ROLUL EXPRESIA SI FUNCȚIONALITATEA FUNCȚI A CANALULUI IONIC TRPA1 [605085]

1
Universitatea din București
Facultatea de Biologie

LUCRARE DE LICENȚĂ

Coordonator știintific:
Lect. Dr. Dana CUCU

Absolvent: [anonimizat]

2018

2
Universitatea din București
Facultatea de Biologie

ROLUL EXPRESIA SI FUNCȚIONALITATEA FUNCȚI A CANALULUI IONIC TRPA1
ÎN CELULELE TUMORALE

Coordonator științific :
Lect
Conf . Dr. Dana CUCU

Absolvent: [anonimizat]

2018

3
ABREVIERI
CGRP – Calcitonin Gene -Related Peptide
DMSO -Dimetil sulfoxid
hTRPA1- human TRPA1
HClO -Acid Hipocloros
ROS -Specii Oxidative Reactive
RNS -Specii Reactive de Azot
TRP-Transient Receptor Potential
TRPA -Transient Receptor Potential Ankyrin
TRPC -Transient Receptor Potential Canonical
TRPM- Transient Receptor Potential Melas tatin
TRPP- Transient Receptor Potential Polycystin
TRPV -Transient Receptor Potential Vanilloid

4
CUPRINS
ABREVIERI …………………………………..……………………..i
INTRODUCERE…………………. …………………….……………5

CAPITOLUL 1. ASPECTE TEORETICE PRIVIND CANALUL TRPA1
1.1 Familia canalelor ionice TRP ……………….
1.2 Caracteristici structurale ale TRPA1…………………..
1.3 Funcționalitatea canalului TRPA1 ……………………….
1.4 Rolul canalului TRPA1 ………………..……..
1.4.1. Sensibilitatea termică specie- specifică a canalului TRPA1
1.4.1.1. TRPA1 la insecte……………….
1.4.1.2. TRPA1 la nematode ……………….
1.4.1.3 TRPA1 la vertebratele ectoterme…………….
1.4.1.4 TRPA1 la mamifere ………………….
1.5 Relația dintre canalele TRPA1 și TRPV1…………………….
1.6 Rolul canalelor TRP în cancer ………….
1.6.1 . Canalele TRPM în cancer ………………
1.6.2 . Canalele TRPV în cancer ……………..
1.6.3. Canalele TRPC în cancer ………………….
CAPITOLUL 2. MATERIALE SI METODE………………………….
2. Studiu ex perimental…………………………………………….
CAPITOLUL 3. REZULTATE SI DISCUTII…………………………..
CAPITOLUL 4. CONCLUZII…………………………………………..
3. Bibliografie………………………………………………………
Comment [DC1]: Se face automat in word. La
sfarsit

5
INTRODUCERE
Transportul regulat al ionilor se realizează prin proteine membranare denumite prin
canale le ionice care mediază o multitudine de procese celulare precum contracția musculară,
proliferarea celulară și transcripția genelor. Canalele ionice sunt clasificate în canale dependente
de voltaj, după selectivitatea ionilor (canale de K, Na, Ca, Cl), canale dependente de ligand, cu
liganzi precum glutamatul, acidul gamma -amino butiric (GABA), acetil colină (Ach), si canale
specializate (conexine, canale operate mecanic). Astfel, disfuncția acestor canale afectează
procesele fiziologice (Bagal, Brown et al. 2013 ). Canalele TRP sunt un grup de canale ionice ce
funcționează ca senzori celulari pentru o gamă largă de stimuli, răspund la elemente de
semnalizare celulară precum Ca2+, temperatură, presiune osmotică, dar și compuși din mediul
extern (Zheng 2013) .
Canalele Transient Receptor Potential (TRP) au fost inițial descoperite la Drosophila
melanogaster (Minke 2010 ) iar de atunci au tot fost studiate din ce în ce mai intens,
descoperindu- se implicatiile acestora în diverse tipuri de maladii. Expunerea prelungită la lumina
puternică arată un flux tranzient de calciu în celulele fotoreceptoare de la musculița de oțet. De
aceea, această genă mutantă a fost denumită “trp”. Această descoperire a dus ulterior la
descoperirea canalelor trp mamaliene, denumite „canonice”, datorită asemănării cu cele de la
Drosophila (Wes, Chevesich et al. 1995 ).
Canalele TRP sunt mediatori importanți ai semnalelor senzoriale cu efecte marcante
asupra funcțiilor celulare și căilor de semnalizare. Mutațiile în genele ce codifică aceste canale
sunt cauza a numeroase boli ereditare la om (Canalopatiile TRP), ce afecte ază sistemele
cardiovascular, renal, osos și nervos. Canalele TRP sunt de asemenea ținte promițătoare
pentru compuși naturali cu potențial terapeutic. Spre exemplu, TRPV1 este supraexprimat într-o
populație de neuroni senzoriali unde mediază excitația și ul terior desensibilizarea pentru
capsaicină și analogul său m ult mai potent, resiniferatoxină. Resiniferatoxina a fost studiată de
Iadarola și Mannes ca și agonist al TRPV1 ce ar putea contracara durerea provocată de cancer
(Kaneko and Szallasi 2014 ).
Activarea canalelor TRP permite trecerea cationilor prin membrană si depolarizează
celulele, ducând la un număr mare de răspunsuri celulare. Aceste canale îndeplinesc diverse Comment [DC2]: Aici o fraza de legatura (o
clasificare sucrta a canalelor in functe de
selectivitate poate..) pentru a introduce fraza urmatoare despre TRP.
Comment [DC3]: Nu se intelege ideea, explic -o
mai bine.
Comment [DC4]: Fraza asta nu spune nimic de
fapt. Da un exemplu de medicament sau de un studio.

6
roluri fiziologice și sunt cel mai probabil prezente la nivelul tuturor celulelor din corpul uman
(Nilius 2013 ).
La mamifere, au fost descoperite în total 28 de canale TRP. Acestea sunt grupate după
similaritatea de secvență în subfamiliile TRPC (Canonical), TRPM (Melastatin), TRPV
(Vanilloid), TRPA (Ankyrin), TRPML (M ucolipin) și TRPP (Polycystin) ( Zheng 2013) .
Anumite canale TRP, precum TRPV1, TRPM8, TRPA1 sunt exprimate în neuroni
senzoriali nociceptivi. Cercetările folosind animale modificate genetic și agenți farmacologici au
confirmat că aceste canale TRP sunt implicate în generarea și transmiterea senzației dureroase și
astfel reprezintă ținte pentru dezvoltarea de agenți analgezici noi (Brederson, Kym et al. 2013) .
Din superfamilia canalelor TRP, TRPA1 este singurul membru al grupului TRPA și este
exprimat predominant în neuroni senzoriali, precum și în celule ale părului și pielii (Wu et al.,
2010). TRPA1 este considerat a fi un chemosenzor și este implicat în canalopatia TRP asociată
cu durere a. TRPA1 este de asemenea exprimat în sistemul vascular și digestiv. Deși nu s -a
demonstrat că TRPA1 ar fi direct implicat în cancer, este implicat în inflamatia intestinală ce este
corelată cu cancerul de colon (Wu et al., 2010). Canalele TRP, în special TRPA1 și TRPV1 sunt
activate de compuși iritanți, majoritatea prezenți în condimente. Agoniști ai TRPA1 ce induc
secreția de adrenalină sunt alilizotiocianatul (AITC) si cinamaldehida (CAN), prezente în uleiul
de muștar și în scorțisoară (Paulsen, Armache et al. 2015) .
Alilizotiocianatul (AITC) este un compus natural ce posedă atât activitate bactericidă, cât
și proprietați anti cancer. Cele mai multe vegetale crucifere sunt surse de AITC în cantitați
considera bile, și printre acestea se numă ră muștarul, wasabi și varza. Proprietățile bactericide și
fungicide ale AITC au fost demonstrate împot riva multor patogeni, și abilităț ile sale împotriva
cancerului au fost dovedite atât în celule cultivate in vitro , cât și pe modele animale.
Bioactivitatea AITC este foarte mare, aproape 90% din cantitatea administrată este absorbi tă
(Geng, Tang et al. 2011) .
Alți activatori ai canalului Transient Receptor Potential Ankirin 1 (TRPA1) sunt produșii
virali si bacterieni. Rolul TRPA1 in acest caz este de detectare si răspuns. Dovezile cele mai
convingătoare provin d in descoperirea că TRPA1 este activat de lipopolizaharide, sau
endotoxine, ce reprezinta principalul imunostimulant prezent la bacteriile Gram -negative,
cauzând activarea rapidă a nociceptorilor (Meseguer, Alpizar et al. 2014 ). De asemenea,
activarea TRPA1 de către lipopolizaharide în nociceptorii vagali și somatici a dus la eliberarea Comment [DC5]: Pe care de fapt nu ai descris -o
Comment [DC6]: E derutanta definitia asta, ca si
cum ar fi o legatura intre TRPA1 si adrenalina

