Școala Doctorală de Fizică [303535]
Universitatea din București
Facultatea de Fizică
Școala Doctorală de Fizică
Specializarea Biofizică
Drd. [anonimizat]
_____________________________________________________________________ _
Studiul interacției proteinelor cu membranele
lipidice model și cu membranele biologice
__________________________________________________________________ ____
Teză de Doctorat
Conducător științific
Prof. Univ. Dr. Aurel POPESCU
București, 2018
[anonimizat], Domnul Profesor Univ. Dr. Aurel I. Popescu, [anonimizat].
Mulțumesc Doamnei Profesor Univ. Dr. Doina Mariana Găzdaru și Domnului CSI Dr. Mihai Radu pentru discuțiile și sugestiile date pe parcursul efectuării și elaborării Tezei.
[anonimizat], care m-[anonimizat], în special Domnișoarei CSIII Dr. [anonimizat], [anonimizat].
Întreaga mea recunoștință vreau să o [anonimizat], Florina, pentru faptul că mi-a [anonimizat]-[anonimizat], [anonimizat]-au deschis noi orizonturi în viață.
Mulțumesc conducerii proiectului “[anonimizat]. Corelarea structurii peptidelor cu funcția lor” – BIOPEP, cu numărul de identificare: [anonimizat]- PCCA Nr. 123/2012 și proiectelor PN 09370301 și PN 16420203 pentru suportul financiar și logistic oferit pe toată perioada studiilor doctorale.
[anonimizat] o [anonimizat] a doi oameni dragi mie, C.P. și D.G., [anonimizat] m-au sprijinit în momente de cotitură din viață. [anonimizat]!
Bogdan Zorilă
2018
Cuprins
Cuprins i
Lista abrevierilor vii
Lista simbolurilor ix
Lista figurilor xi
Lista tabelelor xiii
Introducere generală 1
1 Motivația studiului 3
2 [anonimizat], membranele celulare și membranele lipidice artificiale 5
Introducere 5
2.1 [anonimizat] 5
2.1.1 AMP și rezistența antimicrobiană 6
2.1.2 AMP – alternative la antibioticele clasice 8
2.1.3 Rolul reziduurilor Triptofan și Arginină din structura AMP 9
2.1.4 Modul de acțiune al AMP 10
2.2 Membranele celulare și membranele lipidice artificiale 12
2.2.1 Compoziția și organizarea membranelor celulare 12
2.2.2 Proprietățile bistratului lipidic 15
2.2.3 [anonimizat] 16
3 Principiile de bază ale fluorescenței 19
Introducere 19
3.1 Fluorescența 19
3.1.1 Diagrama Jablonski și caracteristicile emisiei fluorescente 19
3.1.2 Influența factorilor de mediu asupra fluorescenței 23
3.2 Fluorofori 24
3.2.1 Principalele tipuri de fluorofori și proprietățile acestora 24
3.2.2 Fluorofori solvatocromici 25
3.2.2.1 Laurdanul – fluorofor utilizat pentru estimarea fluiditații membranelor lipidice 26
3.2.2.2 Triptofanul – principalul aminoacid ce prezintă fluorescență intrinsecă 27
3.3 Spectroscopia de fluorescență 29
3.3.1 Spectroscopia de fluorescență statică 29
3.3.2 Spectroscopia de fluorescență rezolvată în timp 30
3.4 Alte tehnici utilizate în măsurarea fluorescenței 32
4 AMP utilizate – caracteristici structurale și funcționale ale acestora 33
Introducere 33
4.1 Melitina 33
4.2 Indolicidina 36
4.3 Cecropina P1 38
4.4 Structurile peptidice atimicrobiene nou sintetizate 39
5 Materiale și metode 41
5.1 Prepararea soluției tampon fosfat salin 41
5.2 Prepararea soluțiilor stoc de substanțe fluorescente 41
5.3 Prepararea soluțiilor stoc de peptide 44
5.4 Prepararea veziculelor unilamelare 44
5.5 Metode de spectroscopie utilizate 47
5.5.1 Spectroscopia de absorbție UV-VIS 47
5.5.2 Spectroscopia de fluorescență statică 48
5.5.3 Spectroscopia de fluorescență rezolvată în timp 48
5.6 Prelucrarea datelor 49
6 Realizarea și optimizarea funcționarii aranjamentului experimental pentru TRF 51
Introducere 51
6.1 Aranjamentul experimental pentru TRF 52
6.2 Măsurarea timpilor de viață a fluorescenței 56
6.3 Prelucrarea datelor experimentale 58
6.4 Discuții 63
Concluzii parțiale 66
7 Studiul interacției dintre AMP și membranele lipidice artificiale utilizând fluorescența rezolvată în timp 67
Introducere 67
7.1 Interacția dintre AMP și membranele lipidice formate din DOPC 67
7.2 Discuții 70
Concluzii parțiale 72
8 Evaluarea fluiditații membranelor lipidice utilizand fluorescența Laurdanului folosind modelul de analiză cu funcții asimetrice 73
Introducere 73
8.1 Obținerea parametrilor de formă utilizați în modelul matematic cu funcții LN 76
8.2 Analiza spectrelor de fluorescență ale Laurdanului inserat în membrane lipidice 81
8.3 Discuții 84
Concluzii parțiale 91
9 Efectul AMP asupra fluiditații membranelor lipidice model și membranelor celulare 93
Introducere 93
9.1 Evaluarea efectului AMP asupra membranelor 93
9.2 Discuții 98
Concluzii parțiale 99
10 Evaluarea interacției AMP-membrană lipidică model utilizând stingerea fluorescenței Triptofanului 101
Introducere 101
10.1 Stingerea colizională a fluorescenței 101
10.2 Determinarea constantei de stingere Stern-Volmer pentru AMP 103
10.3 Discuții 108
Concluzii parțiale 112
11 Determinarea energiei libere de partiționare utilizând fluorescența Triptofanului 115
Introducere 115
11.1 Modele utilizate pentru determinarea ΔG 115
11.2 Determinarea ΔG pentru AMP 118
11.3 Discuții 122
Concluzii parțiale 126
12 Evaluarea interacției AMP-membrana model prin analiza cu funcții asimetrice aplicată spectrelor de fluorescență ale Triptofanului 127
Introducere 127
12.1 Analiza fluorescenței reziduurilor de Triptofan din structura proteinelor 127
12.2 Ipoteze de lucru 129
12.3 Analiza spectrelor de fluorescență ale Triptofanului 130
12.4 Discuții 133
Concluzii parțiale 134
Concluzii generale 135
Realizări personale 137
Bibliografie 145
Anexă cu acorduri de copyright pentru imagini din literatură 163
Lista abrevierilor
Lista simbolurilor
Lista figurilor
Figura 2.1 Mecanismele de interacție ale AMP cu membranele lipidice. 11
Figura 2.2 Structura membranei plasmatice a celulelor de mamifer. 13
Figura 2.3 Structura membranei plasmatice a celulelor bacteriene. 14
Figura 2.4 Secțiune transversală printr-un lipozom. 17
Figura 3.1 Diagrama Jablonski. 20
Figura 3.2 Diagrama Jablonski simplificată pentru punerea în evidență a eficienței cuantice a unui fluorofor. 22
Figura 3.3 Influența factorilor de mediu asupra fluorescenței. 23
Figura 3.4 Pierderile de energie ale unui fluorofor aflat în stare excitată. 26
Figura 3.5 Laurdanul. 27
Figura 3.6 Triptofanul. 28
Figura 3.7 Spectrul de fluorescență rezolvată în timp obținut prin metoda TCSPC. 31
Figura 4.1 Melitina 34
Figura 4.2 Indolicidinul 36
Figura 4.3 Cecropina P1 38
Figura 5.1 Graficul miscibilității diferiților solvenți. 42
Figura 5.2 Structurile moleculare ale standardelor de fluorescență. 43
Figura 5.3 Structurile moleculare ale lipidelor utilizate în experimente. 45
Figura 6.1 Spectrofluorimetrul FluoTime 100. 52
Figura 6.2 Aranjamentul experimental pentru măsurarea timpului de viață al fluorescenței. 53
Figura 6.3 Răspunsul spectral al fotomultiplicatorului PMA 182 N/M. 54
Figura 6.4 Modul de achiziți date bazat pe tehnica TCSPC. 55
Figura 6.5 Scăderea fluorescenței în timp. 57
Figura 6.6 Fitarea spectrului de scădere exponențială a fluorescenței indolului. 59
Figura 6.7 Variația timpilor de viață ai fluorescenței cu concentrația de fluorofor din probă. 61
Figura 6.8 Variația timpilor de viață ai fluorescenței cu temperatura probei. 63
Figura 7.1 Variația timpului de viață a reziduurilor de Triptofan 68
Figura 7.2 Modificarea timpilor de viață ai fluorescenței în prezența lipozomilor din DOPC și variația acestora cu temperatura. 69
Figura 7.3 Variația timpului de viață al fluorescenței reziduurilor de Triptofan aflate în structura peptidelor analizate în prezența lipozomilor din DOPC. 71
Figura 8.1 Forma generală a funcției LN. 76
Figura 8.2 Spectre de emisie fluorescentă a Laurdanului. 79
Figura 8.3 Poziția maximului emisiei în funcție de scala polarității solvenților – ET(30). 80
Figura 8.4 Parametrii de formă, și , ca funcție de poziția maximului emisiei. 80
Figura 8.5 Intensitatea normată a emisiei fluorescente a Laurdanului inserat în membrane lipidice preparate din C13, DPPC și DSPC, la diferite temperaturi. 82
Figura 8.6 Comparație între deconvoluția cu funcții LN (A, B și C) și funcții Gauss (D, E și F). 83
Figura 8.7 Pozițiile peak-urilor elementare obținute în urma celor două metode de deconvoluție. 85
Figura 8.8 Comparație între ariile relative ale peak-urilor rezultate în urma deconvoluției cu funcții LN și Gauss. 87
Figura 8.9 Comparație între curbele ΔSR și GP. 90
Figura 8.10 Dependența de temperatură a raportului ariilor relative, obținute în urma deconvoluției cu funcții LN și Gauss. 90
Figura 9.1 Variația parametrilor A – ΔSR și B – SRG/SRB pentru lipozomii preparați din DOPC, simpli și în prezența AMP. 94
Figura 9.2 Variația parametrilor A – ΔSR și B – SRG/SRB pentru lipozomii preparați din DOPC:DPPG, simpli și în prezența AMP. 95
Figura 9.3 Variația parametrilor A – ΔSR și B – SRG/SRB pentru bacterii Escherichia coli, simple și în prezența AMP. 96
Figura 9.4 Modificarea fluidității bistratului lipidic în urma tratamentului cu Melitină. 97
Figura 10.1 Familie de spectre de fluorescență din care se obține valoarea KSV. 104
Figura 10.2 Reprezentări Stern-Volmer pentru Melitină (A), Indolicidină (B) și Cecropina P1 (C). 105
Figura 10.3 Reprezentări Stern-Volmer pentru peptidele nou sintetizate, P1 – P8. 106
Figura 10.4 Valorile KSV, τ0 și kb pentru peptidele utilizate în acest studiu. 108
Figura 11.1 Familie de spectre din care se obțin valorile parametrilor utilizați în modelele de calcul a ΔG utilizând fluorescența statică. 119
Figura 11.2 Fitarea datelor experimentale cu modelele teoretice, pentru Indolicidin titrat cu LUV preparate din DOPC. 120
Figura 11.3 Parametrii obținuți pentru P1 – P8 din modelul descris de ecuația (11.4). 124
Figura 11.4 Parametrii obținuți pentru P1 – P8 din modelul descris de ecuația (11.8). 125
Figura 12.1 Evoluția peak-urilor elementare, obținute în urma deconvoluției, pentru Indolicidină 131
Figura 12.2 Variația ariei relative a peak-urilor obținute în urma deconvoluției. 132
Lista tabelelor
Tabelul 4.1 Caracteristici fizico-chimice pentru peptidele nou sintetizate. 40
Tabelul 5.1 Caracteristici fizico-chimice pentru standardele de fluorescență utilizate. 43
Tabelul 5.2 Caracteristici fizico-chimice pentru peptidele utilizate. 44
Tabelul 6.1 Timpii de viață ai fluorescenței pentru standardele utilizate la calibrarea și verificarea aranjamentului experimental. 60
Tabelul 6.2 Valoarea medie a timpilor de viață ai fluorescenței pentru toată plaja de concentrații măsurate. 62
Tabelul 8.1 Caracteristicile spectrale ale Laurdanului în soluții omogene de solvenți, cu diferite constante dielectrice. 77
Tabelul 8.2 Comparație între valorile SRB la temperaturi extreme și intervalul ΔT obținut din fitarea sigmoidală a curbelor SRB. 88
Tabelul 8.3 Valorile Tm determinate prin diverse metode, pentru lipidele utilizate. 89
Tabelul 10.1 Valorile KSV, τ0 și kb pentru peptidele utilizate în acest studiu. 107
Tabelul 11.1 Variația energiei libere Gibbs, ΔG, de partiționare a peptidelor din mediul hidrofil în mediul hidrofob, pentru Melitină, Indolicidină și Cecropina P1. 121
Tabelul 11.2 Variațiile energiei libere Gibbs, ΔG, de partiționare a peptidelor din mediul hidrofil în mediul hidrofob, pentru toate peptidele. 121
Introducere generală
Lucrarea de față este împărțită în două mari secțiuni, reprezentate de: studiul bibliografic, care are o pondere de 28 % din volumul de informații expuse și partea de cercetare experimentală proprie, care are o pondere de 72 % din informația prezentată. La sfârșitul tezei există o secțiune distinctă care conține partea de realizări proprii (articole publicate, participări la conferințe etc.), partea de referințe bibliografice din literatura de specialitate consultată și o ultimă parte care conține acordurile de utilizare (copyright) pentru o parte din figurile utilizate de-a lungul acestui manuscris, preluate din literatura de specialitate.
Studiul bibliografic
Primul capitol din această secțiune este reprezentat de motivația realizării prezentei teze de doctorat. În acest capitol am încercat să fac un foarte scurt rezumat al legăturii care există între secțiunea de studiu bibliografic și cercetările experimentale proprii.
În capitolul al doilea sunt prezentate aspecte actuale legate de peptidele antimicrobiene, rezistența microorganismelor la tratamentele clasice, avantajele și dezavantajele utilizării peptidelor antimicrobiene în tratamentele antiinfecțioase, rolul anumitor aminoacizi care intră în structura primară a peptidelor și mecanismele de interacție a peptidelor cu membranele celulare. De asemenea, sunt prezentate și informații referitoare la structura membranelor celulare, atât cele ale mamiferelor, cât și cele bacteriene, fiind evidențiate diferențele dintre acestea, proprietățile membranelor lipidice și sunt descrise structurile biomimetice (lipozomii) utilizate în practică.
Tehnicile utilizate, spectroscopia statică de fluorescență și spectroscopia rezolvată în timp și principiile fizice care stau la baza acestora sunt descrise în capitolul al treilea. În acest capitol sunt prezentate și informații despre compușii chimici care sunt utilizați în aceste tipuri de măsurători, cu evidențierea proprietăților celor doi fluorofori, Laurdanul și Triptofanul, ale căror proprietăți fluorescente le-am utilizat în partea de cercetare experimentală.
În capitolul al patrulea, sunt prezentate pe larg informații despre peptidele antimicrobiene utilizate în secțiunea experimentală. Astfel, sunt selectate din literatura de specialitate informațiile cele mai relevante referitoare la cele trei peptide utilizate ca “modele”: Melitina, Indolicidina și Cecropina P1 dar, sunt prezentate și unele caracteristici fizico-chimice ale peptidelor nou sintetizate, P1 – P8, pentru care s-a dorit, în urma experimentelor, obținerea de informații relevante referitoare la modul de interacție al acestora cu membranele lipidice model.
Cercetarea experimentală
Secțiunea de cercetare experimentală proprie începe de la capitolul cinci, în care sunt prezentate materialele și metodele utilizate pentru realizarea experimentelor descrise în următoarele capitole.
În capitolul al șaselea, este prezentată realizarea și optimizarea funcționării aranjamentului experimental pentru măsurarea timpilor de viață ai fluorescenței. Optimizarea funcționării a constat în măsurarea timpilor de viață ai fluorescenței pentru o serie de fluorofori, utilizați în practică drept standarde pentru timpul de viață. O altă serie de experimente au vizat stabilirea “sensibilității” instrumentului de măsură, prin varierea concentrațiilor fluoroforilor în soluție într-o gamă largă de valori.
O aplicație directă a aranjamentului experimental realizat este descrisă pe larg în capitolul șapte, unde am studiat interacția peptidelor antimicrobiene cu membranele lipidice model care imită, într-un mod simplificat, membranele celulelor de mamifere.
În capitolul opt, este descrisă o nouă metodă de analiză a fluidității membranelor lipidice, metodă care este utilizată și în capitolul al nouălea, în care am urmărit modificarea fluidității membranare în urma tratamentelor cu peptide antimicrobiene. Metoda dezvoltată are la bază o procedură de deconvoluție a spectrelor complexe de fluorescență ale Laurdanului, și s-a dovedit a fi mai sensibilă la modificările de fluiditate ale membranei, în comparație cu metodele clasice.
În capitolele zece și unsprezece am studiat interacția peptidelor antimicrobiene cu două tipuri de membrane lipidice model. Studiul a avut două abordări: din punctul de vedere al gradului de accesibilitate al reziduurilor de Triptofan la moleculele solventului și din punctul de vedere al variației energiei libere Gibbs de partiționare din mediul hidrofil în mediul hidrofob. În ambele capitole am făcut o corelație între rezultatele obținute și structura primară a peptidelor, dar și a diferențelor care apar în funcție de tipul de membrana lipidică model utilizată.
În capitolul al doisprezecelea, am propus o nouă abordare în analiza spectrelor de fluorescență ale Triptofanului, abordare care furnizează o soluție pentru evaluarea raportului între peptida legată la nivelul bistratului lipidic și peptida aflată liberă în soluție.
Motivația studiului
Raportul Organizației Mondiale a Sănătății (WHO, 2014), referitor la rezistența antimicrobiană, publicat în anul 2014, indică o creștere alarmantă a numărului de microorganisme rezistente la tratamentele antimicrobiene clasice (antibiotice). În acest raport, una dintre direcțiile recomandate este aceea de creare de noi metode de tratament împotriva infecțiilor cu agenți patogeni, bazate pe proprietățile bacteriostatice și bactericide ale peptidelor antimicrobiene.
Astfel, în cadrul unui grant de cercetare, intitulat “Generarea și investigarea unor noi peptide antimicrobiene, cu dimensiune redusă. Corelarea structurii peptidelor cu funcția lor”, acronim BIOPEP, http://www.science.research.uaic.ro/biopep/index.html, au fost generate și sintetizate opt noi structuri peptidice, numite în mod generic P1 – P8, bogate în reziduuri de Triptofan și Arginină, fiind cunoscut efectul sinergic al acestor reziduuri, împotriva liniilor celulare bacteriene, atunci când ele se află în structura primară a peptidelor.
În paralel cu experimentele in vitro desfășurate utilizând aceste opt peptide (Bacalum și colab., 2017), a fost nevoie și de un studiu aprofundat al mecanismelor biofizice prin care aceste peptide interacționează cu membranele lipidice, pentru determinarea afinității acestor peptide în cazul a două tipuri de membrane lipidice model, care să imite, într-un mod cât mai simplist, membranele celulelor de mamifere și bacteriene. În urma acestui studiu, am pus în evidență diferențele care apar între cele opt peptide, comparând între ele rezultatele obținute, dar și făcând o paralelă cu rezultatele obținute, în aceleași condiții, pentru trei peptide “model”, foarte bine caracterizate în literatură: Melitina, Indolicidina și Cecropina P1, fiecare dintre acestea având mecanisme diferite de interacție cu bistratul lipidic.
Am dorit, în urma experimentelor, în care am utilizat tehnici moderne de fluorescență, să obțin, pe de-o parte, gradul de accesibilitate al reziduurilor de Triptofan la moleculele unui stingător colizional al fluorescenței (acrilamida) și, pe de altă parte, variațiile energiilor libere Gibbs de partiționare a peptidelor din mediul hidrofil în mediul hidrofob. Valorile obținute în aceste experimente au fost comparate cu cele obținute pentru peptidele “model”.
Deoarece membrana, fie ea celulară, fie lipidică model, este primul compartiment celular afectat de interacția cu peptidele antimicrobiene, a fost necesară evaluarea modului în care starea bistratului lipidic este afectată de prezența peptidelor antimicrobiene. Una dintre metodele de investigare este analiza fluidității membranare utilizând probe fluorescente care se inseră în bistratul lipidic, în particular Laurdanul. Analiza detaliată a spectrelor de emisie ale Laurdanului a necesitat dezvoltarea și validarea unei noi metode de evaluare a fluidității membranare, mai sensibilă decât metodele utilizate, până în acest moment, în literatură. Această metotă folosește o procedură de deconvoluție a spectrelor de fluorescență statică utilizând funcții asimetrice de tip log-normal. După validarea metodei, am pus în evidență diferențele care apar la nivelul fluidității bistratului lipidic, în funcție de mecanismul de interacție dintre peptidă și membrana celulară sau lipidică model.
Metoda de analiză a spectrelor complexe de fluorescență statică, utilizând deconvoluția acestora, cu funcții asimetrice de tip log-normal, a fost utilizată și pentru spectrele de emisie fluorescentă ale Triptofanului, dar utilizând o abordare originală a metodei din literatură. Astfel, noua abordare, furnizează o soluție pentru evaluarea raportului între peptida legată la nivelul bistratului lipidic și peptida aflată liberă în soluție.
Pentru evaluarea accesibilității reziduurilor de Triptofan la moleculele de stingător și a variației energiei libere Gibbs, a trebuit să dezvolt, pornind de la zero, un echipament experimental pentru măsurarea timpilor de viață ai fluorescenței. După realizarea practică, verificarea și calibrarea acestuia, am efectuat măsurătorile pentru evaluarea interacțiilor dintre peptidele precizate anterior și membranele lipidice model. Realizarea practică a echipamentului pentru măsurarea timpilor de viață ai fluorescenței a deschis noi direcții de analiză a interacțiilor moleculare, rezultatele obținute venind în completarea celor obținute din experimentele de fluorescență statică, putând fi aplicate pentru o gamă largă de molecule (polipeptide, proteine etc).
Peptidele antimicrobiene – AMP, membranele celulare și membranele lipidice artificiale
Introducere
Toate organismele prezintă mecanisme de apărare înnăscute, mecanisme ce fac parte din sistemul lor imunitar. Peptidele antimicrobiene, AMP, fac parte din aceste mecanisme de apărare înnăscute. AMP-urile sunt compuși cu masă moleculară mică, având în structura lor aminoacizi, ele prezentând un spectru larg de activități antimicrobiene împotriva bacteriilor Gram-negative și Gram-pozitive, a virusurilor, protozoarelor și ciupercilor (Izadpanah și Gallo, 2005).
Peptidele antimicrobiene sintetizate de organismul gazdă, acționează ca o primă linie de apărare în cazul inflamațiilor sau traumelor. Ele joacă un rol important în răspunsul imun adaptiv, deoarece, împreună cu funcțiile antimicrobiene directe, exercită activități imunomodulatoare, citotoxice, acționând, de asemenea, ca mediatori biochimici ai inflamației și influențând chemotaxia (Diamond și colab., 2009).
Majoritatea AMP-urilor sunt caracterizate de proprietăți fizico-chimice generale, ca sarcina electrică netă (încărcare pozitivă, în general) ridicată și separarea spațială a regiunilor hidrofobe de cele hidrofile, ceea ce duce la interacția lor diferită cu miezul hidrofob al bistratului lipidic și cu mediul hidrofil apos extracelular (Konovalova și colab., 2018).
Peptidele antimicrobiene – AMP
Raportul Organizației Mondiale a Sănătății (WHO, 2014), referitor la rezistența antimicrobiană, publicat în 2014, indică o creștere alarmantă a numărului de microorganisme rezistente la tratamentele antimicrobiene clasice (antibiotice). Creșterea numărului de agenți patogeni rezistenți la tratamentele antimicrobiene a dus la necesitatea dezvoltării de noi clase de medicamente pentru combaterea infecțiilor provocate de aceste microorganisme (Boman, 1995; Lehrer și Ganz, 1999; Hancock și Diamond, 2000; Brown și Hancock, 2006; Findlay și colab., 2016). AMP, izolate dintr-o gamă largă de bacterii, plante și vertebrate superioare, inclusiv omul, sunt omniprezente în natură și sunt importante pentru imunitatea înnăscută, fiind considerate drept molecule esențiale în apărarea organismului gazdă împotriva infecțiilor microbiene (Brown și Hancock, 2006; Konovalova și colab., 2018). Datorită acțiunii lor rapide de inactivare a microorganismelor, a toxicității foarte selective și a faptului că bacteriile nu pot dezvolta cu ușurință rezistență împotriva peptidelor, AMP-urile sunt considerate ca alternative potențiale la antibioticele convenționale (Hancock și Patrzykat, 2002; Zasloff, 2002). Majoritatea AMP-urilor nu vizează receptorii moleculari aflați pe suprafața membranei agenților patogeni ci, mai degrabă, interacționează direct cu membrana lipidică, interacția ducând, în final, la permeabilizarea acesteia (Tossi și colab., 2000; Oren și Shai, 2004; Jiang și colab., 2008; Gagnon și colab., 2017; Jiang și colab., 2018).
O comparație a secvențelor AMP relevă faptul că două tipuri de catene laterale sunt esențiale pentru activitatea antimicrobiană. Catenele laterale cationice, cum ar fi cele alcătuite din reziduurile Arginină și Lizină, mediază interacțiunile AMP cu membranele încărcate negativ și / sau cu peretele celular al bacteriilor Gram-negative. Catenele laterale hidrofobe, cum ar fi cele care au în structura lor reziduurile Izoleucină, Leucină, Fenilalanină sau Triptofan, reziduuri ce apar frecvent în structura primară a AMP-urilor, se comportă ca niște ancore lipofile care destabilizează bistratul lipidic, și în cele din urmă produc distrugerea acesteia. S-a observat că activitatea antimicrobiană a AMP este guvernată de încărcarea pozitivă și de hidrofobicitatea reziduurilor din structura acestora, trebuind să existe un echilibru adecvat întrea aceste două tipuri de reziduuri pentru a evita toxicitatea față de celulele de mamifer (Beven și colab., 2003; Epand și colab., 2003; Song și colab., 2004; Song și colab., 2005).
AMP și rezistența antimicrobiană
În prezent, este recunoscut faptul că AMP-urile pot juca un rol promițător în lupta împotriva rezistenței microorganismelor patogene la antibioticele clasice (Zasloff, 2002; Jenssen și colab., 2006; Mahlapuu și colab., 2016; Dosler, 2017; Lohner, 2017; Primon-Barros și Macedo, 2017; Sanchez-Gomez și Martinez-de-Tejada, 2017). Din punct de vedere istoric, rezistența la agenți antimicrobieni precede introducerea primului antibiotic (Penicilina) pentru folosirea în tratamentele clinice (Bush, 2004; Chopra, 2013). Deoarece primele antibiotice au fost toate identificate sau derivate din produse naturale, factorii care determină rezistența antimicrobiană s-au dezvoltat în mediile din care provin acestea (Bush, 2004). În plus, practicile medicale și agricole din ultimii 50 de ani, au favorizat dezvoltarea și răspândirea rezistenței antimicrobiene a agenților patogeni, facând ineficiente metodele clasice de profilaxie a bolilor infecțioase (Poole și colab., 2005). Tratarea infecțiilor cauzate de microorganismele rezistente la mai multe clase de antibiotice (MDR) sunt scumpe, din punctul de vedere al costurilor, și au un grad foarte mare de nereușită (Deshpande și colab., 2004; D'Agata, 2015).
Rezistența agenților patogeni la tratamentele antimicrobiene apare în mai multe moduri, dar se bazează fie pe mecanismul de inactivare a medicamentului (Wright, 2005), fie pe modificări sau mutații apărute la nivelul situsurilor de interacție cu agenții antimicrobieni (Lambert, 2005). Un alt mecanism este cel al rezistenței fenotipice, datorată modurilor de creștere specifice (biofilme) din timpul infecției. Acesta este predominant în infecțiile cu agenți patogeni de natură bacteriană și joacă, probabil, un rol important în cadrul rezistenței la tratamentele antimicrobiene in vivo, contrar testelor in vitro care indică susceptibilitatea microorganismelor la anumite tipuri de antibiotice (Stewart și Costerton, 2001).
Datorită dezvoltării rezistenței agenților patogeni la tratamentele clasice, au fost dezvoltate noi strategii de tratament a infecțiilor. Una dintre aceste stragetii este utilizarea AMP (Hancock, 2001) al căror mod de acțiune indică o sensibilitate scăzută la mecanismele MDR, cât și o activitate ridicată împotriva unei game extinse de microorganisme (Epand și Vogel, 1999; Kouya și colab., 2009; Wang, 2010; Mohd și Gupta, 2011; Marquette și Bechinger, 2018).
AMP-urile sunt produse de majoritatea speciilor vii, de la procariote (Vanbelkum și colab., 1991; Baba și Schneewind, 1998) la plante (Garcia-Olmedo și colab., 1998; Castro și Fontes, 2005; Marmiroli și Maestri, 2014; Ficarra și colab., 2018), insecte (Bulet și Stocklin, 2005; Chernysh și colab., 2015; Tonk și colab., 2017), amfibieni (Kreil, 1994; Simmaco și colab., 1998; Rollins-Smith și colab., 2005; Wang și colab., 2016; Kumar și Sanil, 2017; Dennison și colab., 2018) și mamifere, inclusiv oameni (Travis și colab., 2000; Ryley, 2001; Ganz, 2003; Oppenheim și colab., 2003; Wiesner și Vilcinskas, 2010; Harder și Schröder, 2016; Sen și colab., 2016; Khurshid și colab., 2018) ele făcând parte din mecanismul de apărare al organismului gazdă.
AMP – alternative la antibioticele clasice
În momentul de față, este acceptată ideea că secvențele specifice a AMP nu sunt esențiale în definirea activității antimicrobiene, aceasta depinzând mai mult de proprietățile fizico-chimice ale AMP: sarcina cationică, hidrofobicitatea și tipul de structură pe care acestea o adoptă (Tossi și colab., 2000; Yamamoto și Tamura, 2010; Zhu și colab., 2014; Zhu și colab., 2015; Gagnon și colab., 2017; Jiang și colab., 2018). Astfel, deși modurile nespecifice de acțiune a acestora ar putea, într-adevăr, să diminueze capacitatea agenților patogeni de a dezvolta mecanisme de rezistență la AMP (Mor, 2000; Perron și colab., 2006), caracteristicile comune între membranele celulare microbiene și cele de mamifer par să fie responsabile de selectivitatea relativ scăzută a AMP-urilor, în comparație cu antibioticele convenționale.
Ca alternative la medicamentele clasice, AMP prezintă o serie de dezavantaje suplimentare: activitate redusă în prezența sărurilor și a cationilor bivalenți (Goldman și colab., 1997; Bals și colab., 1998; Minahk și Morero, 2003; Rydlo și colab., 2006), susceptibilitate la modificări ale pH-ului (Lee și colab., 1997; Rydlo și colab., 2006) și la proteaze sau alte componente plasmatice (Rozek și colab., 2003). Utilizarea AMP ca agenți antimicrobieni poate suferi și din cauza problemelor farmacocinetice slabe și din cauza costurilor de producție ridicate (Bradshaw, 2003; Yeaman și Yount, 2003; Gordon și colab., 2005; Marr și colab., 2006), cum este în cazul peptidelor formate numai din D-aminoacizi, care, deși sunt rezistente la proteoliză, au un preț de producție semnificativ mai ridicat față de al celor obținute din L-aminoacizi (Bessalle și colab., 1990).
Există, astfel, o nevoie clară de stabilire a unor strategii alternative pentru depășirea deficiențelor AMP, atunci când acestea sunt tratate ca alternative la antibioticele clasice, ca potențiali agenți terapeutici. Un număr considerabil de studii SAR (relația structură-activitate antimicrobiană), care vizează o mai bună înțelegere a mecanismelor de acțiune ale AMP-urilor naturale, au contribuit la obținerea de informații referitoare la modul de acțiune și la relațiile care există între structura AMP și activitatea antimicrobiană a acestora. Astfel, aceste studii au avut mai multe direcții de abordare: biblioteci combinatoriale (Eichler și Houghten, 1995; Blondelle și colab., 1996; Blondelle și Lohner, 2004), abordarea minimalistă (Epand și colab., 2003; Jing și colab., 2003a) și obținerea în laborator de peptide cu anumite secvențe specifice de aminoacizi, în structura lor primară (Tossi și colab., 1997; Tiozzo și colab., 1998; Tossi și colab., 2000; Zhu și colab., 2014; Zhu și colab., 2015).
Rolul reziduurilor Triptofan și Arginină din structura AMP
Reziduurile de Triptofan și Arginină se regăsesc în proporții variabile, uneori neobișnuit de mari, în structura primară a peptidelor antimicrobiene. Rolul acestor reziduuri a fost investigat cu atenție, dar nu este încă foarte clar ce proprietăți specifice conferă ele peptidelor antimicrobiene, în plus față de sarcina pozitivă și hidrofobicitate. De exemplu, reziduurile de Triptofan au fost plasate în diferite poziții pe scările de hidrofobicitate ale aminocizilor (Mazze și colab., 2005).
A fost demonstrat, analizând structurile din PDB, că cea mai favorabilă configurație, din punct de vedere energetic, în soluții apoase, este orientarea paralelă a acestor reziduuri, unul față de celălalt, în structura proteinelor (Minoux și Chipot, 1999). Astfel, în această configurație, catena laterală a Arginineipoate să formeze aproape tot atâtea legături de hidrogen cumoleculele de apă, din mediul înconjurător, ca atunci când aceasta nu este implicată în nicio reacție de tip cation-electron π (Aliste și colab., 2003).
Din analiza modului în care proteinele membranare interacionează cu bistratul lipidic, s-a observat că reziduurile de Triptofan preferă zona de interfață a bistratului cu mediul apos (Persson și colab., 1998; Yau și colab., 1998; Sun și colab., 2008). Acest comportament a fost observat și pentru AMP care conțin în structura lor reziduuri de Triptofan. Simulările de dinamică moleculară au arătat importanța reziduurilor de Triptofan în interacția dintre peptide și membranele lipidice, acestea putându-se asocia cu capetele polare (colina) încărcate pozitiv ale lipidelor (Aliste și colab., 2003) și putând forma legături de hidrogen cu moleculele de apă, atunci când se află la interfața bistratului lipidic (Aliste și colab., 2003; Petersen și colab., 2005). Regiunea de interfață a bistratului lipidic cu mediul apos, datorită interacțiunilor electrostatice complexe care apar la nivelul acesteia, a fost propusă ca fiind zona ideală de interacție a reziduurilor de Triptofan cu bistratul lipidic (Yau și colab., 1998).
Natura cationică și orientarea Argininei atunci când aceasta formează legături de hidrogen, împreună cu proprietătile complexe ale Triptofanului par să se completeze foarte bine, reciproc, pentru scopul peptidelor antimicrobiene. Caracterul cationic al Argininei este un mijloc eficace de atracție al AMP la nivelul membranelor țintite de acestea, iar formarea legăturilor de hidrogen facilitează interacția acesteia cu suprafețele încărcate negativ (lipopolizaharidele, acidul teichoic sau fosfatidil glicerolul din capetele polare ale lipidelor). Triptofanul, datorită proprietăților hidrofobe, reprezintă cel mai potrivit aminoacid care permite o asociere prelungită a AMP cu membranele (Jing și colab., 2003b).
Modul de acțiune al AMP
AMP-urile sunt active împotriva unei mari varietăți de bacterii Gram-negative și Gram-pozitive, drojdii, fungi și virusuri. Mecanismul de acțiune implică interacția electrostatică a moleculelor peptidice încărcate pozitiv cu suprafața membranelor agenților patogeni, încărcate negativ, urmată de penetrarea membranei citolpasmatice, ceea ce duce la pierderea conținutului intracelular în mediul extracelular (Konovalova și colab., 2018).
Mecanismul de acțiune al AMP-urilor cationice este intens studiat. Majoritatea studiilor desfășurate au fost efectuate utilizând membrane lipidice model, cu diferite compoziții de lipide. Studiile efectuate pe membranele celulelor bacteriene s-au efectuat utilizând fluororfori sensibili la modificările potențialului membranar sau peptide marcate fluorescent. Aceste studii au împărțit mecanismele de acțiune al AMP asupra membranelor în două categorii: mecanisme care perturbă (distrug) membrana și mecanisme care nu distrug membrana, acestea acționând asupra organitelor celulare în urma transferului lor prin membrană (Friedrich și colab., 2000).
Atunci când intercația AMP cu membranele lipidice duce la apariția unor reorganizări la nivelul bistratului, reorganizări în urma cărora apar efecte de distrugere la nivelul bistratului, sunt implicate trei tipuri de mecanisme: “carpet like”, “barrel-stave” și formarea de pori toroidali (Brogden, 2005; Diamond și colab., 2009).
Mecanismul de interacție de tip “carpet like”
În acest caz, peptidele sunt adsorbite la suprafața bistratului și formează un strat aproape continuu asemănător unui covor, de unde și denumirea de interacție “carpet like”, ca în Figura 2.1 – A. Cu cât concentrația de peptidă este mai mare pe suprafața membranei, cu atât este mai mare numărul peptidelor care penetrează membrana și formează pori toroidali tranzitorii, care permit și altor peptide accesul la suprafața bistratului. Atunci când se atinge un anumit prag al concentrației peptidelor care interacționează cu bistratul lipidic, integritatea structurală a membranei este afectată, porțiuni din ea fiind rupte, în urma formarii de micelii.
