaris care nu este nicidecum o iarba ci un arbust flori mici de culoare violet (fig. I.1 a). Arbustul are tulpina lemnoasă si poate să crească pâna la un metru. Este folosită și ca arbust ornamental in stâncării mai ales că există variante care ȋnfloresc iarna fig. I.1 b).. Nu este o plantă etențioasă deoarece poate să crească pe soluri părăsite, terenuri considerate dificile și pe care nu se dezvolta decât foarte rar alte plante. Este răspândit ȋn toată Europa și ȋn America de Nord (wikipedia.org).

a b

04102013143202iarba neagra.jpg http://www.afaceriardelene.ro

Figura I.1 – Arbust de Iarbă Neagră Calluna Vulgaris

Cele mai intinse zone geografice ocupate de această plantă și deci, locul ȋn care se produce cea mai mare cantitate de miere de iarbă neagră se află ȋn Marea Britanie, mai ales ȋn Scoția (Fig. I.2). Acest sortiment de miere se obține și ȋn alte zone nordice ale Europei cum sunt Norvegia și Danemarca dar și ȋn Polonia. În mod neașteptat acest sortiment se obține și în N-V Italiei, mai precis în zona montană a Piemontului. Figura I.2 prezintă exemple de miere de iarbă neagră provenită din țarile menționate.

www.johnmuircountrystore.com http://www.bienmanger.com/2F5166_Heather_Honey_From_Norway.html

lynghonning.jpg www.svansoe.dk

http://www2.ars-alimentaria.it/Prodotto?idProdotto=64783&onlyForRegione=&onlyForProvincia=

Figura I.2

Perioada de ȋnflorire și implicit de obținere pentru acest sortiment special de miere este scurtă, de circa trei săptămâni ȋn septembrie. Astfel cantitățile obținute sunt mult mai mici decât la alte sortimente ceea ce, alături de caracteristicile speciale fac ca mierea de iarbă neagră să fie cu adevărat deosebită. (http://world-of-honey.com/honey-products/heather-honey/)

Caracterizare fizico-chimică

Consistența acestui sortiment de miere este cu mult diferită de celelalte sortimente de miere fiind de tipul unui jeleu, fiind tixotropică motiv pentru care nu poate fi extrasa din faguri prin metodele obisnuite. Tixotropia mierii de iarba neagra se datoreste unei conținutului ridicat în proteine care poate ajunge la 2% din greutatea mierii. Aparatele care ajută la trecerea mierii din stare tixotropă în stare fluidă se numesc perforatoare. Ele pot fi manuale sau electrice, dotate cu baterii de ace care au distanțarea și așezarea corespunzătoare celulelor fagurilor. Acele întră în celulele fagurelui și distrug structura de gel a mierii fără a det,eriora pereții fagurelui. După această operație, mierea este adusă sub formă lichidă ceea ce permite mai departe efectuarea extracției prin forța cemtrifugă, asemănătore celorlalte procedee de extracție ale altor sortimete de miere.

O altă deosebire față de celelalte sortimente de miere, o constituie prezența unor bule mici de aer în structură ( Fig ) și faptul că nu cristalizează decât greu și specific.. Culoarea specifică este culoarea chilimbarului, având aromă asemănătoare cu cea a caramelelor, iar cu trecerea timpului, gustul mierii devine mai intens. Aroma mierii de Iarbă Neagră este foarte intensă, ușor amăruie ceea ce o încadrează în categoria produselor premium. Acidul fenilacetic este responsabil de aromă.

Fig – Bule de aer și aspectul tixotropic în mierea de iarbă neagră din Rogojel

Tixotropia mierii de iarbă neagră influențează cristalizarea acesteia. În cazul mierii de iarbă neagră cristalele cresc pe loc, de unde se poate deduce faptul că germenii de cristalizare sunt imobilizați în gel, ceea ce la o miere obișnuită se desfățoară pe toată suprafața. Are loc formarea cristalelor cu dimensiuni cuprinse între 1-2 mm în diamentru (Fig ). Aceste cristale sunt văzute ca niște aglomerări sub formă aproape sferică cu o consistență dură.

INBH IN Rog

Fig – Cristale în mierea de iarbă neagră

Culoarea mierii de iarbă neagră este o culoare medie ce tinde spre roșu și care pe scara Pfund atinge 85 de mm. În masa acestei mieri se poate observa alocuri porțiuni tulburi, acestea se datorează prezenței proteinei.

În ceea ce privește conductibilitatea electrică a mierii de iarbă neagră, aceasta este ridicată pentru o miere care provine din flori.

Conținutul de substanțe minerale de asemenea este ridicat. Ph-ul mierii de iarbă neagră este cuprins între 4 și 4,6 de unde putem deduce că aciditatea acestui sortiment de miere este medie.

În ceea ce privește conținutul de zaharuri, mierea de iarbă neagră are un conținut mult mai ridicat de fructoză în comparație cu cel de glucoză iar zaharurile secundare o cantitate mult redusă. Datorită cantității ridicate de fructoză, acest sortiment de miere dipune de o viteză mică de cristalizare.

Ceea ce o poate diferenția foarte uțor de alte sortimente de miere pe mierea de iarbă neagră o face conținutul bogat în amilază.

Acidul Phenylacetic,, dehydrovomifoliol și 4-(3-oxo-1-butynyl)-3,5,5-trimethylcyclohex-2-en-1-one sunt markeri chimici specifici pentru mierea de iarbă neagră.

O altă caracteristică deosebită a mierii de iarbă neagră o constituie conținutul neobișnuit de ridicat de apă, ceea ce în mod obișnuit se asociază cu fermentarea. De obicei conținutul de apă al acestui sortiment se situează între 19% și 23% dar s-au înregistrat și valori peste 25%. Tixotropia mierii, consistența ei de gel, împiedică albinele să elimine apa mai puternic împiedicând în același timp fermentația. (http://www.honeytraveler.com/single-flower-honey/heather-honey./ ) De altfel și legislația europeană recunoaște această particularitate și în timp ce limita maxim admisă pentru conținutul de apă în toate sortimentele de miere este 20%, pentru mierea de iarbă neagră se acceptă maxim 23% iar pentru mierea destinată industriei alimentare obținută din iarbă neagră (Calluna) maximul admis este 25% (DIRECTIVA 2001/110/CE)

În ceea ce privește spectrul polinic, polenul de Calluna este prezent de multe ori în cantități variabile inferior minimului cerut de 45% (Perssano-Oddo și Pirro, 2004). Astfel în mierea obținută în Piemont (Italia) polenul de Calluna s-a situat între 35-37%, pentru 10g miere media a fost de 20.000 granule dar deviația standard de 42.300.

Modul de extracție poate influența spectrul polinic al mierii de iarbă neagră. Utilizarea de perforatoare în miere introduce cantități semnificative de polen care are ca și origine celulele unde acesta este depozitat de către albine. Procesul de epurare este oprit datorită vâscozității anormale prin diferența de gravitate. Astfel, polenul care se așează pe suprafața mierii, în decursul a câtorva zile rămâne prizonie, care poate fi identificat prin analize al căror rezultat este schimbat. Se poate trage concluzia din cele spuse anterior că o miere de iarbă neagră pură poate conține ca polen predominant o specie diferită cum ar fi polenul de castan. O miere de iarbă neagră naturală, fără adaosuri de polen, în urma analizei polinice prin tehnica de extracție trebui să se identifice polenul de iarbă neagră dominant într-o cantitate normală. Mierea de iarbă neagră se poate deosebi de la regiune la regiune, de la țară la țară datorită floeri secundare variate a speciei Calluna Vulgaris.

Fig. I.3 – Polen de CALLUNA VULGARIS (L.) HULL – ERICACEAE

Din punct de vedere al proprietîților terapeutice, aceast sortiment de miere este benefic în:

Tratarea anemiei

Tratarea bolilor nervoase

Tratează probleme ale căilor urinare

Tratarea infecțiilor digestive dar și a celor intestinale

O ridicată proprietate antioxidantă comparativ cu alte sortimente de miere

I.4.2 Mierea de hrișcă.

Înainte de a începe să vorbesc despre mierea de hrișcă vă voi prezenta ce este de fapt hrișca. Hrișca este o plantă anuală, care atinge între 20 și 70 de cm, cu o rădăcină subțire ce prezintă mai multe ramificații laterale, tulpina de asemenea prezintă și ea ramificații și o culoare brun-roșcată, frunzele au formă de inimă, cu împrejmuirea marginilor rotunjită. Însă ce ne interesează pe noi în obținerea mierii de la planta hrișcă sunt florile. Florile sunt foarte parfumate, de culoare alb-roz și bogate în nectar, bucuria albinelor. (Fig I.4) . Nectarul se culege din iulie până în octmbrie prin plasarea stupilor la câmpul de hrișcă. http://uaglobalinc.com/buckwheat-honey.

Fig I.4 _ floarea de hrisca

Zonele geografice în care se cultivă hrișca sunt deci și cele în care acest sortiment se poate obține ca miere monoflorală. Este vorba de Statele Unite, Canada dar și Europa, de exemplu Polonia și Ucraina. Câteva exemple sunt prezentate în figura I.

Fig I. – Miere de hrisca

http://www.thevirginiatouch.com/item.aspx/gunters-buckwheat-honey-1lb/105/

http://www.thehoneybeestore.ca/Buckwheat-Honey-Ontario-p/123820.htm

http://uaglobalinc.com/buckwheat-honey/

http://www.pl.all.biz/en/buckwheat-honey-bgg1092284

Mierea de hrișcă este o miere închisă la culoare și densă, cu vâscozitate mare, asemănătoare unui jeleu.Culoarea, între 85 – 120 mm pe scara Pfund cataloghează acest sortiment în domeniul de culoare ambra spre ambră-închis după cum se observă în figura I. Culoarea se închide după colectare și după crislalizare are aspect de ceai negru. http://uaglobalinc.com/buckwheat-honey

http://uaglobalinc.com/buckwheat-honey

mieladictos.com

Figura – Scara de culoare Pfund cu exemplificare la miere

În ceea ce privește aroma, mierea de hrișcă este asemănată cel ami adesea cu melasa și are o aromă puternică de pământ. Ea este mai puțin dulce, comparativ cu mierile mai deschise la culoare dar are un conținut mai bogat în microelemente și compuși cu rol de antioxidant. Procesul de cristalizare începe greu, dar, odată pornit conduce la formarea unor cristale mari.

