ROLUL APORTULUI EXOGEN DE SELENIU ȊN EVOLUȚIA UNOR PARAMETRI BIOCHIMICI LA ANIMALELE DE LABORATOR [303245]

Universitatea de Medicinǎ și Farmacie „Grigore T. Popa” Iași

Facultatea de Farmacie

ROLUL APORTULUI EXOGEN DE SELENIU ȊN EVOLUȚIA UNOR PARAMETRI BIOCHIMICI LA ANIMALELE DE LABORATOR

Coordonator științific:

Prof. Dr. Rodica Cuciureanu

Doctorand: [anonimizat] 2013 –

CUPRINS

Rezultatele cercetǎrilor din cadrul studiilor de doctorat au putut fi obținute și datoritǎ statutului de bursier ȋn cadrul proiectului „Burse doctorale pentru creșterea competitivitǎții ȋn domeniul medical și farmaceutic” – POSDRU 88/1.5/S/58965.

PARTEA GENERALĂ

CAPITOLUL I

INTRODUCERE

Seleniul a [anonimizat] 1817 [anonimizat]. [anonimizat], cu rol în apărarea împotriva stresului oxidativ. [anonimizat], [anonimizat] (GPx). GPx, [anonimizat], [anonimizat], protejează elementele celulare de speciile reactive ale oxigenului. A fost demonstrat faptul cǎ seleniul are un rol important în procesul de creștere al animalelor și al omului; contribuie la prevenirea apariției cancerului și la încetinirea ratei de dezvoltare a acestuia. Seleniul este folosit în tratamentul adjuvant al astmului și al unor afecțiuni dermatologice.

[anonimizat]. [anonimizat], putându-și schimba forma pe parcursul circulației în lanțul trofic. Cantitatea de seleniu din alimente variază în limite largi în funcție de zona geografică de proveniență și de cantitatea de seleniu din solul regiunii respective. [anonimizat] <10 µg/zi în zonele deficitare în seleniu până la aproximativ 5000 µg/zi în regiunile în care selenioza este endemică. [anonimizat], selenați sau selenocisteină.

[anonimizat]. [anonimizat], sunt unele din simptomele intoxicației acute cu seleniu. Selenioza cronicǎ include efecte negative la nivelul țesuturilor keratinizate: căderea părului și leziuni la nivelul unghiilor și al pielii.

Descoperirea selenoproteinelor în 1973 a fost punctul de început pentru explicarea rolului acestui element în fiziologia umană și la animale. Studiile întreprinse în continuare au arătat că selenocisteina este forma sub care se află elementul în selenoproteinele umane și în majoritatea celor bacteriene. S-a stabilit faptul că singurele gene care controlează metabolismul seleniului sunt cele care reglează sinteza selenoproteinelor și cele care reglează catabolismul selenocisteinei. Deci, se pare că homeostazia seleniului este controlată doar de rata sintezei de selenoproteine și de excreția metaboliților seleniului. Prin metode moderne de genetică s-a putut stabili că în genomul uman există 25 [anonimizat].

Rolul studiilor științifice făcute în acest domeniu, al biochimiei seleniului este în principal acela de a stabili importanța acestui element pentru sănătatea omului și a animalelor. Cercetătorii chinezi au semnalat în 1979 existența unei boli seleno-dependente – boala Keshan, o cardiomiopatie infantilă, răspândită într-o zonă în care conținutul în seleniu din sol era foarte redus. S-a demonstrat că această boală poate fi prevenită prin suplimentarea alimentației cu seleniu. În lume există multe zone în care conținutul de seleniu în sol este redus, dar nu într-o măsură care să permită manifestarea explicită a bolii Keshan.

S-au efectuat studii și pentru evidențierea relațiilor existente între mutațiile produse în genele care reglează sinteza unor selenoproteine și existența unor boli legate direct de izoformele anormale ale selenoproteinelor.