Mecanismul de interacție de formare a porilor toroidali
În acest caz, peptidele sunt adsorbite la suprafața bistratului lipidic, dupa care agregă, iar agregarea duce la formarea porilor toroidali. În structura porilor, peptidele au regiunile hidrofobe orientate către capetele polare ale lipidelor și rămân asociate cu acestea datorită interacțiilor electrostatice. Astfel, interiorul porilor va avea în structura lui zonele hidrofile ale peptidelor și capetele polare ale lipidelor din structura bistratului, așa cum se poate vedea în Figura 2.1 – B.
Mecanismul de interacție de tip “barrel-stave”
În această situație, peptidele sunt încorporate în bistratul lipidic, cu zonele hidrofobe orientate către cozile hidrofobe ale lipidelor ce alcătuiesc membrana și cu zonele hidrofile orientate către interiorul porului, cum se poate observa în Figura 2.1 – C.
Membranele celulare și membranele lipidice artificiale
Membranele biologice formează stratul protector în jurul celulelor și delimitează mediul intracelular, citosolul și organitele celulare (nucleul, aparatul Golgi, mitocondriile, reticulul endoplasmatic, cloroplastele, lizozomii etc.), de cel extracelular. Membranele reprezintă una din componentele esențiale ale celulelor, deoarece acestea sunt responsabile pentru o serie de funcții indispensabile vieții, cum ar fi procesele de transport, transmisia semnalelor electrice, aderența și comunicarea intercelulară. Aceste proprietăți sunt determinate de compoziția chimică și în special de caracteristicile structurale ale biomembranelor, care variază nu numai între specii diferite, dar și între diferite tipuri de celule (Alberts, 2008; Becker, 2012).
Compoziția și organizarea membranelor celulare
Membranele biologice sunt caracterizate de o diversitate moleculară impresionantă, fiind compuse, în cea mai mare parte din lipide și proteine, dar și dintr-o mică parte de carbohidrați, legați covalent la acestea. Lipidele formează bistratul lipidic, acesta fiind o structură suport pentru toate membranele biologice în care sunt încorporate proteine (Alberts, 2008).
Membranele plasmatice ale celulelor de mamifer conțin patru mari clase de fosfolipide: fosfatidilcolină (PC), fosfatidiletanolamină (PE), fosfatidilserină (PS) și sfingomielină (SM), care, împreună, reprezintă mai mult de jumătate din conținutul în lipide în majoritatea membranelor. Aceste fosfolipide sunt distribuite asimetric între cele două fețe ale bistratului lipidic, așa cum se poate observa în Figura 2.2. Fața exterioară a membranei plasmatice constă în principal din PC și SM, în timp ce PE și PS sunt fosfolipidele predominante în structura feței interioare a bistratului. Un al cincilea fosfolipid, fosfatidilinositol (PI) este, de asemenea, localizat la nivelul feței interioare a membranei plasmatice. Deși PI este o componentă membranară prezentă în cantități foarte mici, el joacă un rol important în semnalizarea celulară. Capeteloe polare ale lipidelor PS și PI sunt încărcate negativ, astfel că fața interioară a bistratului prezintă încărcare netă negativă (Cooper, 2000).
În plus, față de fosfolipidele amintite anterior, membranele plasmatice ale celulelor de mamifer conțin glicolipide și colesterol. Glicolipidele se găsesc exclusiv pe fața exterioară a bistratului și reprezintă doar aproximativ 2 % din totalitatea lipidelor care alcătuiesc membrana plasmatică. Colesterolul, pe de altă parte, este un constituent major al membranei celulelor animale, fiind prezent în aproximativ aceleași cantități molare ca fosfolipidele.
Membranele celulelor bacteriene au o structură diferită de cele de mamifer. Pereții acestora sunt mai rigizi, determinând astfel o formă bine definită a celulei și, în același timp, împiedicând distrugerea peretelui celular ca rezultat al presiunii osmotice. Structura peretelui celular împarte bacteriile în două mari clase, ce se pot diferenția printr-un procedeu de marcare cunoscut sub numele de colorație Gram, dezvoltată de Christian Gram în anul 1884. Așa cum se poate observa în Figura 2.3, bacteriile Gram-negative (spre exemplu Escherichia coli) au un sistem de membrană plasmatică dublă, în care membrana lipidică interioară (citoplasmatică) este înconjurată de un perete celular rigid și de cea de-a doua membrană lipidică, mult mai permeabilă. Spre deosebire de acestea, bacteriile Gram-pozitive (spre exemplu, agentul patogen Staphylococcus aureus) au o singură membrană plasmatică, înconjurată de un perete celular rigid, mult mai gros decât al celor Gram-negative (Cooper, 2000).
În ciuda diferențelor structurale, componenta principală a peretelui celular, pentru ambele tipuri de bacterii, este un peptidoglican, alcătuit din lanțuri polizaharidice lineare, legate între ele de oligopeptide. Din cauza acestei structuri reticulate, peptidoglicanul formează un înveliș covalent puternic care înconoară întreaga celulă bacteriană. Structura unică a peretelui celular face ca bacteriile să fie sensibile la unele antibiotice. Spre exemplu, Penicilina inhibă enzima responsabilă de formarea legăturilor încrucișate între diferitele catene ale peptidoglicanului, interferând astfel cu lanțul de sinteză a peretelui celular, blocând în acest fel creșterea bacteriană.
Proprietățile bistratului lipidic
Membranele biologige au ca structură de bază bistraturile lipidice. Proprietățile bistratului lipidic depind de tipul lipidelor din care acesta este alcătuit (saturate, nesaturate sau steroli), dar și de proprietățile fizico-chimice ale mediului. Cele mai importante proprietăți ale bistratului lipidic sunt: fluiditatea, esențială pentru toate sistemele biologice, și organizarea laterală, care depinde de interacțiunile ce apar între numeroasele componente din structura membranei.
Fluiditatea bistratului lipidic
Membranele biologice sunt structuri dinamice, în care atât lipidele cât și proteinele pot să difuzeze translațional și rotațional. Comparativ cu proteinele, care prezintă două tipuri de difuzie, una laterală și una rotațională, după o axă perpendiculară pe suprafața bistratului, lipidele din structura membranei prezintă trei moduri de difuzie: rotațională, în jurul axei longitudinale, laterală și transversală (mișcarea de tip “flip-flop”, între cele două monostraturi lipidice). Toate aceste tipuri de difuzie sunt întâlnite și în situația membranelor lipidice model.
O caracteristică importantă a bistratului lipidic este capacitatea de tranziție a acestuia între două stări (faze) caracterizate de proprietăți (coeficienți de difuzie) diferite: de la faza solidă (gel) la faza fluidă (cristal lichid). Tranziția între aceste stări este dependentă de temperatură, definindu-se astfel un punct critic, numit temperatură de tranziție, Tm, temperatură care este considerată punctul de “topire” al membranei, cozile lipidelor având peste această temperatură o mișcare oarecum dezordonată. Temperatura de tranziție este influențată de lungimea cozilor lipidelor dar și de existența dublelor legături în structura acestora. Mișcarea moleculelor care intră în alcătuirea membranei (lipide, proteine etc.), care crește odată cu temperatura, caracterizează fluiditatea bistratului lipidic.
Separarea de fază a lipidelor din componența bistratului
Membranele biologice cât și membranele lipidice model, obținute din mai multe tipuri de lipide, prezintă în structura lor o organizare laterală, astfel încât pot exista, în același timp, mai multe domenii lipidice (în Engleză, rafts) care prezintă proprietăți fizice diferite. Aceste proprietăți sunt descrise, în mod uzual, de cele trei faze în care putem regăsi bistratul, din punctul de vedere al organizării laterale a acestuia: faza de gel (solid ordonat), faza de lichid ordonat și faza de cristal lichid (lichid dezordonat).
Pentru majoritatea lipidelor, faza de gel se observă la temperaturi scăzute. Aceasta este caracterizată de o împachetare laterală ridicată a cozilor moleculelor de lipid, ceea ce conduce la obținerea unei fluidități scăzute a bistratului, coeficienții de difuzie fiind în acest caz foarte mici. Împachetarea lipidelor depinde de lungimea cozilor și de gradul de nesaturare al acestora. Faza de cristal lichid se observă la temperaturi mai mari decât Tm, când lipidele “se topesc”, lucru ce duce la o fluiditae mai crescută a bistratului.
Membranele lipidice artificiale – structuri biomimetice
Datorită complexității membranelor biologice, în a căror structură se găsesc sute, sau chiar mii, de componente (diferite proteine și tipuri de lipide), utilizarea sistemelor model, în care compoziția membranei și dimensiunile fizice ale acesteia sunt controlate de către utilizator, reprezintă cea mai simplă și avantajoasă modalitate de studiu a proprietăților specifice acestora.
Lipozomii, care reprezintă unul dintre tipurile de membrane lipidice model, sunt folosiți în practică pentru că utilizatorul poate controla compoziția, condițiile fizico-chimice, dimensiunile și forma membranei. Ei pot fi ușor preparați în laborator, din lipide naturale sau sintetice, sunt reproductibili, au o omogenitate ridicată și sunt stabili în timpul măsurătorilor. Membranele model pot fi utilizate, cu ușurință, pentru măsurători de spectroscopie și de fluorescență. Structural, lipozomii sunt vezicule sferice, în care un volum de substanță apoasă este complet închis de către un bistrat lipidic, cum se poate observa în Figura 2.4.
Dintre metodele de obținere a lipozomilor, pentru experimentele de laborator, cele mai folosite sunt:
metoda sonicării, prin care se obțin lipozomi cu diametrul de aproximativ 50 nm – SUV (Small Unilamellar Vesicles), distribuiți uniform în suspensie;
metoda extrudării, prin care se obțin lipozomi cu diametrele între 50 nm și 1 μm – LUV (Large Unilamellar Vesicles), dimensiunile acestora fiind în funcție de filtrul folosit;
metoda electroformării, prin care se obțin lipozomi “gigant” – GUV (Giant Unilamellar Vesicles).
Din punct de vedere al structurii, lipozomii se împart în: vezicule unilamelare (ULV) – SUV, LUV și GUV, vezicule multilamelare (MLV), vezicule multicompartimentate (MVV) și vezicule oligolamelare (OLV).
Principiile de bază ale fluorescenței
Introducere
Spectroscopia de fluorescență a devenit una dintre cele mai utilizate tehnici în domeniul biofizicii, cu aplicații în studierea structurii și funcțiilor macromoleculelor de interes biologic precum și a sistemelor biologice (membrana lipidică, citoschelet, nucleu, grupări de celule).
Fluorescența
Studiul sistemelor biologice prin investigarea fenomenului de fluorescență a cunoscut o dezvoltare semnificativă în ultimele două decenii. Spectroscopia de fluorescență și fluorescența rezolvată în timp sunt considerate a fi principalele metode experimentale în biochimie și biofizică. Investigarea fenomenului de fluorescență este acum extrem de folosită în biotehnologie, secvențierea ADN, criminalistică și în analizele genetice. O creștere la fel de semnificativă a cunoscut și utilizarea fluorescenței în imagistica celulară și moleculară. Imagistica de fluorescență este folosită în localizarea și dozarea moleculelor intracelulare, uneori la nivelul de detecție a unei singure molecule (Lakowicz, 2006).
Diagrama Jablonski și caracteristicile emisiei fluorescente
Emisia de lumină (în spectrul UV, VIS, IR) de către orice subsțantă poartă numele de luminescență și apare din stări electronice excitate. Luminescența este, în principiu, împărțită în două categorii: fluorescența și fosforescența, diferența între aceste două fenomene facând-o starea excitată în care găsim molecula studiată, respectiv singlet sau triplet (Lakowicz, 2006). În funcție de modul în care molecula de interes a ajuns pe un nivel energetic superior, luminescența poate fi împartita în mai multe categorii: fotoluminescența, chemiluminescența, radioluminescența, etc. (Valeur, 2001).
La apariția fenomenului de fluorescență, electronul din starea excitată de singlet este împerecheat cu electronul (cu spin opus) din starea fundamentală. Revenirea electronului din starea excitată, în starea fundamentală, se face rapid, prin emisia unui foton (dezexcitare radiativă) sau prin disipare de căldură (dezexcitare neradiativă). Viteza de emisie a fluorescenței este, în general, 108 s-1, și astfel timpul de viață al fluorescenței este de aproximativ 10 ns (Lakowicz, 2006).
Energia, E, necesară electronului pentru a trece din starea energetică fundamentală în starea excitată singlet este, de fapt, energia fotonilor absorbiți de molecula fluorescentă:
unde h este constanta lui Planck (h = 6.63 × 10-34 Js), c este viteza luminii în vid (c ≈ 3 × 108 m/s) și λ este lungimea de undă a radiației electromagnetice.
Procesele care apar între absorbția și emisia luminii sunt, în general, evidențiate cu ajutorul diagramei Jablonski (Figura 2.1). Stările energetice electronice: fundamentală, prima stare excitată și a doua stare excitată în care se află electronul sunt notate în figură cu S0, S1 și respectiv, S2. Pentru fiecare din aceste stări electronul poate exista pe unul din nivelurile energetice vibraționale reprezentate în figură prin cifrele 0, 1, 2 etc. Săgețile reprezentate prin linii continue desemnează procese care implică schimb radiativ de energie, în timp ce, acelea reprezentate prin linii întrerupte descriu procese neradiative. Tranziția S2 → S1 are loc în intervale de timp t < 10-10 s, în timp ce procesele care conduc la tranziția S1 → S0 sunt caracterizate de timpi de viață cuprinși în domeniul 10-10 s până la 10-7 s (Țugulea și Găzdaru, 2003).
Fenomenul de fluorescență este, în general, caracterizat prin spectrele de emisie ale fluoroforilor studiați în experimente. Un spectru de emisie fluorescentă este reprezentat de dependența intensității fluorescenței (CPS) de lungimea de undă (nm) sau de numărul de undă (cm-1). Spectrele de emisie sunt foarte diferite și depind de structura chimică a fluoroforului și de solventul în care acesta este dizolvat, pH-ul soluției, temperatură etc.
Fenomenul de fluorescență prezintă următorii parametri și caracteristici de bază:
– deplasarea Stokes;
– spectrele de emisie sunt, în general, independente de lungimea de undă de excitație;
– eficiența cuantică;
– timpul de viață.
Deplasarea Stokes
Din analiza unei diagrame Jablonski reiese că fluorescența apare la lungimi de undă mai mari (energii mai mici) decât lungimea de undă a radiației electromagnetice care a fost absorbită (deplasare Stokes).
Diferența între energia radiației absorbite și energia radiației emise este o caracteristică universală a fluoroforilor în soluții. Una dintre cauzele deplasării Stokes este dezexcitarea rapidă de pe un nivel vibrațional superior al nivelului electronic S1 pe ultimul nivel vibrațional al acestuia. În plus, fluoroforii pot prezenta deplasare Stokes dependentă de proprietățile fizico-chimice ale solventului (polaritatea solventului, indicele de refracție al solventului, temperatura, pH-ul etc.).
Independența spectrelor de emisie de lungimea de undă de excitație
O altă proprietate a emisiei fluorescente: pentru lungimi de undă de excitație diferite sunt înregistrate spectre de emisie aproximativ identice. Această regulă este cunoscută drept regula lui Kasha (Kasha, 1950) și derivă din faptul că eficiența cuantică a unui fluorofor este, în general, independentă de lungimea de undă de excitație. Independența spectrelor de emisie de lungimea de undă de excitație apare datorită faptului că în urma tranziției pe unul din nivelurile vibro-rotaționale superioare, energia în exces față de cel mai scăzut nivel de vibrație al stării S1 este disipată rapid (10-12 s), fluoroforul ramânând în această ultimă stare energetică până la apariția emisiei fluorescente.
Simetria dintre spectrele de emisie și de excitație (un spectru de excitație reprezintă variația coeficientului molar de extincție cu lungimea de undă), numită regula imaginii în oglindă, este consecința acelorași tranziții între nivelurile energetice vibraționale ale nivelurilor S0 și S1.
Eficiența cuantică
Eficiența cuantică (sau randament cuantic) a unui fluorofor este definită ca numărul de fotoni emiși, raportat la numărul de fotoni absorbiți. Eficiența cuantică a unui fluorofor este reprezentată, cel mai bine într-o diagramă Jablonski simplificată, de tipul celei din Figura 3.2.
În această figură s-a notat cu Γ constanta de viteză de emisie a fluoroforului și cu knr constanta de viteză a proceselor de desexcitare neradiativă, care apar la revenirea fluoroforului pe nivelul S0. Astfel, avem pentru eficiența cuantică a fluoroforului următoarea relație:
unde suma (Γ + knr) este proporțională cu numărul de fotoni absorbiți. Eficiența cuantică a unui fluorofor poate fi aproximativ egală cu 1, dacă viteza dezexcitărilor neradiative este mult mai mică decât numărul fotonilor emiși (knr << Γ), dar, întotdeauna, este subunitară.
Timpul de viață al fluorescenței
Timpul de viață al stării excitate este definit ca fiind timpul mediu pe care îl petrec moleculele unui fluorofor pe nivelurile energetice superioare, înainte ca acestea să revină pe nivelul energetic fundamental. Pentru fluorofori, în general, timpul de viață mediu al stării excitate este de aproximativ 10 ns. Pentru orice fluorofor, timpul de viață mediu este:
Timpul de viață a stărilor excitate ale unui fluorofor, în absența proceselor neradiative, se numește timp de viață natural sau timp de viață intrinsec și este dat de următoarea relație:
Eficiența cuantică și timpul de viață mediu al stării excitate sau timpul de viață natural pot fi modificate de factorii care afectează rata de emisie, Γ, sau rata de descreștere neradiativă, knr.
Influența factorilor de mediu asupra fluorescenței
Polaritatea solventului și condițiile de mediu locale (pH-ul, temperatura, etc) au efecte semnificative asupra caracteristicilor spectrale ale fluoroforilor (Suhling și colab., 2005). Influența acestor factori este redată în Figura 2.3.
Cu toate că principala cauză a deplasării Stokes este dezexcitarea neradiativă pe nivelul vibrațional cu cea mai mică energie al stării electronice S1, trebuie avuți in vedere și ceilalți factori ce pot afecta emisia fluorescentă și, implicit, deplasarea Stokes:
– polaritatea și vâscozitatea solventului;
– rata de relaxare dipolară a solventului;
– modificările conformaționale ale fluoroforului;
– rigiditatea mediului local;
– transferul intern de sarcină;
– formarea de legături de hidrogen și reacții chimice în stare excitată;
– reacții fluorofor-fluorofor;
– modificări în rata de dezexcitare radiativă/neradiativă.
Fluorofori
Un fluorofor este o porțiune a unei molecule, care o face pe aceasta să fie fluorescentă. În urma numeroaselor descoperiri din chimia organică, astăzi beneficiem de o multitudine de substanțe fluorescente. Fluorescența este foarte utilă, în particular stiințelor vieții, ca o metodă experimentală nedistructivă, pentru analiza biomoleculelor și a agregatelor celulare.
Principalele tipuri de fluorofori și proprietățile acestora
Un fluorofor este o grupare funcțională a unei molecule care absoarbe energie la o lungime de undă și emite la o altă lungime de undă. Energia emisă și, în consecință, lungimea de undă a fotonului emis, depind în principal de natura fluoroforului și de condițiile fizico-chimice în care acesta se află. Principalele tipuri de fluorofori utilizați în experimente sunt:
– fluoroforii biologici;
– coloranții organici;
– nanoparticulele cuantice.
Principalele caracteristici ale fluoroforilor sunt:
– lungimea de undă a maximului de excitație și de emisie (exprimate, de obicei în nm): corespunde peak-urilor din spectrul de excitație și, respectiv, de emisie (în general câte unul pentru fiecare porțiune de spectru, dar pot exista de asemenea și spectre complexe rezultate din suprapunerea mai multor peak-uri);
– coeficientul molar de extincție (sau absorbție molară, exprimat în mol-1×cm-1×L): stabilește o relație între cantitatea de lumină absorbită, la o lungime de undă dată, și cantitatea de fluorofor din soluție;
– eficiența cuantică: reprezintă eficiența transferului de energie de la fotonii incidenți la fotonii care apar în urma fluorescenței (numărul de fotoni emiși raportat la numărul de fotoni absorbiți de fluorofor);
– timpul de viață (exprimat în ps sau ns): reprezintă durata de timp cât fluoroforul stă pe nivelul energetic superior înainte de a reveni pe nivelul energetic de bază; sau timpul necesar unei populații din fluoroforul considerat, aflate pe un nivel energetic superior, să revină pe nivelul energetic de bază în proporție de 1/e (~0.37);
– deplasarea Stokes (exprimată în nm sau cm-1): reprezintă diferența dintre maximul intensitații din spectrul de excitație și maximul intensității din spectrul de emisie.
Fluorofori solvatocromici
Emisia fluoroforilor apare la lungimi de undă mai mari decât ale absorbției luminii. Aceste pierderi de energie sunt datorate proceselor dinamice care apar în urma absorbției, așa cum se poate vedea în Figura 2.4. În urma absorbției unui foton, un fluorofor trece, în general, din punct de vedere energetic, pe unul din nivelurile vibraționale ale stării excitate S1. Excesul de energie vibrațională este pierdut rapid în solvent. Dacă un fluorofor, în urma absorbției unui foton, trece în starea excitată S2, atunci acesta va trece rapid (10-12 s) în starea excitată S1, în urma fenomenuleui de conversie internă.
Un fluorofor aflat în stare excitată are momentul de dipol (μe) mai mare decât momentul de dipol în starea de bază (μg). Interacțiunea solventului cu fluoroforul aflat în stare excitată, duce la o scădere și mai pronunțată a energiei stării excitate a fluoroforului (creștere a lungimii de undă de emisie). Acest fenomen apare datorită faptului că moleculele solventului (dipolii) se pot reorienta în jurul dipolului fluoroforului (μe) aflat în stare excitată. Astfel, cu cât polaritatea solventului crește, cu atât energia fluoroforului în stare excitată scade, emisia fluorescentă deplasându-se către lungimi de undă mai mari (deplasare batocromică).
Fluoroforii folosiți în experimentele ce pun în evidență relaxarea solventului sunt caracterizați de diferența mare între momentul electric de dipol în starea excitată și momentul electric de dipol în starea de bază (Δμ = μe – μg).
Laurdanul – fluorofor utilizat pentru estimarea fluiditații membranelor lipidice
Fluoroforul solvatocromic LAURDAN (6-dodecanoyl-2-dimethylamino naphthalene) s-a dovedit a fi util în caracterizarea membranelor lipidice (Lakowicz și Sheppard, 1981; Parasassi și colab., 1986). Acesta detectează tranzițiile de fază (faza de gel și faza lichidă) atunci când este inserat în bistratul lipidic, datorită sensibilitații sale la polaritatea mediului, fiind un bun indicator al stării de hidratare a membranei. Laurdanul prezintă o coadă alifatică formată din 12 atomi de carbon, fapt care îi facilitează inserarea în bistratul lipidic (Jurkiewicz și colab., 2006) (Figura 2.5 A).
Creșterea numărului de molecule de apă conținute în bistratul lipidic duce la o deplasare spre roșu a maximului de emisie a Laurdanului (Samanta și Fessenden, 2000). Această deplasare se datorează relaxarii moleculelor de apă în jurul fragmentului naftalenic, depinzând în primul rând de faza în care se află bistratul lipidic (Figura 2.5 B) (Sanchez și colab., 2007).
Triptofanul – principalul aminoacid ce prezintă fluorescență intrinsecă
Spectroscopia de fluorescență este utilizată, în mod curent, pentru studierea structurilor biologice, precum și a peptidelor și proteinelor. Aminoacizii aromatici, Triptofan (W), Tirozină (Y) și Fenilalanină (F), datorită faptului că prezintă fluorescență intrinsecă, sunt utilizați pentru studierea modificărilor conformaționale ale proteinelor și peptidelor, a dinamicii acestora, dar și pentru punerea în evidență a intercțiilor biomoleculare la care acestea participă (Hui și colab., 2015). Dintre cei trei aminoacizi, cel mai utilizat în practică este Triptofanul (Figura 2.6). Fluorescența indolului, gruparea cromoforă din structura Triptofanului, este extrem de sensibilă la proprietățile fizico-chimice ale mediului inconjurător, făcând astfel din molecula de Triptofan un indicator al modificărilor conformaționale ale moleculelor, dar și al interacției dintre acestea și alte molecule (Hayes și Kollman, 1976a; Hayes și Kollman, 1976b; Honig și Nicholls, 1995; Sham și colab., 1998).
În principiu, dacă structura proteinei este cunoscută, modificările din spectrul de fluorescență al Triptofanului pot fi interpretate în termeni structurali la rezoluție atomică (Chen și Barkley, 1998).
Eficiența cuantică a fluorescenței Triptofanului poate varia între 0 și 0.35 (Lakowicz, 2006), fiind extrem de sensibilă la polaritatea locală a mediului (Weber, 1960; Beechem și Brand, 1985; Eftink, 1991).
Printre proprietățile, cel mai des utilizate sunt: modificarea intensității fluorescenței, modificarea poziției maximului emisiei fluorescente (λmax), forma generală a spectrului de emisie, anizotropia (depolarizarea) fluorescenței, timpii de viață ai fluorescenței și transferul rezonant de energie (FRET). Poziția maximului de emisie, la fel ca eficiența cuantică, este extrem de sensibilă la proprietățile mediului, variind de la ~ 308 nm (azurină) până la ~ 355 nm (glucagon), fiind în relație directă cu gradul de expunere al grupării cromofore la moleculele solventului (Reshetnyak și Burstein, 2001).
Toate acestea fac ca fluorescența Triptofanului să constitue un bun indicator al conformației peptidelor și, deasemenea, al interacției acestora cu membranele celulare.
Spectroscopia de fluorescență
Așa cum am precizat în paragrafele anterioare, emisia fluorescentă furnizează informații din care se pot deduce efectele mediului înconjurător asupra fluoroforului. Pentru obținerea acestor informații se înregistrează semnalul fluorescent (spectre, timpi de viață ai fluorescenței, gradul de polarizare a semnalului fluorescent etc.) cu ajutorul instrumentelor numite spectrofluorimetre.
Măsurarea semnalului fluorescent poate fi efectuată, în general, prin două mari metode: spectroscopia de fluorescență statică (staționară) și spectroscopia de fluorescență rezolvată în timp.
Spectroscopia de fluorescență statică
În măsurătorile de fluorescență statică (cele mai uzuale măsurători), proba analizată este expusă la un fascicul de lumină cu intensitatea relativ constantă. Concomitent cu iluminarea este înregistrat și spectrul de emisie fluorescentă al probei (Figura 2.7). Atunci când proba este iluminată pentru prima dată, starea staționară este atinsă, aproape instantaneu.
Este important să înțelegem relația dintre măsurătorile de fluorescență rezolvată în timp și cele de fluorescență staționară (statică), aceasta din urmă fiind o medie a scăderii intensității fluorescenței rezolvate în timp. Dacă considerăm un fluorofor care prezintă un singur timp de scădere, τ, a intensității fluorescenței, atunci relația dintre scăderea intensității și timpul τ este:
unde I0 este intensitatea la timpul t = 0.
Măsurătorile de fluorescență statică reprezintă o medie a intensității fluorescenței rezolvate în timp. Relația dintre intensitatea fluorescenței staționare (ISS) și intensitatea fluorescenței rezolvată în timp este:
Intensitatea I0 poate fi considerată ca fiind dependentă de parametrii instrumentului de măsură și de concentrația fluoroforului în soluție. Astfel, în termeni moleculari, intensitatea fluorescenței statice este proporțională cu timpul de viață, în acest fel fiind justificate ecuațiile (2.2) și (2.3), care ne arată că eficiența cuantică este proporțională cu timpul de viață (Lakowicz, 2006).
Un spectrofluorimetru clasic conține trei elemente principale: o sursă de lumină policromatică (albă) în undă continuă (tipic, lampă cu descărcare în xenon sau sursă LED policromatică), sistemul optic (lentile de focalizare, monocromatoare de excitație și emisie, sistemul de fixare a probei de analizat) și un detector cu sensibilitate foarte mare (e.g., fotomultiplicator, cel mai des utilizat, fotodiodă cu avalanșă etc.). În plus, prin adăugarea unui detector suplimentar se pot efectua și măsurători ale eficienței cuantice a fluoroforilor, iar dacă se dorește măsurarea anizotropiei, în căile optice de excitație și emisie pot fi introduse prisme pentru polarizarea luminii.
Spectroscopia de fluorescență rezolvată în timp
Cunoașterea dinamicii stărilor excitate prezintă o importanță majoră în înțelegerea proceselor de natură fotobiologică (Valeur, 2001). Deși spectroscopia de fluorescență statică este ușor de implementat, ea suferă de mai multe dezavantaje. Măsurătorile intensității emisiei de fluorescență depind de mai mulți factori, cum ar fi excitația probei și eficiența de colectare a fotonilor emiși de către aceasta, eficiența de transmisiei a luminii prin căile optice și neomogenitatea probei de analizat.
Măsurătorile de fluorescențărezolvată în timp sunt independente de intensitatea semnalului și, prin urmare, sunt independente de toate artefactele care afectează măsurătorile bazate pe intensitate, menționate în paragraful anterior.
În momentul de față, se utilizează două tehnici pentru obținerea informațiilor referitoare la timpul de viață al fluorescenței: fluorimetria în pulsuri și fluorimetria cu modularea fazei (armonică).
Atunci când se utilizează fluorimetria în pulsuri, excitarea probei se face cu un puls foarte scurt de lumină (numit puls Dirac – δ) și se înregistrează fluorescența probei în funcție de timp. Pentru aflarea intensității fluorescenței, I(t), la orice moment t, este necesar să se înregistreze profilul pulsului de lumină, IRF(t’), intensitatea fluorescenței fiind în acest caz:
unde s-a notat cu: I(t) – intensitatea fluorescenței, IRF(t’) – intensitatea corespunzătoare profilului pulsului de lumină generat de sursa de excitație, Ai – amplitudinea componentei, i, în număr de impulsuri, la momentul t = 0, τi – timpul de viață al componentei, i.
Fluorimetrele în pulsuri se bazează pe metoda numărării unui singur foton, metodă numită în continuare, TCSPC. Principiul metodei se bazează pe faptul că probabilitatea de detecție a unui singur foton, la un timp t, după pulsul de excitare, este proportională cu intensitatea fluorescenței la acel moment, t. După înregistrarea unui număr foarte mare de pulsuri (minim 105) rezultă curba (histograma) de scădere exponențială a numărului de pulsuri pentru timpi de înregistrare mai mari (Figura 2.7).
În fluorimetria cu modularea fazei, proba este excitată cu lumină în undă continuă modulată sinusoidal la frecvență înaltă. Astfel, răspunsul fluorescent al probei, este și el modulat la aceeași frecvență, dar cu întârziere de fază și parțial demodulat (amplitudine mai mică) în comparație cu faza și amplitudinea luminii care a excitat proba.
Alte tehnici utilizate în măsurarea fluorescenței
Odată cu evoluția tehnologică, măsurarea fluorescenței ”a migrat” de la măsurătorile efectuate în cuva spectrofluorimetrului, unde se poate analiza o populație foarte mare de fluorofori, către microscopie, unde analiza se poate face la nivel celular, sub-celular sau chiar la nivel de o singură moleculă.
Tehnicile de microscopie de fluorescență se împart în mai multe categorii:
Microscopia fluorescentă;
Microscopia confocală, care în plus față de microscopia de fluorescență are avantajul adăugarii axei z în imagini, obținându-se astfel conformații 3D ale specimenelor analizate;
Imagistica timpului de viață a fluorescenței (FLIM), tehnică în care se înregistrează variația timpilor de viață ai florescenței ai unuia sau mai multor flourofori, în funcție de modul în care aceștia interacționează cu specimenul analizat;
Microscopia de fluorescența cu excitare multifotonică;
Spectroscopia corelată de fluorescență – tehnică de măsurare la nivel de o singură moleculă;
Microscopia cu super-rezoluție, unde s-a reușit coborârea sub limita de difracție.
Alte două tehnici de măsurare, care utilizează fluorescența, sunt citometria în flux și rezonanța plasmonilor de suprafață.
AMP utilizate – caracteristici structurale și funcționale ale acestora
Introducere
Peptidele antimicrobiene (AMP) sunt o clasă aparte de proteine cu masa moleculară mică, cu compoziții diverse, produse de o gamă largă de organisme. Structura lor primară, caracterul amfipatic, sarcina netă și dimensiunile mici le permit acestora adsorbția și inserarea în bistratul lipidic, ducând la alterarea structurii acestuia prin diferite mecanisme de interacție (Yeaman și Yount, 2003; Brogden, 2005; Hale și Hancock, 2007; Mookherjee și Hancock, 2007).
Pentru investigarea modului de interacție a structurilor peptidice nou sintetizate cu potențial antimicrobian cu bistraul lipidic, se va face, în capitolele următoare, o comparație între acestea și trei peptide antimicrobiene, intens studiate în literatură, care prezintă mecanisme de interacție diferite: formare de pori toroidali transmembranari – Melitina (Yang și colab., 2001; Lee și colab., 2004), alterarea membranei citoplasmatice – Indolicidina (Subbalakshmi și Sitaram, 1998) și tapetarea stratului exterior al membranei (modelul de interacție “carpet-like”) – Cecropina P1 (Gazit și colab., 1995; Shai, 1995).
Melitina
Melitina este principala componentă toxică din veninul albinei europene (Apis mellifera), fiind o peptidă cationică, cu un puternic efect hemolitic (Habermann, 1972; Dempsey, 1990). Este o peptidă lineară formată din 26 de reziduuri de aminoacizi (GIGAVLKVLTTGLPALISWIKRKRQQ), cu două porțiuni cu proprietăți diferite. Structura 2D a Melitinei se poate observa în Figura 4.1. Prima porțiune, cu proprietăți preponderent hidrofobe, este reprezentată de reziduurile din capătul N-terminal (de la reziduul 1 la reziduul 20). Cealaltă porțiune, din capătul C-terminal, prezintă proprietăți hidrofile (de la reziduul 21 la reziduul 26), caracterul amfifil al Melitinei făcând-o solubilă în apă. În prezența membranelor lipidice (artificiale sau naturale) Melitina se asociază cu acestea (Dempsey, 1990; Sansom, 1991; Saberwal și Nagaraj, 1994).
Melitina are un caracter preponderent hidrofob, similar cu al altor peptide și proteine care prezintă afinitate ridicată pentru membranele lipidice. Melitina are sarcina netă +6|e| la pH fiziologic, patru dintre aceste sarcini, KRKR, fiind aliniate către capătul C-terminal, puternic bazic, iar celelalte două fiind poziționate către capătul N-terminal, K-7 și G-1. Distribuția asimetrică a aminoacizilor polari și apolari conferă Melitinei un caracter amfipatic, atunci când structura secundară a acesteia este α-helix (Dathe și Wieprecht, 1999). În soluții apoase, la concentrații mici, Melitina adoptă în soluție o structură de tip elice dezordonată (“random coil”) dar, sub influența unor factori fizico-chimici, aceasta adoptă o structură de tip α-helix, tetramerică (Dempsey, 1990).
În soluții apoase, monomerii de Melitină agregă într-o structură tetramerică în urma creșterii concentrației de sare din soluție, a pH-ului sau în urma creșterii concentrației peptidei. A fost demonstrat, prin intermediul spectroscopiei de fluorescență, ca Melitina se găsește sub formă monomerică în soluții cu salinitate scăzută (Quay și Condie, 1983; Raghuraman și Chattopadhyay, 2006). Tetramerizarea apare, la pH neutru, atunci când concentrația peptidei sau tăria ionică a soluției sunt mari (Faucon și colab., 1979; Talbot și colab., 1979; Raghuraman și Chattopadhyay, 2006). Trecerea de la monomer la tetramer a fost raportată pentru concentrații mici de peptidă în condiții de pH ridicat (Knoppel și colab., 1979), dar și ca fiind dependentă de temperatură (Wilcox și Eisenberg, 1992; Iwadate și colab., 1998). Agregarea (autoasocierea) Melitinei în soluții apoase este un fenomen complex și este direct corelată cu concentrația acesteia și prprietățile fizico-chimice ale soluției, care la rândul lor, au efect asupra interacțiilor hidrofobe, electrostatice și dipolare care apar la capătul N-terminal al Melitinei (Demchenko, 1988; Chattopadhyay, 2003; Geddes și Lakowicz, 2004; Raghuraman și Chattopadhyay, 2006).
Dimensiunile mici și disponibilitatea acesteia face ca Melitina să fie una dintre cele mai potrivite peptide pentru investigarea interacțiilor lipide-proteine la nivel molecular (Dempsey, 1990), utilizând o mare varietate de metode și tehnici de biofizică (Raghuraman și Chattopadhyay, 2007). Melitina se asociază rapid cu membranele formate din PC, în timpi de ordinul milisecundelor (Schwarz și Beschiaschvili, 1989; Sekharam și colab., 1991; Constantinescu și Lafleur, 2004), având un coeficient de partiție (KP), din faza apoasă în bistratul lipidic, de ⁓ 10-3 – 10-5 M-1 (Schwarz și Beschiaschvili, 1989; Beschiaschvili și Baeuerle, 1991; Mozsolits și colab., 2001; Kriech și Conboy, 2003).
