Scopul acestui studiu a fost investigarea profilurilor de sensibilitate la substanțe antimicrobiene ale unor agenți patogeni izolați din I.T.U. [307894]

Infecția de tract urinar (I.T.U) este o [anonimizat]. Deoarece poate apărea colonizarea asimptomatică a [anonimizat] a urinii, cu urmarirea unor caracteristici precum prezența markerilor inflamatori și analize microbiologice pentru a diagnostica în mod definitiv I.T.U ((Willey și colab, 2008).

Infecția de tract urinar reprezintă o problemă majoră de sanatate existentă la nivel global. [anonimizat], [anonimizat]. Capacitatea agenților patogeni bacterieni de a [anonimizat]. Factorii de virulență pot fi de mai multe tipuri: adezine, [anonimizat], [anonimizat].

Eficiența terapeutică a antibioticelor asupra I.T.U. [anonimizat] a mecanismelor de rezistență la antibiotice, o cauză fiind reprezentată de utilizarea necorespunzătoare și în exces a antibioticelor în terapia bolilor infecțioase (Bush și colab, 2011).

Activitatea umană complexă și de lungă durată a determinat apariția modificărilor structurii și funcționării agenților patogeni. Deși în ultimii ani s-au depus mari eforturi pentru a [anonimizat] o amenințare la adresa sănătății publice la nivel mondial.

Scopul acestui studiu a fost investigarea profilurilor de sensibilitate la substanțe antimicrobiene ale unor agenți patogeni izolați din I.T.U.

Pentru îndeplinirea acestui scop au fost propuse următoarele obiective:

Izolarea și identificarea unor tulpini bacteriene din I.T.U.

[anonimizat] I.T.U

Capitolul 1. Infecțiile de tract urinar (I.T.U)

Infecția de tract urinar (I.T.U) [anonimizat]-se pe locul doi după infecțiile de tract respirator (Bernic și Moroz, 2006). Anual afectează 150 de milioane de oameni la nivel global. Deși atât bărbații cât și femeile pot fi infectați, I.T.U [anonimizat] 50% dintre acestea prezentând I.T.U în cursul vieții. Aproximativ 25% [anonimizat] I.T.U recurente în următoarele 6 luni, unele dintre acestea prezentând 6 sau mai multe infecții în anul următor. [anonimizat], iar tratamentul cu antibiotice nu exclude recurențele. ITU pot deveni o [anonimizat] (Willey și colab, 2008).

1.1. Aparatul urinar feminin și masculin.

Aparatul urinar (sau renal) feminin și masculin este compus din: rinichi, uretere, [anonimizat], și la bărbați este prezentă prostata.

Fig 1. [anonimizat]ecțiilor urinare înalte și joase. Centrul de Diagnostic și Tratament Dr. Victor Babeș. https://www.cdt-babes.ro/articole/infectie-urinara.php.

Rinichii sunt organe pereche, cu rol în filtrare, eliminând din organism substanțe toxice, produse fie de organism sau provenite din mediul extern. Glomerulii renali filtrează într-o singură zi o cantitate de patru ori mai mare decat toată apa din organism, de 15 ori mai mult decat lichidele extracelulare și de 60 de ori mai mult decât volumul plasmatic.

Uretrele sunt canale care permit trecerea urinei de la rinichi la vezica urinară (Willey și colab, 2008).Vezica urinară este un organ musculo-cavitar, alcătuită din două componente, respectiv corp și col, posedă o funcție importantă a sistemului urinar, și anume depozitarea și eliminarea urinei. Datorită pereților elastici, poate înmagazina aproximativ 400-700 ml de urină sau chiar 1500-2000 ml, la extindere maximă (Willey și colab, 2008). Uretra este un conduct musculo-membranos care are ca rol principal transportul urinii din vezica urinară către exterior. Are o lungime de 3-4 cm la femei, iar la bărbați are 20-21 cm. La bărbați, aceasta traversează prostata, cu rol în procesul reproducător (Willey și colab, 2008).

În absența infecției, tractul urinar este steril cu excepția 1/3 externe a uretrei la femei. Dat fiind faptul că uretra la femei este mai scurtă și se află în apropierea orificiului anal, persoanele de sex feminin sunt mult mai predispuse infecțiilor urinare (bacteriile au o distanță mai scurtă de parcurs până la vezică).

Căile urinare și tractul genital masculin sunt sterile. Doar partea anterioară a uretrei este colonizată cu specii prezente în microbiota normală tegumentară: stafilococi coagulazo-negativi, streptococi, enterococi, enterobacterii, difterimorfi, neisserii saprofite, precum și Mycoplasma spp., sau Ureaplasma urealyticum.

Funcționarea normală a tractului urinar este asigurată de fluxul urinar (peristaltismul uretral), pH acid, ureea în concentrații mari și micțiunea periodică. În majoritatea cazurilor, infecțiile urinare se produc între micțiuni, atunci când microorganismele se pot multiplica și coloniza mucoasele (Salvatore, 2011). Principala sursă de infecție este reprezentată de microbiota fecală. Un alt rezervor de infecție urinară sunt focarele infecțioase din sfera ORL, cutanat sau prostatic, în acest caz microorganismele ajung la nivelul tractului urinar pe cale sangvină (Dielubanza, 2011).

1.2. Etiologia, incidența și factorii de risc

Infecția urinară reprezintă alterarea patologică și funcțională, rezultată în urma colonizării și multiplicării agenților patogeni în interstițiul renal și căile urinare.

I.T.U sunt cauzate, în marea majoritate a cazurilor, de agenți patogeni bacterieni (Hummers-Praders și colab, 2005) mai rar, sunt produse de fungi sau virusuri (Amdekar, 2011). Microorganismele pot ajunge în urină pe diferite căi:

din exterior, pătrund prin uretră și ajung în vezică, iar apoi pot ajunge la nivelul rinichilor;

din interior, prin intermediul sângelui; dintr-o alta zonă a corpului, de regulă din intestin și, prin circulația sangvină ajung în uretră; focarele de infecție, generale (septicemii, febră tifoidă) sau localizate (otite, vaginită) pot fi surse de infecție.

contact sexual (Verhelst și colab, 2005).

I.T.U. sunt determinate, în majoritatea cazurilor, de bacterii Gram-negativ (90% enterobacterii), urmate de bacterii Gram-pozitiv. Cea mai frecvent izolată specie Gram-negativă, implicată în I.T.U., este Escherichia coli, numeroase studii au arătat că aceasta este cauza a 80-85% din I.T.U (Amdekar, 2011).

Alți agenți patogeni întâlniți în etiologia I.T.U. sunt Pseudomonas aeruginosa, Enterococcus faecalis, Klebsiella spp, Proteus spp sau Enterobacter spp, ultimele trei specii făcând parte alături de E. coli, din clasa Enterobacteriaceae (Salvatore, 2011).

În categoria agenților patogeni rari se pot încadra alte enterobacterii (Serratia spp, Morganela spp), chlamydii (Chlamydia trachomatis), micoplasme, fungi (Candida albicans), paraziți sau virusuri (Drekonja și Jhonson, 2010).

I.T.U. sunt mult mai frecvente la femei, comparativ cu bărbați, acestea fiind de 4 ori mai afectate (Amdekar , 2011). Vârstele cu risc de apariție a I.T.U. sunt cuprinse între 16 și 35 de ani; cel puțin o dată în viață o femeie prezintă I.T.U sau 10% din populația feminină prezintă anual I.T.U (Nicolle, 2008).

Incidența I.T.U la copii este diferită în funcție de sex și vârstă. În primele trei luni de viață, I.T.U. sunt mai întâlnite la băieței comparativ cu fetițele, în schimb, după cele 3 luni de la naștere frecvența infecțiilor crește în cazul fetițelor. În perioada copilăriei, aproximativ 10% din populație poate fi afectată (Vodă și Mihăescu, 2015).

Conform unor date statistice ale Institutului de Sănătate publică, în cadrul proiectului de cercetare "CARMIN-ROM 2016", publicat în anul 2018, infecțiile urinare pe teritoriul României, au prezentat o creștere substanțială, acestea clasându-se pe locul 3, după infecțiile respiratorii (I.R.) și infecțiile de plagă chirurgicală. După cum se poate observa în tabelul 1, în anul 2013, I.T.U. s-au clasat pe locul 2, după I.R. Între anii 2013-2016 numărul cazurilor de I.T.U. aproape s-au dublat față de anii 2005-2008 (Popescu și colab., 2018).

Tabel 1. Infecții asociate asistenței medicale raportate în funcție de ani și

de numărul de cazuri (CARMIN-ROM 2016, Institutul de Sănătate publică, 2018).

Toți oamenii sunt sensibili la dezvoltarea de I.T.U, însă anumiți factori cresc expunerea la potențiali uropatogeni iar alți factori cresc sensibilitatea organismului uman la dezvoltarea de I.T.U. Factorii care cresc expunerea la uropatogeni includ: prezența unui cateter urinar și relațiile sexuale. Activitatea sexuală este responsabilă de 75-90% din I.T.U la femeile active din punct de vedere sexual (Nicolle, 2008). Markerii ai sensibilitații organismului gazdă la dezvoltarea de ITU includ: vârsta, sexul și prezența de condiții ce afectează tractul urinar precum sarcina, diabetul, mărirea prostatei, vaginită atrofică datorită deficienței de estrogen, malnutriția, spitalizarea prelungită, obezitatea (Hellerstein, 2002; Grabe și colab, 2001).

Prevenirea I.T.U. este foarte importantă. Prevenirea include o igienă riguroasă, hidratarea, ce favorizează eliminarea unei cantități mai mari de urină, și astfel favorizează și eliminarea produșilor toxici din corp, precum și curățarea tractului urinar.

1.3. Clasificarea și formele clinice

Conform datelor publicate în anul 2013 de către Grabe și colaboratorii, există mai multe criterii de clasificare ale infecțiilor de tract urinar, prezentate în tabelul 2.

Tabel 2. Clasificarea infecțiilor de tract urinar (după Grabe și colab,2013)

Urina, datorită anumitor particularități, precum aciditatea, concentrația mare de uree sau osmolaritate variabilă, constituie un mediu inadecvat pentru multiplicarea microorganismelor uropatogene (Chang și colab., 2006). De asemenea, fluxul urinar constant, precum și golirea vezicii reprezintă factori de apărare esențiali față de microorganismele uropatogene (Talan și colab, 2000).

Uretrita este o infecție ce afectează atât sexul feminim cât și sexul masculin. Este produsă de bacterii care ajung, pe cale sexuală, la nivelul uretrei.

Cistita este o infecție determinată de tulpini bacteriene uropatogene (E. coli) provenite din tractul intestinal care pot ajunge la nivelul uretrei, vezicii urinare, vaginului.

Pielonefrita este un proces de tip inflamator ce afectează rinichii (Health Protection Agency, 2008). Frecvent, bacteriile localizate la nivelul vezicii urinare inițiază procesui infecțios (Larcombe, 2012).

I.T.U. complicate sunt fie infecții asociate cu anomalii de tip funcțional sau structural ale aparatului urinar (Grabe și colab, 2013) sau infecții datorate prezenței în organismul gazdă a unui corp străin de exemplu catetere (Popescu , 2007). I.T.U. complicate sunt infecții de lungă durată, cauzate în mod frecvent de Proteus spp și Klebsiella spp (Valiquette, 2001).

I.T.U recurente sunt caracterizate de episoade de infecție cu simptomatologie cu episoade lipsite de simptomatologie. Recăderea este o I.T.U. recurentă cu același microorganism patogen, ce apare la 14 zile după finalizarea tratamentului, în timp ce reinfecția este datorată de un alt microorganism patogen (Ma și Shorliffe, 2004).

În ceea ce privește bacteriuriile nerezolvate, acestea se produc ca urmare a unui tratament incorect sau rezistenței agentului patogen la tratament, în timp ce bacteriuria persistentă se caracterizează prin detecția agentului patogen în condițiile administrării un tratament corespunzător (Montini și colab, 2011).

1.4. Patogeneza infecțiilor de tract urinar

Aderența este un eveniment cheie care inițiază fiecare pas în patogeneza I.T.U necomplicată. În general, etapa inițială a apariției I.T.U. este reprezentată de contaminarea zonei periuretrală de care un agent uropatogen bacterian din microbiota intestinală, urmată apoi de colonizarea uretrei și migrarea ulterioară a agentului uropatogen la nivelul vezicii urinare. Etapa de migrare la nivelul vezicii urinare este mediată de adezine (pili, fimbrii) și flageli.

Interacțiunile complexe dintre gazdă-agent uropatogen de la nivelul vezicii urinare pot conduce la colonizarea cu succes a acesteia sau pot determina eliminarea agenților uropatogeni. Colonizarea vezicii urinare este mediată de adezine care recunosc și leagă receptori de la nivelul epiteliului vezicii urinare (cunoscut și sub denumirea de uroepiteliu) (Flores-Mireles și colab, 2015).

Uropatogenii produc toxine și proteaze care induc leziuni la nivelul celulelor gazdă, eliberând nutrienți esențiali pentru sinteza de siderofori cu afinitate mare pentru fierul din mediu. Sideroforii fac parte din categoria factorilor de virulență nespecifici, având rol indirect în patogeneză, însă sunt importanți ca factori de virulență specifici în formarea infecțiilor.

Pentru a supraviețui mecanismelor de apărare ale gazdei, respectiv infiltratul de neutrofile la nivelul zonei afectată, celule bacteriene își pot modifica caracterele morfologice având ca rezultat rezistența la fagocitoză. În aceste condiții este favorizată multiplicarea patogenului și ulterior, formarea biofilmului. Prin dezvoltarea de biofilme, este favorizată creșterea și multiplicarea și ascensiunea la nivelul rinichilor a patogenului. Colonizarea epiteliului renal este favorizată de aderarea prin intermediul adezinelor (pili) și este urmată de producerea de toxine bacteriene și distrugerea țesutului gazdă (Flores-Mireles și colab, 2015).

În cazul I.T.U. necomplicate netratate corespunzător, uropatogenii sunt capabili să traverseze bariera epitelială tubulară pentru a accesa fluxul de sânge și astfel poate avea loc inițierea bacteriemiei.

Etapele de colonizare ale I.T.U. complicate sunt asemănătoare cu cele descrise în cazul I.T.U. necomplicate, inclusiv colonizarea periuretrală, progresia spre uretră și migrarea către vezica urinară. Însă, I.T.U. complicate sunt inițiate atunci când celulele bacteriene aderă la nivelul cateterului urinar, o piatră la rinichi sau o piatră vezicală.

Fibrinogenul care se acumulează pe cateter favorizează aderarea uropatogenilor. Aderarea celulelor bacteriene la nivelul fibrinogenului facilitează multiplicarea și de formarea de biofilme. Similar cu I.T.U. necomplicate, biofilmul în acest caz promovează supraviețuirea bacteriană și ascensiunea la nivelul rinichilor și colonizarea acestora. I.T.U. complicate netratate, pot progresa, de asemenea, spre bacteriemie, prin traversarea epiteliului tubular (Flores-Mireles și colab, 2015).

Fig.2. Etapele patogenezei infecțiilor de tract urinar necomplicate (a) și infecțiilor de tract urinar complicate (b) (după Flores-Mireles și colab, 2015).

1.5. Diagnosticul infecțiilor de tract urinar

Diagnosticul ITU se bazează pe investigațiile biologice și paraclinice, dar și pe baza semnelor clinice. Diagnosticul are o importanță deosebită pentru stabilirea conduitei terapeutice.

Kass (1956) a stabilit bazele cantitative ale diagnosticului de bacteriurie (număr de germeni/ml urină). Acest criteriu cantitativ diferențiază contaminările urinare de infecțiile propriu-zise, astfel: 103 UFC/ml, urina poate fi contaminată (bacteriurie nesemnificativă); 104-105 UFC/ml, rezultatul nu este concludent și se recomandă repetarea analizei; 105UFC/ml, însoțită de semne clinice, este o bacteriurie semnificativă (Berceanu-Văduva, 2019).

În cazul celor mai multe infecții urinare simptomatice, numărul de UFC/mL depășeste 105 UFC/ml (Hay și colab, 2011).

Diagnosticul I.T.U include de asemenea efectuarea sumarului urinar. Prezența nitriților poate sugera infecții cu bacterii producătoare de nitriți. Testul nitraților poate fi negativ, dacă infecția de tract urinar este cauzată de agenți patogeni care nu produc nitrați, de exemplu P. aeruginosa (Cavagnaro, 2005). Prezența în număr mare a leucocitelor și a eritrocitelor în urină poate sugera un proces inflamator local (Ma și Shortliffe, 2004, Craig și colab, 2010). Sedimentul urinar poate evidenția prezența de microrganisme, hematii, leucocite (Watson, 2004).

În cazul I.T.U., proteina C-reactivă poate suferi modificări ale valorilor normale, anumiți autori considerând că valorile peste 20 µg/ml pot fi considerate ca indicatori a prezenței unei posibile infecții (Grabe și colab, 2008). Există și alți markeri care prezintă modificări ale valorilor în timpul unei infecții, respectiv N-acetil-ß-glucozamidinază urinară și beta-2-microglobulina, VSH (viteza de sedimentare a hematiilor) crescut sau fibrinogenul seric mărit (Bernic și Moroz, 2006). Însă, diagnosticul nu se poate pune în absența unei uroculturii pozitive sau doar pe baza unuia din markeri prezentați mai sus, fiind necesară identificarea propriu-zisă a microorganismului.

