Screeningul Si Identificarea Peptidelor Si Glicopeptidelor din Fluidele Corporale ale Unor Pacienti Suferinzi de Boli de Stocare Lizozomale

CUPRINS

Considerații teoretice……………………………………………………………………………………….p. 06

Introducere. Motivația lucrării…………………………………………………………………p. 06

Spectrometria de masă. Considerații generale…………………………………………..p. 07

Ionizarea prin electrospray………………………………………………………………………p. 11

Tendințe actuale în dezvoltarea sistemului de chip pentru electrospray în analiza glicopeptidelor din urină………………………………………………………………p. 15

Bolile de stocare lizozomală – generalități…………………………………………………p. 17

Boala lui Schindler…………………………………………………………………………………..p. 20

Aparatură, materiale și metode………………………………………………………………………..p. 25

Solvenți, reactivi și materiale…………………………………………………………………….p. 25

Spectrometrul de masă QTOF………………………………………………………………….p. 32

Robotul NanoMate utilizat pentru ionizarea automatizată prin Chip – ESI…………………………………………………………………………………………………………..p. 34

Cuplajul robotului cu spectrometrul de masă……………………………………………p. 35

Nomenclatura ionilor obținuți prin fragmentare pentru determinarea secvenței glicoconjugaților………………………………………………………………………………………p. 38

Rezultate experimentale. Discuții……………………………………………………………………..p. 41

Analiza pe oligozaharide…………………………………………………………………………..p. 41

Aplicarea și dezvoltarea metodei pentru analiza structurală și compozițională a glicopeptidelor din urina pacientului…………………………………………………………p. 42

Analiza de screening prin chip – electrospray utilizând cuplajul NanoMate – QTOF a glicopeptidelor din urina pacientului…………………………………..p. 43

Analiza comparativă a glicopeptidelor din urina pacientului, față de urina unui individ sănătos……………………………………………………………………………p. 45

Analiza structurală prin tandem MS. Identificarea și structura biomarkerilor din urina pacientului cu boala lui Schindler…………………..p. 53

Concluzii. Perspective………………………………………………………………………………………p. 56

Bibliografie……………………………………………………………………………………………………..p. 59

Mulțumiri……………………………………………………………………………………………………….p. 66

Considerații teoretice

Introducere. Motivația lucrării

Am ales această lucrare, întrucât bolile de stocare lizozomală [1] sunt boli foarte agresive, care duc la moarte, aceste boli se manifestându-se îndeosebi la copii. Astfel, prin cercetare, se pot determina cauzele și efectele acestora, făcând posibilă ameliorarea stării de sănătate a pacienților care suferă de aceste tipuri de boli, prin căutarea unei terapii de înlocuire a enzimei [2] de care corpul are nevoie și anume, -N-acetilgalactosaminidaza (NAGA), pornind de la profesorul Schindler, care, la rândul său a căutat o terapie (enzyme replacement therapy), astfel încât pacienții să nu treacă dintr-un stadiu incipient al bolii într-unul mai grav, sau chiar să moară.

De menționat este că macromoleculele biologice sunt elemente fundamentale ale vieții, chiar dacă se expun sub forma diversității lor sau prin prisma faptului că acestea conduc către boli îngrozitoare.

Depistarea de la început a acestor boli permite identificarea unor aspecte importante, care, tratate consecvent, pot ajuta la ameliorarea stării de sănătate a pacienților suferinzi. Atât John B. Fenn (Fig. 1.1.1, cel care a aplicat prima oară ionizarea prin electrospray în spectrometria de masă), cât și Koichi Tanaka, au primit premiul Nobel pentru Chimie (2002), pentru dezvoltarea unor metode analitice, care vin în ajutorul investigării biomoleculelor.

În lucrarea de față voi prezenta rezultate ale părții experimentale în care am prelucrat probe primite de la Universitatea din Bonn, Germania (unde s-au extras glicopeptidele ce prezintă un interes major pentru lucrarea de față), parte experimentală în care am tratat boala Schindler de tipul I, în care am adăugat câteva puncte de interes prezentate într-un eseu, sub formă de prezentare orală [3], rezultate care au fost apreciate de participanții conferinței [3].

Fig. 1.1.1. Profesorul John B. Fenn [4]

Trebuie menționat și faptul că partea experimentală s-a realizat pe un spectrometru de masă performant, care lucrează cu o precizie ridicată, reducând în mod evident timpul de lucru; astfel, apare posibilitatea de a obține rezultate în timp util.

Spectrometria de masă. Considerații generale

Scurt istoric

În urma studiilor lui J.J. Thomson (1912), spectrometria de masă a suferit nenumărate îmbunătățiri, având în vedere că în 1958, cromatografia pe gaz a fost combinată cu spectrometria de masă – metodă ce a revoluționat analiza moleculelor volatile și a celor non-volatile, precum fosfolipide, zaharide sau peptide, începând cu anii '80.

Apariția a două metode de ionizare, precum ESI [5] (electrospray) și MALDI [6] (maxtrix assisted laser desorption/ ionization – ionizarea prin desorbție laser asistată de o matrice) au revoluționat spectrometria de masă, având în vedere că până în anii '80, biomoleculele nu puteau fi analizate cu spectrometria de masă (trebuie ca proba să fie volatilă într-o incintă, pentru a putea fi bombardată cu electroni).

Pe lângă aspectele menționate, spectrometria de masă nu folosește radiații electromagnetice, un aspect care o diferentiaza fundamental de celelalte tehnici spectrale de analiză (spectrometria în infraroșu sau în violet, rezonanța magnetică nucleară).

Unele din cele mai remarcabile aspecte ale descoperirii acestor metode sunt: acuratețe crescută în determinarea maselor mici, chiar și la rezoluție slabă, îmbunătățiri în ceea ce privește sensibilitatea, limite de detecție mai bune și spectrometre de masă în tandem mai eficiente, chiar și în cazul moleculelor cu masă moleculară mare – acestea sunt doar câteva din avantajele pe care le prezintă aceste metode revoluționare, iar cum tehnologia avansează, cu siguranță că și utilizarea spectrometrelor de masă vor avea aplicații nenumărate.

Spectrometria de masă se folosește pentru determinarea compoziției izotopice a elementelor, un element important în geo-științe și arheologie, determinarea maselor moleculare și a formulei moleculare, folosind instrumente cu rezoluție înaltă, identificarea compușilor organici, elucidarea structurii moleculare prin interpretarea fragmentărilor pe care ionii moleculari îi suferă.

Cele mai recente aplicații ale spectrometriei de masă care îi conferă un loc superior în ceea ce privește metodele analitice, sunt orientate îndeosebi spre rezolvarea problemelor de natură biomedicală, biologică, proteomică, biochimică, biofizică, sau metabolomică. Trebuie reținut faptul că această tehnică se folosește des în domeniul industrial, farmaceutic, în domeniul alimentar (aprecierea calității alimentelor), în controlul poluării, pentru determinarea și identificarea poluanților, în științele medico-legale, în arheologie, etc.

Spectrometria de masă (Fig. 1.2.1) este una dintre cele mai folosite metode (această metodă permite obținerea ionilor din molecule, separarea lor în funcție de raportul m/z – masă/ sarcină și înregistrarea acestora) în prezent, deoarece este o metodă analitică performantă, având în vedere caracteristicile esențiale pe care le are, și anume:

Sensbilitate de neegalat;

Domeniu extins de aplicabilitate – cele mai recente aplicații ale spectrometriei de masă se folosesc în următoarele domenii: biologie, biofizică, biochimie, biomedicină, proteomie, metabolomie, farmacie, poluare, industria alimentară, științe medico-legale, arheologie;

Limită de detecție;

Viteză.

Informații pe care spectrometria de masă nu le furnizează:

Spectrometria de masă nu poate oferi informații doar despre moleculele care pot fi ionizate;

Spectrometria de masă nu este o metoda analitică cantitativă; pentru a putea obține informații cantitative, un spectrometru de masă trebuie să fie cuplat fie cu un cromatograf, fie cu electroforeza capilară;

Spectrometria de masă nu poate oferi informații cu privire la stereochimia moleculei;

Spectrometria de masă s-a limitat timp de cincizeci de ani strict la molecule gazoase sau ușor sublimabile sau volatile.

În cadrul acestei metode, în ceea ce privește caracterizarea unor eșantioane mici de molecule izolate din celule, înregistrarea unui succes al analizelor ce folosesc această metodă depinde de eficacitatea și eficiența etapelor de preparare (preliminare) a probelor.

În spectrometria de masă, sarcina este exprimată în multipli ai sarcinii elementare sau sarcina unui electron în valoare absolută:

iar masa este exprimată în unități atomice de masă, u:

Proprietatea fizică ce se măsoară în spectrometria de masă este raportul (masă/ sarcină). Când masa este exprimată în unități atomice de masă și sarcina, în unități elementare, atunci raportul masă/ sarcină are dimensiunea de . Pentru a simplifica acest lucru, s-a introdus o nouă unitate de măsură, și anume Thomson-ul, cu simbolul Th și formula:

Un rol special în dezvoltarea instrumentației cu mare putere de procesare îl joacă dispozitivele de tip microfabricate și tehnologiile ultramoderne, care au capacitatea de a detecta, distribui și manipula cantități mici de probe.

Procedeele tradiționale de separare prin electroforeză capilară [7] sau pe gel mono și bidimensională, cromatografie lichidă, sau metodele alternative ce folosesc protocoalele clasice de digestie, separare și purificare prin tehnicile cunoscute, reprezintă bazele fazelor premergătoare analizei structurale prin spectrometria de masă.

Alte avantaje pe care le prezintă metodele acestea constau în viteza ridicată a determinării, reducerea volumului de probă și a consumului de reactivi, integrarea unor elemente operaționale și capacitatea de a asigura o viteză de analiză ridicată prin realizarea în paralel a operațiilor, toate acestea răspunzând necesităților bio-tehnologiei pentru procesarea rapidă a probelor.

Metodele moderne de analiză, cum este și spectrometria de masă [8], simplifică anumite proceduri, pentru că întreaga linie de procesare implică numeroase etape, care, de obicei, se realizează secvențial, necesitând timp îndelungat și o muncă susținută.

Având în vedere faptul că partea experimentală a acestei lucrări presupune analiza unor biopolimeri, precum peptide, proteine, compuși glicoconjugați, acizi nucleici, aceasta se poate realiza cu spectrometria de masă ESI (electrospray) și MALDI (matrix assisted laser desorption/ionisation), metodă care reprezintă o tehnologie MS majoră.

Numai folosind aparatură de înaltă performanță, precum un spectrometru de masă ca cel utilizat în partea experimentală a acestei lucrări și procedee adecvate, procesarea în paralel și automatizarea pot reduce semnificativ timpul de analiză (un aspect important în cercetare).

Un spectrometru de masă trebuie ca întotdeauna să efectueze următoarele procese:

– să producă ionii din probă în sursa de ionizare;

– să separe acești ioni, în funcție de raportul masă/sarcină în analizorul de masă;

– dacă este necesar, să fragmenteze ionii aleși și să analizeze fragmentele într-un analizor secundar;

– să detecteze ionii emergenți din ultimul analizor și să măsoare intensitatea acestora cu un detector, care convertește ionii în semnale electrice;

– să proceseze semnalele de la detector care sunt transmise către computer și să controleze instrumentul prin feedback. Pentru a se putea realiza etapele menționate anterior, este necesar un spectrometru de masă, aspect asupra căruia voi reveni în cele ce urmează.