În literatura de specialitate există numeroase studii în care este investigată interacția dintre Melitină și sisteme care mimează membrana lipidică (micelii, micelii inversate și lipozomi), toate acestea ducând la concluzia că Melitina adoptă o structură tip α-helix în prezența acestora (Dempsey și Butler, 1992; Weaver și colab., 1992; Bismuto și colab., 1993; Ghosh și colab., 1997; Ladokhin și White, 2001; Yang și colab., 2001; Raghuraman și Chattopadhyay, 2003; Raghuraman și Chattopadhyay, 2004a; Raghuraman și Chattopadhyay, 2004b; Raghuraman și Chattopadhyay, 2004c; Raghuraman și Chattopadhyay, 2006). Este recunoscut faptul că Melitina interacționează selectiv cu membranele (Ghosh și colab., 1997; Sheynis și colab., 2003), având o afinitate mult mai mare pentru lipidele care prezintă sarcini negative în zona capetelor polare (Batenburg și colab., 1988; Lee și colab., 2001).
Orientarea Melitinei în membrane este dependentă de concentrația ei în soluție, de compoziția lipidică și de condițiile fizice în care se află bistratul lipidic. La concentrații mici, petida este orientată paralel cu planul membranei, trecând la o orientare perpendiculară față de acesta odată cu creșterea concentrației, așa cum este explicat în modelul de acțiune în doi pași al peptidelor antimicrobiene (Huang, 2000). Orientarea α-helix-ului de Melitină este dependentă, deasemenea, și de alte proprietăți ale bistratului lipidic: hidratarea, temperatura și faza (gel sau cristal lichid) în care acesta se găsește (Vogel, 1987; Frey și Tamm, 1991; Toraya și colab., 2004). În anumite condiții de temperatură, pH, tăria ionică a soluției, compoziția lipidică și raportul lipde-peptide, Melitina inserată în bistrat formează agregate care duc la formarea porilor transmembranari (Raghuraman și Chattopadhyay, 2007).
Indolicidina
Indolicidina a fost izolată, prima oară, în 1992 din granulocitele citoplasmei neutrofilelor de bovină (Selsted și colab., 1992). Structura sa primară este deosebită (ILPWKWPWWPWRR), structura 2D a Indolicidinei putându-se observa în Figura 4.2, datorită compoziției sale: Triptofan (cinci reziduuri), Prolină (trei reziduuri) și Arginină (două reziduuri).
Sarcina netă a Indolicidinei la pH fiziologic este +4|e|, aceasta având un puternic caracter hidrofob, datorat în cea mai mare parte reziduurilor de Triptofan prezente în structura primară (Falla și colab., 1996). Acestea fac din Indolicidină un bun candidat la studierea interacțiilor peptidă-lipid, el interacționând cu un spectru mare de membrane cu diferite compoziții lipidice.
Atunci când Indolicidina se află liberă în soluție sau adsorbit la nivelul bistratului, structura secundară a acestuia este una dezordonată (Ladokhin și colab., 1997). Cele cinci reziduuri de Triptofan oferă posibilitatea explorării funcției îndeplinite de acest reziduu la inserarea proteinelor în membrane (Wimley și White, 1993).
Indolicidina se asociază atât cu membranele lipidice obținute din lipide neutre, cât și cu cele obținute din lipide anionice. Partiția peptidei în bistrat este puternică, dar reversibilă, pentru ambele tipuri de membrane (Ladokhin și colab., 1997). Atunci când peptida interacționează cu membrane obținute din lipide ce prezintă sarcini negative în zona capetelor polare (PG), spre deosebire de interacția cu cele obținute din lipide neutre (PC), spectrul de fluorescență al acesteia prezintă o deplasare mai mare către albastru, dar cu o eficiență cuantică mai mică. Aceste diferențe între spectrele de fluorescență pentru cele două tipuri de membrane se pot datora structurii pe care o adoptă Indolicidina atunci când interacționează cu acestea, a interacțiilor ce apar între lipide și peptidă sau o combinație a acestora (Ladokhin și colab., 1997).
Utilizând tehnica AFM s-a arătat că Indolicidina produce o subțiere a bistratului lipidic în regiunea de interacție (Mecke și colab., 2005; Shaw și colab., 2006; Shaw și colab., 2008). Aceste rezultate experimentale sunt în concordanță cu simulările de dinamică moleculară care s-au efectuat pentru interacția dintre Indolicidină și membranele lipidice model (Hsu și Yip, 2007; Khandelia și Kaznessis, 2007; Neale și colab., 2014).
Indolicidina are efect bacteriostatic și bactericid împotriva tulpinilor Gram-negative și Gram-pozitive (Selsted și colab., 1992; Shi și colab., 1996; Subbalakshmi și Sitaram, 1998; Bacalum și colab., 2017). Microorganismele tratate cu Indolicidină capătă o formă alungită, formă care sugerează faptul că acestea și-au pierdut capacitatea de diviziune celulară. În plus, bacteriile Escherichia coli tratate cu Indolicidină prezintă diverse structuri filamentoase la nivelul membranei (Shi și colab., 1996; Subbalakshmi și Sitaram, 1998). În concentrații de 100 µg/mL Indolicidina inhibă sinteza acizilor nucleici (ADN și ARN) în Escherichia coli, iar în concentrații > 150 µg/mL este afectat și mecanismul de sinteză proteică (Subbalakshmi și Sitaram, 1998). În concentrații mici, Indolicidina produce permeabilizarea membranei externe la Escherichia coli (Falla și colab., 1996; Subbalakshmi și colab., 1996) formând canale ionice, așa cum a reieșit din măsurătorile de conductanță efectuate pe bistraturi lipidice planare (Falla și colab., 1996; Wu și colab., 1999). Indolicidina prezintă, de asemenea, activitate antifungică (Ahmad și colab., 1995) și vermicidă (Aley și colab., 1994).
Indolicidina este citotoxică pentru limfocitele T de șobolan și umane (Schluesener și colab., 1993), produce hemoliză (Ahmad și colab., 1995; Bacalum și colab., 2017) și prezintă activitate împotriva virusului HIV-1 (Robinson și colab., 1998).
Cecropina P1
Cecropina P1 este o peptidă antimicrobiană de origine animală, izolată din intestinul subțire al porcinelor (Lee și colab., 1989), fiind produsă de un vierme parazit A. suum. Familia Cecropinelor, din care face parte și Cecropina P1, sunt AMP încărcate pozitiv, ce permeabilizează membranele bacteriene. Structura primară a Cecropinei P1 este formată din 31 de resturi de aminoacizi (SWLSKTAKKLENSAKKRISEGIAIAIQGGPR, structura 2D a Cecropinei P1 putându-se observa în Figura 4.3).
Structura secundară adoptată de Cecropina P1 în soluții apoase, determinată prin tehnica 2D NMR, este de tip α-helix amfifil alungit, aproximativ pe toată lungimea moleculei (Sipos și colab., 1992). S-a propus, în urma studiilor de dinamică moleculară, că zona din peptidă care conține resturile de aminoacizi -SEG- poate fi o zonă flexibilă a acesteia, capătul C-terminal având caracter hidrofob și cel N-terminal fiind puternic încărcat electric (Gazit și Shai, 1993; Gazit și colab., 1994a; Gazit și colab., 1995).
Cecropina P1 are sarcina netă +5|e|, și prezintă afinitate pentru membranele lipidice cu caracter acid. La interacția cu membranele lipidice artificiale, această peptidă formează un monostrat care, la atingerea unei concentrații limită, afectează împachetarea laterală a lipidelor (Gazit și colab., 1994b; Gazit și colab., 1995). Datele obținute pentru interacția Cecropinei P1 cu diverse tipuri de membrane lipidice (Gazit și colab., 1995) sugerează că aceasta respectă mecanismul de interacție “carpet-like”, asemănător cu cel propus pentru o altă peptidă antimicrobiană, Dermaseptina (Pouny și colab., 1992). Acest mecanism de interacție are loc în patru etape: (i) monomerii de peptidă se leagă preferențial la capetele polare ale lipidelor ce prezintă sarcină negativă, (ii) alinierea monomerilor de peptidă la suprafața membranei, cu porțiunile amfipatice ale α-helix-ului, reziduurile cu caracter bazic, interacționând cu capetele încărcate ale lipidelor sau cu moleculele de apă, (iii) reorientarea (rotirea) moleculei, astfel încât reziduurile hidrofobe ajung în zona hidrofobă a bistratului lipidic și (iv) dezintegrarea unor porțiuni de membrană care apar datorită afectării împachetării laterale a lipidelor.
Cecropina P1, la fel ca cecropinele izolate din insecte, produce liza peretelui celular al bacteriilor, în funcție de concentrația peptidei (Westerhoff și colab., 1989; Boman și colab., 1993; Matsuzaki și colab., 1994). Această AMP are efect bactericid asupra tulpinilor E. coli D21, Bacillus megaterium Bml1, Acinetobacter calcoaceticus Acl1 și Pseudomonas aeruginosa OT97 (Gazit și colab., 1995).
Cecropina P1 a prezentat și activitate antivirală, la teste desfășurate in vitro, împotriva virusului necrozei hematopoietice infecțioase, a virusului septicemiei hemoragice virale, a virusului necrozei pancreatice infecțioase (Chiou și colab., 2002; Chiou și colab., 2014) și a virusului care produce sindromul respirator și reproductiv la porcine (Guo și colab., 2014).
Structurile peptidice atimicrobiene nou sintetizate
Structurile peptidice nou sintetizate (P1 – P8, Tabelul 4.1 (Bacalum și colab., 2017)) au avut ca punct de plecare peptida Octa 2 (RRWWRWWR), o peptidă cu un puternic efect antimicrobian, bogată în succesiunea de reziduuri -RW- (Strom și colab., 2002). Ca structură de pornire s-a utilizat o formă modificată a Octa 2 (P5: RRWWRWWRR), adăugându-se în capătul C-terminal al acesteia încă un reziduu de Arginină, pentru creșterea afinității acesteia pentru membrane (Deslouches și colab., 2013).
Modificând secvența lui P5, prin înlocuirea aminoacizilor Triptofan (W) sau Arginină (R) cu Histidină (H), au fost generate alte șapte structuri peptidice. Înlocuirea s-a făcut ținând cont de de influența asupra următorilor parametri: sarcina netă, care a variat între +4|e| și +6|e|, și numărul de reziduuri de Triptofan din structura primară, între 2 și 4 reziduuri. Astfel, s-au obținut structuri cu același număr de reziduuri de aminoacizi, dar cu diferite sarcini nete și număr diferit de reziduuri de Triptofan, rezultând în acest fel structuri cu hidrofobicitate diferită.
Pentru testa rezultatul înlocuirii reziduurilor W sau R cu H, pentru cele opt AMP au fost testate, in vitro, efectele bacteriostatice și bactericide asupra tulpinilor Gram-negative și Gram-pozitive, dar și citotoxicitatea împotriva celulelor mononucleare din sângele periferic cât și proprietățile hemolitice (Bacalum și colab., 2017).
Peptidele P1 – P8 au fost sintetizate folosind tehnica de sinteză pe suport solid, SPPS (Solid Phase Peptide Synthesis) (Chan și White, 1999), în cadrul Centrului de Chimie Organică Suopramoleculară și Organometalică, Grupul de Chimie Organică de la Universitatea Babeș-Bolyai, Cluj Napoca.
Materiale și metode
Prepararea soluției tampon fosfat salin
Pentru prepararea tamponului fosfat salin – PBS, s-au folosit următoarele substanțe, în cantitățile precizate în continuare:
Fosfat disodic (Na2HPO4·2H2O), m = 1.44 g;
Fosfat monopotasic (KH2PO4), m = 0.24 g;
Clorură de sodiu (NaCl), m = 8 g;
Clorura de potasiu (KCl), m = 0.2 g.
Substanțele precizate anterior se dizolvă în 900 mL apa ultrapură, pe o plită cu agitator magnetic. După dizolvare, se verifică pH-ul soluției astfel obținute, acesta trebuind sa fie în jur de 7.4. Se pot face mici ajustări ale pH-ului utilizând soluții concentrate de HCl (pentru a-l scădea) sau NaOH (pentru a-l crește). În final, se adaugă încă 100 mL de apa ultrapură.
PBS-ul astfel obținut are pH = 7.4, concentrația de fosfat de 10 mM, concentrația de NaCl de 137 mM și de KCl de 2.7 mM.
Prepararea soluțiilor stoc de substanțe fluorescente
Soluția stoc de Laurdan (Invitrogen/Molecular Probes, Eugene, OR, USA) a avut o concentrație de 100 µM, acesta fiind dizolvat în DMSO. Pentru experimentele din Capitolul 6, unde una dintre direcțiile experimentale a fost înregistrarea spectrelor de fluorescență ale Laurdanului în diverși solvenți, utilizând graficul din Figura 4.1, pentru solvenții imiscibili cu DMSO-ul, s-a utilizat o soluție stoc de Laurdan dizolvat în etanol, la aceeași concentrație cu aceea a soluției preparate în DMSO.
Pentru prepararea soluțiilor stoc de standarde de fluorescență au fost utilizate substanțele din Tabelul 4.1. Pentru dizolvarea NATA și L-Triptofan-ului s-a utilizat PBS. Indol-ul a fost dizolvat în apă iar PPO-ul și p-Terfenilul-ul au fost dizolvate în alcool etilic. Concentrațiile finale ale soluțiilor stoc se regăsesc în ultima coloană a tabelului următor.
Structurile chimice pentru substantele din Tabelul 5.1 se pot observa în Figura 5.2.
Prepararea soluțiilor stoc de peptide
Toate peptidele utilizate în cadrul experimentelor: Melitina, Cecropina P1, Indolicidin (Bachem, Budendorf, Switzerland) și P1 – P8 (Universitatea “Babeș-Bolyai”, Cluj Napoca), sub forma de pudră liofilizată, au fost dizolvate în PBS. Concentrațiile soluțiilor stoc de peptide au fost determinate spectrofotometric pe baza datelor din Tabelul 4.2, acestea regăsindu-se în ultima coloană a tabelului.
Prepararea veziculelor unilamelare
Lipidele utilizate la prepararea veziculelor unilamelare mari (LUV) folosite în cadrul experimentelor din această lucrare sunt: DOPC: 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfocolină (Sigma-Aldrich), PC13: 1,2-ditridecanoil-sn-glicero-3-fosfocolină, DMPC: 1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3- fosfocolină, DPPC: 1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfocolină, DSPC: 1,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfocolină (Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL, USA), DPPG: 1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-phospho-(1'-rac-glicerol) (Na+) (Sigma-Aldrich).
În experimentele în care s-a monitorizat fluorescența Laurdanului, pentru dezvoltarea modelului de analiză a spectrelor de fluorescență cu funcții asimetrice, s-au utilizat pentru prepararea LUV-urilor următoarele lipide: PC13, DMPC, DPPC și DSPC, concentrația finală a lipidelor în suspensia de lipozomi fiind de 50 µM.
În experimentele în care s-a monitorizat stingerea fluorescenței Triptofanului și modificările induse de AMP-uri la nivelul membranelor lipidice s-au utilizat pentru prepararea LUV-urilor următoarele lipide: DOPC și DOPC:DPPG, în raport molar 85:15, concentrația finală a lipidelor în suspensia de lipozomi fiind de 50 µM.
În experimentele în care s-au monitorizat modificările din spectrele de fluorescență ale Triptofanului, apărute în urma titrării soluției de peptidă cu fracții egale dintr-o soluție concentrată de lipozomi, au fost folosiți lipozomi preparați din DOPC și DOPC:DPPG, în raport molar 85:15, concentrați lipidică a suspensiei inițiale fiind de 12.5 mM.
Lipozomii (LUV) au fost preparați prin metoda extrudării, această metodă constând, pe scurt, din urătoarele operații:
– cantitatea necesară de lipide dizolvate în cloroform (12,5 mg/mL) a fost amestecată și uscată în flux de azot;
– filmul de lipide format a fost hidratat cu PBS, încălzit la o temperatură mai mare decât temperatura de tranziție a lipidelor – Tm și agitat puternic; în urma acestor operațiuni a rezultat o suspensie de lipozomi multilamelari (MLV);
– suspensia obținută a fost supusă la 5 cicluri de îngheț-dezgheț și apoi extrudată (20 de treceri), printr-un filtru de policarbonat cu dimensiunea porilor de 200 nm, într-un extruder standard (Avanti Polar Lipids, Alabastre, AL, USA); extrudarea s-a efectuat la o temperatură mai mare decât Tm.
În final, a rezultat o suspensie de lipozomi unilamelari (LUV), cu diametrele în jurul valorii de 200 nm.
Metode de spectroscopie utilizate
Pentru realizarea obiectivelor din prezenta lucrare, au fost utilizate trei tehnici de spectroscopie, frecvent folosite în experimentele de biofizică.
Spectroscopia de absorbție UV-VIS
Măsuratorile de spectroscopie de absorbție s-au efectuat utilizând un spectrofotometru UV-VIS-NIR, model Jasco V-770 (Jasco International Co., Ltd., Hachioji, Tokyo, Japan), echipat cu suport de cuve cu 6 poziții, cu termostat Peltier și agitator magnetic. Înregistrarea spectrelor de absorbție s-a făcut folosind cuve de quartz de 3 mL, cu dimensiunile laturilor de 10 mm x 10 mm, la o viteză de scanare de 200 nm/min, fanta monocromatorului fiind de 1 nm. Temperatura în cuvă a fost de 25 °C, suspensiile fiind în continuu agitate magnetic, la o viteză de rotație de 120 rot/min. Pentru toate spectrele înregistrate a fost aplicată corecția pentru linia de bază (baseline).
Experimentele de spectroscopie UV-VIS efectuate pentru realizarea obiectivelor prezentei lucrări au urmărit două direcții.
Pe de-o parte s-a monitorizat absorbanța soluțiilor stoc utilizate în cadrul experimentelor, în vederea determinării concentrației acestora, utilizând ecuația (6.1) și coeficienții de extincție molară din Tabelul 5.1, pentru standardele de fluorescență și din Tabelul 5.2, pentru soluțiile stoc de peptide și coeficientul molar de extincție al acrilamidei (ε = 0.23 M-1cm-1) la lungimea de undă λ = 295 nm (Eftink și Ghiron, 1976). Spectrele de absorbție au fost înregistrate în intervalul de lungimi de undă λabs ∈ [250, 500] nm.
Cealaltă direcție a măsurătorilor de spectroscopie UV-VIS a urmărit monitorizarea absorbanței suspensiilor de lipozomi simpli în intervalul de lungimi de undă λabs ∈ [350, 600] nm, pentru experimentele în care s-a analizat fluorescența Laurdanului, și a absorbanței lipozomilor aflați în prezența acrilamidei în intervalul de lungimi de undă λabs ∈ [250, 500] nm, pentru experimentele în care s-a analizat fluorescența Triptofanului. Pentru acest tip de experimente, s-a urmărit obținerea unei absorbanțe a suspensiilor < 0.05, în caz contrar fiind necesare corecții ale spectrelor de emisie fluorescentă pentru compensarea fenomenului de “inner-filter effect” (Lakowicz, 2006).
Spectroscopia de fluorescență statică
Înregistrările spectrelor de emisie fluorescentă s-au facut cu ajutorul unui fluorimetru FluoroMax 3 (Horiba Jobin Yvon, New Jersey, NJ, USA) echipat cu termostat cu element Peltier și agitator magnetic. Pentru măsurarea suspensiilor s-a folosit o cuvă de quartz de 3 mL, cu dimensiunile laturilor de 10 mm x 10 mm. Pentru fiecare înregistrare a fost aplicată spectrului de fluorescență corecția spectrală a fotomultiplicatorului.
În experimentele în care s-a monitorizat fluorescența Laurdanului, lungimea de undă de excitație a fost λex = 378 nm, iar spectrele de emisie au fost înregistrate în intervalul λem ∈ [400, 600] nm, fanta monocromatorului fiind de 3 nm (excitație/emisie). Contribuția spectrală a lipozomilor simpli a fost scăzută din fiecare spectru de emisie. Spectrele de emisie fluorescentă a Laurdanului inserat în lipozomi au fost înregistrate la diverse temperaturi, alese astfel încât să acopere plaja de temperaturi în care să se poată regăsi, separat, cele două faze ale bistratului lipidic (cel puțin trei repetiții pentru fiecare tip de lipid).
În experimentele în care s-a monitorizat stingerea fluorescenței triptofanului, lungimea de undă de excitație a fost λex = 295 nm, iar spectrele de emisie au fost înregistrate în intervalul λem ∈ [310, 500] nm, fanta monocromatorului fiind de 3 nm (excitație/emisie). Contribuția spectrală a lipozomilor simpli și a lipozomilor în prezența stingătorului (acrilamida) a fost scăzută din fiecare spectru de emisie.
În experimentele în care s-au monitorizat modificările din spectrele de fluorescență ale triptofanului, apărute în urma titrării soluției de peptidă cu fracții egale dintr-o soluție concentrată de lipozomi, lungimea de undă de excitație a fost λex = 285 nm, iar spectrele de emisie au fost înregistrate în intervalul λem ∈ [300, 500] nm, fanta monocromatorului fiind de 3 nm (excitație/emisie).
Spectroscopia de fluorescență rezolvată în timp
Măsurătorile de timp de viață a fluorescenței s-au făcut cu ajutorul unui spectrofluorimetru ”home made” construit în jurul unei plăci de achiziție TimeHarp 200 – TCSPC (PicoQuant, Germania). Toate componentele opto-mecanice au fost achiziționate de la Thorlabs (Thorlabs, Germania). Ca sursă de excitație a fost utilizat un LED cu funcționare în impulsuri, cu lungimea de undă λem = 280 nm și FWHM ≈ 600 ps, tip PLS 8-2-363 (PicoQuant, Germania), controlat de un generator de impulsuri, tip PDL 800-D, la o rată de repetiție a impulsurilor de 10 MHz (PicoQuant, Germania). Toate probele au fost măsurate într-o cuvă de cuarț de 10 mm x 10 mm, într-un suport de probă termostatat, echipat cu agitator magnetic. Termostatul Peltier, tip 5R7-001, cu interfață RS232 și software de control specializat, a fost achiziționat de la Oven Industries (Oven Industries, PA, SUA). Acest fluorimetru este, de asemenea, echipat cu prisme de polarizre Glan-Taylor (Thorlabs, Germania), detașabile, pentru a măsura fluorescența probelor la unghi magic și / sau anizotropia timpilor de viață a fluorescenței. Ca detector de fluorescență se utilizează un fotomultiplicator tip PMA 182-P-M (PicoQuant, Germania). Pe calea de emisie, spectrofluorimetrul are un schimbător automat de filtre cu 6 poziții. Filtrele uilizate în cadrul experimentelor efectuate au fost:
Filtre tip trece-bandă: XHQA330 (330 nm, FHWM 10 nm), XHQA340 (340 nm, FHWM 10 nm), XHQA350 (350 nm, FHWM 10 nm);
Filtru tip trece-sus: XUL0325 (UV 325 nm).
Pentru experimentele efectuate pentru calibrarea și verificarea spetrofluorimetrului, experimente în care s-au utilizat standardele de fluorescență precizate în subcapitolul 4.2, au fost utilizate toate cele patru filtre de emisie.
Pentru experimentele în care s-a monitorizat stingerea fluorescenței și partiționarea AMP în bistratul lipidic, s-a utilizat numai filtrul de emisie tip trece-sus.
Pentru înregistrarea profilului pulsului de lumină generat de sursa de extitație s-a înregistrat IRF-ul utilizând o soluție de dioxid de siliciu coloidal – LUDOX (Sigma-Aldrich), lumina împraștiată fiind colectată direct de fotomultiplicator (niciun filtru interpus pe calea de emisie).
Prelucrarea datelor
Spectrele de absorbție UV-VIS, spectrele de fluorescență statică și rezultatele obținute în urma prelucrării spectrelor de fluorescență rezolvată în timp au fost prelucrate și analizate utilizând pachetul software OriginPro 2016 (OriginLab Corporation, Northampton, MA, USA).
Pentru analiza spectrelor de fluorescență rezolvată în timp a fost utilizat pachetul software FluoFit (PicoQuant, Germania).
Pentru analiza spectrelor de fluorescență statică cu ajutorul funcțiilor asimetrice au fost folosite pachetele software Fityk 0.9.8 (http://fityk.nieto.pl) și MatLab R2016b (MathWorks, Natick, MA, USA).
Pentru generarea structurilor chimice a fost utilizat pachetul software ChemOffice 2015 (PerkinElmer, PerkinElmer Informatics, Inc.).
Realizarea și optimizarea funcționarii aranjamentului experimental pentru TRF
Introducere
Măsurătorile de fluorescență rezolvată în timp sunt, la momentul actual, larg utilizate în spectroscopia de fluorescență, atât în studiul macromoleculelor biologice cât și în imagistica celulară. Acest tip de măsurători oferă mai multe informații decât măsurătorile de fluorescență statică.
Rezultatele descrise în cadrul acestui capitol au fost prezentate la Conferința Națională de Biofizică – Cluj-Napoca, ediția 2016 și la Sesiunea Științifică Anuală a Facultații de Fizică, Universitatea din București – ediția 2017.
Importanța măsurării timpului de viață al fluorescenței
Să luăm în considerare, de exemplu, o proteină care conține două reziduuri laterale de Triptofan, fiecare cu timpi de viață diferiți. Datorită suprapunerii spectrelor de absorbție și emisie ale acestor reziduuri, obținute prin măsurători de fluorescență statică, nu este, în general, posibil să se facă o diferență între cele două reziduuri de triptofan legate de molecula studiată. Însă, folosind metoda de măsurare a timpilor de viață, rezultă că cele două reziduuri au timpi diferiți de scădere a fluorescenței, aceasta fiind o informație foarte utilă, ducând la înțelegerea modului cum interacționează cele două reziduuri de triptofan cu proteina dar și cu celelalte macromolecule din soluție (Lakowicz, 2006).
Situațiile în care măsurătorile de fluorescență rezolvată în timp oferă informații suplimentare față de cele de fluorescență statică sunt destul de numeroase. Unul dintre aceste cazuri este și acela când fluorescența rezolvată în timp face diferența dintre stingerea statică și stingerea dinamică a fluorescenței. Formarea de agregate în stare fundamentală nu micșorează timpul de viață al fluorescenței moleculelor rămase libere în soluție, fiind observată numai fluorescența acestora, în timp ce stingerea dinamică acționează asupra întregii populații de fluorofori aflați în stare excitată, ducând astfel la scăderea timpului mediu de viață.
Alte aplicații ale fluorescenței rezolvate în timp sunt studiul transferului rezonant de energie (FRET) și imagistica celulară de fluorescență cu rezolvare temporală (FLIM).
Aranjamentul experimental pentru TRF
La punerea în practică a aranjamentului experimental s-a plecat de la planul original al fluorimetrului FluoTime 100 (Figura 6.1), produs de firma germană PicoQuant, din două motive: primul, datorită faptului că majoritatea componentelor (generatorul de impulsuri și LED-urile folosite la excitare, fotomultiplicatorul folosit la detectarea fluorescenței, placa de captură, programul de înregistrare a spectrelor de scădere a fluorescenței și programul de prelucrare și analiză a spectrelor) au fost achiziționate de la firma mai sus menționată, și al doilea motiv, design-ul minimalist al fluorimetrului FluTime 100.
Conform cu cele expuse mai sus, aranjamentul experimental realizat se compune din:
– suport de cuplare a modulelor LED sau laser;
– sistem mobil (poate fi introdus în calea optică) de selectare a planului de polarizare a fasciculului de lumină de excitare;
– sistem optic fix pentru focalizarea fasciculului de lumină de excitare;
– compartimentul probei dotat cu agitator magnetic și termostat cu element Peltier, controlat prin intermediul unui software specializat;
– sistem optic fix pentru focalizarea pe detector a luminii produse în urma fluorescenței;
– sistem mobil (poate fi introdus în calea optică) de selectare a planului de polarizare a fasciculului de lumină de emisie;
– schimbător automat de filtre cu software de control specializat;
– detector (fotomultiplicator);
– placa de achiziție;
– program de achiziție a datelor (spectre care înregistrează scăderea în timp a fluorescenței);
– program de analiză a datelor (calculare a timpilor de viață ai fluorescenței).
În continuare, se va prezenta, pe scurt, fiecare componentă a instalației.
Accesoriile optice
Toate accesoriile optice, suportul de montare al sursei de lumină (LED sau laser), suporturile reglabile pentru montarea lentilelor și a prismelor de polarizare, tuburile de legătură, lentilele și prismele de polarizare, suporturile fixe pentru montarea pe compartimentul probei și compartimentul probei, schimbătorul automat de filtre au fost achiziționate de la firma specializată Thorlabs (www.thorlabs.de), fiind realizate din aluminiu brunat (anodizat).
Detectorul
Detectorul utilizat este un fotomultiplicator de tipul PMA 182 N/M, produs de PicoQuant, cu următoarele caracteristici:
– intervalul de lungimi de undă: 185 nm – 820 nm;
– impulsuri parazite (dark counts): < 900 cps;
– lățimea pulsului de ieșire pentru un singur electron: 1.5 ns;
– timpul de creștere/descreștere a impulsului de ieșire: 750 ps;
– polaritatea impulsului de ieșire: negativă;
– detectorul este dotat cu obturator comandat electronic, pentru calea optică, acesta fiind acționat la manevrarea capacului de la compartimentul probei.
Răspunsul spectral al fotomultiplicatorului (curba roșie – trasată ca eficiență de detecție în funcție de lungimea de undă), în comparație cu alte două tipuri de fotomultiplicatoare, poate fi observat în Figura 6.3.
Generatorul de pulsuri
Generatorul de pulsuri care comandă LED-urile și, în același timp, convertorul timp-amplitudine este de tipul PDL 800-D achiziționat de la PicoQuant.
Placa de achiziție și programul de achiziție a datelor
Placa de achiziție folosită este TimeHarp 200, care împreună cu programul de achiziție a datelor TimeHarp, formează un sistem complet de măsurare a timpului de viață al fluorescenței, la o rezolutie < 40 ps/canal.
Schema bloc a plăcii de achiziție și principiul de funcționare al acesteia sunt redate în Figura 6.4.
Măsurarea timpilor de viață a fluorescenței
Pentru verificarea funcționarii corecte a aranjamentului experimental și pentru calibrarea lui s-au folosit o serie de substanțe fluorescente, utilizate în mod curent ca standarde pentru măsurarea timpului de viață a fluorescenței (Lakowicz, 2006; Boens și colab., 2007).
Concentrațiile soluțiilor stoc au fost determinate spectrofotometric, utilizând formula Beer–Lambert:
unde: A – absorbanța optică a probei, ε – coeficientul molar de extincție la o lungime de undă dată, c – concentrația molară a cromoforului și l – drumul optic.
Pentru calibrarea aranjamentului experimental standardele au fost utilizate la concentrația finală de 10 µM. Temperatura de lucru a fost de 20° C, probele fiind măsurate cu agitare continuă. Pentru eliminarea din spectru a oricărui artefact datorat împrăștierii luminii în probă, a fost intercalată, pe calea optică de excitare, o prismă de polarizare, utilizată la o înclinare unghiulară de 35,3° față de direcția verticală (Valeur, 2001).
Măsurarea timpilor de viață din scăderea în timp a fluorescenței probei, se poate observa în Figura 5.5 – B, făcută după următorul protocol:
Probele au fost diluate de la concentrația inițială a soluțiilor stoc la concentrația de lucru de 10 µM;
Pentru fiecare înregistrare, s-a utilizat un volum de 3 mL;
Parametrii pentru înregistrarea fiecarui spectru au fost: nivelul discriminatorului: 50 mV, nivelul de trecere prin zero: 10 mV, nivelul de declanșare a intrării ”Sync”: -450 mV, rezoluția spectrului: 40 ps/canal;
Pentru fiecare fluorofor s-au înregistrat spectre la lungimile de undă: 330 nm, 340 nm, 350 nm și > 325 nm;
Pentru fiecare spectru, s-a înregistrat un maxim de 10.000 de impulsuri pentru canalul unde s-a înregistrat maximul fluorescenței.
Pentru fiecare set de experimente (zi de înregistrări) a fost înregistrată la începutul masurătorilor funcția de răspuns a instrumentului – IRF. Un astfel de spectru este exemplificat în Figura 6.5 – A.
Pentru verificarea ”sensibilității” aranjamentului experimental, am realizat un al doilea set de experimente (Kapusta, 2002; Wahl, 2014), în care concentrația probelor a fost variată între 1 µM și 500 µM (în pași de 1-2-3-5 µM, cu multiplii corespunzători), temperatura probelor fiind menținută constantă, la 25 °C.
Deoarece temperatura este unul dintre factorii care influențează emisia fluorescentă și, implicit, timpul de viață al fluorescenței, am imaginat și realizat un al treilea tip de experimente, în acest caz concentrația probelor fiind menținută constantă, la 10 µM, dar variind temperatura probei, în intervalul (10 – 40) °C, cu pas de 2.5 °C.
Având în vedere că unul dintre obiectivele urmărite în capitolele ce urmează este determinarea timpului mediu de viață al fluorescenței pentru Triptofan, aflat în structura pepidelor care fac obiectul experimentelor descrise în Capitolele 7, 10 și 11, în cadrul experimentelor din acest capitol, au fost înregistrate și analizate spectrele de scădere a fluorescenței pentru L-Triptofan, în aceleași condiții ca pentru standardele de fluorescență utilizate (setul al doilea și al treilea de experimente). Timpii de viață, analizați în cadrul acestui capitol, reprezintă timpul mediu de viață a fluorescenței L-Triptofanului, numeric egal cu suma ponderată după intensitățile individuale ale celor doi timpi de viață ai fluorescenței, și reprezintă timpul mediu cât stă fluoroforul în starea excitată.
Prelucrarea datelor experimentale
Spectrele experimentale de tipul celor exemplificate în Figura 5.5 au fost prelucrate utilizând pachetul software FluoFit v4.4 (PicoQuant, Germania), modelul utilizat fiind reconvoluția exponențială din ecuația (3.7) cu unul (în cazul standardelor) sau doi timpi de viață ai fluorescenței (în cazul L-Triptofan-ului).
Programul de analiză a datelor, fereastra principală a acestuia fiind redată în Figura 6.6, generează în urma procedurii de fitare timpul/timpii de viață al/ai fluorescenței, amplitudinea corespunzătoare fiecărui timp de viață rezultat, nivelul de semnal pentru linia de bază (baseline) corespunzătoare spectrelor IRF și obținut pentru substanța fluorescentă analizată.
În plus, față de parametrii amintiți mai sus, în raportul detaliat sunt generați și timpii medii de viață ai fluorescenței, ponderați după intensitatea și amplitudinea semnalului fluorescent înregistrat.
Un parametru important în procesul de fitare și în modul de analiză a datelor este χ2(red), ”hi-pătrat redus”, caseta din dreapta sus în Figura 6.6. Pe baza acestui parametru, se estimează calitatea fitării. O fitare bună generează un parametru χ2(red) cu valori cuprinse între 0,9 și 1,5 (valoarea ideală ≈1).
Timpii de viață ai fluorescenței pentru standardele utilizate se regăsesc în Tabelul 6.1. Rezultatele obținute reprezintă media a zece măsurători diferite, cu deviațiile standard aferente. Concentrația finală a soluțiilor analizate a fost de 10 µM și temperatura probei de 25 °C. Aceste valori sunt comparate cu datele disponibile din literatura de specialitate.
Rezultatele obținute în urma experimentelor pentru verificarea ”sensibilității” aranjamentului epxerimental se pot observa în Figura 6.7. Trebuie precizat că, pentru condițiile experimentale disponibile, nu s-a reușit obținerea unui spectru utilizabil (raportul între semnalul util și impulsurile datorate liniei de bază a fost extrem de mic) la prelucrarea datelor pentru emisia fluorescentă a PPO-ului, la lungimea de undă de 330 nm.
La stabilirea ”sensibilității” spectrofluorimetrului am utilizat soluții cu concentrații între 1 µM și 500 µM, în pași de 1-2-3-5 µM. Temperatura probei a fost de 25 °C. Aceste valori se regăsesc în Tabelul 6.2.
Studierea variației timpilor de viață ai fluorescenței în funcție de temperatura probei, a fost o consecință a faptului că, inițial, măsurătorile au fost efectuate la temperatura de 25 °C, rezultatele obținute fiind în mod repetat mai mari decât valorile disponibile în literatura de specialitate. Astfel, trecând la temperatura de lucru de 20 °C, după obținerea rezultatelor din Tabelul 6.1, am concluzionat că se poate realiza setul de experimente care să pună în evidență variația timpului de viață cu temperatura.
Rezultatele obținute în urma măsurării timpilor de viață ai fluorescenței, ca funcție de temperatură, sunt expuse în graficele din Figura 6.8.
Discuții
Așa cum am mai precizat într-un paragraf anterior, pentru calibrarea și verificarea aranjamentului experimental de măsurare a timpilor de viață ai fluorescenței, am utilizat patru fluorofori ce prezintă un singur timp de scădere exponențială a fluorescenței. Acești fluorofori sunt numiți în practică standarde pentru măsurarea timpului de viață al fluorescenței.
Dacă analizăm rezultatele din Tabelul 6.1, obținute în acest set de experimente, putem observa că timpii de viață sunt în concordanță cu rezultatele din literatură. Există mici diferențe între aceste rezultate și cele disponibile în literatură, dar acestea pot fi explicate după cum urmează:
Pentru Indol, valoarile obținute în experimente diferă față de prima valoare de referință datorită temperaturii de lucru, care nu este precizată, cel mai probabil fiind cu câteva grade mai mare de 20 °C și faptului că, în aceste experimente, s-a utilizat pe calea de excitare, o prismă pentru selectarea planului de polarizare a luminii; pentru valorile din referința a doua putem spune că rezultatele obținute se încadrează în această plajă de valori, cu precizarea că valorile din această referință sunt date pentru diferite condiții de măsură (temperatură, pH, compoziția solventului, etc.).