Antioxidanții din mierea de hrișcă, ajută organismul și îl protejează de efectele nocive provocate de radicalii liberi. Mierea de hrișcă are un rol important în prevenirea bolilor cardiovasculare și a cancerului. Un alt rol important îl are în prevenirea uitării de scurtă durată dar și a pierderii vederii.

Din punct de vedere al compoziției, pe lângă bogata prezență a antioxidanților, mierea de hrișcă mai conține vitamine din complexul B, mai exact vitaminele B2 și B3, vitamina C. Aceste vitamine au rol important terapeutic.

Proprietățile cele mai importante ale mierii de hrișcă sunt:

Acțiunea antioxidantă

Prevenția bolii fără leaac, a cancerului și a bolilor de natură cardiovasculară

Metabolizează glucidele, lipidele și proteinele din organism

Menține glucoza din sânge la un nivel redus

CAPITOLUL II

COMPUȘI CU ROL ANTIOXIDANT ÎN MIEREA DE ALBINE

II.1 Tipuri de compuși cu rol antioxidant ȋn mierea de albine: acizi fenolici si flavonoide, enzime, vit C

Antioxidanții pot fi definiți într-un sistem biologic ca: orice substanță care atunci când este prezentă în concentrații scăzute în comparație cu cea a unui substrat oxidabil ar întârzia semnificativ sau preveni oxidarea substratului. Substratul oxidabil poate fi orice moleculă care se găsește în alimente sau materiale biologice, inclusiv carbohidrati, ADN, lipide și proteine. Hrana este un sistem multicomponent compus de o varietate de biomolecule, și prin urmare, această definiție descrie bine un antioxidant.

Antioxidantii se întâlnesc în mod natural în alimente sau pot fi adăugați în mod intenționat și se pot forma în timpul prelucrării materiei prime sau a alimentului.

Utilizarea antioxidanților datează de secole chiar dacă nu au fost definiți sau explicați chimic, aceștia au fost utilizați pentru îmbunătățirea calității alimentelor prin întârzierea oxidării lipidelor.

Antioxidantii întârzie în mod specific deteriorarea, râncezirea sau modificările de culoare datorate oxidării provocate de lumină, căldură și unele metale. Cu toate acestea, compoziția mierii și activitatea antioxidantă variază foarte mult în funcție de sursa florală și factorii externi, cum ar fi de sezon și mediu.

Antioxidanții se pot clasifica în funcție de mecanismul lor de acțiune astfel:

Primari

Secundari

Cu funții multiple

În lucrarea mea vom analiza antioxidanții din mierea de albine care în urma clasificării se situează în grupa antioxidanților secundari și anume: acizii fenolici și flavonoidele, enzimele și vitamina C.

Acizii fenolici și flavoniodele. Mierea de albine este bogată în acizi fenolici și flavonoide, care prezintă o gamă largă de efecte biologice și acționează ca antioxidanți naturali. Analiza polifenolilor a fost privită ca o modalitate foarte promițătoare de a studia originile florale și geografice ale mierii.

Compușii fenolici sau polifenolii sunt una dintre cele mai importante grupări de compuși care apar la plante, în care aceștia sunt distribuiți pe scară largă. Polifenolii, de asemenea sunt produșii secundari de metabolism din plante. Flavonoidele și acizii fenolici constituie cele mai importante clase de polifenoli, cu mai mult de 5000 de compuși descriși deja în articolele de specialitate.

Cei mai importanți acizi fenolici prezenți în mierea de albine sunt acizii galic, cafeic, ferulic și benzoic (Krystyna Pyrzynska și Magdalena Biesaga, 2009), dar în afara acestora, s-au mai gasit și acid sinapic, siringic și vanilinic. Flavonoidele prezente în miere aparțin tuturor claselor și anume flavonoli, flavones, flavanone, izoflavone și antocianidine (Fig II.1)

Figura II.1 – Clase de flavonoide

(După Krystyna Pyrzynska și Magdalena Biesaga, 2009),

Mecanismul acțiunii antibacteriene al mierii păcălește parțial procesul ridicat de osmoză datorită conținutlui ridicat de zahăr și al acidității în special datorită prezenței acidului gluconic.

Fracțiunea fenolică de miere nu are activitate antibacteriană semnificativă dar s-a ajuns la concluzia că, compușii fenolici din miere pot contribui dar nu țin cont de observarea activității antibactericide non-peroxide din miere. Activitatea non-peroxidă din miere poate fi interpretată datorită absenței catalazei derivate din plante în miere. Perohidul de hidrogen poate fi distrus de țesutul catalazei atunci când mierea este utilizată precum un pansament.

Prin urmare, activitatea non-peroxidică a mierii devine foarte importantă datorită importanței mierii ca întreg și a compușilor săi fenolici ca factori antibacterieni, în special împotriva bateriilor rezistente la antibiotice.

Bobocii de Calluna vulgaris conțin compuși fenolici cum sunt: acidul chlorogenic 3-O-glucosidă, 3-O-galactosidă și 3-O-arabinosidă (Jalal et al, 1982 citat de Monschein et a;., 2010).

Enzimele. Enzimele sunt niște proteide cu ajutorul cărora are loc procesul de formare a celuleor vii într-un timp scurs la o temperatură a mediului înconjurător. Fără prezența lor reacțiile complexe de formare a celulelor vii ar avea loc la viteze foarte mici. Enzimele sunt acele substanțe care catalizează reacțiile biochimice din organism. Sunt întâlnite în microorganisme, organime vegetale și organisme animale. Datorită acestor răspândiri ele pot fi întâlnite și sub denumirea de biocatalizatori. Rolul lor esențial estea acela de a degrada substanțele din materia vie și de asemenea biosinteza.

Revenind la enzimele din miere, cele mai importante sunt:

Amilaza. Este o enzimă alcalină cu rol de catalizare a reacției de transformare a amidonului în dextrin și mai departe. Acest ferment este de o consistență foarte puternică, dacă este sub formă pură poate digera de patru milioane de ori greutatea sa în amidon. Amilaza participă și intervine în digestia glucidelor din alimente chiar începând din cavitatea bucală.

Invertaza. În cazul invertazei catalizarea are loc la reacția de hidroliză a zaharozei, scindând molecula ozidei în componentele ei și anume: fructoza și glucoza. Dacă amilaza era prezentă încă din cavitatea bucală, invertaza în corpul uman este prezentă la nivelul intestinului subțire. Invertizarea zaharozei are loc prin consum de calciu de unde reiese și faptul că zahărul rafinat este decalcifiant. Fără procesul de invertizare a zaharozei nu are loc absorbția zahărului prin monoglucide componente.

Lipsa invertazei în organismul uman duce la un grad mai mare sau mai mic de intoleranță la zaharoză, ceea ce provoacă surmenaj sau astenie. Deficitul de invertază poate fi legat și de cantitatea redusă de amilză. Aceste lipsuri duc la o digestie deficitară.(http://www.nutrigo.ro/enzimele-din-miere/)

Proteaza. Catalizarea proteazelor duce la scindarea moleculelor proteinelor. Lipsa lor în organismul uman provoacă disfuncții precum: malnutriție, alergie alimentară și carența proteică.

Pentru a ști dacă mierea pe care vrem să o achiziționăm conține sau nu enzime, ne putem orienta după gradul de zaharisire al acesteia. O miere zaharisită va avea un conținut redus sau chiar deloc de enzime.

Exsită anumiți factori care influențează activitatea enzimelor:

Temperature optimă de activitate (total distruse la 80°C)

Reacția mediului (enzimele prezente în miere au un ph cuprins între 4 și 7; ph-ul mai mic favorizează invertaza iar cel mai mare amilza)

Prezența electroliților (pot inhiba sau stimula enzimele)

Influența razelor UV

Vitamina C. Este un antioxidant ce participă active la opriprea proceselor degenerative din organism. Vitamina C este o vitamin hidrosolubilă (solubilă în apă) ceea ce o face să fie eliminată în cantități semnificative din organism. Vitamina C nu este produsă în organismul uman, ea trebuie asimilată din alimente, printer care se numără și mierea de albine. În organism vitamina C ajută la formarea colagenului care este o proteină ce ajută la susținerea cartilagiilor, oaselor, vaselor sangvine, dinților etc. Un rol esențial al vitaminei C din miere este acela de a susține sistemul imunitar.

II.2 Determinarea compușilor fenolici în mierea de albine

Compușii fenoloci au fost dovediți a avea cel mai important rol în activitatea antioxidantă a mierii de albine drept pentru care determinarea lor este deosebit de important și utilă.

Din punct de vedere analytic problema determinării fenolilor poare fi privită și condusă în două moduri:

Determinarea globală a compușilor fenolici

Determinarea tipurilor de compuși fenolici prezenți

Determinarea global se referă la determinarea cantitativă a tuturor acestor compuși prin metoda Folin-Ciocâlteu care va fi prezentată pe larg la Capitolul V – Metode, deoarece a fost aplicată concret în prezenta lucrare de disertație. Problema o constituie faptul că în acest mod rezultatul determinării trebuie exprimat, strict matematic într-un echivalent de compus fenolic în scopul comparării rezultatelor obținute. Cel mai adesea se folosește echivalarea față de acidul galic dar în studiile de specialitate se mai găsesc echivalări și în alți acizi fenolici cum este acidul cafeic, ceea ce nu este benefic deoarece împiedică compararea sortimentelor de miere din acest punct de vedere. De asemenea o astfel de determinare nu ne dă nici un fel de informație cu privire la tipurile concrete de compuși prezenți și care pot fi utilizați ca și marker al originii botanice sau geografice a mierii.

O astfel de determinare se poate face utilizând tehnici cromatografice (Pyrzynska și Biesaga, 2009), caz în care compușii trebuie extrași din miere ceea ce se referă în primul rând la separația de glucide. Determinarea comportă mai multe etape, după cum urmează:

Omogenizarea probelor

În această etapă, după lichefierea obligatory care se practică în baie de apă termostatată la maxim 450C, se pot aplica tratamente mecanice de omogenizare sau se poate utilizeze sonicarea în același scop.

Extracția compușilor fenolici

Ca și extracție se poate aplica oricare din cele două tehnici fundamentale și anume LLE (liquid-liquid extraction – extracție în fază lichidă) sau SPE (solid phase extraction – extracție în fază solidă). În cazul LLE cel mai adesea se folosește ca și solvent acetatul de etil sau alcoolul etilic. Scăderea timpilor de ectracție prin utilizarea energiei microundelor sau a ultrasunetelor nu este întotdeauna benefică deoarece poate reduce selectivitatea procesului mai ales la utilizarea microundelor.