Capitolul 2. Caracterele de patogenitate și virulență ale uropatogenilor bacterieni

Infecțiile de tract urinar (I.T.U) afectează o mare parte din populația umană la nivel global. Anual, aproximativ 150 de milioane de oameni dezvoltă I.T.U. Se estimează că 40% din femei dezvoltă cel puțin o I.T.U în cursul vieții, și anual, 11% din femeile cu vârste mai mari de 18 ani manifestă o I.T.U. (Terlizzi și colab, 2017). I.T.U. prezintă un spectru etiologic vast, ce tinde mai ales în mediu spitalicesc, spre extindere. Principalele microorganisme implicate în etiologia ITU sunt bacteriile Gram-negative apaținând familiei Enterobacteriaceae: E. coli, Klebsiella spp, Raoultella planticola, Proteus spp, Enterobacter spp, Serratia spp, non-enterobacterii: P. aeruginosa, dar și bacteriile Gram pozitive ce includ grupul streptococilor B, Enterococcus spp. și Staphylococcus spp. În cazuri rare, în I.T.U. pot fi implicate ca agenți etiologici virusurile sau fungii (Candida spp).

2.1. Escherichia coli

Specia E. coli face parte din genul Escherichia, ce cuprinde bacterii comensale, colonizatori ai microbiotei normale la om, de asemenea este prezent și în mediu (apă, sol, etc). Majoritatea tulpinilor de E.coli sunt comensale la nivelul tractului intestinal, însă unele tulpini pot provoca infecții ce pot pune viața în pericol (Lefevre și colab, 2010). Caracterele de cultură și metabolice utile în identificarea și caracterizarea tulpinilor de E. coli sunt prezentate în tabelul nr. 3.

Factori de patogenitate și virulență. Unele tulpini de E.coli pot determina infecții severe. Capacitatea unor tulpini de E. coli de a produce infecții, se datorează expresiei unor factori de patogenitate și de virulență (Dale și colab, 2018). Astfel, unele tulpini de E. coli posedă factori de patogenitate și virulență, codificați de gene plasmidiale sau de bacteriofagi, precum fimbrii, capsulă, siderofori și toxine, diferențiindu-se în mai multe patotipuri (Shakhatreh și colab, 2018).

E. coli uropatogen (UPEC) are o pondere semnificativă ca agent etiologic al I.T.U (90%) (Hannan și colab., 2012). Pe baza prezenței la nivelul genomului a insulelor de patogenitate (Pathogenicity Islands (PAI)) și expresiei factorilor de virulență precum adezine, toxine, polizaharide de suprafață, flageli și sisteme de preluare a fierului au fost descrise 4 filogrupuri UPEC: A, B1, B2 și D (Bien și colab., 2012).

Tabel 3. Caracterele morfologice și metabolice ale speciei E. coli (după Chifiriuc și colab, 2015).

În cursul I.T.U., patogeneza UPEC cuprinde mai multe etape:

colonizarea cu UPEC a zonelor periuretrale și vaginale urmată de colonizarea uretrei;

ascensiunea în lumenul vezicii urinare și creșterea ca celule panctonice în urină

aderența la suprafață uroepiteliului și interacțiunea cu mecanismele de apărare locale, de la nivelul epiteliului vezicii urinare.

formarea biofilmului,

invazia și multiplicarea intracelulară a bacteriilor cu formarea de rezervoare intracelulare de bacterii la nivelul vezicii urinare Replicarea intracelulară a patogenului poate atinge 105 bacterii / celulă. La nivel intracelular, bacteriile manifestă modificări morfologice.

colonizarea rinichilor și lezarea țesutului gazdă cu risc crescut de bacteriemie /septicemie (Terlizzi și colab, 2017)..

UPEC colonizează vezica folosind o varietate de factori de virulență, care prin urmare, joacă roluri critice în patogeneza I.T.U (Flores-Mireles și colab, 2016). Factorii de virulență includ componente structurale de suprafață, cum ar fi lipopolizaharide (LPS), capsulă polizaharidică, flageli, vezicule derivate din membrana externă, pili, curli, adezine, proteine ​​membranei externe (OMPs), precum și toxine secretate, sisteme de secreție și receptori Ton-dependenți, inclusiv receptori pentru siderofori (Fig. 3). Toate aceste componente pot reprezenta potențiali candidați pentru dezvoltarea de noi medicamente și vaccinuri (Terlizzi și colab, 2017).

Fig.3. Factori de aderență și colonizare la tulpinile UPEC (după Telizzi și colab, 2017).

LPS sunt molecule cu proprietăți amfipatice alcătuite din acizii grași atașați de un miez de oligozaharide, care la rândul său este legat de un lanț lung polizaharidic denumit antigen O (Simpson și colab., 2015). Componentele structurale ale LPS mediază multiple aspecte ale ciclului de viață al UPEC, precum capacitatea de colonizare a vezicii urinare, capacitatea de a eluda mecanismele imunității înnăscute și dobândite. De asemenea, LPS au conferă rezistență la antibiotice hidrofobe și hipersensibilitate la molecule toxice hidrofobe (cum ar fi sărurile biliare și unele antibiotice) atunci când cantitatea de LPS de la suprafața celulei scade (Flores-Mireles și colab, 2016).

UPEC prezintă două tipuri de pili, și anume pili de tip 1, codificați de operonul fim, acest tip de pil posedă capacitatea de hemaglunatinare cu manoza, și cel de-al doilea tip de pili este reprezentat de pili de tip P sau pili Pap codificați de operonul pap (Terlizzi și colab, 2017). La izolatele clinice de UPEC, operonul fim este constitutiv în timp ce pap face parte din PAI, cu rol în codificarea de factori de virulență.

Ambele tipuri de pili sunt molecule heteropolimerice alcătuite dintr-o subunitate majoră de natură proteică aflată la baza pilului și mai multe proteine ​​subunitare minore situate la capătul distal, la nivelul cărora sunt atașate adezinele PapG și FimH. PapG și FimH sunt compuse din două domenii, primul permite procesul de copolimerizare, în timp ce al doilea este alcătuit din lectină ce permite legarea de carbohidrați (Kline și colab., 2009). Receptori de la nivelul epiteliului vezicii urinare recunosc și leagă FimH, realizând faza de aderență inițială a patogenului la epiteliul organismului gazdă, urmată de invazie. Expresia pililor de tip 1 este strict reglată de variația de fază (modificări reversibile între expresia activă a pililor de tip 1 și pierderea expreisiei). Mecanismele moleculare implicate în variația de fază sunt strict reglate de semnalele din mediu din tractul urinar, cum ar fi pH acid și săruri. La UPEC, pilii sunt implicați în atașarea ințială la mucoasa tractului urinar. Un alt mecanism implicat în aderență și colonizare este reprezentat de adezinele afimbriale. Adezina TosA a fost identificată la aproximativ 30% din izolatele UPEC fiind exprimate în cursul I.T.U. O altă adezină, FdeC, s-a demonstrat a fi implicată în colonizarea vezicii urinare și a rinichilor în experimente realizate pe animale de laborator (Nesta et al., 2012).

Curli sunt apendici de suprafață bacterieni, cu structură și trăsături fizice similare fibrilelor amiloide descrise în boli degenerative la om. Curli au rol de secreție extracelulară a subunităților ca ​proteine monomerice solubile. Curli au rol de asemenea în formarea de biofilme (Goyal și colab., 2014).

Flagelii sunt organite, conferă caracterul invaziv al unor tulpini EPEC și joacă un rol cheie în etapele formării biofilmelor: aderența, maturarea și dispersia acestuia (Nakamura și colab., 2016).

Toxinele UPEC au diferite funcții în cursul infecției. De exemplu, α-hemolizina este asociată cu leziuni renale și procesele de cicatrizare, prin inducerea de oscilații de Ca2+ în celulele epiteliale ale tubulilor renali favorizează ascensiunea și colonizarea ureterelor și a parenchimului renal. La UPEC, toxinele, adezinele, enzimele și LPS-urile nu sunt eliberate ca molecule solubile, ci sunt asociate cu vezicule derivate din membrana externă. Formarea de vezicule membranare este considerată o modalitate eficientă de protecție a toxinelor bacteriene și de livrare a acestor toxine în celula gazdă (Telizzi și colab, 2017).

Sideroforii sunt molecule chelatoare de fier produse de tulpinile UPEC pentru achiziția de ion feric (Fe3+), exemple: yersiniabactin, salmochelin, și aerobactin. Tractul urinar este un situs limitat în ceea ce privește rezerva de fier, astfel că achiziția acestuia este o cerință critică pentru supraviețuirea UPEC.

Receptorii pentru siderofori necesită prezența complexului TonB, localizat la nivelul membranei citoplasmatice ce posedă o afinitate ridicată pentru achiziția fierului și permite prin urmare legarea și chelatarea fierului la suprafața celulei (Telizzi și colab, 2017). Celele uroepiteliale, pentru a împiedica preluarea ferului, supraexprimă receptorul pentru transferină și pentru lipocalin 2.

Importanța factorilor de virulență la UPEC este susținută de informațiile oferite de aplicarea tehnologiilor omics, care au fost utilizate pentru investigarea diversității genomice a tulpinilor UPEC, expresia globală a unor gene în diferite modele de infecție atât in vitro cât și in vivo, și pentru definirea proteinelor UPEC specifice drept noi ținte terapeutice (Lo et al., 2017).

Tehnologiile de secvențiere NGS (Next Generation Sequencing) permit determinarea rapidă a genomurilor tulpinilor UPEC, utile în monitorizarea focarelor, epidemiologia tulpinilor emergente, precum și evoluția rezistenței la antibiotice. Pe de altă parte, analiza diferitelor genomuri UPEC și comparația cu baza de date genomică existentă entru E. coli a relevat plasticitatea genomului tulpinilor UPEC și prezența de gene PAI specifice cu rol de codificare a factorilor de virulență, cum ar fi pili, adezine și siderofori (Moriel și colab., 2016).

2.2. Klebsiella pneumoniae

Genul Klebsiella cuprinde 10 specii, 4 fiind importante din punct de vedere clinic: K.pneumoniae; K. ozaenae; K.oxytoca; K. rhinoscleromatis. Speciile de Klebsiella sunt imobile, lactozo-fermentative, cu un aspect particular pe mediul de cultură, respectiv colonii foarte mucoase, ce permite diferențierea de alte specii din familia Enterobacteriaceae (Berceanu-Văduva, 2019).

K. pneumoniae este agentul etiologic a numeroase infecții la om, care includ: penumonii, sepsis, I.T.U., bacteriemii, meningite, abcese. Aproximativ 7% din I.T.U sunt produse de K. penumoniae. Este implicată de asemenea în I.T.U asociate cateterelor, se consideră că acestea sunt facilitate de capacitatea crescută a tulpinilor de K. pneumoniae de a adera și de a forma de biofilme la suprafața cateterelor (Schroll și colab., 2010).

Caractere de cultură și metabolice. K.pneumoniae este un agent patogen oportunist, bacil Gram-negativ, imobil (Tabel 4), ce fermentează lactoza. În tabelul 5 sunt prezentate și alte caractere metabolice importante ale acestei specii. Este frevent izolat din probe biologice provenite de la pacienți cu pneumonie, leziuni deschise, infecții de trat urinar, precum și alte infecții. Este prezent în mediu înconjurător (sol, apă, plante) și în procent foarte mic (5%) la nivelul mucoasei tractului respirator superior la om (Chifiriuc și colab, 2015).

Factori de patogenitate și virulență. K. pneumoniae utilizează numeroase strategii pentru creștere, multiplicare și pentru a se proteja de răspunsul de apărare al gazdei. Până în prezent au fost patru clase majore de factori de virulență, care au fost caracterizate la K. penumoniae: capsulă, inclusiv producerea unei hipercapsule la tulpinile hipervirulente, lipopolizaharide (LPS), siderofori și fimbrii. Numeroși alți factori au fost recent identificați ca importanți pentru virulența tulpinilor de K. pneumoniae: expresia de proteine ale membranei plasmatice externe, expresia de porine, expresia de pompe de eflux și gene implicate în metabolismul alantoinei.

Capsula este o matrice polizaharidică extraparietală, necesară pentru virulența K. pneumoniae și este cel mai bine studiat factor de virulență al K. pneumoniae (Fig.4). Este compusă din subunități repetate de patru până la șase zaharuri, precum acizi uronici. Pe baza testărilor serologice, au fost identificate 77 serotipuri capsulare. Progresele recente în tehnicile moleculare au dus la o discriminare suplimentară între tipurile de K. pneumoniae (Pacsoza și Mecas, 2016). Tulpinile K. pneumoniae hipervirulente produc o hipercapsulă exopolizaharidică care este mai robustă decât capsula tipică. Această hipercapsulă poate contribui semnificativ la patogenitatea K. pneumoniae hipervirulente. Tulpinile acapsulare de K. pneumoniae sunt cu mult mai puțin virulente decât tulpinile ce prezintă capsulă.

Polizaharidele capsulare sunt denumite antigene K, acestea sunt tulpina-specifice (de ex.K1 și K2, până la K78). Genele necesare pentru producerea capsulei sunt localizate pe un operon cromosomal, denumit cps. Organizarea dar și secvențierea sunt conservate în comparație cu E. coli. Clusterul genic cps adăpostește un număr de gene implicate în producția capsulei, inclusiv wzi, wza, wzb, wzc, gnd, wca, cpsB, cpsG și galF. Fenotipurile hipercapsulate manifestă o rezistență crescută la o varietate de mecanisme de apărare umorale (ex. complement, lactoferină), se corelează de asemenea cu o rezistență mărită la fagocitoza mediată de neutrofile și macrofage.

Lipopolizaharidele (LPS), denumită și endotoxină, este o componentă majoră a membranei externe a bacteriilor Gram-negative (Fig.5.) Prin eliberarea endotoxinelor se produce șocul septic. Recunoașterea LPS de către gazdă se realizează prin intermediul receptorului Toll-4 (TLR4) și declanșează cascada inflamatorie. Acest răspuns al gazdei este cel care duce la patogeneza devastatoare a sepsisului și șocului septic (Standiford și colab, 2012). Moleculele LPS sunt alcătuite din lipidul A, un domeniu principal oligozaharidic și antigenul O. Aceste componente sunt codificate de genele wb, waa, respectiv lpx. Spre deosebire de cele 77 de antigene K diferite, au fost doar identificate doar 9 tipuri de antigen O (DeMajumdar și colab, 2015).

Fig.4. Factorii de virulență descriși la tulpinile patogene de K.pneumoniae.

Există patru factori de virulență bine caracterizați pentru K. pneumoniae patogenă: capsulă, LPS, fimbriae (tip 1 și tip 3) și siderofori. Capsula este o matrice polizaharidică extracelulară care învelește bacteriile. Tulpinile clasice de K. pneumoniae produc o capsulă care poate fi din oricare dintre serotipurile K1 până la K78; K1 și K2 sunt asociate cu o patogenitate crescută. Tulpinile HV (hipervirulente) formează o hipercapsulă, care amplifică producția de material capsular, rezultând astfel o capsulă relativ mai mare și sunt predominant ale serotipului K1, în timp ce tulpinile rămase sunt ale serotipului de tip K2. LPS este parte integrantă a membranei exterioare; este produsă atât de tulpinile clasice cât și de cele HV și poate face parte din serotipurile antigenului O1 până la O9. Ambele tipuri de K. pneumoniae realizează structuri adezive, legate de membrană, de exemplu fimbrii de tip 1 și de tip 3 și secretă siderofori. Dintre siderofori, enterobactina este produsă de aproape toate tulpinile, iar yersiniabactina este produsă de aproximativ jumătate din tulpinile clasice și aproape toate HV. Salmochelinul și aerobactina sunt rareori produse de tulpinile clasice, dar sunt de obicei secretate de tulpini HV, aerobactina prezentând cea mai înaltă expresie dintre siderofori (Pacsoza și Mecas, 2016).

Trei dintre acestea, O1, care este cel mai frecvent, O2 și O3, sunt responsabile pentru aproape 80% din toate infecțiile produse de Klebsiella. Izolatele K. pneumoniae cu antigen O scurt sau absent (LPS grosier) sunt sensibile la complementul seric, în timp ce izolatele cu antigen O lung (LPS neted) sunt rezistente la complementul seric. Variațiile în LPS pot juca, de asemenea, un rol în protejarea bacteriilor împotriva peptidelor antimicrobiene, inclusiv a polimixinelor.

K. pneumoniae produce mai multe tipuri de siderofori (Holden și Bachman, 2015): enterobactina salmochelin, yersiniabactina și aerobactina. Achiziția de fierului este necesară pentru replicarea K. pneumoniae, induce, de asemenea, inflamația și contribuie la diseminarea bacteriilor (Pacsoza și Mecas, 2016).

Fig.5. Structura factorului de virulență LPS

Rolul lipopolizaharidei în virulența K. pneumoniae. LPS este compus din trei subunități majore: lipidul A, un miez de oligozaharide și antigenul O. Lipidul A se introduce în membrana bacteriană și este un activator potențial puternic al inflamației. K. pneumoniae își poate modifica structrura lipidului A pentru a-l face mai puțin inflamator în timpul infecției, iar lipidul A se poate proteja și împotriva acțiunii bactericide a peptidelor antimicrobiene cationice. Antigenul O este subunitatea cea mai exterioară a LPS. Are roluri importante în protejarea împotriva complementului, inclusiv prevenirea legării C1q la bacterii, care inhibă activarea ulterioară a căii complementului, precum și legarea C3b departe de membrana bacteriană externă și, prin urmare, abrogarea lizei bacteriene prin complexul de atac al membranei complementare. (Pacsoza și Mecas, 2016)

Un pas esențial în progresia către infecție este ca bacteriile să adere la suprafețele gazdă. La K. pneumoniae, acest lucru mediat de structuri filamentoase extraparietale denumite fimbrii. Pilii de tip 1 (fim) asigură aderarea bacteriilor la suprafețele mucoaselor și epitelialiale. Pilii de tip 3 au rol în aderență la suprafețele celulare, și în formarea de biofilme (Schroll și colab., 2010). Aceste structuri joacă un rol important în colonizarea cateterelor urinare, și în I.T.U. asociate (Murphy et al., 2013).

