Școala doctorală de Biologie [307729]

[anonimizat], ECOLOGIC ȘI DIAGNOZA NEMATOZILOR GALICOLI FITOPARAZIȚI DIN GENUL MELOIDOGYNE

CUPRINS TEZĂ DE DOCTORAT

INTRODUCERE

OBIECTIVE

STRUCTURA TEZEI

LISTA ABREVIERILOR

PARTEA I – STUDIU DE DOCUMENTARE ASUPRA LITERATURII DE

SPECIALITATE ……………………………………………………………………………………………….. 1

CAPITOLUL I ………………………………………………………………………………………………… 1

Istoricul taxonomic al genuluiMeloidogyneși stadiul actual al cercetărilor la nivel mondial și în România …………………………………………………………………………………………. 1

Istoricul taxonomic al genuluiMeloidogyne (1855 – până în prezent) …… 1

Stadiul actual al cercetărilor genului Meloidogyne la nivel mondial și în România (1950 – până în prezent) …………………………………………………………………………. 6

Încadrarea sistematică a genului Meloidogyne și importanța fitosanitară a acestui grup de nematode ……………………………………………………………………………………………….. 9

Caracterizarea genul Meloidogyne ……………………………………………………………… 15

1.3.1. Elemente de biologie ……………………………………………………………………………. 15

1.3.2. Elemente de morfologie ………………………………………………………………………… 19

1.3.3. Elemente de bionomie ………………………………………………………………………….. 24

Bibliografie ……………………………………………………………………………………………………… 27

PARTEA a II-a – CONTRIBUȚII PERSONALE …………………………………………….. 37

CAPITOLUL II ……………………………………………………………………………………………… 37

2. Distribuția și diversitatea speciilor de nematode galicole în diferite arii din România .. 37

Introducere ……………………………………………………………………………………………… 37

2.2. Materiale și metode ……………………………………………………………………………………… 39

2.2.1. Prelevarea probelor de sol/material vegetal …………………………………………….. 39

2.2.2. [anonimizat]/părți plante …………………………………………………………………………………………….. 42

2.3. Parametri pentru evaluarea nematodelor galicole în probele analizate ……………… 62

Rezultate și discuții ………………………………………………………………………………. 65

Concluzii …………………………………………………………………………………………….. 77

Bibliografie …………………………………………………………………………………………………… 78

CAPITOLUL III ………………………………………………………………………………………….. 83

3. Influența mai multor nivele de inocul ale nematodelor galicole (Meloidogyne spp.) asupra creșterii tomatelor (Solanum lycopersicum L.) ………………………………………………….. 83

3.1. Introducere …………………………………………………………………………………………….. 83

3.2. Materiale și metode …………………………………………………………………………………. 87

3.2.1. Obținerea materialului bilogic …………………………………………………………… 87

3.2.1.1. Obținerea izolatelor de nematode …………………………………………………… 87

3.2.1.2. Obținerea materialului vegetal ………………………………………………………. 89

3.2.2. Incolcularea cu nematode și evaluarea infectivității asupra tomatelor …….. 92

3.3. Rezultate și discuții ……………………………………………………………………………….. 94

3.4. Concluzii …………………………………………………………………………………………….. 101

Bibliografie ………………………………………………………………………………………………… 103

CAPITOLUL IV ………………………………………………………………………………………… 108

4. Identificarea și caracterizarea principalelor specii de nematode galicole din România prin metode de diagnoză specifice …………………………………………………………………… 108

4.1. Introducere ……………………………………………………………………………………………. 108

4.2. Materiale și metode ………………………………………………………………………………… 109

4.2.1. Extracția nematodelor galicole …………………………………………………………… 109

4.2.2. Omorârea , fixarea, pregătirea nematodelor pentru montare și realizarea preparatelor permanente ………………………………………………………………………………… 115

4.2.3. Identificarea morfo-biometrică a nematodelor galicole …………………………. 117

4.2.4. Identificarea nematodelor galicole utilizând metode de biologie moleculară .. 118

4.3. Rezultate și discuții …………………………………………………………………………………. 122

4.4. Concluzii ……………………………………………………………………………………………….. 158

Bibliografie ………………………………………………………………………………………………….. 161

CAPITOLUL V ……………………………………………………………………………………………. 169

5. Cercetări de ecologie – Observații în dinamică asupra limitei de toleranță termică a juvenililor infestanți, în absența plantelor-gazdă ……………………………………………….. 169

5.1. Introducere ……………………………………………………………………………………………. 169

5.2. Strategii de adapatare ale nematodelor la condițiile de mediu ……………………….. 172

5.3. Cercetări privind influența temperaturii asupra nematodelor fitoparazite din genul Meloidogyne ………………………………………………………………………………………………… 174

5.3.1. Materiale și metode ………………………………………………………………………….. 176

5.4. Rezultate și discuții ……………………………………………………………………………….. 177

5.5. Concluzii ……………………………………………………………………………………………… 184

Bibliografie ………………………………………………………………………………………………… 186

CONCLUZII GENERALE …………………………………………………………………………… 189

BIBLIOGRAFIE GENRALĂ ……………………………………………………………………….. 192

MULȚUMIRI

La sfârșitul stagiului de doctorat doresc să adresez câteva cuvinte de mulțumire celor care m-au îndrumat sau mi-au acordat suportul pe parcursul elaborării acestei lucrări.

Doresc să mulțumesc și să-mi exprim recunoștința doamnei Profesor Univ. Dr. Tatiana Eugenia ȘESAN, conducătorul științific al lucrării, pentru îndrumarea, încurajarea și susținerea în finalizarea acestei teze de doctorat.

Mulțumesc, totodată, Școlii Doctorale de Biologie și Comisiei de referenți, membrii ai comisiei de doctorat, în persoana doamnelor Profesor Univ. Dr. Ionela DOBRIN, Profesor Univ. Dr. Carmen Mariana CHIFIRIUC ………………………………….pentru sfaturile acordate, profesionalismul și amabilitatea de a evalua teza.

Mulțumesc conducerii Oficiului Fitosanitar Brașov și colectivului Laboratorului Regional de Nematologie din Brașov pentru sprijinul acordat și pregătirea materialului prezentat în cadrul tezei.

Mulțumesc colegilor specialiști din cadrul Laboratorului Național Fitosanitar București, departamentele nematologie și biologie moleculară, pentru buna colaborare și suportul tehnic oferit de fiecare dată atunci când l-am solicitat.

Mulțumesc colegilor specialiști ai Oficiilor Fitosanitare Județene precum și Oficiilor Județene de Studii Pedologice și Agrochimice din Arad, Bacău, Bihor, Botoșani, Brăila, Buzău, Călărași, Constanța, Covasna, Dâmbovița, Galați, Giugiu, Gorj, Harghita, Hunedoara, Ialomița, Mehedinți, Mureș, Olt, Prahova, Satu Mare, Sălaj, Sibiu, Teleorman, Timiș, Tulcea, Vâlcea și Vrancea, pentru suportul oferit în prelevarea probelor de sol și a materialului vegetal.

Folosesc acest prilej pentru a mulțumi doamnelor dr. Francesca DE LUCA din cadrul Instituto per la Protezione Sostenible delle Piante – Bari, Italia, dr. Géraldine ANTHOINE și Anne-Marie CHAPPE din cadrul Laboratoire de la Santé des végétaux, Unite de Nematologie – Le Rheu, Franța, pentru buna colaborare și sprijinul acordat în realizarea analizelor de biologie moleculară.

Adresez mulțumiri colegilor nematologi dr. Miklós BOZSÓ și Ágnes TÓTH din cadrul Central Laboratory for Pest Diagnosis – Budapest, Ungaria, precum domnului dr. Emmanuel TZORTZAKAKIS din cadrul Plant Protection Institute – Iraklion, Grecia, pentru amabilitatea și opiniile exprimate privind analizele de biomorfometrie.

Nu în ultimul rând, mulțumesc familiei pentru înțelegerea și ajutorul acordat pe întreaga perioadă a tezei de doctorat.

INTRODUCERE

Plantele, cultivate sau spontane, rareori sunt expuse influenței unui singur patogen.

Așa cum recunoștea marele geograf, arheolog și explorator britanic Percy Harrison Fawcett, încă din 1931 „natura nu lucrează cu culturi pure”, iar multe dintre bolile plantelor sunt determinate de patogeni asociați (Olteanu și colab., 2001). Există însă un domeniu al patologiei vegetale mai puțin cunoscut dar tot atât de important, datorită pierderilor pe care le provoacă anual agriculturii. Este vorba de fitonematologie sau fitohelmintologie (studiul speciilor de nematode fitofage libere din sol și a celor parazite la plante). Fitonematodele parazite aparțin fitoparazitologiei, care face parte, la rândul ei, din vasta știință – Parazitologia, știința care studiază parazitismul, paraziții și parazitozele. În sensul larg al definiției, parazitologia abordează întreaga problematică a paraziților de origine – zoo și fito – și a bolilor cauzate de aceștia.

Posibilitățile tehnice ale laboratoarelor de specialitate, finețea metodelor de diagnoză și avansarea cunoștințelor privind biologia și bionomia nematodelor au permis, în ultimii ani, aprofundarea cercetărilor și lărgirea cadrului de investigații în direcția nematologiei vegetale.Prin urmare, multe daune atribuite, în trecut, agenților patogeni bacterieni, virali și micotici, în prezent se știe că sunt datorate acținii directe sau indirecte a nematodelor fitoparazite.

Speciile de Meloidogyne, paraziți comuni în interacțiunile sinergice, își stabilesc zonele de hrănire în interiorul rădăciniiplantelor-gazdă sensibile, transformă celulele parenchimului în celule gigant, bogate în substanțe nutritive. Acest țesut alterat este mai sensibil la invazie și parazitare de către alte organisme (bacterii, ciuperci etc.) prezente în rizosferă. Atunci când acești patogeni secundari invadează rădăcinile, ei devin adesea patogeni dominanți. Dimensiunile foarte reduse ale corpului nematodelor fitoparazite galicole, comparativ cu alte grupe de animale dăunătoare, face dificilă identificarea acestora.

Un rol important îl au datele biometrice și particularitățile anatomo-morfologice corespunzătoare stadiului de dezvoltare. De aceea, în diagnoză, este necesar ca aprecierile asupra unei specii de nematod, rezultate pe baza simptomelor exterioare de atac la plante, să fie completată cu analiza microscopică a materialului (sol/material vegetal).

Deși literatura de profil din Europa este bogată în lucrări ce vizează nematodele galicole fitoparazite ale plantelor, comparativ cu alte grupe de nevertebrate (insecte, acarieni), există numeroase aspecte ale biologiei, ecologiei și diagnozei lor care sunt puțin sau deloc abordate în România.

Nematodele aparținând genului Meloidogyne, au fost și vor face obiectul multor studii internaționale privind biologia, distribuția, plantele-gazdă atacate și modul de dăunare însă rezultatele obținute nu pot fi întru totul extrapolate la fiecare țară fără o verificare și o completare a acestor studii în mai multe arii de interes.

De pildă, predilecția față de factorii biotici și abiotici ale unei specii sau alteia pot să difere mult de la o zonă geografică la alta.

Distribuția geografică/zonală a speciilor de Meloidogyne nu este cunoscută pe teritoriul țării noastre, iar prin această lucrare aducem o contribuție importantă în această direcție.

Variabilitatea morfologică și biometrică este, de asemenea, un subiect puțin cunoscut în cadrul acestui gen de nematode la noi în țară, sub aspectul schimbărilor climatice și nu numai,acestă variabilitate a fost dovedită în cadrul aceleiași specii, de la limita nordică a arealului României până la limita de sud.

OBIECTIVELE CERCETĂRII

În majoritatea cazurilor prezența nematodelor galicole aparținând genului Meloidogyne are o evoluție insidiosă în culturile agricole de importanță economică, legume, fructe sau plante ornamentale. În alte cazuri însă, se pot observa gale foarte voluminoase, de până la câțiva centrimetri în diametru, iar gravitatea atacului depinde în mare măsură de răspunsul plantei-gazdă, de factorii abiotici, nivele de infestare etc.

Atât în cazul evoluțiilor insidioase, cât și a celor agresive, se impun măsuri pentru a suprima dezvoltarea, reproducerea și mai ales diseminarea acestui grup de nematode.

Toate aceste aspecte au importanță în aplicarea strategiilor de management și control printr-o înțelegere mai bună a biologiei genului ca întreg și a diferențelor dintre specii.

Datorită lipsei unor informații detaliate privind nematodele genului Meloidogyne, prezentul studiu și-a propus ca obiective actualizarea privind fauna și distribuția speciilor de nematode aparținând acestui gen în România și sublinierea importanței identificării speciilor de nematode prin combinarea metodelor bio-morfometrice cu metodele moleculare.

Această lucrare este prima teză din țara noastră care a avut ca obiect de studiu acest grup de nematode.

OBIECTIVELE GENERALE ale cercetării au fost:

Abordarea globală a distribuției acestor nematode în România, caracterizarea lor morfo-biometrică și moleculară pentru a contribui la cunoașterea modului de acțiune asupra plantelor-gazdă, a biologiei și ecologiei acestora cu impact fitosanitar;

S-a avut în vedere că nu toate speciile genului Meloidogyne sunt reglementate ca organisme de carantină și, din acest motiv, este important ca identificarea să fie cât mai exactă, deoarece măsurile de carantină se aplică împotriva organismelor care au acest statut;

Crearea unei colecții de preparate micoscopice semipermanente și permanente.

OBIECTIVELE SPECIFICEale cercetăriiau fost:

Aspecte privind istoricul taxonomic al genului Meloidogyne, încadrarea sistematică, importanța fitosanitară, precum și caracterizarea nematodelor galicole din punct de vedere bio-morfo-ecologic, conform literaturii de specialitate;

Colectarea de informații privind distribuția speciilor de nematode galicole, din genul Meloidogyne, în diferite arii geografice din România, precum și parametri pentru evaluarea nematodelor din probele analizate;

Influența mai multor nivele de inocul ale nematodelor galicole (Meloidogyne spp.) asupra creșterii plantelor de tomate (Lycopersicum esculentum L.);

Identificarea și caracterizarea speciilor majore de nematode galicole din România prin metode de diagnoză specifice – aspecte și recomandări pentru recunoașterea și identificarea speciilor de nematode galicole din genul Meloidogyne;

Relevarea unor aspecte privind ecologia nematodelor din genul Meloidogyne prin observații, în dinamică, asupra limitei de toleranță termică a juvenililor infestanți, în absența plantelor-gazdă.

STRUCTURA TEZEI

Teza de doctorat a fost elaborată sub conducerea doamnei Profesor Univ. Dr. Tatiana Eugenia ȘESAN, membru corespondent al Academiei de Știinșe Agricole și Silvice.

Prezenta lucrare și-a propus să obțină noi informații referitoare la diversitatea morfologică, bio-ecologia și diagnoza nematodelor aparținâng genului Meloidogyne în România.

Teza este structurată în două părți: Studiul de documentare asupra literaturii de specialitate (Partea I) și Partea de contribuții personale (Partea a II-a). Cea de-a doua parte este organizată în patru capitole (2-5). Fiecare capitol din partea a doua a tezei cuprinde:

introducere privind tematica analizată;

materiale și metode utilizate în cadrul studiului;

rezultate și discuții;

concluzii;

bibliografie.

LISTA DE ABREVIERI

ADN – Acid dezoxiribonucleic

ARNr – Acid ribonucleic ribozomal

ANDm – Acid dezoxiribonucleic mitocondrial

cm – Centimetru

COI – Citocrom oxidaza I

DESS – soluție care conține dimetil sulfoxin, disodium EDTA și NaCl saturată

h – Oră

L – Litru

min. – Minute

mg – Miligram

ml – Mililitru

μm – Microm

Ø – Diametru

Pb – perechi de baze

PCR – Polymerase Chain Reaction

rpm – Rorații pe minut

SSU – subunitatea ribozomală mică

PARTEA I. STUDIU DE DOCUMENTARE ASUPRA LITERATURII DE SPECIALITATE

CAPITOLUL I

Istoricul taxonomic al genului Meloidogyne și stadiul actual al cercetărilor la nivel mondial și în România

Istoricul taxonomic al genului Meloidogyne (1855 – până în prezent)

Istoria taxonomică a genului Meloidogyne Göldi, 1982 poate fi divizată în trei părți importante: (i) perioada 1855-1878, în care au fost observate corelații între prezența galelor și nematode, urmată de (ii) o lungă perioadă de relativă confuzie (1879-1948) când nematodele galicole au fost incluse în același gen ca și nematozii cu chiști (Heterodera Schmidt, 1871); (iii) perioada de relansare taxonomică, după anul 1949, când nematodele galicole au fost plasate într-un gen separat, fiind descrise în numeroase publicații taxonomice în continuă expansiune (Karssen, 2002).

1855-1878

Deși nematodele galicole sau prezența galelor a fost semnalată cu mult timp înainte de 1855, cauza apariției acestora din urmă a fost necunoscută sau pusă pe seama altor organisme, altele decât nematodele. Englezul Berkeley (1855) a corelat, pentru prima dată, galele castraveților de seră cu prezența nematodelor.

În 1859, Schacht raportează pentru prima dată bolile produse de nematozi la sfecla de zahăr în Germania, în cele din urmă (1871) acesta descrie chiștii formați pe sfecla de zahăr ca fiind Heterodera schachtii.

Patru ani mai târziu, italianul Licopoli (1875) descrie mici gale pe rădăcinile de urechelniță comună (Sempervivum tectorum L.) și la alte Crassulaceae.

Urmează prima semnalare a nematodelor galicole în plantațiile de cafea din Brazilia de către Jobert (1878). Acesta descrie diferite stadii de dezvoltare ale nematozilor dar denumește incorect stadiul de chist al femelei adulte.

Prima descriere a nematodelor galicolede către Berkeley (1855), a fost trecută cu vederea, dar aceasta este una dintre cele mai timpurii contribuții în patologia plantelor.

Berkeley a fost, de asemenea, cel care l-a sfătuit pe Charles Darwin în experimetele sale, privind răspândirea semințelor în apele sărate, opinii publicate în Originea speciilor (1859, 2017).

1879-1948

Primul nematod galicol a fost descris în Europa de către botanistul francez Maxim Cornu în 1879. Acest autor a studiat cu atenție galele de pe rădăcinile diferitelor leguminoase din zona Loire și a observat în 1874 infestații cu nematodul galicol la Onobrychis sativa.

Deși el a descris femelele ca stadiu de chiști, pentru a exprima relația strânsă cu Hetereodera schachtii, a crezut la acea vreme că specia a fost mai mult legată de Anguilla radicicola Greef, 1872, descriind-o ca pe o specie nouă Anguilla maroni.

Germanul Müller (1884) publică un excelent și detaliat studiu morfologic despre nematodele galicole. Autorul a redenumit speciaAnguilla caH. radicicola, acest nume fiind folosit pentru nematodele galicole ale radacinilor până în 1932.

Un an mai târziu, germanul Frank (1885)a publicat câteva noi gazde ale nematoduluiHeterodera radicicola. Olandezul Trueb (1885) a studiat cauza piticirii plantelor de trestie de zahăr din Java –Indonezia, detectând un nematod galicol și l-a descris ca specie nouă numită Heterodera javanica. Descrierea însă a fost sumară și bazată pe câteva desene ale femelelor și măsurători ale ouălor (Karssen, 2002)

Deloc surprinși, Beijerinck (1887) și van Breda de Haan (1899) au considerat Heterodera javanica identică cu H. radicicola.

În 1887 (publicat în 1892), Göldi a descris diferite boli la plantele de cafea în Brazilia, incluzând un nematod galicol. El a dat denumirea nematoduluiMeloidogyne exigua, descriindu-l și ilustrându-l în linii mari. Această publicație însă a fost ingnorată sau necunoscută de cei mai mulți nematologi până în 1949.

Deși s-a vorbit despre denumiri precum Anguillula și Heterodera, numele genului de Meloidogyne nu a fost propus până în 1887, când Göldi a descris Meloidogyne exigua pe rădăcinile arborelui de cafea din Brazilia.

În Brazilia el și-a scris numele Emilio Augusto Goeldi deși în literatura de specialitate apar două denumiri, de Göldi și Goeldi. Anul publicării descrierii lui Göldi pentru speciaMeloidogyne exigua este deseori citat ca 1887 sau 1892, deși în Volumul VII al Arhivei Muzeului Național articolul a fost publicat în 1892 (Karssen, 2002).

Neal (1889) a publicat un studiu interesant și amplu asupra “bolii cu gale” în Stalele Unite ale Americii. El a descris neatodele galicole ca fiind specii noi: “Am numit acest vierme în mod provizoriu Anguillula arenaria, dar s-ar putea foarte bine să aparțină unui gen diferit”, adăugând măsurărori cu ilustrații. De asemenea, el a descris spiculul cozii, caracteristic pentru stadiile juvenile L3-L4, și pierderea lui după ultima napârlire, ilustrând totodată, o parte a glandelor rectale femele.

Stone și Smith (1898) au publicat mai multe detalii despre diferitele stadii de dezvoltare ale nematodelor galicole ale rădăcinilor; de asemenea, autorii au ilustrat masculul răsucit în interiorul cuticulei juvenilului.

În 1899, olandezul van Breda de Haan , a raportat Heterodera radicicola la tutun în India.

Lavergne (1901) a reanalizat materiale referitoare la nematodele cu gale din America de Sud și a studiat nematodele în Chile, detectând un nou nematod, descriindu-l ca fiind Anguillula vialae, a ilustrat galele tipice ale nematodelor galicole la vița de vie, câteva ouă relativ mici, dar o descriere propriu-zisă a nematodului galicol nu a fost inclusă.

Prima femeie care a publicat materiale despre nematozii galicoli a fost Kati Marcinowski (1909). Studiul ei, detaliat și solid“Parasitische und semiparasitische an Pflanzen lebende Nematoden” include 24 de pagini despre chiști și nematode galicole.

Marcinowski afost prima care a descris, în detaliu, diferențele morfologice dintre chistul și nematodul galicol la masculi, femele și juvenili. Deși a descoperit două specii diferite de chiști,autoarea a crezut că există doar o singură specie de nematode galicole, și a sinonimizat speciile slab descriseMeloidogyne exigua, Heterodera javanica, Anguillula arenaria și Anguillula vialae cu Heterodera radicicola.

Unul dintre cele mai controversate aspecte ale taxonomiei acestui gen a avut loc în 1919, când Kofoid și White, lucrând în SUA, au descris o nouă specie de oxiuri la om, Oxyurus incognita. Ulterior, Sandgrund (1923) comentează în cercetările sale că atunci când rădăcinile de fasole infestate cu nematode de rădăcină (Heterodera radicicola) au fost ingerate de oameni ar putea traversa tractul digestiv și mai apoi recuperate prin scaun.

El a concluzionat că ouăle descrise de Kofoid și White (1919) au provenit din rădăcini cu nematode fitoparazite, mai degrabă, și nu ale noilor helminți.

Cobb, în 1924, a recunoscut că există diferențe între chiștii formați și nematodele de rădăcină, propunând genul Caconema (Cobb, 1924). În acest gen a fost inclusă și specia Heterodera radicicola, ea insăși denumită greșit din cauza unor identificări eronate datând din 1884 (Müller). Goodey (1932) nu a acceptat propunerea lui Cobb privind introducerea genului Caconema, considerând nematodele galicole și cele cu chiști de aceeași natură.

Deși Nagakura (1930) a publicat un studiu amplu despre nematodele galicole, diferențiindu-le în numerose moduri de nematodele cu chiști, cu atente observații asupra morfologiei și ciclului de viață, autorul menționându-le sub denumirea deHeterodera radicicola.

1949-2000

În 1949 Chitwood a publicat lucrarea “Revizuirea genului Meoidogyne Goeldi, 1887”. Acestă lucrare, relativ mică, a schimbat substanțial taxonomia nematodelor galicole.

El a separat nematodele galicole de Heterodera, a revizuit din nou genul Meloidogyne și a întocmit o diagnoză generică pentru acest ultim gen.

Cu privire la nivelul speciilor, Chitwood a redescris Meloidogyne arenaria, M. exigua, M. incognita și M. javanica, după care a descrisM. hapla și o varietate de M. incognita, varietatea acrita.

Chitwood a “înviat”genul Meloidogyne așa cum a propus Goeldi (1887) cu specia tip Meloidogyne exigua, chiar dacă nu a existat niciun material care să descrie amănunțit această specie (insuficient descrisă pentru a stabili genul).

Acțiunea nomenclaturii lui Chitwood a fost criticată de către Gillard (1961) și de Whitehead (1968). Aceștia din urmă au criticat “învierea” acestui gen, recunoscând mai degrabă vechea denumire dată genului, a cărei adevărată identitate a fost extrem de nesigură.

Chitwood, consideră că Goeldi, în 1887, a fost primul autor care a descris nematodele galicole, deși după scrierile lui Wouts și Sher (1971) și ale lui Fortuner (1984), această publicare a descrierii ar fi fost făcută în anul 1892 și nu în 1887.

Cele mai multe publicații de după 1949 despre nematodele galicole din genul Meloidogyne îl menționau pe Goeldi ca autor al speciei Meloidogyne exigua. În publicația originală Goeldi este numit Göldi cu semne diacritice.

Așadar, numele original Göldi rămâne numele corect al celui care a descris speciaMeloidogyne exigua. Chiar și în ampla “Bibliografia și lisita gazdelor” aparținând genului Heterodera (anonim 1931), denumirea speciei era deja listată ca Göldi, 1892 (Karssen, 2012).

Câteva studii istorice asupra nematodelor galicolole sunt disponibile. Astfel, Chitwood (1949) a descris perioada taxonomică dintre anii 1887 și 1949. Gillard (1961) a fost unul din primii care au descris istoria nomenclaturală și taxonomică începând din 1872. În plus, autorul a studiat biologia, distribuția și controlul nematodelor galicole.

Au urmat două studii istorice ale lui Whitehead (1968) și Franklin (1979) începute încă din 1855.Autorii americani au descris în special morfologia femelelor și a modelului perineal, masculii și juvenilii a peste 30 specii de nematode galicole.

În 1949 Chitwood a publicat “Revizia genului Meloidogyne, Goldi, 1887” care a schimbat complet taxonomia nematodelor galicole ale rădăcinilor.

2000 – până în prezent

După anul 2000, literatura nematologică s-a îmbogățit permanent, ajungând la un număr impresionant de lucrări specifice, între care sunt și vor rămâne de referință următoarele:

Plant Nematodes of Agricultural Importance, lucrare apărută în anul 2007, unde autorii americani Bridge J. și Starr J., descriu în detaliu simptomele provocate de acest grup de dăunători la cereale, legume, floarea-soarelui, rădăcinoase, specii floricole cu bulbi, tubeculi, arbori și pajiști;

În anul 2009 Perry R.N., Moens M. și Starr J.L, în cartea Root-knot Nematodes, descriu nematodele genului Meloidogyne din punct de vedere al impactului economic prin daunele produse, biologia, interacțiunea plantă-nematod, morfologia, ciclul de viață, detecția speciilor și strategii de gestionare a atacului cu nematodele galicole;

În 2011 apare lucrarea de referință Genomics and Molecular Genetics of Plant-Nematodes Interactions unde autorii Jones J, Gheysen G și Feroll C., descriu relațiile extrem de complexe ale nematodelor în raport cu planta-gazdă, studii fundamentale despre biologia moleculară și instrumentele genomice, care au furnizat ulterior rezultate relevante în practica agricolă;

Plant Nematology: Cyst and Root Knot Nematodesreprezintă o lucrare importantă în literatura nematologică, apărută în anul 2013, unde autorul londonez Kaushal K.K. trece în revistă istoricul taxonomic al celor două genuri de nematode, ample rezulate ale unor studii agroclimatice cu impact asupra acestui grup de nevertebrate, importanța economică și fitosanitară a nematodelor cu chiști și a celor galicole dar și aspecte privind modul de dăunare;

În carteaHorticultural Nematology (2014), autoarea de origine indiană Ravichandra N.G. folosește cele 81 ilustrații color pentru a scoate în evidență importanța fitonematodelor în horticultură, descrie concepte filogenetice și evolutive ale acestui grup de viețuitoare, evaluarea pierderilor în culturile horticole tropicale și subtropicale, importanța nematodelor de carantină, tehnici de identificare utile în diagnoză și managementul daunelor provocate de nematodele galicole;

Literatura nematologică internațională a fost completată în anul 2017 cu o lucrare complexă, cuprinzând 569 de pagini și 177 ilustrații color, numită Nematology in South Africa: A View from the 21st Century, unde autorul Fourie H. și colaboratorii săi, descriuînceputurile nematologiei pe teritoriul african, studii ale adaptării nematodelor la schimbările climatice, soluții viabile la problemele cauzate de atacul nematodelor galicole în Africa de Sud și nu numai.

Managementul integrat al nematodelor galicole, alături de biologia,taxonomia, ecologia și biochimia acestora, precum și controlul biologic/chimic prin acțiunea nematocidelor, au fost și fac obiectul unor publicații în diferite articole monografice, articole cu date aplicative ale celor mai importante reviste și jurnale de specialitate: Nematology (International Journal of Fundamental and Applied Nematological Research) din Regatul Unit, Journal of Nematology din Statele Unite ale Americii (Florida), Asian Journal of Nematology (China), Nematologia Brasileira (Brazilia), Russian Journal of Nematology (Rusia), Pakistan Journal of Nematology (Pakistan) și Nematologia Mediterranea(Instituto per la Protezione delle Piante – Italia).

Stadiul actual al cercetărilor genului Meloidogyne la nivel mondial și în România (1950 – până în prezent)

Între anii 1949 și 1998 mai mult de 80 specii de Meloidogyne au fost descrise, în America de Nord și Sud, Africa, China și Europa.

În trecut, în Europa, nematodele galicole din genul Meloidogyne erau considerate de importanță secundară, după nematozii cu chiști (Globodera și Heterodera). Odată cu reducerea utilizării nematocidelor de sinteză, genul Meloidogyne a devenit din ce în ce mai important, iar în ultimii ani au fost detectate specii noi de interes economic (Wesemael și colab.,2011).

În prezent este cunoscut faptul că specii precum Meloidogyne hapla și M. naasi sunt identificate în culturile agricole din climatul rece. Din anii 1990, speciile M. chitwoodi și M. fallax au devenit tot mai prezente în producțiile de cartofi și legume din nordul continentului european în timp ce M. arenaria, M. incognita și M. javanica s-au dovedit a fi specii răspândite cu precădere în climatul cald din sudul Europei, precum și în spațiile protejate din nordul Europei (Karssen, 2002).

Recent a fost descrisă specia M. minor (Karssen și colab. 2004), cu distribuție limitată la Marea Britanie, Olanda, Belgia și Irlanda (Lammers și colab., 2006; Viaene și colab., 2007), însă potențialul său de a produce daune la cartofi îndeamnă la o atentă supraveghere a acestei specii. Spre deosebire de aceasta, M. enterolobii este considerată o specie extrem de agresivă, fiind adăugată în lista de alertă a Organizației Europene și Mediteraneene de Protecția Plantelor (OEPP)(Kiewnick și colab., 2008).

Cele mai multe specii identificate în ultimii ani au fost întâlnite pe arii agricole, excepție făcând M. ardenensis, M. silvestris, M. maritima, M. krally, M. ulmi și M. duysti (Wesemael și colab.,2011). Specia M. minor a fost detectată în dunele de coastă din Irlanda unde, probabil, există habitatul său natural (Lammers și colab., 2006).

La începutul anilor 2000 au fost izolați juvenili de M. chitwoodi din solul unor păduri de stejar belgiene, indicând prezența de multă vreme a acestor populații în astfel de habitate silvestre (Waeyenberge și Moens, 2001). Puține studii sunt disponibile în privința speciilor de Meloidogyne în habitatele lor naturale, deși acest lucru ar oferi informații valoroase despre originea acestor specii și relația sol-hrană.

Cercetările viitoare se vor îndrepta către identificarea cât mai exactă a acestor specii de nematode fitoparazite, către managementul și controlul acestora în ariile de interes agricol.

Pentru o identificare fiabilă cea mai bună abordare rămâne integrarea datelor morfologice, analizele de biologie moleculară, împreună cu informațiile despre modul de reproducere, numărul de cromozomi, plante-gazdă și distribuție (Karssen și Moens, 2006).

Multe grupuri de cercetători europeni, americani și asiatici au dezvoltat tehnici moleculare pentru identificarea speciilor de Meloidogyne (Block și Powers, 2009).

Electroforeza proteinelor a fost prima tehnică biochimică aplicată în nematologie (Perry și colab., 2007). Fenotipuri de izoenzime ale adulților (femele) au fost dezvoltate în Franța de către Dalmasso și Berge(1978),iar de atunci esteraza și malatdehidrogenaza au rămas markeri fiabili pentru identificarea speciilor de Meloidogyne, utilizați ca standard la descrierea de noi specii (Esbenhade și Triantaphyllou, 1985, Karssen și colab., 1995).

Gelul bidimensional electroforetic, care oferă o mai bună amprentare și separare a proteinelor, a fost folosit pentru a separa speciileM. chitwoodi, M. fallax și M. hapla (Beek și colab.,1997; Tastet și colab., 1999).

Pentru separarea speciilor de Meloidogyne prin electroforeză proteică este necesar prelevarea femelelor adulte. Deoarece profilele ADN nu sunt specifice fiecărei etape de dezvoltare, în ultimii ani s-a recurs la prelevarea materialului genetic și din alte stadii de dezvoltare (juvenili). Astfel, s-a pus la punctPolymerase Chain Reaction (PCR), devenind cea mai răspândită tehnică pentru identificarea nematodelor genului Meloidogyne și pentru studierea diversității lor genetice (Wesemael și colab.,2011). Metodele PCR multiplex dezvoltate ulterior permit detectarea uneia sau mai multor specii într-un singur test PCR.

Zijlstra (1997) a identificat specii de nematode galicole dintr-un amestec de mai mulți juvenili (M. chitwoodi, M. fallax, M. hapla și M. incognita) într-o singură reacție PCR; tehnica a făcut posibilă detectarea speciilor prezente în amestecuri de sub 2%.

După anii 2000 autorii Roland Perry, Maurice Moens, James Star, RavichandraN.G., Karssen Gerrit, rămân cei mai activi autori ai publicațiilor ce vizeză speciile de Meloidogyne.

În anul 2007 au fost publicate metode de biologie moleculară și s-a realizat un protocol de diagnostic molecular pentru speciile M. incognita, M. enterolobii,M. hapla, M. javanica, M. arenaria, M. chitwoodi și M. fallax,care poate utiliza câte un singur juvenil sau adult (Adam și colab., 2007).

La nivel mondial genul Meloidogyne include aproape 100 de specii descrise (Hunt și Handoo, 2009; Mucksood și Tabreiz, 2016).

În România primele referiri asupra nematodelor parazite ale plantelor se datorează lui Pricină (1910), cuprinzând o scurtă descriere, mod de atac și câteva indicații privind combaterea speciilor Tylenchus tritici, Heterodera schachtii și Ditylenchus dipsaci.

Manolache (1944) semnalează prezența unei noi specii dăunătoare în culturile de ardei, castraveți și roșii din județul Ilfov și anume nematodul rădăcinilor (Meloidogyne spp.), citat sub denumirea de Heterodera maroni Cornu.

Lucrările publicate în țara noastră privind grupul de nematode galicole ale rădăcinilor, cunoscute sub denumirea de “viermi ai rădăcinilor” sau Heterodera maroni Cornu (Manolache și colab.,1949) se referă în cea mai mare parte la aspect de combatere (Mustățea, 1957; Mustățea și Pătrașcu, 1960; Hrisafi, 1960; Boguleanu, 1961; Beratlief și colab., 1962; Diaconu, 1970) și mai puțin asupra plantelor gazdă, modul de atac, daune produse (Rogojanu,1954; Ceianu, 1958; Gusic, 1963), inclusiv sistematica și morfologia dăunătorului (Radu și Dărăbanțiu, 1960).

Primele referiri asupra genului Meloidogyne, apar în anul 1970 odată cu identificarea speciei Meloidogyne incognita, ca unul dintre principalii dăunători ai plantelor de seră din țara noastră (Romașcu, 1973). Ulterior, în anul 1971 a fost depistată la cale (Calla aethiopica) un nou nematod galicol de seră, fiind vorba deMeloidogine arenaria (Romașcu, 1973) iar la sfărșitul anului 1973 și începutul lui 1974 a fost depistată specia Meloidogyne hapla – “un parazit al rădăcinilor la morcovi din câmp” (Romașcu, 1973; Romașcu, 1975; Romașcu și colab., 1977; Romașcu, 1979).

Institutul de Protecția Plantelor – București (actualmente Institutul de Cercetare-Dezvoltare pentru Protecția Plantelor), Stațiunea de Cercetări Legumicole – Ișalnița, Intreprinderea Județeană de Legume-Fructe – Ilfov sunt centre unde cercetători precum Emil și Gabriela Romașcu, M. Ivan, V. Lemeni și alții, au publicat articole despre nematodele galicole, între anii 1970 și 1980. Este de amintit cartea “Nematozii plantelor agricole și combaterea lor” aparută în 1973, semnată de către Emil Romașcu, unul dintre pionierii descrierii speciilor de Meloidogyne în România.

Mai recent, autori precum Pașol P., Roșca I. Rojancovschi E., Micu L., Petanec D., Stan C., Dobrin I., Bunescu H., Boțoman Ghe., Puiu C.,au publicat capitole, cursuri, și articole despre nematodele galicole fitoparazite ale plantelor.

Fauna helmintologică în diferite areale viticole precum și rolul unor specii de nematode din familia Longidoridae (Nematoda: Dorylamidia) în transmiterea unor boli virotice la plante, a făcut obiectul unor studii recente (Groza, 2013).

Încadrarea sistematică a genului Meloidogyne și importanța fitosanitară a acestui grup de nematode

Datorită unor similitudini în morfologie și biologie, nematodele galicole și cele cu chiști au apărut în multe descrieri sistematice, ambele grupuri fiind adesea plasate într-o singură familie sau subfamilie, Heteroderidae sau Heteroderinae. Această suspiciune a indicat că cele două grupuri au evoluat probabil separatși au atins această similitudine prin intermediul evoluției convergente.

Nematodele galicole au fost incluse pentru prima dată într-ofamilie proprie de către Skarbilovich (1959), propunerea de Meloidogyne subliniind diferențele între nematodele cu chiști și cele cu gale.

Apariția metodelor moleculare a permis o mai bună înțelegere a Filumului Nematoda. Ca urmare, morfologia bazată pe scheme sistematice a fost înlocuită în mare măsură cu scheme bazate pe filogenia moleculară. În încercarea lor de a unifica sistematica De Ley și Blaxter (2002, 2004) au introdus Infraordinul ca unitate taxonomică.

Poziția sistematică a nematodelor galicole la nivel de familie a fost și rămâne un subiect controversat.De Ley și Blaxter (2002, 2004), Karssen și colab., (2013), nume consacrate în nematologia actuală, dau următoarea încadrare sistematică:

Filumul Nematoda Potts, 1932

Clasa Chromadorea Inglis, 1983

Ordinul Rhabditida Chitwood, 1933

Subordinul Thylenchina Thorne, 1949

Infraordinul Tylenchomorpha De Ley și Blaxter, 2002

Superfamilia Tylenchoidae Örley, 1880

Famila Meloidogynidae, Skarbilovich, 1959

Genul Melodogyne Gölgi 1887

Dintre toate nematodele parazite ale plantelor, cele aparținând genului Meloidogyne reprezintă cel mai important grup din punct de vedere economic. Importanța studierii acestui grup se impune datorită distribuției lor la nivel mondial, fiind considerați paraziți obligatorii ai rădăcinilor, tuberculilor și a altor organe la câteva mii de specii de plante, având ca rezultat efecte devastatoare asupra calității și randamentului culturilor agricole (Moens și colab., 2009).

Pierderile cauzate de aceste nematode sunt, în medie, mai mari în regiunile tropicale decât în cele temperate. Acest lucru se datorează unei diversități mai mari a speciilor în astfel de regiuni, condiții de mediu favorabile pentru nematozi, colonizare, reproducere și dispersare, lipsa unui suport tehnic și a resurselor financiare pentru combatere (De Waele și Elsen, 2007).

Un aspect important al studierii acestui grup de nematode rezidă din faptul că multe specii se regăsesc în lista nematodelor supuse carantinei fitosanitare aparținând diverselor organizații mondiale de protecția plantelor .

Astfel, specii precum Meloidogyne chitwoodi și M. fallax se află pe Lista A2 a Organizației Europene și Mediteraneene de Protecția Plantelor (OEPP) încă din anul 1995, respectiv 1998, precum și în „Lista de alertă” a Organizației de Protecția Plantelor din America de Nord (NAPPO).

Celor două specii amintite mai sus li s-a alăturat, în anul 2010, M. enterolobii(sinonim cuM. mayaguensis), specie semnalată pe teritoriul European în țări precum Belgia, Franța, Olanda și Suedia. Acest nematod a fost introdus pe continental european odată cu materilalul vegetal importat din Asia (China – Hainan și Guangdong, Vietnam), America de Sud (Brazilia, Venezuela) și Africa (Burkina Faso, Côte d’Ivoire, Malawi, Senegal, Africa de Sud).

Pe continentul american M. enterolobiia fost semnalat pentru prima dată în 2002la plante ornamentale, într-un câmp de tomate și într-o pepinieră de fructe tropicale. Acest nematod este dificil de controlat și eradicat fiind o specie polifagă și deosebit de agresivă

(Blok și colab. 2002; Brito și colab., 2004; Xu și colab. 2004; OEPP Bulletin 41, 2011).

În ultimii ani o specie tropicală de nematode galicole, M. ethiopica, a fost identificată prima dată în Europa (Dornberk-Slovenia) (Širca și colab. 2004).

Specia s-a dovedit foarte dăunătoare pentru multe plante mono- și dicotiledonate de importanță economică din Europa (legume, plante ornamentale sau fructe).

Calea de dispersare a acestui nematod în Europa rămâne, până în prezent, necunoscută.

În ciuda originii tropicale, Meloidogyne ethiopica are potențialul de a supraviețui în aer liber din clima continentală (veri călduroase și ierni reci), chiar și în zonele în care temperatura solului scade sub 0°C în timpul iernii. Acest lucru indică faptul că M. ethiopica ar putea să să-și extindă arealul și să se răspândească în partea sudică și centrală a regiunii europene.În plus, M. ethiopica ar putea supraviețui în condiții controlate (sere, solarii) din aceste regiuni.

Odată pătruns pe continent acest nematod este, în general, dificil de controlat sau eradicat. Pe baza caracteristicilor morfologice M. ethiopica poate fi confundat cu M. incognita și, astfel, poate fi omis în cazul unei diagnoze sumare. Luând în considerație gama vastă de plante-gazdă a acestei specii și capacitatea de a supraviețui în multe regiuni ale Europei, este de dorit evitarea introducerii acesteia în ariile agricole (Carneiro și colab., 2003; Strajnar și colab. 2011; Conceicao și colab. 2012;).

Meloidogyne mali este un alt nematod galicol, originar din Japonia, a cărui prezență în Europa a fost semnalată recent, deși introducerea sa a avut loc probabil cu câteva decenii în urmă. Specia a fost identificată în Wageningen –Olanda, în anul 2013, în câteva plantații de ulm (Ulmus spp.). În 2014, M. mali a fost detectat la mai mulți arbori ornamentali din Haga. În Italia, nematodul a fost întâlnit pentru prima dată în 1998 la Ulmus chenmoui din regiunea Pisa – Toscana. Inițial a fost descris ca o specie nouă, M. ulmi, care mai târziu a devenit sinonimă cu M. mali (Ahmed și colab., 2013).

Deși prezența specieiM. mali a fost confirmată doar în Italia și Olanda, se consideră că distribuția sa în Europa și America ar putea fi mai extinsă. În Statele Unite ale Americii, M. mali a fost prima dată identificat în 2016, în probe de rădăcini colectate de la un gard viu de Euonymus kiautschovicus (Celestraceae), într-o grădină privată. Originea acestei infestări nu este cunoscută, dar se presupune că nematodul ar fi pătruns pe continentul european și american odată cu importul materialului de plantare silvic(Palmisano și Ambrogioni, 2000; Eisenback și colab. 2017).

În urma unor evaluări preliminare a riscurilor, atât specia M. ethiopica cât și M. mali au fost introduse temporar (câțiva ani) în „Lista de alertă” a OEPP și NAPPO, urmând a fi supuse unei analize a riscului pentru a vedea dacă pot fi transferați pe lista dăunătorilor de carantină fitosanitară (https://www.eppo.int/QUARANTINE/Alert_List/alert_list.htm).

Deși speciile de Meloidogyne sunt considerate ca aparținând, în lume, celui mai important gen de nematode fitoparazite (Sasser și Freckman, 1987), informațiile cu privire la impactul economic al acestora, în Europa, sunt limitate.

Astfel, creșterea lentă a plantelor, îngălbenirea frunzelor și piticirea sunt adesea atribuite tulburărilor de nutriție minerală sau deficitului de apă (Stilrling și colab., 1998).

Boala petelor galbene de pe terenurile de golf produsă de Melodogyne minor, deprecierea tuberculilor de cartof cauzată de M. chitwoodi și M. fallax, deformări și creșteri excesive ale rădăcinilor de morcov produse de M. hapla, stagnari în creștere si cloroze ale frunzelor de tutun cauzate de M. incognita, sunt doar câteva exemple vizibile produse de nematozii galicoli (Figura 1 – A și B; Figura 2 – A și B) (Greco și Di Vito, 2009).

Figura 1. A – boala petelor galbene produsă de Meloidogyne minor ; B – deprecierea tuberculilor de cartof cauzată de Meloidogye chitwoodi (Greco N. & Di Vito M. 2009. Population dinamics and damage levels. In: Perry R., Moens M., Starr J.L. (Eds.). Root-knot Nematodes. CAB International, Wallingford, pp. 294-297)

Figura 2. A – deformări și creșteri excesive ale rădăcinilor de morcov produse de Meloidogyne hapla ; B – stagnări în creștere și cloroză a frunzelor la tutun cauzate de Meloidogye incognita(original)

În multe cazuri de infestări cu nematozi galicoli nu există simptome, iar galele de pe rădăcini pot fi limitate și foarte mici (Karssen , 2002).

Cu toate acestea au fost făcute estimări ale randamentelor scăzute și calității slabe a recoltelor la nivel mondial. Pierderile în principalele culturi horticole (legume , plante ornamentale, medicinale și aromatice, viță de vie), sunt redate în tabelul 1. (Ravichandra, 2014).

Tabel 1. Pierderi cauzate de Meloidogyne spp. la nivel mondial în culturi horticole (Ravichandra N.G. 2014. Horticultural Nematology. Springer India, pp. 1-54).

Pierderile economice cauzate de Meloidogyne spp. nu se limitează doar la reducerea randamentelor în producțiile agricole. Rotația culturilor și dezinfectarea câmpurilor sau a spațiilor protejate infestate ar putea fi îngrădită financiar sau ar putea ridica costurile de producție (Wesemael și colab., 2011).

În afara pierderilor directe cauzate de atacul nematozilor, multe pierderi raportate sunt indirecte. Acestea din urmă includ irosirea apei pentru irigare precum și a îngrășămintelor, deoarece rădăcinile cu nematozi, deteriorate, nu utilizează apa și ferilizanții în mod corespunzător (Mai, 1985).

Se cunosc adevărate „complexe ale atacurilor” cu nematozi din genul Meloidogyne împreună cu alți nematozi fitoparaziți.

Interacțiunile dintre Meloidogyne spp. si speciile de Fusarium au fost raportate la multe culturi gazdă (Abawi și Barker, 1984; Griffin, 1986; Siddiqui și Mahmood, 1999).

Scleroții de Rhizoctonia solani s-au descoperit în rădăcinile de tomate cu gale de Meloidogyne incognita, în timp ce regiunile fără gale erau lipsite de scleroți (Golden și Van Gundy, 1974).

Caracterizarea genului Meloidogyne

Elemente de biologie

Ouăle nematodelor galicole sunt incluse în masa gelatinoasă prezentă la suprafața galelor rădăcinilor, iar uneori în interiorul galelor. Această masă gelatinoasă (ovisac sau matrix gelatinos) are rolul protectiv împotriva condițiilor externe, dar și a prădătorilor din sol (Karssen și Moens, 2006).

Există studii limitate asupra glicoproteinelor și a altor componente ale masei gelatinoase, în ciuda importanței sale evidente (Sharon și Spiegel, 1993). În afară de protecția ouălor față de condițiile de mediu, s-a demonstrat proprietatea antimicobiană a acestei mase (Orion și Kritzman, 1991).

În urma procesului de embriogeneză rezultă primul stadiu juvenil (J1), care năpârlește în interiorul oului și se transformă în stadiu infestant J2 (larve de vârsta a doua, larve invazive, larve infective, larve infestante sau larve infectante).

Dezvoltatea acestor două stadii (J1 și J2) depinde de temperatură, de umiditatea suficientă sau insuficientă, dar și de alți factori, astfel încât trecerea la stadiu de juvenil infestant (J2) urmată de eclozare se face atunci când condițiile sunt favorabile pentru deplasare și localizarea plantei-gazdă.

Coaja oului devine flexibilă cu puțin timp înainte de eclozare, iar acest proces de pierdere a rigidității este exclusiv enzimatic.

Când juvenilii din stadiul J2eclozează părăsesc masele gelatinoase ale ouălor infectând rădăcinile din apropierea galei sau infectează noi rădăcini, la distanță de gale.

Juvenilii J2 infectivi și masculii sunt stadii ale nematodelor galicole ce pot fi găsite libere în sol, supraviețuind perioade îndelungate. În această perioadă aceștia consumă doar rezervele energetice proprii (lipide) din intestin. Infecțiozitatea juvenililor J2 este mult diminuată după petrecerea unui timp îndelungat în afara rădăcinilor, în absența plantelor gazdă (Ferraz și Brown, 2002).

Juvenilii J2 infectivi, imediat după eclozare, pot rămâne un timp în masa gelatinoasă sau în solul periradicular, apoi înaintează înspre regiunea de elongare radiculară, imediat în spatele vârfului de creștere a rădăcinii. De asemenea, ei sunt atrași de meristemele apicale și de zonele în care apar rădăcinile laterale unde își stabilesc zonele de penetrare și hrănire. Cortexul rădăcinii este penetrat în apropierea zonei de diferențiere în timp ce juvenilii migrează intracelular în interiorul rădăcinii iar apoi fac o mișcare de 180° întorcându-se spre zona de diferențiere (Wyss și colab. 1992; Perry și Curtis, 2013).

Natura stimulilor produși de rădăcini și percepută de către juvenili nu este clară.

O parte din compușii organici și anorganici, secretați de rădăcini, formează gradienți la suprafața rădăcinilor și apoi eliberați în sol pot influența nematozii. CO2 este considerat cel mai important factor de atracție pentru nematodele fitoparazite.

Juvenilii penetrează peretele rigid al rădăcinii prin folosirea stiletului și a enzimelor celulolitice și pectinolitice (Abad și colab., 2003).

Cu scopul de a susține etapele parazitare ce vor urma, J2odată intrat în cilindrul vascular induce rediferențierea a 5-7 celule parenchimale radiculare care devin multinucleate și hipertrofiate, căpătând funcția celulelor de hrănire. Aceste celule de hrănire devin celule gigant la scurt timp, foarte active metabolic, acționând ca niște formațiuni specializate în furnizarea substanțelor nutritive pentru nematode, până la maturarea completă (Caillaud și colab., 2008).

În urma penetrării țesutului gazdei și a inițierii spațiului de hănire, J2 își modifică radical morfologia. Astfel, juvenilul crește în lungime, simultan cu extindrea glandelor faringiene și a metacorpului. Începe diviziunea primordiilor genitale și a celor șase glande rectale, dezvoltate posterior la juvenilul femel. Primordiile genitale iau forma literei „V” și se deschid într-un vagin rudimentar, cu comunicare exterioară aproape de peretele corpului, posterior. Gonada sexului masculin se dezvoltă ca o ramură unică, în același timp cu vasele deferente, poziționate posterior, care se vor uni cu rectul.

În timpul dezvoltării ulterioare juvenilii J2, treptat, nu se mai hrănesc rămânând în țesutul cortical al rădăcinii, iau forma unor “cârnăciori” suferind trei năpârliri, transformându-se în juvenili de stadiu J3 iar apoi J4.

Ultima năpârlire este cea în care apar masculii vermiformi care rămân în interiorul cuticulei stadiului J4. Femela se mărește foarte mult, începe hrănirea în scurt timp și devine piriformă.

La ultima năpârlire stiletul este reformat, iar organele digestive și reproducătoare sunt funcționale.