Pentru NATA, valorile diferă foarte puțin față de primele două valori de referință, cel mai probabil, datorită diferenței dintre compozițiile tamponului fosfat utilizat în experimente; de asemenea, penru a doua valoare de referință, se precizează faptul că măsurătorile au fost efectuate fără a utiliza prisme de polarizare în căile optice de excitare/emisie.
Pentru PPO și p-Terfenil, diferențele care apar între rezultatele experimentale și valorile de referință regăsite în literatură, sunt datorate în primul rând solvenților utilizați în timpul măsurătorilor; în experimentele din prezenta lucrare s-a utilizat etanol, spre deosebire de ciclohexan și metanol în lucrarea publicată în 2007 de Boens și colab.
Cu toate că L-Triptofan-ul nu este utilizat ca standard pentru timpul de viață al fluorescenței, acesta prezentând în practică, în funcție de sistemul analizat, doi timpi (Lakowicz, 2006; Gerken și Imhof, 2010) sau trei timpi (Lakowicz, 2006; Albani, 2009; Albani, 2014a; Albani, 2014b) de viață ai fluorescenței, am ales să compar rezultatele obținute cu valorile din literatură, deoarece în structura peptidelor studiate în capitolele următoare regăsim acest aminoacid. Dacă analizăm rezultatele obținute pentru primul tip de experimente, unde pentru L-Triptofan, se compară timpul de viață mediu obținut cu valorile disponibile în literatură, observăm că, cea mai mare diferență apare în situația în care emisia fluorescentă este colectată prin intermediul filtrului trece-sus (λem > 325 nm). Aceasta diferență apare deoarece filtrul permite ca toți fotonii emiși să ajungă la detector, această proprietate fiind utilizată în toate studiile din Capitolele 10 și 11.
Așa cum se poate observa din Figura 6.7, valorile timpilor de viață sunt distribuite uniform, pe toată plaja valorilor concentrațiilor, în jurul unei valori medii pentru toate lungimile de undă. De precizat că, pentru concentrații mari ale fluoroforului, în cazul PPO și p-Terfenil, apare fenomenul de auto-absorbție, acest fapt ducând la o creștere a timpului de viață al fluorescenței (Marrodan și colab., 2009).
Din analiza datelor experimentale corespunzătoare variației timpilor de viață ai fluorescenței în funcție de temperatură, reprezentate în graficele din Figura 6.8, a rezultat că timpul de viață al Indol-ului este cel mai afectat de creșterea temperaturii. Pentru ΔT = 30 °C, se observă o variație a timpului de viață, Δτ ≈ 3.1 ns. Aceasta variație este o indicație a creșterii numărului de interacții (ciocniri) dintre gruparea cromoforă și moleculele solventului, creștere datorată agitației moleculare, adică datorate creșterii temperaturii.
Așa cum se poate observa din graficele amintite mai sus, cu toate că și în cazul NATA și în cazul L-Triptofan-ului avem aceeași grupare cromoforă (i.e., inelul indolic), aceeași diferență de temperatură afectează, într-o mai mică măsură timpul de viață al fluorescenței (acest lucru rezultă din faptul că valoarea pantei graficelor pentru NATA și L-Triptofan este aproximativ jumătate din panta graficelor corespunzătoare Indol-ului și Δτ ≈ 1.5 ns pentru NATA, respectiv Δτ ≈ 1.8 ns pentru L-Triptofan). Acest fenomen se datorează faptului că, odată cu creșterea complexității moleculei, numărul de interacții dintre gruparea cromoforă și moleculele solventului scade.
Interesantă este comporatrea PPO-ului și p-Terfenil-ului, ale căror variații ale timpului de viață cu temperatura prezintă variații extrem de mici, în cazul p-Terfenil-ului având chiar o comportare diferită față de ceilalți fluorofori, în sensul că, pentru temperaturi mai mari timpul de viață crește. Acest comportament este o consecință directă a faptului că cei doi compuși, în afara utilizării lor ca standarde pentru măsurarea timpului de viață al fluorescenței, sunt utilizați ca scintilatori lichizi pentru detecția radiațiilor nucleare, atunci când sunt dizolvați în solvenți organici (Mobius și colab., 1993; Iwanowska și colab., 2012; Angelone și colab., 2014; Ye și colab., 2015; Mark și colab., 2016).
Concluzii parțiale
În cadrul activităților, descrise în acest capitol, am dezvoltat, conform obiectivelor urmărite, un aranjament experimental pentru măsurarea timpilor de viață ai fluorescenței. Spectrofluorimetrul a fost calibrat, din punct de vedere al alinierii tuturor componentelor opto-mecanice și apoi, verificat, utilizând standarde pentru măsurarea timpului de viață al fluorescenței. Rezultatele obținute în urma măsurătorilor sunt similare cu cele din literatura de specialitate.
Spectrofluorimetrul poate măsura timpi de viață ai fluorescenței într-o gamă largă a concentrațiilor (1 µM – 500 µM) fluoroforilor de interes: Indol-ul și derivații acestuia, NATA și L-Triptofan.
La punerea la punct a metodelor experimentale trebuie ținut cont de faptul că timpul de viață al fluorescenței este sensibil la proprietățile fizico-chimice ale mediului (solventului) și anume, la variațiile de temperatură, pH, salinitate a mediului etc.
Studiul interacției dintre AMP și membranele lipidice artificiale utilizând fluorescența rezolvată în timp
Introducere
Peptidele antimicrobiene – AMP, au fost găsite într-o mare varietate de organisme vii, fiind utilizate de caătre acestea fie în mod direct, pentru combaterea infecțiilor și a bolilor datorate diverșilor patogeni, fie ca imuno-modulatori care exercită diferite funcții în organismul gazdă.
Mecanismul exact prin care se produce interacția membrană lipidică – AMP este în continuare intens investigat, fiind pus permanent în dezbatere.
Studiile de biofizică, ce se axează pe înțelegerea structurii secundare a peptidelor în membrane, au arătat că multe dintre acestea prezintă o configurație de tip ”random coil” în soluție, dar formează o structură de tip ”α-helix” atunci când interacționează cu membranele fosfolipidice. Peptidele pot adopta diferite orientări față de bistratul lipidic: paralel, perpendicular sau oblic față de planul membranei (Ningsih și colab., 2012).
Rezultatele prezentate în cadrul acestui capitol au fost prezentate la Conferința Națională de Biofizică, Cluj-Napoca – ediția 2016.
Interacția dintre AMP și membranele lipidice formate din DOPC
În cadrul acestui studiu, am urmărit realizarea unei analize comparative, din punct de vedere al variației timpilor de viață ai fluorescenței, între Melitină, pe de-o parte și trei dintre peptidele nou sintetizate: P1 – din clasa celor cu trei reziduuri de Triptofan, P5 – considerată peptida de referință pentru grupul de opt peptide și P8 – din clasa celor cu patru reziduuri de Triptofan.
Ca referință, pentru timpii de viață analizați, am folosit rezultatele obținute pentru timpul de viață al fluorescenței pentru L-Triptofan, prezentat pe larg în capitolul anterior.
Concentrația finală a peptidelor uilizate în acest studiu a fost de 1 µM, iar a lipidelor (DOPC) din care au fost formați lipozomii a fost de 50 µM. Protocolul de măsurare a fost următorul:
Pentru măsurarea timpului de viață al fluorescenței pentru situația în care peptida s-a aflat în PBS, acesta a fost înregistrat la cinci temperaturi diferite în intervalul (10 – 50) °C;
Pentru măsurarea timpului de viață al fluorescenței, atunci când peptida s-a aflat în prezența lipozomilor, acesta a fost înregistrat în același interval de temperatură, în nouă puncte diferite;
Înainte de înregistrarea timpilor de viață ai fluorescenței amestecul peptidă-lipozomi a fost lăsat să se echilibreze timp de 30 min. la 25° C, la întuneric, cu agitare continuă.
Înregistrarea timpilor de viață, reprezentați in graficul anterior s-a făcut utilizând filtrul de emisie cu λ = 350 nm. Pentru fiecare înregistrare, proba a fost lăsată un timp de 10 min. la temperatura respectivă, pentru atingerea echilibrului termic.
Diferențele care apar între timpul de viață înregistrat pentru Melitină față de cel al L-Triptofanului, la o anumită temperatură, spre exemplu 20 °C, se datorează faptului că Melitina adoptă, atunci când se află în soluție, o configurație de tip ”random coil”, reziduul de Triptofan aflat în structura Melitinei fiind mai puțin accesibil moleculelor soluției tampon (Bello și colab., 1982).
Pentru celelalte trei peptide studiate, timpii de viață obținuți, mai mici decât ai L-Triptofanului, sunt o confirmare a faptului că, la nivelul reziduurilor de Triptofan, apar alte două interacții: pe de-o parte, timpul de viață este afectat de interacțiile fluorofor-fluorofor (Valeur, 2001; Lakowicz, 2006), așa numitul fenomen de auto-stingere (”self quenching”) și, pe de altă parte, de prezența reziduurilor de Histidină din structura acestor peptide (Chen și Barkley, 1998).
Discuții
Toate variațiile timpilor de viață obținuți, pentru situația în care peptidele au fost în prezența DOPC, comparate cu timpii de viață ai fluorescenței, obținuți pentru L-Triptofan, se pot observa în Figura 7.2.
Așa cum am mai precizat, Melitina adoptă în soluție, la concentrații mici, cum este și cazul experimentelor de față, o structura de tip ”random coil” dar, într-o mică fracție, o structură de tip α-helix (White și colab., 1998). Spre deosebire de această situație, atunci când soluția are tărie ionică mare, pH ridicat sau concentrația peptidei este suficient de mare, Melitina se auto-asociază într-o structură tetramerică de tip α-helix, ducând la formarea unui nucleu hidrofob al acestei structuri (Bello și colab., 1982; Dempsey, 1990; Raghuraman și Chattopadhyay, 2006; Raghuraman și Chattopadhyay, 2007). Același tip de structură, α-helix, formează și în situația în care se găsește legată la membrane de diverse compoziții lipidice (Dempsey, 1990; de Jongh și colab., 1994; Ghosh și colab., 1997; Raghuraman și Chattopadhyay, 2004b; Raghuraman și Chattopadhyay, 2004c; Raghuraman și Chattopadhyay, 2007) sau micelii (Raghuraman și Chattopadhyay, 2003; Raghuraman și Chattopadhyay, 2004a).
Dacă analizăm rezultatele obținute pentru Melitină, în prezența DOPC (Figura 7.2 – A), putem observa că, odată cu creșterea temperaturii la care se află proba, scăderea timpilor măsurați nu urmează aceeași tendință cu timpii măsurați în situația în care Melitina se află liberă în soluție, aceștia din urmă având același comportament cu timpii măsurați pentru L-Triptofan. Acest lucru se datorează faptului că membranele formate din DOPC, la temperaturi mai mari, devin mai fluide, α-helix-ul Melitinei reorientându-se mai în profunzimea nucleului hidrofob al bistratului, datorită hidrofobicității acestei peptide. Astfel, Triptofanul aflat în structura acesteia este mai puțin accesibil moleculelor solventului.
Rezultatele obținute pentru cele trei peptide, P1, P5 și P8, atunci când acestea se găsesc în prezența lipozomilor din DOPC, pun în evidență faptul că reziduurile de Triptofan din structura acestora se află localizate la nivelul suprafeței bistratului lipidic (Yau și colab., 1998). Acest lucru rezultă din comportamentul timpilor de viață, atunci când temperatura probei variază, timpii de viață corespunzători celor trei peptide urmând aceeași tendință cu aceea a L-Triptofanului, pentru ambele situații în care regăsim peptida liberă sau în prezența lipozomilor din DOPC. Deoarece timpii de viață ai fluorescenței sunt mai mari, în cazul măsurătorilor în prezența lipozomilor, avem o indicație directă a interacției care apare între peptidele studiate și bistratul lipidic, Triptofanul interacționând într-o mai mică măsură cu moleculele solventului.
Pe de altă parte, dacă facem o comparație între diferențele care apar, la oricare dintre temperaturile de lucru, între timpii de viață ai fluorescenței măsurați pentru cele trei peptide în prezența DOPC, putem face o corelație între valorile acestora și variațiile energiei libere Gibbs de partiționare din mediul hidrofil în mediul hidrofob, reprezentat de interfața membrană lipidică-solvent. Variațiile energiei libere de partiționare pentru cele trei peptide sunt: ΔGP1 = -2.71 kcal/mol, ΔGP5 = -5.52 kcal/mol și ΔGP8 = -5.22 kcal/mol, acestea fiind energii teoretice, calculate utilizând scala de hidrofobicitate Wimley-White, implementată în pachetul software MPEx (Bacalum și colab., 2017). În medalionul din dreapta figurii anterioare, sunt reprezentate valorile timpilor de viață ai fluorescenței, înregistrați la temperatura de 20 °C, în funcție de variația energiei libere Gibbs. Observam că există o dependență liniară între aceste valori, timpul de viață având valori mai mari pentru variații mai mici ale energiei libere Gibbs. Astfel, interacțiile mai puternice dintre peptidă și membrana lipidică pot fi puse în evidență cu ajutorul acestei tehnici de măsurare.
Concluzii parțiale
În cadrul experimentelor descrise în acest capitol, am arătat că se poate pune în evidență interacția dintre AMP și membranele lipidice, constituite din DOPC, măsurând timpii de viață ai fluorescenței Triptofanului, aflat în structura AMP-urilor.
De asemenea, am arătat că timpul de viață măsurat este în directă legătura cu numărul de reziduuri de Triptofan din structura AMP și variația energiei libere Gibbs.
În cazul Melitinei, creșterea temperaturii probei, atunci când aceasta se află în prezența lipozomilor din DOPC, duce la o mai bună inserare a acesteia în bistratul lipidic.
Pentru cele trei AMP-uri nou sintetizate: P1, P5 și P8, atunci când acestea se află în prezența lipozomilor din DOPC, creșterea temperaturii a dus la scăderea valorilor măsurate pentru timpul de viață, acestea având același comportament ca în situația în care peptidele s-au aflat doar în soluția de tampon fosfat salin. Acest comporatment este o indicație a faptului că reziduurile de Triptofan sunt localizate la interfața membrană lipidică-solvent, fiind parțial expuse moleculelor acestuia (solventului).
Evaluarea fluiditații membranelor lipidice utilizand fluorescența Laurdanului folosind modelul de analiză cu funcții asimetrice
Introducere
Descompunerea spectrelor complexe de fluorescență este o problemă esențială în spectroscopia analitică. Forma spectrelor de fluorescență este dată de prezența în soluție a mai multor fluorofori, care emit la lungimi de undă diferite, sau a aceluiași fluorofor prezent în diferite stări electronice excitate. Spectrele de emisie ale fluoroforilor au o forma asimetrică, chiar și în soluții omogene, unde se presupune că există o singură populație de molecule care emite. Acest fapt se datorează diferențelor dintre nivelurile vibraționale ale stării fundamentale și ale primei stări excitate (Valeur, 2001). Soluția pentru analiza acestui tip de spectre este descompunerea lor în peak-uri elementare de emisie.
În literatura de specialitate, au fost propuse câteva modele de analiză a spectrelor, cel mai des utilizat fiind cel cu funcții Gauss și Lorentz, datorită simetriei, dar au fost propuse și modele care utilizează funcții asimetrice. Burstein și colaboratorii (2001) au dezvoltat o procedură de analiză a spectrelor de fluorescență (Burstein și Emelyanenko, 1996), pentru o clasă largă de fluorofori, procedură ce utilizează funcții asimetrice, de tip log-normal (LN), reprezentate în scala numerelor de undă (Siano și Metzler, 1969). În particular, acest grup a dezvoltat un algoritm extrem de robust pentru analiza spectrelor de fluorescență ale Triptofanului din structura proteinelor (Burstein și colab., 2001). Acest procedeu de analiză a fost extins, de același grup, și pentru Prodan și Acrilodan (Emelyanenko și colab., 2000).
În acest capitol, este prezentat algoritmul de descompunere a spectrelor de fluorescență statică a Laurdanului utilizând funcții de tip LN și aplicațiile acestui algoritm pentru evaluarea gradului de fluiditate a membranelor lipidice model constituite din diverse tipuri de lipide.
Rezultatele prezentate în cadrul acestui capitol au fost prezentate la: Conferința Națională de Biofizică, Iași – ediția 2013, Sesiunea de Comunicari Științifice a tinerilor cercetatori din IFIN-HH – ediția 2013, Conferința ”Analytical and Nanoanalytical Methods for Biomedical and Environmental Sciences” – IC-ANMBES 2014 și la Sesiunea Științifică Anuală a Facultații de Fizică, Universitatea din București – ediția 2014. De asemenea, rezultatele obținute au constituit subiectele a trei articole științifice, publicate în revistele: Optoelectronics and Advanced Materials – Rapid Communications, Analytical Biochemistry și Romanian Reports in Physics.
Proprietățile Laurdanului inserat în membrane lipidice.
Fluoroforul solvatocromic Laurdan este intens folosit în experimentele care analizează proprietățile membranelor biologice și artificiale (Parasassi și colab., 1991; Bagatolli și colab., 1999; Emelyanenko și colab., 2000; Bagatolli, 2006). Coada alifatică, așa cum se observă din Figura 3.5, formată din 12 atomi de C, îi facilitează acestuia inserarea în membrana lipidică, considerându-se, în general, că inelul naftalenic ramâne localizat la nivelul glicerolului din structura lipidelor (Bagatolli, 2006; Jurkiewicz și colab., 2006), cu momemntul electric de dipol orientat perpendicular pe planul membranei (Bagatolli și colab., 1999; Bagatolli, 2006; Sanchez și colab., 2007). Proprietățile fluorescente ale Laurdanului depind de relaxarea moleculelor polare ale solventului, atunci când acestea se găsesc în proximitatea fluoroforului aflat în stare excitată (Jurkiewicz și colab., 2012). Atunci când acesta este inserat în membranele lipidice, relaxarea se datorează moleculelor de apă care pot penetra membrana, numărul acestora depinzând de faza în care se găsesc lipidele membranare (Parasassi și colab., 1998; Sanchez și colab., 2007). În acest fel, faza lipidelor membranare (gel și/sau cristal lichid) poate fi evaluată utilizând fluorescența Lurdanului (Parasassi și colab., 1990a).
Ținând cont de cele expuse anterior, pentru o membrană cu un grad ridicat de împachetare a lipidelor (aflată în starea de gel), în jurul inelului naftalenic al Laurdanului, regăsim un numaăr mic de molecule de apă, ducând astfel la o relaxare dipolară mică. Pentru o membrană cu un grad scăzut de împachetare a lipidelor, aflată în starea de cristal lichid, vom regăsi un număr mult mai mare de molecule de apă care pot penetra bistratul până la nivelul glicerolului din structura lipidelor, acolo unde este localizată gruparea cromoforă a Laurdanului (Parasassi și colab., 1998; Sanchez și colab., 2007). Acest fapt se poate observa foarte ușor din deplasarea spre roșu care apare în spectrul de fluorescență al Laurdanului, care pornește de la aproximativ 440 nm, pentru starea de gel a bistratului și ajunge în jurul valorii de 490 nm, pentru starea fluidă a acestuia (Bagatolli și Gratton, 2000; Bagatolli, 2006; Sanchez și colab., 2007).
Utilizând intensitățile fluorescenței Laurdanului la 440 nm (IB) și 490 nm (IG), se poate defini așa numita polarizare generalizată – GP (Parasassi și colab., 1990a):
Teoretic, valorile GP pot varia în soluții omogene, utilizând solvenți care să acopere o gamă largă de valori ale polarității (de la ciclohexan, apolar, până la alcooli, extrem de polari), între +1 (niciun efect al solventului) până la -1 (efect puternic al polarității solvntului) (Parasassi și colab., 1991). Experimental, s-a arătat, prin intermediul tehnicilor de spectroscopie (Parasassi și colab., 1990a; Parasassi și colab., 1991; Parasassi și colab., 1994; Parasassi și colab., 1998) sau de microscopie (Yu și colab., 1996; Bagatolli și Gratton, 2000; Kubiak și colab., 2011; Sanchez și colab., 2011; Owen și colab., 2012), că valorile efective ale GP se încadrează între +0.6 și -0.4. Valorile extreme ale GP nu sunt atinse tocmai datorită suprapunerii spectrale a benzilor de emisie ce corespund celor două stări de relaxare ale Laurdanului inserat în bistratul lipidic.
Cu toate acestea, dacă în locul intensităților de la 440 nm și 490 nm se folosește numărul de molecule fluorescente, corespunzător fiecărei stări, se poate obține un parametru care să definească, mult mai precis, sistemul analizat. Aceste informații se obțin din descompunerea spectrelor de fluorescență ale Laurdanului în două peak-uri elementare, corespunzătoare fiecărei stări energetice a fluoroforului. Descompunerea spectrelor se face, de obicei, utilizând funcții de tip Gauss (De Vequi-Suplicy și colab., 2006; Lucio și colab., 2010; Ionescu și Ganea, 2012).
În continuare, este descris modelul matematic și modul de obținere al parametrilor de formă, utilizați în acest model, folosind modelul propus de Emelyanenko (Emelyanenko și colab., 2000) și adoptat de noi pentru analiza spectrelor complexe ale Laurdanului.
Obținerea parametrilor de formă utilizați în modelul matematic cu funcții LN
Așa cum a fost demonstrat de către Siano și Metzler, analiza cu funcții LN cu patru parametri descrie, mult mai exact, forma spectrelor de absorbție ale derivaților hidroxipiridinei, față de situația în care acestea sunt analizate cu funcții Gauss (Siano și Metzler, 1969). Modelul matematic prezentat în continuare, utilizează funcții LN, cu intensitatea fluorescenței reprezentată în scala numerelor de undă (Figura 8.1), model propus anterior pentru descrierea spectrelor de emisie a fluoroforilor organici (Burstein și Emelyanenko, 1996):
unde I este intensitatea emisiei fluorescente, Im este intensitatea maximă, este numărul de undă, este poziția intensității maxime, este asimetria spectrului ( și reprezintă numerele de undă corespunzătoare FWHM) și a reprezintă punctul limită al funcției, dat de expresia: .
Spectrele de emisie fluorecentă ale Laurdanului, în soluții omogene, au fost înregistrate pentru solvenții din Tabelul 8.1. Parametrii de formă, , și , au fost determinați printr-o procedură de fitare neliniară, utilizând pachetul software Fityk 0.9.8 (http://fityk.nieto.pl).
Laurdanul a fost dizolvat în DMSO sau, pentru solvenții imiscibili cu DMSO, s-a utilizat Laurdan dizolvat în etanol. Toți solvenții utilizați au avut puritate spectroscopică. Concentrația finală a Laurdanului, în soluțiile omogene, a fost de 1 µM.
Spectrele de emisie au fost corectate, în timpul înregistrărilor, cu sensibilitatea spectrală a fotomultiplicatorului și, înainte de prelucrarea datelor, din valorile obținute, au fost scăzute valorile datorate împrăștierii Raman pe moleculele solventului, pentru fiecare din solvenții utilizați.
Ipoteza de lucru în aceste experimente este bazată pe faptul că în soluții omogene, există doar o singură specie de molecule de fluorofor care emite. Această presupunere a fost utilizată și în alte studii care au avut în vedere emisia Laurdanului și Prodanului în solvenți puri (Kawski și colab., 2000; Moyano și colab., 2006). În orice caz, există câteva studii care avansează ipoteza că Laurdanul, chiar în solvenți puri, prezintă un spectru de emisie complex, dar majoritatea acestor studii sunt efectuate în soluții extrem de vâscoase: glicerol (Kozyra și colab., 2003) și uleiuri Primol/Marcol (Viard și colab., 1997) sau la temperaturi foarte scăzute în etanol utilizat pe intervalul de temperaturi -108 °C până la +25 °C (Vincent și colab., 2005).
Pentru a găsi o corelație între forma spectrelor de fluorescență și polaritatea mediului în care Laurdanul se află, formă ce dictează valorile parametrilor de formă, am înregistrat spectrele de emisie fluorescentă a Laurdanului în solvenții din Tabelul 8.1.
Câteva exemple de spectre înregistrate în soluții omogene, care acoperă toată gama polarității solvenților (apolari, polari aprotici și polari protici) sunt prezentate în Figura 8.2 – A. Din aceste spectre, ies în evidență două aspecte:
Spectrele de emisie, pentru toată gama solvenților, au formă asimetrică;
Poziția spectrelor de emisie este puternic afectată de polaritatea solventului, acestea deplasându-se către zona de roșu, odată cu creșterea polarității solventului.
Forma spectrelor de emisie fluorescentă a Laurdanului este evident asimetrică, asimetria – ρ având o ușoară tendință de scădere, în timp ce polaritatea solventului crește (Tabelul 8.1). Spectrele de emisie au fost fitate foarte bine cu funcția LN, ecuația (8.2), după cum se poate observa în Figura 8.2 – B, C și D, reziduurile rezultate în urma analizei având valori mai mici de 2 % pentru toți solvenții (Tabelul 8.1).
Deplasarea spre roșu a spectrelor de fluorescență ale Laurdanului este în strânsă legătură cu
polaritatea solventului, datorită proprietăților solvatocromice ale acestuia. Poziția în spectru a maximului de emisie, , depinde de polaritatea solventului, exprimată în scala ET(30), după o relație liniară, după cum se poate observa în Figura 8.3. Există în literatura de specialitate câteva studii referitoare la dependența spectrelor de fluorescență ale Laurdanului de polaritatea
solventului (Kawski și colab., 2000; Morozova și colab., 2011), iar rezultatele obținute în cadrul acestui studiu sunt în concordanță cu acestea. Această dependență liniară permite interpretarea modificărilor ce apar în spectrele de emisie, direct în termenii de polaritatea mediului.
În Figura 8.4, limitele FWHM, și , sunt reprezentate în funcție de poziția maximului spectrului de emisie. Aceste valori prezintă o dependență liniară și, în urma fitării, se
obțin relațiile între acești parametri, relații care condiționează forma spectrelor.
Analizând în detaliu graficul din Figura 8.4, am observat că există o diferență între parametrii funcțiilor liniare corespunzătoare solvenților polari, respectiv apolari. Din această cauză
relațiile de constrângere a parametrilor de formă, ce definesc forma generală a spectrelor de emisie, au fost definite pentru cele două grupe de solvenți. Numărul de undă ce definește limita de separare
între cele două clase de solvenți, polari și apolari, a fost stabilit la valoarea de 22.300 cm-1. Relațiile liniare între parametrii de constrângere a formei spectrelor de emisie, obținuți în urma fitării graficelor, sunt detaliate în continuare.
pentru (grupa solvenților polari), respectiv:
pentru (grupa solvenților apolari).
Analiza spectrelor de fluorescență ale Laurdanului inserat în membrane lipidice
Spectrele de emisie fluorescentă a Laurdanului, inserat în membrane lipidice, au fost înregistrate între 1 °C și 70 °C, în funcție de tipul de lipide utilizate. Acestea au fost corectate pentru sensibilitatea spectrală a fotomultiplicatorului canalului de emisie al fluorimetrului și pentru artefactele datorate împraștierii și liniei Raman. Toate înregistrările au fost efectuate la valori ale absorbanței soluțiilor mai mici de 0.05, în acest fel nefiind necesare corecțiile pentru autoabsorbție (Lakowicz, 2006).
Înainte de fitarea spectrelor, toate spectrele de emisie au fost transformate în scala numerelor de undă utilizând relația , unde reprezintă intensitatea de emisie exprimată în funcție de numărul de undă, este intensitatea emisiei exprimată în funcție de lungimea de undă și este lungimea de undă (Valeur, 2001).
Emisia fluorescentă a Laurdanului a fost înregistrată în lipozomi preparați din C13, DPPC și DSPC, la temperaturi alese astfel încât, pentru cele trei tipuri de lipide, tranziția din starea de gel în starea de lichid cristalin să fie foarte bine pusă în evidență. Astfel, înregistrările pentru C13 au fost efectuate între 1 °C și 60 °C, pentru DPPC între 20 °C și 60 °C și pentru DSPC între 35 °C și 70 °C. Spectrele înregistrate pentru fiecare tip de lipid au fost normate la valorile înregistrate pentru prima temperatură, așa cum se poate observa în Figura 8.5.
Analizând familiile de curbe din Figura 8.5 se observă că, pentru toate cele trei lipide utilizate în cadrul acestui studiu, regăsim comportarea normală a emisiei fluorescente a moleculelor de Laurdan, și anume, maximul emisiei se deplasează de la 440 nm, atunci când regăsim lipidele în faza de gel, până la aproximativ 490 nm, atunci când acestea se află în faza de cristal-lichid.
Pentru a descrie contribuția celor două stări de relaxare în care putem găsi moleculele de Laurdan, corespunzătoare celor două stări ale bistratului lipidic, în spectrul final de emisie fluorescentă, am aplicat o procedură de deconvoluție, ca sumă a două funcții LN, ce se bazează pe ecuația (8.2) și cu constrângerile pentru forma finală a funcțiilor descrise pe larg în paragrafele anterioare (Burstein și colab., 2001; Bacalum și colab., 2013).
Pentru toate rezultatele experimentale s-a facut o comparație între deconvoluția cu funcții LN și Gauss. În Figura 8.6 se pot observa comparațiile între aceste două tipuri de deconvoluție, pentru spectrele de emisie a Laurdanului inserat în lipozomii preparați din DPPC, la trei temperaturi distincte: 20 °C graficele din A și D, 41 °C graficele din B și E, respectiv 60 °C graficele din C și F. Pentru spectrele din A, B și C s-au folosit funcții de tip LN, iar pentru cele din D, E și F funcții de tip Gauss.
Discuții
Așa cum am precizat într-un paragraf anterior, funcțiile LN sunt determinate de valorile a patru parametri: intensitatea maximă a emisiei fluorescente (Im) și trei care determină forma generală a spectrului (, și ). Considerând relațiile liniare între și și drept constrângeri, numărul variabilelor independente din ecuația (8.2) se reduce doar la două (intensitatea maximă a spectrului și poziția în spectru a acesteia). Acest lucru duce la realizarea unei metode de descompunere a spectrelor complexe de fluorescență, mult mai robuste și impune, în același timp, constrângeri legate de forma și poziția peak-urilor elementare în spectru, în relație directă cu valorile parametrilor (care constrâng forma peak-ului) și scala de polaritate.
Astfel, peak-urile elementare, care rezultă în urma descompunerii spectrelor de fluorescență, vor fi întotdeauna corelate cu polaritatea solventului, așa cum se poate observa din Figura 8.2, Figura 8.3 și Figura 8.4.
Dacă urmărim pozițiile celor două maxime ale peak-urilor rezultate în urma deconvoluției cu funcții de tip Gauss, se observă că acestea pleacă din jurul valorilor de 435 nm (pentru peak-ul albastru, corespunzător stării de gel a bistratului) și 465 nm (pentru peak-ul verde, corespunzător stării fluide a bistratului), ajungând la 425 nm și 490 nm, odată cu creșterea temperaturii, valorile obținute fiind în concordanță cu studiile anterioare (Yu și colab., 1996; Lucio și colab., 2010; Ionescu și Ganea, 2012). Chiar dacă aceste studii dau o explicație pentru modificarea poziției peak-ului verde, datorată creșterii numărului de molecule de apă care interacționează cu gruparea cromoforă a Laurdanului, niciunul dintre acestea nu explică scăderea care apare în cazul peak-ului corespunzător stării de gel. Această scădere nu poate fi susținută de explicații fizice, ea indicând faptul că, odată cu creșterea temperaturii, o parte din moleculele de Laurdan se află într-un mediu mai rigid, fiind în interacție cu un număr mai mic de molecule de apă. Utilizând metoda de analiză cu funcții de tip LN se poate analiza cu mai mare acuratețe nivelul de hidratare al bistratului lipidic, așa cum este el indicat de către moleculele de Laurdan.
Atunci când spectrele de emisie ale Laurdanului au fost analizate prin deconvoluție cu funcții de tip LN, cele două peak-uri rezultate în urma deconvoluției se găsesc poziționate în spectru, pentru toată gama de temperaturi utilizate și independent de tipul de lipide utilizate, în jurul valorilor de 440 nm și 490 nm. În Figura 8.7 sunt reprezentate pozițiile peak-urilor elementare obținute în urma deconvoluției spectrelor de emisie ale Laurdanului inserat în membrana lipozomilor preparați din DMPC. Rezultate asemănătoare s-au obținut și pentru celelate tipuri de lipozomi, preparați din C13, DPPC și DSPC.
La temperatura de 20 °C (Figura 8.6, A și D) regăsim lipidele în stare de gel (pentru DPPC, Tm este de 41 °C) și este de așteptat ca majoritatea moleculelor de Laurdan să emită din starea de relaxare dipolară corespunzătoare unei interacții reduse cu moleculele de apă. Din analiza cu funcții LN (Figura 8.6, A), aria peak-ului albastru, care se află la aproximativ 440 nm, este așa cum era de așteptat, și anume, mult mai mare decât aria peak-ului verde. În urma deconvoluției cu funcții Gauss, contrar așteptarilor, aria peak-ului verde este mai mare decât a celui albastru (Figura 8.6, D), acest fapt idicând că, deși bistratul se află în stare de gel, o fracție semnificatvă (> 50 %) de molecule de Laurdan emit din starea de relaxare dipolară corespunzătoare cazului de lichid cristalin a bistratului. Pentru spectrele înregistrate la temperatura de 41 °C (Figura 8.6, B și E), unde se presupune că cele două stări ale bistratului coexistă (Tokumasu și colab., 2002), am obținut, din deconvoluția cu funcții Gauss un peak verde mult mai intens decât cel albastru, spre deosebire de deconvoluția cu funcții LN, unde cele două peak-uri au aproximativ aceeași arie. Această tendință de variație a celor două peak-uri s-a obținut și pentru celelalte două tipuri de lipide utilizate. Pentru ultima condiție, atunci când temperatura probei a fost de 60 °C, prezentată în graficele din Figura 8.6, C și F, la această temperatură lipidele aflându-se în starea de lichid cristalin, se observă că pentru deconvoluția cu funcții Gauss, contribuția peak-ului albastru este nesemnificativă, contrar celor obținute la deconvoluția cu funcții LN, unde peak-ul albastru are o contribuție mult mai mare în spectrul de emisie.
Analizând evoluția ariilor celor două peak-uri obținute în urma deconvoluției cu funcții LN, se observă, pentru toate cazurile analizate, că la temperaturi mici contribuția preponderentă în spectrul de emisie se datorează peak-ului albasru. De asemenea, crescând temperatura, aria peak-ului albastru descrește și cea a peak-ului verde crește, devenind aproximativ egale în jurul temperaturii de tranziție. Crescând și mai mult temperatura, aria peak-ului verde devine predominantă în spectrul de emisie, cea a peak-ului albastru scăzând corespunzător. Aceste rezultate demonstrează faptul că și la temperaturi scăzute, atunci când bistratul lipidic se află în starea de gel, există o populație de molecule de Laurdan care emit din starea de relaxare dipolară corespunzătoare stării fluide a bistratului. Rezultatele sunt similare cu cele pentu LUV preparate din DMPC (Bacalum și colab., 2013), fiind o confirmare, în plus, a faptului că deconvoluția cu funcții LN a spectrelor de emisie a Laurdanului poate fi extinsă pentru diverse sisteme lipidice.
În Figura 8.8, sunt prezentate în detaliu valorile ariilor relative ale celor două peak-uri, pentru cele două metode de deconvoluție. Aria relativă a peak-ului din canalul albastru (SRB), pentru măsurătorile efectuate la cea mai mică temperatură, este ≈ 0.92 pentru lipozomii preparați din C13, ≈ 0.96 pentru cei preparați din DPPC și ≈ 0.97 pentru DSPC, scăzând odată cu creșterea temperaturii, valoarea acestei arii fiind de ≈ 0.25 pentru toate tipurile de lipide utilizate, atunci când bistratul lipidic se află în starea de lichid cristalin. Spre deosebire de rezultatele anterioare, obținute la deconvoluția cu funcții LN, la utilizarea funcțiilor Gauss în deconvoluții, aria relativă a peak-ului albastru pornește, întotdeauna, din jurul valorii de 0.35, pentru starea de gel a bistratului, și descrește aproape de 0, pentru starea fluidă a acestuia, indiferent de tipul de lipide utilizat. Aria relativă a peak-ului verde (SRG) are o variație în sens opus față de aria relativă a peak-ului albastru. Din graficele prezentate în Figura 8.7 se observă că ariile relative ale peak-urilor, obținute în urma deconvoluției cu funcții LN, au un punct de intersecție. În jurul acestei temperaturi, caracteristică fiecărui tip de lipid, se regăsesc cele două stări, de gel și de lichid cristalin, ale bistratului lipidic. În cazul deconvoluției cu funcții Gauss, aria relativă a peak-ului verde este mai mare decât cea a peak-ului albastru, pentru toată gama de temperaturi utilizate, sugerând faptul ca starea fluidă a bistratului este predominantă, chiar și pentru temperaturi mult mai mici decât Tm. Acest comportament este greu de integrat în modelele existente de hidratare a bistratului pe parcursul tranziției gel-fluid, așa cum am demonstrat pentru LUV preparate din DMPC (Bacalum și colab., 2013).
Pentru obținerea experimentală a Tm, curbele experimentale din Figura 8.8 se fitează cu funcția sigmoidală. Punctul, în care ariile corespunzătoare celor două populații de Laurdan devin egale, reprezintă temperatura la care cele două stări ale bistratului coexistă și un număr egal de molecule de Laurdan emit din cele două stări de relaxare dipolară, în condițiile experimentale date și presupunând că moleculele de Laurdan au aceeași eficiență cuantică pentru cele două stări ale bistratului. Astfel, s-au determinat valorile din Tabelul 8.3, pentru fiecare din lipidele utilizate în acest studiu.