Fig. 1.2.1. Schema unui spectrometru de masă

Ionizarea prin electrospray

„Am dat aripi de electrospray elefanților moleculari.”

John B. Fenn

Ionizarea prin electrospray [9-11] a fost descoperită de Malcom Dole, în anii ’60, fiind aplicată de John B. Fenn în spectrometria de masă, câștigând astfel premiul Nobel în Chimie (2002).

Fenn și-a folosit cunoștințele pentru a îmbunătăți metoda lui Malcom Dole, folosind contracurenți de gaz pentru desolvatare, eliminând resolvatarea a ionilor macromoleculari formați, descoperirea fiind urmărită îndeaproape de rezultatele unui grup de cercetare din Rusia.

În ESI (Fig. 1.3.1 – 1.3.4), principiul de formare a ionilor în fază gazoasă este diferit de cel de ionizare obișnuită, prin impact electronic, prin bombardarea cu atomi rapizi, ionizare chimică, sau prin ionizare chimică la presiune atmosferică.

În cadrul acestei tehnici, ionii moleculelor greu volatile se obțin prin electropulverizare, un fenomen care se desfășoară la capătul unei capilare prin care curge soluția probei de analizat în imediata vecinătate a contraelectrodului (2 cm între contraelectrod și vârful capilarului).

În contrast cu ionizările prin impact electronic, ionizarea chimică sau bombardarea cu electroni rapizi, unde ionii încărcați multiplu se observă foarte rar, în cazul sursei de ioni cu electrospray, în soluție se formează ioni simplu și multiplu incărcați.

Fig. 1.3.1. Injectarea probei prin orificiu cu ajutorul metodei ESI

Spectrometria de masă [12] este o abordare instrumentală care permite determinarea masei moleculare, de aceea este adesea numită „scara cea mai mică din lume”. Evoluția spectrometriei de masă a fost marcată de noi progrese în tehnologie, care au creat o direcție complexă a instrumentelor; din orice punct de vedere se discută, componentele fundamentale ale spectrometrelor de masă le reprezintă sursa de ioni, analizorul de masă și detectorul.

Fig. 1.3.2. Electrospray pe bază de chip („avionul” lui John B. Fenn)

Diferența dintre ESI și tehnicile de ionizare pe care le-am enumerat anterior, constă în faptul că în ESI, proba se dizolvă într-o soluție cu solvenți polari (și eventual cu adaos de electroliți în concentrație scăzută) și se pulverizează printr-un capilar menținut la un potențial ridicat, la presiune atmosferică. Prin electropulverizare, rezultă picături încărcate electric din care solventul se evaporă, astfel se obțin ioni în fază gazoasă.

Dintre toate metodele, ionizarea prin electrospray este una dintre cele mai deosebite, având în vedere că deține avantajul de a genera ioni direct din preparat, la presiune atmosferică, ceea ce face ca această metodă să poată fi aplicată pe o scară largă de molecule non-volatile.

Între capilar și contraelectrod se aplică o diferență de potențial de 3-6 kV. Datorită curgerii electroosmotice dar și a prezenței diferenței de potențial enorme, picătura de soluție care se formează la capătul capilarului va „exploda” în zeci de milioane de particule fine ce conțin moleculele probei de analizat producând o „ceață” de particule. Fiecare microparticulă conține și molecule ale solventului care se îndepărtează prin desolvatare. Astfel, se formează ioni mono și multiplu încărcați, fapt ce permite analiza biomoleculelor și a intermediarilor metabolici.

Fig. 1.3.3. „Aripile” – Electrospray pe bază de capilar

În electrospray, lichidul conținând analitul de interes este pompat printr-un capilar de metal, care are un capăt deschis, cu un vârf ascuțit, ca în Fig. 1.3.4:

Fig. 1.3.4. Procesul de ionizare prin electrospray.

Vârful se atașează la o sursă de tensiune, capătul său intersectând o placă de contra-electrod. Cu cât tensiunea crește, lichidul se încarcă mai tare, iar datorită efectului de încărcare – descărcare, acesta este pulverizat din capilar, formându-se așa-numitul „con Taylor”.

Tendințe actuale în dezvoltarea sistemului de chip pentru electrospray în analiza glicopeptidelor din urină

Caracterizarea compozițională și structurală a unei probe biologice prin aceste metode și tehnici superioare se realizează în prezent folosind în special metoda nanoelectrospray (nanoESI) [13-15] întrucât aceasta prezintă o sensibilitate și reproductibilitate superioară. Însă, acești parametri sunt puternic influențați de forma vârfului de electrospray, dar și de dimensiunea acestuia. În cazul amestecurilor deosebit de complexe, componentele biologice cu concentrație redusă sunt mai dificil de ionizat si de detectat.

Având în vedere că performanțele superioare reprezintă scopul dezvoltării unor chip – uri nanoESI în spectrometria de masă, metodele tradiționale nu sunt suficiente, pe lângă acestea fiind nevoie și de altele pentru a putea realiza aceste performanțe, precum nanoESI cu pulverizare prin capilar, sau microESI cu infuzie prin seringă, asigurându-se un consum mic de probă și reducerea timpului de prelucrare prealabilă a probelor.

Tendințele actuale în domeniu urmăresc creșterea performanțelor ionizării prin electrospray, reducând costurile de analiză, cantitatea de probă necesară, dar și a timpului de prelucrare a probelor înainte de analiza prin MS; astfel, pentru cantități mici de probă se folosesc dispozitive microfabricate și tehnologii ultramoderne „lab on a chip”, dispozitive cu capacitatea de a detecta, manipula și distribui cantități foarte mici de probă.

Prin optimizări și automatizări, se urmărește:

a) îmbunătățirea vitezei de analiză, în special prin realizarea operațiilor în paralel;

b) creșterea numărului de determinări prin integrarea unor elemente operaționale;

c) reducerea volumului probei și a consumului de reactivi.

Pentru a crește performanțele acestor metode, cu scopul de a reduce atât timpul de prelucrare și analiza, cât și costurile, sau cantitatea necesară de probă, actualele tendințe în ceea ce privește dezvoltarea sistemului de chip pentru electrospray presupun proceduri complexe de preparare a probelor, privind purificarea, separarea și digestia acestora, astfel se folosesc sistemele microTAS (sisteme de microanaliză totală), care facilitează integrarea pe un singur chip a unor operații fundamentale, precum purificarea, separarea, cât și prepararea probei din prealabil.

Pulverizarea prin electrospray a acestora în spectrometrul de masă, cu scopul de a obține informații detaliate, atât din punct de vedere structural, cât și din punct de vedere compozițional, se realizează prin fragmentare și ulterior printr-o analiză de screening.

Aparatura actuală poate prelucra volume mici de probă, de ordinul picolitrilor, astfel nu numai analiza complexă a ADN-ului se poate realiza pe un chip microTAS, dar și tratarea din prealabil, separarea, reacțiile enzimatice specifice în analiza moleculelor mici, a medicamentelor, a drogurilor, a proteinelor, a hidraților de carbon, a lipidelor, a poluanților, a proteinelor, detectarea, digestia sau separarea sunt procedee care se pot realize pe un chip microTAS.

Cuplarea dispozitivelor chip microTAS cu spectrometrul de masă

Dispozitivele de analiză sunt cuplate cu interfețe specifice nanoESI (pentru că sunt mai compatibile), astfel se folosește (pentru prepararea rapidă a probelor) un chip microfluidic (Fig. 1.4.1), iar apoi se separă probele și bineînțeles, se ionizează prin cele două metode menționate.

Pentru a putea realiza acest tip de cuplaj, trebuie să existe o interfață stabilă și puternică, însă pentru instrumentele de spectrometrie masă din comerț s-au dezvoltat două tipuri de ionizări, care au revoluționat spectrometria de masă: ESI și MALDI: ionizarea prin electrospray și ionizarea prin desorbție laser asistată de o matrice.

Ambele sisteme de chip ESI au fost testate și aplicate la analiza amestecurilor complexe de glicopeptide din urina unor pacienți suferind de boala lui Schindler.

Prin disocieri induse prin ciocnire [16], s-a realizat pentru prima dată în lume, cuplajul dintre spectrometria de masă și ionizarea prin electrospray, cu scopul de a îmbunătăți eficiența ionizării, electropulverizarea în sine, stabilitatea semnalului, folosindu-se un chip din Siliciu cu orificii, având un diametru de ordinul micrometrilor, pentru a se asigura un spray fin, o ionizare foarte bună și un consum mic de probă, scop atins în laboratorul de Spectrometrie de masă din cadrul INCEMC Timișoara, în colaborare cu Facultatea de Fizică din cadrul Universității de Vest din Timișoara, unde am prelucrat probe primite de la Universitatea din Bonn, Germania, unde s-au extras glicopeptidele care reprezintă interesul major al acestei lucrări.

Fig. 1.4.1. Schema interfeței microchip ESI-MS, dezvoltată de un grup de cercetători americani în anul 2003

Astfel, s-au dovedit potențialul și capacitatea cuplajului dintre ionizarea prin electropulverizare și spectrometria de masă de înaltă performanță, în cadrul analizei unor componente prelevate din urina pacienților suferinzi (metodă neinvazivă), fără să fie necesară vreo metodă de separare laborioasă. În consecință, metoda de analiză folosită pentru partea experimentală, metodă care a revoluționat spectrometria de masă, reprezintă un preambul în descoperirea de noi biomarkeri.

În comparație cu metodele obișnuite de ionizare bazată pe electrospray cu capilar, metoda de ionizare folosită confirmă capacitățile superioare ale metodei, astfel că o ionizare mai puternică ne permite să detectăm specii minore de glicopeptide, fapt care reprezintă biomarkeri fundamentali, pe care nu îi putem identifica prin nici o altă metodă analitică, dacă luăm în vedere sensibilitatea ridicată a aparaturii folosite – s-au folosit cantități infime de material biologic, pentru a-l putea analiza structural și compozițional, astfel deosebim o aplicabilitate ridicată în cadrul investigațiilor clinice.

Bolile de stocare lizozomală – generalități

Bolile de stocare lizozomală [17, 18] reprezintă dereglări recesive (care apar în urma unei activități deficitare a unei enzime), caracterizate prin acumularea (în ceea ce privește diferite tipuri de celule) de molecule cu importanță biologică ridicată, precum macromoleculele biologice, care sunt fragmentate parțial sau chiar deloc, conducând la diverse anomalii și afecțiuni la nivel celular.

Pentru a putea discuta la nivel de moleculă în medicină și biologie, trebuie ca să existe o dezvoltare de metode continuă, pentru a putea găsi caracteristicile biomoleculelor, structura individuală a acestora, și interacțiunile dintre acestea.

Recent, conceptul de boli de stocare lizozomale a fost extins, astfel încât să includă, de asemenea si proteinele activatoare sau defecte ale proteinelor necesare activității enzimelor cu caracter lizozomal.