După această năpârlire stiletul este așadar funcțional iar femelele cresc foarte rapid (Triantaphyllou și Hirchmann, 1960; Franklin 1965; Eisenback și Hirschmann, 1991).

Energia necesară pentru a ajunge la stadiul J3 și J4 este obținută de juvenili înainte de a doua năpârlire deoarece stadiile J3 și J4 nu reușesc să se hrănească pe seama gazdei.

Acest lucru se întâmplă pentru că aceste stadii nematodele sunt lipsite de stilet și rămân în teaca cuticulară încă de la stadiul J2. Această cuticulă păstrează un apendice spicat, în vârf, deși în interior juvenilul ocupă un spațiu perfect rotunjit posterior.

Acest aspect îi diferențiază față de juvenilii în curs de dezvoltare ai altor specii de nematode fitoparazite (Globodera și Heterodera) ce nu prezintă apendice spicat.

În condiții favorabile, stadiul J2 se transformă (năpârlește) în stadiul J3 după aproximativ 14 zile. Timpul „alocat” pentru trecerea de la stadiul J3 la stadiul J4 este mult mai scurt, de doar 3-4 zile.

Faza endofită a biologiei nematodelor Meloidogyne spp. are loc în afara plantei-gazdă în timp ce faza endofită de dezvoltare are loc integral în rădăcina plantei-gazdă (Figura 3).

Figura 3. Fazele derulării ciclului biologic la nematodele din genul Meloidogyne (Abad și colab. 2008. Genome sequence of the metazoan plant-parasitic nematode Meloidogyne incognita. Nature Biotechnology 26(8): 909-915.)

Aprovizionarea cu substanțe nutritive poate fi un factor important. În lipsa hranei s-a remarcat o creștere a numărului de masculi față de cel al femelelor. Se cunoaște faptul că, în astfel de condiții, juvenilii femeli pot deveni masculi adulți. În acest caz, masculii rezultați din juvenilii femeli pot avea 1-2 gonade de lungimi variabile. Uneori se întâlnesc și forme intersexuale (masculi cu vulvă).

Numărul de generații pe an variază în funcție de procurarea hranei. În mod obișnuit, există mai multe generații pe an (10 – 12), însă la Meloidogyne naasi există o singură generație.

În condiții favorabile o femelă poate produce câteva sute de ouă. Fiecare femelă poate produce 30 – 80 de ouă pe zi. Ouăle nu sunt reținute în corpul femelei, așa cum se întâmplă la nematodele din genurile Heterodera și Globodera.

Raportul între sexe este dezechilibrat la nematodele galicole ale rădăcinilor, astfel că la M. carolinensis și M. spartinae raportul este de obicei 1:1.

La M. hapla și M. incognitaraportul este foarte variabil.

În funcție de condițiile de mediu, masculii pot fi rari, absenți sau în număr mare în sol.

Deși masculii apar într-un număr redus, în anumite condiții efectivul lor poate depăși pe cel al femelelor (Iacob și colab., 1978)

Acești paraziți obligatorii au evoluat prin abilitatea de a manipula funcțiile plantei-gazdă în propriul lor beneficiu. Ei induc rediferențierea parenchimului rădăcinii cu apariția celulelor gigant, sursă propice de nutrienți pentru stadiile de dezvoltare ulterioare.

Spre deosebire de alte nematode fitoparazite care distrug celulele prin intermediul cărora se alimentează, în cazul nematodelor galicole este esențial ca celulele de hrănire să rămână sănătoase și active metabolic pe parcursul ciclului biologic al nematodului (Adab și colab. 2008).

Aceste adevărate spații de alimentare specializate, conținând celulele gigant care formează galele, sunt remarcabile pentru complexitatea lor. Țesuturile sunt mult mai mari decât țesuturile tipice floemului și xilemului sau a celui cortical, celulele având într-un final un volum de 100 de ori mai mare față de celulele normale din rădăcină. Celulele gigant sunt similare, ca și funcționalitate, cu celulele sincițiale induse de alte nematode dar diferă în acest caz, prin prezența femelelor sedentare, distincte. Spre deosebire de sincițiu, fiecare celulă gigant se dezvoltă de la o celulă inițială unică, mai degrabă, și nu prin fuzionarea mai multor celule adiacente.

Celulele gigant nu sunt numai multinucleate, conținând mai mult de 80 de nuclei fiecare, dar nucleele individuale pentru fiecare celulă sunt poliploide, unele cu creșteri de până la opt ori a numărului de cromozomi (Huang și Maggenti, 1969; Wiggers și colab., 1990).

Elemente de morfologie

Prima descoperire a galelor induse de nematode a fost făcută de către Berkely în 1855, într-o seră din Anglia, fiind apoi recunoscute ca agenți patogeni importanți pentru numeroase specii de plante din toată lumea. Aproape de sfârșitul secolului al XIX-lea sunt recunoscute ca dăunători ai plantelor de interes economic, apărând diverse studii detaliate cu privire la morfologia lor.

Deși au existat multe studii asupra morfologiei și a ciclului de dezvoltare, cel mai important, în acest sens, a fost făcut de către Chitwood (1949), care a arătat că nematodele galicole cuprind mai multe specii diferite. Studiile histologice (Elsea, 1951; Maggenti și Allen, 1960) au adăugat detalii importante în înțelegerea morfologiei acestui gen de nematode și, la scurtă vreme după aceea, utilizarea microscopului electronic cu transmisie (TEM) a îmbunătățit cunoștințele de ultrastructură asupra modificărilor care apar în faza de parazitism.

Observații suplimentare cu privire la morfologia diferitelor stadii de viață au fost elucidate cu ajutorul microscopului electronic (SEM). Acest instrument a adus clarificari în privința modelului perineal, a morfologiei juvenililor, a masculilor, a formei capului femelelor la patru specii comune: Meloidogyne incognita, M. hapla, M. javanica și M. arenaria (Eisenback și colab., 1980; Eisenback și Hunt, 2009).

Morfologia nematodelor galicole ale rădăcinilor a fost revizuită de mai multe ori, iar toate aceste revizuiri au fost importante pentru identificarea speciilor și înțelegerea relațiilor filogenetice. În plus, aceste detalii morfologice sunt adesea folosite pentru a determina sau elucida o funcție fiziologică.

Nu în ultimul rând, observațiile morfologice se fac utile în interpretarea interacțiunii nematodelor cu mediul și implicarea în relația gazdă-parazit, deoarece această înteracțiune are o mare influență asupra morfologiei nematodului (Jepson, 1987; Eisenback și Hunt, 2009). Speciile de Meloidogyne sunt caracterizate printr-un dimorfism sexual pronunțat, atât prin forma cât și prin mărimea corpului (Cîndea, 1984).

1.3.2.1. Femela – sedentară, de culoare alb-perlată, având corpul rotund spre piriform, zona gâtului fiind îndoită uneori (Figura 4). Stadiul de chist nu este prezent la acest gen de nematode. Deși femela este sedentară, regiunea gâtului este bine îmbrăcată în mușchi, permițând acesteaia să-și schimbe poziția capului, astfel încât se poate hrăni pe una sau mai multe celule gigant din interiorul galelor. Creșterea în dimensiune a corpului adaugă volum sistemului reproducător, în contrast cu intestinul. Acesta din urmă este mai puțin specializat, servind doar ca depozit pentru nutrienții extrași din plantă.

Cele două ovare sunt în contact direct cu intestinul, asfel că nutrienții stocați în intestin traversează câteva membrane celulare, devenind disponibili pentru creșterea oogoniilor și oocitelor în transformarea lor spre oul matur, complet format (Eisenback și Hunt, 2009).

Figura 4. Structura femelei nematodului galicol al rădăcinilorMeloidogyne spp.(Eisenback J.D. & Triantaphyllou H. 1991. Root-knot nematodes: Meloidogyne species and races. In: Nickle W.R. (Eds.). Manual of Agricultural Nematology. M. Dekker, New York, pp.191-270)

Lungimea femelei este de 300 – 3000µm, iar lățimea 300 – 700µm.

La femela complet dezvoltată cuticula prezintă inelări, întotdeauna pronunțate în regiunea capului și în partea posterioară a corpului, unde formează modelul cuticular sau perineal caracteristic, ce poate fi observat în jurul regiunii ano-vulvare (Figura 5) (Eisenback și Triantaphyllou, 1991). Forma acestui model este adesea variabilă și inflențată de diverși factori de dezvoltare. Perineul este mărginit de fasmide situate mai sus de anus, dorsal.

Figura 5. Structura modelului perineal al femelei (Eisenback J.D. & Triantaphyllou H. 1991. Root-knot nematodes: Meloidogyne species and races. In: Nickle W.R. (Eds.). Manual of Agricultural Nematology. M. Dekker, New York, pp.191-270).

Unele specii au linii laterale sau punctuații subcuticulare, mai sus de perineu.

De obicei, anusul este acoperit de mici cuticule pliate iar perineul poate fi ușor ridicat.

Stiletul, relativ subțire la acest gen, are o lungime de 10 – 25µm ; la multe specii conul stiletului este ușor curbat dorsal, iar corpul stiletului este drept, la baza căriua se află trei butoni. Forma butonilor bazali variază, de la rotunjiți la alungiți transversal, înclinați posterior.

Orificiul glandei faringiene dorsale (DGO) este situat la 2,5 – 9µm înapoia butonilor bazali ai stiletului.

Porul secretor-excretor este situat, de obicei, între butonii bazali ai stiletului și nivelul metacorpului.

Metacorpul, în sine, este relativ mare și conectat, posterior, la glandele faringiene.

Aceste glande au lungimi și forme variabile, suprapunându-se ventral peste intestin.

Gonadele sunt lungi, parțial spiralate.

Aparatul reproducător este compus din ovar, cu zonă germinală și zonă de creștere, oviduct, spermatecă lobată și uter foarte lung. Cele mai multe ouă neembrionate sunt depozitate în masa gelatinoasă produsă de șase glande mari, unicelulare, rectale și excretată prin anus.

1.3.2.2. Masculul – mobil, vermiform, cu anule clare, cu lunigimea variabilă de 600 – 2500µm (Figura 6) (Eisenback și Triantaphyllou, 1991). Structura cefalică și linia stiletului sunt bine reprezentate; acesta din urmă având lungimea de 13 – 33µm. Orificiul glandei faringiene dorsale este localizat la 2 – 13µm în spatele celor trei butoni bazali ai stiletului. Forma butonilor bazali este similară cu a femelei.

Figura 6. Structura masculului nematodului galicol al rădăcinilorMeloidogyne spp.

(Eisenback J.D. & Triantaphyllou H. 1991. Root-knot nematodes: Meloidogyne species and races. In: Nickle W.R. (Eds.). Manual of Agricultural Nematology. M. Dekker, New York, pp.191-270).

Metacorpul este mult mai mic comparativ cu cel al femelei. Porul secretor – excretor și hemizonidul sunt localizați la nivelul metacorpului și se suprapun, ventral, cu glandele faringiene. Hemizonidul este poziționat anterior și uneori posterior de porul secretor – excretor. Nucleii glandei faringiene sunt, în mod obișnuit, reduși la doi.

Există un singur testicul și mult mai rar două la acest gen de nematzi.

La cele mai multe specii liniile laterale, de pe suprafața corpului, au patru incizuri iar benzile exterioare sunt adesea areolate.

Coada este foarte scurtă, rotunjită, fără bursă. Fasmidele, mici, sunt poziționate în apropierea colacei. Spiculii sunt subțiri, au 20 – 40µ lungime, în timp ce gubernaculum are 10µ lungime.

1.3.2.3. Juvenilul infestant (juvenilul de stadiu J2)- vermiformă, inelată, având 250 – 600µm lungime (Figura 7) (Eisenback și Hunt, 2009; Eisenback șiTriantaphyllou, 1991).

Structura capului este similară cu a masculului, dar mult mai mică, iar sclerotizarea arhitecturii capului este mai slab evidențiată. Linia stiletului este delicată, având 9 – 16µm, iar poziția orificiului glandei esofagiene dorsale se situează la 2 – 12µm înapoia butonilor bazali ai stiletului.

Figura 7. Structurajuvenilului infestant al nematodului galicol al rădăcinilorMeloidogyne spp.(Eisenback J.D. & Hunt D.J. 2009. General morphology. In: Perry R.N., Moens M., Starr J.L. (Eds.). Root-knot Nematodes. CAB International, Wallingford, UK, pp. 18-53; Eisenback J.D. &Triantaphyllou H. 1991. Root-knot nematodes: Meloidogyne species and races. In: Nickle W.R. (Eds.). Manual of Agricultural Nematology. M. Dekker, New York, pp.191-270).

Metacorpul este relativ mic.

Hemizonidul este situat anterior sau posterior de porul excretor.

Trei glande faringiene, poziționate ventral, se suprapun peste intestin.

Rectul este umflat. Coada are 15 – 100µm lungime și se îngustează spre vârf iar terminal este hialină. Fasmidele sunt foarte mici și localizate la o treime din lungimea cozii, sub nivelul anusului. Liniile laterale au patru incizuri iar benzile exterioare sunt areolate.

Juvenilii din stadiile J3 și J4 sunt sedentari, umflați și localizați în interiorul rădăcinii; nu au stilet și se dezvoltă în interiorul cuticulei stadiului J2. Energia acumulată de stadiile larvare este înmagazinată și transferată primordiului genital care ulterior dezvoltă sistemul de reproducere adult (Triantaphyllou și Hirschmann 1960; Triantaphyllou, 1960; Eisenback și Hirschmann, 1981; Jepson 1983a).

1.2.2.4. Oul –elipsoidal, variază ca dimensiune și formă având aproximativ 95µ lungime și 40µ în diametru. Coaja oului este formată dintr-un strat exterior vitelin de aproximativ 30nm grosime, urmează apoi un strat mijlociu, chitinos, de cca. 400nm iar în interior se găsește un strat glicolipidic de diferite grosimi. Acest ultim înveliș face oul foarte rezistent la produsele chimice concentrate; în această etapă oul nefiind sensibil la toxine, așa cum sunt cele din nematocidele comune.

Chitina a fost detectată în coaja oului cu ajutorul testelor histologice și în urma examinărilor la microscopul electronic. Se estimează că în coaja oului se găsește 30% chitină (Bird și Self, 1995; Bird și McClure, 1976).

1.3.3. Elemente de bionomie

Nematodele se dezvoltă aproape în orice mediu terestru fiind printre cele mai cosmopolite organisme de pe planetă. Patru din cinci metazoare sunt reprezentate de nematode, în timp ce 100 g de sol pot găzdui până la 3000 de nematode.

Cu o valoare estimată la 1 milion de specii, numai insectele rivalizează în diversitate cu nematodele (Gaugler și Bilgrami, 2004).

Nematodele galicole demonstrează o mare diversitate sub diferite aspecte ale ciclului lor de viață. În privința cerințelor față de temperatură nematodele galicole pot fi împărțite în două grupuri distincte: specii criofile și specii termofile, separate astfel după capacitatea de transformare a lipidelor corpului (în faza lichidă) la temperatura de 10°C (Lyons și colab., 1975; Evans și Perry, 2009)

Meloidogyne chitwoodi, M. hapla și M. naasi sunt specii criofile capabile să supraviețiuască în sol la temperaturi sub 10°C, în timp ce M. arenaria, M. javanica și M. exigua sunt specii termofile și nu supraviețuiesc pe termen lung la temperaturi sub 10°C (Evans și Perry, 2009). Ca și supraviețuirea, eclozarea larvelor este controlată în principal de temperatură. Nematodele acestui grup au mai multe generații într-un an, iar acest număr de generații variază în funcție de specie și de disponibilitatea sursei de hrană. Excepție face M. naasi, care are o singură generație pe an. (Rivoal și Cook, 1993).

În raport cu plantele-gazdă nematodele galicole demonstrează diverse grade de adaptabilitate și preferințe așa încât ariile ocupate de culturi de interes agricole dovedesc mai bune gazde decât buruienile (Mandulu și Trudgil, 1993).

Multe specii de nematode galicole cu înmulțirea sexuată (amfimixică) au spectru limitat de plante-gazdă, fie plante lemnoase, fie erbacee perene.

Astfel, M. spartinae pare să se limiteze la speciile de stuf (Spartina spp.), M. pini și M. megatyla sunt limitate la câteva specii de pin (Pinus spp.), în timp ce M. subartica se limitează doar la unele ierburi perene (Commelinidae spp.) (Jepson, 1987; Moens și colab. 2009).

În afară de M. hapla, care are o gamă largă de plante-gazdă neincluzând gramineele, speciile cu înmulțire prin autofecundare (automixie) au un spectru îngust de plante-gazdă în timp ce speciile cu înmulțire mitotică au o gamă largă de plante-gazdă, incluzând majoritatea plantelor superioare (Trudgill și Blok, 2001).

Ouăle și juvenilii genului Meloidogyne nu supraviețuiesc la fel de mult precum cele ale celorlalte genuri de nematode fitoparazite, Heterodera și Globodera, la care ouăle rămân viabile mulți ani în interiorul chiștilor.

Ouăle speciilor de Meloidogyne sunt depozitate într-o masă gelatinoasă albicioasă sau maronie. Masele de ouă (albicioase) formate devreme în planta-gazdă conțin ouă care vor ecloza în scurt timp continuând ciclul biologic pentru mai multe generații. Masele de ouă formate mai târziu sau în condiții de stres (maronii) conțin ouă care rămân într-o stare latentă,neeclozând imediat. Acestă stare de dormantă, numită diapauză, asigură transmiterea nematodelor de la un sezon la altul (Perry și Moens, 2006).

Dacă femelele sunt localizate spre suprafața rădăcinilor straturile exterioare ale masei gelatinoase sunt expuse deshidratării ceea ce duce la o întărire a matricei exercitând o presiune mecanică asupra ouălor din straturile profunde, inhibând ecloziunea în condiții de uscăciune (Bird și Soeffky, 1972).

Ca și la celelalte viețuitoare poikiloterme temperatura joacă un rol important în distribuția, creșterea, supraviețuirea și reproducerea nematodelor galicole.

Textura solului, umiditatea, aerația și potențialul osmotic sunt factori care interacționează și dificil de interpretat în modul lor de acțiune asupra nematodelor galicole.

Speciile de Meloidogyne rămân active în sol la un nivel al umidității de 40-60% în câmp, iar în solurile foarte uscate sau excesiv de umede activitatea lor metabiolică scade.

Frecvența acesteui gen de nematode este mai mare în solurile nisipoase. Aerația redusă a solului (în special cel lutos) poate induce starea dormantă, care este însă reversibilă atunci când condițiile favorabile de mediu revin.

În mediul uscat, masa gelatinoasă în care sunt înglobate ouăle are rolul de a menține un nivel optim al umidității, îmbunătățind bariera pierderii apei.

Embrionii și juvenilii din stadiul J1sunt mai rezistenți la uscăciune, spre deosebire de juvenilii din stadiul J2, din cauza schimbărilor ce au loc în membrana oului.

În solurile uscate nematodele pot fi supuse presiunii osmotice crescute, în special după aplicarea de îngrășăminte; însă chiar și micile schimbări în potențialul osmotic pot influența comportamentul nematodelor (Perry și Curtis, 2013).

Bibliografie

Abad P., Favery B., Rosso M.N., Castagnone-Sereno P. 2003. Root-knot nematode parasitism and host response: molecular basis of a sophisticated interaction. Molecular Plant Pathology4: 217-224.

Adab P., Gouzi J., Aury J.M., Castagnone-Sereno P., Danchin E.G.J., Deleury E., Perfus-Barbeoch L., Anthouard V., Artiguenave F., Blok V.C., Caillaud M.C., Coutinho P.M., Dasilva C., De Luca F., Deau F., Esquibet M., Flutre T., Goldstone J.V., Hamamouch N., Hewezi T., Jaillon O., Jubin C., Leonetti P., Magliano M., maier T.R., Markov G.V., McVeigh P., Pesole G., poulian P., Robonson-Rechavi M., Sallet E., Se Guerens B., Steinbach D., tytgat T., Ugrate E., Ghelder C.V., Veronico P., Baum R.J., Blaxter M., Bleve-Zacheno T., Davis E.L., Ewbank J.J., Favery B., greiner E., Henrissat B., Jones J.T., Laudet V., Maule A.G., Quesneville H., Rosso M.N., Schiex T., Smant G., Weissenbach J., Wincker P. 2008. Genome sequence of the metazoan plant-parasitic nematode Meloidogyne incognita. Nature Biotechnology 26(8): 909-915.

Adam M.A.M., Phillips M.S., Block V.C. 2007.Molecular diagnostic key for identification of single juvenilesof seven common and economically important species of seven common and economically important root-knot nematodes (Meloidogyne spp.). Plant Pathology 56: 190-197.

Abawi G.S. & Barker K.R. 1985. Effects of cultivar, soil, temperature and levels of Meloidogyne incognita on root necrosis and Fusarium wild of tomatoes. Phytopathology74: 433-438.

Ahmed M., van Vossenberg B.T., de Cornelisse C., Karssen G. 2013. On the species status of the root-knot nematode Meloidogyne ulmi Palmisano & Ambrogioni (Nematoda, Meloidogynidae). ZooKeys362:1-27.

Beek J.G., Folkertsma R., Poleij L.M., van Koert P.H.G., Bakker J. 1997. Molecular evidence that Meloidogyne hapla, M. chitwoodi and M. fallax are distinct biological entities. Fundamental and Applied Nematology 20: 513-520.

Beijerinck M.W. 1887. The Gardenia root-desease. Garderners Chronicle 1: 488-489.

Beratlief C., Romașcu E., Adriano M. 1962. Mijloace de combatere a viermelui rădăcinilor (Heterodera maroni Cornu). Rev. Gosp. Agric. Stat. Vol. XIV, nr. 15, pp.13-24.

Berkeley M.J. 1855. Vibrio forming cysts on the roots of cucumbers. Gardener’s Chronicle and Agricultural Gazette 14, pp. 220.

Bird A.F. &Soeffky A.1972. Changes in the ultrastructure of the gelatinous matrix of Meloidogyne javanicaduring dehydration. Journal of Nematology 14: 166–169.

Bird A.F., McClure M.A. 1976. The tylenchid (Nematoda) eggshell: structure, composition and permeability.Parasitology 72: 19–28.

Bird A.F.& Self P.G. 1995. Chitin in Meloidogyne javanica. Fundamental and Applied Nematology 18: 235–239.

Blok V.C., Wishart J., Fargette M., Berthier K., Philips M.S. 2002. Mitochondrial DNA differences distinguishing Meloidogyne mayaguensis from the major species of tropical root-knot nematodes. Nematology4: 773-781.

Block V.C. &Powers T.O. 2009. Biochemical and molecular identification. In: Perry R.N., Moens M., Starr J.L. (Eds.). Root-knot nematodes. Wallingford, UK, CABI Publishing, pp. 38-118.

Boguleanu G. 1961.Combaterea în sere a nematodului rădăcinilor (Heterodera maroni Cornu). Grădina, via și livada 4, pp. 60-62.

Breda de Haan J.V. 1899. Levensgeschiedenis en Bestrijding van het Tabaksaaltje (Heterodera radicicola) in Deli. Meded. Pl.Tuin, Batavia 35.

Bridge J., Starr J. 2007. Plant Nematodes of Agricultural Importance. Manson Publishing, U.K., 152 pp.

Brito J., Powers T.O., Mullin P.G., Inserra R.N., Dickson D.W. 2004.Morphological and molecular characterization of Meloidogyne mayaguensis isolates from Florida. Journal of Nematology36: 232-240.

Caillaud M.C., Dubreuil G., Quentin M., Perfus-Barbeoch L., Lecomte P., de Almeida Engler J., Abab P., Rosso M.N., Favery B. 2008. Root-knot nematodes manipulate plant cells functions during a compatible interaction. Journal of Plant Physiology 165 : 104-113.

Carneiro R.M.D.G., Gomes C.B., Almeida M.R.A., Gomes A.C.M.M., Martins I. 2003. First record of Meloidogyne ethiopica Whitehead 1968 on kiwi in Brazil and reaction on different plant species. Nematologia Brasileira27: 151-158.

Ceianu V. 1958. Viermele rădăcinilor-Heterodera maroni. Grădina, via și livada, nr. 11, pp. 48-51.

Chitwood B.G. 1949. Root-knot nematodes, part I. A revision of the genus Meloidogyne Goeldi, 1877. Proceeding of the Helminthological Society of Washinton. 16, pp. 90-104.

Cîndea E. 1984. Dăunătorii legumelor și combaterea lor. Editura Ceres, pp. 35-36; 83-88; 150-153.

Cobb N.A. 1924. The amphids of Caconema and other nemas. Journal Parasitology 11: 118-120.

Conceicao I.L, Tzortzakakis E.A., Gomes P., Abrantes I., da Cunha M.J. 2012. Detection of the root-knot nematode Meloidogyne ethiopica in Greece. European Journal of Plant Pathology134(3): 451-457.

Cornu M. 1879. Études sur le Phylloxera vastatrix. Mémories Présentés par Divers Savants á l’Academie des Sciences, Institut France 26, pp.163-341.

Dalmasso A. & Berge J.B. 1978. Molecular polymorphism and phylogenetic relationship in some Meloidogyne spp.: application to taxonomy of Meloidodyne. Journal of Nematology 10: 323-332.

Darwin C. 1959. The origin of species – Preservation of favoured races in the struggle for life. London: John Murray, Albemarle street, 502 pp.

Darwin C. 2017. Originea speciilor (Ediție revizuită), Editura Academiei Române – București, pp. 23-488.

De Ley P., Blaxer M. 2002. Systematic position and phylogeny. In: Lee D.L. (Eds.) The Biology of Nematodes. Taylor & Francis Editure, London , UK, pp. 1-30.

De Ley P., Blaxer M. 2004. A new sistem for Nematoda: combining morphological characters with molecular tree, and translating clades into raks and taxa. In: Cook R., Hunt D.J.(Eds.) Prooceding of the Fourth International Congress of Nematology, 8-13 iunie 2002, Spania.

De Waele D. &Elsen A. 2007. Challenges and tropical plant nematology. Annual Review of Phytopathology 45: 457-485.

Diaconu N. 1970. Combaterea în sere a nematodului rădăcinilor (Meloidogyne maroni Cornu) pe cale chimică. Revista de Horticultră și Viticultură 9: 69-75.

Eisenback J.D., Hunt D.J. 2009. General Morphology. In: Perry R.N., Moens M., Starr J.L. (Eds.).Root-knot Nematodes. CAB International, Wallingford, UK, pp. 18-53.

Eisenback J.D., Graney L.S., Vieira P. 2017. First report of the apple root-knot nematode (Meloidogyne mali) in North America, found parasitizing Euonymus in New York. Plant Disease 101(3):510.

Eisenback J.D. &Triantaphyllou H.1991. Root-knot nematodes: Meloidogyne species and races. In: Nickle W.R. (Eds.).Manual of Agricultural Nematology, New York , pp. 191-274.

Eisenback J.D., Hirschmann H., Trianthaphyllou A.C. 1980. Morphological comparation of Meloidogyne female head structures, perineal patterns and stylet. Journal of Nematology 12: 300-310.

Eisenback J.D. & Hirschmann H. 1981. Identification of Meloidogyne species on the basis of headshape and stylet morphology. Journal of Nematology 13: 513–521.

Elsea J.R. 1951. The historical anatomy of the nematode Meloidogyne hapla. Proceeding of the Helminthological Society of Washinton18: 53-63.

Esbenshade P.R. & Triantaphyllou A.C. 1985. Use of enzyme phenotipes for the identification of Meloidogyne species. Journal of Nematology 22 :10-15.

Evans A.F. &Perry R.N. 2009. Survival mechanisms. In: Perry R.N., Moens M., Starr J.L. (Eds.).Root-knot Nematodes. CAB International, Wallingford, UK, pp. 201-219.

Ferraz L.C.C.B & Brown D.J.F. 2002. An introduction to Nematodes: Plant Nematology. Pentsoft Sofia, Bulgaria, pp. 40-52.

Fortuner R. 1984. List and status of the genera and families of plant-parasitic nematodes. Helminthology Abstracts 53: 87-133.

Fourie H. Spaull V.W., Joens D., Daneel M.S., De Waele D. 2017. Nematology in South Africa: A View from the 21st Century. Springer International Switzerland, 569 pp.

Frank A.B. 1885. Über das Wurzelalchen und die durch dasselbe verursachten Beschadigungen der Pflazen. Landw. Jagrb. 14: 149-176.

Franklin M.T. 1965. Meloidogyne root-knot eelworms. In: Plant nematology, Technical Bulletin 7, London, pp. 59-88.

Franklin M.T. 1979. Taxonomy of genus Meloidogyne. In: Lamberti F., Taylor C.E. (Eds.). Root-knot nematodes (Meloidogyne species), Systematics, Biology and Control, Academic Press, London, pp. 37-54.

Gaugler R. & Bilgrami A.R. 2004. Nematode behaviour. CABI Publishing, Wallingford, UK, pp. xi-xvii.

Gillard A. 1961. Onderzoekingen omtrent de biologie, de verspreiding en de bestrijding van wortelknobbelaaltjes (Meloidogyne spp.). Meded LandbHoogesch., Gent – Holland 26: 551-646.

Golden J.K., Van Gundy S.D. 1974. A disease complex of okra and tomato involving the nematode Meloidogyne incognita and soil-inhabiting fungus Rhizoctonia solani. Phytopathology 65: 265-273.

Goodey T. 1932. On the nomenclature of the root-gall nematode. JournalHelminthology 10: 21-28.

Greco N. & Di Vito M. 2009. Population dinamics and damage levels. In: Perry R., Moens M., Starr J.L. (Eds.). Root-knot Nematodes. CAB International, Wallingford, pp. 294-297.

Griffin G.D., Anderson J.L., Jorgenson E.C. 1968. Interaction of Meloidogyne hapla and Agrobacteriumtumefaciens in relation to raspberry cultivars. Plant Disease Reporter 52: 492–493.

Groza (Bontă) M. 2013. Cercetări asupra populațiilor de nematozi din familia Longidoridae prezente în România. U.S.A.M.V. – București, Teză de doctorat, 220 pp.

Gusic V. 1963. Observații asupra atacului viermelui rădăcinilor (Heterodera maroni-Meloidogyne maroni) în culturile de ciclamene din sere. Anal. Rom. Sov. Agric. Zoot., nr. 3: 89-103.

Göldi E.A. 1892. Relatoria sobre a molestia do cafeiro na provincia da Rio de Janeiro. Archos Mus. Nac., Rio de Janeiro 8: 7-122.

Hrisafi C. 1960. Experiențe de combatere a nematodului rădăcinilor Heterodera maroni(Cornu).Com. Academ. R.P.R. 10: 355-360.

Huang C.S. & Maggenti A.R. 1969. Mitotic aberrations and nuclear changes of developing gigant cell in Vicia faba caused by root knot nematode Meloidogyne javanica. Phytopathology59: 447-455.

Hunt D.J. & HandooZ.A. 2009. Taxonomy, identification and principal species. In: Perry R.N., Moens M., Starr J.L.(Eds.). Root-Knot Nematodes, CAB International, Wallingford, UK, pp. 55-97.

Iacob N., Romașcu E., Grossu A.V., Rado G., Manolache C., Ceuca T., Ștefan V., Boguleanu G. 1978. Tratat de zoologie agricolă – Dăunătorii plantelor cultivate, Vol I, Edit. Acad. R.S.R., București, pp. 83-99.

Jepson S.B. 1983a. The use of second-stage juvenile tails as an aid in the identification of Meloidogynespecies. Nematologica 29: 11–28.

Jepson S.B. 1983b. Identification of Meloidogyne: a general assessment and a comparison of malemorphology using light microscopy, with a key to 24 species. Revue de Nematologie 6: 291–309.

Jepson S.B. 1987. Identification of Root-knot Nematodes (Meloidogyne species). CAB International, Wallingford, UK, 265 pp.

Jobert C. 1878. Sur un maladie du cafeier observee au Bresil. Compte Rendue Hebdomodaire des Seances del’Académie des Sciences, Paris 87: 941-943.

Jones J., Gheysen G., Fenoll C. 2011. Genomics and Molecular Genetics of Plant-Nematode Interactions. Springer Science, U.K., 557 p.

Karssen G., van Hoenselaar T., Verker B.B., Janssen R. 1995. Secies identification of cyst and root-knot nematodes from potato by electrophoresis of individual females. Electrophoresis16: 105-109.

Karssen G. 2002. The Plant Parasitic Nematode Genus Meloidogyne Göldi, 1892 (Tylenchida) in Europe. Brill Academic, Belgia, pp. 11-24.

Karssen G., Bolk, R.J., Van Aelst A.C., Van Den Beld I., Kox L.F.F., Korthals G., Molendijk L., Zijlstra C., Van Hoof R., Cook R. 2004. Description of Meloidogyne minor (Nematoda: Meloidogynidae), a root-knot nematode associated with yellow patchdisease in golf courses. Nematology 6: 59-72.

Karssen G. & Moens M. 2006. Root-knot nematodes. In: Perry R.N., Moens M. (Eds.). Plant nematology. CABI Publishing, Wallingford, UK, pp. 59-90.

Karssen G., Wisemael W., Moens M. 2013. Root-knot Nematodes. In:Perry R N., Moens M. (Eds.).Plant Nematology2nd Edition. CAB International, Wallingford, UK, pp. 73-105.

Kaushal K.K. 2013. Plant Nematology: Cyst and Root Knot Nematodes. Biotech Books Publisher, Astral International, Dheli, India, 350 p..

Kiewnick S., Karssen G., Brito J.A., Oggenfuss M., Frey J. 2008. First report of root-knot nematode Meloidogyne enterolobii on tomato and cucumber in Switzerland. Plant Desease 92: 1370-1970.

Kofoid C.A. & White W.A. 1919. A new nematode infection of main. J. Am. med. Ass. 72: 567-569.

Lammers W., Karssen G., Jelleman P., Baker R., Hockland S., Fleming C., Turner S. 2006.Pest risk assessement Meloidogyne minor. Lavergne G. 1901. La anguilula en Sud-America. Revista Chilena de Historia Naturel, Valpariosa 4: 85-91.

Lavergne G. 1901. La anguilula en Sud-America. Revista Chilena de Historia Naturel, Valpariosa 4: 85-91.

Licolopi G. 1875. Sopra alcuni tubercoli radicellari continente anguillole. Rendicoti dell’Accademia delle Scienze, Fisiche e Mathematiche, Napoli 14: 41-42.

Lyons J.M., Keith A.D., Thomason I.J. 1975. Temperature-induced phase transitions in nematodelipids and their influence on respiration. Journal of Nematology7: 98–104.

Maggeti A.R. & Allen M.W. 1960. The orifin of gelatinous matrix Meloidogyne. Proceedings of the Helminthological Society of Washinton 27: 4-10.

MaiW.F.1985.Plant Parasitic Nematodes: Their Threatto The Agriculture. In:Sasser J.N.,Carter C.C. (Eds.).AnAdvancedTreatiseonMeloidogyne – BiologyandControl, vol.I.,NorthCarolinaStateUniversityGraphics,Raleigh,NorthCarolina,422 p.

Mandulu J. & Trudgill D.L. 1993. Weed hosts of Meloidogyne javanica in Tanzania. Pakistan Journal of Nematology 11: 61-64.

Manolache C. 1944. Cîțiva dușmani ai culturilor de toamnă. Ogorul românesc 7: 19-20.

Manolache C., Panin S., Săvescu A., Bucșan I., Manolache F., Hrisafi C. 1949. Situația dăunătorilor animali ai plantelor cultivate în anul 1947-1948. Institutul de Cercetări Agronomice, Metode, Rapoarte, Memorii, Seria nouă, nr. 1:11.

Marcinowski K. 1909. Parasitisch und semiparasitisch an Pflanzen lebende Nematoden. Arbeiten aus der Kaiserlichen Biologischen Anstalt für Land – und Forstwirtschaft 7(1): 1-192.

Moens M., Perry R.N., Starr J.L. 2009. Meloidogyne species – A Diverse Group of Novel and Important Plant Parasites. In: In: Perry R.N., Moens M., Starr J.L. (Eds.). Root-knot Nematodes. CAB International, Wallingford, UK, pp. 1-17.

Mucksood A. G. &Tabreiz A. K., 2016. Race Composition of Meloidogyne Species Infecting Pseuderanthemum atropurpureum in Aligarh District of Western Uttar Pradesh. Asian Journal of Nematology5: 8-13.

Müller C. 1884. Mittheilungen über die unseren Kulturpflanzen schädlichen, das Geschlecht Heterodera bildenden Würmer. Landw. Jahrb. 13: 1-42.

Mustățea D. 1957.Combaterea viermelui rădăcinilor (Heterodera maroni) în serele O.C.L. Aprozar – Balta Doamnei.Grădina, via și livadanr.12: 63-64.

Mustățea D. & Pătrașcu D. 1960. Combaterea Heteroderei maroni Cornu în serele Balta Doamnei, Regiunea Ploiești. Gădina, via și livada, nr. 12: 63-64.

Nagakura K. 1930. Ueber den Bau und die Lebensgeschichte der Heterodera radicicola (Greef) Müller. Japanese Joutnal of Zoology 3: 95-160.

Neal J.C. 1889. The root-knot disease of the peach, orange and other plants in Florida, due to the work of Anguillula. Bull. U.S. Ent. 20: 1-31.

OEPP. Bulletin 41. 2011. EPPO Standard PM7/103,Meloidogybe enterolobii. Bulletin OEPP/EPPO 41: 329-339.

Olteanu Gh., Panaitescu D., Gherman I., Zgardan E., Apatenko V., Fazakas B., Codreanu B.D., Teodorescu I., Iacobiciu I., Tălămbuță N., Erhan D., Marx M., Cristea Gh., Junie M., Doicescu D. 2001. Poliparazitismul la om, animale, plante și mediu. Editura Ceres – București, pp. 13-26; 348-356.

Orion D. & Kritzman G. 1991. Antimicrobial activity of Meloidogyne javanica gelatinous matrix. Nematologica 14: 481-483.

Palmisano A.M. &Ambrogioni L. 2000. Meloidogyne ulmi a root-knot nematode from elm. Nematologia Mediterranea28(2): 279-293.

Perry R.N. & Curtis R.H.C. 2013. Behaviour and Sensory Perception. In: Perry R.N., Moens M. (Eds.). Plant Nematology, 2nd Edition, CAB International, UK, pp. 246-273.

Perry R.N. & Moens M. 2006. Plant Nematology. CABI International, Wallington, UK, pp. 59-88.

Perry R.N., Subbotin S.A., Moens M. 2007. Molecular diagnostics of plant parasitic nematodes. In: Punja Z.K., De Boer S.H., Sanfacon H. (Eds.). Biotechnology and Plant Disease Management. Wallingford, UK, CABI Publishing, pp. 195-226.

Perry R.N., Moens M., Starr J.L. 2009. Root Knot Nematodes. CAB International, U.K., pp. 2-155; 201-219; 246-466.

Pricină I. 1910. Din insectele și ciupericle parazite. Viața Agricolă, Nr.3, pp. 4-6.

Radu V. &Dărăbanțiu V. 1960. Heterodera maroni în Republica Populară Română (regiunile Cluj și București). Știiță și cercetare biologică – Seria Zoologie 11: 67-90.

Ravichandra N.G. 2014. Horticultural Nematology. Springer India, pp. 1-54; 101-113;127-202; 321; 369-410.

Rivoal R. & Cook R. 1993. Nematodes pests of cereals. In: Evans K., Trudgill D.L., webster J.M. (Eds.) Plant-parasitic Nematodes in Temperate Agriculture. CAB International, Wallingford, pp. 259-303.

Rogojanu V. 1954. Viermele rădăcinilor (Heterodera maroni Cornu). Grădina, via și livada 9: 51-56.

Romașcu E. 1973. Nematozii plantelor agricole și combaterea lor. Editura Ceres, București, pp. 39; 57; 73-79; 91; 100-107; 132; 141-143.

Romașcu E. 1975. Nematodul galicol – Meloidogyne hapla Chitwood 1948 (Nematoda: Heteroderidae) – un nou dăunător al rădăcinilor de morcov. Analele I.C.P.P.București 11: 147-156.

Romașcu E. 1979. Un nou dăunător la căpșun – nematodul galicol al rădăcinilor (Meloidogyne hapla). Simp. Trust. Pomic. Pitești-Mărăcineni, pp.452-456.

Romașcu E., Ivan M., Lemeni V., Romașcu G. 1977. Considerații morfologice și bio-ecologice asupra speciilor de nematozi ai genului Meloidogyne Goeldi, 1877, identificate în România. Analele I.C.P.P. XII, pp. 267-281.

Sandground J. 1923. “Oxyurius incognita” or Heterodera radicicola? J. Parasit. 10, pp. 92-94.

Sasser J.N. & Freckman D.W. 1987. A World Perspective on Nematology: The Role of the Society. In: Veech J.A., Dickson, D.W. (Eds.). Vistas on Nematology, Hyattsville, Maryland, S.U.A. pp. 7-20.

Schacht H. 1871. Über einige Feinde und Krankheiten der Zuckerrübe. Zeitschr. Rübenyucker-Industrie 9, pp. 239-250.

Siddiqui Z.A. & Mahmood I. 1999. Role of bacteria in the management of plant parasitic nematodes.A review. Bioresource Technol. 69:167–179.

Sharon E., Spiegel Y. 1993. Glycoprotein characterization of the gelatinous matrix in the root-knot nematode Meloidogyne javanica. Journal of Nematology25: 585-589.

Skarbilovich T.S. 1959. On the structure of systematics of nematodes order Tylenchida Throne, 1949. Acta parasit. pol. 7: 177-132.

Stirling G. R., Nicol J. M., Reay F. 1998. Advisoryservices for nematodes pests – Operational guide (RuralIndustries Research and Development CorporationPublication Canberra 99/41, 120.

Stone G.H. & Smith R. 1898. Nematode Worms. Hatch. Exp. Stat. Mass. Bull. 55: 1-67.

Širca S., Urek G., Karssen G. 2004. First report of the root-knot nematode Meloidogyne ethiopica on tomato in Slovenia. Plant Disease88(6), p 680.

Strajnar P., Širca S., Knapič M., Urek G. 2011. Effect of Slovenian climatic conditions on the developmentand survivalof the root-knot nematode Meloidogyne ethiopica. European Journal of Plant Pathology129:81-88.

Tastet C., Bossis M., Gautheir J.P., Renault L., Mugniery D. 1999. Meloidogyne chitwoodi and M. fallax protein variation assessed by two-dimensional electrophoregram-computed analysis. Nematology 1: 301-314.

Trianthaphyllou A.C. & Hirschimnn H. 1960. Post-infection development of Meloidogyne incognita Chitwood 1949 (Nematoda: Heteroderidae). Ann. Inst. Phyropath. Benaki 3: 1-11.

Triantaphyllou A.C. 1962. Oogenesis in the root-knot nematode Meloidogyne javanica. Nematologica 7: 105–113.

Trudgil D.L., Blok V.C. 2001. Apomictic, polyphagous root-knot nematodes: exceptionally successful and damaging biotrophic root pathogens. Annual Review of Phytopathology 39: 53-77.

Trueb M. 1885. Onderzookinden over sereh-zeik suikerrit gedaan in slands plantentuin te Buintenzorg. Meded. Pl.Tuin, Batavia 2.

Viaene N.M., Wiseborn D.B., Karssen G. 2007. First report of the root-knot nematode Meloidogyne minor on turfgrass in Belgium. Plant Deseas91: 908.

Waeyenberge L. &Moens M. 2001. Meloidogyne chitwoodi and M. fallax in Belgium. Nematologia Mediterranea 29: 91-97.

Wesemael W.M.L., Viaene N., Moens M.2011. Root-knot nematodes (Meloidogyne spp.) in Europe. Nematology13(1):3-16.

Whitehead A.G. 1968. Taxonomy of Meloidogyne (Nematoda: Heteroderidae) with descriptions of four new species. Trans. zool. Soc. Lond. 31: 263-401.

Wiggers R.J., Starr J.L., Price H.R. 1990. ADN content and variation cromosome number in plant cells affected by Meloidogyne incognita and M. arenaria. Phytopathology 80: 1391-1395.

Wouts W.M. & Sher S.A. 1971. The genera of the subfamily Heteroderidae (Nematoda: Tylenchoidae) with a description of two new genera. J. Nematol. 3:129-144.

Wyss U., Grundler F.M.W., Munch A. 1992. The parasitic behaviour of second stage juvniles of Meloidogyne incognita in roots of Arabidopsis thaliana. Nematologica 38: 98-111.

Xu J., Liu P., Meng Q., Long H. 2004. Characterisation of Meloidogyne species from China using isozyme phenotypes and amplified mitochondrial DNA restriction fragment length polymorphism. European Journal of Plant Pathology110: 309-315.

Zijlstra C. 1997. A fast PCR-assay to identify Meloidogyne hapla, M. chitwoodi and M. fallax and to sensitively differentiate them from each other and from M. incognita in mixtures. Fundamental and Applied Nematology20: 505-511.

⁎

⁎ ⁎

Surse web:

https://www.eppo.int/QUARANTINE/Pest_Risk_Analysis/PRAdocs_nematodes/08-14648 PRA MELGMI.pdf

https://www.eppo.int/QUARANTINE/Alert_List/alert_list.htm

PARTEA a II – a CONTRIBUȚII PERSONALE

CAPITOLUL II

2. Distribuția și diversitatea speciilor de nematode galicole în diferite arii din România

Introducere

Nematodele genului Meloidogyne sunt considerate paraziți obligatorii ai plantelor, care se deplasează în interiorul rădăcinilor, unde are loc o parte a ciclului biologic, hrănindu-se prin intermediul celulelor plantelor-gazdă (Williamson și Gleason, 2003).

Ca și alți paraziți ai plantelor și animalelor, nematodele și-au dezvoltat strategii care pot ajuta la invadarea și colonizarea plantei, afectând sistemul de apărare al gazdei, în beneficiul lor, în final depășind capacitatea de apărare a plantei-gazdă (Haegeman și colab. 2012; Rosso și colab. 2012; Mitchum și colab., 2013).

Prin secreția a numeroși compuși chimici (efectori) în celulele radiculare, nematodele galicole induc diferențierea acestora în “celule de hrănire” hipertrofiate, multinucleate și mult mai active metabolic, numite celule gigantice (Kyndt și colab., 2013).

Daunele provocate plantelor sunt datorate în mare măsură distrugerii țesuturilor vasculare cu extinderea hipertrofiei și hiperplastiei celulelor din sistemul radicular.

Această deformare apare ca urmare a expansiunii nematodului în celulele rădăcinii, interferând astfel cu mișcarea direcțională fiziologică a apei și nutrienților (Daramola și colab., 2015).

Alături de prezența nodozităților pe suprafața rădăcinilor, plantele infectate au în general o creștere slabă, neuniformă, cu diferite grade de ofilire (Siddiqi, 1986).

Culturile de legume sunt deosebit de sensibile la atacul nematodelor galicole, la care,în plus, se observă reducerea vigorii plantelor, putrezirea și deformarea rădăcinilor.

Pratylenchus reniformis, Globodera rostochiensis și Meloidogyne spp. sunt printre cele mai patogene specii de nematode ai legumelor (Taylor și Sasser, 1978).

Incidența și prevalența speciilor de Meloidogyne este cunoscută în întreaga lume.

Aceste specii de nematode au fost semnalate în Europa, Asia, Africa, America de Nord și de Sud precum și în Australia. Cele patru specii care au fost întâlnite mai frecvent (Meloidogyne hapla, M. incognita, M. arenaria, M. javanica) au fost semnalate în aproape toate zonele regiunilor temperate și tropicale.

Se delimitează specia Meloidogyne hapla ce are un habitat mult mai specific zonelor reci.

La nivel mondial s-au efectuat multe studii pentru a stabili incidența și prevalența nematodelor galicole la diverse plante ornamentale sau de interes agricol.

Astfel, Choi (1976) a realizat un studiu al nematodelor galicole raportând la acea vreme o infestație de 48% cu M. hapla, 38% M. incognita, 8% M. arenaria și 5,7% M. javanica, în șapte provincii coreene.

Ibrahim și colaboratorii (1984) au constatat că 79% din probele de sol recoltate au fost infectate cu diverse specii de Meloidogyne în Egipt.

Lordello și colaboratorii (1984) au raportat Meloidogyne incognita din cultura de bumbac, în proporție de 56%, în regiunea braziliană Sao Pulo.

Autorul coreean Cho și colaboratorii săi (1987),au investigat distribuția și diversitatea nematodelor galicole la diverse culturi de fructe și legume, în câmp, semnalând specia M. hapla ca fiind dominantă în ariile centrale ale peninsulei coreene, specia M. incognita răspândită în sudul țării, în timp ceM. javanica a fost limitată la insulele Jeju și zonele litorale din sudul peninsulei.

Berney și Bird (1992) au prelevat probe de sol în perioada 1986 – 1988 detectând M. hapla într-o proporție de 69,8% în ariile din toate regiunile cultivate cu morcov din Michigan, Satele Unite ale Americii.

Sorribas și Verdejolucas (1994) au descoperit că speciile deMeloidogyne au apărut în 49% din totalul probelor prelevate din câmpurile de tomate ale regiunii spaniole Baix Llobrogot, de lângă Barcelona.

Corrales și colaboratorii (1999) au semnalat Meloidogyne spp. în 90% din probele de sol prelevate și în 83% din probele de rădăcini ale speciei Solanum quitoense din opt regiuni ale Văii Cauca din Columbia.

Carrilo-Fasio și colaboratorii (2000) au raportat frecvența de 82,5% a speciei M. incognita, iar speciile M. arenaria și M. javanica au fost raportate în proporție de 2,5% , respectiv 5% în regiunea Sinaloa din Mexic, la plantele de tomate, vinete, ardei gras și castraveți.

Dautova și Gommers (2000) au studiat apariția speciilor de nematode galicole în mai multe zone din Republica Macedonia, unde M. incognita (47,9%) și M. javanica (35,6%) au fost speciilepredominante, urmate de M. arenaria (13,7%), iar specia M. hapla (2,7%) a fost întâlnită sporadic.

Barbosa și colaboratorii (2004) au constatat că 70% din plantațiile din zona Rio de Janeiro, Brazilia,de unde au fost prelevate probele au fost infestate cu Meloidogyne exigua.

În anul 2004, Olowe a evidențiat apariția speciilor M. incognita, M. javanica și M. arenaria, populații pure sau mixte, în toate exploatațiile agricole de Vigna unguiculata din Nigeria. Distribuția globală, redată de autorul nigerian, pentru speciaM. incognita a fost de 51,8%, M. javanica de 44,1% iar M. arenaria a fost de 4,1%.

Bhsole și colaboratorii (2004) au efectuat un studiu în regiunea Parbhani-Maharashtra din India, în sezonul de vară, pentru a evidenția prezența nematodelor parzite ale bamelor (Abelmoschus esculentus) și au remarcat că M. incognita a fost specia predominantă.

Khan și colaboratorii (2005) au efectuat un studio referitor la apariția și distribuția geografică a nematodelor galicole în principala provincie pakistaneză Punjab, raportând un procent de 40,92%probe infestate cu Meloidogyne spp. Densitatea maximă a nematodelor a fost întâlnită în regiunea Faisalabad (67%), în timp ce un procent mult mai mic (9%) a fost observat în regiunea nordică a țării, Attock. Dintre cele 47 plante-gazdă ale nematodelor galicole luate în studiu, infestația maximă a fost înregistrată la tomate (81%), urmată de bame (78%), vinete (70%) și castraveți (52%).

Anwar și colaboratorii (2007, 2010) au detectat apariția a 85,10% specii de Meloidogyne la plantele de interes agricol în aceeași regiune pakistaneză, Punjab

2.2. Materiale și metode.

2.2.1. Prelevarea probelor de sol/părți din plante

Pentru o eficiență ridicată a extracției nematodelor galicole și pentru obținerea unor rezultate cât mai exacte, s-a avut în vedere ca prelevarea probelor să furnizeze informații complete despre solul și porțiunile de rădăcini supuse analizelor nematologice.

S-au luat utilizat două metode diferite pentru a determina prezența nematodelor pe rădăcini: i) prima metodă a constat în examinarea directă a plantelor-gazdă în cultură și a rădăcinilor acestora, pentru a observa prezența/absența galelor; ii) a doua metodă a implicat analiza probelor colectate, fiind vizate regiuni preponderent legumicole.