Î n aceste condiții extracția în fază solidă a câștigat tot mai mult teren și s-a observat faptul că utilizarea rășinii AMberlite XAD-2 duce la procente de recuperare a compușilor fenolici din miere de 80-90% (Tomas-Barberan, 2000, citat de Pyrzynska și Biesaga, 2009). Practic soluția de miere acidifiată este trecută peste o coloană ce conține rășina activată ceea ce conduce la reținerea compușilor fenolici pe rășină. Ei sunt în continuare recuperați prin eluare cu methanol care se evaporă ulterior sub presiune redusă. Ca o alternativă se pot folosi cartușe de extracție de tip C18.

Purificarea compușilor fenolici

Reziduul de la îndepărtarea metanolului se redizolvă în apă și compușii fenolici sunt reextrași cu dietileter, care se îndepărtează sub current de azot. Reziduul solid se dizolvă în methanol fiind astfel pregătit pentru analiza cromatografică.

Determinarea ca atare a compușilor fenolici

Se utilizează tehnica HPLC în faze inverse (RP) pe coloane umplute cu C-18. Această tehnică este preferată pentru că permite eluția cu gradient, mult mai utilă decât cea izocratică în cazul unor amestecuri complexe așa cum este cazul compușilor fenolici din miere. Cei mai utilizați solvenți ca și fază mobilă cunt acetonitrilul și metanolul iar detecția este în UV la λ 290nm și 340nm utilizând sistemul DAD (diode array detection).

Chiar dacă HPLC rămâne cea mai uzitată metodă, compușii fenoloci din miere s-au mai determinat și prin GC (cromatografie de gaze) sau CE (electroforeză capilară) dar cu rezultate mai slabe.

Un studiu efectuat în anul 2009 de către cercetători din Polonia și Lituania (Kaškonienė et al, 2009) asupra a patru sortimente de miere florală (tei, rapiță, iarbă neagră și hrișcă) a relevat diferențierea și impactul pe care îl are determinarea globală a compușilor fenolici prin metoda Folin – Ciocâlteu fața de determinarea ca atare a acestor compuși prin HPLC. Ambele determinări au fost conduse asupra extractelor metanolice obținute din miere pe cartușe C18. Valorile obținute au fost identice pentru mierea de hrișcă și iarbă neagră respectiv 201 µg/g, mai mici la mierea de tei (153 µg/g) și cele mai reduse la mierea de rapiță, 71,7 µg/g. Determinarea identității compușilor fenolici a dus la situația prezentată în tabelul II.

Tabelul II. – Compuși fenolici identificați (Kaškonienė et al, 2009)

Se observă faptul că s-au identificat atât acizi fenolici cât și flavonoide (Fig II. și II. ) iar numărul lor este de câte 6 la tei și hrișcă și 7 la rapiță și iarba neagră, în limita compușilor disponibili în etalonul utilizat. Numărul de compuși însă se observă a nu fi relevant atâta timp cât mierea de rapiță și cea de iarbă neagră au același număr de compuși fenolici dar cantitatea totală este de trei ori mai mare în iarbă neagră.

De asemenea se observă că un singur acid fenolic și anume acidul cafeic respectiv un singur compus tip flavonoid (kempferolul) se găsește în toate sortimentele testate Pe de altă parte există compuși care se regăsesc numai în câte un sortiment: acid galic, acid clorogenic, și quercetină în mierea de hrișcă, crisin în mierea de iarbă neagră, isorhamnetin în mierea de tei respectiv picocembrin și galangin în mierea de rapiță. Se observă astfel că identificarea tipurilor de compuși fenolici poate servi la autentificarea mierii alături de compușii responsabili de aromă și care se pot determina tot prin tehnici cromatografice.

Figura II. – Flavonoide identificate, Kaškonienė et al, 2009

Figura II. – Acizi fenolici identificați, Kaškonienė et al, 2009

II.3 Efectele benefice ale antioxidanților din miere asupra sǎnǎtații

Mierea de albine este un puternic antioxidant și nu conține grăsimi de unde rezultă faptul că nu influențează nivelul de colesterol din organismul uman. Sortimentele de miere mai bogate în antioxidanți sunt cele de culoarea închisă și cu un conținut mai ridicat de apă. Sortimentele de miere: Iarbă Neagră și Hrișcă sunt sortimente de culoare închisă ceea ce am specificat și în descrierea lor deci sunt bogate în antioxidanți.

Antioxidanții din miere îi conferă acesteia multiple proprietăți. Mierea de albine nu este doar un aliment cu proprietăți nutriționale ci și un puternic terapeut. Principalii antioxidanți din miere sunt acizii fenolici și flavonoidele, enzimele și vitaminele. Aceștia împreună contribuie la menținerea organismului în ciclul de viață prin aportul de substanțe necesare dezvoltării celulelor.

Un antioxidant importatnt din miere, pinocembrinul este întâlnit doar în miere și propolis, ajută la menținerea în parametrii normali a celulelor nervoase. Pinocembrinul este un puternic antioxidant, antibactericid și antiinflamatoriu.

Tot datorită conținutului de antioxidanți din miere organismul uman este ”păzit” de diferite boli iar în caz de anumite probleme de sănătate aceștia acționează asupra afecțiunii astfel ducând la o bună funcționalitate a organismului.

O alimentație bogată în antioxidanți oferă organismului uman o stare de vitalitate mai ales la schimbările climatice care au loc în timpul anului care pot oferi omului stări de oboseală și disconfort. Antioxidanții sunt substanțe nutritive care ajută la întărirea sistemului imunitar și protecția împotriva bolilor cronice. Așa cum am menționat și anterior, schimbările climatice supun organismul uman la diferite stări de adaptare care în medie se desfășoară în decursul a două săptămâni. În această perioadă la nivelul corpului au loc o serie de modificări printre care slbirea sistemului imunitar și dereglarea metabolismului. Prin urmare în această perioadă cei mai de seamă dușmani ai organismului sunt radicalii liberi care pot și înfruntați doar de antioxidanți.

Radicalii liberi sunt niște compuși ce un pot fi văzuți cu ochiul liber însă generează circa cincizeci de afecțiuni de ordin medical ceea ce asupra organismului survine cu o serie de atacuri continue. Oxidanții sau radicalii liberi, odată pătrunși în organism aduc cu ei molecule reactive și instabile care acționează negativ asupra celulelor sănătoase. Rolul antioxidanților în organism este acela de a regenera celule îmbătrânite de radicalii liberi astfel ducțnd la refacerea echilibrului din organism. Antioxidanții sunt cei care ajută la întărirea sistemului natural de apărare astfel diminuează consecințele negative ale stilului de viață nesănătos prin consumul de tutun, alcool și poluarea din mediul înconjurător.

Antioxidanții din miere împiedică procesul de îmbătrânire al celulelor vii din organism și mențin funcțiile vitale ale organismului într-o stare normală de funcționare pe o perioadă mai lungă. Antioxidanții din miere ajută la reglarea nivelului de colesterol, astfel previn bolile cardiace, apără sistemul nervos central și previne afecșiunile neurologice.

De-a lungul timpului s-au efctuat o serie de cercetări științifice în urma cărăra s-a demonstart că perosanele care sunt consumatoare de antioxidanți naturali zilnic sunt predispuși mai puțin atacului radicalilor liberi; s-a dovedit că 75% din consumatorii de antioxidanți naturali au scăpat de impactul cu radicalii liberi. Cercetătorii sunt cei care au tras și un semnal de alarmă în legătura cu proveniența antioxidanților. Aceștia trebuie să provină din alimente proaspete. De exemplu în cazul mierii de albine, dacă acesta este predispusă unor temperaturi ridicate în momentul prelucrării din faguri atunci au loc pierderi semnificative în substanțe nutritive.

Prin consumul regulat de miere, respectiv 2-3 lingurițe/zi se poate menține o stare bună de sănătate prevenind apariția bolilor cronice și chiar a cancerului.

Antioxidanții din miere au și alte beneficii asupra organismului:

Ajută la o mai bună digestie – tratează afecțiuni ca și ulcerul și constipația

Ține sub control diabetul – ea duce la scăderea nivelului zahărului din sânge chiar dacă are mai multe calorii decât zahărul

Ajută la slăbit – ajută la absorbția depozitelor de grăsimi din organismul uman

Energizant natural – datorită conținutului bogat de carbohidrați

Vindecă rănile – datorită proărietăților antibiotice s-a dovedid că mierea are putere să distrugă un microb care împiedică țesuturile să se vindece

Calmarea tuselor – distruge bateriile și virușii datorită conținutului bogat de vitamine, substanțe nutritive și enzime

Proprietăți antioxidante, anti bactericide și antifungice – îmbunătățește sistemul imunitar; este utilizată ca un antiseptic natural.

Previne anemia – ajută la absorbția calciului și mărește cantitatea de hemoglobină

Utilizată pentru diferite afecțiuni ale pielii : arsuri, acnee etc.

PARTEA a II – a – EXPERIMENTALĂ

CAPITOLUL III

SCOPUL LUCRĂRII

Mierea de albine este un aliment deosebit de valoros pentru sănătatea umană datorită conținutului de compuși cu rol antioxidant. Cercetările în domeniu au relevat faptul că mierea de mană are o capacitate antioxidantă superioară mierilor florale. Totuși, și dintre acestea, există sortimente creditate a avea un conținut de compuși bioactivi semnificativ, comparabil cu al cel al mierii de mană. În acest sens au fost creditate sortimente monoflorale de culoare închisă cum sunt mierea de hrișcă, de castan sau de iarbă neagră.

Scopul prezentei lucrări este de a determina comparativ compușii cu potențial antioxidant și activitatea antioxidantă specifica a mierii de Iarbă Neagră din N-V României și a mierii de Hrișcă din Polonia, regiunea Podkarpatia. De asemenea s-a investigat posibila relație între compușii fenolici, respectiv prolină și activitatea antioxidantă.

Pentru atingerea acesui scop s-au executat determinări după cum urmează:

Determinarea conținutului total de fenoli prin metoda Folin Ciocâlteu

Determinarea spectrofotometrică a prolinei

Determinarea activității antioxidante – metoda DPPH

Determinarea activității antioxidante – metoda FRAP

Determinarea culorii

CAPITOLUL IV

MATERIALUL TESTAT

Materialul testat a constat ȋn probe de miere de iarbă neagră și de hrișcă, după cum urmează:

Miere de iarbă neagră – Fig IV.1 și IV.2

Mierea de iarba neagră a provenit de la doi apicultori privați, astfel:.