Dintre bolile de stocare lizozomale (LSD – lysosomal storage diseases), amintim boala Fabry și boala lui Schindler, boli cu un caracter deosebit atât în medicină, cât și în fizica medicală, deoarece, cu ajutorul acesteia, pentru bolile menționate se poate găsi o terapie pentru ameliorarea stării de sănătate a pacienților (boala lui Schindler o voi dezvolta într-un paragraf dedicat acesteia).

Boala lui Fabry [19, 20] este o afecțiune moștenită, cauzată de absența sau activitatea deficitară a α-A-galacozidazei din lizozomi, care conduce la acumularea de globotriaosilceramide (Gb3), legate de glicosfingolipidele din pereții vaselor de sânge din corp. Simptomele acestei boli se prezintă sub formă de deteriorări severe ale funcțiilor cardiace și renale, tulburări gastrointestinale, atacuri tranzitorii ischemice și accidente vasculare cerebrale. Alte efecte ale acestei boli (Fig. 1.5.1 – 1.5.3) care apar deseori, se regăsesc la nivelul pielii, ochilor, urechilor, plămânilor și oaselor.

Această boală își are debutul în copilărie, fiind caracterizată de acroparasteziază, angiokeratoma, opacitatea corneală și lenticulară și hipohidroză. De-a lungul timpului, apar de asemenea și boli microvasculare de rinichi, inimă, dar și creier, progresând și ajungând chiar la moarte. Deși există câteva variante de terapii de înlocuire a enzimei și chiar dacă există un control al simptomelor, marea problemă este lipsa unui protocol standardizat pentru un diagnostic prematur, înainte de apariția unei deteriorări majore a țesuturilor. Cu toate acestea, în ultimii ani, au fost făcute eforturi mari în ceea ce privește dezvoltarea unor metode fiabile de detectare a bolii.

Fig. 1.5.1. Angiokeratom [21]

Fig. 1.5.2. Hipohidroză [22]

În cazul copiilor, cât și al adulților, odată ce există o suspiciune în ceea ce privește simptome ale bolii Fabry, diagnosticul definitoriu în cazul pacienților de sex masculin e realizat prin demonstrarea activității deficitare a enzimei lizozomale (printr-o probă de sânge). În cazul femeilor, această metodă nu este fiabilă, din cauza inactivării aleatoare a unui cromozom din celulele probei. În cazul acestora, analiza mutațiilor a fost dezvoltată cu scopul de a detecta heterozigoții. Măsurarea produșilor de stocare, Gb3 în plasmă, urină sau lizo-Gb3 în plasmă s-au dovedit a fi utile pentru diagnosticare și monitorizarea tratamentului.

Fig. 1.5.3. Pacient suferind de boala Fabry – afecțiune oculară [23]

Apariția terapiei de înlocuire a enzimei a subliniat importanța diagnosticului prematur, chiar și în cazul screening-ului bolii Fabry la copiii nou-născuți.

În zilele noastre, cele mai potrivite metode pentru screening-ul bolii Fabry sunt bazate pe protocoale de spectrometrie de masă, dezvoltate de grupurile de cercetători, în colaborare cu firma Genzyme.

Boala lui Schindler

„Nu există tratament pentru această boală, dar cunoașterea mutațiilor care o cauzează ne permite să studiem prenatal diagnosticul, care se bazează pe molecule.”

Robert J. Desnick și Detlev Schindler

Boala lui Schindler [24] a fost descoperita de Profesorul Detlev Schindler (Fig. 1.6.1.). Boala este o tulburare regresivă autozomală (cu referință către cromozomii din celulele somatice – toate celulele corpului sunt celule somatice, cu excepția celulelor sexuale), recent cunoscută, cauzată de activitatea deficitară a α-N-acetilgalactozaminidaza (NAGA), o hidrolază lizozomală [25], cunoscută mai degrabă drept α-galactozidaza B.

Fig. 1.6.1. Profesorul Detlev Schindler [26]

Clinic, afecțiunea este mai degrabă heterogenă (Fig. 1.6.2.) cu trei fenotipuri diferite, identificate până în prezent. Cea mai severă formă este cea de tipul I, o distrofie neuro-axonală la copiii nou-născuți. A fost descrisă [27, 28] prima oară la trei copii nou-născuți din Germania: doi dintre ei, născuți cu părinți consanguini și al treilea fiind un văr îndepărtat. Toți trei copiii au fost născuți după o sarcină normală, ce implică manifestările specifice de-a lungul sarcinii și din timpul nașterii. Frații sunt vii, în prezent, în starea descrisă mai jos, în timp ce verișorul lor a murit în mod neașteptat la optsprezece luni de viață, de apnee (suspendarea respirației) suferită în timpul unei crize prelungite de convulsii.

Evoluția clinică a celor doi frați este caracterizată de trei stadii:

Dezvoltare aparent normală în primele 9-12 luni;

O perioadă de dezvoltare întârziată, urmată de o regresie rapidă, începând cu al doilea an de viață (cu fratele mai tânăr îmbătrânind mai repede);

Tulburări neurologice progresive, urmate în 3-4 ani de orbire corticală, surditate, spasticitate, mioclonii (contracție involuntară bruscă, dezordonată a mușchilor), atitudine decorticată (nepăsătoare) și retard psihomotor profund și puțin, dacă există, contact cu mediul înconjurător (cu alte cuvinte, nu mai realizează ce se întâmplă în mediul înconjurător).

La 4 și respectiv 5 ani de viață, frații afectați au avut abilități de dezvoltare în stadiul de nou-născuți, nu au avut niciunul mișcări voluntare, vreun contact cu mediul înconjurător sau răspuns la stimuli. Aparent, aceștia nu vedeau sau auzeau, erau inconștienți și dependenți de hrănirea prin tuburi. Amândoi frații au supraviețuit unor episoade de pneumonie, grație eforturilor sârguincioase ale părinților, în ceea ce privește îngrijirea lor, dar au rămas până în prezent în aceeași stare vegetativă.

O formă mai puțin severă, boala Schindler de tipul II (numită de asemenea, boala Kanzaki) este o tulburare care apare la debutul adolescenței, caracterizată prin angiokeratoma corporis diffusum (afecțiune a vaselor de sânge) și insuficiență intelectuală moderată. Până în prezent, se cunosc trei adulți cu această afecțiune: o persoană de naționalitate japoneză și doi frați spanioli cu cel puțin un părinte consauguin; aceștia au fost identificați și sunt în viață.

Boala Schindler de tipul III, descoperită recent la doi frați germani consanguini și un copil francez (care nu e consanguin cu aceștia), este o formă intermediară și variabilă, cu manifestări variind de la convulsii și retard psihomotor în copilărie, la o formă mai ușoară de autism, cu vorbire și limbaj întârziate și dificultăți de comportament marcate în perioada incipientă a copilăriei.

În toate formele acestei boli rare de stocare lizozomală moștenite [29], defectul enzimatic sever (activitatea reziduală a enzimei crește de la 0,5% până la 2% în plasmă, limfoblaste și fibroblaste (limfoblastele sunt celule embrionare, precursoare ale limfocitelor, limfocitele sunt leucocite cu nucleul foarte voluminos, care se găsesc în limfă și în sânge și au un rol important în procesul de imunitate, iar fibroblastele sunt celule de țesut conjunctiv) conduce către o acumulare neobișnuită de sialilați, asialo-glicopeptide și oligozaharide cu urme de α-N-acetilgalactozaminil, în tipuri variate de țesuturi și fluide corporale.

Sialilarea [30] se referă la tipul și distribuția acizilor sialici în glicanii glicoproteinelor, iar glicanii sunt sinonimi cu polizaharidele, utilizați de asemenea, pentru a desemna grupările glucidice de masă moleculară variată, care sunt legate de proteine (proteoglicani), peptide (peptidoglicani) sau lipide (lipidoglicani).

În urina umană [31], carbohidrații complecși sunt produși de excreție catabolici. Catabolismul este un proces biologic de transformare a unor substanțe complexe, specifice organismului, în alte substanțe mai simple și nespecifice, pe care organismul le elimină. În urină, glicanii apar fie ca oligozaharide libere, fie legate de peptide, cu structuri și concentrații care variază în funcție de diferite condiții fiziologice și patologice.

În toate cele trei stadii ale bolii Schindler, deficitul NAGA a fost identificat ca fiind cauzatorul glicopeptiduriei, iar concentrația O-glicanilor în urină a fost estimată a fi de 100 de ori mai mare decât în cazul oamenilor sănătoși. Din această cauză, screening-ul (screeningul este o examinare inițială, care constă în aplicarea unui ansamblu de procedee și tehnici de investigație unei populații în scopul identificării prezumtive a unei boli, anomalii sau a unor factori de risc), caracterizarea structurală și identificarea completă a aminoacizilor glicosialilați O-GalNAc și a peptidelor extrase din urina pacienților au o importanță majoră în diagnosticare.

Arsenalul dezvoltat de metodele microfluidice sau de spectrometria de masă, prezentate în partea a II-a a fost folosit de novo pentru analiza peptidelor O-glicozilate din urina celor doi germani consanguini, diagnosticați cu boala Schindler (stadiul I).

Fig. 1.6.2. Pacient suferind de boala Schindler [32]

Glicozilarea (chimică) este reacția în care un carbohidrat donor este legat de o grupare hidroxil sau altă grupare funcțională a altei molecule, numită moleculă acceptoare. În principiu, glicosilația se referă la procesul enzimatic care lipește glicanii de proteine, lipide sau alte molecule organice.

Ca un rezumat al celor spuse, putem afirma următoarele:

boala lui Schindler are trei stadii, primul fiind cel mai agresiv, care poate duce la moarte, al doilea este mai puțin agresiv decât primul, iar al treilea, care este recent descoperit, este intermediar între primele două stadii;

în cadrul primului stadiu, se poate observa și după aspectul facial al copilului că acesta suferă de retard mintal, distrofie neuroaxonală, culminând cu o stare vegetativă la vârsta de 3-4 ani în general și debut în perioada infantilă;

al doilea stadiu, mai puțin sever, prezintă o deteriorare (slabă) a intelectului și o afecțiune a vaselor de sânge – angiokeratoma corporis diffusum;

în cazul celui de-al treilea stadiu, pacientul suferind prezintă autism, retard psihomotor sau convulsii.

De menționat este faptul că profesorul Schindler nu a găsit un tratament pentru această boală [33, 34], însă a căutat o terapie de înlocuire a enzimei (enzime replacement therapy), pentru a putea îmbunătăți starea de sănătate a pacienților suferinzi.

Aparatură, materiale și metode

Solvenți, reactivi și materiale

Pentru a putea realiza experimentele optime și pentru a putea pregăti probele pentru analizele prin spectrometria de masă, folosind cuplajul cu robotul NanoMate, au fost folosiți reactivi cu o puritate de grad ridicat și de asemenea, o aparatură performantă, de ultima generație, care să ajute la îndeplinirea activităților studiului.

Solvenții, precum metanol, cloroform, acid formic (98%) sau acetonitril (cu grad de puritate HPLC) au fost achiziționați de la firma Sigma, fiind utilizați, fără a-i purifica ulterior, datorită purificării testate prin infuzie „blank” (înainte de experimente) și datorită calității acestora. De asemenea, s-a folosit și apa bidistilată, în cadrul experimentelor care necesitau dizolvarea probei în apă (la început, probele prelucrate au fost dizolvate în mai mulți solvenți, probând pe rând toți solvenții). Pentru bidistilarea apei, s-a folosit un sistem cu o capacitate bazală de 2000 L de apă cu un total de săruri de 1.79 mol/m3, conductivitatea sistemului fiind de 20 µS/cm (obținând apa bidistilată cu conductivitate 0.1 µS/cm), presiune de 10 bari și debit maxim de 450 L/h.

