Școala Doctorală de Fizică [608815]
UNIVERSITATEA DIN BUCUREȘTI
Facultatea de Fizică
Școala Doctorală de Fizică
Specializarea Biofizică
Drd. Bogdan ZORILĂ
_____________________________________________________________________ _
STUDIUL INTERACȚIEI P ROTEINELOR CU MEMBR ANELE
LIPIDICE MODEL ȘI CU MEMBRANELE BIOLOGIC E
__________________________________________________________________ ____
Teză de Doctorat
Conducător științific
Prof. Univ. Dr. Aurel POPESCU
București, 201 8
Dedicată familiei mele,
soției Florina
și copiilor
Sofia și Darius
Mulțumiri
Mulțumesc conducătorului științific, Domnul Profesor Univ . Dr.
Aurel I. Popescu, pentru îndrumarea, încrederea și sfaturile utile oferite
pe parcursul perioadei de studii doctorale.
Mulțumesc Doamnei Profesor Univ . Dr. Doina Mariana Găzdaru și
Domnului C SI Dr. Mihai Radu pentru discuțiile și sugestiile date pe
parcursul efectuării și elaborării Tezei.
Mulțumesc tuturor colegilor din IFIN -HH, care m -au sprijinit în tot
acest timp și au reușit să mă suporte , cu bune și cu rele, în special
Domnișoarei CSIII Dr. Mihaela Bacalum, colega de birou și
colaboratoare în descifrarea tainelor biofizicii , pentru sfaturile și
discuțiile constructive avute î n tot acest timp, dar și Doamnei Păpușa
Andrei și Domnului Dan Jianu pentru sprijinul logistic și pentru sfaturile
și cuvintele de încurajare oferite.
Întreaga mea recunoștință vreau să o adresez familiei mele pentru
sprijinul oferit , în special soției mel e, Florina, pentru faptul că mi -a fost
alături în toată această perioadă, sprijinindu -mă și dând dovadă de multă
înțelegere și răbdare , dar și celor doi copii, Sofia și Darius, care mi -au
deschis noi orizonturi în viață.
Mulțumesc conducerii proiectului “ Generarea și investigarea unor
noi peptide antimicrobiene, cu dimensiune redus ă. Corelarea structurii
peptidelor cu func ția lor ” – BIOPEP, cu numărul de identificare: PN II –
PT- PCCA Nr. 123/2012 și proiectelor PN 09370301 și PN 16420203
pentru suportul fin anciar și logistic oferit pe toată perioada studiilor
doctorale.
În final, vreau s ă aduc o caldă recunoștință, în memoria a doi oameni
dragi mie, C.P . și D.G., care mi -au fost alături și m -au sprijinit în
momente de cotitură din viață. Sper că sunt mândri de mine, acolo unde
sunt acum!
Bogdan Zorilă
2018
i Cuprins
Cuprins ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………… i
Lista abrevierilo r ………………………….. ………………………….. ………………………….. …………………… vii
Lista simbolurilor ………………………….. ………………………….. ………………………….. ……………………. ix
Lista figurilor ………………………….. ………………………….. ………………………….. …………………………. xi
Lista tabelelor ………………………….. ………………………….. ………………………….. ……………………….. xiii
Introducere generală ………………………….. ………………………….. ………………………….. ……………….. 1
1 Motivația studiului ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………. 3
2 Peptidele antimicrobiene – AMP, membranele celulare și membranele lipidice artificiale
………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………………….. ……………….. 5
Introducere ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………………….. …. 5
2.1 Peptidele antimicrobiene – AMP ………………………….. ………………………….. ……………………. 5
2.1.1 AMP și rezistența antimicrobiană ………………………….. ………………………….. ……………………. 6
2.1.2 AMP – alternative la antibioticele clasice ………………………….. ………………………….. …………. 8
2.1.3 Rolul reziduurilor Triptofan și Arginină din structura AMP ………………………….. …………….. 9
2.1.4 Modul de acțiune al AMP ………………………….. ………………………….. ………………………….. …. 10
2.2 Membranele celulare și membranele lipidice artificiale ………………………….. ……………… 12
2.2.1 Compoziția și organizarea membranelor celulare ………………………….. …………………………. 12
2.2.2 Proprietățile bistratului lipidic ………………………….. ………………………….. ……………………….. 15
2.2.3 Membran ele lipidice artificiale – structuri biomimetice ………………………….. ………………… 16
ii 3 Principiile de bază ale fluorescenței ………………………….. ………………………….. ………………… 19
Introducere ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………………….. .. 19
3.1 Fluorescența ………………………….. ………………………….. ………………………….. ……………………. 19
3.1.1 Diagrama Jablonski și caracteri sticile emisiei fluorescente ………………………….. ……………. 19
3.1.2 Influența factorilor de mediu asupra fluorescenței ………………………….. ………………………… 23
3.2 Fluorofori ………………………….. ………………………….. ………………………….. ……………………….. 24
3.2.1 Principalele tipuri de fluorofori și proprietățile acestora ………………………….. ………………… 24
3.2.2 Fluorofori solvatocromici ………………………….. ………………………….. ………………………….. …. 25
3.2.2.1 Laurdanul – fluorofor utilizat pentru estimarea fluiditații membranelor lipidice ……….. 26
3.2.2.2 Triptofanul – principalul aminoacid ce prezintă fluorescență intrinsecă …………………… 27
3.3 Spectroscopia de fluorescență ………………………….. ………………………….. ………………………. 29
3.3.1 Spectroscopia de fluorescență statică ………………………….. ………………………….. ……………… 29
3.3.2 Spectroscopia de fluorescență rezolvată în timp ………………………….. ………………………….. . 30
3.4 Alte tehnici utilizate în măsurarea fluorescenței ………………………….. ………………………… 32
4 AMP utilizate – caracteristici structurale și funcționale ale acestora …………………………. 33
Introducere ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………………….. .. 33
4.1 Melitina ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………………….. . 33
4.2 Indolicidina ………………………….. ………………………….. ………………………….. …………………….. 36
4.3 Cecropina P1 ………………………….. ………………………….. ………………………….. …………………… 38
4.4 Structurile peptidice atimicrobiene nou sintetizate ………………………….. ……………………. 39
5 Materiale și metode ………………………….. ………………………….. ………………………….. ……………. 41
5.1 Prepararea soluției tampon fosfat salin ………………………….. ………………………….. …………. 41
iii 5.2 Prepararea soluțiilor stoc de substanțe fluorescente ………………………….. …………………… 41
5.3 Prepararea soluțiilor stoc de peptide ………………………….. ………………………….. …………….. 44
5.4 Prepararea veziculelor unilamelare ………………………….. ………………………….. ………………. 44
5.5 Metode de s pectroscopie utilizate ………………………….. ………………………….. …………………. 47
5.5.1 Spectroscopia de absorbție UV -VIS ………………………….. ………………………….. ……………….. 47
5.5.2 Spectroscopia de fluorescență statică ………………………….. ………………………….. ……………… 48
5.5.3 Spectroscopia de fluorescență rezolvată în timp ………………………….. ………………………….. . 48
5.6 Prelucrarea datelor ………………………….. ………………………….. ………………………….. …………. 49
6 Realizarea și optimizarea funcționarii aranjamentului experimental pentru TRF ……… 51
Introducere ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………………….. .. 51
6.1 Aranjamentul experimental pentru TRF ………………………….. ………………………….. ………. 52
6.2 Măsurarea timpilor de viață a fluorescenței ………………………….. ………………………….. ….. 56
6.3 Prelucrarea datelor experimentale ………………………….. ………………………….. ……………….. 58
6.4 Discuții ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………………….. .. 63
Concluzii parțiale ………………………….. ………………………….. ………………………….. …………………… 66
7 Studiul interac ției dintre AMP și membranele lipidice artificiale utilizând fluorescența
rezolvată în timp ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………… 67
Introducere ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………………….. .. 67
7.1 Interacția dintre AMP și membranele lipidice formate din DOPC ………………………….. 67
7.2 Discuții ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………………….. .. 70
Concluzii parțiale ………………………….. ………………………….. ………………………….. …………………… 72
iv 8 Eval uarea fluiditații membranelor lipidice utilizand fluorescența Laurdanului folosind
modelul de analiză cu funcții asimetrice ………………………….. ………………………….. ………….. 73
Introducere ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………………….. .. 73
8.1 Obținerea parametrilor de formă utilizați în modelul matematic cu funcții LN ………. 76
8.2 Analiza spectrelor de fluorescență ale Laurdanului inserat în membrane lipidice …… 81
8.3 Discuții ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………………….. .. 84
Concluzii parțiale ………………………….. ………………………….. ………………………….. …………………… 91
9 Efectul AMP asupra fluiditații membranelor lipidice model și membranelor celulare .. 93
Introducere ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………………….. .. 93
9.1 Evaluarea efectului AMP asupra membranelor ………………………….. …………………………. 93
9.2 Discuții ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………………….. .. 98
Concluzii parțiale ………………………….. ………………………….. ………………………….. …………………… 99
10 Evaluarea interacției AMP -membrană lipidică model utilizând stingerea fluorescenței
Triptofanului ………………………….. ………………………….. ………………………….. …………………… 101
Introducere ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………………….. 101
10.1 Stingerea colizională a fluorescenței ………………………….. ………………………….. ……………. 101
10.2 Determinarea constantei de stingere Stern -Volmer pentru AMP ………………………….. 103
10.3 Discuții ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………………….. 108
Concluzii parțiale ………………………….. ………………………….. ………………………….. …………………. 112
11 Determinarea energiei libere de partiționare utilizând fluorescența Triptofanului …… 115
Introducere ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………………….. 115
11.1 Modele utilizate pentru determinarea ΔG ………………………….. ………………………….. …… 115
v 11.2 Determinarea ΔG pentru AMP ………………………….. ………………………….. …………………… 118
11.3 Discuții ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………………….. 122
Concluzii parțiale ………………………….. ………………………….. ………………………….. …………………. 126
12 Evaluarea interacției AMP -membrana model prin analiza cu funcții asimetrice aplicată
spectrelor de fluorescență ale Triptofanului ………………………….. ………………………….. …… 127
Introducere ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………………….. 127
12.1 Analiza fluorescenței reziduurilor de Triptofan din structura proteinelor …………….. 127
12.2 Ipoteze de lucru ………………………….. ………………………….. ………………………….. …………….. 129
12.3 Analiza spectrelor de fluorescență ale Triptofanului ………………………….. ………………… 130
12.4 Discuții ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………………….. 133
Concluzii parțiale ………………………….. ………………………….. ………………………….. …………………. 134
Concluzii generale ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………… 135
Realizări personale ………………………….. ………………………….. ………………………….. ……………….. 137
Bibliografie ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………………….. 145
Anexă cu acorduri de copyright pentru imagini din literatură ………………………….. ………… 163
vi
vii Lista abrevierilor
ADN – acidul dezoxiribonucleic
AFM – microscopie de forță atomică (din engl. Atomic Force Microscopy)
AMP – Peptide anti microbiene (din engl. Antimicrobial Peptides)
C13 – 1,2-ditridecanoyl -sn-glycero -3-phosphocholine
CPS – impulsuri pe secundă (din engl. Counts Per Second)
DMPC – 1,2-dimyristoyl -sn-glycero -3-phosphocholine
DMSO – dimetilsulfoxid
DOPC – 1,2-dioleoyl -sn-glycero -3-phosphocholine
DPPC – 1,2-dipalmitoyl -sn-glycero -3-phosphocholine
DPPG – 1,2-dipalmitoyl -sn-glycero -3-phospho -(1'-rac-glycerol) (sodium salt)
DSPC – 1,2-distearoyl -sn-glycero -3-phosphocholine
FLIM – imagistică de timp de viață a fluorescențe i (din eng. Fluorescence Lifetime Imaging
Microscopy)
FRET – transfer rezonant de energie (din engl. Förster Resonance Energy Transfer)
FWHM – lărgimea la semi -înălțime (din engl. Full Width at Half Maximum )
GP – polarizarea generalizată (din eng. Generalized Polarisation)
IR – spectrul electromagnetic în domeniul infraroșu
IRF – funcția de răspuns a instrumentului (din eng. Instrument Response Function)
LN – funcție de tip log -normal
MDR – microorganisme rezistente la antibiotice (din engl. Multi-drug resistant)
NATA – N-acetil -L-triptofanamida
NMR – rezonanță magnetică nucleară (din engl. Nuclear Magnetic Resonance)
OD – densitatea opdtică (din engl. Optical Density)
viii PBS – tampon fosfat salin (din engl. Phosphate Buffered Saline)
PC – fosfatid ilcolină (din engl. Phospho choline)
PDB – bază de date cu structuri proteice (din engl. Protein Data Bank)
PE – fosfatidiletanolamină (din engl. Phospho ethanolamine)
PG – fosfogligerol (din engl. Phospho glycerol)
PI – Fosfatidilinositol (din engl. Phosphatidyl inositol )
PPO – 2,5-difeniloxazol
PS – fosfatidilserină (din engl. Phospho serine)
SAR – relația structură -activitate antimicrobiană (din engl. Structure -activity relationship)
SM – sfingomielină (din engl. Sphingo myelin)
TCSPC – tehnică de măs urare bazată pe corelarea în timp a unui singur foton (din eng. Time-
Correlated Single -Photon Counting)
TRF – Fluorescență rezolvată în timp (din engl. Time Resolved Fluorescence)
TSA – mediu de cultură ( Trypticase Soy Agar)
TSB – mediu lichid de crește re (Tryptic Soy Broth)
UV – spectrul electromagnetic în domeniul ultraviolet
VIS – spectrul electromagnetic în domeniul vizibil
ix Lista simbolurilor
Ai – amplitudinea componentei i a semnalului măsurat
APL – gradul de asociere dintre peptide și bistr atul lipidic
c – viteza luminii în vid
ΔG – Variația energi ei libere Gibbs de partiționare din mediu hidrofob în mediu hidrofil
Δλ – deplasarea maximului de emisie fluorescentă
ΔSR – diferența ariilor relative
e – numărul lui Euler (≈ 2.71828)
|e| – sarcina electrică elementară (1.6 x 10-19 C)
E – energia radiației electromagnetice
ε – coeficientul molar de extincție
F, Fi – intensitatea maximului de fluorescență
Γ – constanta de viteză a proceselor radiative
h – constanta lui Planck
Ii – intens itatea componentei i a semnalului măsurat
kb – constanta bimoleculară
knr – constanta de viteză a proceselor neradiative
KP – coeficient de partiție din mediul apos în bistratul lipidic
KSV – constanta de stingere Stern -Volmer
λ – lungimea de undă a r adiatiei electromagnetice
µe – momentul electric de dipol în starea excitată
µg – momentul electric de dipol în starea fundamentală
ν – frecvența radiației electromagnetice
Q – eficiența cuantică a unui fluorofor
x Si – stări energetice electronice ( i = 0 – fundamentală, i = 1 prima stare excitată etc.)
SRB – aria relativă a peak -ului albastru
SRG – aria relativă a peak -ului verde
Tm – temperatura de tranziție a bistratului
τ – timpul de viață al fluorescenței
𝜏̃ – timpul de viață mediu al fluores cenței
τn – timpul de viață natural (intrinsec) al fluorescenței
xi Lista figurilor
Figura 2.1 Mecanismele de interacție ale AMP cu membranele lipidice. ………………………….. ………………………….. …. 11
Figura 2.2 Structura membranei plasmatice a celulelor de mamifer. ………………………….. ………………………….. ……….. 13
Figura 2.3 Structura membranei plasmatice a celulelor bacteriene. ………………………….. ………………………….. ………… 14
Figura 2.4 Secțiune transversală printr -un lipozom. ………………………….. ………………………….. ………………………….. …. 17
Figura 3. 1 Diagrama Jablonski. ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………………….. … 20
Figura 3.2 Diagrama Jablonski simplificată pentru punerea în evidență a eficienței cuantice a unui fluoro for. ……… 22
Figura 3.3 Influența factorilor de mediu asupra fluorescenței. ………………………….. ………………………….. ……………….. 23
Figura 3.4 Pierderile de energie ale unui fluorofor aflat în stare excitată. ………………………….. ………………………….. … 26
Figura 3.5 Laurdanul. ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………………….. ……………… 27
Figura 3.6 Triptofanul. ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………………….. …………….. 28
Figura 3.7 Spectrul de fluorescență rezolvată în timp obținut prin metoda TCSPC. ………………………….. ………………. 31
Figura 4.1 Melitina ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………………….. …………………. 34
Figura 4.2 Indolicidinul ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………………….. …………… 36
Figura 4.3 Cecropina P1 ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………….. 38
Figura 5.1 Graficul miscibilității diferiților solvenți. ………………………….. ………………………….. ………………………….. … 42
Figura 5.2 Structurile moleculare ale standardelor de fluorescență. ………………………….. ………………………….. ………… 43
Figura 5.3 Structurile moleculare ale lipidelor utilizate în experimente. ………………………….. ………………………….. ….. 45
Figura 6.1 Spectrofluorimetrul FluoTime 100. ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………… 52
Figura 6.2 Aranjamentul experimental pentru măsurarea timpului de viață al fluorescenței. ………………………….. ….. 53
Figura 6. 3 Răspunsul spectral al fotomultiplicatorului PMA 182 N/M. ………………………….. ………………………….. …… 54
Figura 6.4 Modul de achiziți date bazat pe tehnica TCSPC. ………………………….. ………………………….. ………………….. 55
Figura 6.5 Scăderea fluorescenței în timp. ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………. 57
Figura 6.6 Fitarea spectrului de scădere exponențială a fluorescenței indolului. ………………………….. ……………………. 59
Figura 6. 7 Variația timpilor de viață ai fluorescenței cu concentrația de fluorofor din probă. ………………………….. …. 61
Figura 6.8 Variația timpilor de viață ai fluorescenței cu temperatura probei. ………………………….. ……………………….. 63
Figura 7.1 Variația timpului de viață a reziduurilor de Tri ptofan ………………………….. ………………………….. ……………. 68
Figura 7.2 Modificarea timpilor de viață ai fluorescenței în prezența lipozomilor din DOPC și variația acestora cu
temp eratura. ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………….. 69
Figura 7.3 Variația timpului de viață al fluorescenței reziduurilor de Triptofan aflate în structura peptidelor anali zate
în prezența lipozomilor din DOPC. ………………………….. ………………………….. ………………………….. ……………….. 71
Figura 8.1 Forma generală a funcției LN. ………………………….. ………………………….. ………………………….. ……………….. 76
Figura 8.2 Spectre de emisie fluorescentă a Laurdanului. ………………………….. ………………………….. ……………………… 79
Figura 8.3 Poziția maximului emisiei în funcție de scala polarității solvenților – ET(30). ………………………….. ……….. 80
Figur a 8.4 Parametrii de formă, 𝝂𝒎𝒊𝒏 și 𝝂𝒎𝒂𝒙 , ca funcție de poziția maximului emisiei. ………………………….. ……. 80
xii Figura 8.5 Intensitatea normată a emi siei fluorescente a Laurdanului inserat în membrane lipidice preparate din C13,
DPPC și DSPC, la diferite temperaturi. ………………………….. ………………………….. ………………………….. …………. 82
Figura 8.6 Comparație între deconvoluția cu funcții LN (A, B și C) și funcții Gauss (D, E și F). ………………………… 83
Figura 8.7 Pozițiile peak -urilor elem entare obținute în urma celor două metode de deconvoluție. ……………………….. 85
Figura 8.8 Comparație între ariile relative ale peak -urilor rezulta te în urma deconvoluției cu funcții LN și Gauss. .. 87
Figura 8.9 Comparație între curbele ΔSR și GP. ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………. 90
Figura 8.10 Dependența de temperatură a raportului ariilor relative, obținute în urma deconvoluției cu funcții LN și
Gauss. ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………………….. . 90
Figura 9.1 Variația parametrilor A – ΔSR și B – SRG/SRB pentru lipozomii preparați din DOPC, simpli și în prezența
AMP. ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………………….. .. 94
Figura 9.2 Variația parametrilor A – ΔSR și B – SRG/SRB pentru lipozomii preparați din DOPC:DPPG, simpli și în
prezența AMP. ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………. 95
Figura 9.3 Variația parametrilor A – ΔSR și B – SRG/SRB pentru bacterii Escherichia coli, simple și în prezența AMP.
………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………………….. ……….. 96
Figura 9.4 Modificarea fluidității bistratului lipidic în urma tratamentului cu Melitină. ………………………….. …………. 97
Figura 10.1 Familie de spectre de fluorescență din care se obține valoarea K SV. ………………………….. …………………. 104
Figura 10.2 Reprezentări Stern -Volmer pentru Melitină (A), Indolicidină (B) și Cecropina P1 (C). …………………… 105
Figura 10.3 Reprezentări Stern -Volmer pentru peptidele nou sintetizate, P1 – P8. ………………………….. ………………. 106
Figura 10.4 Valorile KSV, τ0 și k b pentru peptidele utilizate în acest studiu . ………………………….. ………………………… 108
Figura 11.1 Familie de spectre din care se obțin valorile parametrilor utilizați în modelele de calcul a ΔG utili zând
fluorescența statică . ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………. 119
Figura 11.2 Fitarea datelor experimentale cu modelele teoretice, pentru Indolicidin titrat cu LUV preparate din
DOPC. ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………………… 120
Figura 11.3 Parametrii obținuți pentru P1 – P8 din modelul descris de ecuația (11.4). ………………………….. …………. 124
Figura 11.4 Parametrii obținuți pentru P1 – P8 din modelul descris de ecuația (11.8). ………………………….. …………. 125
Figura 12.1 Evoluția peak -urilor elementare, obținute în urma deconvoluției, pent ru Indolicidină …………………….. 131
Figura 12.2 Variația ariei relative a peak -urilor obținute în urma deconvoluției. ………………………….. …………………. 132
xiii Lista tabelelor
Tabelul 4.1 Carac teristici fizico -chimice pentru peptidele nou sintetizate. ………………………….. ………………………….. . 40
Tabelul 5.1 Caracteristici fizico -chimice pentru standardele de fluorescență utilizate. ………………………….. …………… 43
Tabelul 5.2 Caracteristici fizico -chimice pentru peptidele utilizate. ………………………….. ………………………….. ……….. 44
Tabelul 6.1 Timpii de viață ai fluorescenței pentru standardele utilizate la calibrarea și verificarea ar anjamentului
experimental. ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………………….. …………………. 60
Tabelul 6.2 Valoarea medie a timpilor de viață ai fluorescenței pentru toată plaja de concentrații măsurate. ………… 62
Tabelul 8.1 Caracteristicile spectrale ale Laurdanului în soluții omogene de solvenți, cu diferite constante dielectrice.
………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………………….. ……….. 77
Tabelul 8.2 Comparație între valo rile S RB la temperaturi extreme și intervalul ΔT obținut din fitarea sigmoidală a
curbelor S RB. ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………….. 88
Tabelul 8.3 Valorile T m determi nate prin diverse metode, pentru lipidele utilizate. ………………………….. ………………. 89
Tabelul 10.1 Valorile KSV, τ0 și k b pentru peptidele utilizate în acest studiu . ………………………….. ………………………. 107
Tabelul 11.1 Variația energiei libere Gibbs, ΔG, de partiționare a peptidelor din mediul hidrofil în mediul hidrofob,
pentru Melitină, Indolicidină și Cecropina P1. ………………………….. ………………………….. ………………………….. . 121
Tabelul 11.2 Variațiile energiei libere Gib bs, ΔG, de partiționare a peptidelor din mediul hidrofil în mediul hidrofob,
pentru toate peptidele. ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………………….. …… 121
xiv
1 Introducere generală
Lucrarea de față este împărțită în două mari secțiuni, reprezentate de : studiul bibliografic ,
care are o pondere de 28 % din volumul de informații expuse și partea de cercetare experimentală
proprie , care are o pondere de 72 % din informația prezentată. La sfârșitul tezei există o secțiune
distinctă care conține partea de realizări proprii (articole publicate, participări la conferințe etc.),
partea de referințe bibliografice din literatura de specialitate consultată și o ultimă parte care
conține acordurile de utilizare (copyright) pentru o parte din figurile utilizate de -a lungul acestui
manuscris , preluate din literatura de specialitate .
Studiul bibliografic
Primul capitol din această secțiune este reprezentat de motivația realizării prezentei teze de
doctorat . În acest capitol am încerca t să fac un foarte scurt rezumat al legăturii care există între
secțiunea de studiu bibliografic și cercetările experimentale proprii.
În capitolul al doilea sunt prezentate aspecte actuale legate de peptidele antimicrobiene ,
rezistența microorganismelor l a tratamentele clasice , avantajele și dezavantajele utilizării
peptidelor antimicrobiene în tratamentele antiinfecțioase , rolul anumitor aminoacizi care intră în
structura primară a peptidelor și mecanismele de interacție a peptidelor cu membranele celular e.
De asemenea, sunt prezentate și informații referitoare la structura membranelor celulare, atât cele
ale mamiferelor, cât și cele bacteriene, fiind evidențiate diferențele dintre acestea , proprietățile
membranelor lipidice și sunt descrise structurile bi omimetice (lipozomii) utilizate în practică .
Tehnicile utilizate, spectroscopia statică de fluorescență și spectroscopia rezolvată în timp
și principiile fizice care stau la baza acestora sunt descrise în capitolul al treilea . În acest capitol
sunt prezent ate și informații despre compușii chimici care sunt utilizați în aceste tipuri de
măsurători , cu evidențierea proprietăților celor doi fluorofori , Laurdanul și Triptofanul, ale căror
proprietăți fluorescente le-am utilizat în partea de cercetare experiment ală.
În capitolul al patrulea , sunt prezentate pe larg informații despre peptidele antimicrobiene
utilizate în secțiunea experimentală . Astfel, sunt selectate din literatura de specialitate informațiile
cele mai relevante referitoare la cele trei peptide u tilizate ca “modele”: Melitina , Indolicidina și
Cecropina P1 dar, sunt prezentate și unele caracteristici fizico -chimice ale peptidelor nou
2 sintetizate, P1 – P8, pentru care s -a dorit , în urma experimentelor, obținerea de informații
relevante referitoare l a modul de interacție al acestora cu membranele lipidice model .
Cercetarea experimentală
Secțiunea de cercetare experimentală proprie începe de la capitolul cinci , în care sunt
prezentate materialele și metodele utilizate pentru realizarea experimentelor d escrise în
următoarele capitole .
În capitolul al șaselea , este prezentată realizarea și optimizarea funcțion ării aranjamentului
experimental pentru măsurarea timpilor de viață ai fluorescenței . Optimizarea funcționării a
constat în măsurarea timpilor de vi ață ai fluorescenței pentru o serie de fluorofori, utilizați în
practică drept standarde pentru timpul de viață . O altă serie de experimente au vizat stabilirea
“sensibilit ății” instrumentului de măsură, prin varierea concentrațiilor fluoroforilor în soluț ie
într-o gamă largă de valori .
O aplicație directă a aranjamentului experimental realizat este descrisă pe larg în capitolul
șapte , unde am studiat interacția peptidelor antimicrobiene cu membranele lipidice model care
imită, într -un mod simplificat, memb ranele celulelor de mamifer e.
În capitolul opt , este descrisă o nouă metodă de analiză a fluidității membranelor lipidice ,
metodă care este utilizată și în capitolul al nouălea , în care am urmărit modificarea fluidității
membranare în urma tratamentelor cu peptide antimicrobiene . Metoda dezvoltată are la bază o
procedură de deconvoluție a spectrelo r complexe de fluorescență ale Laurdanului, și s -a dovedit
a fi mai sensibilă la modificările de fluiditate ale membranei, în comparație cu metodele clasice.
În capitolele zece și unsprezece am studiat interacția peptidelor antimicrobiene cu două
tipuri de membrane lipidice model. Studiul a avut două abordări: din punctul de vedere al gradului
de accesibilitate al reziduurilor de Triptofan la moleculele solventulu i și din punctul de vedere al
variației energiei l ibere Gibbs de partiționare din mediul hidrofil în mediul hidrofob. În ambele
capitole am făcut o corelație între rezultatele obținute și structura primară a peptidelor , dar și a
diferențelor care apar în f uncție de tipul de membran a lipidică model utilizată.
În capitolul al doisprezecelea , am propus o nouă abordare în analiza spectrelor de
fluorescență ale Triptofanului, abordare care furnizează o soluție pentru evaluarea raportului
între peptida legată la nivelul bistratului lipidic și peptida aflată liberă în soluție .
3 1 Motivația studiului
Raportul Organizației Mondiale a Sănătății (WHO, 2014 ), referitor la rezistența
antimicrobiană, publicat în anul 2014, indică o creștere alarmantă a numărului de microorganisme
rezistente la tratamentele antimicrobiene clasice (antibiotice). În acest raport, una dintre direcțiile
recomandate este aceea de cre are de noi metode de tratament împotriva infecțiilor cu agenți
patogeni, bazate pe proprietățile bacteriostatice și bactericide ale peptidelor antimicrobiene.
Astfel, în cadrul unui grant de cercetare, intitulat “ Generarea și investigarea unor noi
peptide antimicrobiene, cu dimensiune redusă. Corelarea structurii peptidelor cu funcția lor ”,
acronim BIOPEP , http://www.science.research.uaic.ro/biopep/index.html , au fost generate și
sintetizate opt noi structuri peptidice, numite în mod generic P1 – P8, bogate în reziduuri de
Triptofan și Arginină , fiind cunoscut efectul sinergic al acestor reziduuri , împotriva liniilor
celulare bacteriene, atunci când ele se află în structura primară a peptidelor .
În paralel cu experimentele in vitro desfășurate utilizând aces te opt peptide (Bacalum și
colab., 2017 ), a fost nevoie și de un studiu aprofundat al mecanismelor biofizice prin care
aceste peptide interac ționeaz ă cu membrane le lipidice , pentru determinarea afinității
acestor peptide în cazul a două tipuri de membrane lipidice model, care s ă imite, într -un
mod cât mai simplist, membranele celulelor de mamifer e și bacteriene . În urma acestui
studiu , am pus în evidență diferențel e care apar între cele opt peptide, compar ând între ele
rezultatele obținute, dar și făcând o paralelă cu rezultatele obținute, în aceleași condiții,
pentru trei peptide “model” , foarte bine caracterizate în literatură : Melitina, Indolicidina și
Cecropina P1, fiecare dintre acestea având mecanisme diferite de interacție cu bistratul
lipidic.
Am dorit, în urma experimentelor, în care am utilizat tehnici moderne de fluorescență,
să obțin , pe de -o parte , gradul de accesibilitate al reziduurilor de Tripto fan la moleculele
unui stingător colizional al fluorescenței (acrilamida) și , pe de altă parte , variațiile energiilor
libere Gibbs de partiționare a peptidelor din mediul hidrofil în mediul hidrofob. Valorile
obținute în aceste experimente au fost comparate cu cele obținute pentru peptide le “model” .
4 Deoarece membrana, fie ea celulară, fie lipidică model, este primul compartiment celular
afectat de interacția cu peptidele antimicrobiene, a fost necesară evaluarea modului în care
starea bistratului lipidic este afe ctată de prezența peptidelor antimicrobiene. Una dintre
metodele de investigare este analiza fluidității membranare utilizând probe fluorescente care
se inseră în bistratul lipidic, în particular Laurdanul. Analiza detaliată a spectrelor de emisie
ale Laur danului a necesitat dezvolta rea și valida rea unei noi metode de evaluare a fluidității
membranare, mai sensibilă dec ât metodele utilizate , până în acest moment , în literatură.
Această metotă folosește o procedură de deconvoluție a spectrelor de fluorescenț ă statică
utilizând funcții asimetrice de tip log -normal. După validarea metodei, am pus în evidență
diferențele care apar la nivelul fluidității bistratului lipidic , în funcție de mecanismul de
interacție dintre peptidă și membrana celulară sau lipidică m odel.
Metoda de analiză a spectrelor complexe de fluorescență statică, utilizând deconvoluția
acestora , cu funcții asimetrice de tip log -normal, a fost utilizată și pentru spectrele de emisie
fluorescentă ale Triptofanului , dar utilizând o abordare origina lă a metodei din literatură.
Astfel, noua abordare, furnizează o soluție pentru evaluarea raportul ui între peptida legată
la nivelul bistratului lipidic și peptida aflată liberă în soluție.
Pentru evaluarea accesibilit ății reziduurilor de Triptofan la mole culele de stingător și a
variației energiei libere Gibbs, a trebuit să dezvolt, pornind de la zero, un echipament
experimental pentru măsurarea timpilor de viață ai fluorescenței. După realizarea practică,
verificarea și calibrarea acestuia, am efectuat mă surătorile pentru evaluarea interacțiilor
dintre peptidele precizate anterior și membranele lipidice model. Realizarea practică a
echipamentului pentru măsurarea timpilor de viață ai fluorescenței a deschis noi direcții de
analiză a interacțiilor molecular e, rezultatele obținute venind în completarea celor obținute
din experimentele de fluorescență statică, putând fi aplicate pentru o gamă largă de molecule
(polipeptide, proteine etc).
5 2 Peptidele antimicrobiene – AMP,
membranele celulare și membranele
lipidice artificiale
Introducere
Toate organismele prezintă mecanisme de apărare înnăscute, mecanisme ce fac parte din
sistemul lor imunitar. Peptidele antimicrobiene , AMP , fac parte din aceste mecanisme de apărare
înnăscute. AMP -urile sunt compuși cu masă m oleculară mică, având în structura lor amino acizi,
ele prezentând un spectru larg de activități antimicrobiene împotriva bacteriilor Gram -negative și
Gram -pozitive, a virusurilor, protozoarelor și ciupercilor (Izadpanah și Gallo, 2005 ).
Peptidele antimicrobiene sintetizate de organismul gazdă, ac ționează ca o prim ă linie de
apărare în cazul inflamațiilor sau traumelor. Ele joacă un rol important în răspunsul imun ad aptiv,
deoarece, împreună cu funcțiile antimicrobiene directe, exercită activități imunomodulatoare,
citotoxice , acțion ând, de asemenea, ca mediatori biochimici ai inflamației și influenț ând
chemotaxia (Diamond și colab., 2009 ).
Majoritatea AMP -urilor sunt caracterizate de proprietăți fizico -chimice generale, ca sarcina
electrică netă (încărcare pozitivă , în general ) ridicată și separarea spațială a regiunilor hidrofobe
de cele hidrofile, ceea ce duce la interacția lor d iferită cu miezul hidrofob al bistratului lipidic și
cu mediul hidrofil apos extracelular (Konovalova și colab., 2018 ).
2.1 Peptidele antimicrobiene – AMP
Raportul Organizației Mondiale a Sănătății (WHO, 2014 ), referitor la rezistența
antimicrobiană , publicat în 2014, indică o creștere alarmantă a numărului de microorganisme
rezistente la tratamentele antimicrobiene clasice (antibiotice). Creșterea numărului de agenți
patogeni rezistenți la tratamentele antimicr obiene a dus la necesitatea dezvoltării de noi clase de
medicamente pentru combaterea infecțiilor provocate de aceste microorganisme (Boman, 1995 ;
6 Lehrer și Ganz, 1999 ; Hancock și Diamond, 2000 ; Brown și Hancock, 2006 ; Findlay și colab.,
2016 ). AMP, izolate dintr -o gamă largă de bacterii, plante și vertebrate superioare, inclusiv omul,
sunt omniprezente în natură și sunt importante pentru imunitatea înnăscută, fiind considerate drept
molecule esențiale în apărarea organismului gazdă împotriva infecțiilor microbiene (Brown și
Hancock, 2006 ; Konovalova și colab. , 2018 ). Datorită acțiunii lor rapide de inactivare a
microorganismelor , a toxicității foarte selective și a faptului că bacteriile nu pot dezvolta cu
ușurință rezistență împotriva peptidelor, AMP -urile sunt considerate ca alternative potențiale la
antib ioticele convenționale (Hancock și Patrzykat, 2002 ; Zasloff, 2002 ). Majoritatea AMP -urilor
nu vizează rec eptorii moleculari aflați pe suprafața membranei agenților patogeni ci , mai degrabă ,
interacționează direct cu membrana lipidică, interacția ducând , în final , la permeabilizarea acesteia
(Tossi și colab., 2000 ; Oren și Shai, 2004 ; Jiang și colab., 2008 ; Gagnon și colab., 2017 ; Jiang și
colab., 2018 ).
O comparație a secvențelor AMP relevă faptul că două tipuri de catene laterale sunt esențiale
pentru activitatea antimicrobiană. Catenele laterale cationice, cu m ar fi cele alcătuite din
reziduurile Arginină și Lizină , medi ază interacțiunile AMP cu membranele încărcate negativ și /
sau cu peretele celular al bacteriilor Gram -negative . Catenele laterale hidrofobe, cum ar fi cele
care au în structura lor r eziduuril e Izoleucină, Leucină, Fenilalanină sau Triptofan , reziduuri ce
apar frecvent în structura primară a AMP -urilor, se comportă ca niște ancore lipofile care
destabilizează bistratul lipidic, și în cele din urmă produc distrugerea acesteia. S -a observat că
activitatea antimicrobiană a AMP este guvernată de încărcarea pozitivă și de hidrofobicitatea
reziduurilor din structura acestora, trebuind să existe un echilibru adecvat întrea aceste două ti puri
de reziduuri pentru a evita toxicitatea față de celulele de m amifer (Beven și colab., 2003 ; Epand și
colab., 2003 ; Song ș i colab., 2004 ; Song și colab., 2005 ).
2.1.1 AMP și rezistența antimicrobiană
În prezent , este recunoscut faptul că AMP -urile pot juca un rol promițător în lupta împotriva
rezistenței microorganismelor patoge ne la antibioticele clasice (Zasloff, 2002 ; Jenssen și colab.,
2006 ; Mahlapuu și colab., 2016 ; Dosler, 2017 ; Lohner, 2017 ; Primon -Barros ș i Macedo, 2017 ;
Sanchez -Gomez și Martinez -de-Tejada, 2017 ). Din punct de vedere istoric, rezistența la agenți
antimicrobieni precede introducerea primului antibiotic (Penicilina) pentru folosir ea în
tratamentele clinice (Bush, 2004 ; Chopra, 2013 ). Deoarece primele antibiotice au fost toate
7 identificate sau derivate din produse naturale, factorii care determină rezistența antimicrobiană
s-au dezvoltat în mediile din care provin acestea (Bush, 2004 ). În plus, practicile medicale și
agricole d in ultimii 50 de ani, au favorizat dezvoltarea și răspândirea rezistenței antimicrobiene a
agenților patogeni, facând ineficiente metodele clasice de profilaxie a bolilor infecțioase (Poole și
colab., 2005 ). Tratarea infecțiilor cauzate de microorganismele rezistente la mai multe clase de
antibiotice (MDR) sunt scumpe, din punctul de vedere al costurilor, și au un grad foarte mare de
nereușită (Deshpande și colab., 2004 ; D'Agata, 2015 ).
Rezistența agenților patogeni la tratamentele antimicrobiene apare în mai multe moduri, dar
se bazeaz ă fie pe mecanismul de inactivare a medicamentului (Wright, 2005 ), fie pe modificări
sau mutații apărute la nivelul situsurilor de interacție cu agenții antimic robieni (Lambert , 2005 ).
Un alt mecanism este cel al rezistenței fenotipice , datorat ă modurilor de creștere specifice
(biofilme) din timpul infecției. Acesta este predominant în infecțiile cu agenți patogeni de natură
bacteriană și joacă, probabil, un rol important în cadrul rezis tenței la tratamentele antimicrobiene
in vivo , contrar testelor in vitro care indică susceptibilitatea microorganismelor la anumite tipuri
de antibiotice (Stewart și Costerton, 2001 ).
Datorită dezvoltării rezistenței agenților patogeni la tratamentele clasice, au fost dezvoltate
noi strategii de tratament a infecțiilor. Una dintre aceste stragetii este utilizarea AMP (Hancock,
2001 ) al căror mod de acțiune indică o sensibilitate scăzută la mecanismele MDR, cât și o activitate
ridicată împotriva unei game extinse de microorganisme (Epand și Vogel, 1999 ; Kouya și colab.,
2009 ; Wang, 2010 ; Mohd și Gupta, 2011 ; Marquette și Bechinger, 2018 ).
AMP -urile sunt produse de majoritatea speciilor vii, de la procariote (Vanbelkum și colab.,
1991 ; Baba și Schneewind, 1998 ) la plante (Garcia -Olme do și colab., 1998 ; Castro și Fontes, 2005 ;
Marmiroli și Maestri, 2014 ; Ficarra și colab., 2 018), insecte (Bulet și Stocklin, 2005 ; Chernysh și
colab., 2015 ; Tonk și colab., 2017 ), amfibieni (Kreil, 1994 ; Simmaco și colab., 1998 ; Rollins –
Smith și colab., 2005 ; Wang și colab., 2016 ; Kumar și Sanil, 2017 ; Dennison și colab., 2018 ) și
mamifere, inclusiv oameni (Travis și colab., 2000 ; Ryley, 200 1; Ganz, 2003 ; Oppenheim și colab.,
2003 ; Wiesner și Vilcinskas, 2010 ; Harder și Schröder, 2016 ; Sen și colab., 2016 ; Khurshid și
colab., 2018 ) ele făcând parte din mecanismul de apărare al organismului gazdă.
8 2.1.2 AMP – alternative la antibioticele clasice
În momentul de față , este acceptată ideea că secvențele specifice a AMP nu sunt esențiale în
definirea activității antimicrobiene , aceasta depinzând mai mult de proprietățile fizico -chimice ale
AMP: sarcina cationică, hidrofobicitatea și tipul de structură pe care acestea o adoptă (Tossi și
colab., 2000 ; Yamamoto și Tamura, 2010 ; Zhu și colab., 2014 ; Zhu și colab., 2015 ; Gagnon și
colab., 2017 ; Jiang și colab., 2018 ). Astfel, deși modurile nespecifice de acțiune a acestora ar putea,
într-adevăr, să diminueze capacitatea agenților patogeni de a dezvolta mecanisme de rezistență la
AMP (Mor, 2000 ; Perron și colab., 2006 ), caracteristicile comune între membranele celulare
microbiene și cele de mamifer par s ă fie responsabile de selectivitatea relativ scăzută a
AMP -urilor, în comparație cu antibioticele convenționale.
Ca alternative la medicamentele clasice, AMP prezintă o serie de dezavantaje suplimentare:
activitate redusă în prezența să rurilor și a cationilor bivalenți (Goldman și colab., 1997 ; Bals și
colab., 1998 ; Minahk și Morero, 2003 ; Rydlo și colab., 2006 ), susceptibilitate la modificări ale
pH-ului (Lee și colab., 1997 ; Rydlo și colab., 2006 ) și la proteaze sau alte componente plasmatice
(Rozek și colab., 2003 ). Utilizarea AMP ca agenți antimicrobieni poate suferi și din cauza
problemelor farmacocinetice slabe și din cauza costurilor de producție ridicate (Bradshaw, 2003 ;
Yeaman și Yount, 2003 ; Gordon și colab., 2005 ; Marr și colab., 2006 ), cum este în cazul peptidelor
formate numai din D -aminoacizi, care, deși sunt rezistente la proteoliză, au un preț de producție
semnificativ mai ridicat față de al celor obținute din L -aminoacizi (Bessalle și colab., 1990 ).
Exist ă, astfel, o nevoie clară de stabilire a unor strategii alternative pentru depășirea
deficiențelor AMP, atunci când acestea sunt tratate ca alternative la antibioticele clasice, ca
potențiali agenți terapeutici. Un număr considerabil de studii SAR (relația structură -activitate
antimicrobiană ), care vizează o mai bună înțelegere a mecanismelor de acțiune ale AMP -urilor
naturale, au contribuit la obținerea de informații referitoare la modul de acțiune și la relațiile care
există între structura AMP și activitatea antimicrobiană a acestora. Astfel, aceste studii au avut mai
multe direcții de abordare: biblioteci combinatoriale (Eichle r și Houghten, 1995 ; Blondelle și
colab., 1996 ; Blondelle și Lohner, 2004 ), abordarea minimalistă (Epand și colab., 2003 ; Jing și
colab., 2003a ) și obținerea în laborator de peptide cu anumite secvențe specifice de aminoacizi, în
structura lor primară (Tossi și colab., 1997 ; Tiozzo și colab., 1998 ; Tossi și colab., 2000 ; Zhu și
colab., 2014 ; Zhu și colab., 2015 ).
9 2.1.3 Rolul reziduurilor Triptofan și Arg inină din structura AMP
Reziduurile de Triptofan și Arginin ă se re găsesc în proporții variabile, uneori neobișnuit de
mari, în structura primară a peptidelor antimicrobiene. Rolul acestor reziduuri a fost investigat cu
atenție, dar nu este încă foarte clar ce proprietăți specifice conferă ele peptidelor antimicrob iene,
în plus față de sarcina pozitivă și hidrofobicitate. De exemplu, reziduurile de Triptofan au fost
plasate în diferite poziții pe scările de hidrofobicitate ale aminocizilor (Mazze și colab., 2005 ).
A fost demo nstrat, analizând structurile din PDB, că cea mai favorabilă configurație, din
punct de vedere energetic, în soluții apoase, este orientarea paralelă a acestor reziduuri, unul față
de celălalt, în struc tura proteinelor (Minoux și Chipot, 1999 ). Astfel, în această configurație, catena
laterală a Argininei poate să formeze aproape tot atâtea legături de hidrogen cumoleculele de apă,
din mediul înconjurător, ca atunci c ând aceasta nu este implicată în nicio reacție de tip c ation –
electron π (Aliste și colab., 2003 ).
Din analiza modului în care proteinele membranare interacionează cu bistratul lipidic, s -a
observat că r eziduurile de Triptofan preferă zona de interfață a bistratului cu mediul apos (Persson
și colab., 1998 ; Yau și colab., 1998 ; Sun și colab., 2008 ). Acest comportament a fost observat și
pentru AMP care conțin în structura lor reziduuri de Triptofan. Simulările de dinamică mole culară
au arătat importanța reziduurilor de Triptofan în interacția dintre peptide și membranele lipidice,
acestea putându -se asocia cu capetele polare (colina) încărcate pozitiv ale lipidelor (Aliste și
colab., 2003 ) și putând forma legături de hidrogen cu moleculele de apă, atunci când se află la
interfața bistratului lipidic (Aliste și colab., 2003 ; Petersen și colab., 2005 ). Regiunea de interfață
a bistratului lipidic cu mediul apos, datorită interacțiunilor electrostatice complexe care apar la
nivelul acesteia, a fost propusă ca fiind zona ide ală de interacție a reziduurilor de Triptofan cu
bistratul lipidic (Yau și colab., 1998 ).