Sistemul de secreție de tip VI (T6SS), identificat pentru prima dată în V. cholerae este o structură ancorată în membrana celulelor bacteriene care servește la injectarea diferitelor molecule efectoare și toxine în alte celule (celule eucariote și celule bacteriene) (Journet și Cascales, 2016; Sarris și colab., 2011).

2.3. Enterobacter spp

Genul Enterobacter face parte din familia Enterobacteriaceae și cuprinde 9 specii bacteriene, 3 dintre aceste specii (Enterobacter aerogenes, E. gergoviae și E. cloacae) având o deosebită importanță din punct de vedere medical, anume Enterobacter aerogenes (E. aerogenes), poate fi izolat din infecții ale sângelui, puroi, ITU, infecții ale tractului respirator (Asadi și Hamid, 2017). Manifestările clinice ale I.T.U datorate Enterobacter spp. diferă puțin de cele ale infecțiilor din cauza altor bacili Gram-negativi. Spectrul bolii variază de la bacteriurie asimptomatică până la pielonefrită și urosepsis. Tindall și colab. (2017) au redenumit specia E. aerogenes în Klebsiella aerogenes, pe baza pe similitudinilor morfologice și chimice dintre cele două genuri.

Caractere de cultură și metabolice. E. aerogenes, este un bacil Gram-negativ, oxidazo-negativ, catalază pozitiv, citrat pozitiv și indol negativ (Tabel 5). Prezintă flageli peritrihi, cu rol în mobilitate. Speciile de Enterobacter sunt agenți patogeni oportuniști și rareori produc infecții la individul sănătos (Tindal și colab, 2017).

Factori de patogenitate și virulență. Ca agenți patogeni oportuniști, izolați frecvent în infecții nosocomiale, se cunosc foarte puține informații despre factorii de virulență. Factorii de virulență descriși: endotoxinele (Piyush Jha și colab, 2016), pilii de tip 1 și tip 3, sisteme de achiziție a ionului feric (aerobactină). De asemenea, unele tulpini pot produce o hemolizină asemănătoare cu α-hemolizina produsă de tulpinile de E. coli (Greenwood și colab, 2002).

2.4 Raoultella planticola

Membră a familiei Enteribacteriaceae, genul Raoultella, este un bacil Gram-negativ, aerob, capsulat (tabel 4), oxidazo-negativ (tabel 5), care, în general, produce infecții la pacienți imunocompromiși (Skelton și colab., 2017). Se cunosc foarte puține informații despre factorii de virulență și patogenitate. Prezintă caractere de virulență similare cu cele ale tulpinilor de K. pneumoniae (Demiray și colab, 2016). R. planticola poate determina infecții grave precum bacteriemie, pneumonie, infecții intraabdominale, I.T.U și infecții ale țesuturilor moi (Vassallo J și colab, 2016).

2.5. Citrobacter koseri

C. koseri este un bacil Gram-negativ, nesporulat, aerob sau facultativ anaerob. În tabelul 5 sunt prezentate caracterele metabolice ale acestei specii, printre care absența fermenării lactozei sau fermentarea glucozei și producere de gaz.

C. koseri este un agent oportunist ce produce o varietate de infecții la om. La pacientul adult, tractul urinar este unul dintre cele mai frecvente situsuri de infecție. Un studiu realizat de Samonis și colab, în 2009, pe un lot de 78 de pacienți cu infecții cauzate de Citrobacter a relevat faptul că 53% dintre acestea erau infecții de tract urinar, majoritatea fiind pielonefrită (Samonis și colab, 2009).

Factori de patogenitate și virulență. Mecanismele de patogenitate și virulență în cazul acestei specii sunt puțin caracterizate. Factorii de virulență includ flagelul, cu rol în colonizare și diseminarea bacteriilor, producerea de toxine și proteaze, capacitatea de formare de biofilme, capacitatea de a supraviețui mecanismelor bactericide ale leucocitelor polimorfonucleare (Nayar și colab, 2013).

2.6. Proteus spp

Genul Proteus cuprinde 8 specii, dintre care 3 prezintă importanță din punct de vedere clinic, și anume P. vulgaris, P. mirabilis și P. penneri. Genul Proteus este foarte răspândit în natură, fiind evidențiat în habitate cu materie organică aflată în descompunere (sol, ape reziduale, carne alterată). La om și animale bacilul Proteus face parte din microbiota normală a tubului digestiv (Berceanu-Văduva, 2019). Genul Proteus reprezintă a treia cauză de producere a infecțiilor nosocomiale. P. vulgaris produce infecții pulmonare, I.T.U sau, atunci când localizarea acestuia este extraintestinală, bacteriemii. P. mirabilis produce I.T.U, fiind frecvent izolată în laboratorul clinic (Chifiriuc și colab, 2015).

Caractere de cultură și metabolice. P. mirabilis produce o mare cantitate de urează ce descompune ureea în CO2 și NH3, ce determină creșterea pH urinar, favorizând astfel formarea de calculi urinari (Broomfield și colab, 2009). Creșterea pH urinar este de asemenea, toxică pentru uroepiteliu (efect necrozant), prezența calciului și a magneziului în urină poate provoca retenția urinară și dezvoltarea bacteriuriei și ale altor infecții ascendente, conducând astfel la pielonefrită (Chi-Yu și colab, 2012).

Factori de patogenitate și virulență. În interacțiunile dintre agenții patogeni Gram-negativi și organismele superioare, un rol semnificativ îl joacă structura suprafeței celulei bacteriene (fimbrii, flageli, antigene pentru capsule, componente ale membranei externe). Se consideră că suprafața celulară a bacililor de Proteus este foarte importantă pentru virulență, având rol în aderență, colonizarea tractului urinar și ulterior formarea pietrelor urinare. Aderența bacteriană la suprafețele epiteliale este considerată a fi una dintre cele mai importante mecanisme de virulență, jucând un rol semnificativ în inițierea I.T.U. (Scaffer și Pearsons, 2015).

Fimbriile la tulpinile de P. mirabilis sunt factori esențiali de virulență în I.T.U, însă există puține detalii cu privire la expresia lor, caracteristicile fizice și funcțiile biologice. Un alt factor de virulență important pentru specia P. mirabilis este flagelul. Flagelul facilitatea colonizarea și diseminarea, astfel se consideră ca acesta are un rol important în patogenitatea speciei. Un alt factor implicat în virulența și patogenitatea celulelor de Proteus este așa mobilitatea de tip swarming, cu rol în invadarea organismului gazdă, cu producerea de infecții grave, precum septicemie sau bacteriemie dar și în colonizarea cateterelor (Jones și colab, 2004; Strating și colab, 2012). Alți factori implicați în patogenitate și virulență sunt: lipopolizaharidele, toxine, adezine, proteaze (Scaffer și Pearsons, 2015).

2.7. Pseudomonas aeruginosa

Caractere de cultură și metabolice. P. aeruginosa este o bacterie aerobă, Gram-negativă, mobilă, oxidazo-pozitivă și lactozo-negativă. Datorită producției de pigmenți solubili în apă, cum ar fi pioverdina (galben-verde) și piocianina (verde-albastru) este ușor detectată in vitro pe agar (Peix și Bahema, 2009). P. aeruginosa are o răspândire ubicuitară natură, se găsește în sol și mediu acvatic, dar și pe obiecte sau plante. Această specie nu necesită condiții speciale de creștere, prezintă cerințe nutriționale minime, se poate dezvolta pe diferite medii precum: suprafețele din sălile din unități sanitare, pe echipamente medicale (Abreu și colab, 2017). Ps. aeruginosa este un agent patogen oportunist, fiind implicat în etiologia infecțiilor nosocomiale. Colonizează organismul uman, astfel că la indivizii imunocompromiși poate produce I.T.U,, infecții ale aparatului respirator, bacteriemii (Chifiriuc și colab, 2015, Pachori și colab, 2019). Caracterele morfologice și metabolice ale acestei specii sunt descrise în tabelul 4, respectiv tabelul 5.

Factori de patogenitate și virulență. Patogeneza infecțiilor cu Pseudomonas spp este multifactorială, având un spectru extins de factori de virulență din care fac parte: pilii de tip IV, exotoxina A, exoenzima S, elastaza, proteaza alcalină, hemolizine, fosfolipază C, rhamnolipide și siderofori. Expresia majorității factorilor de virulență extracelulari, precum și formarea de biofilme este coordonată și reglată de semnale de quorum-sensing (Matheson și colab, 2006). ITU cauzate de Ps. aeruginosa sunt de obicei dobândite în spital (12% din infecțiile urinare nosocomiale), fiind asociate cateterelor. P. aeruginosa manifestă o mare capacitate de aderență și formare de biofilme la diferite suprafețe, inclusiv epiteliul vezicii urinare, iar infecția poate avea loc pe cale ascendentă sau descendentă (Rahul Mittal și colab, 2009; Kuchma și colab, 2005; Ryder și colab, 2007). Biofilmele sunt rezistente la agenții antimicrobieni și, prin urmare, sunt greu de eradicat (Rahul Mittal și colab, 2009).

2.8. Enterococcus spp.

Caractere de cultură și metabolice. E. faecalis sunt coci gram-pozitivi, anaerobi facultativi, nemotil; fermentează glucoza fără producerea de gaz și catalazo-negativi. Catabolizează o varietate de surse de energie, inclusiv glicerol, lactat, malat, citrat, arginină, agmatină și mulți acizi (tabelul 5). Rezistă la concentrații ridicate de săruri biliare, detergenți, metale grele, etanol, azidă pH extrem de alcalin (9,6) și desicare. Temperatura optimă de creștere este cuprinsă între 10 și 45°C și pot supraviețui la temperaturi de 60°C timp de 30 minute (Stuart și colab, 2006). Enterococii sunt membrii ai microbiotei gastro-intestinale. Produc frecvent infecții oportuniste în gazde sensibile și/sau în spitale, izolatele manifestând fenotipuri de multi-rezistență la antibiotice (Van Tyne și colab, 2014).

Factori de virulență și patogenitate. Enterococii rezistenți la vancomicină (VRE) (Enterococcus faecium și E. faecalis) posedă markeri de rezistență la antibiotice, genele vanA și /sau vanB, precum și capacitatea de a forma biofilme. E. faecalis exprimă numeroși factori de virulență cu ol în procesul infecțios precum: hemolizine (citolizine, adezine numite și „substanță de agregare”. Asocierea producerii de citolizină cu rezistența la nivelul înalt la gentamicinei este asociată cu o creștere de cinci ori a riscului de deces la pacienții cu bacteriemie produsă de E. faecalis (Hirt și colab, 2002).

Enterococii posedă multiple caractere care le sporesc virulența ca urmare, prevalența infecțiilor enterococice este în creștere. Enterococii constituie o cauză semnificativă a infecțiilor nosocomiale, clasându-se printre primele trei infecții frecvente asociate asistenței medicale, inclusiv I.T.U, bacteriemie și infecții asociate plăgilor chirurgicale (Weiner si colab, 2016).

2.9. Staphylocuccus aureus

Caractere de cultură și metabolice. S. aureus. sunt coci Gram-pozitive (tabelul 4), catalazo-pozitivi (tabelul 5), facultativ anaerobi. Stafilococii patogeni sunt adeseori hemolitici, coagulează plasma și produc o diversitate de enzime extracelulare și toxine. Sunt agenți patogeni oportuniști, colonizează tegumentele, suprafețele mucoaselor, partea superioară a tractul gastro-intestinal și respirator, precum și tractul urogenital (Hanna și colab, 2019).

Factori de patogenitate și virulență. Patogenitatea S. aureus se datorează unui număr mare de factori de virulență, până la 70 de factori, care conferă tulpinilor patogene proprietăți noi fiziologice, metabolice și de biosinteză, precum capacitatea de a se multiplica și de a se disemina în țesuturi; sinteza unui număr mare de tipuri de molecule toxice sau cu activitate enzimatică, codificate de gene plasmidiale sau cromosomale (Martison și colab, 2012).

Factorii de virulență prezenți la Staphylococcus sp. sunt clasificați în mai multe categorii: particularități biochimice ce favorizează supraviețuirea în macrofage (pigmentogeneza, producerea de catalază); mecanisme de evitare a răspunsului imun al gazdei (proteina A, capsula, coagulazele libere și legate); invazine (hialuronidaza, stafilokinaza sau fibrinolizina, care acționează ca factor de difuzie, leucocidinele; proteazele; lipazele, beta-lactamazele); exotoxine (alfa-toxina, leucocidina, toxinele exfoliative, toxina sindromului de șoc toxic, enterotoxine) (Chifiriuc și colab, 2015).

Purtătorii de S. aureus reprezintă un factor important în trasmiterea, virulența și patogenitatea speciilor, aceștia fiind izvoare de infecție pentru persoanele nepurtătoare cu un sistem imunitar deficitar. În ultimul an, incidența infecțiilor cu stafilococi și, mai precis, S.aureus rezistent la meticilină (MRSA) au crescut într-o manieră semnificativă (Chifiriuc și colab, 2015). Majoritatea cazurilor de bacteriurie cu S. aureus nu sunt asociate cu simptome generale de I.T.U. Deoarece bacteriuria apare concomitent cu cateterizarea urinară pe termen lung, semnificația clinică a izolării S. aureus din urină nu este definită la acești pacienți (Hanna și colab, 2019).

2.10. Streptococcus agalactiae

Caractere de cultură și metabolice. S. agalactiae (streptococ de grup B (SGB)), aparține grupului Lancefield B. Este β-hemolitic, pozitiv pentru testul CAMP și component al microbiotei vaginale la 5-25% dintre femei. Este un comensal comun al tractului gastrointestinal uman și genito-urinar. Reprezintă o cauză majoră de infecție gravă la nou-născuți, la femeile însărcinate și la persoanele în vârstă cu boli cronice medicale. La nou-născuți, infecția cu SGB cauzează cel mai frecvent pneumonie, meningită și sepsis. Colonizarea cervicovaginală maternă și infecția neonatală, poate rezulta din transmiterea verticală a SGB de la mame la sugari (Tan și colab, 2010, Simon și colab, 2019).

Spectrul SGB include bacteriurie asimptomatică (BA), cistită, pielonefrită, uretrită și urosepsis. BA este deosebit de frecvent întâlnită în rândul femeilor însărcinate, deși, cele mai expuse riscului de cistită din cauza SGB par a fi persoanele în vârstă (Kerneis și colab, 2017).

Factori de virulență și patogenitate. Mecanismele patogene care stau la baza ITU datorate S. agalactiae sunt slab definite. Puține studii au examinat rolul factorilor de virulență ale S. agalactiae. Infecția cu SGB începe de multe ori cu aderarea la celulele epiteliale de la nivelul suprafețelor mucoase, cum ar fi cele care căptușesc tractul respirator sau urogenital. SGB pot adera la celulele epiteliale vaginale umane în condiții de pH scăzut. Multe dintre interacțiunile cu celule gazdă implică atașarea SGB la moleculele matricei extracelulare: fibronectina, fibrinogenul și laminina, care, la rândul lor, leagă proteine de suprafață ale celulei gazdă cum ar fi integrinele (Chifiriuc și colab, 2015). SBG exprimă un număr important de factori de virulență cel mai important fiind polizaharidele capsulară (bogată în acid sialic) și o toxină care formează pori, denumită β-hemolizină. Se consideră că pigmentul produs de către SGB și hemolizina sunt molecule identice sau strâns legate (Rajagopal, 2009).

2.11. Serratia marcescens

Caractere de cultură și metabolice. S. marcescens este un bacil patogen oportunist, Gram-negativ, facultativ anaerob și a fost inițial considerată a fi un comensal, nepatogen. S. marcescens este implicată în infecții dobândite în spital, în special bacteremia asociată cateterelor, I.T.U și infecții asociate plăgilor. Caracterele morfologice și metabolice ale acestei specii sunt descrise în tabelul 4, respectiv tabelul 5.

Factori de virulență și patogenitate. S. marcescens a fost în mod tradițional asociată cu patogenitate intrinsecă scăzută. Deși aproape toate izolatele produc toxine extracelulare, cum ar fi DNază, chitinază, lecitinază, lipază, gelatinază și siderofori, se pare că acestea nu acționează ca factori de virulență. Însă, studiile indică faptul că S. marcescens poate exprima și factori invazivi. Aproape toate izolatele de S. marcescens secretă o hemolizină care formează pori, ShIA, care este asociată cu citotoxicitatea celulară și cu eliberarea de mediatori ai inflamației. Se consideră că această citotoxină contribui la invadarea țesuturilor gazdă. Conform studiilor de specialitate realizate pe izolate de S. marcescens, s-a constat că acestea se pot angaja în mecanisme de semnalizare celulară, ce pot fi implicate în procesul de apariție a biofilmului (Lai și colab, 2005).