7
locală de neuropeptide, provocînd durere, inflamație neurogenică și vasodilatație. Spre deosebire
de răspunsurile imune tradiționale , care sunt lente, aceste efecte ale produșilor bacterieni toxici
sunt foarte rapide, de ordinul secundelor de la aplicare (Poltorak, He et al. 1998) .
În ceea ce privește inflamația, în timpul acesteia sistemul imunitar eliberează factori
solubili care susțin refacerea țesutului, suprimă inflamația si reduc durerea. Printre acești factori
endogeni se află clase de mediatori lipidici, printre care si reso lvinele, ce acționează ca și
inhibitori ai TRPV1 si TRPA1, reducând durerea inflamatorie (Park, Xu et al. 2011).
Activitatea TRPA1 a fost corelată cu patofiziologia unor afecțiuni precum migrenele și
neuropatiile periferice asociate cu diabetul sau chimioterapia ( Eberhardt, Filipovic et a l. 2012) .
Mecanismul activității TRPA1 în migrene presupune activarea sa de către agenți iritanți și
provocatori de durere, și astfel are loc eliberarea peptidei pro migrene, CGRP pe această cale
neurală. Unii activatori ai TRPA1 sunt cunoscuți ca declanșatori ai migrenelor
(nitroglicerină,partenolid) (Benemei, Fusi et al. 2014) .
TRPA1 este de asemenea fundamental pentru manifestarea unor forme de iritație, o
senzație ce induce scărpinatul, cu rol de apărare împotriva paraziților externi și airitanților.
TRPA1 participă și în alte afecțiuni cutanate, precum dermatita alergică de contact (Oh, Oh et al.
2013 ).
Un rol deosebit al TRPA1 a fost desc operit prin caracterizarea Caenorhabiditis elegans ,
cu privire la gena Trpa1. Acești viermi, precum multiple animale, trăiesc mai mult în climate reci. Studiile sugerează că durata de viață a C. elegans este reglată de o cascadă de semnalizare
ce presupune activarea dependentă de temperaturi scăzute a TRPA1, influx de Ca
2+ și activarea
factorului de transcripție DAF -16/FOXO. Activarea acestei căi a dus la creșterea duratei de viață
în viermii adulți, dar a avut efect opus la larve ( Xiao, Zhang et al. 2013) .
Cancerul pancreatic este o problemă de sănătate majoră, mai ales deoarece tratamentele
convenționale pentru cancer nu sunt foarte eficiente. Aproape toți pacienții ce suferă de cancer pancreatic dezvoltă metastaze urmate de deces. Mulți pacienti prezintă mutații ale oncogenei K –
ras, dar de asemenea numeroase gene supresor tumorale sunt inactivate. Prognosticul acestei boli este sumbru, 15-20% dintre pacienti sunt eligibili pentru rezecție, dar doar 20% din aceștia
supraviețuiesc 5 ani de la realizarea proc edurii. Pentru tumorile in stadiu avansat, cu metastaze,
tratamentul actual cu gemcitabină și chemoiradiere este relativ ineficient . Cu toate acestea, cele

8
mai promițătoare par a fi strategiile bazate pe biologia moleculară a cancerului pancreatic (Li,
Xie et al. 2004 ).
Un rol important în progresia adenocarcinomului pancreatic ductal (PDAC) îl au celulele
pancreatice stelate (PSC). Odată activate, PSC susțin proliferarea și metastaza celulelor tumorale.
Studiul realizat de Storck, Hild și colab. este printre primele ce studiază expresia și funcția
canalelor ionice în celulele pancreatice stelate. Aceștia au descoperit că celulele pancreatice
stelate exprimă canale K Ca3.1, a căror activitate este necesară pentru migrare, și că acestea
cooperează cu TRPC3 pentru a -și exercita funcția (Storck, Hild et al. 2017) .
Implicarea TRPA1 în cancer în mod direct nu a fost demonstrată încă, insă acesta este
implicat în inflamația intestinală, ce este asociată cu cancerul de colon, și Schaefer și colab. au
demonstrat că activatori ai TRPA1, precum izotiocianatul de alil, prin inhalare, promovează
viabilitatea și proliferarea celulelor carcinomului pulmonar cu celule mici (Schaefer, Sto hr et al.
2013) (Engel, Leffler et al. 2011) .
Hayashi, Nakamura și colab. au folosit AITC, agonist al TRPA1 într -un experiment de
wound healing circular al epiteliului gastric. AITC a prevenit repararea zgârieturii în celulele de
epiteliu gastric de șoarece
Scopul acestui studiu este determinarea funcției canalului Transient Receptor Potential
Ankyrin 1 (TRPA1) în celulele adenocarcinomului pancreatic ductal din multiple linii celulare ,
utilizînd AITC ca și activator specific. Obiectivele principale sunt determinarea rolului acestui
canal în migrare și proliferare celulară , și utilizarea sa ca biomarker pentru identificarea bolii și
gradului de malignitate.

Comment [DC7]: Introducerea trbuie sa se
incheie cu precizarea scopului si obiectivelor lucrarii.
Mai mult, trebuie sa faci o introducere la ce ai lucrat
tu. Deci cateva vorbe despre canalele ionice in
cancerul pancreatic. AI cateva studii la care te poti
referi.
Comment [DC8]: Nu maid a enter la sfarsitul
paginii. Pui direct page break.

9
CAPITOLUL 1. ASPECTE TEORETICE PRIVIND CANALUL
TRPA1

1.1 Familia canalelor ionice TRP

Membrii superfamiliei TRP de canale ionice prezintă caracteristici comune, precum cele
6 segmente transmembranare, grade variate de omologie de secvență si permeabilitatea
pentru cationi. În ciuda acestor similaritați, canalele TRP sunt neobișnuite din punct de
vedere al selectivității cationilor si mecanismelor specifice de activare raportat la alte familii
de canale ionice. În multe cazuri, canalele TRP pot fi considerate ca fiind integratoare de
semnale multiple, astfel raspunsul la un input este modificat de către altul. O caracteristică
funcțională este aceea că aceste canale joacă roluri majore in raspunsul la toate clasele
majore de stimuli externi, precum lumina, sune tul, substanțe chimice, temperatură și stimuli
tactili. Canalele TRP oferă de asemenea celulelor abilitatea de a simți modificări în mediul inconjurător, pr ecum modificări de osmolaritate (Venkatachalam and Montell 2007 ).
Canalele TRP sunt ex primate si funcționează într -o mare varietate de organisme
pluricelulare, precum Drosophila melanogaster, Danio rerio, Mus musculus ș i Homo
sapiens . Superfamilia de canale TRP este împarțită în doua grupuri, ce sunt la rândul lor
împărțite în șapte sub familii (Fig. 1 ). A 8 -a subfamilie, TRPY, este reprezentată de canale
TRP de la drojdii. Prezența canalelor TRP la drojdii indică faptul că originea acestor canal e
precedă apariția metazoarelor (Montell 2005 ). Comment [DC9]: Nu dai enter nici inainte nici
dupa titlul de capitol. Se da din paragraph un spatiu
care se mentine permanent.
Comment [DC10]: Daca nu ti- e greu ar fi
potrivita o schema a filogeniei.

10

Figura 1. Superfamilia TRP. (a) Membru al fiecăreia dintre subfamiliile grupului 1. (b) Membru
al fiecăreia dintre subfamiliile grupului 2.
Sunt indicate urmatoarele domenii: A -repetiții ankirinice; cc -domenii coiled -coil; domenii
protein kinazice; domenii TRP.; +++ reprezintă trecerea cationilor (c) Compoziția superfamiliei
TRP ca număr de membri la viermi, muște, șoareci și oameni (Venkatachalam and Montell
2007 ).

Comment [DC11]: Plusurile din figure[ ce
semnific[?

11

Separarea canalelor TRP în cele 2 grupuri este bazată pe modificări topologice si de
secvență. Canalele TRP ce aparțin grupului 1 constituie 5 subfamilii, acestea prezintă cea mai
mare omologie de secvență cu canalul TRP de la Drosophila . Cele mai înrudite canale cu cel de
la Drosophila sunt numite canale TRP clasice, sau TRPC. Subfamiliile TRPV, TRPM, TRPA și
TRPN sunt numite după numele original al membrului descoperit inițial al fiecărei subfamilii.
Proteinele TRPN nu se întâlnesc la mamifere, dar sunt exprimate l a unele vertebrate, precum
Danio rerio. Canalele TRP aparținând grupului 1 prezintă elemente si domenii specifice. Cea
mai mare omologie de secvență se observă la nivelul celor 6 segmente transmembranare.
Subfamiliile TRPC, TRPM si TRPN prezintă de asemenea un domeniu TRP, situat în imediata
vecinătate a celui de al 6 -lea segment transmembranar. Cele mai conservate porțiuni ale
domeniului TRP sunt TRP box 1 și 2. Cu excepția subfamiliei TRPM, canalele din grupul 1
prezintă repetiții ankirinice N -terminale. Cele două subfamilii TRPP și TRPML alcătuiesc grupul
2. Subfamilia TRPP pare a fi cea mai veche, deoarece membri ai acesteia se intâlnesc și la drojdii
și la mamifere (Venkatachalam and Montell 2007 ).

1.2.Caracteristici structurale ale TRPA1
Toate canalele TRP au o structură general conservată, fiind alcătuite din 4 subunități ce
formează un por, fiecare conținând 6 segmente transmembranare (S1-S6) formate dintr -un
segment senzor S1 -S4 și o regiune por conducător de ioni S5 -S6. Domeniile amino -terminal și
carboxi -terminal sunt localizate la nivel citoplasmatic. Printre canalele TRP mamaliene,
Transient Receptor Potential Ankirin 1 ( TRPA1 ) este singurul ce conține un linker alcătuit dintr –
o buclă în ac de păr beta urmată de 2 regiuni alfa- helix și helixul situat înaintea segmentului S1
care leagă domeniul repetițiilor ankirinice cu primul segment transmembranar (Fig. 2) (Cvetkov,
Huynh et al. 2011 ; Brewster and Gaudet 2015) ; (Paulsen, Armache et al. 2015 ).
Mai mult, Dintre canalele TRP ale vertebratelor , TRPA1 conține cea mai mare structură
ARD, estimată la aproximativ 14 -18 segmente de ankyrină. Capătul N -terminal al TRPA1 este
distribuit în două zone cu densitați distincte constituite din două ”tulpini” urmate de uno
”crescență” braț flexibil ă (Fig. 2) (Zheng 2013 ).. Comment [DC12]: Cumva figurat in imagine ca
nu se itnelege despre ce este vorba.

12

Figura 2. Structura canalului ionic TRPA1 (Clapham 2015 ) (modificat )

TRPA1 este exprimat în terminațiile neuronilor senzoriali nociceptivi și este activat de
compusi exogeni toxici și compusi endogeni proinflamatori, rezultând într-un influx de cationi si
depolarizare a neuronului, ceea ce este perceput ca și senzație de du rere. S -a observat că aceste
substanțe reacționează cu tioli si amine primare, ceea ce a dus la prezumpția că acești compusi iși
modifică covalent receptorul, nu îl activează după mecanismul lacăt -cheie (Hinman, Chuang et
al. 2006 ).
Pentru a testa ipoteza, autorii acestui studiu au folosit N -metil maleimidă (NMM)
deoarece aceasta reacționează ireversibil cu lanțurile sulfhidril (SH) în condiții fiziologice.
Astfel, unde TRPA1 tratat cu AITC a produs un răspuns electric tranzitoriu, aplicarea de NMM a
dus la un răspuns pers istent. Prin mutageneza resturilor de cisteină, au fost identificate 3 resturi
de cisteină (Cys621, Cys641 si Cys665) situate la capătul N -terminal ce conferă sensibilitate Comment [DC13]: Cred ca trebuie inserat alta
imagine aici la care sa f=pti faci trim iterile din text.