Prelevarea probelor de sol este una dintre cele mai importante etape din cadrul diagnozei acestui gen de nematode. O bună parte din erorile înregistrate se datorează prelevării necorespunzătoare. Rezultatul final al extracției nematodelor depinde în mod directde reprezentativitatea probei de sol, de aceea, prelevării probelori s-a acordat o atenție sporită, etapizat, după cum urmează :

Întocmirea unui plan prin delimitarea suprafețelor de teren supuse analizei nematologice, suprafețe care nu au prezentat diferențe semnificative între ele (de exemplu: suprafețe cultivate cu aceeași specie de plante, culturi ce au beneficiat de aceleași tratamente fitosanitare etc.). Porțiunile neuniforme, denivelate, din parcele au fost neglijate dacă suprafața lor a fost mai mică de 10%. Au fost vizate în deosebi zonele cu simptome cât mai specifice ce trezeau suspiciunea infestării cu nematode galicole, care, la inspecție, prezentau plante cu diferite grade de ofilire în vetre, slabă creștere, piticire sau îngălbenire a frunzelor.Odată cu prelevarea probelor, au fost examinate preliminar, prin inspecție vizuală, rădăcinile plantelor cu simtomele mai sus amintite. Nu în ultimul rând au fost vizate parcelele cunoscute anterior ca fiind infestate cu nematode galicole, cărora nu li s-au aplicat tratamente cu nematocide, fumigații sau alte metode de dezinfecție a solului.

Momentul prelevării probelor de sol. Probele de sol au fost prelevate în timpul perioadei de vegetație, dar și imediat după recoltare, în special la rădăcinoase.A fost evitată prelevarea probelor după ploaie, când umiditatea solului a fost mare, din considerente ce au ținut de manipularea și omogenizarea solului. S-a evitat, așadar, recoltarea, dar și analizarea probelor de sol prea umed.Probele de sol au fost procesate în cadrul Laboratorului Regional de Nematologie – Brașov, în perioada aprilie 2014 – septembrie 2016.

Prelevarea probelor parțiale și alcătuirea probei medii. Odată identificate corect zonele supuse observațiilor s-a trecut la prelevarea efectivă a probelor.

Atât pentru culturile de câmp cât și pentru cele din spații protejate, în funcție de tipul de sol, de tipul de exploatație agricolă și mai puțin de tehnologie, am “împărțit” parcelele în unități de cca. 1ha pentru exploatațiile familiale mici, sere modulare și solarii tip tunel și, respectiv, 2ha pentru exploatațiie familiale mari.

Fiecărei unități îi corespunde o probă medie. Această probă medie a fost compusă din probe parțiale (subprobe), reprezentate dintr-un amestec de fragmente de rădăcini sau chiar rădăcini întregi și sol din apropierea rizosferei, de la o adâncime de 5-30 cm. Proba medie s-a constituit din 2kg/ha.

Cu cât numărul de subprobe a fost mai mare cu atât a fost mai reprezentativă proba medie. Stabilirea punctelor de prelevare a probelor parțiale s-a făcut în funcție de configurarea terenului, prelevând în zig-zag sau în diagonalele parcelelor, moduri care au asigurat uniformitatea prelevării (figura 1.1.) (Ravichandra, 2010).

Prelevarea propriu-zisă a probelor s-a efectuat cu ustensile specifice (scafe și/sau sonde de prelevare) în funcție de textura solului (figura 1.2.). Înainte de prelevare, solul a fost curățat, la suprafață, pentru a elimina resurile organice (frunze, coceni, paie etc.).

Sondele și scafele au fost curățate și spălate după fiecare prelevare din fiecare fermă/seră/solar pentru a preveni răspândirea nematodelor și contaminarea încrucișată a eșantioanelor.

Figura 2.1. Diferite moduri de prelevare a probelor de sol în vederea analizelor nematologice (Ravichandra R.N. Methods and techniques in plant nematology. 2010. PHI Learning Private Limited, New Delhi, pp. 12-30)

Figura 2.2. Ustensile (scafe – dispuse vertical și sonde – dispuse orizontal) pentru prelevarea probelor de sol (Laboratorul Regional de Nematologie – Brașov) (original)

Etichetarea. Pentru interpretarea corectă a rezultatelor s-a impus etichetarea fiecărei probe cu informații necesare pentru identificare. În laborator, probele de sol au fost recepționate, examinate preliminar și depozitate (la 4-8°C pe o perioadă de până la 10 zile), apoi procesate prin extracție (figura 1.3.).

Figura 2.3. Aspecte ale stocarii și depozitării eșantioanelor ce urmează a fi supuse analizelor nematologice din Laboratorul Regional de Nematologie – Brașov (original)

Etichetarea a inclus următoarele informații:

identificarea zonei (adresa, județul, comuna sau satul);

identificarea unității analitice (fermă, parcelă, seră, solar etc.);

numărul probei și data la care a fost prelevată;

cultura agricolă;

mențiuni (au fost trecute informații privind potențiale tratamente fitosanitare cu nematocide, culoarea și mirosul particular al unor probe, fotografii sau alte detalii relevante).

2.2.2. Cadrul fizico-geografic și pedoclimatic al zonelor din care au fost prelevate probele de sol/părți plante

Zonele din care au fost prelevate probele de sol și care în urma extracției au fost depistate nematode ale genului Meloidogyne, aparțin următoarelor 29 de județe: Arad, Bacău, Bihor, Botoșani, Brașov,Brăila, Buzău, Călărași, Constanța, Covasna, Dâmbovița, Galați, Giugiu, Gorj, Harghita, Hunedoara, Ialomița, Mehedinți, Mureș, Olt, Prahova, Satu Mare, Sălaj, Sibiu, Teleorman, Timiș, Tulcea, Vâlcea și Vrancea.

Coordonatele geografice s-au stabilit utilizând motorul de căutare Google Earth.

O parte din datele privind cadrul fizico-geografic au fost furnizate de către Direcțiile Agricole Județene aferente județelor de unde au fost prelevate probe de sol. Condițiile pedoclimatice au fost furnizate de către stațiile AgroExpert din cadrul Oficiilor Fitosaniatre și din cadrul Oficiilor Județene de Studii Pedologice și Agrochimice din județele de proveniență a probelor.

Județul Arad

Din județul Arad au fost ridicate un număr de trei probe de sol provenite dintr-o exploatație familială mare din comuna Macea, localizată în partea de nord-vest a județului, în Câmpia Tisei, la 23 km de orașul Arad. Coordonatele geografice ale zonei sunt: latitudine 46°22'30.13"N și longitudine21°19'15.62"E.

Zona legumicolă are un relief predominant de câmpie, cu climă mai secetoasă în anumite perioade ale anului, în comparație cu celelalte localități ale județului, cu o vegetație caracteristică de silvostepă, halofită pe sărături, adaptată la aceste condiții.

Tipurile de sol existente în comuna Macea variază de la cernoziomuri și soluri aluvionare până la nisipuri, soluri sărăturate și soloneturi (www.macea.ro). Tot din județul Arad a fost prelevată o probă dintr-o fermă a comunei Dorobanți, situată în Câmpia Aradului, la 25 km de municipiul Arad, având următoarele coordonate: 46°20'38.69"Nord, 21°14'58.95"Est.

Județul Bacău

Patru probe de sol (sol și rădăcini) au provenite din comuna Pâncești, dintr-o exploatație familială mică. Coordonatele geografice ale parcelei sunt:46°12'44.53"N,27°3'40.01"E. Zona are un climat temperat-continental încadrat în “ținutul climatic al dealurilor înalte”. Teritoriul comunei aparține bazinului hidrografic al râului Bârlad.

În zonă, se disting următoarele tipuri de soluri podzolitice: brun podzolit – argilo iluvial, brun podzolit – predoghizat argilo-iluvial și brun podzolit – molic arfilo-iluvial.

Cantitatea de humus este redusă în acestă zonă (date O.J.S.P.A. Bacău).

Temperatura medie anuală este de 8,7°C, cu o minimă în luna ianuarie de – 5,2°C și o maximă în luna iulie de 19,7°C. Media anuală a precipitațiilor este de 556,2 mm, cu un maxim lunar în lunile de primăvară (www.primariapancesti.ro, date O.F. Bacău).

Cele patru probe au fost prelevate dintr-o parcelă cultivată cu tomate, plante care prezentau fenomene de ofilire, necroze ale rădăcinilor și prezența galelor într-un număr mare (figura 2.4.).

Figura 2.4. Prezența galelor pe rădăcini și fenomene de ofilire la plantele de tomate (Lycopersicum esculentum) (original)

Județul Bihor

Din acest județ au fost prelevate două probe de sol, una din comuna Tărcaia, iar cealaltă din comuna Avram Iancu. Comuna Tărcaia este așezată în partea sud-vestică a județului Bihor, în centruldepresiunii Beiușului, pe cursul superior al râului Crișul Negru ce străbate depresiunea ( www.tarcaia.ro).

Pentru comuna Tărcaia coordonatele geografice sunt:46°38'8.13"N și22°21'40.15"E. Comuna Avram Iancu este așeată la extremitatea sud-vestică a județului Bihor, la 59 km de reședința județ, municipiul Oradea, în câmpia joasă a Crișului.

Coordonatele locației din care au fost prelevate probele sunt: latituidine 46°39'54.76"N și longitudine 21°32'16.43"E.

Temperatura medie anuală a ambelor comune este de 10°C. Solurile din zonă sunt reprezentatea de cele silvestre, podzolice și cernoziomuri (care au extinderea cea mai mare) (https://ro.wikipedia.org/wiki/Judetul_Bihor).

Ambele probe au fost prelevare dintr-o exploatație familială mică, de la plante de tomate și vinete care prezentau stagnare în creștere, ofilire și gale pe rădăcinile secundare.

Județul Botoșani

Județul de află în zona de contact din regiunea dealurilor înalte ale văii Siretului și cea a dealurilor joase ale câmpiei Moldovei.

Vegetația este caracteristică zonei de silvostepă, cu o climă temperat-continentală, influențată de maselede aer din estul continentului european, cu temperaturi medii anuale de 8-11°C, cu vânturi predominante din nord-vest și sud-vest.

Vecinătatea cu câmpia Euro-Asiatică face ca încadrarea climatică a județului Botoșani să se caracterizeze printr-un regim al temperaturilor aerului și al precipitațiilor cu valori caracteristice climatului continental-excesiv.

Cernoziomurile cambice caracterzizează cea mai mare parte a tipurilor de sol (Poclid, 2013).

Din acest județ au fost ridicate cinci probe de sol, provenite de la o cultură de tomate ale unei exploatații familiale mici, din municipiul Botoșani. Coordonatele cartografice ale parcelei sunt: 47°44'43.22"N, 26°41'32.87"E.

Județul Brașov

Situat în partea central-estică a țării, pe parcursul mijlociu al Oltului în interiorul arcului Carpatic, aflându-se la granița Carpaților Orientali cu Carpații Meridionali, județul Brașov are un relief deosebit de variat.

Zonele de unde s-au prelevat probele de sol au fost: Săcele, Sebeș, Bod și municipiul Brașov.

Orașul Săcele este situat în sudul Țării Bârsei, la poalele muntelui Piatra Mare.

Coordonatele geografice ale locației de prelevare sunt:45°37'3.37"N, 25°42'56.71"E.

Aproximativ 10% din suprafața localității se caracterizează printr-un relief ușor ondulat cu soluri brun acide, soluri litomorfe și podzolice aluvionare. În general, solurile din această zonă prezintă feritilitate scăzută (date O.J.S.P.A. Brașov).

O bună parte din teritoriu se situează în zona montană unde se întâlnesc forme geomorfologice diverse: coline piemontane (Ciucaș, munții Bârsei) și câmpie piemontană.

Precipitațiile cad în cantități variabile și neregulat, în cantități mai mari pe perioada verii.

Frecvent apar înghețurile târzii iar regimul pluviometric este continental, uneori moderat eolian. Vânturile bat predominant din direcția nord-vest (Grecu și colab., 2008).

Opt probe de sol au fost prelevate dintr-un solar tip tunel, cu tomate, în care era prezent fenomenul de ofilire, alături de piticirea plantelor în asociere cu boli criptogamice (figura 2.5.).

Figura 2.5. Fenomene de ofilire și piticire în asociere cu boli criptogamice la tomate (Lycopersicum esculentum) (original)

Satul Sebeș aparține comunei Hârseni și este situat la 15 km de municipiul Făgăraș.

Coordonatele geografice sunt : 45°43'44.97"N, 25° 1'50.44"E.

Zona are un climat temperat – continental, cu tranziție între clima temperată de tip oceanic și cea temperată de tip continental.

Din satul Sebeș au fost prelevate cinci probe de sol dintr-o cultură de afin, anul IV, de pe o parcelă având suprafața de 1ha, parcelă cu următoarele caracteristici agrochimice ale solului: pH 3,96; Nt% 0,472; P ppm 57,3; Humus % 9,90; Al 100g sol 2,17; C.E. us/cm 103,6; CTSS mg/100 g sol 35,2 (conform B.A. 619/25.10.2016 Awsystem Suceava– Analize agrochimice sol). Plantele prezentau creștere neuniformă, pierderea frunzelor, cloroze, stagnare în creștere, brunificarea coletului, rădăcini anormal dezvoltate, pe suprafața cărora erau vizibile mici gale (figura 2.6.).

Figura 2.6. Uscarea și cloroza foliajului (A,C și F), creșteri excesive ale rădăcinilor cu prezența galelor (B), pierderea frunzelor și stagnare în creștere (D și G) la arbuști afin (Vaccinium myrtillus) (original)

Comuna Bod este situată în partea de nord a Țării Bârsei, mărginită de valea Oltului la nord și valea Bârsei la vest. Coordonatele locației de unde s-au recoltat probele sunt: latitudine 45°46'3.25"N și longitudine25°38'4.53"E.

Solurile zonale sunt brune acide, brune podzolice și criptopodzolice.

Temperatura medie înregistrată în comună este de 7,8°C iar vânturile suflă din direcția sud-vest și nord-vest iar în timpul verii mișcările de aer au caracter de föhn (www.primariabod.ro).

Patru probe de sol au fost recoltate dintr-o seră modularăaparținând fabricii Dacia Plant, unde tomatele prezentau creșteri neuniforme și cloroze ale frunzelor.

Din municipal Brașov a fost recoltată o probă, de la o planta de apartament (Mammillaria backebergiana, familia Cactaceae), ce prezenta stagnare în creștere și gale pe suprafața rădăcinilor (figura 2.7.).

Figura 2.7. Stagnare în creștere însoțită de prezența galelor pe suprafața rădăcinilor la cactus (Mammillaria backebergiana) (original)

Județul Brăila

Patru probe au fost recolate din comuna Gropeni, situată pe malul stang al Dunării, în partea de est a județului.Teritoriul adminsitrativ al comunei Gropeni se încadrează din punct de vedere geomorfologic în Câmpia Brăilei, Terasa Brăilei și Lunca Dunării (date www.comunagropeni.ro).

Pentru această zonă, coordonatele prelevării probelor sunt: 45° 4'39.95"N, 27°53'25.93"E.

Temperatura medie anuală este de 10,5°C, în timp ce precipitațiile anuale sunt reduse (cca. 456 l apă/m.p.), cu caracter torențial vara.

Cernoziomurile formează 75% din suprafața zonei, alături de cernoziomuri carbonatice, soluri aluviale și aluviuni gleizate (frecvența acestora este favorizată de prezența apei freatice la mică adâncime, cu un grad de mineralizare scăzut) (Oancea, 1973).

Probele au provenit dintr-o exploatație familială mică și dintr-o cultură de viță de vie (figura 2.8.).

Figura 2.8. Aspecte ale rădăcinilor cu gale la vița de vie (Vitis vinifera) (original)

O a doua locație de prelevare a probelor a fost satul Vărsătura ce aparține comunei Chiscani, situată imediat în amonte de municipiul Brăila, la confluența Luncii Dunării, Munții Măcinului, Câmpiei Bărăganului, Câmpiei Siretului inferior și Câmpiei Covorluinului.Coordonatele geografice ale parcelei sunt: 45°13'28.05"N, 27°55'54.81"E.

Clima este continental – teperată cu caracter excesiv, temperaturilemedii anualevariind între -11°C și +23°C. Vânturile sunt uscate și calde (vara), din direcție sudică și sud-estică, accentuând perioada de secetă excesivă.

Solurile zonale sunt de tipul cernoziomurilor, formate din loess, reprezentând cea mai mare parte (60-70%) din teritoriu. Există și soluri aluvionale provenite din aluviuni specific luncii Dunării, care inundă anual malurile sale, iar după retragerea apelor acestea au evoluție spre cernoziomuri cu mari variații de structură și elemente nutritive pentru culture agricole, în special cele de câmp și legumicole (www.primariachiscani.ro; Alexandru și Alexandru, 1998, 2000).

Din satul Vărsătura au fost prelevate 5 probe de sol din două solarii tip tunel, cultivate tomate ce prezentau fenomene de ofilire accentuate, în timp ce unele plantule s-au dezvoltat mai slab la scurt timp după apariția frunzelor cotiledonare.

Județul Buzău

O singură probă de sol a fost prelevată din satut Scăieni ce aparține comunei Bozioru, amplasată în de nord-vestul județului Buzău, zona Subcarpații de Curbură, în valea râului Bălăneasa. Geografic, parcela are următoarele coordonate: 45°23'27.91"N, 26°27'11.18"E.

Solurile zonale sunt reprezentate de aluviuni, soluri aluvionale, cernoziomuri tinere, cernoziomuri în diferite grade de levigare, cernoziomuri tipice stepei (cernoziomuri castanii). Clima se caracterizează printr-o repartiție relativ uniformă a elementelor climatice continentale, cu o temperatură medie anuală de 10,6 °C (www.isubuzau.ro).

Proba de sol a provenit dintr-un câmp cultivat cu salată, plante ce prezentau “plaje” cu stagnare în creștere și asociere cu boli criptogamice.

Județul Călărași

Comuna Grădiștea se află în partea central-sudică a județului, pe malul nordic al Dunării, în marginea sudică a terasei Călărași. Locația de prelevare a probelor are următoarele coordonate :44° 8'2.63"N, 26°45'21.64"E.

Clima zonală este continentală, mai puțin moderată decât a altor regiuni din sudul țării. Solurile sunt constituite în cea mai mare parte din soluri aluvionare și diferite tipuri de cernoziomuri, cu o fertilitate ridicată (https://www.ropedia.ro/judetul/Calarasi).

Din comuna Grădiștea au fost ridicate două probe de sol plus rădăcioase (morcovi) dintr-o exploatație familială mică.

Județul Constanța

Probele provenite din acest județ au fost prelevate din comuna Ostrov așezată la extremitatea sud-vestică a Dobrogei, unde Dunărea intră în țară părăsind malul bulgăresc.

Coordonatele de prelevare a parcelei de tomate: latitudine27°22'41.26"E și longitudine 44° 6'13.27"N.Coordonatele geografice pentru probele de viță de vie sunt: 44° 6'15.65"N, 27°23'13.09"E.

Comuna este încadrată în Podișul Dobrogei de Sud, cu relief colinar (văi și dealuri) unde podgoriile au cunoscut o mare extindere pe pantele terasate.

Temperatura medie anuală depășește 11°C. Perioada cea mai bogată în precipitații este la sfârșitul primăverii și începutul verii, cu o medie de 350-400mm/an.

Solurile sunt de tip cernoziom levigat (format din loessuri lutoase și luto-argiloase).

Regosolurile, puțin feritile, sunt prezente în zonă și s-au format sub influența unui climat continental mai pronunțat (www.ostrov.judetul-constanta.ro).

Au fost ridicate trei probe de sol; două probe provenite dintr-o plantație de tomate, respectiv o probă dintr-o plantație de viță de vie, în aceasta din urmă nu au fost detectate nematode galicole. Toate cele trei probe au aparținut unei exploatații familiale mici.

Județul Covasna

Comuna Cernat este situată în centrul județului Covasna, în zona subcarpatică a munților Boboc, în vestul bazinului Târgu-Secuiesc, pe cursul superior al râului Cernat.

Clima din zonă este temperat-continentală, cu nuanțe climatice în funcție de particularitățile reliefului: climă mai caldă și mai uscată în zona de podiș și depresionară.

Solurile sunt brune și argiloaluvionale podzolice, cernoziomurile levigate dar și turbele eutrofe. Acestea din urmă prezintă un grad redus de fertilitate (Pișota și colab., 1975).

Aria de prelevare a probelor are următoarele coordinate geografice: 45°57'53.88"N, 26° 1'19.89"E.

S-au ridicat șase probe se sol dintr-un solar tip tunel cultivat cu salată.

La o inspecție vizuală au fost observate plante tinere ce prezentau malformații (gale) ale părților subterane ale plantelor tinere.

Județul Dâmbovița

Județul Dâmbovița livrează un consum de 7,7% din producția de legume a României.

Câmpia Română cuprinde aproximativ jumătate din suprafața județului, reprezentată de câmpia înaltă a Ialomiței și Dâmboviței dar și câmpia Titului.

Satul Băleni Sârbi aparține comunei Băleni situată în Câmpia Târgoviște, la aproximativ 22 km de municipiul Târgoviște. Coordonatele cartografice ale parcelelor sunt: 44°49'34.21"N, 25°38'36.73"E (ardei); 44°49'13.26"N, 25°38'13.96"E (tomate), respectiv 44°49'1.94"N, 25°39'43.27"E (păstârnac, țelină, sfeclă roșie).

Media anuală a temperaturilor depășește 10°C iar cea mai mare parte din climă este reprezentată de cea continentală și în mica măsură continental-moderată.

Verile sunt foarte calde, cu precipitații moderate iar iernile sunt blânde, cu viscole rare și intervale de încălzire frecvente.

Solurile, ca și în alte regiuni de prelevare, sunt diferite și reflectă particularitățile climatice, de relief și microrelief ale stratului superficial și ale pânzei de apă freatică.

În zonă se întâlnesc soluri brune podzolice și brune podzolice argiloiluvionare (Bugă și Zăvoianu, 1974).

Din satul Băleni au fost ridicate 14 probe de sol plus părți din plante (rădăcinoase) provenite de pe terenuri cultivate cu ardei, tomate, țelină și păstârnac ale unei exploatații familiale mari (figura 2.9.).

Figura 2.9. Prezența galelor voluminoase pe suprafața rădăcinilor de țelină (Apium graveolens) (A); deformări ale rădăcinilor de morcov și păstârnac (Daucus carota, Pastinaca sativa) (B și C); ofilire și piticire la plantele de ardei (Capsicum annuum) (D) (original)

Județul Galați

Județul Galați reprezintă 1,9% din suprafața României și se înscrie în aria județelor pericarpatice dunărene, fiind situat la conflența Siretului, Prutului și a Dănării.

S-au recoltat trei probe din comuna Șendreni ce se află în partea de sud a județului, la distanță de 10 km de municipiul Galați. Temperatura medie anuală zonală, calculată pe o perioadă de 5 ani, este de 10°C. Crivățul reprezintă 29% din frecvența anuală a vânturilor, urmat de vântul Austral, mai uscat, din direcție sudică, oferind zonei un cadru climatic temperat-continental.

Solurile comunei Șendreni (cu satele Movileni și Șerbenii-Vechi) sunt reprezentate de cernoziomuri carbonatice, cernoziomuri de fâneață și în mică măsură de soluri brun-cenușii (Geacu, 2007).

Zona de prelevare a probelor are următoarele coordonate geografice: 45°24'44.83"N, 27°55'58.59"E (rădăcinoase) și 45°24'58.71"N, 27°54'29.88"E (tomate).

Au fost prelevate trei probe de pe suprafețe cultivare cu rădăcinoase și tomate.

Plantele prezentau deformări accentuate ale rădăcinilor, gale și necroze ușoare pe rădăcinile principale.

Județul Giurgiu

Probele au provenit din comuna Vărăști, localizată la marginea estică ajudețului Giurgiu, pe malul stâng al râului Sabar, limitată de județul Ilfov și județul Călărași. Clima este temperat-continentală moderată, cu veri excesiv de calde și secetoase în timp ce iernile sunt blânde.

Vânturile dominante sunt cele estice și nord-estice. Temperatura medie anuală este de 11,5°C. Solurile sunt reprezentate prin cernoziomurile levigate și solurile brun-roșcate de pădure (https://ro.wikipedia.org/wiki/Judetul_Giurgiu).

Din comuna Vărăști au fost ridicate un total de 16 probe de sol și părți din plante (rădăcini) provenite din mai multe exloatații familiale mari cultivate cu varză, păstârnac, tomate,conopidă și ardei, având următoarele coordonate geografice: 44°14'29.02"N, 26°14'55.15"E și 44°14'36.41"N, 26°13'56.54"E.

Județul Gorj

Probele au provenit din satul Rasova ce aparține comunei Bălești, situată în partea de vest a muncipiului Târgu Jiu. Agriculura zonală preponderentă se află în bună parte în sistem privat (cultura mare, pomicultură legumicultură, viticultură).

Clima este temperat-continentală, cu o mare variație de nuanțe. Vânturile dominante în zona depresionară sunt cele din sus și sud-est de origine tropicală.

Sunt prezente fenomene de degradare natural și antropică a solului.

Condițiile de sol și mai ales de relief, puternic fragmentat, nu permit folosirea largă în agricultură a solului. În zona Bălești solurile sunt podzolice aluvionale (Vlăscescu și Ianoș, 1998).

Din satul Rasova au fost ridicate două probe de sol dintr-o cultură de salată, respectiv tomate, din următoarea locație geografică: 45° 2'50.99"N, 23°10'52.48"E.

Județul Harghita

Județul reprezintă 2,8% din suprafața țării și este situat în partea centrală a Carpaților Orientali. În zona dealurilor și depresiunilor intramonate sunt prezente solurile argiloaluvionale brune și podzolice , precum și solurile litomorfe hidromorfe. Iernile sunt geroase cu durată mai lungă, în timp ce verile sunt răcoroase.

Precipitațiile medii anuale variază între 500 și 1000mm l/m.p. Temperatura medie anuală este de 7°C în zonele de deal ale podișului Transilvaniei ( https://ro.wikipedia.org/wiki/Judetul_Harghita).Comuna Mugeni este sediul adminsitrativ a opt sate din depresiunea Mugeni, pe valea râului Târnava Mare.

Din satul Dobeni, comuna Mugeni, au fost recoltate patru probe de sol, dintr-o exploatație familială mică, provenite de pe un teren cultivat cu tomate. Locația geografică a parcelei de prelevare este : 46°17'9.63"N, 25°11'0.16"E.

Plantele de tomate prezentau fenomene de ofilire și gale pe rădăcinile secundare.

Județul Hunedoara

Județul este așezat în cursul de mijloc al râului Mureș, aproape de Munții Apuseni, traversat de Râul Strei, Râul Mare, Jiu și Crișul Alb.

Proba din acest județ a provenit din comuna Lunciou de Jos situată în partea central-nordică a județului Hunedoara, în Țara Zarandului, având următoarele coordonate geografice: 46° 4'52.38"N, 22°46'41.97"E.

Solurile din zonă sunt reprezentate de cele brune și brun-roșcate de pădure, acociate cu cernoziomuri, soluri brune de terasă și mai rar soluri aluviale și cernoziomuri levigate (Bara și colab., 2012).

A fost prelevate două probe de sol, provenite dintr-un solar tip tunel, cu răsaduri de varză. Plantele tinere prezentau creșteri asimetrice și semne de carențe nutriționale.

Județul Ialomița

Din acest județ au fost prelevate probe din orașul Slobozia, municipiul de reședință a județului Ialomița, poziționat în centrul Câmpiei Române, localitate traversată de râul Ialomița. Locația de prelevare are următoarele coordonate: 44°34'29.09"N, 27°20'3.66"E.

Climatul orașului este temperat-continental de tip pontic, cu contraste puternice de temperatură între iarnă și vară, cu o medie anuală a izotermelor de +10°C și – 11°C.

Crivățul este vântul predominant pe perioada de iarnă în timp ce Băltărețul își face simțită prezența pe perioada de vară.

Solurile tipice zonei Slobozia sunt cernoziomurile, solurile brun-roșcate, cambice, aluvionale și într-o mică măsură solurile sărăturate (https://ro.wikipedia.org/wiki/Judetul_Ialomita).

Au fost prelevate cinci probe de rădăcinoase (morcovi) ce prezentau deformări în creștere și slabe necroze ale rădăcinilor (asociere probabilă cu boli criptogamice).

Județul Mehedinți

Județul este situat la granița regiunilor istorice Oltenia și Banat, din sud-vestul României.

Clima este temperat-continentală, caracteristică dealurilor înalte, cu influențe submediteraneene, unde toamnele sunt ploioase și iernile blânde.

Județul este traversat de fluviul Dunărea și râul Motru. Sunt prezente solurile aluvionale în mare parte (www.bnr.ro/files/d/Pubs_ro/Monografii/Monografie_Mehedinti.pdf).

Comuna Căzănești, de unse s-au prelevat probele de sol, este situată în partea nord-estică a județului, la o distanță de 28 km de municipiul Drobeta Turnu Severin.

Au fost prelevate două probe de sol, dintr-o exploatație familială mare, având o suprafață cultivată cu tomate.

Locația geografică a parcelei este: 44°43'27.88"N, 22°53'38.51"E.

Județul Mureș

Probele au provenit din comuna Suplac, situată pe mijlocul râului Târnava Mică, la 34 km de municipiul Târgu Mureș.Coordonatele geografice ale zonei de prelevare: 46°23'48.84"N, 24°30'56.02"E.Clima este continental-moderată. Solurile sunt argiloiluviale, soluri bune de pădure și cernoziomice, cernoziomuriel levigate freatic dar și humicogleice.

Temperaturile medii anuale sunt de 8-9°C. Vânturile predominante sunt cele din vest și nord-vest, de intensitate și frecvență mijlocie, verile fiind călduroase iar iernile aspre (https://ro.wikipedia.org/wiki/Judetul_Mures).

Din comuna Suplac au fost prelevate patru probe, dintr-o exploatație familială mică cultivată cu ardei, unde s-au semnalat fenomene de slabă creștere a plantelor și fenomene de cloroză de diferite intensități.

Județul Olt

Județul este situat în partea de sud, ocupând 2,8% din suprafața țării, pe cursul inferior al râului Olt , făcând parte din categoria județelor riverane fluviului Dunărea.

Clima este temperat-continentală, mai aridă în partea de sud a județului, de unde au fost recoltate probele de sol, respectivdin comuna Izbiceni, aflată pe malul drept al râului Olt. Coordonatele parcelei sunt: latitudine 43°49'17.75"N și longitudine 24°39'34.93"E și 43°49'46.55"N,24°38'55.58"E.

Vânturile (Crivățul și Austrul) scot în evidență o zonă de interferență între partea estică a Câmpiei Române și partea vestică a aceleiași regiuni.

În zonă predomină solurile brun-roșcate cu feritilitate redusă, cernoziomurile foarte ferile dar și soluri negre argiloase sau regosolurile nisipoase (Ciobanu și colab., 2011; Ciobanu și Vătămanu, 2012).

Din comuna Izbiceni au fost recoltate trei probe provenite de la trei specii de legume: salată, tomate și vinete, cultivate în solarii modulare.

Județul Prahova

Situat în partea central-sudică a țării, pe parcursul râurilor Prahova și Teleajen, județul Prahova reprezintă 1,98% din teritoriul României.

Prima locație de prelevare a probelor de sol provine din comuna Gura Vadului, este situată în partea de est a județului, la limita cu județul Buzău. În apropiere se găsesc dealurile Istriței, pe malurile râului Tohăneasca. Coordonate geografice de prelevare: 45° 2'40.35"N, 26°26'32.46"E.

În zonă predomină solurile bune podzolice, cernoziomurile cambice și solurile argiloaluvionale (https://ro.wikipedia.org/wiki/Judetul_Prahova).

Din comuna Gura Vadului au fost prelevate două probe de sol, dintr-o exploatație familială mică, de pe un teren cultivat cu tomate ce prezentau fenomene de piticire.

A doua locație de prelevare provine din comuna Jugureni, situată în partea de est a județului Prahova, la 50km distanță de municipiul Ploiești. Latitudine: 45° 7'29.42"N și longitudine: 26°22'37.54"E. Comuna este delimitată de Băile Boboci și Dealul Mălinului.

Regimul climatic general se caracterizează prin veri foarte calde, cu cantități medii de precipitații, nu foarte importante, sub formă de averse și prin ierni relativ reci, marcate la interval regulate atât de viscole cât și de relative încălziri. Relieful este predominant colinar (www.primariajugureni.ro).

Din comuna Jugureni au fost recolatate două probe de sol provenite dintr-o exploatație familială mică cultivată cu ardei. Plantele prezentau slabă creștere și rădăcini acoperite de gale.

O altă locație de prelevare a fost cea din satul Brătășanca ce aparținei comunei Filipeștii de Târg situată în partea de vest a județului Prahova, la limita cu județul Dâmbovița, între râurile Plovița și Prahova.

Coordonatele geografice ale acestei locații sunt: 44°55'56.24"N, 25°48'35.38"E.

Din zonă au fost prelevate patru probe dintr-o plantație de rădăcinoase (morcovi).

Ultima locație de prelevare a fost cea din comuna Plopu aflată în centrul județului Prahova, la nord-est de municipiul Ploiești, în bazinul mediu și superior al râului Bucovel.

Coordonatele geografice ale locației sunt: 45° 0'55.21"N, 26° 8'1.45"E.

În zonă, predomină solurile de tipul cernoziomurilor cambice și argiloaluvionale (https://www.forajeapa.ro/prahova-ploiesti).

Au fost recoltate patru probe dintr-o cultură de păstârnac cu deformări ale părților subterane ale plantelor și prezența galelor pe suprafața rădăcinilor (figura 2.10.).

Figura 2.10. Prezența galelor pe suprafața rădăcinilor de păstârnac (Pastinaca sativa) (original)

Județul Satu Mare

Județul este situat în nord-vestul României, în zona transfrontalieră cu Ungaria și Ucraina, reprezentând 1,85% din teritoriul național. Clima este temperat-continentală cu ierni lungi și veri moderate sub aspect termic. Vânturile dominante sunt cele din sector nord-vestic (primăvara și vara), estic și nord-estic (toamna și iarna) (www.satu-mare.ro).

Solurile specifice sunt silveste brune și brune-podzolice (Bogdan și Călinescu, 1976).

Comuna Halmeu se află în partea de nord a județului Satu Mare, străbătută de râul Tur, în câmpia Ugocei.

Din Halmeu au fost prelevate probe de sol având următoarele coordonate geografice: 47°58'49.48"N, 23° 0'35.58"E.S-au prelevat trei probe dintr-o seră modulară, cultivată cu tomate și ardei. Plantele prezentau gale pe rădăcini dar și îngălbenirea ale frunzelor bazale, nervuri verzi în interiorul frunzelor, creșterea neuniformă a fructelor (posibile carențe de potasiu ca urmare a infestației cu nematode galicolole).

Județul Sălaj

Județul Sălaj reprezintă 1,6% din suprafața României, este așezat în partea nord-vestică a țării, în cursul văilor Someșului, Almașului, Crasnei și Barcăului, încadrându-se în sectorul de climă continental-moderată (Abrudan și Medve, 2008).

Probele din acest județ au fost prelevate din comuna Vârșolț așezată în zona dealurilor Silvaniei, pe cursul superior al râului Crasna, având coordonatele geografice: 47°12'26.04"N, 22°55'2.39"E. Comuna se încadrează în sectorul climatic continental-moderat, caracteristic regiunilor vestice și nord-vestice ale țării.

Solul din zonă este de tipul cernoziomului, cernoziomului levigat dar sunt întâlnite și soluri nisipoase.

În cea mai mare parte a anului teritoriul comunei se găsește sub dominarea vânturilor de vest și nord-vest (www.virsolt.ro)

Au fost prelevate trei probe de sol dintr-un solar tip tunel cultivat cu tomate și ardei.

Creșterea neuniformă și slaba fructificare a atras atenția asupra unui posobil atac cu nematozi galicoli, lucru confirmat prin prezența galelor la o atentă examinare a rădăcinilor.

Județul Sibiu

Județul este situat în podișul Transilvaniei, în nordul Carpaților Meridionali, reprezentând 2,28% din suprafața țării.

Comuna Șelimbăr, a fost locul de prelevare a probei de sol, comună aflată în partea centrală a județului, pe cursul râului Seviș, la 5km de orașul Sibiu. Coordonatele geografice ale parcelei sunt: latitudine: 45°46'22.69"N și longitudine 24°10'55.20"E.

Clima este temperat-continentală, cu influențe termice datorate munților din vecinătate. Temperatura medie anuală este de 8,9°C.

În zona Șelimbăr se întâlnesc soluri brune montane de pădure (tipice sau podzolice) și soluri specific pajiștilor (https://ro.wikipedia.org/wiki/Comuna_Șelimbăr,_Sibiu).

A fost recoltată o probă de sol, dintr-o exploatație familială mică, provenită de la o cultură de tomate.

Comuna Porumbacul de Jos, comună situată la 33 km de orașul Sibiu, pe malul râului Porumbac. A fost prelevată o singură probă reprezentată de cățiva tuberculi de cartof, având următoarele coordonate geografice: 45°45′22″N, 24°27′18″E (figura 2.11.)

Figura 2.11. Secțiune în tubercul de cartof infestat cu female de Meloidogyne hapla (între periderm și cortex) (original)

Județul Teleorman

Județul este situat în zona centrală a Câmpiei Române (între râurile Olt și Vedea), având o suprafață de 2,4% din teritoriul țării, cu o climă temperat-continentală specific câmpiei sudice. Regimul climatic general (climat continental) se caracterizează prin veri caniculare, cu precipitații moderate ce cad în averse și ierni reci cu viscole și frecvente intervale de încălzire. Vânturile sunt influențate de relief, mai ales în partea estică și sudică a județului.

Județul dispune de o fertilitate ridicată a solurilor, întâlnindu-se cernoziomuri, cernoziomuri argiloiluviale, cernoziomuri cambice (levigate), soluri brune-roșcate, inclusiv podzolite (Dragomir și colab., 2002).

Probele au provenit din comuna Măgura, formată din satul Giureni și Măgura (reședința). Locația geografică de prelevare este: 44°1'31.37"N, 25°23'32.07"E

Cernoziomurile au o bună caracteristică pentru agricultura județului în timp ce levisolurile ocupă locul II ca importanță zonală (Dragomir și colab., 2002).

Din comuna Măgura au fost recoltate cinci probe dintr-un solar tip tunel cultivat cu castraveți. Plantele prezentau slabă fructificare de la an la an iar suparafața rădăcinilor era acoperită de gale mari.

Județul Timiș

Este cel mai vestic județ al României, amplasat în centrul provinciei Banat, reprezentând 3,69% din suprafața țării.

Se întâlnesc următoarele tipuri de soluri: cernoziomuri, cernoziomuri de fânețe, cernoziomuri levidate, alături de soluri Silvestre (Munteanu și Munteanu, 1998).

Orașul Deta este situat între Timișoara și frontiera cu Serbia, la o distanță de 44 km de reședința de județ. Coordonate geografice: 45°23'43.32"N, 21°13'17.53"E.

Orașul este situat în câmpia joasă a Bârzavei, traversat de râul Birdeanca, afluent al Bârzavei. Teritoriul localității este dominat de clima temperat-continentală. Ponderea cea mai mare o au masele de aer maritim dinspre vest, cu grad ridicat de umiditate, apoi cele subtropicale dinspre Marea Mediterană și cele continentale dinspre est.

Datorită acestor caracteristici climatice, iernile nu sunt foarte geroase, verile sunt călduroase, iar primăverile și toamnele sunt scurte. Media anuală a temperaturii aerului se situează înte 10-11°C, pe când cea maximă atinge 40°C. (www.detatm.ro).

A fost ridicată o singură probă (sol+rădăcini) de la o planta decorativă (Saintpaulia ionantha) (figura 2.12.).

Figura 2.12. Plantă ornamentală (Saintpaulia ionantha) infestată cu Meloidogyne arenaria (original)

Județul Tulcea

Județul ocupă jumătatea nordică a regiunii istorice Dobrogea, în sud-estul României.

Clima este continental-excesivă, cu precipitații reduse dar cu umiditate atmosferică ridicată, specific deltei. Verile sunt călduroase iar iernile sunt reci, marcate de viscole.

Temperatura medie anuală este una dintre cele mai ridicate din țară, fiind de 10,8°C, în timp ce precipitațiile medii anuale sunt reduse, de până la 500 mm.

Solurile sunt argiloase în mare parte, soluri aluvionale, dar și gleisoluri (www.info-delta.ro).

Comuna Luncavița este amplasată la 52 km de orașul reședință de județ Tulcea, delimitată de Lunca Dunării, Munții Măcinului și Podișul Niculițelului (Gheorghe și colab., 1980).

Din această comună au fost prelevate patru probe provenite dintr-un solar tip tunel cultivat cu vinete și castraveți, având următoarele coordonate geografice: 45°17'11.44"N, 28°16'38.48"E.

Comuna Sarichioi localizată în partea de nord-est a Podișului Babadag, pe țărmul de vest al lacului Razim și pecel estic al lacului Babadag, la 43 km de orașul Tulcea.

Locul prelevării probelor are coordonatele: 44°56'53.05"N, 28°51'10.33"E.

Au fost recoltate patru probe dintr-un solar tip tunel cultivat cu tomate ce prezentau radicele abundente, cu aspect încâlcit, purtând pe le numeroase gale.

Județul Vâlcea

Situat în partea central-sudică a României, județul Vâlcea se întinde de-a lungul bazinului mijlociu al râului Olt, înconjurat de Munții Cozia la est și Culmea Căpățânii la vest. Clima este temperat continentală, cu slabe infuențe mediteraneene. Temperaturile medii anuale sunt de 9-10°C. Județul ocupă 2,4% din suprafața totală a țării (https://ro.wikipedia.org/wiki/Judetul_Valcea).

Comuna Voicești este așezată pe malul Oltului, la extremitatea sud-estică a județului Vâlcea, în imediata vecinătate a municipiului Drăgășani, la întâlnirea Podișului Getic cu Câmpia Română. Geografic, are următoarele coordonate: 44°36'46.22"N, 24°17'18.56"E.

Au fost recoltate două probe de rădăcinoase dintr-o fermă agricolă (exploatație familială mică).

Comuna Ștefănești este așezată în sudul județului Vâlcea, la 50 km de reședința de județ, Râmnicu Vâlcea. Din această comună s-au recoltat probe cu rmătoarea locație geografică: 44°37'9.48"N, 24°13'0.68"E. Suprafața comunei este străbătută de râul Dobrușa.

Principalele tipuri de soluri îtâlnite în comună sunt: soluri brune de pădure, soluri lutoase și luto-argiloase (www.primariastefanesti-vl.ro)

Au fost recoltate patru probe de sol dintr-o exploatație familială mică cultivată cu tomate și dovlecei.

Județul Vrancea

Județul Vrancea este situat la granița dintre regiunile istorice Muntenia și Moldova, la curbura Carpaților Orientali. Rețeaua hidrografică aparține în totalitate râului Siret și afluenților săi. Clima este temperată, cu variații datorate confluenței reliefului.

Vânturile dominante, în toate anotimpurile, bat dinspre nord-est. Temperatura medie anuală, în zona de câmpie, este de 9°C. Județul Vrancea are o structură de soluri foarte variate și complexe, datorită diversității condițiilor geografice. Astfel, se întâlnesc cernoziomuri levigate și compacte, cernoziomuri freatice-umede levigate, soluri aluvionare, soluri brune de pădure și brune-podzolice (Ghinea, 2000).

Comuna Jariștea este situată în partea central a județului Vrancea și în partea estică a dealului Măgura Odobeștilor, deal extern al Subcarpaților de Curbură.

Au fost prelevate cinci probe de sol provenite dintr-un solar tip tunel cultivat cu tomate, având următoatele coordonate geografice: latitudine 45°47'44.74"N și longitudine 27°3'47.22"E.

2.3. Parametri pentru evaluarea nematodelor galicole din probele analizate

Diversele nivele de populații de nematode galicole, precum și prezența anumitor specii au fost estimate în mostrele de sol și părți din plante pentru ca rezultatele să fie utilizate în diverse scopuri. Unul dintre aceste scopuri este acela de a evidenția totalitatea cazurilor de îmbolnăvire a plantelor, provocate de nematode galicole, pe o perioadă dată, raportată la întreaga suprafață eșantionată. Acest lucru se traduce prin incidența procentuală a infestației, calculată după formula de mai jos (Nchore și colab. 2010; Hussain, 2012):

Nr. total de probe infectate

Incidența (%) = x100

Nr. total de probe examinate

Prevalența procentuală a nematodelor galicole, pentru unitățile eșantionate, a fost calculată după formula de mai jos (Hussain, 2012):

Nr. total al unitaților (ha) cu nematode

Prevalența (%) = x100

Nr. total al unitaților (ha) investigate

Frecvența speciilor de nematode galicole pentru toate ariile supuse observațiilor a fost calculată după formula de mai jos (Norton, 1978; Esfahani, 2009; Anwar și colab. 2010):

Nr. de probe detectate cu nematode

Frecvența speciilor de nematode (%) = x100

Nr. de plante investigate

Severitatea atacului pe rădăcini a fost evaluată cu ajutorul unei scale, de la 0 la 5, astfel : 1= 1-2 gale, 2= 3-10 gale, 3= 11-30 gale, 4= 31-100 gale, 5= peste 100 gale (Taylor și Sasser, 1978).

Speciile detectate în probele prelevate au fost identificare, în principal, pe baza modelelor perineale descrise de către Taylor și Netschler (1974), a formei capului și cozii masculilor și juvenililor infestanți. Juvenilii infestanți au fost identificați pe baza caracterelor de specie, în preparate proaspete, semipermanente. Extracția lor a fost efectuată prin metoda Cobb, prin intermediul sitării și decantării, după care s-a folosit metoda Baermann (Southey, 1986). Nematozii (masculi și juvenili) au fost colectați în soluții apoase, numărați cu ajutorul unei camere de numărare și exprimați ca număr/200g sol și 10 rădăcini.

Femele au fost disecate din interiorul rădăcinilor infectate și plasate într-o placă Petri mică (Ø 4 cm) cu apă distilată. Sub o lupă binocular (20x) au fost selectate femelele mature, piriforme și sferiforme, complet dezvoltate care au fost mai apoi transferate pe o altă placă Petri în soluție de 45% acid lactic, timp de 3h (figura 2.13).

Figura 2.13. Apectul femelei tinere de Meloidogyne spp. după tratarea cu acid lactic 45%; prin transparența corpului se pot observa: gâtul (g), cuticula subțire (c) și modelul perineal (mp) (original)

Partea posterioară a corpului a fost tăiată cu un bisturiu, iar țesuturile corpului (ouă, intestine) au fost îndepărtate cu o pensulă fină, din interior spre exterior, până ce cuticula a rămas perfect curată. După îndepărtatrea țesuturilor, cuticula a fost plasată într-o picătură de glicerină anhidră, în care a fost tăiată într-o piesă mai mică, cuprinzind vulva, liniile laterale, anusul, arcul dorsal și ventral (figura 2.14.).

Astfel, modelul perineal tipic a fost transferat pe o lamă de microscop, într-o picătură de glicerină, pe care s-a așezat o lamelă după care a fost examinat la microscop Modelul perineal a fost comparat cu diagramele standard ale femelelor de Meloidogyne. Au fost examinate un număr de 15-20 modele perineale de la fiecare probă prelevată

Figura 2.14. Pregătirea modelului perineal în vederea examinării: A,B: excizia gâtului femelei și îndepărtatea conținutului corpului; C: tăierea porțiunii posterioare a corpului; D: decuparea surplusului cuticuar în jurul modelului perineal; E: aspect final al modelului perineal înainte de a fi examinat (Hartman K.M. & Sasser J.N. 1985. Identification of Meloidogyne species on the basis of differential host test and perineal pattern morphology. In: Barker K.R., Carter C.C., Sasser J.N. (Eds.) An Advaced Treatise on Meloidogyne, Volume II: Methodology. A cooperative publication on the Departament of Plant Pathology and the United Stated Agency for International Development, North Carolina State University Graphics, Releigh, North Carolina, pp. 69-77)

2.4. Rezultate și discuții

Nematodele galicole aparținând genului Meloidogyne au fost identificate în majoritatea ariilor investigate. Astfel, au fost prelevate un număr de 176 de probe, dintre care 115 au fost infestate. Excepție au făcut probele prelevate din comunele Căianul Mic și Dumitra, ambele din județul Bistrița; probele ridicate dintr-o plantație de viță de vie din județul Constanța; municipul Galați (zona Bădălan) și comuna Târgu Bujor din județul Galați; comuna Colibași din județul Giurgiu; orașele Deva și Hațeg din județul Hunedoara; comuna Braniștea din județul Mehedinți; comuna Valea Călugărească din județul Prahova.

Din zonele enumerate mai sus au fost prelevate probe, însă nu au fost identificate nematode galicole.

La inspecția vizuală a multor plante au fost întâlnite următoarele simptome: malfolmații ale părților subterane, necroze ale rădăcinilor, dezvoltare asimetrică între părțile subterane și cele aeriene ale plantelor, gale pe rădăcinile principale și secundare, brunificarea coletului, plante slab dezvoltate la scurt timp după apariția primelor frunze cotiledonare, rădăcini lemnificate și acoperite de gale voluminoase, bine conturate sau confluente, asocieri cu boli criptogamice.

Simptomele prezente pe părțile aerine ale plantelor, în cazul infestărilor cu nematode galicole, sunt adesea greșit interpretate ca fiind simptome ale diverselor carențe nutriționale.

Numărul maxim de probe ridicate a provenit din comuna Vărăști din județul Giurgiu (16 probe), urmată de satul Băleni din județul Dâmbovița (14 probe), ambele zone fiind cunoscute ca importante bazine legumicole.

Atunci când indexul de gale (IG) a fost ridicat (4-5), densitatea medie a nematodelor, atât din sol cât și din rădăcini, a fost foarte mare ceea ce indică o relație pozitivă între indexul de gale și densitatea nematodelor. Astfel, la un indice de gale 5 numărul total al nematodelor din 100 g + 10 g rădăcini a fost de 957,33 la morcov (Daucus carota) în comuna Gradiștea, județul Călărași.

Cea mai mică densitate de nematode galicole (specia Meloidogyne hapla) a fost observată la cartof (Solanum tuberosum), în medie 3 nematozi/ 200g sol+ rădăcini. Acest lucru s-ar explica printr-o infestare recentă (începutul primăverii) sau printr-o rezistență ridicată a soiului de cartof.

Au fost și situații în care numărul total de nematode din sol și rădăcini a fost mare însă indicele de gale a avut valori medii. Explicația ar fi aceea că o pondere mare a numărului de nematode a fost detectată în sol și nu în rădăcinile, unde se formează galele.

Specia Meloidogyne javanica, a fost identificată pentru prima dată în România la cinci plante de tomate (Lycopersicum esculentum) provenite dintr-un solar tip tunel, din Brăila, sat Vărsătura. La un indice de gale mediu (3), densinatea nematozilor a fost crescută (628/ 200g sol+rădăcini). După examinarea probelor de sol au fost observate multe femele tinere, juvenili și foarte puțin masculi, ceea ce denotă o populație în creștere datorită condițiilor constante de temperatură și uniditate.

Cultura tomatelor a fost predominantă din totalul numărului de probe prelevate (176), dar și din totalul numărului de probe infestate (115).

Incidența maximă (100%) a speciei Meloidogyne incognita a fost întâlnită la sfeclă roșie (Apium graveolens), conopidă (Brassica oleracera var. botrytis), țelină (Apium graveolens), pătrunjel (Petroselinum crispum), salată (Lactuca sativa), cactus (Mammillaria backebergiana) și dovlecel (Cucurbita pepo var. oblonga)

Incidența maximă a speciei Meloidogyne hapla a fost întâlnită la culturi precum conopidă (Brassica oleracera var. botrytis), țelină (Apium graveolens), afin (Vaccinium myrtillus) și ardei (Capsicum annuum).

Un maximum al incidenței speciei Meloidogyne arenaria a fost întâlnit doar la planta ornamentală la violeta de Parma (Saintpaulia ionantha).

Incidența speciei Meloidogyne javanica a fost de 6,67% la tomate (Lycopersicum esculentum).

Tabel 2.1. Prezentarea localităților de prelevare a probelor, tipul locațiilor, plantele-gazdă și speciile de Meloidogyne identificate

Notă: 1) EfM= exploatație familială mare; Efm= exploatație familială mică; ST= solar tip tunel; Vv= viță de vie; Po= plantă ornamentală; SM= seră modulară.

2) Mi= Meloidogyne incognita; Mh= Meloidogyne hapla; Ma= Meloidogyne arenaria; Mj= Meloidogyne javanica.

Tabel 2.2. Densitatea populațiilor de nematode (pe 200 g sol + 10 g rădăcini) din probele prelevate, pentru fiecare plantă-gazdă (media, deviația standard ± eroarea standard) și indexul de gale (IG).