Analizând mai în detaliu datele obținute în urma deconvolutiilor cu funcții LN, prezentate în Figura 8.7, se pot observa unele diferențe, alături de temperatura de tranziție, ce caracterizează lipidele utilizate în acest studiu: ariile relative ale peak-urilor corespunzătoare temperaturilor extreme și intervalul de temperatură în care are loc tranziția de fază a bistratului. Valorile acestor parametri se regasesc în Tabelul 8.2, în care, în plus față de lipidele utilizate în acest studiu, am adăugat și valorile pentru DMPC, obținute într-un studiu anterior (Bacalum și colab., 2013).
În primul rând, se poate observa o mică diferență între valorile SRB obținute pentru cele patru tipuri de LUV pentru cele mai mici valori ale temperaturilor de lucru. Aceste valori cresc monoton cu lungimea lanțurilor de acizi grași din compoziția lipidelor utilizate, acest fenomen fiind inexistent la cealaltă extremă a temperaturilor de lucru. Al doilea fenomen care se poate observa este scăderea intervalului de temperatură în care are loc tranziția de fază a lipidelor (obținut din fitarea valorilor SRB cu o funcție sigmoidală). Și acest parametru variază monoton cu lungimea lanțurilor de acizi grași din compoziția lipidelor utilizate.
Aceste efecte pot avea o explicație simplă dacă facem comparația între lungimea cozii hidrofobe a Laurdanului, formată din 12 atomi de carbon, și lungimile cozilor hidrofobe a lipidelor uilizate: DSPC-ul are 18 atomi de carbon, DPPC-ul are 16 atomi de carbon, DMPC-ul 14 atomi și C13, așa cum reiese și din prescurtare, are 13 atomi de carbon. Astfel, cu cât cozile hidrofobe ale lipidelor sunt mai lungi, cu atât mai mult moleculele de Laurdan sunt mai bine izolate în bistrat față de moleculele de apă, atunci când lipidele sunt în faza de gel. În mod contrar, atunci când bistratul se află în faza fluidă, moleculele de Laurdan au o comportare asemănătoare, indiferent de tipul lipidului din care este alcătuit bistratul. Diferențele datorate lungimii cozilor hidrofobe ale lipidelor apar și pentru zona temperaturilor de tranziție a bistratului. Astfel, pentru C13, zona temperaturii de tranziție și intervalul de valori în care are loc această tranziție, din starea de gel în starea de cristal lichid, este mult mai largă decât pentru DSPC, pentru care această zona are o variație mult mai bruscă (Figura 8.8). Un atsfel de efect nu poate fi pus în evidență prin metodele alternative (scanarea calorimetrică diferențială) utilizate pentru determinarea temperaturilor de tranziție a lipidelor (Xie și colab., 2010).
Utilizând valorile ariilor relative, corespunzătoare celor două peak-uri, se poate defini un nou parametru, asemanător GP, numeric egal cu diferența dintre cele două arii relative: ΔSR = SRB – SRG. Acest parametru descrie accesibilitatea moleculelor de Laurdan față de moleculele de apă, atunci când acesta se află inserat în bistratul lipidic, și depinde de fracțiile de fluorofor corespunzătoare celor doua faze ale acestuia, variind, teoretic, între +1 (emisie decât din starea nerelaxată) și -1 (emisie decât din starea relaxată). Valorile GP au fost calculate utilizând ecuația (8.1). În Figura 8.8 sunt reprezentați parametrii amintiți anterior, ΔSR și GP, pentru Laurdan inserat în lipozomi preparați din C13, DPPC și DSPC.
Parametrul ΔSR pornește de la valori mari, ≈ 0.85 pentru C13, ≈ 0.91 pentru DPPC și ≈ 0.95 pentru DSPC și scade până la ≈ – 0.5 pentru toate lipidele utilizate. Comparativ cu acesta, valorile GP sunt ≈ 0.44, ≈ 0.45 și, respectiv, ≈ 0.48, și scad până la ≈ – 0.4. Din valorile anterioare se observa că intervalul de variație al parametrului ΔSR este semnificativ mai mare decât intervalul de variație al GP. Intervalul de variație, mai mare, a valorilor parametrului ΔSR sugerează fapul că acesta este mult mai sensibil în detectarea și caracterizarea nivelului de hidratare în membranele lipidice.
Valorile GP calculate pentru lipozomii utilizați în acest studiu (Figura 8.9) sunt similare celor din literatura de specialitate (Bagatolli și colab., 1999).
Studii anterioare, efectuate pe lipozomi, au arătat că Tm pentru lipide poate fi determinată din dependența de temperatură a GP (Bagatolli și colab., 1999; Ionescu și Ganea, 2012). Astfel, în urma fitarii cu o funcție sigmoidală a graficelor prezentate în Figura 8.9, atât pentru ΔSR, cât și pentru GP, au fost obținute temperaturile de tranziție, Tm, pentru lipidele utilizate. Acestea (Tabelul 8.3) se corelează pentru cele două metode de analiză, ΔSR și GP, cât și cu datele din literatură (Koynova și Caffrey, 1998).
Am calculat, de asemenea, și raporul ariilor relative, SRG / SRB, obținute în urma celor două tipuri de deconvoluție, acest raport fiind un alt parametru utilizat în literatură (Ionescu și Ganea, 2012) pentru analiza modificărilor care apar în spectrele de fluorescență a Laurdanului. Variația acestor parametri, pentru toate lipidele utilizate, este reprezentată în Figura 8.10.
Concluzii parțiale
În cadrul experimentelor descrise în acest capitol, am pus la punct o nouă metodă de analiză a spectrelor de emisie fluorescentă a Laurdanului inserat în bistraturi lipidice. Această metodă are la bază un model de deconvoluție cu funcții de tip LN.
Pentru punerea la punct a metodei este necesar ca parametrii funcției de deconvoluție să fie calibrați în prealabil. Această calibrare se face utilizând spectrele de fluorescență a Laurdanului dizolvat întro gama largă de solvenți (cu diferite valori ale momentului de dipol electric). În urma calibrării parametrilor, am pus la punct modelul de deconvoluție cu funcții LN.
Validarea modelului s-a făcut utilizând spectrele de fluorescență a Laurdanului inserat în lipozomi preparați din trei tipuri distincte de lipide: C13, DPPC și DSPC. În urma deconvoluției au fost obținute câte două peak-uri distincte, corespunzătoare celor două stări ale bistratului lipidic.
Dependența de temperatură a ariilor relative ale celor două peak-uri obținute în urma deconvoluției, oferă o imagine mai realistă referioare la tranziția de fază a bistratului, atunci când această dependență este comparată cu cea obținută în urma analizei cu funcții Gauss.
Noul parametru propus pentru caracterizarea fluidității membranelor lipozomale, ΔSR, este mult mai sensibil cu privire la nivelul de hidratare al bistratului, așa cum este indicat de către Laurdan. Aria peak-ului corespunzător fazei de gel a bistratului și intervalul de temperatură în care are loc tranziția de fază sunt dependente de lungimea cozilor hidrofobe ale lipidelor.
Această metodă de analiză poate fi aplicată și sistemelor mult mai complexe (lipozomi preparați din mai multe specii de lipide, cu diverse proporții ale acestora, cu sau fară colesterol, membrane celulare, membrane bacteriene).
Efectul AMP asupra fluiditații membranelor lipidice model și membranelor celulare
Introducere
Modificările care apar în spectrul de emisie fluorescentă a Laurdanului sunt extrem de sensibile la gradul de hidratare și la faza în care se găsește bistratul lipidic (Parasassi și colab., 1998; Bagatolli, 2006). Metoda prezentată în capitolul anterior, care utilizează ariile relative ale peak-urilor elementare de emisie fluorescentă a Laurdanului, corespunzătoare celor două stări ale bistratului, s-a dovedit mai sensibilă decât analiza clasică ce utilizează parametrul GP (Bacalum și colab., 2013; Zorilă și colab., 2016). La fel ca în cazul GP (Parasassi și colab., 1990b; Parasassi și colab., 1998; Zhang și colab., 2006), creșterea valorii parametrului ΔSR este asociată cu un nivel mai ridicat de împachetare al lipidelor din componența bistratului, ceea ce duce la o scădere a numărului de molecule de apă de la interfața hidrofobă-hidrofilă, acolo unde se găsește porțiunea cromoforă a Laurdanului.
Rezultatele prezentate în cadrul acestui capitol au fost prezentate la Conferința Națională de Biofizică, București – ediția 2018 și stau la baza redactării unui articol științific, aflat în stadiul de manuscris, ce urmează să fie trimis spre publicare într-o revistă de specialitate.
Evaluarea efectului AMP asupra membranelor
Pentru evaluarea efectelor AMP asupra lipozomilor preparați din DOPC și din DOPC:DPPG, o suspensie, cu concentrația finală a lipidelor de 50 µM, în care s-a inserat Laurdan (concentrația finală 100 nM), a fost tratată cu peptida de interes, timp de 30 min. la întuneric, fiind agitată continuu. Concentrația finală a peptidei în suspensia de lipozomi a fost de 1 µM. Tratamentul cu peptidă s-a făcut în aceleași condiții ca acela cu Laurdan. Peptidele utilizate în acest studiu au fost: Melitina, Indolicidina și Cecropina P1.
Efectul acestor peptide asupra bistratului lipidic a fost evaluat înregistrând spectrele de fluorescență ale Laurdanului, în intervalul de temperatură 10 °C – 60 °C, cu pasul de 5 °C.
În Figura 9.1 este reprezentată variația parametrilor ΔSR (A) și SRG/SRB (B) pentru lipozomii preparați din DOPC, simpli și în prezența AMP.
În Figura 9.2 este reprezentată variația parametrilor ΔSR (A) și SRG/SRB (B) pentru lipozomii preparați din DOPC:DPPG, simpli și în prezența AMP.
Pentru evaluarea efectului AMP asupra membranelor externe ale bacteriilor Gram-negative am utilizat E. coli (ATCC 8739), tratate cu Laurdan, timp de 30 min. în întuneric, cu agitare continuă, concentrația de fluorofor fiind aceeași ca în experimentele cu lipozomi. După tratamentul cu Laurdan, a urmat tratamentul cu peptide (Melitină sau Indolicidină), în aceleași condiții ca la lipozomi. În Figura 9.3 sunt reprezentate rezultatele obținute în cadrul acestui set de experimente.
Pentru acest studiu am utilizat E. coli (ATCC 8739) (Microbiologics, SUA), aflate la nu mai mult de 4 pasaje fată de cultura de referință. Cultura a fost reanimată pe mediu Tryptic Soy Agar (TSA) (Merck, Germania), timp de 18 – 24 h, la 35 – 37 șC. După perioada de incubare, am realizat o suspensie bacteriană cu OD echivalent cu 106 UFC/mL. Un mililitru de suspensie a fost adăugat în 100 mL Tryptic Soy Broth (TSB) (Merck, Germania), proaspăt preparat, și incubat peste noapte la 35 – 37 șC, cu agitare la 200 rpm. Creșterea s-a realizat în aceste condiții pentru a asigura accesul în mod egal al celulelor la mediul de cultură și pentru a evita sedimentarea acestora (Bolshakova și colab., 2001). După perioada de incubare, suspensiile au fost centrifugate, la 5.000 g pentru 7 minute, agitate și spălate de două ori în PBS, apoi resuspendate în PSB și ajustate la OD echivalent cu 104 UFC/mL (Cui și colab., 2012).
Într-o altă serie de experimente, am urmărit cum este afectată fluiditatea bistratului de cantități crescătoare de peptidă (Melitină). LUV au fost preparate din DOPC și DOPC:Chol, în raport de 65:35. Același raport intre DOPC și colesterol s-a utilizat și la prepararea MLV. MLV au fost preparate după același protocol ca LUV, până în punctul (exclusiv) în care trebuia efectuată operația de îngheț-dezgheț. Concentrațiile lipidelor și Laurdanului au fost cele precizate în Capitolul 5, în care am descris materialele și metodele utilizate. Concentrațiile de peptidă au fost: 0.25 µM, 0.5 µM, 0.75 µM, 1 µM, 1.5 µM, 2 µM și 2.5 µM.
Discuții
În literatura de specialitate există numeroase studii în care se evaluează efectele factorilor fizici, chimici și biochimici asupra membranelor celulare și/sau artificiale (Polozov și colab., 1997; Granjon și colab., 2001; Chou și colab., 2010; Nielsen și Otzen, 2010; Cui și colab., 2012; Machan și colab., 2014; Bacalum și colab., 2017; Onate-Garzon și colab., 2017; Zorilă și colab., 2017; Hernández-Villa și colab., 2018; Man și colab., 2018).
În experimentele prezentate în cadrul acestui capitol am urmărit efectele AMP asupra membranelor lipidice model și membranelor biologice utilizând fluorescența Laurdanului.
Pentru tratamentul aplicat LUV preparate din DOPC, cu cele trei peptide, Melitina, Indolicidina și Cecropina P1, din Figura 9.1, se observă că, cea mai mică influență asupra fluidității bistratului a avut-o Cecropina P1. Astfel, pentru toată gama de temperaturi utilizate, aceasta nu a indus nici o modificare la nivelul fluidității membranare, valorile ΔSR și SRG/SRB fiind aproximativ identice cu cele din situația în care a fost evaluată fluiditatea lipozomilor simpli. Acest comporatment era de așteptat având în vedere modul de acțiune al acestei peptide, de tip “carpet-like” (Pouny și colab., 1992), concentrația la care s-a lucrat fiind insuficientă pentru afectarea împachetării laterale a lipidelor (Gazit și colab., 1994b; Gazit și colab., 1995). Efectul Melitinei s-a manifestat pentru toată gama de temperaturi de lucru, în urma interacției cu bistratul lipidic aceasta inducând o rigidizare a lui, valorile ΔSR fiind mai mari decât în cazul lipozomilor fără tratament aplicat. Efectul de rigidizare indus de Melitină se observă mai bine din variația parametrului SRG/SRB, care pentru temperaturi > 20 °C se diferențiază în mod evident de valorile lipozomilor simpli, ca urmare a modului de interacție a acestei peptide cu membranele formate din lipide neutre. Rigidizarea se manifestă și în cazul Indolicidinei, fiind mai evidentă la temperaturi > 30 °C, datorită modului de interacție a acestei peptide, reziduurile hidrofobe comportându-se ca niște puncte de ancorare pentru ea la suprafața bistratului. Odată cu creșterea temperaturii bistratul lipidic devine mai fluid, gradul de împachetare al lipidelor fiind mai scăzut. Astfel, reziduurile hidrofobe pătrund mai în profunzimea acestuia, ducând la o creștere aparentă a împachetaării.
Același comportament de modificare al fluidității membranare, la interacția cu Melitina și Indolicidina, l-am obținut și pentru situația în care LUV au fost preparate din DOPC:DPPG. Gradul de afectare a fluidității bistratului este, pentru cele două peptide, mai mare decât în cazul interacției acestora cu LUV formate din lipide neutre, probabil, datorită apariției interacțiilor de natură electrostatică, în plus față de interacțiile hidrofobe. Acest comportament era de așteptat, deoarece ambele peptide au afinitate mai mare pentru lipidele care prezintă sarcini negative în zona capetelor polare (Batenburg și colab., 1988; Ladokhin și colab., 1997; Lee și colab., 2001). În schimb, Cecropina P1 prezintă același comportament față de membranele formate din DOPC:DPPG, ca și în cazul DOPC, fluiditatea bistratului lipidic fiind identică cu cea din situația în care lipozomii s-au aflat singuri în soluție.
Pentru testarea efectelor AMP asupra membranei externe a bacteriilor E. coli, am ales să folosesc Melitina și Indolicidina. Valorile ΔSR obținute indică un grad de împachetare mult mai ridicat al lipidelor, datorat complexității care o au membranele biologice, față de cele din bistratul lipidic al lipozomilor. Efectele peptidelor asupra membranelor de E. coli se manifestă pentru tot intervalul temperaturilor studiate, fiind mai pronunțat la temperaturi < 25 °C.
Atunci când am titrat lipozomii cu concentrații crescătoare de Melitină, pentru toate cazurile studiate: LUV din DOPC, DOPC:Chol și MLV din DOPC:Chol, la ambele temperaturi de lucru, 15° C și 37° C, a apărut o saturare a valorilor parametrului ΔSR, diferența între această valoare și valoarea ΔSR fără tratament fiind dependentă de lipidele care intră în componența bistratului și de temperatura de lucru.
Concluzii parțiale
Rezultatele obținute în urma experimentelor desfășurate au indicat că împachetarea lipidelor, din membranele obținute artificial și a celor biologice, este afectată de interacția cu AMP. Gradul de afectare al împachetării lipidelor, raportat în cadrul acestor experimente de parametrul ΔSR, este dependent de combinația peptidă-lipide.
Complexitatea membranelor biologice, datorată constituenților, mult mai mare decât a celor artificiale, duce la un nivel de împachetare mai mare decât în cazul lipozomilor. Datorită complexității, aceste membrane sunt mai puțin afectate de interacția cu AMP.
Pe de altă parte, gradul de destabilizare a bistratului, în cazul membranelor artificiale, depinde de componentele constituente ale acestuia. Cu toate acestea, pentru interacția dintre o peptidă și lipozomi, există o concentrație limită a acesteia, peste care efectul destabilizator nu se mai manifestă.
Considerând că bistratul lipidic este prima componentă afectată de tratamentul cu AMP, această metodă de analiză poate fi utilizată, împreună cu alte tehnici de fluorescență, pentru evaluarea efectelor peptidelor antimicrobiene asupra membranelor biologice sau artificiale.
Evaluarea interacției AMP-membrană lipidică model utilizând stingerea fluorescenței Triptofanului
Introducere
Fenomenul de stingere a fluorescenței se referă la orice proces fizico-chimic ce duce la scăderea intensității fluorescenței unei probe. Există o mare varietate de interacții moleculare care duc la apariția fenomenului de stingere a fluorescenței. Aceste interacții includ reacțiile care apar în timpul stării excitate a fluoroforului, rearanjări ale structurii moleculare, transferul rezonant de energie între molecule, formarea de complexe moleculare în starea fundamentală și stingerea colizională a fluorescenței (Lakowicz, 2006).
Stingerea fluorescenței este intens studiată, pe de-o parte ca fenomen fundamental și pe de altă parte ca sursă de informații referitoare la interacțiile care apar la nivelul sistemelor biochimice. Există două tipuri de stingere: statică și dinamică, ambele tipuri implicând contactul molecular între moleculele de fluorofor și moleculele de stingător. În cazul stingerii colizionale, care este tot de tip dinamic, moleculele de stingător trebuie să intre în contact cu cele de fluorofor pe parcursul timpului de viață al stării excitate.
Rezultatele obținute în cadrul acestui capitol au fost prezentate parțial la Conferința ”Analytical and Nanoanalytical Methods for Biomedical and Environmental Sciences” – IC-ANMBES 2016.
Stingerea colizională a fluorescenței
Există o mare varietate de substanțe care se comportă ca stingători colizionali pentru fluorofori. Unul dintre cei mai cunoscuți stingători colizionali ai fluorescenței, care acționează aproape asupra tuturor fluoroforilor, este oxigenul molecular (Eftink și Ghiron, 1994). Atomii grei, iodul și bromul, sunt de asemenea, stingători ai fluorescenței. Fluorescența Indolului și a derivaților acestuia este afectată de Histidină, Cisteină, Cu2+, Pb2+, Cd2+ și Mn2+. În plus, fluorescența Indolului, Triptofanului și a derivaților acestora este stinsă de acrilamidă, succinimidă, dimetilformamidă, Eu3+, Ag+, Cs+ etc. (Eftink și Ghiron, 1976; Eftink și Ghiron, 1981; Eftink, 1991; Lakowicz, 2006).
Stingerea colizională a fluorescenței este descrisă de ecuația Stern-Volmer:
unde și sunt intensitătile fluorescenței, și sunt timpii de viață a fluorescenței în absența, respectiv în prezența stingătorului, reprezintă constanta bimoleculară, este timpul de viață al fluoroforului în absența stingătorului și reprezintă concentrația stingătorului. Din ecuația anterioară se observă că reprezintă constanta de stingere Stern-Volmer. Relația este valabilă doar pentru fluoroforii care prezintă un singur timp de scădere exponențială a fluorescenței (Lakowicz și Geddes, 2002). Pentru fluoroforii care prezintă mai mulți timpi de viață, așa cum este și în cazul de față pentru reziduurile de Triptofan din structura peptidelor, în ecuația (10.1) se vor folosi valorile timpului de viață mediu.
Datele obținute în urma experimentelor de stingere a fluorescenței sunt, în general, reprezentate ca în funcție de . Din panta acestui grafic se obține, în urma unei fitări liniare, constanta de stingere .
Utilizând valorile obținute pentru și timpii de viață ai fluorescenței măsurați în absența stingătorului se poate determina valoarea constantei bimoleculare, , valoare care este un indicator al eficienței stingerii sau al gradului de acesibilitate al stingătorului la moleculele de fluorofor.
Determinarea constantei de stingere Stern-Volmer pentru AMP
Măsurătorile de stingere a fluorescenței Triptofanului, utilizând ca stingător o soluție concentrată de acrilamidă, s-au efectuat utilizând peptidele (din Tabelul 5.2) la o concentrație finală de 1 µM. Lipozomii au fost preparați din DOPC și DOPC:DPPG, iar lipidele din care aceștia au fost preparați au avut o concentrație finală de 50 µM.
Pentru efectuarea măsurătorilor de stingere a fluorescenței, soluțiile în care au fost suspendate peptidele (PBS sau cele două tipuri de LUV) au fost lăsate în întuneric, la temperatura de 25° C, cu agitare continuă, timp de 30 min., pentru atingerea echilibrului. Soluției i-au fost înregistrate spectrele de fluorescență statică și rezolvată în timp. Din aceste spectre s-au obținut valorile corespunzătoare maximului intensității fluorescenței (F0) și timpului de viață mediu (), valori care s-au utilizat ulterior la prelucrarea datelor. Pentru stingerea fluorescenței s-a titrat o soluție concentrată de acrilamidă, având concentrația inițială de 10 M, în pași de 7.5 µL. Astfel, concentrația acrilamidei a fost incrementată în pași de 25 mM. După echilibrarea soluției timp de 15 min., au fost înregistrate spectrele de fluorescență statică și rezolvată în timp. Chiar dacă valorile timpilor de viață nu au fost utilizate la determinarea constantei de stingere, KSV, Triptofanul având doi timpi de viață, acestea au fost înregistrate pentru confirmarea tipului de stingere urmărit. În cazul unei stingeri pur dinamice, dependența () este liniară, cu panta graficului diferită de 0, spre deosebire de stingerea statică, unde fluoroforul și stingătorul formează un complex care nu mai emite fluorescent, în acest caz panta graficului fiind egală cu 0 (Chilom și colab., 2017). Pentru toate peptidele s-au obținut dependențe liniare între și , cu panta graficelor diferită de 0, confirmând astfel că stingerea fluorescenței în aceste experimente a fost una de tip colizional (stingere dinamică).
Constantele KSV, corespunzătoare fiecărei peptide, aflate în una dintre condițiile: în PBS, în amestec cu LUV preparați din DOPC sau din DOPC:DPPG, au fost obținute analizând familia de spectre de emisie fluorescentă (Figura 10.1) corespunzătoare fiecărui set de măsurători. Valorile obținute pentru KSV (Tabelul 10.1) reprezintă media a trei măsurători diferite.
În Figura 10.2 sunt reprezentate variațiile rapoartului , pentru Melitină, Indolicidină și Cecropina P1, în funcție de concentrația acrilamidei. Valorile reprezentate grafic în figura următoare reprezintă media a trei măsurători diferite. În această figură se observă o ușoară curbură a graficului, pentru Melitină și Indolicidină în prezența LUV preparate din DOPC:DPPG, la concentrații mari ale acrilamidei. Acest comportament apare când o fracție din reziduurile de Triptofan este mai puțin accesibilă moleculelor de stingător.
În Figura 10.3 sunt reprezentate variațiile rapoartului , pentru peptidele P1 – P8, în funcție de concentrația acrilamidei. Valorile reprezentate grafic în figura următoare reprezintă media a trei măsurători diferite. În final, toate rezultatele obținute, și , sunt prezentate în Tabelul 10.1.
Discuții
Rezultatele obținute în urma prelucrării datelor experimentale, prezentate în Tabelul 10.1, sunt reprezentate grafic în Figura 10.4.
Valorile obținute pentru KSV și kb, corespunzătoare Melitinei în PBS (16.56 ± 0.53 M-1 și 6.16 ± 0.20 M-1ns-1) și DOPC (2.57 ± 0.04 M-1 și 1.01 ± 0.02 M-1ns-1), sunt în concordanță cu valorile regăsite în literatură (Raghuraman și Chattopadhyay, 2004c; Raghuraman și Chattopadhyay, 2006). Interesantă este comportarea Melitinei în prezența LUV preparați din DOPC-DPPG. Utilizarea lipidelor anionice, DPPG (15 %), duce la o creștere de aproape două ori a valorilor KSV și kb obținute în aceast caz (4.64 ± 0.29 M-1 și 1.94 ± 0.12 M-1ns-1). Acest fapt se datorează structurii secundare pe care o adoptă Melitina atunci când se află adsorbită la nivelul bistratului lipidic, având de-o parte a α-helix-ului reziduurile hidrofobe și diametral opus reziduurile polare și cele cationice (Dathe și Wieprecht, 1999; Raghuraman și Chattopadhyay, 2007). Reorientarea Melitinei în LUV preparate din DOPC:DPPG se observă și din ușoara scădere a timpului mediu de viață al fluorescenței, τ0 = 2.40 ns ± 0.09 ns, spre deosebire de situația în care Melitina se află în prezența LUV preparate din DOPC, timpul de viață mediu al fluorescenței fiind în acest caz = 2.55 ns ± 0.08 ns. Prezența lipidelor anionice în structura bistratului duce la o orientare diferită a peptidei față de planul acestuia, în final, reziduul de Triptofan fiind mai expus mediului hidrofil și, implicit, moleculelor de stingător.
La fel ca în cazul Melitinei, interacția Indolicidinei cu cele două tipuri de membrane lipidice artificiale, preparate din DOPC și DOPC:DPPG, a dus la o scădere substanțială a valorilor KSV și kb, comparativ cu situația în care peptida s-a aflat suspendată doar în PBS. Astfel, în cazul DOPC am obținut valorile 3.33 ± 0.04 M-1 și 1.46 ± 0.02 M-1ns-1 pentru KSV și, respectiv, kb, iar în cazul DOPC:DPPG am obținut valorile 5.41 ± 0.15 M-1 și 2.34 ± 0.07 M-1ns-1 pentru KSV și, respectiv, kb. Dacă pentru KSV, în PBS s-au obținut valori apropiate pentru Melitină și Indolicidină (aceste valori sunt apropiate de valoarea KSV pentru Triptofan în PBS), diferențele dintre aceste două peptide o fac valorile obținute pentru constanta bimoleculară, kb. În cazul Indolicidinei în PBS aceasta are valoarea de 10.47 ± 0.12 M-1ns-1, comparativ cu valoarea de 6.16 ± 0.20 M-1ns-1 obținută pentru Melitină. Această diferență este o indicație a faptului că Triptofanul din structura Indolicidinei este mult mai accesibil moleculelor de acrilamidă. Același lucru este sugerat și de diferența care apare între timpii de viață corespunzători celor două peptide, în cazul în care acestea se află suspendate doar în PBS. Reorientarea reziduurilor de Triptofan din structura Indolicidinei, în prezența celor două tipuri de lipozomi, se observă și din creșterea timpilor de viață, corespunzători celor două situații, DOPC și DOPC:DPPG. Deși timpii de viață ai fluorescenței sunt aproximativ identici pentru cele două tipuri de LUV, diferența între modul în care Indolicidina interacționează cu aceste membrane o face valoarea constantei bimoleculare. În cazul DOPC:DPPG, utilizarea lipidelor anionice duce la o reorientare a peptidei relativ la planul membranei datorită interacțiilor de natură electrostatică, valoarea mai mare pentru constanta bimoleculară sugerând un grad mai mare de expunere al reziduurilor de Triptofan la mediul hidrofil, acestea interacționând mai mult cu acrilamida.
Pentru Cecropina P1 diferențele care apar între structura secundară a acestei peptide (α-helix alungit) și cele două discutate anterior, Melitina (structura tip “random coil”) și Indolicidina (structură dezordonată), sunt indicate de valorile obținute pentru KSV și kb. Valoarea kb, de 5.15 ± 0.07 M-1ns-1, cea mai mică dintre valorile obținute pentru cele cele trei peptide, când acestea se află în soluții apoase, este un indicator al faptului că reziduul Triptofan din structura acesteia este cel mai puțin accesibil moleculelor de acrilamidă. Modificarea conformației peptidei în prezența LUV preparate din DOPC se vede, pe de-o parte, din scăderea valorii kb, la 1.46 ± 0.02 M-1ns-1 și, pe de altă parte, prin creșterea timpului de viață al fluorescenței de la 1.75 ± 0.01 ns la 2.32 ± 0.07 ns, consecință a reorientării peptidei relativ la planul bistratului. Atunci când peptida se află în prezența LUV preparate din DOPC:DPPG, interacțiile între DPPG și reziduurile cationice prezente în structura acesteia, duc la o scădere a timpului de viață, la valoarea de 1.89 ± 0.02 ns și la creșterea constantei bimoleculare la o valoare dublă, 3.70 ± 0.08 M-1ns-1. Astfel, manifestarea interacțiilor electrostatice, în plus față de cele hidrofobe, care erau dominante în situația peptidei în prezența LUV preparate din DOPC, duce la adoptarea unei conformații diferite a peptidei, relativ la planul membranei lipidice, reziduul de Triptofan fiind mai expus mediului.
Pentru peptidele nou sintetizate, P1 – P8, se observă un comportament aproximativ identic, pentru cele trei situații analizate, PBS, cele mai mari valori ale kb, DOPC, valori “medii” ale kb, și DOPC:DPPG cele mai mici valori ale kb, excepție făcând P4, care în prezența LUV preparate din DOPC:DPPG are o valoare a kb, de 2.28 ± 0.07 M-1ns-1, mai mare decât în cazul în care se află în prezența LUV preparate din DOPC, kb având în această situație valoarea de 4.00 ± 0.04 M-1ns-1.
Dacă împărțim cele opt peptide în trei clase, în funcție de numărul reziduurilor de Triptofan prezente în structura primară a acestora, și anume: 2 reziduuri (P4), 3 reziduuri (P1 – P3) și 4 reziduuri (P5 – P8), și considerăm că toate reziduurile prezintă, inițial, același grad de accesibilitate la moleculele de stingător, lucru care se observă din valorile obținute pentru τ0 în PBS, excepție făcând aceeași peptidă P4, observăm că valorile obținute pentru kb, atunci când peptidele se află în PBS, sunt și ele împărțite tot în trei clase, clase care se află în legătură directă cu numărul de reziduuri de Triptofan din structura peptidelor. Astfel, pentru clasa P1 – P3, valorile kb au fost situate în intervalul 5.32 ± 0.08 M-1ns-1, pentru P3, și 6.08 ± 0.05 M-1ns-1, pentru P2; pentru P4, clasa cu 2 reziduuri, am obținut o valoare a kb de 4.00 ± 0.04 M-1ns-1; pentru clasa cu 4 reziduuri, P5 – P8, valorile kb s-u situat între 6.33 ± 0.05 M-1ns-1, pentru P6, fiind cea mai mică valoare obținută pentru cele patru peptide, și 9.04 ± 0.13 M-1ns-1, pentru P7. Analizând mai în detaliu aceste valori observăm că două dintre peptidele studiate, P4 și P6, prezintă valori ale kb mai mici decât celelalte; P4 are cea mai mică valoare dintre toate cele opt peptide și P6 are cea mai mică valoare din clasa celor cu 4 reziduuri de Triptofan.
Pentru cazul în care peptidele se află în prezența LUV preparate din DOPC, dacă analizăm valorile timpului de viață (Figura 10.4 – B), se poate spune că acestea au un comportament asemănător, cu valori ale lui τ0 cuprinse între 1.97 ± 0.05 ns, pentru P1, și 2.34 ± 0.02 ns, pentru P5. Toate aceste valori sunt mai mari decât în cazul în care peptidele s-au aflat în PBS. Un comportament diferit l-a avut în această situație P3, aceasta având pentru τ0 o valoare de 1.37 ± 0.02 ns, puțin mai mică (≈ 0.2 ns) față de situația când peptida s-a aflat în PBS și cu ≈ 0.8 ns față de valorile lui τ0 ale celorlalte peptide. Din valorile kb, se observă că peptidele cu cel mai mare grad de expunere al grupărilor cromofore, prezente în structura lor, sunt P1, P3 și P8. Cea mai mică dintre valorile obținute pentru constanta bimoleculară, 4.00 ± 0.04 M-1ns-1 a fost pentru P4, fapt care era de așteptat, dealtfel, având în vedere că aceasta are în structura sa doar 2 reziduuri de Triptofan.
Atunci când peptidele s-au aflat în prezența LUV preparate din DOPC:DPPG, au apărut ușoare creșteri pentru valorile τ0, excepție facând aceeași P4, pentru care valoarea obținută a fost mai mică decât în cazul LUV preparate din DOPC. Acest rezultat indică faptul că grupările cromofore din structura peptidei P4 sunt mai expuse solventului, fapt care rezultă și din valorile kb corespunzătoare celor două situații. Pentru celelalte peptide, se observă că interacția dintre DPPG și reziduurile de Arginină favorizează inserția peptidei în bistratul lipidic, grupările cromofore din structura peptidei fiind mai puțin accesibile moleculelor de acrilamidă, în comparație cu situația în care între peptide și bistrat se manifestă numai interacții de hidrofobe (între reziduurile de Triptofan și bistratul din DOPC). Astfel, cea mai mică valoare pentru kb s-a obținut pentru P7, de 1.30 ± 0.02 M-1ns-1. Valori asemănătoare s-au obținut și pentru P1, P2 și P6.
Rezultatele obținute în experimentele descrise în cadrul acestui capitol, împreună cu cele din capitolul următor, vor fi utilizate la redactarea unui articol, care va fi trimis spre publicare într-o revistă de specialitate.
Concluzii parțiale
În experimentele din acest capitol am determinat constantele de stingere Stern-Volmer (KSV), timpul de viață mediu al fluorescenței reziduurilor de Triptofan (τ0) și constantele bimoleculare (kb) pentru Melitină, Indolicidină, Cecropina P1 și cele opt peptide nou sintetizate, P1 – P8, cu potențial antimicrobian.
Pentru punerea la punct a protocoalelor de lucru au fost utilizate Melitina, Indolicidina și Cecropina P1. Pe baza rezultatelor obținute pentru situația în care acestea s-au aflat în PBS, am pus în evidență relația care există între structura secundară pe care acestea o adoptă în soluție și constanta bimoleculară care a rezultat în urma prelucrării datelor experimentale. Astfel, pentru cea mai complexă structură, α-helix-ul alungit al Cecropinei P1, am obținut cea mai mică valoare a constantei bimoleculare, iar cea mai mare valoare a acestei constante a fost obținută pentru Indolicidină, care are o structură dezordonată. În prezența LUV preparate din DOPC, interacția dintre reziduurile hidrofobe din structura primară a peptidelor, duce la o scădere substanțială a constantei bimoleculare pentru toate cele trei peptide. Interacțiile dintre reziduurile cationice, din structura peptidelor, și lipidele anionice, în situația în care peptidele s-au aflat în prezența LUV preparate din DOPC:DPPG, a dus la o creștere a constantelor bimoleculare, corespunzătoare celor trei peptide, datorită reorientării acestora față de planul membranei lipozomilor.
Comportamentul peptidelor P1 – P8, în prezența moleculelor de stingător (acrilamidă) este asemănător, dacă se ține cont de numărul reziduurilor de Triptofan din structura acestora și de timpul de viață al fluorescenței în absența acrilamidei, excepție facând P4 și P6. Astfel, putem spune despre aceste două peptide că, atunci când se află în PBS, prezintă o structură distinctă de celelalte șase, în sensul că grupările cromofore sunt mai puțin accesibile moleculelor de acrilamidă, ca rezultat al valorilor obținute pentru constantele bimoleculare.
Interacțiile dintre peptidele P1 – P8 și LUV preparate din DOPC sunt puse în evidență cu ajutorul valorilor obținute pentru constantele bimoleculare, kb, corespunzătoare fiecărei peptide. Se observă că și aceste valori sunt grupate în funcție de numărul reziduurilor de Triptofan din structura peptidelor. Astfel, avem un prim grup de valori pentru peptidele cu 3 reziduuri, P1 – P3, un grup de valori pentru P5 – P8 și, separat, valoarea cea mai mică a constantei bimoleculare, pentru P4. O valoare aparte o are timpul de viață corespunzător peptidei P3, mai mică în comparație cu al celorlalte peptide, ceea ce duce la concluzia că aceasta adoptă, în interacția cu bistratul format din DOPC, o conformație în care reziduurile de Triptofan sunt mai expuse mediului hidrofil.
În prezența LUV formate din DOPC:DPPG, interacțiile dintre reziduurile cationice, în cazul de față Arginina, și lipidele anionice (DPPG) din structura bistratului, în plus față de interacțiile hidrofobe datorate Triptofanului, au dus la o scădere a constantelor bimoleculare pentru toate peptidele, scădere care este un indicator că grupările cromofore sunt mai puțin accesibile moleculelor de acrilamidă.