13
pentru substanțe electrofile. Canalul mutant respectiv prezenta sensibilitate redus ă pentru NMM
și AITC, dar sensiblitatea pentru delta-9- tetrahidrocannabinol, un agonist non- electrofil al
TRPA1 nu a fost afectată. Astfel s -a demonstrat că cele 3 resturi de cisteină identificate conferă
sensibilitate pentru compuși electrofili și că acei compuși non -electrofili interacționeză prin alt
mecanism (Hinman, Chuang et al. 2006 ).
De asemenea, structura determinată a canalului TRPA1 de către Paulsen, Armache și colab
evidențiază distribuția spațială a cisteinelor cheie. Cisteina din poziția 621 (C621) este situată în
prima structură de tip helix- turn-helix, C641 este situată în prima porțiune a structurii beta -pliate,
iar C665 se află înt r-o buclă flexibilă ce conectează structurile beta -pliate cu al doilea helix -turn-
helix . Dintre acestea, cea mai importantă este cisteina din poziția 621, care prezintă reactivitate
ridicată, crescută de restul de lizină adiacent (Paulsen, Armache et al. 2015 ).
La anumite specii non -mamaliene, TRPA1 prezintă o sensibili tate relativ scazută la compuși
electrofili și este mai degrabă activat de căldură. Studii de mutageneză au evidențiat regiuni din
interiorul ARD care codifică pentru răspuns chimic sau termic. Acest lucru sugerează că
domeniul repetărilor ankirinice comunică cu porul. Secvența de repetiții ankyrinice este legată
steric de zonele helix -turn-helix suprapuse ale regiunii linker prin intermediul legăturilor polare
si hidrofobe. Structura este propagată superior și terminată la nivelul domeniului TRP -like, astfel
formând o rețea de interacțiuni strânse cap abile de a duce informație de la domeniul repetițiilor
ankirinice la por (Paulsen, Armache et al. 2015 ).

14
1.3.Funcționalitatea canalului TRPA1
In principiu scrisul merge asa :
1. Se enunta caracteristica este sensibil la…:
2. Se declara grupul care a studiat
3. Se descrie pe scurt (asa cum faci tu) rpin ce experiment.
Cred ca este bine sa structurezi capitolul asa:
Rol in hipoxie
Rol in inflamatie (detectie de ROS)
Rol in detectia ROS
Senzor termic
Titlurile subcapitolelor pot fi mai elaborate.
1.3.1. Rol în hipoxie
În condiții de hiperoxie, O 2 oxidează cisteinele din pozițiile 633 și 856. Oxidarea
activează canalul, putând anula activarea prin hidroxilare la Pro394. S-a demonstrat acest lucru
prin studii de mutageneză ale Dacă cisteinel ore din pozițiile 633 si 856 .suferă mutații , raspunsul
Raspunsul celulelor ce exprimă TRPA1 in caz de hiperoxie este redus drastic. Un alt studiu
realizat de Mori, Takahashi și colab . a demonstrat că în condiții de hipoxie are loc activarea
canalului TRPA1. În condiții normale de oxigenare, TRPA1 este hidroxilat la nivelul prolinei
din poziția 394, în cadrul domeniului repetițiilor ankirinice, de către prolin hidroxilaze (PHD),
inactivând canalul. În condiții de hipoxie, concentrațiile scăzute de O 2 scad activitatea prolin
hidroxilazelor, astfel ducând la nivele crescute de TRPA1 activ ce nu prezintă modificări la nivelul prolinei 394 (Pro394) (Takahashi, Kuwaki et al. 2011
). În condiții de hiperoxie, O 2
oxidează cisteinele din pozițiile 633 și 856. Oxidarea activează canalul, putând anula activarea
prin hidroxilare la Pro394 (Takahashi, Kuwaki et al. 2011 ).
De asemenea, Wang, Cvetkov și colab. au identificat 4 legături disulfurice, ce se
formează între 5 resturi diferite de cisteină in vivo. Aceste modalități de organizare a legăturilor
disulfurice ar putea conduce la mai multe forme conformaționale ale canalului TRPA1, astfel
prezentând diferite situsuri de legare pentru molecule efectoare, precum și accesibilitate
modificată pentru resturile de cisteină ce sunt implicate î n modificări covalente (Wang, Cvetkov
et al. 2012 ). Formatted: List Paragraph, Numbered +
Level: 1 + Numbering Style: 1, 2, 3, … + Start
at: 1 + Alignment: Left + Aligned at: 0.25" +
Indent at: 0.5"
Formatted: Indent: Left: 0.25"
Formatted: Font: (Default) Times New
Roman, 12 pt, Bold
Comment [DC14]: Un alt studiu realizat de ..a
demonstrate ca in conditii de hipoxie..
Field Code Changed

15
În afară de activatorii menționați anterior (izotiocianatul de alil, cinnamaldehida și alicin a),
ce sunt compuși iritanți naturali, TRPA1 este activat și de compuși iritanți de sinteză, prezenți în
gazul lacrimogen, gazele de eșapament, fumul de țigară și agenții de curățare puternici .
Exemplele includ acroleină, formalină și aldehide α – sau β -nesaturate (Kaneko and Szallasi
2014 ).
1.3.2. Rol în inflamație (detecție de ROS)
Două studii diferite au identificat iritanți care activează canalul TRPA1 în neuronii
senzoriali ai căilor aeriene, rezultând în inflamație neurogenică și hipersenzitivitate respiratorie.
Astfel, s -a dovedit activarea TRPA1 de către compuși toxici din fumu l de țigară și aerul poluat,
precum crotonaldehidă, acroleină și agenți oxidanți precum peroxidul de hidrogen (Simon and
Liedtke 2008) .
De asemenea, se menționează și rolul acestui canal în tuse. O rețea densă de nervi
senzoriali localizați în zona inferioară a căilor ae riene inferioare servește această funcție. O
varietate de receptori și canale prezente în terminații sesizează stimulii iritanți și activează
sistemele de răspuns reflex, incluzând tusea. Bessac și Jordt arată rolul predominant al canalelor
TRPV1 și TRPA1 ca senzori ai iritării căilor aeriene și inițiatori ai reflexului de tuse (Bessac and
Jordt 2008 ).
Au fost oferite dovezi ce arată cum substanțe precum superoxidul și peroxinitritul pot
activa TRPA1. Inhalarea de peroxid de hidrogen ( H2O2) provoacă depresia frecvenței
respiratorii la șoareci. Hipocloritul este o altă specie oxidantă ce a fost recent descrisă ca
activator al canalului TRPA1. La fel ca alți iritanți, acesta poate fi format prin inhalarea de clor
sub formă gazoasă sau poate fi generat endogen de către macrofage și neutrofile, ca și consecință
a inhalării de substanțe toxice (Fig. 3 ) (Volpi, Facchinetti et al. 2011 ). Comment [DC15]: Pai asta ai mai spus nu te
repeti

16

Figura 3. Activarea canalului ionic TRPA1 de catre neutrofile si macrofage
Sunt indicate următoarele : ROS -specii reactive de oxigen, RNS -specii reactive de azot, HClO –
acid hipocloros, NO -oxid nitric (Facchinetti and Patacchini 2010 ) (modificat)

Speciile reactive de oxigen (ROS) și speciile reactive de azot (RNS) ce sunt eliberate de
neutrofile și macrofage activate induc peroxidarea sau nitrarea lipidelor, și astfel generează
compuși foarte reactivi, precum acroleină, 4 -hidroxinonenal și acid nitrooleic, toți aceștia
capabili să activeze TRPA1, și prin acest mecanism să inducă durere și inflamație în căile aeriene
(Facchinetti and Patacchini 2010 ).
La mamifere, sistemele respirator si cardiovascular trebuie să se adapteze rapid pentru a
menține livrarea O 2 la organele ce il necesită cel mai mult, precum creierul si inima. Neuronii cu
aferențe vagale au fost propuși ca având funcția de a detecta hipoxia in diferite organe, precum
plămânii si inima, in ischemii și alte afecțiuni ce scad aprovizionarea cu O 2 (Gruss, Ettorre et al.
2006 ). Astfel, s -a ajuns la demonstrarea că TRPA1 este capabil de a detecta schimbări in
disponibilitatea oxigenului in vivo (Takahashi, Kuwaki et al. 2011 ). Canalul TRPA1 este capabil
să „simtă” O2 prin intermediul mai multor procese, precum hidroxilarea prolinei de către prolin
hidroxilaze, si oxidare directă a resturilor de cisteină (Takahashi, Kuwaki et al. 2011 ).
În caz de hipoxie, concentratia scăzută de O 2 scade activitatea prolin hidroxilazelor,
anulând activitatea inhibitorie a prolin hidroxilării asupra TRPA1, ceea ce duce la activarea