Natura cationică și orientarea Argininei atunci când aceasta formează legături de hidrogen,
împreună cu proprietătile complexe ale Triptofanului par s ă se completeze foarte bine, reciproc,
pentru scopul peptidelor antimicrobiene. Car acterul cationic al Argininei este un mijloc eficace de
atracție al AMP la nivelul membranelor țintite de acestea, iar formarea legăturilor de hidrogen
facilitează interacția acesteia cu suprafețele încărcate negativ (lipopolizaharidele, acidul teichoic
sau fosfatidil glicerolul din capetele polare ale lipidelor). Triptofanul, datorită proprietăților
10 hidrofobe, reprezintă cel mai potrivit aminoacid care permite o asociere prelungită a AMP cu
membranele (Jing și colab., 2003b ).
2.1.4 Modul de ac țiune al AMP
AMP -urile sunt active împotriva unei mari varietăți de bacterii Gram -negative și Gram –
pozitive, drojdii, fungi și virusuri. Mecanismul de acțiune implică interacția electrostatică a
moleculelor peptidice în cărcate pozitiv cu suprafața membranelor agenților patogeni, încărcate
negativ, urmată de penetrarea membranei citolpasmatice, ceea ce duce la pierderea conținutului
intracelular în mediul extracelular (Konovalova și colab., 2018 ).
Mecanismul de ac țiune al AMP -urilor cationice este intens studiat. Majoritatea studiilor
desfășurate au fost efectuate utilizând membrane lipidice model, cu diferite compoziții de lipide.
Studiile efectuate pe membranele celulelor bacteriene s -au efectuat utilizând fluororfori sensibili
la modificările potențialului membranar sau peptide marcate fluorescent. Aceste studii au împărțit
mecanismele de acțiune al AMP asupra membranelor în două categorii: mecanisme care perturbă
(distrug) membrana și mecanisme care nu distrug membrana, acestea acționând asupra organitelor
celulare în urma transferului lor prin membrană (Friedrich și colab., 2000 ).
Atunci când intercația AMP cu membranele lipidice duce la apariția unor reorganizări la
nivelul bistratului, reorganizări în urma cărora apar efecte de distrugere la nivelul bistratului, sunt
implicate trei tipuri de mecanisme : “carpet like ”, “barrel -stave ” și formarea de pori toroidali
(Brogden, 2005 ; Diamond și colab., 2009 ).
Mecanismul de interacție de tip “carpet like ”
În acest caz, p eptidele sunt adsorbite la suprafața bistratului și formează un strat aproape
continuu asemănător unui covor, de unde și denumirea de interacție “carpet like ”, ca în Figura 2.1
– A. Cu cât concentra ția de peptidă este mai mare pe suprafața membranei, cu atât este mai mare
numărul peptidelor care penetrează membrana și formează pori toroidali tranzitorii, care permit și
altor peptide accesul la suprafața bistratului. Atunci când se atinge un anumit pr ag al concentrației
peptidelor care interacționează cu bistratul lipidic , integritatea structurală a membranei este
afectată, porțiuni din ea fiind rupte , în urma formarii de micelii.
11
Figura 2.1 Mecanisme le de interacție al e AMP cu membranele lipidice.
A – Mecanis mul de interacție “carpet like ”; B – Mecanismul de formare a porilor
toroidali ; C – Mecanismul de interacție “barrel -stave ”.
Imagini preluate din (Brogden, 2005 )
A B
C
12 Mecanismul d e interacție de formare a porilor toroidali
În acest caz, p eptidele sunt adsorbite la suprafața bistratului lipidic, dupa care agregă, iar
agregarea duce la formarea porilor toroidali. În structura porilor, peptidele au re giunile hidrofobe
orientate către capetele polare ale lipidelor și rămân asociate cu acestea datorită interacțiilor
electrostatice. Astfel, interiorul porilor va avea în structura lui zonele hidrofile ale peptidelor și
capetele polare ale lipidelor din structura bistratului , așa cum se poa te vedea în Figura 2.1 – B.
Mecanismul de interacție de tip “barrel -stave ”
În această situație, p eptidele s unt încorporate în bistratul lipidic, cu zonele hidrofobe
orientate către cozile hidrofobe ale lipidelor ce alcătuiesc membrana și cu zonele hidrofil e orientate
către interiorul porului, cum se poate observa în Figura 2.1 – C.
2.2 Membranele celulare și membranele lipidice
artificiale
Membranele biologice formează stratul protector în jurul celulelor și delimitează mediul
intracelular, cito solul și organ itele celulare ( nucleul, aparatul Golgi, mitocondriile, reticulul
endoplasmatic, cloroplastele, lizozomii etc.), de cel extracelular . Membranele reprezintă una din
componentele esențiale ale celulelor, deoarece acestea sunt responsabile pentru o serie de fun cții
indispensabile vieții, cum ar fi procesele de transport, transmisia semnal elor electrice , aderența și
comunicarea intercelulară . Aceste proprietăți sunt determinate de compoziția chimică și în special
de caracteristicile structurale ale biomembr anelor, care variază nu numai între specii diferite, dar
și între diferite tipuri de celule (Alberts, 2008 ; Becker, 2012 ).
2.2.1 Compozi ția și organizarea membranelor celulare
Membranele biologice sunt caracterizate de o diversitate moleculară impresionantă, fiind
compuse , în cea mai mare parte din lipide și proteine, dar și dintr -o mică parte de carbohidrați,
legați covalent la acestea. L ipidele formează bistratul lipidic, acesta fiind o structură suport pentru
toate membranele biologice în care sunt încorporate proteine (Alberts, 2008 ).
Membranele plasmatice ale celulelor de mamifer conțin patru mari clase de fosfolipide:
fosfatidilcolină (PC) , fosfatidiletanolamină (PE), fosfatidilserină (PS) și sfingomielină (SM), care,
13 împreună, reprezintă mai mult de jumătate din conținutul în lipide în majoritatea membranelor.
Aceste fosfolipide sunt distribuite asimetric între cele două fețe ale bistratului lipidic, așa cum se
poate observa în Figura 2.2. Fața exterioară a membranei plasmatice constă în principal din PC și
SM, în timp ce PE și PS sunt fosfolipidele predominante în structura feței interioare a bistratului.
Un al cincilea fosfolipid, fosfatidilino sitol (PI) este, de asemenea , localizat la nivelul feței
interioare a membranei plasmatice. Deși PI este o componentă membranară prezentă în can tități
foarte mici , el joacă un rol important în semnalizarea celulară . Capeteloe polare ale lipidelor PS și
PI sunt încărcate negativ, astfel că fața interioară a bistratului prezintă încărcare netă negativă
(Cooper, 2000 ).
Figura 2.2 Structura membranei plasmatice a celulelor de mamifer .
Imagine preluată din (Cooper, 2000 ).
În plus , față de fosfolipide le amintite anterior , membranele plasmatice ale celulelor de
mamifer conțin glicolipide și colesterol. Glicolipidele se găsesc exclusiv pe fața exterioară a
bistratului și reprezintă doar aproximativ 2 % din totalitatea lipidelor care alcătuiesc membrana
plasmatică. Colesterolul, pe de altă parte, este un constit uent major al membranei celulelor
animale, fiind prezent în aproximativ aceleași cantități molare ca fosfolipidele.
Membranele celulelor bacteriene au o structură diferită de cele de mamifer. Pereții acestora
sunt mai rigizi, determinând astfel o formă bin e definită a celulei și , în același timp , împiedicând
14 distrugerea peretelui celular ca rezultat al presiunii osmotice. Structura peretelui celular împarte
bacteriile în două mari clase, ce se pot diferenția printr -un procedeu de marcare cunoscut sub
numele de colorație Gram , dezvoltată de Christian Gram în anul 1884. Așa cum se poate observa
în Figura 2.3, bacteriile Gram -negative (spre exemplu Escherichia coli ) au un sistem de membrană
plasmatică dublă, în care membrana lipidică interioară (citoplasmatică) este înconjurată de un
perete celular rigid și de cea de -a doua membrană lipidică, mult mai permeabilă. Spre deosebire
de acestea, bacteriile Gram -pozitive (spre exemplu , agentul patogen Staphylococcus aureus ) au o
singură membrană plasmatică, înconjurată de un perete celular rigid, mult mai gros decât al celor
Gram -negative (Cooper, 2000 ).
Figura 2.3 Structura membranei plasmatice a celulelor bacteriene .
Imagine preluată din (Cooper, 2000 ).
În ciuda diferențelor structurale, componenta principală a peretelui celular, pentru ambele
tipuri de bacterii, este un peptidoglican, alcătuit din lanțuri polizaharidice lineare, legate între ele
15 de oligopeptide. Din cauza acestei structuri reticulate, peptidoglicanul formează un înveliș
covalent puternic care înconoară întreaga celulă ba cteriană. Structura unică a peretelui celular face
ca bacteriile s ă fie sensibile la unele antibiotice. Spre exemplu, Penicilina inhibă enzima
responsabilă de formarea legăturilor încrucișate între diferitele catene ale peptidoglicanului,
interferând astfe l cu lanțul de sinteză a peretelui celular, blocând în acest fel creșterea bacteriană.
2.2.2 Propriet ățile bistratului lipidic
Membranele biologige au ca structură de bază bistraturile lipidice. Proprietățile bistratului
lipidic depind de tipul lipidelor din car e acesta este alcătuit (saturate, nesaturate sau steroli), dar și
de proprietățile fizico -chimice ale mediului. Cele mai importante proprietăți ale bistratului lipidic
sunt: fluiditatea, esențială pentru toate sistemele biologice, și organizarea laterală, care depinde de
interacțiunile ce apar între numeroasele componente din structura membranei.
Fluiditatea bistratului lipidic
Membranele biologice sunt structuri dinamice, în care atât lipidele cât și proteinele pot s ă
difuzeze translațional și rotațional . Comparativ cu proteinele, care prezintă două tipuri de difuzie,
una laterală și una rotațională, după o axă perpendiculară pe suprafața bistratului, lipidele din
structura membranei prezintă trei moduri de difuzie: rotațională, în jurul axei longitudinale,
laterală și transversală (mișcarea de tip “ flip-flop”, între cele două monostraturi lipidice ). Toate
aceste tipuri de difuzie sunt întâlnite și în situația membranelor lipidice model.
O caracteristică importantă a bistratului lipidic este capacitatea de t ranziție a acestuia între
două st ări (faze) caracterizate de proprietăți (coeficienți de difuzie) diferite: de la faza solidă (gel)
la faza fluidă (cristal lichid). Tranziția între aceste st ări este dependentă de temperatură , definindu –
se astfel un punct c ritic, numit temperatur ă de tranziție, Tm, temperatură care este considerată
punctul de “topire ” al membranei , cozile lipidelor având peste această temperatură o mi șcare
oarecum dezordonată . Temperatura de tranziție este influențată de lungimea cozilor lip idelor da r
și de existența dublelor legături în structura acestora. Mișcarea moleculelor care intră în alcătuirea
membranei (lipide, proteine etc.), care crește odată cu temperatura, caracterizează fluiditatea
bistratului lipidic.
16 Separarea de faz ă a lipi delor din componen ța bistr atului
Membranele biologice cât și membranele lipidice model, obținute din mai multe tipuri de
lipide, prezintă în structura lor o organizare laterală, astfel încât pot exista, în același timp, mai
multe domenii lipidice (în Engle ză, rafts) care prezintă proprietăți fizice diferite. Aceste proprietăți
sunt descrise, în mod uzual, de cele trei faze în care putem regăsi bistratul, din punctul de vedere
al organizării laterale a acestuia: faza de gel (solid ordonat), faza de lichid or donat și faza de cristal
lichid (lichid dezordonat).
Pentru majoritatea lipidelor, faza de gel se observă la temperaturi scăzute. Aceasta este
caracterizată de o î mpachetare laterală ridicată a cozilor moleculelor de lipid , ceea ce conduce la
obținerea une i fluidități scăzute a bistratului, coeficienții de difuzie fiind în acest caz foarte mici.
Împachetarea lipidelor depinde de lungimea cozilor și de gradul de nesaturare al acestora. Faza de
cristal lichid se observ ă la temperaturi mai mari decât Tm, când lipidele “se topesc” , lucru ce duce
la o fluiditae mai crescută a bistratului.
2.2.3 Membranele lipidice artificiale – structur i biomimetice
Datorită complexității membranelor biologice, în a căror structură se găsesc sute, sau chiar
mii, de componente (diferite proteine și tipuri de lipide), utilizarea sistemelor model, în care
compoziția membranei și dimensiunile fizice ale acesteia sunt controlate de către utilizator,
reprezintă cea mai simpl ă și avantajoasă modalitate de studiu a proprietăților specifice aces tora.
Lipozomii , care reprezintă unul dintre tipurile de membrane lipidice model , sunt folosi ți în
practică pentru că utilizatorul poate controla compoziția, condițiile fizico -chimice, dimensiunile și
forma membranei . Ei pot fi ușor prepara ți în laborator, din lipide naturale sau sintetice, sunt
reproductibil i, au o omogenitate ridicată și sunt stabil i în timpul măsurătorilor. Membranele model
pot fi utilizate , cu ușurință , pentru măsurători de spectroscopie și de fluorescență . Structural,
lipozomii sunt ve zicule sferice, în care un volum de substan ță apoasă este complet închis de către
un bistrat lipidic , cum se poate observa în Figura 2.4.
17
Figura 2.4 Secțiune transversală printr -un lipozom .
Imagine preluată din (Alberts, 2008 ).
Dintre metodele de obținere a lipozomilor, pentru experimentele de laborator, cele mai
folosite sunt:
– metoda sonicării , prin care se obțin lipozomi cu diametrul de aproximativ 50 nm – SUV
(Small Unilamellar Vesicles) , distribuiți uniform în suspensie ;
– metoda extrudării , prin care se obțin lipozomi cu diametrele între 50 nm și 1 μm – LUV
(Large Unilamellar Vesicles) , dimensiunile acest ora fiind în funcție de filtrul folosit ;
– metoda electroformării , prin care se obțin lipozomi “gigant” – GUV (Giant Unilamellar
Vesicles) .
Din punct de vedere al structurii , lipozomii se împart în: vezicule unilamelare (ULV) – SUV,
LUV și GUV, vezicule mult ilamelare (MLV), vezicule multicompartimentate (MVV) și vezicule
oligolamelare (OLV).
18
19 3 Principiile de baz ă ale fluorescen ței
Introducere
Spectroscopia de fluorescență a devenit una dintre cele mai utilizate tehnici în domeniul
biofizicii, cu aplicații în studierea structurii și funcțiilor macromoleculelor de interes biologic
precum și a sistemelor biologice (membrana lipidică, citoschelet, nucleu, grupări de celule).
3.1 Fluorescen ța
Studiul sistemelor biologice prin investigarea fe nomenului de fluorescență a cunoscut o
dezvoltare semnificativă în ultimele două decenii. Spectroscopia de fluorescență și fluorescența
rezolvată în timp sunt considerate a fi principalele metode experimentale în biochimie și biofizică.
Investigarea fenome nului de fluorescență este acum extrem de folosită în biotehnologie,
secvențierea ADN, criminalistică și în analize le genetice. O cre ștere la fel de semnificativă a
cunoscut și utilizarea fluorescenței în imagistica celulară și moleculară. Imagistica de fl uorescență
este folosită în localizarea și dozarea moleculelor intracelulare, uneori la nivelul de detecție a unei
singure molecule (Lakowicz, 2006 ).
3.1.1 Diagrama Jablonski și caracteristicile emisiei fluorescente
Emisia de lumină (în spectrul UV, VIS, IR) de către orice subsțantă poartă numele de
lumin escență și apare din stări electronice excitate. Lumin escența este, în principiu, împărțită în
două categorii: fluorescența și fosforescența, diferența între aceste dou ă fenomene facând -o starea
excitată în care g ăsim molecu la studiat ă, respectiv singlet sau triplet (Lakowicz, 2006 ). În funcție
de modul în care molecula de interes a ajuns pe un nivel energetic superior, lumin escența poate fi
împartita în mai multe categorii: fotolumin escența, chemilumin escența, radiolumin escența, etc.
(Valeur, 2001 ).
La apariția fenomenului de fluorescență, electronul din starea excitată de singlet este
împerecheat cu electronul (cu spin opus) din starea fundamentală. Revenirea electronului din starea
excitată, în starea fundamentală, se face rapid, prin emisia unui f oton (dezexcitare radiativă) sau
20 prin disipare de c ăldură (dezexcitare neradiativă). Viteza de emisie a fluorescenței este, în general ,
108 s-1, și astfel timpul de viață al fluorescenței este de aproximativ 10 ns (Lakowicz, 2006 ).
Energia , E, necesară electronului pe ntru a trece din starea energetică fundamental ă în starea
excitată singlet este , de fapt , energia fotonilor absorbiți de molecula fluorescent ă:
𝐸= ℎ𝑐
𝜆 (3.1)
unde h este constanta lui Planck ( h = 6.6 3 × 10-34 Js), c este viteza luminii în vid ( c ≈ 3 × 108 m/s)
și λ este lungimea de undă a radiației electromagnetice.
Procesele care apar între absorbția și emisia luminii sunt, în general, evidențiate cu ajutorul
diagramei Jablonski (Figura 2.1). Stările energetice electronice: fundamentală, prima stare excitată
și a doua stare excitată în care se află electronul sunt notate în figură cu S 0, S1 și respectiv, S2.
Pentru fiecare din aceste stări electronul poate exista pe unul din nivelurile energetice vibr aționale
reprezentate în figură prin cifrele 0, 1, 2 etc. Săgețile reprezentate prin linii continue desemnează
procese care implică schimb radiativ de energie, în timp ce, acelea reprezentate prin linii întrerupte
descriu procese neradiative. Tranziția S 2 → S 1 are loc în intervale de timp t < 10-10 s, în timp ce
procesele care conduc la tranziția S 1 → S 0 sunt caracterizate de timpi de viaț ă cuprinși în domeniul
10-10 s până la 10-7 s (Țugulea și Găzdaru, 2003 ).
Figura 3.1 Diagrama Jablonski .
Si, Ti (i = 0, 1, 2) = stări electroni ce singlet respectiv, triplet (Seery, 2009 ).
21 Fenomenul de fluorescență este, în general, caracterizat prin spectrel e de emisie ale
fluoroforilor studiați în experimente. Un spectru de emisie fluorescentă este reprezentat de
dependența intensit ății fluorescenței (CPS) de lungimea de undă (nm) sau de numărul de undă
(cm-1). Spectrele de emisie sunt foarte diferit e și depind de structura chimică a fluoroforului și de
solventul în care acesta este dizolvat, pH -ul soluției, temperatură etc.
Fenomenul de fluorescență prezintă următo rii parametri și caracteristici de bază:
– deplasarea Stokes;
– spectrele de emisie sun t, în general, independente de lungimea de undă de excitație;
– eficiența cuantică;
– timpul de viață.
Deplasarea Stokes
Din analiza unei diagrame Jablonski reiese că fluorescența apare la lungimi de undă mai
mari (energii mai mici) decât lungimea de undă a radiației electromagnetice care a fost absorbită
(deplasare Stokes) .
Diferența între energia radiației absorbite și energia radiației emise este o caracteristică
universală a fluoroforilor în soluții. Una dintre cauzele deplasării Stokes este dezexcita rea rapidă
de pe un nivel vibrațional superior al nivelului electronic S 1 pe ultimul nivel vibrațional al acestuia.
În plus, fluoroforii pot prezenta deplasare Stokes dependentă de proprietățile fizico -chimice ale
solventului (polaritatea solventului, indi cele de refracție al solventului, temperatura, pH -ul etc.).
Independen ța spectrelor de emisie de lungimea de und ă de excita ție
O altă proprietate a emisiei fluorescente : pentru lungimi de undă de excitație diferite sunt
înregistrate spectre de emisie aprox imativ identice. Această regulă este cunoscută drept regula lui
Kasha (Kasha, 1950 ) și deriv ă din faptul că eficiența cuantică a unui fluorofor este, în general,
independentă de lungimea de und ă de excitație. Independența spectrelor de emisie de lungimea de
undă de excitație apare datorit ă faptului că în urma tranziției pe unul din nivel urile vibro –
rotaționale superioare, energia în exces față de cel mai scăzut nivel de vibrație a l stării S 1 este
disipată rapid (10-12 s), fluoroforul ramânând în această ultimă stare energetică p ână la apariția
emisiei fluorescente.
22 Simetria dintre spectr ele de emisie și de excitație (un spectru de excitație reprezintă variația
coeficientului molar de extincție cu lungimea de undă), numit ă regula imaginii în oglindă, este
consecința acelorași tranziții între nivelurile energetice vibraționale ale niveluril or S 0 și S 1.
Eficien ța cuantic ă
Eficiența cuantică (sau randament cuantic) a unui fluorofor este definită ca numărul de fotoni
emiși, raportat la numărul de fotoni absorbiți. Eficiența cuantică a unui fluorofor este reprezentată,
cel mai bine într -o dia gramă Jablonski simplificată, de tipul celei din Figura 3.2.
Figura 3.2 Diagrama Jablonski simplificat ă pentru punerea în
evidenț ă a eficienței cuantice a unui fluorofor .
Adaptare după (Lakowicz, 2006 ).
În această fig ură s -a notat cu Γ constanta de vitez ă de emisie a fluoroforului și cu knr
constanta de vitez ă a proceselor de desexcitare neradiativ ă, care apar la revenirea fluoroforului pe
nivelul S 0. Astfel, avem pentru eficiența cuantică a fluoroforului următoarea r elație:
𝑄= 𝛤
(𝛤+ 𝑘𝑛𝑟) (3.2)
unde suma (Γ + k nr) este proporțională cu numărul de fotoni absorbiți. Eficiența cuantică a unui
fluorofor poate fi aproximativ egală cu 1, dacă viteza dezexcitărilo r neradiative este mult mai mică
decât numărul fotonilor emiși (knr << Γ ), dar, întotdeauna , este subunitară.
Timpul de via ță al fluorescen ței
Timpul de viață al stării excitate este definit ca fiind timpul mediu pe care îl petrec
moleculele unui fluorofor pe nivelurile energetice superioare, înainte ca acest ea să revină pe
23 nivelul energetic fundamental. Pentru fluorofori, în general, timpul de viață mediu al stării excitate
este de aproximativ 10 ns. Pentru orice fluorofor, timpul de viață mediu este:
𝜏= 1
(𝛤+ 𝑘𝑛𝑟) (3.3)
Timpul de viață a stărilor excitate ale unui fluorofor, în absența proceselor neradiative, se
numește timp de viață natural sau timp de viață intrinsec și este dat de următoarea relație:
𝜏𝑛= 1
𝛤 (3.4)
Eficiența cuantică și timpul de viață mediu al stării excitate sau timpul de viață natural pot
fi modificate de factorii care afectează rata de emisie , Γ, sau rata de descre ștere neradiativă , knr.
3.1.2 Influen ța factorilor de mediu asupra fluorescen ței
Polaritatea solventului și condițiile de mediu locale (pH -ul, temperatura, etc) au efecte
semnificative asupra caracteristicilor spectrale ale fluoroforilor (Suhling și colab., 2005 ). Influența
acestor factori este redată în Figura 2.3.
Figura 3.3 Influența factorilor de mediu asupra fluores cenței.
Adaptare după (Lakowicz, 2006 ).
Cu toate că principala cauză a deplasării Stokes este dezexcitarea neradiativă pe nivelul
vibrațional cu cea mai mică energie al stării electronice S 1, trebuie avuți in vedere și ceilalți factori
ce pot afecta emisia fluorescen tă și, implicit, deplasarea Stokes:
24 – polaritatea și vâscozitatea solventului;
– rata de relaxare dipolară a solventului;
– modifică rile conformaționale ale fluoroforului;
– rigiditatea mediului local;
– transferul intern de sarcină;
– formarea de legături de hidrogen și reacții chimice î n stare excitată;
– reacții fluorofor -fluorofor;
– modificări în rata de dezexcitare radiativă/neradiativă.
3.2 Fluorofori
Un fluorofor este o porțiune a unei molecule, care o face pe aceasta să fie fluorescentă. În
urma numero aselor descoperiri din chimia organică, astăzi beneficiem de o multitudine de
substanțe fluorescente. Fluorescența este foarte utilă, în particular stiințelor vieții, ca o metodă
experimentală nedistructivă, pentru analiza biomoleculelor și a agregatelor c elulare.
3.2.1 Principalele tipuri de fluorofori și propriet ățile acestora
Un fluorofor este o grupare funcțională a unei molecule care absoarbe energie la o lungime
de undă și emite la o altă lungime de undă. Energi a emisă și, în consecință, lungimea de undă a
fotonului emis , depind în principal de natura fluoroforului și de condițiile fizico -chimice în care
acesta se află. Principalele tipuri de fluorofori utilizați în experimente sunt:
– fluoroforii biologici;
– coloranții organici;
– nanoparticulele cuantice.
Principalele caracteristici ale fluoroforilor sunt:
– lungimea de undă a maximului de excitație și de emisie (exprimat e, de obicei în nm): corespunde
peak -urilor din spectrul de excitație și , respectiv, de emisie (în general câte unul pentru fiecare
25 porți une de spectru, dar pot exista de asemenea și spectre complexe rezultate din suprapunerea mai
multor peak -uri);
– coeficientul molar de extincție (sau absorbție molară, exprimat în mol-1×cm-1×L): stabile ște o
relație între cantitatea de lumină absorbită, l a o lungime de undă dată, și cantitatea de fluorofor din
soluție;
– eficiența cuantică: reprezintă eficiența transferului de energie de la fotonii incidenți la fotonii
care apar în urma fluorescenței (numărul de fotoni emiși raportat la numărul de fotoni a bsorbiți de
fluorofor);
– timpul de viață (exprimat în ps sau ns): reprezintă durata de timp cât fluoroforul stă pe nivelul
energetic superior înainte de a reveni pe nivelul energetic de bază; sau timpul necesar unei
populații din fluoroforul considerat, a flate pe un nivel energetic superior, să revină pe nivelul
energetic de bază în proporție de 1/e (~0. 37);
– deplasarea Stokes (exprimată în nm sau cm-1): reprezintă diferența dintre maximul intensitații din
spectrul de excitație și maximul intensit ății din spectrul de emisie.
3.2.2 Fluorofori solvatocromici
Emisia fluoroforilor apare la lungimi de undă mai mari decât ale absorbției luminii . Aceste
pierderi de energie sunt datorate proceselor dinamice care apar în urma absorbției, a șa cum se
poate vedea în Figura 2.4. În urma absorbției unui foton, un fluorofor trece, în general, din punct
de vedere energetic, pe unul din nivelurile vibraționale ale stării excitate S 1. Excesul de energie
vibrațională este pierdut rapid în solvent. Dacă un fluorofor, în urma absorbț iei unui foton, trece
în starea excitată S 2, atunci acesta va trece rapid (10-12 s) în starea excitată S 1, în urma
fenomenuleui de conversie internă.
Un fluorofor aflat în stare excitată are momentul de dipol (μ e) mai mare decât momentul de
dipol în starea de bază (μ g). Interacțiunea solventului cu fluoroforul aflat în stare excitată, duce la
o scădere și mai pronunțată a energiei stării excitate a fluoroforului (creștere a lungimii de undă
de emisie). Acest fenomen apare datorită faptului că moleculele sol ventului (dipolii) se pot
reorienta în jurul dipolului fluoroforului (μ e) aflat în stare excitată. Astfel, cu cât polaritatea
26 solventului crește, cu atât energia fluoroforului în stare excitată scade, emisia fluorescentă
deplasându -se către lungimi de undă mai mari (deplasare batocromică ).
Figura 3.4 Pierderile de energie ale unui fluorofor aflat în stare
excitată .
Adaptare după (Lakowicz, 2006 ).
Fluoroforii folosiți în experimentele ce pun în evidență relaxarea solven tului sunt
caracterizați de diferența mare între momentul electric de dipol în stare a excitată și momentul
electric de dipol în starea de bază (Δμ = μ e – μg).
3.2.2.1 Laurdanul – fluorofor utilizat pentru estimarea fluidita ții
membranelor lipidice
Fluoroforul solv atocromic LAURDAN (6 -dodecanoyl -2-dimethylamino naphthalene) s -a
dovedit a fi util în caracterizarea membranelor lipidice (Lakowicz și Sheppard, 1981 ; Parasassi și
colab., 1986 ). Acesta detectează tranzițiile de fază (faza de gel și faza lichid ă) atunci când este
inserat în bistratul lipidic, datorită sensibilitații sale la polaritatea mediului, fiind un bun indicator
al stării de hidratare a membranei. Laurdanul prezintă o coadă alifatic ă formată din 12 atomi de
carbon, fapt care îi facilitează inserarea în bistratul lipidic (Jurkiewicz și colab., 2006 ) (Figura 2.5
A).
27
Figura 3.5 Laurdanul .
A – molecula de Laurdan ; B – spectrele de emisie fluorescentă ale Laurdanului
corespunzătoare celor două faze ale bistratului : faza de gel (albastru) și faza fluidă (verde) .
Creșterea num ărului de molecule de apă conținute în bistratul lipidic duce la o deplasare spre
roșu a maximului de emisie a Laurdanului (Samanta și Fessenden, 2000 ). Această deplasare se
datorează relaxarii moleculelor de apă în jurul fragmentului naftalenic, depinzând în primul rând
de faza în care se află bistratul lipidic (Fig ura 2.5 B) (Sanchez și colab., 2007 ).
3.2.2.2 Triptofanul – principalul aminoacid ce prezint ă fluorescen ță
intrinsec ă
Spectroscopia de fluorescenț ă este utilizată , în mod curent , pentru studierea structurilor
biologice , precum și a peptidel or și proteine lor. Aminoacizii aro matici, Triptofan (W), Tirozină
(Y) și Fenilalanină (F), datorită faptului c ă prezintă fluorescență intrinsecă, sunt utilizați pentru
studierea modificărilor conformaționale ale proteinelor și peptidelor, a dinamic ii acestora, dar și
pentru punerea în evid ență a intercțiilor biomoleculare la care acestea participă (Hui și colab.,
2015 ). Dintre cei trei aminoacizi, cel mai utilizat în practică este Triptofanul (Figura 2.6).
Fluorescența indolului, gruparea cromoforă din structura Triptofanului, este extrem de sensibilă la
proprietățile fizico -chimice ale mediului incon jurător, f ăcând astfel din molecula de Triptofan un
28 indicator al modificărilor conformaționale ale moleculelor, dar și al interac ției dintre acestea și alte
molecule (Hayes și Kollman, 1976a ; Hayes și Kollman, 1976b ; Honig și Nicholls, 1995 ; Sham și
colab., 1998 ).
300 350 400 450 500012345IFLUORESC. [x105 cps]
[nm] Indolicidina +PBS
Indolicidina + LUV (DOPC)B
Figura 3.6 Triptofanul .
A – molecula de Triptofan ; B – spectrele de emisie fluorescentă ale Triptofanului din
structura moleculei de Indolicidină, pentru două situații diferite .
În principiu, dac ă structura proteinei este cunoscută, modificările din spectrul de fluorescență
al Triptofanului pot fi interpretate în termeni structurali la rezoluție atomică (Chen și Barkley,
1998 ).
Eficiența cuantică a fluorescenței Triptofanului poate varia între 0 și 0.35 (Lakowicz, 2006 ),
fiind extrem de sensibil ă la polaritatea locală a mediului (Weber, 1960 ; Beechem și Brand, 1985 ;
Eftink, 1991 ).
Printre proprietățile , cel mai des utilizate sunt: modificarea intensi tății fluorescenței,
modificarea poziției maximului emisiei fluorescente ( λmax), forma generală a spectrului de emisie,
anizotropia (depolarizarea) fluorescenței, timpii de viață ai fluorescenței și transferul rezonant de
energie (FRET). Poziția maximului de emisie, la fel ca eficiența cuantică, este extrem de sensibilă
la proprietățile mediului, variind de la ~ 308 nm (azurin ă) până la ~ 355 nm (glucagon), fiind în
relație directă cu gradul de expunere al grupării cromofore la moleculele solventului (Reshetnyak
și Burstein, 2001 ).
A
29 Toate acestea fac ca fluorescența Triptofanului să consti tue un bun indicator al conformației
peptidelor și, deasemenea, al interacției acestora cu membranele celulare .
3.3 Spect roscopia de fluorescen ță
Așa cum am precizat în paragrafele anterioare, emisia fluorescentă furnizează informații din
care se pot deduce efectele mediului înconjurător asupra fluoroforului. Pentru obținerea acestor
informații se înregistrează semnalul fluo rescent (spectre, timpi de via ță ai fluorescenței, gradul de
polarizare a semnalului fluorescent etc.) cu ajutorul instrumentelor numite spectrofluorimetre.
Măsurarea semnalului fluorescent poate fi efectuată , în general, prin două mari metode :
spectroscop ia de fluorescență static ă (staționară) și spectroscopia de fluorescenț ă rezolvat ă în
timp.
3.3.1 Spectroscopia de fluorescen ță static ă
În măsurătorile de fluorescență statică (cele mai uzuale măsurători), proba analizată este
expusă la un fascicul de lumin ă cu intensitatea relativ constantă. Concomitent cu iluminarea este
înregistrat și spectrul de emisie fluorescentă al probei (Figura 2.7). Atunci când proba este
iluminată pentru prima dată, starea staționară este atinsă, aproape instantaneu.
Este important să înțelegem relația dintre măsurătorile de fluorescență rezolvată în timp și
cele de fluorescență staționară (statică) , aceasta din urmă fiind o medie a scăderii intensității
fluorescenței rezolvate în timp. Dacă considerăm un fluorofor care prezintă un sing ur timp de
scădere, τ, a intensității fluorescenței, atunci relația dintre scăderea intensității și timpul τ este:
𝐼(𝑡)= 𝐼0𝑒−𝜏
𝑡 (3.5)
unde I0 este intensitatea la timpul t = 0.
Măsur ătorile de fluorescență static ă reprezint ă o medie a intensității fluorescenței rezolvate
în timp. Relația dintre intensitatea fluorescenței staționare ( ISS) și intensitatea fluorescenței
rezolvată în timp este:
30 𝐼𝑆𝑆= ∫ 𝐼0𝑒−𝜏
𝑡 𝑑𝑡∞
0 (3.6)
Intensitatea I0 poate fi considerată ca fiind dependentă de parametrii instrumentului de
măsură și de concentrația fluoroforului în soluție. Astfel, în termeni moleculari, intensitatea
fluorescenței statice este proporțională cu timpul de viață, în acest fel fiind justificate ecuațiile
(2.2) și (2.3), care ne arată că eficiența cuantică este proporțională cu timpul de viață (Lakowicz,
2006 ).
Un spectrofluorimetru clasic conține trei elemente principale: o sursă de lumin ă
policromatică (albă) în undă continuă (tipic , lampă cu descărcare în xenon sau surs ă LED
policromatică), sistemul optic (lentile de focalizare, monocromatoare de excitație și emisie,
sistemul de fixare a probei de analizat) și un detector cu sensibilitat e foarte mare ( e.g.,
fotomultiplicator , cel mai des utilizat, fotodiodă cu avalanșă etc.). În plus, prin adăugarea unui
detector suplimentar se pot efectua și măsurători ale eficienței cuantice a fluoroforilor, iar dac ă se
dorește m ăsurarea anizotropiei, în căile optice de excita ție și emisie pot fi introduse prisme pentru
polarizarea luminii.
3.3.2 Spectroscopia de fluorescen ță rezolvat ă în timp
Cunoașterea dinamicii stărilor excitate prezintă o importanță majoră în înțelegerea
proceselor de natură fotobiologică (Valeur, 2001 ). Deși spectroscopia de fluorescență statică este
ușor de implementat, ea suferă de mai multe dezavantaje. Măsurătorile intensității emisiei de
fluorescență depind de mai mulți factori, cum ar fi excitația probei și eficiența de colectare a
fotonilor emiși de către aceasta , eficiența de transmisiei a luminii prin căile optice și
neomogenit atea probei de analizat.
Măsurătorile de fluorescențărezolvată în timp sunt independente de intensitatea semnalului
și, prin urmare, sunt independente de toate artefactele care afectează măsurătorile bazate pe
intensitate, menționate în paragraful anterior.
În momentul de față , se utilizează două tehnici pentru obținerea informațiilor referitoare la
timpul de viață al fluorescenței: fluorimetria în pulsuri și fluorimetria c u modularea fazei
(armonică) .
31 Atunci c ând se utilizeaz ă fluorimetria în pulsuri, excitarea probei se face cu un puls foarte
scurt de lumină (numit puls Dirac – δ) și se înregistr ează fluorescenț a probei în funcție de timp.
Pentru aflarea intensității fluo rescenței, I(t), la orice moment t, este necesar să se înregistreze
profilul pulsului de lumină, IRF(t’), intensitatea fluorescenței fiind în acest caz:
𝐼(𝑡)=∫𝐼𝑅𝐹 (𝑡′)∑𝐴𝑖𝑒−𝑡−𝑡′
𝜏𝑖𝑑𝑡′𝑛
𝑖=1𝑡
−∞ (3.7)
unde s -a notat cu: I(t) – intensitatea fluorescenței, IRF(t’) – intensitatea corespunzătoare profilului
pulsului de lumină generat de sursa de ex citație, Ai – amplitudinea componentei , i, în număr de
impulsuri, la momentul t = 0, τi – timpul de viață al componentei , i.
Fluorimetrele în pulsuri se bazează pe metoda numărării unui singur foton , metodă numită
în continuare , TCSPC . Principiul metodei se bazează pe faptul că probabilitatea de detecție a unui
singur foton , la un t imp t, după pulsul de excitare , este proportională cu intensitatea fluorescenței
la acel moment , t. După înregistrarea unui număr foarte mare de pulsuri (minim 105) rezultă curba
(histograma) de scădere exponențială a numărului de pulsuri pentru timpi de î nregistrare mai mari
(Figura 2.7) .
Figura 3.7 Spectru l de fluorescență rezolvată în timp obținut prin
metoda TCSPC .
(Wahl, 2014 ).
În fluorimetria cu modularea fazei, proba este excitată cu lumină în undă continuă modulată
sinusoidal la frecvenț ă înaltă. Astfel, răspunsul fluorescent al probei, este și el modulat la aceeași
32 frecvență, dar cu întârziere de fază și parțial demodulat (amplitudine mai mică) în comparație cu
faza și am plitudinea luminii care a excitat proba .
3.4 Alte tehnici utilizate în măsurarea fluorescen ței
Odată cu evolu ția tehnologic ă, măsurarea fluorescenței ”a migrat” de la măsur ătorile
efectuate în cuva spectrofluorimetrului, unde se poate analiza o populație foart e mare de fluorofori,
către microscopie, unde analiza se poate face la nivel celular, sub -celular sau chiar la nivel de o
singură moleculă.
Tehnicile de microscopie de fluorescenț ă se împart în mai multe categorii:
– Microscopia fluorescentă;
– Microscopia co nfocală, care în plus față de microscopia de fluorescență are avantajul
adăugarii axei z în imagini, obțin ându-se astfel conformații 3D ale specimenelor
analizate;
– Imagistica timpului de viață a fluorescenței (FLIM), tehnică în care se înregistreaz ă
variaț ia timpilor de viață ai florescenței ai unuia sau mai mul tor flourofori, în funcți e de
modul în care aceștia interacționeaz ă cu specimenul analizat ;
– Microscopia de fluorescența cu excitare multifotonică;
– Spectroscopia corelat ă de fluorescență – tehnică de măsurare la nivel de o singură
moleculă;
– Microscopia cu super -rezoluție, unde s -a reușit coborârea sub limita de difracție.
Alte două tehnici de măsurare , care utilizeaz ă fluorescența , sunt citometria în flux și
rezonanța plasmonilor de suprafață.
33 4 AMP utilizate – caracteristici structurale
și func ționale ale acestora
Introducere
Peptidele antimicrobiene (AMP) sunt o clasă aparte de proteine cu masa moleculară mică,
cu compoziții diverse, produse de o gamă largă de organisme. Structura lor primară, car acterul
amfipatic, sarcina netă și dimensiunile mici le permit acestora adsorbția și inserarea în bistratul
lipidic , ducând la alterarea structurii acestuia prin diferite mecanisme de interacție (Yeaman și
Yount, 2003 ; Brogden, 2005 ; Hale și Hancock, 2007 ; Mookherjee și Hancock, 2007 ).
Pentru investigarea modului de interacție a structurilor peptidice nou sintetizate cu potențial
antimicrobian cu bistraul lipidic, se va face , în capitolele următoare, o comparație între acestea și
trei peptide antimicrobiene, intens studiate în literatură, care prezintă mecanisme de interacție
diferite: formare de pori toroidali transmembranari – Melitina (Yang și colab., 2001 ; Lee și colab.,
2004 ), alterarea membranei citoplasmatice – Indolicidin a (Subbalakshmi și Sitaram, 1998 ) și
tapetarea stratului exterior al membranei (modelul de interacție “carpet -like”) – Cecropina P1
(Gazit și colab., 1995 ; Shai, 1995 ).
4.1 Melitina
Melitina este principala componentă toxică din veninul albinei europene ( Apis mellifera ),
fiind o peptidă cationică, cu un puternic efect hemolitic (Habermann, 1972 ; Dempsey, 1990 ).
Este o peptidă lineară formată din 26 de reziduuri de aminoacizi
(GIGAVLKVLTTGLPALISWIKRKRQQ) , cu două porțiun i cu proprietăți diferite . Structura 2D
a Melitine i se poate observa în Figura 4.1. Prima porțiune, cu proprietăți preponderent hidrofobe,
este reprezentată de reziduurile din capătul N-terminal (de la reziduul 1 la reziduul 20). Cealaltă
porțiune, din cap ătul C-terminal, prezintă proprietăți hidrofile (de la reziduul 21 la reziduul 26) ,
caracterul amfifil al Melitinei făcând -o solubilă în apă. În prezența membranelor lipidice
34 (artificiale sau naturale) Melitina se asociază cu acestea (Dempsey, 1990 ; Sansom, 1991 ; Saberwal
și Nagaraj, 1994 ).
Figura 4.1 Melitina
(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/16133648 ).
Melitina are un caracter preponderent hidrofob, similar cu al altor peptide și proteine care
prezintă afinitate ridicată pentru membranele lipidice. Melitina are sarcina netă +6 |e| la pH
fiziologic, patru dintre aceste sarcini, KRKR, fiind aliniate către capătul C-terminal, puternic bazic,
iar celelalte două fiind poziționate către capătul N-terminal, K -7 și G -1. Distribuția asimetrică a
aminoacizilor polari și apolari conferă Melitinei un caracter amfipatic , atunci când structura
secundară a acesteia este α-helix (Dathe și Wieprecht, 1999 ). În soluții apoase, la concentrații mici,
Melitina adoptă în soluție o structură de tip elice dezordonată (“ random coil ”) dar, sub influen ța
unor factori fizico -chimici, aceasta adoptă o structură de tip α-helix , tetrameri că (Dempsey, 1990 ).
În soluții apoase, monomerii de Melitină agregă într -o structură tetram erică în urma creșterii
concentrației de sare din soluție, a pH -ului sau în urma creșterii concentrației peptidei. A fost
demonstrat, prin intermediul spectroscopiei de fluorescență, ca Melitina se g ăsește sub formă
monomerică în soluții cu salinitate scăz ută (Quay și Condie, 1983 ; Raghuraman și Chattopadhyay,
2006 ). Tetramerizarea apare, la pH neutru, atunci când concentrația peptidei sau tăria ionică a
soluției sunt mari (Faucon și colab., 1979 ; Talbot și colab., 1 979; Raghuraman și Chattopadhyay,
2006 ). Trecerea de la monomer la tetramer a fost raportată pentru concentrații mici de peptidă în
condiții de pH ridicat (Knoppel și colab., 1979 ), dar și ca fiind dependentă de temperatură (Wilcox
și Eisenberg, 1992 ; Iwadate ș i colab., 1998 ). Agregarea (autoasocierea) Melitinei în soluții apoase
este un fenomen complex și este direct corelată cu concentrația acesteia și prprietățile fizico –
35 chimice ale soluției , care la rândul lor , au efect asupra interacțiilor hidrofobe, elec trostatice și
dipolare care apar la capătul N-terminal al Melitinei (Demchenko, 1988 ; Chattopadhyay, 2003 ;
Geddes și Lakowicz, 2004 ; Raghuraman și Chattopadhyay, 2006 ).
Dimensiunile mici și disponibilitatea acesteia face ca Melitina să fie una dintre cele mai
potrivite peptide pentru investigarea interacțiilor lipide -proteine la nivel molecular (Dempsey,
1990 ), utilizând o mare varietate de metode și tehnici de biof izică (Raghuraman și Chattopadhyay,
2007 ). Melitina se asociază rapid cu membranele formate din PC , în timpi de ordinul
milisecundelor (Schwarz și B eschiaschvili, 1989 ; Sekharam și colab., 1991 ; Constantinescu și
Lafleur, 2004 ), avân d un coeficient de partiție ( KP), din faza apoasă în bistratul lipidic , de ⁓ 10-3 –
10-5 M-1 (Schwarz și Beschiaschvili, 1989 ; Beschiaschvili și Baeuerl e, 1991 ; Mozsolits și colab.,
2001 ; Kriech și Conboy, 2003 ).
În literatura de specialitate există numeroase studii în care este investigată int eracția dintre
Melitină și sisteme care mimează membrana lipidică (micelii, micelii inversate și lipozomi), toate
acestea ducân d la concluzia că Melitina adoptă o structură tip α-helix în prezența acestora
(Dempsey și Butler, 1992 ; Weaver și colab., 1992 ; Bismuto și colab., 1993 ; Ghosh și colab., 1997 ;
Ladokhin și White, 2001 ; Yang și colab., 2001 ; Raghuraman și Chattopadhyay, 2003 ; Raghuraman
și Chattopadhyay, 2004a ; Raghuraman și Chattopadhyay, 2004b ; Raghuraman și Chattopadhyay,
2004c ; Raghuraman și Chattopadhyay, 2006 ). Este recunoscut faptul că Melitina interacționează
selectiv cu membranele (Ghosh și colab., 1997 ; Sheynis și colab., 2003 ), având o afinitate mult
mai mare pentru lipidele care prezintă sarcini negative în zona c apetelor polare (Batenburg și
colab., 1988 ; Lee și colab., 2001 ).