Oradea – Probe din anii 2012, 2013, 2014, 2015. Mierea a fost colectată în zona de munte, la trecerea din județul Bihor spre județul Cluj

Mierea a fost achiziționată în ambalaje de sticlă cu capac metallic, cu masa de 200 -400g de la punctul de vânzare propriu și de la sediul producătorului.

Figura IV.1 – Miere de iarbă neagră, apicultor Oradea

Rogojel, județul Cluj – Probe din anii 2014 și 2015

Probele au provenit prin achiziție directă de la apicultor, în ambalaje de sticlă cu capac metallic, 400g.

Figura IV.2 – Miere de iarbă neagră, apicultor Rogojel,

Mierea de hrișcă – Fig IV.3

Mierea de hrișcă provine din Polonia, regiunea Podkarpatie și a fost pusă la dispoziție în cadrul activităților comune de cercetare științifică ale studenților de la Departamentului Ingineria Produselor Alimentare – Facultatea de Protecție a Mediului, niversitatea din Oradea și Universitatea din Rzeszow – Polonia, Departamentul de Chimia Alimentelor și Toxicologie, Facultatea de Biologie și Agricultură. S-au testat patru probe de miere de hrișcă din anii 2012, 2013 (două) și 2014. Probele provin de la apicultori privați și se găsesc în ambalaje de masă plastică cu capac, 200g.

2012 – 2013 2014

Fig IV.3 – Miere de hrișcă – Polonia

CAPITOLUL V

METODE UTILIZATE ÎN DETERMINĂRI

Evaluarea capacitatii antioxidante în miere

În afara rolului nutrițional, mierea este de asemenea folosită ca un conservant alimentar, prevenind reacțiile de oxidare în produsele alimentare, cum ar fi oxidarea lipidelor în carne și brunificarea enzimatică la fructe și legume. Antioxidantii întârzie în mod specific deteriorarea, râncezirea sau modificările de culoare datorate oxidării provocate de lumină, căldură și unele metale. Cu toate acestea, compoziția mierii și activitatea antioxidantă variază foarte mult în funcție de sursa florală și factorii externi, cum ar fi de sezon și mediu. Mierea conține cel puțin 181 de substanțe și este considerată ca parte a medicinii tradiționale [Chow, 2002, citat de Alvarez-Suarez et al, 2009]. O gamă largă de constituenți minori sunt de asemenea prezenți în miere, dintre care mulți sunt cunoscuți ca având proprietăți antioxidante. Aceștia includ acizii fenolici și flavonoidele [Tomas-Barberan et al, 2001], anumite enzime (glucoza, oxidaza, catalaza și aminoacizii.

Mierea prezintă un mare potențial, servind ca un antioxidant într-un sistem de emulsie. Aceasta a fost încorporată în matrici de carne cu rol de a inhiba oxidarea lipidelor, precum și pentru a preveni reacțiile brunificare din fructe și legume [Antoni et al., 2002].

Polifenolii, inclusiv flavonoidele și acizi fenolici, sunt găsiți în miere, acești compuși acționează ca radicali liberi captatori de radicali peroxidici, și ca, chelatori de metale. Capacitatea antioxidantă a unor tipuri de miere a fost determinată și dovedită a fi semnificativă pentru conținutul fenolic (Chiș et al, 2016). Mulți autori au studiat conținutul fenolic și de flavonoide în miere pentru a determina dacă există o corelație cu originile florale], și, de asemenea, pentru a determina prezența activității antimicrobiene. [Alvarez-Suarez et al, 2009.].

V.1 Determinarea unor component cu rol antioxidant

V.1.1 Determinarea conținutului total de fenoli prin metoda Folin Ciocâlteu

Principiu

Reactivul Folin-Ciocâlteu, este un reactiv complex pe bazǎ de acid fosfomolibdenic și fosfotungstic. În mediu basic, compușii fenolici transferǎ electroni cǎtre molibden formând un complex colorimetrabil albastru a cǎrui absorbanțǎ se poate mǎsura la lungimi de undǎ ȋntre 750 – 765 nm. Mediul bazic este creat de cǎtre soluția de carbonat de sodiu care ajusteazǎ pH-ul ȋn jur de 10. Compușii fenolicii reacționează cu reactivul Folin Ciocalteau numai în condiții bazice (ajustat de o soluție de carbonat de sodiu la pH de 10 ; MacDonald –Wickes și colaboratorii 2006 )

Metoda se folosește pentru cuantificarea compușilor polifenolici din numeroase alimente de origine vegetalǎ cum ar fi: legume frunzoase și condimente (Fahad Al-Juhaimi and Kashif Ghafoor, 2011), vin (Singleton et al., 1999), cacao (Wollgast, 2004, Kroyer and Molnar, Jonfia-Essien et al., 2008), tomate Devanand et al., 2006), vișine (Filimon et al, 2011). Dintre alimentele de origine animalǎ metoda se folosește pentru mierea de albine (Măghitaș et al, 2009), etc.

Compoziția exactǎ a reactivului Folin-Ciocâlteu nu este cunoscutǎ dar se acceptǎ faptul cǎ el conține un complex acid fosfomolibdenic/fosfotungstic. Mecanismul de reacție se bazeazǎ pe transferul electronilor in mediu bazic de la compușii fenoliciși alte specii reducǎtoare cǎtre molibden formând un complex albastru care poate fi determinat spectrofotometric la lungimi de undǎ ȋntre 750 – 765 nm.

Metoda mǎsoarǎ cantitatea de substanța testatǎ care este necesarǎ pentru a inhiba oxidarea reactivului. Deoarece reactivul reacționeazǎ cu orice substanțǎ cu caracter reducǎtor din mediu, nu doar cu fenolii, el determinǎ de fapt capacitatea reducǎtoare totalǎ a materialului testat, nu doar conținutul de compuși fenolici.

Ca și standard pentru ȋntocmirea curbei de etalonare se utilizează cel mai adesea acidul galic (Fig V.1)

Fig V.1 Acid galic

www.lookchem.com

Reactivi:

Reactiv Folin-Ciocâlteu 2 N

Soluție Na2CO3 (75g/l)

Etalon (Standard) acid galic, soluție stoc, concentrație 250 mg/L

Mod de lucru

Proba constă dintr-o soluție de miere filtrată obținută astfel. Se cântărește, cu precizie de 0,1 mg, o cantitate cât mai apropiată de 5g și se dizolvată ȋn 50 ml apa distilata, urmată de filtrare (Fig V.2).

Figura V.2 – Pregătirea probelor

Amestecul de reacție

Pentru determinarea fenolilor se iau 0,5 ml soluție de miere filtrată la care se adaugǎ 2,5 ml reactiv Folin-Ciocâlteu concentrație 0,2 N, se omogenizează energic și dupa 5 minute se adauga 2 ml soluție Na2CO3 7,5%. Se citeste absorbanța dupǎ 2 ore la λ=760 nm fața de blank.

Întocmirea curbei de etalonare

Soluția stoc de acid galic se diluează astfel ȋncât sa avem minim 5 puncte de calibrare ȋntre 0 și 250 mg/L. În continuare se iau câte 0,5 ml din fiecare soluție preparată ca și mai sus și se parcurg aceeași pași ca și la prelucrarea probelor de miere, respectiv măceșe și amestecuri miere/măcieșe. Se ȋntocmește o curbă de etalonare sub forma unui grafic Concentrație (mg/L) = f (absorbanță) utilizând funcțiunile programului EXCEL

Calcul concentrației probe necunoscute:

Se va nota absorbanța obținută pentru probele de testate și cu ajutorul curbei de etalonare (ecuația de regresie) se va determina concentrația de acid galic corespunzătoare probelor necunoscute exprimată ca și mg GAE/100 g produs

VI.1.2 – Determinarea prolinei

Prolina este cel mai abundant aminoacid din miere (Fig. V. . Determinarea ei servește ca un criteriu pentru verificarea autencității mierii dar poate fi unii autori consider că poate avea și un rol antioxidant. (Meda et al, 2004, Truzzi et al, 2014)

Fig V. Prolina

glossary.periodni.com

Definiție:

Conținutul de prolină este definit ca fiind culoarea dezvoltată cu ninhidrină în comparație cu un standard de prolină și exprimată ca procent din masa de miere în mg / kg.

Principiu:

Prolina și ninhidrina formează un complex colorat. După adăugarea a 2-propanol, este determinată extincția soluției de probă și a unei soluțiii de referință, la o lungime de undă maximă. Conținutul prolină este determinat de raportul acestora. Metoda se bazează pe metoda originală a lui Ough citat de Bogdanov, 2006.

Reactivi:

Trebuie utilizate subatanțe chimic pure:

Apa ar trebui să fie distilată sau de puritate corespunzătoare.

Acid formic (H.COOH), 98 până la 100%.

Soluție de ninhidrină în etilenglicol monometileter (metil-celosolv), 3% în volum.

Soluție de referință prolină. Se prepară o soluție apoasă care conține prolină stoc 40mg / 50ml. Se diluează 1 ml la 25 ml cu apă pentru a da o soluție care conține 0,8 mg / 25ml

2-propanol, 50% în volum, în apă.

Echipament:

Spectrofotometru (înregistrare, dacă este posibil) măsurarea în intervalul de la 500 la 520 nm.

Cuve, 1 cm.

Tuburi cu capac cu filet sau dop, volumul nominal de 20 ml

Balon cotat, volum nominal de 100 ml

Baie de apă termostatată.

Modul de lucru:

Prepararea soluției de probă.

Se cântăresc cu precizie aproximativ 5 g de miere într-un pahar de laborator și se dizolvă în 50 ml de apă, se transferă cantitativ într-un balon cotat de 100 ml. Se diluează la volum cu apă și se agită bine.

Determinare.

De reținut: coeficientul de extincție nu este constant. Prin urmare, pentru fiecare serie de măsurători media coeficientului de extincție al soluției etalon prolină trebuie să fie determinată cel puțin în trei probe.

Se pipetează prin intermediul unei pipette de precizie:

E1 – 0,5 ml din soluția de probă într-un singur tub,

E2 – 0,5 ml de apă (test martor), într-un al doilea tub și

E3, E4, E5 -0.5 ml soluție standard prolină în alte trei tuburi.

Adăugați 1 ml de acid formic și 1 ml de soluție ninhidrină pentru fiecare tub.

Se pune dopul cu atenție și se agită puternic timp de 15 minute.