17
canalului. În caz de hiperoxie, O 2 activează TRPA1 oxidând resturile de cisteină 633, 856 sau
ambele. Aceste resturi sunt localizate la nivelul domeniului repetărilor ankirinice si la regiunea
linker situată între S4 si S5. TRPA1 poate apărea sub cel puțin două forme oxidate în condiții de
hiperoxie: o stare oxidată relativ instabilă, reversată de către glutation, si o stare oxidată relativ
stabilă. Grupările sulfhidril situate pe cisteinele 633 si 856 pot fi modificate la acid sulfenic în
prima stare sau pot forma legături disulfurice în cea de a doua stare. Acest sistem de oxidare
poate înlătura inhibiția prolin hidroxilări i spre a activa TRPA1 (Mori, Takahashi et al. 2016) .
1.3.3. Senzor termic
Precum am arătat în introducere, TRPA1 se exprimă în regnul animal începând cu
insectele. Canalul TRPA1 al insectelor este sensibil la compuși electrofilici. Acesta este activat
de căldură, raportat pentru speciile de Anopheles gambiae și Bombyx mori (Sato, Sokabe et al.
2014 ). În urma experi mentelor in vivo s -a demonstrat că pragul de activare al canalului TRPA1
de la Drosophila melanogaster este puțin mai ridicat decât temperatura preferată de musculiță,
cea de 25 ℃, astfel sugerând faptul că TRPA1 are rol în detectarea temperaturii ridicate nocive și
evitarea ei (Kang, Panzano et al. 2011) .
În cazul nematodelor, precum Caenorhabditis elegans , TRPA1 este exprimat într -o mare
varietate de țesuturi, precum neuroni, mușchi, intestin și celule epiteliale. TRPA1 de la
Caenorhabditis (ceTRPA1) este implicat și in mecanosenzație, dovedit de mutanții pentru
această proteină cu deficit în comportamentul mecanosenzorial. Spre deosebire de canalul
TRPA1 de la artropode, studiile au demonstrat activarea ceTRPA1 de către temperaturile scăzute
(Xiao, Zhang et al. 2013 ). Această diferență ar putea proveni din faptul că ceTRPA1 nu provine
din canalul TRPA1 ancestral, ci este mai înrudit cu prot eina TRPA1 întâlnită la anemone. Astfel,
prezintă diferențe majore față de canalul TRPA1 de la alte nevertebrate, inclusiv insensibi litatea
la com mpuși electrofili (Kang, Pulver et al. 2010 ).
La fel ca la nematode, pierderea genei TRPA1 ancestrale a avut loc și la himenoptere.
Himenopterele au ca reprezentanți albine, viespi și furnici. Acestea prezintă o proteină specifică
pentru himenoptere (hsTRPA) ce are o serie de similarități cu TRPA1 de la Drosophila , precum
activarea la temperaturi ridicate și sensibilitatea de compuși chimici nocivi. La albine, întâlnim
un posibil rol social, deoarece temperatura de întreținere a descendenților în stup este de 32 –
36℃ ℃, iar punctul de activare al hsTR PA1 se află la temperatura de 34℃, deci putând fi Comment [DC16]: Vezi ca nu apare correct
simbolul. Modifica peste tot.

18
posibilă detectarea creșterilor de temperatură pentru a activa comportamentul de răcire al
stupului ( Laursen, Anderson et al. 2015) .
În ceea ce privește vertebratele ectoterme, funcția canalului TRPA1 de senzor de căldură
și chimic este înalt conservată. Canalele ortoloage ale broaștelor, șopârlelor și șerpilor sunt
sensibile la căldură și prezintă activare termică la temperatur i de 40℃, 34℃ și respectiv 37℃,
însă excepția este Danio rerio (peștele zebră), la care TRPA1 deși este sensibil la compuși
electrofili, nu prezintă activare la căldură (Laursen, Anderson et al. 2015) .
TRPA1 a fost inițial descris ca și termosenzor folosind ortologul de la șoarece, ce a confirmat
activarea la temperaturi sub cele ale canalului TRPM8 (sub 17℃). Această temperatură provoacă
durere la oame ni, dar cu toate acestea, sensibilitatea la frig este disputată, unele studii au obținut
un răspuns evident la frig, în timp ce altele nu au înregistrat modificări, sugerând astfel că acest
canal este controlat stringent de către celulă. Spre deosebire de alte canale TRP precum TRPM8,
manipularea genetică și farmacologică a funcției canalului TRPA1 nu produce modificări în
temperatura corpului ( Laursen, Anderson et al. 2015) .

1.4. Relația dintre canalele TRPA1 ș i TRP V1
TRPA1 și TRPV1 sunt membri ai superfamiliei TRP înrudiți structural. Funcțiile TRPA1
și TRPV1 se interconectează foarte mult. Acest lucru este clar în special în relație cu durerea și
inflamația unde TRPV1 este coexprimat pe majoritatea nervilor senzoriali ce exprimă TRPA1 și
împreună integrează o varietate mare de stimuli dureroși. Descoperirea mai recentă a faptului că
aceste două canale sunt exprimate pe zone non -neuronale a dus la cercetări amănunțite. Celulele
în care sunt exprimate variază de la țesut muscular neted la keratinocite și celule endoteliale
(Fernandes, Fernandes et al. 2012). Astfel, 97% din neuronii ce exprimă TRPA1 exprimă
TRPV1, în timp ce 30% din neuronii ce exprimă TRPV1 exprimă TRPA1 (Story, Peier et al.
2003) .Ambele canale sunt canale permeabile pentru Ca2+. Acest lucru permite TRPV1 să
influe nțeze caracteristici intrinseci ale canalului TRPA1, incluzând relații de voltaj
(Staruschenko, Jeske et al. 2010 ).
Și TRPV1 și TRPA1 sunt canale permeabile pentru calciu si ar putea forma un complex
la nivelul membranei plasmatice a neuronilor senzoriali. Acest lucru permite ca TRPV1 să
influențeze caracteristici intrinseci ale canalului TRPA1, incluzând relația voltaj -curent. În mod
similar, Salas et al au arătat că trăsăturile canalului TRPA1 situat la nivelul neuronilor nu sunt

19
replicate in celule ce exprimă doar TRPA1, ci aceste trăsături sunt prezente doar atunci când
TRPA1 si TRPV1 sunt coexprimate. Mai mult decât atât, Si TRPV1 si TRPA1 sunt integratori ai
unei game de stimuli dureroși, si agoniștii TRPV1 și TRPA1 sunt capabili sa desensibilizeze
caile TRPV1 si TRPA1 (Ruparel et al 2008).
Canalele TRP Vanilloid sunt împarțite în 6 membri, numerotați de la 1 la 6. Cu toate
acestea, doar TRPV1 din subfamilia TRPV este cu adevărat activat de vaniloizi, incluzând
capsaicina, compusul pungent din ardeii iuți. Este important de menționat că receptorul TRPV1
suferă desensibilizare după administrare repetată de capsaicină sau după expunere prelungită la
aceasta. Receptorul nu doar că suferă desensibilizare pentru alți activatori ai aceluiași receptor,
dar calea TRPV1 scade raspunsul la agoniști ai TRPA1 și invers. Mecanismele desensibilizării
sunt diferite, cel indus de ca psaicină este independent de prezența ionilor de Ca2+, în timp ce
mecanismul heterolog (desensibilizarea TRPA1 ca urmare a acțiunii capsaicinei asupra TRPV1)
este dependent de ionii de Ca2+ (Ruparel et al 2008).
Au fost identificați multipli activatori ai canalelor TRPV1 și TRPA1 (Tabel 1 ).

Tabel 1. Agoniști și modulatori ai canalelor TRPV1 și TRPA1 (Fernandes, Fernandes et al. 2012 )
(modificat)

20
Canalele TRPA1 și TRPV1 au un rol sinergic în durerea și inflamația pancreatică.
Metodele histologice au confirmat că inflamația pancreatică este asociată cu excitabilitate
crescută și expresia ARN -ului mesager al canalelor TRP în cel ulele pancreatice. Astfel,
inflamația pancreatică a crescut semnificativ expresia și proprietățile funcționale ale TRPA1 și
TRPV1, precum și excitabilitatea neuronilor senzoriali pancreatici în căile spinale și
vagale.Antagoniștii acestor canale TRP au acționat sinergic spre a stopa inflamația pancreatică și
durerea asociată (Schwartz, Christianson et al. 2011) .

1.5. Rolul canal elor TRP în cancer

Multe proteine din structura celulelor tumorale prezintă expresie crescută sau scăzută
comparativ cu nivelele din celulele normale. Unele dintre aceste proteine, spre exemplu cele
codificate de oncogene si gene supresor tumorale au un rol major în tumorigeneză și apariția
metastazelor, în timp ce altele, precum cele implicate in homeostazia calciului , sunt asociate cu
progresia cancerului . Majoritatea tipurilor de cancer sunt heterogene în ceea ce privește rata de
creștere și gradul de agresivitate. U nele din cele mai importante căi de semnalizare alterate în
tumorigeneză cresc rata de proliferare și inhibă apoptoza. Homeostazia calciului controlează
aceste procese celulare, inclusiv proliferarea, apoptoza, transcripția si angiogeneza (Roderick and
Cook 2008 ).
Homeostazia calciului joacă un rol foarte important în supraviețuirea și funcționarea normală
a celulelor. Astfel, homeostazia calciului este atinsă prin diferite canale de Ca2+ sau pompe
asociate cu membrana plasmatică (Stewart, Yapa et al. 2015) .
Spre deosebire de celulele normale, ce folosesc metabolismul mitocondrial ca sursă primară de
energie, celulele canceroase folosesc ATP glicolitic ca sursă primară (Gatenby and Gillies 2007 ;
Hanahan and Weinberg 2011 ). ATP glicolitic accentuează activitatea pompelor de calciu
cunoscute ca ATP -aze de calciu ale membranei plasmatice (PMCA) pentru a furniza energia
necesară menținerii nivelului scăzut de calciu în celulele canceroase pancreatice. Calciul
intracelular în exces c onduce la citotoxicitate în aceste celule și s -a dovedit că PMCA joacă un
rol major în menținerea nivelului normal al calciului intracelular (Carafoli 1991) .
Semnalizarea calciului este necesară pentru proliferarea celulară în toate celulele eucariote,
dar unele celule transformate malign prezintă dependență redusă de calciu pentru a pastra rata de