Orientarea Melitinei în membrane este dep endentă de concentrația ei în soluție, de
compoziția lipidică și de condițiile fizice în care se află bistratul lipidic. La concentrații mici, petida
este orientată paralel cu planul membranei, trecând la o orientare per pendiculară față de acesta
odată cu creșterea concentrației, așa cum este explicat în modelul de acțiune în doi pași al
peptidelor antimicrobiene (Huang, 2000 ). Orientarea α-helix -ului de Melitină este dependentă ,
deasemenea , și de alte proprietăți ale bistratului lipidic: hidratarea, temperatura și faza (gel sau
cristal lichid) în care acesta se găsește (Vogel, 1987 ; Frey și Tamm, 1991 ; Toraya și colab ., 2004 ).
În anumite condiții de temperatură, pH, tăria ionică a soluției, compoziția lipidică și raportul lipde –
36 peptide, Melitina inserată în bistrat formează agregate care duc la formarea porilor
transmembranari (Raghuraman și Chattopadhyay, 2007 ).
4.2 Indolicidin a
Indolicidin a a fost izolat ă, prima oară , în 1992 din granulocite le citoplasmei neutrofile lor de
bovină (Selsted și colab., 1992 ). Structura sa primară este deosebită (ILPWKWPWWPWRR ),
structura 2D a Indolicidin ei putându -se observa în Figura 4.2, datorită compoziției sale: Triptofan
(cinci reziduuri), Prolină (trei reziduuri) și Arginină (două reziduuri).
Figura 4.2 Indolicidinul
(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/16129733 ).
Sarcina netă a Indolicidin ei la pH fiziologic este +4 |e|, ace asta având u n puternic caracter
hidrofob, datorat în cea mai mare parte reziduurilor de Triptofan prezente în structura primară
(Falla și colab., 1996 ). Acestea fac din Indolicidin ă un bun candidat la studierea interacțiilor
peptidă -lipid, el interacționând cu un spectru mare de membrane cu diferite compoziții lipidice.
Atunci când Indolicidin a se află liber ă în soluție sau adsorb it la nivelul bistratului, structura
secundară a acestuia este una dezordonată (Ladokhin și colab., 1997 ). Cele cinci reziduuri de
Triptofan oferă posibilitat ea explor ării funcției îndeplinite de acest reziduu la inserarea proteinelor
în membrane (Wimley și White, 1993 ).
Indolicidin a se asociază atât cu membranele lipidice obținute din lipide neutre, cât și cu cele
obținute din lipide anionice. Partiția peptidei în bistrat este puternică, dar reversibilă, pentru
ambele tipuri de membrane (Ladokhin și colab., 1997 ). Atunci când peptida interacționează cu
37 membrane obținute din lipide ce prezintă sarcini negative în zona capetelor polare (PG), spre
deosebire de interacția cu c ele obținute din lipide neutre (PC) , spectrul de fluorescență al acesteia
prezintă o deplasare mai mare către albastru, dar cu o eficiență cuantică mai mică. Aceste diferențe
între spectrele de fluorescență pentru cele două tipuri de membrane se pot datora structurii pe care
o adoptă Indolicidin a atunci când interacționează cu acestea, a interacțiilor ce apar între lipide și
peptidă sau o combinație a acestora (Ladokhin și colab., 1997 ).
Utilizând tehnica AFM s -a arătat că Indolicidin a produce o subțiere a bistratului lipidic în
regiunea de interacție (Mecke și colab., 2 005; Shaw și colab., 2006 ; Shaw și colab., 2008 ). Aceste
rezultate experimentale sunt în concordanță cu simulările de dinamică moleculară care s -au
efectuat pentru interacția dintre Indolicidin ă și membranele lipidice model (Hsu și Yip, 2007 ;
Khandelia și Ka znessis, 2007 ; Neale și colab., 2014 ).
Indolicidin a are efect bacteriostatic și bactericid împotriva tulpinilor Gram -negative și
Gram -pozitive (Selsted și colab., 1992 ; Shi și colab., 1996 ; Subbalakshmi și Sitaram, 1998 ;
Bacalum și colab., 2017 ). Microorganismele tratate cu Indolicidin ă capătă o formă alungită, form ă
care su gerează faptul că acestea și -au pierdut capacitatea de diviziune celulară. În plus, bacteriile
Escherichia coli tratate cu Indol icidin ă prezintă diverse structuri filamentoa se la nivelul
membranei (Shi și colab., 1996 ; Subbalakshmi și Sitaram, 1998 ). În concentrații de 100 µg/mL
Indolicidin a inhibă sinteza acizilor nucleici (A DN și ARN) în Escherichia coli , iar în concentrații
> 150 µg/mL este afectat și mecanismul de sinteză proteică (Subbalakshmi și Sitaram, 1998 ). În
concentrații mici, Indolicidin a produce permeabilizarea membranei externe la Escherichia coli
(Falla și colab., 1996 ; Subbalakshmi și colab., 1996 ) formând canale ionice, așa cum a reieșit din
măsurătorile de conductanță efectuate pe bistrat uri lipidice planare (Falla și colab., 1996 ; Wu și
colab., 1999 ). Indolicidin a prezintă , de asemenea , activitate antifungică (Ahmad și colab., 1995 )
și vermicidă (Aley și colab., 1994 ).
Indolicidin a este citotoxic ă pentru lim focitele T de șobolan și umane (Schluesener și colab.,
1993 ), produce hemoliză (Ahmad și colab., 1995 ; Bacalum și colab., 2017 ) și prezintă activitate
împotriva virusului HIV -1 (Robinson și colab., 1998 ).
38 4.3 Cecropina P1
Cecropina P1 este o peptidă antimicrobiană de origine animală, izolată din intestinul subțire
al porcinelor (Lee și colab., 1989 ), fiind produsă de un vierme parazit A. suum . Familia
Cecropinelor, din care fac e parte și Cecropina P1, sunt AMP încărcate pozitiv, ce permeabilizează
membranele bacteriene. Structura primară a Cecropinei P1 este formată din 31 de resturi de
aminoacizi (SWLSKTAKKLENSAKKRISEGIAIAIQGGPR, structura 2D a Cecropinei P1
putându -se observa în Figura 4.3).
Figura 4.3 Cecropina P1
(https://pubchem.nc bi.nlm.nih.gov/compound/16130477 ).
Structura secundară adoptată de Cecropina P1 în soluții apoase, determinată prin tehnica 2D
NMR, este de tip α-helix amfifil alungit, aproximativ pe toat ă lungimea moleculei (Sipos și colab.,
1992 ). S-a propus , în urma studiilor de dinamică moleculară, că zona din peptidă care conține
39 resturile de aminoacizi -SEG – poate fi o zonă flexibilă a acesteia, capătul C -terminal având caracter
hidrofob și cel N -terminal fiind puternic încărcat electric (Gazit și Shai, 1993 ; Gazit și colab.,
1994a ; Gazit și colab., 1995 ).
Cecropina P1 are sarcina netă +5 |e|, și prezintă afinitate pentru membranele lipidice cu
caracter acid. La interacția cu membranele lipidice artificiale , această peptidă formează un
monostrat care, la atingerea unei concentrații limită, afectează împachetarea laterală a lipidelor
(Gazit și colab., 1994b ; Gazit și colab., 1995 ). Datele obținute pentru interacția Cecropinei P1 cu
diverse tipuri de membrane lipidice (Gazit și colab., 1995 ) sugerează că aceasta respectă
mecanismul de interacție “ carpet -like”, asemănător cu cel propus pentru o altă peptidă
antimicrobiană, Dermaseptin a (Pouny și colab., 1992 ). Acest mecanism de interacție are loc în
patru etape: (i) monomerii de peptidă se leagă preferențial la capetele polare ale lipidelor ce
prezintă sarcină negativă, (ii ) alinierea monomerilor de peptidă la suprafața membranei, cu
porțiunile amfipatice ale α-helix -ului, reziduurile cu caracter bazic, interacționând cu capetele
încărcate ale lipidelor sau cu moleculele de apă, (iii) reorientarea (rotirea) moleculei, astfel încât
reziduurile hidrofobe ajung în zona hidrofobă a bistratului lipidic și (iv) dezintegrarea unor porțiuni
de membrană care apar datorită afectării împachetării laterale a lipidelor.
Cecropina P1, la fel ca cecropinele izolate din insecte, produce liza peretelui celular al
bacteriilor, în funcție de concentrația peptidei (Westerhoff și colab., 1989 ; Boman și colab., 1993 ;
Matsuzaki și colab., 1994 ). Această AMP are efect bactericid asupra tulpinilor E. coli D21,
Bacillus megaterium Bml1, Acinetobacter calcoaceticus Acl1 și Pseudomonas aeruginosa OT97
(Gazit și colab., 1995 ).
Cecropina P1 a prezentat și activitate antivirală, la teste desfășurate in vitro , împotriva
virusului necrozei hematopoietice infecțioase, a virusului septicemiei hemoragice virale, a
virusului necrozei pancreatice infecțioase (Chiou și colab., 2002 ; Chiou și colab., 2014 ) și a
virusului care produce sindromul respirator și reproductiv la porcine (Guo și colab., 2014 ).
4.4 Structur ile peptidice atimicrobiene nou sintetizate
Structurile peptidice nou sintetizate (P1 – P8, Tabelul 4.1 (Bacalum și colab., 2017 )) au avut
ca punct de plecare peptida Octa 2 (RRWWRWWR), o peptidă cu un puternic efect antimicrobian,
40 bogată în succesiunea de reziduuri -RW- (Strom și colab., 2002 ). Ca structură de pornire s -a utilizat
o formă modificată a Octa 2 (P5: RRWWRWWRR), adăugându -se în capătul C -terminal al
acesteia încă un reziduu de Arginină, pentru creșterea afinității acesteia pentru membrane
(Deslouches și colab., 2013 ).
Tabelul 4.1 Carac teristici fizico -chimice pentru peptidele nou
sintetizate .
Peptida Secvența Masa
moleculară
[g/mol ] Numărul de reziduuri
de triptofan (W) Sarcina netă la
pH neutru
P1 RRWWRHWRR 1493.75 3 +6|e|
P2 RRWHRWWRR 1493.75 3 +6|e|
P3 RRHWRWWRR 1493.75 3 +6|e|
P4 RRWHRHWRR 1444.68 2 +6|e|
P5 RRWWRWWRR 1542.82 4 +6|e|
P6 HRWWRWWRR 1523.78 4 +5|e|
P7 RRWWHWWRR 1523.78 4 +5|e|
P8 HRWWRWWRH 1504.73 4 +4|e|
Notă: Datele prezentate în acest tabel au fost preluate din (Bacalum și colab., 2017 )
Modificând secvența lui P5 , prin înlocuirea aminoacizilor Triptofan (W) sau Arginină (R)
cu Histidină (H), au fost generate alte șapte structuri peptidice. Înlocuirea s -a făcut ținând cont de
de influența asupra următorilor parametri: sarcina netă, care a variat între +4 |e| și +6 |e|, și num ărul
de reziduuri de Triptofan din structura primară, între 2 și 4 reziduuri. Astfel , s-au obținut structuri
cu același număr de reziduuri de aminoacizi, dar cu diferite sarcini nete și număr diferit de
reziduuri de Triptofan, rezultând în acest fel structuri cu hidrofobicitate diferită.
Pentru testa rezultatul înlocuirii reziduurilor W sau R cu H , pentru cele opt AMP au fost
testate, in vitro , efectele bacteriostatice și bactericide asupra tulpinilor Gram -negative și Gram –
pozitive , dar și citotoxicitatea împotriva celulelor mononucleare din sângele periferic cât și
proprietățile hemolitice (Bacalum și colab., 2017 ).
Peptidele P1 – P8 au fost sintetizate folosind tehnica de sinteză pe suport solid, SPPS (Solid
Phase Peptide Synthesis) (Chan și White, 1999 ), în cadrul Centrului de Chimie Organică
Suopramoleculară și Organometalică, Grupul de Chimie Organică de la Universitatea Babeș –
Bolyai, Cluj Napoca.
41 5 Materiale și metode
5.1 Prepararea solu ției tampon fosfat salin
Pentru prepararea tamponului fosfat salin – PBS, s-au folosit urm ătoarele substanțe , în
cantitățile precizate în continuare:
– Fosfat disodic (Na 2HPO 4·2H2O), m = 1.44 g;
– Fosfat monopotasic (KH 2PO 4), m = 0.24 g;
– Clorură de sodiu (NaCl), m = 8 g;
– Clorura de potasiu (KCl), m = 0.2 g.
Substanțele precizate anterior se dizolvă în 900 mL apa ultrapură, pe o plită cu agitator
magnetic. Dup ă dizolvare, se verifică pH -ul soluției astfel obținute, acesta trebuind sa fie în jur de
7.4. Se pot face mici ajustări ale pH -ului utilizân d soluții concentrate de HCl (pentru a -l scădea)
sau NaOH (pentru a -l crește). În final , se adaug ă încă 100 mL de apa ultrapur ă.
PBS-ul astfel obținut are pH = 7.4, concentrația de fosfat de 10 mM, concentrația de NaCl
de 137 mM și de KCl de 2.7 mM.
5.2 Prepararea solu țiilor stoc de substan țe fluorescente
Soluția stoc de Laurdan (Invitrogen/Molecular Probes, Eugene, OR, USA) a avut o
concentrație de 100 µM, acesta fiind dizolvat în DMSO. Pentru experimentele din Capitolul 6,
unde una dintre direcțiile e xperimentale a fost înregistrarea spectrelor de fluorescență ale
Laurdanului în diverși solvenți, utilizând graficul din Figura 4.1, pe ntru solvenții imiscibili cu
DMSO -ul, s-a utilizat o soluție stoc de Laurdan dizolvat în etanol, la aceeași concentrație c u aceea
a soluției preparate în DMSO.
42
Figura 5.1 Graficul miscibilității diferiților solvenți .
(https://www.chromacademy.com/lms/sco5/So lvent_Miscibility_Chart.pdf ).
Pentru prepararea soluțiilor stoc de standarde de fluorescență au fost utilizate substanțele din
Tabelul 4.1. Pentru dizolvarea NATA și L -Triptofan -ului s -a utilizat PBS . Indol -ul a fost dizolvat
în apă iar PPO -ul și p-Terfenilul -ul au fost dizolvate în alcool etilic . Concentrațiile finale ale
soluțiilor stoc se reg ăsesc în ultima coloană a tabelului următor.
43 Tabelul 5.1 Caracteristici fizico -chimice pentru standardele de
fluorescență utilizate .
Peptida Masa moleculară
[g/mol ] Coeficientul molar de
extincție la λ = 280 nm a
[M-1cm-1] Concentrația finală a
soluțiilor stoc de peptide
[mM]
Indol 117.15 4950 1
NATA 245.28 5150 1
PPO 221.25 18350 10
p-Terfenil 230.31 32900 10
L-Triptofan 204.23 5500 1
a (Gauglitz și colab., 2014 )
Structurile chimice pentru substantele din Tabelul 5.1 se pot observa în Figura 5.2.
A
B
C
D
E
Figura 5.2 Structur ile molecular e ale standardelor de fluorescență .
A – Indol , B – NATA , C – PPO, D – p-Terfenil , E – L-Tripofan .
44 5.3 Prepararea solu țiilor stoc de peptide
Toate peptidele utilizate în cadrul experimentelor: Melitina, Cecropina P1, Indolicidin
(Bachem, Budendorf, Switzerland) și P1 – P8 (Universitatea “Babeș -Bolyai”, Cluj Napoca ), sub
forma de pudr ă liofilizat ă, au fost dizolvate în PBS. Concentrațiile soluțiilor stoc de peptide au fost
determinate spectrofotometric pe baza datelor din Tabelul 4.2, acestea regăsindu -se în ultima
coloană a tabelului .
Tabelul 5.2 Caracteristici fizico -chimice pentru peptidele utilizate .
Peptida Masa moleculară
[g/mol ] Coeficientul molar de
extincție la λ = 280 nm
[M-1cm-1] Concentrația finală a
soluțiilor stoc de peptide
[µM]
Melitinaa 2846.50 5500 351.5
Cecropina P1b 3338.90 5500 150.0
Indolicidinb 1906.32 27500 210.0
P1c 1493.75 16500 67.2
P2c 1493.75 16500 140.0
P3c 1493.75 16500 98.7
P4c 1444.68 11000 85.6
P5c 1542.82 22000 79.0
P6c 1523.78 22000 153.0
P7c 1523.78 22000 167.7
P8c 1504.73 22000 165.3
a – (Raghuraman și Chattopadhyay, 2004c )
b – (http://www.antistaphybase.com )
c – (Bacalum și colab., 2017 )
5.4 Prepararea veziculelor unilamelare
Lipidele utilizate la prepararea veziculelor unilamelare mari (LUV) folosite în cadrul
experimentelor din aceast ă lucrare sunt: DOPC: 1,2 -dioleoil -sn-glicero -3-fosfocolin ă (Sigma –
Aldrich) , PC13: 1,2 -ditridecanoil -sn-glicero -3-fosfocolin ă, DMPC: 1,2 -dimyristoyl -sn-glycero -3-
fosfocolină , DPPC: 1,2 -dipalmitoil -sn-glicero -3-fosfocolin ă, DSPC: 1,2 -distearoil -sn-glicero -3-
45 fosfocolină (Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL, USA) , DPPG: 1,2 -dipalmitoil -sn-glicero -3-
phospho -(1'-rac-glicerol) (Na+) (Sigma -Aldrich).
A
B
C
D
E
F
Figura 5.3 Structur ile molecular e ale lipidelor utilizate în
experimente .
A – DOPC ; B – PC13 ; C – DMPC ; D – DPPC ; E – DSPC ; F – DPPG .
În experimentele în care s -a monitorizat fluorescența Laurdanului, pentru dezvoltarea
modelului de analiză a spectrelor de fluorescență cu funcții asimetrice, s -au utilizat pentru
prepararea LUV -urilor următoarele lipide: PC13, DMPC, DPPC și DSPC , concentrația finală a
lipidelor în suspensia de lipozomi fiind de 50 µM.
46 În experimentele în care s-a monitorizat stingerea fluorescenței Triptofanului și modificările
induse de AMP -uri la nivelul membranelor lipidice s-au utilizat pentru prepararea LUV -urilor
următoarele lipide: DOPC și DOPC:DPPG , în raport molar 85:15, concentrația finală a lipidelo r
în suspensia de lipozomi fiind de 50 µM.
În experimentele în care s -au monitorizat modificările din spectrele de fluorescență ale
Triptofanului, apărute în urma titrării soluției de peptidă cu fracții egale dintr -o soluție concentrată
de lipozomi, au fos t folosiți lipozomi preparați din DOPC și DOPC:DPPG , în raport molar 85:15 ,
concentrați lipidic ă a suspensiei inițiale fiind de 12.5 mM.
Lipozomii (LUV) au fost preparați prin metoda extrudării, această metodă constând , pe scurt,
din urătoarele operații:
– cantitatea necesară de lipide dizolvate în cloroform (12,5 mg/mL) a fost amestecată și
uscată în flux de azot;
– filmul de lipide format a fost hidratat cu PBS, încălzit la o temperatură mai mare decât
temperatura de tranziție a lipidelor – Tm și agitat puternic; în urma acestor operațiuni a
rezultat o suspensie de lipozomi multilamelari (MLV);
– suspensia obținută a fost supusă la 5 cicluri de îngheț -dezgheț și apoi extrudată (20 de
treceri), printr -un filtru de policarbonat cu dimensiunea porilor de 200 nm, într -un
extruder standard (Avanti Polar Lipids, Alabastre, AL, USA); extrudarea s -a efectuat la
o temperatură mai mare dec ât Tm.
În final, a rezultat o suspensie de lipozomi unilamelari (LUV) , cu diametrele în jurul valorii
de 200 nm.
47 5.5 Metode de sp ectroscopie utilizate
Pentru realizarea obiectivelor din prezenta lucrare, au fost utilizate trei tehnici de
spectroscopie , frecvent folosite în experimentele de biofizică.
5.5.1 Spectroscopia de absorb ție UV-VIS
Măsuratorile de spectroscopie de absorbție s -au efectuat utilizând un spectrofotometru UV –
VIS-NIR, model Jasco V -770 (Jasco International Co., Ltd., Hachioji, Tokyo, Japan) , echipat cu
suport de cuve cu 6 poziții , cu termostat Peltier și agitator magnetic. Înregistrarea spectrelor de
absorbție s -a făcut folosind cuve de quartz de 3 mL, cu dimensiunile laturilor de 10 mm x 10 mm,
la o viteză de scanare de 200 nm/min, fanta monocromatorului fiind de 1 nm. Temperatura în cuvă
a fost de 25 °C, suspensiile fiind în continuu agitate magnetic, la o viteză de rot ație de 120 rot/min.
Pentru toate spectrele înregistrate a fost aplicată corecția pentru linia de bază ( baseline ).
Experimentele de spectroscopie UV -VIS efectuate pentru realizarea obiectivelor prezentei
lucrări au urmărit două direcții.
Pe de -o parte s -a monitorizat absorbanța soluțiilor stoc utilizate în cadrul experimentelor, în
vederea determinării concentrației acestora , utiliz ând ecuația (6.1) și coeficienții de extincție
molar ă din Tabelul 5.1, pentru standardele de fluorescență și din Tabelul 5.2, pentru soluțiile stoc
de peptide și coeficientul molar de extincție al acrilamidei (ε = 0.23 M-1cm-1) la lungimea de undă
λ = 295 nm (Eftink și Ghiron, 1976 ). Spectrele de absorbție au fost înregistrate în intervalul de
lungimi de undă λabs ∈ [250, 500] nm.
Cealaltă direc ție a măsurătorilor de spectroscopie UV -VIS a urm ărit monitorizarea
absorbanței suspensiilor de lipozomi simpli în intervalul de lungimi de undă λ abs ∈ [350, 600] nm,
pentru experimentele în care s -a analizat fluorescența Laurdanului, și a absorbanței lipozomilor
aflați în prezența acrilamidei în intervalul de lungimi de undă λ abs ∈ [250, 500] nm , pentru
experimentele î n care s -a analizat fluorescența Triptofanului . Pentru acest tip de experimente , s-a
urmărit obținerea unei absorbanțe a suspensiilor < 0.05, în caz contrar fiind necesare corecții ale
spectrelor de emisie fluorescentă pentru compensarea fenomenului de “in ner-filter effect”
(Lakowicz, 2006 ).
48 5.5.2 Spectroscopia de fluorescen ță static ă
Înregistrările spectrelor de emisie fluorescentă s -au facut cu ajutorul unui fluorimetru
FluoroMax 3 (Horiba Jobin Yvon, New Jersey, NJ, USA) echipat cu termostat cu element Peltier
și agitator magnetic . Pentru măsurarea suspensiilor s -a folosit o cuvă de quartz de 3 mL, cu
dimensiun ile laturilor de 10 mm x 10 mm . Pentru fiecare înregistrare a fost aplicată spectrului de
fluorescență corecția spectrală a fotomultiplicatorului.
În experimentele î n care s -a monitorizat fluorescența Laurdanului, l ungimea de undă de
excitație a fost λ ex = 378 nm, iar spectrele de emisie au fost înregistrate în intervalul
λem ∈ [400, 600] nm, fanta monocromatorului fiind de 3 nm (excitație/e misie). Contribuția
spectrală a lipozomilor simpli a fost scăzută din fiecare spectru de emisie. Spectrele de emisie
fluorescentă a Laurdanului inserat în lipozomi au fost înregistrate la diverse temperaturi, alese
astfel încât să acopere plaja de temperat uri în care să se poată reg ăsi, separat, cele dou ă faze ale
bistratului lipidic (cel puțin trei repetiții pentru fiecare tip de lipid).
În experimentele în care s -a monitorizat stingerea fluorescenț ei triptofa nului, lungimea de
undă de excitație a fost λ ex = 295 nm, iar spectrele de emisie au fost înregistrate în intervalul
λem ∈ [310, 500] nm, fanta monocromatorului fiind de 3 nm (excita ție/emisie). Contribu ția
spectral ă a lipozomilor simpli și a lipozomilor în prezența sting ătorului (acrilamida) a fost sc ăzută
din fiecare spectru de emisie.
În experimentele în care s -au monitorizat modificările din spectrele de fluorescenț ă ale
triptofanului , apărute în urma titrării soluției de peptidă cu fracții egale dintr -o soluție concentrată
de lipozomi , lungimea de undă de excitație a fost λ ex = 285 nm, iar spectrele de emisie au fost
înregistrate în intervalul λem ∈ [300, 500] nm, fanta monocromatorului fiind de 3 nm
(excita ție/emisie).
5.5.3 Spectroscopia de fluorescen ță rezolvat ă în timp
Măsur ătorile de timp de viață a fluorescenței s -au făcut cu ajutorul unui spectrofluorimetru
”home made” construit în jurul unei plăci de achiziție TimeHarp 200 – TCSPC (PicoQuant,
Germania). Toate componentele opto -mecanice au fost achiziționate de la Thorlabs (Thorlabs,
German ia). Ca sursă de excitație a fost utilizat un LED cu funcționare în impulsuri , cu lungimea
49 de undă λem = 280 nm și FWHM ≈ 600 p s, tip PLS 8 -2-363 (PicoQuant, Germania) , controlat de
un generator de impulsuri , tip PDL 800 -D, la o rată de repetiție a impulsu rilor de 10 MHz
(PicoQuant, Germania). Toate probele au fost măsurate într -o cuvă de cuarț de 10 mm x 10 mm,
într-un suport de probă termostatat , echipat cu agitator magnetic. Termostatul Peltier, tip 5R7 -001,
cu interfață RS232 și software de control spec ializat , a fost achiziționat de la Oven Industries
(Oven Industries, PA, SUA). Acest fluorimetru este , de asemenea , echipat cu prisme de polarizre
Glan -Taylor (Thorlabs, Germania) , detașabile , pentru a măsura fluorescența probelor la unghi
magic și / sau anizotropia timpilor de viață a fluorescenței . Ca detector de fluorescență se utilizează
un fotomultiplicator tip PMA 182 -P-M (PicoQuant, Germania). Pe calea de emisie ,
spectrofluorimetrul are un schimbător automat de filtre cu 6 poziții. Filtrele uilizate în cadrul
experimentelor efectuate au fost:
– Filtre tip trece -band ă: XHQA330 (330 nm, FHWM 10 nm), XHQA340 (340 nm, FHWM
10 nm), XHQA350 (350 nm, FHWM 10 nm);
– Filtru tip trece -sus: XUL0325 (UV 325 nm).
Pentru experimentele efectuate pentru calibrarea și ver ificarea spetrofluorimetrului,
experimente în care s -au utilizat standardele de fluorescență precizate în subcapitolul 4.2, au fost
utilizate toate cele patru filtre de emisie .
Pentru experimentele în care s -a monitorizat stingerea fluorescenței și partiți onarea AMP în
bistratul lipidic , s-a utilizat numai filtrul de emisie tip trece -sus.
Pentru înregistrarea profilului pulsului de lumină generat de sursa de extitație s -a înregistrat
IRF-ul utilizând o solu ție de dioxid de siliciu coloidal – LUDOX (Sigma -Aldrich) , lumina
împraștiat ă fiind colectată direct de fotomultiplicator (niciun filtru interpus pe calea de emisie).
5.6 Prelucra rea datelor
Spectrele de absorbție UV -VIS, spectrele de fluorescență static ă și rezultatele obținute în
urma prelucrării spectrelor de fluorescență rezolvată în timp au fost prelucrate și analizate utilizând
pachetul software OriginPro 2016 (OriginLab Corporation, Northampton, MA, USA).
Pentru analiza spectrelor de fluorescență rezolvată în timp a fost utilizat pachetul software
FluoF it (PicoQuant, Germania).
50 Pentru analiza spectrelor de fluorescență statică cu ajutorul funcțiilor asimetrice au fost
folosite pachetele software Fityk 0.9.8 (http://fityk.nieto.pl ) și MatLab R2016b (MathWorks,
Natick, MA, USA).
Pentru generarea structurilor chimice a fost utilizat pachetul software ChemOffice 2015
(PerkinElmer, PerkinElmer Informatics, Inc.).
51 6 Realizarea și optimizarea func ționarii
aranjament ului experimental pentru TRF
Introducere
Măsurătorile de fluorescență rezolvată în timp sunt, la momentul actual, larg utilizate în
spectroscopia de fluorescență, atât în studiul macromoleculelor biologice cât și în imagistica
celulară. Acest tip de măsurători of eră mai multe informații decât măsurătorile de fluorescență
statică.
Rezultatele descrise în cadrul acestui capitol au fost prezentate la Conferința Național ă de
Biofizic ă – Cluj-Napoca, ediția 2016 și la Sesiunea Științific ă Anuală a Facultații de Fizică ,
Universitatea din București – ediția 2017 .
Importan ța măsurării timpului de via ță al fluorescen ței
Să luăm în considerare, de exemplu, o proteină care conține două re ziduu ri laterale de
Triptofan, fiecare cu timpi de viață diferiți. Datorită suprapunerii spectrelor de absorbție și emisie
ale acestor re ziduu ri, obținute prin măsurători de fluorescență statică, nu este, în general, posibil
să se facă o diferență între cele două re ziduuri de triptofan legate de molecula studiată. Însă,
folosind metoda de măsu rare a timpilor de viață , rezultă că cele două re ziduuri au timpi diferiți de
scădere a fluorescenței, aceasta fiind o informație foarte utilă, ducând la în țelegerea modului cum
interacționează cele două re ziduuri de triptofan cu proteina dar și cu celelal te macromolecule din
soluție (Lakowicz, 2006 ).
Situațiile în care măsurătorile de fluorescență rezolvată în timp oferă informații suplimentare
față de cele de fluorescență statică sunt destul de numeroase. Unul dintre aceste cazuri este și acela
când fluorescența rezo lvată în timp face diferența dintre stingerea statică și stingerea dinamică a
fluorescenței. Formarea de agregate în stare fundamentală nu micșorează timpul de viață al
fluorescenței moleculelor rămase libere în soluție, fiind observată numai fluorescența acestora , în
timp ce stingerea dinamică ac ționează asupra întregii populații de fluorofori aflați în stare excitată,
ducând astfel la scăderea timpului mediu de viață.
52 Alte aplicații ale fluorescenței rezolvate în timp sunt studiul transferului rezonant de energie
(FRET) și imagistica celulară de fl uorescență cu rezolvare temporală (FLIM).
6.1 Aranjamentul experimental pentru TRF
La punerea în practică a aranjamentului experimental s -a plecat de la planul original al
fluorimetrului FluoTime 100 (Figura 6.1), produs de firma germană PicoQuant, din două motive:
primul, datorită faptului că majoritatea componentelor (generatorul de impulsuri și LED -urile
folosite la excitare, fotomultiplicatorul folosit la detectarea fluorescenței, placa de captură,
programul de în registrare a spectrelor de scădere a fluorescenței și programul de prelucrare și
analiză a spectrelor) au fost achizi ționate de la firma mai sus men ționată, și al doilea motiv , design –
ul minimalist al fluorimetrului FluTime 100 .
Figura 6.1 Spectrofluorimetrul FluoTime 100 .
(PicoQuant, 2014 ).
53 Conform cu cele expuse mai sus, aranjamentul experimental realizat se compune din:
– suport de cuplare a modulelor LED sau laser;
– sistem mobil (poate fi introdus în calea optică) de selectare a planului de polarizare a
fascic ulului de lumină de excitare ;
– sistem optic fix pentru focalizarea fascic ulului de lumină de excitare;
– compartimentul probei dotat cu agitator magnetic și termostat cu el ement Peltier , controlat
prin intermediul unui software specializat ;
– sistem optic fix pentru focalizarea pe detector a luminii produse în urma fluorescenței;
– sistem mobil (poate fi introdus în calea optică) de selectare a planului de polarizare a
fasci culului de lumină de emisie;
– schimb ător automat de filtre cu software de control specializat ;
– detector (fotomultiplicator);
– placa de achizi ție;
– program de achizi ție a datelor (spectre care înregistrează scăderea în timp a fluorescenței);
– program de analiză a datelor (calculare a timpilor de viață ai fluorescenței).
Figura 6.2 Aranjamentul experimental pentru măsurarea timpului de
viață al fluorescenței .
În continuare , se va prezenta, pe scurt, fie care componentă a instala ției.
54 Accesoriile optice
Toate accesoriile optice, suportul de montare al sursei de lumină (LED sau laser), suporturile
reglabile pentru montarea lentilelor și a prismelor de polarizare, tuburile de legătură, lentilele și
prismele de polarizare, suporturile fixe pentru montarea pe compartimentul probei și
compartimentul probei, schimb ătorul automat de filtre au fost achiziționate de la firma specializată
Thorlabs (www.thorlabs.de), fiind realizate din aluminiu brunat (anodizat).
Detectorul
Detectorul utilizat este un fotomultiplicator de tipul PMA 182 N/M, produs de PicoQuant ,
cu următoarele caracteristici:
– intervalul de lungimi de undă: 185 nm – 820 nm;
– impulsuri parazite (dark counts): < 900 cps;
– lățimea pulsului de ieșire pe ntru un singur electron: 1.5 ns;
– timpul de creștere/descreștere a impulsului de ieșire: 750 ps;
– polaritatea impulsului de ieșire: negativă;
– detectorul este dotat cu obturator comandat electronic, pentru calea optică, acesta fiind
acționat la manevrar ea capacului de la compartimentul probei.
Figura 6.3 Răspunsul spectral al fotomultiplicatorului PMA 182 N/M .
(PicoQuant, 2016 ).
55 Răspunsul spectral al fotomultiplicat orului (curba roșie – trasată ca eficiență de detecție în
funcție de lungimea de undă), în comparație cu alte două tipuri de fotomultiplicatoare, poate fi
observat în Figura 6.3.
Generatorul de pulsuri
Generatorul de pulsuri care comandă LED -urile și, în a celași timp, convertorul
timp-amplitudine este de tipul PDL 800 -D achiziționat de la PicoQuant.
Placa de achiziție și programul de achiziție a datelor
Placa de achiziție folosită este TimeHarp 200, care împreună cu programul de ach iziție a
datelor TimeHarp, formează un sistem complet de măsurare a timpului de viață al fluorescenței, la
o rezolutie < 40 ps/canal.
Schema bloc a plăcii de achiziție și principiul de funcționare al acesteia sunt redate în
Figura 6.4.
A
B
Figura 6.4 Modul de achiziți date bazat pe tehnica TCSPC .
A – schema bloc a unui modul TCSPC . B – principiul de funcționare a unui modul TCSPC.
CFD = discriminator de semnal cu fracție constantă . TAC = convertor tim p-amplitudine .
ADC = convertor analog -digital (Wahl, 2014 ).
56 6.2 Măsurarea timpilor de via ță a fluorescen ței
Pentru verificarea funcționarii corecte a aranjamentului experimental și pentru calibrarea lui
s-au folosit o serie de substanțe fluorescente, utilizate în mod curent ca standarde pentru m ăsurarea
timpului de viaț ă a fluorescenței (Lakowicz, 2006 ; Boens și colab., 2007 ).
Concentrațiile soluțiilor stoc au fost determinate s pectrofotometric, utilizând formula
Beer –Lambert:
𝐴= 𝜀·𝑐·𝑙 (6.1)
unde: A – absorb anța optică a probei, ε – coeficientul molar de extincție la o lungime de undă dată,
c – concentrația molară a cromoforului și l – drumul optic.
Pentru calibrarea aranjamentului experimental standardele au fost utilizate la concentrația
finală de 10 µM. Temperatura de lucru a fost de 20 ° C, probele fiind măsurate cu agitare continuă.
Pentru eliminarea din spectru a oricărui artefact datorat împr ăștierii luminii în probă, a fost
intercalată , pe calea optică de excitare, o prismă de polarizare, utilizată la o înclinare unghiulară
de 35 ,3° față de direcția verticală (Valeur, 2001 ).
Măsurarea timpilor de viață din scăderea în timp a fluorescenței probei , se poate observa în
Figura 5.5 – B, făcută după următorul protocol:
– Probele au fost diluate de la concentrația inițială a solu țiilor stoc la concentrația de lucru
de 10 µM;
– Pentru fiec are înregistrare , s-a utilizat un volum de 3 mL;
– Parametrii pentru înregistrarea fiecarui spectru au fost: nivelul discriminatorului : 50 mV,
nivelul de trecere prin zero : 10 mV, nivelul de declanșare a intrării ”Sync” : -450 mV,
rezoluția spectrului : 40 ps /canal ;
– Pentru fiecare fluorofor s -au înregistrat spectre la lungimile de undă: 330 nm, 340 nm,
350 nm și > 325 nm;
– Pentru fiecare spectru , s-a înregistrat un maxim de 10 .000 de impulsuri pentru canalul
unde s -a înregistrat maximul fluorescenței.
57 A
B
Figura 6.5 Scăderea fluorescenței în timp .
A – IRF; B – scăderea fluorescenței indolului (10 µM) în apă .
58 Pentru fiecare set de experimente (zi de înregistrări) a fost înregistrată la începutul
masurătorilor funcția de răspuns a instrumentului – IRF. Un astfel de spectru este exemplificat în
Figura 6.5 – A.
Pentru verificarea ”sensibilității” aranjamentului experimental , am realizat un al doilea set
de experimente (Kapusta, 2002 ; Wahl, 2014 ), în care concentrația probelor a fost variată între 1
µM și 500 µM (în pași de 1 -2-3-5 µM, cu multiplii corespunzători ), temperatura probelor fiind
menținută constant ă, la 25 °C.
Deoarece temperatura este unul dintre factorii care influențeaz ă emis ia fluorescentă și,
implicit, timpul de viață al fluorescenței, am imaginat și realizat un al treilea tip de experimente,
în acest caz concentrația probelor fiind menținută constantă, la 10 µM, dar variind temperatura
probei, în intervalul (10 – 40) °C, cu pas de 2.5 °C.
Având în vedere că unul dintre obiectivele urmărite în capitolele ce urmează este
determinarea timpului mediu de viață al fluorescenței pentru Triptofan, aflat în structura pepidelor
care fac obiectul experimentelor descrise în Capitolele 7 , 10 și 11, în cadrul experimentelor din
acest capitol , au fost înregistrate și analizate spectrele de sc ădere a fluorescenței pentru
L-Triptofan, în aceleași condiții ca pentru standardele de fluorescență utilizate (setul al doilea și al
treilea de experimente). Timpii de viață , analizați în cadrul acestui capitol , reprezintă timpul mediu
de viață a fluorescenței L -Triptofanului, numeric egal cu suma ponderată dup ă inten sitățile
individuale ale celor doi timpi de viață ai fluorescenței , și reprezintă timpul mediu cât stă
fluoroforul în starea excitată .
6.3 Prelucrarea datelor experimentale
Spectrele experimentale de tipul celor exemplificate în Figura 5.5 au fost prelucrate utilizând
pachetul software FluoFit v4.4 (PicoQuant, Germania), mod elul utilizat fiind reconvoluția
exponențial ă din ecuația (3.7) cu unul (în cazul standardelor) sau doi timpi de viață ai fluorescenței
(în cazul L -Triptofan -ului).
Programul de analiză a datelor, fereastra principală a acestuia fiind redată în Figura 6.6,
generează în urma procedurii de fitare timpul/timpii de viață al/ai fluorescenței, amplitudinea
59 corespunzătoare fiecărui timp de viață rezultat, nivelul de semnal pentru linia de bază
(baseline) corespunzătoare spectrelor IRF și obținut pentru su bstanța fluorescentă analizată.
În plus , față de parametrii amintiți mai sus, în raportul detaliat sunt generați și timpii medii
de viață ai fluorescenței, ponderați dup ă intensitatea și amplitudinea semnalului fluorescent
înregistrat.
Un parametru importa nt în procesul de fitare și în modul de analiză a datelor este χ2(red),
”hi-pătrat redus”, caseta din dreapta sus în Figura 6.6. Pe baza acestui parametru , se estimează
calitatea fit ării. O fitare bună generează un parametru χ2(red) cu valori cuprinse într e 0,9 și
1,5 (valoare a ideal ă ≈1).
Figura 6.6 Fitarea spectrului de scădere exponențială a fluorescenței
indolului .
Timpii de viață ai fluorescenței pentru standardel e utilizate se regăse sc în Tabelul 6.1.
Rezultatele obținute reprezintă media a zece m ăsurători diferite, cu deviațiile standard aferente.
60 Concentrația final ă a soluțiilor analizate a fost de 10 µM și temperatura probei de 25 °C. Aceste
valori sunt comparate cu datele disponib ile din literatura de specialitate.
Tabelul 6.1 Timpii de viață ai fluorescenței pentru standardele
utilizate la calibrarea și verificarea aranjamentului experimental .
Fluorofor 𝝉̅ ± 𝒔𝒅 [ns] 𝝀𝒆𝒎 [nm] 𝝉̅𝑳𝒊𝒕. [ns]
Indol 4.713 ± 0.025 330
4.49a, 3.65 ⁓ 4.95e, f 4.719 ± 0.020 340
4.718 ± 0.022 350
4.713 ± 0.018 > 325
NATA 3.075 ± 0.011 330
3.00a, 2.98b, 3.10c 3.103 ± 0.003 340
3.109 ± 0.008 350
3.087 ± 0.006 > 325
PPO 1.562 ± 0.006 340
1.40a, 1.56b, 1.36 ⁓ 1.65c, f 1.565 ± 0.005 350
1.458 ± 0.043 > 325
p-Terfenil 1.100 ± 0.002 330
1.05a, 0.98 ⁓ 1.17c, f 1.093 ± 0.004 340
1.096 ± 0.007 350
1.066 ± 0.006 > 325
L-Triptofan 2.538 ± 0.166 330
2.626b, 2.45 ⁓ 3.05d, f 2.695 ± 0.038 340
2.936 ± 0.042 350
3.180 ± 0.017 > 325
a – (http://www.iss.com/resources/reference/data_tables/FL_LifetimeStandards.html )
b – (Gerken și Imhof, 2010 )
c – (Boens și colab., 2007 )
d – (Albani, 2009 ; Albani, 2014a ; Albani, 2014b )
e – (Lakowicz, 2006 )
f – aceste valori sunt pentru diferite condi ții fizico -chimice (temperatură, pH, diferite tipuri de solvenți utilizați)
Rezultatele obținute în urma experimentelor pentru verificarea ”sensibilității”
aranjamentului epxerimental se pot observa în Figura 6.7. Trebuie precizat că, pentru condițiile
experimentale disponibile, nu s -a reușit obținerea unui spectru utilizabil (raportul între semnalul
util și impulsurile datorate liniei de baz ă a fost extrem de mic) la prelucrarea datelor pentru emisia
fluorescentă a PPO-ului, la lungimea de und ă de 330 n m.
La stabilirea ”sensibilității” spectrofluorimetrului am utilizat soluții cu concentrați i între
1 µM și 500 µM, în pași de 1 -2-3-5 µM. Temperatura probei a fost de 25 °C. Aceste valori se
regăsesc în Tabelul 6.2.
61
1E-6 1E-5 1E-412345
D CB = 340 nm = 330 nm [ns]
C [M]A
1E-6 1E-5 1E-412345 Indol NATA PPO p-Terph Triptofan [ns]
C [M]
1E-6 1E-5 1E-412345
= 350 nm [ns]
C [M]1E-6 1E-5 1E-412345
> 325 nm [ns]
C [M]
Figura 6.7 Variația timpilor de viață ai fluorescenței cu concentrația de fluorofor
din probă .
Timpii de viață ai fluorescenței înregistrați la diverse lungimi de undă de emisie:
A – λem = 330 nm; B – λem = 340 nm; C – λem = 350 nm; D – λem > 325 nm.
Studierea variației timpilor de viață ai fluorescenței în funcție de temperatura probei , a fost
o consecință a faptului că , inițial , măsurătorile au fost efectuate la temperatura de 25 °C, rezultatele
obținute fiind în mod repetat mai mari decât valorile disponibile în literatura de specialitate. Astfel,
trecând la temperatura de lucru de 20 °C, după obținerea rezultatelor din Tabelul 6.1, am
62 concluzionat că se poate realiza setul de experimente care să pună în evidență variația timpului de
viață cu temperatura.
Tabelul 6.2 Valoarea medie a timpilor de viață ai fluorescenței pentru
toată plaja de concentrații măsurate .
Fluorofor 𝝉̅ ± 𝒔𝒆 [ns] 𝝀𝒆𝒎 [nm]
Indol 4.171 ± 0.006 330
4.166 ± 0.001 340
4.176 ± 0.006 350
4.178 ± 0.005 > 325
NATA 2.865 ± 0.003 330
2.894 ± 0.005 340
2.898 ± 0.005 350
2.842 ± 0.004 > 325
PPO 1.554 ± 0.002 340
1.556 ± 0.003 350
1.434 ± 0.012 > 325
p-Terfenil a 1.111 ± 0.002 330
1.118 ± 0.011 340
1.119 ± 0.009 350
1.078 ± 0.018 > 325
L-Triptofan a 2.240 ± 0.018 330
2.501 ± 0.018 340
2.666 ± 0.010 350
2.836 ± 0.007 > 325
a – Pentru PPO și p -Terfenil au fost excluse valorile timpilor de viață corespunzători ultimelor trei
concentrații
Rezultatele obținute în urma măsurării timpilor de viață ai fluorescenței , ca funcție de
temperatură , sunt expuse în graficele din F igura 6.8.
63 6.4 Discu ții
Așa cum am mai prec izat într -un paragraf anterior, pentru calibrarea și verificarea
aranjamentului experimental de măsurare a timpilor de viață ai fluorescenței , am utilizat patru
fluorofori ce prezintă un singur timp de scădere exponențială a fluorescenței. Acești fluorofori sunt
numiți în practică standarde pentru măsurarea timpului de viață al fluorescenței .
10 15 20 25 30 35 401234567 [ns]
T [oC] = 330 nm
10 15 20 25 30 35 401234567
= 350 nm = 340 nm Indol NATA PPO p-Terph L-Triptofan [ns]
T [oC]A B
C D
10 15 20 25 30 35 401234567 [ns]
T [oC]10 15 20 25 30 35 401234567 > 325 nm [ns]
T [oC]
Figura 6.8 Variația timpilor de viață ai fluorescenței cu temperatura probei .