Tabel 2.3. Incidența (%) speciilor de nematode galicole pentru fiecare cultură (plantă-gazdă)

Mi= Meloidogyne incognita; Mh= Meloidogyne hapla; Ma= Meloidogyne arenaria; Mj= Meloidogyne javanica

Fig. 2.15. Zonele de prelevare a probelor și distribuția speciilor de Meloidogine identificate pe teritoriul României (Mi: Meloidogyne incognita; Mh: M. hapla; M.a: M. arenaria; M.j: M. javanica)

Fig. 2.16. Reprezentarea procentuală a speciilor de Meloidogyne identificate în România 2.5.Concluzii.

Climatul temperat continental și condițiile edafice din zonele supuse investigațiilor s-au dovedit a fi favorabile dezvoltării nematodelor galicole aparținând genului Meloidogyne.

Managementul culturilor infestate și combaterea integrată sunt aproape inexistente în culturile legumicole infestate, depinzând în mare măsură de resursele financiare; acest lucru ar explica transmiterea populațiilor de nematode galicole de la un an la altul.

Nematodele galicole ale rădăcinilor au fost pentru prima oară semnalate în România la plante-gazdă precum vița de vie (Vitis vinifera), cartof (Solanum tubersoum), brocoli (Brassica oleracea var. conditiva), cactus (Mammillaria backebergiana) și violetă de Parma (Saintpaulia ionantha).

Deși cele patru specii de Meloidogyne identificare induc gale pe rădăcini, răspunsul plantei-gazdă este foarte diferit, ceea ce ne face să considerăm că speciile de nematode galicole generează interacțiuni specifice cu planta-gazdă.

În comparație cu alte culturi agricole (cereale, pomi fructiferi), legumele pot fi infestate într-un număr mult mai mare cu nematode galicole, în deosebi în spațiile protejate.

Nu au fost identificate interacțiuni ale nematodelor galicole cu alte specii de nematode fitoparazite, în condiții de teren sau spații protejate și nici infestații mixte între diferitele specii ale genului Meloidogyne.

În urma acestor investigații se poate aprecia că nematodele genului Meloidogyne sunt foarte răspândite printre plantele-gazdă aparținân familiilor Apiaceae și Solanaceae.

Bibliografie

Abrudan I. & Medve A. 2008. Ghidul ariilor naturale protejate din județul Sălaj. Editura Școala noastră – Zalău, pp. 4-20.

Alexandru I. Ș., Alexandru M. 1998. Brăila. Editura libertatea, pp. 50-123.

Alexandru I. Ș., Alexandru M. 2000. Brăila-Galați. Brăila. Editura Dunărea – Paper Print Invest, 116 p.

Anwar S.A., Kamran M., Javed M., Khan S.A., Sahi G.H. 2010. Incidence of root-nkot nematodes on tomato in Sargodha, Punjam, Pakistan. Pakistan Journal of Nematology 28(2): 253-262.

Anwar S.A., Zia A., Hussain M., Kamran M. 2007. Host suitability of selected plants to Meloidogyne incognita in the Punjab, Pakistan. International Journal of Nematolgoy (1): 144 – 150.

Bara I.S., Toma D., Lazăr I. 2012. Județul Hunedoara – monografie, vol. I, Editura Emia, pp. 7-49.

Barbosa D.H.S.G., Veira H.D., Souza R.M., Silva C.P. 2004. Survey of root-knot nematode (Meloidogyne spp.) in coffee plantations in the state of Rio de Janeiro, Brazil. Nematologia Brasileira 28(1): 43-47.

Berney M.F. & Bird G.W. 1992. Distribution of Heterodera carotae and Meloidogyne hapla in Michigan carrot production. Journal of Nematology 24(4): 776-778.

Bhosle B.B., Mukesh S., Puri S.N., Suvasish D. 2004. Prevalence of phytophagous nematodes in rizosphere of okra (Abelmoschus esculentus) in Parbhani district, Maharashtra, India. Indian Journal of Nematology 34(1): 56-59.

Bogdan A. & Călinescu M. 1976. Județul Satu Mare. Editura Academiei RSR- București, pp. 10-44.

Bugă D. & Zăvoianu I. 1974. Județul Dîmbovița. Editura Academiei RSR, 164 p.

Carrillo-Fasio J.A., García Estrada R.S., Molar R.A., Márquez-Zequera I., Cruz Ortega J.E. 2000. Identificación y Distribución de Especies del Nematodo Nodulador (Meloidogyne spp.) en Hortalizas, en Sinaloa, México. Revista Mexicana de Fitopatología, México, vol. XVIII , nr. 2, pp. 115- 119.

Cho H.J., Kim C.H., Park J.S., Jeoung M.G. 1987. Distribution of root-knot nematodes Meloidogyne spp. and their races in economic crops in Korea. Korean Journal of Plant Pathology 3(3): 159-163.

Choi Y.E. 1976. Studies on root-knot nematodes (Meloidogyne spp.) in Koreea. The Kasetsart Journal 12:31-35.

Ciobanu N. & Vătămanu V.V. 2012. Flora spontană din zona de sud a județului Olt. Editura Sintech, pp. 24-118.

Ciobanu N., Cremeneanu V.M., Cremeneanu C.C., Petrescu E., Țugui G. 2011. Flora spontană și fauna sălbatică a județului Olt. Editura Sintech, 253 pp.

Corrales S.P., Francia Varon de A., Barrera M.N. 1999. Survey and effect of Meloidogyne spp. in lulo crop Solanum quitoense. Acta Agronomica Universidad Nacional de Colombia 49(3/4): 43-47.

Daramola F.Y., Popoola J.O., Eni A.O., Sulaiman O. 2015. Characterization of root-knot nematodes (Meloidogyne spp.) associated with Abelmoscnus esculentus, Celosia argentea and Corchorus olitorius. Asian Journal of Biological Sciences 8(1): 42-50.

Dautova M. & Gommers F.J. 2000. Meloidogyne spp. In Macedonia: distribution and virulence for Mi resistance in tomato. Nematol. Medit. 20: 121-128.

Dragomir G., Dragomir Ș., Ivan P. 2002. Comuna Drăgănești-Vlașca, județul Teleorman: file de monografie. Editura Tipoaltex, Alexandria, pp. 16-55.

Esfahani M.N. 2009. Distribution and identification of root-knot nematode species in tomato fields. Mycopathologia 7(1):45-49.

Geacu S. 2007. Județul Galați- Dicționar de geografie fizică. Editura DC Press, pp. 15-218.

Gheorghe I., Maran A., Stan G., Rusali N., Bauman V., Băluță S., Berbecea P. 1980. Tulcea: monografie. Editura Sport Turism, București, 312 pp.

Ghinea D. 2000. Enciclopedia geografică a României. Editura Enciclopedică, București, 1455 p.

Grecu F., Mărculeț I., Mărculeț C., Dobre R. 2008. Podișul Transilvaniei de sud și unitățile limitrofe – Repere geografice. Editura Universității București, pp. 15-67.

Haegeman A., Mantelin S., Jones J.T., Gheysen G. 2012. Functional roles of effectors of plant-parasitic nematodes Gene 492(1):19–31.

Hartman K.M. & Sasser J.N. 1985. Identification of Meloidogyne species on the basis of differential host test and perineal pattern morphology. In: Barker K.R., Carter C.C., Sasser J.N. (Eds.) An Advaced Treatise on Meloidogyne, Volume II: Methodology. A cooperative publication on the Departament of Plant Pathology and the United Stated Agency for International Development, North Carolina State University Graphics, Releigh, North Carolina, pp. 69-77.

Hussain M.A., Mukhtar T., Kayani M.Z., Aslam M.N., Haque M.I. 2012. A survey of okra (Abelmoschus esculentus) in the Punjab province of Pakistan for determination of prevalence, incidence and severity of root-knot disease caused by Meloidogyne spp. Pakistan Journal of Botany 44 (6): 2071- 2075.

Ibrahim I. K.A., Rezk M.A., El-Saedy M.A. 1976. Occurrence and distribution of plant parasitic nematodes in Northen Egypt. Alexandrian Journal of Agricultural Research 24: 93-101.

Khan H.U., Mukhtar T, Ahmad R. 2005. Geographical distribution of root-knot nematodes (Meloidogyne spp.) in Punjab province of Pakistan. Pakistan Journal of Nematology 23(1): 133-140.

Kyndt T., Vieira P., Gheysen G., de Almeida-Engler J. 2013. Nematode feeding sites: unique organs in plant roots. Planta 238(5): 807-818.

Lordello A.I.L., Lordello R.R.A., Cia E., Fuzatto M.G. 1984. A preliminary raport on a survey of nematodes of the genus Meloidogyne attacking cotton in the state of Sao Paulo. Nematologia Brasileira 8:185-192.

Mitchum M.G. & Hussey R.S., Baum T.J., Wang X., Elling A., Wubben M., Davis E.L.2013. Nematode effector proteins: an emerging paradigm of parasitism. New Phytology Journal 199: 879–894.

Munteanu I. & Munteanu R. 1998. Timiș, Monografie. Editura Marineasa, Timișoara, pp. 4-22.

Nchore, S.B., Waceke, J.W and KariukiG., M. 2010. Incidence and prevalence of root-knot nematode Meloidogyne species in selected indigenous leafy vegetables in Kisii and Trans-Mara Counties of Kenya. In: Transforming Agriculture for improved livelihoods through Agricultural Product Value Chains. 12th KARI Biennial Scientific Conference, November 8-12, Nairobi, Kenya, pp. 675 – 681.

Norton D.C. 1978. Relationship of physical and chemicals factors to populations of plant-parasitic nematodes. Annual review of Phytopathology 17: 279-299.

Oancea D.I. 1973. Gruparea urbană Galați-Brăila: studiu de geografie regională. Editura Academiei RSR – București, pp. 25-61.

Olowe T. 2004. Occurrence and distribution of root-knot nematodes Meloidogyne spp. in cowpea growing areas of Nigeria. Nematology 6: 811-817.

Pișota I., Mihai E., Iovănescu M. 1975. Județul Covasna. Academia RSR, pp. 40-139.

Poclid M. 2013. Județul Botoșani în 2013 – Monografie geografică. Editura Taida, Iași, 607 p.

Ravichandra R.N. Methods and techniques in plant nematology. 2010. PHI Learning Private Limited, New Delhi, pp. 12-30.

Rosso M.N. & Hussey R. 2012. Nematode Effectors Protein: Targets And Functions In Plant Parasitism. In: Martin F., Kamoun S. (Eds.). Effectors in Plant-Microbe Interactions. Wiley-Blackwell, Oxford, UK. pp. 327–354.

Siddiqi R.M. 1986. Suborder Tylenchida. In: Tylenchida – Parasites of Plants and Insects, Commonwealth Institute of Parasitology, U.K., pp. 307-320.

Sorribas F.J., Verdejolucas S. 1994. Survey of Meloidogyne spp. in tomato production fields of Baix-Llobregat county, Spain. Journal of Nematology 26(4): 731-736.

Southey J.F. Laboratory methods for work with plant and soil nematodes. Ministery of Agriculture, Fisheries and Food, London, UK, 5-30 pp.

Taylor A.L. & Sasser J.N. 1978. Biology, identification and control of root-knot nematodes (Meloidogyne species). Deptartament of Plant Pathology North Carolina State University and U.S Agency for International Development, pp. 111

Taylor D.P., Netscher C. 1974. Improved technique for preparing perineal patterns of Meloidogyne spp. Nematologica 20(2): 268-269.

Vlăscescu G. & Ianoș I. 1998. Orașele României: mică enciclopedie. Editura Odeon, 494 p.

Williamson V.M. & Gleason C.A. 2003. Plant-Nematode interactions. Current Opinion in Plant Biology 6(4):327–333.

⁎

⁎ ⁎

Surse web:

www.macea.ro

www.primariapancesti.ro

www.tarcaia.ro

www.primariabod.ro

www.comunagropeni.ro

www.isubuzau.ro

https://www.ropedia.ro/judetul/Calarasi

www.ostrov.judetul-constanta.ro

https://ro.wikipedia.org/wiki/Judetul_Giurgiu

https://ro.wikipedia.org/wiki/Judetul_Harghita

https://ro.wikipedia.org/wiki/Judetul_Ialomita

www.bnr.ro/files/d/Pubs_ro/Monografii/Monografie_Mehedinti.pdf

https://ro.wikipedia.org/wiki/Judetul_Mures

www.primariajugureni.ro

Județul Prahova

https://ro.wikipedia.org/wiki/Judetul_Prahova

www.virsolt.ro

www.detatm.ro

www.info-delta.ro

www.primariastefanesti-vl.ro

https://ro.wikipedia.org/wiki/Judetul_Valcea

https://ro.wikipedia.org/wiki/Judetul_Bihor

https://ro.wikipedia.org/wiki/Comuna_Șelimbăr,_Sibiu

CAPITOLUL III

3. Influența nivelelor de inocul cu nematode galicole (Meloidogyne spp.) asupra creșterii tomatelor (Lycopersicum esculentum)

3.1. Introducere

Potențialul de reproducere, patogenitatea și numărul de generații pe care specile de Meloidogyne spp. le produc în timpul unei perioade de vegetație pot varia între populațiile diferitelor specii, precum și în cadrul aceleiași specii (Van Gundy, 1985; Manzanilla-López și Starr, 2009). Acest lucru depinde de agresivitatea nematodelor, de prezența și disponibilitatea unei plante-gazde adecvate, de profilul agricol al ariei respective și de rotația culturilor (Greco și Di Vito, 2009).

Evaluarea compatibilității plantei-gazdă este o indicație majoră a potențialului de reproducere diferențiat care există între speciile de Meloidogyne, dar și între populațiile aceleiași specii. Utilizarea unor astfel de evaluări se justifică în cuantificarea agresivității diferitelor specii de Meloidogyne. De exemplu, la porumb (Zea mays), variabilitatea patogenității nematodelor galicole se presupune că ar fi motivul pentru care unii hibrizi cultivați reacționează diferit la populațiile izolate geografic (Windham și Williams, 1987).

Mulți autori au demonstrat diferența de agresivitate a speciilor Meloidogyne incognita și M. arenaria pe o serie de hibrizi de porumb în diverse experimente de-a lungul anilor (Baldwin și Barker, 1970; Windham și Williams, 1987; 1988; 1994).

Mai mult decât atât, Baldwin și Barker (1970) au stabilit că femelele mature de M. incognita produc în general mai multe mase de ouă în rădăcini la unele soiuri de Zea mays decât femelele de M. javanica sau M. arenaria. Acest fapt a explicat parțial potențialul de reproducere și agresivitate.

Pentru hibrizii de porumb, pe arii locale, au fost înregistrate inclusiv diferențe substanțiale în ceea ce privește compatibilitatea gazdei cu populațiile de M. incognita și M. javanica (Ngobeni și colab., 2011).

Spre deosebire de porumb, legumele solano-fructoase reprezintă plante-gazdă mult mai favorabile dezvoltării celor mai importante specii de Meloidogyne. În această grupă sunt cuprinse tomatele (Lycopersicum esculentum), ardeii (Capsicum annuum), vinetele (Solanum melongena) și păpălăul (Physalis peruviana). Plantele din această grupă sunt anuale, fac parte din aceeași familie botanică (Solanaceae), au perioadă de vegetație relativ lungă (120-130 zile), sunt pretențioase la căldură, lumină și umiditate.

Speciile legumicole din această grupă sunt de importanță economică deosebită și, de aceea, necesită măsuri speciale de cultură. În România, tomatele reprezintă cultura numărul unu în sere și solarii (Popescu și Zăvoianu, 2013).

Evoluția suprafețelor și producțiilor de tomate în perioada anilor 2010-2016 este redată în tabelul 3.1.

Tabel 3.1. Evoluția suprafețelor și producțiilor de tomate (Ministerul Agriculturii și Dezvoltării Rurale, 2016) (http://www.madr.ro/horticultura/fructe-si-legume.html)

Cuvântul tomată derivă din tomatl, cuvânt provenit din limba veche mexicană nahuatl, vorbită în centrul Mexicului. Denumirea specifică de lycopersicum înseamnă ”piersica lupului”(Ansari și colab., 2016).

În țara noastră tomatele sunt plante anuale, în același an înfloresc, fructifică și produc semințe, iar în zonele de origine (America Centrală și de Sud, Peru, Ecuador și Mexic) se comportă ca plante perene. În condiții de seră tomatele pot să vegeteze mai mulți ani.

Sistemul radicular al tomatelor, în care se dezvoltă nematodele Meloidogyne spp., prezintă următoarele particularități botanice și biologice:

rădăcina principală atinge 1,5 m adâncime, dar numeroase rădăcini laterale pot ajunge la 1,6 m;

rădăcina explorează un volum de sol de 8m3 pentru 9 m2 suprafață, dacă distanțele de plantare permit;

în condiții normale de temperatură, la plantele tinere, rădăcinile cresc cu 2-4 mm/zi, la 30 de zile după răsărirea plantelor rădăcina principală ajunge la 50 cm lungime iar pe un sol bine lucrat dinamica creșterii rădăcinilor, după plantare, se apreciază la cca. 20 cm la două săptămâni, 75 cm la trei săptămâni, 100 cm la patru săptămâni și 125 cm la cinci săptămâni;

la plantele care provin din semănarea directă în câmp, rădăcina principală este mai dezvoltată, pe când la cele provenite din răsad, este mai superficială, fiind răspândită mai mult în stratul superior de sol de 30-50cm adâncime;

plantele de tomate își refac bine sistemul radicular și, în plus, au capacitatea de a emite cu ușurință rădăcini adventive;

la tomatele cultivate în spații protejate, masa principală a rădăcinilor se dezvoltă la 18-45 cm adâncime, o parte ajungând până la 1 m, iar reprezentarea pe orizontală se realizează pe o rază de 50-80 cm;

ramificarea rădăcinilor depinde și de temperatura solului, astfel că, sub 10°C și peste 37°C creșterea rădăcinilor se oprește, – temperaturile optime pentru creșterea sistemului radicular sunt cuprinse între 15-35°C;

la rădăcinile bătrâne apare lignificarea, începând de la bază, fenomen caracteristic tomatelor perene (Popescu și Zăvoianu, 2013).

Infecția cu Meloidogyne spp. la tomate acționează prin pierderea sau absorbția produșilor de fotosinteză de către nematozi, prin intermediul celulelor gigant din interiorul galelor.Prin urmare, productivitatea scade, producția obținută este săracă, iar calitatea fructelor și timpul de depozitare al acestora se reduc. Daunele cauzate de Meloidogyne spp. conduc la simptome asemănătoare celor cauzate de deficiența nutrienților, a stresului hidric și a agenților patogeni cu transmitere prin sol. Tomatele puternic infectate nu răspund la aplicarea îngrășămintelor sau a irigării, deoarece țesuturile conducătoare ale rădăcinilor sunt grav afectate.

Daunele predispun culturile la atacul altor patogeni prin pierderea nutrienților din sol, ceea ce favorizează creșterea ciupercilor și a bacteriilor fitopatogene (Sasser, 1989; Kankam și Adomako, 2014).

Împiedicarea absorbției normale a apei și a nutrienților din cauza numeroaselor gale reprezintă una dintre pagubele directe provocate de parazitarea rădăcinilor de către nematodele galicole, însă de cele mai multe ori apar atacuri secundare cauzate de infecții cu ciuperci telurice: Rhizoctonia solani, Verticillium spp. sau bateria Ralstonia solanacearum. Prin penetrarea rădăcinilor de către juvenili, sunt create porți de intrare facile pentru mai mulți agenți patogeni ce vor provoca infecții afectând și mai mult activitatea plantelor (Prohrib și Petrache, 2014).

Cultura tomatelor deține un record al atacului cu boli, printre care se pot aminti: pătarea și bășicarea fructelor (Xanthomonas vesicatoria), pătarea brună (Alternaria solani), septorioza sau pătarea albă (Septoria lycopersici), făinarea (Erysiphe sp., Leveillulataurica), putregaiul cenușiu (Botrytis cinerea), antracnoza (Colletrotrichum coccodes), putrezirea fructelor (Phytophotora parasitica), mana tomatelor (Phytophotora infestans), fusarioza (Fusarium oxysporum, Fusarium lycopersici), verticiloza (Verticillium dahliae), pătarea cafenie (Cladosporium fulvum/Flavia fulva), putregaiul bazei tulpinii tomatelor (Didymella lycopersici), bășicarea fructelor (Xanthomonas campestris), boala petelor de bronz (Tomato spotted wilt virus), boala frunzelor de ferigă (Cucumber mosaic virus – CMV), mozaicul tomatelor (Tobacco mosaic virus – TMV). Dăunătorii, de asemenea, destul de numeroși, printre care: coropișnița (Gryllotalpa gryllotalpa), păianjenul rușu comun (Tetranychus urticae), păduchele roșu al solanaceelor (Microsiphon solani), păianjenul lat (Ployphagotarsonemus latus), păduchele verde al solanaceelor (Microsiphon euphorbitae), tripsul comun (Thrips tabaci), gândacul din Colorado (Leptinotarsa decemlineata), omida fructelor (Helicoverpa armigera armigera), musculița albă de seră (Trialeurodes vaporariorum), musca minieră (Liriomyza trifolii), molia tomatelor (Tuta absoluta), ploșnița verde a tomatelor (Nezera viridula), țânțarul tomatelor (Lasioptera spp.), viermele sârmă (Agriotes spp.) .

La acest record nedorit de boli și dăunători se adaugă nematodele galicole din genul Meloidogyne, paraziți obligatorii și polifagi (Ciofu și colab., 2004; Popescu și Zăvoianu, 2013; Grabner și Weidenweber, 2017).

Este cunoscut faptul că prezența nematozilor galicoli crește semnificativ incidența și severitatea atacului cu Fusarium și a bacteriilor fitopatogene asigurând un mediu propice pentru acești patogeni (Agrios, 1997).

În acord cu Kinloch (1982), creșterea unei plante este invers proporțională cu densitatea inițială a nematodelor Meloidogyne spp.

Pe măsură ce populația de nematode crește peste pragul economic, controlul devine mai dificil. Așadar, este important să se evalueze creșterea potențială a nematodelor galicole, astfel încât acestea să rămână sub nivelurile la care reduc producția de tomate.

Astfel, au fost dezvoltate strategii de control pentru a gestiona aceste creșteri ale speciilor de Meloidogyne. Printre acestea, se pot aminti utilizarea de nematocide, control biologic și folosirea unor soiuri rezistente. Infecția nematodelor asupra plantelor-gazdă , prin densități scăzute ale acestora, pot spori creșterea productivității sau, din contră, să nu aibe niciun efect asupra plantelor, însă uneori pot cauza daune severe recoltei (Kankam și Adomako, 2014).

Scopul acestui studiu a fost acela de a evalua efectul diferitelor densități ale inocului, cu două specii de nematode galicole, asupra creșterii și formării galelor la mai multe varietați comerciale de tomate.

Au fost alese specii de nematode galicole diferite, bazându-ne pe faptul că specia Meloidogyne incognita a fost des depistată și identificată în culturile de tomate iar M. javanica este o specie nou identificată, nefiind încă evaluată sub aspectul modului de atac asupra culturii de tomate în România.

Pentru investigarea patogenității au fost urmăriți parametri reproducerii nematodelor și ai creșterii plantelor de tomate.

3.2. Materiale și metode

3.2.1. Obținerea materialului biologic

3.2.1.1. Obținerea izolatelor de nematode

S-a obținut un izoltat din specia M. incognita (provenit din amestecul mai multor populații din comunele Macea-Arad, Băleni-Dâmbovița și Jugureni-Prahova) și a unui izoltat de M. javanica (comuna Chiscani-Brăila), menținute in vitro pe plante de tomate din soiul Moneymaker, considerat a fi susceptibil (Anwar și colab., 1994; Nono-Womdim și colab., 2002). Creșterea și menținerea populațiilor de nematode, inocularea și urmărirea patogenității s-a realizat în condiții controlate, în camera de creștere a Laboratorului Regional de Nematologie din cadrul Oficiului Fitosanitar Brașov, în perioada aprilie-octombrie 2014.

Ambele speciide Meloidogyneau fost multiplicate în cicluri scurte de cultură, de până la 60 zile, populații cultivate ca monospecie, permițând nematodelor parcurgerea mai multor etape de dezvoltare și formarea maselor de ouă pe suprafața rădăcinilor necesare pentru obținerea inoculului dorit.

După 55 de zile de la inocuare experimentele au fost oprite deoarece, în acest interval se consideră că majoritatea speciilor de Meloidogyne ar fi trebuit să dezvolte una-două generații în rădăcinile plantelor de tomate (Kleynhans, 1991; Agenbag, 2016).

Atât populația de M. incognita cât și cea de M. javanica au fost supuse unei diagnoze preliminare, atât prin morfometrie în cadrul Laboratorului Regional de Nematologie – Brașov, cât și prin biologie moleculară în cadrul Laboratorului Central Fitosanitar – Ilfov, respectiv Instituto per la Protezione Soisteinable delle Piante, Bari – Italia.

Obținerea izolatelor de nematode (juvenili stadiul J2), în vederea preparării inoculului, a fost realizată în urma eclozării maselor de ouă recoltate din rădăcinile plantelor de tomate infestate, folosind o metodă adaptată cu NaOCl 0,5% după cum urmează:

au foste alese rădăcinile cu galele bine formate, spălate atent pentru a îndepărta solul aderent;

rădăcinile au fost tăiate în bucăți de 1cm;

bucățile de rădăcină au fost plasate într-un blender, adăugându-se apă (500 ml) și soluție NaOCl 0,5% (100 ml);

mixarea soluției la turație scăzută timp de 15-20 secunde;

suspensia obținută a fost trecută printr-o sită de 40μm iar reziduul clătit imediat cu apă de robinet timp de 3 minute;

reziduul spălat a fost transferat într-o sită de 20μm, iar apoi turnat într-un pahar Berzelius cu ajutorul unei pisete cu H2O (Hussey și Barker, 1973; Machado și colab., 2010).

Metoda descrisă mai sus se bazează pe digestia chimică a matrixului gelatinos de către NaOCl și eliberarea ouălor din masele de ouă (figura 3.1.).

Figura 3.1. Prezența femelelor tinere (f) și a maselor de ouă (mo) pe suprafața rădăcinilor (r) de tomate (A); matrixul gemalitons (mg) care înglobează ouălele în contact cu suprafața rădăcinei (B) (original)

Amestecul obținut în paharul Berzelius, format în mare parte din ouă, dar și juvenili eclozați spontan, a fost distribuit apoi în vase pentru eclozare (hârtie de filtru așezată pe o plasă de aluminiu montată pe o placă Petri)(figura 3.2.).

Figura 3.2.Vase pentru eclozarea nematodelor Meloidogyne spp. – Laboratorul Regional de Nematologie, Brașov (original)

Pentru a optimiza procesul de eclozare, evitându-se evaporarea și slaba oxigenare, s-a completat cu apă proaspătă fiecare vas de eclozare, adăugându-se totodată câte o picătură de H2O2 3% o dată pe zi.

Juvenilii eclozați au fost recoltați la un interval de 24-72 h iar suspensia obținută a fost lăsată să se sedimenteze cca. 10 minute, apoi din sedimentse, după care din sediment s-a transferat cu ajutorul unei pipete automate într-un pahar Berzelius și s-a ajustat volumul la 50 ml, prin adăugarea sau extragerea apei.

S-au extras apoi subprobe care s-au transferat într-o cameră Perspex de numărare, gravată, sub un steromicroscop binocular Leica MZ9.5(magnitudine 40x). S-au însumat toate numărătorile și s-a calculat numărul mediu al juvenililor, stabilindu-se cele trei nivele de inocul: 1000 – considerat nivel minim, 2500 respectiv, 5000 juvenili/inocul.

3.2.1.2. Obținerea materialului vegetal.

Meloidogyne spp., Rotylenchulus reniformis, Globodera rostochiensis și alte câteva specii de nematode ectoparazite sunt cunoscute ca fiind dăunători ai tomatelor în diferite părți ale lumii. Tomatele sunt considerate cele mai favorabile plante-gazdă pentru nematozilole galicole ale rădăcinilor (Dropkin, 1980; Abiodun și colab., 2017).

Sortimentul de soiuri și hibrizi (varietăți) de tomate folosit în România este deosebit de divers și cuprinde peste 70 de soiuri, hibrizi și populații locale. La nivel mondial sortimentul este mult mai vast și satisface cerințele pieții actuale de pe tot globul, funcție de preferințele consumatorilor, interesele producătorilor, în concordanță cu circumstanțele ecologice și geografice și, în mod special, cu sistemele și tipurile de cultură. Sortimentul actual mondial, ca și cel din țara noastră, este deosebit de mobil, în sensul că apar soiuri din ce în ce mai performante, fiind eliminate cele care nu fac față exigențelor actuale (Stan și colab., 2003).

Pentru cultura în sere și solarii se folosesc soiuri și hibrizi cu rezistențe la boli și dăunători, adaptați la condițiile de lumină mai slabă din unele perioade, cu precocitate pronunțată, cu fructe uniforme ca aspect, mărime, culoare și rezistență la transport.

Pentru acest studiu au fost folosite varietăți de tomate comerciale utilizate în cele mai întâlnite tehnologii de cultivare – tunele joase, tunele înalte (solarii tunel) și solarii bloc – în câteva ferme din Bacău, Bistrița, Buzău, Constanța, Galați, Mureș, Prahova, Hunedoara,Teleorman și Tulcea :

Kiveli F1 – hibrid extratimpuriu cu creștere nedeterminată și fructe de mărime mare; are o gamă largă de rezistențe la boli (Verticilium spp., Fusarium oxysporum, Fusarium lycopersici, Tomato mosaic virus), inclusiv la nematode (Meloidogyne incognita); fructele au greutate mare (180-230g) și fermitate foarte bună iar culoarea este roșie intensă la maturitate; hibridul Kiveli F1 are un potențial de producție deosebit, toleranță sporită la condiții de temperatură scăzută și o bună adaptabilitate la semănare în perioada toamnă-iarnă; este în principal recomandat pentru spații protejate (solarii), dar cu potențial ridicat de producție și în cultura în câmp, pe araci; Kiveli F1 a fost întâlnit în solarii din satul Scăieni, comuna Bozioru (Buzău), comuna Suplac (Mureș), comuna Cujmir (Mehedinți) și comuna Plopu (Prahova).

Venizia F1 – este un hibrid de tomate cu creștere nedeterminată cu maturitate timpurie și performațe deosebite pe ciclul I de cultură; mărimea fructelor este medie spre mare, cu greutatea de 170-190 g, în medie, în funcție de condițiile de cultură, rezistență și fermitate foarte bună; forma fructelor este sferică, uniformă, se păstreză foarte bine și au rezistență la transport; Venezia F1 prezintă o gamă foarte largă de rezistențe (Verticillium spp., Fusarium oxysporum, Fusarium lycopersici, Tomato Mosaic Virus race 0, Tomato Spoted Wild Virus, Alternaria alternata, Stemphylium solani), precum și la Meloidogyne incognita;Venizia F1 a fost întâlnit întâlnit în comuna Suplac (Mureș), orașul Deva (Hunedoara) și comuna Măgura (Teleorman).

Emir F1 – este un hibrid semitimpuriu, foarte productiv, cu creștere nedeterminată, fructe rotund-globuloase, uniforme, cărnoase, cu greutate de 150-180 g; Emir F1 este ideal pentru spații protejate și câmp putând fi recoltat în ciorchine, cu durată lungă de păstare; rezistent la Verticillium spp., Fulvia fulva, Tomato Mosaic Virus.(Popescu și Zăvoianu, 2013); Emir F1 a fost întâlnit în comuna Lunciou de Jos (Hunedoara), comuna Pâncești (Bacău) și comuna Luncavița (Tulcea).

Moneymaker – soi vechi cu origini în Marea Britanie (Bristol), creat în anul 1897, comercializat cu succes la noi în țară, fiind unul dintre cele mai populare soiuri, cu creștere nedeterminată, înălțimea plantei fiind de cca. 118 cm, cu 6 ramuri/plantă, în medie 52 fructe/plantă, ciorchinii au 7-12 fructe cu o greutate aproximativă a fructului de 40g, producția fiind de 2,08 kg/plantă, cu fructe de mărime medie și formă rotundă (Goswami și colab., 2015; Kiewnick și colab. 2009; Singh și Khruma, 2007); Moneymaker a fost întâlnit în comuna Șendreni (Galați), comuna Plopu (Prahova), orașul Hațeg (Hunedoara), comuna Dumitra (Bistrița), comuna Căzănești (Mehedinți) și comuna Ostrov (Constanța).

Pentru a observa cât mai bine interacțiuea dintre plantele-gazdă și Meloidogyne spp. este necesar nu doar un nivel ridicat al pragului nematodelor în sol, dar trebuie luați în considerare factorii de mediu care ar afecta culturile, tipul de sol, textura și dimensiunea porilor, istoricul culturii agricole și al ariei, modelul de distribuție al nematodelor și multiplicarea lor, aspecte care sunt la fel de importante (Kahan, 2008; Schomaker și colab. 2006).

În acest studiu au fost folosite varietăți de tomate (Kiveli F1, Venzia F1, Emir F1 și Moneymaker) întâlnite în fermele de unde s-au prelevat în prealabil probele de sol în care s-au detectat Meloidogyne incognita, respectiv M. javanica.

Răsadurile pentru cele patru varietăți au fost obținute în tăvi alveolare folosindu-se ca substrat agroperlit horticol pentru înrădăcinare cu granule mai mici de 2 mm și nisip de râu în proporție de 1:1 (două tăvi tip Marcoser, cu câte 70 alveole/tavă, destinate special pentru creșterea răsadurilor și a plantelor legumicole și floricole).

Tăvile alveolare au fost așezate în camera de creștere până la apariția frunzelor adevărate și uscarea cotiledoanelor. Temperatura ambientală a fost menținută la valori de 19-21°C (minimă) și 25-27°C (maximă), umititatea relativă fiind de 60%, parametri monitorizați cu termo-higrometrul Venta (umiditatea relativă exprimată în procente, cu alarmă optică și acustică pentru toți parametri), la o fotoperioadă de 12 h.

Răsadurile de tomate au fost udate manual o dată la trei zile, iar după germinare s-au fertilizat săptămânal odată cu apa de udare (Agrecol, Polonia, NPK 9:3:6 + microelemente pentru utilizare horticolă).

După apariția a 3-4 frunze adevărate, aproximativ la patru săptămâni, au fost transplantate în ghivece cu diametrul de 10 cm (500 cm³) într-un amestec de sol luto-argilos și nisip de râu (1:1), sterilizat în prealabil la 120°C, 40 minute, pentru a distruge potențialii patogeni.

3.2.2. Inocularea cu nematode și evaluarea infectivității aupra tomatelor

La câteva zile după transplantare și după determinarea numărului de juvenili/inocul s-a recurs la inocularea răsadurilor de tomate cu ajutorul unei pipete automate, prin efectuarea a 3-4 găuri (⅓din ghiveci) la suprafața solului cât mai aproape de tulpina răsadului, cu ajutorul unui plantator.

Au fost inoculate câte patru plante din fiecare varietate de tomate cu 1000, 2500 și 5000 de juvenili de Meloidogyne incognita sau M. javanica, corespunzând la 32 de tratamente cu 4 repetări/tratament (două specii de Meloidogynex patru varietăți de tomate x trei nivele de inocul + opt ghivece neinoculate din fiecare varietate).

Ghivecele au fost distribuite în mod aleatoriu (model randomizat) în camera de creștere, astfel încât a existat un spațiu suficient între plante, evitându-se posibila contaminarea încrucișată între cele două specii de nematode concomitent cu udarea, datorită scurgerii apei de la un ghiveci la altul, datorită mâinilor operatorului sau a altor echipamente.

Tomatele au fost evaluate după 55 de zile sub aspectul variabilității în reproducere a populațiilor de nematode și al răspunsului plantelor. Tomatele au fost scoase din ghiveci și excizate la nivelul coletului. Rădăcinile au fost atent scuturate, spălate individual, pentru a îndepărta resturile de sol și detritusurile aderente.

Au fost luați în calcul următorii parametrii :

populația inițială (Pi) : corespunde celor trei tipuri de inocul;

populația finală (Pf) : corespunde mediei între juvenilii recuperați din sol și cei recuperați din rădăcini, împreună cu ouălele;

indicele de gale (IG) : corespunde galelor formate până la finalul celor 55 de zile;

factorul de reproducere (Fr) : se calculează împărțind populația finală la cea inițială (Fr = Pf/Pi);

lungimea tulpinilor (Lt) și lungimea rădăcinilor (Lr) la finalul celor 55 de zile;

greutatea tulpinilor (Gt) și greutatea rădăcinilor (Gr) la finalul celor 55 de zile.

Indicele de gale (IG) este un indicator al deteriorării plantelor în timp ce Fr este un indicator al reproducerii nematodelor galicole sau a eficienței (sensibilității) tomatelor (Taylor și Sasser, 1978; Maleita și colab, 2012).

Gradul de rezistență (Gr) în ceea ce privește sensibilitatea varietăților de tomate a fost evaluat pe baza indicelui de gale (IG) și a factorului de reproducere (Fr) în conformitate cu schema lui Canto-Sáenz (Tabel 3.3.).

Varietățile cu IG mai mare de 2 sunt desemnate ca fiind sensibile la atacul nematodelor galicole (plantă propice reproducerii nematodelor cu Fr > 1, daune semnificative la un IG > 2) sau foarte sensibile ( Fr ≤ 1 si GI > 2).

De obicei, aceste varietăți sunt eliminate de la testele de evaluare a gradului de rezistență. Varietățile rămase sunt clasificate astfel : rezistente (plante-gazdă sabe pentru înmulțirea nematodelor cu Fr ≤ 1 și daune minime datorate unui IG ≤ 2) și tolerante (plante-gazdă propice înmulțirii nematodelor și daune minime la un IG ≤ 2) (Taylor și Sasser, 1978).

Tabel 3.2. Schema atribuită de Canto-Sáenz desemnată compatibilității (rezistenței) plantei-gazdă (Taylor A.L. & Sasser J.N. 1978. Biology, identification and control of root-knot nematodes (Meloidogyne spp.). Departament of Plant Pathology, North Carolina State University and the United States Agency for International Development, University Graphics, NC, USA, 111 pp.)

Numărul de gale/sistem radicular a fost evaluat cu ajutorul unei scale a gravității atacului, de la 0 la 5 conform tabelului 3.4.:

Tabel 3.4. Scala de evaluare a atacului nematodelor galicole (Taylor A.L. & Sasser J.N. 1978. Biology, identification and control of root-knot nematodes (Meloidogyne spp.). Departament of Plant Pathology, North Carolina State University and the United States Agency for International Development, University Graphics, NC, USA, 111 pp.)

Extracția ouălor din fiecare sistem radicular, pentru a stabili Pf, s-a realizat cu metoda adaptată folosint 0,5 % NaOCl (Hussey și Barker, 1973; Machado și colab., 2010).

Juvenilii din sol au fost extrași prin metoda cernerii și decantării (Cobb) combinată cu metoda pâlniei Baermann modificată (Hooper, 1986).

Aceste metode nematologice au permis decantarea juvenililor, recoltarea lor la 48h, concentrarea pe o sită cu ochiuri de 20μm folosind o pisetă și apoi numărarea cu ajutorul unei camere de numărare sub un stereomicroscop binocular.

3.3. Rezultate și discuții.

Pe parcursul celor 55 de zile varietățile de tomate au fost atent supravegheate pentru a nu permite bolilor majore sau a altor dăunători să interfere cu dezvoltarea nematodelor galicole.

Un aspect important luat în calcul în cadrul acestor experimente a fost starea fiziologică a juvenililor infestanți, tipul de sol, aerația, umiditatea, stadiul de creșterea a plantelor-gazdă (De Guiran și Demeure, 1978).

Din experiența noastră, încheierea tardivă a experimentului și observațiile efectuate după 60-65 de zile nu ar fi furnizat rezultate satisfăcătoare deoarece o parte din rădăcini s-ar fi degradat, în timp ce populația de nematode suferă un declin natural.

Pe de altă parte, în astfel de condiții, ar fi prezenți masculii, într-o mai mică sau mai mare măsură, la cele două specii de nematode, știindu-se că apariția acestora corespunde unei presiuni ridicate exercitate asupra populației de nematozi.

Nivelul ridicat al nematodelor galicole în rădăcini se răsfrânge asupra plantei-gazdă conducând la pierderea frunzelor, creșterea anormală a sistemului radicular și la o severitate a formării galelor (Hussain și colab., 2016).

În folosirea juvenililor infestanți pentru evaluarea patogenității a fost importantă sincronizarea inculării cu perioada optimă de creștere a răsadurilor, deoarece juvenilii nu penetreză rapid rădăcinile de tomate incomplet dezvoltate.

Folosirea soluției de NaOCl 0,5% în tehnica de extracție a ouălorare scopul de a dizolva matrixul glicoproteic ce înglobează masele de ouă dar acționează, în același timp, ca un dezinfectant pentru micoorganismele potențial patogene din masa de ouă. În unele studii s-a amestecat solul cu anumite substanțe antibiotice.

Astfel, unii autori au raportat infestări cu specii de Meloidogyne mai mari de 250 ouă/cm³ sol la Cucumis melo și Capsicum annuum fără vreo afectare a populației de nematode (Di Vito și colab., 1985a, 1985b).

Pentru colectarea unor cantități mai mari de juvenili din stadiul J2, Lambert și colaboratorii (1992) au experimentat extracția juvenililor din plante de tomate crescute în cultură hidroponică.

În cazul de față, toate varietățile de tomate, la cele trei nivele de inocul, au avut un IG> 2, mai puțin varietatea Kiveli F1 la nivelul minim și maxim al inoculării cu specia M. javanica și la primul nivel de inocul cu specia M. incognita, unde IG = 2. Un maxim al acestui indice a fost observat la varietățile Emir F1 și Moneymaker, la cele trei nivele de inocul cu Meloidogyne javanica, precum și la varietățile Venezia F1, Emir F1 și Moneymaker la cele trei nivele de inocul cu Meloidogyne incognita. Nu același lucru a fost observat la varietatea Kiveli F1, la toate trei nivele de inocul cu ambele specii de nematode, unde IG nu a depășit valoarea de 2,5.

La un nivel minim de inocul (1000 J2) s-a înregistrat o creștere a juvenililor infestanți din sol pentru specia Meloidogyne javanica, astfel: Kiveli F1 = 1040 J2, Venezia F1 = 2138 J2, Moneymaker = 3697,5 J2 și Emir F1 = 3785 J2. Se poate remarca faptul că la varietatea Kiveli F1 numărul de nematode înregistrează o creștere modestă spre deosebire de celelalte trei varietăți de tomate, la care creșterea populației inițiale se dublează sau chiar triplează.

Dimpotrivă, la aceeași specie de nematod însă la nivelul maxim de inocul (5000 J2) s-au înregistrat valori ușor crescute ale numărului de juvenili din sol comparativ cu primul nivel de inocul, astfel: Kiveli F1 = 1313 J2, Venezia F1 = 2912 J2, Moneymaker = 3902 J2 și Emir F1 = 3938,7 J2.

Creșterea numărului de gale a fost observată la toate nivele de inoculare, iar distrugerea sistemului radicular s-a realizat tocmai prin dezvoltarea acestor gale, conducând implicit la o concurență a juvenililor pentru hrană. Per ansamblu, numărul de gale/rădăcini de tomate a crescut semnificativ odată cu creșterea densității inițiale atât la Meloidogyne javanica cât și la M. incognita.

Totuși, creșterea a fost mai mică la tomatele din varietatea Kiveli F1 inoculate cu M. incognita (cca. 6 gale/rădăcină), în timp ce la restul varietăților de toamte au dezvoltat peste 100 gale/rădăcini (IG 5). Numărul de gale/g rădăcini de tomate inoculate cu Meloidogyne incognita și Meloidogyne javanica din varietatea Venezia F1 au fost semnificativ mai multe și mai mici (păstrând IG 5) decât la varietatea Kiveli F1 deși numărul de juvenili a fost similar la cele două varietăți.

Explicația cea mai probabilă vine din faptul că varietatea Venezia F1 a dezvoltat un număr suplimentar de false gale, cu un conținut ridicat în celule hipertrofiate și mai puțin în femele cu mase de ouă sau juvenili în interior (Tabel 3.5.).

Tabel 3.5. Influența nivelelor de inocul (1000, 2500 și 5000 J2) ale nematodelor Meloidogyne javanica și Meloidogyne incognita asupra dezvoltării sistemului radicular al tomatelor: Kiveli F1, Venezia F1, Emir F1 și Moneymaker după 55 zile de la inoculare

IG = Indice de gale (0-5) : 0 = gale absente, 1 = 1-2, 2 = 3-10, 3 = 11-30, 4 = 31-100, 5 = > 100 gale/sistem radicular ; Pf = populația finală (J2 sol + J2 rădăcini + ouă), media a patru repetiții ± deviația standard ; Fr = Factorul de reproducere = densitatea Pf/Pi.

În privința Fr se poate consemna o creștere maximă a acestui parametru la varietățile Emir F1 (Fr = 12,8) și Moneymaker (Fr = 13) la un nivel de 1000 J2/inocul cu M. javanica, urmat de valori apropiate la aceleași varietăți de tomate, Emir F1 (Fr = 13,2) și Moneymaker (Fr = 13,8) cu 1000 J2/inocul însă la specia M. incognita.

Fr scade la următorul nivel mediu de inocul (2500 J2/inocul) și cel maxim (5000 J2/inolcul), dar rămâne relativ ridicat la varietățile de tomate Emir F1, respectiv Moneymaker.

Cea ma scăzută valoarea a Fr a fost înregistrată la nivele maxime de inocul la varietățile Kiveli F1 (Fr = 0,7) și Venezia F1 (Fr = 1,5) datorită numărului mic al nematodelor recuperate la Pf (Figura 3.6.)

Figura 3.6. Reproducerea speciilor Meloidogyne javanica și Meloidogyne incognita pe varietăți de tomate Kiveli F1 (Kiv), Venezia F1 (Ven), Emir F1 (Emi) și Moneymaker (Mo) la diferite nivele de inocul (1000, 2500 și 5000 J2) după 55 zile de la inoculare

În cazul lungimii rădăcinilor (Lr) s-a luat în calcul media obținută în ghivecele cu inocul 0 (martor), comparativ cu cele trei nivele de inocul pentru fiecare varietate și specie de Meloidogyne.

Astfel, media indicelui Lr s-a înregistrat la varietatea Moneymaker (17,06 cm) inoculată cu specia Meloidogyne javanica, la toate cele trei nivele de inocul, comparativ cu lotul martor (25 cm).

O diferență notabilă a fost măsurată la varietatea Venezia F1 inoculată cu nivelul mediu de J2 de M. incognita a căror rădăcini au fost de 20 cm comparativ cu lotul standard de 27 cm. Creșteri neînsemnate ale Lt au fost remarcate la varietatea Kiveli F1 inoculată cu specia M. incognita (59,5 cm; 62,2 cm și 63,7 cm), comparativ cu lotul martor (56 cm). Acest fapt neobișnuit s-a datorat cel mai probabil unui IG relativ mic, a unui Fr scăzut și răspunsului favorabil la administrarea îngrășămintelor aplicate.

Deși lungimea și greutatea tulpinilor proaspete au scăzut odată cu creșterea densității inițiale a nematodelor galicole, plantele inoculate cu nivele medii și maxime de inocul (2500, respectiv 5000 juvnenili) au arătat o creștere în greutate a rădăcinilor proaspete.

În ansamblu, indicele Lt, după măsurătorile efectuate a înregistrat o scădere față de loturile martor. Plantele au crescut în medie 21,5 cm la un inocul maxim cu M. javanica, varietatea Moneymaker, față de 45 cm înregistrat la lotul martor.

Varietatea Kiveli F1, la primul nivel de inocul cu M. javanica a înregistrat o neînsemnată scădere în creștere (Lt = 54,5 cm) față de lotul martor (Lt = 56 cm)(figura 3.7.)

Figura 3.7. Influența inoculului (0, 1000, 2500 și 5000 J2) pentru speciileMeloidogyne javanica (Ja) și Meloidogyne incognita (In) asupra lungimii (cm) rădăcinilor și tulpinilor varietăților de tomate Kiveli F1, Venezia F1, Emir F1 și Moneymaker după 55 zile de la inoculare

Rezultatele noastre au arătat diferențe semnificative ale indicelui Gr la plantele cu nivel zero de inocul și cele infestate cu nivel mediu; un exemplu în acest sens a fost întâlnit la varietatea Moneymaker inoculată cu 2500 juvenili, ce a înregistrat o dublare a indicelui Gr(10,7 g) la finalul experimentului, spre deosebire de plantele neinoculate din lotul de control (5g), urmat de varietatea Emir F1 cu o creștere a Gr (9,5 g) la inoculul maxim cu Meloidogyne incognita comparativ cu lotul martor (5 g). La loturile martor rămase neinoculate, Gr a fost în jur de 5-6 g.

Indicele Gt la loturile martor a fost de cca. 9-10 g și nu s-au înregistrat dublări ale acestui indice la niciun nivel de inocul, la nicio varietate de tomate. Cu toate acestea, creșteri ale acestui indice au fost remarcate la varietatea Venezia (cca. 14 g) comparativ cu lotul martor (9 g) în cazul inoculării cu nematodul M. javanica și o creștere ușor mai mare (cca. 16 g) în cazul celor trei nivele de inocul cu nematodul M. incognita.

La celelalte varietăți creșterea indicelui Gt a fost prea puțin evidentă, comparativ cu plantele rămase neinoculate. Astfel, creșteri de 1-2 g au fost înregistrate la majoritatea celorlalte varietăți de tomate inoculate cu ambele specii de Meloidogyne (figura 3.8.).

Figura 3.8. Rezultatul inoculului (0, 1000, 2500 și 5000 J2) pentru speciile Meloidogyne javanica (Ja) și Meloidogyne incognita (In) asupra greutății (g) rădăcinilor și tulpinilor varietăților de tomate Kiveli F1, Venezia F1, Emir F1 și Moneymaker după 55 zile de la inoculare

Toate plantele-gazdă au avut un indice GR considerat sensibil (IG> 2, Fr> 1).

La nivele de inoculare minime, atât cu M. javanica cât și cu M. incognita, varietatea Kiveli F1 s-a dovedit a fi tolerantă (IG ≤ 2, Fr> 1) însă această toleranță este neînsemnată la un nivel minim de inocul, varietatea devenind sensibilă la valori superioare de inocul, corespunzând unei creșteri a populației de nematode.

În condiții de câmp, variațiile temperaturii zilnice, temperatura solului la sfârșitul sezonului de recoltare precum și moartea plantelor-gazdă poate afecta eclozarea și supraviețuirea nematodelor galicole (Wesemael și colab., 2006; Wesemael și Moens, 2008).

Astfel, agresivitatea populației de nematode exprimată la începutului ciclului de cultură următor poate fi diferită de populația “crescută” în spații controlate (Di Vito și Greco, 1988). Pe de altă parte, în sere și solarii atenția trebuie îndreptată către prezența microorganismelor antagoniste din sol, densitatea nematodelor care întodeauna este mai mare și neuniformă, către utilizarea nematocidelor, gestionarea mai riguroasă a factorilor biotici și abiotici în astfel de condiții, iar dinamica nematodelor trebuie evaluată pe perioade mai îndelungate (1-2 cicluri de cultură) (Mc Sorley și Parrado, 1986; Greco și Di Vito, 2009).

Inocularea și evaluarea patogenității speciilor de Meloidogyne se consideră o metodă consumatoare de timp, dar eficientă în același timp (Greco și Di Vito, 2009).

Mai multe studii au arătat că există o relație inversă între populația de nematozi din sol și reproducerea lor în rădăcinile plantei-gazdă. O relație pozitivă există, de asemenea, între densitatea inițială a populației de nematozi și gradul de distrugere provocat plantei (Barker și Olthof, 1976; Schomaker și Been, 2006; Greco și Di Vito, 2009).

Aceste studii au permis estimarea limitei de toleranță, definită ca densitate a populației de nematode la plante, până la momentul în care nu a avut loc o pierdere măsurabilă a randamentului plantei-gazdă și a pragului economic. Evaluarea acestor nivele critice este esențială în dezvoltarea programelor de gestionare a atacurilor nematodelor galicole (Ferris, 1978; Korayem, 2006).

Investigațiile preliminare în spații controlate sunt de preferat pentru speciile predominante de nematode galicole, printre care M. javanica și M. incognita) pentru a constata agresivitatea acesora pe plante-gazde potrivite.

Seinhorst (1965, 1970) a conceput mai multe modele pentru a descrie relația dintre densitățile populațiilor de nematode la plante, randamentuul plantei-gazdă și populația de nematode la recoltare.

Datele publicate sugerează limite de toleranță aproximate la 0,25 ouă/g sol.