În ceea ce privește concentrarea, folosind un evaporator cu vid de tipul SpeedVac Concentrator (Fig. 2.1.3), cuplat cu o pompă de vid, de tipul ROTAVAC Valve Control, s-a realizat liofilizarea soluțiilor probelor, astfel, evaporatorul menționat (care are și trapă de răcire), are o capacitate de 40 de orificii pentru tuburile Eppendorf (nu mai mari de 2 microlitri), dar și un display electronic, pentru a putea regla timpul de funcționare și temperatura.

Prelucrarea probelor

Probele uscate au fost cântărite cu ajutorul unei balanțe analitice (Fig. 2.1.4) având o precizie de 0.0001g și capacitatea de măsură de maxim 100g; soluțiile probelor au fost păstrate în tuburi Eppendorf, fiind depozitate în perioada în care s-au realizat experimentele la temperatura de -270C, iar pentru dezghețare s-a folosit un termobloc digital, termobloc cu 20 de orificii pentru tuburile Eppendorf (Fig. 2.1.1), putând încălzi probele până la 1500C. Încălzirea acestora, în vederea dezghețării, s-a făcut prin menținerea probei în termobloc la 250C, timp de 1-2 minute, pentru a nu se deprecia probele de natură biologică pe care le-am analizat.

Fig. 2.1.1. Tuburi Eppendorf

În ceea ce privește optimizarea concentrației, înainte de analiză s-au realizat mai multe diluții ale soluției-stoc, diluții vortexate timp de 1-2 minute, urmând a fi centrifugate timp de 20 minute, într-o minicentrifugă (cu viteză de centrifugare de 6000 rotații pe minut), prevăzută cu un rotor cu 6 orificii pentru tuburile Eppendorf.

În vederea obținerii unor soluții stoc, probele uscate au fost dizolvate în solvenți sau amestecuri de solvenți (cum sunt cei menționați anterior), iar apoi acestea au fost vortexate cu scopul de a se solubiliza (timp de aproximativ 10 minute), folosind un vortex (Fig. 2.1.2) cu o viteză de rotație ridicată, și anume 2900 rotații pe minut, fiind utilizat pentru tuburi cu un diametru de maxim 30 milimetri.

Ulterior, soluțiile au fost centrifugate timp de o oră – două, folosind o centrifugă (de la firma Sigma), cu o viteză de 15000 rotații pe minut, în cele din urmă, fiind colectat supernatantul (deoarece doar prin centrifugare putem evita blocarea orificiilor chip-ului cu impurități solide, impurități care nu s-au dizolvat în urma extracției și prelucrării probelor).

Fig. 2.1.2. Vortex

Fig. 2.1.3. SpeedVac

Fig. 2.1.4. Balanță analitică

Fig. 2.1.5. Pipete

Pipetele folosite (Fig. 2.1.5) pentru obținerea soluțiilor probelor și pentru aplicarea lor în plăcile de microtitrare ale aparatului, au fost pipete automate cu volum reglabil (0.5-10 μL, 5-50 μL sau 100-1000 μL), cu vârf de unică folosință de la firma Eppendorf din Germania.

Metoda folosită pentru a elimina sărurile – dializa, a fost necesară pentru probele de glicopeptide din urina pacienților suferinzi de boala Schindler, fiind aplicată cu ajutorul unor membrane de dializă de 500 Da de tipul „cut-off”, achiziționate din Germania.

Calibrarea spectrelor de masă

Calibrarea spectrelor de masă s-a realizat cu ajutorul unui standard, numit standard de calibrare extern. Standardul, cu numele comercial „tuning mix”, reprezinta un amestec de peptide, ai căror ioni acoperă tot domeniul care cuprinde raportul masă/sarcină, în care se obțin semnale ale probelor analizate, fie prin metoda detecției a ionilor negativi, cât și a celor pozitivi. Spectrele de masă au fost calibrate prin folosirea iodurii de sodiu cumpărată de la firma Sigma, care furnizează semnale ce acoperă domeniul de mase pe care l-am investigat.

Parametrii pentru obținerea ionilor la calibrare cu standardul „tuning mix”:

Temperatura gazului de evaporare: 3500C;

Presiunea gazului: 40 psi;

Debitul gazului de evaporare: 10 L/min;

Intervalul de scanare: 100 – 2500 m/z.

Tabelul 2.1.6. Valorile m/z pentru ioni pozitivi și negativi pentru standardul de calibrare extern de tipul „tuning mix”

Spectrometrul de masă QTOF

(Spectrometrul de masă cuadrupolar hibrid cu timp de zbor)

Aparatura folosită în cadrul experiențelor din laborator este un spectrometru de masă, un spectrometru de masă cuadrupolar hibrid cu timp de zbor (Fig. 2.2.1) QTOF [35, 36], de la firma Waters (Marea Britanie), care posedă o sursă de ionizare prin electropulverizare/ electrospray, o sursă cu o geometrie interesantă, astfel capilarul de electropulverizare este dispus perpedicular pe contraelectrod, pentru ca, în sursă, ionii să aibă o traiectorie în formă de Z. Acest spectrometru este un sistem care combină performanța și simplicitatea analizorului de tip cuadrupolar, cu eficiența analizorului cu timp de zbor, instrument folosit pe tot domeniul maselor, pentru detecția simultană a ionilor.

Elementele constitutive ale spectrometrului sunt:

Analizorul cuadrupolar;

Cameră de ciocnire;

Analizorul reflectron TOF (time of flight).

Principiul de funcționare:

Ionii care sunt generați în sursă ajung să fie transferați către analizorul cuadrupolar, cu ajutorul lentilelor RF; după ce trec prin acesta, ionii ajung în analizorul cu timp de zbor, astfel că acesta funcționează ca un fotomultiplicator (studiat în cadrul efectului fotoelectric), cu excepția că nu se folosește radiația luminoasă, ci pulsul de ioni, astfel: ionii cad pe prima dinodă, extrag electronii, care sunt accelerați către a doua dinodă, fenomenul repetându-se până semnalul ajunge să fie amplificat.

Fig. 2.2.1. Spectrometrul de masă cuadrupolar hibrid cu timp de zbor, de la firma Waters (Marea Britanie)

Am obținut măsurători de masă cu o acuratețe excelentă, astfel s-au putut diferenția componenții de mase similare, datorită puterii de rezoluție ridicate, timpul rapid de răspuns și de acumulare a semnalului făcând ca spectrometrul de masă cuadrupolar cu timp de zbor QTOF să fie cel mai recomandat pentru metoda de ionizare prin electrospray [37], combinată cu spectrometria de masă.

În ceea ce privește spectrometrul cu accelerare ortogonală (QTOF-ul), atât axele analizorului cu timp de zbor, cât și axa sursei au direcții independente, accelerarea fasciculului ionic în sursă făcându-se ortogonal. Există câteva posibilități care sunt favorabile, în ceea ce privește independența axelor, precum cea de a putea controla energia fasciculului ionic din regiunea de accelerare, în mod independent și cea de a putea reduce împrăștierea după viteze în direcția analizorului cu timp de zbor.

În consecință, aceste aspecte reprezintă niște avantaje, deoarece se îmbunătățesc atât sensibilitatea spectrometrului de masă (aceasta se mărește considerabil), atingând valori de la 10 la 100 de ori mai mari decât în cazul spectrometrelor de masă cuadrupolare triple, cât și puterea de rezoluție, care reprezintă o valoare excelentă (și constantă pe domeniul de masă) pentru un analizor precum cel menționat.

În cadrul analizorului cuadrupolar cu timp de zbor QTOF, ionii sunt accelerați și lăsați să zboare liber într-o zonă liberă de câmp, unde vor ajunge în funcție de raportul masă/sarcină (cei care au raportul acesta mai mare, vor ajunge, evident, mai târziu pe detector, în comparație cu un raport mai mic), astfel apare acest tip de separare în funcție de raportul masă/sarcină.

Robotul NanoMate utilizat pentru ionizarea automatizată prin Chip – nanoESI

Pentru a putea analiza probele, le-am electropulverizat printr-un chip de siliciu, cu orificii (în număr de 100-400) de la 2.5 până la 10 µm, astfel proba se ionizează perfect, fiind pregătită pentru fragmentarea prin disocieri induse prin ciocnire. Pentru fragmentarea ionilor, s-a folosit heliu de la firma LindeGaz, România, și pentru desolvatarea probelor, s-a utilizat azot cu o puritate de 99.999 % vol, de la aceeași firmă, ionizarea fiind complet automatizată, iar moleculele nu se fragmentează când traversează spectrometrul de masă.

Fig. 2.3.1. Robotul NanoMate și chip-ul din siliciu (prin amabilitatea Advion BioSciences, USA)

Ionizarea prin chip – nanoESI [38] a fost realizată folosind un robot de tip NanoMate (Fig. 2.3.1) de la firma Advion BioSciences, USA (de la care am achiziționat și plăcile de microtitrare cu 96 de orificii, dar și placa cu vârfurile de infuzie a probelor pentru pipeta conductivă a robotului), conectat la spectrometrul de masă și la un computer care folosește software-ul ChipSoft (pe un sistem de operare de tip Windows).

Cuplajul robotului cu spectrometrul de masă

Robotul NanoMate, cuplat [39] cu spectrometrul de masă cuadrupolar hibrid cu timp de zbor (Fig. 2.4.1) prin metoda chip – nanoESI, complet automatizat a fost prima oară optimizat pentru studiile glicomice; robotul conferă o sursă de ioni automatizată pentru metodele ce folosesc spectrometria de masă [41, 42].

Cuplajul este capabil să prelucreze probe cu debit redus, în jurul valorii de 50-70 nl/ min, însă elementul de bază al acestui cuplaj este chip-ul electrospray [43].

Pregătirea probei pentru analiză nu este o metodă complicată: robotul cu cele 96 de godeuri cuprinse pe un platan ne oferă posibilitatea de analiză a mai multor probe (reducând timpul de prelucrare, astfel rezultatele se pot obține mai repede); proba de analiză este preluată de o pipetă conductivă, aspirată și electropulverizată prin chip (folosind reactivi puternici, chipul este constituit dintr-un substrat de siliciu monolitic), către spectrometrul de masă.

Motivul pentru care proba nu este injectată direct în spectrometrul de masă este mai mult decât evident, dacă luăm în considerare diametrul orificiilor chip-ului (menționat în paragraful precedent), astfel proba nu pătrunde în spectrometrul de masă cu impurități, în caz contrar, chiar dacă acestea ar putea ajunge în aparat, ar modifica considerabil rezultatele pe care le obținem după optimizări.

Dispozitivele convenționale de electrospray definesc câmpul electric la o diferență de potențial între dispozitivul care pulverizează, astfel avem un potențial fluidic, și spectrometrul de masă conectat.

Electropulverizarea este inițializată prin aplicarea unei presiuni inițiale și a unei tensiuni; fiecare godeu și vârf de pipetă e folosit o singură dată, pentru a evita reziduurile și contaminarea tipică injectării automate convenționale.