Se pun tuburile într-o baie de apă care fierbe timp de 15 minute, având grija ca imersarea tuburilor sa fie peste nivelul soluției.

Se transferă într-o baie de apă la 70° C timp de 10 minute.

Adăugați 5 ml de 2-propanol-soluție apoasă în fiecare tub și reînchideți cu capacul imediat.

Se lasă să se răcească și se determină absorbanța la 45 de minute după scoaterea din baia de apă la 70° C la λ 510 nm, folosind cuve de 1 cm.

Notă: Respectarea timpilor menționați mai sus este critică.

Calcul:

Prolina în mg / kg, miere, la o zecimală se calculează în conformitate cu următoarea ecuație:

Prolina (mg / kg) = (ES / Ea) x (E1 / E2) x 80

Unde:

ES = absorbanța soluției de probă

Ea = absorbanța soluției etalon prolină (media a două citiri),

E1 = mg prolină luată pentru soluția etalon

E2 = Greutatea de miere, în grame.

80 = factorul de diluție

VI.2 Metode de determinare a capacității antioxidante

Studiile efectuate în privința mecanismelor testelor de determinare a activitătti antioxidanților din miere sunt descrise în tabelul 2, dând principiul de măsurare și modul de cuantificare (Alvarez-Suarez et al, 2009)

Testele de transfer de electroni măsoară capacitatea de reducere a substratului (antioxidant), acestea includ echivalentul Trolox, Capacitatea antioxidantă (TEAC), ionul feric reduce puterea antioxidantă (FRAP) și 2,2-difenil-1- picrylhydrazyl (DPPH). Aceste teste sunt caracterizate prin capacitatea lor de a suferi un singur transfer de electron. Testele se bazează pe următoarele reacții și transferul de electroni:

Proba (oxidant) + e (de la antioxidant) probă redusă + antioxidant oxidat

Proba este un oxidant, care extrage un electron din antioxidant, determinând scimbarea culorii probei. Gradul de schimbare a culorii este proporțională cu capacitatea antioxidantă; variația absorbanței (∆A) este reprezentată grafic în funcție de concentrația antioxidantului, oferind o curbă liniară în care panta curbei reflectă capacitatea de reducere [exprimată ca Trolox echivalent (TE) sau de sulfat feros de amoniu (FRAP)].

Pe de altă parte, testele de transfer ale atomului de hidrogen măsoară capacitatea de hidrogen donată substratului, printre care cele mai utilizate in studiile antioxidante în miere este capacitatea de absorbtie a radicalului oxigen (ORAC). Este clar că donarea atomului de hidrogen este esențială în etapa de reacție în lanț de peroxidare a lipidelor; prin urmare, testele transferului de hidrogen sunt relevante pentru măsurarea ruperii lanțului capacității antioxidante. Este clar că în multe cazuri capacitatea antioxidantă sau capacitatea de a capta radicali, a unui compus este legată de eliberarea atomului de hidrogen donat, și nu neapărat la potențialul redox al compusului

Tabelul V.1 Tipuri de teste in Vitro ale capacității de captare a radicalilor stabili, non-biologici si evaluarea capacitatii reducătoare totale din miere

După Alvarez-Suarez et al, 2009

Reactivii avuți la dispoziție au făcut posibilă punerea în aplicare în prezenta lucrare a testelor DPPH și FRAP drept pentru care principiile lor teoretice vor fi prezentate la pct VI.2.1 și VI.2.2 .

VI.2.1 Activitate Antioxidanta – metoda DPPH

Metoda utilizată în prezent pe scară largă a fost propusă inițial de către Brand-Williams et al. în 1995.

Principiu

In aceast test antioxidantii reduc radicalul liber 2,2-difenil-1-picrilidrazil. In prezenta unui antioxidant, culoarea violet a DPPH• dispare si schimbarea absorbantei poate fi urmarita spectrofotometric la 515 nm.

Activitatea de absorbtie a mierii pentru DPPH• a fost evaluata de diversi autori ce au urmarit metodologia descrisa de alti autori [Meda et al, 2004, Mărghitaș et al. 2008]. Probele de miere se dizolva in apă sau în metanol la concentratii specifice si fiecare soluție este amestecata cu DPPH in solutie de metanol, blank-ul continand aceeasi cantitate de metanol si DPPH. Amestecurile sunt lasate un timp fix de exemplu 15 minute la 25 șC sau până la stabilizare absorbanței este apoi masurata la 517 nm (Chiș et al., 2016).

www.odec.ca

In general, rezultatele sunt raportate ca procent de inhibare, ceea reprezinta cantitatea de antioxidant necesara sa reduca concentratia initiala de DPPH• cu 50%, notat EC50. Activitatea antioxidantă (AA) ca și capacitate de captare a radicalilor liberi pentru fiecare miere este estimata folosind o curba standard de acid ascorbic si rezultatul este dat ca % echivalent de acid ascorbic, in ceea ce priveste epuizarea DPPH-ului, care este calculata cu ajutorul ecuatiei:

AA (%) = [Aa – (Ab – Ac)] x 100/(Aa – Ao), unde

Aa este absorbanta obtinuta fara esantionul de miere ( doar DPPH si metanol),

Ab este absorbanta amestecului incubat (de DPPH si solutie de miere),

Ac este absorbanta blank-ului

Ao este absorbanta minima obtinuta, cand DPPH-ul a fost complet absorbit [89].

Metoda DPPH este un test rapid si simplu ce garanteaza rezultate sigure si necesita doar un spectrofotometru UV-vis, pentru a fi efectuat, ceea ce probabil explica folosirea lui pe scara larga la determinarea activității antioxidante. Totusi, interpretarea este complicata cand compusii de testare au spectre ce suprapun DPPH-ul la 515 nm. Astfel intervin carotenoizii ce sunt prezenti in miere. Testul nu este o reactie competitiva, deoarece DPPH-ul se comporta si ca radical si ca oxidant. DPPH-ul este un radical de azot stabil ce nu are nicio asemanare cu radicalii peroxil foarte reactivi si tranzitori implicati in peroxidarea lipidelor. Inca un dezavantaj foarte important este ca multi antioxidanti ce reactioneaza rapid cu radicalii peroxizilor sunt aproape sau complet inerti la DPPH. In ciuda limitarilor mentionate mai sus, DPPH•-ul este stabil, disponibil comercial si nu trebuie sa fie generat inaintea analizelor precum ABTS•+. Datorita acestor motive acesta poate fi considerat o metoda spectrofotometrica utila si usoara cu privire la masurarea capacitatii antioxidante din miere.

Etapele determinării activității antioxidante prin Metoda DPPH sunt următoarele:

Reactivi:

Prepararea soluției DPPH (1,1-difenil-1,2 picrylhyhrazyl) radical, 1mgL-1 diluat la 0,04 mgL-1 cu CH3OH (metanol);

Prepararea soluțiilor de miere având concentrații de la 5% până la 0,5 %;

Mod de lucru:

Amestecul de reacție : se pun într-o eprubetă 750μL soluție de miere și 1500 μL soluție de DPPH după care se păstrează timp de o oră la temperatura de 20°C;

După aceasta se fac citirile absorbanței la spectrofotometru cu lungimea de undă λ = 517 nm; se iau în considerare numai acele eprubete în care avem nuantă de roz deoarece în cele complet galbene nu mai există deloc DPPH (a fost complet redus de către compușii antioxidanți din miere) deci nu se pot face aprecieri cu privire la activitatea antioxidantă.

După citire, rezultatele se calculează după următoarea formulă:

%Inhibition (%AA) =[(Absblank – Abssample)/Absblank] x 100

Se reprezintă grafic %AA = f (concentrație soluție miere) și prin interpolare pe grafic se determină concentrația soluției de miere care produce scăderea activității DPPH cu 50%, numită IC50%

VI.2.2 Activitate Antioxidantă – metoda FRAP

Principiu

Principiul acestei metode este bazat pe reducerea complexului feric 2,4,6-tripiridil-s-triazina (Fe3+ -TPTZ) la forma feroasa colorata a acestuia (Fe 2+ -TPTZ) in prezenta antioxidantilor după cum se exemplifică în fig V. .

Figura VI. – Testul FRAP

www.intechopen.com

Testul FRAP, “Capacitatea ferică de reducere a plasmei”, a fost descrisă de Benzie și Strain, 1996, și a fost utilizată de diverși autori pentru studierea capacitții antioxidanților din diverse vegetale dar și din miere [39, 45]. Pentru ca testul FRAP să măsoare capacitatea de reducere bazată pe reducerea ionului feric, antioxidanții ce acționează prin inactivarea radicalilor (transfer de H), în special carotenoizii (prezenți în mierea de albine), nu vor fi determinați. Alt punct de luat în considerare este producția concomitentă de Fe (II), care este un binecunoscut pro-oxidant și poate duce la generarea de radicali suplimentari în mediul de reacție, precum OH• din H2O2. În final, compușii care absorb la lungimea de undă a determinării pot interveni, cauzând supraestimarea valorii FRAP. PH-ul mic (3.6) necesar pentru această probă poate duce la precipitarea unor proteine, cum ar fi cazeina în mostrele de lapte [Chen et al, 2004 citat de Suarez-Alvaro, 2009].

În ceea ce privește limitările, orice compus (chiar și fără proprietăți antioxidante) cu potențial redox mai mic decât cel al perechii redox Fe(III)/Fe(II), poate reduce, teoretic, Fe(III) la Fe(II), contribuind la valoarea FRAP și inducând, în mod fals, rezultate mari. Pe de alta parte, nu toți antioxidanții reduc Fe(III) într-un ritm destul de rapid pentru a permite măsurarea acestuia în timpul de observare (tipic 4 min). Într-adevar, mulți polifenoli reacționează mai încet și necesită un timp de reacție mai mare (mai mare de 30 min) pentru o cuantificare totală și, în funcție de timpul de analiză, ordinea reacționării lor se schimbă. Însă, câțiva compuși polifenolici (acidul cafeic, acidul ferulic, quercitina și acidul tanic) pot avea reacții mai lente, necesitând mai mult timp (30 min) pentru completarea reducerii complexe. Când este folosit să determine potențialul antioxidant al polifenolilor în apă și metanol (solvent utilizat pentru extractie în mierea de albină), schimbarea absorbanței continuă și după 4 minute [Blasa et al, 2006]. Prin urmare, valorile FRAP pentru acești compuși nu pot fi determinate cu acuratețe în 4 minute, și din această cauză, se recomandă cu fermitate 10 minute ca timp de reacție util (Alvarez-Suarez et al., 2009).