Acestă limită este exprimată în funcție de specia de nematode și de planta-gazdă respectivă, ea regăsindu-se la mai multe culturi de legume în experiențe la ghiveci, în condiții controlate (Greco și Di Vito, 2009).

Creșterea densității inițiale a nematodelor a făcut să crească numărul de ouă, J2 și gale/g rădăcini, creșterea fiind mai mare pentru specia de nematozi galicoli Meloidogyne javanica, cu un maxim înregistrat de 10646, 7 juvenili din stadiu J2 + ouă la tratamentul cu un inoculul mediu pentru varietatea Moneymaker, cu peste 120 gale/sistem radicular.

În general, rata de reproducere a nematodului scade o dată cu creșterea densității inițiale, așa cum este relatat în multe studii nematologice anterior publicate (Lindesy și Clayshulte, 1982; Di Vito și colab., 1985a; El-Sherif și colab., 2007).

Acest rezultat s-ar explica prin reducerea cantității de hrană disponibilă raportată la un număr superioar de nematode. Totodată, o mai mare concurență pentru spațiile de alimentare de pe suprafața rădăcinilor face ca densitatea populație de Meloidogyne să scadă.

Deși specia M. javanica a fost depistată și identificată într-o arie relativ redusă (câteva spații protejate din județul Brăila), aceasta trebuie monitorizată sub aspectul continuării și al evaluării patogenității, deoarece gama plantelor-gazdă ar putea fi mai mare.

Specia poate avea un potențial de transmitere pentru terenurile sau spațiile protejate din vecinătate.

Lungimea rădăcinilor pare să fie mai mică la toate nivelele de inocul spre deosebire de rădăcinile plantelor dezvoltate fără a fi inoculate, așa cum au sugerat și alte studii nematologice (Anwar și Van Gundy, 1993; Anwar și McKenry, 2012; Hussain și colab., 2016)

3.4. Concluzii

Aceste cercetări oferă informații importante privind impactul reproducerii populațiilor de nematode galicole prin formarea galelor și a maselor de ouă fiind în strânsă legătură cu nivelul de infestare inițial. Rezultatele din cadrul Laboratorului Regional de Nematologie din Brașov au arătat că dezvoltarea rădăcinilor cu gale se face în detrimentul creșterii părții aeriene, înfloririi și a fructificării plantelor de tomate.

Productivitatea plantelor de tomate scade datorită faptului că infecția cu Meloidogyne spp. face dificilă absorbția produșilor de fotosinteză și a apei intermediul celulelor gigant din interiorul galelor.

Prezența nematodelor galicole în diferite stadii de infestare crește semnificativ severitatea atacului cu boli fungice și bacteriene.

Toate varietățile de tomate luate în studiu (Kiveli F1, Venezia F1, Emir F1 și Moneymaker) s-au dovedit a fi sensibile la atacul cu nematode galicole;

Deși plantele unde nu s-a înregistrat o reproducere a nematodelor din ambele specii (Fr = 0) și fără daune (IG = 0) ar putea fi considerate ca imune, însă o astfel de denumire nu se poate atribui în cadrul experiențelor nostru deoarece procedura nu este suficient de sensibilă; numărul foarte mic de gale sau de mase de ouă pot deveni nedetectabile chiar și la cel mai riguros experiment.

Bibliografie

Agenbag M. 2016. Identification and reproduction potential of South African Meloidogyne species. Dissertation submitted in fulfilment of the requirements fo the degree Master Scientiae in Enviromental Sciences at the Potchefstroom Campus of the North-West University, 105 pp.

Agrios G.N. 1997. Plant Pathology 4th Edition, Academic Press, USA, pp. 217-224.

Ansari T., Asif M., Siddiqui M.A. 2016. Potential of Botanic for Root-knot Nematode Management on Tomato. Lambert Academic Publishing, Germania, pp. 1-14.

Anwar S.A & Van Gundi S.V., 1993. Effect of Meloidogyne incognita on root shoot growth parametres of susceptible and resiatant varietes of tomato. Afro-Asian Journal of Nematology 3: 152-460.

Anwar S.A. & McKenry M.V. 2012. Incidence and population density of plant-parasitic nematodes infecting vegetable crops ad associated yield losses. Pakistan Journal of Zoology 44: 327-333.

Anwar S.A., Trudgill D.L., Phillips M.S. 1994. The contribution of variation in invasion and development rates of Meloidogyne incognita to host status differences. Nematologica 40: 579-586.

Baldwin J. G., Barker K. R. 1970. Host suitability of selected hybrids, varieties and inbreds of corn to populations of Meloidogyne spp. Journal of Nematology 2: 345-350.

Barker K.R. & Olthof T.H.A. 1975. Relationship between nematode population densities and crop responses. Annual Review of Phytopathology 14: 327-353.

Canto-Sáenz M. 1985. The nature of rezistance to Meloidogyne incognita Chitwood, 1949. In: Sasser J.N. & Carter C.C. (Eds.). An Advanced Treatise on Meloidogyne – Biology and Control, Vol. I, Raleigh, North Carolina State University Graphics, USA, pp. 225-231.

Ciofu R., Stan N., Popescu V., Chilom V., Apahidean S., Horgoș A., Berar V., Lauder K.F., Anastasiu N. 2004. Tratat de legumicultură. Editura Ceres, București, pp. 341-391; 603-646.

De Guiran G. & Demeure Y. 1978. Influence du potentiel hydrique des solus sur le masses d’oeufs de Meloidogyne incognita (Nematoda: Meloidogynidae). Revuie de Nématologie 1:119-134.

Di Vito M., Greco N., Carella A. 1985a. Population densities of Meloidogyne incognita and yield of Capsicum anuum. Journal of Nematology 17: 45-49.

Di Vito M., Greco N., Zaccheo G. 1985b. On the host range Meloidogyne artiellia. Nematologia Mediterranea 13: 207-212.

Di Vito M. & Greco N. 1988. Inverstigation on the biology of Meloidogyne artiellia. Revue de Nématologie 11: 223-227.

Dropkin V.H. 1980. Interaction to Plant Nematology. John Wiley and Sons, New York, pp. 293.

El-Sherif A.G., Refaei A.R., El-Nagar M.E., Salem H.M.M. 2007. The role of egg inoculum level of Meloidogyne incognita on their reproduction and host reaction. African Journal of Agricultural Research 2: 159-163.

Ferris H. 1978. Nematode economic thresholds derivation requirements and theoretical consideration. Journal of Nematology 10: 341-350.

Goswami A., Goswami V., Singh B. 2015. Morphological and molecular characterisation of tomato (Lycopersicum esculentul Mill) genotypes. Vegetos India 28(4): 67-75.

Grabner M., & Weidenwber C. 2017. Tomatele, de la pasiune la practică. Editura Casa, Oradea, pp. 100-107.

Greco N., Di Vito M. 2009. Population dynamics and damage levels. In: Perry R., Moens S., Starr J.L. (Eds.). Root-Knot Nematodes. CABI Publisching , Wallingford U.K. pp. 246-274.

Greco N. & Di Vito M. 2009. Population Dynamics and Damage Levels. In: Perry R.N., Moens M. and Starr J.L. (Eds.). Root-knot Nematodes. CAB International, Wallingford, UK, pp. 246-274.

Hooper D.J. 1986. Extraction of free-living stages from soil. In: Southey J.F. (Eds.). Laboratory Methods for Work with Plant and Soil Nematodes. Ministry of Agriculture Fisheres and Food, London, UK, pp. 5-30.

Hussain M., Zouhar M., Rysanek P., Anwar S.A. 2016. Relationship between Meloidogyne incognita density and plant growth okra. The Journal of Animal and Plant Sciences 26(3): 739-744.

Hussey R.S. & Barker K.R. 1973. A comparation of methods of collecting inocula of Meloidogyne spp., including a new technique. Plant Desease Reporter 57: 1025-1028.

Kahan M., R. 2008. Plant Nematodes, Methodology, Morphology, Systematics, Biology and Ecology. Science Publishers, New Jersey, 333 pp.

Kankam F. & Adomako J. 2014. Influence of inoculum levels of root-knot nematodes (Meloidogyne spp.) on tomato (Solanum lycopersicum L.). Asian Journal of Agriculture and Food Science Volume 2.

Kiewnick S., Dessimoz M., Franck L. 2009. Effects of the Mi-1 and N root-knot nematode-resistance gene on infection and reproduction of Meloidogyne enterolobii on tomato and pepper cultivars. Journal of Nematology 41(2): 134-139.

Kinloch R.A. 1982. Galling and yields of soybean cultivars grow in Meloidogyne arenaria infected soils. Journal of Nematology 19: 233-239.

Kleynhans K.P.N. 1991. The root-knot nematodes of South Africa. Departament of Agricultural Development, South Africa. Goverment Printers, Pretoria. Technical Communication nr. 231, 165 pp.

Korayem A.M. 2006. Relationship between Meloidogyne incognita density and damage to sugar beet in sandy clay soil. Egypt Journal of Phytopathology 14: 61-68.

Lambert K.N., Tedfold E.C., Caswell E.P, Williamson V.M. 1992. A system for continous production of root-knot nematode juveniles in hydroponic culture. Phytopathology 82: 512-515.

Lindsey D.L. & Clayshule M.S. 1982. Influence of initial population densities of Meloidogyne incognita on three Chile cultivars. Journal of Nematology 14: 353-358.

Machado Z.C.A., Siquera de Simoes M.K., Filho V.J. 2010. Methods and Techniques in Plant Nematology – A Practical Review on Methods and Techniques in Plant Nematology, VDM Verlag Dr. Müller, pp. 21-37.

Maleita C.M.N., Curtis R.H.C., Powers S.J., Obrantes I.M. De O. 2012. Inoculum levels of Meloidogyne hispanica and M.javanica affect nematode reproduction and growth of tomato genotipes. Phytopathologia Mediterranea 51(3): 566-576.

Manzanilla-López R.H., & Starr J.L. 2009. Interactions with Other Pathogens. In: Perry R.N., Moens M. and Starr J.L. (Eds). Root-knot Nematodes.CAB International, Wallingford, UK, pp. 223-240.

McSorley R. & Parrado J.L. 1986. Relationship between height of kneaf and root galling by Meloidogyne incognita. Nematotropica 16: 205-211.

Ngobeni G.L., Fourie H., Mc Donald A.H., Mashela P.W. 2011. Host suitiability of selected South African maize genotypes to the root-knot nematode species Meloidogyne incognita race 2 and Meloidogyne javanica: A preliminary study. South African Journal of Plant and Soil 28: 49-54.

Nono-Womdim R., Swai I.S., Mrosso L.K., Chadha M.L., Opena R.T. 2002. Identification of root-knot nematode species occuring on tomatoes in Tanzania and resistant lines for thei control. Plant Diseases 86(2): 127-130.

Popescu V. & Zăvoianu R. 2013. Cultura tomatelor, ardeiului și vinetelor. Editura M.A.S.T., București, pp. 5-67.

Prohib C. & Petrache M. 2014. Grădina de legume – ghid pentru combaterea bolilor și dăunătorilor. Editura Ploirom București, pp. 165-169.

Sasser J.N., 1989. Plant Parasitic Nematodes: The Farmer’s Hidden Enemy. North Carolina State University, Raleight, pp. 11-14.

Schomaker C., H. & Been T.H. 2006. Plant growth and population dynamics. In: Perry R. and Maurice M. (Eds). Plant Nematology. CAB International, Wallingford, UK, pp. 275-301.

Seinhorst J.W. 1965. The relationship between nematode density and damage to plants. Nematologica 11: 137-154.

Seinhorst J.W. 1970. Dynamics of populations of plant parasitic nematodes. Annual Review of Phytopathology 8: 131-156.

Singh S. & Khurma U. 2007. Susceptibility of six tomato cultivars to the root-knot nematode Meloidogyne incognita. The South Pacific Journal of Natural Science 13: 73-77.

Stan N., Munteanu N., Stan T. 2003. Legumicultură, vol. III. Editura Ion Ionescu De La Brad, Iași, pp. 10-54.

Taylor A.L. & Sasser J.N. 1978. Biology, Identification and Control of Root-knot Nematodes (Meloidogyne spp.). Departament of Plant Pathology, North Carolina State University and the United States Agency for International Development, University Graphics, NC, USA, 111 pp.

Van Gundy S.D. 1985. Ecology of Meloidogyne spp. – emphasis on environmental factors affecting survival and pathogenicity. In: Sasser J.N., Carter C.C. (Eds.). An Advanced Treatise on Meloidogyne. Volume I: Biology and control. Raleigh NC, USA, North Carolina State University Graphics, pp. 177-182.

Wesemael W.M.L., Moens M. 2008. Quality damage on carrots (Daucus carota L.) caused by the root-knot nematode Meloidogyne chitwoodi. Nematology 10: 261-270.

Wesemael W.M.L., Perry R.N., Moens M. 2006. The influence of root diffusate and host age on hatching of the root-knot nematodes Meloidogyne chitwoodi and M. fallax. Nematology 8: 893-899.

Windham G.L., Williams W.P. 1987. Host suitability of commercial corn hybrids to Meloidogyne arenaria and M. incognita. Annals of Applied Nematology 1: 13-16.

Windham G. L. & Williams W.P. 1988. Reproduction of Meloidogyne javanica on corn hybrids and inbreds. Journal of Nematology 2: 25-28.

Windham G. L. And Williams W.P. 1994. Penetration and development of Meloidogyne incognita in roots of resistant and susceptible corn genotypes. Journal of Nematology 26: 80-85.

⁎

⁎ ⁎

http://www.madr.ro/horticultura/fructe-si-legume.html

CAPITOLUL IV.

Identificarea și caracterizarea principalelor specii de nematode galicole din România prin metode de diagnoză specifice

4.1. Introducere

Atât în cazurile în care observațiile efectuate în câmp au fost îndeajuns de concludente, dar și în situațiile unor suspiciuni ale atacului cu nematode galicole, probele de sol din apropierea rizosferei, radicelele și porțiunile mari din rădăcini, au fost trimise către laborator în vederea analizelor nematologice. O primă etapă din acest set de analize constă în extracția nematodelor fitoparazite, dintre care fac parte și cei din genul Meloidogyne, prin diverse tehnici, corespunzătoare fiecărei etape și a posibilităților de lucru.

Până în anii 1940, metodele de extracție ale nematodelor au fost comune cu cele de extracție a protozoarelor din sol.

Ulterior, în cazul nematodelor, nu se mai aplicau metode de cercetare asupra populației sau clasei, ci tehnici aparte care mergeau până la metode aplicate familiilor de nematode.

Müller (1968) descrie metodele de extracție folosite de Stöckli (1943), Franz (1950) și Volz (1951) care, în cercetările lor, au examinat direct nematode din sol, într-un vas Petri cu puțină apă și cu ajutorul unui stereomicroscop, respectiv a unui microscop de cercetare, folosindu-se de un ac ascuțit, o pensetă ascuțită din oțel sau o pipetă subțire.

Pentru cercetări în serie, selectarea nematodelor din materialul vegetal, prin examinare directă, necesita însă mult timp.

Au apărut, mai apoi, metode automate de extracție a nematodelor din sol.

La aceste metode au contribuit, printre alții, Stefanski (1927), Baermann (1917), Micoletzky (1922), Backlund (1938) , Overgaard – Nielsen (1947) și Renkeon (1949).

Se pare că cea mai răspândită a fost metoda folosită de Stefanski, Baermann și Micoletzky, îmbunătățită de Overgraard – Nielsen, sub îndrumarea lui Kirjanova (1935).

În cazul acestei metode proba de sol se așeza într-o pâlnie, pe o plasă concavă din perlon, cu ochiuri de 1mm. La ieșirea din pâlnie se monta un furtun de cauciuc, prevăzut la un capăt cu o clemă cu o clemă. După ce proba era așezată pe plasă, în pâlnie se introducea apă de jos în sus, până ce proba de sol era acoperită pe jumătate cu apă.

Deasupra probei se instala, la o distanță de 23 cm, o lampă de 16 W ce încălzea proba la cca. 30°C.

Overgaard – Nielsen (1947) dispune aceste piese de extracție într-un dispozitiv, în așa fel încât lămpile se poziționau în capac, marginile pâlniilor în deschizătura superioară, pâlniile pe un fund intermediar prevăzut cu orificii, iar pe fundul dispozitivului se aflau clemele furtunelor din cauciuc și vasele de captare.

Principiul extracției se baza pe faptul că nematodele din probele de sol, sensibile la lumină și căldură, erau reactivate în mișcările lor, prin încălzirea treptată a materialului de cercetare și părăseau, de sus în jos, mediul luminat. Ei se decantau în coloana de apă formată deasupra clemei de pe furtun. După cca. 12 h se încheia separarea automată.

Nemotodele se transferau, cu ajutorul jetului de apă, în vasul de captare iar mai apoi numărați și determinați cu ajutorul unui microscop, respectiv stereomicroscop.

Determinările de la acea vreme au arătat că prin această metodă se extrăgeau până la 90% din nematozii existenți în respeciva probă de sol.

Cu ajutorul acestei metode se putea determina o parte considerabilă a mesostomilor, rotatoriilor și altor nematelminți din proba de sol, însă eroarea în ceea ce privește numărul acestor extracții, din sol către apa adăugată, era mai mare la aceste organisme.

Ronkenon (1949), grăbea migrarea nematodelor prin faptul că agita solul așezat pe plasa de perlon, ceea ce contribuia la desprinderea acestora de particulele de sol. El credea că fără această agitare nematodele nu se desprind, separându-i pe cei activi de cei inactivi.

Nematodele care înainte de cercetare se aflau în stare anabiotică, deveneau mai târziu active. Ronkenon recomanda ca probele de sol să fie menținute în pâlnie chiar și 1-2 săptămâni.

Reisinger (1954) executa preparate microscopice prin strivire, fixate cu tetraoxid de osmiu sau cu ajutorul metodei cu acid acetic și carmin, iar pentru colorația vitală folosea colorantul roșu neutru.

4.2. Materiale și metode

4.2.1. Extracția nematodelor galicole

Extracția nematodelor galicole, ca parte a diagnozei, presupune recuperarea eficientă a cât mai multor stadii de dezvoltare din eșantioanele de sol/rădăcini.

Pentru probele de sol nu este posibilă observarea directă a nematodelor datorită texturii granulare a eșantionului, ceea ce face imposibilă identificarea, chiar și a formelor adulte.

Pentru nematodele fitoparazite reglementate de către Organizația Europeană și Mediteraneană pentru Protecția Plantelor (OEPP), printre care fac parte și cei din genul Meloidogyne, sunt necesare metode standardizate care asigură o recuperare ridicată a nematodelor în condițiile unei eșantionări corecte. Au fost publicare puține rezultate cu privire la eficacitatea metodelor de extracție (Oostenbrink, 1960; Seinhorst, 1965,1988; Coolen și D’Here, 1972; Ayoub, 1980; Southey, 1986; Turner, 1988; Verschoor, 2000; Hooper și colab., 2005; Bulletin OEPP, 2013).

Extracția nematodelor, omorârea, fixarea cu ajutorul fixatorilor, realizarea preparatelor permenente și semipermanente, precum și identificarea morfo-biometrică s-au făcut în cadrul Laboratorului Regional de Nematologie- Brașov și în Laboratorul Central Fitosanitar – Unitatea de Nematologie – Ilfov, cu următoarele echipamente optice: stereomicroscop Leica MZ 9.5 (magnitudine 20x – 40x), microscop stereoscopic NOVEX AP-8 LED binocular (magnitudine 25 x – 40x) și microscop optic Leica DM LB2 (magnitudine 20x – 100x) cu cameră Leica DC300 și softwer procesor de imagine DCF295.

Identificările privind diagnoza prin biologie moleculară au fost făcute în cadrul Instituto per la Protezione Sostenible delle Piante – Bari, Italia, respectiv Laboratoire de la Santé des végétaux, Unite de Nematologie – Le Rheu, Franța.

Chiar dacă metodele de extracție sunt considerate fiabile și supuse testărilor periodice, rămâne aproape imposibil de a determina dacă terenul supus analizei nematologice este liber sau nu de nematode galicole, chiar și atunci când rezultatul analizelor este unul neagativ.

Pentru acest studiu au fost selectate cele mai uzitate tehnici de extracție ale acestui gen de nematode, care au permis recuperarea unui număr cât mai mare de juvenili, masculi și femele, astfel: examinarea directă, pâlnia Baermann/vasul Oostenbrink, incubarea rădăcinilor, digestia enzimatică, flotația și cernerea.

Examinarea directă – metodă simplă ce a presupus plasarea unor porțiuni din rădăcină într-o placă Petri, urmând ca formele larvare și masculii să părăsească fragmentele de țesut vegetal, decantându-se. Ulterior, sedimentul a fost examinat sub un stereomicroscop Leica MZ 9.5, cu magnitudinea de 20x, folosindu-ne de o placă de numărare și de ajutorul unui ac entomologic de disecție.

Pâlnia Baermann/vasul Oostenbrink – metoda a fost introdusă de către Baermann (1917) destinată nematodelor mobile. În versiunea sa inițială proba era învelită într-o țesătură fină, aproape complet îmbibată cu apă, rezultând o recuperare scăzută a nematodelor. Versiunea modificată, cea folosită de către noi, utilizează un coș din inox plus un filtru din hârtie pentru a distribui eșantionul de sol pe o suprafață mai mare (figura 4.1.).

Figura 4.1. Sistem de extracție a nematodelor galicole, din sol sau rădăcini, cu ajutorul pâlniei Baermann – Laboratorul Regional de Nematologie – Brașov (original)

Oostenbrink (1954) a înlocuit pâlnia cu o farfurie, însă această metodă a fost modificată de mai multe ori de către Witehead și colab. (1965) și de către Rodriguez-Kabana (1981) (figura 4.2.).

Figura 4.2. Sistem de extracție a nematodelor galicole cu ajutorul vaselor Oostenbrink, Laboratorul Regional de Nematologie – Brașov (original)

În această tehnică de extracție s-au folosit următoarele materiale:

cuțit și foarfecă de laborator;

pâlnie de sticlă cu Ø 15 cm;

tub de cauciuc atașat de tubul pâlniei, închis cu cleme Mhor;

hărtie de filtru pentru filtrare rapidă;

coș din inox cu Ø 15 cm și ochiuri de 250μ ;

pahar Berzelius de 100ml;

cameră de numărare nematode;

stereomicroscop Leica MZ 9.5;

lame și lamele pentru preparate microscopice;

site de plastic și vase din oțel inoxidabil (pentru metoda Oostenbrink).

Tehnica a presupus îndepărtarea țesuturilor lezate sau putrezite de pe rădăcini, apoi au fost tăiate în piese de 1cm și vortexate într-un blender timp de 30 sec. Suspensia vegetală obținută a fost turnată în hârtia de filtru, plasată în coșul de inox al pâlniei. S-a completat cu apă, astfel încât materialul vegetal să fie acoperit pe jumătate.

Nematodele galicole au părăsit țesutul vegetal macerat prin vortexare, traversând hârtia de filtru, concentrându-se în partea inferioară a pâlniei, după care, au fost colectați, prin deschiderea clemei Mhor, în vasul de colectare (paharul Berzelius). După jumătate de oră s-a îndepărtat supernatantul, iar suspensia obținută a fost trecută printr-o sită de 20μm pentru a reduce volumul de apă.

Examinarea nematodelor s-a făcut într-o placă Petri, după care au fost numărate cu ajutorul camere de numărare.

Incubarea rădăcinilor – metoda este folosită cu succes pentru extracția nematodelor mobile din genul Meloidogyne precum și a altor specii (Bursaphelenchus spp., Radopholus spp., Nacobbus aberrans).

Metoda a fost introdusă de către Young (1954) și modificată mai apoi de Montain și Patrick (1959), care au folosit borcane de sticlă în loc de pungi de polietilenă.

În această tehnică de extracție s-au folosit următoarele materiale:

foarfece de laborator;

cântar electronic ADAM CB 501;

pahar Berzelius de 100 ml;

saci de polietilenă (capacitate 1,5L);

sită nematologică cu ochiuri de 20μm;

stereomicroscop Leica MZ 9.5;

cameră de numărare;

pisetă cu capacitatea de 400ml;

lame și lamele de sticlă.

Rădăcinile au fost spălate de solul aderent, apoi tăiate în piese mici de până la 2 cm. Au fost cântărite câte 10 g rădăcini, umezite și introduse într-o pungă de polietilenă, închisă și incubată timp de trei zile la temperatura camerei. Pe perioada incubației, majoritatea nematodelor (juvenili și/sau masculi) au părăsit rădăcinile.

După trei zile s-au spălat rădăcinile în interiorul pungii, cu ajutorul unui unei pisete, iar apa rezultată s-a colectat într-un pahar Berzelius.

Suspensia de nematozi a fost trecută printr-o sită de 20 μm pentru a reduce volumul de apă. Nematodele au fost numărate într-o cameră de numărare sub un stereomicroscop cu magnitudinea 20 x.Eficacitatea extracției a fost îmbunătățită prin adăugarea de aer, printr-o barbotare fină, cu ajutorul unei pompe de acvariu, o dată pe zi, timp de 30 min.

Digestia enzimatică – metoda are la bază folosirea enzimelor celulolitice și pectinolitice pentru recuperarea stadiilor mobile și imobile ale speciilor de nematode din genul Meloidogyne (figura 4.3.).

Figura 4.3. Aspecte ale tehnicii de extracție enzimatică a nematodelor galicolie (Laboratorul Central Fitosanitar – Unitatea de Nematologie, Ilfov) (original)

Metoda se pretează pentru rădăcinile lemnificate precum și pentru peridermul tuberculilor de cartofi (Kaplan și Davis, 1990; Julio și colab., 2003; Viaene și coab., 2007).

Pentru această metodă s-au folosit următoarele materiale:

cântar electronic ADAM CB 501;

cuțit;

cupe de plastic cu capacitatea de 200 ml;

pH – metru;

incubator;

agitator orbital;

stereomicroscop Leica MZ 9.5, microscop optic Leica DM LB2 ;

cameră de numărare nematode;

lame și lamele pentru preparate microscopice;

site nematologice de 160 μm ,40 μm, respectiv 20 μm;

soluții enzimatice (Pectinex®- 26000 unități poligalactoză/ml; Celluclast® – 700 unități endoglucanază/ml);

soluție tampon fosfat;

soluție de antibiotice (tetraciclină 50 mg + streptomicină 50 mg/ 1L apă).

Procedura a constat în îndepărtarea peridermului tuberculilor de cartofi prin decojire și tăierea rădăcinilor în fragmente mici de până la 2 cm.

S-au transferat 5 g periderm de tuberculi/fragmente de rădăcini într-o cupă de plastic cu capacitatea de 200 ml. S-a adăugat 50 ml soluție enzimatică (10 ml Pectinex®+ 10 ml Celluclast®+ 30 ml soluție fosfat tampon) și 5 ml soluție cu antibiotice. Valoarea pH-ul a fost de 4,5 – 5, prin ajustarea cu soluție tampon fosfat.

Cupele de plastic au fost incubate la 35°C pe un agitator orbital, la 150 rpm, timp de 48 h.

Toate stadiile de nematode s-au extras prin turnarea soluției obținute în trei site nematologice suprapuse, în ordine descrescătoare, (160 μm, 40 μm și 20μm), sub un jet slab de apă, înlăturarea supernatantului și centrifugarea sedimentului rezultat. Nematodele au fost numărate într-o cameră de numărare sub un stereomicroscop, apoi examinate la microscopul optic.

Flotația și sitarea – tehnica a fost introdusă de Cobb (1918), folosită în special pentru nematodele din vasta familie Tylenchidae. Metoda folosește diferențele de mărime, formă și viteză cu care se sedimentează nematodele și particulele de sol, dar vizează și mobilitatea nematodelor.

Pentru acestă metodă s-au folosit următoarele materiale:

găleți cu capacitatea de 5L;

spatulă din plastic;

site nematologice (160 μm, 40 μm și 20μm);

pâlnie Baermann;

stereomicroscop Leica MZ 9.5;

pahare Berzelius de 100 ml, respectiv 500 ml;

cameră de numărare nematode;

sticlă de ceas cu Ø 6 cm;

lame și lamele pentru preparate microscopice.

Metoda de lucru a constat în plasarea a 200 g sol în găleata de 5L și adăugarea a 4L de apă, după care s-a agitat viguros timp de 5 sec. Solul, în suspensie, a fost lăsat să se sedimenteze timp de 45 sec., iar apoi supernatantul a fost turnat peste cele trei site nematologice suprapuse, de 160 μm, 40 μm și respectiv 20 μm. Solul reținut pe sitele de 40 μm și 20 μm au fost transferat, cu ajutorul unei pisete, într-un pahar Berzelius de 500 ml.

Suspensia de sol a fost turnată apoi într-un sistem de extracție tip pâlnie Baermann, cu adăugare suplimentară de apă. După 24 h nematodele au fost colectate într-un pahar Berzelius de 100 ml.

Examinarea nematodelor s-a făcut prin transferul acestora în plăci Petri iar numărarea lor s-a realizat cu ajutorul unei camere de numărare (placă Petri din plastic, cu fundul plat, gravată) (Ravichandra, 2010). Ouălele au fost numărate într-o cameră de numărat Mc Master, compusă dintr-o lamă cu două godeuri cu fund plat, acoperite parțial cu două lame fixe, situate la o anumită distanță de nivelul bazal al godeurilor (Dănculescu, 1981).

Când extractul a presupus o suspensie de nematode în viață, aceasta s-a examinat cât mai repede posibil, deoarece suspensia apoasă se poate deprecia datorită prezenței fungilor și a bacteriilor, dar și mortalității nematodelor (van Benzooijen, 2006).

4.2.2. Omorârea, fixarea, pregătirea nematodelor pentru montare și realizarea preparatelor permanente

Omorârea nematodelor reprezintă primul și cel mai important pas în studiile de diagnoză, ele neputând fi examinate vii datorită mișcărilor ondulatorii, acestea determinând ca imaginile obținute microscopic să apară distorsionate. Omorârea se poate face separat sau în același timp cu fixarea. Când are loc separat, nematodele sunt colectate într-un volum mic de apă, într-o eprubetă, care se scufundă într-o baie de apă la 70-90°C timp de 20-30 sec.

Nematodele omorâte cu apă la 90°C pot suferi denaturări și modificări ale structurilor anatomice, datorită diferențelor de presiune osmotică la care sunt supuse (Grewal, 1990).

Noi am optat pentru omorârea concomitentă cu fixarea, prin adăugarea fixatorului la 70°C, peste o cantitate foarte mică de apă (2-3 picături) în care se găseau nematodele. În acest caz, nematodele au murit în câteva secunde, șocul termic ducând la relaxarea musculaturii acestora.

Pentru a evita distorsionarea și deteriorarea din timpul montării, nematodele au fost fixate cât mai curând după omorâre. Literatura nematologică recomandă diverse formule pentru prepararea fixatorilor (combinații de aldehidă formică, acid acetic glacial, glicerină, acid propionic și trietanolamină) (Bajaj și colab., 2011; Kanwar și colab., 2014).

Pentru acest studiu s-a folosit fixatorul TAF (aldehidă formică 40% 7 ml : trietanolamină 2 ml : apă distilată 91 ml) pentru executarea preparatelor temporare și fixatorul FG (aldehidă formică 40% 8 ml : glicerină 2 ml : apă distilată 90 ml) pentru preparatele permanente.

Au fost evitați fixatorii pe bază de alcool deoarece pot produce contractarea nematodelor.

Montarea nematodelor s-a realizat pe lama de microscop (26 x 76 mm),deasupra căreias-a plasat o lamelă de sticlă rotundă (Ø 19 mm). Unele caractere morfologice importante sunt mai ușor de vizualizat în preparatele proaspăt executate, imediat după omorârea nematodelor, spre deosebire de preparatele permenente.

Pe o lamă de microscop s-au așezat nematodele într-o picătură de fixator FG, iar cu ajutorul uni ac nematologic sau al unei pensule fine, juvenilii sau masculii se aliniază unii lângă alții, verical sau orizontal, în maxim 10 exemplare pe lamă, peste care s-a adăugat o lamelă rotundă de sticlă. A fost șers excesul de fixator, de jur împrejurul lamelelor, apoi s-a sigilat cu lac de unghii incolor (două straturi).

Executarea preparatelor microscopice permanente s-a făcut după modelul anterior descris, dar sigilarea s-a realizat cu inel de parafină.

Inelul de parafină a fost preparat folosind o tub de cupru cu Ø 19 mm, prevăzut cu un mâner din lemn, tub care se încălzește la o flacără, apoi se înmoaie în parafina solidă și se aplică în centrul lamei de microscop, având în mijloc o picătură de soluție fixatoare.

Pentru executarea în bune condiții a preparatelor, s-a folosit un ac nematologic pentru a preveni formarea bulelor de aer. După adăugarea lamelei pe inelul de parafină solidificat, preparatul s-a așezat pe o plită electrică, la 65°C timp de câteva secunde.

Imediat ce parafina solidă s-a topit, nematodele au fost sigilate în fixatorul FG.

Pentru prepararea modelului perineal, femelele au fost extrase cu grijă din rădăcini cu ajutorul unui bisturiu fin și al unui ac de disecție entomologic, apoi fixate 12 h în aldehidă formică 3% și plasate în acid lactic 45%, timp de 30 minute.

Cuticula a fost secționată în zona posterioară cu un ac hipodermic. După secționarea și prelucrarea a 5-10 modele perineale, acestea au fost transferate pe o lamă de microscop avand în mijloc o picătură de glicerină anhidră și apoi sigilate cu inel de parafină după modelul descris mai sus (Franklin, 1962; Taylor și Netscher, 1974; Taylor, 1987; Gerber și Taylor, 1988). Acidul lactic are rolul de a îndepărta structurile/organele care se lipesc de zona cuticulară perineală. Pentru o vizualizare mai bună a modelelor perineale, noi am preferat imersarea, în prealabil, a rădăcinilor cu femele și mase de ouă într-o soluție de Phloxin B (colorant al cuticulei, derivat de fluoresceină), timp de 45 minute (figura 4.4.).

Figura 4.4. Imersarea rădăcinilor de tomate și castraveți în Phloxin B – (A, B); aspectul femelelor (f) pe suprafața galelor (g) – (C) (original)

4.2.3. Identificarea morfo-biometrică a nematodelor galicole

Morfologia nematodelor galicole a fost revizuită de mai mulți autori (Whitehead, 1968; Esser și colab., 1976; Jepson, 1983; Hirschmann, 1985a, 1985b; Kleynhans, 1991; Eisenbach și Triantaphillou, 1991; Karssen, 2002; Karssen și Moens, 2006; Karssen și colab., 2013).

Multe detalii morfo-biometrice sunt importante pentru determinarea speciilor și pentru identificarea relațiilor filogenetice. Observațiile morfologice sunt utile pentru interpretarea interacțiunii nematodelor galicole cu mediul și implicarea acestor fitonematozi în relația plantă-gazdă – parazit. Această ultimă interacțiune ar avea influență asupra morfologiei nematodului.

În derularea ciclului biologic complex, schimbările morfologice pornesc de la zigotul unicelular, vermiform, apoi primul stadiu juvenil larvar (J1) care năpârlește o singură dată, în interiorul oului, devenind juvenil de stadiul doi, infectiv (J2), stadiu care mai târziu eclozează.

Detaliile morfo-biometrice ale nematodelor galicole au importanță majoră în identificarea speciilor, dar și în determinarea funcțiilor fiziologice (Chitwood, 1949; Esser și colab. 1976; Elsea, 1951; Maggenti și Allen, 1960; Bird, 1968a,b, 1969, 1979; Baldwin și Hirschmann, 1975, 1976; Franklin, 1971, 1978 ; Dropkin și Acedo, 1974; McClure și Bird, 1976; Wergin și Endo, 1976; Dropkin și Bird, 1978; Viglierchio, 1979; Wouts, 1979; Shepherd și Clark, 1983; Hirschmann, 1985a).

Cele mai comune caractere morfologice și morfometrice, pentru identificarea și separarea speciilor de Meloidogyne, sunt redate în tabelul 4.1.

Valorile biometrice au fost completate cu indici suplimentari (Jepson, 1983,1987):

n = numărul de specimene luate în studiu;

a = lungimea corpului/diametrul cel mai mare al corpului;

b = lungimea corpului/distanța de la capătul anterior până la capătul posterior al glandei esofagiene;

c = lungimea corpului/diametrul corpului la anus.

Tabel 4.1. Caracteristicile folosite pentru identificarea Meloidogyne spp. (Kleynhans, 1991; Brito și colab. 2004; Hunt și Handoo, 2009; Karssen și colab., 2013)

⁎DGO = deschiderea orificiului glandei esofagiene dorsale

4.2.4. Identificarea nematodelor galicole utilizând metode de biologie moleculară

Pentru identificarea, prin tehnici de biologie moleculară, a nematodelor galicole prezente în România, s-a recurs la analiza PCR convențională, tehnica RAPD și SCAR, urmate de analiza de secvențiere a lui Sanger.

Populațiile speciilor Meloidogyne incognita, M. arenaria, M. hapla și M. javanica au fost identificate morfo-biometric în prealabil și crescute pe plante de tomate în Laboratorul Regional de Nematologie – Brașov.

Reacția de polimerizare în lanț, PCR (polimerase chain reaction), are la bază o tehnologie in vitro care imită capacitate de replicarea a ADN-ului și care constă în generarea rapidă a unor copii multiple a unei secvențe nucleotidice țintă (ADN sau ARN) dintr-o genă de interes sau un patogen specific; produsul amplificat PCR este apoi detectat prin diverse metode. Secvențierea originală a terminației dideoxi necesită o matriță monocatenară.

Secvențierea Sanger este o modificare a procesului de replicare a ADN-ului. Produșii PCR după purificare (cu kit-uri speciale) sunt folosiți ca matrițe pentru secvențiere.

Ampliconii sunt migrați pe gel de agaroză iar benzile sunt extrase sub raze UV prin decupare (Solcan și Sisea, 2012).

Pentru identificarea nematodelor reglementate de către Organizația Europeană și Mediteraneană de Protecția Plantelor, printre care și speciile de Meloidogyne, s-a utilizat o combinație de trei teste: ADNr 18S (subunitatea ribozomală mică SSU), ARNr 28S (subunitatea ribozomală mare LSU) și citocromoxidaza I (gena COI mitocondrială, COI).

Amestecul de reacție s-a bazat pe reactivi Phusion® High-Fidelity (New England Biolabs). Apa a fost deionizată, distilată și liberă de nucleaze.

Amplificarea s-a făcut într-un termociclu PELTIER tip C1000 (Bio-Rad).

Extracția acidului nucleic s-a realizat din juvenili din stadiul J2, plasați în 25μl apă purificată.

ADN-ul a fost extras folosind kit-ul “Single Worm Lysis” (ClearDetections).

Lizatele de nematozi au fost folosite imediat sau depozitate a 20°C până la utilizare.

PCR pentru ADNr 18S – a presupus secvențierea PCR a cca. 1730 pb a ADN-ului ribozomal, subunitatea SSU, este daptată de către Holterman și colab. (2006), utilizând două reacții separate (5’-3’): 988F (CTCAAAGATTAAGCATGC) / 1912R (TTTACGGTCAGAACTAGGG ) (dimensiunea ampliconului cuprinzând primeri de cca. 980 pb) și 1813 F (CTGCGTGAGAGGTGAAAT)/ 2646 R (GCTACCTTGTTACGACTTTT) (primeri de cca. 880 pb). Profilul termociclului: 1 min. La 98°C , 5 x (10 sec. La 98°C, 20 sec. La 45°C, 60 sec. La 72°C), 35 x (10 sec. La 98°C, 20 sec. la 54°C, 60 sec. la 72°C).

PCR pentru ADNr 28S – secvențiază cca. 1000 pb a ADN-ului robozomal 28S (LSU), metodă adaptată de către Holterman și colab. (2008). Profilul termociclului: 1 min. la 98°C, 5x (10 sec. la 98°C, 20 sec. la 45°C și 30 sec. la 72°C), 10 min. la 72°C. S-au folosit seturile de primeri (5’- 3’): 28-81 FOR (TTAAGCATATCATTT AGC GGAGGAA) și 28-1006 REV (GTTCGATTAGTCTTT CGCCCCT).

PCR pentru COI – secvențiere PCR a cca. 447 pb (mărimea ampliconului care include primeri) a genei mitocondriale a subunității citocromoxidazei I

este adaptat de către Hu și colab. (2002). Profilul termociclului: 1 min. la 98°C, 40x (10 sec. la 98°C, 20 sec. la 41°C, 30 sec. la 72°C), 10 min. la 72°C. COI este o regiune de codificare a proteinelor. Perechea de primeri (5’-3’):JB3 (TTTTTTGGGCATCCT GAGGTTTAT) /JB5 (AGCACCTAAACTTAAA ACATAATGAAAATG) (Bulletin OEPP, 2016).

Tehnica RAPD – s-a bazat pe determinarea polimorfismului, la nivel alelic, în ceea ce privește producerea unor produși de amplificare sau lipsa lor, în urma utilizării unui primer oligonucleotidic, într-o poziție care să-i permită realizarea amplificării.

Această varinată a tehnicii PCR nu a necesitat clonarea sau secvențierea ADN-ului, putând detecta mai mulți loci simultan. ADN-ul izolat a fost supus reacției PCR, utilizând primeri oligonucleotidici care hibridizează la secvențele sale complementare.

Secvențele de primeri scurți, împerechiați aleator, sunt folosiți la amplificarea ADN de tip RAPD, rezultând un polimorfism de prezență/absență în gel (Carșai și colab., 2010).

Fragmentele de ADN amplificate prin tehnica PCR-RAPD au fost clonate iar mai apoi, pe baza lor, au fost constituiți primeri specifici care au avut lungimi mai mari decât primerii RAPD. Acest test s-a făcut prin tehnica SCAR (Sequence Characterized Amplified Region). Prin utilizarea primerilor SCAR în reacția PCR, nu s-a rezolvat problema reproductibilității reduse, întâmpinată la markerii RAPD. Obținerea unui marker codominant poate deveni un avantaj, în convertirea markerilor RAPD în markeri SCAR (Giovanelli și colab., 2002). Totuși, markerii SCAR pot manifesta dominață completă când unul sau ambii primeri coincid parțial cu varianța din secvența unui anumit locus. Markerii SCAR dominanți pot fi făcuți deseori codominanți, prin digestia produsului PCR, cu diferite enzime de restricție (Blok și Powers, 2009).

Pentru identificarea nematodelor galicole au fost folosiți primeri specifici PCR ce au amplificat regiuni repetitive ale regiunii secvențiate SCAR. Secvența repetitivă a fost identificată după o analiză a unui grup de izolate ale mai multor specii de Meloidogyne, cu primeri scurți RAPD. Benzile diferențiate au fost izolate, secvențiate, iar primerii specifici proiectați.

Sensibilitatea și specificitatea acestor seturi de primeri variază în funcție de numărul de specii și izolate ce urmează a fi testate (Zijlstra, 2000; Randig și colab., 2002; Blok și Powers, 2009).

Reacția de amplificare SCAR a fost efectuată în 25μl conținând 10Mm tris Ph 9, 1,5Mm MgCl, 50Mm KCl, 200μM pentru fiecare din dATP, d CTP, d GTP și d TTP, 0,5 unități ADN polimerază Taq (Pharmacia), 1-10 ng ADN total. Pentru reacție s-au utilizat primeri Far/Rar pentru concentrația finală de 0,3 μM, primeri Finc/Rinc, primeri Fjav/Rjav în concentrație de 0,24 μM (tabel 4.2.).

Pentru amplificarea SCAR termociclul a fost programat 2 min. la 94°C, 35 x 30 sec. la 94°C, 30 sec. la temperatura de răcire și 1 min. la 72°C.

Temperaturile de răcire au fost de 54°C pentru primerii Finc/Rinc, 61°C pentru primerii Far/Rar și 64°C pentru primerii Fjav/Rjav.

Tabel 4.2.Secvențe de nucleotide ale primerilor folosiți pentru fiecare derivat SCAR provenit de la markerii RAPD (Zijlstra , 2000)

⁎ literele mici reprezintă parte din secvența produșilor de reacție a primerilor RAPD

Analiza de secvențiere prin metoda dideoxi sau Sanger, s-a bazat pe întreruperea controlată a sintezei enzimatice a ADN-ului, amplificat prin PCR.

Etapele secvențierii au fost:

izolarea ADN-ului genomic sau a fragmentului (genei) ce urmează să fie secvențiat,

purificarea ADN-ului izolat;

amplificarea prin PCR a fragmetului de analizat cu primeri specifici, în prezența celor deoxi nucleotidelor (dNTP) marcate fluorescent și a polimerazei;

vizualizarea produșilor de amplificare prin migrarea în gel de agaroză;

purificarea produșilor de amplificare;

secvențierea automată;

citirea secvențelor pe secvența automată;

alinierea secvențelor de pe cele două catene sens și antisens.

Reacțiile de secvențiere încep întotdeauna după ce ADN-ul supus secvențierii a fost inițial amplificat prin reacția PCR, purificat și cuantificat (Coșer și colab., 2006; Carșai și colab., 2010).

4.3. Rezultate și discuții

Globalizarea a făcut să crească foarte mult distanțele de comercializare și, alături de alți factori, a condus la creșterea posibilităților ca patogenii non-indigeni ai plantelor să fie introduși în areale noi (McCullough și colab., 2006).

Introducerea în noi habitate a nematodelor fitoparazite poate afecta diversitatea, productivitatea, precum și funcționarea ecosistemului natural sau agricol (Volvas, 2003).

Materialele provenite din culturi vegetale destinate comerțului pot deveni periculoase când nematodele însoțesc aceste plante destinate comercializării, într-un nou habitat (McCullough și colab., 2006; Trisciuzzi și colab., 2014).

Nicio tehnică de extracție, din cele folosite de noi, nu a permis recuperarea populației de nematode (din sol sau părți din rădăcini) pornind de la o singură probă, decât prin divizarea în fracții mici. Metodele folosite în cadrul Laboratorului Regional de Nematologie Brașov au întrunit două caracteristici:

a) fidelitatea, ce a garantat extracția unei populații constante de nematode galicole, în raport cu populația reală;

b) eficacitatea, condiție indispensabilă pentru punerea în evidență a populațiilor mici, care adesea, s-au aflat la originea suspicinuilor de atac.

În continuare sunt prezentate avantajele și dezavantajele tehnicilor de extracție observate în cursul experimentelor.

Beneficiile aduse de tehnica examinării directe a nematodelor au fost: utilizarea unei cantități mici de apă, spre deosebire de alte metode; totodată, metoda s-a dovedit a fi ieftină, simplă și rapidă.

Dezavantajele observate în acestă tehnică: metoda devine laborioasă în codițiile examinării unui volum mare de probe, iar suspensia ce urmează a fi examintă rămâne “încărcată” cu detritusuri vegetale, diverse animale unicelulare (protozoare flagelate, ciliforme). Uneori materialul vegetal (rădăcinile mai mari) a trebuit rehidratat; totodată, a trebuit evitată expunerea îndelungată a nematodelor împreună cu rădăcinile plantelor (femelele) din cauză că metaboliții plantelor, moartea unor animale unicelulare eucariote aflate în apă, precum și produșii aflați în descompunere pot omorî nematodele.

Metoda de extracție cu ajutorul pâlniei Baermann a scos în evidență următoarele avantaje: suspensia finală rămâne curată, folosirea unei cantități mici de apă, costul redus al metodei iar nematodele sunt recuperate într-o bună proporție din probele mici.

Dezavantajul major a fost acela că metoda rămâne potrivită doar pentru probele de până la 70 – 100 g. Alte dezavantaje observate: tulburarea apei prin creșterea bacteriană excesivă pentru unele fragmente vegetale (cormi, bulbi, tuberculi); moartea nematodelor (în special stadiile J2) prin lipsa oxigenării apei; cu cât proba este mai voluminoasă cu atât recuperarea devine mai slabă.

Cele mai multe nematode au fost recuperate în primele 24 -48 h (în funcție de natura probei – sol sau țesut radicular). Trebuie avut în vedere ca hârtia de filtru să rețină particulele din sol și țesutul vegetal dar să permită totodată trecerea nematodelor.

Dacă proba este lăsată în pâlnie mai mult de 72 h se poate adăuga 0,15 % H2O2, se completează cu apă pentru a mări mobilitatea nematodelor și, prin urmare, creșterea ratei de recuperare.

Stratul în care se așează proba în pâlnia Baermann sau vasul Oostenbrink nu trebuie să fie mai mare de 2 – 5 mm.

Unii autori recomandă utilizarea echipamentelor din plastic sau inox iar tuburile atașate pâlniei să fie din silicon. În acest ultim caz, tubul ar permite o difuzie mai mică a O2, spre deosebire de tuburile de polietilenă, care ar putea duce la asfixia nematozilor (Stoller, 1957).

În cazul incubării rădăcinilor, metoda prezintă avantajul folosirii unui echipament ieftin, iar volumul de muncă este redus.

Dezavantaje observate: perioadă lungă până la obținerea rezultatelor, iar eficacitatea rămâne redusă, spre deosebire de celelalte metode de extracție.

Eficacitatea poate fi îmbunătățită prin folosirea unei pompe de acvariu pentru aerarea probelor sau prin adăugarea a 1 % H2O2.

Extracția nematodelor prin digestie enzimatică prezintă o eficiență ridicată în timp ce nematodele recuperate rămân intacte. De asemenea, metoda folosește o cantitate mică de apă. Dezavantaje observate: datorită incubării timpul de extracție este relativ lung; nu trebuie neglijat nici costul ridicat al enzimelor de extracție.

Timpul de incubare și concentrația enzimelor folosite se poate ajusta în funcție țesutul plantei gazdă (rădăcini, epiderma tuberculilor etc.).

O altă metodă de extracție a fost cea prin flotație și cernere, pentru care au fost observate următoarele avantaje: nu necesită o aparatură elaborată; metoda rămâne simplă și rapidă cu eficacitate mare în recuperarea nematodelor; metoda este versatilă pentru multe genuri ne nematode.

Se pot consemna următoarele dezavantaje: metoda s-a dovedit a fi nepotrivită pentru solul argilos deoarece particulele fine rămân în suspensie, astfel încât extractul final, din vasul de colecatre, apare“încărcat”. De asemenea, metoda are dezavantajul de a fi limitată la 200 g sol pentru fiecare probă supusă extracției.

Pe lângă aceste considerente, eficacitatea metodelor de extracție ale nematozilor galicole, depinde în mare măsură de tipul de sol și de stadiile nematodelor ce urmează a fi extrase. În ansamblu, solurile argiloase și cele cu încărcătură organică ridicată se pretează mai greu extracției nematodelor, spre deosebire de solurile nisipoase, ceea ce ar duce la creșterea volumul de muncă.

După extracție, omorârea nematodelor, montarea și realizarea preparatelor microscopice, s-a luat în calcul mai multe aspecte de diagnoză. Astfel, la femelele mature

s-au observat îngroșari ale cuticulei în regiunea capului și, mai cu seamă, în regiunea posterioară a corpului, unde formează modelul cuticular sau modelul perineal (regiunea ano-vulvară). Forma acestui model este variabilă, de la specie la specie, fiind influențată de diverși factori de dezvoltare (figura 4.5.).

Figura 4.5. Aspecte variate ale modelelor perineale pentru 12 specii de Meloidogyne (♀). A, B: M. arenaria; C, D: M. hapla; E, F: M. incognita; G, H: M. javanica; I: M. acronea; J: M. chitwoodi; K, L: M. enterolobii; M: M. ethiopica; N, O: M. exigua; P: M. fallax; Q, R: M. graminicola; S, T: M. paraniensis (Hunt & Handoo. 2009. Taxonomy, identification and principal species. In: Perry R.N., Moens M., Starr J.L. (Eds.). Root – knot Nematodes. CAB International, Wallingford, UK, pp. 55-97)

În urma observațiilor morfologice au fost constatate următoarele:

Meloidogyne incognita

Specie polifagă, atacă atât mono- cât și dicotiledonatele. Nematodul are o largă distribuție pe plan mondial, oarecum limitată în regiunile temperate (Hunt și Handoo, 2009).

Caracterele morfologice generale sunt redate în figura 4.6.