Determinarea energiei libere de partiționare utilizând fluorescența Triptofanului
Introducere
Utilizarea tehnicilor de spectroscopie de fluorescență pentru studierea interacțiilor care apar între AMP și membranele lipidice au avantajul că în structura primară a acestor peptide se regăsește reziduul Triptofan. Mai multe proprietăți ale acestui fluorofor intrinsec, proprietăți dependente de mediul în care acest fluorofor se găsește, pot fi utilizate pentru determinarea variației energiei libere Gibbs, ΔG, de partiționare din mediul hidrofil în mediul hidrofob: deplasarea maximului de fluorescență care apare la interacția peptidă-bistrat, modificări ale eficienței cuantice și a timpului mediu de viață al fluorescenței Triptofanului (Loura și colab., 2003).
O parte din rezultatele obținute în cadrul acestui capitol au fost prezentate la Conferința ”International Balkan Workshop on Applied Physics and Materials Science” – IBWAP 2017.
Modele utilizate pentru determinarea ΔG
Asocierea AMP cu membranele lipidice este descrisă cel mai bine din punt de vedere cantitativ (la atingerea echilibrului dintre cantitatea de peptidă care se găsește în faza apoasă și cantitatea de peptidă adsorbită la nivelul bistratului) de valoarea coeficientului de partiție, KP, definit astfel:
unde: reprezină concentrația peptidei adsorbite la nivelul bistratului, reprezintă concentrația peptidei din faza apoasă și reprezintă concentrația lipidelor din soluție (White și colab., 1998).
Valoarea variației energiei libere Gibbs, ΔG, de partiționare din mediul hidrofil în mediul hidrofob se obține utilizând coeficientul de partiție definit în ecuația (11.1):
unde: reprezintă constanta universală a gazului ideal, temperatura la care s-a desfășurat experimentul, în grade Kelvin și este concentrația molară a apei (Seelig, 2004).
Rezultatele experimentale obținute pentru cele trei peptide utilizate ca model, Melitina, Indolicidina și Cecropina P1, au fost analizate utilizând mai multe modele din literatura de specialitate.
Un prim model de calcul al coeficientului de partiție, KP, face legătura între deplasarea maximului de emisie fluorescentă, Δλ, și gradul de asociere dintre peptide și bistratul lipidic (Șchiopu și colab., 2012), cele două mărimi fiind proporționale. Gradul de asociere, APL, este definit ca:
Deoarece deplasarea maximului de emisie fluorescentă este proporțională cu concentrația de lipide din soluția analizată, datele experimentale pot fi analizate utilizând ecuația hiberbolică:
unde reprezintă deplasarea maximă a emisiei fluorescente, atunci când concentrația lipidelor în soluție este mult mai mare decât concentrația peptidei.
Următorul model folosit la prelucrarea datelor experimentale utilizează valorile intensității fluorescenței la o lungime de undă fixă, lungime de undă aleasă astfel încât sa conțină informații din spectrul de fluorescență în absența lipozomilor dar și din spectrele înregistrate în prezența lipozomilor (Ladokhin și colab., 2000). Dezavantajul acestei metode este reprezentat de faptul că intensitatea de fluorescență înregistrată pentru fiecare combinație peptidă-lipid în parte, trebuie corectată pentru artefactele datorate împrăștierii luminii. Factorul de corecție se obține în urma titrării unei soluții de Triptofan, în aceleași condiții ca la titrarea soluțiilor de peptide.
Relația care se folosește pentru corecția spectrelor de fluorescență este (Ladokhin și colab., 2000):
unde: este intensitatea fluorescenței corectată, pentru fiecare concentrație a lipidelor, este intensitatea măsurată a fluorescenței, pentru fiecare concentrație a lipidelor, este intensitatea fluorescenței Triptofanului în PBS și este intensitatea fluorescenței Triptofanului, pentru fiecare concentrație a lipidelor.
Datele experimentale se analizează folosind următoarea ecuație (Ladokhin și colab., 2000):
unde: reprezintă concentrația lipidelor din soluție, reprezintă intensitatea fluorescenței atunci când partiția peptidei în bistrat este completă și este concentrația molară a apei (55.3 M).
Ultimul model de analiză a datelor experimentale de fluorescență statică este descris de ecuația (11.7), ecuație în care se pot utiliza fie intensitatea fluorescenței la o lungime de undă fixă, aleasă la fel ca pentru ecuația (11.6), fie aria totală sau parțială, a spectrului de fluorescență (Loura și colab., 2003):
unde: este intensitatea măsurată (aria) a fluorescenței, pentru fiecare concentrație a lipidelor și este intensitatea măsurată (aria) a fluorescenței în PBS.
Pentru determinarea variației energiei libere Gibbs, ΔG, de partiționare din mediul hidrofil în mediul hidrofob, utilizând rezultatele experimentale obținute în urma măsurării timpului de viață mediu al fluorescenței, am folosit două modele descrise în literatură.
Primul model utilizat este descris de următoarea ecuație (Bastos și colab., 2008):
unde: este timpul de viață mediu măsurat, este timpul de viață mediu măsurat, pentru situația în care regăsim peptida în PBS, reprezintă timpul de viață mediu atunci când partiția peptidei în bistrat este completă și reprezintă volumul molar al lipidului.
Al doilea model care utilizează variația timpul de viață mediu al fluorescenței, și ultimul din cele folosite pentru determinarea variației energiei libere Gibbs de partiționare a peptidelor din mediul hidrofil în mediul hidrofob, este asemănător cu cel descris de ecuația (11.7) și are următoarea formă (Loura și colab., 2003):
Determinarea ΔG pentru AMP
Pentru determinarea variației energiei libere Gibbs, ΔG, de partiționare a peptidelor din mediul hidrofil în mediul hidrofob a fost folosit un protocol de lucru în care soluția de peptidă a fost titrată cu o soluție concentrată de LUV.
Soluția de peptidă dizolvată în PBS, având concentrația finală de 1 µM, a fost ținută în întuneric, cu agitare continuă, timp de 30 min., pentru atingerea echilibrului. După scurgerea acestui interval, au fost înregistrate spectrele de fluorescență statică și fluorescență rezolvată în timp, spectre din care s-au determinat valorile și , utilizate pentru prelucrarea datelor folosind ecuațiile prezentate anterior.
Titrarea soluțiilor de peptidă s-a făcut utilizând soluții concentrate de LUV, 12.5 mM, preparate din DOPC și DOPC:DPPG. La fiecare pas al titrării, amestecul de peptide cu lipozomi a fost ținut în întuneric, timp de 15 min. și agitat continuu, pentru atingerea echilibrului. În final s-au înregistrat spectrele de fluorescență statică și fluorescență rezolvată în timp ale amestecului de peptide și LUV. Concentrațiile finale ale lipidelor, în soluția de peptide, rezultate în urma titrarii, au fost: 5 µM, 10 µM, 20 µM, 40 µM, …, 180 µM și 200 µM. Din prelucrarea acestor spectre au rezultat valorile folosite pentru determinarea ΔG utilizând ecuațiile din modelele descrise anterior. O familie de spectre, pentru Indolicidină titrată cu LUV preparate din DOPC, utilizate pentru determinarea variației energiei libere Gibbs de partiționare a peptidelor din mediul hidrofil în mediul hidrofob, este prezentată în figura următoare.
Pentru obținerea ΔG, datele experimentale au fost fitate, în Origin, cu ecuațiile corespunzătoare fiecărui model de analiză. Este de precizat faptul că pentru concentrația lipidelor s-au folosit valori reduse la jumătate, deoarece se consideră că peptidele interacționează numai cu peretele exterior al LUV (White și colab., 1998). Un exemplu de fitări, pentru Indolicidină titrată cu LUV preparate din DOPC, este ilustrat în Figura 11.2.
Valorile ΔG, obținute în urma prelucrării datelor experimentale, pentru Melitină, Indolicidină și Cecropina P1, sunt prezentate în Tabelul 11.1. Pentru fiecare combinație peptidă-lipide, a fost determinată ΔG, utilizând modelele descrise de ecuațiile (11.4), (11.6) – (11.9). Valorile din tabel sunt valorile medii obținute din trei experimente diferite ± deviațiile standard.
Aceste rezultate au fost prezentate la Conferința ”International Balkan Workshop on Applied Physics and Materials Science” – IBWAP 2017, sub forma unei lucrări tip Poster.
Pentru peptidele P1 – P8 valorile ΔG au fost obținute utilizând modele descrise de ecuațiile (11.4) și (11.8). Aceste valori sunt prezentate în Tabelul 11.2 și reprezintă valorile medii obținute din trei experimente diferite ± deviațiile standard. Pentru aceste peptide am ales, pentru determinarea variației energiei libere de partiționare ΔG, să folosesc modelele descrise de ecuația (11.4), pentru fluorescența statică, și ecuația (11.8), pentru fluorescența rezolvată în timp. Alegerea celor două modele am decis-o din două considerente: a) pentru modelul care utilizează datele obținute din experimentele de fluorescență statică; din acesta se obține, în plus de valoarea coeficientului de partiție, KP, și deplasarea maximului de emisie fluorescentă, deplasare ce este un indicator al gradului de penetrare al reziduurilor de Triptofan în interiorul bistratului lipidic; b) pentru modelul care utilizează datele obținute din experimentele de fluorescență rezolvată în timp; din acesta se obține și valoarea limită a timpului de viață, acesta fiind un indicator al faptului că fluoroforul, și implicit, structura din care acesta face parte, nu mai suferă modificări conformaționale.
Discuții
Alegerea modelelor utilizate pentru determinare variației energiei libere Gibbs, ΔG, de partiționare din mediul hidrofil în mediul hidrofob, reprezentat de membrana lipidică, pentru peptidele P1 – P8, am făcut-o analizând inițial datele obținute pentru Melitină, Indolicidină și Cecropina P1, prezentate în Tabelul 11.1. Din rezultatele prezentate în acest tabel, se remarcă două situații deosebite: în cazul Melitinei, pentru modelele care utilizează valorile timpilor de viață, ecuațiile (11.8) și (11.9) și pentru Cecropina P1, pentru modelele care utilizează poziția maximului emisiei fluorescente, ecuația (11.4) și itensitatea fluorescenței la o lungime de undă constantă, ecuațiile (11.6) și (11.7). În cazul Melitinei, valorile timpului de viață obținute, atunci când erau reprezentate în funcție de concentrația (redusă la jumătate) a lipidelor, nu au avut o variație după o lege de tip hiperbolic. Pentru Cecropina P1, nu am putut obține variații ale maximului emisiei fluorescente pentru a putea utiliza modelul descris de ecuația (11.4), iar variațiile intensității fluorescenței la lungimea de undă de 335 nm, pe lângă faptul că au fost mici, nu au putut fi fitate cu ajutorul modelelor descrise de ecuațiile (11.6) și (11.7). Pentru Indolicidină, rezultatele experimentale obținute le-am putut analiza cu toate modelele descrise anterior, rezultatele obținute cu modelele descrise de ecuațiile (11.4) și (11.8) fiind în concordanță cu cele din literatură (Ladokhin și colab., 1997). O confirmare în plus a faptului că eficiența cuantică a reziduurilor de Triptofan, din structura Indolicidinei, este redusă în prezența lipidelor anionice au fost rezultatele obținute cu ajutorul modelelor descrise de ecuațiile (11.6) și (11.7), modele ce țin cont de intensitatea fluorescenței sau de aria spectrului de fluorescență, acestea fiind dependente de eficiența cuantică a fluoroforului studiat (Triptofanul).
Astfel, în urma prelucrării datelor experimentale, pentru peptidele utilizate, am obținut valorile din Tabelul 11.2, cu ajutorul modelelor descrise de ecuațiile (11.4) și (11.8). Valorile pentru peptidele P1 – P8 din Tabelul 11.2 sunt reprezentate sub formă grafică în Figurile 11.3 și 11.4.
Pentru Melitină, valorile ΔG obținute pentru DOPC, de -9.43 ± 0.17 kcal/M, și DOPC:DPPG, de -10.11 ± 0.02 kcal/M, sugerează că, pentru cazul în care avem în structura lipozomilor lipide anionice (DPPG), aceasta adoptă, aparent, o configurație mai stabilă la nivelul bistratului. Din valorile deplasărilor maximului de emisie fluorescentă, Δλ, de 20.5 ± 0.3 nm pentru DOPC și de 20.0 ± 0.2 nm pentru DOPC:DPPG, reiese că reziduul de Triptofan din structura Melitinei se află aproximativ în aceleași condiții de mediu, fiind ușor mai expus în cazul DOPC:DPPG, așa cum am arătat și în capitolul anterior (Figura 10.4 – B). Astfel, ușoara diferență dintre valorile ΔG apare datorită strict interacțiilor electrostatice dintre reziduurile cationice din structura Melitinei și lipidele anionice din structura bistratului.
Pentru Indolicidină, valorile obținute pentru ΔG, Δλ și τlim. indică o configurație mai stabilă a peptidei pentru interacția cu LUV preparate din DOPC:DPPG (ΔG = -10.45 ± 0.02 kcal/mol, valoare rezultată din măsuratorile de fluorescență statică sau ΔG = -10.26 ± 0.10 kcal/mol, valoare rezultată din măsuratorile de fluorescență reolvată în timp) față de situația în care peptida interacționează cu LUV din DOPC (ΔG = -9.75 ± 0.29 kcal/mol, valoare rezultată din măsuratorile de fluorescență statică sau ΔG = -9.64 ± 0.01 kcal/mol, valoare rezultată din măsuratorile de fluorescență reolvată în timp), cu o reorientare a reziduurilor de Triptofan către o zonă mai hidrofobă a bistratului care duce la o creștere a deplasării maximului de emisie fluorescentă, Δλ, de la 13.7 ± 0.3 nm, în cazul DOPC, la 15.1 ± 0.7 nm, în cazul DOPC:DPPG. Aceeași reorientare a grupărilor cromofore rezultă și din diferențele care apar între timpii de viață limită ai fluorescenței.
Valoarea ΔG obținută pentru situația în care Cecropina P1 interacționează cu LUV preparate de DOPC:DPPG, de -9.46 ± 0.43 kcal/mol, este mai mare decât pentru situația în care peptida interacționează cu LUV preparate doar din DOPC, de -8.21 ± 0.05 kcal/mol. Din valorile obținute pentru timpii de viață se observă că în pentru cazul DOPC:DPPG reziduul de Triptofan are un timp de viață mai scurt, datorat orientării diferite a peptidei față de planul bistratului, acesta fiind mai accesibil moleculelor solventului.
Trebuie precizat că, în cazul peptidelor P3 și P4 nu s-au obținut, în urma titrării cu soluția concentrată de lipozomi, deplasări ale maximului de emisie fluorescentă. Totuși, în urma titrării, au apărut creșteri ale intensității spectrelor de emisie fluorescentă, poziția maximului de emisie rămânând neschimbată, relativ la situația în care peptidele au fost doar în PBS, acest lucru sugerând că la nivelul reziduurilor de Triptofan apar interacții care afectează eficiența cuantică a acestuia.
Rezultatele obținute pentru celelalte peptide, care au prezentat deplasări ale maximului de emisie fluorescentă, astfel putând calcula pentru ele valoarea ΔG, sunt detaliate în Tabelul 11.2 și Figura 11.3. În situația interacției acestor peptide cu LUV, preparate din DOPC, cea mai mare valoare a variației energiei a avut-o P2, de -8.27 ± 0.34 kcal/mol, iar cea mai mică a fost pentru P6, de -9.34 ± 0.33 kcal/mol. Valorile mai mici obținute pentru peptidele cu 4 reziduuri de Triptofan în structura lor, P5 – P8, față de cele cu 3 reziduuri, P1 – P2, sunt explicabile datorită faptului că, având un reziduu de Triptofan în plus în structură, acesta duce la adoptarea unei configurații mai stabile a peptidei relativ la planul membranei. Pentru situația în care peptidele au interacționat cu LUV, preparate din DOPC:DPPG, cea mai mică valoare a variației energiei libere Gibbs a fost pentru P6, de -10.23 ± 0.26 kcal/mol.
Din valorile deplasărilor maximului emisiei fluorescente, se observă că reziduurile de Triptofan, care intră în componența peptidei P2, sunt cele mai expuse mediului hidrofil de la interfața bistratului, în situația în care acesta este obținut din DOPC. Pentru aceeași compoziție lipidică a bistratului, cel mai puțin expuse reziduuri sunt ale peptidei P7. O creștere semnificativă (dublare) a deplasării maximului o are P2 în prezența LUV preparate din DOPC:DPPG. Cea mai mare valoare a deplasării maximului a fost obținută, în această situație, pentru peptida P1.
Valorile obținute în urma prelucrării datelor experimentale, pentru peptidele P1 – P8, din Tabelul 11.2, cu modelul descris de ecuația (11.8), sunt reprezentate sub formă grafică în Figura 11.4. La fel ca la modelul utilizat anetrior, cea mai mică energie am obținut-o tot pentru peptida P6, în ambele cazuri, pentru DOPC având valoarea de -9.15 ± 0.52 kcal/mol, iar pentru DOPC:DPPG având valoarea de -9.97 ± 0.04 kcal/mol.
Surprinzător a fost comportamentul peptidei P3 pentru care, utilizând această metodă de analiză, am obținut o variație mare a timpului de viață pentru cele două situații, în cazul DOPC, având valoarea de 1.51 ± 0.08 ns, iar în cazul DOPC:DPPG, având valoarea de 3.70 ± 0.20 ns, valori care nu se corelează cu cele ale energiilor de partiție pentru cele două situații, în cazul DOPC:DPPG energia de partiție fiind de -7.35 ± 0.16 kcal/mol, mai mică decât în cazul DOPC, când a avut valoarea de -8.15 ± 0.19 kcal/mol.
Concluzii parțiale
Modelele de calcul ale variației energiei libere Gibbs, de partiționare din mediul hidrofil în bistratul lipidic, au generat rezultate comparabile cu cele din literatura de specialitate, pentru Melitină, Indolicidină și Cecropina P1 (Ladokhin și colab., 1997; White și colab., 1998; He și Lazaridis, 2013).
Rezultatele obținute pentru peptidele P1-P8, pentru valorile variației energiei libere Gibbs, indică faptul că peptida P6 are cea mai bună afinitate pentru membranele care conțin lipide anionice. Aceste rezultate se corelează cu testele in vitro efectuate pentru aceste peptide (Bacalum și colab., 2017).
Ținând cont proprietățile peptidelor P1 – P8: structura primară scurtă, număr mare de reziduuri de Triptofan (4 pentru jumătate dintre ele, P5 – P8) și sarcina netă a acestora, pot trage concluzia că acestea au un comportament asemănător cu cel al Indolicidinei, față de membranele lipidice.
Experimentele descrise în acest capitol vor trebui continuate, cel puțin utilizând peptida P6, în combinație cu mai multe tipuri de sisteme lipidice (LUV preparate din diverse lipide constituente, în rapoarte variabile) și în diverse condiții fizico-chimice, fiind demonstrat faptul că energia de partiționare din mediul hidrofil în bistratul lipidic este dependentă de acești factori (He și Lazaridis, 2013).
Evaluarea interacției AMP-membrana model prin analiza cu funcții asimetrice aplicată spectrelor de fluorescență ale Triptofanului
Introducere
Spectroscopia de fluorescență este o tehnică de analiză, extrem de utilizată, pentru investigarea structurii, conformației și dinamicii peptidelor și proteinelor, deoarece proprietățile fluorescente ale aminoacizilor, care prezintă fluorescență intrinsecă, din care face parte și Triptofanul, sunt extrem de sensibile la variațiile proprietaăților fizico-chimice ale mediului înconjurător, atunci când acesta face parte din structura peptidelor sau proteinelor studiate.
Obiectivul major al spectroscopiei de fluorescență a reziduurilor de Triptofan este interpretarea proprietăților fluorescente în funcție de parametrii structurali ai peptidelor și proteinelor și de punere în evidență a modificărilor conformaționale ale acestora, în anumite condiții fizico-chimice.
Rezultatele obținute în cadrul acestu capitol au fost prezentate parțial la Conferința ”Analytical and Nanoanalytical Methods for Biomedical and Environmental Sciences” – IC-ANMBES 2018.
Analiza fluorescenței reziduurilor de Triptofan din structura proteinelor
Una dintre problemele interpretării spectrelor de fluorescență ale proteinelor este natura complexă a acestor spectre. Majoritatea proteinelor conțin mai mult de un reziduu de Triptofan, fiecare dintre aceste reziduuri având un spectru de fluorescență individualizat, în funcție de poziția ocupată în structura proteinei. Astfel, este necesară determinarea parametrilor spectrali individuali, dintr-un spectru mult mai larg de fluorescență, în care aceste spectre individuale se manifestă.
În anul 2001, Burstein și colaboratorii săi au propus, într-o serie de articole, utilizarea funcțiilor asimetruce, de tip LN, descrise de ecuația (8.2), pentru analiza spectrelor complexe de fluorescență ale peptidelor și proteinelor, cu parametrii de constrângere a formei spectrelor determinați pentru Triptofan (Burstein și Emelyanenko, 1996):
Aceștia au analizat și caracterizat o gamă foarte mare de spectre de fluorescență, pentru diferite peptide și proteine, complexe prin natura lor, aflate în diverse condiții fizico-chimice, validând astfel modelul de analiză propus (Burstein și colab., 2001; Reshetnyak și Burstein, 2001; Reshetnyak și colab., 2001). Aceste experimente s-au desfășurat considerând valabile următoarele ipoteze de lucru (Abornev și Burshtein, 1992):
Forma spectrului de fluorescență a unui peak elementar al Triptofanului, reprezentat în domeniul numerelor de undă, este descrisă de o funcție LN biparametrică (depinde de amplitudinea maximă a emisiei fluorescente și de poziția acesteia în spectrul de fluorescență), descrisă de ecuația (8.2) (Burstein și Emelyanenko, 1996).
Forma și poziția spectrelor de emisie fluorescentă a Triptofanului rămân neschimbate la stingerea fluorescenței cu molecule mici de stingător (acrilamida), solubile în apă (Burstein, 1968; Lehrer, 1971; Burstein, 1977; Lehrer și Leavis, 1978).
Modificările componentelor individuale (peak-uri elementare) rezultate în urma deconvoluției respectă legea Stern-Volmer, descrisă de ecuația (10.1), atunci când grupările cromofore din structura peptidelor sau proteinelor interacționează cu moleculele de stingător (Lehrer, 1971; Burstein, 1977; Lehrer și Leavis, 1978).
Pentru atenuarea zgomotului, care apare aleator în spectrele de fluorescență măsurate, și pentru a obține o acuratețe mare a rezultatelor deconvoluției (Akseenko și colab., 1989) la realizarea acestei proceduri (deconvoluția spectrului de fluorescență) se folosesc toate valorile obținute în spectrul experimental, care sunt mult mai mari ca număr decât numărul parametrilor rezultați în urma deconvoluției.
Astfel, conform modelului cu proprietătile menționate anterior, a fost confirmată existența celor cinci clase de reziduuri de Triptofan care emit fluorescent, cu cea mai suscceptibilă existență, din structura peptidelor și proteinelor:
Clasa A (λem = 308 nm, spectre structurate), din care fac parte reziduurile de Triptofan care nu formează legături de hidrogen în starea excitată, cu moleculele solventului sau cu grupările polipeptidice alăturate, din structura proteinelor (Hershberger și colab., 1981).
Clasa S (λem = 316 nm, spectre structurate), include reziduurile de Triptofan din structura proteinelor care pot forma complexe moleculare cu stoichiometria de 1:1.
Clasa I (330 nm ≤ λem ≤ 332 nm, 48 nm ≤ Δλ ≤ 50 nm), include reziduurile de Triptofan din structura proteinelor care pot forma complexe moleculare cu stoichiometria de 2:1.
Clasa II (340 nm ≤ λem ≤ 342 nm, 53 nm ≤ Δλ ≤ 55 nm), din care fac parte reziduurile de Triptofan expuse moleculelor de apă legată, care au un timp lung de relaxare dipolară.
Clasa III (350 nm ≤ λem ≤ 353 nm, 59 nm ≤ Δλ ≤ 61 nm), conține reziduurile de Triptofan expuse aproape în întregime la moleculele de apă din soluție, al căror spectru de emisie este aproape identic cu cel al moleculelor de L-Triptofan liber în soluție.
Ipoteze de lucru
În literatura de specialitate există studii care utilizează deconvoluția cu funcții de tip LN a spectrelor complexe de fluorescență ale Triptofanului, din structura peptidelor și proteinelor (Linke și colab., 2004; Reshetnyak și colab., 2004; Reshetnyak și colab., 2006), și doar câteva din acestea tratează interacția dintre peptide sau proteine cu membranele lipidice (Reshetnyak și colab., 2007; Torrent și colab., 2007). Toate aceste studii tratează problema deconvoluției spectrelor pe baza principiilor amintite anterior, din punctul de vedere al stingerii fluorescenței reziduurilor de Triptofan.
Ținând cont de ipotezele de lucru ale metodei de analiză a spectrelor de emisie fluorescentă a reziduurilor de Triptofan și de existența celor cinci clase de spectre de emisie, descrise anterior, am considerat că este utilă dezvoltarea unui pachet asemănător de coduri de analiză a spectrelor de fluorescență (Burstein și colab., 2001), analiză care s-a axat pe prelucrarea datelor obținute în cadrul experimentelor descrise în capitolul anterior. Scopul acetseia a fost determinarea cantității (fracției) de peptidă aflată în faza apoasă și adsorbită la nivelul bistratului lipidic.
La prelucrarea și analiza datelor am considerat următoarele:
Cele două peptide analizate, Indolicidina și P6, prezintă în soluții apoase o structură secundară dezordonată, astfel că reziduurile de Triptofan, aflate în structura primară a acestora, sunt total expuse moleculelor solventului; datorită acestui lucru, era de așteptat să se regăsească în spectrul de emisie fluorescentă, corespunzător fiecărei peptide aflate doar în PBS sau în faza apoasă atunci când interacționează cu bistratul, o singură specie de molecule fluorescente, cu caracteristicile de emisie foarte apropiate de emisia fluorescentă a moleculelor de L-Triptofan dizolvate în soluție apoasă (clasa III din lista anterioară).
În situația în care peptida se află adsorbită la nivelul bistratului lipidic, toate reziduurile de Triptofan din structura acesteia interacționează, prin interacții hidrofobe, cu suprafața exterioară a bistratului.
Datorită lungimii reduse a peptidelor, acestea nu pot penetra bistratul lipidic în urma unei reorientări la nivelul acestuia, ca în cazul Melitinei, reorientare în urma căreia unele reziduuri ar fi mai puțin accesibile mediului hidrofil, rezultând astfel două categorii de reziduuri cu grade diferite de accesibilitate pentru moleculele solventului și, implicit, asociat acestora, două peak-uri elementare care să rezulte în urma deconvoluției.
Ținând cont de ipoteza anterioară, am considerat că pentru peptidele adsorbite la nivelul bistratului, fluorescența reziduurilor de Triptofan va genera în spectrul complex de fluorescență un singur peak elementar, corespunzător uneia dintre clasele A, S, I sau II.
În prezența LUV, peptidele care nu sunt adsorbite la nivelul bistratului vor genera un peak elementar cu caracteristici care se încadrează în clasa III.
Analiza spectrelor de fluorescență ale Triptofanului
Pentru analiza spectrelor de fluorescență am dezvoltat un pachet de coduri, scrise în limbajul de programare MatLab, care respectă algoritmul de calcul descris în Capitolul 8, utilizând ecuația (8.2) și parametrii de constrângere a formei generale a peak-urilor elementare evidențiați în ecuația (12.1). Programul Matlab generează grafice de tipul celor din Figura 12.1, dar și un fișier cu parametri rezultați în urma deconvoluției: aria peak-urilor elementare, aria relativă a acestora, poziția maximului de fluorescență a fiecărui dintre peak-uri și parametrul care caracterizează calitatea deconvoluției. Acest program generează, în plus față de graficele de tipul celor din
Figura 12.1 și fișierele de date care stau la baza generării acestora. Pe baza parametrului care estimează calitatea deconvoluției, utilizatorul poate lua decizia de creștere a numărului de peak-uri elementare cu care se face analiza (maxim 3), cu condiția ca acestea să respecte caracteristicile fizice (poziția peak-urilor elementare în spectrul complex de emisie fluorescentă) definite în clasele descrise anterior.
În Figura 12.1 sunt reprezentate grafic pozițiile peak-urilor elementare, obținute în urma deconvoluței spectrelor complexe de fluorescență, obținute pentru Indolicidină în situațiile în care aceasta a fost titrată cu soluții concentrate de LUV obținute din DOPC (Figura 12.1 A – D) și din DOPC:DPPG (Figura 12.1 E – H). Spectrele reprezentate în această figură corespund celor patru situații marcate în Figura 12.2 – A.
În Figura 12.2 sunt reprezentate valorile ariilor relative, corespunzătoare celor două fracții de peptidă, aflată fie în faza apoasă, fie adsorbită la nivelul bistratului, obținute în urma deconvoluției, pentru Indolicidină (graficul A) și pentru P6 (graficul B).
Discuții
Ținând cont de ipotezele de lucru care au stat la baza acestei metode de analiză și considerând că aria relativă a peak-urilor obținute în urma deconvoluției spectrelor de fluorescență este direct proporțională cu fracțiile de peptidă adsorbite la nivelul bistratului, respectiv din faza apoasă, am reprezentat variația acestor arii în funcție de cantitatea de lipide titrată în soluția de peptide, obținând astfel graficele din Figura 12.2, pentiru Indolicidină (graficul A), respectiv pentru P6 (graficul B).
Utilizând modelul de analiză a spectrelor dse fluorescență cu funcții LN am obținut, pentru Indolicidină, rezultatele reprezentate în Figura 12.1 și Figura 12.2 – A. Din aceste figuri se observă, pentru situația în care peptida se află în prezența LUV, preparați din DOPC (Figura 12.1, B – D) sau DOPC:DPPG (Figura 12.1, F – H), în spectrul de emisie fluorescentă, în urma deconvoluției, am obținut două peak-uri elementare. Aceste peak-uri, sunt proporționale cu cantitatea de peptidă adsorbită la nivelul bistratului (fracția de peptidă legată), respectiv cu cantitatea de peptidă aflată în faza apoasă (fracția de peptidă liberă), dacă se ține cont de ipotezele de lucru prezentate anterior.
Se observă că, pentru același raport peptidă-lipide, de exemplu, cazul numărul 2 din Figura 12.2 – A, acest raport fiind de 1:5, caz reprezentat în graficele B și F din Figura 12.1, fracția de peptidă legată, reprezentată de peak-urile de la lungimile de undă mai mici, este aproape dublă pentru cazul în care aceasta s-a aflat în prezența LUV preparate din DOPC:DPPG (graficul F) față de situația în care s-a aflat în prezența LUV preparate din DOPC (graficul B).
Se remarcă faptul că, la concentrați mari ale lipidelor, unde ariile relative ale peak-urilor ramân aproximativ constante, pentru DOPC:DPPG, fracția de peptidă adsorbită reprezintă aproximativ 75 % din cantitatea totală de peptidă din soluție, spre deosebire de DOPC, unde această fracție reprezintă aproximativ 60 % din cantitatea totală de peptidă.
Pentru P6 am obținut aproximativ același tip de variație a ariilor relative ale peak-urilor elementare obținute în urma deconvoluției. Spre deosebire de cazul Indolicidinei, atunci când în suspensia de P6 a fost titrată soluția de LUV preparate din DOPC, fracția de peptidă adsorbită la nivelul bistratului a fost mai mică decât fracția de peptidă din faza apoasă, pentru toate valorile raportului peptidă-lipide, așa cum se observă din Figura 12.2 – B. În cazul LUV preparate din DOPC:DPPG fracția de peptidă adsorbită la nivelul bistratului pentru concentrațiile mari ale lipidelor a fost de aproximativ 65 %, iar pentru LUV preparate din DOPC de aproximativ 45 %.
Poziția în spectrul de emisie fluorescentă a peak-ului elementar, corespunzătoar peptidelor adsorbite la nivelul bistratului, a fost pentru Indolicidină titrată cu DOPC la 335 nm și cu DOPC:DPPG la 337 nm, pentru peptida P6 titrată cu DOPC la 337 nm și cu DOPC:DPPG la 331 nm. Aceste valori sugerează că, în situația în care P6 interacționează cu LUV preparate din DOPC:DPPG, reziduurile de Triptofan din structura acesteia sunt mai puțin expuse moleculelor solventului.
Concluzii parțiale
Metoda de analiză a spectrelor complexe de emisie fluorescentă a reziduurilor de Triptofan cu funcții asimetrice de tip LN, validată pentru peptide și proteine aflate în diverse condiții fizico-chimice (Burstein și Emelyanenko, 1996; Burstein și colab., 2001; Reshetnyak și Burstein, 2001; Reshetnyak și colab., 2001), poate fi aplicată și pentru studierea interacției dintre AMP și membranele lipidice model.
Utilizând această metodă se obțin fracțiile de peptidă adsorbită la nivelul bistratului lipdidic, respectiv aflată în faza apoasă. Astfel, se pot pune în evidență diferențele care apar la interacțiile dintre diferite AMP și membranele lipidice model, cu diferite compoziții ale lipidelor constituente.
Metoda de analiză prezentată în cadrul acestui capitol trebuie să fie în continuare aplicată și altor combinații de peptide în interacție cu diverse tipuri de membrane lipidice model, în vederea validării ipotezelor de lucru propuse.
Această metodă, după ce va fi validată, poate avea aplicații în experimentele de determinare a variației energiei libere Gibbs, în experimentele în care se studiază transferul rezonant de energie etc.
Concluzii generale
Toate rezultatele experimentale, obținute cu aranjamentul experimental realizat și calibrat în teză, referitoare la timpii de viață ai fluorescenței, sunt comparabile cu valorile găsite în literatură. Timpul de viață al fluorescenței, în cazul moleculelor care includ în structura lor un inel indolic, este afectat de variațiile de temperatură într-o mai mare măsură decât timpul de viață obținut pentru ceilalți compuși. De aceea, în experimente, trebuie să se aibă în vedere influența factorilor fizico-chimici asupra grupărilor cromofore ale moleculelor studiate.
În urma analizării datelor obținute în cazul Melitinei, a rezultat că, la creșterea fluidității bistratului, obținut din DOPC, aceasta se reorienteză față de bistrat, pătrunzând în profunzimea lui, către zona hidrofobă a acestuia. Spre deosebire de Melitină, cele trei peptide analizate în teză (și anume: P1, P5 și P8), având reziduurile de Triptofan localizate la nivelul interfeței membrană lipidică-solvent, paralele cu planul membranei, sunt mult mai expuse mediului hidrofil, în comparație cu reziduul de Triptofan din structura Melitinei. Datele experimentale din Texă demonstrează că mecanismul de acțiune al peptidelor nou sintetizate (și anume: P1, P5 și P8) asupra bistratului lipidic diferă față de cel al Melitinei.
Noul parametru propus pentru caracterizarea fluidității membranelor lipozomale, ΔSR, obținut în urma deconvoluției spectrelor de emisie fluorescentă ale Laurdanului inserat în membrane lipidice, utilizând funcții asimetrice de tip LN, este mult mai sensibil la nivelul de hidratare a bistratului, așa cum este indicat de către Laurdan. Aria peak-ului corespunzător fazei de gel a bistratului și intervalul de temperatură în care are loc tranziția de fază sunt dependente de lungimea cozilor hidrofobe ale lipidelor.
Împachetarea lipidelor, obținută din spectrele de fluorescență ale Laurdanului din membranele obținute artificial și a celor biologice, este afectată de interacția cu AMP. Complexitatea membranelor biologice, mult mai mare decât a celor artificiale, duce la un nivel de împachetare mai mare decât în cazul lipozomilor. Datorită complexității, aceste membrane sunt mai puțin afectate de interacția cu AMP. Gradul de destabilizare a bistratului, în cazul membranelor artificiale, depinde de componentele constituente ale acestuia. Pentru interacția dintre Melitină și lipozomi, preparați din DOPC și DOPC:Chol, există o concentrație limită, peste care efectul destabilizator nu se mai manifestă.
Interacțiile dintre peptidele P1 – P8 și LUV preparate din DOPC sunt puse în evidență cu ajutorul valorilor obținute pentru constantele bimoleculare, kb, corespunzătoare fiecărei peptide. Se observă că și aceste valori sunt grupate în funcție de numărul reziduurilor de Triptofan din structura peptidelor. În prezența LUV formate din DOPC:DPPG, interacțiile dintre reziduurile cationice și lipidele anionice (DPPG) din structura bistratului, în afară de interacțiile hidrofobe datorate Triptofanului, au dus la o scădere a constantelor bimoleculare pentru toate peptidele, scădere care este un indicator că grupările cromofore sunt mai puțin accesibile moleculelor de stingător (i.e., acrilamidă).
Rezultatele obținute pentru peptidele P1-P8, pentru valorile variației energiei libere Gibbs, indică faptul că peptida P6 are cea mai mare afinitate pentru membranele care conțin lipide anionice. Ținând cont de proprietățile peptidelor P1 – P8: structura primară scurtă și sarcina netă a acestora, am ajuns la concluzia că acestea au un comportament asemănător cu cel al Indolicidinei, față de membranele lipidice.
Utilizând deconvoluția spectrelor de fluorescență ale Triptofanului cu funcții de tip LN se obțin fracțiile de peptidă adsorbită la nivelul bistratului lipdidic, respectiv aflată în faza apoasă. Astfel, se pot pune în evidență diferențele care apar la interacțiile dintre diferite AMP și membranele lipidice model, cu diferite compoziții ale lipidelor constituente.