Robotul a fost cuplat cu spectrometrul de masă printr-un suport special care permite ajustarea (grosieră) a poziției robotului în raport cu conul de eșantionare. Pentru a realiza o poziționare mai bună, s-a folosit software-ul menționat mai devreme, care poate controla robotul în așa fel încât să existe un transfer optim al speciilor ionice în spectrometrul de masă.

Fig. 2.4.1. Conectarea robotului NanoMate la spectrometrul de masă QTOF

În chip-ul electrospray, câmpul electric din jurul godeurilor se formează la apariția unei diferențe de potențial între chip-ul din siliciu menținut la potențial zero și tensiunea aplicată lichidului prin vârful pipetei conductive. Distanța aceasta este mică, de ordinul micronilor, astfel câmpul este constant. De menționat, în ceea ce privește distanța, este faptul că, în comparație cu distanța dintre godeuri și spectrometrul de masă, distanța ce definește câmpul electric este de aproape 1000 de ori mai mică.

În studiile realizate, cuplajul a fost inițial optimizat pentru ioni negativi, deoarece se potrivește cel mai bine experimentelor de ionizare făcute în laborator pentru lucrarea de față.

Pentru a preveni orice tip de contaminare sau doar pentru a elimina posibilitatea unor erori experimentale de măsurare, robotul a fost programat să aspire întregul volum de probă, urmat de 2 µl de aer, prin vârful pipetei; ulterior, proba a fost „livrată” către orificiile chip-ului (acest proces fiind realizat printr-o comandă dată de manipulator și anume „DELIVER SAMPLE”).

În continuare, funcția de electropulverizare a fost inițializată prin aplicarea unei tensiuni cuprinse între 1.4 și 1.9 kV, și o presiune cuprinsă între 0.3 și 1.3 psi. Aceste optimizări au fost cruciale pentru generarea și menținerea analizelor în parametri optimi.

Metodele analitice folosite au demonstrat fiabilitatea spectrometrului de masă cuadrupolar hibrid cu timp de zbor, complet automatizat prin chip nanoESI, cu privire la screening-ul [44, 45] și identificarea peptidelor și glicopeptidelor necesare pentru partea experimentală, fiind foarte util pentru analiza unor amestecuri biologice complexe, putând duce chiar la determinarea unor diagnostice, datorită sensibilității crescute, a reproductibilității, a acurateții, a automatizării și vitezei de procesare și a potențialului de detecție pentru componentele mici din amestecurile complexe și nu în ultimul rând, datorită abilității de a genera un electrospray constant.

Nomenclatura ionilor obținuți prin fragmentare pentru determinarea secvenței glicoconjugaților

În urma fragmentării, se obțin ioni care au un caracter decisiv pentru determinarea secvenței glicoconjugaților [46-48]. Folosind variantele MS/MS sau ESI-QTOF-MS/MS, putem alege condiții, astfel încât, unitățile monozaharidice care constituie lanțul să fie înlăturate, pentru a putea determina secvența glicoconjugaților.

Pentru fiecare fragment, există rezultate cu semnificație specifică și precisă, pe care le vom nota folosind notațiile lui Domon și Costello (acceptate unanim în prezent), după cum se poate vedea în continuare.

După cum știm, orice polizaharid conține două capete, care se leagă de o proteină sau de un lipid; aceste capete pot fi reducătoare sau nereducătoare. Agliconul reprezintă partea lanțului polizaharidic, această parte fiind neglucidică.

Câteodată, fragmentarea lanțului oligozaharidic nu are loc chiar în dreptul legăturilor eterice, dintre unitățile ce le constituie, acestea aflându-se în interiorul hetero-ciclului constituent al zaharului.

În urma scindării acestor legături, rezultă fragmente care se notează cu B și C, în cazul în care conțin capătul nereducător, și cu Z și Y, în cazul în care conțin agliconul și implicit, capătul reducător.

Fig. 2.5.1. Nomenclatura scindărilor din cadrul unei secvențe oligozaharidice, după convenția de notare Domon și Costello

În situația în care fragmentul rămâne atașat de specia ionizată, specie ce conține capătul reducător sau agliconul, îl notăm, conform notațiilor acceptate, cu X, și în caz contrar, îl notăm cu A, în cazul în care fragmentul rămâne atașat de specia (ionizată), care conține capătul nereducător.

Indicii superiori care ne apar în notația lui X și a lui A ne arată unde are loc scindarea, în dreptul cărei legături din hetero-ciclu.

Exemplu: Notația 1,3A3 se referă la faptul că fragmentul respectiv aparține capătului nereducător, scindarea legăturilor între atomii de carbon, numerotați cu 1 și 3 având loc la nivelul celui de-al treilea zahar.

3. Rezultate experimentale. Discuții

Analiza pe oligozaharide

Începând cu sfârșitul secolului XX și continuând cu secolul XXI, secvențierea oligozaharidelor și a glicoproteinelor reprezintă un succes remarcabil în domeniile cu aplicabilitate ridicată, deși legăturile numeroase și problemele existente în ceea ce privește ionizarea acestora au împiedicat folosirea nemodificată la nivelul grupărilor hidroxilice a spectrometriei de masă.

Odată cu apariția celor două metode care au revoluționat spectrometria de masă și anume, ionizarea prin electrospray/ electropulverizare și ionizarea prin desorbție laser asistată de o matrice, lucrurile s-au schimbat, astfel încât, cu acestea, putem obține informații importante cu privire la felul cum se leagă oligozaharidele în interiorul lanțului polizaharidic și de asemenea, și cum se pot îndepărta acestea, rând pe rând.

Legăturile dintre unitățile monozaharidice, care sunt și cele mai frecvente sunt legăturile cele mai afectate de fragmentare. Fragmentarea oligozaharidelor poatea avea loc atât în modul „ion negativ”, cât și în modul „ion pozitiv”, rezultând fragmente, în care apar picuri cu valori mai mari decât masa teoretică calculată – valorile obținute au cu 23 Da sau 39 Da (sau multipli ai acestor valori) mai mult decât masa teoretică.

Mai există și pierderi de una sau mai multe molecule de apă, astfel încât picul respectiv apare cu o masă mai mică cu 18 Da (sau multipli ai acestei valori), putând deduce astfel ce tip de legătură avem între unitățile glucidice (ba chiar și natura unității glucidice) și ordine în care se succed în lanț aceste unități glucidice.

De ce se întâmplă acest lucru?

Acest lucru se întâmplă datorită faptului că soluția în care se concentrează oligozaharidele care vor fi ionizate conține ioni de potasiu sau sodiu (în locul acestuia poate fi tot potasiu sau uneori, ambii ioni), formând aducți cu grupările hidroxilice, apărând în spectru acei picuri care corespund ionilor mono-, di- sau poli- sodiați.

Aplicarea și dezvoltarea metodei pentru analiza structurală și compozițională a glicopeptidelor din urina pacientului

În ceea ce privește analiza structurală și compozițională a glicopeptidelor din urina pacientului, aplicarea și dezvoltarea metodei a fost un pas mare în realizarea acestei analize.

De-a lungul timpului, s-au elaborat și chiar publicat numeroase metode de identificare a componentelor O-glicopeptidice, prezente în urina pacienților, bazate pe diverse tehnici de spectrometrie de masă.

În cadrul studiului, etapa imediată a avut în vedere testarea, optimizarea și aplicarea cuplajului de care am vorbit anterior (cuplajul NanoMate QTOF MS) pe o categorie de compuși glicoconjugați, mai exact un amestec complex de peptide O-glicozilate, existente în urina unor pacienți suferinzi de boala Schindler de tipul I, care au o deficiență enzimatică de α-N-acetilgalactozaminidază, deficiență ce duce la acumularea de aminoacizi și peptide glicozilate sialilate (pe care le luăm, de exemplu, din mâncare), ducând până la moarte, deoarece enzima care este în deficit în cazul acestor pacienți acționează asemeni unei foarfece, descompunând moleculele care sunt absorbite de organism.

Determinarea componentelor care se elimină prin urină, drept produși catabolici de excreție are o importanță deosebită, fiind implicate în realizarea unui tratament eficient.

Prin fragmentare, folosind disocierea indusă prin ciocnire, CID (collision induced dissociation), structurile au putut fi analizate, obținând rezultate remarcabile.

Deoarece componentele de glicopeptide acumulate sunt într-un număr foarte mare, detectarea/ identificarea lor în totalitate este practic, imposibilă, în cazul lipsei unei metode eficiente și sensibile, cum ar fi analiza prin spectrometria de masă.

Tehnica combinată NanoMate QTOF MS (cuplajul spectrometrului de masă cuadrupolar hibrid cu un robot NanoMate) s-a dovedit a fi cea mai eficientă pentru analiza amestecului complex extras din urina pacientului (metodă neinvazivă), deoarece, prin aceasta, s-au putut separa componentele [49] din amestec, iar, după separarea prin electropulverizare, acestea au putut fi detectate.

În comparație cu tehnica disocierii induse prin ciocnire, metoda CE (capillary electrophoresis, electroforeza capilara) prezintă câteva dezavantaje, deși rezultatele au fost remarcabile, din punct de vedere al numărului de componente noi identificate, dar și din punct de vedere al acurateții informațiilor structurale, precum:

Timpul de analiză ridicat (de ordinul zecilor de minute), pentru separarea prin capilar și detecția de către spectrometrul de masă;

Necesitatea realizării unei interfețe de cuplaj între spectrometrul de masă și cromatografia prin electroforeză;

Consum ridicat de probă;

Costuri mari pentru realizarea interfeței, mentenanța aparaturii și întreținerea sa.

Neajunsurile acestei metode au dus la analiza prin NanoMate MS a unei fracțiuni separate prin cromatografie [50] pe gel permeabil din amestecul complex de glicopeptide, obținând date destul de promițătoare, având în vedere consumul mic de probă și timpul redus de analiză, arătând că prin această metodă putem identifica și componente mici din amestecuri complexe, fără a mai fi nevoie de alte ajustări sau cuplaje.

Analiza de screening prin chip – electrospray utilizând cuplajul NanoMate – QTOF a glicopeptidelor din urina pacientului

Pentru a putea extinde cercetările care s-au raportat la amestecul de glicopeptide, amestec extras și purificat din urina unui pacient suferind de boala Schindler, am supus acest amestec la o analiză, folosind cuplajul NanoMate QTOF MS, în condițiile menționate în paragraful în care a fost descris deja acest tip de cuplaj.

Proba a fost dizolvată în mai mulți solvenți, cu concentrații diferite, în final folosind metanolul ca solvent, la o concentrație de 5 pmoli/µl, apoi am analizat-o folosind tehnica de detecție a ionilor negativi, deoarece s-a dovedit a fi cea mai bună variantă, după ce am făcut numeroase optimizări.

Observațiile pe care le-am făcut au scopul de a arăta că structurile moleculare prezente în acest amestec sunt toate specii sialilate. Prin deprotonarea moleculei Neu5Ac, în soluție, glicopeptida formează cationi, datorită prezenței acidului sialic Neu5Ac.