Reactivi:

Reactiv FRAP proaspăt preparat compus din:

25 ml tampon acetat pH 3.6 – 300 mM

2.5 ml TPTZ (2, 4, 6-tripyridyl-s-triazină) 10 mM, obținut prin diluare in soluție 40 mM HCl

2.5 ml FeCl3 ´ 6H2O. 20 mM

Standard:

Soluție de sulfat feros FeSO4·7H2O, concentrație1mM

Soluție de TROLOX concentrație1mM

NOTA: TROLOX – (acid 6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylic) este un analoc hidrosolubil al vitaminei E

en.chembase.cn

Mod de lucru:

Probele de soluție de miere sunt amestecate cu soluția reactivului FRAP preparat ca mai sus și absorbanța amestecului de reacție este masurată spectrofotometric la 593 nm, după o incubare de 10 minute la 37șC față de martorul de reacție (același amestec, dar fară probă).

Amestecul de reacție este format din:

200 µl soluție de miere 10%

1800 µl reactiv FRAP

S-a întocmit o curbă de calibrare (etalonare) folosind ca și standard soluțiile de FeSO4·7H2O și/sau TROLOX cu concentrații 0 – 1000µM care se obțin prin diluarea corespunzătoare a etalonului stoc. Procedura de lucru este identică cu cea de la prelucrarea probelor necunoscute.

Rezultatele finale sunt exprimate ca și cum concentrația antioxidanților ar avea o capacitate de reducere a ionului feric echivalentă cu cea a 1 mM FeSO4, folosit ca soluție standard. De asemenea, Trolox si Fe(NH4) 2 (SO4) 2 ·6H2O (sulfat feros de amoniu) pot fi utilizate pentru curba de calibrare, iar în acest caz, rezultatele sunt exprimate ca micromoli de echivalent Trolox (TE) sau sulfat feros de amoniu/100 grame de miere.

VI.3 Determinarea culorii mierii

A – Determinarea culorii pe scara Pfund

O scală utilizată în industria de mierii pentru a descrie culoarea acesteia. Măsurătorile au fost realizate inițial cu graderul Pfund de culoare, care constă dintr-o bucată de sticlă de culoarea chihlimbarului lângă o celulă de sticlă, care este umplută cu miere. Instrumentul este citit vizual; citirea este distanța de pană ce trebuie să fie mutată pentru a face un rezultat, și se exprimă în milimetri.

Mod de lucru:

Probele de miere au fost încălzite la 50°C pentru a dizolva cristalele de zahar, iar culoarea a fost determinată spectrofotometric prin măsurarea absorbanței unei soluții de miere 50% (g / v) la 635 nm. (Ferreira et al., 2009)

Calcul:

Mierile au fost clasificate conform scalei Pfund după conversia valorilor de absorbție: mm Pfund = -38.70 + 371.39 × ABS (alb, 1984).

B – Determinarea culorii pe baza absorbanței la λ=450 nm

Mod de lucru

Deoarece culoarea mierii reflectă parțial conținutul de pigmenți cu proprietăți antioxidante (carotenoide, flavonoide, etc.), mierea a fost diluat până la 50% (g / v) cu apă caldă (45-50◦C), sonicată timp de 5 minute și filtru (0.45 um dimensiunea porilor, Agilent Technologies, Milano, Italia) pentru a elimina particulele mari. (Beretta și colab., 2005)

Calcul:

Absorbanța netă a fost definită ca diferența dintre absorbanța spectrofotometrică la 450 și 720 nm.

CAPITOLUL VI

REZULTATE

Pe parcursul prezentului capitol referirea la probele de miere testate se va face conform codurilor menționate în tabelele VI.1 și VI.2 . Codurile identifică tipurile de miere (IN pentru iarbă neagră și H pentru hrișcă) și proveniența (BH – apicultor din județul Bihor, respectiv Rog – apicultor din Rogojel, COMUNA ???). Literele E, F, G de la probele de miere de hrișcă identifică probele ca fiind din localități diferite din regiunea Podkarpatie, Polonia. La probele care probin de la același apicultor dar din ani diferiți codul conține și această referire.

VI.1 . Rezultatele determinării compușilor cu rol antioxidant

Cantitățile de compuși fenolici și de prolină determinate în probele testate sunt menționate în tabelele VI.1 și VI.2.

Tabelul VI.1 – Compuși cu rol antioxidant în mierea de iarbă neagră

Analizând valorile obținute se observă faptul că între probele de miere de iarbă neagră provenită din două surse există mari deosebiri. Conținutul mediu de total fenoli al probelor INBH (141,3 mg GAE/100g) este de nivelul celui tipic pentru mierile închise la culoare de tipul celei de mană pe când mierea din Rogojel prezintă valori medii inferioare, respectiv 84.18 mg GAE/100g. Cele constate sunt în acord cu valorile raportate de către diferiți cercetători și care care acoperă un domeniu larg, între 37 și 189 mg GAE/100g. Astfel Moise și colab, 2013 a găsit pentru mierea de iarbă neagră din zona Clujului valori cuprinse între 51,0 și 56,7 în același domeniu ca și Weselowska et al, 2014 care a raportat valori între 37 și 43 mg GAE/100g pentru miere de iarbă neagră provenită din sud-estul Poloniei, anii 2011, 2012. În schimb Wilczyńska A, 2010 a găsit pentru mierea de iarbă neagră din diferite regiuni din Polonia valori între 109 și 189 mg GAE/100g la fel ca și Escudero et al, 2013 pentru mieri provenite din nord-vestul Spaniei – 181 mg GAE/100g.

Mierea de iarbă neagră este recunoscută pentru conținutul ridicat de prolină. În studiul coordonat de Persano-Oddo, 20 asupra principalelor sortimente de miere monoflorală din Europa, conținutul mediu de prolină pentru acest sortiment a fost de 646±196 mg/kg. Variația în limite largi (309-1033 mg/kg.), constatată pe cele 144 probe luate în considerare, s-a evidențiat și la probele testate în prezenta lucrare unde cea mai mică valoare a fost 465.3 mg/kg. și cea mai mare 1544.13 mg/kg. În Polonia, Janiszewska,et al, 2012 a găsit valori medii de 284 în timp ce Dimiņš, et al. a găsit în Lituania în 2006 valori mult superioare 1268 mg/.kg

Tabelul VI.2 – Compuși cu rol antioxidant în mierea de hrișcă

Conținutul total de fenoli determinat pentru mierea de hrișcă testată în prezenta lucrare atinge cele mai ridicate valori față de oricare alt sortiment din Europa comparabil doar cu mierea de Manuka din Noua Zeelandă sau cu cele din Malaezia între 510.4 și, 602.4 mg GAE/kg (Siok et al, 2014) Etiopia (Sime et al,., 2015: 330-610 mg (GAE)/100 g honey sau Algeria (Khalil et al., 2012: 459.83 mg GAE/kg.

Conținutul de prolină al mierii de hrișcă testate este superior celui înregistrat pentru mierea de iarbă neagră și în același timp la nivelul superior al valorilor raportate pentru acest sortiment la nivel european. Astfel în Polonia, Janiszewska,et al, 2012 a găsit valori medii de 227,8 în timp ce Dimiņš, et al. a găsit în Lituania în 2006 valori mult superioare 870 mg/.kg.

VI. Rezultatele determinării culorii

În tabelul VI.3 sunt prezentate valorile obținute la determinarea culorii prin cele două metode experimentale aplicate. Au fost calculate valorile medii și deviația standard la fiecare sortiment iar la mierea de iarba neagra și separat, în funcție de zona de proveniență.

Tabelul VI.3 – Dterminarea culorii

Ca o primă observație, probele de miere de hrișcă prezintă o mult mai mare omogenitate a culorii decât cele de iarbă neagră, conform valorilor SD calculate. Situația se poate datora faptului că probele de miere de hrișcă provin din aceeași regiune și se referă la numai doi ani de recoltare, față de patru în cazul INBH.

În ceea ce privește relația între cele două moduri de determinare a culorii, la mierea de iarbă neagră corelația este mai puternică (R2=0.964), decât în cazul mierii de hrișcă (R2=0,741) după cum se exemplifică în figura VI.1.

Figura VI.1 – Corelarea metodelor de determinare a culorii

Tabelul prezintă pe coloana din dreapta încadrarea în clasa de culoare conform scării Pfund (http://honeybeesuite.com/the-color-of-honey). Rezultatele obținute sunt în concordanță cu cu examinarea vizuală (Fig IV.1 și IV.2). De asemenea se observă faptul că există variații semnificative de la un an la altul chiar la mierea ce provine de la același apicultor. Acest fapt se datorează cel mai probabil faptului că este dificil de obținut miere de iarbă neagră pură în zona geografică de proveniență a acestor probe datorită bazei melifere insuficient de extinse. De asemenea condițiile meteo diferite de la un an la altul influențează colectarea nectarului. Intensitatea culorii determinată prin Abs450 indică prezența unor pigmenți de tip carotenoide și flavonoide despre care se cunoaște că au rol antioxidant (Moniruzzaman, et al, 2013)

Potrivit scării mierea de hrișcă aparține categoriei “Chihlimbar închis” .

În cazul mierii de iarbă neagră între conținutul total de fenoli și culoare există o corelație puternică, indiferent de modul de determinare al culorii, aspect certificat prin valorile lui R2 din figura VI.2. Bertoncelj et al, 2007 și Kek et al, 2014 au găsit același tip de corelare (0.887 , respective 0.826) pentru diferite sortimente de miere din Slovacia și Tailanda.

Figura VI.2 – Corelarea între conținutul de fenoli și culoare,

miere de iarbă neagră

Cu totul alta este situația în cazul mierii de hrișcă unde o astfel de corelație nu se regăsește (Fig VI.3)

Figura VI.2 – Corelarea între conținutul de fenoli și culoare, miere de hrișcă

VI. 3 Rezultatele obținute la determinarea activității antioxidante

Rezultatele determinării activității antioxidante sunt prezentate în tabelul VI.4 pentru testul DPPH.