Protocoalele dezvoltate pe parcursul acestei Teze, permit studierea efectelor diferiților agenți de stres: tratamente cu radiații ionizante, tratamente termice, chimice etc., asupra membranelor celulare de mamifere și bacteriene. De asemenea, urmează ca metoda de analiză a spectrelor de fluorescență ale Triptofanului să fie validată utilizând și alte combinații peptidă-lipide.
Realizări personale
Articole legate de Teză publicate in extenso în reviste științifice indexate ISI, cu factor de impact
Chilom, C. G., Zorilă, B. și Popescu, A. I. (2017) Characterization of Some Physico-Chemical Properties and Interactions of Human and Bovine Serum Albumins with Mitomycin C, Romanian Journal of Physics, 62. (IF = 1.433, AIS = 0.259)
Zorilă, B., Bacalum, M., Popescu, A. I. și Radu, M. (2016) Log-Normal Deconvolution of Laurdan Fluorescence Spectra – a Tool to Assess Lipid Membrane Fluidity, Romanian Reports in Physics, 68, 702-712. (IF = 1.467, AIS = 0.18)
Bacalum, M., Zorilă, B. și Radu, M. (2016) Investigating the Anticancer Activity of Some Cationic Antimicrobial Peptides in Epithelial Tumor Cells, Romanian Reports in Physics, 68, 1159-1169. (IF = 1.467, AIS = 0.18)
Bacalum, M., Zorilă, B. și Radu, M. (2013) Fluorescence spectra decomposition by asymmetric functions: Laurdan spectrum revisited, Analytical Biochemistry, 440, 123-129. (IF = 2.275, AIS = 0.8)
Bacalum, M., Zorilă, B., Radu, M. și Popescu, A. (2013) Laurdan solvatochromism: influence of solvent polarity and hydrogen bonds, Optoelectronics and Advanced Materials-Rapid Communications, 7, 456-460. (FI =0.386, AIS = 0.07)
Alte articole publicate in extenso în reviste științifice indexate ISI, cu factor de impact
Melintescu, A., Chambers, S. D., Crawford, J., Williams, A. G., Zorilă, B. și Galeriu, D. (2018) Radon-222 related influence on ambient gamma dose, Journal of Environmental Radioactivity, 189, 67-78. (IF = 2.263, AIS = 0.6)
Zorila, F. L., Ionescu, C., Craciun, L. S. și Zorilă, B. (2017) Atomic force microscopy study of morphological modifications induced by different decontamination treatments on Escherichia coli, Ultramicroscopy, 182, 226-232. (IF = 2.929, AIS = 1)
Chambers, S. D., Galeriu, D., Williams, A. G., Melintescu, A., Griffiths, A. D., Crawford, J., Dyer, L., Duma, M. și Zorilă, B. (2016) Atmospheric stability effects on potential radiological releases at a nuclear research facility in Romania: Characterising the atmospheric mixing state, Journal of Environmental Radioactivity, 154, 68-82. (IF = 2.263, AIS = 0.6)
Galeriu, D., Melintescu, A., Duma, M., Zorilă, B. și Gheorghiu, A. (2014) Nuclear Meteorology at IFIN-HH, Romanian Journal of Physics, 59, 999-1011. (IF = 1.758, AIS = 0.243)
Articole legate de Teză aflate în stadiul de manuscris
Claudia G. Chilom, Bogdan Zorilă, Maria Bălășoiu, R. N. Yaroslavtsev, S. V. Stolyar, Anna S. Artemyeva, D. Soloviov, A. I. Kuklin, Mihaela Bacalum, Structural and spectrophotometric characterization of ferrihydrite nanoparticles in interaction with liposomes and the effect against normal and tumour cells.
B. Zorilă, Mihaela Bacalum, Claudia G. Chilom, Spectral characterization of folic acid effects of lipid membranes: from model membranes to cells membranes.
F. L. Zorilă, M. M. Manea, B. Zorilă, Spectroscopic study of membrane modifications induced by different decontamination treatments on Escherichia coli.
Lucrări legate de Teză prezentate la conferințe internaționale
Bogdan Zorilă, Mirela Cristea, Mihaela Bacalum, Claudia G. Chilom, The influence of folic acid on the fluidity of dppc liposomal membranes and the effect against normal and tumour cells, 18th International Balkan Workshop on Applied Physics and Materials Science, IBWAP-2018, Constanța, Roânia, Prezentare poster
Claudia G. Chilom, Bogdan Zorilă, Mihaela Bacalum, S. Stolyar, Anna Artemieva, R. Yaroslavtsev, A. Kuklin, Maria Bălășoiu, Characterization of ferrihydrite nanoparticles in interaction with liposomes and the effect against normal and tumour cells, 18th International Balkan Workshop on Applied Physics and Materials Science, IBWAP-2018, Constanța, Roânia, Prezentare poster
Bogdan Zorilă, Mihaela Bacalum and Mihai Radu, Evaluation of lipid membrane tryptophan rich peptides bound fraction by fluorescence spectrum deconvolution, 5th International Conference on Analytical and Nanoanalytical Methods for Biomedical and Environmental Sciences, IC-ANMBES-2018, Brașov, România, Prezentare poster
Bogdan Zorilă, Models applied to steady state and time resolved fluorescence data analysis to obtain water-to-lipid partition free energy. An experimental approach., 17th International Balkan Workshop on Applied Physics and Materials Science, IBWAP-2017, Constanța, Roânia, Prezentare poster
Florina Lucica Zorilă, Bogdan Zorilă, Maria Mihaela Manea, Spectroscopic study of membrane fluidity modifications induced by different decontamination treatments on Escherichia coli, 17th International Balkan Workshop on Applied Physics and Materials Science, IBWAP-2017, Constanța, Roânia, Coautor prezentare poster
Bogdan Zorilă, Mihaela Bacalum, Study of the interaction between antimicrobial peptides and model cell membranes by steady state and time resolved fluorescence, 4th International Conference on Analytical and Nanoanalytical Methods for Biomedical and Environmental Sciences, IC-ANMBES-2016, Brașov, România, Prezentare poster
Bogdan Zorilă, Mihaela Bacalum and Mihai Radu, Log-Normal deconvolution of Laurdan fluorescence spectra – a tool to assess lipid membrane fluidity, 3th International Conference on Analytical and Nanoanalytical Methods for Biomedical and Environmental Sciences, IC-ANMBES-2014, Brașov, România, Prezentare poster
Alte lucrări prezentate la conferințe internaționale
Bogdan Zorilă, Valentin-Teodor Acasandrei, Nicolae Mocanu, Support database for first responders in transportation incident involving dangerous materials, 18th International Balkan Workshop on Applied Physics and Materials Science, IBWAP-2018, Constanța, Roânia, Prezentare poster
Bogdan Zorilă, Software developments for monitoring meteorological and radiological parameters, ELSEDIMA 2018, Cluj-Napoca, România, Prezentare poster
Anatol Oprea, Bogdan Zorilă, Big data analysis for radon map, ELSEDIMA 2018, Cluj-Napoca, România, Coautor prezentare orală
Bogdan Zorilă, Valentin-Teodor Acasandrei, Nicolae Mocanu, Local centre for radiological surveillance of the environment (LCRSE) – components and future upgrades for web and offline use, 16th International Balkan Workshop on Applied Physics and Materials Science, IBWAP-2016, Constanța, Roânia, Prezentare poster
F.L. Zorilă, C. Ionescu, L.S. Crăciun, B. Zorilă, AFM investigation of morphological modifications induced by different decontamination treatments on bacteria, 15th International Balkan Workshop on Applied Physics, IBWAP-2015, Constanța, România, Coautor prezentare poster
Bogdan Zorilă, Chemical detection capabilities of mobile CBRN unit, 3th EMERSYS Project Steering Committee, Workshop for stakeholders information and consultation, 2015, Giurgiu, România, Prezentare orală
Bogdan Zorilă, Practical examples with the DIEX platform for registering/visualizing real time data while they are recorded and transmitted from the actual scene of a Radiological/Nuclear emergency, “Theoretical and practical training on use of radiological and nuclear detection equipment” (Session Training 6) o the EMERSYS Course “Enhance the exercise preparation and emergency expertise from local and the cross-border area by training CBRN operational staff”, 2015, București, România, Prezentare orală
B. Zorilă, V.T. Acasandrei, A. Cocioceanu, DIEX Platform – Status Report, Main planning conference to prepare common exercise for CBRN emergency situations, 2015, Russe, Bulgaria, Prezentare orală
D. Galeriu, M. Duma, A. Melintescu, B. Zorilă, Towards a nuclear safety ASOS at IFIN-HH, 5th International Workshop on Optoelectronic Techniques for Environmental Monitoring, OTEM-2011, Măgurele, România, Coautor prezentare orală
Lucrări legate de Teză prezentate la conferințe naționale
Bogdan Zorilă, Mihaela Bacalum, Constantin Daniel Neguț, Mihalis Cuturbinis, Mihai Radu, Effect of gamma radiation on fluorescent peptides, 15th National Conference of Biophysics, 2018, București, România, Prezentare poster
Bogdan Zorilă, Mihaela Bacalum and Mihai Radu, Fluidity changes in lipid bilayers induced by antimicrobial peptides, 15th National Conference of Biophysics, 2018, București, România, Prezentare poster
Mirela Cristea, Bogdan Zorilă, Mihaela Bacalum, Claudia G. Chilom, The effect of folic acid on DPPC liposomes, Bucharest University Faculty of Physics 2018 Meeting, Măgurele, Romania, Coautor prezentare orală
Bogdan Zorilă, Mihaela Bacalum, Mihai Radu, Aurel I. Popescu, Fluorescence lifetime of tryptophan – a tool to assess protein microenvironment. Design and optimization of a time resolved fluorimeter, Bucharest University Faculty of Physics 2017 Meeting, Măgurele, Romania, Prezentare orală
Bogdan Zorilă, Mihaela Bacalum, The development and applications of a simple fluorescence lifetime spectrometer, 14th National Conference of Biophysics, 2016, Cluj-Napoca, România, Prezentare poster
Bogdan Zorilă, Mihaela Bacalum, Aurel Popescu, Study of the interaction between antimicrobial peptides and model cell membranes by time resolved fluorescence, 13th National Conference of Biophysics, 2015, Timișoara, România, Prezentare poster
Bogdan Zorilă, Mihaela Bacalum and Mihai Radu, Log-normal deconvolution of Laurdan fluorescence spectra – a tool to assess lipid membrane fluidity, Bucharest University Faculty of Physics 2014 Meeting, Măgurele, Romania, Prezentare orală
Bogdan Zorilă, Mihaela Bacalum, Mihai Radu, Decomposition of Laurdan fluorescence spectra – a new tool for lipid membrane characterization, Scientific communication session of young researchers from IFIN-HH, 2013, Măgurele, Romania, Prezentare orală
Bogdan Zorilă, Mihaela Bacalum, Mihai Radu, A new method for analyzing the elementary, simulated and measured complex spectra of Laurdan, Bucharest University Faculty of Physics 2013 Meeting, Măgurele, Romania, Prezentare orală
B. Zorilă, M. Bacalum, M. Radu, Solvent effects and photophysical studies of polarity sensitive probe – Laurdan, 12th National Conference on Biophysics with International Participation, CNB-2013, Iași, România, Prezentare poster
M. Bacalum, B. Zorilă, E. Angheluță, M. Radu, Laurdan fluorescence spectroscopy as a tool to investigate lipid bilayer dynamics, 11th National Conference on Biophysics with International Participation, CNB-2011, Sibiu, România, Coautor prezentare poster
Mihaela Bacalum, Bogdan Zorilă, Elena Angheluță, Marcel Ameloot and Mihai Radu, Using laurdan fluorescence to investigate fluidity changes in biological and artificial membranes, 11th National Conference on Biophysics with International Participation, CNB-2011, Sibiu, România, Coautor prezentare orală
Alte lucrări prezentate la conferințe naționale
Bogdan Zorilă, EMERSYS DIEX Platform for exchanging CBRN data and information. future developments with applications in IFIN-HH, Scientific communication session of young researchers from IFIN-HH, 2015, Măgurele, Romania, Prezentare orală
Florina-Lucica Zorilă, Mihaela Bacalum, Bogdan Zorilă, Cristina Ionescu, Study of the morphological and metabolical modifications induced by different chemical decontamination agents on Escherichia coli, 13th National Conference of Biophysics, 2015, Timișoara, România, Coautor prezentare poster
Participări la cursuri de specializare
"Time-Resolved Microscopy and Correlation Spectroscopy", 2012, PicoQuant, Berlin, Germany, Certificat de participare
“Training Course for Installation, Maintenance and Repairs” for SARAD instruments, 2017, SARAD GmbH, Dresden, Germany, Certificat de autorizare
“Panasonic TLD Training Course in TLD Reader/Irradiator Electronic Testing and Repair”, 2017, Dositracker SRL, Măgurele, România, Certificat de recunoaștere
“Toward an integrated, joint cross-border detection system and harmonized rapid responses procedures to chemical, biological, radiological and nuclear emergencies Emersys”, 2015, IFIN-HH, București, România, Certificat de formator intern
“Datalogger Programming in CRBasic”, 2013, Campbell Scientific Ltd., Shepshed, United Kingdom, Certificat de participare
“Huygens imaging trainings”, 2012, Scientific Volume Imaging B.V., Hilversum, The Netherlands, Certificat de participare
Alte activități desfășurate
Conducător științific din partea IFIN-HH pentru lucrarea de diplomă “Studiul fluidității lipozomilor cu dipalmitoilfosfatidilcolină (DPPC) și al interacțiunii lor cu acidul folic.”, 2018, Universitatea din București, Facultatea de Fizică, Absolvent: Mirela Cristea
Conducător științific din partea IFIN-HH pentru lucrarea de diplomă “Dependența fluidității membranelor lipidice model de compoziția lipidică.”, 2016, Universitatea din București, Facultatea de Fizică, Absolvent: Alexandra Alina Lungana
Conducător științific din partea IFIN-HH pentru lucrarea de diplomă “Aplicațiile laserilor în biologie. Spectroscopia Corelată de Fluorescență.”, 2015, Universitatea “Politehnica” din București, Facultatea de Electronică, Telecomunicații și Tehnologia Informației, Absolvent: Taisia Ioana Bucur
Conducător științific din partea IFIN-HH pentru lucrarea de disertație “Studiul fluidității membranelor lipidice model preparate din DOPC/DPPC.”, 2014, Universitatea din București, Facultatea de Fizică, Masterand: Mihai Avram
Bibliografie
Abornev, S. M. și Burshtein, E. A. (1992) Resolution of Protein Tryptophan Fluorescence-Spectra into Elementary Components, Molecular Biology, 26, 890-897.
Ahmad, I., Perkins, W. R., Lupan, D. M., Selsted, M. E. și Janoff, A. S. (1995) Liposomal entrapment of the neutrophil-derived peptide indolicidin endows it with in vivo antifungal activity, Biochim Biophys Acta, 1237, 109-14.
Akseenko, V., Shumskaya, T., Slapochnikova, V. și Shein, N. (1989) Quantitative analysis of multicomponent systems based on the mathematical treatment of vibrational spectra, J. Appl. Spectrosc, 51, 306-311.
Albani, J. R. (2009) Fluorescence lifetimes of tryptophan: structural origin and relation with So –> 1Lb and So –> 1La transitions, J Fluoresc, 19, 1061-71.
Albani, J. R. (2014a) Origin of tryptophan fluorescence lifetimes part 1. Fluorescence lifetimes origin of tryptophan free in solution, J Fluoresc, 24, 93-104.
Albani, J. R. (2014b) Origin of tryptophan fluorescence lifetimes. Part 2: fluorescence lifetimes origin of tryptophan in proteins, J Fluoresc, 24, 105-17.
Alberts, B. (2008) Molecular biology of the cell., New York, NY [u.a.], Garland Science Taylor & Francis.
Aley, S. B., Zimmerman, M., Hetsko, M., Selsted, M. E. și Gillin, F. D. (1994) Killing of Giardia lamblia by cryptdins and cationic neutrophil peptides, Infect Immun, 62, 5397-403.
Aliste, M. P., MacCallum, J. L. și Tieleman, D. P. (2003) Molecular dynamics simulations of pentapeptides at interfaces: Salt bridge and cation-pi interactions, Biochemistry, 42, 8976-8987.
Angelone, M., Battistoni, G., Bellini, F., Bocci, V., Collamati, F., Lucia, E. D., Faccini, R., Ferroni, F., Fiore, S., Marafini, M., Materazzo, D., Mattei, I., Morganti, S., Patera, V., Piersanti, L., Pillon, M., Recchia, L., Russomando, A., Sarti, A., Sciubba, A., Camillocci, E. S. și Voena, C. (2014) Properties of para-Terphenyl as a Detector for alpha, beta and gamma Radiation, IEEE Transactions on Nuclear Science, 61, 1483-1487.
Baba, T. și Schneewind, O. (1998) Instruments of microbial warfare: bacteriocin synthesis, toxicity and immunity, Trends in Microbiology, 6, 66-71.
Bacalum, M., Janosi, L., Zorilă, F., Tepes, A. M., Ionescu, C., Bogdan, E., Hadade, N., Craciun, L., Grosu, I., Turcu, I. și Radu, M. (2017) Modulating short tryptophan- and arginine-rich peptides activity by substitution with histidine, Biochim Biophys Acta, 1861, 1844-1854.
Bacalum, M., Zorilă, B. și Radu, M. (2013) Fluorescence spectra decomposition by asymmetric functions: Laurdan spectrum revisited, Analytical Biochemistry, 440, 123-129.
Bagatolli, L. A. (2006) To see or not to see: lateral organization of biological membranes and fluorescence microscopy, Biochim Biophys Acta, 1758, 1541-56.
Bagatolli, L. A. și Gratton, E. (2000) Two photon fluorescence microscopy of coexisting lipid domains in giant unilamellar vesicles of binary phospholipid mixtures, Biophys J, 78, 290-305.
Bagatolli, L. A., Parasassi, T., Fidelio, G. D. și Gratton, E. (1999) A model for the interaction of 6-lauroyl-2-(N,N-dimethylamino)naphthalene with lipid environments: implications for spectral properties, Photochem Photobiol, 70, 557-64.
Bals, R., Wang, X. R., Wu, Z. R., Freeman, T., Bafna, V., Zasloff, M. și Wilson, J. M. (1998) Human beta-defensin 2 is a salt-sensitive peptide antibiotic expressed in human lung, Journal of Clinical Investigation, 102, 874-880.
Bastos, M., Bai, G., Gomes, P., Andreu, D., Goormaghtigh, E. și Prieto, M. (2008) Energetics and partition of two cecropin-melittin hybrid peptides to model membranes of different composition, Biophys J, 94, 2128-41.
Batenburg, A. M., van Esch, J. H. și de Kruijff, B. (1988) Melittin-induced changes of the macroscopic structure of phosphatidylethanolamines, Biochemistry, 27, 2324-31.
Becker, W. M. (2012) World of the cell, New York, Pearson.
Beechem, J. M. și Brand, L. (1985) Time-resolved fluorescence of proteins, Annu Rev Biochem, 54, 43-71.
Bello, J., Bello, H. R. și Granados, E. (1982) Conformation and aggregation of melittin: dependence on pH and concentration, Biochemistry, 21, 461-5.
Beschiaschvili, G. și Baeuerle, H. D. (1991) Effective charge of melittin upon interaction with POPC vesicles, Biochim Biophys Acta, 1068, 195-200.
Bessalle, R., Kapitkovsky, A., Gorea, A., Shalit, I. și Fridkin, M. (1990) All-D-Magainin – Chirality, Antimicrobial Activity and Proteolytic Resistance, Febs Letters, 274, 151-155.
Beven, L., Castano, S., Dufourcq, J., Wieslander, A. și Wroblewski, H. (2003) The antibiotic activity of cationic linear amphipathic peptides: lessons from the action of leucine/lysine copolymers on bacteria of the class Mollicutes, Eur J Biochem, 270, 2207-17.
Bismuto, E., Sirangelo, I. și Irace, G. (1993) Folding and dynamics of melittin in reversed micelles, Biochim Biophys Acta, 1146, 213-8.
Blondelle, S. E. și Lohner, K. (2004) Combinatorial libraries: A tool to design antimicrobial and antifungal peptide analogues having lytic specificities for structure–activity relationship studies, Peptide Science, 55, 74-87.
Blondelle, S. E., PerezPaya, E. și Houghten, R. A. (1996) Synthetic combinatorial libraries: Novel discovery strategy for identification of antimicrobial agents, Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 40, 1067-1071.
Boens, N., Qin, W., Basaric, N., Hofkens, J., Ameloot, M., Pouget, J., Lefevre, J. P., Valeur, B., Gratton, E., vandeVen, M., Silva, N. D., Jr., Engelborghs, Y., Willaert, K., Sillen, A., Rumbles, G., Phillips, D., Visser, A. J., van Hoek, A., Lakowicz, J. R., Malak, H., Gryczynski, I., Szabo, A. G., Krajcarski, D. T., Tamai, N. și Miura, A. (2007) Fluorescence lifetime standards for time and frequency domain fluorescence spectroscopy, Anal Chem, 79, 2137-49.
Bolshakova, A. V., Kiselyova, O. I., Filonov, A. S., Frolova, O. Y., Lyubchenko, Y. L. și Yaminsky, I. V. (2001) Comparative studies of bacteria with an atomic force microscopy operating in different modes, Ultramicroscopy, 86, 121-8.
Boman, H. G. (1995) Peptide Antibiotics and Their Role in Innate Immunity, Annual Review of Immunology, 13, 61-92.
Boman, H. G., Agerberth, B. și Boman, A. (1993) Mechanisms of action on Escherichia coli of cecropin P1 and PR-39, two antibacterial peptides from pig intestine, Infect Immun, 61, 2978-84.
Bradshaw, J. P. (2003) Cationic antimicrobial peptides – Issues for potential clinical use, Biodrugs, 17, 233-240.
Brogden, K. A. (2005) Antimicrobial peptides: pore formers or metabolic inhibitors in bacteria?, Nat Rev Microbiol, 3, 238-50.
Brown, K. L. și Hancock, R. E. (2006) Cationic host defense (antimicrobial) peptides, Curr Opin Immunol, 18, 24-30.
Bulet, P. și Stocklin, R. (2005) Insect antimicrobial peptides: Structures, properties and gene regulation, Protein and Peptide Letters, 12, 3-11.
Burstein, E. A. (1968) Quenching of protein fluorescence. I. Principles of the method. Solutions of tryptophan, tyrosine and denatured proteins, Biophysics (Moscow), 13, 433-442.
Burstein, E. A. (1977) Intrinsic protein luminescence (the nature and application), Advances in Science and Technology (Itogi Nauki i Tekhniki), ser. Biophysics, 7.
Burstein, E. A., Abornev, S. M. și Reshetnyak, Y. K. (2001) Decomposition of protein tryptophan fluorescence spectra into log-normal components. I. Decomposition algorithms, Biophysical Journal, 81, 1699-1709.
Burstein, E. A. și Emelyanenko, V. I. (1996) Log-normal description of fluorescence spectra of organic fluorophores, Photochemistry and Photobiology, 64, 316-320.
Bush, K. (2004) Antibacterial drug discovery in the 21st century, Clinical Microbiology and Infection, 10, 10-17.
Castro, M. S. și Fontes, W. (2005) Plant defense and antimicrobial peptides, Protein and Peptide Letters, 12, 13-18.
Chan, W. și White, P. (1999) Fmoc solid phase peptide synthesis, Oxford, Oxford University Press. Disponibil on-line: http://public.eblib.com/choice/publicfullrecord.aspx?p=4963406.
Chattopadhyay, A. (2003) Exploring membrane organization and dynamics by the wavelength-selective fluorescence approach, Chem Phys Lipids, 122, 3-17.
Chen, Y. și Barkley, M. D. (1998) Toward understanding tryptophan fluorescence in proteins, Biochemistry, 37, 9976-82.
Chernysh, S., Gordya, N. și Suborova, T. (2015) Insect Antimicrobial Peptide Complexes Prevent Resistance Development in Bacteria, Plos One, 10.
Chilom, C. G., Zorila, B., Popescu, A. I. și Zorila, B. (2017) Characterization of some physico-chemical properties and interactions of human and bovine serum albumins with mitomycin C, Rom. J. Phys. Romanian Journal of Physics, 62, 7-8.
Chiou, P. P., Chen, M. J., Lin, C. M., Khoo, J., Larson, J., Holt, R., Leong, J. A., Thorgarrd, G. și Chen, T. T. (2014) Production of homozygous transgenic rainbow trout with enhanced disease resistance, Mar Biotechnol (NY), 16, 299-308.
Chiou, P. P., Lin, C. M., Perez, L. și Chen, T. T. (2002) Effect of cecropin B and a synthetic analogue on propagation of fish viruses in vitro, Mar Biotechnol (NY), 4, 294-302.
Chopra, I. (2013) The 2012 Garrod Lecture: Discovery of antibacterial drugs in the 21st century, Journal of Antimicrobial Chemotherapy, 68, 496-505.
Chou, H. T., Wen, H. W., Kuo, T. Y., Lin, C. C. și Chen, W. J. (2010) Interaction of cationic antimicrobial peptides with phospholipid vesicles and their antibacterial activity, Peptides, 31, 1811-1820.
Constantinescu, I. și Lafleur, M. (2004) Influence of the lipid composition on the kinetics of concerted insertion and folding of melittin in bilayers, Biochim Biophys Acta, 1667, 26-37.
Cooper, G. M. (2000) The cell : a molecular approach, Washington; Sunderland, Mass., Sunauer Associates ASM Press.
Cui, Y., Oh, Y. J., Lim, J., Youn, M., Lee, I., Pak, H. K., Park, W., Jo, W. și Park, S. (2012) AFM study of the differential inhibitory effects of the green tea polyphenol (-)-epigallocatechin-3-gallate (EGCG) against Gram-positive and Gram-negative bacteria, Food Microbiology, 29, 80-87.
D'Agata, E. M. C. (2015) Rapidly Rising Prevalence of Nosocomial Multidrug-Resistant, Gram-Negative Bacilli: A 9-Year Surveillance Study, Infection Control & Hospital Epidemiology, 25, 842-846.
Dathe, M. și Wieprecht, T. (1999) Structural features of helical antimicrobial peptides: their potential to modulate activity on model membranes and biological cells, Biochim Biophys Acta, 1462, 71-87.
de Jongh, H. H., Goormaghtigh, E. și Killian, J. A. (1994) Analysis of circular dichroism spectra of oriented protein-lipid complexes: toward a general application, Biochemistry, 33, 14521-8.
De Vequi-Suplicy, C. C., Benatti, C. R. și Lamy, M. T. (2006) Laurdan in Fluid Bilayers: Position and Structural Sensitivity, Journal of Fluorescence, 16, 431-439.
Demchenko, A. P. (1988) Red-Edge-Excitation Fluorescence Spectroscopy of Single-Tryptophan Proteins, European Biophysics Journal with Biophysics Letters, 16, 121-129.
Dempsey, C. E. (1990) The actions of melittin on membranes, Biochim Biophys Acta, 1031, 143-61.
Dempsey, C. E. și Butler, G. S. (1992) Helical structure and orientation of melittin in dispersed phospholipid membranes from amide exchange analysis in situ, Biochemistry, 31, 11973-7.
Dennison, S. R., Harris, F., Mura, M. și Phoenix, D. A. (2018) An Atlas of Anionic Antimicrobial Peptides from Amphibians, Current Protein & Peptide Science, 19, 823-838.
Deshpande, L. M., Fritsche, T. R. și Jones, R. N. (2004) Molecular epidemiology of selected multidrug-resistant bacteria: A global report from the SENTRY Antimicrobial Surveillance Program, Diagnostic Microbiology and Infectious Disease, 49, 231-236.
Deslouches, B., Steckbeck, J. D., Craigo, J. K., Doi, Y., Mietzner, T. A. și Montelaro, R. C. (2013) Rational design of engineered cationic antimicrobial peptides consisting exclusively of arginine and tryptophan, and their activity against multidrug-resistant pathogens, Antimicrob Agents Chemother, 57, 2511-21.
Diamond, G., Beckloff, N., Weinberg, A. și Kisich, K. O. (2009) The Roles of Antimicrobial Peptides in Innate Host Defense, Current Pharmaceutical Design, 15, 2377-2392.
Dosler, S. (2017) Antimicrobial peptides: Coming to the end of antibiotic era, the most promising agents, Istanbul Journal of Pharmacy, 47, 72-76.
Eftink, M. R. (1991) Fluorescence techniques for studying protein structure, Methods Biochem Anal, 35, 127-205.
Eftink, M. R. și Ghiron, C. A. (1976) Fluorescence quenching of indole and model micelle systems, The Journal of Physical Chemistry, 80, 486-493.
Eftink, M. R. și Ghiron, C. A. (1981) Fluorescence quenching studies with proteins, Anal Biochem, 114, 199-227.
Eftink, M. R. și Ghiron, C. A. (1994) Oxygen fluorescence quenching studies with single tryptophan-containing proteins, J Fluoresc, 4, 187-93.
Eichler, J. și Houghten, R. A. (1995) Generation and Utilization of Synthetic Combinatorial Libraries, Molecular Medicine Today, 1, 174-180.
Emelyanenko, V. I., Reshetnyak, Y. K., Andreev, O. A. și Burstein, E. A. (2000) Log-normal component analysis of fluorescence spectra of prodan and acrylodan bound to proteins, Biofizika, 45, 207-219.
Epand, R., Lehrer, R. I., Waring, A., Wang, W., Maget-Dana, R., Lelievre, D. și Epand, R. M. (2003) Direct comparison of membrane interactions of model peptides composed of only Leu and Lys residues, Biopolymers, 71, 2-16.
Epand, R. M. și Vogel, H. J. (1999) Diversity of antimicrobial peptides and their mechanisms of action, Biochimica Et Biophysica Acta-Biomembranes, 1462, 11-28.
Falla, T. J., Karunaratne, D. N. și Hancock, R. E. (1996) Mode of action of the antimicrobial peptide indolicidin, J Biol Chem, 271, 19298-303.
Faucon, J. F., Dufourcq, J. și Lussan, C. (1979) The self-association of melittin and its binding to lipids: an intrinsic fluorescence polarization study, FEBS Lett, 102, 187-90.
Ficarra, F. A., Grandellis, C., Garavaglia, B. S., Gottig, N. și Ottado, J. (2018) Bacterial and plant natriuretic peptides improve plant defence responses against pathogens, Molecular Plant Pathology, 19, 801-811.
Findlay, F., Proudfoot, L., Stevens, C. și Barlow, P. G. (2016) Cationic host defense peptides; novel antimicrobial therapeutics against Category A pathogens and emerging infections, Pathog Glob Health, 110, 137-47.
Frey, S. și Tamm, L. K. (1991) Orientation of melittin in phospholipid bilayers. A polarized attenuated total reflection infrared study, Biophys J, 60, 922-30.
Friedrich, C. L., Moyles, D., Beveridge, T. J. și Hancock, R. E. W. (2000) Antibacterial action of structurally diverse cationic peptides on gram-positive bacteria, Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 44, 2086-2092.
Gagnon, M. C., Strandberg, E., Grau-Campistany, A., Wadhwani, P., Reichert, J., Burck, J., Rabanal, F., Auger, M., Paquin, J. F. și Ulrich, A. S. (2017) Influence of the Length and Charge on the Activity of alpha-Helical Amphipathic Antimicrobial Peptides, Biochemistry, 56, 1680-1695.
Ganz, T. (2003) Defensins: Antimicrobial peptides of innate immunity, Nature Reviews Immunology, 3, 710-720.
Garcia-Olmedo, F., Molina, A., Alamillo, J. M. și Rodriguez-Palenzuela, P. (1998) Plant defense peptides, Biopolymers, 47, 479-491.
Gauglitz, G., Moore, D. S. și Vo-Dinh, T. (2014) Handbook of spectroscopy Vol. 1-4, Weinheim, Wiley-VCH.
Gazit, E., Bach, D., Kerr, I. D., Sansom, M. S., Chejanovsky, N. și Shai, Y. (1994a) The alpha-5 segment of Bacillus thuringiensis delta-endotoxin: in vitro activity, ion channel formation and molecular modelling, Biochem J, 304 ( Pt 3), 895-902.
Gazit, E., Boman, A., Boman, H. G. și Shai, Y. (1995) Interaction of the mammalian antibacterial peptide cecropin P1 with phospholipid vesicles, Biochemistry, 34, 11479-88.
Gazit, E., Lee, W. J., Brey, P. T. și Shai, Y. (1994b) Mode of action of the antibacterial cecropin B2: a spectrofluorometric study, Biochemistry, 33, 10681-92.
Gazit, E. și Shai, Y. (1993) Structural and functional characterization of the alpha 5 segment of Bacillus thuringiensis delta-endotoxin, Biochemistry, 32, 3429-36.
Geddes, C. D. și Lakowicz, J. R. (2004) Annual reviews in fluorescence 2003, Journal of Fluorescence, 14, 127-127.
Gerken, U. și Imhof, N. (2010) Time-Resolved Spectroscopy of Proteins, Disponibil on-line: https://www.picoquant.com/images/uploads/page/files/7354/appnote_tr_proteins.pdf, Institute of Microbiology, University of Hohenheim, Stuttgart, Germany.
Ghosh, A. K., Rukmini, R. și Chattopadhyay, A. (1997) Modulation of tryptophan environment in membrane-bound melittin by negatively charged phospholipids: implications in membrane organization and function, Biochemistry, 36, 14291-305.
Goldman, M. J., Anderson, G. M., Stolzenberg, E. D., Kari, U. P., Zasloff, M. și Wilson, J. M. (1997) Human beta-defensin-1 is a salt-sensitive antibiotic in lung that is inactivated in cystic fibrosis, Cell, 88, 553-560.
Gordon, Y. J., Romanowski, E. G. și McDermott, A. M. (2005) A review of antimicrobial peptides and their therapeutic potential as anti-infective drugs, Current Eye Research, 30, 505-515.
Granjon, T., Vacheron, M. J., Vial, C. și Buchet, R. (2001) Mitochondrial creatine kinase binding to phospholipids decreases fluidity of membranes and promotes new lipid-induced beta structures as monitored by red edge excitation shift, Laurdan fluorescence, and FTIR, Biochemistry, 40, 6016-6026.
Guo, C., Huang, Y., Cong, P., Liu, X., Chen, Y. și He, Z. (2014) Cecropin P1 inhibits porcine reproductive and respiratory syndrome virus by blocking attachment, BMC Microbiol, 14, 273.
Habermann, E. (1972) Bee and wasp venoms, Science, 177, 314-22.
Hale, J. D. și Hancock, R. E. (2007) Alternative mechanisms of action of cationic antimicrobial peptides on bacteria, Expert Rev Anti Infect Ther, 5, 951-9.
Hancock, R. E. și Diamond, G. (2000) The role of cationic antimicrobial peptides in innate host defences, Trends Microbiol, 8, 402-10.
Hancock, R. E. și Patrzykat, A. (2002) Clinical development of cationic antimicrobial peptides: from natural to novel antibiotics, Curr Drug Targets Infect Disord, 2, 79-83.
Hancock, R. E. W. (2001) Cationic peptides: effectors in innate immunity and novel antimicrobials, The Lancet Infectious Diseases, 1, 156-164.
Harder, J. și Schröder, J.-M. (2016) Antimicrobial Peptides: Role in Human Health and Disease, Antimicrobial Peptides: Role in Human Health and Disease, 1-158.
Hayes, D. M. și Kollman, P. A. (1976a) Electrostatic potentials of proteins. 1. Carboxypeptidase A, J Am Chem Soc, 98, 3335-45.
Hayes, D. M. și Kollman, P. A. (1976b) Electrostatic potentials of proteins. 2. Role of electrostatics in a possible catalytic mechanism for carboxypeptidase A, J Am Chem Soc, 98, 7811-4.
He, Y. și Lazaridis, T. (2013) Activity determinants of helical antimicrobial peptides: a large-scale computational study, PLoS One, 8, e66440.
Hernández-Villa, L., Manrique-Moreno, M., Leidy, C., Jemioła-Rzemińska, M., Ortíz, C. și Strzałka, K. (2018) Biophysical evaluation of cardiolipin content as a regulator of the membrane lytic effect of antimicrobial peptides, Biophysical Chemistry, 238, 8-15.
Hershberger, M. V., Lumry, R. și Verrall, R. (1981) The 3-Methylindole/n-Butanol Exciplexes: Evidence for Two Exciplex Sites in Indole Compounds, Photochemistry and Photobiology, 33, 609-617.
Honig, B. și Nicholls, A. (1995) Classical electrostatics in biology and chemistry, Science, 268, 1144-9.
Hsu, J. C. și Yip, C. M. (2007) Molecular dynamics simulations of indolicidin association with model lipid bilayers, Biophys J, 92, L100-2.
http://fityk.nieto.pl.
http://www.antistaphybase.com.
http://www.iss.com/resources/reference/data_tables/FL_LifetimeStandards.html.
https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/16129733.
https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/16130477.
https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/16133648.
https://www.chromacademy.com/lms/sco5/Solvent_Miscibility_Chart.pdf.
Huang, H. W. (2000) Action of antimicrobial peptides: two-state model, Biochemistry, 39, 8347-52.
Hui, Y., Xue, X., Xuesong, Z. și Yan, W. Intrinsic Fluorescence Spectra of Tryptophan, Tyrosine and Phenyloalanine. 5th International Conference on Advanced Design and Manufacturing Engineering (ICADME 2015), 2015. Atlantis Press, 224-233.
Ionescu, D. și Ganea, C. (2012) A study of quercetin effects on phospholipid membranes containing cholesterol using Laurdan fluorescence, Eur Biophys J.