Tabelul 4. Caracterele de morfologie ale agenților uropatogeni (MicrobiologyInfo.com)

Tabelul 5. Caracterele metabolice și caracterele biochimice ale agenților uropatogeni implicați în patogeneza infecțiilor de tract urinar (MicrobiologyInfo.com)

Legendă: ’’+’’- PREZENT; ’’-’’- NEGATIV; ’’V’’- VARIABIL; ’’/’’ – nu sunt informații

Capitolul 3. Rezistența la antibiotice a uropatogenilor

Eficiența terapeutică a antibioticelor este pusă în pericol de diseminarea la nivel global a mecanismelor de rezistență la antibiotice, cauzată de utilizarea excesivă și necorespunzătoare a acestora în terapia bolilor infecțioase (Bush și colab., 2011).

Creșterea rezistenței la antibiotice a uropatogenilor afectează eficiența terapiei empirice cu antibiotice a I.T.U., cele mai prevalente infecții bacteriene la nivel global. Studiile sugerează că uropatogenii rezistenți la antibiotice pot persista în intestin după eradicarea infecției și pot produce infecții recurente urmare a contaminării periuretrale. O mai bună înțelegere a dinamicii transmiterii dintre tracturile intestinal și urinar, asociată cu o caracterizare fenotipică a populațiilor de uropatogeni în ambele habitate, poate contribui la dezvoltarea de terapii prudente care să prevină creșterea rezistenței la antibiotice a uropatogenilor.

I.T.U. sunt printre cele mai prevalente infecții bacteriene, afectează mai frecvent femeile, jumătate dintre acestea fiind afectate de cel puțin o I.T.U în cursul vieții. Majoritatea I.T.U. sunt produse de tulpini uropatogene de E. coli (UPEC), care sunt specific adaptate pentru colonizarea tractului urinar. Tulpini de K. pneumoniae, S. saprophyticus, E. faecalis, și P. mirabilis sunt cauze frecvente ale I.T.U.

În prezent, tulpinile bacteriene rezistente la antibiotice asociate cu I.T.U. sunt frecvent rezistente la majoritatea antibioticelor utilizate. Plasmidele ce conțin gene codificatoare pentru beta-lactamaze de spectru extins s-au răspândit rapid în cadrul familiei Enterobacteriaceae. Deosebit de alarmant sunt tulpinile UPEC producătoare de beta-lactamaze de spectru extins care în prezent sunt detectate la pacienți fără factori de risc, precum expunerea în unitățile sanitare. Eficiența terapiei empirice este complicată la pacienții cu I.T.U cronice, care prezintă un istoric de expunere repetată la antibiotice care poate conduce la creșterea rezistenței la antibiotice a uropatogenilor. Pentru acești pacienți, sunt urgent necesare dezvoltarea de strategii care să ghideze antibioterapia prudentă. Conceptul clinic este de a tratta indivizii cu istoric de I.T.U. recurente pe baza profilurilor de sensibilitate ale uropatogenilor izolați în I.T.U anterioare (Thänert și colab.,, 2019).

3.1 Clasificarea antibioticelor

Schemele de clasificare a antibioticelor se bazează pe structurile moleculare, modul de acțiune, spectrul de activitate sau calea de administrare (injectabilă, orală și topică) (Stokes și colab, 2019). Ținta specifică de acțiune a antibioticelor definește mecanismul lor de acțiune:

inhibarea sintezei peretelui celular prin blocarea enzimelor care intervin în sinteza peptidoglicanilor (transglicozilaze, transpeptidaze, carboxipeptidaze), efectul final fiind liza bacteriei prin șoc osmotic (ex. penicilinele și cefalosporinele cu nucleu β-lactamic, vancomicina, bacitracina, fosfomicina, cicloserina);

alterarea structurală sau funcțională a membranei plasmatice (ex. polimixinele B și E, gramicidinele, tirocidinele);

inhibarea biosintezei acizilor nucleici și proteinelor la nivelul replicării, transcrierii sau traducerii informației genetice:

inhibarea replicării materialului genetic prin cuplare cu ADN-giraza (quinolonele);

blocarea transcrierii informației genetice, prin cuplare cu ARN-polimeraza dependentă de ADN (rifamicinele, novobiocina);

inhibarea sintezei proteice prin blocarea traducerii informației genetice la diferite niveluri (formarea complexelor de inițiere, elongarea, legarea ARNt aminoacilat la ribosom etc. (ex. aminoglicozidele, macrolidele, streptograminele, lincosamidele, fenicolii, acidul fusidic);

antagonism competitiv cu biosinteza precursorilor nucleotidici (sulfamidele, trimetroprimul, nitroimidazolii, nitrofuranii) (Chifiriuc și colab, 2015).

Figura 6. Modul de acțiune al antibioticelor. Antibioticele pot inhiba creșterea bacteriilor prin țintirea peretelui celular bacterian sau a membranei celulare. Alte ținte sunt reprezentate de inhibarea sintezei acidului nucleic și de inhibarea sintezei proteinelor. Inhibarea sintezei proteinelor este un proces realizat de ribozomi, complexe de nucleoproteine ​​construite dintr-o subunitate mică (30S)și o subunitate mare (50S). Antibioticele pot acționa, de asemenea, ca antimetaboliți prin inhibarea metabolismului folatului (și, prin urmare, sinteza ADN-ului) pe o cale care implică acid paraaminobenzoic (PABA) și doi precursori ai acidului folic, acidul dihidrofolic (DHF) și acidul tetrahidrofolic (THF). Antibioticele pot inhiba giraza ADN, enzimă care modifică conformația ADN-ului, cu rol în replicare și transcriere. Clasele de antibiotice implicate în fiecare mecanism sunt reprezentate în figura 6 prin textul de culoare gri (Sanseverino și colab., 2018)

Antibiotice cu acțiune asupra biosintezei peretelui celular (β-lactamii)

Antibioticele beta-lactamice sunt una dintre cele mai prescrise clase de medicamente cu numeroase indicații clinice. Din punct de vedere biochimic, aceste medicamente au o caracteristică comună și anume inelul beta-lactam, compus din 3 atomi de carbon și unul de azot care este foarte reactiv (Eckburg și colab, 2019). Situsul de acțiune al acestei clase de antibiotice este reprezentat de sinteza peretele celular (peptidoglicanul). Peptidoglicanul este un component vital al peretelui celular bacterian ce îi asigură stabilitate mecanică. Antibioticele beta-lactamice inhibă ultima etapă din sinteza peptidoglicanului prin procesul de acilare a transpeptidazei, împiedicând astfel formarea peptidoglicanului (Eckburg și colab, 2019). Țintele pentru acțiune ale antibioticelor beta-lactamice sunt proteinele ​​care leagă penicilina (PBP-penicillin-binding protein). Această legare, la rândul său, întrerupe procesul de transpeptidare terminală și induce pierderea de viabilitate și liza celulară (Eckburg și colab, 2019). Reprezentanții clasei beta-lactaminelor includ penicilinele, cefalosporinele, monobactami și carbapenemii.

Penicilinele sunt un grup de antibiotice beta-lactamice, prima penicilină fiind descoperită în 1928 de către Alexander Fleming. Toate penicilinele au aceeași structură inel beta-lactamic și inel tiazolidină, dar diferă prin lanțurile lor laterale (Patterson și colab, 2019).

Penicilinele includ: penicilina G, penicilina V, penicilină procaină, penicilina benzathină precum și alți 15 compuși înrudiți cu efecte antibacteriene mai largi (Taremi și colab, 2019). Alte peniciline: penicilinele antistafilococice, aminopenicilinele (amoxicilină și penicilinele antipseudomonale (piperacilină).

Amoxicilina este o aminopenicilină. Combinația amoxicilină-acid clavulanic (un inhibitor de β-lactamază) prezintă un spectru vast de acțiune față de mai multe infecții bacteriene, precum I.T.U, infecții de tract respirator. Se află pe lista Organizației Mondiale a Sănătății cu medicamente esențiale (Gillies și colab, 2016). Combinația amoxicilină-acid clavulanic are activitate bactericidă, prin inhibarea biosintezei stratului de peptidoglican. Amoxicilina se leagă la PBP și inhibă sinteza peptidoglicanului (Evans și colab, 2020). Mecanismele de rezistență ale patogenilor la antibiotice beta-lactamice includ producerea de enzime numite beta-lactamaze. Aceste enzime hidrolizează inelul beta-lactam, necesar exercitării acțiunii β-lactaminelor. Acidul Clavulanic previne această degradare prin legarea și inactivarea beta-lactamazelor, restabilind astfel efectele antimicrobiene ale amoxicilinei (Evans și colab, 2020).

Piperacilină/tazobactam este o combinație care conține piperacilină și inhibitor de β-lactamază, respectiv tazobactam. Combinația are activitate împotriva multor bacterii Gram-pozitive și Gram-negative, inclusiv P. aeruginosa. Piperacilina este utilizată cel mai frecvent în combinație cu inhibitorul de beta-lactamază tazobactam, care îmbunătățește eficacitatea piperacilinei prin inhibarea mai multor beta-lactamaze, în special a celor aparținând grupelor SHV-1 și TEM (Zhanel și colab, 2008). Se află pe lista Organizației Mondiale a Sănătății cu medicamente esențiale, cele mai sigure și eficiente medicamente necesare într-un sistem de sănătate.

Cefalosporinele prezintă un mecanism de acțiune similar cu cel al penicilinelor, respectiv inhibarea sintezei peptidoglicanului (Pichichero și colab, 2007).

Cefalosporinele sunt antibiotice grupate în cinci generații în funcție de spectrulul lor de acțiune împotriva bacteriilor Gram pozitive și Gram-negative. Cefalosporinele de primă generație au acțiune împotriva majorității cocilor Gram-pozitiv și bacililor Gram-negativ (E. coli, P. mirabilis, K. pneumoniae). Cefalosporinele de a doua generație prezintă acțiune împotriva bacteriilor Gram-negativ, H. influenza, și Bacteroides. Cefalosporinele de a treia generație au o acțiune redusă asupra microorganismelor Gram-pozitive, dar au o acțiune crescută împotriva Enterobacteriaceae, Neisseria și H. influenza. Cefalosporinele de a patra generație au o acțiune similară cu cefalosporinele de a treia generație, dar prezintă un mecanism de acțiune suplimentar împotriva bacteriilor Gram-negative ce prezintă mecanisme de rezistență. Cea de-a cincea generație cefalosporine are acțiune împotriva stafilococilor rezistenți la meticilină și pneumococilor rezistenți la penicilină (Bui și Preuss, 2020).

Cefalosporinele utilizate cel mai adesea în terapia I.T.U fac parte din generația a doua (cefuroxim) și cefalosporine de generația a treia (cefixim, cefoxitin și ceftazidim). Cefuroximul împiedică creșterea bacteriană în principal prin inhibarea PBP, ceea ce conduce la liză și în cele din urmă, la moartea celulelor. Prezintă o activitate bună față de un spectru larg de bacterii Gram-pozitive și Gram-negative in vitro, inclusiv cele asociate cel mai frecvent cu I.T.U (Bischoff și colab, 2018).

Cefiximul, cefalosporină de a treia generație, este activ față de patogeni bacterieni care produc I.T.U. în comunitate. Este hidrolizată numai de β-lactamaze cu spectru extins și de niveluri ridicate de cefalosporinaze mediate cromosomiale (Garcia-Rodriquez și Munoz, 2000).

Antibiotice cu acțiune asupra sintezei proteice.

Antibioticele bacteriostatice determină inhibarea sinteza proteinelor bacteriene: macrolide, tetracicline, clindamicină, linezolid și cloramfenicol (Nemeth și colab, 2015).

Din clasa macrolidelor fac parte eritromicina, claritromicina și azitromicina. Eritromicina are o activitate slabă împotriva organismelor Gram-negative și anaerobe. Claritromicina are un spectru de activitate similar cu eritromicina, cu activitate suplimentară împotriva unor specii de Staphylococcus și Streptococcus (Jelić și Antolović, 2016).

Mecanismul de acțiune al macrolidelor se bazează pe capacitățile lor de a lega subunitatea ribosomală bacteriană 50S provocând astfel blocarea sintezei proteinelor. Odată legat, antibioticul împiedică translația ARNm, în special creșterea lanțului peptidic, prin prevenirea adăugării următorului aminoacid de către ARNt. Macrolidele sunt considerate bacteriostatice, deoarece inhibă doar sinteza proteinelor, deși, în doze mari, pot fi bactericide (Vázquez-Laslop și colab, 2018).

Aminoglicozidele au un spectru larg de activitate: bacterii aerobe, bacterii Gram-negative și micobacterii. Există mai multe antibiotice din clasa aminoglicozidelor: gentamicină, tobramicină, amikacină, neomicină, plazomicină și streptomicină (Block și Blanchard, 2020). Aminoglicozidele au activitate bactericidă, ținta de acțiune fiind subunitatea ribosomală 30S. Se leagă de situsul A de la ARN 16S, o componentă a subunității ribosomale 30S. Legarea determină alterarea traducerii și consecutiv inhibarea sintezei proteinelor (Krause și colab, 2016).

Gentamicina (1962) prezintă activitate față de bacterii Gram-negative (Pseudomonas, Proteus, E.coli, K. pneumoniae, E. aerogenes, Serratia spp) și Staphylococcus. Gentamicina este utilizată în tratamentul infecțiilor tractului respirator, I.T.U, infecții ale sângelui (Mould și colab, 2010). Gentamicina este un antibiotic cu activitate bactericidă, leagă subunitatea 30S și inhibă astfel sinteza proteice. Au fost propuse mai multe mecanisme de acțiune ale gentamicinei (Borovinskaya și colab, 2007).

Inhibarea sintezei acizilor nucleici

Quinolonele și fluorochinolonele sunt agenți antimicrobieni sintetici și cu activitate bactericidă, cu spectru larg de acțiune, fiind foarte eficiente atât împotriva bacteriilor Gram negativ, cât și a celor pozitive. Acest grup de antibiotice se leagă de topoizomeraza II bacteriană (giraza ADN) și / sau topoizomeraza IV și interferă cu procesul de sinteză a acizilor nucleici și în etapele ulterioare ale sintezei proteice (Santhosh, 2014).Fluorochinolonele (ciprofloxacină, levofloxacină, norfloxacină, ofloxacină și gatifloxacină) sunt antibiotice cu spectru larg de acțiune, fiind utilizate în tratamentul infecțiilor cu bacterii Gram-pozitive și Gram-negative. De ​​exemplu, fluorochinolonele sunt considerate antibiotice de primă linie pentru cistita acută necomplicată (Chao și Farrah, 2019).

Ciprofloxacina este utilizată pentru tratarea infecțiilor bacteriene, precum I.T.U., bolilor cu transmitere sexuală, infecții cutanate, infecții gastrointestinale, infecții ale tractului respirator inferior (Sharma și colab, 2010). Se află în ghidurile de tratament pentru pielonefrită acută, infecții ale tractului urinar complicate sau dobândite în spital, prostatită acută sau cronică (Thai și Zito, 2019). Levofloxacina este aprobat de FDA pentru tratamentul pneumoniei nosocomiale, prostatitei, pielonefritei acute, I.T.U necomplicate sau complicate (Podder și Sadiq, 2019).

Trimetoprim-sulfametoxazol este utilizat în prevenirea și tratarea a numeroase infecții bacteriene (Kemnic și Coleman, 2019). Utilizarea acestuia a fost aprobată de FDA pentru tratamentul I.T.U., pneumonie, shigeloză. Sulfametoxazolul este o sulfonamidă și acționează asupra căii de sinteză folatului. Trimetoprimul inhibă dihidrofolat reductază, și blochează producerea de tetrahidrofolat, utilizat în sinteza purinelor. Are acțiune bacteriostatică. Combinația de sulfametoxazol-trimetoprim blochează două etape în biosinteza acizilor și proteinelor esențiale, având acțiune bactericidă (Kemnic și Coleman, 2019). Ratele de rezistență ale izolatelor de E. coli din SUA și majoritatea Europei au depășit 20%.

3.2 Mecanismele de rezistență la antibiotice ale agenților uropatogen

Diferitele clase de antibiotice, precum aminoglicozide, amfenicoli, ansamicine, beta-lactamine (inclusiv carbapenem), glicopeptide, licosamide, lipoglicopeptide, lipopeptide, macrolide și ketolide, noimidazoli, oxalidinone, polimixină, fluoroquinolone, sulfonamide și tetraciclinele acționează selectiv împotriva mai multor ținte celulare microbiene, precum peretele celular, membrana plasmatică, sinteza proteinelor și a metaboliților sau transcripția și replicarea ADN-ului. Rezultatul acțiunii lor este reprezentat de distrugerea celulei microbiene sau inhibarea creșterii celulare.

Bacteriile prezintă o capacitate naturală de a dezvolta rezistență la antiotice. Presiunea selectivă exprimată de antibiotice poate determina bacteriile să dobândească și să răspândească materialul genetic necesar rezistenței la medicamente, prin mutații spontane și prin procesul de transfer orizontal de gene (HGT- horizontal gene transfer) (MacLean și San, 2019). HGT permite bacteriilor schimbul de material genetic, inclusiv genele de rezistență la antibiotice, (ARG- antibiotic resistance gene) între diverse specii, favorizând considerabil dezvoltarea multirezistenței la antibiotice (MDR-multidrug resistance) în populațiile bacteriane, rezistență microbiană (AMR- antimicrobial resistance) și patogenitatea tulpinilor (Le Roux și Blokesch, 2018).