21
proliferare. Cu toate acestea, disfuncții ale canalelor de calc iu sunt implicate în tumorigeneză
deoarece expresia crescută a canalelor de calciu prezente în membrana plasmatică amplifică
influxul de calciu, astfel promovând caile de proliferare dependente de calciu (Roderick and
Cook 2008 ).
Mulți dintre membrii familiei TRP de canale ionice permeabile pentru Ca2+ și Na+ prezintă
expersie alterată în celulele tumorale, majoritatea modificărilor la nivelul acestora nu presupun
mutații ale genei TRP, ci nivele crescute sau scăzute ale expresiei proteinei TRP salbatică (wild
type), în funcție de stadiul cancerului (Duncan, Deeds et al. 1998) .
Canalele TRP contribuie la schimbări în concentrația intracelulară a calciului, fie acționând
ca și căi de intrare a calciului prin membrana plasmatică fie prin schimbări în polarizarea
mem branei, modulând forța de intrare prin căi alternative, precum și activitatea canalelor de
Ca2+dependente de voltaj. De asemenea, canalele TRP sunt exprimate pe membranele
rezervoarelor interne de calciu (reticulul endoplasmic) unde pot acționa ca și declanșatori pentru
proliferare crescută, diferențiere aberantă și p ierderea abilității de a intra î n apoptoz ă ducând la
proliferarea necontrolată caracteristică celulelor canceroase. Expresia crescută sau scăzută a
anumitor proteine TRP în cancer și progresia cancerului au fost folosite spre a dezvolta noi
strategii de a distruge celulele tumorale. Unul din aspecte presupune intrarea prin canale TRP
exprimate în celule tumorale a Ca2+și Na+ ceea ce conduce la o concentrație crescută de Ca2+ și
Na+ intracitoplasmatic, ce distruge celulele prin apoptoză și necroză. Această strategie necesită
expresia și activarea selectivă a unui anumit canal TRP în celulele țintă. Noile strategii de a
distruge aceste celule prin activarea căii apoptozei sunt valide, deoarece pentru multe tipuri de
cancer, căile normale de intrare in procesul de apoptoză sunt inhibate și celulele sunt rezistente la
apoptoză (Wertz and Dixit 2000 ).
O altă abordare posibilă este introducerea de molecule antiproliferative în celule prin canale
TRP. Această strategie permite introducerea selectivă a unor molecule incărcate electric ce sunt
citotoxice atunci când se află în interiorul celulei, dar relativ non -toxice când se află la exteriorul
celulei. Prin cuplarea unei astfel de molecule cu un agoni nst al unui canal TRP, ar fi în special
afectate celulele tumorale pe membrana cărora este supraexprimat canalul TRP respectiv, dar ar
avea efect scăzut asupra celulelor normale în care exprimarea canalului TRP este mult mai
scăzută. Doxorubicina, un antibi otic obținut din Streptomyces peucetius var. Caesius , este un
agent chemoterapeutic cu o greutate moleculară mică (543 Daltoni) și incărcătură electrică, astfel

22
este un candidat viabil pentru a fi transportat prin canalele TRP sau alte canale ce prezintă
dimensiune mare a porului. Deși doxorubicina este foarte eficientă împotriva tumorilor umane
(cancer mamar, carcinom pulmonar cu celule mici și leucemii), aceasta generează radicali liberi,
deci doza adimistrată este limi tată de potențialul cardiotoxic. Astfel, facilitarea transportului în
celule tumorale ar putea crește funcț ia terapeutică a doxorubicinei (Santoni and Farfariello
2011 ).
S-au realizat experimente pe celule de neuroblastom ce au fost transfectate cu TRPV1, și
apoi expuse la o concentrație scăzută de doxorubicină, administrată împreună cu capsaicină.
Aceste experimente au arătat că doxorubicina a patruns doar în celulele ce au fost transfectate cu
TRPV1, și intrarea a necesitat expunerea celulelor la capsaicină, agonist al TRPV1, astfel
sugerând că antibioticul a pătruns prin canalele TRPV1 activate. Experimente similare au fost
realizate și pentru canalul TRPM8, folosind agoniști ai acestuia împreună cu doxorubicină
(Santoni and Farfariello 2011 ).

1.5.1. Canalele TRPM în cancer
TRPM8
TRPM8 face parte din superfamilia canalelor TRP și subfamilia Melastatin (TRPM). Este un
canal cationic ce în condiții fiziologice facilitează trecerea ionilor de Ca si Na prin membrana
plasmatică, ducând la depolarizarea celulei. Deși expresia acestui canal este normală în celule
prostatice normale, în cancerul de p rostată aceasta crește foarte mult (Tsavaler, Shapero et al.
2001 ). În prostata normală, expresia genei trpm8 este controlată de receptori pentru androgeni.
Experimente le de imunohistochimie și reacție de polimerizare în lanț (PCR) realizate pe celule
de cancer de prostată umană au arătat că TRPM8 este în principal exprimat în celule epiteliale
apicale dependente de androgeni, și expresia acestuia scade în celulele ce își pierd activitatea de
receptor androgenic . Și alte tumori, precum cele formate la nivelul sânului, colonului, plămânilor
și pielii prezintă expresie crescută a TRPM8, deși expresia sa în celulele normale corespondente
acestor tipuri de cancer este aproape nedetectabilă ( Bidaux, Roudbaraki et al. 2005) .
TRPM8 este de asemenea un biomarker pentru adenocarcinomul pancreatic ductal. Acesta inhibă migrarea celulelor tumorale, astfel sugerează posibilitatea folosirii în terapie (Cucu, Chiritoiu et
al. 2014) .

23
TRPM1
Studiile privind expresia canalului TRPM1 au dus la descoperirea de nivele crescute în țesuturile
benigne și nivele scăzute în melanoame primare. În cazul melanoamelor metastatice, nu a fost
detectat ARN mesager (ARNm) (Duncan, Deeds et al. 2001) . Expresia ARNm pentru TRPM1
pare sa fie corelată cu progresia tumorală a melanocitelor, precum și grosimea tumorii și
potențialul de a metastaz a (Fang and Setaluri 2000) .
1.5.2. Canalele TRPV în cancer
TRPV1
TRPV1 este cel mai bine cunoscut pentru funcția pe care o îndeplinește în neuronii nociceptivi,
aceea de a detecta temperaturi foarte ridicate și durere. Este activat de căldură și capsaicină,
compusul pungent din ardeiul iute (Moiseenkova -Bell, Stanciu et al. 2008 ).
Modificări în expresia TRPV1 sunt întalnite în cancerul urotelial uman. Astfel, TRPV1 prezintă expresie crescută în celulele car cinomului urotelial papilar. De asemenea, expresie crescută
întâlnim și în carcinomul hepatic. Examinarea clinico -patologică a indicat o corelație
semnificativă între expresia canalului TRPV1 și diferențierea celulară (Lazzeri, Vannucchi et al.
2005) .
TRPV2
Analiza genei și proteinei TRPV2 în tumori superificiale și invazive a evidențiat creșterea cantității de ARNm al TRPV2 odată cu avansarea stadiului tumoral (Wang, Hu et al. 2004) . În
tumori de tip gliom, ARNm corespunzător proteinei TRPV2 este exprimat în astrocite, dar expresia sa scade pe măsură ce stadiul histologic al tumorii crește (Nabissi, Morelli et al. 2010) .
TRPV6
Canalul TRPV6 este implicat în controlul progresiei tumorilor hormon -dependente, precum cele
de prostată și sân. Expresia ARNm al TRPV6 este foarte scăzută sau nedetectabilă în țesuturi prostatice normale sau benigne, dar și în cazul neoplaziilor prostatice intraepiteliale și
adenocarcinoamelor și al tuturor tumorilor cu o suprafață mai mică de 2.3 cm
3. Analiza țesutului
prostatic afectat arată creșterea direct proporțională a expresiei ARNm al TRPV6 c u agresivitatea
cancerului ( Fixemer, Wissenbach et al. 2003) .

24
1.5.3. Canalele TRPC în cancer
În urma experimentelor imunohistochimice și reacției de polimerizare în lanț în timp real
(RT-PCR), a fost analizată expresia proteinei TRPC6. Expresia proteinei suferă o creștere
semnificativă în cancerul de prostată comparat iv cu hiperplazia prostatică benignă, însă nu se
observă o diferență în expresia proteinei între tumorile androgen -dependente și cele androgen –
independente (Yue, Wang et al. 2009) .

25
CAPITOLUL 2 . MATERIALE ȘI METODE
1. REACTIVI ȘI SOLUȚII

Liniile celulare din adenocarcinomul pancreatic au fost cultivate pe mediu
DMEM (Dullbeco ’s Modified Eagle Medium). La acest mediu au fost adăugate 10% ser
fetal bovin si 1% soluție de antibiotic Streptomicină.
Liniile celulare au fost cultivate pe flask -uri de 25 cm2 și au fost incubate la
temperatura de 37℃ si 5% CO 2.
Pentru pasajul celulelor s -a folosit solutie 0.25% tripsină -EDTA (Gibco 25200-
056).

2. CULTURI DE CELULE

Linia celulară Panc -1
Linia celulară BxPc -3
Linia celulară PK -9
Linia celulară MiaPaca -2

26

3. MENȚINEREA CELULELOR

Dezghețarea
Într-un tub Corning de 15 mL se introduc 4 mL de mediu de cultură pentru centrifugarea
celulelor și neutralizarea DMSO -ului in care au fost inghețate. Criotubul cu celule se dezgheață
1-2 minute in baia de apă, apoi se extrage conținutul criotubului și se pune in tubul Corning de
15 mL. Se centrifughează la 1500 rpm 5 minute. După centrifugare, se scoate supernatantul, se
pune 1 mL de mediu de cultură steril peste sediment, se resuspendă si se adaugă conținutul într –
un flask de 25 cm2. Se incubează la 37℃ si 5% CO 2 pentru 48h.
Hrănirea
Mediul de cultură se schimbă din două în două zile. Se indepărtează mediul din flask cu o
pipetă serologică si se adaugă 5 mL de mediu de cultură steril si se incubează pentru 48 de ore.

Pasajul
Pentru a realiza un pasaj, confluența celulelor trebuie sa fie de cel puțin 70%. Înainte de
efectuarea unui experiment, celulele trebuie pasate de cel puțin 3 ori. Se extrage mediul din flask
și se adaugă 1 mL de tripsină. Se incubează 5 -10 minute pentru a se desprinde celulele de
substrat. Se vizualizează la microscop pentru a confirma desprinderea celulelor. Tripsina se
inactivează cu 3 mL de mediu de cultură. Cei 3 mL de mediu de cultură impreuna cu tripsina se
adaugă într-un tub Corning de 15 mL și se c entrifughează la 2000 rpm, 5 minute. După
centrifugare se aruncă supernatantul, se adaugă 1 mL de mediu de cultură steril, se resuspendă și
se pune într -un flask de 25 cm2. Se completează cu mediu până la 5 mL volum final și se
incubează pentru 48 de ore.
Pentru realizarea experimentelor, celulele trebuie pasate astfel încât să fie numărate și
calculate la densitatea necesară. În urma centrifugării, se ia o cantitatea de mediu în care au fost

27
resuspendate celulele și se pune în camera de numărare. În urma numărării, se stabilesc diluțiile
necesare pentru a se ajunge la o densitate de celule/mL.

Înghețarea
Mediul din flask este extras și se adaugă 1 mL de tripsină. Se incubează timp de 5 -10
minute, apoi se vizualizează la microscop pentru a observa dacă s -a realizat desprinderea
celulelor. Se adaugă 2 mL de mediu de cultură steril pentru inactivarea tripsinei, se resuspendă și
se pune totul într-un tub Corning. Se centrifughează la 2000 rpm pentru 5 minute. Supernatantul
este îndepărtat, iar sedimentul se r esuspendă în ser fetal bovin (FBS), adăugându- se 10% DMSO.
Suspensia celulară este împărțită in criotuburi și ținută la -70℃.