Timpii de viață ai fluorescenței înregistrați la diverse lungimi de undă de emisie:
A – λem = 330 nm; B – λem = 340 nm; C – λem = 350 nm; D – λem > 325 nm.
64 Dacă analizăm rezultatele din Tabelul 6.1, obținute în acest set de experi mente, putem
observa că timpii de viață sunt în concordanță cu rezultatele din literatură. Există mici diferențe
între aceste rezultate și cele disponibile în literatură, dar acestea pot fi explicate după cum urmează:
– Pentru Indol , valoarile obținute în ex perimente difer ă față de prima valoare de referință
datorită temperaturii de lucru , care nu este precizată, cel mai probabil fiind cu câteva
grade mai mare de 20 °C și faptului că , în aceste experimente , s-a utilizat pe calea de
excitare , o prism ă pentru s electarea planului de polarizare a luminii; pentru valorile din
referința a doua putem spune că rezultatele obținute se încadrează în această plajă de
valori, cu precizarea că valorile din această referință sunt date pentru diferite condiții de
măsură (te mperatură, pH, compoziția solventului, etc.).
– Pentru NATA , valorile difer ă foarte puțin față de primele două valori de referință , cel
mai probabil , datorită diferenței dintre compozițiile tamponului fosfat utilizat în
experimente; de asemenea, penru a doua valoare de referință , se precizează faptul c ă
măsurătorile au fost efectuate f ără a utiliza prisme de polarizare în căile optice de
excitare/emisie.
– Pentru PPO și p-Terfenil , diferențele care apar între rezultatele experimentale și valorile
de referință r egăsite în literatură , sunt datorate în primul rând solvenților utilizați în
timpul măsur ătorilor ; în experimentele din prezenta lucrare s -a utilizat etanol, spre
deosebire de ciclohexan și metanol în lucrarea publicată în 2007 de Boens și colab.
Cu toate că L-Triptofan -ul nu este utilizat ca standard pentru timpul de viață al
fluorescenței, acesta prezentând în practică, în funcție de sistemul analizat, doi timpi (Lakowicz,
2006 ; Gerken și Imhof, 2010 ) sau trei timpi (Lakowicz, 2006 ; Albani, 2009 ; Albani, 2014a ;
Albani, 2014b ) de viață ai fluorescenței, am ales să compar rezultatele obținute cu valorile din
literatură, deoarece în structura peptidelor studiate în capitolele urm ătoare reg ăsim acest
aminoacid. Dacă analizăm rezultatele obținute pentru primul tip de experimente, unde pentru
L-Triptofan , se compar ă timpul de viață mediu obținut cu valorile disponibile în literatură,
observăm că , cea mai mare diferență apare în situația în care emisia fluorescentă este colectată prin
intermediul filtrului trece -sus ( λem > 325 nm ). Aceasta diferență apare deoarece filtrul permite ca
toți fotonii emiși să ajungă la detector, această proprietate fiind utilizată în toate studiile din
Capitol ele 10 și 11.
65 Așa cum se poate observa din Figura 6.7, valorile timpilor de viață sunt distribuite uniform,
pe toată plaja valorilor concentrațiilor, în jurul unei valori medii pentru toate lungimile de undă.
De precizat că , pentru concentrații mari ale flu oroforului, în cazul PPO și p-Terfenil, apare
fenomenul de auto -absorbție, acest fapt ducând la o creștere a timpului de viață al fluorescenței
(Marrodan și colab., 2009 ).
Din analiza datelor experimentale corespunzătoare variației timpilor de viață ai fluorescenței
în funcție de temperatură, reprezentate în graficele din Figura 6.8, a rezultat că timpul de viață al
Indol -ului este cel mai afectat de cr eșterea temperaturii . Pentru ΔT = 30 °C, se observă o variație
a timpului de viață , Δτ ≈ 3.1 ns. Aceasta variație este o indicație a creșterii numărului de interacții
(ciocniri) dintre gruparea cromoforă și moleculele solventului , creștere datorată agitați ei
moleculare , adică datorate creșterii temperaturii .
Așa cum se poate observa din graficele amintite mai sus, cu toate că și în cazul NATA și în
cazul L -Triptofan -ului avem aceeași grupare cromoforă (i.e., inelul indolic ), aceeași diferență de
temperatură afectează , într-o mai mic ă măsură timpul de viață al fluorescenței (acest lucru rezultă
din faptul că valoarea pantei graficelor pentru NATA și L -Triptofan este aproximativ jumătate din
panta graficelor corespunzătoare Indol -ului și Δτ ≈ 1.5 ns pentru NAT A, respectiv Δτ ≈ 1.8 ns
pentru L -Triptofan). Acest fenomen se datorează faptului că, odată cu creșterea complexității
moleculei, num ărul de interacții dintre gruparea cromoforă și moleculele solventului scade.
Interesantă este comporatrea PPO -ului și p -Terfenil -ului, ale căror variații ale timpului de
viață cu temperatura prezintă variații extrem de mici, în cazul p -Terfenil -ului având chiar o
comportare diferită faț ă de ceilalți fluorofori, în sensul că, pentru temperaturi mai mari timpul de
viață crește. Acest comportament este o consecință directă a faptului că cei doi compuși, în afara
utilizării lor ca standarde pentru măsurarea timpului de viață al fluorescenței, sunt utilizați ca
scintilatori lichizi pentru detecția radiațiilor nucleare , atunci când sunt dizolvați în solvenți organici
(Mobius și colab., 1993 ; Iwanowska și colab., 2012 ; Angelone și colab., 2014 ; Ye și colab., 2015 ;
Mark și colab., 2016 ).
66 Concluzii par țiale
În cadrul activităților , descrise în acest capitol , am dezvoltat, conform obiectivelor
urmărite, un aranjament experimental pentru măsurarea timpilor de viață ai fluorescenței.
Spectrofluorimetrul a fost calibrat, din punct de vedere al alinierii tuturor componentelor opto –
mecanice și apoi , verificat, utilizând standarde pentru măsurarea timpului de viață al fluorescenței.
Rezultatele obținute în urma măsurătorilor sunt similare cu cele din literatura de specialitate.
Spectrofluorimetrul poate măsura timpi de viață ai fluorescenței într -o gamă largă a
concentrațiilor (1 µM – 500 µM) fluoroforilor de interes: Indol -ul și derivații acestuia, NATA și
L-Triptofan.
La punerea la punct a metodelor experimentale trebuie ținut cont de faptul că timpul de viață
al fluorescenței este s ensibil la pr oprietățile fizico -chimice ale mediului (solventului) și anume, la
variațiile de temperatură, pH, salinitate a mediului etc.
67 7 Studiul interac ției dintre AMP și
membranele lipidice artificiale utilizând
fluorescența rezolvată în timp
Introducere
Peptidele antimicrobiene – AMP, au fost găsite într -o mare varietate de organisme vii, fiind
utilizate de caătre acestea fie în mod direct, pentru combaterea infecțiilor și a bolilor datorate
diverșilor patogeni, fie ca imuno -modulatori care exercită diferi te funcții în organismul gazdă .
Mecanism ul exact prin care se produce interacția membrană lipidică – AMP este în
continuare intens investigat, fiind pus permanent în dezbatere .
Studiile de biofizică , ce se axea ză pe înțelegerea structurii secundare a pepti delor în
membrane , au arătat că multe dintre acestea prezintă o configurație de tip ” random coil ” în soluție,
dar formează o structură de tip ” α-helix ” atunci când interacționează cu membranele fosfolipidice.
Peptidele pot adopta diferite orientări față de bistratul lipidic: paralel, perpendicular sau oblic față
de planul membranei (Ningsih și colab., 2012 ).
Rezultatele prezentate în cadrul acestui capitol au fost prezentate la Conferința Național ă de
Biofizic ă, Cluj-Napoca – ediția 2016 .
7.1 Interacția dintre AMP și membranele lipidice
formate din DOPC
În cadrul acestui studiu , am urmărit realizarea unei analize comparative, din punct de vedere
al variației timpilor de viață ai fluorescenței, între Melitină, pe de -o parte și trei dint re peptidele
nou sintetizate: P1 – din clasa celor cu trei re ziduuri de Triptofan, P5 – considerat ă peptida de
referință pentru grupul de opt peptide și P8 – din clasa celor cu patru re ziduuri de Triptofan.
68 Ca referință , pentru timpii de viață analizați , am folosit rezultatele obținute pentru timpul de
viață al fluorescenței pentru L -Triptofan, prezentat pe larg în capitolul anterior.
Concentrația finală a peptidelor uilizate în acest studiu a fost de 1 µM, iar a lipidelor (DOPC)
din care au fost formați li pozomii a fost de 50 µM. Protocolul de măsurare a fost următorul:
– Pentru m ăsurarea timpului de viață al fluorescenței pentru situația în care peptida s -a aflat
în PBS, acesta a fost înregistrat la cinci temperaturi diferite în intervalul (10 – 50) °C;
– Pentru m ăsurarea timpului de viață al fluorescenței , atunci când peptida s -a aflat în
prezența lipozomilor, acesta a fost înregistrat în același interval de temperatură, în nou ă
puncte diferite;
– Înainte de înregistrarea timpilor de viață ai fluorescenței amest ecul peptidă -lipozomi a
fost lăsat s ă se echilibreze timp de 30 min. la 25 ° C, la întuneric, cu agitare continuă.
10 20 30 40 501.53.04.5 L-Tiptofan
Melitina
P1
P5
P80 [ns]
T [oC]
Figura 7.1 Variația timpului de viață a reziduurilor de Triptofan
aflate în structura peptidelor analizate .
Înregistrarea timpilor de viață , reprezentați in graficul anterior s-a făcut utilizând filtrul de
emisie cu λ = 350 nm. Pentru fiecare înregistrare, proba a fost lăsată un timp de 10 min. la
temperatura respectivă , pentru atingerea echilibrului termic.
69 Diferențele care apar între timp ul de viață înregistra t pentru Melitină față de cel al L –
Triptofanului , la o anumită temperatură , spre exemplu 20 °C, se datorează faptului c ă Melitina
adoptă, atunci când se află în s oluție, o configurație de tip ” random coil ”, reziduul de Triptofan
aflat în structura Melitinei fiind mai puțin accesibil moleculelor soluț iei tampon (Bello și colab.,
1982 ).
10 20 30 40 501.53.04.5 L-Triptofan
Melitina
Melitina + DOPC0 [ns]
T [oC]A B
D10 20 30 40 501.53.04.5
L-Triptofan
P5
P5 + DOPC L-Triptofan
P1
P1 + DOPC0 [ns]
T [oC]
10 20 30 40 501.53.04.50 [ns]
T [oC]10 20 30 40 501.53.04.5 L-Triptofan
P8
P8 + DOPC0 [ns]
T [oC]C
Figura 7.2 Modificarea timpilor de viață ai fluorescenței în prezența lipozomilor
din DOPC și variația acestora cu temperatura .
Pentru celelalte trei peptide studiate, timpii de viață obținuți, mai mici dec ât ai
L-Triptofanului , sunt o confirmare a faptului că , la nivelul reziduurilor de Triptofan , apar alte două
interacții: pe de -o parte , timpul de viață este afectat de interacțiile fluorofor -fluorofor (Valeur,
70 2001 ; Lakowicz, 2006 ), așa numitul fenomen de auto -stingere (” self quenching ”) și, pe de altă
parte , de prezența reziduurilor de Histidină din structura acestor peptide (Chen și Barkley, 1998 ).
7.2 Discuții
Toate variațiile timpilor de viață obținuți, pentru situația în care peptidele au fost în prezența
DOPC, comparate cu timpii de viață ai fluorescenței , obținuți pentru L -Triptofan , se pot observa
în Figura 7.2.
Așa cum am mai precizat, Melitina adoptă în soluție, la concentrații mici, cum este și cazul
experimentelor de față, o structura de tip ” random coil ” dar, într-o mică fracție, o structură de tip
α-helix (White și colab., 1998 ). Spre deosebire de această situație, atunci când soluția are tărie
ionică mare, pH ridicat sau concentrația peptidei este suficient de mare, Melitina se auto -asociază
într-o structură tetramerică de tip α-helix, ducând la formarea unui nucleu hidrofob al acestei
structuri (Bello și colab., 1982 ; Dempsey, 1990 ; Raghuraman și Chattopadhyay, 2006 ;
Raghuraman și Chattopadhyay, 2007 ). Același tip de structură , α-helix , formează și în situația în
care se găsește legată la membrane de diverse compoziții lipidice (Dempsey, 1990 ; de Jongh și
colab., 1994 ; Ghosh și colab., 1997 ; Raghuraman și Chattopadhyay, 2004b ; Raghuraman și
Chattopadhyay, 2004c ; Raghuraman și Chattopadhyay, 2007 ) sau micelii (Raghuraman și
Chattopadhyay, 2003 ; Raghuraman și Chattopadhyay, 2004a ).
Dacă analizăm rezultatele obținute pentru Melitină , în prezența DOPC (Figura 7.2 – A),
putem observa că, odată cu cre șterea temperaturii la care se află proba, scăderea timpilor măsurați
nu urmează aceeași tendinț ă cu timpii măsurați în situația în care Melitina se afl ă liberă în soluție,
aceștia din urmă având același comportament cu timpii măsurați pentru L -Triptofan. Acest lucru
se datorează faptului c ă membranele formate din DOPC, la temperaturi mai mari, devin mai fluide,
α-helix -ul Melitinei reorientându -se mai în profunzimea nucleului hidrofob al bistratului , datorită
hidrofobicității acestei peptide . Astfel, Triptofanul aflat în structura aces teia este mai pu țin
accesibil moleculelor solventului.
Rezultatel e obținute pentru cele trei peptide, P1, P5 și P8, atunci c ând acestea se găsesc în
prezența lipozomilor din DOPC , pun în evidență faptul că reziduurile de Triptofan din structura
acestora se află localizate la nivelul suprafeței bistratului lipidi c (Yau și colab., 1998 ). Acest lucru
71 rezultă din comportamentul timpilor de viață , atunci când temperatura probei variază, t impii de
viață corespunzători celor trei peptide urm ând aceeași tendință cu aceea a L-Triptofanului, pentru
ambele situații în care regăsim peptida liberă sau în prezența lipozomilor din DOPC. Deoarece
timpii de viață ai fluorescenței sunt mai mari , în cazul măsur ătorilor în prezența lipozomilor , avem
o indicație directă a interacției care apare între peptidele studiate și bistratul lip idic, Triptofanul
interacționând într -o mai mică măsură cu moleculele solventului.
10 20 30 40 501.53.04.5
-5.5 -5.0 -4.5 -4.0 -3.5 -3.0 -2.51.53.04.50 [ns]
G [kcal/mol] P1 P5 P80 [ns]
T [oC]
Figura 7.3 Variația timpului de viață a l fluorescenței reziduurilor de
Triptofan aflate în structu ra peptidelor analizate în prezența
lipozomilor din DOPC .
În figura din dreapta -sus, este reprezentată dependența timpului de
viață, măsurat la 20 °C, în funcție de variația energiei libere Gibbs.
Pe de altă parte, dacă facem o comparație între diferențel e care apar , la oricare dintre
temperaturile de lucru , între timpii de viață ai fluorescenței m ăsurați pentru cele trei peptide în
prezența DOPC , putem face o corelație între valorile acestora și va riațiile energiei libere Gibbs de
partiționare din mediul hidrofil în mediu l hidrofob , reprezentat de interfața membrană lipidică –
solvent . Variațiile e nergie i libere de partiționare pentru cele trei peptide sunt: ΔGP1 = -2.71
72 kcal/mol , ΔGP5 = -5.52 kcal/mol și ΔGP8 = -5.22 kcal/mol, acestea fiind energii teoretic e, calculate
utilizând scala de hidrofobicitate Wimley -White, implementat ă în pachetul software MPEx
(Bacalum și colab., 2017 ). În medalionul din dreapta figurii anterioare , sunt reprezentate valorile
timpilor de viață ai fluorescenței, înregistrați la temperatura de 20 °C, în funcție de variația energiei
libere Gibbs. Observam c ă există o dependență liniară între aceste valori, timpul de viață având
valori mai ma ri pentru variații mai mici ale energi ei libere Gibbs . Astfel, interacțiile mai puternice
dintre peptidă și membrana lipidică p ot fi puse în evidență cu ajutorul acestei tehnici de măsurare.
Concluzii parțiale
În cadrul experimentelor descrise în acest cap itol, am arătat că se poate pune în evidență
interacția dintre AMP și membranele lipidice, constituite din DOPC, m ăsurând timpii de viață ai
fluorescenței Triptofanului, aflat în structura AMP -urilor.
De asemenea, am arătat că timpul de viață măsurat este în directă legătura cu num ărul de
reziduuri de Triptofan din structura AMP și variația energi ei libere Gibbs.
În cazul Melitinei, creșterea temperaturii probei, atunci când aceasta se află în prezența
lipozomilor din DOPC, duce la o mai bun ă inserare a ace steia în bistratul lipidic.
Pentru cele trei AMP -uri nou sintetizate : P1, P5 și P8, atunci când acestea se află în prezența
lipozomilor din DOPC, creșterea temperaturii a dus la scăderea valorilor măsurate pentru timpul
de viață, acestea având același comp ortament ca în situația în care peptidele s -au aflat doar în
soluția de tampon fosfat salin. Acest comporatment este o indicație a faptului c ă reziduurile de
Triptofan sunt localizate la interfața membrană lipidic ă-solvent, fiind parțial expuse moleculelor
acestuia (solventului).
73 8 Evaluarea fluidita ții membranelor lipidice
utilizand fluorescen ța Laurdanului
folosind modelul de analiză cu funcții
asimetrice
Introducere
Descompunerea spectrelor complexe de fluorescență este o problemă esențială în
spectrosco pia analitică . Forma spectrelor de fluorescență este dată de prezența în soluție a mai
multor fluorofori, care emit la lungimi de undă diferite, sau a aceluiași fluorofor prezent în diferite
stări electronice excitate. Spectrele de emisie ale fluoroforilor au o forma asimetrică, chiar și în
soluții omogene, unde se presupune că există o singură populație de molecule care emite. Acest
fapt se datorează diferențelor dintre nivelurile vibraționale ale stării fundamentale și ale primei
stări excitate (Valeur, 2001 ). Soluția pentru analiza acestui tip de spectre este descompunerea lor
în peak -uri elementare de emisie .
În literatura de specialitate , au fost propuse c âteva modele de analiză a spectrelor, cel mai
des utilizat fiind cel cu funcții Gauss și Lorentz , datori tă simetriei, dar au fost propuse și modele
care utilizează funcții asimetrice. Burstein și colaboratorii (2001) au dezvoltat o procedură de
analiză a spectrelor de fluorescență (Burstein și Emelyanenko, 1996 ), pentru o clasă largă de
fluorofori, procedură ce utilizează funcții asimetrice, de tip log-normal (LN) , reprezentate în scala
numerelor de und ă (Siano și Metzler, 1969 ). În particular, acest grup a dezvoltat un algoritm
extrem de robust pentru analiza spectrelor de fluorescență ale Triptofanului din structura
proteinelor (Burstein și colab., 2001 ). Acest procedeu de analiză a fost extins, de același grup, și
pentru Prodan și Acrilodan (Emelyanenko și colab., 2000 ).
În acest capitol , este prezentat algoritmul de descompunere a spectrelor de fluorescență
statică a Laurdanului utilizând funcții de tip LN și aplicațiile acestui algoritm pentru evaluarea
gradului de fluiditate a membranelor lipidice model constituite din diverse tipuri de lipide.
74 Rezultatele prezentate în cadrul acestui capitol au fost prezentate la : Conferința Național ă
de Biofizic ă, Iași – ediția 201 3, Sesiunea de Comunicari Științifice a tinerilor cercetatori din
IFIN -HH – ediția 2013, Conferința ”Analytical and Nanoanalytical Methods for Biomedical and
Environmental Sciences” – IC-ANMBES 2014 și la Sesiunea Științific ă Anuală a Facultații de
Fizică , Universitatea din București – ediția 201 4. De asemenea , rezultatele obținute au constituit
subiect ele a trei articol e științific e, publicat e în revist ele: Optoelectronics and Advanced Materials
– Rapid Communications, Analytical Biochemistry și Romanian Reports in Physics.
Proprietățile Laurdanului inserat în membrane lipidice .
Fluoroforul solvatocromic Laurdan este intens folosit în experimentele care analizează
proprietățile membranelor biologice și artificiale (Parasassi și colab., 1991 ; Bagatolli și colab.,
1999 ; Emelyanenko și colab., 2000 ; Bagatolli, 2006 ). Coada alifatică , așa cum se observă din
Figura 3.5, format ă din 12 atomi de C, îi facilitează acestuia inserarea în membrana lipidică,
considerându -se, în general, că inelul naftalenic ramâne localizat la nivelul glicerolului din
structura lipidelor (Bagatolli, 2006 ; Jurkiewicz și colab., 2006 ), cu momemntul electric de dipol
orientat perpendicular pe planul membranei (Bagatolli și colab., 1999 ; Bagatolli, 2006 ; Sanchez și
colab., 2007 ). Proprietățile fluorescente ale Laurdanului depind de relaxarea moleculelor polare
ale solventului , atunci când acestea se găsesc în proximitatea fluoroforului aflat în stare excitată
(Jurkiewicz și colab., 2012 ). Atunci când acesta este inserat în membranele lipidice, relaxarea se
datorează moleculelor de apă care pot penetra membrana, num ărul acestora depinzând de faza în
care se găsesc lipidele membranare (Parasassi și colab., 1998 ; Sanchez și colab., 2007 ). În acest
fel, faza lipidelor membranare (gel și/sau cristal lichid ) poate fi evaluată utilizând fluorescența
Lurdanului (Parasassi și colab., 1990a ).
Ținând cont de cele expuse anterior, pentru o me mbrană cu un grad ridicat de împachetare a
lipidelor (aflată în starea de gel), în jurul inelului naftalenic al Laurda nului , regăsim un numaăr
mic de molecule de apă, ducând astfel la o relaxare dipolară mică. Pentru o membrană cu un grad
scăzut de împachetare a lipidelor, aflată în starea de cristal lichid , vom regăsi un num ăr mult mai
mare de molecule de ap ă care pot pe netra bistratul p ână la nivelul glicerolului din structura
lipidelor, acolo unde este localizată gruparea cromoforă a Laurdanului (Parasassi și colab., 1998 ;
Sanchez și colab., 2007 ). Acest fapt se poate observa foarte u șor din deplasarea spre roșu care
apare în spectrul de fluorescență al Laurdanului, care pornește de la aproximativ 440 nm , pentru
75 starea de gel a bistratului și ajunge în jurul valorii de 490 nm, pentru starea fluidă a acestuia
(Bagatolli și Gratton, 2000 ; Bagatolli, 2006 ; Sanchez și colab., 2007 ).
Utilizând intensitățile fluorescenței Laurdanului la 440 nm ( IB) și 490 nm ( IG), se poate
defini așa numita polarizare generalizată – GP (Parasassi și colab. , 1990a ):
𝐺𝑃= 𝐼𝐵−𝐼𝐺
𝐼𝐵+𝐼𝐺 (8.1)
Teoretic, valorile GP pot varia în soluții omogene, utilizând solvenți care să acopere o gamă
largă de valori ale polarității (de la ciclohexan, apolar, până la alcooli, extrem de polari), între +1
(niciun efect al solventului) până la -1 (efect puternic al polarității solvntului) (Parasassi și colab.,
1991 ). Experimental, s -a arătat , prin intermediul tehnici lor de spectroscopie (Parasassi ș i colab.,
1990a ; Parasassi și colab., 1991 ; Parasassi și colab., 1994 ; Parasassi și cola b., 1998 ) sau de
microscopie (Yu și colab., 1996 ; Bagatolli și Gratton, 2000 ; Kubiak și colab., 2011 ; Sanchez și
colab., 2011 ; Owen și colab., 2012 ), că valorile efective ale GP se încadrează între +0.6 și -0.4.
Valorile extreme ale GP nu sunt atinse tocmai datorită suprapunerii spectrale a benzilor de emisie
ce corespund celor două st ări de relaxare ale Laurdanului inserat în bistratul lipidic.
Cu toate acestea, dacă în locul intensităților de la 440 nm și 490 nm se folosește num ărul de
molecule fluorescente, corespunzător fiecărei stări, se poate obține un parametru care să
definească , mult mai precis , sistemul analizat. Aceste informații se obțin din descompunerea
spectrelor de fluorescență ale Laurdanulu i în două peak -uri elementare, corespunzătoare fiecărei
stări energetice a fluoroforului . Desco mpunerea spectrelor se face, de obicei, utilizând funcții de
tip Gauss (De Vequi -Suplicy și colab., 2006 ; Lucio și colab., 2010 ; Ionescu și Ganea, 2012 ).
În continuare , este descris modelul matematic și modu l de obți nere al parametrilor de formă,
utilizați în acest model, folosind modelul propus de Emelyanenko (Emelyanenko și colab., 2000 )
și adoptat de noi pentru analiza spectrelor complexe ale Laurdanului .
76 8.1 Obținerea parametrilor de formă utilizați în modelul
matematic cu funcții LN
Așa cum a fost demonstrat de către Siano și Metzler, analiza cu funcții LN cu patru parametri
descri e, mult mai exact , forma spectrelor de absorbție a le derivaților hidroxipiridinei, față de
situația în care acestea sunt analizate cu funcții Gauss (Siano și Metzler, 1969 ). Modelul matematic
prezentat în continuare, utilizează funcții LN, cu intensi tatea fluorescenței reprezentată în scala
numerelor de undă (Figura 8.1), model propus anterior pentru descrierea spectrelor de emisie a
fluoroforilor or ganici (Burstein și Emelyanenko, 1996 ):
{𝐼=𝐼𝑚𝑒𝑥𝑝 [−𝑙𝑛2
𝑙𝑛2𝜌∗𝑙𝑛2(𝑎−𝜈̃
𝑎−𝜈̃𝑚)] 𝑑𝑎𝑐ă 𝜈̃<𝑎
𝐼=0 𝑑𝑎𝑐ă 𝜈̃≥𝑎 (8.2)
unde I este intensitatea emis iei fluorescente, Im este intensitatea maximă , 𝜈̃ este numărul de undă,
𝜈̃𝑚 este poziția intensității maxime, 𝜌=𝜈̃𝑚−𝜈̃𝑚𝑖𝑛
𝜈̃𝑚𝑎𝑥 +𝜈̃𝑚 este asimetria spectrului ( 𝜈̃𝑚𝑎𝑥 și 𝜈̃𝑚𝑖𝑛 reprezintă
numerele de undă corespunzătoare FWHM) și a reprezintă punc tul limită al funcției, dat de
expresia : 𝑎=𝜈̃𝑚+(𝜈̃𝑚𝑎𝑥 − 𝜈̃𝑚𝑖𝑛 ) ∗ 𝜌
(𝜌2 − 1).
1.6 1.8 2.0 2.2 2.4 2.6 2.80.00.20.40.60.81.0
mmaxIFluoresc.
[x104 cm-1]min
Figura 8.1 Forma generală a fun cției LN .
Adaptare din (Bacalum și colab., 2013 ).
77 Spectrele de emisie fluorecentă ale Laurdanului, în soluții omogene, au fost înregistrate
pentru solvenții d in Tabelul 8.1. Parametrii de formă, 𝜈̃𝑚, 𝜈̃𝑚𝑖𝑛 și 𝜈̃𝑚𝑎𝑥, au fost determinați printr –
o procedură de fitare neliniară, utilizând pachetul software Fityk 0.9.8 (http://fityk.nieto.pl ).
Tabelul 8.1 Caracteristicile spectrale ale Laurdanului în soluții
omogene de solvenți, cu diferite constante dielectrice.
Adaptare din (Bacalum și colab., 2013 ).
Solvent ῡm [cm-1] ῡmin [cm-1] ῡmax [cm-1] FWHMa [cm-1] ρ R2b Solvent apolar Ciclohexan 24 814 23 048 26 349 3 301 1.391 0.9978
Hexan 24 752 23 025 26 416 3 390 1.393 0.9982
Toluen 23 753 21 935 25 031 3 096 1.375 0.9996
Benzen 23 641 21 884 24 948 3 064 1.374 0.9996
Cloroformc 22 523 20 659 23 809 3 150 1.249 0.9999 Solvent polar aprotic Acetat de etil 23 095 21 238 24 392 3 154 1.286 0.9999
Tetrah idrofuran 23 041 21 237 24 342 3 105 1.289 0.9998
Aceton ă 22 272 20 517 23 644 3 127 1.232 0.9999
Dimet ilformamid ă 21 786 20 038 23 117 3 078 1.226 0.9999
Acetonitril 21 692 20 024 23 130 3 106 1.200 0.9999
Dimet ilsulfoxid 21 413 19 684 22 744 3 060 1.215 0.9999 Solvent polar protic Isopropanol 20 704 19 101 22 082 2 981 1.183 0.9993
Propanol 20 661 19 098 22 073 2 976 1.183 0.9993
Butanol 20 492 18 836 21 843 3 007 1.178 0.9993
Etanol 20 161 18 541 21 588 3 047 1.180 0.9996
Metanol 19 763 18 121 21 164 3 044 1.167 0.9996
a – Lărgimea la semiîn ălțime a spectr ului fitat;
b – R2 este coeficientul care stabilește calitatea fitului;
c – Cloroformul este considerat fie drept solvent apolar, datorită miscibilității extrem de scăzute cu apa ( <1 %),
fie solvent polar, datorită asimetriei distribuției de sarcină (are m omentul de dipol electric de 1.5D, comparabil
cu cel al solvenților polari aprotici). Din această cauză, poziția peak -ului de emisie al Laurdanului în cloroform
este mult mai în stânga decât pozițiile peakurilor corespunzătoare primilor doi solvenți polari aprotici (acetat de
etil și tetrahidrofuran).
78 Laurdanul a fost dizolvat în DMSO sau, pentru solvenții imiscibili cu DMSO, s -a utilizat
Laurdan dizolvat în etanol. Toți solvenții utilizați au avut puritate spectroscopică. Concentrația
finală a Laurdanul ui, în soluțiile omogene , a fost de 1 µM.
Spectrele de emisie au fost corectate, în timpul înregistr ărilor, cu sensibilitatea spectrală a
fotomultiplicatorului și , înainte de prelucrarea datelor, din valorile obținute, au fost scăzute valorile
datorate împ răștierii Raman pe moleculele solventului, pentru fiecare din solvenții utilizați.
Ipoteza de lucru în aceste experimente este bazată pe faptul că în soluții omogene, există
doar o singură specie de molecule de fluorofor care emite. Această presupunere a f ost utilizată și
în alte studii care au avut în vedere emisia Laurdanului și Prodanului în solvenți puri (Kawski și
colab., 2000 ; Moyano și colab., 2006 ). În orice caz, există câteva studii care avansează ipoteza că
Laurdanul, chiar în solvenți puri, prezintă un spectru de emisie complex, dar majoritatea acestor
studii sunt efectuate în soluții extrem de vâscoas e: glicerol (Kozyra și colab., 2003 ) și uleiuri
Primol/Marcol (Viard și colab., 1997 ) sau la temperaturi foarte scăzute în etanol utilizat pe
intervalul de temperaturi -108 °C până la +25 °C (Vincent și colab., 2005 ).
Pentru a găsi o corelație între forma spec trelor de fluorescență și polaritatea mediului în care
Laurdanul se află, formă ce dictează valorile parametrilor de formă, am înregistrat spectrele de
emisie fluorescentă a Laurdanului în solvenții din Tabelul 8.1.
Câteva exemple de spectre înregistrate în soluții omogene, care acoperă toată gama
polarității solvenților (apolari, polari aprotici și polari protici) sunt prezentate în Figura 8.2 – A.
Din aceste spectre, ies în evidență două aspecte:
– Spectrele de emisie, pentru toată gama solvenților, au formă asimetrică;
– Poziția spectrelor de emisie este puternic afectată de polaritatea solventului, acestea
deplasându -se către zona de roșu , odată cu creșterea polarității solv entului.
Forma spectrelor de emisie fluorescentă a Laurdanului este evident asimetrică, asimetria – ρ
având o ușoar ă tendință de scădere , în timp ce polaritatea solventului crește (Tabelul 8.1). Spectrele
de emisie au fost fitate foarte bine cu funcția LN , ecuația (8.2), dup ă cum se poate observa în
Figura 8.2 – B, C și D, reziduurile rezultate în urma analizei avân d valori mai mici de 2 % pentru
toți solvenții (Tabelul 8.1).
Deplasarea spre roșu a spectrelor de fluorescență ale Laurdanului este în strâns ă legătură cu
79 polaritatea solventului, datorită proprietăților solvatocromice ale acestuia. Poziția în spectru a
maximului de emisie , 𝜈̃𝑚, depinde de polaritatea solventului, exprimată în scala ET(30), după o
relație liniară, după cum se poate observ a în Figura 8.3. Există în literatura de specialitate câteva
studii referitoare la dependența spectrelor de fluorescență ale Laurdanului de polaritatea
2.0 2.40.00.20.40.60.81.0
2.0 2.40.00.20.40.60.81.0
2.0 2.40.00.20.40.60.81.01.8 2.0 2.2 2.4 2.6 2.80.00.20.40.60.81.0
BIFLUORESC.
[x104 cm-1] Toluen
LN fit
ReziduuriC Acetonitril
LN fit
Reziduuri
[x104 cm-1]D Metanol
LN fit
Reziduuri
[x104cm-1]IFluoresc.A Toluen
Cloroform
Acetonitril
DMSO
Isopropanol
Metanol
[x104 cm-1]
Figura 8.2 Spectre de emisie fluorescentă a Laurdanului .
A – în diverși solvenți, B , C, D – fitate cu funcția LN .
Adaptare din (Bacalum și colab., 2013 ).
solventului (Kawski și colab., 2000 ; Morozova și colab., 2011 ), iar rezultatele obținute în cadrul
acestui studiu sunt în co ncordanță cu acestea. Aceast ă dependență liniară permite interpretarea
modificărilor ce apar în spectrele de emisie , direct în termeni i de polaritatea mediului.
În Figura 8.4, limitele FWHM, 𝜈̃𝑚𝑖𝑛 și 𝜈̃𝑚𝑎𝑥, sunt reprezentate în funcție de p oziția
maximului spectrului de emisie. Aceste valori prezintă o dependență liniară și, în urma fitării, se
80 obțin relațiile între acești parametri, relații care condiționează forma spectrelor.
30 35 40 45 50 551.92.02.12.22.32.42.5m [x104 cm-1]
ET(30) [kcal/mol ]
Figura 8.3 Poziția maximului emisiei în funcție de scala polarității
solvenților – ET(30).
Adaptare din (Bacalum și colab., 2013 ).
Analizând în detal iu graficul din Figura 8.4, am observat că există o diferență între parametrii
funcțiilor liniare corespunzătoare solvenților polari, respectiv apolari. Din această cauză
2.0 2.1 2.2 2.3 2.4 2.51.82.02.22.42.6
Solv. apolarimin
maxmin, max [x104
cm-1]
m [x104
cm-1]Solv. polari
Figura 8.4 Parametrii de formă, 𝝂̃𝒎𝒊𝒏 și 𝝂̃𝒎𝒂𝒙, ca funcție de p oziția
maximului emisiei .
Adaptare din (Bacalum și colab., 2013 ).
relațiile de constrângere a parametrilor de formă, ce definesc forma generală a spectrelor de emisie,
au fost definite pentru cele două grupe de solvenți. Numărul de undă ce definește limita de separare
81 între cele dou ă clase de solvenți, polari și apolari, a fost stabilit la valoa rea de 22 .300 cm-1. Relațiile
liniare între parametrii de constrânger e a formei spectrelor de emisie, obținuți în urma fit ării
graficelor, sunt detaliate în continuare.
{𝜈̃𝑚𝑖𝑛 =−958 .4+0.966 ∗𝜈̃𝑚
𝜈̃𝑚𝑎𝑥 =1688 .8+0.986 ∗𝜈̃𝑚 (8.3)
pentru 𝜈̃𝑚<22 300 𝑐𝑚−1 (grupa solvenților polari), respectiv:
{𝜈̃𝑚𝑖𝑛 =1150 .7+0.877 ∗𝜈̃𝑚
𝜈̃𝑚𝑎𝑥 = −99.3+1.058 ∗𝜈̃𝑚 (8.4)
pentru 𝜈̃𝑚≥22 300 𝑐𝑚−1 (grupa solvenților apolari ).
8.2 Analiza spectrelor de fluorescen ță ale Laurdanului
inserat în membrane lipidic e
Spectrele de emisie fluorescentă a Laurdanului , inserat în membrane lipidice , au fost
înregistrate între 1 °C și 70 °C, în funcție de tipul de lipide utilizate. Acestea au fost corectate
pentru sensibilitatea spectrală a fotomultiplicatorului canalului de emisie al fluorimetrului și pentru
artefactele datorate împraștier ii și liniei Rama n. Toate înregistr ările au f ost efectuate la valori ale
absorbanței soluțiilor mai mici de 0.05, în acest fel nefiind necesare corecțiile pentru autoabsorbție
(Lakowicz, 2006 ).
Înainte de fitarea spectrelor, toate spectrele de emisie au fost transformate în scala numerelor
de undă utilizând rela ția 𝐼𝜈̃=𝐼𝜆×𝜆2, unde 𝐼𝜈̃ reprezintă intensitatea de emisie exprimată în funcție
de număr ul de undă, 𝐼𝜆 este intensitatea emisiei exprimată în funcție de lungimea de undă și 𝜆 este
lungimea de undă (Valeur, 2001 ).
Emisia fluorescentă a Laurdanului a fost înregistrat ă în lipozomi preparați din C13, DPPC
și DSPC, la temperaturi alese astfel încât, pentru cele trei tipuri de lipide, tranziția din starea de
gel în starea de lichid cristalin să fie foarte bine pusă în evidență. Astfel, înregistrările pentru C13
au fost efectuate între 1 °C și 60 °C, pentru DPPC între 20 °C și 60 °C și pentru DSPC între 35 °C
82 și 70 °C. Spectrele înregistrate pentru fiecare tip de l ipid au fost normate la valorile înregistrate
pentru prima temperatură, așa cum se poate observa în Figura 8.5.
400 450 500 550 6000.00.20.40.60.81.0
60 oCLipozomi C13IFLULORESC.
[nm]1 oC
400 450 500 550 6000.00.20.40.60.81.0
60 oC20 oC Lipozomi DPPC
[nm]400 450 500 550 6000.00.20.40.60.81.0
70 oC35 oC Lipozomi DSPC
[nm]
Figura 8.5 Intensitatea normată a emisiei fluorescente a Laurdanului inserat
în membrane lipidice preparate din C13, DPPC și DSPC, la diferite
temperaturi .
Adaptare din (Zorilă și colab., 2016 ).
Analizând familiile de curbe din Figura 8.5 se observă că , pentru toate cele tre i lipide utilizate
în cadrul acestui studiu , regăsim comportarea normală a emisiei fluorescente a moleculelor de
Laurdan, și anume , maximul emisiei se deplasează de la 440 nm, atunci când regăsim lipidele în
faza de gel, până la aproximativ 490 nm, atunci când acestea se află în faza de cristal -lichid.
Pentru a descrie contribuția celor două st ări de relaxare în care putem găsi moleculele de
Laurdan, corespunzătoare celor două stări ale bistratului lipidic, în spectrul final de emisie
fluorescentă, am aplic at o procedură de deconvoluție , ca sumă a două funcții LN, ce se bazează pe
ecuația (8.2) și cu constrângerile pentru forma finală a funcțiilor descrise pe larg în paragrafele
anterioare (Burstein și colab., 2001 ; Bacalum și colab., 2013 ).
Pentru toate rezultatele experimentale s -a facut o comparație între deconvoluția cu funcții
LN și Gauss. În Figura 8.6 se pot observa comparațiile între aceste două tipuri de deconvoluție,
pentru spectrele de emisie a Laurdanului inserat în lipozomi i preparați din DPPC, la trei
temperaturi distincte: 20 °C graficele din A și D, 41 °C graficele din B și E, respectiv 60 °C
grafi cele din C și F. Pentru spectrele din A, B și C s -au folosit funcții de tip LN, iar pentru cele din
D, E și F funcții de tip Gauss.
83
16000 18000 20000 22000 24000 260000123456IFLUORESC. [x1010]
[cm-1] Spectrul de fluorescenta
LN fit
LN peak albastru
LN peak verdeA
16000 18000 20000 22000 24000 260000123456 Spectrul de fluorescenta
Gauss fit
Gauss peak albastru
Gauss peak verdeIFLUORESC. [x1010]
[cm-1]D
16000 18000 20000 22000 24000 2600001234 Spectrul de fluorescenta
LN fit
LN peak albastru
LN peak verdeIFLUORESC. [x1010]
[cm-1]B
16000 18000 20000 22000 24000 2600001234 Spectrul de fluorescenta
Gauss fit
Gauss peak albastru
Gauss peak verdeIFLUORESC. [x1010]
[cm-1]E
16000 18000 20000 22000 24000 26000012345 Spectrul de fluorescenta
LN fit
LN peak albastru
LN peak verdeIFLUORESC. [x1010]
[cm-1]C
16000 18000 20000 22000 24000 26000012345 Spectrul de fluorescenta
Gauss fit
Gauss peak albastru
Gauss peak verdeIFLORESC. [x1010]
[cm-1]F
Figura 8.6 Comparație între deconvoluția cu funcții LN (A, B și C) și funcții
Gauss (D, E și F) .
LUV preparate din DPPC la 20 °C (A și D), 41 °C (B și E) și 60 °C (C și F).
84 8.3 Discu ții
Așa cum am precizat într -un paragraf anterior, funcțiile LN sunt determinate de valorile a
patru parametri: intensitatea maximă a emisiei fluorescente ( Im) și trei care determină forma
generală a spectrului ( 𝜈̃𝑚, 𝜈̃𝑚𝑖𝑛 și 𝜈̃𝑚𝑎𝑥). Considerând relațiile liniare între 𝜈̃𝑚𝑖𝑛 și 𝜈̃𝑚𝑎𝑥 și 𝜈̃𝑚 drept
constrângeri, numărul variabilelor independente din ecuația (8.2) se reduce doar la două
(intensitatea maximă a spectrului și poziția în spectru a acesteia ). Acest lucru duce la realizarea
unei metode de descompunere a spectrelor complexe de fluorescență , mult mai robust e și impune,
în același timp, constrângeri legate de forma și poziția peak -urilor elementare în spectru , în relație
directă cu valorile para metrilor (care constrâng forma peak -ului) și scala de polarit ate.
Astfel, peak -urile elementare, care rezult ă în urma descompunerii spectrelor de fluorescență,
vor fi întotdeauna corelate cu polaritatea solventului , așa cum se poate observa din Figura 8.2,
Figura 8.3 și Figura 8.4.
Dacă urmărim pozițiile celor două maxime ale peak -urilor rezultate în urma deconvoluției
cu funcții de tip Gauss, se observ ă că acestea pleacă din jurul valorilor de 435 nm (pentru peak -ul
albastru, corespunzător stării de gel a bistratului) și 465 nm (pentru peak -ul verde, corespunzător
stării fluide a bistratului) , ajungând la 425 nm și 490 nm , odată cu creșterea temperaturii, valorile
obținute fiind în concordanță cu studiile anterioare (Yu și colab., 1996 ; Lucio și colab., 2010 ;
Ionescu și Ganea, 2012 ). Chiar dacă aceste studii dau o explicație pentru modificarea poziției peak –
ului verde, datorată creșterii numărului de molecule de apă care interacționează cu gruparea
cromoforă a Laurdanului, niciunul dintre acestea nu explică sc ăderea care apare în cazul peak -ului
corespunzător stării de gel. Această scădere nu poate fi susținută de explicații fizice, ea indicând
faptul că, odată cu creșterea temperaturii, o parte din moleculele de Laurdan se află într -un mediu
mai rigid, fiind în interacție cu un număr mai mic de molecule de apă. Util izând metoda de analiză
cu funcții de tip LN se poate analiza cu mai mare acuratețe nivelul de hidratare al bistratului lipidic,
așa cum este el indicat de c ătre moleculele de Laurdan.
Atunci când spectrele de emisie ale Laurdanului au fost analizate prin deconvoluție cu funcții
de tip LN, cele dou ă peak -uri rezultate în urma deconvoluției se găsesc poziționate în spectru,
pentru toată gama de temperaturi utilizate și independent de tipul de lipide utilizate, în jurul
valorilor de 440 nm și 490 nm. În Figur a 8.7 sunt reprezentate pozițiile peak -urilor elementare
85 obținute în urma deconvoluției spectrelor de emisie ale Laurdanului inserat în membrana
lipozomilor preparați din DMPC. Rezultate asemănătoare s -au obținut și pentru celelate tipuri de
lipozomi, prep arați din C13, DPPC și DSPC.
0 10 20 30 40 50 60430440450460470480490500
B LN
G LN
BGauss
GGaussB, G [nm]
T [oC]
Figura 8.7 Pozițiile peak -urilor elementare obținute în urma celor
două metode de deconvoluție .
Adaptare din (Bacalum și colab., 2013 ).
La temperatura de 20 °C (Figura 8.6, A și D) regăsim lipidele în stare de gel (pentru DPPC,
Tm este de 41 °C) și este de așteptat ca majoritatea moleculelor de Laurdan să emită din starea de
relaxare dipolară corespunzătoare unei interacții reduse cu moleculele de apă. Din analiza cu
funcții LN (Figura 8.6, A), aria peak -ului albastru, care se află la aproximativ 440 nm, este așa
cum era de așteptat, și anume , mult mai mare decâ t aria peak -ului verde. În urma deconvoluției cu
funcții Gauss, contrar așteptarilor, aria peak -ului verde este mai mare decât a celui albastru (Figura
8.6, D), acest fapt idicând că, deși bistratul se află în stare de gel, o fracție semnificatvă ( > 50 %)
de molecule de Laurdan emit din starea de relaxare dipolară corespunzătoare cazului de lichid
86 cristalin a bistratului. Pentru spectrele înregistrate la temperatura de 41 °C (Figura 8.6, B și E),
unde se presupune că cele două st ări ale bistratului coexistă (Tokumasu și colab., 2002 ), am
obținu t, din deconvoluția cu funcții Gauss un peak verde mult mai intens decât cel albastru, spre
deosebire de deconvoluția cu funcții LN, unde cele două peak -uri au aproximativ aceeași arie.