Figura 4.6. Meloidogyne incognita. A: femelă – regiunea capului și gâtului; B-D: femelă – regiunea anterioară; E: mascul – regiunea anterioară; F-G: mascul – regiunea cozii; H: mascul – câmpurile latelare; I: juvenil infestant (J2) – regiunea anterioară: J: juvenil infestant (J2) – regiunea cozii (Whiteahead, 1968. Taxonomy of Meloidogyne with descriptions of four new species. Transactions of the Zoological Society of London 31, pp. 263-401.); K: modele perineale (♀) (Orton – Williams, 1973. Meloidogyne incognita. In: CIH Descriptions of Plant-parasitic Nematodes, Set 2, nr. 18, Farnham Royal, UK)

Femelele: endoparazite; majoriatatea de formă globuloasă și mai rar piriforme (femelele tinere), anulate (cu două anule) înapoia zonei cefalice; butonii bazali ai stiletului rotunjiți și orientați în lateral; modelul perineal a prezentat un aspect variabil în general, cu un arc dorsal înalt, oval sau rotunjit, cu linii laterale distincte, netede spre sinuoase, marcate de întreruperi drepte, ondulate, singure sau intercalate, continue sau fragmentate; zona perivulvară liberă, fără striuri, cu rare întrepătrunderi între striurile vulvare și cele ale anusului; fasmide neproeminente, având aceeași distanță, între ele, cu înălțimea vulvei; câmpurile laterale distincte iar striurile (dorsale și ventrale) sunt neîntrerupte; verticilul cozii a fost prezent (figura 4.7.).

Figura 4.7.Micrografii ale modelului perineal (A și C); zona anterioară (B) pentru specia Meloidogyne incognita (examinare la microscop optic -obiectivul 40x) (original)

Observațiile noastre, asupra morfologiei modelului perineal, au fost similare cu descrierile anterioare ale unor autori de referință în literatura nematologică (tabel 4.3.).

Tabel 4.3. Meloidogyne incognita – caracterele morfologice ale diagnozei modelului perineal

Aspecte particulare întâlnite: o parte din femele prezentau trei anule, în loc de două, înapoia zonei cefalice; modelele perineale ale acestei specii au prezentat cea mai mare variabilitate; o parte dintre modelele perineale au avut arcul dorsal coborât și rotunjit.

Masculii: migratori; au avut regiunea labială neaplatizată; butonii bazali rotunjiți sau ușor elongați în lateral; capul neaplatizat; au fost vizualizate patru linii laterale; prezența unui singur testicul la majoritatea masculilor examinați; coada se termină rotunjit, fără striuri; fasmidele poziționate anterior cloacei; spiculii ușor curbați; gubernaculul de formă semilunară (figura 4.).

Figura 4.8. Micrografii ale zonei anterioare (A și B) și a zonei posterioare (C) ale masculilor de Meloidogyne incognita (examinare cu obiectivul 40x) (original)

Aspecte particulare întâlnite: câțiva mascului au prezentat două testicule, în loc de unul; au fost prezente buzele laterale la un sigur exemplar examinat, aspect foarte rar observat la masculii acestei specii.

Juvenilii de stadiu J2: butonii bazali ai stiletului sunt proemineți și rotunjiți; hemizonidul se află anterior sau în vecinătatea porului excretor; lungimea cozii a fost mică la majoritatea specimenelor, rotunjită la capătul terminal; rectul cu aspect umflat, ușor observabil la preparatele microscopice proaspăt executate (figura 4.9.).

Figura 4.9. Micrografii ale zonei anterioare (A) și zonei posterioare (B și C) ale juvenililor de stadiu J2 din specia Meloidogyne incognita (examinare cu microscop optic, obiectiv 20x A, respectiv 40x B-C)

Comparativ cu populația tip, descrisă biometric pentru prima oară la noi în țară, de către Romașcu (1977) și în raport cu populația descrisă de către Ravichandra (2014), au fost constatate următoarele:

niciun mascul nu a măsurat 2000 μm în lungime (Ravichandra, 2014), maximum fiind de 1869 μm, cu o medie a lungimii corpului de 1462 μm;

lungimea stiletului a avut un minim de 20 μm și un maxim măsurat de 22 μm, spre deosebire de populația descrisă de Ravichandra (2014), de 24 – 26 μm;

juvenilii supuși observațiilor noastre au avut o lungime a corpului mai mare, de până la 461 μm, spre deosebire de populațiile cu care au fost comparați, 339 μm (Ravichandra, 2014), respectiv 442 μm (Romașcu, 1977);

lungimea cozii juvenililor a avut un maxim de 59 μm la populația luată în studiu și un maxim de 65 μm la populațiile descrise de Romașcu (1977);

oul a măsurat în lungime un maximum de 91 μm, în timp ce populația descrisă de Romașcu a avut un maxim de 97,5 μm.

Ceilalți parametri biometrici, ai tuturor stadiilor de dezvoltare au avut valori apropiate la populațiile luate în studiu, comparativ cu valorile înregistrate de către Romașcu (1977) și Ravichandra (2014). Valorile comparative sunt redate în tabelul 4.4.

Tabel 4.4. Comparații (în μm) ale parametrilor biometrici înregistrate la populațiile de Meloidogyne incognita, cu date descrise în litratura nematologică (media ± deviația standard, minima – maxima)

*DGO = deschiderea orificiului glandei esofagiene dorsale

Meloidogyne arenaria

Specia este cunoscută ca fiind polifagă, atacând atât plantele monocotiledonate cât și celedicotiledonate.

Nematodul este semnalat în regiunile calde, iar în climatul răcoros se întâlnește, mai cu seamă, în spațiile protejate (sere, solarii, răsadnițe) (Hunt și Handoo, 2009).

Caracterele morfologice generale ale acestei specii de nematode galicole sunt redate în figura 4.10.

Figura 4.10. Meloidogyne arenaria. A-D: femelă – regiunea anterioară; E, F: mascul – regiunea anteroară; G: juvenili infestanți (J2) – regiunea anterioară; H: juvenili infestanți (J2) – regiunea cozii (Whiteahead, 1968. Taxonomy of Meloidogyne with descriptions of four new species. Transactions of the Zoological Society of London 31, pp. 263-401); I: modele perineale (♀) (Orton – Williams, 1975. Meloidogyne arenaria. In: CIH Descriptions of Plant-parsitic Nematodes, Set 5, nr. 62, Commonwealth Agricultural Bureaux, Farnham Royal, UK).

Femelele: endoparazite; sidefii – albicioase și piriforme; gâtul, de formă conică, este în aceeași linie cu porțiunea globuloasă a corpului; nu prezintă protuberanță posterioară; orificiul glandei esofagiene dorsale se deschide înapoia butonilor bazali; butonii bazali ai stiletului sunt rotunzi spre ușor alungiți; modelul perineal ovoid transversal cu spații fine între striuri; arcul dorsal este coborât, relativ neted, cu striuri dorasale care coboară brusc către capătul lateral formând “umeri”; partea din apropierea zonei dorsale anale este liberă de striuri, ca și cea perivulvară; liniile laterale sunt bine delimitate, îndepărtate, marcate de joncțiunea striurilor dorsale și cele ventral; fasmidele mult mai spațiate decât lățimea vulvei; porțiunea terminală a cozii nu prezintă verticil distinct (figura 4.11.).

Figura 4.11. Micrografii ale modelului perineal (A,B și C) aparținând speciei Meloidogyne arenaria ( examinare la microscopul optic, obiectivul 40x) (original)

Observațiile asupra caracterelor morfologice ale modelului perineal au avut un grad mare de similitudine cu descrierile anterioare ale unor autori recunoscuți în literatura nematologică (tabel 4.5.).

Tabel 4.5. Meloidogyne arenaria – caracterele morfologice ale diagnozei modelului perineal

Aspecte particulare întâlnite: unele female nu prezentau striuri dorsale care să formeze “umeri” sau aceste striuri erau foarte slab reliefate; rareori au fost observate striuri subțiri, foarte netede sau slab conturate în partea ventrală a modelului perineal; două modele perineale prezentau coadă vericilată, rar întâlnită la modelul perineal al acestei specii.

Masculii: regiunea capului este netedă, iar cea labială este nedelimitată de corp; sunt prezente două anule incomplete în regiunea cefalică; discul labial este rotunjit dând un aspect neted; trecerea de la anulele capului la cele ale corpului se face fără o demarcație; stiletul are un aspect robust, cu butonii bazali relav voluminoși; deschiderea orificiului glandei esofagiene dorsale se face la o distanță mai mare față de baza butonilor bazali (figura 4.12.).

Figura 4.12. Micrografii ale părții anterioare (A și C) și ale părții posterioare la masculii din specia Meloidogyne arenaria (examinare la microscop optic, obiectiv 40x) (original)

Aspecte particulare întâlnite: deși forma și structura anatomică a capului poate constintui un caracter al diagnosticului diferențial între masculii acestor specii, putem aprecia că forma este similară, în mare parte, cu a celorlalți masculi ale speciilor de Meloidogyne; cu toate acestea, dimensiunea specimenelor detectate la noi în țară pare a fi mai mică spre deosebire de masculii descriși în literatura de specialitate.

Juvenilii de stadiu J2: prezintă o coadă de lungime medie spre lungă, iar partea terminală, hialină, este lungă; vârful cozii este rotunjit spre ascuțit; stiletul este moderat de lung; hemizonidul poziționat la nivelul a 1-3 anule de porul extrector (figura 4.13.).

Figura 4.13. Micrografii ale părții anterioare (A) și posterioare (B) ale juvenililor de stadiu J2 din specia Meloidogyne arenaria (examinare la microscopul optic, obiectivul 40x) (original)

Comparativ cu descrierile biometrice ale altor autori, putem aprecia că populația luată în studiu prezintă următoarele diferențe:

lungimea stiletului femelelor a avut un maxim de 16 μm, față de 22,9 μm descrise de Romașcu (1977);

la masculi, lungimi ale corpului de până la 2000 μm au fost semnalate de Ravichandra (2014), în timp ce masculii măsurați de către noi au avut până în 1165 μ;

lungimea stiletului la masculii luați în stiudiu a avut un maxim de 27 μm, spre deosebire de celelalte date biometrice, de 24 μm (Ravichandra, 2014), respective 22,9 μm (Romașcu, 1977);

un maxim al lungimii juvenililor din stadiul J2, de 490 μm, a fost consemnat de către Ravichandra (2014), în timp ce pupulațiile luate în studiu și cele descrise de Romașcu (1977) au avut valori apropiate;

lungimea stiletului la populația descrisă de Romașcu (1977) a fost mai mare (12,2 – 13,3 μm) spre deosebire de valorile consemnate la pupulațiile luate în studiu de către noi (8,5 – 9,8 μm).

Comparativ, celelalte valori biometrice au avut un grad ridicat de similaritate (tabel 4.6.).

Tabel 4.6. Comparații (în μm) ale parametrilor biometrici înregistrate la populațiile de Meloidogyne arenaria cu date descrise în litratura nematologică (media ± deviația standard, minima – maxima)

*DGO = deschiderea orificiului glandei esofagiene dorsale.

Meloidogyne hapla

Specia atacă îndeosebi plantele monocotiledonate. Nematodul este comun în ariile temperate și la altitudinile înalte ale zonelor tropicale (Hunt și Handoo, 2009).Caracterele morfologice generale, ale acestui nematod cu largă răspândire, sunt redate în figura 4.14.

Figura 4.14. Meloidogyne hapla. A, B: femelă – regiunea anterioară; C: femelă întreagă; D: mascul – regiune anterioară; E: mascul – câmpuri laterale; F: mascul – coadă; G: juvenil infestant (J2) – regiune anterioară; H: juvenil infestant (J2) – câmpuri laterale; I: juvenil infestant (J2) – regiunea cozii (Whiteahead, 1968. Taxonomy of Meloidogyne with descriptions of four new species. Transactions of the Zoological Society of London 31, pp. 263-401); J: modele perineale (♀) (Orton – Williams, 1974. Meloidogyne hapla. In: CIH Descriptions of Plant-parsitic Nematodes, Set 3, nr. 31, Commonwealth Agricultural Bureaux, Farnham Royal, UK).

Femelele: endoparazite; corpul piriform, albicios și fără protuberanță în partea terminală; stiletul prezintă butoni bazali relativ mici, rotunjiți; în zona cefalică sunt prezente două anule; hemizonidul este situat anterior de porul excretor; porul excretor este situat la cca. 15-18 anule înapoia zonei cefalice; modelul perineal are formă generală circulară, cu striuri netede spre ușor ondulate; uneori striurile ventrale se extind în lateral, pe una sau ambele părți formând “aripi” ce întâlnesc striurile ventrale într-un unghi drept; striurile laterale sunt slab marcate (mici și neregulate); se remarcă punctuații distincte între zona anterioară a modelului perineal și coadă; fasmidele sunt larg poziționate una față de cealaltă; verticilul cozii a fost absent (figura 4.15.).

Figura 3.15. Micrografii ale modelului perineal (A,B și C) aparținând speciei Meloidogyne hapla (examinare la microscopul optic, obiectivul 40x) (original)

Descrierile observate de către noi au fost în concordanță cu caracterele morfologice ale modelului perineal consemnate de către alți autori (tabelul 4.7.)

Tabel 3.7. Meloidogyne hapla – caracterele morfologice ale diagnozei modelului perineal

Aspecte particulare întâlnite: cuticula unor female o fost obsevată ca fiind mult îngroșată în partea posterioară a corpului; la câteva modele perineale s-au observat câmpuri laterale întrerupte, estompate sau slab vizualizate.

Masculii: au prezentat zona cefalică nedemarcată de corp, cu aspect de trunchi de con; înapoia zonei cefalice se află 1-2 anule; hemizonidul se află la cca. 40-50 anule înapoia zonei cefalice și la 4-5 anule de porul excretor; stiletul este subțire, cu butoni bazali rotunjiți, nedetașați prea mult de baza stiletului; aspectul terminal al cozii este rotunjit; spiculii sunt relativ mici; gubernaculum de formă semilunară, cu îngroșare mai evidentă în partea proximală și subțiat în capătul distal (figura 4.15.)

Figura 4.15. Micrografii ale părții anterioare (A și C) și ale părții posterioare la masculii din specia Meloidogyne hapla (examinare la microscop optic, obiectiv 40x) (original)

Aspecte particulare întâlnite: masculii au fost prezenți în număr mare în multe populații și absenți în alte populații.

Juvenilii de stadiu J2: regiunea capului netedă, rotunjită; butonii bazali ai stiletului sunt mici, rotunjiți; hemizonidul situat anterior de porul excretor; zona hialină a cozii ușor boselată, având formă generală neregulată; coada se termină fin, rotunjită (figura 3.16.).

Figura 4.16. Micrografii ale părții anterioare (A) și posterioare (B și C) ale juvenililor de stadiu J2 din specia Meloidogyne hapla (examinare la microscopul optic, obiectivul 40x) (original)

În urma comparării parametrilor biometrici, putem aprecia că populația luată în stiudiu prezintă următoarele diferențe:

se remarcă lungimea stiletului mai mare (13,5 – 15,5μm) la populația de female luate în studiu spre deosebire de populațiile descrise de Romașcu (1977) (12,2 – 13,3μm).

lungimea corpului masculilor a fost mai mare la populțiile luate în studiu de către noi, cu un maximum de 1869 μm, spre deosebire de populațiile descrise de Romașcu (1977) care au avut un maximum de 1432,2 μm;

aceeași diferență a fost observată și în cazul lungimii corpului juvenililor de stadiu J2 la populația luată în studiu (441 – 461 μm), față de populația descrisă de Romașcu (1977) (338,5 – 359,4 μm);

lungimea oului embrionat a fost mai mică la populațiile descrise de Romașcu (1977) (68,9 – 79,4 μm), comparativ cu populațiile examinate în acest studiu (80 -91 μm).

Celelalte măsurători biometrice, observate la populațiile luate în studiu de către noi, nu au pus în evidență prezența unor diferențe semnificative la specia Meloidogyne hapla (tabel 4.8).

Tabel 4.8. Comparații (în μm) ale parametrilor biometrici înregistrate la populațiile de Meloidogyne hapla, cu date descrise în litratura nematologică (media ± deviația standard, minima – maxima)

*DGO = deschiderea orificiului glandei esofagiene dorsale

Meloidogyne javanica

Specie polifagă, atacă atât plantele monocotiledonate cât și cele dicotiledonate.

Nematodul este larg răspândit la nivel mondial, limitat la culturile protejate din zonele temperate (Hunt și Handoo, 2009). Caracterele morfologice generale ale acestei specii sunt redate în figura 4.17.

Figura 4.17.Meloidogyne javanica. A: femelă – regiunea capului și gâtului (vedere laterală); B: mascul – regiunea anterioară; C: juvenil infestant (J2) – regiunea anterioară; D: juvenil infestant (J2) – regiunea cozii; E: femele întregi (Jepson, 1987. Identification of Root-Knot Nematodes (Meloidogyne species). CAB International, Wallingford, UK, pp 57-246); F: modele perineale (♀) (Orton Williams, 1972. Meloidogyne javanica. In: CIH Descriptions of Plant-parsitic Nematodes, Set 1, nr. 3, Commonwealth Agricultural Bureaux, Farnham Royal, UK).

Femelele: endoparazite; piriforme, albicioase; fără protuberanță în partea terminală a corpului; gâtul ușor proeminent, în formă de cârjă; stiletul este subțire, ușor curbat, cu butoni bazali mici, rotunjiți; se disting 1-2 anule înapoia zonei cefalice; porul excretor situat în zona capului, la aproximativ trei lungimi de stilet; modelul perineal este ovoid dorso-ventral, uneori aplatizat mult dorsal; striurile sunt spațiate apropiat, fine, continue, marcate spiralat și neregulat în zona cozii; câmpurile laterale sunt bine conturate, se întrepătrund, împărțind în mod clar modelul dorsal de cel ventral; arcul dorsal poate fi coborât sau ușor înălțat; câmpurile laterale devin slab vizualizate, la distanță de capătul terminal al cozii; regiunea perivulvară fără striuri la marea majoritate a modelelor perineale; fasmidele sunt mai apropiate sau la fel de late ca și înălțimea vulvei; coada este mică, verticilată (figura 4.18.).

Figura 4.18.Micrografii ale modelului perineal (A,B și C) aparținând speciei Meloidogyne javanica (examinare la microscopul optic, obiectivul 20 x A, 40x B și C) (original)

Caracterizarea modelului perineal, urmărind anumiți parametri de diagnoză, s-a făcut în acord cu descrierile semnalate de către alți autori cunoscuți în literatura nematologică (tabel 4.9).

Tabel 4.9.Meloidogyne javanica – caracterele morfologice ale diagnozei modelului perineal

Aspecte particulare întâlnite: deși regiunea perivulvară nu prezintă striuri în mod obișnuit, la unele modele perineale au fost observate striuri transversale, fine, între vulvă și anus, formând un model, în care centrul striurilor se află în zona central-terminală a cozii.

Masculii: prezintă zona capului nedelimitată de cea corpului, cu anule din ce în ce mai proeminente antero-lateral; glanda esofagiană este ușor suprapusă peste intestin, pe o distanță scurtă, ventral; câmpurile laterale prezente, cu patru incizuri; butonii bazali ai stiletului sunt rotunjiți, neproeminenți; valvele bulbului esofagian sunt relativ mari; hemizonidul este situat la 2-4 anule, anterior de porul excretor; porul excretor este distinct; coada cu aspecte mai variabile spre deosebire de masculii celorlalte specii, rotunjită, ventral; partea terminală a cozii se prezintă fin striată; organele copulatoare ușor curbate, cu o proeminență ventrală și vârfuri drepte; fasmidele situate la nivelul cloacei sau poziționate ușor anterior; gubernaculum este fin, semilunar (figura 4.19.).

Figura 4.19. Micrografii ale părții anterioare (A și C) și ale părții posterioare la masculii din specia Meloidogyne javanica (examinare la microscop optic, obiectiv 20x A și B, obiectiv 40x C) (original)

Aspecte particulare întâlnite: câțiva dintre masculii examinați prezentau două testicule, în loc de un singur testicul, dar și testicule atrofiate sau parțial dezvoltate; totodată, au fost observate și alte forme intersexuate reprezentate printr-o colacă ușor umflată sau chiar prezența unei vulve; unii masculi au fost extrași odată cu examinarea directă sau cu disecția femelelor din rădăcini și nu din sol, așa cum ne-am fi așteptat; de menționat că mulți masculi au fost observați ca fiind inacivi sexual, ceea ce denotă o întrerupere a parcursului lor în dezvoltare.

Aceaste “anomalii” ar corespunde cu posibila transformare în female, descrisă la speciile de Meloidogyne, de către Papadopoulou și Triantafillou (1982).

Juvenilii de stadiu J2: prezintă zona capului nedelimitată de cea a corpului; zona cefalică cu aspect de trunchi de con (vedere laterală); prezintă trei anule înapoia zonei cefalice; butonii bazali ai stiletului neproeminenți, rotunjiți; coada are aspect fin, terminată rotunjit, boselată în partea teriminală (2-4 anule); rectul cu aspect umflat; hemizonidul este situat la cca. 2-3 anule în imediata deschidere a porului excretor, anterior (figura 4.20.).

Oul: s-au observat variații frecvente, atât în ceea ce privește dimensiunile cât și detaliile de structură internă, în raport cu fazele de dezvoltare. Majoritatea ouălelor au fost observate în matrixul gelatinos, neoperculate, în stadiul preembronar (figura 4.20.D).

Figura 4.20. Micrografii ale juvenililor infestanți (J2): regiunea cozii (A,B și C); ouă conținând celule vitelogene, stadiu preembrionar (D) (original)

Comparând valorile biometrice ale populațiilor luate în studiu cu cele înregistrate de către alți autori, s-au putut constata următoarele aspecte:

lungimea corpului femelelor nu a depășit 800 μm și nici lățimea de 580 μm, precum pupulațiile descrise de Orton-Williams (1972);

lungimea corpului masculilor a fost mai mare la populația luată în studiu, până în 1686 μm, față valorile populațiilor cu care au fost comparate, de 1298 μm ale lui Orton-Williams (1972), respectiv 1440 μm descrise de Ravichandra (2014);

spiculii masculilor au înregistrat valori biometrice mai mari la populația luată în studiu (35,5 μm), spre deosebire de populațiile descrise de Ravichandra (2014) (maximum 31 μm) și populațiile descrise de către Orton-Williams (1872) (maximum 30,7 μm);

valoarea biometrică c a fost mai ridicată (maximum 224 μm) la populația luată în studiu, față de valoarea măsurată biometric către de Orton-Williams (1972) (maximum 144 μm).

Biometria specie Meloidogyne javanica detectată la noi în țară este similară cu cea descrisă în alte țări. Valorile sunt compartate cu cele ale altor autori, care au detaliat și măsurat cei mai importanți indicatori ai diagnozei biometrice (tabel 4.10.).

Tabel 4.10. Comparații (în μm) ale parametrilor biometrici înregistrate la populațiile de Meloidogyne javanica luate în studiu, cu date descrise în litratura nematologică (media ± deviația standard, minima – maxima)

*DGO = deschiderea orificiului glandei esofagiene dorsale

În investigațiile de identificare a nematodelor galicole prin metode de biologie moleculară, în urma reacției PCR-SCAR cu folosirea primerilor specifici, s-a constatat că specia Meloidogyne arenaria este sensibilă la primerii Far/Rar, specia Meloidogyne incognita are sensibilitate pentru primerii Finc/Rinc (probele codate MiN22 și MiN28), specia Meloidogyne javanica sensibilă pentru primerii Fjav/Rjav, în timp ce specia Meloidogyne hapla reacționează pozitv la primerii Fh/Rh (tabel 4.11).

Tabel 4.11. Rezultatele reacției PCR pentru Meloidogyne arenaria (MaN1-MaN7), Meloidogyne incognita (MiN22 – MiN29), Meloidogyne javanica (MjN15 – MjN21) și Meloidogyne hapla (MhN8-MjN14)

*negativ – datorită conservării inadecvate a nematodelor până la executarea analizei sau datorită unei sensibilități ridicate în timpul reacției PCR

Analizele de secvențiere și reconstrucție filogenetică au fost efectuate pentru a identifica secvențele cele mai apropiate ale nematodelor galicole, utilizând analiza BLAST NCBI (nasic Local Alignment Search Tool / National Center for Biotechnology Information), cu secvențe obținute pentru trei gene țintă diferite (SSU1, SSU2 și COI).

Au fost analizate rezultatele prin BLAST NCBI pentru secvențele care au produs alinieri semnificative (scoruri totale/maxime și perechi de identități/similitudini).

Rezultatele au fost concludente pentru specia Meloidogyne hapla și mai puțin concludente pentru speciile M. incognita, M. arenaria și M. javanica. Compararea secvențelor obținute cu secvențele disponibile în baza de date NCBI și Qbanck a scos în evidență faptul că cele mai mari scoruri de similitudine ale secvențelor sunt la același nivel pentru mai multe specii de nematode galicole (incluziv pentru Meloidogyne ethiopica), fiind dificil de precizat originea speciilor M. arenaria, M. incognita și M. javanica de pe teritoriul României (figura 4.21.).

Figura 4.21. Alinierea secvențelor țintă (SSU1 – MhN9, MhN10, MhN12, MhN13; SSU2 –MhN8, MhN12, MhN14; COI – MhN8, MhN13, MhN14) analizate pentru specia Meloidogyne hapla

Figura 4.21. Alinierea secvențelor țintă (SSU1 – MhN9, MhN10, MhN12, MhN13; SSU2 –MhN8, MhN12, MhN14; COI – MhN8, MhN13, MhN14) analizate pentru specia Meloidogyne hapla

Figura 4.21. Alinierea secvențelor țintă (SSU1 – MhN9, MhN10, MhN12, MhN13; SSU2 –MhN8, MhN12, MhN14; COI – MhN8, MhN13, MhN14) analizate pentru specia Meloidogyne hapla

Figura 4.21. Alinierea secvențelor țintă (SSU1 – MhN9, MhN10, MhN12, MhN13; SSU2 –MhN8, MhN12, MhN14; COI – MhN8, MhN13, MhN14) analizate pentru specia Meloidogyne hapla

Figura 4.21. Alinierea secvențelor țintă (SSU1 – MhN9, MhN10, MhN12, MhN13; SSU2 –MhN8, MhN12, MhN14; COI – MhN8, MhN13, MhN14) analizate pentru specia Meloidogyne hapla

În cazul materialului genetic al speciei Meloidogyne hapla rezultatul este mult mai specific pentru cele trei subunități țintă (figura 4.22.)

Figura 4.22.Alinierea secvențelor țintă (SSU1 – MhN9, MhN10, MhN12, MhN13; SSU2 –MhN8, MhN12, MhN14; COI – MhN8, MhN13, MhN14) analizate pentru speciileMeloidogyne incognita, M. arenaria și M. javanica.

Figura 4.22.Alinierea secvențelor țintă (SSU1 – MhN9, MhN10, MhN12, MhN13; SSU2 –MhN8, MhN12, MhN14; COI – MhN8, MhN13, MhN14) analizate pentru speciileMeloidogyne incognita, M. arenaria și M. javanica.

Figura 4.22.Alinierea secvențelor țintă (SSU1 – MhN9, MhN10, MhN12, MhN13; SSU2 –MhN8, MhN12, MhN14; COI – MhN8, MhN13, MhN14) analizate pentru speciileMeloidogyne incognita, M. arenaria și M. javanica.

Figura 4.8. Arborele filogeneric al secvenței regiunilor D2-D3 și ITS a ARNr care includ speciile luate în studiu în România (M. incognita, M. hapla, M. arenaria și M. javanica) alături de secvențele speciilor de Meloidogyne disponibile în NCBI

3.4. Concluzii

Rezultatele experimentelor realizate în scopul detectării și identificării speciilor de Meloidogyne prezente în România, prin diverse tehnici de diagnoză, permit formularea următoarelor concluzii:

Datorită manifestărilor nespecifice, principala parte a diagnozei revine laboratorului.

În diagnoza nematodelor aparținând genului Meloidogyne, femelele au fost întotdeauna identificate în interiorul rădăcinilor (sedentare), masele de ouă adesea sparte la suprafața galelor, în timp ce masculii și juvenili au fost identificați în apropierea rădăcinilor sau liberi în sol.

Dimorfismul sexual este foarte accentuat la speciile de Meloidogyne, neexistând stadiul de chist; morfologic, gâtul este proeminent în cazul femelelor și este absent în cazul masculilor; porul excretor la female este situat opus sau anterior bulbului median, în timp ce la mascul se poziționează anterior bulbului median; în schimb, forma butonilor bazali la mascul este similară cu cea de la femelă.

Cu toate că modelul perineal reprezintă punctul de plecare în diagnoza acestui gen de nematode, prezența variabilității printre modelele perineale ale femelelor aceleiași specii și compararea lor cu descrierile altor autori ar putea reprezenta un factor limitativ în acuratețea identificării speciei respective, doar pe baza caracterelor modelului perineal.

În funcție de echipamentul de extracție disponibil, sunt posibile modificări ale metodelor atât timp cât acestea rămân în conformitate cu protocoalele de diagnoză europene și cu regulamentele internaționale asociate nematodelor supuse carantinei fitosanitare (Meloidogyne chitwoodi, M. fallax, M. enterolobii, M. mali, Radopholus similis, Xiphinema rivesi, Bursaphelenchus xylophilus, Globodera rostochiensis, G. pallida, Aphelenchoides besseyi); astfel de modificări pot include parametri precum viteza de amestecare, viteza de centrifugare și durata acesteia, precum și dimensiunea ochiurilor sitelor nematologice de extracție.

În diagnoza nematologică a genului Meloidogyne pot apărea erori de interpretare în cursul examinării stadiilor preadulte, astfel elementele nematologice de pasaj (spori și peri vegetali, ouă, chiști, oochiști ai diverșilor nematode saprofite) pot simula ouăle aproape embrionate sau juvenilii morți.

Din punct de vedere morfologic, modelul perineal al femelei, structura cefalică și a cozii masculului rămân cele mai concludente elemente care completează diagnoza; dilatația rectului a fost observată la majoritatea juvenililor din stadiul J2 al tuturor speciilor de nematode galicole, la preparatele proaspăt executate și, din acest motiv, considerăm că acesta poate fi un caracter de diagnostic suplimentar; în preparatele permanente dilatația rectului tinde să fie estompată și chiar mai greu de vizualizat; au fost sintetizate datele din literature nematologică privind identificarea genului Meloidogyne din România, completându-le cu rezultatele personale obținute în cadrul Laboratorului Regional de Nematologie – Brașov și Laboratorului Central Fitozanitar, Unitatea de Nematologie – Ilfov, reușind să punem la dispoziția specialiștilor chei de teterminare a patru specii de Meloidogyne (M. incognita, M. hapla, M. arenaria și M. javanica), absolut necesare practicienilor în acest domeniu de studiu.

Specia Meloidogyne javanica a fost pentru prima oară detectată și identificată în România în țară; caracteristicile morfologice, biometrice și idetificarea prin biologie moleculară constintuie un punct de plecare în depistarea altor specii aparținând acestui gen.

Bibliografie

Ayoub S.M. 1980. Plant Nematology. An Agricultural Training Aid. NemaAid Publication, Sacramento, CA, United States of America, 195 pp.

Backlund H. 1938. Eine Methode zur quantitativen Underschuchung der Mikrofauna in Moos, Förna, Trift u. dgl. Sowe einige vorläufige Ergebnisse mit dieser Methode. Mem. Soc. Fauna et Flora, nr 14.

Baermann G. 1917. Eine einfache Methode zur Auffindung von Ankylostomum (Nematoden) Larven in Erdproben. Geneesk. Tijdschr. Nem.-Indië 57, pp. 131-137.

Bajaj H.K., Kanwar R.S., Gupta D.C. 2011. Handbook of Practical Nematology. Scientific Publishers, Jodhpur, India, pp. 100 – 140.

Baldwin J.G. & Hirschmann H. 1975. Body wall fine structure of the anterior region of Meloidogyne incognita and Heterodera glycines. Journal of Nematology 8: 1-17.

Baldwin J.G. & Hirschmann H. 1976. Comparative fine structure of stomatal region of males of Meloidogyne incognita and Heterodera glycines. Journal of Nematology 8: 1–17.

Bird A.F.1968a.Changes associated with parasitism in nematodes. III. Ultrastructure of the egg shell, larval cuticle, and contents of the subventral esophageal glands in Meloidogyne javanica, with some observations on hatching. Journal of Parasitology 54: 475–489.

Bird A.F. 1968b. Changes associated with parasitism in nematodes. IV. Cytochemical studies on the ampulla of the dorsal esophageal gland of Meloidogyne javanica and on exudations of the buccal stylet. Journal of Parasitology 54: 879–890.

Bird A.F. 1979. Ultrastructure of the tail region of the second-stage preparasitic larva of the root-knot nematode. International Journal of Parasitology 9: 357–370.

Blok V.C. & Powers T.O. 2009. Biochemical and Molecular Identification. In: Perry R.N., Moens M., Starr J.L. (Eds.). Root – knot Nematodes. CAB International, Wallingford, UK, pp. 98-138.

Brito J., Powers T.O., Mullin P.G. Inserra R.N., Dickson D.W. 2004. Morphological and molecular characterization of Meloidogyne mayaguensis isolates from Florida. Journal of Nematology 36: 232-240.

Bulletin OEPP/EPPO Bulletin. 2013. PM 7/119 (1) Nematode extraction. Vol. 43. pp. 471-495.

Bulletin OEPP/EPPO Bulletin. 2016. PM 7/129 (1) DNA barcoding as an identification tool for a number of regulated pests. Vol. 46, pp. 501-537.

Carșai T.C., Vlaic A., Coșier V., Bâltean A.V. 2010. Cercetări privind polimorfismul la locusul genei leptinei în scopul aplicării selecției asistate de markeri genetici la taurine. Editura Bioflux, Cluj, pp 11-30.

Chitwood B.J.1949. Root-knot nematodes – Part I. A revision of the genus Meloidogyne Goeldi1887. Proceedings of the Helminthological Society of Washington nr. 16, pp. 90–104.

Cliff G.M. & Hirschmann H. 1985. Evaluation of morphological variability in Meloidogyne arenaria. Journal Nematology 17: 445-459.

Cobb N.A. 1918. Estimating the nema population of the soil. Agric. Tech. Circ. Bur. Pl. Ind. U.S., Departament Agriculture. nr 1.

Coolen W.A. & D’Here C.J. 1972. A method for the quantitative extraction of nematodes from plant tissue. State Agriculture Research Centre, Ghent, Belgia, pp.77.

Coșer V., Vlaic A., Oroian T., Dărăban S., Carșai C. 2006. The use of genome walking method for finding unknown sequence of genomic DNA. Lucrări Științifice Zootehnie și Biotehnologii – Timișoara, volum 39(1): 23-28.

Dănculescu P. 1981. Laboratorul clinic – Parazitologie. Editura Medicală, București, pp. 11-90.

Dropkin V.H. & AcedoJ. 1974. An electron microscopic study of the glycogen and lipid in female Meloidogyne incognita (root-knot nematode). Journal of Parasitology 60: 1013–1021.

Dropkin V.H., Bird A.F. 1978. Physiological and morphological studies on secretion of a protein – carbohydrate complex by a nematode. International Journal of Parasitology 8: 225–232.

Eisenback J.D. & Hunt D.J. 2009. General morphology. In: Perry R.N., Moens M., Starr J.L. (Eds.). Root – knot Nematodes. CAB International, Wallingford, UK, pp. 18-54.

Eisenback J.D. & Triantaphillou H. 1991. Root-knot Nematodes: Meloidogyne Species and Races. In: Nickle W.R. (Eds.). Manual of Agriculture Nematology. Dekker, New York, pp. 191-274.

Elsea J.R.1951. The histological anatomy of the nematode Meloidogyne hapla (Heteroderidae). Proceedings of the Helminthological Society of Washington 18, pp. 53–63.

Esser R.P., Perry V.G., Taylor A.L. 1976. A diagnostic compendium of the genus Meloidogyne (Nematoda: Hereoderidae). Proceedings of the Helminthological Society of Washinton. 43: 138-150.

Esser R.P., PerryV.G., Taylor A.L.1976. A diagnostic compendium of the genus Meloidogyne (Nematoda: Heteroderidae). Proceedings of the Helminthological Society of Washington 43, pp.138–150.

Eyualem A. & Blaxter M. 2003. Comparation of biological, molecular and morphological methods of species identificationin a set of cultured Panagrolaimus isolates. Journal of Nematology 35(1):119.

Franklin M.T. 1962. Preparation of the posterior cuticular patterns of Meloidogyne spp. for identification. Nematologica. 7: 336-337.

Franklin M.T. 1978. Meloidogyne. In: SoutheyJ.F. (Eds.) Plant Nematology. HerMajesty’s Stationery Office, London, UK, pp.98–124.

Franz H. 1950. Qualitative and quantitative Untersuchungsmethoden in Biozönotik und Ökologie. Acta Biotheoretica 9(3): 101-104.

Gerber K. & Taylor A.L. 1988. Asimple techniques for mounting whole root-knot nematode females. Journal of Nematology 20:502-503.

Giovanelli J.L., Farnhann M.W., Wang M., Allen E. 2002. Development of sequence characterized amplified region (SCAR) markers linked to down mildew resistance in broccoli. Proceeding of 13th Crucifer Genetics Work-shop, March 23-26, Davis, CA, p.84.

Grewal P.S. 1990. The use of agar as a cover-glass support for mounting nematodes. Revue Nematologie 13(1): 121-122.

Hirschmann H., 1985a.The classification of the family Meloidogyne. In: Sasser,J.N. & CarterC.C. (Eds). An Advanced Treatise on Meloidogyne. Volume I. Biology and Control. A cooperative publication of the Department of Plant Pathology and the United States Agency for International Development, North Carolina State University Graphics, Raleigh, North Carolina, SUA, pp. 35–45.

Hirschmann H. 1985b. The genus Meloidogyne and morphological characters differentiating its species. In: SasserJ.N. & Carter C.C.(Eds.). An Advanced Treatise on Meloidogyne. VolumeI. Biology and Control. A cooperative publication of the Department of Plant Pathology and the United States Agency for International Development, North Carolina State University Graphics, Raleigh, North Carolina, SUA, pp. 79–93.

Holterman M., Holovachov O, Van den Elsen S., Van Megen H., Bongers T., Bakker J. 2008. Small subunit ribosomal DNA-based phylogenity of masal Chromadoria (Nematoda) suggests that transitions from marine to terrestrial habitats (and vice versa) require relatively simple adaptations. Molecular Phylogenetics and Evolution 48: 758-763.

Holterman M., Van der Wurff A., Van der Elsen S., Van megen H. Bongers T., Holovachov O. 2006. Phyllum-wide analysis of SSU rDNA releavs deep phylogenetic relationships among nematodes and accelerated evolution toward crown clades. Molecular Biology and Evolution 23: 1792-1800.

Hooper D.J., Hallmann J., Subbotin S.A. 2005. Methods for extraction, processing and detection of plant and soil nematodes. In: Luc M., Sikora R.A., Bridje J. (Eds.). Plant parasitic Nematodes in Subtropical and Tropical Agriculture. CAB International, Wallingford, U.K. pp. 53-86.

Hu M., Hoglund J., Chilton N.B., Zhu X.O., Gasser R.B. 2002. Mutation scanning analysis of mitochondria cytochrome C oxidase subunit I reveals limited gene flow among bovine lungworm subpopulation in Sweden. Electrophoresis. 23: 3357-3363.

Hunt D.J. & Handoo Z.A. 2009. Taxonomy, identification and principal species. In: Perry R.N., Moens M., Starr J.L. (Eds.). Root – knot Nematodes. CAB International, Wallingford, UK, pp. 55-97.

Jepson S.B. 1983. The use of second-stage juvenile tails as an aid in the identifications of Meloidogyne species. Nematologica 29: 11-28.

Jepson S.B. 1987. Identification of Root-Knot Nematodes (Meloidogyne species). CAB International, Wallingford, UK, pp 57-246.

Julio V.A., Freitas L.G., Colho J.L.C., Muscardi D.C., Ferraz S. 2003. Extraction of Meloidogyne javanica females from tomato roots through maceration with fungal enzymes. Nematologia Brasiliera 27: 75-80.

Kanwar R.S., Bajaj H., Dabur K. 2014. Techniques in Plant Nematology –Nematological Techniques. Lambert Academic Publisching, Saarbrücken, Germania, pp. 43-53.

Kaplan D.T. & Davis E.L. 1990. Improved nematode extraction from carrot disk culture. Journal of Nematology 22: 399- 406.

Karssen G. 2002. The Plant-parasitic Nematode Genus Meloidogyne Göldi, 1892 (Tylenchida) in Europe. Brill Academic Publishers, Leiden, Olanda, pp. 131-161.

Karssen G., Moens M. 2006. Root-knot nematodes. In: Perry R.N., Moens M. (Eds.). Plant Nematology. CAB International, Wallingford, UK, pp. 59-90.

Karssen G., Wesemael W., Moens M. 2013. Root-knot Nematodes. In: Perry R.N., Moens M. (Eds.). Plant Nematology (2nd edition). CAB International, Wallingford, UK, pp. 73-108.

Kirjanova E.S. 1963. Collection and taxonomy of root nematodes of the family Heteroderidae (Skarbilovich, 1947) Thorne 1949. In: Methods of Investigating Nematodes of Plants, Soil and Insects. USSR Academy of Sciences , Zoological Institute, Leningrad, pp. 6-32.

Kleynhans K.P.N. 1991. The Root-knot Nematodes of South Africa. Plant Protections Reserach Institute, Pretoria. Technical Comunication Nr. 231 – Departament of Agriculture Development, South Africa, 61 pp.

Maggenti A.R. & Allen M.W. 1960.The origin of the gelatinous matrix in Meloidogyne. Proceedings of the Helminthological Society of Washington 27, pp. 4–10.

McClullough D.G. Work T.T., Cavey J.F., Liebhold A.M., Marshall D. 2006. Interceptions of nonindigenous plant pests at US ports of entry and border crossings over a 17 year period. Botanical Invasions 8: 611-630.

McClureM.A. & BirdA.F. 1976. The tylenchoid (Nematoda) egg shell: formation of the egg shell in Meloidogyne javanica. Parasitology 72: 29–39.

Micoletzky H. 1922. Die freilebenden Erdnematoden. Mit besonderer Berücksichtigung der Steiermark und der Bukowina , zugleich eine Revizion samtlicher nicht mariner freilebender Nematoden in Forum von Genus-Beschreibungen und Bestimmugsschlüssel. Arch. Naturgsch. A 89.

Montain W.B., Patrick Z.A. 1959. The peach replant problem in Ontario. The pathogenity of Pratylenchus penetrans. Canadian Journal of Botany 37: 459-470.

Müller G. 1968. Biologia solului. Editura Agro-Silvică București. pp 117-378.

Oostenbrink M. 1954. Een doelmatige methode voor het toetsen van aaltjesbetrij-dingsmiddelen in ground met Hoplolaimus uniformis als proefdier. Meded. LadbHogesch. OptzoekStns Gent 19, pp. 377-408.

Oostenbrink M. 1960. Estimating nematode populations by some selected methods. In: Sasser J.N., Jenkins W.R. (Eds.). Nematology. The University of North Carolina Press, Chapel Hill, NC, SUA. pp. 85-102.

Orton Williams K.J., 1972. Meloidogyne javanica. In: CIH Descriptions of Plant-parsitic Nematodes, Set 1, nr. 3, Commonwealth Agricultural Bureaux, Farnham Royal, UK.

Orton Williams K.J., 1973. Meloidogyne incognita. In: CIH Descriptions of Plant-parasitic Nematodes,Set 2,nr. 18,Commonwealth Agricultural Bureaux Farnham Royal, UK.

Orton Williams K.J., 1974. Meloidogyne hapla. In: CIH Descriptions of Plant-parsitic Nematodes,Set 3,nr. 31, Commonwealth Agricultural Bureaux, Farnham Royal, UK.

Orton Williams K.J., 1975. Meloidogyne arenaria. In: CIH Descriptions of Plant-parsitic Nematodes,Set 5,nr. 62, Commonwealth Agricultural Bureaux, Farnham Royal, UK.

Overgaard-Nielsen C. 1947. An apparatus for quantitative extraction of nematodes and rotifers from soil and moss. Natura Jutlandica nr. 1, pp. 4-8.

Papadopoulou J. & Triantaphyllou A.C. 1982. Sex-differentiation in Meloidogyne incognita anatomical evidence of sex reversal. Journal of Nematology 14(4): 549-666.

Randig O., Bongiovanni M., Carneiro R.M.D.G., Castagnone-Sereno P. 2002. Genetic diversity of root-knot nematodes from Brasil and development of SCAR markers specific for the coffee-damaging species. Genome 45: 862-870.

Ravichandra N.G. 2010. Methods and Tehniques in Plant Nematology. PHD Lerning Private Limited, New Delhi, India, pp. 59-79.

Reisinger E. 1954. Edaphische Kleintuberbellarien als bodenkudliche Leitformen. Carinthia II. Mitt. Naturwissensch. Ver. Karnten nr. 64.

Renkeon O. 1949. A controlled method for separating terrestrical nematodes. Oikos nr. 1, pp. 82-87.

Rodriguez-Kabana R. 1981. A simple incubation method for the extraction of nematodes from soil. Nematropica 11: 175-185.

Seinhorst J.W. 1988.The estimation of densities of nematode populations in soil and plants. Vaxtskyddsrapporter nr. 51, Uppsala, Suedia.

Shepherd A.M. & Clark S.A. 1983. Spermatogenes is and sperm structure in some Meloidogyne species (Heteroderoidea, Meloidogynidae) and a comparison with those in some cyst nematodes (Heteroderoidea, Heteroderidae). Revue de Nématologie 6: 17–32.

Singh S.K., Conde B., Hodda M. 2012. Root-Knot Nematode (Meloidogyne incognita) on Bitter Melon (Momordica charantia) near Darwin, Australia. Australasian Plant Disease Notes 7: 75-78.

Solcan C., & Sisea C.R. 2012. Biologie moleculară. Editura “Ion Ionescu de la Brad”, Iași, pp. 152-258.

Southey J.F. 1986. Laboratory Methods for Work with Plant and Soil Nematodes. Her Majesty’s Stationary Office, London, U.K. pp. 6-157.

Stefanski W. 1927. Les nématodes libres des torrents de Sinaia avec des considerations sur les nematodes des torrents en géneral. Soc. Română Știi. Nr. 9.

Stöckli A. 1943. Bodenbiologische Studien. Schweiz. Landwirtsch. Nr. 21, 44 pp.

Stoller B.B. 1957. An improved test for nematodes in the soil. Plant Disease Reorter 41: 531 – 532.

Taylor A.L. 1987. Identification and estimation of root-knot nematode species in mixed populations. Florida Departament of Agriculture and Consumer Services Bulletin nr. 12. Gainesville, Glorida, SUA, pp. 10-73.

Taylor D.P. & Netscher C. 1974. An improved technique for preparing perineal patters of Meloidogyne spp. Nematologica 20: 268-269.

Trisciuzii N., Troccoli A., Volvas N., Cantalapierda-Navarrete C., Palomares-Rius J.E., Castillo P. 2013. Detection of camellia root-knot nematode Meloidogyne camelliae Golden in Japanese camellia bonsai imported into Italy: integrative diagnosis, parasitic habits and molecular phylogeny. European Journal of Plant Pathology 138: 231-235.

Turner S.J. 1988. Sample preparation, soil extraction and laboratory facitities for detection of potato cyst nematode. In: Marks J.R., Brodie B.B. (Eds.). Potato Cyst Nematodes: Biology, Distribution and Control. CAB International, Wallingford, U.K. pp. 75-95.

Van Bezooijen J. 2006. Methods and Techniques for Nematology. Wageningen University, Olanda, pp. 60-75.

Verschoor B.C. & De Goede R.G.M. 2000. The nematode extraction efficiency of the Oostenbrink elutriator-cottonwood filter with special referece to nematode body size and life strategy. Nematology 2: 325:342.

Viaene N., Mahieu T., de la Pena E. 2007. Distribution of Meloidogyne chitwoodi in potato tubers and comparation of extraction methods. Nematology 9: 143-150.

Viglierchio D.R. 1979. Selected aspects of root knot nematode physiology. In: Lamberti F., TaylorC.E. (Eds.).Root knot Nematodes (Meloidogyne species) – Systematics, Biology and Control. Academic Press, London & NewYork, pp.115–154.

Volvas N., Trisciuzzi N., Troccoli A., Luca F., Cantalapierda-Navarrete C., Castillo P. 2007. Integrative diagnosis and parasitic habits of Cryphoderma brinkmani a non-cyst forming heteroderided nematode intercept on Japanese white pine bonsai trees imported into Italy. European Journal of Plant Pathology 135: 717-726.

Volz P. 1951. Untersuchungen uber die Mikrofauna des Waldbodens. Zoologische Jahrbücher, Abt. Systematik und Ökologie 79: 514-566.

Wergin W.P. & Endo B.Y. 1976. Ultrastructure of aneurosensory organina root-knot nematode. Journal of Ultrastructure Research 56: 258–276.

Whitehead A.G. 1968. Taxonomy of Meloidogyne (Nematoda: Heteroderidae) with descriptions of four new species. Transactions of the Zoological Society, London 31, pp. 263-401.

Whitehead A.G. & Hemming J.R. 1965. A comparation of some quantitative methods of extracting small vermiform nematodes fom soil. Annals of Applied Biology 55: 28-38.

Wouts W.M.1979. Characterization of the family Meloidogynidae with a discussion on its relationship to other families of the suborder Tylenchina based on gonad morphology. In: Lamberti F. & Taylor C.E.(Eds.). Rootknot Nematodes (Meloidogyne species)- Systematics, Biology and Control. Academic Press, London & NewYork, pp.21-35.

Young T.W. 1954. An incubation method for collecting migratory endo-parasitic nematodes. Plant Disease Reporter 38: 794-795.

Zijlstra C. 2000. Identification of Meloidogyne chitwoodi, M. fallax and M. hapla based on SCAR-PCR: a powerful way of enabling reliable identification of populations of individuals that share common trails. European Journal of Plant Pathology 106: 283-290.

CAPITOLUL 5

Cercetări de ecologie – Observații în dinamică asupra limitei de toleranță termică a juvenililor infestanți (J2), în absența plantelor-gazdă

5.1. Introducere

Nematodele parazite ale plantelor din genul Meloidogyne nu parazitează în mod izolat sistemul radicular al plantelor. O mare diversitate de virusuri, bacterii și fungi coexistă cu nematodele din sol, multe dintre aceste microorganisme fiind patogene pentru plante.

Totodată, organisme cum ar fi acarienii, actinomicetele, colembolele și altele sunt cunoscute că interacționează cu nematodele parazite ale plantelor (Monzanilla-Lopez și Starr, 2009).

O ipoteză în apariția complexului de boli la plante ar fi aceea că rănirea rădăcinilor sau a altor părți subterane, ca urmare a parzitismului cu nematode galicole, este principalul factor care crește susceptibilitatea la alți agenți patogeni (Monzanilla-Lopez și Starr, 2009; Agenbag, 2016).

Multe nematode fitoparazite, în special paraziți ai plantelor anuale, pot supraviețui în sol în absența plantelor gazdă pentru o anumită perioadă de timp, ce poate varia de la câteva săptămâni la câteva luni. În tot acest interval nematodele suportă variate forme de stres ale mediului, cum ar fi înghețul, inundațile, seceta etc.

Cel mai simplu mecanism ce împiedică răspunsul imediat la factorii stresori ai mediului duce la scăderea parțială a activității metabolice a nematodelor și intrarea acestora în starea dormantă. Dacă condițiile neprielnice continuă sau se înrăutățesc nematodele îți încetează mișcările intrând în starea de criptobioză. Această alternare a diferitelor stări metabolice poate dura zile, spătâmâni, luni sau chiar ani, redevenind revesibilă de îndată ce condițiile din mediu devin favorabile (Ferraz și Brown, 2002).

Nematodele parazite ale plantelor sunt prezente în aproape orice tip de habitat, singurii factori limitativi pentru supraviețuire rămân resursele de hrană și umiditatea.

Câteva specii au dezvoltat abilități de supraviețuire chiar și în condiții extreme, de exemplu în condiții deșertice, pentru o perioadă relativ lungă de repaos cu reducerea energiei consumate. Aceste nematode își vor continua ciclul biologic când condițiile de mediu redevin favorabile. Nematodele parazite ale plantelor care adoptă astfel de strategii de supraviețuire constituie aproximativ 20% din descrierile întregului filum Nematoda (Ferraz și Brown, 2002).

Nematodele galicole ale genului Meloidogyne sunt considerate înalt patogene pentru speciile de plante cultivate. Toate speciile acestui gen au cinci stadii de dezvoltare postembrinară, separate de patru năpârliri (Siddiqui și Taylor, 1970).

Aerația, textura solului, umiditatea și potențialul osmotic sunt factori ce interacționează strâns, fiind dificilă determinarea fiecărui efect separat, asupra nematodelor.