Optimizarea pentru analiza compoziției glicopeptidelor sialilate, care au fost extrase prin metode neinvazive din urina unui pacient suferind de boala Schindler tipul I, folosind cuplajul NanoMate QTOF MS s-a realizat cu ajutorul următoarelor caracteristici: potențialul chip-ului: 10V, tensiunea contraelectrodului: 40V, timpul de acumulare al semnalului: 10 minute, solvent: CH3OH (metanol), în concentrație de 80%, precizie de 20 părți-pe-milion (ppm), calibrarea fiind făcută cu iodură de sodiu (NaI), presiunea azotului: 15 psi, temperatură de desolvatare: 70oC.

Următoarea etapă s-a realizat prin folosirea solventului corespunzător, în care am dizolvat proba, apoi am vortexat-o 10 minute și ulterior, am supus-o centrifugării la o viteză de 5000 rotații pe secundă, timp de 40 de minute. Supernatantul colectat după centrifugare a fost electropulverizat prin ESI în spectrometrul de masă cuadrupolar hibrid cu timp de zbor, folosind tehnica de ion negativ, după ce proba a fost depusă în orificiul plăcii de microtitrare a robotului NanoMate.

S-a obținut, după condiții optimizate, prin achiziționarea semnalului timp de 10 minute, un spectru de masă, pe care îl voi prezenta în cele ce urmează, identificând specii diferite, și anume numeroase glicoforme din amestecul pe care l-am analizat, chiar dacă nu a fost implicată o tehnică de separare cuplată cu spectrometrul, pentru ionizarea probei.

Aceste măsurători de screening (Fig. 3.2.1) au arătat că în amestecul complex biologic există O-glicopeptide cu un lanț peptidic scurt (Ser și Thr) și lanțuri de carbohidrat cu dimensiune variabilă (Fig. 3.2.1.).

Condiții aplicate:

Timp de achiziție a semnalului: 1 min.;

Consumul mediu al probei: 2 pmoli;

Solvent: MeOH

Concentrația probei: 15 pmoli/µl;

Se poate observa faptul că spectrul este foarte bogat în semnale, fiecare semnal fiind echivalent cu o specie, identificând câteva sute de specii diferite de glicopeptide, iar pentru a identifica structura acestor oligozaharide pe care le vedeți aici, am izolat câteva dintre ele și le-am supus fragmentărilor prin disocieri induse prin ciocnire.

Fig. 3.2.1. Spectrul nanoESI prin chip MS al amestecului de glicopeptide din urina pacientului; rezultate originale, publicate conform [3]

Analiza comparativă a glicopeptidelor din urina pacientului, față de urina unui individ sănătos

Din spectrul nanoelectrospray prin chip al amestecului de glicopeptide din urina pacientului este evident că spectrul este foarte bogat în semnale, fiecare semnal fiind echivalent cu o specie, identificându-se astfel câteva sute de specii diferite de glicopeptide.

Pentru a identifica structura acestor oligozaharide pe care le-am prezentat în această lucrare, am izolat câteva dintre ele și le-am supus fragmentărilor prin disocieri induse prin ciocnire; In figura 3.2.2 se prezinta o zonă magnificată, pentru a evidenția spectrul pe tot domeniul (de la 500 la 1250), dar dacă se aplică în continuare procedeul de magnificare, se vor putea observa câteva sute de componente sunt în urină, spre deosebire de indivizii sănătoși (Fig. 3.2.3.).

Fig. 3.2.2. Spectrul nanoESI prin chip MS al amestecului: zona magnificată m/z; rezultate originale, publicate conform [3]

Condiții aplicate:

Timp mediu de achiziție: 1 min.;

Consumul mediu al probei: 2 pmoli;

Solvent: MeOH

Concentrația probei: 15 pmoli/µl;

Fig. 3.2.3. Spectrul nanoESI prin chip MS al amestecului de glicopeptide din urina unui individ sănătos; rezultate originale, publicate conform [3]

Condiții aplicate:

Timp mediu de achiziție: 1 min.;

Consumul mediu al probei: 2 pmoli;

Solvent: MeOH

Concentrația probei: 15 pmoli/µl.

Fig. 3.2.4. Structura moleculară a ionului dublu încărcat, la m/z 897.79

Fig. 3.2.5. Modul de fragmentare prin chip MS/MS al NeuAc2Gal3GlcNAc2GalNAc-Thr (analiză structurală prin tandem MS); rezultate originale, publicate conform [3]

Condiții aplicate:

Timp mediu de achiziție: 1 min.;

Consumul mediu al probei: 2 pmoli;

Solvent: MeOH

Concentrația probei: 15 pmoli/µl.

Ulterior, am identificat exact structura, una din cele mai importante fiind octa-zaharida legata de aminoacidul treonină (Fig. 3.2.4 – 3.2.6). O altă structură identificată prin fragmentare, este una deosebit de important din punct de vedere biologic si anume o tetrazaharidă, legate de treonină, care are și o fucoză, structuri care nu s-au identificat și la indivizii sănătoși (Fig. 3.2.7).

Fig. 3.2.6. Spectrul MS/MS, obținut prin disocieri induse prin ciocnire, la energii joase a ionului dublu încărcat la m/z: 897.79; rezultate originale, publicate conform [3]

Condiții aplicate:

Fereastră de izolare: 2 Da;

Debitul de electrospray 50 µl/min;

Timp mediu de achiziție: 1 min.;

Consumul mediu al probei: 2 pmoli;

Energie de ciocnire: 40-80 eV;

Gaz de ciocnire: Ar.

Fig. 3.2.7. Spectrul nanoESI prin chip MS/MS a simplului ion încărcat prin disocieri induse prin ciocnire la m/z: 920.25; rezultate originale, publicate conform [3]

Condiții aplicate:

Fereastră de izolare: 2 Da;

Debitul de electrospray 50 µl/min;

Timp mediu de achiziție: 1 min.;

Consumul mediu al probei: 2 pmoli;

Energie de ciocnire: 20-40 eV;

Gaz de ciocnire: Ar.

Ca o comparație, in Tabelul 3.2.1 se pot observa O-glicopeptidele care s-au identificat în cazul pacientului cu boala Schindler, în comparație cu un individ sănătos (Tabel 3.2.2), în cazul căruia există mai puține structuri și care sunt mult mai scurte (mai puțin complexe din punct de vedere structural).

Tabelul 3.2.1. Structurile identificate prin chip nanoESI MS în urina pacientului suferind de boala Schindler; rezultate originale, publicate conform [3]

Tabel 3.2.2. Structurile identificate prin chip nanoESI MS în urina individului sănătos; rezultate originale, publicate conform [3]

Analiza structurală prin tandem MS. Determinarea structurii biomarkerilor din urina pacientului cu boala lui Schindler

Înainte de achiziția spectrului de masă, ionul care corespunde unei specii moleculare, a cărei structură se dorește a fi determinată (o altă denumire este cea de „ion precursor”) este fragmentat într-o celulă de ciocnire, în cadrul studiilor MS/MS. Acest aspect reprezintă un punct de pornire pentru secvențierea peptidelor/ carbohidraților, elucidarea structurală, dobândirea selectivității și a unei sensibilități ridicate în ceea ce privește analiza cantitativă, dar și identificarea analiților cu ajutorul prezenței fragmentelor de tip „diagnostic” sau „amprentă”.

O metodă comună de fragmentare, numită și în cadrul capitolului „Aparatură, materiale și metode”, este disocierea indusă prin ciocnire (în cărțile de specialitate se mai găsește și sub forma de „descompunere activată prin ciocnire”), astfel, ionul precursor suferă ciocniri care se repetă, ciocniri cu atomii gazului de coliziune, producându-se „ionii-produși” atunci când crește energia potențială a moleculei (până când se atinge pragul de fragmentare).

Fig. 3.2.8. Reprezentarea schematică a proceselor implicate în disocierea indusă prin ciocnire

Modul de funcționare al metodei nu este unul complicat, rezultând, în urma interacțiunii, fragmente mari, putând fi reținute, separate și trimise în camera de coliziune unde procesul de reia, fiecare putând trece prin aceste procese, astfel: ionul molecular intră în celula de ciocnire, sau, în cazul altor analizoare, este izolat în capcană, ceilalți ioni fiind îndepărtați, celulă de ciocnire în caz există un gaz de ciocnire (Ar, He, N2, CO2) energizat, aflat la o presiune ridicată și inert din punct de vedere chimic.

Există câteva considerente de care trebuie să ținem cont în ceea ce privește tipul fragmentării, deoarece acesta variază în funcție de tipul ionilor-produși și de cantitatea de energie care este implicată în proces, și anume: la energii ridicate, apar reacții retro – sintetice, care sunt mai semnificative din punct de vedere structural și au ca rezultat ruperea moleculelor, putând apărea chiar scindări (scindări ce duc la fragmentare necontrolată, pe care, evident, trebuie să o evităm) ale legăturii simple de carbon; în cazul energiilor joase, aproape de pragul inferior, în funcție de natura ionului precursor, reacțiile de fragmentare se limitează deseori la pierderi neutre: H2O, CO, CO2, MeOH, MeCN; chiar dacă aceste pierderi se pot folosi pentru a obține informații legate de grupările funcționale, pierderile de molecule neutre (din punct de vedere structural), nu sunt considerate semnificative.

În ceea ce privește peptidele, prin disocieri induse prin ciocnire, fragmentarea lanțului peptidic se face aleatoriu, astfel o limitare considerabilă este imposibilitatea de a studia modificările posttranslaționale ale proteinelor, pentru că legăturile prin care se atașează de lanțul peptidic sunt mai slabe, rupându-se mai repede decât legăturile dintre aminoacizii ce le constituie, chiar dacă se obțin multe informații structurale.

Un lucru important, de care trebuie să ținem cont, este faptul că trebuie să utilizăm energii în jurul pragului de fragmentare, sau chiar mai jos de acesta, MS/MS putându-se realiza prin mai multe metode și anume:

Folosirea analizorului cu capcană ionică;

Cuplarea mai multor intrumente, fie de același tip, fie de tipuri diferite.

Cel mai bun control asupra disocierii induse prin ciocnire sunt instrumentele cu capcană ionică și cele prin rezonanță cu ioni ciclotrone a transformatei Fourier (FTICR), permițând experimente cu stadii multiple de fragmentare, fiind esențiale pentru studiile de elucidare structurală, deși tind să producă reacții energetice mai puține, în comparație cu QTOF, care produce fragmentări mai multe (deși controlul de operare este mai redus).

Pentru a mări debitul experimentului, sensibilitatea și cel mai important lucru, reproductibilitatea necesară pentru analiza glicopeptidelor din urina pacientului, comparativ cu testele standard, noile protocoale și tehnici bazate pe spectrometrele de masă microfluidice au fost implementate în zona bolilor de stocare lizozomale.

Până în prezent, două tipuri de sisteme microfluidice, aflate în legătură cu spectrometrele de masă au fost optimizate și introduse pentru investigații legate de bolile de stocare lizozomale: sistemul NanoMate care permite manipularea robotizată a probei, urmat de metoda chip nanoelectrospray, bazată pe un chip din Siliciu și un microchip planar din polimeri, încorporând un microcanal la capătul unde electrospray-ul este generat.

Deși au fost aplicate până în prezent doar în cazul bolii Schindler, spectrometrele de masă microfluidice au arătat abilitatea de a descoperi în urina pacienților aminoacizi O-glicozilați și O-glicopeptide, ca biomarkeri ai bolii, utili pentru diagnosticul rapid.