Tabelul VI.3 – Activitate antioxidantă, testul DPPH

După cum se observă, pentru a putea compara activitatea antiradical a probelor testate cu reactivul DPPH este nevoie să se lucreze la concentrații ale probelor de miere mai mici de 5%, pentru că la această concentrație majoritatea probelor prezintă RSA>100%. În ceea ce privește compararea cu rezultatele din articolele științifice, acest aspect nu este foarte concludent datorită aplicării testului DPPH în variante diverse din punct de vedere al concentrației reactivului, raportul între volumele de reactivi, timpul după care se măsoară absorbanța, etc. De exemplu în studiul publicat de Moise et al în 2013 s-au găsit pentru mierea de iarba neagră valori ale RSA% între 49 și 61% la soluții de miere de 1,25% dar s-au folosit soluții de DPPH de concentrație 0,025 mg/ml (0,06mM) față de 0,04mg/ml (0,1mM) utilizat în prezentul studiu. Wilczyńska A, 2010 a găsit pentru mierea de iarbă neagră din diferite regiuni din Polonia valori RSA >100% la concentrații ale mierii de 20%, ceea ce reprezintă o activitate mai slabă decât pentru IN testată în prezenta lucrare la care majoritatea soluțiilor 5% au avut deja RSA>100%. Pentru mierea de hrișcă, în aceleași condiții, s-au găsit valori RSA între 56% și 100%, ceea ce din nou reprezintă o activitate antioxidantă mai mică decât cea găsita la probele H testate în prezenta lucrare.

Datorită acestor motive utilizarea valorii IC50% este mult mai relevantă atât pentru a compara probele între ele cât și diversele sortimente de miere. Valorile IC50% indică o activitate antioxidantă semnificativă pentru probele testate cu menționarea faptului că rezultatele obținute pentru mierea de hrișcă sunt mult mai omogene decât cele de la iarba neagră, ceea ce este explicabil prin faptul că au aceeași origine geografică și provin din doua perioade succesive.. Probele de miere de IN testate în prezenta lucrare au prezentat valori IC50% între 8,02% și 0,82% iar pentru mierea de hrișcă între 2,06% și 0,72%. Probele INBH au prezentat activitate antioxidantă mai ridicată decât cele IN Rog, practic la același nivel cu probele de H. Escudero et al, 2013, au găsit pentru mierea de iarbă neagră din Spania IC50% de 1,15%, ceea ce se regăsește la probele INBH.

Curbele de etalonare folosite pentru calculele aferente activității antioxidante cu reactivul FRAP sunt prezentate în figurile VI. Și VI. Iar rezultatele testării probelor de miere se găsesc în VI.5

.

Figura VI. – Curba de etalonare FRAP, Fe2+

Figura VI. – Curba de etalonare FRAP, Trolox

Tabelul VI.4 – Activitate antioxidantă, testul FRAP

În ceea ce privește activitatea antioxidantă determinată prin testul FRAP, s-au obținut valori semnificative pentru ambele sortimente, la toate probele testate. Pentru IN valorile se încadrează între minim 310 µmFeSO4 (213 µmTx) pentru INRog14 și maxim 712 µmFeSO4 (412 µmTx) pentru IN15BH. Valorile la H sunt mai omogene și se încadrează între 388 µmFeSO4 (211 µmTx) și 445 µmFeSO4 (288 µmTx). Studiul lui Maurya et al, 2014, a găsit pentru mierea de hrișcă valori mai mari, respectiv 800,7 µmFe2+. Aplicarea diferită a testului FRAP (soluții de miere 20%) face dificilă compararea valorilor din prezentul studiu cu cele găsite în Polonia de către Kus et al, 2013 pentru iarbă neagră (2,1 mmFe2+) respectiv hrișcă (5,7 mm Fe2+). Anumite constatări de la testul DPPH sunt valabile și la testul FRAP, respectiv activitatea antioxidantă a mierii de iarbă neagră BH este superioară celei provenite din Rogojel. Dar, spre deosebire de situația înregistrată la testul DPPH, la testului FRAP mierea de hrișcă are o activitate antioxidantă inferioară celei INBH.

VI. Corelarea compușilor cu rol antioxidant cu activitatea antioxidantă

Ținând cont de studiile prezentate în literatura de specialitate s-au testat corelațiile de tip liniar între conținutul total de fenoli, prolină, culoare și activitatea antioxidantă exprimată prin IC50% (DPPH) și µmFeSO4 – µm Trolox (FRAP). În tabelul VI. Și VI. Este prezentată sinteza acestor corelații iar în Anexele se găsesc graficele respective.

Tabelul VI. – Corelarea componentelor cu rol antioxidant

și activitatea antioxidantă

Analizând datele din tabelel VI. se observă faptul că atât la mierea de iarbă neagră cât și la cea de hrișcă activitatea antioxidantă, indiferent de testul aplicat, este corelată în cea mai mare măsură cu conținutul total de fenoli (TPC), R2 având valori peste 0,800 în toate cazurile. Aceeași situație s-a constatat în studiile publicate de Ferreira et al., 2008 (corelare TPH – DPPH) și Bertoncelj et al., 2007 (corelare TPH FRAP).

În ceea ce privește conținutul de prolină, corelarea cu activitatea antioxidantă este mai slabă decât a fenolilor, dar mai puternică la mierea de hrișcă decât la cea de iarbă neagră.

Culoarea, indiferent dacă este exprimată în mm Pfund sau Absorbanță netă este corelată cu activitatea antioxidantă numai la mierea de iarbă neagră, R2 încadrânduse între 0,766 și 0,836. Bertoncelj et al., 2007 a găsit pentru mierile din Slovacia o corelare semnificativă între Absorbanța netă și activitatea antioxidantă determinată prin FRAP (µm Fe2+ 0,853) dar mult mai slabă față de IC50% (0,432).

CONCLUZII

Rezultatele obținute în urma determinărilor practice din prezenta lucrare de disertație conduc către următoarele concluzii:

A – Referitor la compușii cu rol antioxidant:

mierea de iarbă neagră este sortimentul de miere monoflorală provenit din zona de vest a țării cu cel mai mare conținut total de fenoli;

conținut total de fenoli al probelor de miere de iarbă neagră testate se situează pe același nivel cu cele mai mari valori găsite la nivel European (Polonia, Spania) pentru acest sortiment;

mierea de hrișcă din regiunea Podkarpatie, Polonia, este o sursă deosebită de compuși cu rol antioxidant conținutul ei de fenoli fiind cel mai ridicat dintre toate mierile monoflorale din Europa; din acest punct de vedere ea este comparabilă doar cu mierile din Noua Zeelandă sau cele specifice florei tropicale din Asia de Sud-Est și Africa;

Probele de miere de iarba neagră și hrișcă testate au confirmat conținutul ridicat de prolină specific pentru aceste sortimente de miere.

B – Referitor la culoare

Examinarea vizuală a probelor de miere testate a fost confirmată prin determinarea instrumentală a culorii;

Pe scara de culoare Pfund toate probele de miere de hrișcă din regiunea Podkarpatie, Polonia s-au încadrat la categoria ”Chihlimbar închis”;

Probele de miere de iarbă neagră nu au fost uniforme din punct de vedere al culorii:

probele INBH s-au încadrat la categoria “Chihlimbar închis”

probele din Rogojel s-au încadrat la categoria “Chihlimbar deschis”

În cazul mierilor foarte închise la culoare cum este mierea de hrișcă, corelarea metodelor spectrofotometrice directe de determinare a culorii nu este evident, deci se impune determinarea culorii prin metode mai laborioase de tip CIE L*a*b*;

Culoarea și conținutul de fenoli sunt corelate în cazul mierii de iarbă neagră, ceea ce nu este valabil în cazul mierii de hrișcă unde culoarea se datorează în mai mare măsură unor pigmenți sau unor produși de descompunere Maillard.

C – Referitor la determinarea activității antioxidante

Atât testul DPPH cât și FRAP au relevant o activitate antioxidantă puternică și omogenă la mierea de hrișcă din regiunea Podkarpatie, Polonia

Probele de miere de iarbă neagră INBH au prezentat activitate antioxidantă superioară celor provenite din Rogojel, la ambele teste aplicate.

Aceste rezultate, corroborate cu cele de la conținutul de compuși cu rol antioxidant, conduc către concluzia că mierea INRog conține și alte sortimente de mieri florale din zona de munte, în ciuda aspectului tixotropic specific pe care îl prezintă.

D – Referitor la corelarea compușilor cu rol antioxidant cu activitatea antioxidantă

La ambele sortimente testate conținutul total de fenoli influențează în cea mai mare măsură activitatea antioxidantă, pentru ambele teste aplicate;

Conținutul de prolină influențează în cea mai mare măsură activitatea antioxidantă în cazul mierii de hrișcă decât a celei de iarbă neagră;

Corelarea diferită a culorii cu activitatea antioxidantă (puternică la iarbă neagră și slabă la hrișcă), indică prezența la mierea de iarbă neagră a unor pigmenți nonfenolici, aspect care poate fi elucidate prin cercetări ulterioare.

CONCLUZIE GENERALĂ

Mierea de iarbă neagră din zona de vest a României și mierea de hrișcă

din regiunea Podkarpatie, Polonia, reprezintă sortimente de miere monoflorală valoroa se

cu o activitatea antioxidantă puternică, deci sunt un adevărat izvor de sănătate

BIBLIOGRAFIE

Al-Juhaimi, F and K Ghafoor, 2011, Total Phenols and Antioxidant Activities in Leaf and Steam Extracts from Coriander, Mint and Parsley Grown in Saudi Arabia, pak. J. Bot., 43(4): pp 2235-2237

Alvarez Suarez, JM, Sara Tulipani1, Stefania Romandini1, Alexis Vida l2 and Maurizio Battino1 2009, Methodological Aspects about Determination of Phenolic Compounds and In Vitro Evaluation of Antioxidant Capacity in the Honey: A Review

Antony, S.M.; Han, I.Y., Rieck, J.R., Dawson, P.L,. Antioxidative effect of Maillard reaction products added to turkey meat during heating by addition of honey. J. Food Sci., 2002, 67, 1719 -1724.

Benzie, I.F., Strain J. The ferric reducing ability of plasma (FRAP) as a measure of ‘‘Antioxidant Power”: The FRAP assay. Anal. Biochem.,1996, 239, 70-76.

Beretta Giangiacomo, Paola Granataa, Maria Ferrerob, Marica Oriolia, Roberto Maffei Facinoa, Standardization of antioxidant properties of honey by a combination of spectrophotometric/fluorimetric assays and chemometrics, Analytica Chimica Acta 533 (2005) 185–191

Bertoncelj, J., Doberšek, U., Jamnik, M., Golob, T., 2007, Evaluation of the phenolic content, antioxidant activity and colour of Slovenian honey, Food Chemistry, 105, 822–828

Blasa, M., Candiracci, M., Accorsi, A., Piacentini, M.P., Albertini, M.C., Piatt, E,.2006, Raw millefiori honey, Food Chemistry 97: 217-222.