Această tendință de variație a celor două peak -uri s-a obținut și pent ru celelalte două tipuri de
lipide utilizate. Pentru ultima condiție, atunci când temperatura probei a fost de 60 °C, prezentată
în graficele din Figura 8.6, C și F, la această temperatură lipidele aflându -se în starea de lichid
cristalin, se observ ă că pentru deconvoluția cu funcții Gauss , contribuția peak -ului albastru este
nesemnificativă, contrar celor obținute la deconvoluția cu funcții LN, unde peak -ul albastru are o
contribuție mult mai mare în spectrul de emisie.
Analizând evoluția ariilor celor do uă peak -uri obținute în urma deconvoluției cu funcții LN,
se observă, pentru toate cazurile analizate, că la temperaturi mici contribuția preponderentă în
spectrul de emisie se datorează peak -ului albasru. De asemenea, crescând temperatura, aria
peak -ului albastru descrește și cea a peak -ului verde crește, devenind aproximativ egale în jurul
temperaturii de tranziție. Crescând și mai mult temperatura, aria peak -ului verde devine
predominantă în spectrul de emisie, cea a peak -ului albastru scăzând core spunzător. Aceste
rezultate demonstrează faptul că și la temperaturi scăzute, atunci când bistratul lipidic se află în
starea de gel, există o populație de molecule de Laurdan care emit din starea de relaxare dipolară
corespunzătoare st ării fluide a bistra tului. Rezultatele sunt similare cu cele pentu LUV preparat e
din DMPC (Bacalum și colab., 2013 ), fiind o confirmare, în plus, a faptului c ă deconvoluția cu
funcț ii LN a spectrelor de emisie a Laurdanului poate fi extinsă pentru diverse sisteme lipidice.
În Figura 8.8, sunt prezentate în detaliu valorile ariilor relative ale celor două peak -uri, pentru
cele două metode de deconvoluție. Aria relativă a peak -ului din canalul albastru (SRB), pentru
măsurătorile efectuate la cea mai mică temperatură, este ≈ 0.92 pentru lipozomii preparați din C13,
≈ 0.96 pentru cei preparați din DPPC și ≈ 0.97 pentru DSPC, scăzând odată cu creșterea
temperaturii, valoarea acestei arii f iind de ≈ 0.25 pentru toate tipurile de lipide utilizate, atunci
când bistratul lipidic se află în starea de lichid cristalin. Spre deosebire de rezultatele anterioare,
obținute la deconvoluția cu funcții LN, la utilizarea funcțiilor Gauss în deconvoluții, aria relativă
a peak -ului albastru pornește , întotdeauna , din jurul va lorii de 0.35 , pentru starea de gel a
bistratului, și descrește aproape de 0 , pentru starea fluidă a acestuia, indiferent de tipul de lipide
87 utilizat. Aria relativă a peak -ului verde (SRG) are o variație în sens opus față de aria relativă a peak –
ului albastru. Din graficele prezentate în Figura 8.7 se observă că ariile relative ale peak -urilor,
obținute în urma deconvoluției cu funcții LN, au un punct de intersecție. În jurul acestei
temperaturi , caracteristică fiecărui tip de lipid, se regăsesc cele două st ări, de gel și de lichid
cristalin, ale bistratului lipidic. În cazul deconvoluției cu funcții Gauss, aria relativă a peak -ului
verde este mai mare decât cea a peak -ului albastru , pentru toată gama de temperaturi utilizate,
sugerând faptul ca starea fluidă a bistratului este predominantă, chiar și pentru temperaturi mult
mai mici decât Tm. Acest comportament este greu de integrat în modelele existente de hidratare a
bistratului pe parcu rsul tranziției gel -fluid, așa cum am demonstrat pentru LUV preparate din
DMPC (Bacalum și colab., 2013 ).
0 10 20 30 40 50 600.00.20.40.60.81.0SRB, SRG
T [oC]A B C
20 30 40 50 600.00.20.40.60.81.0
T [oC]30 40 50 60 700.00.20.40.60.81.0 SrB – LN fit SrG – LN fit SrB – Gauss fit SrG – Gauss fit
T [oC]
Figura 8.8 Comparație între ariile relative ale peak -urilor rezultate în urma
deconvoluției cu funcții LN și Gauss .
Lipozomi preparați din: A – C13, B – DPPC, C – DSPC .
Adaptare din (Zoril ă și colab., 2016 ).
Pentru obținerea experimentală a Tm, curbele experimentale din Figura 8. 8 se fitează cu
funcți a sigmoidală. Punctul , în care ariile corespunzătoare celor două populații de Laurdan devin
egale , reprezintă temperatura la care cele două stări ale bistratului coexistă și un număr egal de
molecule de Laurdan emit din cele două stări de relaxare dipolară, în condițiile experimentale date
și presupunând că moleculele de Laurdan au aceeași eficiență cuantică pentru cele două stări ale
bistrat ului. Astfel , s-au determinat valorile din Tabelul 8.3, pentru fiecare din lipidele utilizate în
acest studiu.
Analizând mai în detaliu datele obținute în urma deconvolutiilor cu funcții LN, prezentate în
Figura 8.7, se pot observa unele diferențe, alături de temperatura de tranziție, ce caracterizează
88 lipidele utilizate în acest studiu : ariile relative ale peak -urilor corespunzătoare temperaturilor
extreme și intervalul de temperatură în care are loc tranziția de fază a bistratului. Valorile acestor
parame tri se regasesc în Tabelul 8.2, în care, în plus față de lipidele utilizate în acest studiu, am
adăugat și valorile pentru DMPC, obținute într -un studiu anterior (Bacalum și colab., 2013 ).
Tabelul 8.2 Comparație între valorile S RB la temperaturi extreme și
intervalul ΔT obținut din fitarea sigmoidală a curbelor S RB.
(datele din Figura 8.7 și din (Bacalum și colab., 2013 )).
Adaptare din (Zorilă și colab., 2016 ).
Lipid SRB la T min SRB la T max ΔT
C13 0.92 0.21 7.45
DMPC 0.95 0.26 5.31
DPPC 0.96 0.26 2.02
DSPC 0.97 0.25 1.57
În primul rând, se poate observa o mică diferență între valorile SRB obținute pentru cele patru
tipuri de LUV pentru cele mai mici valori ale temperaturilor de lucru. Aceste valori cresc monoton
cu lung imea lanțurilor de acizi grași din compoziția lipidelor utilizate, acest fenomen fiind
inexistent la cealaltă extremă a temperaturilor de lucru. Al doilea fenomen care se poate observa
este scăderea intervalului de temperatură în care are loc tranziția de fază a lipidelor (obținut din
fitarea valorilor SRB cu o funcție sigmoidală). Și acest parametru variază monoton cu lungimea
lanțurilor de acizi grași din compoziția lipidelor utilizate.
Aceste efecte pot avea o explicație simplă dacă facem comparația într e lungimea cozii
hidrofobe a Laurdanului, formată din 12 atomi de carbon, și lungimile cozilor hidrofobe a lipidelor
uilizate : DSPC -ul are 18 atomi de carbon, DPPC -ul are 16 atomi de carbon, DMPC -ul 14 atomi și
C13, așa cum reiese și din prescurtare, are 1 3 atomi de carbon. Astfel, cu cât cozile hidrofobe ale
lipidelor sunt mai lungi, cu atât mai mult moleculele de Laurdan sunt mai bine izolate în bistrat
față de moleculele de apă, atunci când lipidele sunt în faza de gel. În mod contrar, atunci când
bistra tul se află în faza fluidă, moleculele de Laurdan au o comportare asem ănătoare, indiferent de
tipul lipidului din care este alcătuit bistratul. Diferențele datorate lungimii cozilor hidrofobe ale
lipidelor apar și pentru zona temperaturilor de tranziție a bistratului. Astfel, pentru C13, zona
temperaturii de tranziție și intervalul de valori în care are loc această tranziție, din starea de gel în
starea de cristal lichid, este mult mai largă decât pentru DSPC, pentru care această zona are o
variație mult ma i bruscă (Figura 8.8). Un atsfel de efect nu poate fi pus în evidență prin metodele
89 alternative (scanarea calorimetrică diferențială) utilizate pentru determinarea temperaturilor de
tranziție a lipidelor (Xie și colab., 2010 ).
Tabelul 8.3 Valorile T m determinate prin diverse metode, pentru
lipidele utilizate .
Adaptare din (Zorilă și colab., 2016 ).
Parametrul
analizat Tm [° C]
C13 DPPC DSPC
GP a 22.01 40.93 53.35
ΔSR a 19.27 40.32 53.04
SRB, SRG b 30.83 42.81 54.06
SRG / SRB a 23.00 41.50 53.70
Literatura c 13.50 41.30 54.50
a – fitare cu funcție sigmoidală
b – intersecția curbelor S RB și SRG
c – (Koynova și Caffrey, 1998 )
Utilizând valorile ariilor relative, corespunzătoare celor două peak -uri, se poate defini un
nou parametru, asemanător GP, numeric egal cu diferența dintre cele două arii relative:
ΔSR = SRB – SRG. Acest parametru descrie accesibilitatea moleculelor de Laurdan față de moleculele
de apă, atunci când acesta se află inserat în bistrat ul lipidic, și depinde de fracțiile de fluorofor
corespunzătoare celor doua faze ale acestuia, variind, teoretic, între +1 (emisie decât din starea
nerelaxată) și -1 (emisie decât din starea relaxată) . Valorile GP au fost calculate utilizând ecuația
(8.1). În Figura 8.8 sunt reprezentați parametrii amintiți anterior, ΔSR și GP, pentru Laurdan inserat
în lipozomi preparați din C13, DPPC și DSPC.
Parametrul ΔSR pornește de la valori mari, ≈ 0.85 pentru C13, ≈ 0.91 pentru DPPC și ≈ 0.95
pentru DSPC și scade pâ nă la ≈ – 0.5 pentru toate lipidele utilizate. Comparativ cu acesta, valorile
GP sunt ≈ 0.44, ≈ 0.45 și, respectiv, ≈ 0.48, și scad până la ≈ – 0.4. Din valorile anterioare se
observa că intervalul de variație al parametrului ΔSR este semnificativ mai mare decât intervalul
de variație al GP. Intervalul de variație, mai mare, a valorilor parametrului ΔSR sugerează fapul că
acesta este mult mai sensibil în detectarea și caracterizarea nivelului de hidratare în membranele
lipidice.
Valorile GP calculate pen tru lipozomii utilizați în acest studiu (Figura 8.9) sunt similare
celor din literatura de specialitate (Bagatolli și colab., 1999 ).
90
0 10 20 30 40 50 60-0.6-0.4-0.20.00.20.40.60.81.0 sR GPSr, GP
T [oC]A
20 30 40 50 60-0.6-0.4-0.20.00.20.40.60.81.0
BSr, GP
T [oC]30 40 50 60 70-0.6-0.4-0.20.00.20.40.60.81.0
CSr, GP
T [oC]
Figura 8.9 Comparație între curbele ΔSR și GP .
Lipozomi preparați din: A – C13, B – DPPC, C – DSPC .
Adaptare din (Zorilă și colab., 2016 ).
Studii anterioare , efectuate pe lipozomi , au arătat că Tm pentru lipide poate fi determinată
din dependența de temperatură a GP (Bagatolli și colab., 1999 ; Ionescu și Ganea, 2012 ). Astfel, în
urma fitarii cu o funcție sigmoidală a graficelor prezentate în Figura 8.9, atât pentru ΔSR, cât și
pentru GP, au fost obținute temperaturile de tranziție, Tm, pentru lipidele utilizate. Acestea (Tabelul
8.3) se corelează pentru cele două metode de analiză , ΔSR și GP, cât și cu datele din literatură
(Koynova și Caffrey, 1998 ).
0 10 20 30 40 50 60 7001234SRG/SRB – LN fit
T [oC]0 10 20 30 40 50 60 7001020304050 PC13 DPPC DSPCSRG/SRB – Gauss fit
T [oC]
Figura 8.10 Dependența de temperatură a raportului ariilor relative,
obținute în urma deconvoluției cu funcții LN și Gauss .
Adaptare din (Zorilă și colab., 2016 ).
91 Am calculat , de asemenea , și raporul ariilor relative, SRG / SRB, obținute în urma celor două
tipuri de deconvoluție, acest raport fiind un alt parametru utilizat în literatură (Ionescu și Ganea,
2012 ) pentru analiza modificăr ilor care apar în spectrele de fluorescență a Laurdanului. Variația
acestor parametri, pentru toate lipidele utilizate, este reprezentată în Figura 8.10.
Concluzii par țiale
În cadrul experimentelor descrise în acest capitol, am pus la punct o nouă metodă d e analiză
a spectrelor de emisie fluorescentă a Laurdanului inserat în bistraturi lipidice. Această metodă are
la bază un model de deconvoluție cu funcții de tip LN.
Pentru punerea la punct a metodei este necesar ca parametrii funcției de deconvoluție să f ie
calibrați în prealabil. Această calibrare se face utilizând spectrele de fluorescență a Laurdanului
dizolvat întro gama largă de solvenți (cu diferite valori ale momentului de dipol electric). În urma
calibrării parametrilor, am pus la punct modelul de deconvoluție cu funcții LN.
Validarea modelului s -a făcut utilizând spectrele de fluorescență a Laurdanului inserat în
lipozomi preparați din trei tipuri distincte de lipide : C13, DPPC și DSPC. În urma deconvoluției
au fost obținute câte două peak -uri dist incte, corespunzătoare celor două st ări ale bistratului lipidic.
Dependența de temperatură a ariilor relative ale celor două peak -uri obținute în urma
deconvoluției , oferă o imagine mai realistă referioare la tranziția de fază a bistratului , atunci când
această dependență este comparată cu cea obținută în urma analizei cu funcții Gauss.
Noul parametru propus pentru caracterizarea fluidității membranelor lipozomale, ΔSR, este
mult mai sensibil cu privire la nivelul de hidratare al bistratului, așa cum este i ndicat de către
Laurdan. Aria peak -ului corespunzător fazei de gel a bistratului și intervalul de temperatură în care
are loc tranziția de fază sunt dependente de lungimea cozilor hidrofobe a le lipidelor.
Această metodă de analiză poate fi aplicată și sistemelor mult mai complexe (lipozomi
preparați din mai multe specii de lipide, cu diverse proporții ale acestora, cu sau fară colesterol,
membrane celulare, membrane bacteriene).
92
93 9 Efectul AMP asupra fluiditații
membranelor lipidice model și
membranelor celulare
Introducere
Modificările care apar în spectrul de emisie fluorescentă a Laurdanului sunt extrem de
sensibile la gradul de hidratare și la faza în care se găsește bistratul lipidic (Parasassi și colab.,
1998 ; Bagatolli, 2006 ). Metoda prezentată în capitolul anterior, care utilizează ariile relative ale
peak -urilor elementare de emisie f luorescentă a Laurdanului, corespunzătoare celor două st ări ale
bistratului, s -a dovedit mai sensibilă decât analiza clasică ce utilizează parametrul GP (Bacalum ș i
colab., 2013 ; Zorilă și colab., 2016 ). La fel ca în cazul GP (Parasassi și colab., 1990b ; Parasassi și
colab., 1998 ; Zhang și colab., 2006 ), creșterea valorii parametrului ΔSR este asociată cu un nivel
mai ridicat de împachetare al lipidelor din componența bistratului, ceea ce duce la o scădere a
numărului de molecule de apă de la interfața hidrofobă -hidrofilă, acolo unde se găsește porțiunea
cromoforă a Laurdanului.
Rezultatele prezentate în cadrul acestui capitol au fost prezentate la Conferința Națională de
Biofizică, București – ediția 2018 și stau la baza redactării unui articol științific, aflat în stadiul de
manuscris, ce urmează să fie trimis spre publicare într -o revistă de specialitate.
9.1 Evaluarea e fectului AMP asupra membranelor
Pentru ev aluarea efectelor AMP asupra lipozomilor preparați din DOPC și din
DOPC:DPPG, o suspensie, cu concentrația finală a lipidelor de 50 µM, în care s -a inserat Laurdan
(concentrația finală 100 nM) , a fost tratată cu peptida de interes, timp de 30 min. la întun eric, fiind
agitată continuu. Concentrația finală a peptidei în suspensi a de lipozomi a fost de 1 µM.
Tratamentul cu peptidă s -a făcut în aceleași condiții ca acela cu Laurdan. Peptidele utilizate în
acest studiu au fost: Melitina, Indolicidin a și Cecropin a P1.
94 Efectul acestor peptide asupra bistratului lipidic a fost evaluat înregistrând spectrele de
fluorescență ale Laurdanului, în intervalul de temperatură 10 °C – 60 °C, cu pasul de 5 °C.
În Figura 9.1 este reprezentată variația parametrilor ΔSR (A) și SRG/SRB (B) pentru lipozomii
preparați din DOPC, simpli și în prezența AMP.
10 20 30 40 50 60-0.75-0.60-0.45-0.30-0.15 DOPC
DOPC + Melitina
DOPC + Indolicidina
DOPC + Cecropina P1SR
T [oC]
10 20 30 40 50 6012345
DOPC
DOPC + Melitina
DOPC + Indolicidina
DOPC + Cecropina P1SRG/SRB
T [oC]
Figura 9.1 Variația parametri lor A – ΔSR și B – SRG/SRB pentru
lipozomii prep arați din DOPC , simpli și în prezența AMP .
În Figura 9.2 este reprezentată variația parametrilor ΔSR (A) și SRG/SRB (B) pentru lipozomii
preparați din DOPC:DPPG, simpli și în prezența AMP.
95
10 20 30 40 50 60-0.75-0.60-0.45-0.30-0.15 DOPC: DPPG
DOPC :DPPG + Melitina
DOPC :DPPG + Indolicidin
DOPC :DPPG + Cecropina P1SR
T [oC]
10 20 30 40 50 6012345
DOPC:DPPG
DOPC:DPPG + Melitina
DOPC:DPPG + Indolicidina
DOPC:DPPG + Cecropina P1SRG/SRB
T [oC]
Figura 9.2 Variația parametrilor A – ΔSR și B – SRG/SRB pentru
lipozomii preparați din DOPC :DPPG , simpli și în prezența AMP .
Pentru evaluarea efectului AMP asupra membranelor externe ale bacteriilor Gram -negative
am utilizat E. coli (ATCC 8739), tratate cu Laurdan , timp de 30 min. în întuneric, cu agitare
continuă, concentrația de fluorofor fiind aceeași ca în experimentele cu lipozomi . După tratamentul
cu Laurdan, a urmat tratamentul cu peptid e (Melitină sau Indolic idină), în aceleași condiții ca la
lipozomi. În Figura 9.3 sunt reprezentate rezultatele obținute în cadrul acestui set de experimente.
96 Pentru acest studiu am utilizat E. coli (ATCC 8739) (Microbiologics, SUA), aflate la nu mai
mult de 4 pasaje fat ă de cul tura de referință. Cultura a fost reanimată pe mediu Tryptic Soy Agar
(TSA) (Merck, Germania), timp de 18 – 24 h, la 35 – 37 șC. După perioada de incubare , am realizat
o suspensie bacteriană cu OD echivalent cu 106 UFC/m L. Un mililitru de suspensie a fost adăugat
în 100 m L Tryptic Soy Broth (TSB) (Merck, Germania), proaspăt preparat, și incubat peste noapte
la 35 – 37 șC, cu agitare la 200 rpm. Creșterea s -a realizat în aceste condiții pentru a asigura accesul
în mod egal al celulelor la mediul de cultură ș i pentru a evita sedimentarea acestora (Bolshakova
și colab., 2001 ). După perioada de incubare, suspensiile au fost centrifugate, la 5 .000 g pentru
7 minute, agitate și spălate de două ori în PBS, apoi resuspendate în PSB și ajustate la OD
echivalent cu 104 UFC/m L (Cui și colab., 2012 ).
10 20 30 40 50 600.000.150.300.450.60E. coli
E. coli + Melitina
E. coli + IndolicidinaSR
T [oC]
10 20 30 40 50 600.30.60.91.2
E. coli
E. coli + Melitina
E. coli + IndolicidinaSRG / SRB
T [oC]
Figura 9.3 Variația parametrilor A – ΔSR și B – SRG/SRB pentru
bacterii Escherichia coli , simple și în prezența AMP .
97 Într-o altă serie de experimente , am urmărit cum este afectată fluiditatea bistratului de
cantități crescătoare de peptidă (Melitin ă). LUV au fost preparate din DOPC și DOPC:Chol, în
raport de 65:35. Același raport intre DOPC și colesterol s -a utilizat și la prepararea MLV. MLV
au fost preparate după același protocol ca LUV, până în punctul (exclusiv) în care trebuia efectuată
operați a de îngheț -dezgheț. Concentrațiile lipidelor și Laurdanului au fost cele precizate în
Capitolul 5, în care am descris materialele și metodele utilizate. Concentrațiile de peptidă au fost:
0.25 µM, 0.5 µM, 0.75 µM, 1 µM, 1.5 µM, 2 µM și 2.5 µM.
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5-0.6-0.5-0.4-0.3-0.2
C [M]SRA 37o C 15o C
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5-0.2-0.10.00.10.20.30.4 37o C 15o C
C [M]SRB
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.50.00.10.20.30.40.5 37o C 15o C
C [M]SRC
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5-0.6-0.5-0.4-0.3-0.2-0.10.00.1 LUV-DOPC LUV-DOPC:Chol MLV-DOPC:Chol
C [M]DSR
Figura 9.4 Modificarea fluidității bistratului lipidic în urma tratamentului cu Melitină .
A – LUV preparate din DOPC; B – LUV preparate din DOPC:Chol; C – MLV preparate din DOPC:Chol;
D – modificările fluidității bistratului lipidic, la 37 ° C, pentru cazurile reprezentate în A, B și C;
Concentrația Melitinei a fost variată între 0.25 µM și 2.5 µM.
98 9.2 Discuții
În literatura de specialitate există numeroase studii în care se evaluează efectele factorilor
fizici, chimici și biochimici asupra membranelor celulare și/sau artificiale (Polozov și colab., 1997 ;
Granjon și colab., 2001 ; Chou și colab., 2010 ; Nielsen și Otzen , 2010 ; Cui și colab., 2012 ; Machan
și colab., 2014 ; Bacalum și colab., 2017 ; Onate -Garzon și colab., 2017 ; Zorilă și colab., 2017 ;
Hernández -Villa și colab., 2018 ; Man și colab., 2018 ).
În experimentele prezentate în cadrul acestui capitol am urmărit efectele AMP asupra
membranelor lipidice model și membranelor biologice utilizând fluorescența Laurdanului.
Pentru tratamentul apl icat LUV preparate din DOPC, cu cele trei peptide, Melitina,
Indolicidin a și Cecropina P1, din Figura 9.1, se observă că , cea mai mică influență asupra fluidității
bistratului a avut -o Cecropina P1. Astfel, pentru toată gama de temperaturi utilizate, aceas ta nu a
indus nici o modificare la nivelul fluidității membranare, valorile ΔSR și SRG/SRB fiind aproximativ
identice cu cele din situația în care a fost evaluată fluiditatea lipozomilor simpli. Acest
comporatment era de așteptat având în vedere modul de a cțiune al acestei peptide, de tip “ carpet –
like” (Pouny și colab., 1992 ), concentra ția la care s -a lucrat fiind insuficientă pentru afectarea
împachetării laterale a lipidelor (Gazit și colab., 1994b ; Gazit și colab., 1995 ). Efectul Melitinei s –
a manifestat pentru toată gama de temperaturi de lucru, în urma interacției cu bistratul lipidic
aceasta inducând o rigidizare a lui, valorile ΔSR fiind mai mari decât în cazul lipozomilor f ără
tratament aplicat. Efectul de rigidizare indus de Melitină se observă mai bine din variația
parametrului SRG/SRB, care pentru temperaturi > 20 °C se diferențiază în mod evident d e valorile
lipozomilor simpli , ca urmare a modului de interacție a acestei peptide cu membranele formate din
lipide neutre. Rigidizarea se manifestă și în cazul Indolicidin ei, fiind mai evidentă la temperaturi
> 30 °C, datorită modului de interacție a aces tei peptide, reziduurile hidrofobe comportându -se ca
niște puncte de ancorare pentru ea la suprafața bistratului. Odată cu creșterea temperaturii bistratul
lipidic devine mai fluid, gradul de împachetare al lipidelor fiind mai scăzut. Astfel , reziduurile
hidrofobe pătrund mai în profunzimea acestuia, ducând la o creștere aparentă a împachetaării.
Același comportament de modificare al fluidității membranare, la interacția cu Melitina și
Indolicidin a, l-am obținut și pentru situația în care LUV au fost prepa rate din DOPC:DPPG. Gradul
de afectare a fluidității bistratului este, pentru cele două peptide, mai mare decât în cazul interacției
99 acestora cu LUV formate din lipide neutre , probabil , datorită apariției interacțiilor de natură
electrostatică, în plus faț ă de interacțiile hidrofobe . Acest comportament era de așteptat, deoarece
ambele peptide au afinitate mai mare pentru lipidele care prezintă sarcini negative în zona capetelor
polare (Batenburg și colab., 1988 ; Ladokhin și colab., 1997 ; Lee și colab., 2001 ). În schimb,
Cecropina P1 prezintă același comport ament față de membranele formate din DOPC:DPPG, ca și
în cazul DOPC, fluiditatea bistratului lipidic fiind identică cu cea din situația în care lipozomii
s-au aflat singuri în soluție.
Pentru testarea efectelor AMP asupra membranei externe a bacteriil or E. coli, am ales să
folosesc Melitina și Indolicidin a. Valorile ΔSR obținute indică un grad de împachetare mult mai
ridicat al lipidelor , datorat complexității care o au membranele biologice, față de cele din bistratul
lipidic al lipozomilor. Efectele p eptidelor asupra membranelor de E. coli se manifestă pentru tot
intervalul temperaturilor studiate, fiind mai pronunțat la temperaturi < 25 °C.
Atunci când am titrat lipozomii cu concentrații crescătoare de Melitină, pentru toate cazurile
studiate: LUV din DOPC, DOPC:Chol și MLV din DOPC:Chol, la ambele temperaturi de lucru,
15° C și 37° C, a apărut o saturare a valorilor parametrului ΔSR, diferența între această valoare și
valoarea ΔSR fără tratament fiind dependentă de lipidele care intră în componența bi stratului și de
temperatura de lucru.
Concluzii parțiale
Rezultatele obținute în urma experimentelor desfășurate au indicat că împachetarea lipidelor,
din membranele obținute artificial și a celor biologice, este afectată de interacția cu AMP. Gradul
de af ectare al împachetării lipidelor, raportat în cadrul acestor experimente de parametrul ΔSR, este
dependent de combinația peptidă -lipide.
Complexitatea membranelor biologice, datorată constituenților, mult mai mare decât a celor
artificiale, duce la un nive l de împachetare mai mare decât în cazul lipozomilor. Datorită
complexității, aceste membrane sunt mai puțin afectate de interacția cu AMP.
Pe de altă parte, gradul de destabilizare a bistratului, în cazul membranelor artificiale,
depinde de componentele c onstituente ale acestuia. Cu toate acestea, pentru interacția dintre o
100 peptidă și lipozomi, există o concentrație limită a acesteia, peste care efectul destabilizator nu se
mai manifestă.
Considerând că bistratul lipidic este prima componentă afectată de t ratamentul cu AMP,
această metodă de analiză poate fi utilizată, împreun ă cu alte tehnici de fluorescență, pentru
evaluarea efectelor peptidelor antimicrobiene asupra membranelor biologice sau artificiale.
101 10 Evaluarea interac ției AMP -membran ă
lipidică model utiliz ând stingerea
fluorescen ței Triptofan ului
Introducere
Fenomenul de stingere a fluorescenței se referă la orice proces fizico -chimic ce duce la
scăderea intensității fluorescenței unei probe. Există o mare varietate de interacții molecular e care
duc la apariția fenomenului de stingere a fluorescenței. Aceste interacții includ reacțiile care apar
în timpul stării excitate a fluoroforului, rearanjări a le structurii moleculare, transfer ul rezonant de
energie între molecule, formarea de complex e moleculare în starea fundamentală și stingerea
colizională a fluorescenței (Lakowicz, 2006 ).
Stingerea fluorescenței este intens studiată, pe de -o parte ca fenomen fundamental și pe de
altă parte ca sursă de informații referitoare la interacțiile care apar la nivelu l sistemelor biochimice.
Există două tipuri de stingere: statică și dinamică, ambele tipuri implicând contactul molecular
între moleculele de fluorofor și moleculele de stingător. În cazul stingerii colizionale, care este tot
de tip dinamic, moleculele de stingător trebuie să intre în contact cu cele de fluorofor pe parcursul
timpului de viață al stării excitate.
Rezultatele obținute în cadrul acestu i capitol au fost prezentate parțial la Conferința
”Analytical and Nanoanalytical Methods for Biomedical and Environmental Sciences” – IC-
ANMBES 2016 .
10.1 Stingerea colizională a fluorescen ței
Există o mare varietate de substanțe care se comportă ca stingători colizionali pentru
fluorofori. Unul dintre cei mai cunoscuți stingători colizionali ai fluorescenței, care a cționează
aproape asupra tuturor fluoroforilor, este oxigenul molecular (Eftink și Ghiron, 1994 ). Atomii grei,
iodul și bromul, sunt de asemenea , stingători ai fluorescenței. Fluorescența Indolului și a
102 derivaților acestuia este afectată de Histidină, Cisteină, Cu2+, Pb2+, Cd2+ și Mn2+. În plus,
fluorescența Indolului, Triptofanului și a derivaților acestora este stin să de acrilamidă,
succinimidă, dimetilformamidă, Eu3+, Ag+, Cs+ etc. (Eftink și Ghiron, 1976 ; Eftink și Ghiron,
1981 ; Eftink, 1991 ; Lakowicz, 2006 ).
Stingerea colizională a fluorescenței este descrisă de ecuația Stern -Volmer :
𝐹0
𝐹=𝜏0
𝜏=1+𝑘𝑏𝜏0[𝑄]=1+𝐾𝑆𝑉[𝑄] (10.1)
unde 𝐹0 și 𝐹 sunt intensitătile fluorescenței , 𝜏0 și 𝜏 sunt timpii de viață a fluorescenței în absența,
respectiv în prezența stingătorului, 𝑘𝑏 reprezintă con stanta bimoleculară, 𝜏0 este timpul de viață al
fluoroforului în absența stingătorului și 𝑄 reprezintă concentrația stingătorului. Din ecuația
anterioară se observă că 𝐾𝑆𝑉=𝑘𝑏𝜏0 reprezintă constanta de stingere Stern -Volmer. Relația
𝜏0
𝜏=1+𝑘𝑏𝜏0[𝑄]=1+𝐾𝑆𝑉[𝑄] este valabilă doar pentru fluoroforii care prezintă un singur timp
de scădere exponențială a fluorescenței (Lakowicz și Geddes, 2002 ). Pentru fluoroforii care
prezintă mai mulți timpi de viață, așa cum este și în cazul de față pentru reziduurile de Triptofan
din structura peptidelor, în ecuația (10.1) se vor folosi valorile timpului de viață mediu.
Datele obținute în urma experimentelor de stingere a fluorescenței sunt, în general,
reprezentate ca 𝐹0𝐹⁄ în funcție de [𝑄]. Din panta acestui grafic se obține , în urma un ei fitări liniar e,
constanta de stingere 𝐾𝑆𝑉.
Utilizând valorile obținute pentru 𝐾𝑆𝑉 și timpii de viață ai fluorescenței măsurați în absența
stingătorului se poate determina valoarea constantei bimoleculare, 𝑘𝑏, valoare care este un
indicator al eficienței stingerii sau al gradului de acesibilitate al stingătorului la moleculele de
fluorofor.
103 10.2 Determinarea constantei de stingere Stern -Volmer
pentru AMP
Măsurătorile de stingere a fluorescenței Triptofanului, uti lizând ca stingător o soluție
concentrată de acrilamidă, s -au efectuat utilizând peptidele (din Tabelul 5.2) la o concentrație
finală de 1 µM. Lipozomii au fost preparați din DOPC și DOPC:DPPG, iar lipidele din care aceștia
au fost preparați au avut o conc entrație finală de 50 µM.
Pentru efectuarea măsurătorilor de stingere a fluorescenței, soluțiile în care au fost
suspendate peptidele (PBS sau cele două tipuri de LUV) au fost lăsate în întuneric, la temperatura
de 25° C, cu agitare continuă, timp de 30 mi n., pentru atingerea echilibrului. Soluți ei i-au fost
înregistrate spectrele de fluorescență statică și rezolvată în timp. Din aceste spectre s -au obținut
valorile corespunzătoare maximului intensității fluorescenței ( F0) și timpului de viață mediu ( 𝜏0),
valori care s -au utilizat ulterior la prelucrarea datelor . Pentru stingerea fluorescenței s -a titrat o
soluție concentrată de acrilamidă, având concentrația inițială de 10 M, în pași de 7.5 µL. Astfel,
concentrația acrilamidei a fost incrementată în paș i de 25 mM. După echilibrarea soluției timp de
15 min., au fost înregistrate spectrele de fluorescență statică și rezolvată în timp. Chiar dacă
valorile timpilor de viață nu au fost utilizate la determinarea constantei de stingere, KSV,
Triptofanul având d oi timpi de viață, acestea au fost înregistrate pentru confirmarea tipului de
stingere urmărit. În cazul unei stingeri pur dinamice, dependența 𝜏0
𝜏 ([𝑄]) este liniară, cu panta
graficului diferită de 0, spre deosebire de stingerea statică, unde fl uoroforul și stingătorul formează
un complex care nu mai emite fluorescent, în acest caz panta graficului fiind egală cu 0 (Chilom
și colab., 2017 ). Pentru toate peptidele s -au obținut dependențe liniare între 𝜏0
𝜏 și [𝑄], cu panta
graficelor diferită de 0, confirmând astfel că stingerea fluorescenței în aceste experimente a fost
una de tip coli zional (stinger e dinamică).
104
300 350 400 450 5000.00.51.01.52.02.5
Acrilamida 200 mMIFLUORESC. [ *105 ]
[nm]Acrilamida 0 mM
Figura 10.1 Familie de spectre de fluorescență din care se obține
valoarea K SV.
Constantele KSV, corespunzătoare fiecărei peptide, aflate în una dintre condițiile: în PBS, în
amestec cu LUV preparați din DOPC sau din DOPC:DPPG, au fost obținute analizând familia de
spectre de emisie fluorescentă (Figura 10.1) corespunzătoare fiecărui set de măsurători. Valorile
obținute pentru KSV (Tabelul 10.1) reprezintă media a trei măsurători diferite.
În Figura 10.2 sunt reprezentate variațiile rapoartului 𝐹0
𝐹, pentru Melitină, Indolicidin ă și
Cecropina P1, în funcție de concentrația acrilamidei. Valorile reprezentate grafic în figura
următoare reprezintă media a trei măsur ători diferite. În această figură se observă o ușoară curbură
a graficului, pentru Melitină și Indolicidin ă în prezența LUV preparate din DOPC:DPPG, la
concentrații mari ale acrilamidei. Acest comportament apare când o fracție din reziduurile de
Triptofan este mai puțin accesibilă moleculelor de stingător.
105
0.00 0.05 0.10 0.15 0.201234 PBS DOPC DOPC:DPPGF0/F
Cacy [M]A
0.00 0.05 0.10 0.15 0.2012345F0/F
Cacy [M]B PBS DOPC DOPC:DPPG
0.00 0.05 0.10 0.15 0.20123F0/F
Cacy [M]C PBS DOPC DOPC:DPPG
Figura 10.2 Reprezentări Stern -Volmer pentru Melitină (A),
Indolicidin ă (B) și Cecropina P1 (C) .
În Figura 10.3 sunt reprezentate variațiile rapoartului 𝐹0
𝐹, pentru peptidele P1 – P8, în funcție
de concentrația acrilamidei. Valorile reprezentate grafic în figura următoare reprezintă media a trei
măsurători diferite. Î n final, toate rezultatele obținute, 𝐹0
𝐹=𝑓([𝑄]),𝜏0 și 𝑘𝑏, sunt prezentate în
Tabelul 10.1.
106
0.00 0.05 0.10 0.15 0.201.01.52.02.53.0 PBS
DOPC
DOPC:DPPGF0/F
Cacy [M]P1
0.00 0.05 0.10 0.15 0.201.01.52.02.53.03.5 PBS
DOPC
DOPC:DPPGF0/F
Cacy [M]P2
0.00 0.05 0.10 0.15 0.201.01.52.02.53.0 PBS
DOPC
DOPC:DPPGF0/F
Cacy [M]P3
0.00 0.05 0.10 0.15 0.201.01.52.02.5 PBS
DOPC
DOPC:DPPGF0/F
Cacy [M]P4
0.00 0.05 0.10 0.15 0.201.01.52.02.53.03.54.0 PBS
DOPC
DOPC:DPPGF0/F
Cacy [M]P5
0.00 0.05 0.10 0.15 0.201.01.52.02.53.03.5 PBS
DOPC
DOPC:DPPGF0/F
Cacy [M]P6
0.00 0.05 0.10 0.15 0.201.01.52.02.53.03.54.0 PBS
DOPC
DOPC:DPPGF0/F
Cacy [M]P7
0.00 0.05 0.10 0.15 0.201.01.52.02.53.03.5 PBS
DOPC
DOPC:DPPGF0/F
Cacy [M]P8
Figura 10.3 Reprezentări Stern -Volmer pentru peptidele nou sintetizate , P1 – P8.
107 Tabelul 10.1 Valorile KSV, τ0 și k b pentru peptidele utilizate în acest studiu .
Sistem Peptida Structura primar ă a KSV b [M-1] 𝝉̃𝟎 b [ns] kb b [M-1ns-1]
PBS Melitina GIGAVLKVLTTGLPALIS WIKRKRQQ 16.56 ± 0.53 2.69 ± 0.02 6.16 ± 0.20
Indolicidin a ILPWKWPWW PWRR 17.58 ± 0.20 1.68 ± 0.01 10.47 ± 0.12
Cecropina P1 SWLSKTAKKLENSAKKRISEGIAIAIQGGPR 8.99 ± 0.13 1.75 ± 0.01 5.15 ± 0.07
P1 RRWW RHWRR 9.37 ± 0.04 1.64 ± 0.01 5.72 ± 0.02
P2 RRWHRWW RR 11.08 ± 0.08 1.82 ± 0.03 6.08 ± 0.05
P3 RRH WRWW RR 8.42 ± 0.12 1.58 ± 0.02 5.32 ± 0.08
P4 RRWHRH WRR 7.81 ± 0.08 1.95 ± 0.01 4.00 ± 0.04
P5 RRWW RWW RR 12.88 ± 0.12 1.50 ± 0.04 8.58 ± 0.09
P6 HRWW RWW RR 10.42 ± 0.08 1.65 ± 0.02 6.33 ± 0.05
P7 RRWW HWW RR 14.13 ± 0.20 1.56 ± 0.02 9.04 ± 0.13
P8 HRWW RWW RH 12.53 ± 0.10 1.41 ± 0.09 8.87 ± 0.11
DOPC Melitina GIGAVLKVLTTGLPALIS WIKRKRQQ 2.57 ± 0.04 2.55 ± 0.08 1.01 ± 0.02
Indolicidin ILPWKWPWW PWRR 3.33 ± 0.04 2.28 ± 0.03 1.46 ± 0.02
Cecropina P1 SWLSKTAKKLENSAKKRISEGIAIAIQGGPR 3.39 ± 0.05 2.32 ± 0.07 1.46 ± 0.02
P1 RRWW RHWRR 7.67 ± 0.09 1.97 ± 0.05 3.88 ± 0.05
P2 RRWHRWW RR 6.56 ± 0.21 2.10 ± 0.01 3.12 ± 0.10
P3 RRH WRWW RR 5.64 ± 0.01 1.37 ± 0.02 4.10 ± 0.01
P4 RRWHRH WRR 4.25 ± 0.01 2.19 ± 0.11 1.94 ± 0.01
P5 RRWW RWW RR 6.76 ± 0.22 2.34 ± 0.02 2.89 ± 0.09
P6 HRWW RWW RR 6.09 ± 0.07 2.22 ± 0.04 2.74 ± 0.03
P7 RRWW HWW RR 6.05 ± 0.25 2.24 ± 0.05 2.70 ± 0.11
P8 HRWW RWW RH 8.19 ± 0.26 2.21 ± 0.03 3.70 ± 0.12
DOPC:DPPG Melitina GIGAVLKVLTTGLPALIS WIKRKRQQ 4.64 ± 0.29 2.40 ± 0.09 1.94 ± 0.12
Indolicidin ILPWKWPWW PWRR 5.41 ± 0.15 2.31 ± 0.07 2.34 ± 0.07
Cecropina P1 SWLSKTAKKLENSAKKRISEGIAIAIQGGPR 7.01 ± 0.15 1.89 ± 0.02 3.70 ± 0.08
P1 RRWW RHWRR 3.34 ± 0.12 2.16 ± 0.08 1.55 ± 0.06
P2 RRWHRWW RR 3.80 ± 0.08 2.20 ± 0.06 1.73 ± 0.04
P3 RRH WRWW RR 4.36 ± 0.04 1.54 ± 0.08 2.83 ± 0.03
P4 RRWHRH WRR 4.76 ± 0.13 2.09 ± 0.07 2.28 ± 0.07
P5 RRWW RWW RR 5.27 ± 0.22 2.37 ± 0.04 2.22 ± 0.09
P6 HRWW RWW RR 4.19 ± 0.08 2.30 ± 0.04 1.82 ± 0.03
P7 RRWW HWW RR 3.02 ± 0.04 2.32 ± 0.03 1.30 ± 0.02
P8 HRWW RWW RH 4.71 ± 0.10 2.20 ± 0.05 2.14 ± 0.04
a În structura primară a peptidelor sunt evidențiate în roșu reziduurile de Triptofan.
b Valori medii obținute în trei experimente diferite ± deviațiile standard.
108 10.3 Discu ții
Rezultatele obținute în urma prelucrării datelor experi mentale, prezentate în Tabelul 10.1,
sunt reprezentate grafic în Figura 10.4.
Mel IndCP1 P1 P2 P3 P4 P5 P6 P7 P8
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11048121620KSV [M-1] PBS DOPC DOPC:DPPG A
Figura 10.4 Valorile KSV, τ0 și k b pentru pept idele utilizate în acest studiu .
Valorile obținute pentru KSV și kb, corespunzătoare Melitinei în PBS (16.56 ± 0.53 M-1 și
6.16 ± 0.20 M-1ns-1) și DOPC (2.57 ± 0.04 M-1 și 1.01 ± 0.02 M-1ns-1), sunt în concordanță cu
valorile regăsite în literatură (Raghuraman și Chattopadhyay, 2004c ; Raghuraman și
Chattopadhyay, 2006 ). Interesantă este comportarea Melit inei în prezența LUV preparați din
DOPC -DPPG. Utilizarea lipidelor anionice, DPPG (15 %), duce la o creștere de aproape două ori
109 a valorilor KSV și kb obținute în aceast caz (4.64 ± 0.29 M-1 și 1.94 ± 0.12 M-1ns-1). Acest fapt se
datorează structurii secun dare pe care o adoptă Melitina atunci când se află adsorbită la nivelul
bistratului lipidic , având de -o parte a α-helix -ului reziduurile hidrofobe și diametral opus
reziduurile polare și cele cationice (Dathe și Wieprecht, 1999 ; Raghuraman și Chattopadhyay,
2007 ). Reorientarea Melitinei în LUV preparate din DOPC:DPPG se observă și din ușoara sc ădere
a timpului mediu de viață al fluorescenței, τ0 = 2.40 ns ± 0.09 ns, spre deosebire de situația în care
Melitina se află în prezența LUV preparate din DOPC, timpul de viață mediu al fluorescenței fiind
în acest caz 𝜏̃0 = 2.55 ns ± 0.08 ns. Prezența lipidelor ani onice în structura bistratului duce la o
orientare diferită a peptidei față de planul acestuia, în final, reziduul de Triptofan fiind mai expus
mediului hidrofil și, implicit, moleculelor de stingător.
La fel ca în cazul Melitinei, interacția Indolicidin ei cu cele două tipuri de membrane lipidice
artificiale, preparate din DOPC și DOPC:DPPG, a dus la o scădere substanțială a valorilor KSV și
kb, comparativ cu situația în care peptida s -a aflat suspendată doar în PBS . Astfel, în cazul DOPC
am obținut valoril e 3.33 ± 0.04 M-1 și 1.46 ± 0.02 M-1ns-1 pentru KSV și, respectiv, kb, iar în cazul
DOPC:DPPG am obținut valorile 5.41 ± 0.15 M-1 și 2.34 ± 0.07 M-1ns-1 pentru KSV și, respectiv,
kb. Dacă pentru KSV, în PBS s -au obținut valori apropiate pentru Melitină și Indolicidin ă (aceste
valori sunt apropiate de valoare a KSV pentru Triptofan în PBS) , diferenț ele dintre aceste două
peptide o fac valorile obținute pentru constanta bimoleculară, kb. În cazul Indolicidin ei în PBS
aceasta are valoarea de 10.47 ± 0.12 M-1ns-1, comparativ cu valoarea de 6.16 ± 0.20 M-1ns-1
obținută pentru Melitină. Această diferență este o indicație a faptului c ă Triptofanul din structura
Indolicidin ei este mult mai accesibil moleculelor de acrilamidă. Același lucru este sugerat și de
diferenț a care apare între timpii de viață corespunzători celor două peptide , în cazul în care acestea
se afl ă suspendate doar în PBS . Reorientarea reziduurilor de Triptofan din structura Indolicidin ei,
în prezența celor două tipuri de lipozomi, se observ ă și din creșterea timpilor de viață ,
corespunzători celor două situații , DOPC și DOPC:DPPG . Deși timpii de viață ai fluorescenței
sunt aproximativ identici pentru cele două tipuri de LUV, diferența între modul în care Indolicidin a
interacționează cu aceste membran e o face valoarea constantei bimoleculare. În cazul
DOPC:DPPG, utilizarea lipidelor anionice duce la o reorientare a peptidei relativ la planul
membranei datorită interacțiilor de natură electrostatică, valoarea mai mare pentru constanta
bimoleculară suger ând un grad mai mare de expunere al reziduurilor de Triptofan la mediul
hidrofil, acestea interacționând mai mult cu acrilamida.