Este greu de diagnosticat un pacient suferind de boala Schindler, deoarece prezintă simptome care conduc către alte boli, precum epilepsia sau autismul, de aceea introducerea acestor metode de analiza ofera o perspectiva clara in acest domeniu.

Mai mult decât atât, toate experimentele bazate pe spectrometria de masă prin chip, pentru screening-ul și separarea prin disocieri induse prin ciocnire a glicanilor extrași din urina pacienților suferind de boala lui Schindler, comparativ cu indivizii sănătoși au fost caracterizate de sensibilitate de neegalat, reproductibilitate, precizie și calitate.

4. Concluzii. Perspective

Lucrarea de față a avut următoarele ținte specifice ale cercetării:

Screeningul detaliat al glicopeptidelor sialilate, al asialo-glicopeptidelor, dar și al oligozaharidelor libere, prezente în urina ambilor copii afectați;

Detecția, fragmentarea și identificarea tuturor structurilor posibile modificate sau alungite de atașamentele periferice, precum O-Ac si O-Fuc și numărul de reziduuri de tipul NeuAc;

Analiza structurală detailată prin spectrometria de masă în tandem, bazată pe tehnici de disociere de tipul collision-induced, cu eficiență ridicată;

Determinarea expresiei O-GalNAc-Ser/Thr din urina unui copil sanatos de aceeasi vârsta in vederea analizelor comparative.

Amestecurile complexe ale peptidelor de O-glicozilate au fost extrase, purificate, separate și pre-fracționate la Universitatea din Bonn, Germania. Întreaga procedură de preparare este descrisă în publicațiile originale.

Luând în considerare obiectivele prezentate în debutul lucrării și scopul stabilit al lucrării de față, se pot deriva următoarele concluzii din rezultatele experimentale pe care le-am obținut:

În această lucrare s-a prezentat un cuplaj deosebit de important în cadrul ariei acestor studii, și anume cuplajul dintre un robot NanoMate și un spectrometru de masă cuadrupolar hibrid cu timp de zbor (QTOF), spectrometru ce reprezintă un instrument ce conține un analizor bazat pe separarea ionilor în funcție de raportul masă/sarcină, capabil să funcționeze în regim de tandem MS, având o acuratețe și rezoluție extrem de ridicate;

În ceea ce privește cuplajul realizat, s-a presupus montarea interfeței robot – spectrometru și, pentru funcționarea în conexiune – adaptarea atât a spectrometrului, cât și a robotului;

După realizarea cuplajului dintre cele două aparate, pentru a putea permite lucrul în regim cuplat, a fost necesară optimizarea parametrilor funcționali ai celor două instrumente;

Datorită faptului că se folosesc cantități picomolare de probe necesare pentru o investigare completă din punct de vedere structural a extractelor biologice complexe, s-a dovedit sensibilitatea ridicată a experimentului, ceea ce reprezintă un avantaj major al acestei tehnologii;

Această platformă bazată pe chip electrospray s-a putut testa, optimiza și aplica pe o varietate de amestecuri complexe, pentru a verifica fezabilitatea analizelor de probe biologice complexe, dar și pentru elaborarea protocoalelor a cât mai multor tipuri de biomolecule, protocoale adecvate care să permită abordarea acestora în ceea ce privește screening-ul și identificarea compozițională structurală detailată;

Prin cuplajul NanoMate QTOF MS s-au studiat glicopeptidele sialilate, extrase din urina unui pacient suferind de boala lui Schindler de tipul I, deoarece acesta oferă rezultate de screening și analiza structurală asupra acestor compuși cu un rol semnificativ din punct de vedere biologic; astfel, pentru asemenea tipuri de biomolecule extrase din acest tip de matrice umană, postularea unui potențial rol de biomarker al acestei specii a fost posibilă, conform rezultatelor;

În comparație cu metodele tradiționale, de infuzie bazată pe electrospray cu capilar, această platformă analitică a demonstrat un grad mare de superioritate, în ceea ce privește capacitățile și performanța sa;

S-au observat o serie de avantaje, permițând detectarea speciilor minore care reprezintă biomakeri relevanți [51,52], specii ce nu ar putea fi detectate prin alte metode analitice; astfel am observat avantaje ca de exemplu, faptul că oferă o viteză de lucru ridicată, datorită automatizării manipulării probei, un semnal de electrospray stabil pe timp îndelungat, eficiență ridicată a ionizării, reproductivitate ridicată și intensitate constantă a semnalului de electrospray;

Studiul realizat prezintă o importanță deosebită deoarece sistemul folosit a fost optimizat și aplicat cu succes pentru investigarea polizaharidelor lungi legate de peptide si aminoacizi, putând fi caracterizate prin tehnica MS/MS, folosind disocierea indusă prin ciocnire;

– Rezultatele pe care le-am obținut au arătat că sistemul este capabil să genereze spectre de masă cu rezoluție ridicată, cu o eficiență a ionizării, sensibilitate și viteză ridicate, în comparație cu alte tehnici de ionizare, calitatea lor fiind superioară.

Noile metode de spectrometrie de masă prin metoda chip au fost implementate pentru analiza compozițională a amestecurilor foarte eterogene de peptide O-glicozilate sialilate din urina pacienților diagnosticați cu boala Schindler vs. indivizii sănătoși.

În cadrul acestui studiu, glicoformele care prezintă zaharide variate cu catena lungă, crescând de la tri- la dodecazaharide, suportând până la trei radicali de acizi sialici au putut fi pentru prima oară detectate și identificate direct sub o deviație medie de masă de sub 6ppm (părți pe milion).

Spectrometria de masă prin chip electrospray, optimizată pentru ionii negativi reprezintă deci o metodologie avansată pentru screening-ul și identificarea unor componente unice din amestecurile complexe de aminoacizi și peptide sialilate O-glicozilate.

Metoda expusă aici reprezintă o platformă sigură pentru identificarea și elucidarea structurală de biomolecule cu valoare de diagnostic pentru pacienții cu boli de stocare lizozomală și un instrument adițional versatil pentru studiile funcționale glicomice.

Perspectivele pe care le am au o țintă clară: voi continua cu cercetarea, de-a lungul ciclului de Master și Doctorat, în care doresc să continui cu studiul aprofundat al bolilor de stocare lizozomală, căutarea unor terapii de înlocuire a enzimelor [53-58] de care corpul are nevoie pentru o funcționare mai bună (dacă nu normală), aplicarea pentru proiecte de cercetare, implicare în acestea și desfășurarea mai multor stagii de cercetare în diverse țări în care sunt grupuri de cercetători care au același scop ca și mine.

5. Bibliografie

[1] Khatiwada B., Pokharel A., Lysosomal storage disease, JNMA J Nepal Med Assoc. 48(175), 5-242, 2009

[2] Henley W.E., Anderson L.J., Wyatt K.M., Nikolaou V., Anderson R., Logan S., The NCS-LSD cohort study: a description of the methods and analyses used to assess the long-term effectiveness of enzyme replacement therapy and substrate reduction therapy in patients with lysosomal storage disorders, J Inherit Metab Dis., 2014

[3] Sârbu M., Robu A.C., Mălăescu I., Zamfir A.D., Austrian Mass Spectrometry Forum, Vienna, Feb. 16-22, 2014,

[4] http://www.ilsussidiario.net/img/Emmeciquadro/16/Otoleva_Fenn_ok.jpg

[5] Yahmashita M, Fenn J.B., Electrospray Ion Source. Another Variation on the Free-Jet Theme, J.Phys.Chem. 88, 4451-4459, 1984

[6] Chen Y., Allegood J., Liu Y., Wang E., Cachón-González B., Cox T.M., Merrill A.H. Jr, Sullards M.C., Imaging MALDI mass spectrometry using an oscillating capillary nebulizer matrix coating system and its application to analysis of lipids in brain from a mouse model of Tay-Sachs/Sandhoff disease, Anal. Chem. 80, 2780-2788, 2008

[7] Zamfir A.D., König S., Althoff J., Peter-Katalinić J., Capillary electrophoresis and off-line capillary electrophoresis-electrospray ionization quadrupole time-of-flight tandem mass spectrometry of carbohydrates, J Chromatogr A. 895(1-2), 9-291, 2000

[8] Mesmin C., Cholet S., Blanchard A., Chambon Y., Azizi M., Ezan E., Mass spectrometric quantification of AcSDKP-NH2 in human plasma and urine and comparison with an immunoassay, Rapid Commun Mass Spectrom. 26, 72-163, 2012

[9] Fenn J.B., Mann M.., Meng C.K., Wong S.F., Whitehouse C.M., Electrospray ionization-principles and practice, Mass Spectrom. Rev. 9, 37-70, 1990

[10] Fenn J.B., Mann M., Meng C.K., Wong S.F., Whitehouse C.M.., Electrospray ionization for mass spectrometry of large biomolecules., 2003

[11] Yang Y., Kameoka J., Wachs T., Henion J.D., Craighead H.G., Quantitative mass spectrometric determination of methylphenidate concentration in urine using an electrospray ionization source integrated with a polymer microchip.Anal Chem. 76(9), 2568-74, 2004

[12] Vukelić Ž., Zarei M., Peter-Katalinić J., Zamfir A.D., Analysis of human hippocampus gangliosides by fully-automated chip-based nanoelectrospray tandem mass spectrometry, J.Chromatogr.A 1130, 238-245, 2006

[13] Zhang S., Chelius D., Characterization of protein glycosylation using chip-based infusion nanoelectrospray linear ion trap tandem mass spectrometry, J.Biomol.Technol. 15, 120-133, 2004

[14] Louw S., Njoroge M., Chigorimbo-Murefu N., Chibale K., Comparison of electrospray ionisation, atmospheric pressure chemical ionisation and atmospheric pressure photoionisation for the identification of metabolites from labile artemisinin-based anti-malarial drugs using a QTRAP® mass spectrometer, Rapid Commun Mass Spectrom. 26(20), 42-2431, 2012

[15] Van Pelt C.K., Zhang S., Fung E., Chu I., Liu T., Li C., Korfmacher W.A., Henion J., A Fully Automated Nanoelectrospray Tandem Mass Spectrometric Method for Analysis of CaCo-2 Samples, Rapid Commun.Mass Spectrom 17, 1573-1578, 2003

[16] Sârbu M., Ghiulai R.M., Zamfir A.D., Recent developments and applications of electron transfer dissociation mass spectrometry in proteomics, Amino Acids, 2014

[17] Schindler D., Kleijer W.J., Huijmans J.M., Galjaard H., Linden H.U., Peter-Katalinić J., Egge H., Dabrowski U., Cantz M., Lysosomal alpha-N-acetylgalactosaminidase deficiency: a new inherited metabolic disease 2, 804, 1987

[18] Kadali S., Kolusu A., Gummadi M.R., Undamatla J., The Relative Frequency of Lysosomal Storage Disorders: A Medical Genetics Referral Laboratory's Experience From India, 2014

[19] Silva L.B., Badiz T.C., Enokihara M.M., Porro AM., Fabry disease: clinical and genotypic aspects of three cases in first degree relatives, An Bras Dermatol. 89, 3-141, 2014