La o umiditate a solului de 40-60% speciile de Meloidogyne își desfășoară optim activitatea, însă, pe măsură ce solul se usucă, activitatea metabolică a nematodelor încetinește. În condiții de scădere dramatică a umidității cele mai rezistente ”stadii” rămân masele de ouă în interiorul cărora umiditatea rămâne constantă. Cu toate acestea, supraviețuirea maselor de ouă rămâne mult mai ridicată în solurile umede și chiar îmbibate cu apă.

În solul uscat, embriogeneza și dezvoltarea primului stadiu juvenil sunt puternic influențate de presiunea osmotică, în special după aplicarea fertilizanților. Chiar și micile schimbări de potențial osmotic pot influența comportamentul nematodelor.

Creșterea daunelor produse de nematodele galicole sunt adesea asociate cu solul alcalin. Majoritatea speciilor de Meloidogyne se dezvoltă în solurile nisipoase, excepție făcând Meloidogyne ertiellia ce cauzează daune severe asociate cu solurile argiloase (> 35% argilă) (Evans și Perry, 2009).

Nematodele din sol răspund rapid la perturbațiile biotice și abiotice, ele fiind foarte numeroase în sol cu o distribuție atât pe verticală cât și pe orizontală, într-o mare diversitate de stadii și în diferite modele de distribuție (“plaje”). Astfel, gradul de dăunare depinde de creșterea numărului (densitatea) acestora din sol. Abundența în sol și distribuția în rădăcini, în cazul speciilor de Meloidogyne depind, la rândul lor, de textura solului, ciclul culturilor agricole, dar și de factorii antropici. Cunoașterea comportamentului acestor nematode în diverse habitate și mai ales cunoașterea reacțiilor lor la factorii ecologici majori (temperatură, umiditate) sunt importante pentru a evalua potențialul patogen dintr-o anumită regiune, fiind totodată un criteriu important de înțelegere a comportamentului lor în anumite „plaje” de atac.

Anhidrobioza permite supraviețuirea nematodelor în condiții extreme inclusiv în solurile din deșert (Freckman și Kaplar, 1977) sau în climatul Antarcticii (Pickup și Rothery, 1991), dispersați în semințe uscate, resturi vegetale sau particule de praf (Barrett, 1991).

Speciile de nematode aparținând genurilor Pratylenchus și Meloidogyne sunt considerate moderat-sensibile la condiții de uscăciune a solului. Un procent ridicat (70%) din aceste populații (adulții) intră în stare de anhidrobioză când solul se usucă lent.

Nematodele prezente la interfața dintre sol și aer sunt mai vulnerabile la deshidratare și recurg la strategii de anhidrobioză. Pragul de diferențiere termică pentru nematodele fitoparazite are, cel mai probabil, o bază genetică ce poate fi importantă în supraviețuirea peste iarnă, în funcție de diferitele zone geografice unde au habitatul nematodele. Stadiile larvare sunt considerate forme de rezistență, parte a ciclului bilogic, ca răspuns la condițiile adverse de mediu. În aceste stadii durata de viață a nematodelor poate fi prelungită, astfel că ciclul biologic al fito- și zoonematodelor poate fi considerabil extins la multe dintre specii

(figura 5.1).

Figura 5.1. Media, în zile, a duratei de viață pentru diverse specii de nematode, în stadiu de adulți sau diverse stadii larvare (Lewis și Pérez, 2004. Ageing and development behaviour. In: Gaugler R. & Bilgrami A.(Eds.). Nematode Behaviour, CAB International, Wallingford, UK. pp. 151-172)

5.2. Strategii de adaptare ale nematodelor la condițiile de mediu

Solul este un habitat deosebit de bogat în nematode, acestea din urmă reprezentând peste 26% din totalul viețuitoarelor din sol, multe dintre ele fiind bacteriovore, fungivore, prădătoare sau parazite ale plantelor (Warton, 1986).

Nematodele parazite ale plantelor reprezintă un grup extrem de divers de organisme, cu o varietate de adaptări la diverse condiții întâlnite în sol dar și în plante. Un exemplu ar fi acela că ele suferă, temporar, o deshidratare ușoară ca răspuns la stresul din mediu sau o deshidratare mai accentuată, graduală (anhidrobioză). Aceste răspunsuri se petrec pe termen lung, însă pe termen scurt ele agregă sau formează larve Dauer foarte rezistente la mediu.

Toate aceste adaptări au ca scop supraviețuirea pe termen lung a populațiilor de nematode fitoparazite și nu numai.

Hibernarea și diapauza sunt extrem de importante pentru supraviețuirea sezonieră ca, de altfel, supraviețuirea pe termen lung a maselor de ouă, în timp ce schimbarea raportului dintre sexe pot îmbunătăți șansele de supraviețuire ale generațiilor următoare, la speciile de Meloidogyne . Tot ca o strategie de supraviețuire este și creșterea numărului de masculi, mărind astfel șansele de reproducere, șansele la o fecunditate ridicată.

Embrionii și juvenilii din stadiul J1 ale speciilor de Meloidogyne, supraviețuiesc mult mai bine în condiții de uscăciune decât stadiul J2 pentru că survin schimbări în coaja oului, după prima năpârlire, aceasta devenind mult mai permeabilă. După formarea stadiului de juvenil J2, activitatea enzimatică crescută duce la subțierea cojii oului, însoțită de schimbarea permeabilității și creșterea sensibilității la deshidratare (Wallace, 1968a, 1958b; Perry și colab., 1992).

Persistența sau chiar creșterea populațiilor de Meloidogyne de la un an la altul se datorează iernilor blânde dar și florei segetale care acționează ca rezervor de plante-gazdă.

Kutywayo și Been (2006) au constatat existența a unor buruieni ca fiind bune gazde pentru Meloidogyne chitwoodi. Rata de reproducere intensă permite transmiterea populațiilor de nematode galicole de la un an la altul, în ciuda mortalității ridicate a ouălelor și juvenililor la temperaturi coborâte.

Agregarea nematodelor are loc acazional, în funție de specie, formând mari aglomerări iar cel mai cunoscut exemplu fiind acela al speciilor Dithylenchus spp. Acest grup de nematode libere se organizează în așa-numite “smocuri” sau “lână de nematode”, ca urmare a uscării accentuate a solului, fiind vizibile chiar și cu ochiul liber (Cooper și van Gundy,1971).

În literatura nematologică se folosește adesea termenul de dormanță. La modul general, aceasta implică reducerea metabolismului pentru a conserva energia.

Dormanța include alți doi termini: repaosul și diapauza.

Repaosul nematodelor presupune încetarea temporară a metabolismului și a dezvoltării, ca răspuns la condițiile adverse de mediu, spre deosebire de diapauză care nu implică schimbări fiziologice. Repaosul se intituie spontan și se reia atunci când condițiile de mediu devin favorabile continuării ciclului biologic. Repaousul poate fi obligatoriu sau facultativ. Repaosul obligatoriu apare atunci când condițiile nefavorabile de mediu afectează un anumit stadiu de dezvoltare al nematodelor. Repaosul facultativ nu afectează un anumit stadiu de dezvoltare din ciclul biologic al nematodelor (Evans și Perry, 2009).

Diapauza nematodelor este o încetare a dezvăltării, reversibilă doar atunci când anumite condiții specifice unui stadiului de dezvoltare, au fost îndeplinite, chiar dacă celelalte condiții sunt prezente. Diapuza este o strategie de depășire pe termen lung a condițiilor nefavorabile din mediu sau este datorată absența plantei-gazdă (Evans și Perry, 2009).

De Guiran și Villemin (1980) au constatat că procentul juvenililor din stadiu J2 neeclozați, care intră în diapuză, variază de la 10% la specia Meloidogyne arenaria la 94% pentru specia M. naasi. Ca și repaousul, diapauza poate fi obligatorie sau facultativă.

Diapuaza obligatorie este inițiată de factori endogeni iar dezvoltarea poate fi reluată după o anumită perioadă de timp. Diapuza facultativă este inițiată de factori exogeni și mai puțin de stimuli endogeni. Diapauza este un fenomen bine studiat la insecte și a fost descris pentru prima dată de către De Guiran în 1979 la specia Meloidogyne incognita (Curtis și colab., 2009).

S-a constatat că este greu de separat tipurile de dormanță pe baza activității metabolice a nematodelor fiind dificil de a face o distincție între afectarea ontogenetică indusă de dormanță și afectarea dezvoltării somatice. Cea mai relevantă însă rămâne cauza care a indus starea de dormanță (Evans și Perry, 1976; Evans, 1987; Evans și Perry, 2009).

De Guiran și Villemin (1980) au raportat procente ridicate ale juvenililor din stadiul J2 neeclozați în diapauză, fiind asociați cu rezistența plantelor la aceste specii de nematode.

Huang și Pereira (1994) au constatat că juvenilii (J2) din masele de ouă care au prezentat o sensibilitate scăzută au înregistrat o întârziere în eclozare. Acești autori au presupus că plantele care se află spre sfârșitul perioadei de creștere, ar secreta substanțe ce afectează hrănirea femelelor și, indirect, întârzierea eclozării juvenililor.

Acest fapt poate demonstra influența pe care o au plantele asupra dezvoltării și supraviețuirii speciilor de Meloidogyne.

Matrixul gelatinos în care sunt incluse ouălele constituie prima linie de apărare împotriva stresului osmotic, împotriva nivelului scăzut de O2 și umidității din sol, precum și împotriva prădătorilor și a deshidratării excesive. Prin urmare, mastrixul gelatinos oferă multiple avantaje care sporesc supraviețuirea. La momentul producerii masei gelatinoase, aceasta conține doar ouă neebrionate, apoi juvenili din stadiile J1 și J2.

Mai multe studii au considerat masa de ouă ca entitate biologică (Wallace, 1966; Bird și Soeffky, 1972; de Guiran și Villemin, 1980; Evans și Perry, 2009)

5.3. Cercetări privind influența temperaturii asupra nematodelor fitoparazite din genul Meloidogyne

Evaluarea impactului schimbărilor climatice asupra infestării cu dăunători a culturilor agricole este foarte importantă deoarece permite adaptarea măsurilor de prevenire și control asupra densității populațiilor și asupra dispersării acestora ( Prot și van Gundy, 1981).

Meloidogyne spp. sunt endoparaziți sedentari care au relații biotrofice foarte complexe cu plantele gazdă. Controlul acestor specii este dificil datorită succesiunii multor generații în condiții prielnice (primăvară-toamnă) dar și datorită pontei (matrixul gelatinos de ouă) relativ rezistente. Așadar, strategiile de supraviețuire sunt puternic dependente de condițiile biotice și abiotice.

Capacitatea noastră de a investiga și înțelege în totalitate ecologia acestui gen de nematode se pare că rămâne limitată. Cu toate acestea, se știe că temperatura joacă un rol covârșitor în dezvoltarea acestor specii fitoparazite.

Astfel, la speciile de Meloidogyne cromozomii sexului sunt absenți iar comporamentul reproductiv poate fi influențat de către factorii de mediu. Acești factori au o influență puternică asupra raporului dintre sexe astfel încât stresul din mediu unde viețuiesc nematodele limitează resursele, făcând ca juvenilii să nu se transforme în femele, ci în masculi.

Densitatea mare a nematodelor, vârsta plantei-gazdă, chiar și aplicarea de erbicide foliare sunt factori “masculinizanți” care pot influența creșterea numărului de masculi (Davide și Triandaphyllou, 1968; Entwistle, 2003). Fiind cunoscute ca organisme poikiloterme, dezvoltarea lor este strâns legată de variațiile valorilor termice.

De pildă, dezvoltarea embrionară, care este un proces de diferențiere, nu are loc în afara unor variații de temperatură, depinzând în totalitate de aceasta și abia în al doilea rând de planta gazdă (Reversat, 1981). Dintre toți factorii de mediu, temperatura are cel mai mare impact, astfel încât variațiile temperaturii la speciile de nematode galicole sunt importante pentru supraviețuirea speciilor, schimbări climatice afectând agresivitatea atacului și distribuția spațială a nematodelor (figura 5.2.).

Figura 5.2. Reprezentarea etapelor de dezvoltare, în funcție de temperatură, a nematodelor galicole prezente în sol (Ferraz și Brown 2002. An Introduction to Nematodes: Plant Nematology, A student’s textbook. Pentsoft Sofia, Bulgaria, pp. 107-139, adaptat de noi)

Pentru specia Meloidogyne hapla, intervalul optim de dezvoltare este de 15-20°C, în timp ce pentru Meloidogyne javanica intervalul optim este de 25-30°C; peste 40°C și sub 0°C activitatea lor parazitară este foarte scăzută sau mor.

Partea activă a ciclului de dezvoltare începe atunci când juvenilul din stadiu J2 devine infestant. Eclozarea, la cele mai multe specii de Meloidogyne, se desfășoară în apă sau medii umede fiind determinată în principal de influența temperaturii. Supraviețuirea în timpul fazei de inițiere a atacului și apoi pe parcursul vieții parazite depind totodată de rezervele energetice ale juvenililor, prezente sub formă de lipide (Wright și Perry, 2006). În perioada de latență, din afara plantei, nematodele depind exclusiv de aceste rezerve energetice.

Acest experiment a avut ca obiectiv urmărirea juvenililor a trei specii de nematode galicole la valori ale temperaturilor de 4˚C, 10˚C și respectiv 20˚C, pe diferite perioade de timp (2, 4, 6, 8, 10 și 12 spătămâni), în absența plantelor-gazdă, unde supaviețuiea tuturor speciilor a fost corelată cu temperatura.

5.3.1. Materiale și metode

Materialul infestant (reprezentat de către juvenilii din stadiul J2) a fost colectat din rezerva de nematode a Laboratorului Regional de Nematologie – Brașov. Populațiile de nematode din care a urmat să aibe loc extracția au fost menținute pe plante de Lycopersicum esculentum și Cucumis sativus în condiții controlate de 14 h lumină/zi, în ghivece de 12 cm Ø, într-un substart alcătuit din 50% nisip de râu și 50% sol argilos, autoclavat la 120˚C timp de 20 minute. Când platulele au avut trei frunze adevărate au fost inoculate cu juvenili. După 35 zile a avut loc colectarea maselor de ouă și punerea acestora la incubat în vederea eclozării juvenililor și colectarii acestora.

Pentru studierea supraviețuirii juvenililor infestanți proaspăt eclozați, în absența plantelor-gazdă, aceștia au fost plasați în cilindri de plastic de 6 cm înălțime și 3cm diametru cu adaos de apă distilată. În fiecare flacon cilindric au fost plasați 200 J2 din fiecare specie ce a urmat să fie analizată.

Înainte de începerea experimentului propriu-zis un lot martor a fost observat pentru a verifica impactul comparativ între apa de robinet și apa distilată, asupra supraviețuirii juvenililor. Wright (1998) a observat că apa distilată nu este un mediu favorabil pentru nematodele parazite ale plantelor, existând posibilitatea unor presiuni ionice și osmotice care ar putea afecta grav supraviețuirea.

Observațiile noastre au fost efectuate pe stadii juvenile de Meloidogyne hapla, M. incognita și M. javanica. După cinci săptămâni nu a fost observată nici o diferență în morfologia sau supraviețuirea lor, astfel încât apa distilată a fost folosită fără rezerve ca mediu pentru menținerea nematodelor pe parcursul experimentelor.

Juvenilii din cele trei specii au fost expuși la 4˚C, 10˚C și 20˚C deoarece aceste temperaturi corespund cu media anotimpurilor sezonului temperat, specific țării noastre.

Tuburile au fost plasate în incubatoare iar testele au avut trei repetiții.

Volumul de apă distilată din tuburi s-a menținut la 5 ml iar dopul recipientelor a fost perforat pentru a permite evaporarea apei.

Pentru evitarea condițiilor anoxice, soluțiile au fost barbotate de două ori pe săptămână, timp de 1h, cu ajutorul unei pompe de acvariu. Supraviețuirea a fost observată prin verificarea morfologiei generale, aspectul cutoculei, dar mai ales a mobilității juvenililor sub lupa binocular (20x) și la microscopul optic Leica MZ 9.5 (40x).

Înainte de a fi examinate, nematodele din stadiul J2 păstrate la 4˚C, respectiv la 10˚C, s-au depozitat la temperatura camerei timp de 4h pentru recăpătarea mobilității acestora într-o măsură cât mai mare. Nematodele imobile sau cele muribunde au fost “stimulate” folosind un ac nematologic pentru a verifica mișcările de înaintare, odulatorii.

Pentru analiza statistică propriu-zisă s-a folosit programul XLSTAT (AddinSoft), versiunea 7,5 ce funcționează sub Excel.

5.4. Rezultate și discuții

Au fost observate diferențe semnificative în supraviețuirea celor trei specii de nematode expuse la trei valori diferite de temperatură timp de 12 săptămâni. Supraviețuirea a fost calculată pentru cei mai importanți parametrii statistici exprimați în medii, procente, abateri și dispersii pentru temperaturi de 4˚C (tabel 5.1.), 10˚C (tabel 5.2.), respectiv 20˚C (tabel 5.3.).

Diferența dintre specii a fost mult mai pronunțată la cele două valori ale temperaturilor extreme (4˚C și 20˚C) față de nivelul intermediar de temperatură (10˚C).

Supraviețuirea speciei Meloidogyne hapla a fost mai grav afectată la 4˚C în timp ce la 10˚C și 20˚C supraviețuirea juvenililor a decurs relativ constant. La 4˚C supraviețuirea acestei specii a fost de 0 % în săptămânile 10 și 12. Declinul în supraviețuirea acestei specii, la valoarea de 4˚C, a început în săptămâna a 6-a (cu o medie de 20,33 a numătului de juvenili), iar în săptămâna a 8-a supraviețuirea a scăzut brusc (1,33 juvenili infestați), ceea ce a corespuns cu o valoare de 0,67% a juvenililor cestei specii

Mulți autori, printre care Towson și Apt (1983) au constatat că durata supraviețuirii speciilor de nematode galicole este strâns legată de umiditate și mai ales de temperatură.

Slaba supraviețuire (sub 50% în primele patru săptămâni) la 4˚C a speciei Meloidogyne hapla , în cazul experimentului nostru, arată că nematodele nu își parcurg ciclul biologic în bunde condiții, deși specia este cunoscută ca fiind criofilă, capabilă să supraviețuiască în sol la temperaturii sub 10˚C pe parcursul mai multor săptămâni (Karssen și Moens, 2006).

Unii autori au arătat că Meloidogyne hapla poate supraviețui la temperaturi mult mai scăzute de – 8˚C iar acestă toleranță la temperaturi scăzute variază în funcție de diferitele etape de creștere (Vrian și colab.,1978). Se pare că ouăle sunt mai bine adaptate la temperaturi scăzute decât juvenilii prospăt eclozați.

La 20˚C supraviețuirea a fost mai mare, de 60%, în primele 4 săptămâni urmând ca din săptămâna a 6-a să scadă brusc. Această temperatură este cunoscută ca fiind optimă pentru majoritatea proceselor fiziologice, metabolice și etologice ale acestor specii (Bird și Wallace, 1965). De altfel, în săptămânile 10 și 12 supraviețuirea la 4˚C nu a fost posibilă la niciuna dintre cele trei specii de nematode galicole.

Forge și MacGuidwin (1992) au descoperit că temperatura scăzută (în stadiul de ou) induce unele modificări fiziologice ale juvenililor investanți J2, modificări care sporesc capacitatea speciei M. hapla de a rezista la temperaturi scăzute. Acest fapt explică de ce juvenilii J2 au murit în primele săptămâni după eclozare în urma expunerii la temperatura de 4˚C, lipsind practic acele mecanisme de dezvoltare a rezistenței când J2 se află în stadiul de ou.

Spre deosebire de temperaturile inferioare (4°C), la 10˚C supraviețuirea a fost de aproape 23% în ultima săptămână, la specia Meloidogyne incognita, specie la care juvenilii încă prezentau mișcări intense, ondulatorii, de înaintare. La examinare stiletul era bine conurat, retractil, iar cuticula intactă. În cazul expunerii juvenililor la temperature coborâte (4°C) am constatat o mortalitate ridicată între a 8-a și a 10-a săptămână. Astfel, dintr-un total de 200 juvenili, în a 8-a spătămână au supraviațuit în medie 11,3 specimene, iar în săptămâna a 10-a a fost găsit în viață un singur juvenil.

Se poate spune că stadiile larvare ale acestei specii supraviețuiesc cel mai bine la temperatura de 20°C în primele două săptămâni, însă procentul de supraviețuire la 10 săptămâni este similar cu cel din expunerea la temperatura de 4°C (0.17%). În ansamblu, supraviețuirea juvenililor din această specie se menține relativ constantă pe parcursul celor 12 săptămâni, la valoarea termică de 10˚C.

Juvenilii speciei Meloidogyne javanica s-au dovedit a fi sensibili la temperaturi joase de 4˚C, astfel încât ei supraviețuiesc doar în proporție de 10,34 % în săptămâna a 2-a , pentru ca în spătămâna a 6-a doar 1% din ei să supraviețuiască. Supraviețuirea constantă a acestor juvenili pe parcursul studiului s-a înregistrat la 10˚C, dovadă fiind procentul ridicat (68 % supraviețuire) în săptămâna a 8-a la această specie.

Putem aprecia că juvenili acestei specii au înregistrat cele mai scăzute procente supraviețuire la valori ale temperaturii de 4°C. Astfel, în primele două săptămâni după examinare ei au supraviețuit în proporție de 10,34%, spre deosebire de juvenilii specie M. incognita (29,34%), respectiv M. hapla (47,67%). La valoarea de 4°C doar 2 juvenili au fost identificați ca fiind vii în săptămâna a 4-a. Acest fapt demonstrează fără echivoc sensibilitatea la temperature scăzute a acestei specii de nematode galicole nou identificate pe teritoriul României. Acest lucru s-ar traduce printr-o mortalitate accentuată în condiții de câmp și printr-o prolificitate ridicată la culturile de legumicole din spații protejate, acolo unde temperature nu scade sub 4°C.

Mortalitatea accentuată, în cazul acestei specii, a fost de asemenea constatată în intervalul săptămânilor 8-12 , când niciun juvenil nu a supraviețuit la 4°C.

Cea mai constantă dar și ridicată rată de supraviețuire au avuto juvenilia în cadrul expunerii la 10°C, când procentul supraviețuirii a fost maxim în primele două săptămâni (94%), descrescând la o valoare procentuală de 11,5% în săptămâna a 12-a.

La 20˚C juvenilii celor trei specii au supraviețuit în procente ridicate pe parcursul celor patru săptămâni (peste 74% Meloidogyne hapla, 38,17% la specia M. arenaria și 51,50% pentru specia M. javanica), scade la sub 5% în săptămîna a 8-a (3,17% M. hapla, 2,34% M. incognita, 0,17% M. javanica), în timp ce în ultima săptămână procentul supraviețuirii este absent la toate cele trei specii de nematode galicole.

Cel mai mare procent de supraviețuire, pentru toate 3 speciile de nematode galicole a fost consemnat în cazul expunerii acestora la 10°C pe parcursul tuturor celor 12 săptămâni.

Astfel, în cazul juvenililor infestanți ai specie M. hapla supraviețuirea a fost de 96,67% în primele două săptămâni și de 15,5% în săptămâna a 12-a; juvenilia speciei M. incognita au supraviețuit în proporție de 75,37% în prime două săptămâni de observații și în proporție de 22,84% în ultima săptămână (a 12-a) de observații; juvenilii din specia M. javanica au înregistat un procent al supraviețuirii de 94% în primele două săptămâni și de 11,5 în săptămâna a 12-a.

La numărarea periodică a de juvenililor din loturile luate în stiudiu au fost atent examinate mișcările de deplasare pe verticală dar mai ales pe orizontală, viteza de sedimantare greoaie/rapidă a juvenililor aflați în suspensie, contracții ale mușchilor somatici, prezența unei ușoare opacifieri a sistemului digestiv precum și claritatea porțiunii hialine a cozii. Prezența acestor elemente de diagnoză a făcut diferența între juvenilii vii și cei morți.

Diferențierea între juvenilii vii și cei morți este posibilă prin colorația lor cu permanganat de potasiu (Jatala, 1975) sau prin verificarea fluorescenței nematodelor în lumină UV după imersarea lor în diacetat de fluoresceină (Bird, 1979). Aceste metode sunt însă foarte utile când se lucrează cu un număr mic de nematozi (<100 J2).

Tabel 5.1. Efectele interacțiunii nematodelor (nr. minim, nr. maxim, media, abaterea medie și dispersia) la temperatura de 4˚C, timp de 12 săptămâni pentru speciile M. hapla, M. incognita și M. javanica

Tabel 5.2. Efectele interacțiunii nematodelor (nr. minim, nr. maxim, media, abaterea medie și dispersia) la temperatura de 10˚C, timp de 12 săptămâni pentru speciile M. hapla, M. incognita și M. javanica.

Tabel 5.3. Efectele interacțiunii nematozilor (nr. minim, nr. maxim, media, abaterea medie și dispersia) la temperatura de 20˚C, timp de 12 săptămâni pentru speciile M. hapla, M. incognita și M. javanica.

Tabel 5.4. Procentul de nematozi la temperatura de 4˚C, 10˚C și 20˚C, pe parcursul a 12 săptămâni pentru speciile M. hapla, M. incognita și M. javanica.

De altfel, în săptămânile 10 și 12 supraviețuirea la 4˚C nu a fost posibilă la niciuna dintre cele trei specii de nematozi galicoli (Grafic 2).

Figură 5.3. Reprezentarea grafică a numărului de nematozi, la 4˚C, pe parcursul a 12 săptămâni la speciile M. hapla, M. incognita și M. javanica.

Figură 5.4. Reprezentarea grafică a numărului de nematozi, la 10˚C, pe parcursul a 12 săptămâni la speciile M. hapla, M. incognita și M. javanica.

Spre deosebire de temperaturile inferioare, la 10˚C supraviețuirea a fost de aproape 23% în ultima săptămână, la specia Meloidogyne incognita, specie la care juvenilii încă prezentau mișcări intense.

Figură 5.5. Reprezentarea grafică a numărului de nematozi, la 20˚C, pe parcursul a 12 săptămâni la speciile M. hapla, M. incognita și M. javanica.

Câmpurile infestate se pot lăsa necultivate în perioada iunie-septembrie (Griffin și Jersen, 1997). Chiar și specii termofile, printre care Meloidogyne javanica, pierd din infecțiozitate la temperaturi de peste 35˚C (Freire și colab.,2007).

Meloidogyne arenaria – induce gale mari sistemului radicular care, uneori, apar ca un șirag de perle pe toată lungimea rădăcinilor. La plantele de tomate, aceste gale, apar mai frecvent pe rădăcinile subțiri și cele laterale, mult mai reduse spre deosebire de galele produse de M. incognita, care, au dispunere asemănătoare doar că sunt mai spațiate.

Meloidogyne hapla – induce gale relativ mici, poziționate adesea pe rădăcina pivotantă, pe cele secundare sau în partea terminală a acestora.

Meloidogyne incognita – indice gale mari.

Meloidogyne javanica – indice gale relativ mari.

5.5. Concluzii

Lipsa stimulilor din partea plantei-gazdă reflectă, cel mai probabil, gama largă de plante-gazdă atacate de acest gen de nematode.

Dezvoltarea, eclozarea juvenililor și migrarea speciilor de Meloidogyne sunt dependente, în cea mai mare parte, de sursele de căldură și de apă. Temperatura rămâne factorul determinant cel mai important care influențează puternic mecanismele de supraviețuire. Pe baza acestei capacități de supraviețuire speciile de Meloidogyne se grupează în termofile și criofile.

În acest experiment, supraviețuirea celor trei specii s-a dovedit afectată de temperatură și de timpul scurs de la eclozare. Slaba supraviețuire (sub 50% în primele patru săptămâni) la 4˚C a speciei Meloidogyne hapla , în cazul experimentului de față, este contrară altor constatări deși specia este cunoscută ca fiind criofilă, capabilă să supraviețuiască în sol la temperaturii sub 10˚C.

La 20˚C supraviețuirea a fost mai mare de 60% în primele 4 săptămâni urmând ca din săptămâna a 6-a să scadă abrupt. După eclozare, la 20˚C, proaspeții juvenili de Meloidogyne hapla ar trebui să găseasă o plantă gazdă în scurt timp fiindcă, după patru săptămâni, supraviețuirea lui scade drastic. Specia este cunoscută și sub denumirea de viermele nordic al rădăcinilor iar la 10˚C sau peste acest prag termic Meloidogyne hapla începe dezvoltarea.

Deși specia a fost descoperită în climatul temperat, considerată rezistentă la temperaturi scăzute, mulți nematologi nu sunt încă siguri de originea sa. O evoluție mult mai constantă, mai tolerantă față de temperatura medie a experimentului (10˚C), a avut specia Meloidogyne incognita explicând astfel distribuția mai largă a acestui nematod și nu ar fi exclus o potențială de amenințare pentru multe culturi agricole cu acestă specie

Cel mai mare conținut de lipide, din interiorul juvenililor, s-a observant în primele 4 săptămâni, la toate cele trei specii când mobilitatea lor a fost crescută, ceea ce ar sugera activități metabolice ridicate.

Epuizarea conținutului lipidic a debutat din partea anterioară a corpului și doar sporadic, la unii juvenili, s-au observant pierderi pe toată suprafața corpului.

Având în vedere diferitele constatări, inclusiv prezentul experiment, se poate spune rotația culturilor cu plantele predilecte speciilor de nematozi galicoli, necultivarea terenurilor, fie și câteva luni, precum și temperaturile scăzute peste iarnă, pot afecta grav supraviețuirea.

Cu toate acestea, rămâne dificilă extrapolarea acestor rezultate in vitro. Ele pot avea însă caracter orientativ în bună parte , deoarece solul este un sistem complex în care efectele sezoniere, ritmul diurn și schimbările de temperatură, fluctuațiile umidității și alți numeroși factori ar avea impact mult mai mare în supraviețuirea și infecțiozitatea juvenililor din stadiul J2.

În acest experiment supraviețuirea a fost verificată prin observarea mișcărilor ondulatorii de înaintare. Se știe că în situațiile nefavorabile de mediu juvenilii de Meloidogyne pot intra în diapauză. Este posibil ca o parte din nematode să fi fost deja în această stare în timpul experimentului fiind considerați morți, mai cu seamă pentru juvenilii expuși la 4˚C.

BIBLIOGRAFIE

Agenbag M. 2016. Identification and reproduction potential of South Africa Meloidogyne species. Dissertation submitted in fulfilmentof the requirements for the degree Magister Scientiae in Environmental Sciences at the Potchefstroom Campus of the North-West Univesity, 106 pp.

Barret J., 1991. Anhydrobiotic nematodes. Agricultural Zoology Reviews, volume 4. Andover UK.

Bird A.F. & Soeffky A. (1972). Changes in the ultrastructure of the gelatinous matrix of Meloidogyne javanica during dehydration. Journal of Nematology 4: 166-169.

Bird A.F. & Wallace H.R., 1965. The influence of temperature on Meloidogyne hapla and Meloidogyne javanica. Nematologica 11: 581-589.

Bird A.F., 1979. A method of distinguishing between living and dead nematodes by anzymatically induced fluorescence. Journal of Nematology 11: 103-105.

Cooper A.F., & van Gundy S.D., 1971. Senescence, quiescence and cryptobiosis. Plant Parasitic Nematodes, volume II. Academic Press NY, pp. 297-318.

Curtis R.H.C., Robinson A.F., Perry R.N. 2009. Hatch and host location. In: In: Perry R.N., Moens M., Starr J.L. (Eds.). Root-knot Nematodes, Cabi International, Wallingford, UK, pp.139-152.

Davide R.G., Triantaphyllou A.C., 1968. Influence of environment on development and sex differentiation of root-knot nematodes. Nematologica 14: 37-46.

De Guiran D. 1979. A necessary diapause in root-knot nematodes. Observations on its distribution and inheritance in Meloidogyne incognita. Revue de Nématologie 2: 223-231.

De Guiran D. & Villemin M.A. 1980. Spécifité de la diapause embryonnaire des oeufs de Meloidogyne (Nematoda). Revue de Nématologie 3: 115-121.

Entwistle K., 2003. Root-knot nematode infection of creeping bentgrass greens. Greekpeeper International, February.

Evans A.A.F. & Perry R.N. 1976. Survival strategies in nematodes. In: Croll N.A. (Ed.). The Organisation of Nematodes. Academic Press, London, pp. 383-424.

Evans A.A.F. & Perry R.N. 2009. Survival mechanisms. In: Perry R.N., Moens M., Starr J.L. (Eds.). Root-knot Nematodes, Cabi International, Wallingford, UK, pp. 201-219.

Evans A.A.F. 1987. Diapause in nematodes as a survival strategy. In: Veech J.A. & Dickson D.W. (Eds.). Vistas on Nematology. Society of Nematologists, Maryland, pp. 180-187.

Ferraz Luiz C.C.B, Brown D.J.F. 2002. An Introduction to Nematodes: Plant Nematology, A student’s textbook. Pentsoft Sofia, Bulgaria, pp. 7-11;

Forge T.A., MacGuidwin A.E., 1992. Impact of thermal history on Meloidogyne hapla second stage juveniles to external freezing. Journal of Nematology 24: 262-268.

Freckman D., Kaplan T.D., 1977. A comparation of techniques for extraction and study of anhydrobiotic nematodes for dry soils. Journal of Nematology , 9: 176-181.

Freire E.S., Campos V.P., Dutra M.R., Rocha F.S., Silva J.R.C., Poza E.A., 2007. Infectividade de juveniles do seguando estadio de Meloidogyne incognita em tomaterio apos privacao alimentar em solo e agua em diferentes condicoes. Summa Phytopathologica 33: 270-274.

Griffin G.D., Jensen K.B., 1997. Importance of temperature in the pathology of Meloidogyne hapla and Meloidogyne chitwoodi on legumes. Journal of Nematology 29: 112-116.

Huang S.P. & Pereira A.S. 1994. Influence of inoculum density, host and low temporare period on delayed hatch of Meloidogyne javanica eggs. J. Nemato. 26(1): 72-75.

Jatala P., 1975. Efficiency of potassium permanganate in differentiating between live and dead nematodes. Annals of Applied Biology 80: 109-113.

Karssen G., Moens M., 2006. Root-knot nematodes. In: Perry R.N., Moens M. (Eds). Plant Nematology, pp. 59-88.

Kutywayo V. & Been T.H. 2006. Host status of six major weeds to Meloidogyne chitwoodi and Pratylenchus penetrans, including a preliminary field survey concerning other weeds. Nematology 8: 647-657.

Lewis E.E. & Pérez E.E., 2004. Ageing and development behaviour. In: Gaugler R. & Bilgrami A.(Eds.). Nematode Behaviour, CAB International, Wallingford, UK. Pp. 151-172

Monzanilla-Lopez R.H. & Starr J.L. 2009. Interactions with other pathogens. In: Perry R.N., Moens M., Star J.L. (Eds.), Root-Knot Nematodes. CAB International, Wallingford, UK, pp. 223-240.

Perry R.N., Knox D.P., Beane J. 1992. Enzimes released during hatching of Globodera rostochiensis and Meloidogyne incognita. Fundamental and Applied Nematology 15: 238-288.

Pickup J., Rothery P., 1991. Watter-loss and anhydrobiotic survival of nematodes of Antarctic fell-fields. Oikos 61: 379-388.

Prot J.C., van Gundy S.D., 1981. Influence of photoperiod and temperature on migrations of Meloidogyne juveniles. Journal of Nematology 13: 217-220.

Reversat G., 1981. Consuption of food reserves by starved second stage juveniles of Meloidogyne javanica under conditions osmobiosis. Nematologia 27:207-214.

Siddiqui I.A. $ Taylor D.P. 1970. The biology of Meloidogyne naasi. Nematologica 16: 133-143.

Towson A.J., Apt W.J., 1983. Effect of soil water potential on survival of Meloidogyne javanica in follow soil. Journal of Nematology 15: 110-115.

Vrian T.C., Barker K.R., Holtzman G.I., 1978. Influence of low temperature on rate of development of Meloidogyne incognita and Meloidogyne hapla larvae. Journal of Nematology 10: 166-171.

Wallace H.R. 1966. Factors influencing the infectivity of plant-parasitic nematodes. Proceedings of the royal Society of London, Series B 164, pp. 592-614.

Wallace H.R. 1968a. The influence of soil moisture on the survival and hatch of Meloidogyne javanica. Nematologica 14: 231-241.

Wallace H.R. 1968b. The influence of aeration on the survival and hatch of Meloidogyne javanica. Nematologica 14: 223-230.

Warton D.A., 1986. A functional biology of nematodes. The Johns Hopkins University Press, Baltimore, MD.

Wright D.J., 1998. Respiratory physiology, nitrogen excretion and osmotic and ionic regulation. Wallingford CABI, pp. 103-131.

Wright D.J., Perry R.N., 2006. Reproduction, Physiology and biochemistry. In: Perry R.N., and Moens M., (Eds). Plant nematology. Wallingford CABI, pp. 185-202.

CONCLUZII GENERALE

Necesitatea abordării temei de cercetare a acestei lucrări a rezultat din faptul că în prezent, în țara noastră, există un volum de informații redus privind, morfologia, variabilitatea și ecologia speciilor de nematode galicole aparținând genului Meloidogyne.

Prin studiul populațiilor provenite din 29 de județe, de la 18 plante-gazdă aparținând a 10 familii botanice, au fost depistate, identificate și descrise patru specii: Meloidogyne incognita, M. hapla, M. arenaria și M. javanica.

Aceste patru specii au importanță fitosanitară și prezintă o largă toleranță față de habitat, planta-gazdă și temperatură.

Pentru aceste specii au fost realizate măsurători și descrieri ale stadiilor juvenile de dezvoltare (J2), precum și ale adulților, stabilindu-se totodată distribuția acestor specii în diferite locații din România.

Datorită diferențelor morfometrice identificate în populațiile de Meloidogyne au fost effectuate analize suplimentare de bilogie moleculară ale AND-ului acestor specii (PCR, PCR-SCAR, secvențierea unor domenii a genelor ribozomale), stabilindu-se existența unei variabilități morfologice interspecifice.

Prin utilizarea analizelor de secvențiere și reconstrucție filogenetică a regiunii D2-D3 ADNr 28 S a fost contruit un arbore filogenetic pentru cele patru specii de Meloidogyne, realizându-se astfel încadrarea taxonomică a acestor specii stabilindu-se anumite asemănări genetice cu populațiile din ale țări.

Analizând concluziie desprinse din rezulatele obținute pe parcursul acestui studiu, putem aprecia că populațiile specie M. incognita și M. hapla au o distribuție procentuală similar, echilibrată, spre deosebire de populațiile din speciile M. arenaria, respective M. javanica care au o distribuție mai limitată pe teritoriul României.

În cadrul descrierilor celor patru specii, numărul masculilor a fost semnificativ mai mare în condiții adverse de mediu.

Pe parcursul investigațiilor de teren și a celor din laborator au fost observate hipertrofii ale țesutului radicular, cel mai adesea la locul de hrănire a nematodului, care au codus la formarea galelor caracteristice, mai mult sau mai puțin pronunțate, în funcție intensitatea atacului, specia de nematod identificată și planta-gazdă.

Diagnoza inițială s-a făcut observând dimorfismul sexual evident prin forma și dimensiunile celor două sexe.

Modelul perineal al femelie, rezultat din aspectul general al striurilor dorsale și ventrale, forma anusului, a vulvei, prezența fasmidelor și a punctuațiilor, forma capului și structura cozii mascului și juvenilului infestant, reprezintă caractere de bază în diagnoza acestui grup de nematode.

BIBLIOGRAFIE GENERALĂ

Abad P., Favery B., Rosso M.N., Castagnone-Sereno P. 2003. Root-knot nematode parasitism and host response: molecular basis of a sophisticated interaction. Molecular Plant Pathology4: 217-224.

Abawi G.S. & Barker K.R. 1985. Effects of cultivar, soil, temperature and levels of Meloidogyne incognita on root necrosis and Fusarium wild of tomatoes. Phytopathology74: 433-438.

Abrudan I. & Medve A. 2008. Ghidul ariilor naturale protejate din județul Sălaj. Editura Școala noastră – Zalău, pp. 4-20.

Adab P., Gouzi J., Aury J.M., Castagnone-Sereno P., Danchin E.G.J., Deleury E., Perfus-Barbeoch L., Anthouard V., Artiguenave F., Blok V.C., Caillaud M.C., Coutinho P.M., Dasilva C., De Luca F., Deau F., Esquibet M., Flutre T., Goldstone J.V., Hamamouch N., Hewezi T., Jaillon O., Jubin C., Leonetti P., Magliano M., maier T.R., Markov G.V., McVeigh P., Pesole G., poulian P., Robonson-Rechavi M., Sallet E., Se Guerens B., Steinbach D., tytgat T., Ugrate E., Ghelder C.V., Veronico P., Baum R.J., Blaxter M., Bleve-Zacheno T., Davis E.L., Ewbank J.J., Favery B., greiner E., Henrissat B., Jones J.T., Laudet V., Maule A.G., Quesneville H., Rosso M.N., Schiex T., Smant G., Weissenbach J., Wincker P. 2008. Genome sequence of the metazoan plant-parasitic nematode Meloidogyne incognita. Nature Biotechnology 26(8): 909-915.

Adam M.A.M., Phillips M.S., Block V.C. 2007.Molecular diagnostic key for identification of single juvenilesof seven common and economically important species of seven common and economically important root-knot nematodes (Meloidogyne spp.). Plant Pathology 56: 190-197.

Agenbag M. 2016. Identification and reproduction potential of South African Meloidogyne species. Dissertation submitted in fulfilment of the requirements fo the degree Master Scientiae in Enviromental Sciences at the Potchefstroom Campus of the North-West University, 105-106 pp.

Agrios G.N. 1997. Plant Pathology 4th Edition, Academic Press, USA, pp. 217-224.

Ahmed M., van Vossenberg B.T., de Cornelisse C., Karssen G. 2013. On the species status of the root-knot nematode Meloidogyne ulmi Palmisano & Ambrogioni (Nematoda, Meloidogynidae). ZooKeys362:1-27.

Alexandru I. Ș., Alexandru M. 1998. Brăila. Editura libertatea, pp. 50-123.

Alexandru I. Ș., Alexandru M. 2000. Brăila-Galați. Brăila. Editura Dunărea – Paper Print Invest, 116 p.

Ansari T., Asif M., Siddiqui M.A. 2016. Potential of Botanic for Root-knot Nematode Management on Tomato. Lambert Academic Publishing, Germania, pp. 1-14.

Anwar S.A & Van Gundi S.V., 1993. Effect of Meloidogyne incognita on root shoot growth parametres of susceptible and resiatant varietes of tomato. Afro-Asian Journal of Nematology 3: 152-460.

Anwar S.A. & McKenry M.V. 2012. Incidence and population density of plant-parasitic nematodes infecting vegetable crops ad associated yield losses. Pakistan Journal of Zoology 44: 327-333.

Anwar S.A., Kamran M., Javed M., Khan S.A., Sahi G.H. 2010. Incidence of root-nkot nematodes on tomato in Sargodha, Punjam, Pakistan. Pakistan Journal of Nematology 28(2): 253-262.

Anwar S.A., Trudgill D.L., Phillips M.S. 1994. The contribution of variation in invasion and development rates of Meloidogyne incognita to host status differences. Nematologica 40: 579-586.

Anwar S.A., Zia A., Hussain M., Kamran M. 2007. Host suitability of selected plants to Meloidogyne incognita in the Punjab, Pakistan. International Journal of Nematolgoy (1): 144 – 150.

Ayoub S.M. 1980. Plant Nematology. An Agricultural Training Aid. NemaAid Publication, Sacramento, CA, United States of America, 195 pp.

Backlund H. 1938. Eine Methode zur quantitativen Underschuchung der Mikrofauna in Moos, Förna, Trift u. dgl. Sowe einige vorläufige Ergebnisse mit dieser Methode. Mem. Soc. Fauna et Flora, nr 14.

Baermann G. 1917. Eine einfache Methode zur Auffindung von Ankylostomum (Nematoden) Larven in Erdproben. Geneesk. Tijdschr. Nem.-Indië 57, pp. 131-137.

Bajaj H.K., Kanwar R.S., Gupta D.C. 2011. Handbook of Practical Nematology. Scientific Publishers, Jodhpur, India, pp. 100 – 140.

Baldwin J. G., Barker K. R. 1970. Host suitability of selected hybrids, varieties and inbreds of corn to populations of Meloidogyne spp. Journal of Nematology 2: 345-350.

Baldwin J.G. & Hirschmann H. 1975. Body wall fine structure of the anterior region of Meloidogyne incognita and Heterodera glycines. Journal of Nematology 8: 1-17.

Baldwin J.G. & Hirschmann H. 1976. Comparative fine structure of stomatal region of males of Meloidogyne incognita and Heterodera glycines. Journal of Nematology 8: 1–17.

Bara I.S., Toma D., Lazăr I. 2012. Județul Hunedoara – monografie, vol. I, Editura Emia, pp. 7-49.

Barbosa D.H.S.G., Veira H.D., Souza R.M., Silva C.P. 2004. Survey of root-knot nematode (Meloidogyne spp.) in coffee plantations in the state of Rio de Janeiro, Brazil. Nematologia Brasileira 28(1): 43-47.

Barker K.R. & Olthof T.H.A. 1975. Relationship between nematode population densities and crop responses. Annual Review of Phytopathology 14: 327-353.

Barret J., 1991. Anhydrobiotic nematodes. Agricultural Zoology Reviews, volume 4. Andover UK.

Beek J.G., Folkertsma R., Poleij L.M., van Koert P.H.G., Bakker J. 1997. Molecular evidence that Meloidogyne hapla, M. chitwoodi and M. fallax are distinct biological entities. Fundamental and Applied Nematology 20: 513-520.

Beijerinck M.W. 1887. The Gardenia root-desease. Garderners Chronicle 1: 488-489.

Beratlief C., Romașcu E., Adriano M. 1962. Mijloace de combatere a viermelui rădăcinilor (Heterodera maroni Cornu). Rev. Gosp. Agric. Stat. Vol. XIV, nr. 15, pp.13-24.

Berkeley M.J. 1855. Vibrio forming cysts on the roots of cucumbers. Gardener’s Chronicle and Agricultural Gazette 14, pp. 220.

Berney M.F. & Bird G.W. 1992. Distribution of Heterodera carotae and Meloidogyne hapla in Michigan carrot production. Journal of Nematology 24(4): 776-778.

Bhosle B.B., Mukesh S., Puri S.N., Suvasish D. 2004. Prevalence of phytophagous nematodes in rizosphere of okra (Abelmoschus esculentus) in Parbhani district, Maharashtra, India. Indian Journal of Nematology 34(1): 56-59.

Bird A.F.& Self P.G. 1995. Chitin in Meloidogyne javanica. Fundamental and Applied Nematology 18: 235–239.

Bird A.F. & Wallace H.R., 1965. The influence of temperature on Meloidogyne hapla and Meloidogyne javanica. Nematologica 11: 581-589.

Bird A.F. & Soeffky A.1972. Changes in the ultrastructure of the gelatinous matrix of Meloidogyne javanicaduring dehydration. Journal of Nematology 14: 166–169.

Bird A.F. 1979a. Ultrastructure of the tail region of the second-stage preparasitic larva of the root-knot nematode. International Journal of Parasitology 9: 357–370.

Bird A.F., 1979b. A method of distinguishing between living and dead nematodes by anzymatically induced fluorescence. Journal of Nematology 11: 103-105.

Bird A.F. & McClure M.A. 1976. The tylenchid (Nematoda) eggshell: structure, composition and permeability. Parasitology 72: 19–28.

Bird A.F. 1968a. Changes associated with parasitism in nematodes. III. Ultrastructure of the egg shell, larval cuticle, and contents of the subventral esophageal glands in Meloidogyne javanica, with some observations on hatching. Journal of Parasitology 54: 475–489.

Bird A.F. 1968b. Changes associated with parasitism in nematodes. IV. Cytochemical studies on the ampulla of the dorsal esophageal gland of Meloidogyne javanica and on exudations of the buccal stylet. Journal of Parasitology 54: 879–890.

Block V.C. & Powers T.O. 2009. Biochemical and molecular identification. In: Perry R.N., Moens M., Starr J.L. (Eds.). Root-knot nematodes. Wallingford, UK, CABI Publishing, pp. 38-138.

Blok V.C., Wishart J., Fargette M., Berthier K., Philips M.S. 2002. Mitochondrial DNA differences distinguishing Meloidogyne mayaguensis from the major species of tropical root-knot nematodes. Nematology 4: 773-781.

Bogdan A. & Călinescu M. 1976. Județul Satu Mare. Editura Academiei RSR- București, pp. 10-44.

Boguleanu G. 1961.Combaterea în sere a nematodului rădăcinilor (Heterodera maroni Cornu). Grădina, via și livada 4, pp. 60-62.

Breda de Haan J.V. 1899. Levensgeschiedenis en Bestrijding van het Tabaksaaltje (Heterodera radicicola) in Deli. Meded. Pl.Tuin, Batavia 35.

Bridge J., Starr J. 2007. Plant Nematodes of Agricultural Importance. Manson Publishing, U.K., 152 pp.

Brito J., Powers T.O., Mullin P.G. Inserra R.N., Dickson D.W. 2004. Morphological and molecular characterization of Meloidogyne mayaguensis isolates from Florida. Journal of Nematology 36: 232-240.

Bugă D. & Zăvoianu I. 1974. Județul Dîmbovița. Editura Academiei RSR, 164 pp.

Bulletin OEPP/EPPO Bulletin. 2013. PM 7/119 (1) Nematode extraction. Vol. 43. pp. 471-495.

Bulletin OEPP/EPPO Bulletin.2016. PM 7/129 (1) DNA barcoding as an identification tool for a number of regulated pests. Vol. 46, pp. 501-537.

Caillaud M.C., Dubreuil G., Quentin M., Perfus-Barbeoch L., Lecomte P., de Almeida Engler J., Abab P., Rosso M.N., Favery B. 2008. Root-knot nematodes manipulate plant cells functions during a compatible interaction. Journal of Plant Physiology 165 : 104-113.

Canto-Sáenz M. 1985. The nature of rezistance to Meloidogyne incognita Chitwood, 1949. In: Sasser J.N. & Carter C.C. (Eds.). An Advanced Treatise on Meloidogyne – Biology and Control, Vol. I, Raleigh, North Carolina State University Graphics, USA, pp. 225-231.

Carneiro R.M.D.G., Gomes C.B., Almeida M.R.A., Gomes A.C.M.M., Martins I. 2003. First record of Meloidogyne ethiopica Whitehead 1968 on kiwi in Brazil and reaction on different plant species. Nematologia Brasileira 27: 151-158.

Carrillo-Fasio J.A., García Estrada R.S., Molar R.A., Márquez-Zequera I., Cruz Ortega J.E. 2000. Identificación y Distribución de Especies del Nematodo Nodulador (Meloidogyne spp.) en Hortalizas, en Sinaloa, México. Revista Mexicana de Fitopatología, México, vol. XVIII , nr. 2, pp. 115- 119.

Carșai T.C., Vlaic A., Coșier V., Bâltean A.V. 2010. Cercetări privind polimorfismul la locusul genei leptinei în scopul aplicării selecției asistate de markeri genetici la taurine. Editura Bioflux, Cluj, pp 11-30.

Ceianu V. 1958. Viermele rădăcinilor-Heterodera maroni. Grădina, via și livada, nr. 11, pp. 48-51.

Chitwood B.J. 1949. Root-knot nematodes, part I. A revision of the genus Meloidogyne Goeldi, 1877. Proceeding of the Helminthological Society of Washinton. 16, pp. 90-104.

Cho H.J., Kim C.H., Park J.S., Jeoung M.G. 1987. Distribution of root-knot nematodes Meloidogyne spp. and their races in economic crops in Korea. Korean Journal of Plant Pathology 3(3): 159-163.

Choi Y.E. 1976. Studies on root-knot nematodes (Meloidogyne spp.) in Koreea. The Kasetsart Journal 12:31-35.

Ciobanu N. & Vătămanu V.V. 2012. Flora spontană din zona de sud a județului Olt. Editura Sintech, pp. 24-118.

Ciobanu N., Cremeneanu V.M., Cremeneanu C.C., Petrescu E., Țugui G. 2011. Flora spontană și fauna sălbatică a județului Olt. Editura Sintech, 253 pp.

Ciofu R., Stan N., Popescu V., Chilom V., Apahidean S., Horgoș A., Berar V., Lauder K.F., Anastasiu N. 2004. Tratat de legumicultură. Editura Ceres, București, pp. 341-391; 603-646.

Cîndea E. 1984. Dăunătorii legumelor și combaterea lor. Editura Ceres, pp. 35-36; 83-88; 150-153.

Cliff G.M. & Hirschmann H. 1985. Evaluation of morphological variability in Meloidogyne arenaria. Journal Nematology 17: 445-459.