110 Pentru Cecropina P1 diferențele care apar între structura secundară a acestei peptide (α-helix
alungit) și cele două discutate anterior, Melitina (structura tip “ random coil ”) și Indolicidin a
(structură dezordonată), sunt indicate de valorile obținute pentru KSV și kb. Valoarea kb,
de 5.15 ± 0.07 M-1ns-1, cea mai mică dintre valorile obținute pentru cele cele trei peptide, când
acestea se află în soluții apoase, este un indicator al faptului că reziduul Triptofan din structura
acesteia este cel mai puțin accesibil moleculelor de acrilamidă. Modificarea conformației peptidei
în prezența LUV preparate din DOPC s e vede, pe de -o parte, din scăderea valorii kb, la 1.46 ± 0.02
M-1ns-1 și, pe de altă parte, prin creșterea timpului de viață al fluorescenței de la 1.75 ± 0.01 ns la
2.32 ± 0.07 ns, consecință a reorientării peptidei relativ la planul bistratului. Atunci când peptida
se află în prezența LUV preparate din DOPC:DPPG, interacțiile între DPPG și reziduurile
cationice prezente în structura acesteia, duc la o sc ădere a timpului de viață, la valoarea de
1.89 ± 0.02 ns și la creșterea constantei bim oleculare la o valoare dublă, 3.70 ± 0.08 M-1ns-1. Astfel,
manifestarea interacțiilor electrostatice, în plus față de cele hidrofobe, care erau dominante în
situația peptidei în prezența LUV preparate din DOPC, duce la adoptarea unei conformații diferite
a peptidei, relativ la planul membranei lipidice, reziduul de Triptofan fiind mai expus mediului.
Pentru peptidele nou sintetizate, P1 – P8, se observă un comportament aproximativ identic,
pentru cele trei situații analizate, PBS , cele mai mari valori ale kb, DOPC , valori “medii” ale kb, și
DOPC:DPPG cele mai mici valori ale kb, excepție făcând P4, care în prezența LUV preparate din
DOPC:DPPG are o valoare a kb, de 2.28 ± 0.07 M-1ns-1, mai mare decât în cazul în care se află în
prezența LUV preparate din DOP C, kb având în această situație valoarea de 4.00 ± 0.04 M-1ns-1.
Dacă împărțim cele opt peptide în trei clase, în funcție de numărul reziduurilor de Triptofan
prezente în structura primară a acestora, și anume: 2 reziduuri (P4), 3 reziduuri (P1 – P3) și 4
reziduuri (P5 – P8), și considerăm că toate reziduurile prezintă, inițial, același grad de accesibilitate
la moleculele de stingător , lucru care se observă din valorile obținute pentru τ0 în PBS, excepție
făcând aceeași peptidă P4, observăm că valorile obț inute pentru kb, atunci când peptidele se află în
PBS, sunt și ele împărțite tot în trei clase, clase care se află în legătură directă cu numărul de
reziduuri de Triptofan din structura peptidelor. Astfel, pentru clasa P1 – P3, valorile kb au fost
situate în intervalul 5.32 ± 0.08 M-1ns-1, pentru P3, și 6.08 ± 0.05 M-1ns-1, pentru P2; pentru P4,
clasa cu 2 reziduuri, am obținut o valoare a kb de 4.00 ± 0.04 M-1ns-1; pentru clasa cu 4 reziduuri,
P5 – P8, valorile kb s-u situat între 6.33 ± 0.05 M-1ns-1, pent ru P6, fiind cea mai mică valoare
obținută pentru cele patru peptide, și 9.04 ± 0.13 M-1ns-1, pentru P7. Analizând mai în detaliu
111 aceste valori observăm că dou ă dintre peptidele studiate, P4 și P6, prezintă valori ale kb mai mici
decât celelalte; P4 are ce a mai mică valoare dintre toate cele opt peptide și P6 are cea mai mică
valoare din clasa celor cu 4 reziduuri de Triptofan.
Pentru cazul în care peptidele se află în prezența LUV preparate din DOPC, dacă analizăm
valorile timpului de viață (Figura 10.4 – B), se poate spune că acestea au un comportament
asemănător, cu valori ale lui τ0 cuprinse între 1.97 ± 0.05 ns, pentru P1, și 2.34 ± 0.02 ns, pentru
P5. Toate aceste valori sunt mai mari decât în cazul în care peptidele s-au aflat în PBS. Un
comportament diferit l -a avut în această situație P3, aceasta având pentru τ0 o valoare de
1.37 ± 0.02 ns, puțin mai mic ă (≈ 0.2 ns) față de situația când peptida s -a aflat în PBS și cu ≈ 0.8
ns față de valorile lui τ0 ale celorlalte peptide. Din valoril e kb, se observă că peptidele cu cel mai
mare grad de expunere al grupărilor cromofore, prezente în structura lor, sunt P1, P3 și P8. Cea
mai mică dintre valorile obținute pentru constanta bimoleculară, 4.00 ± 0.04 M-1ns-1 a fost pentru
P4, fapt care era d e așteptat, dealtfel, având în vedere că aceasta are în structura sa doar 2 reziduuri
de Triptofan.
Atunci când peptidele s -au aflat în prezența LUV preparate din DOPC:DPPG, au apărut
ușoare creșteri pentru valorile τ0, excepție facân d aceeași P4, pentru c are valoarea obținută a fost
mai mică decât în cazul LUV preparate din DOPC. Acest rezultat indică faptul că grupările
cromofore din structura peptidei P4 sunt mai expuse solventului , fapt care rezultă și din valorile kb
corespunzătoare celor două situații . Pentru celelalte peptide, se observă că interacția dintre DPPG
și reziduurile de Arginină favorizează inserția peptidei în bistratul lipidic, grupările cromofore din
structura peptidei fiind mai puțin accesibile moleculelor de acrilamidă, în comparație c u situația
în care între peptide și bistrat se manifestă numai interacții de hidrofobe ( între reziduurile de
Triptofan și bistratul din DOPC). Astfel, cea mai mică valoare pentru kb s-a obținut pentru P7, de
1.30 ± 0.02 M-1ns-1. Valori asemănătoare s -au ob ținut și pentru P1, P2 și P6.
Rezultatele obținute în experimentele descrise în cadrul acestui capitol, împreună cu cele din
capitolul următor, vor fi utilizate la redactarea unui articol, care va fi trimis spre publicare într -o
revistă de specialitate.
112 Concluzii par țiale
În experimentele din acest capitol am determinat constantele de stingere Stern -Volmer ( KSV),
timpul de viață mediu al fluorescenței reziduurilor de Triptofan ( τ0) și constantele bimoleculare
(kb) pentru Melitină, Indolicidin ă, Cecropina P1 și cele opt peptide nou sintetizate, P1 – P8, cu
potențial antimicrobian.
Pentru punerea la punct a protocoalelor de lucru au fost utilizate Melitina, Indolicidin a și
Cecropina P1. Pe baza rezultatelor obținute pentru situația în care acestea s -au aflat î n PBS, am
pus în evidență relația care există între structura secundară pe care acestea o adoptă în soluție și
constanta bimoleculară care a rezultat în urma prelucrării datelor experimentale. Astfel, pentru cea
mai complexă structură, α-helix -ul alungit a l Cecropinei P1, am obținut cea mai mică valoare a
constantei bimoleculare, iar cea mai mare valoare a acestei constante a fost obținută pentru
Indolicidin ă, care are o structură dezordonată. În prezența LUV preparate din DOPC, interacția
dintre reziduuril e hidrofobe din structura primară a peptidelor, duce la o scădere substanțială a
constantei bimoleculare pentru toate cele trei peptide. Interacțiile dintre reziduurile cationice, din
structura peptidelor, și lipidele anionice, în situația în care peptidel e s-au aflat în prezența LUV
preparate din DOPC:DPPG, a dus la o creștere a constantelor bimoleculare, corespunzătoare celor
trei peptide , datorită reorientării acestora față de planul membranei lipozomilor.
Comportamentul peptidelor P1 – P8, în prezența m oleculelor de stingător (acrilamidă) este
asemănător, dacă se ține cont de numărul reziduurilor de Triptofan din structura acestora și de
timpul de viață al fluorescenței în absența acrilamidei, excepție facând P4 și P6. Astfel, putem
spune despre aceste d ouă peptide că, atunci când se află în PBS, prezintă o structură distinctă de
celelalte șase, în sensul că grupările cromofore sunt mai puțin accesibile moleculelor de acrilamidă ,
ca rezultat al valorilor obținute pentru constantele bimoleculare .
Interacți ile dintre peptidele P1 – P8 și LUV preparate din DOPC sunt puse în evidență cu
ajutorul valorilor obținute pentru constantele bimoleculare, kb, corespunzătoare fiecărei peptide.
Se observă că și aceste valori sunt grupate în funcție de num ărul reziduurilo r de Triptofan din
structura peptidelor. Astfel , avem un prim grup de valori pentru peptidele cu 3 reziduuri, P1 – P3,
un grup de valori pentru P5 – P8 și , separat, valoarea cea mai mică a constantei bimoleculare,
pentru P4. O valoare aparte o are timpul d e viață corespunzător peptidei P3, mai mică în comparație
113 cu al celorlalte peptide, ceea ce duce la concluzia că aceasta adoptă , în interacția cu bistratul format
din DOPC , o conformație în care reziduurile de Triptofan sunt mai exp use mediului hidrofil.
În prezența LUV formate din DOPC:DPPG, interacțiile dintre reziduurile cationice , în cazul
de față Arginina, și lipidele anionice (DPPG) din structura bistratului, în plus față de interacțiile
hidrofobe datorate Triptofanului, au dus la o sc ădere a constan telor bimoleculare pentru toate
peptidele, scădere care este un indicator că grupările cromofor e sunt mai puțin accesibile
moleculelor de acrilamidă.
114
115 11 Determinarea energiei libere de
partiționare utiliz ând fluorescen ța
Triptofanului
Introducere
Utilizarea tehnicilor de spectroscopie de fluorescență pentru studierea interacțiilor care apar
între AMP și membranele lipidice au avantajul că în structura primară a acestor peptide se
regăsește reziduul Triptofan. Mai multe prop rietăți ale acestui fluorofor intrinsec , proprietăți
dependente de mediul în care acest fluorofor se găsește, pot fi utilizate pentru determinarea
variației energiei libere Gibbs, ΔG, de partiționare din mediul hidrofil în mediul hidrofob:
deplasarea maxim ului de fluorescență care apare la interacția peptidă -bistrat, modificări ale
eficienței cuantice și a timpului mediu de viață al fluorescenței Triptofanului (Loura și colab.,
2003 ).
O parte din rezultatele obținute în cadrul acestu i capitol au fost prezentate la Conferința
”International Balkan Workshop on Applied Physics and Materials Science” – IBWAP 2017.
11.1 Modele utilizate pentru determinarea ΔG
Asocierea AMP cu membr anele lipidice este descrisă cel mai bine din punt de vedere
cantitativ (la atingerea echilibrului dintre cantitatea de peptidă care se g ăsește în faza apoasă și
cantitatea de peptidă adsorbită la nivelul bistratului ) de valoarea coeficientului de partiție , KP,
definit astfel:
𝐾𝑃=[𝑃𝐿]
[𝑃𝐴]∗[𝐿] (11.1)
unde: [𝑃𝐿] reprezină concentra ția peptidei adsorbite la nivelul bistratului, [𝑃𝐴] reprezintă
concentrația peptidei din faza apoasă și [𝐿] reprezintă concentrația lipidelor din soluție (White și
colab., 1998 ).
116 Valoarea variației energiei libere Gibbs , ΔG, de partiționare din mediul hidrofil în mediul
hidrofob se obține utilizând coeficientul de partiție definit în ecuația (11.1):
𝛥𝐺=−𝑅𝑇ln(𝐾𝑃∗[𝑊]) (11.2)
unde: 𝑅 reprezi ntă constanta universală a gazului ideal, 𝑇 temperatura la care s -a desfășurat
experimentul, în grade Kelvin și [𝑊] este concentrația molară a apei (Seelig, 2004 ).
Rezultatele experimentale obținute pentru cele trei peptide utilizate ca model, Melitina,
Indolicidin a și Cecropina P1, au fost analizate utilizând mai multe modele din literatura de
specialitate.
Un prim model de calcul al coeficientului de partiție, KP, face legătura între deplasarea
maximului de emisie fluorescentă , Δλ, și gradul de asociere dintre peptide și bistratul lipidic
(Șchiopu și colab., 2012 ), cele două mărimi fiind proporționale. Gradul de asociere , APL, este
definit ca:
𝐴𝑃𝐿=𝐾𝑃∗[𝐿]
𝐾𝑃∗[𝐿]+1 (11.3)
Deoarece deplasarea maximului de emisie fluorescentă este proporțională cu concentrația de
lipide din soluția analizată, datele experimentale pot fi analizate u tilizând ecuația hiberbolică:
𝛥𝜆= 𝛥𝜆𝑚𝑎𝑥 ∗𝐴𝑃𝐿=𝛥𝜆𝑚𝑎𝑥𝐾𝑃∗[𝐿]
𝐾𝑃∗[𝐿]+1 (11.4)
unde 𝛥𝜆𝑚𝑎𝑥 reprezintă deplasarea maximă a emisiei fluorescente, atunci când concentraț ia
lipidelor în soluție este mult mai mare decât concentrația peptidei.
Următorul model folosit la prelucrarea datelor experimentale utilizează valorile intensității
fluorescenței la o lungime de undă fixă, lungime de undă aleasă astfel înc ât sa conțină in formații
din spectrul de fluorescență în absența lipozomilor dar și din spectrele înregistrate în prezența
lipozomilor (Ladokhin și colab., 2000 ). Dezavantajul acestei metode este reprezentat de faptul că
intensitatea de fluorescență înregistrată pentru fiec are combinați e peptidă -lipid în parte, trebuie
corectată pentru artefactele datorate împră știerii luminii. Factorul de corecție se obține în urma
titrării unei soluții de Triptofan , în acelea și condiții ca la titrarea soluțiilor de peptide.
117 Relația care se folosește pentru corecția spectrelor de fluorescență este (Ladokhin și colab.,
2000 ):
𝐹𝑃𝐶𝑜𝑟([𝐿])=𝐹𝑃([𝐿])𝐹𝑇𝑟𝑝𝑃𝐵𝑆
𝐹𝑇𝑟𝑝([𝐿]) (11.5)
unde: 𝐹𝑃𝐶𝑜𝑟 este intensitatea fluorescenței corectată, pentru fiecare concentrație a lipidelor, 𝐹𝑃 este
intensitatea măsurată a fluorescenței, pentru fiecare concentrație a lipidelor, 𝐹𝑇𝑟𝑝𝑃𝐵𝑆 este intensitatea
fluorescenței Triptofanului în PBS și 𝐹𝑇𝑟𝑝 este inten sitatea fluorescenței Triptofanului, pentru
fiecare concentrație a lipidelor.
Datele experimentale se analizează folosind următoarea ecuație (Ladokhin și colab., 2000 ):
𝐹𝑃𝐶𝑜𝑟([𝐿])=1+(𝐹∞−1)𝐾𝑃∗[𝐿]
𝐾𝑃∗[𝐿]+[𝑊] (11.6)
unde: [𝐿] reprezintă concentrația lipidelor din soluție, 𝐹∞ reprezintă intensitatea fluorescenței
atunci când partiția peptidei în bistrat este completă și [𝑊] este concentrația molară a apei
(55.3 M).
Ultimul model de analiză a datelor experimentale de fluorescență statică este descris de
ecuația (11.7), ecuație în care se pot utiliza fie intensitatea fluorescenței la o lungime de undă fixă ,
aleasă la fel ca pentru ecuația (11.6) , fie aria totală sau parț ială, a spectrului de fluorescență (Loura
și colab., 2003 ):
𝐹𝑃𝐿=𝐹𝑃𝐵+(𝐹𝑃𝐿−𝐹𝑃𝐵)∗𝐾𝑃∗[𝐿]
𝐾𝑃∗[𝐿]+[𝑊] (11.7)
unde: 𝐹𝑃𝐿 este intensitatea măsurată (aria) a fluorescenței, pentru fiecare concentrație a lipidelor și
𝐹𝑃𝐵 este intensitatea măsurată (aria) a fluorescenței în PBS.
Pentru determinarea variației energiei libere Gibbs, ΔG, de parti ționare din mediul hidrofil
în mediul hidrofob, utilizând rezultatele experimentale obținute în urma măsur ării timpului de viață
mediu al fluorescenței, am folosit două modele descrise în literatură.
Primul model utilizat este descris de următoarea ecuație (Bastos și colab., 2008 ):
118 𝜏̃=𝜏̃𝑃𝐵+𝜏̃𝑃𝐿∗𝛾𝐿∗𝐾𝑃∗[𝐿]
1+𝛾𝐿∗𝐾𝑃∗[𝐿] (11.8)
unde: 𝜏̃ este timpul de viață mediu m ăsurat, 𝜏̃𝑃𝐵 este timpul de viață mediu m ăsurat, pentru situația
în care regăsim peptida în PBS, 𝜏̃𝑃𝐿 reprezintă timpul de viață mediu atunci când partiția peptidei
în bistrat este completă și 𝛾𝐿 reprezintă volumul molar al lipidului.
Al doilea model care utilizează variația timpul de viață mediu al fluorescenței, și ultimul din
cele folosite pentru determinarea variației energiei libere Gibbs de partiționare a peptidelor din
mediul hidrofil în mediu l hidrofob, este asem ănător cu cel descris de ecuația (11.7) și are
următoarea formă (Loura și colab., 2003 ):
𝜏̃𝑃𝐿=𝜏̃𝑃𝐵+(𝜏̃𝑃𝐿−𝜏̃𝑃𝐵)∗𝐾𝑃∗[𝐿]
𝐾𝑃∗[𝐿]+[𝑊] (11.9)
11.2 Determinarea ΔG pentru AMP
Pentru determinarea variației energiei libere Gibbs, ΔG, de partiționare a peptidelor din
mediul hidrofil în mediul hidrofob a fost folosit un protocol de lu cru în care soluția de peptidă a
fost titrată cu o soluție concentrată de LUV.
Soluția de peptidă dizolvată în PBS , având concentrația finală de 1 µM, a fost ținută în
întuneric, cu agitare continuă, timp de 30 min., pentru atingerea echilibrului. După scu rgerea
acestui interval, au fost înregistrate spectrele de fluorescență statică și fluorescență rezolvată în
timp, spectre din care s -au determinat valorile 𝐹𝑃𝐵 și 𝜏̃𝑃𝐵, utilizate pentru prelucrarea datelor
folosind ecuațiile prezentate anter ior.
Titrarea soluțiilor de peptidă s -a făcut utilizând soluții concentrate de LUV, 12.5 mM,
preparate din DOPC și DOPC:DPPG. La fiecare pas al titrării, amestecul de peptide cu lipozomi a
fost ținut în întuneric, timp de 15 min. și agitat continuu, pentr u atingerea echilibrului. În final
s-au înregistrat spectrele de fluorescență statică și fluorescență rezolvată în timp ale amestecului
de peptide și LUV. Concentrațiile finale ale lipidelor, în soluția de peptide, rezultate în urma
titrarii, au fost : 5 µM, 10 µM, 20 µM, 40 µM, …, 180 µM și 200 µM. Din prelucrarea acestor
spectre au rezultat valorile folosite pentru determinarea ΔG utilizând ecuațiile din modelele
119 descrise anterior. O familie de spectre , pentru Indolicidin ă titrat ă cu LUV preparate di n DOPC,
utilizate pentru determinarea variației energiei libere Gibbs de partiționare a peptidelor din mediul
hidrofil în mediul hidrofob , este prezentată în figura următoare.
300 350 400 450 500012345
200 MIFLUORESC. [x105 cps]
[nm]0 MConcentratia lipidelor
in solutie
Figura 11.1 Familie de spectre din care se obțin valor ile parametrilor
utilizați în modelele de calcul a ΔG utilizând fluorescența statică .
Pentru obținerea ΔG, datele experimentale au fost fitate, în Origin, cu ecuațiile
corespunzătoare fiecărui model de anal iză. Este de precizat faptul că pentru concentrația lipidelor
s-au folosit valori reduse la jumătate, deoarece se consideră că peptidele interacționează numai cu
peretele exterior al LUV (White și colab., 1998 ). Un exemplu de fitări, pentru Indolicidin ă titrat ă
cu LUV preparate din DOPC, este ilustrat în Figura 11.2.
120
0 2 4 6 8 100246810121416
Model fit [nm]
CL/2 [x10-5 M]Model RectHyperbola
Equation y = a*b*x/(1+b*x)
Plot \g(Dl)
a 13.95282
b363074.71028
Reduced Chi-Sqr 0.68117
R-Square(COD) 0.96285
Adj. R-Square 0.95947A
0 2 4 6 8 101.01.52.02.53.03.54.04.5
IFLUORESC. @ 335 nm
Model fitIFLUORESC. [x105 cps]
CL/2 [x10-5 M]Model deltaG_comp (User)
Equation112735.80439+((A-112735.80
439)*B*x)/(55.3+B*x)
Plot 335
A 438301.29416
B 4.25478E6
Reduced Chi-Sqr 1.29099E8
R-Square(COD) 0.98702
Adj. R-Square 0.98584B
0 2 4 6 8 101.501.651.801.952.102.252.40
0
Model fit [ns]
CL/2 [x10-5 M]Model deltaG_tau (User)
Equation(1.5701+A*0.782*x*B)/(1+A*0.7
82*x)
Plot \g(t\-(0_))\-(AMP)
A 270545.39786
B 2.26207
Reduced Chi-Sqr 0.0012
R-Square(COD) 0.97509
Adj. R-Square 0.97282C
Figura 11.2 Fitarea datelor experimentale cu modelele teoretice,
pentru Indolicidin titrat cu LUV preparate din DOPC .
A – fitarea variației Δλ ([L]/2 ), cu ecua ția (11.4); B – fitarea variației 𝐹𝑃𝐿 ([L]/2),
cu ecuația (11.7); C – fitarea variației 𝜏̃ ([L]/2), cu ecuația (11.8) .
Valorile ΔG, obținute în urma prelucrării datelor experimentale, pentru Melitină,
Indolicidin ă și Cecropina P1, sunt prezentate în Ta belul 11.1. Pentru fiecare combinație peptidă –
lipide, a fost determinată ΔG, utilizând modelele descrise de ecuațiile (11.4), (11.6) – (11.9).
Valorile din tabel sunt valorile medii obținute din trei experimente diferite ± deviațiile standard .
Aceste rezu ltate au fost prezentate la Conferința ”International Balkan Workshop on Applied
Physics and Materials Science” – IBWAP 2017, sub forma unei lucrări tip Poster .
121 Tabelul 11.1 Variația energiei libere Gibbs, ΔG, de partiționare a peptidelor din
mediul hidrofil în mediul hidrofob, pentru Melitină, Indolicidin ă și Cecropina P1.
Peptida Melitina Indolicidin a Cecropina P1
Lipid DOPC DOPC:DPPG DOPC DOPC:DPPG DOPC DOPC:DPPG
Modelul de analiză ΔG [kcal/M]
Ecuația 11.4 -9.43 ± 0.17 -10.11 ± 0.02 -9.75 ± 0.29 -10.45 ± 0.02 – –
Ecuația 11.6 a -10.16 ± 0.09 -10.11 ± 0.40 -9.94 ± 0.42 -9.39 ± 0.17 – –
Ecuația 11.7 a -9.66 ± 0.16 -9.94 ± 0.08 -9.22 ± 0.45 -8.99 ± 0.05 – –
Ecuația 11.7 b -9.95 ± 0.01 -10.36 ± 0. 29 -9.23 ± 0.45 -8.87 ± 0.06 -8.13 ± 0.23 -9.38 ± 0.21
Ecuația 11.7 c -10.27 ± 0.26 -10.27 ± 0.26 -9.27 ± 0.48 -8.85 ± 0.06 -8.13 ± 0.22 -9.74 ± 0.10
Ecuația 11.8 – – -9.64 ± 0.01 -10.26 ± 0.10 -8.21 ± 0.05 -9.46 ± 0.43
Ecuația 11.9 – – -9.64 ± 0.01 -10.26 ± 0.10 -8.21 ± 0.05 -9.54 ± 0.31
a Intensitatea de fluorescență la λ = 335 nm
b Aria spectrului de emisie fluorescentă
c Aria spectrului de emisie fluorescentă între λ = 315 nm și λ = 465 nm
Pentru peptidele P1 – P8 valorile ΔG au fost obținute utilizând modele descrise de ecuațiile
(11.4) și (11.8). Aceste valori sunt prezentate în Tabelul 11.2 și reprezintă valorile medii obținute
din trei experimente diferite ± deviațiile standard. Pentru aceste peptide am ales, pentru
determinarea variației energiei libere de partiționare ΔG, să folosesc modelele descrise de ecuația
(11.4), pentru fluorescența statică, și ecuația (11.8), pentru fluorescența rezolvată în timp. Alegerea
celor două modele am decis -o din două considerente: a) pentru modelul care utilizează datele
obținute din experimentele de fluorescență statică ; din acesta se obține, în plus de valoarea
coeficientului de partiție, KP, și deplasarea maximului de emisie fluorescentă, deplasare ce este un
indicator al gradului de penetrare al rezid uurilor de Triptofan în interiorul bistratului lipidic;
b) pentru modelul care utilizează datele obținute din experimentele de fluorescență rezolvată în
timp; din acesta se obține și valoarea limită a timpului de viață, acesta fiind un indicato r al faptului
că fluoroforul , și implicit , structura din care acesta face parte, nu mai suferă modificări
conformaționale.
Tabelul 11.2 Variațiile energiei libere Gibbs, ΔG, de partiționare a peptidelor din mediul
hidrofil în mediul hidrofob, pentru toate peptidele.
Pentru fiecare combinație peptidă -lipid sunt indicate și deplasarea maximului emisiei
fluorescente și timpul de viață limită al fluorescenței .
Metoda Fluorescență statică Fluorescență rezolvată în timp
Lipid DOPC DOPC :DPPG DOPC DOPC :DPPG
Peptida ΔG [kcal/M] Δλ [nm] ΔG [kcal/M] Δλ [nm] ΔG [kcal/M] τlim. [ns] ΔG [kcal/M] τlim. [ns]
Melitina -9.43 ± 0.17 20.5 ± 0.3 -10.11 ± 0.02 20.0 ± 0.2 – – – –
Indolicidin -9.75 ± 0.29 13.7 ± 0.3 -10.45 ± 0 .02 15.1 ± 0.7 -9.64 ± 0.01 2.22 ± 0.06 -10.26 ± 0.10 2.30 ± 0.12
Cecropina P1 – – – – -8.21 ± 0.05 2.03 ± 0.09 -9.46 ± 0.43 1.81 ± 0.01
P1 -8.45 ± 0.32 15.1 ± 0.6 -9.57 ± 0.12 17.7 ± 0.8 -9.03 ± 0.57 2.02 ± 0.12 -9.27 ± 0.20 2.59 ± 0.04
P2 -8.27 ± 0.34 7.6 ± 0.4 -9.15 ± 0.24 15.9 ± 0.9 -9.08 ± 0.01 2.05 ± 0.1 6 -9.00 ± 0.19 3.32 ± 0.05
P3 – – – – -8.15 ± 0.19 1.51 ± 0.08 -7.35 ± 0.16 3.70 ± 0.20
P4 – – – – -7.65 ± 0.72 2.43 ± 0.22 -8.53 ± 0.07 2.53 ± 0.30
P5 -8.59 ± 0.14 12.8 ± 0.6 -9.87 ± 0.19 13.7 ± 0.7 -8.70 ± 0.30 2.47 ± 0.07 -9.45 ± 0.09 3.01 ± 0.02
P6 -9.34 ± 0.33 11.2 ± 0.6 -10.23 ± 0.26 14.4 ± 0.1 -9.15 ± 0.52 2.31 ± 0.04 -9.97 ± 0.04 2.81 ± 0.04
P7 -8.75 ± 0.13 15.4 ± 0.2 -9.63 ± 0.18 16.8 ± 0.2 -8.60 ± 0.17 2.47 ± 0.05 -9.36 ± 0.19 2.87 ± 0.12
P8 -8.86 ± 0.49 12.9 ± 0.5 -9.67 ± 0.53 14.4 ± 0.1 -8.92 ± 0.34 2.36 ± 0.07 -9.37 ± 0.31 2.93 ± 0.15
122 11.3 Discu ții
Alegerea modelelor utilizate pentru determinare variației energiei libere Gibbs, ΔG, de
partiționare din mediul hidrofil în me diul hidrofob, reprezentat de membrana lipidică, pentru
peptidele P1 – P8, am făcut -o analizând inițial datele obținute pentru Melitină, Indolicidin ă și
Cecropina P1, prezentate în Tabelul 11.1. Din rezultatele prezentate în acest tabel , se remarcă două
situații deosebite : în cazul Melitinei , pentru modelele care utilizează valorile timpilor de viață,
ecuați ile (11.8) și (11.9) și pentru Cecropina P1 , pentru modelele care utilizează poziția maximului
emisiei fluorescente, ecuația (11.4) și itensitatea fluor escenței la o lungime de undă constantă,
ecuați ile (11.6) și (11.7). În cazul Melitinei, valorile timpului de viață obținute, atunci când erau
reprezentate în funcție de concentrația (redusă la jumătate) a lipidelor, nu au avut o variație după
o lege de ti p hiperbolic . Pentru Cecropina P1 , nu am putut obține variații ale maximului emisiei
fluorescente pentru a putea utiliza modelul descris de ecuația (11.4), iar variațiile intensității
fluorescenței la lungimea de undă de 335 nm, pe lângă faptul că au fost mici, nu au putut fi fitate
cu ajutorul modelelor descrise de ecuați ile (11.6) și (11.7). Pentru Indolicidin ă, rezultatele
experimentale obținute l e-am putut analiza cu toate modelele descrise anterior, rezultatele obținute
cu modelele descrise de ecuați ile (11.4) și (11.8) fiind în concordanță cu cele din literatură
(Ladokhin și colab., 1997 ). O confirmare în plus a faptului că eficiența cuantică a reziduuril or de
Triptofan , din structura Indolicidin ei, este re dusă în prezența lipidelor anionice au fost rezultatele
obținute cu ajutorul modelelor descrise de ecuați ile (11.6) și (11.7), modele ce țin cont de
intensitatea fluorescenței sau de aria spectrului de f luorescență, acestea fiind dependente de
eficiența cuantică a fluoroforului studiat (Triptofanul) .
Astfel, în urma prelucrării datelor experimentale, pentru peptidele utilizate, am obținut
valorile din Tabelul 11.2 , cu ajutorul modelelor descrise de ecuați ile (11.4) și (11.8) . Valorile
pentru peptidele P1 – P8 din Tabelul 11.2 sunt reprezentate sub formă grafică în Figur ile 11.3 și
11.4.
Pentru Melitină, valorile ΔG obținute pentru DOPC, de -9.43 ± 0.17 kcal/M, și DOPC:DPPG,
de -10.11 ± 0.02 kcal/M, sugerea ză că , pentru cazul în care avem în structura lipozomilor lipide
anionice (DPPG), aceasta adoptă, aparent, o configurație mai stabilă la nivelul bistratului. Din
valorile deplasărilor maximului de emisie fluorescentă, Δλ, de 20.5 ± 0.3 nm pentru DOPC și d e
20.0 ± 0.2 nm pentru DOPC:DPPG, reiese că reziduul de Triptofan din structura Melitinei se află
123 aproximativ în aceleași condiții de mediu, fiind ușor mai expus în cazul DOPC:DPPG, așa cum
am arătat și în capitolul anterior (Figura 10.4 – B). Astfel, u șoara diferență dintre valorile ΔG apare
datorită strict interacțiilor electrostatice dintre reziduurile cationice din structura Melitinei și
lipidele anionice din structura bistratului.
Pentru Indolicidin ă, valorile obținute pentru ΔG, Δλ și τlim. indică o c onfigurație mai stabilă
a peptidei pentru interacția cu LUV preparate din DOPC:DPPG ( ΔG = -10.45 ± 0.02 kcal/ mol,
valoare rezultată din m ăsuratorile de fluorescență statică sau ΔG = -10.26 ± 0.10 kcal/ mol, valoare
rezultată din m ăsuratorile de fluorescență reolvată în timp) față de situația în care peptida
interacționează cu LUV din DOPC (ΔG = -9.75 ± 0.29 kcal/mol , valoare rezultată din m ăsuratorile
de fluorescență statică sau ΔG = -9.64 ± 0.01 kcal/mol , valoare rezultată din m ăsuratorile de
fluorescență r eolvată în timp), cu o reorientare a reziduurilor de Triptofan către o zonă mai
hidrofobă a bistratului care duce la o creștere a deplasării maximului de emisie fluorescentă , Δλ,
de la 13.7 ± 0.3 nm, în cazul DOPC, la 15.1 ± 0.7 nm, în cazul DOPC:DPPG. Ace eași reorientare
a grupărilor cromofore rezultă și din diferențele care apar între timpii de viață limită ai
fluorescenței.
Valo area ΔG obținută pentru situația în care Cecropina P1 interacționează cu LUV preparate
de DOPC:DPPG, de -9.46 ± 0.43 kcal/ mol, este mai mare decât pentru situația în care peptida
interacționează cu LUV preparate doar din DOPC , de -8.21 ± 0.05 kcal/ mol. Din valorile obținute
pentru timpii de viață se observă că în pentru cazul DOPC:DPPG reziduul de Triptofan are un timp
de viață mai scurt, datorat orientării diferite a peptidei față de planul bistratului , acesta fiind mai
accesibil moleculelor solventului .
Trebuie precizat că , în cazul peptidelor P3 și P4 nu s -au obținut, în urma titrării cu soluția
concentrată de lipozomi, deplasări ale maximului de emisie fluorescentă . Totuși, în urma titr ării,
au apărut creșteri ale intensității spectrelor de emisie fluorescentă, poziția maximului de emisie
rămânând neschimbată, relativ la situația în care peptidele au fost doar în PBS, acest lucru sugerând
că la nivelul reziduurilor de Triptofan apar interacții care afecte ază eficiența cuantică a acestuia.
Rezultatele obținute p entru celelalte peptide, care au prezentat deplasări ale maximului de
emisie fluorescen tă, astfel put ând calcula pentru el e valoare a ΔG, sunt detaliate în Tabelul 11.2 și
Figura 11.3. În situația interacției acestor peptide cu LUV , preparate din DOPC , cea mai mare
valoare a variației energiei a avut -o P2, de -8.27 ± 0.34 kcal/ mol, iar cea mai mică a fost pentru
P6, de -9.34 ± 0.33 kcal/ mol. Valorile mai mici obținute pentru peptidele cu 4 reziduuri de
124 Triptofan în structura lor, P5 – P8, față de cele cu 3 reziduuri, P1 – P2, sunt explicabile datorită
faptului că , având un reziduu de Triptofan în plus în structură, acesta duce la adoptarea unei
configurații mai stabile a peptidei relativ la planul membranei. Pentru situația în care peptidele au
interacționat cu LUV , preparate din DOPC:DPPG, cea mai mică valoare a variației energiei libere
Gibbs a fost pentru P6, de -10.23 ± 0.26 kcal/ mol.
P1 P2 P3 P4 P5 P6 P7 P8
1 2 3 4 5 6 7 8-10-8-6-4-20 DOPC DOPC:DPPGG [kcal/M]
A
P1 P2 P3 P4 P5 P6 P7 P8
1 2 3 4 5 6 7 805101520 [nm] DOPC DOPC:DPPGB
Figura 11.3 Parametrii obținuți pentru P1 – P8 din modelul descris
de ecuația (11.4).
A – Variația energiei libere Gibbs, ΔG, de partiționare din mediul hidrofil în
bistratul lipidic ; B – Deplasarea maximului de emisie fluorescentă.
Din valorile deplasărilor ma ximului emisiei fluorescente , se observă că reziduurile de
Triptofan , care intră în componența peptidei P2 , sunt cele mai expuse mediul ui hidrofil de la
interfața bistratului , în situația în care acest a este obținut din DOPC. Pentru aceeași compoziție
125 lipidică a bistratului, cel mai puțin expuse reziduuri sunt ale peptidei P7. O creștere semnificativă
(dublare) a deplasării maximului o ar e P2 în prezența LUV preparate din DOPC:DPPG. Cea mai
mare valoare a deplasării maximului a fost obținută, în această situație , pentru peptida P1.
P1 P2 P3 P4 P5 P6 P7 P8
1 2 3 4 5 6 7 8-10-8-6-4-20 DOPC DOPC:DPPGG [kcal/M]
A
P1 P2 P3 P4 P5 P6 P7 P8
1 2 3 4 5 6 7 801234 DOPC DOPC:DPPGlim. [ns]B
Figura 11.4 Parametrii obținuți pentru P1 – P8 din modelul descris
de ecuația (11.8).
A – Variația energiei libere Gibbs, ΔG, de partiționare din mediul hidrofil în
bistratul lipidic ; B – Timpul de viață al fluorescenței.
Valorile obținute în urma prelucrării datelor experimentale, pentru peptidele P1 – P8, din
Tabelul 11.2, cu modelul descris de ecuația (11.8), sunt reprezentate sub formă grafică în Figura
11.4. La fel ca la modelul utilizat anetrior, cea mai mică energie am obținut -o tot pentru peptida
126 P6, în ambele cazuri, pentru DOPC având valoarea de -9.15 ± 0.52 kcal/ mol, iar pentru
DOPC:DPPG având valoarea de -9.97 ± 0.04 kcal/ mol.
Surprinzător a fost comportamentul peptidei P3 pentru care, utilizând această metodă de
analiză, am obținut o variație mare a timpului de viață pentru cele două situații, în cazul DOPC ,
având valoarea de 1.51 ± 0.08 ns, iar în cazul DOPC:DPPG , având valoarea de 3.70 ± 0.20 ns,
valori care nu se corelează cu cele ale energiilor de partiție pentru cele două situații, în ca zul
DOPC:DPPG energia de partiție fiind de -7.35 ± 0.16 kcal/ mol, mai mică decât în cazul DOPC,
când a avut valoarea de -8.15 ± 0.19 kcal/ mol.
Concluzii par țiale
Modelele de calcul a le variației energiei libere Gibbs, de partiționare din mediul hidrofil î n
bistratul lipidic, au generat rezultate comparabile cu cele din literatura de specialitate, pentru
Melitină, Indolicidin ă și Cecropina P1 (Ladokhin și colab., 1997 ; White și colab., 1998 ; He și
Lazaridis, 2013 ).
Rezultatele obținute pentru peptidele P1 -P8, pentru valorile variației energiei libere Gibbs,
indică faptul că peptida P6 are cea mai bună afinitate pentru membranele care conțin lipide
anionice. Aceste rezultate se corelează cu testele in vitro efectuate pentru aceste peptide (Bacalum
și colab., 2017 ).
Ținând cont proprietățile peptidelor P1 – P8: structura primară scurtă, număr mare de
reziduuri de Triptofan (4 pentru jumătate dintre ele, P5 – P8) și sarcina netă a acestora, pot trage
concluzia că acestea au un comportament asemănător cu cel al Indolicidin ei, față de membranele
lipidice .
Experimentele descrise în acest capitol vor trebui continuate, cel puțin utilizând peptida P6,
în combinație cu mai multe tipuri de sisteme lipidice (LUV preparate din divers e lipide
constituente, în rapoarte variabile) și în diverse condiții fizico -chimice, fiind demonstrat faptul că
energia de partiționare din mediul hidrofil în bistratul lipidic este dependentă de acești factori (He
și Lazaridis, 2013 ).
127 12 Evaluarea interac ției AMP -membrana
model prin analiza cu func ții asimetrice
aplicată spectrel or de fluorescență ale
Triptofanului
Introducere
Spectrosco pia de fluorescență este o tehnică de analiză, extrem de utilizată, pentru
investigarea structurii, conformației și dinamicii peptidelor și proteinelor, deoarece proprietățile
fluorescente ale aminoacizilor , care prezintă fluorescență int rinsecă, din care face parte și
Triptofanul, sunt extrem de sensibile la variațiile proprietaăților fizico -chimice ale mediului
înconjurător, atunci când acesta face parte din structura peptidelor sau proteinelor studiate.
Obiectivul major al spectroscopie i de fluorescență a reziduurilor de Triptofan este
interpretarea proprietăților fluorescente în funcție de parametri i structurali ai peptidelor și
proteinelor și de punere în evidență a modificărilor conformaționale a le acestora , în anumite
condiții fizico -chimice.
Rezultatele obținute în cadrul acestu capitol au fost prezentate parțial la Conferința
”Analytical and Nanoanalytical Methods for Biomedical and Environmental Sciences” – IC-
ANMBES 2018.
12.1 Analiza f luorescenț ei reziduurilor de Triptofan din
structu ra proteine lor
Una dintre problemele interpretării spectrelor de fluorescență a le proteinelor este natura
complexă a acestor spectre. Majoritatea proteinelor conțin mai mult de un reziduu de Triptofan,
fiecare dintre aceste reziduuri având un spectru de fl uorescență individualizat, în funcție de poziția
128 ocupată în structura proteinei. Astfel, este necesară determinarea parametrilor spectrali individuali,
dintr -un spectru mult mai larg de fluorescență, în care aceste spectre individuale se manifestă.
În anul 2001, Burstein și colaboratorii s ăi au propus, într -o serie de articole, utilizarea
funcțiilor asimetruce, de tip LN, descrise de ecuația (8.2) , pentru analiza spectrelor complexe de
fluorescență ale peptidelor și proteinelor , cu parametrii de constrânger e a formei spectrelor
determinați pentru Triptofan (Burstein și Emelyanenko, 1996 ):
{𝜈̃𝑚𝑖𝑛=1.177 ∗𝜈̃𝑚−7780
𝜈̃𝑚𝑎𝑥 =0.831 ∗𝜈̃𝑚+ 7070 (12.1)
Aceștia au analizat și caracterizat o gamă foarte mare de spectre de fluorescență , pentru
diferite peptide și proteine, complexe prin n atura lor, aflate în diverse condiții fizico -chimice,
validând astfel modelul de analiză propus (Burstein și colab., 2001 ; Reshetnyak și Burstein, 2001 ;
Reshetnyak și colab., 2001 ). Aceste experimente s -au desfășurat considerând valabile următoarele
ipoteze de lucru (Abornev și Burshtein, 1992 ):
1. Forma spectrului de fluorescență a unui peak elementar al Triptofanului, reprezentat în
domeniul numerelor de undă, este descrisă de o funcție LN biparametrică (depinde de
amplitudinea maximă a emisiei fluorescente și de poziția acesteia în spectrul de
fluorescență), descrisă de ecuația (8.2) (Burstein și Emelyanenko, 1996 ).
2. Forma și poziția spectrelor de emisie fluorescentă a Triptofanului rămân neschimbate la
stingerea fluorescenței cu molecule mici de stingător (acrilamida), solubile în apă
(Burstein, 1968 ; Lehrer, 1971 ; Burstein, 1977 ; Lehrer și Leavis, 1978 ).
3. Modificările componentelor individuale ( peak -uri elementare) rezultate în urma
deconvoluției respectă legea Stern -Volmer, descrisă de ecuația (10.1), atunci când
grupările cromofore din structura peptidelor sau proteinelor interacționează cu
moleculele de stingător (Lehrer, 1971 ; Burstein, 1977 ; Lehrer și Leavis, 1978 ).
4. Pentru atenuarea zgomotului, care apare aleator în spectrele de f luorescență măsurate, și
pentru a obține o acuratețe mare a rezultatelor deconvoluției (Akseenko și cola b., 1989 )
la realizarea acestei proceduri (deconvoluția spectrului de fluorescență) se folosesc toate
valorile obținute în spectrul experimental, care sunt mult mai mari ca număr decât
numărul parametrilor rezultați în urma deconvoluției.
129 Astfel, conform modelului cu proprietătile menționate anterior, a fost confirmată existența
celor cinci clase de reziduuri de Triptofan care emit fluorescent , cu cea mai suscceptibilă existență,
din structura peptidelor și proteinelor:
1. Clasa A ( λem = 308 nm , spectre stru cturate ), din care fac parte reziduurile de Triptofan
care nu formează legături de hidrogen în starea excitată, cu moleculele solventului sau
cu grupările polipeptidice alăturate, din structura proteinelor (Hershberger și colab.,
1981 ).
2. Clasa S ( λem = 316 nm, spectre structurate), include reziduurile de Triptofan din structura
proteinelor care pot forma complexe moleculare cu stoichiometria de 1:1.
3. Clasa I (330 nm ≤ λem ≤ 332 nm, 48 nm ≤ Δλ ≤ 50 nm), include reziduurile de Triptofan
din structura proteinelor care pot forma complexe moleculare cu stoichiometria de 2:1.
4. Clasa II (340 nm ≤ λem ≤ 342 nm, 53 nm ≤ Δλ ≤ 55 nm), din care fac parte reziduurile de
Triptofan expuse moleculelor de apă legat ă, care au un timp lung de relaxare dipolară .
5. Clasa III (350 nm ≤ λem ≤ 353 nm, 59 nm ≤ Δλ ≤ 61 nm), conține reziduurile de Triptofan
expuse aproape în întregime la moleculele de apă din soluție, al căror spectru de emisie
este aproape identic cu cel al moleculelor de L -Triptofan liber în soluție.
12.2 Ipoteze de lucru
În literatura de specialitate există studii care utilizează deconvoluția cu funcții de tip LN a
spect relor complexe de fluorescență ale Triptofanului, din structura peptidelor și proteinelor
(Linke și colab., 2004 ; Reshetnyak și colab., 2004 ; Reshetnyak și colab., 2006 ), și doar câteva din
acestea tratează interacția dintre peptide sau proteine cu membranele lipidice (Reshetnyak și
colab., 2007 ; Torrent și colab., 2007 ). Toate aceste studii tratează problema deconvoluției
spectrelor pe baza princip iilor amintite anterior, din punctul de vedere al stingerii fluorescenței
reziduurilor de Triptofan.
Ținând cont de ipotezele de lucru ale metodei de analiză a spectrelor de emisie fluorescentă
a reziduurilor de Triptofan și de existența celor cinci clase de spectre de emisie , descrise anterior,
am considerat că este utilă dezvoltarea unui pachet asemănător de coduri de analiză a spectrelor
de fluorescență (Burstein și colab., 2001 ), analiză care s -a axat pe prelucrarea datelor obținute în
cadrul experimentelor descrise în capitolul anterior. Scopul acetseia a fost determinarea cantității
(fracției) de peptidă aflată în faza apoasă și adsorbită la nivelul bistratului lipidic.