Tratarea cu Izotiocianat de alil (AITC)
Izotiocianatul de alil ( AITC, 2 -propenil izotiocianat) aparține unei familli de compuși
intâlniți în natură, numiți izotiocianați (ITC). Izotiocianatul de alil este present în majoritatea
legumelor crucifere și este întâlnit în mod special în muștar, hrean și wasabi. Acesta este un
lichid ce variază de la incolor la galben pal, este relativ solubil in apă, dar foarte solubil în
solvenți organici. Punctul de fierbere este situat la 149 ℃ și are o densitate mai mare decât a apei
(Zhang 2010) .

28

Figura .Structura Izotiocianatului de alil (PubChem)

Soluția de izotiocianat de alil 100 µM/mL a fost adăugată în mediul de cultură al celulelor cu
24 de ore înainte de experimente. Flask -urile tratate cu izotiocianat de alil au fost menținute la
incubator la 37℃ si 5% CO 2.

4. METODE UTILIZATE

Tehnica „wound-healing”
Date generale

Metoda „wound- healing” este simplă, necostisitoare, și este printre primele metode
dezvoltate pentru a studia migrarea direcționată in vitro. Această metodă mimează migrarea
celulară ce are loc pentru vindecarea rănilor in vivo. Pașii de bază presupun real izarea unei
„răni” la nivelul celulelor dispuse în monostrat, fotografierea la inceput si apoi la intervale

29
regulate în timpul migrării pentru inchiderea rănii, și apoi compararea imaginilor pentru a
cuantifica rata de migrare a celulelor ( Rodriguez, Wu et al. 2005 ).

Mod de lucru
Celulele din liniile celulare Panc -1, BxPc -3, MiaPaca -2 ș i P K -9 ajunse la al treilea pasaj
după dezghețare, au fost numărate folosind camera de numărat Burker -Turk. În urma calculelor
și a diluțiilor necesare, acestea au fost cultivate în vase Petri cu diametru de 35 mm la o densitate
de 3×105 celule/mL. Densitatea aceasta a fost aleasă deoarece celulele trebuie să ajungă în cel
mai scurt timp la o confluență de 100 %.
În momentul atingerii confluenței de 100%, s -au împărțit vasele cu celule în grupuri de
control și de tratate cu izotiocianat de alil (AITC) 100μM monito rizate la 24h și 30h. La
momentul 0 a fost trasată o „zgărietură” în mijlocul spațiului cu celule, cu ajutorul unei
micropipete de 200µL . Celulelor din grupul de control le -a fost adăugat în continuare mediul de
cultură specific, iar celor din grupul de tratate mediu de cultură în care s -a adăugat izotiocianat
de alil. S -au folosit vase Petri diferite pentru tratamentul și controlul de la momentul 0 și după
24h, apoi 30h.
Imediat după acest procedeu, s -au realizat poze folosind un microscop VivaTome și
utilizând programul QuickPhoto. S -a monitorizat rata de migrație a celulelor la intervale de 24h
și 30h.
Pentru datele statistice, s -a măsurat suprafața „zgârieturii” cu ajutorul software -ului ImageJ
(Fig.). S -a determinat schimbarea acestei arii procentual faț ă de momentul „zero” (când s -a trasat
zgârietura). Analiza statistică s-a realizat cu programul OriginPro8. Prezentarea datelor s -a
realizat ca media ± eroarea standard a mediei (SEM). Analiza statistică s -a realizat folosi nd testul
Two-Sample Student’s T -Test.

30

Western -blot
Date generale

Western blot este o tehnică foarte importantă în biologia celulară și moleculară. Aceasta
este o metodă sensibilă și rapidă cu ajutorul căreia se separă și identifică proteinele pe baza
unei reacții antigen -anticorp. Mixul de proteine este separat în funcție de greutatea moleculară
în gelul de electroforeză. Rezultatele sunt transferate pe o membrană de nitroceluloză
producându- se benzile specifice fiecăr ei proteine. Ulterior, membrana este incubată cu
anticorpii specifici proteinei de interes. Anticorpii nelegați sunt spălați, iar cei legați sunt
detectați prin developarea filmului (Mahmood și Yang, 2012).
Mod de lucru
Fracțiile proteice au fost obținute prin lizarea celulelor în tampon HEPES -CHAPS (2 %
CHAPS în 50 mM/L HEPES, 200 mM/L NaCl, pH 7,34; Sigma -Aldrich, Inc) și un mix de inhibitori
de proteaze (Roche) și au fost lăsate timp de 30 de minute pe gheață pentru lizare. Ulterior,
probele (cate 50 μg și cate 100 μg) au fost supuse electroforezei în gel de poliacrilamidă 8%,
după care au fost transferate pe o membrană de nitroceluloză (Santa Cruz Biotechnology).
Figura . Măsurarea „rănii” cu ajutorul programului ImageJ

31
Membrana de nitroceluloză a fost tratată peste noapte cu o soluție de lapte degresat 10% la
temperatura camerei. A doua zi, membrana a fost scufundată într -o soluție conținând
anticorpul TRPM8 la o diluție de 1:300 în lapte degresat și PBS și a fost lăsată timp de o oră la incubat pe agitator la temperatura camerei. Ulterior s -a spălat membrana d e 4 ori cate 5
mi n u te c u o s o l u ți e d e P BS -Tween 20, după care s -a adăugat anticorpul secundar „goat -anti-
rabbit” la o diluție de 1:1000 în PBS -Tween 20 și laptele degresat. S -a mai lăsat membrana o oră
la incubat pe agitator la temperatura camerei, după ca re s-a spălat de 3 ori câte 10 minute cu
soluția de PBS -Tween 20. În ultima etapă, membrana impregnată cu proteina de interes a fost
supusă detecției chemiluminescente pentru a se obține benzile proteice (Cucu și colab., 2014).

32
Capitolul 3. Rezultate și discuții
1. Rezultate
Migrația liniei celulare Panc -1
Migr ația celulelor a fost studiată prin tehnica „wound healing ”. Celulele au fost împărțite î n 6
vase Petri, 3 care au reprezentat grupul de control ș i 3 care au fost tratate cu AITC 100 µM si au
reprezentat grupul celulelor tratate. S-au realizat poze pentru monitorizarea migraț iei celulare la
0H, imediat după ce s-a facut scratch -ul, după 24 H de tratam ent si dupa 30 H de tratament când
canalul s -a închis î n proporție destul de mare î n grupul de cont rol. Celulele au fost crescute î n
vase Petri de 24 mm la o confluență de 3×105 celule/ml până au ajuns la densitatea de 100%,
dupa care s -a realizat scratch -ul utilizand v ârful unei micro pipete de 200 uL, ulterior adăugâ ndu-
se mediu DMEM simplu pentru control, sau mediu cu AITC pentru celulele tratat e. Am utilizat
programul ImageJ pentru a măsura suprafața „rănii”. Pentru analiza statistică a datelor am folosit
programul OriginPro, testul Two -Sample Student T -Test.
Control ora 0
Tratate ora 0

Figura etc. Momentul 0 al rănii pentru grupul de control si cel tratat cu AITC 100 µM .

33
Control 24 ore
Tratate 24 ore

Figura etc. Monitorizarea ratei de migrație a grupurilor de control și grupurilor tratate cu AITC la 24 de ore
de la realizarea rănii.
După 24 ore se observă că zgârietura ( scratch -ul) a fost acoperit ă în proporție de 95% î n
grupul de control, spre deosebire de ce l tratat unde AITC -ul a influențat migrația celulară,
diminuand -o.
Control 30 ore
Tratate 30 ore

Figura etc. Monitorizarea ratei de migrație a grupurilor de control și grupurilor tratate cu AITC 100µM la
30 de ore de la realizarea rănii.

34

După 30 ore de la tratament, celulele din grupul de cont rol au acoperit canalul
format î n urma scartch -ului, iar cele din grupul tratat au migrat si ele, însă nu îndeajuns
cât să acopere canalul. Comparând figurile, după 30 de ore se observă diferențe evidente
între grupul de control și grupul celulelor tratate cu AITC 100 µM.

Figura etc. Rezultatele statistice ale experimentelor de migrație realizate pe linia celulară Panc -1,
folosind OriginPro.
Dupa cum am spus ș i mai devreme, prin tratament ul cu AITC am stimulat canalul
și am putut observa implicația TRPA1 in migrația celulelor tumoral e pancreatice. Astfel,
atunci cân d TRPA1 este stimulat, se observă o scadere semnificativă a migraț iei celulare.
Din literatuăa știm că AITC -ul poate avea el insuș i acest efect de diminuare a migrației
celulare, de aceea urmează studii de western blot cu silenț iere de canal pentru a
demonstra activitatea TRPA1, nu a AITC.
04080
**
24 H 30 Hacoperirea rãnii (%) CTRL
AITC 100uM Panc-1
demo demo demo demo
demo demo demo demo
demo demo demo demo
demo demo demo demo
demo demo demo demo
demo demo demo demo
demo demo demo demo
demo demo demo demo

35
Migrația liniei celulare MiaPaca -2
Am realizat studii de migratie celulara pe linia pancreatica tumorala MiaPaCa-2.
Celulele au fost div izate in 6 vase Petri de 24mm. Trei dintre acestea au reprezentat grupul de
control si celelalte 3 urmau a fi tratate cu AITC 100uM. Celulele au fost crescute la o densitate
celulara de 3×105 cel/ml pana au ajuns la confluenta de 100%, in cele 6 vase.Cu varful unei
micropipete de 200uL am realizat un scratch pe intregul diametru al vasului. S -a folosit mediu
DMEM simplu pentru vasele din grupul de control si DMEM cu AITC 100uM pentru vasele din
grupul tratat. Am realizat poze pentru monitorizarea migratie i celulare imediat dupa realizarea
scratch -ului (0H), apoi la 24H si in final la 30H.

Control ora 0
Tratate ora 0

Figura etc. Momentul 0 al rănii pentru grupurile de control și cele tratate cu AITC 100 µM.