Un proces principal prin care bacteriile pot deveni rezistente la antibiotice sunt mutațiile spontane, ce acționează prin inducerea de modificări la nivelul țintelor celulare ale antibioticelor. Elementele genetice mobile (MGE- mobile genetic elements), adică plasmidele și bacteriofagele pot transfera ARG între populațiile bacteriene și s-a dovedit că joacă un rol important în dezvoltarea MDR la bacterii. Plasmidele pot fi transferate la diferite specii bacteriene, creând noi „superbugs”, termen folosit pentru tulpinile care au suferit modificări treptate în genomul său conferindu-le rezistență la multiple medicamente. Apariția globală a „superbugs” care transportă plasmide MDR (de exemplu, NDM-1 și MCR-1) în diverse nișe de mediu (de exemplu, pacienți, animale și sol) indică o propagare rapidă a MDR în rândul populațiilor bacteriene (Sun și colab, 2019).

ARG-urile au fost identificate nu numai la om, ci și la porci, animale însoțitoare și plante (Sun și colab, 2019). Aceste ARG-uri includ variante ale genei bla care codifică β-lactamazele pentru degradarea celei mai noi generații de antibiotice β-lactamice (Huang și colab., 2018, Chi și colab.,2019). Plasmidele joacă un rol important ca vehicule în transferul mai multor ARG de la o gazdă bacteriană MDR la alta simultan. Numeroase studii (Barrón și colab., 2018; Fang și colab.,2018; Huang și colab.,2018; LaBreck și colab.,2018) au arătat că ARG-urile erau adesea identificate în plasmide din bacteriile MDR care trăiesc în nișe diferite

Transferul de ARG are loc prin trei mecanisme: conjugarea (transferul ADN-ului între bacterii prin contact direct de la celulă la celulă), transformarea naturală (absorbția ADN-ului liber din mediu) și transducția (transferul ADN-ului de la un virus la bacterii). Studii recente au identificat căi necunoscute anterior pentru HGT, cum ar fi transducția laterală, care determină transferul rapid al ADN-ului cromozomial de bacteriofagi. Strategia principala de diseminare a ARG-urilor este conjugarea. MGE-urile, cum ar fi plasmidele, transpozonii și integronele care conțin ARG sunt schimbate între bacterii prin contact celulă-celulă. Bacteriile MDR care servesc drept gazde pentru MGE-uri (gene, integroni, transpozoni și plasmide) le conferă fenotipuri de rezistență la antibiotice și facilitează diseminarea lor. Datele bazate pe secvențiere microbiană indică faptul că AMR în majoritatea patogenilor umani importanți a fost determinat de răspândirea unui număr mic de tulpini de succes care pot fi transmise în mod eficient între pacienți (MacLean și San Millan, 2019)

Rezistența intrinsecă (naturală) reprezintă capacitatea de rezistență a tuturor membrilor unei specii bacteriene, față de unul sau mai multe antibiotice. Rezistența naturală este proprietatea intrinsecă a speciei (Habboush și Guzman, 2019; Mărculescu și colab, 2007). Exemple de rezistență intrinsecă la bacteriile implicate în I.T.U.: P. mirabilis manifestă rezisență intrinsecă la tetracicline, tigeciclina, nitrofurantoin.

Mecanismele responsabile pentru rezistența bacteriilor la antibiotice sunt:

Inactivarea antibioticului, cel mai frecvent mecanism întălnit în patologia infecțioasă.

Modificarea permeabilității peretelui celular bacterian care restricționează accesul antibioticelor la situsurile țintă. Aceasta se realizează prin blocarea parțială sau totală a porilor membranei, astfel traversarea membranei externe de către antibiotic este încetinită.

Efluxul activ al antibioticelor din celula bacteriană. Pompele de eflux expulzează antibioticul, nepermițând acumularea acestuia în celulă în cantități necesare exercitării acțiunii antimicrobiene.

Modificarea situsului țintă al antibioticului. De exemplu modificarea PBP (penicillin binding proteins), proteine inserate pe fața externă a membranei celulare (betalactamice) sau modificarea proteinei țintă ribosomale (aminoglicozide, tetracicline).

Modificarea căilor metabolice la nivelul cărora acționează antibioticele.

Modificarea unor enzime (Mărculescu și colab, 2007, Habboush și Guzman, 2019).

Figura 7. Mecanisme de rezistență la antibiotice: efluxul antibioticelor prin expresia de pompe de eflux,

modificări enzimatice ale antibioticelor, degradarea enzimatică a antibioticelor și

modificarea țintelor de acțiune (Aslam și colab., 2018).

I.T.U. sunt printre cele mai răspândite boli infecțioase bacteriene în populația umană la nivel global. În prezent,. I.T.U.-urile sunt din ce în ce mai dificil de tratat din cauza apariției pe scară largă a mecanismelor de rezistență la antibiotice. De o îngrijorare deosebită sunt membrii familiei Enterobacteriaceae, inclusiv E. coli și K. pneumoniae, care au dobândit plasmide care codifică pentru beta-lactamaze de spectru extins, responsabile pentru diseminarea rezistenței la cefalosporine generația a treia și la alte antibiotice (Flores-Mireles, 2016).

3.2.1. E. coli uropatogenă (UPEC). Eficiența tratamentului cu antibiotice depinde de identificarea uropatogenilor și determinarea profilurilor de sensibilitate la antibiotice (Bartoletti și colab., 2016). Prescriea de antibiotice pentru tratarea I.T.U fără identificare și stabilire a spectrului de sensibilitate la antibiotice, a condus la apariția de rate înalte de rezistență în rândul uropatogenilor și la scăderea eficienței terapiei orale. Astfel că, în prezent, persistența și rezistența la antibiotice a tulpinilor de UPEC constituie o problemă gravă (Blango și Mulvey, 2010).

În Europa, ratele de rezistență la antibiotice ale tulpinilor UPEC prezintă valori medii de 11,8% pentru cefalosporine de a treia generație și 22,3% pentru fluorochinolone. În SUA, tulpinile de UPEC rezistente la fluorochinolone au reprezentat 31,3% dintre izolatele colectate de la pacienții internați între 2007 și 2010. Aceste date confirmă faptul că numărul de antibiotice disponibile și prevalența rezistenței la antibiotice se agravează, așa cum este demonstrat de numărul ridicat de studii clinice (Bartoletti și colab., 2016).

În România, în anul 2017, s-a observat, o ușoară scadere a ratelor de rezistență la ampicilină și la cefalosporine de generația a treia la E. coli, de altfel, există o regresie și în ierarhia statelor EARS Net. Conform raportărilor, România se clasează pe locul al 4-lea în ceea ce privește rezistența la aminopeniciline și pe locul 7, în cazul rezistenței la cefalosporinelor. Tendința generală a ratelor de rezistență, pentru intervalul 2012-2017 este în continuare una crescătoare, dar cu o semnificație mai redusă. Pentru perioada analizată, anume 2012-2017, se constată că nivelul de rezistență se menține aproape constant pentru fluorochinolone, între 28%-31%. Au fost identificate și raportate tulpini de E.coli rezistente la carbapeneme.

Studiul realizat de Ghibelean și colab. în 2020, în cadrul a două spitale din România, au raportat faptul că cel mai frecvent agent uropatogen izolat a fost E.coli (35.98%). Mai mult, acest procent poate fi comparat cu rezultate obținute în studii realizate în Etiopia (Seifu și Gebissa, 2018), Polanda (Kot, 2019) sau alte orase din România, precum Timișoara (Chiță și colab, 2017), Cluj-Napoca (Farkas și colab, 2018) sau chiar București (Delcaru și colab, 2017).

Analiza nivelelor de rezistență la fluorochinolone și la cefalosporine de generația a 3-a ale izolatelor de E. coli între diverse regiuni geografice din România a arătat că ratele de rezistență la fluoroquinolone, în perioada 2012-2017 a fost mai mare în Transilvania și Banat, 36,2% față de 29,5% în București și 21,3% în Moldova. Nivelul rezistenței la cefalosporine de generația a treia a fost aproape identic în cele trei regiuni București, 20,7%, Transilvania și Banat, 23,6% și Moldova 16,7% (Carmin-Rom, 2017).

O constatare importantă în studiul realizat de Ghibelean și colab., 2020, a fost reprezentat de rezistența alarmant de mare la levofloxacină a E. coli. În ultimii ani, ratele de rezistență pentru fluorochinolone au crescut exponențial. O lucrare recentă din 2019 din Spania (Smithson și colab., 2019), care a vizat, de asemenea, detectarea uropatogenilor implicați în rezistență ridicată a E. coli la fluoroquinolone, prezintă similarități în ceea ce privește rezultatele raportate. Un studiu din Etiopia (Bitew și colab, 2017) sugerează rate de rezistență chiar mai mari la levofloxacină – R = 55,6% pentru E. coli, o constatare care indică o creștere a rezistenței în toată lumea, în special pentru fluorochinolone, din cauza supraprescripției. Ratele de rezistență pentru amoxicilină- acid clavulanic sunt de asemenea considerabile, peste un sfert din toate tulpinile identificate sunt rezistente la combinarea aminopenicilinei cu inhibitorul beta-lactamazei. Aceste numere sunt mai mici decât rezultatele din SUA, unde ratele de rezistență pentru E. coli la aminopeniciline au fost între 37,9% și 42,8% (Ghibelean și colab, 2020).

În mod surprinzător, în numeroase studii s-au detectat rate relativ mici de rezistență pentru E. coli la amikacin (4.83%), nitrofurantoin (14.33%), și fosfomicină (2.80%) (Ghibelean și colab, 2020) , ampicilină (7,7%) (Woldemariam și colab., 2019). Aceste două medicamente sunt un bun tratament empiric de primă linie, recomandată și de Asociația Europenă de Urologie. Cercetarea de la începutul anului 2019 în Australia a examinat eficiența acestor agenți antimicrobieni asupra tulpinilor de E. coli, concluzionând că sunt o alegere valoroasă pentru I.T.U inferioare necomplicate și că bacteriile rezistența la acești agenți este neobișnuită (Gardiner și colab, 2019).

Unele izolate UPEC pot fi rezistente la ampicilină și cefalosporine orale de primă generație (Moya-Dionisio et al. 2016). Rezistența la cefuroxim (cefalosporină de generație secundară) în Belgia, Germania și Spania a fost de 5,5%, 12,8%, respectiv 16,6% (Kresken și colab. 2016). Izolate E. coli de la pacienții internați în Anglia au fost rezistente la cefalosporine de a treia generație (cefotaxim / ceftazidim) (13.8–21.3%) (Abernethy și colab. 2017). Procentul de UPEC susceptibil la a treia generație de cefalosporine din România a fost de 87% (Ciontea și colab. 2018), în timp ce, alte cercetări efectuate în România au demonstrat că rata de rezistență a fost 47,52% pentru ampicilină și 41,16% pentru tetraciclină (Cristea și colab. 2019). Rezistența UPEC izolate în secția de urologie din Franța, pentru amoxicilină, ticarcilină, acidul nalidixic a crescut alarmant ajungând la 61,4%, 59% și, respectiv, 31,9% (Lavigne și colab. 2016). În Iran, rezistența la ampicilină, ceftazidime și acid nalidixic a fost mai mare de 50%, în timp ce amikacinul și gentamicina au arătat activitate ridicată față de UPEC (89,1% și 82,4% din izolatele sensibile) (Faghri et al. 2016). Rezistența împotriva gentamicinei și a amikacinei ls UPEC izolate de ambulatoriu din Pakistan au fost de 29%, respectiv 4% (Ali și colab. 2016)

Carbapenemele, piperacilina-tazobactamul și amikacina au fost foarte active (> 95% sensibilitate) împotriva izolatelor de E. coli din I.T.U colectate din 2010 până în 2014 în Canada și Statele Unite (Lob et al. 2016). Carbapenemele (ertapenem, imipenem, meropenem, doripenem) sunt recomandate pentru tratamentul acut I.T.U. necomplicată, I.T.U. complicată și urosepsis.

Producerea de betalactamaze cu spectru extins (ESBL, Extended Spectrum Beta-Lactamases), reprezintă unul dintre mecanismele care contribuie la rezistența tulpinilor de E. coli la antibioticele β-lactamice. Tulpinile ESBL pot degrada peniciline, cefalosporine de primă, a doua și a treia generație și monobactami. Aceste enzime pot fi inhibate de inhibitori de β-lactamaze, precum acidul clavulanic (Flores-Mireles, 2016).

Rezistența E. coli la β-lactami este mediată în primul rând de β-lactamaze, care hidrolizează inelul β-lactam și inactivează astfel antibioticul. Au fost descrise numeroase β-lactamaze. Peste 200 de β-lactamaze au fost clasificate în patru grupe principale și opt subgrupuri, în funcție de caracteristicile lor funcționale și structurale. Enzimele clasice TEM-1, TEM-2 și SHV-1 sunt β-lactamazele mediate de plasmidial la bacilii Gram-negativ. Variante ale TEM-1, TEM-2 și SHV-1 au apărut ca urmare a substituțiilor unice de aminoacizi în secvențele genelor codificatoare și sunt responsabile de inactivarea cefalosporinelor mai noi, dar care sunt încă sensibile la inhibitori de β-lactamază (Brinas și colab, 2000).

Tulpini rezistente la inhibitori de β-lactamază au apărut în anii '80, fiind descrise diferite mecanisme. Cea mai frecventă este hiperproducția de β-lactamaze clasice sau sinteza de β-lactamaze TEM rezistente la inhibitori prin substituții de aminoacizi. Alte mecanisme posibile sunt hiperproducția de AmpC β-lactamază cromosomală, sinteza de OXA β –lactamaze sau modificări ale permeabilității membranei (Brinas și colab, 2000). Identificarea surselor de transmitere a E. coli producătoare de ESBL este importantă pentru prevenirea răspândirii acestor fenotipuri de rezistență. De asemenea, identificarea factorilor de risc este importantă pentru determinarea pacienților cu un risc crescut de infecție: vârsta înaintată, diferite afecțiuni (cel mai frecvent diabet), I.T.U anterioare, spitalizarea de lungă durată și utilizarea anterioară de antibiotice pe o perioadă mai îndelungată. Studiile privind colonizarea tractului intestinal cu specii producătoare de ESBL au pus în evidență o asociere între utilizarea de antiacide și prevalența crescută a I.T.U.

Dintre antibiotice, imipenemul reprezintă cel mai eficient antibiotic împotriva tuturor tulpinilor UPEC (100%), urmat de ertapenem (99,98%), amikacin (99,94%) și nitrofurantoin (99,91%). Carbapenemele precum imipenem reprezintă cea mai bună opțiune pentru tratamentul infecțiilor cu uropatogeni ESBL. Tulpinile UPEC sunt, de asemenea, sensibile la ciprofloxacină, cefotaximă, piperacilină / tazobactam, azitromicină, doxiciclină și ceftriaxonă. Însă, numeroase izolate UPEC sunt rezistente la ampicilină, cefalosporine orale de primă generație, sulfametoxazole-trimetoprim, cefuroxim, amoxicilin-acid clavulanic, acid nalidixic și aminopeniciline. În unele cazuri, combinațiile de antibiotice pot determina o creștere semnificativă a sensibilității, exemplu: triclosa, amoxicilină și gentamicină. O analiză retrospectivă a identificat ciprofloxacina drept cel mai utilizat antibiotic în terapia empirică a I.T.U. (76% din cazuri) (Terlizzi și colab, 2017).

Datorită efectelor ecologice, cefalosporinele orale și fluorochinolonele nu mai sunt recomandate ca tratamente de rutină, cu excepția situațiilor clinice specifice. Mai mult, creșterea la nivel mondial a prevalenței tulpinilor UPEC rezistente la trimpethoprim pune la îndoială utilizarea acesteia cu sau fără sulfonamidă ca agent profilactic eficient. La femeile gravide cu istoric de I.T.U. recurente au fost puse în evidență nivele crescute de rezistența ale tulpinilor UPEC la ampicilină (96,42%), tetraciclină (85,71%), amikacină (71,42%), ciprofloxacină (67,85%) și gentamicină (58,71%) (Terlizzi și colab, 2017). Noile antibiotice: colistina, finafloxacină și cefiderocol (S-649266), care sunt în prezent în stadiul clinic de dezvoltare pot fi utile în tratamentul I.T.U. (Terlizzi și colab, 2017).

În figura 8 sunt reprezentate formulele structurale ale celor mai reprezentative antibiotice față de care s-a demonstrat rezistența tulpinilor de UPEC (fond roșu) și a celor la care tulpinile de UPEC prezintă sensibilitate la (fond verde). Fundalul galben prezintă antibiotice față de care unele tulpini UPEC prezintă rezistență.

Figura 8. Formulele structurale ale celor mai reprezentative antibiotice pentru care s-a demonstrat rezistența UPEC (fond roșu) și a celor la care tulpinile de UPEC prezintă sensibilitate la (fond verde). Fundalul galben prezintă antibiotice față de care unele tulpini UPEC prezintă rezistență.

3.2.1. K. pneumoniae. Tulpinile de K. pneumoniae pot prezenta fenotipuri de rezistență ESBL. Aceste enzime conferă rezistență la antibiotice β-lactamice, inclusiv cefalosporine de generație a treia și monobactami. Până în prezent, peste 400 de enzime ESBL au fost identificate, iar cele mai multe dintre ele au evoluat datorită mutațiilor incluzând TEM-1, TEM-2 și SHV-1, cu peste 150 de membri. Până la sfârșitul anilor 90, majoritatea tulpinilor de K. pneumoniae ESBL (în principal TEM și SHV) au fost izolate din focare nosocomiale (Munoz-Price și colab, 2013).