130 La prelucrarea și analiza datelor am considerat următoarele:
1. Cele două peptide analizate, Indolicidin a și P6, prezintă în soluții apoase o structur ă
secundară dezordonată, astfel că reziduurile de Triptofan, aflate în structura primară a
acestora, sunt total expuse moleculelor solventului ; datorită acestui lucru, era de așteptat
să se regăs ească în spectrul de emisie fluorescentă, corespunzător fiecărei peptide aflate
doar în PBS sau în faza apoasă atunci când interacționează cu bistratul , o singură specie
de molecule fluorescente, cu cara cteristicile de emisie foarte apropiate de emisia
fluorescentă a moleculelor de L -Triptofan dizolvate în soluție apoasă (clasa III din lista
anterioară).
2. În situația în care peptida se află adsorbită la nivelul bistratului lipidic, toate reziduurile
de Tri ptofan din structura acesteia interacționează, prin interacții hidrofobe, cu suprafața
exterioară a bistratului.
3. Datorită lungimii reduse a peptidelor, acestea nu pot penetra bistratul lipidic în urma unei
reorientări la nivelul acestuia, ca în cazul Melit inei, reorientare în urma căreia unele
reziduuri ar fi mai puțin accesibile mediului hidrofil, rezultând astfel două categorii de
reziduuri cu grade diferite de accesibilitate pentru moleculele solventului și, implicit,
asociat acestora, două peak -uri elem entare care s ă rezulte în urma deconvoluției.
4. Ținând cont de ipoteza anterioară, am considerat că pentru peptidele adsorbite la nivelul
bistratului, fluorescența reziduurilor de Triptofan va genera în spectrul complex de
fluorescență un singur peak element ar, corespunzător uneia dintre clasele A, S, I sau II .
5. În prezența LUV, peptidele care nu sunt adsorbite la nivelul bistratului vor genera un
peak elementar cu caracteristici care se încadrează în clasa III.
12.3 Analiza spectrelor de fluorescen ță ale Triptofan ului
Pentru analiza spectrelor de fluorescență am dezvoltat un pachet de coduri, scrise în limbajul
de programare MatLab, care respectă algoritmul de calcul descris în Capitolul 8 , utilizând ecuația
(8.2) și parametrii de constrângere a formei generale a peak-urilor elementare evidențiați în
ecuația (12.1). Programul Matlab generează grafice de tipul celor din Figura 12.1, dar și un fișier
cu parametri rezultați în urma deconvoluției: aria peak -urilor elementare, aria relativă a acestora,
poziția maximul ui de fluorescență a fiecărui dintre peak -uri și parametrul care caracterizează
calitatea deconvoluției. Acest program generează, în plus față de graficele de tipul celor din
131
Figura 12.1 Evoluția peak -urilor elementare , obținute în urma deconvoluției, pentru Indolicidin ă
A și E – Indolicidin a în PBS ; aceste grafice corespund situației 1 din Figura 12.2; B și F – Indolicidin a în prezența LUV preparați din DOPC (B) și
DOPC:DPPG (F), concentrația lipidelor fiind de 5 µM, situația 2 din Figura 12.2 ; C și G – Indolicidin a în prezența LUV preparați din DOPC (C) și
DOPC:DPPG (G), concentrația lipidelor fiind de 20 µM, situația 3 din Figura 12.2 ; D și H – Indolicidin a în prezen ța LUV preparați din DOPC (D)
și DOPC:DPPG (H), concentrația lipidelor fiind de 200 µM, situația 4 din Figura 12.2 ; Peak -urile reprezentate cu roșu sunt corespunzătoare fracției
de peptidă adsorbită la nivelul bistratului și cele reprezentate cu galben sun t corespunzătoare fracției de peptidă aflată în faza apoasă.
A B C D
H E G F
132 Figura 12.1 și fișierele de date care stau la baza generării acestora. Pe baza parametrului care
estimează calitatea deconvoluției, utilizatorul poate lua decizia de creștere a numărului de
peak -uri elementare cu care se face analiza (maxim 3), cu condiția ca acestea s ă respecte
caracteristicile fizice (poziția peak-urilor elementare în spectrul complex de emisie fluorescentă)
definite în clasele descrise anterior.
0 5 10 15 200.00.20.40.60.81.0 DOPC – fractia de peptida adsorbita
DOPC – fractia de peptida libera
DOPC:DPPG – fractia de peptida adsorbita
DOP:-DPPG – fractia de peptida liberaFPEPT.
C [x10-5 M]1
23 4
A
0 5 10 15 200.00.20.40.60.81.0 DOPC – fractia de peptida adsorbita
DOPC – fractia de peptida libera
DOPC:DPPG – fractia de peptida adsorbita
DOPC:-DPPG – fractia de peptida liberaFPEPT.
C [x10-5 M]B
Figura 12.2 Variația ariei relative a peak -urilor obținute în urma
deconvoluției.
A – Indolicidin a; B – peptida P6.
În Figura 12.1 sunt reprezentate grafic pozițiile peak -urilor elementare, obținute în urma
deconvoluței spectrelor complexe de fluorescență, obținute pentru Indolicidin ă în situațiile în care
aceasta a fost titrat ă cu soluții concentrate de LUV obținute din DOPC (Figura 12.1 A – D) și din
133 DOPC:DPPG (Figura 12.1 E – H). Spectrele reprezentate în această figură corespund celor patru
situații marcate în Figura 12.2 – A.
În Figura 12.2 sunt reprezentate valorile ariilor relative, corespunzătoare celor două fracții
de peptidă, aflată fie în faza apoasă, fie adsorbită la nivelul bistratului, obținute în urma
deconvoluției, pentru Indolicidin ă (graficul A) și pentru P6 (graficul B).
12.4 Discu ții
Ținând cont de ipotezele de lucru care au stat la baza acestei metode de analiză și considerând
că aria relativă a peak -urilor obț inute în urma deconvoluției spectrelor de fluorescență este direct
proporțională cu fracțiile de peptidă adsorbite la nivelul bistratului, respectiv din faza apoasă, am
reprezentat variația acestor arii în funcție de cantitatea de lipide titrată în soluția de peptide,
obținând astfel graficele din Figura 12.2, pentiru Indolicidin ă (graficul A), respectiv pentru P6
(graficul B).
Utilizând modelul de analiză a spectrelor dse fluorescență cu funcții LN am obținut, pentru
Indolicidin ă, rezultatele reprezentate în Figura 12.1 și Figura 12.2 – A. Din aceste figuri se observă,
pentru situația în care peptida se află în prezența LUV, preparați din DOPC (Figura 12.1, B – D)
sau DOPC:DPPG (Figura 12.1, F – H), în spectrul de emisie fluorescentă, în urma deconvoluției,
am obținut două peak -uri elementare. Aceste peak -uri, sunt proporționale cu cantitatea de peptidă
adsorbită la nivelul bistratului (fracția de peptidă legată) , respectiv cu cantitatea de peptidă aflată
în faza apoasă (fracția de peptidă liberă), dacă se ț ine cont de ipotezele de lucru prezentate anterior.
Se observă că , pentru ac elași raport peptidă -lipide, de exemplu , cazul num ărul 2 din Figura
12.2 – A, acest raport fiind de 1:5, caz reprezentat în graficele B și F din Figura 12.1 , fracți a de
peptidă leg ată, reprezentat ă de peak -urile de la lungimile de undă mai mici, este aproape dubl ă
pentru cazul în care aceasta s -a aflat în prezența LUV prepara te din DOPC:DPPG (graficul F) față
de situația în care s -a aflat în prezența LUV preparate din DOPC (graficul B).
Se remarcă faptul că , la concentrați mari ale lipidelor, unde ariile relative ale peak -urilor
ramân aproximativ constante, pentru DOPC:DPPG , fracția de peptidă adsorbită reprezintă
aproximativ 75 % din cantitatea total ă de peptidă din soluție, spre de osebire de DOPC, unde
această fracție reprezintă aproximativ 60 % din cantitatea totală de peptidă.
134 Pentru P6 am obținut aproximativ același tip de variație a ariilor relative a le peak -urilor
elementare obținute în urma deconvoluției. Spre deosebire de caz ul Indolicidin ei, atunci când în
suspensia de P6 a fost titrată soluția de LUV preparate din DOPC, fracția de peptidă adsorbită la
nivelul bistratului a fost mai mică decât fracția de peptidă din faza apoasă, pentru toate valorile
raportului peptidă -lipide , așa cum se observă din Figura 12.2 – B. În cazul LUV preparate din
DOPC:DPPG fracția de peptidă adsorbită la nivelul bistratului pentru concentrațiile mari ale
lipidelor a fost de aproximativ 65 %, iar pentru LUV preparate din DOPC de aproximativ 45 %.
Poziția în spectrul de emisie fluorescentă a peak -ului elementar, corespunzătoar peptidelor
adsorbite la nivelul bistratului, a fost pentru Indolicidin ă titrat ă cu DOPC la 335 nm și cu
DOPC:DPPG la 337 nm , pentru peptida P6 titrată cu DOPC la 337 nm și cu D OPC:DPPG la
331 nm. Aceste valori sugerează că, în situația în care P6 interacționează cu LUV preparate din
DOPC:DPPG, reziduurile de Triptofan din structura acesteia sunt mai puțin expuse moleculelor
solventului.
Concluzii par țiale
Metoda de analiz ă a spectrelor complexe de emisie fluorescentă a reziduurilor de Triptofan
cu funcții asimetrice de tip LN, validată pentru peptide și proteine aflate în diverse condiții
fizico -chimice (Burstein și Emelyanenko, 1996 ; Burstein și colab., 2001 ; Reshetnyak și Burstein,
2001 ; Reshetnyak și colab., 2001 ), poate fi aplicată și pentru studierea interacției dintre AMP și
membranele lipidice model.
Utilizând această metodă se obțin fracțiile de peptidă adsorbită la nivelul bistratului lipdidic,
respec tiv aflată în faza apoasă. Astfel , se pot pune în evidență diferențele care apar la interacțiile
dintre diferite AMP și membranele lipidice model, cu diferite compoziții ale lipidelor constituente.
Metoda de analiză prezentată în cadrul acestui capitol tre buie să fie în continuare aplicată și
altor combinații de peptide în interacție cu diverse tipuri de membrane lipidice model, în vederea
validării ipotezelor de lucru propuse.
Această metodă, după ce va fi validată, poate avea aplicații în experimentele de determinare
a variației energiei libere Gibbs, în experimentele în care se studiază transferul rezonant de energie
etc.
135 Concluzii generale
Toate rezultatele experimentale, obținute cu aranjamentul experimental realizat și calibrat în
teză, referitoare la timpii de viață ai fluorescenței, sunt comparabile cu valorile găsite în literatură.
Timpul de viață al fluorescenței, în cazul moleculelor care includ în structura lor un inel indolic ,
este afectat de variațiile de temperatură într-o mai mare măsură decâ t timpul de viață obținut pentru
ceilalți compuși. De aceea, în experimente, trebuie să se aibă în vedere influența factorilor fizico –
chimici asupra grupărilor cromofore ale moleculelor studiate.
În urma analizării datelor obținute în cazul Melitinei, a re zultat că, la creșterea fluidității
bistratului, obținut din DOPC, aceasta se reorienteză față de bistrat, pătrunzând în profunzimea lui,
către zona hidrofobă a acestuia. Spre deosebire de Melitină, cele trei peptide analizate în teză (și
anume: P1, P5 și P8), având reziduurile de Triptofan localizate la nivelul interfeței membrană
lipidică -solvent, paralele cu planul membranei, sunt mult mai expuse mediului hidrofil, în
comparație cu reziduul de Triptofan din structura Melitinei. Datele experimentale din T exă
demonstrează că mecanismul de acțiune al peptidelor nou sintetizate ( și anume: P1, P5 și P8 )
asupra bistratului lipidic diferă față de cel al Melitinei.
Noul parametru propus pentru caracterizarea fluidității membranelor lipozomale, ΔS R,
obținut în urm a deconvoluției spectrelor de emisie fluorescentă ale Laurdanului inserat în
membrane lipidice, utilizând funcții asimetrice de tip LN, este mult mai sensibil la nivelul de
hidratare a bistratului, așa cum este indicat de către Laurdan. Aria pe ak-ului corespunzător fazei
de gel a bistratului și intervalul de temperatură în care are loc tranziția de fază sunt dependente de
lungimea cozilor hidrofobe ale lipidelor.
Împachetarea lipidelor, obținută din spectrele de fluorescență ale Laurdanului din
membranele obținute artificial și a celor biologice, este afectată de interacția cu AMP.
Complexitatea membranelor biologice, mult mai mare decât a celor artificiale, duce la un nivel de
împachetare mai mare decât în cazul lipozo milor. Datorită complexității, aceste membrane sunt
mai puțin afectate de interacția cu AMP. Gradul de destabilizare a bistratului, în cazul
membranelor artificiale, depinde de componentele constituente ale acestuia. Pentru interacția
dintre Melitină și lipozomi, preparați din DOPC și DOPC:Chol, există o concentrație limită , peste
care efectul destabilizator nu se mai manifestă.
136 Interacțiile dintre peptidele P1 – P8 și LUV preparate din DOPC sunt puse în evidență cu
ajutorul valorilor obținute pentru consta ntele bimoleculare, k b, corespunzătoare fiecărei peptide.
Se observă că și aceste valori sunt grupate în funcție de numărul reziduurilor de Triptofan din
structura peptidelor. În prezența LUV formate din DOPC:DPPG, interacțiile dintre reziduurile
cationice și lipidele anionice (DPPG) din structura bistratului, în afară de interacțiile hidrofobe
datorate Triptofanului, au dus la o scădere a constantelor bimoleculare pentru toate peptidele,
scădere care este un indicator că gr upările cromofore sunt mai puțin accesibile moleculelor de
stingător (i.e., acrilamidă ).
Rezultatele obținute pentru peptidele P1 -P8, pentru valorile variației energiei libere Gibbs,
indică faptul că peptida P6 are cea mai mare afinitate pentru membranele care conțin lipide
anionice. Ținând cont de proprietățile peptidelor P1 – P8: structura primară scurtă și sarcina netă
a acestora, am ajuns la concluzia că acestea au un comportament asemănător cu cel al Indolicidinei,
față de membranele lipidice.
Utilizând deconvoluția spe ctrelor de fluorescență ale Triptofanului cu funcții de tip LN se
obțin fracțiile de peptidă adsorbită la nivelul bistratului lipdidic, respectiv aflată în faza apoasă.
Astfel, se pot pune în evidență diferențele care apar la interacțiile dintre diferite A MP și
membranele lipidice model, cu diferite compoziții ale lipidelor constituente.
Protocoalele dezvoltate pe parcursul acestei Teze , permit studi erea efectelor diferiților agenți
de stres : tratamente cu radiații ionizante, tratamente termi ce, chimice etc ., asupra membranelor
celulare de mamifere și bacteriene . De asemenea, urmează ca metoda de analiză a spectrelor de
fluorescență ale Triptofanului să fie validată utiliz ând și alte co mbinații peptidă -lipide.
137 Realizări personale
Articole legate de Teză publicate in extenso în reviste științifice
indexate ISI , cu factor de impact
Chilom, C. G., Zoril ă, B. și Popescu, A. I. (2017) Characterization of Some Physico -Chemical
Prop erties and Interactions of Human and Bovine Serum Albumins with Mitomycin C , Romanian
Journal of Physics, 62. ( IF = 1.433 , AIS = 0. 259)
Zoril ă, B., Bacalum, M., Popescu, A. I. și Radu, M. (2016) Log-Normal Deconvolution of Laurdan
Fluorescence Spectra – a Tool to Assess Lipid Membrane Fluidity , Romanian Reports in Physics,
68, 702 -712. ( IF = 1.467 , AIS = 0.18 )
Bacalum, M., Zoril ă, B. și Radu, M. (2016) Investigating the Anticancer Activity of Some Cationic
Antimicrobial Peptides in Epithelial Tumor Cells , Romanian Reports in Physics, 68, 1159 -1169.
(IF = 1.467 , AIS = 0.18 )
Bacalum, M., Zoril ă, B. și Radu, M. (2013) Fluorescence spectra decomposition by asymmetric
functions: Laurdan spectrum revisited , Analytical Biochemistry, 440, 123-129. (IF = 2.275 ,
AIS = 0.8)
Bacalum, M., Zoril ă, B., Radu, M. și Popescu, A. (2013) Laurdan solvatochromism: influence of
solvent polarity and hydrogen bonds , Optoelectronics and Advanced Materials -Rapid
Communications, 7, 456 -460. ( FI =0.386, AIS = 0.07 )
Alte articole publicate in extenso în reviste științifice indexate ISI , cu
factor de impac t
Melintescu, A., Chambers, S. D., Crawford, J., Williams, A. G., Zoril ă, B. și Galeriu, D. (2018)
Radon -222 related influence on ambient gamma dose , Journal of Environmental Radioactivity ,
189, 67 -78. (IF = 2.263 , AIS = 0.6 )
Zorila, F. L., Ionescu, C., Craciun, L. S. și Zoril ă, B. (2017) Atomic force microscopy study of
morphological modifications induced by different decontamination treatments on Escherichia coli ,
Ultramicroscopy, 182, 226 -232. ( IF = 2.929 , AIS = 1 )
Chambers, S. D., Galeriu, D., Williams, A. G., Melintescu, A., Griffiths, A. D., Crawford, J., Dyer,
L., Duma, M. și Zoril ă, B. (2016) Atmospheric stability effects on potential radiologic al releases
138 at a nuclear research facility in Romania: Characterising the atmospheric mixing state , Journal
of Environmental Radioactivity, 154, 68 -82. (IF = 2.263 , AIS = 0.6 )
Galeriu, D., Melintescu, A., Duma, M., Zoril ă, B. și Gheorghiu, A. (2014) Nuclea r Meteorology
at IFIN-HH, Romanian Journal of Physics, 59, 999 -1011. ( IF = 1.758 , AIS = 0. 243)
Articole legate de Teză aflate în stadiul de manuscris
Claudia G. Chilom, Bogdan Zorilă , Maria Bălășoiu, R. N. Yaroslavtsev, S. V. Stolyar, Anna S.
Artemyeva, D. Soloviov, A. I. Kuklin, Mihaela Bacalum, Structural and spectrophotometric
characterization of ferrihydrite nanoparticles in interaction with liposomes and the effect against
normal and tumour cells.
B. Zorilă , Mihaela Bacalum, Claudia G. Chilom, Spectral characterization of folic acid effects of
lipid membranes: from model membranes to cells membra nes.
F. L. Zoril ă, M. M. Manea , B. Zorilă , Spectroscopic study of membrane modifications induced by
different decontamination treatments on Escherichia coli .
Lucrări legate de Teză prezentate la conferințe inter naționale
Bogdan Zorilă , Mirela Cr istea, Mihaela Bacalum, Claudia G. Chilom , The influence of folic acid
on the fluidity of dppc liposomal membranes and the effect against normal and tumour cells ,
18th International Balkan Workshop on Applied Physics and Materials Science , IBWAP -2018,
Constanța, Roânia , Prezentare poster
Claudia G. Chilom, Bogdan Zorilă , Mihaela Bacalum, S. Stolyar, Anna Artemieva,
R. Yaroslavtsev, A. Kuklin, Maria Bălășoiu , Characterization of ferrihydrite nanoparticles in
interaction w ith liposomes and the effect against normal and tumour cells , 18th International
Balkan Workshop on Applied Physics and Materials Science , IBWAP -2018, Constanța, Roânia ,
Prezentare poster
Bogdan Zoril ă, Mihaela Bacalum and Mihai Radu , Evaluation of lipid m embrane tryptophan rich
peptides bound fraction by fluorescence spectrum deconvolution , 5th International Conference on
Analytical and Nanoanalytical Methods for Biomedical and Environmental Sciences ,
IC-ANMBES -2018, Brașov, România , Prezentare poster
139 Bogdan Zoril ă, Models applied to steady state and time resolved fluorescence data analysis to
obtain water -to-lipid partition free energy. An experimental approach. , 17th International Balkan
Workshop on Applied Physics and Materials Science , IBWAP -2017, Constanța, Roânia ,
Prezentare poster
Florina Lucica Z orilă, Bogdan Z orilă, Maria Mihaela M anea, Spectroscopic study of membrane
fluidity modifications induced by different decontamination treatments on Escherichia coli ,
17th International Balkan Workshop on Applied Physics and Materials Science , IBWAP -2017,
Constanța, Roânia , Coautor prezentare poster
Bogdan Z orilă, Mihaela B acalum , Study of the interaction between antimicrobial peptides and
model cell membranes by steady state and time resolved fluorescence , 4th International Conference
on Analytical and Nanoanalytical Methods for Biomedical and Environmental Sciences ,
IC-ANMBES -2016, Brașov , România , Prezentare poster
Bogdan Zoril ă, Mihaela Bacalum and Mihai Radu , Log-Normal deconvolut ion of Laurdan
fluorescence spectra – a tool to assess lipid membrane fluidity , 3th International Conference on
Analytical and Nanoanalytical Methods for Biomedical and Environmental Sciences ,
IC-ANMBES -2014, Brașov, România , Preze ntare poster
Alte l ucrări prezentate la conferințe inter naționale
Bogdan Z orilă , Valentin -Teodor A casandrei , Nicola e M ocanu , Support database for first
responders in transportation incident involving dangerous materials , 18th International Balkan
Workshop on Applied Physics and Materials Science , IBWAP -2018, Constanța, Roânia ,
Prezentare poster
Bogdan Zorilă , Software developments for monitoring meteorological and radiological
parameters , ELSEDIMA 2018 , Cluj -Napoca, România , Prezentare poster
Anatol Oprea, Bogdan Zorilă , Big data analysis for radon map , ELSEDIMA 2018 , Cluj -Napoc a,
România , Coautor prezentare orală
Bogdan Z orilă, Valentin -Teodor A casandrei , Nicolae M ocanu , Local centre for radiological
surveillance of the envi ronment ( LCRSE ) – components and future upgrades for web and offline
140 use, 16th International Balkan Workshop on Applied Physics and Materials Science , IBWAP -2016,
Constanța, Roânia , Prezentare poster
F.L. Z orilă, C. I onescu , L.S. C răciun, B. Z orilă, AFM investigation of morphological
modifications induced by different decontamination treatments on bacteria , 15th International
Balkan Workshop on Applied Physics , IBWAP -2015, Constanța, România , Coautor prezentare
poster
Bogdan Z orilă, Chemical detection capabilities of mobile CBRN unit, 3th EMERSYS Project
Steering Committee, Workshop for stakeholders information and consultation , 2015, Giurgiu,
România , Prezentare orală
Bogda n Zorilă , Practical examples with the DIEX platform for registering/visualizing real time
data while they are recorded and transmitted from the actual scene of a Radiological/Nuclear
emergency , “Theoretical and practical training on use of radiological and nuclear detection
equipment” (Session Training 6) o the EMERSYS Course “Enhance the exercise preparation and
emergency expertise from local and the cross -border area by training CBRN operational staff” ,
2015, București, România, Prezentare orală
B. Z orilă, V.T. A casandrei , A. C ocioceanu , DIEX Platform – Status Report , Main planning
conference to prepare common exercise for CBRN emergency situations, 2015, Russe, Bulgaria ,
Prezentare orală
D. Galeriu, M. Duma, A. Melintescu, B. Zoril ă, Towards a nuclear safety ASOS at IFIN -HH,
5th International Workshop on Optoelectronic Techniques for Environmental Monitoring,
OTEM -2011, M ăgurele, Rom ânia, Coautor prezentare orală
Lucrări legate de Teză prezentate la conferințe naționale
Bogdan Zoril ă, Mihaela Bacalum, Constantin Daniel Neguț, Mihalis Cuturbinis, Mihai Radu ,
Effect of gamma radiation on fluorescent peptides , 15th National Conference of Biophysics , 2018,
București, România , Prezenta re poster
Bogdan Zoril ă, Mihaela Bacalum and Mihai Radu , Fluidity changes in lipid bilayers induced by
antimicrobial peptides , 15th National Conference of Biophysics , 2018, București, România ,
Prezentare poster
141 Mirela Cristea, Bogdan Zorilă , Mihaela Bacalu m, Claudia G. Chilom , The effect of folic acid on
DPPC liposomes , Bucharest University Faculty of Physics 201 8 Meeting , Măgurele, Romania ,
Coautor prezentare orală
Bogdan Z orilă, Mihaela B acalum , Mihai R adu, Aurel I. P opescu , Fluorescence lifetime of
trypt ophan – a tool to assess protein microenvironment. Design and optimization of a time resolved
fluorimeter , Bucharest University Faculty of Physics 2017 Meeting , Măgurele, Romania ,
Prezentare orală
Bogdan Z orilă, Mihaela B acalum , The development and applic ations of a simple fluorescence
lifetime spectrometer , 14th National Conference of Biophysics , 2016 , Cluj -Napoca, România ,
Prezentare poster
Bogdan Zoril ă, Mihaela Bacalum, Aurel Popescu , Study of the interaction between antimicrobial
peptides and model cell membranes by t ime resolved fluorescence , 13th National Conference of
Biophysics , 2015, Timișoara, România , Prezentare poster
Bogdan Zoril ă, Mihaela Bacalum and Mihai Radu , Log-normal deconvolution of Laurdan
fluorescence spectra – a tool to assess lipid membrane fluidity , Bucharest University Faculty of
Physics 2014 Meeting , Măgurele, Romania , Prezentare orală
Bogdan Zoril ă, Mihaela Bacalum, Mihai Radu , Decomposition of Laurdan fluorescence spectra
– a new tool for lipid membrane c haracterization , Scientific communication session of young
researchers from IFIN -HH, 2013, Măgurele, Romania , Prezentare orală
Bogdan Zoril ă, Mihaela Bacalum, Mihai Radu , A new method for analyzing the elementary,
simulated and measured complex spectra of Laurdan , Bucharest University Faculty of Physics
2013 Meeting, Măgurele , Romania, Prezentare orală
B. Zoril ă, M. Bacalum, M. Radu , Solvent effects and photophysical studies of polarity sensitive
probe – Laurdan , 12th National Conference on Biophysics with International Participation ,
CNB -2013 , Iași, România , Prezentare poster
M. Bacalum, B. Zoril ă, E. Anghelu ță, M. Radu , Laurdan fluorescence spectroscopy as a tool to
investigate lipid bilayer dynamics , 11th National Conference on Biophysics with Inter national
Participation , CNB -2011, Sibiu, România, Coautor p rezentare poster
142 Mihaela Bacalum, Bogdan Zoril ă, Elena Anghelu ță, Marcel Ameloot and Mihai Radu , Using
laurdan fluorescence to investigate fluidity changes in biological and artificial membranes , 11th
National Conference on Biophysics with International Participation , CNB -2011 , Sibiu, România ,
Coautor p rezentare orală
Alte l ucrări prezentate la conferințe naționale
Bogdan Z orilă , EMERSYS DIEX Platform for exchanging CBRN data and information. future
developments with application s in IFIN -HH, Scientific communication session of young
researchers from IFIN -HH, 2015 , Măgurele, Romania , Prezentare orală
Florina -Lucica Zoril ă, Mihaela Bacalum, Bogdan Zoril ă, Cristina Ionescu , Study of the
morphological and metabolical modifications induced by diff erent chemical decontamination
agents on Escherichia coli , 13th National Conference of Biophysics , 2015, Timișoara, România ,
Coautor p rezentare poster
Participări la cursuri de specializare
"Time -Resolved Microscopy and Correlation Spectroscopy ", 2012, PicoQuant , Berlin, Germany,
Certificat de participare
“Training Course for Installation, Maintenance and Repairs ” for SARAD instruments, 2017,
SARA D GmbH, Dresden, Germany, Certificat de autorizare
“Panasonic TLD Training Course in TLD Reader/Irradiator Electronic Testing and Repair ”,
2017, Dositracker SRL, Măgurele, România, Certificat de recunoaștere
“Toward an integrated, joint cross -border detect ion system and harmonized rapid responses
procedures to chemical, biological, radiological and nuclear emergencies Emersys ”, 2015,
IFIN -HH, București, România, Certificat de formator intern
“Datalogger Programming in CRBasic ”, 2013, Campbell Scientif ic Ltd. , Shepshed , United
Kingdom , Certificat de participare
“Huygens imaging trainings ”, 2012, Scientific Volume Imaging B.V. , Hilversum , The
Netherlands , Certificat de participare
143 Alte activități desfășurate
Conducă tor științific din partea IFIN -HH pentru lucrarea de diplomă “ Studiul fluidității
lipozomilor cu dipalmitoilfosfatidilcolină (DPPC) și al interacțiunii lor cu acidul folic .”, 2018 ,
Universitatea din București, Facultatea de Fizică , Absolvent: Mirela Cristea
Conducător științific din partea IFIN -HH pentru lucrarea de diplomă “ Dependența fluidității
membranelor lipidice model de compoziția lipidică .”, 201 6, Universitatea din Bucu rești,
Facultatea de Fizică, Absolvent : Alexandra Alina Lungana
Conducător științific din partea IFIN -HH pentru lucrarea de diplomă “ Aplicațiile laserilor în
biologie. Spectroscopia Corelată de Fluorescență .”, 201 5, Universitatea “Politehnica” din
Bucureșt i, Facultatea de Electronică, Telecomunicații și Tehnologia Informației, Absolvent : Taisia
Ioana Bucur
Conducător științific din partea IFIN -HH pentru lucrarea de di sertație “Studiul fluidit ății
membranelor lipidice model preparat e din DOPC/DPPC. ”, 201 4, Universitatea din București,
Facultatea de Fizică, Masterand : Mihai Avram
144
145 Bibliografie
Abornev, S. M. și Burshtein, E. A. (1992) Resolution of Protein Tryptophan Fluorescence -Spectra
into Elementary Co mponents, Molecular Biology, 26, 890 -897.
Ahmad, I., Perkins, W. R., Lupan, D. M., Selsted, M. E. și Janoff, A. S. (1995) Liposomal
entrapment of the neutrophil -derived peptide indolicidin endows it with in vivo antifungal
activity, Biochim Biophys Acta, 1 237, 109 -14.
Akseenko, V., Shumskaya, T., Slapochnikova, V. și Shein, N. (1989) Quantitative analysis of
multicomponent systems based on the mathematical treatment of vibrational spectra, J.
Appl. Spectrosc, 51, 306 -311.
Albani, J. R. (2009) Fluorescence l ifetimes of tryptophan: structural origin and relation with So –
-> 1Lb and So –> 1La transitions, J Fluoresc, 19, 1061 -71.
Albani, J. R. (2014a) Origin of tryptophan fluorescence lifetimes part 1. Fluorescence lifetimes
origin of tryptophan free in soluti on, J Fluoresc, 24, 93 -104.
Albani, J. R. (2014b) Origin of tryptophan fluorescence lifetimes. Part 2: fluorescence lifetimes
origin of tryptophan in proteins, J Fluoresc, 24, 105 -17.
Alberts, B. (2008) Molecular biology of the cell., New York, NY [u.a.], Garland Science Taylor
& Francis.
Aley, S. B., Zimmerman, M., Hetsko, M., Selsted, M. E. și Gillin, F. D. (1994) Killing of Giardia
lamblia by cryptdins and cationic neutrophil peptides, Infect Immun, 62, 5397 -403.
Aliste, M. P., MacCallum, J. L. și Tielem an, D. P. (2003) Molecular dynamics simulations of
pentapeptides at interfaces: Salt bridge and cation -pi interactions, Biochemistry, 42,
8976 -8987.
Angelone, M., Battistoni, G., Bellini, F., Bocci, V., Collamati, F., Lucia, E. D., Faccini, R., Ferroni,
F., Fiore, S., Marafini, M., Materazzo, D., Mattei, I., Morganti, S., Patera, V., Piersanti, L.,
Pillon, M., Recchia, L., Russomando, A., Sarti, A., Sciubba, A., Camillocci, E. S. și Voena,
C. (2014) Properties of para -Terphenyl as a Detector for alpha, beta and gamma
Radiation, IEEE Transactions on Nuclear Science, 61, 1483 -1487.
Baba, T. și Schneewind, O. (1998) Instruments of microbial warfare: bacteriocin synthesis,
toxicity and immunity, Trends in Microbiology, 6, 66 -71.
Bacalum, M., Janosi, L., Zorilă, F., Tepes, A. M., Ionescu, C., Bogdan, E., Hadade, N., Craciun,
L., Grosu, I., Turcu, I. și Radu, M. (2017) Modulating short tryptophan – and arginine -rich
peptides activity by substitution with histidine, Biochim Biophys Acta, 1861, 1844 -1854.
Bacalum, M., Zorilă, B. și Radu, M. (2013) Fluorescence spectra decomposition by asymmetric
functions: Laurdan spectrum revisited, Analytical Biochemistry, 440, 123 -129.
Bagatolli, L. A. (2006) To see or not to see: lateral organization of biological membranes and
fluorescence microscopy, Biochim Biophys Acta, 1758, 1541 -56.
Bagatolli, L. A. și Gratton, E. (2000) Two photon fluorescence microscopy of coexisting lipid
domains in giant unilamellar vesicles of binary phospholipid mixtures, Biophys J, 78, 290 –
305.
146 Bagatoll i, L. A., Parasassi, T., Fidelio, G. D. și Gratton, E. (1999) A model for the interaction of
6-lauroyl -2-(N,N -dimethylamino)naphthalene with lipid environments: implications for
spectral properties, Photochem Photobiol, 70, 557 -64.
Bals, R., Wang, X. R., W u, Z. R., Freeman, T., Bafna, V., Zasloff, M. și Wilson, J. M. (1998)
Human beta -defensin 2 is a salt -sensitive peptide antibiotic expressed in human lung,
Journal of Clinical Investigation, 102, 874 -880.
Bastos, M., Bai, G., Gomes, P., Andreu, D., Goormag htigh, E. și Prieto, M. (2008) Energetics and
partition of two cecropin -melittin hybrid peptides to model membranes of different
composition, Biophys J, 94, 2128 -41.
Batenburg, A. M., van Esch, J. H. și de Kruijff, B. (1988) Melittin -induced changes of the
macroscopic structure of phosphatidylethanolamines, Biochemistry, 27, 2324 -31.
Becker, W. M. (2012) World of the cell, New York, Pearson.
Beechem, J. M. și Brand, L. (1985) Time -resolved fluorescence of proteins, Annu Rev Biochem,
54, 43 -71.
Bello, J., Be llo, H. R. și Granados, E. (1982) Conformation and aggregation of melittin:
dependence on pH and concentration, Biochemistry, 21, 461 -5.
Beschiaschvili, G. și Baeuerle, H. D. (1991) Effective charge of melittin upon interaction with
POPC vesicles, Biochim Biophys Acta, 1068, 195 -200.
Bessalle, R., Kapitkovsky, A., Gorea, A., Shalit, I. și Fridkin, M. (1990) All-D-Magainin –
Chirality, Antimicrobial Activity and Proteolytic Resistance, Febs Letters, 274, 151 -155.
Beven, L., Castano, S., Dufourcq, J., Wieslan der, A. și Wroblewski, H. (2003) The antibiotic
activity of cationic linear amphipathic peptides: lessons from the action of leucine/lysine
copolymers on bacteria of the class Mollicutes, Eur J Biochem, 270, 2207 -17.
Bismuto, E., Sirangelo, I. și Irace, G. (1993) Folding and dynamics of melittin in reversed micelles,
Biochim Biophys Acta, 1146, 213 -8.
Blondelle, S. E. și Lohner, K. (2004) Combinatorial libraries: A tool to design antimicrobial and
antifungal peptide analogues having lytic specificities for structure –activity relationship
studies, Peptide Science, 55, 74 -87.
Blondelle, S. E., PerezPaya, E. și Houghten, R. A. (1996) Synthetic combinatorial libraries: Novel
discovery strategy for identification of antimicrobial agents, Antimicrobial Agents and
Chemotherapy, 40, 1067 -1071.
Boens, N., Qin, W., Basaric, N., Hofkens, J., Ameloot, M., Pouget, J., Lefevre, J. P., Valeur, B.,
Gratton, E., vandeVen, M., Silva, N. D., Jr., Engelborghs, Y., Willaert, K., Sillen, A.,
Rumbles, G., Phillips, D., Visser, A. J ., van Hoek, A., Lakowicz, J. R., Malak, H.,
Gryczynski, I., Szabo, A. G., Krajcarski, D. T., Tamai, N. și Miura, A. (2007) Fluorescence
lifetime standards for time and frequency domain fluorescence spectroscopy, Anal Chem,
79, 2137 -49.
Bolshakova, A. V., Kiselyova, O. I., Filonov, A. S., Frolova, O. Y., Lyubchenko, Y. L. și
Yaminsky, I. V. (2001) Comparative studies of bacteria with an atomic force microscopy
operating in different modes, Ultramicroscopy, 86, 121 -8.
147 Boman, H. G. (1995) Peptide Antibiotics and Their Role in Innate Immunity, Annual Review of
Immunology, 13, 61 -92.
Boman, H. G., Agerberth, B. și Boman, A. (1993) Mechanisms of action on Escherichia coli of
cecropin P1 and PR -39, two antibacterial peptides from pig intestine, Infect Immun, 61,
2978-84.
Bradshaw, J. P. (2003) Cationic antimicrobial peptides – Issues for potential clinical use,
Biodrugs, 17, 233 -240.
Brogden, K. A. (2005) Antimicrobial peptides: pore formers or metabolic inhibitors in bacteria?,
Nat Rev Microbiol, 3, 238 -50.
Brown, K. L. și Hancock, R. E. (2006) Cationic host defense (antimicrobial) peptides, Curr Opin
Immunol, 18, 24 -30.
Bulet, P. și Stocklin, R. (2005) Insect antimicrobial peptides: Structures, properties and gene
regulation, Protein and Peptide Letters, 12, 3 -11.
Burstein, E. A. (1968) Quenching of protein fluorescence. I. Principles of the method. Solutions
of tryptophan, tyrosine and denatured proteins, Biophysics (Moscow), 13, 433 -442.
Burstein, E. A. (1977) Intrinsic protein luminescence (the nature and applic ation), Advances in
Science and Technology (Itogi Nauki i Tekhniki), ser. Biophysics, 7.
Burstein, E. A., Abornev, S. M. și Reshetnyak, Y. K. (2001) Decomposition of protein tryptophan
fluorescence spectra into log -normal components. I. Decomposition algor ithms,
Biophysical Journal, 81, 1699 -1709.
Burstein, E. A. și Emelyanenko, V. I. (1996) Log-normal description of fluorescence spectra of
organic fluorophores, Photochemistry and Photobiology, 64, 316 -320.
Bush, K. (2004) Antibacterial drug discovery in th e 21st century, Clinical Microbiology and
Infection, 10, 10 -17.
Castro, M. S. și Fontes, W. (2005) Plant defense and antimicrobial peptides, Protein and Peptide
Letters, 12, 13 -18.
Chan, W. și White, P. (1999) Fmoc solid phase peptide synthesis , Oxford, Ox ford University Press.
Disponibil on -line: http://public.eblib.com/choice/publicfullrecord.aspx?p=4963406 .
Chattopadhyay, A. (2003) Exploring membrane organization and dynamics by the wavelength –
selective fluorescence approach, Chem Phys Lipids, 122, 3 -17.
Chen, Y. și Barkley, M. D. (1998) Toward understanding tryptophan fluorescence in proteins,
Biochemistry, 37, 9976 -82.
Chernysh, S., Gordya, N. și Suborova, T. (2015) Insect An timicrobial Peptide Complexes Prevent
Resistance Development in Bacteria, Plos One, 10.
Chilom, C. G., Zorila, B., Popescu, A. I. și Zorila, B. (2017) Characterization of some physico –
chemical properties and interactions of human and bovine serum albumins with mitomycin
C, Rom. J. Phys. Romanian Journal of Physics, 62, 7 -8.
Chiou, P. P., Chen, M. J., Lin, C. M., Khoo, J., Larson, J., Holt, R., Leong, J. A., Thorgarrd, G. și
Chen, T. T. (2014) Production of homozygous transgenic rainbow trout with enhanced
disease resistance, Mar Biotechnol (NY), 16, 299 -308.
148 Chiou, P. P., Lin, C. M., Perez, L. și Chen, T. T. (2002) Effect of cecropin B and a synthetic
analogue on propagation of fish viruses in vitro, Mar Biotechnol (NY), 4, 294 -302.
Chopra, I. (2013) The 201 2 Garrod Lecture: Discovery of antibacterial drugs in the 21st century,
Journal of Antimicrobial Chemotherapy, 68, 496 -505.
Chou, H. T., Wen, H. W., Kuo, T. Y., Lin, C. C. și Chen, W. J. (2010) Interaction of cationic
antimicrobial peptides with phospholip id vesicles and their antibacterial activity, Peptides,
31, 1811 -1820.
Constantinescu, I. și Lafleur, M. (2004) Influence of the lipid composition on the kinetics of
concerted insertion and folding of melittin in bilayers, Biochim Biophys Acta, 1667, 26 –
37.
Cooper, G. M. (2000) The cell : a molecular approach, Washington; Sunderland, Mass., Sunauer
Associates ASM Press.
Cui, Y., Oh, Y. J., Lim, J., Youn, M., Lee, I., Pak, H. K., Park, W., Jo, W. și Park, S. (2012) AFM
study of the differential inhibitory ef fects of the green tea polyphenol ( -)-epigallocatechin –
3-gallate (EGCG) against Gram -positive and Gram -negative bacteria, Food
Microbiology, 29, 80 -87.
D'Agata, E. M. C. (2015) Rapidly Rising Prevalence of Nosocomial Multidrug -Resistant, Gram –
Negative Baci lli: A 9 -Year Surveillance Study, Infection Control & Hospital
Epidemiology, 25, 842 -846.
Dathe, M. și Wieprecht, T. (1999) Structural features of helical antimicrobial peptides: their
potential to modulate activity on model membranes and biological cells, Biochim Biophys
Acta, 1462, 71 -87.
de Jongh, H. H., Goormaghtigh, E. și Killian, J. A. (1994) Analysis of circular dichroism spectra
of oriented protein -lipid complexes: toward a general application, Biochemistry, 33,
14521 -8.
De Vequi -Suplicy, C. C., Benatti, C. R. și Lamy, M. T. (2006) Laurdan in Fluid Bilayers: Position
and Structural Sensitivity, Journal of Fluorescence, 16, 431 -439.
Demchenko, A. P. (1988) Red-Edge -Excitation Fluorescence Spectroscopy of Single -Tryptophan
Proteins, European Bio physics Journal with Biophysics Letters, 16, 121 -129.
Dempsey, C. E. (1990) The actions of melittin on membranes, Biochim Biophys Acta, 1031, 143 –
61.
Dempsey, C. E. și Butler, G. S. (1992) Helical structure and orientation of melittin in dispersed
phosphol ipid membranes from amide exchange analysis in situ, Biochemistry, 31, 11973 –
7.
Dennison, S. R., Harris, F., Mura, M. și Phoenix, D. A. (2018) An Atlas of Anionic Antimicrobial
Peptides from Amphibians, Current Protein & Peptide Science, 19, 823 -838.
Deshp ande, L. M., Fritsche, T. R. și Jones, R. N. (2004) Molecular epidemiology of selected
multidrug -resistant bacteria: A global report from the SENTRY Antimicrobial Surveillance
Program, Diagnostic Microbiology and Infectious Disease, 49, 231 -236.
Deslouches , B., Steckbeck, J. D., Craigo, J. K., Doi, Y., Mietzner, T. A. și Montelaro, R. C. (2013)
Rational design of engineered cationic antimicrobial peptides consisting exclusively of
149 arginine and tryptophan, and their activity against multidrug -resistant patho gens,
Antimicrob Agents Chemother, 57, 2511 -21.
Diamond, G., Beckloff, N., Weinberg, A. și Kisich, K. O. (2009) The Roles of Antimicrobial
Peptides in Innate Host Defense, Current Pharmaceutical Design, 15, 2377 -2392.
Dosler, S. (2017) Antimicrobial peptid es: Coming to the end of antibiotic era, the most promising
agents, Istanbul Journal of Pharmacy, 47, 72 -76.
Eftink, M. R. (1991) Fluorescence techniques for studying protein structure, Methods Biochem
Anal, 35, 127 -205.
Eftink, M. R. și Ghiron, C. A. (197 6) Fluorescence quenching of indole and model micelle systems,
The Journal of Physical Chemistry, 80, 486 -493.
Eftink, M. R. și Ghiron, C. A. (1981) Fluorescence quenching studies with proteins, Anal
Biochem, 114, 199 -227.
Eftink, M. R. și Ghiron, C. A. (1 994) Oxygen fluorescence quenching studies with single
tryptophan -containing proteins, J Fluoresc, 4, 187 -93.
Eichler, J. și Houghten, R. A. (1995) Generation and Utilization of Synthetic Combinatorial
Libraries, Molecular Medicine Today, 1, 174 -180.
Emely anenko, V. I., Reshetnyak, Y. K., Andreev, O. A. și Burstein, E. A. (2000) Log-normal
component analysis of fluorescence spectra of prodan and acrylodan bound to proteins,
Biofizika, 45, 207 -219.
Epand, R., Lehrer, R. I., Waring, A., Wang, W., Maget -Dana, R., Lelievre, D. și Epand, R. M.
(2003) Direct comparison of membrane interactions of model peptides composed of only
Leu and Lys residues, Biopolymers, 71, 2 -16.
Epand, R. M. și Vogel, H. J. (1999) Diversity of antimicrobial peptides and their mechanisms of
action, Biochimica Et Biophysica Acta -Biomembranes, 1462, 11 -28.
Falla, T. J., Karunaratne, D. N. și Hancock, R. E. (1996) Mode of action of the antimicrobial
peptide indolicidin, J Biol Chem, 271, 19298 -303.
Faucon, J. F., Dufourcq, J. și Lussan, C. (1 979) The self -association of melittin and its binding to
lipids: an intrinsic fluorescence polarization study, FEBS Lett, 102, 187 -90.
Ficarra, F. A., Grandellis, C., Garavaglia, B. S., Gottig, N. și Ottado, J. (2018) Bacterial and plant
natriuretic peptid es improve plant defence responses against pathogens, Molecular Plant
Pathology, 19, 801 -811.