36
Control 24 ore
Tratate 24 ore

Figura etc. Monitorizarea ratei de migrație a grupurilor de control și grupurilor tratate cu AITC la
24 de ore de la realizarea rănii.

După 24 de ore se observă că scratch -ul a fost acoperi t in proporție mai mare în vasele de
control , deci AITC a scăzut rata migrației și în cazul acestei linii celulare.
Control 30 ore
Tratate 30 ore

Figura etc. Monitorizarea ratei de migrație a grupurilor de control și grupurilor tratate cu AITC
100 µM la 30 de ore de la realizarea rănii.

37
În cazul liniei celulare MiaPaca -2, rata migrației nu a crescut semnificativ de la 24 la 30
de ore de la realizarea zgârieturii, insă se poate observa diferența clară între grupurile de control
și cele tratate cu AITC în ceea ce privește acoperirea zgâriet urii.

Figura etc. Rezultate statistice ale experimentului de migrație, linia celulară MiaPaca -2. Graficul
a fost realizat folosind programul OriginPro.

Asemenea rezultatelor obținute în experimentul de migraț ie al liniei c elulare Panc -1,
pentru linia Mia PaCa -2 am observat o diminuare a migrației î n urma tratamentului cu AITC.
Spre deosebire de Panc -1, la MiaPaC a-2 diferența între grupul de control ș i tratate n u a fost
statistic semnificativă. 02040
ns wound closure (%) CTRL
AITC (100uM)
ns
24 h 30 hMiaPaCa-2
demo demo demo demo
demo demo demo demo
demo demo demo demo
demo demo demo demo
demo demo demo demo
demo demo demo demo
demo demo demo demo
demo demo demo demo

38
Migrația liniei celulare BxP C-3
Am realizat studii de migrație celulară pe linia celulară tumorală pancreatică BxPC -3.
Celulele au fost imparț ite în 6 vase Petri de 24mm. Trei dintre acestea au reprezentat grupul de
control , iar celelalte 3 urmau a fi tratate cu AITC 100u M. Celulele au fost crescute la o densitate
celulară de 3×105 cel/ml pana au ajuns la confluenta de 100%, in toate cele 6 vase. Cu varful unei
micropipete de 200uL am realizat un canal pe intregul diametru al vasului. S -a folosit mediu
DMEM simplu pentru vasele din grupul de control si DMEM cu AITC 100uM pentru vasele din
grupul tratat.
Am realizat poze pentru monitorizarea migratiei celulare imediat dupa realizarea scratch –
ului (0H), apoi la 24H si in final la 30H.
Control ora 0
Tratate ora 0

Figura etc. Momentul 0 al realizării zgârieturii pentru grupurile de control și cele tratate cu AITC
100 µM pentru linia celulară BxPC -3.

39
Control 24 ore
Tratate 24 ore

Figura etc. Monitorizarea ratei de migrație a grupurilor de control și grupurilor tratate cu AITC
100 µM la 24 de ore de la realizarea rănii pentru linia celulară BxPC -3.
După 24 de ore de la realizarea zgârieturii, se observă o diferență clară între rata migrației
grupurilor de control și cele tratate. Canalul aferent grupurilor control a fost acoperit într-o
proporție mult mai mare.
Control 30 ore
Tratate 30 ore

Figura etc. Monitorizarea ratei de migrație a grupurilor de control și grupurilor tratate cu AITC
100 µM la 30 de ore de la realizarea rănii pentru linia celulară BxPC -3.
După 30 de ore de la realizarea rănii, diferența între grupurilor de control și cele tratate
este în continuare prezentă, chiar accentuată. Se poate observa acoperirea suplimentară a
canalului în cazul grupurilor de control, în timp ce acoperirea în cazul grupurilor tratate cu AITC
nu a crescut considerabil.

40

Figura etc. Rezultate statistice ale experimentului de migrație, linia celulară BxPC -3. Graficul a
fost realizat folosind programul OriginPro.
După 24 de ore se observă că scratch -ul a fost acoperit în proporție d e 45% în vasele
control și 3 5% în vasele tratate. După 30 de ore, în vasele de control, scratch -ul a fost acoperit în
proporție de 70%, iar în cele tratate, acoperirea canalului a ajuns la 40 %. Asemenea rezultatelor
obținute în migrația celulară a liniei M iaPaCa -2 și în contrast cu cele obținute la Panc -1, s -a
observat o scădere a migrației nesemnificativă statistic în experimentul realizat cu celule BxPC –
3.
Migrația liniei celulare PK -9
Am realizat studii de migrație celulară pe linia PK9. Celulele au fost imparțite în 6 vase
Petri de 24mm. Trei dintre acestea au reprezentat grupul de control, iar celelalte 3 urmau a fi
tratate cu AITC 100uM. Celulele au fost crescute la o densitate celulară de 3×105 celule/ml pană
au ajuns la confluența de 100%, î n toate cele 6 vase. Cu varful unei micropipete de 200uL am
realizat un canal pe intregul diametru al vasului. S -a folosit mediu DMEM simplu pentru vasele
din grupul de control si DMEM cu AITC 100 µ M pentru vasele din grupul tratat.
Am realizat poze pentru monitor izarea migrației celulare imediat după realizarea scratch –
ului la 0 h, apoi la 24 h și în final la 30 h. 04080
ns CTRL
AITC (100uM)wound closure (%)
24 H 30 HnsBxPC-3
demo demo demo demo
demo demo demo demo
demo demo demo demo
demo demo demo demo
demo demo demo demo
demo demo demo demo
demo demo demo demo
demo demo demo demo

41
Spre deosebire de rezultatele obți nute la celelalte 3 linii, pentru PK -9 s-a observat o
creștere a migrației î n urma tratamentului cu AITC.
Control ora 0
Tratate ora 0

Figura etc. Momentul 0 al realizării zgârieturii pentru grupurile de control și cele tratate cu AITC
100 µM pentru linia celulară PK -9.

Control 24 ore
Tratate 24 ore

Figura etc. Monitorizarea ratei de migrație a grupurilor de control și grupuri lor tratate cu AITC
100 µM la 24 de ore de la realizarea rănii pentru linia celulară PK -9.

42
Se poate observa că după 24 de ore, rata migrației este aproximativ egală între cele două
grupuri, control și tratate. Cu toate acestea, în urma realizării analizei statistice, am determinat
faptul că de fapt în grupul de celule tratate rata migrației a fo st mai mare (Fig. etc).
Control 30 ore
Tratate 30 ore

Figura etc. Monitorizarea ratei de migrație a grupurilor de control și grupurilor tratate cu AITC
100 µM la 24 de ore de la realizarea rănii pentru linia celulară PK -9.

Figura etc. Rezultate statistice ale experimentului de migrație, linia celulară PK -9. 04080 wound closure (%)
30 H 24 H CTRL
AITC (100uM) PK-9
demo demo demo demo
demo demo demo demo
demo demo demo demo
demo demo demo demo
demo demo demo demo
demo demo demo demo
demo demo demo demo
demo demo demo demo

43
După 24 de ore, î n grupul de control s -a observat o acoperire a canalului de 40%, în timp
ce în grupul celulelor tratate cu AITC 100 µM rata migraț iei a fost mai mare, acoperirea atingând
42%. După 30h, diferența dintre cele 2 grupuri crește. Astfel, acoperirea scratch -ului a fost de
45% la grupul de control si de 60% la grupul celulelor tratate cu AITC.
Western -blot

Figura etc. Experiment de Western blot ce demonstrează expresia proteinei TRPA1 în cele 4 linii
celulare pancreatice tumorale. Calnexina a fost folosită drept marker de încărcare. Sunt indicate
urmatoarele: CNX -Calnexină; „- ” reprezintă celulele netratate cu AITC; „+” reprezintă celulele
tratate cu AITC 100 µM.

Western blot -ul s-a realizat în urma experimentelor de migrație celulară prezentate mai
devreme în care am avut o condiție de control și o condiț ie de celule tratate cu AITC pentru
stimu larea canalului. Î n figura de mai sus este prezentat rezultatul testării prin western blot
pentru cele 4 linii celulare pancreatice tumorale PK-9, BxPC -3, MiaPaC a-2 și Panc -1 și am
observat astfel prezența TRPA1 la o greutate moleculară de aproximativ 120-130 kD a în toate
liniile testate. Markerul de încărcare utilizat a fost Calnexina. Dupa cum se observă, î n Panc -1 ar
fi expresia cea mai ridicată, de aceea experimentele de imagistică de calciu s -au realizat doar în
această linie celulară.