De asemenea, în studiul realizat de Ghibelean și colab., 2020, Klebsiella spp. a prezentat rate de rezistență alarmant de mari pentru multe dintre cele mai frecvent utilizate agenți antibiotici din ambele clinici. Cea mai mare rezistență globală a fost observată pentru amoxicilină- acid clavulanică, care este similar cu alte descoperiri din Norvegia (Grude și colab, 2001). În Etiopia (Bitew și colab, 2017), sensibilitatea tulpinilor de Klebsiella spp la combinația de amoxicilină- acid clavulanic este mai mare comparativ cu țările europene. Locul doi în ceea ce privește rezistența este reprezentat de levofloxacină, aproape jumătate din tulpinile totale au prezentat rezistență. Procentele obținute sunt considerabil mai mari în comparație cu alte studii, din Europa și SUA (Jones și colab, 1999). Capacitatea de rezistență a tulpnilor de Klebsiella spp la levofloxacină sunt raportate în alte țări europene. Un raport din Portugalia (Caneiras și colab, 2019) declară o sensibilitate considerabil mai mare la acest medicament, comparativ cu constatările acestui studiu, atât pentru I.T.U.-uri dobândite din spital rezistente dar și pentru tulpinile dobândite de comunitate (Ghibelean și colab, 2020).

Infecțiile cauzate de bacteriile producătoare de ESBL au din ce în ce mai multe limitări terapeutice și pacienții cu aceste infecții prezintă un risc ridicat pentru eșecul tratamentului, asistență medicală timp îndelungat, costuri și mortalitate ridicată (Tzouvelekis și colab, 2012).

3.2.2 Enterobacter spp.

La tulpinile de Enterobacter izolate din infecțiile urinare s-a detectat multi-rezistență la antibiotice. Tulpinile de Enterobacter au dezvoltat mecanisme de de rezistență inductibile, în special producerea de beta-lactamază (Davin-Regli și Pages, 2015).

Rezistența E. aerogenes la cefalosporine de generație a treia este cauzată în mod tipic de supraproducția de AmpC β-lactamaze și, astfel, tratamentul cu cefalosporine de generația a treia poate selecta pentru mutanții care produc exces de AmpC. Supraproducția AmpC se datorează eliminării unei gene cromosomiale sau prin achiziției unei gene ampC transferabile plasmidiale sau prin alte elemente mobile. Rezistența mediată de plasmida AmpC are o prevalență ridicată printre izolatele clinice. Enzima conferă o rezistență la cefalosporine de generația a treia și la ureidopeniciline și carboxi-peniciline și nu este inhibată de inhibitorii comuni ai β-lactamazelor (Potron și colab, 2013).

În ceea ce privește aminoglicozidele, mecanismul major de rezistență al Enterobacteriaceae se datorează enzimelor modificatoare de aminoglicozide, care sunt adesea asociate cu plasmide, dar pot fi asociate și cu elemente transpozabile. Aceste enzime sunt repartizate în trei grupe: acetiltransferaze (acetilarea unei grupări amino), fosfotransferazele (fosforilarea unei grupări hidroxil) și adeniltiltransferazele (adenililarea unei grupări hidroxil). Schimburile de plasmide și diseminările transpozonilor facilitează achiziția rapidă a fenotipurilor de rezistență (Mezzatesta și colab., 2012).

3.2.3. Enterococcus spp

Studii recente arată că tulpinile de Enterococcus spp. au dezvoltat rate de rezistență ridicate la glicopeptide, inclusiv vancomicină, prin expresia genelor de rezistență la vancomicină și teicoplanină (van) care codifică legarea ​​PBP, și anume genele VanA, VanB, VanD, VanE, VanG și VanL. Mecanismul de rezistență cel mai frecvent exprimat la enterococi (vanA) este înlocuirea D-alanină-D-alaninei cu D-alanină-D-lactoză la nivelul peretelui celular, reducând afinitatea de legare a vancomicinei. Tendința de creștere a uropatogenilor rezistenți la numeroase antibiotice a stimulat dezvoltarea de măsuri alternative de control și opțiuni noi de tratament (Flores-Mireles și colab, 2016).

Studii recente din Germania arată că ratele de rezistență ale Enterococcus spp pentru amicilină sunt 15%, în timp ce o altă lucrare din Iran a recunoscut rate mai mari de rezistență ale Enterococcus spp. la toate antibioticele testate după cum urmează fluoroquinolone 65,4%, ampicilină 28,2% și penicilină 68,6%. Scăderea eficacității cu care se confruntă Enterococcus spp. din aproape toți agenții antibacterieni testați ar trebui să fie un semn pentru comunitatea medicală (Ghibelean și colab, 2020).

3.2.4. Ps. aeruginosa prezintă rezistență la o varietate de antibiotice, incluzând aminoglicozide, chinolone și β-lactami. În general, principalele mecanisme ale P. aeruginosa utilizate pentru combaterea atacului la antibiotice pot fi clasificate în rezistență intrinsecă, dobândită și adaptivă. Rezistența intrinsecă include permeabilitatea membranei exterioare scăzută, exprimarea pompelor de efluent care expulzează antibioticele din celulă și producerea de enzime care inactivează antibiotice. Rezistența dobândită poate fi obținută fie prin transferul orizontal al genelor de rezistență, fie prin schimbări mutaționale (Breidenstein și colab., 2011). Rezistența adaptativă implică formarea biofilmului pacienților infectați, unde biofilmul servește ca barieră de difuzie pentru a limita accesul antibiotic la celulele bacteriene.

Patru pompe de eflux aparținând rezistenței la divizarea nodulării (RND) au fost descrise în bacteriile Gram-negative care participă activ la rezistența antimicrobiană (MexAB-OprM, MexXY-OprM, MexCD-OprJ și MexEF-OprN). Aceste pompe sunt folosite de Ps. aeruginosa pentru a obține rezistență împotriva diferitelor familii de antibiotice. MexEF-OprN și MexCD-OprJ conferă rezistență la fluoroquinolone, MexAB-OprM, MexEF-OprN și MexCD-OprJ sunt legate de rezistența împotriva β-lactamilor și, în final, MexXY-OprM, conferă rezistență împotriva aminoglicozidelor (Paz-Zarza și colab, 2019).

De asemenea, au fost identificate mutații ale genelor cromozomiale care conferă rezistență la peniciline, cefalosporine și monobactami în P. aeruginosa. Aceste mutații se găsesc în genele implicate în sinteza peptidoglicanului (ampD, dacB și ampR). De asemenea, mutațiile specifice ampC cresc rezistența la cefalosporine antipseudomonale. Rezistența la carbapenemele cum ar fi imipenemul și meropenemul apare prin impermeabilitatea membranei externe, datorită unei mutații în codificarea genei OprD care scade expresia proteinei în acest situs. S-a arătat că mutațiile genelor au ca rezultat mutații în giraza ADN (GyrA7, GyrB) și topoizomerază de tip IV (ParC/ParE) care induc rezistență la fluoroquinolone. Tulpini care codifică gena rmtA, care metilează subunitatea ARN-ului 16s, au fost de asemenea descoperite că prezintă rezistență la aminoglicozide (Paz-Zarza și colab, 2019).

În Europa, raportul recent al eCDC (European Centre for Disease Prevention and Control) publicat în 2016 a arătat că 33,9% din P. aeruginosa erau rezistente la cel puțin unul dintre grupurile antimicrobiene sub supraveghere (piperacilină ± tazobactam, fluorochinolone, ceftazidime, aminoglicozide și carbapenemuri). Acest raport a arătat variații majore între țări pentru toate grupurile antimicrobiene, cu un procent în general mai mare de rezistență în sudul și estul Europei, comparativ cu părțile din nord. De exemplu, concentrându-se pe rezistența carbapenemelor, 25 până la 50% din izolatele invazive sunt rezistente în Letonia, Polonia, Slovacia, Ungaria, Croația, Serbia, Bulgaria sau Grecia, iar peste 50% din tulpinile sunt rezistente în România. Analizând rezistența combinată la trei sau mai multe dintre antimicrobiene citate anterior, 25 până la 50% din tulpinile invazive izolate sunt rezistente în Slovacia, România, Croația, Bulgaria și Grecia (Bassetti și colab, 2018).

Într-un studiu realizat în Spania, s-a testat sensibilitatea și rezistența izolatelor de P. aeruginosa, constatând că 24% din tulpini erau rezistente la unul sau două antibiotice și aproximativ 33% erau multirezistente. Datele furnizate privind procentul de rezistență la diferite antimicrobiene au fost: 38,4% au fost rezistente la cefepime, 23,7% la ceftazidime, 32,6% la aztreonam, între 32,1% și 22,6% rezistente la imipenem și respectiv meropenem, 28,4% la ciprofloxacină și 22,1% la gentamicină, aceste date fiind alarmante, deoarece principalele antimicrobiene pentru gestionarea infecțiilor cauzate de P. aeruginosa se regăsesc în această listă. Cu toate acestea, se menționează, de asemenea, că doar 3,2% au fost rezistenți la colistină, unul dintre puținele antimicrobiene care este utilizat în caz de multi-rezistență bacteriană dificil de controlat (Cabot și colab, 2011).

Dezvoltarea de noi antibiotice sau strategii terapeutice alternative pentru tratamentul infecțiilor cu P. aeruginosa este necesară pentru pacienții ale căror infecții sunt rezistente la antibiotice convenționale. În ultimii ani au fost explorate noi antibiotice cu moduri de acțiune noi, precum și noi căi de administrare și rezistență de către enzimele bacteriene. Unele dintre aceste antibiotice noi arată o activitate antibacteriană in vitro împotriva P. aeruginosa, precum și o concentrație minimă de inhibiție (CMI) în scădere comparativ cu antibioticele convenționale. În plus, studii recente au raportat mai multe abordări terapeutice non-antibiotice noi, care sunt extrem de eficiente în uciderea tulpinilor de P. aeruginosa rezistente la antibiotice. Aceste abordări includ: inhibarea senzoriilor de cvorum și a lectinelor bacteriene, terapia cu fagi, strategia vaccinului, nanoparticule și peptide antimicrobiene. Aceste abordări terapeutice pot fi utilizate fie ca o alternativă la sau în combinație cu tratamente antibiotice convenționale (Pang și colab, 2019).

Sensibilitatea la antibiotice a R. planticola nu a fost amănunțit investigată încă. Multe studii au demonstrat că tulpinile de R. planticola sunt de obicei susceptibile la a treia sau a patra generație de cefalosporine sau combinații de inhibitori de lactamază (cum ar fi amoxicilina cu acid clavulanic și piperacilină cu tazobactam), aminoglicozide, ciprofloxacină, levofloxacină, tigeciclină și carbapenemuri. Cu toate acestea, R. planticola poate dobândi rezistență la antibiotice mediată de plasmide.

Capitolul 4. Profilurile de sensibilitate la antibiotice ale unor agenți bacterieni uropatogeni

Infecțiile de tract urinar constituie o problemă importantă de sănătate publică și sunt determinate de o gamă largă de patogeni, însă cei mai comuni sunt: Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Proteus mirabilis, Enterococcus faecalis și Staphylococcus saprophyticus. Aceste infecții se caracterizează în prezent prin rate înalte de recurență și creșterea rezistenței la antibiotice.

În terapia infecțiilor de tract urinar sunt utilizate antibiotice orale ce includ cefalosporine, trimetoprim-sulfametoxazole și fluoroquinolone. Din păcate, în ultimii ani, eficiența acestor antibiotice a scăzut progresiv datorită utilizării largi și dezvoltării rezistenței. Atunci cțn ciprofloxacinul a fost introdus în anii 80, rezistența printre tulpinile de E. coli era aproape nulă (1%). Rezistența la fluoroquinolone a crescut progresiv în SUA de la 1.2% în 1998 la 25% în perioada 2012-2014. Rezistența la trimetoprim-sulfametoxazole printre izolatele din ITU de E. coli a crescut de asemenea de la 7% la 9% în 1989 – 1992 la 30% în perioada 2003-2013 (Critchley și colab., 2017).

4.1. Scop și obiective

Scopul acestui studiu a fost investigarea profilurilor de sensibilitate la substanțe antimicrobiene ale unor agenți patogeni izolați din I.T.U.

Pentru îndeplinirea acestui scop au fost propuse următoarele obiective:

Izolarea și identificarea unor tulpini bacteriene din I.T.U.

Determinarea pattern-urilor de sensibilitate la antibiotice ale tulpinilor bacteriene izolate din I.T.U

Studiul clinic s-a efectuat în cadrului laboratorului de analize medicale a Centrul Medical Sfântul Alexandru, București, pe perioada Martie – Iunie 2019, având avizul șefului clinicii, medic primar medicină de laborator, Radu Adriana Claudia.

4.2. Materiale și metode

Materialele și echipamentele utilizate în acest studiu au fost:

Reactivi:

Medii de cultură necesare pentru creșterea izolatelor bacteriene: geloză sange (mediu neselectiv) și CLED (mediu selectiv), mediul cromogen (Brilliance UTI Agar – producător OXOID), mediu Mueller-Hinton (MH),

Analizor automat Vitek.

Solutii necesare colorației Gram: cristal violet, solutie Lugol 1:2:300, soluție alcool-acetonă 1:3, fuxină

Hotă cu flux laminar, Termostat la 37șC, Autoclav pentru sterile și infecte

Microscop binocular, Lupă, Anse calibrate de 1 µL, lame pentru microscopie

Balanță, Ssticlărie de laborator, anse calibrate de 1 µL, lame pentru microscopie

Probele de urină

Probele de urină au provenit de la pacienți care s-au adresat laboratorului de analize medicale în ambulatoriu Centru Medical Sfântul Alexandru, motivele prezentării fiind diverse și anume: pentru control de rutină, pentru evaluarea eficienței antibioterapiei sau pentru că prezentau simptomatologie specifică I.T.U. Lotul a fost reprezentat de un număr de 1082 uroculturi. Însămânțarea, izolarea, identificarea, testarea sensibilității la antibiotice a bacteriilor izolate din uroculturile pozitive s-au facut prin metode de microbiologice descrise mai jos.

4.3 Diagnosticul de laborator al I.T.U.

Urină- biochimie și sediment (sumar)

Cele două teste alcătuiesc profilul cunoscut sub denumirea de sumar de urină. Analiza completă de urină include determinarea caracterelor fizice (culoare, aspect, densitate), chimice (pH, proteine, glucoză, corpi cetonici, bilirubină, urobilinogen, nitriți, activitatea esterazei leucocitare, hemoglobină) și examenul microscopic al sedimentului urinar. Modificarile care pot apare în sumarul de urină pot semnala stări patologice ale aparatului urinar, hepatice sau metabolice.

Examenul microscopic al sedimentului urinar permite identificarea și cuantificarea următoarelor particule: leucocite, hematii, celule epiteliale, cilindrii urinari, cristale, bacterii.

Urocultura

Urocultura este analiza bacteriologică a urinei care permite identificarea agenților etiologici ai I.T.U. Au fost analizate un număr de 1082 probe de urină provenite de la pacienți care s-au adresat laboratorului de analize medicale în ambulatoriu. Probele de urină au fost însămânțate pe următoarele medii de cultură: geloză sânge, CLED și Briliance UTI agar. Mediile de cultură utilizate permit creșterea și multiplicarea izolatelor bacteriene aparținând Enterobacteriaceaelor, P. aeruginosa, Staphylococcus, Enterococcus spp, Streptococcus spp, dar și a tulpinilor de fungi. Mediile utilizate pentru identificarea tulpinilor microbiene sunt medii solide, astfel că acestea permit și studiul caracterelor de cultură, precum morfologia și mărimea coloniilor, formarea de pigment, consistența, transparența sau opacietatea coloniilor.

Mediul de cultură geloză-sânge este un mediu neselectiv ce permite creșterea a numeroase microrganisme. Mediul permite evidențierea activității hemolitice a izolatelor (prezența hemolizei de tip alfa, beta sau gamma).

Mediul CLED agar este un mediu care permite izolarea și diferențierea agenților patogeni urinari. Conține cistină și lactoză și are deficit de electroliți; cea din urmă trăsătură împiedică apariția mobilității de tip swarmming caracteristică speciilor de Proteus spp. Cistina favorizează formarea de colonii dependente de cistină. Albastrul de bromotimol este indicatorul utilizat în agar, acesta se schimbă la galben în cazul producerii de acid în timpul fermentației lactozei sau se schimbă în albastru în caz de alcalinizare. Bacteriile lactozo-pozitive formează colonii galbene. Bacteriile care decarboxilează L-Cistina determină reacții alcaline și favorizează apariția de colonii albastru (Analytical, 2014).

Mediul Briliance UTI Agar este un mediu diferențial care asigură identificarea prezumtivă a agenților patogeni principali care produc I.T.U. Mediul de cultură conține două substraturi cromogene specifice, care sunt scindate de enzime produse de Enterococcus spp., Escherichia coli și coliformi. În plus, conține triptofan care indică activitatea triptofan-deaminazei (TDA), indicând prezența Proteus spp. În tabelul 7 este prezentată reacția de culoare produsă de enzimele specifice bacteriilor însămânțate pe mediul cromogen Briliance UTI Agar.

Tabelul 7. Reacția de culoare produsă de enzimele specifice

bacteriilor însămânțate pe mediul cromogen Briliance UTI Agar.

Raportarea rezultatelor se realizează cantitativ prin numărarea coloniilor dezvoltate pe mediile de cultură. Deoarece se însămânțează 1 µL de probă fiecare colonie crescută reprezintă de fapt 1000unități formatoarea de colonii (UFC) raportate la 1 mL de probă.