O altă direcție de cercetare este aceea de a stabili dozele optime necesare organismului uman, precum și a relației doză/efect și formă chimică/efect. S-au făcut studii pe animale precum și studii clinice care au dus la concluzia că suplimentarea alimentației cu seleniu previne unele tipuri de cancer. În acest caz, acțiunea anticarcinogenă a seleniului nu pare a fi legată de cea a selenoproteinelor deoarece subiecții din studiile clinice nu aveau deficiență de seleniu.

În afară de importanța sa fiziologică, seleniul și compușii săi au impotanță și pentru domeniul industrial: în industria sticlei, la prepararea pigmenților pentru pictură sau pentru colorarea materialelor plastice, emailurilor, cernelurilor, cauciucului, rol catalitic în unele reacții chimice, etc.

I.1. Motivația cercetǎrii

Seleniul este recunoscut ca fiind un microelement esențial, importanța sa fiziologică fiind dată, în primul rând, de faptul că este cofactor pentru o serie de enzime. Deși implicațiile sale în funcționarea organismului animal au fost intens studiate în ultimele cinci decenii, studiile fiind efectuate atât pe diverse specii de animale cât și pe om, există o serie de controverse privind rolul, cât și necesarul fiziologic de seleniu, date de faptul că rezultatele studiilor au fost în anumite cazuri contradictorii.

Rezultatele obținute în urma studiilor privind evaluarea influenței aportului de seleniu asupra statusului acestuia în organism, evaluarea corelației dintre aportul de seleniu și activitatea unor selenoenzime și evaluarea rolului detoxifiant al seleniului contribuie la elucidarea unor aspecte referitoare la mecanismele biochimice în care intervine seleniul, furnizând eventual, prin coroborare cu rezultatele altor studii, informații utile pentru reevaluarea necesarului de seleniu pentru organismul animal și modificarea conduitei terapeutice în cazul suplimentării alimentației cu seleniu.

I.2. Obiective generale

Realizarea tezei de doctorat ȋși propune ca obiective:

Evaluarea toxicității subacute a selenitului de sodiu la doze diferite, prin determinarea unor parametri biochimici, hematologici și prin efectuarea de examene histopatologice;

Evaluarea efectului protector al seleniului în intoxicația subacută cu plumb sau cadmiu la șobolani, prin determinarea unor parametri biochimici, hematologici și prin efectuarea de examene histopatologice;

Determinarea seleniului din probe de sol și de produse alimentare (porumb) în vederea stabilirii unor corelații privind transferul din sol în plantele de cultură;

Determinarea seleniului din probe de produse alimentare;

CAPITOLUL II

SELENIUL ȊN ELEMENTELE DE MEDIU

II.1. Starea naturalǎ și proprietǎțile fizico-chimice

În natură, seleniul se găsește liber sau combinat, în cantități foarte mici, alături de sulf și sulfuri, în litosferă, precum și în meteoriți. Prezența sa nu este semnalată în spectrul soarelui sau al stelelor. Sub formă de minereuri, apare ca seleniuri în: naumannit – Ag2Se, eucairit – (Ag,Cu)2Se, crookesit – (Ag,Cu,Te)2Se, klokmannit – CuSe; apare și sub formă de selenolit – SeO2, calcomenit – PbSeO3, berzelianit – Cu2Se, etc. În pirite, seleniul se găsește față de sulf în raport de 1:600; În cantități foarte mici, se găsește în organismele vii.

La temperatura obișnuită, seleniul este o substanță solidă care poate să se prezinte sub mai multe forme alotropice: seleniul metalic (sau cenușiu hexagonal), seleniul monoclinic și seleniul ortorombic (sau seleniul roșu), seleniul sticlos (sau seleniul negru) și seleniul amorf.

Seleniul metalic este forma cea mai stabilă. Se obține prin încălzirea formelor ortorombice sau monoclinice la ~200˚C sau prin condensarea vaporilor de Se la o temperatură puțin inferioară punctului de topire. Este de culoare cenușie, cristalizat în sistemul hexagonal, puțin solubil în CS2. Prezintă conductibilitate slabă la întuneric. Prezintă efect fotoelectric precum și fotoconductibilitate (Miftode, 2003).