Findlay, F., Proudfoot, L., Stevens, C. și Barlow, P. G. (2016) Cationic host defense peptides;
novel antimicrobial therapeutics against Category A pathogens and emerging infections,
Pathog Glob Health, 110, 137 -47.
Frey, S. și Tamm, L. K. (1991) Orientation of melittin in phospholipid bilayers. A polarized
attenuated total reflection infrared study, Biophys J, 60, 922 -30.
Friedrich, C. L., Moyles, D., Beveridge, T . J. și Hancock, R. E. W. (2000) Antibacterial action of
structurally diverse cationic peptides on gram -positive bacteria, Antimicrobial Agents and
Chemotherapy, 44, 2086 -2092.
150 Gagnon, M. C., Strandberg, E., Grau -Campistany, A., Wadhwani, P., Reichert, J., Burck, J.,
Rabanal, F., Auger, M., Paquin, J. F. și Ulrich, A. S. (2017) Influence of the Length and
Charge on the Activity of alpha -Helical Amphipathic Antimicrobial Peptides,
Biochemistry, 56, 1680 -1695.
Ganz, T. (2003) Defensins: Antimicrobial peptides of innate immunity, Nature Reviews
Immunology, 3, 710 -720.
Garcia -Olmedo, F., Molina, A., Alamillo, J. M. și Rodriguez -Palenzuela, P. (1998) Plant defense
peptides, Biopolymers, 47, 479 -491.
Gauglitz, G., Moore, D. S. și Vo -Dinh, T. (2014) Handbook of spe ctroscopy Vol. 1 -4, Weinheim,
Wiley -VCH.
Gazit, E., Bach, D., Kerr, I. D., Sansom, M. S., Chejanovsky, N. și Shai, Y. (1994a) The alpha -5
segment of Bacillus thuringiensis delta -endotoxin: in vitro activity, ion channel formation
and molecular modelling, Biochem J, 304 ( Pt 3), 895 -902.
Gazit, E., Boman, A., Boman, H. G. și Shai, Y. (1995) Interaction of the mammalian antibacterial
peptide cecropin P1 with phospholipid vesicles, Biochemistry, 34, 11479 -88.
Gazit, E., Lee, W. J., Brey, P. T. și Shai, Y. (199 4b) Mode of action of the antibacterial cecropin
B2: a spectrofluorometric study, Biochemistry, 33, 10681 -92.
Gazit, E. și Shai, Y. (1993) Structural and functional characterization of the alpha 5 segment of
Bacillus thuringiensis delta -endotoxin, Biochemi stry, 32, 3429 -36.
Geddes, C. D. și Lakowicz, J. R. (2004) Annual reviews in fluorescence 2003, Journal of
Fluorescence, 14, 127 -127.
Gerken, U. și Imhof, N. (2010) Time -Resolved Spectroscopy of Proteins , Disponibil on -line:
https:// www.picoquant.com/images/uploads/page/files/7354/appnote_tr_proteins.pdf ,
Institute of Microbiology, University of Hohenheim, Stuttgart, Germany.
Ghosh, A. K., Rukmini, R. și Chattopa dhyay, A. (1997) Modulation of tryptophan environment in
membrane -bound melittin by negatively charged phospholipids: implications in membrane
organization and function, Biochemistry, 36, 14291 -305.
Goldman, M. J., Anderson, G. M., Stolzenberg, E. D., Kari , U. P., Zasloff, M. și Wilson, J. M.
(1997) Human beta -defensin -1 is a salt -sensitive antibiotic in lung that is inactivated in
cystic fibrosis, Cell, 88, 553 -560.
Gordon, Y. J., Romanowski, E. G. și McDermott, A. M. (2005) A review of antimicrobial pepti des
and their therapeutic potential as anti -infective drugs, Current Eye Research, 30, 505 -515.
Granjon, T., Vacheron, M. J., Vial, C. și Buchet, R. (2001) Mitochondrial creatine kinase binding
to phospholipids decreases fluidity of membranes and promotes new lipid -induced beta
structures as monitored by red edge excitation shift, Laurdan fluorescence, and FTIR,
Biochemistry, 40, 6016 -6026.
Guo, C., Huang, Y., Cong, P., Liu, X., Chen, Y. și He, Z. (2014) Cecropin P1 inhibits porcine
reproductive and respira tory syndrome virus by blocking attachment, BMC Microbiol, 14,
273.
Habermann, E. (1972) Bee and wasp venoms, Science, 177, 314 -22.
151 Hale, J. D. și Hancock, R. E. (2007) Alternative mechanisms of action of cationic antimicrobial
peptides on bacteria, Expert Rev Anti Infect Ther, 5, 951 -9.
Hancock, R. E. și Diamond, G. (2000) The role of cationic antimicrobial peptides in innate host
defences, Trends Microbiol, 8, 402 -10.
Hancock, R. E. și Patrzykat, A. (2002) Clinical development of cationic antimicrobial pe ptides:
from natural to novel antibiotics, Curr Drug Targets Infect Disord, 2, 79 -83.
Hancock, R. E. W. (2001) Cationic peptides: effectors in innate immunity and novel
antimicrobials, The Lancet Infectious Diseases, 1, 156 -164.
Harder, J. și Schröder, J. -M. (2016) Antimicrobial Peptides: Role in Human Health and Disease,
Antimicrobial Peptides: Role in Human Health and Disease, 1 -158.
Hayes, D. M. și Kollman, P. A. (1976a) Electrostatic potentials of proteins. 1. Carboxypeptidase
A, J Am Chem Soc, 98, 3335 -45.
Hayes, D. M. și Kollman, P. A. (1976b) Electrostatic potentials of proteins. 2. Role of
electrostatics in a possible catalytic mechanism for carboxypeptidase A, J Am Chem Soc,
98, 7811 -4.
He, Y. și Lazaridis, T. (2013) Activity determinants of helical antimicrobial peptides: a large –
scale computational study, PLoS One, 8, e66440.
Hernández -Villa, L., Manrique -Moreno, M., Leidy, C., Jemioła -Rzemińska, M., Ortíz, C. și
Strzałka, K. (2018) Biophysical evaluation of cardiolipin content as a regulator of th e
membrane lytic effect of antimicrobial peptides, Biophysical Chemistry, 238, 8 -15.
Hershberger, M. V., Lumry, R. și Verrall, R. (1981) The 3 -Methylindole/n -Butanol Exciplexes:
Evidence for Two Exciplex Sites in Indole Compounds, Photochemistry and Photob iology,
33, 609 -617.
Honig, B. și Nicholls, A. (1995) Classical electrostatics in biology and chemistry, Science, 268,
1144 -9.
Hsu, J. C. și Yip, C. M. (2007) Molecular dynamics simulations of indolicidin association with
model lipid bilayers, Biophys J, 9 2, L100 -2.
http://fityk.nieto.pl .
http://www.antistaphybase.com .
http://www.iss. com/resources/reference/data_tables/FL_LifetimeStandards.html .
https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/16129733.
https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/16130477.
https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/16133648.
https:// www.chromacademy.com/lms/sco5/Solvent_Miscibility_Chart.pdf .
Huang, H. W. (2000) Action of antimicrobial peptides: two -state model, Biochemistry, 39, 8347 –
52.
Hui, Y., Xue, X., Xuesong, Z. și Yan, W. I ntrinsic Fluorescence Spectra of Tryptophan, Tyrosine
and Phenyloalanine. 5th International Conference on Advanced Design and Manufacturing
Engineering (ICADME 2015), 2015. Atlantis Press, 224 -233.
152 Ionescu, D. și Ganea, C. (2012) A study of quercetin effe cts on phospholipid membranes containing
cholesterol using Laurdan fluorescence, Eur Biophys J.
Iwadate, M., Asakura, T. și Williamson, M. P. (1998) The structure of the melittin tetramer at
different temperatures –an NOE -based calculation with chemical sh ift refinement, Eur J
Biochem, 257, 479 -87.
Iwanowska, J., Swiderski, L. și Moszynski, M. (2012) Liquid scintillators and composites in fast
neutron detection, Journal of Instrumentation, 7.
Izadpanah, A. și Gallo, R. L. (2005) Antimicrobial peptides, Journal of the American Academy of
Dermatology, 52, 381 -392.
Jenssen, H., Hamill, P. și Hancock, R. E. W. (2006) Peptide antimicrobial agents, Clinical
Microbiology Reviews, 19, 491 -+.
Jiang, Z., Mant, C. T., Vasil, M. și Hodges, R. S. (2018) Role of positivel y charged residues on the
polar and non -polar faces of amphipathic alpha -helical antimicrobial peptides on
specificity and selectivity for Gram -negative pathogens, Chem Biol Drug Des, 91, 75 -92.
Jiang, Z., Vasil, A. I., Hale, J. D., Hancock, R. E., Vasil, M. L. și Hodges, R. S. (2008) Effects of
net charge and the number of positively charged residues on the biological activity of
amphipathic alpha -helical cationic antimicrobial peptides, Biopolymers, 90, 369 -83.
Jing, W., Hunter, H. N., Hagel, J. și Vogel, H. J. (2003a) The structure of the antimicrobial peptide
Ac-RRWWRF -NH2 bound to micelles and its interactions with phospholipid bilayers,
Journal of Peptide Research, 61, 219 -229.
Jing, W. G., Demcoe, A. R. și Vogel, H. J. (2003b) Conformation of a bacter icidal domain of
puroindoline a: Structure and mechanism of action of a 13 -residue antimicrobial peptide,
Journal of Bacteriology, 185, 4938 -4947.
Jurkiewicz, P., Cwiklik, L., Jungwirth, P. și Hof, M. (2012) Lipid hydration and mobility: an
interplay betwe en fluorescence solvent relaxation experiments and molecular dynamics
simulations, Biochimie, 94, 26 -32.
Jurkiewicz, P., Olzynska, A., Langner, M. și Hof, M. (2006) Headgroup hydration and mobility
of DOTAP/DOPC bilayers: a fluorescence solvent relaxation study, Langmuir, 22, 8741 –
8749.
Kapusta, P. (2002) Sensitivity of FluoTime Series Lifetime Spectrometers , Berlin.
Kasha, M. (1950) Characterization of electronic transitions in complex molecules, Discussions of
the Faraday Society, 9, 14 -19.
Kawski, A., Ku kliński, B., Bojarski, P. și Diehl, H. (2000) Ground and Excited State Dipole
Moments of LAURDAN Determined from Solvatochromic and Thermochromic Shifts of
Absorption and Fluorescence Spectra, Z. Naturforsch, A 55, 817 -822.
Khandelia, H. și Kaznessis, Y. N . (2007) Cation -pi interactions stabilize the structure of the
antimicrobial peptide indolicidin near membranes: molecular dynamics simulations, J
Phys Chem B, 111, 242 -50.
Khurshid, Z., Zafar, M. S., Naseem, M., Khan, R. S. și Najeeb, S. (2018) Human Oral Defensins
Antimicrobial Peptides: A Future Promising Antimicrobial Drug, Current Pharmaceutical
Design, 24, 1130 -1137.
153 Knoppel, E., Eisenberg, D. și Wickner, W. (1979) Interactions of Melittin, a Pre -Protein Model,
with Detergents, Biochemistry, 18, 4177 -4181.
Konovalova, M. V., Zubareva, A. A., Lutsenko, G. V. și Svirshchevskaya, E. V. (2018)
Antimicrobial Peptides in Health and Disease (Review), Applied Biochemistry and
Microbiology, 54, 238 -244.
Kouya, T., Koiso, Y., Taiyouji, M., Ohtsubo, S., Tanaka, T . și Taniguchi, M. (2009) Growth –
inhibitory activity of antimicrobial peptides from rice against oral pathogenic bacteria and
clarification of their action mechanism, Journal of Bioscience and Bioengineering, 108,
S141 -S141.
Koynova, R. și Caffrey, M. (199 8) Phases and phase transitions of the phosphatidylcholines,
Biochimica Et Biophysica Acta -Reviews on Biomembranes, 1376, 91 -145.
Kozyra, K. A., Heldt, J. R., Heldt, J., Engelkec, M. și Diehl, H. A. (2003) Concentration and
Temperature Dependence of Laurda n Fluorescence in Glycerol, Zeitschrift für
Naturforschung A.
Kreil, G. (1994) Antimicrobial Peptides from Amphibian Skin – an Overview, Antimicrobial
Peptides, 186, 77 -85.
Kriech, M. A. și Conboy, J. C. (2003) Label -free chiral detection of melittin bindi ng to a
membrane, J Am Chem Soc, 125, 1148 -9.
Kubiak, J., Brewer, J., Hansen, S. și Bagatolli, L. A. (2011) Lipid Lateral Organization on Giant
Unilamellar Vesicles Containing Lipopolysaccharides, Biophysical Journal, 100, 978 -986.
Kumar, T. V. V. și Sanil , G. (2017) A Review of the Mechanism of Action of Amphibian
Antimicrobial Peptides Focusing on Peptide -Membrane Interaction and Membrane
Curvature, Current Protein & Peptide Science, 18, 1263 -1272.
Ladokhin, A. S., Jayasinghe, S. și White, S. H. (2000) How to Measure and Analyze Tryptophan
Fluorescence in Membranes Properly, and Why Bother?, Analytical Biochemistry, 285,
235-245.
Ladokhin, A. S., Selsted, M. E. și White, S. H. (1997) Bilayer interactions of indolicidin, a small
antimicrobial peptide rich i n tryptophan, proline, and basic amino acids, Biophys J, 72,
794-805.
Ladokhin, A. S. și White, S. H. (2001) 'Detergent -like' permeabilization of anionic lipid vesicles
by melittin, Biochim Biophys Acta, 1514, 253 -60.
Lakowicz, J. R. (2006) Principles of F luorescence Spectroscopy , New York, Springer
Science+Business Media, LLC.
Lakowicz, J. R. și Geddes, C. D. (2002) Topics in fluorescence spectroscopy. Volume 2, Volume
2, New York, Plenum Press. Disponibil on -line: http://www.myilibrary.com?id=20633 .
Lakowicz, J. R. și Sheppard, J. R. (1981) Fluorescence spectroscopic studies of Huntington
fibroblast membranes, Am J Hum Genet, 33, 155 -65.
Lambert, P. A. (2005) Bacterial resistance to antibiotics: Modified t arget sites, Advanced Drug
Delivery Reviews, 57, 1471 -1485.
Lee, I. H., Cho, Y. și Lehrer, R. I. (1997) Effects of pH and salinity on the antimicrobial properties
of clavanins, Infection and Immunity, 65, 2898 -2903.
154 Lee, J. Y., Boman, A., Sun, C. X., Ander sson, M., Jornvall, H., Mutt, V. și Boman, H. G. (1989)
Antibacterial peptides from pig intestine: isolation of a mammalian cecropin, Proc Natl
Acad Sci U S A, 86, 9159 -62.
Lee, M. T., Chen, F. Y. și Huang, H. W. (2004) Energetics of pore formation induced by membrane
active peptides, Biochemistry, 43, 3590 -9.
Lee, T. H., Mozsolits, H. și Aguilar, M. I. (2001) Measurement of the affinity of melittin for
zwitterionic and anionic membranes using immobilized lipid biosensors, J Pept Res, 58,
464-76.
Lehrer, R. I. și Ganz, T. (1999) Antimicrobial peptides in mammalian and insect host defence,
Curr Opin Immunol, 11, 23 -7.
Lehrer, S. S. (1971) Solute perturbation of protein fluorescence. Quenching of the tryptophyl
fluorescence of model compounds and of lysozyme b y iodide ion, Biochemistry, 10, 3254 –
3263.
Lehrer, S. S. și Leavis, P. C. (1978) Solute quenching of protein fluorescence, Methods Enzymol,
49, 222 -36.
Linke, D., Frank, J., Pope, M. S., Soll, J., Ilkavets, I., Fromme, P., Burstein, E. A., Reshetnyak, Y.
K. și Emelyanenko, V. I. (2004) Folding kinetics and structure of OEP16, Biophys J, 86,
1479 -87.
Lohner, K. (2017) Membrane -active Antimicrobial Peptides as Template Structures for Novel
Antibiotic Agents, Current Topics in Medicinal Chemistry, 17, 508 -519.
Loura, L. M., de Almeida, R. F., Coutinho, A. și Prieto, M. (2003) Interaction of peptides with
binary phospholipid membranes: application of fluorescence methodologies, Chem Phys
Lipids, 122, 77 -96.
Lucio, A. D., Vequi -Suplicy, C. C., Fernandez, R. M. și Lamy, M. T. (2010) Laurdan spectrum
decomposition as a tool for the analysis of surface bilayer structure and polarity: a study
with DMPG, peptides and cholesterol, J Fluoresc, 20, 473 -82.
Machan, R., Jurkiewicz, P., Olzynska, A., Olsinova, M., Cebecauer, M., Marquette, A., Bechinger,
B. și Hof, M. (2014) Peripheral and Integral Membrane Binding of Peptides Characterized
by Time -Dependent Fluorescence Shifts: Focus on Antimicrobial Peptide LAH(4),
Langmuir, 30, 6171 -6179.
Mahlapuu, M., Hakansson, J., Rings tad, L. și Bjorn, C. (2016) Antimicrobial Peptides : An
Emerging Category of Therapeutic Agents, Frontiers in Cellular and Infection
Microbiology, 6.
Man, D. K. -W., Kanno, T., Manzo, G., Robertson, B. D., Lam, J. K. W. și Mason, A. J. (2018)
Rifampin – or Capreomycin -Induced Remodeling of the Mycobacterium smegmatis Mycolic
Acid Layer Is Mitigated in Synergistic Combinations with Cationic Antimicrobial Peptides,
mSphere, 3, e00218 -18.
Mark, L. M., Peter, F. B., Jason, L. și James, M. R. (2016) Applications f or New Scintillator
Technologies in Gamma Ray Astronomy, Journal of Physics: Conference Series, 763,
012008.
Marmiroli, N. și Maestri, E. (2014) Plant peptides in defense and signaling, Peptides, 56, 30 -44.
155 Marquette, A. și Bechinger, B. (2018) Biophysical Investigations Elucidating the Mechanisms of
Action of Antimicrobial Peptides and Their Synergism, Biomolecules, 8.
Marr, A. K., Gooderham, W. J. și Hancock, R. E. W. (2006) Antibacterial peptides for therapeutic
use: obstacles and realistic outlook, Current Opinion in Pharmacology, 6, 468 -472.
Marrodan, U. T., von Feilitzsch, F., Oberauer, L., Potzel, W., Ulrich, A., Winter, J. și Wurm, M.
(2009) Fluorescence decay -time constants in organic liquid scintillators, Rev Sci Instrum,
80, 043301.
Matsuzaki, K., Murase, O., Tokuda, H., Funakoshi, S., Fujii, N. și Miyajima, K. (1994)
Orientational and aggregational states of magainin 2 in phospholipid bilayers,
Biochemistry, 33, 3342 -9.
Mazze, F. M., Fuzo, C. A. și Degreve, L. (2005) A new amphipathy scale I. Dete rmination of the
scale from molecular dynamics data, Biochim Biophys Acta, 1747, 35 -46.
Mecke, A., Lee, D. K., Ramamoorthy, A., Orr, B. G. și Banaszak Holl, M. M. (2005) Membrane
thinning due to antimicrobial peptide binding: an atomic force microscopy stu dy of MSI –
78 in lipid bilayers, Biophys J, 89, 4043 -50.
Minahk, C. J. și Morero, R. D. (2003) Inhibition of enterocin CRL35 antibiotic activity by mono –
and divalent ions, Letters in Applied Microbiology, 37, 374 -379.
Minoux, H. și Chipot, C. (1999) Cation -pi interactions in proteins: Can simple models provide an
accurate description?, Journal of the American Chemical Society, 121, 10366 -10372.
Mobius, S., Kamolchote, P. și Roeksbutr, W. (1993) Use of Extractive Scintillation and Pulse
Shape -Analysis for En vironmental Alpha -Assay, Science of the Total Environment, 130,
467-471.
Mohd, A. și Gupta, U. S. (2011) Antimicrobial Peptides and their Mechanism of Action, Research
Journal of Biotechnology, 6, 71 -79.
Mookherjee, N. și Hancock, R. E. (2007) Cationic hos t defence peptides: innate immune
regulatory peptides as a novel approach for treating infections, Cell Mol Life Sci, 64, 922 –
33.
Mor, A. (2000) Peptide -based antibiotics: A potential answer to raging antimicrobial resistance,
Drug Development Research, 50 , 440 -447.
Morozova, Y. P., Zharkova, O. M., Balakina, T. Y., Artyukhov, V. Y. și Korolev, B. V. (2011)
Conformal transitions of the laurdan molecule in the absorption and fluorescence spectra,
Russian Physics Journal, 54, 594.
Moyano, F., Biasutti, M. A., Silber, J. J. și Correa, N. M. (2006) New insights on the behavior of
PRODAN in homogeneous media and in large unilamellar vesicles, J Phys Chem B, 110,
11838 -46.
Mozsolits, H., Wirth, H. J., Werkmeister, J. și Aguilar, M. I. (2001) Analysis of antimicrob ial
peptide interactions with hybrid bilayer membrane systems using surface plasmon
resonance, Biochim Biophys Acta, 1512, 64 -76.
Neale, C., Hsu, J. C., Yip, C. M. și Pomes, R. (2014) Indolicidin binding induces thinning of a
lipid bilayer, Biophys J, 106, L29-31.
156 Nielsen, S. B. și Otzen, D. E. (2010) Impact of the antimicrobial peptide Novicidin on membrane
structure and integrity, Journal of Colloid and Interface Science, 345, 248 -256.
Ningsih, Z., Hossain, M. A., Wade, J. D., Clayton, A. H. A. și Gee, M. L. (2012) Slow Insertion
Kinetics during Interaction of a Model Antimicrobial Peptide with Unilamellar
Phospholipid Vesicles, Langmuir, 28, 2217 -2224.
Onate -Garzon, J., Manrique -Moreno, M., Trier, S., Leidy, C., Torres, R. și Patino, E. (2017)
Antimicrobi al activity and interactions of cationic peptides derived from Galleria
mellonella cecropin D -like peptide with model membranes, Journal of Antibiotics, 70, 238 –
245.
Oppenheim, J. J., Biragyn, A., Kwak, L. W. și Yang, D. (2003) Roles of antimicrobial pepti des
such as defensins in innate and adaptive immunity, Annals of the Rheumatic Diseases, 62,
17-21.
Oren, Z. și Shai, Y. (2004) Mode of action of linear amphipathic α -helical antimicrobial peptides,
Peptide Science, 47, 451 -463.
Owen, D. M., Rentero, C., M agenau, A., Abu -Siniyeh, A. și Gaus, K. (2012) Quantitative imaging
of membrane lipid order in cells and organisms, Nature Protocols, 7, 24 -35.
Parasassi, T., Conti, F. și Gratton, E. (1986) Time -resolved fluorescence emission spectra of
Laurdan in phospho lipid vesicles by multifrequency phase and modulation fluorometry,
Cell Mol Biol, 32, 103 -8.
Parasassi, T., De Stasio, G., Dubaldo, A. și Gratton, E. (1990a) Phase Fluctuation in Phospholipid –
Membranes Revealed by Laurdan Fluorescence, Biophysical Journal, 57, 1179 -1186.
Parasassi, T., De Stasio, G., Ravagnan, G., Rusch, R. M. și Gratton, E. (1991) Quantitation of lipid
phases in phospholipid vesicles by the generalized polarization of Laurdan fluorescence,
Biophys J, 60, 179 -89.
Parasassi, T., Di Stefano, M., Loiero, M., Ravagnan, G. și Gratton, E. (1994) Influence of
cholesterol on phospholipid bilayers phase domains as detected by Laurdan fluorescence,
Biophysical Journal, 66, 120 -132.
Parasassi, T., Krasnowska, E. K., Bagatolli, L. și Gratton, E. (1998) LAURDAN and PRODAN as
polarity -sensitive fluorescent membrane probes, Journal of Fluorescence, 8, 365 -373.
Parasassi, T., Stasio, G. D., Miccheli, A., Bruno, F., Conti, F. și Gratton, E. (1990b) Abscisic acid –
induced microheterogeneity in phospholipid vesi cle: a fluorescence study, Biophys Chem,
35, 65 -73.
Perron, G. G., Zasloff, M. și Bell, G. (2006) Experimental evolution of resistance to an
antimicrobial peptide, Proc Biol Sci, 273, 251 -6.
Persson, S., Killian, J. A. și Lindblom, G. (1998) Molecular orde ring of interfacially localized
tryptophan analogs in ester – and ether -lipid bilayers studied by H -2-NMR, Biophysical
Journal, 75, 1365 -1371.
Petersen, F. N. R., Jensen, M. O. și Nielsen, C. H. (2005) Interfacial tryptophan residues: A role
for the cation -pi effect?, Biophysical Journal, 89, 3985 -3996.
PicoQuant (2014) FluoTime 100 Compact Fluorescence Lifetime Spectrometer , PicoQuant,
GmbH
157 PicoQuant (2016) PMA Series Photomultiplier Detector Assembly , PicoQuant, GmbH
Polozov, I. V., Polozova, A. I., Molotk ovsky, J. G. și Epand, R. M. (1997) Amphipathic peptide
affects the lateral domain organization of lipid bilayers, Biochim Biophys Acta, 1328, 125 –
39.
Poole, K., Russell, A. D. și Lambert, P. A. (2005) Mechanisms of antimicrobial resistance:
opportunities for new targeted therapies – Preface, Advanced Drug Delivery Reviews, 57,
1443 -1445.
Pouny, Y., Rapaport, D., Mor, A., Nicolas, P. și Shai, Y. (1992) Interaction of antimicrobial
dermaseptin and its fluorescently labeled analogues with phospholipid membran es,
Biochemistry, 31, 12416 -23.
Primon -Barros, M. și Macedo, A. J. (2017) Animal Venom Peptides: Potential for New
Antimicrobial Agents, Current Topics in Medicinal Chemistry, 17, 1119 -1156.
Quay, S. C. și Condie, C. C. (1983) Conformational studies of aqu eous melittin: thermodynamic
parameters of the monomer -tetramer self -association reaction, Biochemistry, 22, 695 -700.
Raghuraman, H. și Chattopadhyay, A. (2003) Organization and dynamics of melittin in
environments of graded hydration: A fluorescence appro ach, Langmuir, 19, 10332 -10341.
Raghuraman, H. și Chattopadhyay, A. (2004a) Effect of micellar charge on the conformation and
dynamics of melittin, Eur Biophys J, 33, 611 -22.
Raghuraman, H. și Chattopadhyay, A. (2004b) Influence of lipid chain unsaturation on membrane –
bound melittin: a fluorescence approach, Biochim Biophys Acta, 1665, 29 -39.
Raghuraman, H. și Chattopadhyay, A. (2004c) Interaction of melittin with membrane cholesterol:
a fluorescence approach, Biophys J, 87, 2419 -32.
Raghuraman, H. și Chatt opadhyay, A. (2006) Effect of ionic strength on folding and aggregation
of the hemolytic peptide melittin in solution, Biopolymers, 83, 111 -21.
Raghuraman, H. și Chattopadhyay, A. (2007) Melittin: a membrane -active peptide with diverse
functions, Biosci Re p, 27, 189 -223.
Reshetnyak, Y. K. și Burstein, E. A. (2001) Decomposition of protein tryptophan fluorescence
spectra into log -normal components. II. The statistical proof of discreteness of tryptophan
classes in proteins, Biophysical Journal, 81, 1710 -1734 .
Reshetnyak, Y. K., Kitson, R. P., Lu, M. și Goldfarb, R. H. (2004) Conformational and enzymatic
changes of 20S proteasome of rat natural killer cells induced by mono – and divalent
cations, Journal of Structural Biology, 145, 263 -271.
Reshetnyak, Y. K., K oshevnik, Y. și Burstein, E. A. (2001) Decomposition of protein tryptophan
fluorescence spectra into log -normal components. III. Correlation between fluorescence
and microenvironment parameters of individual tryptophan residues, Biophysical Journal,
81, 17 35-1758.
Reshetnyak, Y. K., Segala, M., Andreev, O. A. și Engelman, D. M. (2007) A monomeric membrane
peptide that lives in three worlds: In solution, attached to, and inserted across lipid
bilayers, Biophysical Journal, 93, 2363 -2372.
158 Reshetnyak, Y. K., T chedre, K. T., Nair, M. P., Pritchard, P. H. și Lacko, A. G. (2006) Structural
differences between wild -type and fish eye disease mutant of Lecithin : cholesterol
acyltransferase, Journal of Biomolecular Structure & Dynamics, 24, 75 -82.
Robinson, W. E., Jr ., McDougall, B., Tran, D. și Selsted, M. E. (1998) Anti-HIV-1 activity of
indolicidin, an antimicrobial peptide from neutrophils, J Leukoc Biol, 63, 94 -100.
Rollins -Smith, L. A., Reinert, L. K., O'Leary, C. J., Houston, L. E. și Woodhams, D. C. (2005)
Antimicrobial peptide defenses in amphibian skin, Integrative and Comparative Biology,
45, 137 -142.
Rozek, A., Powers, J. P. S., Friedrich, C. L. și Hancock, R. E. W. (2003) Structure -based design
of an indolicidin peptide analogue with increased protease sta bility, Biochemistry, 42,
14130 -14138.
Rydlo, T., Rotem, S. și Mor, A. (2006) Antibacterial properties of dermaseptin S4 derivatives
under extreme incubation conditions, Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 50, 490 –
497.
Ryley, H. C. (2001) Human antimicr obial peptides, Reviews in Medical Microbiology, 12, 177 –
186.
Saberwal, G. și Nagaraj, R. (1994) Cell-Lytic and Antibacterial Peptides That Act by Perturbing
the Barrier Function of Membranes – Facets of Their Conformational Features, Structure –
Function Co rrelations and Membrane -Perturbing Abilities, Biochimica Et Biophysica
Acta -Reviews on Biomembranes, 1197, 109 -131.
Samanta, A. și Fessenden, R. W. (2000) Excited State Dipole Moment of PRODAN as Determined
from Transient Dielectric Loss Measurements, The Journal of Physical Chemistry A, 104,
8972 -8975.
Sanchez -Gomez, S. și Martinez -de-Tejada, G. (2017) Antimicrobial Peptides as Anti -biofilm
Agents in Medical Implants, Current Topics in Medicinal Chemistry, 17, 590 -603.
Sanchez, S. A., Gunther, G., Tricerri , M. A. și Gratton, E. (2011) Methyl -beta-cyclodextrins
preferentially remove cholesterol from the liquid disordered phase in giant unilamellar
vesicles, J Membr Biol, 241, 1 -10.
Sanchez, S. A., M.A.Tricerri, Gunther, G. și E.Gratton (2007) Laurdan General ized Polarization:
from cuvette to microscope, Modern Research and Educational Topics in Microscopy, 2,
1007 -1014.
Sansom, M. S. P. (1991) The Biophysics of Peptide Models of Ion Channels, Progress in
Biophysics & Molecular Biology, 55, 139 -235.
Șchiopu, I ., Mereuta, L., Apetrei, A., Park, Y., Hahm, K. -S. și Luchian, T. (2012) The role of
tryptophan spatial arrangement for antimicrobial -derived, membrane -active peptides
adsorption and activity, Molecular BioSystems, 8, 2860 -2863.
Schluesener, H. J., Raderma cher, S., Melms, A. și Jung, S. (1993) Leukocytic antimicrobial
peptides kill autoimmune T cells, J Neuroimmunol, 47, 199 -202.
Schwarz, G. și Beschiaschvili, G. (1989) Thermodynamic and kinetic studies on the association of
melittin with a phospholipid bil ayer, Biochim Biophys Acta, 979, 82 -90.
159 Seelig, J. (2004) Thermodynamics of lipid -peptide interactions, Biochim Biophys Acta, 1666, 40 –
50.
Seery, M. (2009) Light Absorption and Fate of Excited State . Disponibil on -line:
https:// www.photochemistry.wordpress.com/2009/08/24/light .
Sekharam, K. M., Bradrick, T. D. și Georghiou, S. (1991) Kinetics of melittin binding to
phospholipid small unilamellar vesicles, Biochim Biophys Acta, 1063, 17 1-4.
Selsted, M. E., Novotny, M. J., Morris, W. L., Tang, Y. Q., Smith, W. și Cullor, J. S. (1992)
Indolicidin, a novel bactericidal tridecapeptide amide from neutrophils, J Biol Chem, 267,
4292 -5.
Sen, M., Sen, S., Celik, S. și Altindis, M. (2016) Antimic robial peptide families expressed by
human tissues, Febs Journal, 283, 218 -218.
Shai, Y. (1995) Molecular Recognition between Membrane -Spanning Polypeptides, Trends in
Biochemical Sciences, 20, 460 -464.
Sham, Y. Y., Muegge, I. și Warshel, A. (1998) The eff ect of protein relaxation on charge -charge
interactions and dielectric constants of proteins, Biophys J, 74, 1744 -53.
Shaw, J. E., Alattia, J. R., Verity, J. E., Prive, G. G. și Yip, C. M. (2006) Mechanisms of
antimicrobial peptide action: studies of indol icidin assembly at model membrane
interfaces by in situ atomic force microscopy, J Struct Biol, 154, 42 -58.
Shaw, J. E., Epand, R. F., Hsu, J. C., Mo, G. C., Epand, R. M. și Yip, C. M. (2008) Cationic
peptide -induced remodelling of model membranes: direct visualization by in situ atomic
force microscopy, J Struct Biol, 162, 121 -38.
Sheynis, T., Sykora, J., Benda, A., Kolusheva, S., Hof, M. și Jelinek, R. (2003) Bilayer localization
of membrane -active peptides studied in biomimetic vesicles by visible and fl uorescence
spectroscopies, Eur J Biochem, 270, 4478 -87.
Shi, J., Ross, C. R., Chengappa, M. M., Sylte, M. J., McVey, D. S. și Blecha, F. (1996)
Antibacterial activity of a synthetic peptide (PR -26) derived from PR -39, a proline –
arginine -rich neutrophil ant imicrobial peptide, Antimicrob Agents Chemother, 40, 115 –
21.
Siano, D. B. și Metzler, D. E. (1969) Band Shapes of the Electronic Spectra of Complex Molecules,
The Journal of Chemical Physics, 51, 1856 -1861.
Simmaco, M., Mignogna, G. și Barra, D. (1998) Antimicrobial peptides from amphibian skin:
What do they tell us?, Biopolymers, 47, 435 -450.
Sipos, D., Andersson, M. și Ehrenberg, A. (1992) The structure of the mammalian antibacterial
peptide cecropin P1 in solution, determined by proton -NMR, Eur J Biochem , 209, 163 -9.
Song, Y. M., Park, Y., Lim, S. S., Yang, S. T., Woo, E. R., Park, I. S., Lee, J. S., Kim, J. I., Hahm,
K. S., Kim, Y. și Shin, S. Y. (2005) Cell selectivity and mechanism of action of
antimicrobial model peptides containing peptoid residues, Biochemistry, 44, 12094 -106.
Song, Y. M., Yang, S. -T., Lim, S. S., Kim, Y., Hahm, K. -S., Kim, J. I. și Shin, S. Y. (2004) Effects
of l- or d-Pro incorporation into hydrophobic or hydrophilic helix face of amphipathic α –
helical model peptide on structure an d cell selectivity, Biochemical and Biophysical
Research Communications, 314, 615 -621.
160 Stewart, P. S. și Costerton, J. W. (2001) Antibiotic resistance of bacteria in biofilms, Lancet, 358,
135-138.
Strom, M. B., Rekdal, O. și Svendsen, J. S. (2002) Antimic robial activity of short arginine – and
tryptophan -rich peptides, J Pept Sci, 8, 431 -7.
Subbalakshmi, C., Krishnakumari, V., Nagaraj, R. și Sitaram, N. (1996) Requirements for
antibacterial and hemolytic activities in the bovine neutrophil derived 13 -residu e peptide
indolicidin, FEBS Lett, 395, 48 -52.
Subbalakshmi, C. și Sitaram, N. (1998) Mechanism of antimicrobial action of indolicidin, FEMS
Microbiol Lett, 160, 91 -6.
Suhling, K., French, P. M. și Phillips, D. (2005) Time -resolved fluorescence microscopy,
Photochem Photobiol Sci, 4, 13 -22.
Sun, H., Greathouse, D. V., Andersen, O. S. și Koeppe, R. E., 2nd (2008) The preference of
tryptophan for membrane interfaces: insights from N -methylation of tryptophans in
gramicidin channels, J Biol Chem, 283, 22233 -43.
Talbot, J. C., Dufourcq, J., de Bony, J., Faucon, J. F. și Lussan, C. (1979) Conformational change
and self association of monomeric melittin, FEBS Lett, 102, 191 -3.
Tiozzo, E., Rocco, G., Tossi, A. și Romeo, D. (1998) Wide -spectrum antibiotic activity of
synthetic, amphipathic peptides, Biochemical and Biophysical Research Communications,
249, 202 -206.
Tokumasu, F., Jin, A. J. și Dvorak, J. A. (2002) Lipid membrane phase behaviour elucidated in
real time by controlled environment atomic force microscopy, Journal of Electron
Microscopy, 51, 1 -9.
Tonk, M., Rahnamaeian, R. și Vilcinskas, A. (2017) Insect antimicrobial peptides, Zeitschrift Fur
Naturforschung Section C -a Journal of Biosciences, 72, E17 -E17.
Toraya, S., Nishimura, K. și Naito, A. (2004) Dynamic structure of vesicle -bound melittin in a
variety of lipid chain lengths by solid -state NMR, Biophys J, 87, 3323 -35.
Torrent, M., Cuyas, E., Carreras, E., Navarro, S., Lopez, O., de la Maza, A., Nogues, M. V.,
Reshetnyak, Y. K. și Boix, E. (2007) Topograph y studies on the membrane interaction
mechanism of the eosinophil cationic protein, Biochemistry, 46, 720 -33.
Tossi, A., Sandri, L. și Giangaspero, A. (2000) Amphipathic, alpha -helical antimicrobial peptides,
Biopolymers, 55, 4 -30.
Tossi, A., Tarantino, C. și Romeo, D. (1997) Design of synthetic antimicrobial peptides based on
sequence analogy and amphipathicity, European Journal of Biochemistry, 250, 549 -558.
Travis, S. M., Anderson, N. N., Forsyth, W. R., Espiritu, C., Conway, B. D., Greenberg, E. P.,
McC ray, P. B., Lehrer, R. I., Welsh, M. J. și Tack, B. F. (2000) Bactericidal activity of
mammalian cathelicidin -derived peptides, Infection and Immunity, 68, 2748 -2755.
Țugulea, L. și Găzdaru, D. M. (2003) Tehnici și metode experimentale în biofizică, Bucure ști,
Editura Universitații din București.
Valeur, B. (2001) Molecular fluorescence principles and applications , New York, Wiley -VCH.
161 Vanbelkum, M. J., Kok, J., Venema, G., Holo, H., Nes, I. F., Konings, W. N. și Abee, T. (1991)
The Bacteriocin Lactococcin -a Specifically Increases Permeability of Lactococcal
Cytoplasmic Membranes in a Voltage -Independent, Protein -Mediated Manner, Journal of
Bacteriology, 173, 7934 -7941.
Viard, M., Gallay, J., Vincent, M., Meyer, O., Robert, B. și Paternostre, M. (1997) Laurd an
solvatochromism: solvent dielectric relaxation and intramolecular excited -state reaction,
Biophys J, 73, 2221 -34.
Vincent, M., de Foresta, B. și Gallay, J. (2005) Nanosecond dynamics of a mimicked membrane –
water interface observed by time -resolved stoke s shift of LAURDAN, Biophys J, 88, 4337 –
50.
Vogel, H. (1987) Comparison of the conformation and orientation of alamethicin and melittin in
lipid membranes, Biochemistry, 26, 4562 -72.
Wahl, M. (2014) Time -Correlated Single Photon Counting , Disponibil on -line:
https:// www.picoquant.com/images/uploads/page/files/7253/technote_tcspc.pdf , Berlin,
Germany.
Wang, G. S. (2010) Structural Studies of Antimicrobial Peptides Prov ide Insight into Their
Mechanisms of Action, Antimicrobial Peptides: Discovery, Design and Novel Therapeutic
Strategies, 141 -168.
Wang, Y., Zhang, Y., Lee, W. H., Yang, X. W. și Zhang, Y. (2016) Novel Peptides from Skins of
Amphibians Showed Broad -Spectrum Antimicrobial Activities, Chemical Biology & Drug
Design, 87, 419 -424.
Weaver, A. J., Kemple, M. D., Brauner, J. W., Mendelsohn, R. și Prendergast, F. G. (1992)
Fluorescence, CD, attenuated total reflectance (ATR) FTIR, and 13C NMR
characterization of the structure and dynamics of synthetic melittin and melittin analogues
in lipid environments, Biochemistry, 31, 1301 -13.
Weber, G. (1960) Fluorescence -polarization spectrum and electronic -energy transfer in tyrosine,
tryptophan and related compounds, Biochem J, 75, 335 -45.
Westerhoff, H. V., Juretic, D., Hendler, R. W. și Zasloff, M. (1989) Magainins and the disruption
of membrane -linked free -energy transduction, Proc Natl Acad Sci U S A, 86, 6597 -601.
White, S. H., Wimley, W. C., Ladokhin, A. S. și Hristova, K. (1998) Protein folding in membranes:
determining energetics of peptide -bilayer interactions, Methods Enzymol, 295, 62 -87.
WHO. (2014) Antimicrobial resistance : global report on surveillance , Geneva, World Health
Organization. Disponibil on -line:
http://www.who.int/drugresistance/documents/surveillancereport/en/ .
Wiesner, J. și Vilcinskas, A. (2010) Antimicrobial peptides The ancient arm of the human immune
system, Virule nce, 1, 440 -464.
Wilcox, W. și Eisenberg, D. (1992) Thermodynamics of melittin tetramerization determined by
circular dichroism and implications for protein folding, Protein Sci, 1, 641 -53.
Wimley, W. C. și White, S. H. (1993) Membrane partitioning: distin guishing bilayer effects from
the hydrophobic effect, Biochemistry, 32, 6307 -12.
162 Wright, G. D. (2005) Bacterial resistance to antibiotics: Enzymatic degradation and modification,
Advanced Drug Delivery Reviews, 57, 1451 -1470.
Wu, M., Maier, E., Benz, R. și Hancock, R. E. (1999) Mechanism of interaction of different classes
of cationic antimicrobial peptides with planar bilayers and with the cytoplasmic membrane
of Escherichia coli, Biochemistry, 38, 7235 -42.
Xie, W., Ludewig, G., Wang, K. și Lehmler, H. J. (2010) Model and cell membrane partitioning
of perfluorooctanesulfonate is independent of the lipid chain length, Colloids and Surfaces
B-Biointerfaces, 76, 128 -136.
Yamamoto, N. și Tamura, A. (2010) Designed low amphipathic peptides with alpha -helical
propensity exhibiting antimicrobial activity via a lipid domain formation mechanism,
Peptides, 31, 794 -805.
Yang, L., Harroun, T. A., Weiss, T. M., Ding, L. și Huang, H. W. (2001) Barrel -stave model or
toroidal model? A case study on melittin pores, Biophys J , 81, 1475 -85.
Yau, W. M., Wimley, W. C., Gawrisch, K. și White, S. H. (1998) The preference of tryptophan
for membrane interfaces, Biochemistry, 37, 14713 -14718.
Ye, X. C., Yu, B. X., Zhou, X., Zhao, L., Ding, Y. Y., Liu, M. C., Ding, X. F., Zhang, X., Ji e, Q.
L., Zhou, L., Fang, J., Chen, H. T., Hu, W., Niu, S. L., Yan, J. Q., Zhao, H. și Hong, D. J.
(2015) Preliminary study of light yield dependence on LAB liquid scintillator composition,
Chinese Physics C, 39.
Yeaman, M. R. și Yount, N. Y. (2003) Mechan isms of antimicrobial peptide action and resistance,
Pharmacol Rev, 55, 27 -55.
Yu, W. M., So, P. T. C., French, T. și Gratton, E. (1996) Fluorescence generalized polarization of
cell membranes: A two -photon scanning microscopy approach, Biophysical Journal , 70,
626-636.
Zasloff, M. (2002) Antimicrobial peptides of multicellular organisms, Nature, 415, 389 -395.
Zhang, Y. L., Frangos, J. A. și Chachisvilis, M. (2006) Laurdan fluorescence senses mechanical
strain in the lipid bilayer membrane, Biochemical and Biophysical Research
Communications, 347, 838 -841.
Zhu, X., Dong, N., Wang, Z., Ma, Z., Zhang, L., Ma, Q. și Shan, A. (2014) Design of imperfectly
amphipathic alpha -helical antimicrobial peptides with enhanced cell selectivity, Acta
Biomater, 10, 244 -57.
Zhu, X., Zhang, L., Wang, J., Ma, Z., Xu, W., Li, J. și Shan, A. (2015) Characterization of
antimicrobial activity and mechanisms of low amphipathic peptides with different alpha –
helical propensity, Acta Biomater, 18, 155 -67.
Zorilă, B., Bacalum, M., Radu, M. și Popescu, A. I. (2016) Log-normal deconvolution of laurdan
fluorescence spectra – A tool to assess lipid membrane fluidity, Rom. Rep. Phys. Romanian
Reports in Physics, 68, 702 -712.
Zorilă, F. L., Ionescu, C., Craciun, L. S. și Zorilă, B. (2017) Atomi c force microscopy study of
morphological modifications induced by different decontamination treatments on
Escherichia coli, Ultramicroscopy, 182, 226 -232.
163 Anexă cu acorduri de copyright pentru
imagini din literatură
Pentru Figura 2.1:
164 Pentru Figura 2.2, 2.3 și 2.4:
165 Pentru Figura 3.1:
166 Pentru Figura 3.7, 6.1, 6.3 și 6.4:
167 Pentru Figura 5.1:
Copyright Notice
© Licențiada.org respectă drepturile de proprietate intelectuală și așteaptă ca toți utilizatorii să facă același lucru. Dacă consideri că un conținut de pe site încalcă drepturile tale de autor, te rugăm să trimiți o notificare DMCA.
Acest articol: Școala Doctorală de Fizică [608815] (ID: 608815)
Dacă considerați că acest conținut vă încalcă drepturile de autor, vă rugăm să depuneți o cerere pe pagina noastră Copyright Takedown.