Rezultatul se exprimă astfel:

> 105 UFC/mL, cu precizarea agentului patologic

104-5 UFC/mL microbiotă polimorfă cu precizarea de a se repeta recoltarea în cazul dezvoltării unei culturi bacteriene mixte

˂ 104 UFC/ml cu următoarea precizare: bacteriurie nesemnificativă pentru infecția urinară

< 103 UFC/mL (în cazul în care urina este sterilă)

4.4. Identificarea izolatelor uropatogene prin metode microbiologice clasice și automatizate

Metodele microbiologice utilizate pentru identificarea tulpinilor microbiene au cuprins analize clasice: examinarea caracterelor de cultură și colonie, examinarea microscopică (colorația Gram) și testele biochimice și analize cu ajutorul sistemelor automatizate (Vitek).

Examinarea caracterelor de cultură și de colonie ale izolatelor obținute pe mediile solide a urmărit determinarea:

dimensiunea coloniilor: mari (stafilococi, enterobacterii), mici (enterococii), pulverulente (streptococii).

forma coloniilor: rotunde (stafilococi, streptococi, gonococi, bacilul piocianic), ondulate (bacilul cărbunos)

marginile coloniei: regulate (stafilococi, streptococi, bacilul coli, bacilul piocianic), neregulate cu prelungiri (B.anthracis, M.tuberculosis, C.diphteriae cu coloniile “R”).

opacitatea (colonii mucoide de stafilococi) sau transparența (coloniile la streptococul beta hemolitic sau bacilul piocianic).

aspectul coloniilor: bombat, mamelonat, ombilicat, aplatizat

dacă colonia este de tip “S” sau “R”. Aceeași tulpină se poate prezenta sub 2 forme de colonii: “S” care sunt netede, bombate, cu margini regulate și “R”, cu margini neregulate, suprafață rugoasă și care aglutinează în ser fiziologic.

aspectul coloniilor: mucos (colonii de Klebsiella spp)

prezența de pigment: alb (S. epidermidis), auriu (S. aureus), citrin (S.saprophyticus), verzui (Pseudomonas spp).

consistența: apoasă (colonii mat și colonii glossy la streptococul beta hemolitic), mucoasă (colonii de Klebsiella spp).

modul în care se detașează de pe mediu: ușor (colonii de tip „S”), greu (colonii de tip „R”)

mirosul: de flori de salcâm (PS. aeruginosa), de putrefacție (Proteus spp), drojdie de bere (Candida sp.).

modificarea mediului prin apariția hemolizei dacă mediul conține sânge (colonii hemolitice pe geloză sânge: S.aureus, streptococii); virarea culorii mediului prin fermentarea unor zaharuri (colonii lactozopozitive: E. coli, Klebsiella spp, colonii lactozo-negative: Proteus, Salmonella, colonii manito-pozitive: S.aureus) (Licker și colab, 2019).

Examinarea caracterelor de microscopie necesită realizarea frotiului și ulterior colorarea acestuia prin metoda colorației Gram în vederea determinării caracterelor de morfologice ale bacteriilor și caracterului Gram.

Frotiul s-a efectuat prin preluarea unei cantități mici de cultură microbiană cu ajutorul unei anse sterile și etalarea acesteia pe o lamă degresată, în prezența unei picături de soluție fiziologică sterilă. Frotiul s-a fixat fie prin trecerea lamei de 2-3 ori flacăra becului de gaz sau prin depunerea a 2-3 picături de etanol timp de 2-3 minute.

Colorația Gram are o importanță deosebită în diagnosticul microbiologic, permite determinarea caracterelor morfologice și împarte bacteriile în două mari categorii: bacterii Gram-negative și bacterii Gram-pozitive.

Principiul colorației Gram: soluția bazică de cristal violet pătrunde în celula bacteriană și interacționează cu componentele citoplasmatice formând un complex intracitoplasmatic, rezistent la decolorarea cu soluție alcool-acetonă în cazul bacteriilor Gram-pozitive. La bacteriile Gram-negative, soluția de cristal violet este eliminată din celule ca urmare a solubilizării lipidelor peretelui celular sub acțiunea agentului decolorant. Soluția de fuxină, va recolora prin urmare numai bacteriile Gram negative (Buiuc și Pânzaru, 2009).

Etapele colorației Gram (Fig.9) sunt umătoarele:

aplicare pe frotiu a soluției de cristal violet, timp de 1-2 minute.

spălare cu apă de robinet pentru îndepărtarea colorantului,

aplicare soluție Lugol (rol de mordant), timp de 2-4 minute,

decolorare cu alcool-acetonă (3:1) timp de 5-7 secunde,

recolorare fuxină/sahranină, timp de 1 minut.

După uscare, frotiurile au fost vizualizate la microscopul optic cu obiectiv de 100x .

La microscop bacteriile Gram-negative apar colorate în roșu, bacteriile Gram-pozitive apar colorate în albastru-violet (Buiuc și Pânzaru, 2009). Peretele celular la bacteriile Gram negative are o structură complexă, fiind alcătuit din mureină, membrana externă care este o copie a membranei plasmatice și spațiul periplasmic. Peretele celular este implicat în facilitarea proceselor de schimb între celula bacteriană și mediu înconjurător, oferă protecție celulei bacteriene și participă la procese de creștere și diviziune.

Figura.9. Etapele realizării colorației Gram.

Sisteme automate (analizor automat Vitek)

Sistemele automatizate de identificare utilizează carduri de reacții miniaturizate, cititoare automate și o bază de date care permite identificarea microorganismelor. Exemple de sisteme automate: analizor Vitek®, Microscan® etc.

Inoculul se prepară în soluție salină din câteva colonii izolate, densitatea se ajustează cu densimetrul Densicheck pentru a obține o turbiditate corespunzătoare de 0.5 – 0.63 McFarland pentru bacili Gram-negativi și coci Gram-pozitivi și 1.8 – 2.2 McFarland pentru fungi. După realizarea inoculului se introduc cardurile corespunzătoare de identificare, caseta cu probe se introduce în stația de inoculare și se așteaptă încărcarea cardurilor. După terminarea încărcării se transferă caseta în stația de încărcare/descărcare carduri, unde se va face sigilarea cardurilor și poziționarea acestora în carusel. După ce se notează datele despre caseta și proba ce urmează a fi analizată, urmează procesul de incubare.

Rezultatele se citesc prin accesarea softului iar din meniu principal se dă click pe caseta cu carduri unde vor apărea rezultatele identificării.

4.5. Determinarea spectrului de sensibilitate la antibiotice

Antibiograma este o metodă utilizată în laboratorul de microbiologie pentru determinarea in vitro a spectrului de sensibilitate la antibiotice. Testarea sensibilității la antibiotice pentru tulpinile bacteriene izolate s-a efecuat prin metoda difuzimetrică Kirby-Bauer în conformitate cu cerințele standardului CLSI 2019.

Metoda Kirby-Bauer (difuzimetrică)

Metoda difuzimetrică Kirby-Bauer este o metodă rapidă care permite determinarea atât a spectrului de sensibilitate a microorganismelor cât și a valorii C.M.I. (concentrația minimă inhibitorie ) pentru calculul dozelor terapeutice de antibiotice.

Principiul metodei: metoda se bazează pe depunerea discurilor cu antibiotic pe suprafața unui mediu solid însămânțat anterior cu o suspensie bacteriană standardizată. Antibioticele vor difuza în mediu și vor realiza un gradient de concentrație, invers proporțional cu diametrul zonei de difuzie. În cazul în care tulpina bacteriană este sensibilă la acțiunea antibioticului, creșterea acesteia este inhibată pe o anumită suprafață în jurul discului, denumită zonă de inhibiție a creșterii (Lazăr și colab., 2004).

Inoculul standardizat se obține prin realizarea unei suspensii lichide din colonii izolate în 3 mL de ser fiziologic până când se atinge o densitate optică de 0.5 McFarland. Mediul de cultură recomandat de standardul CLSI pentru Kirby-Bauer este Muller Hinton agar (MH). Însămânțarea plăcilor se face cu ajutorul unui tampon de vată steril, care se introduce în suspensia bacteriană. Se elimină cu grijă excesul prin presarea și rotirea completă de mai multe ori a tamponului pe peretele tubului. Se însămânțează în pânză cu tamponul pe suprafața mediului în trei direcții până la acoperirea uniformă a întregii suprafețe a mediului de cultură, efectuând în final un striu marginal circular. Se depun discurile cu antibiotic pe suprafața gelozei MH însamațată. Depunerea acestora se face cu pensa, presând ușor fiecare disc pentru a ajunge toată suprafața sa în contact cu mediul de cultură. Se va respecta o distanță de 15 mm de la marginea plăcii și aproximativ 25 mm între discuri. În studiul de față s-a utilizat un dispenser de antibiotice produs de OXOID.

După cel mult 15 minute de la depunerea microcomprimatelor (perioadă de predifuziune) plăcile se incubează la termostat. După 16-18 ore la 37 oC în condiții de aerobioză se citesc zonele de inhibiție și se interpretează conform standardului CLSI2019.

În laboratorul clinic, în vederea stabilirii antibioticoterapiei, antibioticele (AB) sunt alese în funcție de specie, luându-se în calcul și rezistența intrinsecă, dar și standardul CLSI, în acest studiu fiind utilizat standardul CLSI 2019.

În tabelul 8 sunt prezentate antibioticele utilizate în acest studiu și prescurtările aferente acestora. În tabelul 9 sunt prezentate speciile identificate, precum și AB testate pentru fiecare tulpină.

Tabelul 8. Antibioticele utilizate.

Tabelul 9. Tulpinile izolate și AB testate

4.5. Rezultate și discuții

Aplicarea metodelor clasice de izolare și identificare în analiza unui număr de 1082 probe de urină: examenul microscopic al sedimentului urinar, examinarea caracterelor de cultură și colonie, testele biochimice conveționale și sistemele automate au condus obținerea unui număr 157 de tulpini bacteriene. În continuare sunt prezentate exemple de rezultate pozitive ale acestor analize.

Examenul microscopic al sedimentului urinar poate pune în evidență:

Celule albe (leucocite) – semn al unei infecții (figura 10, figura 11)

Celule rosii (eritrocite) – pot semnala o boală renală, boala de sânge sau cancer de vezica urinară

Celule epiteliale – semn al unei tumori, însa cel mai adesea, indică faptul că proba de urina a fost contaminată în timpul testului și că este nevoie de o altă probă

Bacterii sau enzime – pot indica o infecție (figura 11)

Proteine în formă de tub – se pot forma ca urmare a unor tulburari renale

Fig.10. Aspectul unui sediment urinar, se pot observa leucocitele în numarul mare

Fig.11. Aspectul unui sediment urinar, se pot observa leucocite și prezența de microorganisme

Izolarea agentului uropatogen și examinarea caracterelor de cultură

Caractere de cultură ale izolatelor aparținând familiei Enterobacteriaceae

Speciile de importanță medicală aparținând familiei Enterobacteriaceaelor prezintă următoarele caracteristici de cultură: colonii de tip S (regulate, netede și lucioase) de 1-3 mm diametru, rotunde, cu margini neregulate, ușor convexe.

Pe mediul CLED, tulpinile de E. coli formează colonii de tip S, lactozo-pozitive de culoare galbenă (Fig.12) și mai rar lactozo-negative de culoare albastră (Fig.13).

Fig.14 și 15. Aspectul culturii de E. coli, colonii de tip S pe mediul geloză-sange.

Tulpinile de Klebsiella spp dezvoltă colonii foarte bombate, galben-verzui, lucioase cu aspect mucos. După o perioadă de incubare poate prezenta fenomenul de confluență pe suprafața mediului (Fig 16 și 17). Pe mediul geloză-sânge, aspectul coloniilor de Klebsiella spp este de tip mucos (Fig.18 și 19).

Fig.16 și 17. Aspectul coloniilor de Klebsiella spp, colonii de tip mucos pe mediul CLED.

Fig.18. Aspectul coloniilor de Klebsiella sppp, colonii de tip mucos pe mediul geloză-sange.

Fig.19. Aspectul coloniilor de P. aeruginosa (A) și Klebsiella spp (B) pe mediul geloză-sânge

Tulpinile aparținând genului Proteus spp formează colonii albastre-cenușii care pot prezenta „fenomenul de cățărare” (colonii cu caracter invadant, margini dantelate ce pot acoperi toată suprafața mediului). Pe mediul CLED, Proteus spp formează colonii albastre-cenușii (Fig.20), în timp ce, pe mediul geloză-sânge se poate observa fenomenul de cățărare (Fig.21)

Fig.20. Aspectul coloniilor de Proteus spp, mediul CLED.

Fig.21. Aspectul culturii de Proteus spp, mediul geloză-sange,

se poate observa fenomenul de cațărare.

Pentru identificarea preliminară a tulpinilor de Enterobacteriaceae s-a utilizat mediul cromogen (Brilliance UTI Agar – producător OXOID), fiind luate în considerare și caracterele observate în cultura primară. În figurile 22 și 23 sunt prezentate aspectul culturilor de Klebsiella spp, E.coli, P. aeruginosa, Enterococcus spp pe mediul cromogen. Se observă culorile culturilor microbiene pe acest mediu selectiv, care ajută la diferențierea între specii., Culorile caracteristice fiecărei specii se regăsesc în tabelul 7.

Fig.22. Aspectul coloniilor de Escherichia coli (roz), Klebsiella spp (albastru) și P. aeruginosa (maro) pe mediul selectiv Brilliance UTI agar.

Fig.23. Aspectul culturilor de Escherichia coli (roz), Enterococcus (albastru) și P. aeruginosa (maro) pe mediul selectiv Brilliance UTI agar.

Caractere de cultură ale izolatelor aparținând speciei P. aeruginosa

Pseudomonas aeruginosa, fiind un bacil Gram negativ nepretențios poate crește chiar și în apa distilată sau pe medii simple în strictă aerobioză. Pentru identificare se însămânțează pe medii de cultură selectiv. După 24 ore de incubare dezvoltă colonii de tip S, transparente. Atât colonia cât și mediul sunt pigmentate în verde-albăstrui, colonia având reflexe metalice. Cultura emană un miros aromat de tei, salcâm sau iasomie. Pe medii lactozate coloniile sunt lactozo-negative Pseudomonas spp. nu fermentează zaharurile, dar poate descompune oxidativ glucoza determinând acidifierea mediului. Este oxidazo-pozitiv, dar nu produce indol, H2S sau urează.

Fig.24 și 25 Aspectul coloniilor de P. aeruginosa pe mediul geloză-sânge.

Caractere de cultură ale izolatelor aparținând speciei S. aureus

Stafilococii sunt coci Gram pozitivi dispusi în formațiuni asemănătoare unui ciorchine care pot fi cultivate pe medii nutritive simple sau complexe, și care cresc sub formă de colonii de tip S pe medii solide. Stafilococii produc pigment nedifuzibil, care colorează doar colonia bacteriană nu și mediul de cultură, pigmentul poate fi de culoare galben-auriu (S. aureus), albă (S. epidermidis) sau galben-citrin (S. saprophyticus). Pentru identificarea izolatelor de S. aureus s-a utilizat trusa Staph latex kit.

Fig.26 și 27. Aspectul coloniilor de S. aureus pe mediul mediul CLED (colonii cu pigment galben) (stânga) și pe mediul geloză-sânge, testul pentru Optochin (dreapta)

Fig.28. Aspectul culturii de S. aureus de pe mediul geloză-sange,

se poate observa beta-hemoliza.

Fig.29. Aspectul coloniile S. aureus de pe mediul geloză-sange,

se poate observa beta-hemoliza.

Caractere de cultură ale izolatelor aparținând Enterococcus sp.

Enterococii sunt coci Gram pozitivi dispuși în lanțuri scurte sau în diplo, și care au capacitatea de a se dezvolta și pe mediul CLED, deși cel mai bine se pot izola pe mediul geloză-sânge unde pot produce hemoliza de tip α, β sau pot fi nehemolitici. Formează colonii sunt de tip S. Pentru identificare s-a însămânțat pe mediul cromogen Brilliance UTI Agar și s-a interpretat conform tabelului 7.

Fig. 30 și 31. Aspectul culturii și coloniilor de Enterococcus spp pe mediul CLED (stânga)

și mediul Brilliance UTI agar (dreapta).

Caractere de cultură ale izolatelor aparținând Streptococcus sp.

Coloniile de streptococ β hemolitic de grup A sunt colonii mici cu diametrul de 0,5mm, transparente sau translucide, cu o zonă de hemoliză clară în jur, cu margini bine delimitate de 2-3 ori mai mare decât diametrul coloniei (Fig.32). Confirmarea grupului streptococic se realizează prin teste de latex-aglutinare procedând conform instrucțiunilor de lucru ale trusei folosite.

Fig.32. Aspectul coloniile S. agalactiae de pe mediul geloză-sange,

se poate observa beta-hemoliza.

Cercetări privind ratele de rezistență la antibiotice ale tulpinilor izolate din I.T.U

În perioada Martie – Iunie 2019 s-au analizat un număr total de 1082 de probe conforme. Datele privind pacienții care au furnizat probele de urină (grupele de vârsta și sex) sunt prezentate în tabelul nr 10. Se observă că numărul de probelor de urină este de 2,90 mai mare în cazul sexului feminin, respectiv 807 (74%) în cazul femeilor față de 278 (26%) probe de urină aparținând barbaților (Figura 33).

Tabelul 10. Distribuția pe vârste și pe grupe de sex a pacienților din perioada martie-iunie 2019.

Fig.33. Distribuția în funcție de sex a pacienților.