Seleniul monoclinic și seleniul ortorombic sunt două forme cunoscute sub denumirea de seleniu roșu. Se obțin prin precipitare din H2SeO3 cu SO2; formele sunt solubile în CS2; prin evaporarea lentă a unor astfel de soluții rezultă α-Se, care este ortorombic, iar la evaporarea rapidă, β-Se, care este monoclinic; ambele forme conțin ciclooctaseleniu – Se8, sunt solubile în CS2 și benzen și nestabile (Miftode, 2003).

Seleniul sticlos (sau seleniul negru) se obține prin răcirea bruscă a seleniului topit; este o masă strălucitoare, sfărâmicioasă, a cărei culoare variază de la roșu-brun la negru-cenușiu; este o formă instabilă la toate temperaturile, trecând în final în seleniu metalic; la ~80˚ C trece reversibil în seleniu roșu; nu conduce curentul electric (Miftode, 2003).

Seleniul amorf se obține prin reducerea acizilor oxigenați ai seleniului cu SO2 în soluție. Se coloidal se poate obține prin reducerea solubilității Se în diferiți solvenți: apă, glicerina, CS2 sau prin electroliza unei soluții apoase de anhidridă arsenioasă. Seleniul coloidal are o stabilitate redusă și este sensibil la lumină. În stare de vapori, până la 900˚C, molecula de Se este octaatomica; între 900 și 1700˚ C molecula disociază până la Se2 și se află în echilibru cu Se8; peste 1700˚ C apare un echilibru între Se2 și Se (Miftode, 2003).

În Sistemul Periodic al Elementelor, seleniul face parte din gr. a VI-a, alături de O2, S, Te și Po (grupa calcogenilor); are masa atomică Z=34. În condiții obișnuite, seleniul este un element stabil ( nu se oxidează). Formeaza combinații, ca și sulful, la treptele de oxidare -2, 0, +2, +4, +6. În soluții puternic acide, se întâlnesc cationi tetra- și hexavalenți. La valențe superioare, mai stabili sunt anionii selenioși și selenici, analogi cu cei ai sulfului, cu diferența că se reduc mai ușor la seleniu metalic.

Precum sulful, se poate combina atât cu elementele electronegative, cât și cu cele electropozitive, la temperaturi ridicate, formând numeroși compuși: hidrogen seleniat, acid selenhidric, seleniuri, oxizi și oxoacizi ai seleniului, halogenuri și oxohalogenuri, selenoli, selenoeteri, diseleniuri și selenocianați. Dacă este puternic încălzit, seleniul se aprinde și arde cu o flacără albastră, degajând un miros neplăcut, caracteristic (dat de SeO2).

Există 5 izotopi stabili ai seleniului (74Se, 76Se, 77Se, 78Se, 80Se) și încă 4 instabili, cu perioade de înjumătățire variabile. 82Se se găsește în mod natural în mediu, având o perioadă de înjumătățire de 1020 ani. 79Se prezintă interes din punctul de vedere al cercetărilor privind energia nucleara, deoarece este un produs de fisiune al 235U. După stocarea pe o perioadă de timp îndelungată a deșeurilor provenite de la reactoarele nucleare ce folosesc 235U ca material radioactiv, majoritatea radiațiilor vor proveni de la 79Se, cu o perioadă de înjumătățire de 2.95*105 ani. Radioactivitatea mediului ar fi afectată pe termen lung în cazul eliberării acestui izotop în mediu. 75Se este un alt izotop relevant pentru studiile de mediu. Are o perioadă de înjumătățire de 120 de zile. Emite radiații gamma, ceea ce îl face utilizabil în diverse studii, datorită limitei de detecție mici, detecție ce se poate realiza cu detectoarele de radiații; limita de detecție ȋn acest caz fiind de 10-9 mol Se (Fernández-Martínez et Charlet, 2009).