Bogdanov S., 2006, Harmonised methods of the International Honey Commission, pages. 1–54

Brand-Williams, W., Cuvelier, M. E., Berset, C. Use of a free radical method to evaluate antioxidant activity. Food Science and Technology 1995, 28, 25

Chiș A. M., Purcărea C., Dżugan M., Teușdea A., 2016, COMPARATIVE ANTIOXIDANT CONTENT AND ANTIOXIDANT ACTIVITY OF SELECTED ROMANIAN AND POLISH HONEYDEW HONEY, REV.CHIM.(Bucharest), 67, No.2, 2016, 214-218

Chiș Adriana, Notițe de curs – Metode optice și cromatografice ȋn industria alimentară, 2013

Chiș Adriana – Noțiuni fundamentale de CHIMIE ANALITICĂ calitativă, cantitativă și instrumentală – Editura Universității din Oradea, 2010, ISBN 978-606-10-0077-7

Devanand L. L, Sudarsan Mukhopadhyaya, Donald T. Krizek, 2006, Content of total phenolics and phenolic acids in tomato (Lycopersicon esculentum Mill.) fruits as influenced by cultivar and solar UV radiation Journal of Food Composition and Analysis 19 (2006) 771–777

Dimiņš, F., Kūka P, Kūka M., Çakste, I, 2006, The Criteria of Honey Quality and its Changes during Storage and Thermal Treatement, LLU Raski 16 (311), 2006, 73-78

Escuredo O., Miguez M, Fernandez-Gonzalez M, Seijo MC, Nutritional value and antioxidant activity of honeys produced in a European Atlantic area, Food Chemistry 138 (2013) 851–856

European Union Directive (EU), 2002, European Union Directive 2001/110/EC relating to honey Ferreira, Isabel C.F.R Edmur Aires, João C.M. Barreira and Letícia M. Estevinho, Antioxidant activity of Portuguese honey samples: Different contributions of the entire honey and phenolic extract, Food Chemistry, vol 114, issue 4 15 june 2009, pages 1438-1443

Filimon R.V., D.Beceanu, M. Niculaua, C. Arion, 2011, Study on the Anthocyanin Content of Some Sour Cherry Varieties Grown in Iași Area, Romania, Cercetări Agronomice ȋn Moldova, Vol XLIV, No1(145): pp 81-91

Ferreira, I, Aires, E., Barreira, J., Estevinho, L.M., 2008, Antioxidant activity of Portuguese honey samples: Different contributions of the entire honey and phenolic extract, Food Chemistry,114, (4), 1438–1443

Jonfia-Essien et al., 2008), Jonfia-Essien W.A., G. West, PG. Alderson, G. Tucker, 2008, Phenolic content and antioxidant capacity of hybrid variety cocoa beans, Food Chemistry, 108: pp 1155–1159

Janiszewska, K, Magda Aniołowska, Piotr Nowakowski, 2012, Free Amino Acids Content of Honeys from Poland, Pol. J. Food Nutr. Sci., 2012, Vol. 62, No. 2, pp. 85-89

Karadag Ayse, Ozcelik B, Saner S, 2009, Review of Methods to Determine Antioxidant Capacities, Food Anal. Methods (2009) 2:41–60

Kaskoniene V, Maruska A, Kornysova O, Charczun N, Ligor M, Buszewski B, (2009), Quantitative and qualitative determination of phenolic compounds in honey, Chemine Technologija, ISSN 1392-1231, Nr 3 (52), pp 74-80

Kek, Siok Peng, Nyuk Ling China,*, Yus Aniza Yusofa, Sheau Wei Tanb, Lee Suan Chuac, Total Phenolic Contents and Colour Intensity of Malaysian Honeys from the Apis spp. and Trigona spp. Bees, “ST26943”, 2nd International Conference on Agricultural and Food Engineering, CAFEi2014” Agriculture and Agricultural Science Procedia 2 ( 2014 ) 150 – 155

Kroyer G and T Molnar, 2011, Bioactive ingredients in Cocoa and Chocolate Products and their Health Promoting Properties, P2, Poster Session: Chemistry, Biochemistry and Composition, 1st International Congress on Cocoa, Coffee and Tea, Novara, Italy

MacDonald-Wicks LK, Wood LG, Garg ML (2006) Methodology for the determination of biological antioxidant capacity in vitro: a review. J Sci Food Agric 86(13):2046

Maurya, S, Kushwaha, AK, Singh, S., Singh, G., An overview on antioxidative potential of honey from different flora and geographical origins, 21014, Indian Journal of Natural Products and Resources, 5(1), pag 9-19

Mărghitaș L., 2005 – Albinele și produsele lor, Editura Ceres.

Mărghitaș, L. Al, Dezmirean, D., Moise, A., Bobiș, O., Laslo, L., Bogdanov, S., 2008, Physico-chemical and bioactive properties of different floral origin honeys from Romania, Food Chemistry, 112 (4), 863-867

Meda, A.; Lamien, C.E.; Romito, M.; Millogo, J.; Nacoulma, O.G. Determination of the total phenolic, flavonoid and proline contents in Burkina Fasan honey, as well as their radical scavenging activity. Food Chem., 2005, 91, 571-577Bogdanov, 2006

Moise A, Mărghitaș Al, Dezmirean D, Bobiș O, (2013), Nutraceutical Properties of Romanian heather honey, Nutrition & Food Science > Volume 43 issue 3, http://www.emeraldinsight.com/journals.htm?articleid=17088214

Moniruzzaman, M., Khalil, M.I., Sulaiman, S.A., Gan, S.H., 2013a. Physicochemical and Antioxidant Properties of Malaysian Honeys Produced by Apis cerana, Apis dorsata and Apis mellifera. BMC Complementary and Alternative Medicine 13, 1-12.

Monschein, M. , J. Iglesias Neira, , O. Kunert, F. Bucar, Phytochemistry of Heather (Calluna vulgaris (L.) Hull.) and its altitudinal alteration, 2010, digital.csic.es/…/Phytochemistry%20heather.pdf

Neacșu C., 2002 -Compendiu de Apiterapie , Editura tehnică, București

Neacșu H. I. și Janstschi L., Chimie analiticǎ și instrumentalǎ, 2006, Editura Academic Pres & AcademicDirect Cluj-Napoca

Persano Oddo Livia and Roberto Piro, 2004, Main European unifloral honeys: descriptive sheets, Apidologie 35, S38–S81

Prior, R.L.; Wu, X.L.; Schaich, K. Standardized methods for the determination of antioxidant capacity and phenolics in foods and dietary supplements, J. Agric. Food Chem., 2005, 53, 4290-4302.

Pyrzynska Krystyna, Biesaga Magdalena Analysis of phenolic acids and flavonoids in honey Trends in Analytical Chemistry, Vol. 28, No. 7, 2009, 893-902

Sime, D., Minaleshawa Atlabachew , Mesfin Redi-Abshiro and Tewabech Zewde, 2015, TOTAL PHENOLS AND ANTIOXIDANT ACTIVITIES OF NATURAL HONEYS AND PROPOLIS COLLECTED FROM DIFFERENT GEOGRAPHICAL REGIONS OF ETHIOPIA Bull. Chem. Soc. Ethiop. 2015, 29(2), 163-172. ISSN 1011-3924

Singleton V.L. and J.A Rossi, 1965, Colorimetry of total phenolics with phosphomolybdic-phosphotungstic acid reagents. American Journal of Enology and Viticulture 16, pp. 144-158

Tomas-Barberan, FA Isabel Martos, Federico Ferreres, Branka S Radovic and Elke Anklam, HPLC flavonoid profiles as markers for the botanical origin of European unifloral honeys, Journal of the Science ofFood and Agriculture J Sci Food Agric 81 :485±496

Truzzi Cristina, Anna Annibaldi, Silvia Illuminati, Carolina Finale, Giuseppe Scarponi, 2014, Determination of proline in honey: Comparison between official methods, optimization and validation of the analytical methodology, Food Chemistry 150 (2014) 477–481,journal homepage: www.elsevier.com/locate/foodchem

Wesołowska, M., Kačániová, M., Dżugan, M., 2014, The antioxidant properties and microbiological quality of Polish honeys, Journal of Microbiology, Biotechnology and Food Sciences, 3(5), 422-425

White, 1984 J.W. White, Instrumental color classification of honey: Collaborative study, Journal of the AOAC 67 (1984), pp. 1129–1131.

Wilczyńska A, (2010), Phenolic content and antioxidant activity of different types of Polish honey – a short report, Pol. J. Food Nutr. Sci., vol. 60, no. 4, pp. 309-313

Wilczyńska, A, M. Ruszkowska, 2014, WATER ACTIVITY AND COLOUR PARAMETERS CHANGES DURING STORAGE OF LINDEN AND

BUCKWHEAT HONEYS, zeszyty.am.gdynia.pl/…/Water%20activity%20a, PAG 174-181

Wollgast, Ian, The contents and effects of polyphenols in chocolate, Gießen, 2004, Dissertation for obtaining the degree of doctor at the faculty of Agricultural and Nutritional Sciences, Home Economics, and Environmental Management at the University of Gießen, Germanygeb.uni- giessen.de/geb/volltexte/2005/2239/…/WollgastJan-2005-06-10.pd.

http://fiisportiv.ro/mierea-beneficii-si-proprietati

http://nutritie.bio/sanatate/antioxidanti-naturali-beneficii/

http://prodieta.ro/mierea-ingrasa-proprietati-miere-de-albine-sanatate-calorii/

http://www.bee-hexagon.net/files/file/fileE/HealthHoney/Honey_NutritionJACN.pdf

http://www.doxologia.ro/sanatate/medicina-naturista/beneficiile-antioxidantilor-alimentatie

http://www.perfecte.ro/de-mamici/top-7-beneficii-ale-consumului-de-miere-pentru-intreaga-familie.html

ANEXE

Corelarea conținutului de compuși cu rol antioxidant

cu activitatea antioxidantă la mierea de iarbă neagră

Corelarea conținutului de compuși cu rol antioxidant

cu activitatea antioxidantă la mierea de hrișcă

Corelarea culorii (mm Pfund și Absorbanță neta)

cu activitatea antioxidantă la mierea de iarbă neagră

Corelarea culorii (mm Pfund și Absorbanță neta)

cu activitatea antioxidantă la mierea de hrișcă