În privința grupelor de vârstă s-a constatat că, un număr seminificativ mai mare de probe au provenit de la femei cu vârste cuprinse între 65 și 74 de ani (170 de probe), urmată de grupele de vărste de 55-64 de ani (125 de probe), 75-84 de ani (106 de probe) și 25 – 34 de ani (94 de probe).

Rezultatele obținute în urma efectuării uroculturilor se regăsesc în tabelul 11. Analiza unui număr de 1082 de probe de urină a condus la obținerea unui număr de 157 de uroculturi pozitive. Dintre probele pozitive, 137 de uroculturi aparțin sexului feminin (87%) și 20 sexului masculin (13%) (figura 34)

Tabelul 11. Rezultate uroculturilor obținute pentru perioada martie-iunie 2019.

Fig.34. Distribuția pe sexe a uroculturilor pozitive analizate în perioada martie-iunie 2019.

Izolatele identificate în acest studiu fac parte din familiile Enterobacteriaceae, Pseudomonadaceae, precum și stafiloci și enterococi. Cea mai frecvent izolată specie a fost E. coli. Din cele 157 de probe pozitive, E. coli a fost identificată în 114 (72,61%) probe pozitive. Următoarea specie este reprezentată de Klebsiella spp – 20 tulpini (12,73%), Proteus spp – 7 (4,45%) tulpini identificate, Enterococcus spp – 6 (3,82%) tulpini. În ceea ce privește clasa stafilococilor, au fost identificate 7 (4.45%) tulpini de S. aureus, 2 dintre acestea fiind tulpini MRSA. Pentru speciile P. aeruginosa, R. planticola și Enterobacter spp s-a identificat o singură tulpină (0,62%). De asemenea, în acest studiu au fost identificate și tulpini ESBL, respectiv 4 tulpini E. coli ESBL și 2 tulpini Klebsiella spp ESBL.

Figura 35. Reprezentarea grafică a izolatelor identificate în lunile martie-iunie 2019, pentru probele pozitive de urocultură.

Se poate observa faptul că E. coli a predominat ca agent etiologic în infecțiile urinare (72,61%), iar pe locul doi s-a situat K. pneumoniae cu un procent de 12,73%. În figura 36 este prezentată incidența tulpinilor patogene izolate de la pacienții cu infecții urinare analizate în perioada martie-iunie, 2019, în ambulatoriu.

Fig.36. Distribuția tulpinilor microbiene izolate de la pacienții cu infecții urinare analizate în perioada martie-iunie, 2019, în cadrul laboratorului de analize medicale în ambulatoriu.

Infecțiile urinare produse de E. coli au fost întâlnite la femei cu o frecvență mai mare de 10,4 ori față de bărbați (91,22% versus 8,77%). De asemenea, K. pneumonie a fost mai frecvent detectată în infecțiile urinare la sexul feminin comparativ cu cel masculin (90% versus 20%).

În cazul tulpinilor de S. aureus, din cele 7 tulpini, 4 (57,14%) au fost detectate în infecțiile urinare la bărbați și doar 3 (42, 86%) tulpini au fost identificate în infecțiile urinare la femei. De asemenea, P. aeruginosa a fost detectată din uroculturile provenite de la sexul masculin, iar E. aerogenes și R. planticola au fost izolate din uroculturi provenite de la femei.

În figurile 37-41 sunt prezentate spectrele de sensibilitate la antibiotice ale uropatogenilor izolați.

Fig 37. Spectrul de sensibilitate la antibiotice al tulpinilor de E.coli izolate de la pacienți cu infecții urinare, analizate în perioada martie-iunie, 2019.

Fig 38. Spectrul de sensibilitate la antibiotice al tulpinilor de K. pneumoniae izolate de la pacienți cu infecții urinare, analizate în perioada martie-iunie, 2019.

Fig 39. Spectrul de sensibilitate la antibiotice al tulpinilor de Proteus izolate de la pacienți cu infecții urinare, analizate în perioada martie-iunie, 2019.

Fig.40. Spectrul de sensibilitate la antibiotice al tulpinilor de S. aureus izolate de la pacienți cu infecții urinare, analizate în perioada martie-iunie, 2019.

Fig.41.Spectrul de sensibilitate la antibiotice al tulpinilor de Enterococcus izolate de la pacienți cu infecții urinare, analizate în perioada martie-iunie, 2019.

În cazul E. coli, 111 tulpini (97,36%) din cele 114 au fost sensibile- S- la fosfomicină, urmate de 109 tulpini (95,61%) sensibile la gentamicină, 107 (93,85%) tulpini sensibile la ceftazidim 103 (90,35%) tulpini sensibile la cefuroxim, 100 (87,71%) tulpini sensibile la nitrofurantoin. În cazul levofloxacin, ciprofloxacin și amoxacilină/acid clavulanic 96 (84,21%) de tulpini din totalul de 114 au fost sensibile. Tulpinile de E. coli au prezentat o rată scăzută de sensibilitate la sulfametoxazol/trimetoprim de doar 79 (69,91%).

În cazul tulpinilor de E.coli cu fenotip de rezistență ESBL, din cele 3 tulpini identificate, toate au prezentat sensibilitate la gentamicină, urmate de 2 (66,66%) tulpini sensibile la amoxacilină/acid clavulanic și nitrofurantoin și cate o tulpină (33,33%) sensibilă la fosfomicină și piperacilină/tazobactam.

În cazul tulpinilor de K.pneumoniae, un număr de 18 (90%) tulpini din cele 20 identificate au fost sensibile la ciprofloxacin, 16 (80%) tulpini au fost sensibile la ceftazidim, cefuroxim, gentamicină și levofloxacin, 14 (70%) tulpini au fost sensibile la sulfametoxazol/trimetoprim, 13 (65%) tulpini au fost sensibile la amoxacilină/acid clavulanic, 11 (55%) tulpini au fost sensibile la piperacilină/tazobactam și 7 (35%) tulpini au fost sensibile la nitrofurantoin.

Tulpinile de Klebsiella spp cu fenotip de rezistență ESBL (n=2) au prezentat sensibilitate la levofloxacin (100%), urmată de cate o tulpină sensibilă la ciprofloxacin și nitrofurantoin.

Toate cele 7 (100%) tulpini identificate de Proteus spp au prezentat sensibilitate la ciprofloxacin, levofloxacin, și nitrofurantoin, urmate de 6 (85,71%) tulpini cu sensibilitate la amoxacilină/acid clavulanic și ceftazidim. Cea mai mare rezistență, și anume 5 (71,2%) tulpini au prezentat-o pentru sulfametoxazol/trimetoprim.

Tabelul 12. Fenotipurile de rezistență ale tulpinilor bacteriene uropatogene

analizate în perioada martie-iunie, 2019.

Legendă: R= rezistență, SXT=Sulfametoxazol/trimetoprim; AMC=Amoxacilină/acid clavulanic, CN= Gentamicină; F=Nitrofurantoin; CIP=Ciprofloxacin; LEV= Levofloxacin; CXM= Cefuroxim; CAZ= Ceftazidim; AM= Ampicilină; NOR= Norfloxacin; TZP= Piperacilină/tazobactam; E= Eritromicină; P= Penicilină; FOX= Cefoxitim; DA= Clindamicină.

Dintre tulpinile de S. aureus (n= 7 tulpini), 2 tulpini au manifestat fenotip de rezistență MRSA, acestea fiind sensibile la ciprofloxacin, gentamicină, sulfametoxazol/trimetoprim și levofloxacin și rezistente la amoxacilină/acid clavulanic, cefoxitin și eritromicină. În ceea ce privește tulpinile de S.aureus MSSA, toate cele 5 (100%) tulpini identificate au prezentat sensibilate la ciprofloxacin, sulfametoxazol/trimetoprim și 4 (80%) tulpini au fost sensibile la gentamicină, cefoxitim și clindamicină.

În cazul tulpinilor de Enterococcus spp uropatogene, toate cele 6 (100%) tulpini au fost sensibile la amoxacilină/acid clavulanic, ciprofloxacin, nitrofurantoin și 5 (83,33%) dintre cele 6 tulpini au fost sensibile la fosfomicină și levofloxacin.

Tulpina de Enterobacter spp uropatogenă a prezentat rezistență pentru următoarele antibiotice: amoxacilină/acid clavulanic, cefuroxim, fosfomicină și nitrofurantoin. Tulpina uropatogenă de R. planticola a manifestat rezistență la gentamicină. Tulpina de Ps. aeruginosa a manifestat sensibilitate 100% la antibioticele testate.

Discuții

Infecțiile urinare afectează milioane de oameni anual. Datorită prescrierii necontrolate de antibiotice, ratele de rezistență împotriva majorității agenților patogeni implicați în I.T.U. în România a crescut semnificativ în ultimul deceniu, în special pentru E.coli, Pseudomonas, Klebsiella și Stafilococcus spp.

În acest studiu, am constatat că prevalența generală a I.T.U a fost mai mare la femei (87%) comparativ cu bărbații (13%). Acest lucru s-ar putea datora diferențelor anatomice ale organelor urogenitale între cele două sexe. Aceste cifre sunt în conformitate cu studii realizate în Etiopia (63.3% femei; 26.8% bărbați) (Seifu și Gebissa, 2018), Uganda (23.8% femei; 15,9% bărbați) (Nabaigwa și colab, 2018) sau Arabia Saudită (59% femei; 41% bărbați) (Taher și colab, 2019).

De asemenea, a fost observată și o diferență de prevalență în funcție de grupele de vârstă. Această diferență sugerează că vârsta este un factor de risc asociat cu ITU. Incidența ridicată de ITU în rândul grupului de vârstă 65-74 ani poate sugera prezența atrofiei genito-urinară și prolapsul vaginal după menopauză, care la rândul său crește riscul de apariție a bacteriuriei prin creșterea pH-ului vaginal și permițând astfel bacteriilor Gram-negative să crească și să acționeze ca uropatogeni. Mai mult, în alte studii a fost constatat că I.T.U este cea mai frecventă infecție la populațiile vârstnice (Shortliffe și McCue, 2002, Gupta și colab, 2002).

În ceea ce privește incidența tulpinilor identificate, am constatat că cea mai frecvent izolată specie a fost E. coli -114 tulpini (72,61). Această constatare este comparabilă cu studii recente realizate în România (E.coli- 35,9%) (Ghibelean și colab, 2018) și E. coli- 60% (Delcaru și colab, 2017), Nigeria (60.34%) (Ugwu și colab, 2019), India (61%) (Singh și colab, 2018) și Arabia Sudită (17.2 %) (Taher și colab, 2019).

Alte specii identificate în acest studiu au fost Klebsiella spp – 20 tulpini (12,73%), Proteus spp – 7 (4,45%) tulpini, Enterococcus spp – 6 (3,82%) tulpini., S. aureus 7 (4.45%) tulpini , 2 dintre acestea fiind tulpini MRSA. Pentru speciile P. aeruginosa, R. planticola și Enterobacter spp s-a identificat o singură tulpină (0,62%).

Diferite antibiotice sunt utilizate empiric pentru a trata diferite boli. Totuși, creșterea continuă a ratelor de rezistență datorate consumului excesiv de medicamente a devenit o problemă relevantă în comunitatea medicală din întreaga lume. O mulțime de agenți antibiotici folosiți în mod clasic au arătat un nivel ridicat de rezistență la uropatogenii obișnuiți.

În acest studiu, s-a observat o rată de rezistență la sulfametroxazol/trimetoprim de 30,08%. Numeroase studii au arătat o creștere a ratelor de rezistență pentru sulfametroxazol/trimetoprim, ce sugerează că acesta nu este recomandat pentru tratarea I.T.U.

Un studiu realizat de Ghibelean și colab, pe teritoriului României, au arătat o rată de rezistență (36.98%) ce poate fi comparată cu ce s-a obținut în acest studiu. Un studiu realizat în Europa, în 6 țări diferite (Croația, Danemarca, Scoția, Germania, Spania și Suedia) au arătat că în toate cele șase țări există o rată de rezistență ridicată la sulfametroxazol (22-37%) și trimetoprim (15–32%) pentru E. coli (Haslund și colab, 2013). Un alt studiu realizat de Taher și colab, publicat în 2019, raportează rate de rezistență asemănătoare pentru sulfametroxazol/trimetoprim, susținând astfel nivel ridicat de rezistență al E.coli din întreaga lume (Taher și colab, 2019).

O altă constatare importantă în acest studiu este rezistența în creștere la levofloxacin (15, 79%) și ciprofloxacin (15,79%) pentru E.coli. În ultimii ani, ratele de rezistență pentru fluoroquinolone au crescut exponențial. O lucrare recentă din 2019 din Spania, care viza detectarea uropatogenilor implicați în I.T.U au dovedit o rezistență ridicată a tulpnilor de E. coli la fluoroquinolone, similar cu concluziile acestui studiu (Smithson și colab, 2019). Un studiu din România sugerează rate chiar mai mari de rezistență E. coli la levofloxacină (84.62%),o constatare care indică o creștere a rezistenței în toată lumea, în special pentru fluoroquinolone, din cauza supraprescripției (Delcaru și colab, 2017). Studiul realizat de Taher și colab, publicat în 2019 raportează, de asemenea, rate de rezistență mari pentru levofloxacină (44,4%) și ciprofloxacină (37,5%).

Ratele de rezistență pentru amoxicilină-acid clavulanic sunt, de asemenea, considerabile, rezultatele obținute 11.4% sunt, însă, mai mici în comparație cu rezultatele obținute de Ahmed și colab, 2019, reprezentate de o rată de rezistență de 66.2% (Ahmed și colab, 2019).

Rate mici de rezistență au fost identificate pentru gentamicină (4,39%), fosfomicină (2,64%), ceftazidim (6,15%) și cefuroxim (9,15%). Aceste medicamente pot reprezenta un bun tratament empiric de primă linie, recomandat și de orientările Asociației Europene de Urologie. Un studiu realizat de către Zhang și colab, publicat în 2019, prezintă valori ale ratelor de rezistență ce pot fi comparate cu rezultatele acestui studiu.

Cea mai mare rezistență prezentată de Klebsiella spp a fost observată pentru nitrofuranotin (63.15%), urmată de rezistența la amoxacilină- acid clavulanic (27,77%) similar cu alte descoperiri din Norvegia (Grude, 2001).

Proteus spp a prezentat rate ridicate de rezistență pentru sulfametoxazol/trimetoprim (71,42%), urmat de gentamicină (42,85%). Studiu realizat de Chernohorska și Chivilova din 2001, în Cehia, au raportat rezultate similare acestui studiu, respectiv 39,0% la sulfametoxazol / trimetoprim, și 25,4% la gentamicină. În studiul prezent nu s-a identificat rezistență pentru tulpinile de Proteus la următoarele antibiotice: ciprofloxacin, levofloxacin și nitrofurantoin, ceea ce poate sugera că aceste trei medicamente pot fi utilizate pentru tratarea I.T.U.

Pentru Tulpinile de S. aureus, s-a observat o rata de rezistență de 100% pentru penicilină și o rată de 85,71% pentru eritromicină. Valoarea obținută pentru penicilină poate fi corelată cu rata de rezistență obținută de Ragbetli și colab, în 2016, într-un studiu realizat în Turcia. Rata de rezistență obținută de Ragbetli și colab, este cu mult mai mică (17,7%) comparativ cu valoarea obținută în acest studiu. Această diferență poate fi reprezentată de numărul scăzut de tulpini identificate în aceast lucrare, și anume 7, în comparație cu 1083 tulpini analizate în studiul realizat în Turcia (Ragbetli și colab, 2016).

4.6. Concluzii

Incidența UTI diagnosticată atât la populația feminiă cât și masculină este puternic corelată cu vârsta și este mai frecventă la femeile cu vârsta peste 50 de ani. Se poate observa o corelație între perioada de menopauză și favorizarea apariției simptomatologiei specifice I.T.U la femei mult mai frecvent decât la bărbați. Acest lucru se poate explica prin mai mulți factori de risc precum: declanșarea unor dezechilibre hormonale specifice acestei perioade la femei, care perturbă microbiota comensală vaginală (bacili Gram pozitivi sunt înlocuiți de bacili Gram negativi), prin sensibilizarea uretrei și favorizarea contaminării acesteia cu bacili Gram negativi.

Studiul a 157 de agenți patogeni, izolați din infecții urinare analizate în perioada Martie-iunie, 2019 au permis identificarea unor specii de importanță medicală precum Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Proteus spp, Enterobacter spp, Enterococcus spp, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus și altele.

E. coli a predominat ca agent etiologic în infecțiile urinare (72,61%), iar pe locul doi s-a menținut Klebsiella pneumoniae cu un procent de 12,73%, urmate de celelalte specii, dar în număr semnificativ redus.

Cea mai mare rată de rezistență prezentată de tulpinile de E.coli a fost pentru sulfametoxazol/trimetroprim, urmată de rezistența la levofloxacin și ciprofloxacin. Cea mai mică rată de rezistență au prezentat-o pentru gentamicină, fosfomicină, cefuroxim și ceftazidim, acestea reprezentând posibile medicamente utilitate pentru terapia I.T.U. ce au ca agent etiologic E.coli.

Pentru Klebsiella, levofloxacinul este încă o opțiune terapeutică bună, în cazul nitrofurantoinului fiind identificate rate de rezistență în creștere.

Capacitatea agenților uropatogeni de a dezvolta mecanisme de rezistență asupra unui număr foarte mare de antibiotice, poate conduce la apariția speciilor MDR, reprezentând astfel o mare problemă de sănătate publică, ce impune nevoia de noi terapii antimicrobiene pentru tratarea pacienților.