Iwadate, M., Asakura, T. și Williamson, M. P. (1998) The structure of the melittin tetramer at different temperatures–an NOE-based calculation with chemical shift refinement, Eur J Biochem, 257, 479-87.
Iwanowska, J., Swiderski, L. și Moszynski, M. (2012) Liquid scintillators and composites in fast neutron detection, Journal of Instrumentation, 7.
Izadpanah, A. și Gallo, R. L. (2005) Antimicrobial peptides, Journal of the American Academy of Dermatology, 52, 381-392.
Jenssen, H., Hamill, P. și Hancock, R. E. W. (2006) Peptide antimicrobial agents, Clinical Microbiology Reviews, 19, 491-+.
Jiang, Z., Mant, C. T., Vasil, M. și Hodges, R. S. (2018) Role of positively charged residues on the polar and non-polar faces of amphipathic alpha-helical antimicrobial peptides on specificity and selectivity for Gram-negative pathogens, Chem Biol Drug Des, 91, 75-92.
Jiang, Z., Vasil, A. I., Hale, J. D., Hancock, R. E., Vasil, M. L. și Hodges, R. S. (2008) Effects of net charge and the number of positively charged residues on the biological activity of amphipathic alpha-helical cationic antimicrobial peptides, Biopolymers, 90, 369-83.
Jing, W., Hunter, H. N., Hagel, J. și Vogel, H. J. (2003a) The structure of the antimicrobial peptide Ac-RRWWRF-NH2 bound to micelles and its interactions with phospholipid bilayers, Journal of Peptide Research, 61, 219-229.
Jing, W. G., Demcoe, A. R. și Vogel, H. J. (2003b) Conformation of a bactericidal domain of puroindoline a: Structure and mechanism of action of a 13-residue antimicrobial peptide, Journal of Bacteriology, 185, 4938-4947.
Jurkiewicz, P., Cwiklik, L., Jungwirth, P. și Hof, M. (2012) Lipid hydration and mobility: an interplay between fluorescence solvent relaxation experiments and molecular dynamics simulations, Biochimie, 94, 26-32.
Jurkiewicz, P., Olzynska, A., Langner, M. și Hof, M. (2006) Headgroup hydration and mobility of DOTAP/DOPC bilayers: a fluorescence solvent relaxation study, Langmuir, 22, 8741-8749.
Kapusta, P. (2002) Sensitivity of FluoTime Series Lifetime Spectrometers, Berlin.
Kasha, M. (1950) Characterization of electronic transitions in complex molecules, Discussions of the Faraday Society, 9, 14-19.
Kawski, A., Kukliński, B., Bojarski, P. și Diehl, H. (2000) Ground and Excited State Dipole Moments of LAURDAN Determined from Solvatochromic and Thermochromic Shifts of Absorption and Fluorescence Spectra, Z. Naturforsch, A 55, 817-822.
Khandelia, H. și Kaznessis, Y. N. (2007) Cation-pi interactions stabilize the structure of the antimicrobial peptide indolicidin near membranes: molecular dynamics simulations, J Phys Chem B, 111, 242-50.
Khurshid, Z., Zafar, M. S., Naseem, M., Khan, R. S. și Najeeb, S. (2018) Human Oral Defensins Antimicrobial Peptides: A Future Promising Antimicrobial Drug, Current Pharmaceutical Design, 24, 1130-1137.
Knoppel, E., Eisenberg, D. și Wickner, W. (1979) Interactions of Melittin, a Pre-Protein Model, with Detergents, Biochemistry, 18, 4177-4181.
Konovalova, M. V., Zubareva, A. A., Lutsenko, G. V. și Svirshchevskaya, E. V. (2018) Antimicrobial Peptides in Health and Disease (Review), Applied Biochemistry and Microbiology, 54, 238-244.
Kouya, T., Koiso, Y., Taiyouji, M., Ohtsubo, S., Tanaka, T. și Taniguchi, M. (2009) Growth-inhibitory activity of antimicrobial peptides from rice against oral pathogenic bacteria and clarification of their action mechanism, Journal of Bioscience and Bioengineering, 108, S141-S141.
Koynova, R. și Caffrey, M. (1998) Phases and phase transitions of the phosphatidylcholines, Biochimica Et Biophysica Acta-Reviews on Biomembranes, 1376, 91-145.
Kozyra, K. A., Heldt, J. R., Heldt, J., Engelkec, M. și Diehl, H. A. (2003) Concentration and Temperature Dependence of Laurdan Fluorescence in Glycerol, Zeitschrift für Naturforschung A.
Kreil, G. (1994) Antimicrobial Peptides from Amphibian Skin – an Overview, Antimicrobial Peptides, 186, 77-85.
Kriech, M. A. și Conboy, J. C. (2003) Label-free chiral detection of melittin binding to a membrane, J Am Chem Soc, 125, 1148-9.
Kubiak, J., Brewer, J., Hansen, S. și Bagatolli, L. A. (2011) Lipid Lateral Organization on Giant Unilamellar Vesicles Containing Lipopolysaccharides, Biophysical Journal, 100, 978-986.
Kumar, T. V. V. și Sanil, G. (2017) A Review of the Mechanism of Action of Amphibian Antimicrobial Peptides Focusing on Peptide-Membrane Interaction and Membrane Curvature, Current Protein & Peptide Science, 18, 1263-1272.
Ladokhin, A. S., Jayasinghe, S. și White, S. H. (2000) How to Measure and Analyze Tryptophan Fluorescence in Membranes Properly, and Why Bother?, Analytical Biochemistry, 285, 235-245.
Ladokhin, A. S., Selsted, M. E. și White, S. H. (1997) Bilayer interactions of indolicidin, a small antimicrobial peptide rich in tryptophan, proline, and basic amino acids, Biophys J, 72, 794-805.
Ladokhin, A. S. și White, S. H. (2001) 'Detergent-like' permeabilization of anionic lipid vesicles by melittin, Biochim Biophys Acta, 1514, 253-60.
Lakowicz, J. R. (2006) Principles of Fluorescence Spectroscopy, New York, Springer Science+Business Media, LLC.
Lakowicz, J. R. și Geddes, C. D. (2002) Topics in fluorescence spectroscopy. Volume 2, Volume 2, New York, Plenum Press. Disponibil on-line: http://www.myilibrary.com?id=20633.
Lakowicz, J. R. și Sheppard, J. R. (1981) Fluorescence spectroscopic studies of Huntington fibroblast membranes, Am J Hum Genet, 33, 155-65.
Lambert, P. A. (2005) Bacterial resistance to antibiotics: Modified target sites, Advanced Drug Delivery Reviews, 57, 1471-1485.
Lee, I. H., Cho, Y. și Lehrer, R. I. (1997) Effects of pH and salinity on the antimicrobial properties of clavanins, Infection and Immunity, 65, 2898-2903.
Lee, J. Y., Boman, A., Sun, C. X., Andersson, M., Jornvall, H., Mutt, V. și Boman, H. G. (1989) Antibacterial peptides from pig intestine: isolation of a mammalian cecropin, Proc Natl Acad Sci U S A, 86, 9159-62.
Lee, M. T., Chen, F. Y. și Huang, H. W. (2004) Energetics of pore formation induced by membrane active peptides, Biochemistry, 43, 3590-9.
Lee, T. H., Mozsolits, H. și Aguilar, M. I. (2001) Measurement of the affinity of melittin for zwitterionic and anionic membranes using immobilized lipid biosensors, J Pept Res, 58, 464-76.
Lehrer, R. I. și Ganz, T. (1999) Antimicrobial peptides in mammalian and insect host defence, Curr Opin Immunol, 11, 23-7.
Lehrer, S. S. (1971) Solute perturbation of protein fluorescence. Quenching of the tryptophyl fluorescence of model compounds and of lysozyme by iodide ion, Biochemistry, 10, 3254-3263.
Lehrer, S. S. și Leavis, P. C. (1978) Solute quenching of protein fluorescence, Methods Enzymol, 49, 222-36.
Linke, D., Frank, J., Pope, M. S., Soll, J., Ilkavets, I., Fromme, P., Burstein, E. A., Reshetnyak, Y. K. și Emelyanenko, V. I. (2004) Folding kinetics and structure of OEP16, Biophys J, 86, 1479-87.
Lohner, K. (2017) Membrane-active Antimicrobial Peptides as Template Structures for Novel Antibiotic Agents, Current Topics in Medicinal Chemistry, 17, 508-519.
Loura, L. M., de Almeida, R. F., Coutinho, A. și Prieto, M. (2003) Interaction of peptides with binary phospholipid membranes: application of fluorescence methodologies, Chem Phys Lipids, 122, 77-96.
Lucio, A. D., Vequi-Suplicy, C. C., Fernandez, R. M. și Lamy, M. T. (2010) Laurdan spectrum decomposition as a tool for the analysis of surface bilayer structure and polarity: a study with DMPG, peptides and cholesterol, J Fluoresc, 20, 473-82.
Machan, R., Jurkiewicz, P., Olzynska, A., Olsinova, M., Cebecauer, M., Marquette, A., Bechinger, B. și Hof, M. (2014) Peripheral and Integral Membrane Binding of Peptides Characterized by Time-Dependent Fluorescence Shifts: Focus on Antimicrobial Peptide LAH(4), Langmuir, 30, 6171-6179.
Mahlapuu, M., Hakansson, J., Ringstad, L. și Bjorn, C. (2016) Antimicrobial Peptides : An Emerging Category of Therapeutic Agents, Frontiers in Cellular and Infection Microbiology, 6.
Man, D. K.-W., Kanno, T., Manzo, G., Robertson, B. D., Lam, J. K. W. și Mason, A. J. (2018) Rifampin- or Capreomycin-Induced Remodeling of the Mycobacterium smegmatis Mycolic Acid Layer Is Mitigated in Synergistic Combinations with Cationic Antimicrobial Peptides, mSphere, 3, e00218-18.
Mark, L. M., Peter, F. B., Jason, L. și James, M. R. (2016) Applications for New Scintillator Technologies in Gamma Ray Astronomy, Journal of Physics: Conference Series, 763, 012008.
Marmiroli, N. și Maestri, E. (2014) Plant peptides in defense and signaling, Peptides, 56, 30-44.
Marquette, A. și Bechinger, B. (2018) Biophysical Investigations Elucidating the Mechanisms of Action of Antimicrobial Peptides and Their Synergism, Biomolecules, 8.
Marr, A. K., Gooderham, W. J. și Hancock, R. E. W. (2006) Antibacterial peptides for therapeutic use: obstacles and realistic outlook, Current Opinion in Pharmacology, 6, 468-472.
Marrodan, U. T., von Feilitzsch, F., Oberauer, L., Potzel, W., Ulrich, A., Winter, J. și Wurm, M. (2009) Fluorescence decay-time constants in organic liquid scintillators, Rev Sci Instrum, 80, 043301.
Matsuzaki, K., Murase, O., Tokuda, H., Funakoshi, S., Fujii, N. și Miyajima, K. (1994) Orientational and aggregational states of magainin 2 in phospholipid bilayers, Biochemistry, 33, 3342-9.
Mazze, F. M., Fuzo, C. A. și Degreve, L. (2005) A new amphipathy scale I. Determination of the scale from molecular dynamics data, Biochim Biophys Acta, 1747, 35-46.
Mecke, A., Lee, D. K., Ramamoorthy, A., Orr, B. G. și Banaszak Holl, M. M. (2005) Membrane thinning due to antimicrobial peptide binding: an atomic force microscopy study of MSI-78 in lipid bilayers, Biophys J, 89, 4043-50.
Minahk, C. J. și Morero, R. D. (2003) Inhibition of enterocin CRL35 antibiotic activity by mono- and divalent ions, Letters in Applied Microbiology, 37, 374-379.
Minoux, H. și Chipot, C. (1999) Cation-pi interactions in proteins: Can simple models provide an accurate description?, Journal of the American Chemical Society, 121, 10366-10372.
Mobius, S., Kamolchote, P. și Roeksbutr, W. (1993) Use of Extractive Scintillation and Pulse Shape-Analysis for Environmental Alpha-Assay, Science of the Total Environment, 130, 467-471.
Mohd, A. și Gupta, U. S. (2011) Antimicrobial Peptides and their Mechanism of Action, Research Journal of Biotechnology, 6, 71-79.
Mookherjee, N. și Hancock, R. E. (2007) Cationic host defence peptides: innate immune regulatory peptides as a novel approach for treating infections, Cell Mol Life Sci, 64, 922-33.
Mor, A. (2000) Peptide-based antibiotics: A potential answer to raging antimicrobial resistance, Drug Development Research, 50, 440-447.
Morozova, Y. P., Zharkova, O. M., Balakina, T. Y., Artyukhov, V. Y. și Korolev, B. V. (2011) Conformal transitions of the laurdan molecule in the absorption and fluorescence spectra, Russian Physics Journal, 54, 594.
Moyano, F., Biasutti, M. A., Silber, J. J. și Correa, N. M. (2006) New insights on the behavior of PRODAN in homogeneous media and in large unilamellar vesicles, J Phys Chem B, 110, 11838-46.
Mozsolits, H., Wirth, H. J., Werkmeister, J. și Aguilar, M. I. (2001) Analysis of antimicrobial peptide interactions with hybrid bilayer membrane systems using surface plasmon resonance, Biochim Biophys Acta, 1512, 64-76.
Neale, C., Hsu, J. C., Yip, C. M. și Pomes, R. (2014) Indolicidin binding induces thinning of a lipid bilayer, Biophys J, 106, L29-31.
Nielsen, S. B. și Otzen, D. E. (2010) Impact of the antimicrobial peptide Novicidin on membrane structure and integrity, Journal of Colloid and Interface Science, 345, 248-256.
Ningsih, Z., Hossain, M. A., Wade, J. D., Clayton, A. H. A. și Gee, M. L. (2012) Slow Insertion Kinetics during Interaction of a Model Antimicrobial Peptide with Unilamellar Phospholipid Vesicles, Langmuir, 28, 2217-2224.
Onate-Garzon, J., Manrique-Moreno, M., Trier, S., Leidy, C., Torres, R. și Patino, E. (2017) Antimicrobial activity and interactions of cationic peptides derived from Galleria mellonella cecropin D-like peptide with model membranes, Journal of Antibiotics, 70, 238-245.
Oppenheim, J. J., Biragyn, A., Kwak, L. W. și Yang, D. (2003) Roles of antimicrobial peptides such as defensins in innate and adaptive immunity, Annals of the Rheumatic Diseases, 62, 17-21.
Oren, Z. și Shai, Y. (2004) Mode of action of linear amphipathic α-helical antimicrobial peptides, Peptide Science, 47, 451-463.
Owen, D. M., Rentero, C., Magenau, A., Abu-Siniyeh, A. și Gaus, K. (2012) Quantitative imaging of membrane lipid order in cells and organisms, Nature Protocols, 7, 24-35.
Parasassi, T., Conti, F. și Gratton, E. (1986) Time-resolved fluorescence emission spectra of Laurdan in phospholipid vesicles by multifrequency phase and modulation fluorometry, Cell Mol Biol, 32, 103-8.
Parasassi, T., De Stasio, G., Dubaldo, A. și Gratton, E. (1990a) Phase Fluctuation in Phospholipid-Membranes Revealed by Laurdan Fluorescence, Biophysical Journal, 57, 1179-1186.
Parasassi, T., De Stasio, G., Ravagnan, G., Rusch, R. M. și Gratton, E. (1991) Quantitation of lipid phases in phospholipid vesicles by the generalized polarization of Laurdan fluorescence, Biophys J, 60, 179-89.
Parasassi, T., Di Stefano, M., Loiero, M., Ravagnan, G. și Gratton, E. (1994) Influence of cholesterol on phospholipid bilayers phase domains as detected by Laurdan fluorescence, Biophysical Journal, 66, 120-132.
Parasassi, T., Krasnowska, E. K., Bagatolli, L. și Gratton, E. (1998) LAURDAN and PRODAN as polarity-sensitive fluorescent membrane probes, Journal of Fluorescence, 8, 365-373.
Parasassi, T., Stasio, G. D., Miccheli, A., Bruno, F., Conti, F. și Gratton, E. (1990b) Abscisic acid-induced microheterogeneity in phospholipid vesicle: a fluorescence study, Biophys Chem, 35, 65-73.
Perron, G. G., Zasloff, M. și Bell, G. (2006) Experimental evolution of resistance to an antimicrobial peptide, Proc Biol Sci, 273, 251-6.
Persson, S., Killian, J. A. și Lindblom, G. (1998) Molecular ordering of interfacially localized tryptophan analogs in ester- and ether-lipid bilayers studied by H-2-NMR, Biophysical Journal, 75, 1365-1371.
Petersen, F. N. R., Jensen, M. O. și Nielsen, C. H. (2005) Interfacial tryptophan residues: A role for the cation-pi effect?, Biophysical Journal, 89, 3985-3996.
PicoQuant (2014) FluoTime 100 Compact Fluorescence Lifetime Spectrometer, PicoQuant, GmbH
PicoQuant (2016) PMA Series Photomultiplier Detector Assembly, PicoQuant, GmbH
Polozov, I. V., Polozova, A. I., Molotkovsky, J. G. și Epand, R. M. (1997) Amphipathic peptide affects the lateral domain organization of lipid bilayers, Biochim Biophys Acta, 1328, 125-39.
Poole, K., Russell, A. D. și Lambert, P. A. (2005) Mechanisms of antimicrobial resistance: opportunities for new targeted therapies – Preface, Advanced Drug Delivery Reviews, 57, 1443-1445.
Pouny, Y., Rapaport, D., Mor, A., Nicolas, P. și Shai, Y. (1992) Interaction of antimicrobial dermaseptin and its fluorescently labeled analogues with phospholipid membranes, Biochemistry, 31, 12416-23.
Primon-Barros, M. și Macedo, A. J. (2017) Animal Venom Peptides: Potential for New Antimicrobial Agents, Current Topics in Medicinal Chemistry, 17, 1119-1156.
Quay, S. C. și Condie, C. C. (1983) Conformational studies of aqueous melittin: thermodynamic parameters of the monomer-tetramer self-association reaction, Biochemistry, 22, 695-700.
Raghuraman, H. și Chattopadhyay, A. (2003) Organization and dynamics of melittin in environments of graded hydration: A fluorescence approach, Langmuir, 19, 10332-10341.
Raghuraman, H. și Chattopadhyay, A. (2004a) Effect of micellar charge on the conformation and dynamics of melittin, Eur Biophys J, 33, 611-22.
Raghuraman, H. și Chattopadhyay, A. (2004b) Influence of lipid chain unsaturation on membrane-bound melittin: a fluorescence approach, Biochim Biophys Acta, 1665, 29-39.
Raghuraman, H. și Chattopadhyay, A. (2004c) Interaction of melittin with membrane cholesterol: a fluorescence approach, Biophys J, 87, 2419-32.
Raghuraman, H. și Chattopadhyay, A. (2006) Effect of ionic strength on folding and aggregation of the hemolytic peptide melittin in solution, Biopolymers, 83, 111-21.
Raghuraman, H. și Chattopadhyay, A. (2007) Melittin: a membrane-active peptide with diverse functions, Biosci Rep, 27, 189-223.
Reshetnyak, Y. K. și Burstein, E. A. (2001) Decomposition of protein tryptophan fluorescence spectra into log-normal components. II. The statistical proof of discreteness of tryptophan classes in proteins, Biophysical Journal, 81, 1710-1734.
Reshetnyak, Y. K., Kitson, R. P., Lu, M. și Goldfarb, R. H. (2004) Conformational and enzymatic changes of 20S proteasome of rat natural killer cells induced by mono- and divalent cations, Journal of Structural Biology, 145, 263-271.
Reshetnyak, Y. K., Koshevnik, Y. și Burstein, E. A. (2001) Decomposition of protein tryptophan fluorescence spectra into log-normal components. III. Correlation between fluorescence and microenvironment parameters of individual tryptophan residues, Biophysical Journal, 81, 1735-1758.
Reshetnyak, Y. K., Segala, M., Andreev, O. A. și Engelman, D. M. (2007) A monomeric membrane peptide that lives in three worlds: In solution, attached to, and inserted across lipid bilayers, Biophysical Journal, 93, 2363-2372.
Reshetnyak, Y. K., Tchedre, K. T., Nair, M. P., Pritchard, P. H. și Lacko, A. G. (2006) Structural differences between wild-type and fish eye disease mutant of Lecithin : cholesterol acyltransferase, Journal of Biomolecular Structure & Dynamics, 24, 75-82.
Robinson, W. E., Jr., McDougall, B., Tran, D. și Selsted, M. E. (1998) Anti-HIV-1 activity of indolicidin, an antimicrobial peptide from neutrophils, J Leukoc Biol, 63, 94-100.
Rollins-Smith, L. A., Reinert, L. K., O'Leary, C. J., Houston, L. E. și Woodhams, D. C. (2005) Antimicrobial peptide defenses in amphibian skin, Integrative and Comparative Biology, 45, 137-142.
Rozek, A., Powers, J. P. S., Friedrich, C. L. și Hancock, R. E. W. (2003) Structure-based design of an indolicidin peptide analogue with increased protease stability, Biochemistry, 42, 14130-14138.
Rydlo, T., Rotem, S. și Mor, A. (2006) Antibacterial properties of dermaseptin S4 derivatives under extreme incubation conditions, Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 50, 490-497.
Ryley, H. C. (2001) Human antimicrobial peptides, Reviews in Medical Microbiology, 12, 177-186.
Saberwal, G. și Nagaraj, R. (1994) Cell-Lytic and Antibacterial Peptides That Act by Perturbing the Barrier Function of Membranes – Facets of Their Conformational Features, Structure-Function Correlations and Membrane-Perturbing Abilities, Biochimica Et Biophysica Acta-Reviews on Biomembranes, 1197, 109-131.
Samanta, A. și Fessenden, R. W. (2000) Excited State Dipole Moment of PRODAN as Determined from Transient Dielectric Loss Measurements, The Journal of Physical Chemistry A, 104, 8972-8975.
Sanchez-Gomez, S. și Martinez-de-Tejada, G. (2017) Antimicrobial Peptides as Anti-biofilm Agents in Medical Implants, Current Topics in Medicinal Chemistry, 17, 590-603.
Sanchez, S. A., Gunther, G., Tricerri, M. A. și Gratton, E. (2011) Methyl-beta-cyclodextrins preferentially remove cholesterol from the liquid disordered phase in giant unilamellar vesicles, J Membr Biol, 241, 1-10.
Sanchez, S. A., M.A.Tricerri, Gunther, G. și E.Gratton (2007) Laurdan Generalized Polarization: from cuvette to microscope, Modern Research and Educational Topics in Microscopy, 2, 1007-1014.
Sansom, M. S. P. (1991) The Biophysics of Peptide Models of Ion Channels, Progress in Biophysics & Molecular Biology, 55, 139-235.
Șchiopu, I., Mereuta, L., Apetrei, A., Park, Y., Hahm, K.-S. și Luchian, T. (2012) The role of tryptophan spatial arrangement for antimicrobial-derived, membrane-active peptides adsorption and activity, Molecular BioSystems, 8, 2860-2863.
Schluesener, H. J., Radermacher, S., Melms, A. și Jung, S. (1993) Leukocytic antimicrobial peptides kill autoimmune T cells, J Neuroimmunol, 47, 199-202.
Schwarz, G. și Beschiaschvili, G. (1989) Thermodynamic and kinetic studies on the association of melittin with a phospholipid bilayer, Biochim Biophys Acta, 979, 82-90.
Seelig, J. (2004) Thermodynamics of lipid-peptide interactions, Biochim Biophys Acta, 1666, 40-50.
Seery, M. (2009) Light Absorption and Fate of Excited State. Disponibil on-line: https://www.photochemistry.wordpress.com/2009/08/24/light.
Sekharam, K. M., Bradrick, T. D. și Georghiou, S. (1991) Kinetics of melittin binding to phospholipid small unilamellar vesicles, Biochim Biophys Acta, 1063, 171-4.
Selsted, M. E., Novotny, M. J., Morris, W. L., Tang, Y. Q., Smith, W. și Cullor, J. S. (1992) Indolicidin, a novel bactericidal tridecapeptide amide from neutrophils, J Biol Chem, 267, 4292-5.
Sen, M., Sen, S., Celik, S. și Altindis, M. (2016) Antimicrobial peptide families expressed by human tissues, Febs Journal, 283, 218-218.
Shai, Y. (1995) Molecular Recognition between Membrane-Spanning Polypeptides, Trends in Biochemical Sciences, 20, 460-464.
Sham, Y. Y., Muegge, I. și Warshel, A. (1998) The effect of protein relaxation on charge-charge interactions and dielectric constants of proteins, Biophys J, 74, 1744-53.
Shaw, J. E., Alattia, J. R., Verity, J. E., Prive, G. G. și Yip, C. M. (2006) Mechanisms of antimicrobial peptide action: studies of indolicidin assembly at model membrane interfaces by in situ atomic force microscopy, J Struct Biol, 154, 42-58.
Shaw, J. E., Epand, R. F., Hsu, J. C., Mo, G. C., Epand, R. M. și Yip, C. M. (2008) Cationic peptide-induced remodelling of model membranes: direct visualization by in situ atomic force microscopy, J Struct Biol, 162, 121-38.
Sheynis, T., Sykora, J., Benda, A., Kolusheva, S., Hof, M. și Jelinek, R. (2003) Bilayer localization of membrane-active peptides studied in biomimetic vesicles by visible and fluorescence spectroscopies, Eur J Biochem, 270, 4478-87.
Shi, J., Ross, C. R., Chengappa, M. M., Sylte, M. J., McVey, D. S. și Blecha, F. (1996) Antibacterial activity of a synthetic peptide (PR-26) derived from PR-39, a proline-arginine-rich neutrophil antimicrobial peptide, Antimicrob Agents Chemother, 40, 115-21.
Siano, D. B. și Metzler, D. E. (1969) Band Shapes of the Electronic Spectra of Complex Molecules, The Journal of Chemical Physics, 51, 1856-1861.
Simmaco, M., Mignogna, G. și Barra, D. (1998) Antimicrobial peptides from amphibian skin: What do they tell us?, Biopolymers, 47, 435-450.
Sipos, D., Andersson, M. și Ehrenberg, A. (1992) The structure of the mammalian antibacterial peptide cecropin P1 in solution, determined by proton-NMR, Eur J Biochem, 209, 163-9.
Song, Y. M., Park, Y., Lim, S. S., Yang, S. T., Woo, E. R., Park, I. S., Lee, J. S., Kim, J. I., Hahm, K. S., Kim, Y. și Shin, S. Y. (2005) Cell selectivity and mechanism of action of antimicrobial model peptides containing peptoid residues, Biochemistry, 44, 12094-106.
Song, Y. M., Yang, S.-T., Lim, S. S., Kim, Y., Hahm, K.-S., Kim, J. I. și Shin, S. Y. (2004) Effects of l- or d-Pro incorporation into hydrophobic or hydrophilic helix face of amphipathic α-helical model peptide on structure and cell selectivity, Biochemical and Biophysical Research Communications, 314, 615-621.
Stewart, P. S. și Costerton, J. W. (2001) Antibiotic resistance of bacteria in biofilms, Lancet, 358, 135-138.
Strom, M. B., Rekdal, O. și Svendsen, J. S. (2002) Antimicrobial activity of short arginine- and tryptophan-rich peptides, J Pept Sci, 8, 431-7.
Subbalakshmi, C., Krishnakumari, V., Nagaraj, R. și Sitaram, N. (1996) Requirements for antibacterial and hemolytic activities in the bovine neutrophil derived 13-residue peptide indolicidin, FEBS Lett, 395, 48-52.
Subbalakshmi, C. și Sitaram, N. (1998) Mechanism of antimicrobial action of indolicidin, FEMS Microbiol Lett, 160, 91-6.
Suhling, K., French, P. M. și Phillips, D. (2005) Time-resolved fluorescence microscopy, Photochem Photobiol Sci, 4, 13-22.
Sun, H., Greathouse, D. V., Andersen, O. S. și Koeppe, R. E., 2nd (2008) The preference of tryptophan for membrane interfaces: insights from N-methylation of tryptophans in gramicidin channels, J Biol Chem, 283, 22233-43.
Talbot, J. C., Dufourcq, J., de Bony, J., Faucon, J. F. și Lussan, C. (1979) Conformational change and self association of monomeric melittin, FEBS Lett, 102, 191-3.
Tiozzo, E., Rocco, G., Tossi, A. și Romeo, D. (1998) Wide-spectrum antibiotic activity of synthetic, amphipathic peptides, Biochemical and Biophysical Research Communications, 249, 202-206.
Tokumasu, F., Jin, A. J. și Dvorak, J. A. (2002) Lipid membrane phase behaviour elucidated in real time by controlled environment atomic force microscopy, Journal of Electron Microscopy, 51, 1-9.
Tonk, M., Rahnamaeian, R. și Vilcinskas, A. (2017) Insect antimicrobial peptides, Zeitschrift Fur Naturforschung Section C-a Journal of Biosciences, 72, E17-E17.
Toraya, S., Nishimura, K. și Naito, A. (2004) Dynamic structure of vesicle-bound melittin in a variety of lipid chain lengths by solid-state NMR, Biophys J, 87, 3323-35.
Torrent, M., Cuyas, E., Carreras, E., Navarro, S., Lopez, O., de la Maza, A., Nogues, M. V., Reshetnyak, Y. K. și Boix, E. (2007) Topography studies on the membrane interaction mechanism of the eosinophil cationic protein, Biochemistry, 46, 720-33.
Tossi, A., Sandri, L. și Giangaspero, A. (2000) Amphipathic, alpha-helical antimicrobial peptides, Biopolymers, 55, 4-30.
Tossi, A., Tarantino, C. și Romeo, D. (1997) Design of synthetic antimicrobial peptides based on sequence analogy and amphipathicity, European Journal of Biochemistry, 250, 549-558.
Travis, S. M., Anderson, N. N., Forsyth, W. R., Espiritu, C., Conway, B. D., Greenberg, E. P., McCray, P. B., Lehrer, R. I., Welsh, M. J. și Tack, B. F. (2000) Bactericidal activity of mammalian cathelicidin-derived peptides, Infection and Immunity, 68, 2748-2755.
Țugulea, L. și Găzdaru, D. M. (2003) Tehnici și metode experimentale în biofizică, București, Editura Universitații din București.
Valeur, B. (2001) Molecular fluorescence principles and applications, New York, Wiley-VCH.
Vanbelkum, M. J., Kok, J., Venema, G., Holo, H., Nes, I. F., Konings, W. N. și Abee, T. (1991) The Bacteriocin Lactococcin-a Specifically Increases Permeability of Lactococcal Cytoplasmic Membranes in a Voltage-Independent, Protein-Mediated Manner, Journal of Bacteriology, 173, 7934-7941.
Viard, M., Gallay, J., Vincent, M., Meyer, O., Robert, B. și Paternostre, M. (1997) Laurdan solvatochromism: solvent dielectric relaxation and intramolecular excited-state reaction, Biophys J, 73, 2221-34.
Vincent, M., de Foresta, B. și Gallay, J. (2005) Nanosecond dynamics of a mimicked membrane-water interface observed by time-resolved stokes shift of LAURDAN, Biophys J, 88, 4337-50.
Vogel, H. (1987) Comparison of the conformation and orientation of alamethicin and melittin in lipid membranes, Biochemistry, 26, 4562-72.
Wahl, M. (2014) Time-Correlated Single Photon Counting, Disponibil on-line: https://www.picoquant.com/images/uploads/page/files/7253/technote_tcspc.pdf, Berlin, Germany.
Wang, G. S. (2010) Structural Studies of Antimicrobial Peptides Provide Insight into Their Mechanisms of Action, Antimicrobial Peptides: Discovery, Design and Novel Therapeutic Strategies, 141-168.
Wang, Y., Zhang, Y., Lee, W. H., Yang, X. W. și Zhang, Y. (2016) Novel Peptides from Skins of Amphibians Showed Broad-Spectrum Antimicrobial Activities, Chemical Biology & Drug Design, 87, 419-424.
Weaver, A. J., Kemple, M. D., Brauner, J. W., Mendelsohn, R. și Prendergast, F. G. (1992) Fluorescence, CD, attenuated total reflectance (ATR) FTIR, and 13C NMR characterization of the structure and dynamics of synthetic melittin and melittin analogues in lipid environments, Biochemistry, 31, 1301-13.
Weber, G. (1960) Fluorescence-polarization spectrum and electronic-energy transfer in tyrosine, tryptophan and related compounds, Biochem J, 75, 335-45.
Westerhoff, H. V., Juretic, D., Hendler, R. W. și Zasloff, M. (1989) Magainins and the disruption of membrane-linked free-energy transduction, Proc Natl Acad Sci U S A, 86, 6597-601.
White, S. H., Wimley, W. C., Ladokhin, A. S. și Hristova, K. (1998) Protein folding in membranes: determining energetics of peptide-bilayer interactions, Methods Enzymol, 295, 62-87.
WHO. (2014) Antimicrobial resistance : global report on surveillance, Geneva, World Health Organization. Disponibil on-line: http://www.who.int/drugresistance/documents/surveillancereport/en/.
Wiesner, J. și Vilcinskas, A. (2010) Antimicrobial peptides The ancient arm of the human immune system, Virulence, 1, 440-464.
Wilcox, W. și Eisenberg, D. (1992) Thermodynamics of melittin tetramerization determined by circular dichroism and implications for protein folding, Protein Sci, 1, 641-53.
Wimley, W. C. și White, S. H. (1993) Membrane partitioning: distinguishing bilayer effects from the hydrophobic effect, Biochemistry, 32, 6307-12.
Wright, G. D. (2005) Bacterial resistance to antibiotics: Enzymatic degradation and modification, Advanced Drug Delivery Reviews, 57, 1451-1470.
Wu, M., Maier, E., Benz, R. și Hancock, R. E. (1999) Mechanism of interaction of different classes of cationic antimicrobial peptides with planar bilayers and with the cytoplasmic membrane of Escherichia coli, Biochemistry, 38, 7235-42.
Xie, W., Ludewig, G., Wang, K. și Lehmler, H. J. (2010) Model and cell membrane partitioning of perfluorooctanesulfonate is independent of the lipid chain length, Colloids and Surfaces B-Biointerfaces, 76, 128-136.
Yamamoto, N. și Tamura, A. (2010) Designed low amphipathic peptides with alpha-helical propensity exhibiting antimicrobial activity via a lipid domain formation mechanism, Peptides, 31, 794-805.
Yang, L., Harroun, T. A., Weiss, T. M., Ding, L. și Huang, H. W. (2001) Barrel-stave model or toroidal model? A case study on melittin pores, Biophys J, 81, 1475-85.
Yau, W. M., Wimley, W. C., Gawrisch, K. și White, S. H. (1998) The preference of tryptophan for membrane interfaces, Biochemistry, 37, 14713-14718.
Ye, X. C., Yu, B. X., Zhou, X., Zhao, L., Ding, Y. Y., Liu, M. C., Ding, X. F., Zhang, X., Jie, Q. L., Zhou, L., Fang, J., Chen, H. T., Hu, W., Niu, S. L., Yan, J. Q., Zhao, H. și Hong, D. J. (2015) Preliminary study of light yield dependence on LAB liquid scintillator composition, Chinese Physics C, 39.
Yeaman, M. R. și Yount, N. Y. (2003) Mechanisms of antimicrobial peptide action and resistance, Pharmacol Rev, 55, 27-55.
Yu, W. M., So, P. T. C., French, T. și Gratton, E. (1996) Fluorescence generalized polarization of cell membranes: A two-photon scanning microscopy approach, Biophysical Journal, 70, 626-636.
Zasloff, M. (2002) Antimicrobial peptides of multicellular organisms, Nature, 415, 389-395.
Zhang, Y. L., Frangos, J. A. și Chachisvilis, M. (2006) Laurdan fluorescence senses mechanical strain in the lipid bilayer membrane, Biochemical and Biophysical Research Communications, 347, 838-841.
Zhu, X., Dong, N., Wang, Z., Ma, Z., Zhang, L., Ma, Q. și Shan, A. (2014) Design of imperfectly amphipathic alpha-helical antimicrobial peptides with enhanced cell selectivity, Acta Biomater, 10, 244-57.
Zhu, X., Zhang, L., Wang, J., Ma, Z., Xu, W., Li, J. și Shan, A. (2015) Characterization of antimicrobial activity and mechanisms of low amphipathic peptides with different alpha-helical propensity, Acta Biomater, 18, 155-67.
Zorilă, B., Bacalum, M., Radu, M. și Popescu, A. I. (2016) Log-normal deconvolution of laurdan fluorescence spectra – A tool to assess lipid membrane fluidity, Rom. Rep. Phys. Romanian Reports in Physics, 68, 702-712.
Zorilă, F. L., Ionescu, C., Craciun, L. S. și Zorilă, B. (2017) Atomic force microscopy study of morphological modifications induced by different decontamination treatments on Escherichia coli, Ultramicroscopy, 182, 226-232.
Anexă cu acorduri de copyright pentru imagini din literatură
Pentru Figura 2.1:
Pentru Figura 2.2, 2.3 și 2.4:
Pentru Figura 3.1:
Pentru Figura 3.7, 6.1, 6.3 și 6.4:
Pentru Figura 5.1:
Copyright Notice
© Licențiada.org respectă drepturile de proprietate intelectuală și așteaptă ca toți utilizatorii să facă același lucru. Dacă consideri că un conținut de pe site încalcă drepturile tale de autor, te rugăm să trimiți o notificare DMCA.
Acest articol: Școala Doctorală de Fizică [303535] (ID: 303535)
Dacă considerați că acest conținut vă încalcă drepturile de autor, vă rugăm să depuneți o cerere pe pagina noastră Copyright Takedown.