44
BIBLIOGRAFIE
Bagal, S. K., A. D. Brown, et al. (2013). "Ion channels as therapeutic targets: a drug discovery
perspective." J Med Chem 56(3): 593- 624.
Benemei, S., C. Fusi, et al. (2014). "The TRPA1 channel in migraine mechanism and treatment." Br J
Pharmacol 171(10): 2552- 2567.
Bessac, B. F. and S. E. Jordt (2008). "Breathtaking TRP channels: TRPA1 and TRPV1 in airway
chemosensation and reflex control." Physiology (Bethesda) 23: 360 -370.
Bidaux, G., M. Roudbaraki, et al. (2005). "Evidence for specific TRPM8 expression in human prostate
secretory epithelial cells: functional androgen receptor requirement." Endocr Relat Cancer
12(2): 367- 382.
Brederson, J. D., P. R. Kym, et al. (2013). "Targeting TRP channels for pain relief." Eur J Pharmacol 716(1 –
3): 6 1-76.
Brewster, M. S. and R. Gaudet (2015). "How the TRPA1 receptor transmits painful stimuli: Inner
workings revealed by electron cryomicroscopy." Bioessays 37(11): 1184- 1192.
Carafoli, E. (1991). "The calcium pumping ATPase of the plasma membrane." Annu Rev Physiol 53: 531-
547.
Clapham, D. E. (2015). "Structural biology: Pain -sensing TRPA1 channel resolved." Nature 520(7548):
439- 441.
Cucu, D., G. Chiritoiu, et al. (2014). "Characterization of functional transient receptor potential
melastatin 8 channels in human pancreatic ductal adenocarcinoma cells." Pancreas 43(5): 795-
800.
Cvetkov, T. L., K. W. Huynh, et al. (2011). "Molecular arch itecture and subunit organization of TRPA1 ion
channel revealed by electron microscopy." J Biol Chem 286(44): 38168- 38176.
Duncan, L. M., J. Deeds, et al. (2001). "Melastatin expression and prognosis in cutaneous malignant
melanoma." J Clin Oncol 19(2): 56 8-576.
Duncan, L. M., J. Deeds, et al. (1998). "Down- regulation of the novel gene melastatin correlates with
potential for melanoma metastasis." Cancer Res 58(7): 1515- 1520.
Eberhardt, M. J., M. R. Filipovic, et al. (2012). "Methylglyoxal activates nocicep tors through transient
receptor potential channel A1 (TRPA1): a possible mechanism of metabolic neuropathies." J Biol
Chem 287(34): 28291- 28306.
Engel, M. A., A. Leffler, et al. (2011). "TRPA1 and substance P mediate colitis in mice." Gastroenterology
141( 4): 1346 -1358.
Facchinetti, F. and R. Patacchini (2010). The rising role of TRPA1 in asthma .
Fang, D. and V. Setaluri (2000). "Expression and Up- regulation of alternatively spliced transcripts of
melastatin, a melanoma metastasis -related gene, in human mel anoma cells." Biochem Biophys
Res Commun 279(1): 53 -61.
Fernandes, E. S., M. A. Fernandes, et al. (2012). "The functions of TRPA1 and TRPV1: moving away from
sensory nerves." Br J Pharmacol 166(2): 510- 521.
Fixemer, T., U. Wissenbach, et al. (2003). "Expression of the Ca2+ -selective cation channel TRPV6 in
human prostate cancer: a novel prognostic marker for tumor progression." Oncogene 22(49):
7858- 7861.
Gatenby, R. A. and R. J. Gillies (2007). "Glycolysis i n cancer: a potential target for therapy." Int J Biochem
Cell Biol 39(7-8): 1358- 1366.
Geng, F., L. Tang, et al. (2011). "Allyl isothiocyanate arrests cancer cells in mitosis, and mitotic arrest in
turn leads to apoptosis via Bcl -2 protein phosphorylation." J Biol Chem 286(37): 32259- 32267.

45
Gruss, M., G. Ettorre, et al. (2006). "Moderate hypoxia influences excitability and blocks dendrotoxin
sensitive K+ currents in rat primary sensory neurones." Mol Pain 2: 12.
Hanahan, D. and R. A. Weinberg (2011). "Hallm arks of cancer: the next generation." Cell 144(5): 646-
674.
Hinman, A., H. H. Chuang, et al. (2006). "TRP channel activation by reversible covalent
modification." Proc Natl Acad Sci U S A 103(51): 19564- 19568.
Kaneko, Y. and A. Szallasi (2014). "Transient receptor potential (TRP) channels: a clinical perspective." Br
J Pharmacol 171(10): 2474- 2507.
Kang, K., V. C. Panzano, et al. (2011). "Modulation of TRPA1 thermal sensitivity enables sensory
discrimination in Drosophila." Nature 481(7379): 76- 80.
Kang, K. , S. R. Pulver, et al. (2010). "Analysis of Drosophila TRPA1 reveals an ancient origin for human
chemical nociception." Nature 464(7288): 597- 600.
Laursen, W. J., E. O. Anderson, et al. (2015). "Species -specific temperature sensitivity of
TRPA1." Temperature (Austin) 2(2): 214- 226.
Lazzeri, M., M. G. Vannucchi, et al. (2005). "Transient receptor potential vanilloid type 1 (TRPV1)
expression changes from normal urothelium to transitional cell carcinoma of human
bladder." Eur Urol 48(4): 691- 698.
Li, D., K. Xie, et al. (2004). "Pancreatic cancer." The Lancet 363(9414): 1049- 1057.
Meseguer, V., Y. A. Alpizar, et al. (2014). "TRPA1 channels mediate acute neurogenic inflammation and
pain produced by bacterial endotoxins." Nat Commun 5: 3125.
Minke, B. (2010). "The history of the Drosophila TRP channel: the birth of a new channel superfamily." J
Neurogenet 24(4): 216- 233.
Moiseenkova -Bell, V. Y., L. A. Stanciu, et al. (2008). "Structure of TRPV1 channel revealed by electron
cryomicroscopy." Proc Natl Ac ad Sci U S A 105(21): 7451 -7455.
Montell, C. (2005). "The TRP superfamily of cation channels." Sci STKE 2005(272): re3.
Mori, Y., N. Takahashi, et al. (2016). "Redox -sensitive transient receptor potential channels in oxygen
sensing and adaptation." Pfluger s Arch 468(1): 85- 97.
Nabissi, M., M. B. Morelli, et al. (2010). "TRPV2 channel negatively controls glioma cell proliferation and
resistance to Fas -induced apoptosis in ERK -dependent manner." Carcinogenesis 31(5): 794- 803.
Nilius, B. (2013). "Transient rec eptor potential TRP channels as therapeutic drug targets: next
round!" Curr Top Med Chem 13(3): 244- 246.
Oh, M. H., S. Y. Oh, et al. (2013). "TRPA1- dependent pruritus in IL -13-induced chronic atopic
dermatitis." J Immunol 191(11): 5371 -5382.
Park, C. K., Z. Z. Xu, et al. (2011). "Resolvin D2 is a potent endogenous inhibitor for transient receptor
potential subtype V1/A1, inflammatory pain, and spinal cord synaptic plasticity in mice: distinct
roles of resolvin D1, D2, and E1." J Neurosci 31(50): 18433 -18438.
Paulsen, C. E., J. P. Armache, et al. (2015). "Structure of the TRPA1 ion channel suggests regulatory
mechanisms." Nature 520(7548): 511- 517.
Paulsen, C. E., J. P. Armache, et al. (2015). "Structure of the TRPA1 ion channel suggests regulat ory
mechanisms." Nature 525(7570): 552.
Poltorak, A., X. He, et al. (1998). "Defective LPS signaling in C3H/HeJ and C57BL/10ScCr mice: mutations
in Tlr4 gene." Science 282(5396): 2085- 2088.
Roderick, H. L. and S. J. Cook (2008). "Ca2+ signalling checkpoint s in cancer: remodelling Ca2+ for cancer
cell proliferation and survival." Nat Rev Cancer 8(5): 361- 375.
Rodriguez, L. G., X. Wu, et al. (2005). "Wound- healing assay." Methods Mol Biol 294: 23-29.
Santoni, G. and V. Farfariello (2011). "TRP channels and ca ncer: new targets for diagnosis and
chemotherapy." Endocr Metab Immune Disord Drug Targets 11(1): 54 -67.

46
Sato, A., T. Sokabe, et al. (2014). "Embryonic thermosensitive TRPA1 determines transgenerational
diapause phenotype of the silkworm, Bombyx mori." Proc Natl Acad Sci U S A 111(13): E1249-
1255.
Schaefer, E. A., S. Stohr, et al. (2013). "Stimulation of the chemosensory TRPA1 cation channel by volatile
toxic substances promotes cell survival of small cell lung cancer cells." Biochem Pharmacol
85(3): 426- 438.
Schwartz, E. S., J. A. Christianson, et al. (2011). "Synergistic role of TRPV1 and TRPA1 in pancreatic pain
and inflammation." Gastroenterology 140(4): 1283- 1291 e1281- 1282.
Simon, S. A. and W. Liedtke (2008). "How irritating: the role of TRPA1 in sensing cigarette smoke and
aerogenic oxidants in the airways." J Clin Invest 118(7): 2383- 2386.
Staruschenko, A., N. A. Jeske, et al. (2010). "Contribution of TRPV1- TRPA1 interaction to the single
channel properties of the TRPA1 channel." J Biol Chem 285(20): 15167- 15177.
Stewart, T. A., K. T. Yapa, et al. (2015). "Altered calcium signaling in cancer cells." Biochim Biophys Acta
1848(10 Pt B): 2502- 2511.
Storck, H., B. Hild, et al. (2017). "Ion channels in control of pancreatic stellate cell migration." Oncotarget
8(1): 769- 784.
Story, G. M., A. M. Peier, et al. (2003). "ANKTM1, a TRP -like channel expressed in nociceptive neurons, is
activated by cold temperatures." Cell 112(6): 819- 829.
Takahashi, N., T. Kuwaki, et al. (2011). "TRPA1 underlies a sensing m echanism for O2." Nat Chem Biol
7(10): 701- 711.
Tsavaler, L., M. H. Shapero, et al. (2001). "Trp- p8, a novel prostate -specific gene, is up -regulated in
prostate cancer and other malignancies and shares high homology with transient receptor
potential calciu m channel proteins." Cancer Res 61(9): 3760- 3769.
Venkatachalam, K. and C. Montell (2007). "TRP channels." Annu Rev Biochem 76: 387 -417.
Volpi, G., F. Facchinetti, et al. (2011). "Cigarette smoke and alpha,beta -unsaturated aldehydes elicit
VEGF release through the p38 MAPK pathway in human airway smooth muscle cells and lung
fibroblasts." Br J Pharmacol 163(3): 649- 661.
Wang, C., H. Z. Hu, et al. (2004). "An alternative splicing product of the murine trpv1 gene dominant
negatively modulates the activity of TRPV1 channels." J Biol Chem 279(36): 37423- 37430.
Wang, L., T. L. Cvetkov, et al. (2012). "Identification of in vivo disulfide conformat ion of TRPA1 ion
channel." J Biol Chem 287(9): 6169- 6176.
Wertz, I. E. and V. M. Dixit (2000). "Characterization of calcium release -activated apoptosis of LNCaP
prostate cancer cells." J Biol Chem 275(15): 11470- 11477.
Wes, P. D., J. Chevesich, et al. (199 5). "TRPC1, a human homolog of a Drosophila store -operated
channel." Proc Natl Acad Sci U S A 92(21): 9652- 9656.
Xiao, R., B. Zhang, et al. (2013). "A genetic program promotes C. elegans longevity at cold temperatures
via a thermosensitive TRP channel." Cell 152(4): 806- 817.
Yue, D., Y. Wang, et al. (2009). "Expression of TRPC6 in benign and malignant human prostate
tissues." Asian J Androl 11(5): 541- 547.
Zhang, Y. (2010). "Allyl isothiocyanate as a cancer chemopreventive phytochemical." Mol Nutr Food Res
54(1): 127- 135.
Zheng, J. (2013). "Molecular mechanism of TRP channels." Compr Physiol 3(1): 221- 242.