[20] Caetano F., Botelho A., Mota P., Silva J., Leitão Marques A., Fabry disease presenting as apical left ventricular hypertrophy in a patient carrying the missense mutation R118C, S0870-2551(14)00050-X, 2014

[21] http://www.ymed.ro/images/2012/01/Angiokeratom.jpg

[22] http://lasanateca.com/img/cms/hiperhidrosis_palmar.jpg

[23] http://www.e-oftalmolog.ro/wp-content/uploads/2013/01/descematocel.jpg

[24] Sedel F., Turpin J.C., Baumann N., Neurological presentations of lysosomal diseases in adult patients, Rev Neurol (Paris) 163(10), 29-919, 2007

[25] Wang A.M., Schindler D., Desnick R., Schindler disease: the molecular lesion in the alpha-N-acetylgalactosaminidase gene that causes an infantile neuroaxonal dystrophy.J Clin Invest. 86(5), 1752, 1990

[26] http://www.microbiology.columbia.edu/images/schindler.jpg

[27] Zamfir A.D., Vukelić Ž., Schneider A., Sisu E., Dinca N., Ingendoh A., J Biomolec Techniques 18, 188-193, 2007

[28] Linden H. U., Klein R. A., Egge H., Peter-Katalinić J., Dabrowski J., Schindler D., Biol. Chem., 2002

[29] Wenger D.A., Luzi P., Rafi M.A., Lysosomal storage diseases: heterogeneous group of disorders, Bioimpacts. 3, 7-145, 2013

[30] Froesch M., Bindila L., Zamfir A.D., Peter-Katalinić J., Sialylation analysis of O-glycosylated sialylated peptides from urine of patients suffering from Schindler's disease by Fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometry and sustained off-resonance irradiation collision-induced dissociation Rapid Commun. Mass Spectrom. 17, 2822-2832, 2003

[31] Breier A.C., Cé J., Coelho J.C., Correlation of the levels of glycosaminoglycans between urine and dried urine in filter paper samples and their stability over time under different storage temperatures, Clin Chim Acta. 433C, 49-53, 2014

[32] http://ghr.nlm.nih.gov/condition/schindler-disease

[33] Liao H.C., Chiang C.C., Niu D.M., Wang C.H., Kao SM., Tsai F.J., Huang Y.H., Liu H.C., Huang C.K., Gao H.J., Yang C.F., Chan M.J., Lin W.D., Chen Y.J., Detecting multiple lysosomal storage diseases by tandem mass spectrometry – A national newborn screening program in Taiwan, Clin Chim Acta. 431C, 80-86, 2014

[34] Zamfir A.D., J Chromatogr A 1159, 2-13, 2007

[35] Zamfir A.D., Peter-Katalinic J., Glycoscreening by on-line sheathless capillary electrophoresis/electrospray ionization-quadrupole time of flight-tandem mass spectrometry, Electrophoresis 22(12), 57-2448, 2001

[36] Vukelić Ž., Zamfir A.D., Bindila L., Froesch M., Peter-Katalinić J.., Usuki S., Yu R.K., Screening and sequencing of complex sialylated and sulfated glycosphingolipid mixtures by negative ion electrospray Fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometry, J.Am.Soc.Mass Spectrom. 16, 571-580, 2005

[37] Zamfir A.D., Dinca N., Sisu E, Peter-Katalinić J., Copper-coated microsprayer interface for on-line sheathless capillary electrophoresis electrospray mass spectrometry of carbohydrates, J Sep Sci. 29(3), 22-414, 2006

[38] Flangea C., Moșoarcă C., Cozma C., Gălușcă M., Przybylski M., Zamfir A.D., Testing the feasibility of fully automated chip-based nanoelectrospray ionization mass spectrometry as a novel tool for rapid diagnosis of Fabry disease, Electrophoresis 34(11), 80-1572, 2013

[39] Almeida R., Moșoarcă C., Chiriță M., Udrescu V., Dincă N., Vukelić Ž., Allen M., Zamfir A.D., Coupling of fully automated chip-based electrospray ionization to high-capacity ion trap mass spectrometer for ganglioside analysis, Anal Biochem. 378, 43-52, 2008

[40] Gray N., Heaton J., Musenga A., Cowan D.A., Plumb R.S., Smith N.W., Comparison of reversed-phase and hydrophilic interaction liquid chromatography for the quantification of ephedrines using medium-resolution accurate mass spectrometry, J Chromatogr. A 1289, 37-46, 2013

[41] Zamfir A.D., Sisteme avansate de microchip pentru spectrometria de masă și aplicații, Cluj – Napoca: Editura Canonica, 2008

[42] Biancardi A., Piro R., Dall'asta C., Galaverna G., A simple and reliable liquid chromatography-tandem mass spectrometry method for the determination of aflatoxin M1 in milk, Food Addit Contam Part A Chem Anal Control Expo Risk Assess. 30, 8-381, 2013

[43] Bindila L., Froesch M., Lion N., Vukelić Ž., Rossier J.S., Girault H.H., Peter-Katalinić J., Zamfir A.D., A thin chip microsprayer system coupled to Fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometry for glycopeptide screening, Rapid Commun Mass Spectrom. 18-23, 20-2913, 2004

[44] Bonesso L., Piraud M., Caruba C., Van Obberghen E., Mengual R., Hinault C., Fast urinary screening of oligosaccharidoses by MALDI-TOF/TOF mass spectrometry, Orphanet J Rare Dis. 6, 9-19, 2014

[45] Niesser M., Koletzko B., Peissner W., Determination of creatinine in human urine with flow injection tandem mass spectrometry, Ann Nutr Metab. 61, 21-314, 2012

[46] Shihabuddin L.S., Aubert I., Stem cell transplantation for neurometabolic and neurodegenerative diseases, Neuropharmacology. 58, 54-845, 2010

[47] Tomaszewski M., White C., Patel P., Masca N., Damani R., Hepworth J., Samani N.J., Gupta P., Madira W., Stanley A., Williams B., High rates of non-adherence to antihypertensive treatment revealed by high-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (HP LC-MS/MS) urine analysis, Heart 2, 10-1136, 2014

[48] Kwapiszewski R., Szczudlowska J., Kwapiszewska K., Chudy M., Brzozka Z., Determination of Acid _-Galactosidase Activity: Methodology and Perspectives, Indian J Clin Biochem., 57-62, 2014

[49] Hasilik A., Wrocklage C., Schröder B., Intracellular trafficking of lysosomal proteins and lysosomes, Int J Clin Pharmacol Ther. 47, 2009

[50] Kaneko K., Kobayashi R., Yasuda M., Izumi Y., Yamanobe T., Shimizu T., Comparison of matrix proteins in different types of urinary stone by proteomic analysis using liquid chromatography-tandem mass spectrometry, Int J Urol. 19(8), 72-765, 2012

[51] Te Vruchte D., Speak A.O., Wallom K.L., Al Eisa N., Smith D.A., Hendriksz C.J., Simmons L., Lachmann R.H., Cousins A., Hartung R., Mengel E., Runz H., Beck M., Amraoui Y., Imrie J., Jacklin E., Riddick K., Yanjanin N.M., Wassif C.A., Rolfs A., Rimmele F., Wright N., Taylor C., Ramaswami U., Cox T.M., Hastings C., Jiang X., Sidhu R., Ory D.S., Arias B., Jeyakumar M., Sillence D.J., Wraith J.E., Porter F.D., Cortina-Borja M., Platt F.M., Relative acidic compartment volume as a lysosomal storage disorder-associated

Biomarker, J Clin Invest. 72835, 2014

[52] Molin L., Seraglia R., Lapolla A., Ragazzi E., Gonzalez J., Vlahou A., Schanstra J.P., Albalat A., Dakna M., Siwy J., Jankowski J., Bitsika V., Mischak H., Zürbig P., Traldi P., A comparison between MALDI-MS and CE-MS data for biomarker assessment in chronic kidney diseases, J Proteomics. 75(18), 97-5888, 2012

[53] Tanzer F., Buyukkayhan D., Cansu Mutlu E., Kalender Korkmaz F., Enzyme replacement therapy in an infant with Pompe's disease with severe cardiomyopathy, J Pediatr Endocrinol Metab. 22(12), 62-1159, 2009

[54] Lampe C., Atherton A., Burton B.K., Descartes M., Giugliani R., Horovitz D.D., Kyosen

S.O., Magalhães T.S., Martins A.M., Mendelsohn N.J., Muenzer J., Smith L.D., Enzyme Replacement Therapy in Mucopolysaccharidosis II Patients Under 1 Year of Age, JIMD Rep., 2014

[55] McGill J.J., Inwood A.C., Coman D.J., Lipke M.L., de Lore D., Swiedler S.J., Hopwood J.J. Enzyme replacement therapy for mucopolysaccharidosis VI from 8 weeks of age–a sibling control study, Clin Genet. 77, 8-492, 2010

[56] Miebach E., Management of infusion-related reactions to enzyme replacement therapy in a cohort of patients with mucopolysaccharidosis disorders, Int J Clin Pharmacol Ther. 47, 2009

[57] Wraith J.E., Enzyme replacement therapy for the management of the mucopolysaccharidoses, Int J Clin Pharmacol Ther. 47, 2009

[58] Peter-Katalinić J., Williger K., Egge H., Green B., Hanisch F.- G., Schindler D., J. Carbohydr. Chem. 13, 447–454, 1994

6. Mulțumiri

În cadrul acestui paragraf, doresc să mulțumesc tuturor oamenilor care au avut încredere în mine, care au crezut că sunt capabil să ajung atât de departe, începând cu doamna Lect.dr. Daniela SUSAN – RESIGA din cadrul Facultății de Fizică, pentru sprijinul său necondiționat, pentru faptul că a avut atitudinea unui părinte și nu a unui profesor intangibil, de la care am învățat multe lucruri și căreia îi doresc să trăiască mulți ani de-acum înainte, să învețe și alți studenți ce înseamnă viața.

Mulțumiri speciale vreau să îi ofer doamnei Prof.univ.dr. Alina Diana ZAMFIR, pentru că mi-a oferit ocazia de a lucra pe partea experimentală în cadrul laboratorului de spectrometrie de masă din cadrul INCEMC Timișoara (Institutul Național de Cercetare – Dezvoltare pentru Electrochimie și Materie Condensată), în colaborare cu Facultatea de Fizică din cadrul Universității de Vest din Timișoara.

De asemenea, doresc să mulțumesc și celor din grupul de cercetare al doamnei Prof.univ.dr. Alina Diana ZAMFIR, niște oameni care m-au ajutat să înțeleg cum funcționează aparatura, atunci când mi se părea că e un „avion”. Mulțumesc de asemenea, domnului director general al INCEMC Timișoara, CS I dr.ing. Nicolae MIRICA și doamnei șef de departament CS III dr.fiz. Marinela MICLAU.

Totodată trebuie să menționez și familia mea, căreia îi mulțumesc că mi-a fost alături și m-a sprijinit, indiferent de momentele mele în care i-am neglijat; de asemenea, vreau să îi mulțumesc Loredanei LUPU, o colegă dragă, care mi-e ca o soră, și care m-a ajutat ori de câte ori am avut nevoie și cu care voi pleca în New York cu bursa Marie Curie pentru un stagiu de trei luni, pentru a continua cercetarea în ceea ce privește spectrometria de masă.