Cobb N.A. 1918. Estimating the nema population of the soil. Agric. Tech. Circ. Bur. Pl. Ind. U.S., Departament Agriculture. nr 1.

Cobb N.A. 1924. The amphids of Caconema and other nemas. Journal Parasitology 11: 118-120.

Conceicao I.L, Tzortzakakis E.A., Gomes P., Abrantes I., da Cunha M.J. 2012. Detection of the root-knot nematode Meloidogyne ethiopica in Greece. European Journal of Plant Pathology 134(3): 451-457.

Coolen W.A. & D’Here C.J. 1972. A method for the quantitative extraction of nematodes from plant tissue. State Agriculture Research Centre, Ghent, Belgia, pp.77.

Cooper A.F., & van Gundy S.D., 1971. Senescence, quiescence and cryptobiosis. Plant Parasitic Nematodes, volume II. Academic Press NY, pp. 297-318.

Cornu M. 1879. Études sur le Phylloxera vastatrix. Mémories Présentés par Divers Savants á l’Academie des Sciences, Institut France 26, pp.163-341.

Corrales S.P., Francia Varon de A., Barrera M.N. 1999. Survey and effect of Meloidogyne spp. in lulo crop Solanum quitoense. Acta Agronomica Universidad Nacional de Colombia 49(3/4): 43-47.

Coșer V., Vlaic A., Oroian T., Dărăban S., Carșai C. 2006. The use of genome walking method for finding unknown sequence of genomic DNA. Lucrări Științifice Zootehnie și Biotehnologii – Timișoara, volum 39(1): 23-28.

Dalmasso A. & Berge J.B. 1978. Molecular polymorphism and phylogenetic relationship in some Meloidogyne spp.: application to taxonomy of Meloidodyne. Journal of Nematology 10: 323-332.

Daramola F.Y., Popoola J.O., Eni A.O., Sulaiman O. 2015. Characterization of root-knot nematodes (Meloidogyne spp.) associated with Abelmoscnus esculentus, Celosia argentea and Corchorus olitorius. Asian Journal of Biological Sciences 8(1): 42-50.

Darwin C. 1959. The origin of species – Preservation of favoured races in the struggle for life. London: John Murray, Albemarle street, 502 pp.

Darwin C. 2017. Originea speciilor (Ediție revizuită), Editura Academiei Române – București, pp. 23-488.

Dautova M. & Gommers F.J. 2000. Meloidogyne spp. In Macedonia: distribution and virulence for Mi resistance in tomato. Nematol. Medit. 20: 121-128.

Davide R.G. & Triantaphyllou A.C., 1968. Influence of environment on development and sex differentiation of root-knot nematodes. Nematologica 14: 37-46.

Dănculescu P. 1981. Laboratorul clinic – Parazitologie. Editura Medicală, București, pp. 11-90.

De Guiran G. & Demeure Y. 1978. Influence du potentiel hydrique des solus sur le masses d’oeufs de Meloidogyne incognita (Nematoda: Meloidogynidae). Revuie de Nématologie 1:119-134.

De Guiran G & Villemin M.A. 1980. Spécifité de la diapause embryonnaire des oeufs de Meloidogyne (Nematoda). Revue de Nématologie 3: 115-121.

De Ley P., Blaxer M. 2002. Systematic position and phylogeny. In: Lee D.L. (Eds.) The Biology of Nematodes. Taylor & Francis Editure, London , UK, pp. 1-30.

De Ley P., Blaxer M. 2004. A new sistem for Nematoda: combining morphological characters with molecular tree, and translating clades into raks and taxa. In: Cook R., Hunt D.J.(Eds.) Prooceding of the Fourth International Congress of Nematology, 8-13 iunie 2002, Spania.

De Waele D. &Elsen A. 2007. Challenges and tropical plant nematology. Annual Review of Phytopathology 45: 457-485.

Di Vito M. & Greco N. 1988. Inverstigation on the biology of Meloidogyne artiellia. Revue de Nématologie 11: 223-227.

Di Vito M., Greco N., Carella A. 1985a. Population densities of Meloidogyne incognita and yield of Capsicum anuum. Journal of Nematology 17: 45-49.

Di Vito M., Greco N., Zaccheo G. 1985b. On the host range Meloidogyne artiellia. Nematologia Mediterranea 13: 207-212.

Diaconu N. 1970. Combaterea în sere a nematodului rădăcinilor (Meloidogyne maroni Cornu) pe cale chimică. Revista de Horticultră și Viticultură 9: 69-75.

Dragomir G., Dragomir Ș., Ivan P. 2002. Comuna Drăgănești-Vlașca, județul Teleorman: file de monografie. Editura Tipoaltex, Alexandria, pp. 16-55.

Dropkin V.H. & AcedoJ. 1974. An electron microscopic study of the glycogen and lipid in female Meloidogyne incognita (root-knot nematode). Journal of Parasitology 60: 1013–1021.

Dropkin V.H. 1980. Interaction to Plant Nematology. John Wiley and Sons, New York, 293 pp.

Dropkin V.H. & Bird A.F. 1978. Physiological and morphological studies on secretion of a protein – carbohydrate complex by a nematode. International Journal of Parasitology 8: 225–232.

Eisenback J.D. & Hirschmann H. 1981. Identification of Meloidogyne species on the basis of headshape and stylet morphology. Journal of Nematology 13: 513–521.

Eisenback J.D. & Hunt D.J. 2009. General morphology. In: Perry R.N., Moens M., Starr J.L. (Eds.). Root – knot Nematodes. CAB International, Wallingford, UK, pp. 18-54.

Eisenback J.D. & Triantaphillou H. 1991. Root-knot Nematodes: Meloidogyne Species and Races. In: Nickle W.R. (Ed.). Manual of Agriculture Nematology. Dekker, New York, pp. 191-274.

Eisenback J.D. & Hunt D.J. 2009. General morphology. In: Perry R.N., Moens M., Starr J.L. (Eds.).Root-knot Nematodes. CAB International, Wallingford, UK, pp. 18-53.

Eisenback J.D., Graney L.S., Vieira P. 2017. First report of the apple root-knot nematode (Meloidogyne mali) in North America, found parasitizing Euonymus in New York. Plant Disease 101(3):510.

Eisenback J.D., Hirschmann H., Trianthaphyllou A.C. 1980. Morphological comparation of Meloidogyne female head structures, perineal patterns and stylet. Journal of Nematology 12: 300-310.

Elsea J.R. 1951. The historical anatomy of the nematode Meloidogyne hapla (Heteroderidae). Proceeding of the Helminthological Society of Washinton18: 53-63.

El-Sherif A.G., Refaei A.R., El-Nagar M.E., Salem H.M.M. 2007. The role of egg inoculum level of Meloidogyne incognita on their reproduction and host reaction. African Journal of Agricultural Research 2: 159-163.

Esbenshade P.R. & Triantaphyllou A.C. 1985. Use of enzyme phenotipes for the identification of Meloidogyne species. Journal of Nematology 22 :10-15.

Esfahani M.N. 2009. Distribution and identification of root-knot nematode species in tomato fields. Mycopathologia 7(1):45-49.

Esser R.P., Perry V.G., Taylor A.L. 1976. A diagnostic compendium of the genus Meloidogyne (Nematoda: Heteroderidae). Proceedings of the Helminthological Society of Washington 43, pp.138–150.

Evans A.A.F. & Perry R.N. 1976. Survival strategies in nematodes. In: Croll N.A. (Ed.). The Organisation of Nematodes. Academic Press, London, pp. 383-424.

Evans A.A.F. 1987. Diapause in nematodes as a survival strategy. In: Veech J.A. & Dickson D.W. (Eds.). Vistas on Nematology. Society of Nematologists, Maryland, pp. 180-187.

Evans A.A.F. & Perry R.N. 2009. Survival mechanisms. In: Root-knot Nematodes, Perry R.N., Moens M., Starr J.L. (Eds.). Cabi International, Wallingford, UK, pp. 201-219.

Evans A.F. &Perry R.N. 2009. Survival mechanisms. In: Perry R.N., Moens M., Starr J.L. (Eds.).Root-knot Nematodes. CAB International, Wallingford, UK, pp. 201-219.

Eyualem A. & Blaxter M. 2003. Comparation of biological, molecular and morphological methods of species identificationin a set of cultured Panagrolaimus isolates. Journal of Nematology 35(1):119.

Ferraz Luiz C.C.B, Brown D.J.F. 2002. An Introduction to Nematodes: Plant Nematology, A student’s textbook. Pentsoft Sofia, Bulgaria, pp. 7-52.

Ferris H. 1978. Nematode economic thresholds derivation requirements and theoretical consideration. Journal of Nematology 10: 341-350.

Forge T.A., MacGuidwin A.E., 1992. Impact of thermal history on Meloidogyne hapla second stage juveniles to external freezing. Journal of Nematology 24: 262-268.

Fortuner R. 1984. List and status of the genera and families of plant-parasitic nematodes. Helminthology Abstracts 53: 87-133.

Fourie H. Spaull V.W., Joens D., Daneel M.S., De Waele D. 2017. Nematology in South Africa: A View from the 21st Century. Springer International Switzerland, 569 pp.

Frank A.B. 1885. Über das Wurzelalchen und die durch dasselbe verursachten Beschadigungen der Pflazen. Landw. Jagrb. 14: 149-176.

Franklin M.T. 1962. Preparation of the posterior cuticular patterns of Meloidogyne spp. for identification. Nematologica. 7: 336-337.

Franklin M.T. 1965. Meloidogyne root-knot eelworms. In: Plant nematology, Technical Bulletin 7, London, pp. 59-88.

Franklin M.T. 1978. Meloidogyne. In: SoutheyJ.F. (Eds.) Plant Nematology. HerMajesty’s Stationery Office, London, UK, pp.98–124.

Franklin M.T. 1979. Taxonomy of genus Meloidogyne. In: Lamberti F., Taylor C.E. (Eds.). Root-knot nematodes (Meloidogyne species), Systematics, Biology and Control, Academic Press, London, pp. 37-54.

Franz H. 1950. Qualitative and quantitative Untersuchungsmethoden in Biozönotik und Ökologie. Acta Biotheoretica 9(3): 101-104.

Freckman D. & Kaplan T.D., 1977. A comparation of techniques for extraction and study of anhydrobiotic nematodes for dry soils. Journal of Nematology 9: 176-181.

Freire E.S., Campos V.P., Dutra M.R., Rocha F.S., Silva J.R.C., Poza E.A., 2007. Infectividade de juveniles do seguando estadio de Meloidogyne incognita em tomaterio apos privacao alimentar em solo e agua em diferentes condicoes. Summa Phytopathologica 33: 270-274.

Gaugler R. & Bilgrami A.R. 2004. Nematode behaviour. CABI Publishing, Wallingford, UK, pp. xi-xvii.

Geacu S. 2007. Județul Galați- Dicționar de geografie fizică. Editura DC Press, pp. 15-218.

Gerber K. & Taylor A.L. 1988. Asimple techniques for mounting whole root-knot nematode females. Journal of Nematology 20:502-503.

Gheorghe I., Maran A., Stan G., Rusali N., Bauman V., Băluță S., Berbecea P. 1980. Tulcea: monografie. Editura Sport Turism, București, 312 pp.

Ghinea D. 2000. Enciclopedia geografică a României. Editura Enciclopedică, București, 1455 p.

Gillard A. 1961. Onderzoekingen omtrent de biologie, de verspreiding en de bestrijding van wortelknobbelaaltjes (Meloidogyne spp.). Meded LandbHoogesch., Gent – Holland 26: 551-646.

Giovanelli J.L., Farnhann M.W., Wang M., Allen E. 2002. Development of sequence characterized amplified region (SCAR) markers linked to down mildew resistance in broccoli. Proceeding of 13th Crucifer Genetics Work-shop, March 23-26, Davis, CA, p.84.

Golden J.K., Van Gundy S.D. 1974. A disease complex of okra and tomato involving the nematode Meloidogyne incognita and soil-inhabiting fungus Rhizoctonia solani. Phytopathology 65: 265-273.

Göldi E.A. 1892. Relatoria sobre a molestia do cafeiro na provincia da Rio de Janeiro. Archos Mus. Nac., Rio de Janeiro 8: 7-122.

Goodey T.1932. On the nomenclature of the root-gall nematode. Journal Helminthology 10: 21-28.

Goswami A., Goswami V., Singh B. 2015. Morphological and molecular characterisation of tomato (Lycopersicum esculentul Mill) genotypes. Vegetos India 28(4): 67-75.

Grabner M., & Weidenwber C. 2017. Tomatele, de la pasiune la practică. Editura Casa, Oradea, pp. 100-107.

Greco N. & Di Vito M. 2009. Population dinamics and damage levels. In: Perry R., Moens M., Starr J.L. (Eds.). Root-knot Nematodes. CAB International, Wallingford, pp. 246-297.

Grecu F., Mărculeț I., Mărculeț C., Dobre R. 2008. Podișul Transilvaniei de Sud și Unitățile Limitrofe – Repere Geografice. Editura Universității București, pp. 15-67.

Grewal P.S. 1990. The use of agar as a cover-glass support for mounting nematodes. Revué Nematologie 13(1): 121-122.

Griffin G.D., Anderson J.L., Jorgenson E.C. 1968. Interaction of Meloidogyne hapla and Agrobacteriumtumefaciens in relation to raspberry cultivars. Plant Disease Reporter 52: 492–493.

Griffin G.D. & Jensen K.B., 1997. Importance of temperature in the pathology of Meloidogyne hapla and Meloidogyne chitwoodi on legumes. Journal of Nematology 29: 112-116.

Groza (Bontă) M. 2013. Cercetări asupra populațiilor de nematozi din familia Longidoridae prezente în România. U.S.A.M.V. – București, Teză de doctorat, 220 pp.

Gusic V. 1963. Observații asupra atacului viermelui rădăcinilor (Heterodera maroni-Meloidogyne maroni) în culturile de ciclamene din sere. Anal. Rom. Sov. Agric. Zoot., nr. 3: 89-103.

Haegeman A., Mantelin S., Jones J.T., Gheysen G. 2012. Functional roles of effectors of plant-parasitic nematodes Gene 492(1):19–31.

Hartman K.M. & Sasser J.N. 1985. Identification of Meloidogyne species on the basis of differential host test and perineal pattern morphology. In: Barker K.R., Carter C.C., Sasser J.N. (Eds.) An Advaced Treatise on Meloidogyne, Volume II: Methodology. A cooperative publication on the Departament of Plant Pathology and the United Stated Agency for International Development, North Carolina State University Graphics, Releigh, North Carolina, pp. 69-77.

Hirschmann H., 1985a.The classification of the family Meloidogyne. In: Sasser J.N. & Carter C.C. (Eds). An Advanced Treatise on Meloidogyne. Volume I. Biology and Control. A cooperative publication of the Department of Plant Pathology and the United States Agency for International Development, North Carolina State University Graphics, Raleigh, North Carolina, SUA, pp. 35–45.

Hirschmann H. 1985b. The genus Meloidogyne and morphological characters differentiating its species. In: Sasser J.N. & Carter C.C.(Eds.). An Advanced Treatise on Meloidogyne. Volume I. Biology and Control. A cooperative publication of the Department of Plant Pathology and the United States Agency for International Development, North Carolina State University Graphics, Raleigh, North Carolina, SUA, pp. 79–93.

Holterman M., Van der Wurff A., Van der Elsen S., Van megen H. Bongers T., Holovachov O. 2006. Phyllum-wide analysis of SSU rDNA releavs deep phylogenetic relationships among nematodes and accelerated evolution toward crown clades. Molecular Biology and Evolution 23: 1792-1800.

Holterman M., Holovachov O, Van den Elsen S., Van Megen H., Bongers T., Bakker J. 2008. Small subunit ribosomal DNA-based phylogenity of masal Chromadoria (Nematoda) suggests that transitions from marine to terrestrial habitats (and vice versa) require relatively simple adaptations. Molecular Phylogenetics and Evolution 48: 758-763.

Hooper D.J. 1986. Extraction of free-living stages from soil. In: Southey J.F. (Eds.). Laboratory Methods for Work with Plant and Soil Nematodes. Ministry of Agriculture Fisheres and Food, London, UK, pp. 5-30.

Hooper D.J., Hallmann J., Subbotin S.A. 2005. Methods for extraction, processing and detection of plant and soil nematodes. In: Luc M., Sikora R.A., Bridje J. (Eds.). Plant parasitic Nematodes in Subtropical and Tropical Agriculture. CAB International, Wallingford, U.K. pp. 53-86.

Hrisafi C. 1960. Experiențe de combatere a nematodului rădăcinilor Heterodera maroni(Cornu). Com. Academ. R.P.R. 10: 355-360.

Hu M., Hoglund J., Chilton N.B., Zhu X.O., Gasser R.B. 2002. Mutation scanning analysis of mitochondria cytochrome C oxidase subunit I reveals limited gene flow among bovine lungworm subpopulation in Sweden. Electrophoresis 23: 3357-3363.

Huang C.S. & Maggenti A.R. 1969. Mitotic aberrations and nuclear changes of developing gigant cell in Vicia faba caused by root knot nematode Meloidogyne javanica. Phytopathology 59: 447-455.

Hunt D.J. & Handoo Z.A. 2009. Taxonomy, identification and principal species. In: Perry R.N., Moens M., Starr J.L. (Eds.). Root – knot Nematodes. CAB International, Wallingford, UK, pp. 55-97.

Hussain M.A., Mukhtar T., Kayani M.Z., Aslam M.N., Haque M.I. 2012. A survey of okra (Abelmoschus esculentus) in the Punjab province of Pakistan for determination of prevalence, incidence and severity of root-knot disease caused by Meloidogyne spp. Pakistan Journal of Botany 44 (6): 2071- 2075.

Hussain M., Zouhar M., Rysanek P., Anwar S.A. 2016. Relationship between Meloidogyne incognita density and plant growth okra. The Journal of Animal and Plant Sciences 26(3): 739-744.

Hussey R.S. & Barker K.R. 1973. A comparation of methods of collecting inocula of Meloidogyne spp., including a new technique. Plant Desease Reporter 57: 1025-1028.

Iacob N., Romașcu E., Grossu A.V., Rado G., Manolache C., Ceuca T., Ștefan V., Boguleanu G. 1978. Tratat de zoologie agricolă – Dăunătorii plantelor cultivate, Vol I, Edit. Acad. R.S.R., București, pp. 83-99.

Ibrahim I. K.A., Rezk M.A., El-Saedy M.A. 1976. Occurrence and distribution of plant parasitic nematodes in Northen Egypt. Alexandrian Journal of Agricultural Research 24: 93-101.

Jatala P., 1975. Efficiency of potassium permanganate in differentiating between live and dead nematodes. Annals of Applied Biology 80: 109-113.

Jepson S.B. 1983a. The use of second-stage juvenile tails as an aid in the identification of Meloidogynespecies. Nematologica 29: 11–28.

Jepson S.B. 1983b. Identification of Meloidogyne: a general assessment and a comparison of malemorphology using light microscopy, with a key to 24 species. Revue de Nematologie 6: 291–309.

Jepson S.B. 1987. Identification of Root-Knot Nematodes (Meloidogyne species). CAB International, Wallingford, UK, pp 57-246.

Jobert C. 1878. Sur un maladie du cafeier observee au Bresil. Compte Rendue Hebdomodaire des Seances del’Académie des Sciences, Paris 87: 941-943.

Jones J., Gheysen G., Fenoll C. 2011. Genomics and Molecular Genetics of Plant-Nematode Interactions. Springer Science, U.K., 557 p.

Julio V.A., Freitas L.G., Colho J.L.C., Muscardi D.C., Ferraz S. 2003. Extraction of Meloidogyne javanica females from tomato roots through maceration with fungal enzymes. Nematologia Brasiliera 27: 75-80.

Kahan M., R. 2008. Plant Nematodes, Methodology, Morphology, Systematics, Biology and Ecology. Science Publishers, New Jersey, 333 pp.

Kankam F. & Adomako J. 2014. Influence of inoculum levels of root-knot nematodes (Meloidogyne spp.) on tomato (Solanum lycopersicum L.). Asian Journal of Agriculture and Food Science Volume 2.

Kanwar R.S., Bajaj H., Dabur K. 2014. Techniques in Plant Nematology –Nematological Techniques. Lambert Academic Publisching, Saarbrücken, Germania, pp. 43-53.

Kaplan D.T. & Davis E.L. 1990. Improved nematode extraction from carrot disk culture. Journal of Nematology 22: 399- 406.

Karssen G., van Hoenselaar T., Verker B.B., Janssen R. 1995. Secies identification of cyst and root-knot nematodes from potato by electrophoresis of individual females. Electrophoresis16: 105-109.

Karssen G. 2002. The Plant-parasitic Nematode Genus Meloidogyne Göldi, 1892 (Tylenchida) in Europe. Brill Academic Publishers, Leiden, Olanda, pp. 11-161.

Karssen G., Bolk, R.J., Van Aelst A.C., Van Den Beld I., Kox L.F.F., Korthals G., Molendijk L., Zijlstra C., Van Hoof R., Cook R. 2004. Description of Meloidogyne minor (Nematoda: Meloidogynidae), a root-knot nematode associated with yellow patchdisease in golf courses. Nematology 6: 59-72.

Karssen G., Moens M. 2006. Root-knot nematodes. In: Perry R.N., Moens M. (Eds.). Plant Nematology. CAB International, Wallingford, UK, pp. 59-90.

Karssen G., Wesemael W., Moens M. 2013. Root-knot Nematodes. In: Perry R.N., Moens M. (Eds.). Plant Nematology (2nd edition). CAB International, Wallingford, UK, pp. 73-108.

Kaushal K.K. 2013. Plant Nematology: Cyst and Root Knot Nematodes. Biotech Books Publisher, Astral International, Dheli, India, 350 pp.

Khan H.U., Mukhtar T, Ahmad R. 2005. Geographical distribution of root-knot nematodes (Meloidogyne spp.) in Punjab province of Pakistan. Pakistan Journal of Nematology 23(1): 133-140.

Kiewnick S., Dessimoz M., Franck L. 2009. Effects of the Mi-1 and N root-knot nematode-resistance gene on infection and reproduction of Meloidogyne enterolobii on tomato and pepper cultivars. Journal of Nematology 41(2): 134-139.

Kiewnick S., Karssen G., Brito J.A., Oggenfuss M., Frey J. 2008. First report of root-knot nematode Meloidogyne enterolobii on tomato and cucumber in Switzerland. Plant Desease 92: 1370-1970.

Kinloch R.A. 1982. Galling and yields of soybean cultivars grow in Meloidogyne arenaria infected soils. Journal of Nematology 19: 233-239.

Kirjanova E.S. 1963. Collection and taxonomy of root nematodes of the family Heteroderidae (Skarbilovich, 1947) Thorne 1949. In: Methods of Investigating Nematodes of Plants, Soil and Insects. USSR Academy of Sciences , Zoological Institute, Leningrad, pp. 6-32.

Kleynhans K.P.N. 1991. The Root-knot Nematodes of South Africa. Plant Protections Reserach Institute, Pretoria. Technical Comunication Nr. 231 – Departament of Agriculture Development, South Africa, 61-165 pp.

Kofoid C.A. & White W.A. 1919. A new nematode infection of main. J. Am. med. Ass. 72: 567-569.

Korayem A.M. 2006. Relationship between Meloidogyne incognita density and damage to sugar beet in sandy clay soil. Egypt Journal of Phytopathology 14: 61-68.

Kutywayo V. & Been T.H. 2006. Host status of six major weeds to Meloidogyne chitwoodi and Pratylenchus penetrans, including a preliminary field survey concerning other weeds. Nematology 8: 647-657.

Kyndt T., Vieira P., Gheysen G., de Almeida-Engler J. 2013. Nematode feeding sites: unique organs in plant roots. Planta 238(5): 807-818.

Lambert K.N., Tedfold E.C., Caswell E.P, Williamson V.M. 1992. A system for continous production of root-knot nematode juveniles in hydroponic culture. Phytopathology 82: 512-515.

Lammers W., Karssen G., Jelleman P., Baker R., Hockland S., Fleming C., Turner S. 2006.Pest risk assessement Meloidogyne minor. Lavergne G. 1901. La anguilula en Sud-America. Revista Chilena de Historia Naturel, Valpariosa 4: 85-91.

Lavergne G. 1901. La anguilula en Sud-America. Revista Chilena de Historia Naturel, Valpariosa 4: 85-91.

Lewis E.E. & Pérez E.E., 2004. Ageing and development behaviour. In: Gaugler R. & Bilgrami A.(Eds.). Nematode Behaviour, CAB International, Wallingford, UK. Pp. 151-172

Licolopi G. 1875. Sopra alcuni tubercoli radicellari continente anguillole. Rendicoti dell’Accademia delle Scienze, Fisiche e Mathematiche, Napoli 14: 41-42.

Lindsey D.L. & Clayshule M.S. 1982. Influence of initial population densities of Meloidogyne incognita on three Chile cultivars. Journal of Nematology 14: 353-358.

Lordello A.I.L., Lordello R.R.A., Cia E., Fuzatto M.G. 1984. A preliminary raport on a survey of nematodes of the genus Meloidogyne attacking cotton in the state of Sao Paulo. Nematologia Brasileira 8:185-192.

Lyons J.M., Keith A.D., Thomason I.J. 1975. Temperature-induced phase transitions in nematodelipids and their influence on respiration. Journal of Nematology7: 98–104.

Machado Z.C.A., Siquera de Simoes M.K., Filho V.J. 2010. Methods and Techniques in Plant Nematology – A Practical Review on Methods and Techniques in Plant Nematology, VDM Verlag Dr. Müller, pp. 21-37.

Maggeti A.R. & Allen M.W. 1960. The orifin of gelatinous matrix Meloidogyne. Proceedings of the Helminthological Society of Washinton 27: 4-10.

Mai W.F.1985. Plant Parasitic Nematodes: Their Threatto The Agriculture. In:Sasser J.N.,Carter C.C. (Eds.).An Advanced Treatise on Meloidogyne – Biology and Control, vol.I.,North Carolina State University Graphics, Raleigh, NorthCarolina, 422 pp.

Maleita C.M.N., Curtis R.H.C., Powers S.J., Obrantes I.M. De O. 2012. Inoculum levels of Meloidogyne hispanica and M.javanica affect nematode reproduction and growth of tomato genotipes. Phytopathologia Mediterranea 51(3): 566-576.

Mandulu J. & Trudgill D.L. 1993. Weed hosts of Meloidogyne javanica in Tanzania. Pakistan Journal of Nematology 11: 61-64.

Manolache C. 1944. Cîțiva dușmani ai culturilor de toamnă. Ogorul românesc 7: 19-20.

Manolache C., Panin S., Săvescu A., Bucșan I., Manolache F., Hrisafi C. 1949. Situația dăunătorilor animali ai plantelor cultivate în anul 1947-1948. Institutul de Cercetări Agronomice, Metode, Rapoarte, Memorii, Seria nouă, nr. 1:11.

Manzanilla-López R.H., & Starr J.L. 2009. Interactions with Other Pathogens. In: Perry R.N., Moens M. and Starr J.L. (Eds). Root-knot Nematodes.CAB International, Wallingford, UK, pp. 223-240.

Marcinowski K. 1909. Parasitisch und semiparasitisch an Pflanzen lebende Nematoden. Arbeiten aus der Kaiserlichen Biologischen Anstalt für Land – und Forstwirtschaft 7(1): 1-192.

McClullough D.G. Work T.T., Cavey J.F., Liebhold A.M., Marshall D. 2006. Interceptions of nonindigenous plant pests at US ports of entry and border crossings over a 17 year period. Botanical Invasions 8: 611-630.

McClureM.A. & BirdA.F. 1976. The tylenchoid (Nematoda) egg shell: formation of the egg shell in Meloidogyne javanica. Parasitology 72: 29–39.

McSorley R. & Parrado J.L. 1986. Relationship between height of kneaf and root galling by Meloidogyne incognita. Nematotropica 16: 205-211.

Micoletzky H. 1922. Die freilebenden Erdnematoden. Mit besonderer Berücksichtigung der Steiermark und der Bukowina , zugleich eine Revizion samtlicher nicht mariner freilebender Nematoden in Forum von Genus-Beschreibungen und Bestimmugsschlüssel. Arch. Naturgsch. A 89.

Mitchum M.G. & Hussey R.S., Baum T.J., Wang X., Elling A., Wubben M., Davis E.L.2013. Nematode effector proteins: an emerging paradigm of parasitism. New Phytology Journal 199: 879–894.

Moens M., Perry R.N., Starr J.L. 2009. Meloidogyne species – A Diverse Group of Novel and Important Plant Parasites. In: In: Perry R.N., Moens M., Starr J.L. (Eds.). Root-knot Nematodes. CAB International, Wallingford, UK, pp. 1-17.

Montain W.B., Patrick Z.A. 1959. The peach replant problem in Ontario. The pathogenity of Pratylenchus penetrans. Canadian Journal of Botany 37: 459-470.

Monzanilla-Lopez R.H. & Starr J.L. 2009. Interactions with other pathogens. In: Perry R.N., Moens M., Star J.L. (Eds.), Root-Knot Nematodes. CAB International, Wallingford, UK, pp. 223-240.

Mucksood A. G. & Tabreiz A. K., 2016. Race Composition of Meloidogyne Species Infecting Pseuderanthemum atropurpureum in Aligarh District of Western Uttar Pradesh. Asian Journal of Nematology 5: 8-13.

Müller C. 1884. Mittheilungen über die unseren Kulturpflanzen schädlichen, das Geschlecht Heterodera bildenden Würmer. Landw. Jahrb. 13: 1-42.

Müller G. 1968. Biologia solului. Editura Agro-Silvică București. pp 117-378.

Munteanu I. & Munteanu R. 1998. Timiș, Monografie. Editura Marineasa, Timișoara, pp. 4-22.

Mustățea D. & Pătrașcu D. 1960. Combaterea Heteroderei maroni Cornu în serele Balta Doamnei, Regiunea Ploiești. Gădina, via și livada, nr. 12: 63-64.

Mustățea D. 1957.Combaterea viermelui rădăcinilor (Heterodera maroni) în serele O.C.L. Aprozar – Balta Doamnei.Grădina, via și livadanr.12: 63-64.

Nagakura K. 1930. Ueber den Bau und die Lebensgeschichte der Heterodera radicicola (Greef) Müller. Japanese Joutnal of Zoology 3: 95-160.

Nchore, S.B., Waceke, J.W and KariukiG., M. 2010. Incidence and prevalence of root-knot nematode Meloidogyne species in selected indigenous leafy vegetables in Kisii and Trans-Mara Counties of Kenya. In: Transforming Agriculture for improved livelihoods through Agricultural Product Value Chains. 12th KARI Biennial Scientific Conference, November 8-12, Nairobi, Kenya, pp. 675 – 681.

Neal J.C. 1889. The root-knot disease of the peach, orange and other plants in Florida, due to the work of Anguillula. Bull. U.S. Ent. 20: 1-31.

Ngobeni G.L., Fourie H., Mc Donald A.H., Mashela P.W. 2011. Host suitiability of selected South African maize genotypes to the root-knot nematode species Meloidogyne incognita race 2 and Meloidogyne javanica: A preliminary study. South African Journal of Plant and Soil 28: 49-54.

Nono-Womdim R., Swai I.S., Mrosso L.K., Chadha M.L., Opena R.T. 2002. Identification of root-knot nematode species occuring on tomatoes in Tanzania and resistant lines for thei control. Plant Diseases 86 (2): 127-130.

Norton D.C. 1978. Relationship of physical and chemicals factors to populations of plant-parasitic nematodes. Annual review of Phytopathology 17: 279-299.

Oancea D.I. 1973. Gruparea urbană Galați-Brăila: studiu de geografie regională. Editura Academiei RSR – București, pp. 25-61.

OEPP. Bulletin 41. 2011. EPPO Standard PM7/103,Meloidogybe enterolobii. Bulletin OEPP/EPPO 41: 329-339.

Olowe T. 2004. Occurrence and distribution of root-knot nematodes Meloidogyne spp. in cowpea growing areas of Nigeria. Nematology 6: 811-817.

Olteanu Gh., Panaitescu D., Gherman I., Zgardan E., Apatenko V., Fazakas B., Codreanu B.D., Teodorescu I., Iacobiciu I., Tălămbuță N., Erhan D., Marx M., Cristea Gh., Junie M., Doicescu D. 2001. Poliparazitismul la om, animale, plante și mediu. Editura Ceres – București, pp. 13-26; 348-356.

Oostenbrink M. 1954. Een doelmatige methode voor het toetsen van aaltjesbetrij-dingsmiddelen in ground met Hoplolaimus uniformis als proefdier. Meded. LadbHogesch. OptzoekStns Gent 19, pp. 377-408.

Oostenbrink M. 1960. Estimating nematode populations by some selected methods. In: Sasser J.N. & Jenkins W.R. (Eds.). Nematology. The University of North Carolina Press, Chapel Hill, NC, SUA. pp. 85-102.

Orion D. & Kritzman G. 1991. Antimicrobial activity of Meloidogyne javanica gelatinous matrix. Nematologica 14: 481-483.

Orton Williams K.J., 1972. Meloidogyne javanica. In: CIH Descriptions of Plant-parsitic Nematodes, Set 1, nr. 3, Commonwealth Agricultural Bureaux, Farnham Royal, UK.

Orton Williams K.J., 1973. Meloidogyne incognita. In: CIH Descriptions of Plant-parasitic Nematodes,Set 2,nr. 18,Commonwealth Agricultural Bureaux Farnham Royal, UK.

Orton Williams K.J., 1974. Meloidogyne hapla. In: CIH Descriptions of Plant-parsitic Nematodes,Set 3,nr. 31, Commonwealth Agricultural Bureaux, Farnham Royal, UK.

Orton Williams K.J., 1975. Meloidogyne arenaria. In: CIH Descriptions of Plant-parsitic Nematodes,Set 5,nr. 62, Commonwealth Agricultural Bureaux, Farnham Royal, UK.

Overgaard-Nielsen C. 1947. An apparatus for quantitative extraction of nematodes and rotifers from soil and moss. Natura Jutlandica nr. 1, pp. 4-8.

Palmisano A.M. & Ambrogioni L. 2000. Meloidogyne ulmi a root-knot nematode from elm. Nematologia Mediterranea 28(2): 279-293.

Papadopoulou J. & Triantaphyllou A.C. 1982. Sex-differentiation in Meloidogyne incognita anatomical evidence of sex reversal. Journal of Nematology 14(4): 549-666.

Perry R.N. & Curtis R.H.C. 2013. Behaviour and Sensory Perception. In: Perry R.N., Moens M. (Eds.). Plant Nematology, 2nd Edition, CAB International, UK, pp. 246-273.

Perry R.N. & Moens M. 2006. Plant Nematology. CABI International, Wallington, UK, pp. 59-88.

Perry R.N., Knox D.P., Beane J. 1992. Enzimes released during hatching of Globodera rostochiensis and Meloidogyne incognita. Fundamental and Applied Nematology 15: 238-288.

Perry R.N., Moens M., Starr J.L. 2009. Root Knot Nematodes. CAB International, U.K., pp. 2-155; 201-219; 246-466.

Perry R.N., Subbotin S.A., Moens M. 2007. Molecular diagnostics of plant parasitic nematodes. In: Punja Z.K., De Boer S.H., Sanfacon H. (Eds.). Biotechnology and Plant Disease Management. Wallingford, UK, CABI Publishing, pp. 195-226.

Pickup J., Rothery P., 1991. Watter-loss and anhydrobiotic survival of nematodes of Antarctic fell-fields. Oikos 61: 379-388.

Pișota I., Mihai E., Iovănescu M. 1975. Județul Covasna. Academia RSR, pp. 40-139.

Poclid M. 2013. Județul Botoșani în 2013 – Monografie Geografică. Editura Taida, Iași, 607 pp.

Popescu V. & Zăvoianu R. 2013. Cultura Tomatelor, Ardeiului și Vinetelor. Editura M.A.S.T., București, pp. 5-67.

Pricină I. 1910. Din insectele și ciupericle parazite. Viața Agricolă, Nr.3, pp. 4-6.

Prohib C. & Petrache M. 2014. Grădina de legume – ghid pentru combaterea bolilor și dăunătorilor. Editura Ploirom București, pp. 165-169.

Prot J.C., van Gundy S.D., 1981. Influence of photoperiod and temperature on migrations of Meloidogyne juveniles. Journal of Nematology 13: 217-220.

Radu V. & Dărăbanțiu V. 1960. Heterodera maroni în Republica Populară Română (regiunile Cluj și București). Știiță și cercetare biologică – Seria Zoologie 11: 67-90.

Randig O., Bongiovanni M., Carneiro R.M.D.G., Castagnone-Sereno P. 2002. Genetic diversity of root-knot nematodes from Brasil and development of SCAR markers specific for the coffee-damaging species. Genome 45: 862-870.

Ravichandra N.G. 2010. Methods and Tehniques in Plant Nematology. PHD Lerning Private Limited, New Delhi, India, pp. 12-79.

Ravichandra N.G. 2014. Horticultural Nematology. Springer India, pp. 1-54; 101-113;127-202; 321; 369-410.

Reisinger E. 1954. Edaphische Kleintuberbellarien als bodenkudliche Leitformen. Carinthia II. Mitt. Naturwissensch. Ver. Karnten nr. 64.

Renkeon O. 1949. A controlled method for separating terrestrical nematodes. Oikos nr. 1, pp. 82-87.

Reversat G., 1981. Consuption of food reserves by starved second stage juveniles of Meloidogyne javanica under conditions osmobiosis. Nematologia 27:207-214.

Rivoal R. & Cook R. 1993. Nematodes pests of cereals. In: Evans K., Trudgill D.L., webster J.M. (Eds.) Plant-parasitic Nematodes in Temperate Agriculture. CAB International, Wallingford, pp. 259-303.

Rodriguez-Kabana R. 1981. A simple incubation method for the extraction of nematodes from soil. Nematropica 11: 175-185.

Rogojanu V. 1954. Viermele rădăcinilor (Heterodera maroni Cornu). Grădina, via și livada 9: 51-56.

Romașcu E. 1973. Nematozii Plantelor Agricole și Combaterea lor. Editura Ceres, București, pp. 39; 57; 73-79; 91; 100-107; 132; 141-143.

Romașcu E. 1975. Nematodul galicol – Meloidogyne hapla Chitwood 1948 (Nematoda: Heteroderidae) – un nou dăunător al rădăcinilor de morcov. Analele I.C.P.P. București 11: 147-156.

Romașcu E. 1979. Un nou dăunător la căpșun – nematodul galicol al rădăcinilor (Meloidogyne hapla). Simp. Trust. Pomic. Pitești-Mărăcineni, pp. 452-456.

Romașcu E., Ivan M., Lemeni V., Romașcu G. 1977. Considerații morfologice și bio-ecologice asupra speciilor de nematozi ai genului Meloidogyne Goeldi, 1877, identificate în România. Analele I.C.P.P. XII, pp. 267-281.

Rosso M.N. & Hussey R. 2012. Nematode Effectors Protein: Targets And Functions In Plant Parasitism. In: Martin F., Kamoun S. (Eds.). Effectors in Plant-Microbe Interactions. Wiley-Blackwell, Oxford, UK. pp. 327–354.

Sandground J. 1923. “Oxyurius incognita” or Heterodera radicicola? J. Parasit. 10, pp. 92-94.

Sasser J.N. & Freckman D.W. 1987. A World Perspective on Nematology: The Role of the Society. In: Veech J.A., Dickson, D.W. (Eds.). Vistas on Nematology, Hyattsville, Maryland, S.U.A. pp. 7-20.

Sasser J.N., 1989. Plant Parasitic Nematodes: The Farmer’s Hidden Enemy. North Carolina State University, Raleight, pp. 11-14.

Schacht H. 1871. Über einige Feinde und Krankheiten der Zuckerrübe. Zeitschr. Rübenyucker-Industrie 9, pp. 239-250.

Schomaker C., H. & Been T.H. 2006. Plant growth and population dynamics. In: Perry R. and Maurice M. (Eds). Plant Nematology. CAB International, Wallingford, UK, pp. 275-301.

Seinhorst J.W. 1965. The relationship between nematode density and damage to plants. Nematologica 11: 137-154.

Seinhorst J.W. 1970. Dynamics of populations of plant parasitic nematodes. Annual Review of Phytopathology 8: 131-156.

Seinhorst J.W. 1988.The estimation of densities of nematode populations in soil and plants. Vaxtskyddsrapporter nr. 51, Uppsala, Suedia, pp. 23-41.

Sharon E. & Spiegel Y. 1993. Glycoprotein characterization of the gelatinous matrix in the root-knot nematode Meloidogyne javanica. Journal of Nematology 25: 585-589.

Shepherd A.M. & Clark S.A. 1983. Spermatogenes is and sperm structure in some Meloidogyne species (Heteroderoidea, Meloidogynidae) and a comparison with those in some cyst nematodes (Heteroderoidea, Heteroderidae). Revue de Nématologie 6: 17–32.

Siddiqui R.M. 1986. Suborder Tylenchida. In: Tylenchida – Parasites of Plants and Insects, Commonwealth Institute of Parasitology, U.K., pp. 307-320.

Siddiqui I.A. & Taylor D.P. 1970. The biology of Meloidogyne naasi. Nematologica 16: 133-143.

Siddiqui Z.A. & Mahmood I. 1999. Role of bacteria in the management of plant parasitic nematodes. A review. Bioresource Technol 69:167–179.

Singh S. & Khurma U. 2007. Susceptibility of six tomato cultivars to the root-knot nematode Meloidogyne incognita. The South Pacific Journal of Natural Science 13: 73-77.

Singh S.K., Conde B., Hodda M. 2012. Root-Knot Nematode (Meloidogyne incognita) on Bitter Melon (Momordica charantia) near Darwin, Australia. Australasian Plant Disease Notes 7: 75-78.

Širca S., Urek G., Karssen G. 2004. First report of the root-knot nematode Meloidogyne ethiopica on tomato in Slovenia. Plant Disease 88(6): 680.

Skarbilovich T.S. 1959. On the structure of systematics of nematodes order Tylenchida Throne, 1949. Acta parasit. pol. 7: 177-132.

Solcan C., & Sisea C.R. 2012. Biologie moleculară. Editura “Ion Ionescu de la Brad”, Iași, pp. 152-258.

Sorribas F.J., Verdejolucas S. 1994. Survey of Meloidogyne spp. in tomato production fields of Baix-Llobregat county, Spain. Journal of Nematology 26(4): 731-736.

Southey J.F. 1986. Laboratory Methods for Work with Plant and Soil Nematodes. Her Majesty’s Stationary Office, London, U.K. pp. 6-157.

Stan N., Munteanu N., Stan T. 2003. Legumicultură, vol. III. Editura Ion Ionescu De La Brad, Iași, pp. 10-54.

Stefanski W. 1927. Les nématodes libres des torrents de Sinaia avec des considerations sur les nematodes des torrents en géneral. Soc. Română Știi. Nr. 9.

Stirling G. R., Nicol J. M., Reay F. 1998. Advisoryservices for nematodes pests – Operational guide (RuralIndustries Research and Development CorporationPublication Canberra 99/41, p.120.

Stöckli A. 1943. Bodenbiologische Studien. Schweiz. Landwirtsch. Nr. 21, 44 pp.

Stoller B.B. 1957. An improved test for nematodes in the soil. Plant Disease Reorter 41: 531 – 532.

Stone G.H. & Smith R. 1898. Nematode Worms. Hatch. Exp. Stat. Mass. Bull. 55: 1-67.

Strajnar P., Širca S., Knapič M., Urek G. 2011. Effect of Slovenian climatic conditions on the developmentand survivalof the root-knot nematode Meloidogyne ethiopica. European Journal of Plant Pathology 129:81-88.

Tastet C., Bossis M., Gautheir J.P., Renault L., Mugniery D. 1999. Meloidogyne chitwoodi and M. fallax protein variation assessed by two-dimensional electrophoregram-computed analysis. Nematology 1: 301-314.

Taylor A.L. & Sasser J.N. 1978. Biology, Identification and Control of Root-knot Nematodes (Meloidogyne spp.). Departament of Plant Pathology, North Carolina State University and the United States Agency for International Development, University Graphics, NC, USA, 111 pp.

Taylor A.L. 1987. Identification and estimation of root-knot nematode species in mixed populations. Florida Departament of Agriculture and Consumer Services Bulletin nr. 12. Gainesville, Glorida, SUA, pp. 10-73.

Taylor D.P. & Netscher C. 1974. An improved technique for preparing perineal patters of Meloidogyne spp. Nematologica 20: 268-269.

Towson A.J., Apt W.J., 1983. Effect of soil water potential on survival of Meloidogyne javanica in follow soil. Journal of Nematology 15: 110-115.

Triantaphyllou A.C. 1962. Oogenesis in the root-knot nematode Meloidogyne javanica. Nematologica 7: 105–113.

Trianthaphyllou A.C. & Hirschimnn H. 1960. Post-infection development of Meloidogyne incognita Chitwood 1949 (Nematoda: Heteroderidae). Ann. Inst. Phyropath. Benaki 3: 1-11.

Trisciuzi N., Troccoli A., Volvas N., Cantalapierda-Navarrete C., Palomares-Rius J.E., Castillo P. 2013. Detection of camellia root-knot nematode Meloidogyne camelliae Golden in Japanese camellia bonsai imported into Italy: integrative diagnosis, parasitic habits and molecular phylogeny. European Journal of Plant Pathology 138: 231-235.

Trudgil D.L. & Blok V.C. 2001. Apomictic, polyphagous root-knot nematodes: exceptionally successful and damaging biotrophic root pathogens. Annual Review of Phytopathology 39: 53-77.

Trueb M. 1885. Onderzookinden over sereh-zeik suikerrit gedaan in slands plantentuin te Buintenzorg. Meded. Pl.Tuin, Batavia 2.

Turner S.J. 1988. Sample preparation, soil extraction and laboratory facitities for detection of potato cyst nematode. In: Marks J.R., Brodie B.B. (Eds.). Potato Cyst Nematodes: Biology, Distribution and Control. CAB International, Wallingford, U.K. pp. 75-95.

Van Bezooijen J. 2006. Methods and Techniques for Nematology. Wageningen University, Olanda, pp. 60-75.

Van Gundy S.D. 1985. Ecology of Meloidogyne spp. – emphasis on environmental factors affecting survival and pathogenicity. In: Sasser J.N., Carter C.C. (Eds.). An Advanced Treatise on Meloidogyne. Volume I: Biology and control. Raleigh NC, USA, North Carolina State University Graphics, pp. 177-182.

Verschoor B.C. & De Goede R.G.M. 2000. The nematode extraction efficiency of the Oostenbrink elutriator-cottonwood filter with special referece to nematode body size and life strategy. Nematology 2: 325:342.

Viaene N., Mahieu T., de la Pena E. 2007. Distribution of Meloidogyne chitwoodi in potato tubers and comparation of extraction methods. Nematology 9: 143-150.

Viaene N.M., Wiseborn D.B., Karssen G. 2007. First report of the root-knot nematode Meloidogyne minor on turfgrass in Belgium. Plant Deseas 91: 908.

Viglierchio D.R. 1979. Selected aspects of root knot nematode physiology. In: Lamberti F., TaylorC.E. (Eds.).Root knot Nematodes (Meloidogyne species) – Systematics, Biology and Control. Academic Press, London & NewYork, pp.115–154.

Vlăscescu G. & Ianoș I. 1998. Orașele României: mică enciclopedie. Editura Odeon, 494 pp.

Volvas N., Trisciuzzi N., Troccoli A., Luca F., Cantalapierda-Navarrete C., Castillo P. 2007. Integrative diagnosis and parasitic habits of Cryphoderma brinkmani a non-cyst forming heteroderided nematode intercept on Japanese white pine bonsai trees imported into Italy. European Journal of Plant Pathology 135: 717-726.

Volz P. 1951. Untersuchungen uber die Mikrofauna des Waldbodens. Zoologische Jahrbücher, Abt. Systematik und Ökologie 79: 514-566.

Vrian T.C., Barker K.R., Holtzman G.I., 1978. Influence of low temperature on rate of development of Meloidogyne incognita and Meloidogyne hapla larvae. Journal of Nematology 10: 166-171.

Waeyenberge L. &Moens M. 2001. Meloidogyne chitwoodi and M. fallax in Belgium. Nematologia Mediterranea 29: 91-97.

Wallace H.R. 1966. Factors influencing the infectivity of plant-parasitic nematodes. Proceedings of the royal Society of London, Series B 164, pp. 592-614.

Wallace H.R. 1968a. The influence of soil moisture on the survival and hatch of Meloidogyne javanica. Nematologica 14: 231-241.

Wallace H.R. 1968b. The influence of aeration on the survival and hatch of Meloidogyne javanica. Nematologica 14: 223-230.

Warton D.A., 1986. A functional biology of nematodes. The Johns Hopkins University Press, Baltimore, MD, 192 pp.

Wergin W.P. & Endo B.Y. 1976. Ultrastructure of aneurosensory organina root-knot nematode. Journal of Ultrastructure Research 56: 258–276.

Wesemael W.M.L., Moens M. 2008. Quality damage on carrots (Daucus carota L.) caused by the root-knot nematode Meloidogyne chitwoodi. Nematology 10: 261-270.

Wesemael W.M.L., Perry R.N., Moens M. 2006. The influence of root diffusate and host age on hatching of the root-knot nematodes Meloidogyne chitwoodi and M. fallax. Nematology 8: 893-899.

Wesemael W.M.L., Viaene N., Moens M. 2011. Root-knot nematodes (Meloidogyne spp.) in Europe. Nematology 13(1):3-16.

Whitehead A.G. & Hemming J.R. 1965. A comparation of some quantitative methods of extracting small vermiform nematodes fom soil. Annals of Applied Biology 55: 28-38.

Whitehead A.G. 1968. Taxonomy of Meloidogyne (Nematoda: Heteroderidae) with descriptions of four new species. Transactions of the Zoological Society, London 31, pp. 263-401.

Wiggers R.J., Starr J.L., Price H.R. 1990. ADN content and variation cromosome number in plant cells affected by Meloidogyne incognita and M. arenaria. Phytopathology 80: 1391-1395.

Williamson V.M. & Gleason C.A. 2003. Plant-Nematode interactions. Current Opinion in Plant Biology 6(4):327–333.

Windham G. L. & Williams W.P. 1988. Reproduction of Meloidogyne javanica on corn hybrids and inbreds. Journal of Nematology 2: 25-28.

Windham G. L. & Williams W.P. 1994. Penetration and development of Meloidogyne incognita in roots of resistant and susceptible corn genotypes. Journal of Nematology 26: 80-85.

Windham G.L. & Williams W.P. 1987. Host suitability of commercial corn hybrids to Meloidogyne arenaria and M. incognita. Annals of Applied Nematology 1: 13-16.

Wouts W.M. & Sher S.A. 1971. The genera of the subfamily Heteroderidae (Nematoda: Tylenchoidae) with a description of two new genera. Journal of Nematology 3:129-144.

Wouts W.M.1979. Characterization of the family Meloidogynidae with a discussion on its relationship to other families of the suborder Tylenchina based on gonad morphology. In: Lamberti F. & Taylor C.E.(Eds.). Rootknot Nematodes (Meloidogyne species)- Systematics, Biology and Control. Academic Press, London & NewYork, pp.21-35.

Wright D.J., 1998. Respiratory Physiology, Nitrogen Excretion and Osmotic and Ionic Regulation. Wallingford CABI, pp. 103-131.

Wright D.J. & Perry R.N., 2006. Reproduction, physiology and biochemistry. In: Perry R.N., and Moens M., (Eds). Plant Nematology. Wallingford CABI, pp. 185-202.

Wyss U., Grundler F.M.W., Munch A. 1992. The parasitic behaviour of second stage juvniles of Meloidogyne incognita in roots of Arabidopsis thaliana. Nematologica 38: 98-111.

Xu J., Liu P., Meng Q., Long H. 2004. Characterisation of Meloidogyne species from China using isozyme phenotypes and amplified mitochondrial DNA restriction fragment length polymorphism. European Journal of Plant Pathology 110: 309-315.

Young T.W. 1954. An incubation method for collecting migratory endo-parasitic nematodes. Plant Disease Reporter 38: 794-795.

Zijlstra C. 1997. A fast PCR-assay to identify Meloidogyne hapla, M. chitwoodi and M. fallax and to sensitively differentiate them from each other and from M. incognita in mixtures. Fundamental and Applied Nematology20: 505-511.

Zijlstra C. 2000. Identification of Meloidogyne chitwoodi, M. fallax and M. hapla based on SCAR-PCR: a powerful way of enabling reliable identification of populations of individuals that share common trails. European Journal of Plant Pathology 106: 283-290.