II.2. Seleniul ȋn sol, apǎ și aer

Seleniul prezintă proprietăți chimice complexe, ceea ce îi permite să formeze combinații cu o multitudine de elemente din natură. Aceasta face ca seleniul și compușii săi să fie larg răspândiți în toate elementele de mediu: scoarța terestră, sol, apă și aer. Totuși, Se este considerat a fi un element prezent în urme, cu o concentrație medie în scoarța terestră de aproximativ 0,09 mg/kg. Rocile reprezintă sursa primară de seleniu, conținând aproximativ 40 % din totalul existent în scoarța terestră. Rocile sedimentare au o concentrație medie de aproximativ 0,0881 mg/kg, dar cu mari diferențe între diferitele regiuni geografice. (Fernández-Martínez et Charlet, 2009). Deoarece acest tip de roci sunt prezente aproape pe toată suprafața terestră, este de prevăzut că solurile deficiente în seleniu sunt mult mai răspândite decât cele conținând cantități excesive de seleniu. Argilele, cărbunii de pământ sau alte depozite bogate în materie organică conțin de obicei cantități mari de seleniu.

Concentrația seleniului în sol este influențată în primul rând de concentrația acestuia în rocile din care s-au format solurile respective. Concentrațiile variază în medie între 0,1 și 2 mg/kg. În zonele selenifere, s-au raportat și concentrații de 1200mg/kg. Solurile selenodeficiente sunt considerate acelea cu un conținut <0,1 mg/kg, iar soluri selenifere cele cu un conținut > 0,5 mg/kg (Reilly, 2006).

Concentrațiile și formele chimice ale seleniului în soluri sunt date de diverși factori chimici sau fizici, precum pH-ul, compoziția chimică a solurilor, suprafața adsorbantă, statusul oxido-reducător. Procesele care au loc includ oxidarea Se elementar sau a Se(II) din seleniuri metalice la seleniți (la pH acid) sau le selenați (la pH alcalin). Oxianionii selenit și selenat există predominant în solurile aerate alcaline, pe când seleniurile insolubile și seleniul elementar există în special în solurile slab aerate, acide, bogate în material organic, puternic reducătoare (Navarro-Alarcon et Cabrera-Vique, 2008).

Deoarece în timpul activității vulcanice seleniul este evacuat odată cu gazele, concentrațiile acestuia în rocile vulcanice sunt în general mici (în medie – 0,0086 mg/kg). Cenușa vulcanică pe de altă parte, conține cantități mari de seleniu, solurile formate după depunerea acesteia fiind bogate în Se.

Trebuie făcută diferențierea între conținutul solului în Se și disponibilitatea (biodisponibilitatea) sa. Există interacțiuni fizico-chimice între Se (toate speciile chimice) și celelalte componente anorganice sau organice ale solului, seleniul putând fi astfel imobilizat.

Solurile vulcanice sunt soluri acide, cu o porozitate mare, mediul reducător prevalând rareori. In aceste soluri selenații sunt instabili, seleniții fiind forma prevalentă de seleniu. În solurile vulcanice din Hawaii, conținutul în seleniu variază între 1 și 20 mg/kg dar nu este disponibil pentru vegetație, datorită asocierii sale cu materiale care conțin fer și aluminiu, acesta fiind un exemplu de sol cu un conținut mare de seleniu și biodisponibilitate scăzută (Navarro-Alarcon et Cabrera-Vique, 2008).

Rețelele hidrologice reprezintă unul dintre cele mai semnificative sisteme implicate în transportul seleniului. Anual, aproximativ 14000 tone de seleniu sunt transferate de pe continente în oceane, cea mai mare parte fiind reprezentată de seleniul inclus în sedimente ~85 % și doar 15% fiind seleniu în forme solubile. Formele solubile ale seleniului prezente în apele de suprafață sunt reprezentate în general de seleniți și selenați.

Materia organică joacă un rol fundamental privind proprietățile fizico-chimice ale solului (pH, tensiunea superficială, capacitatea de schimb ionic, etc.), influențând mobilitatea oligoelementelor din sol. Mecanismele exacte ale interacțiunilor dintre seleniu și materia organică sunt încă puțin cunoscute, având în vedere heterogenitatea compușilor organici existenți în sol și în apă. Seleniul este asociat cu materia organică prin 2 tipuri diferite de procese (Reilly, 2006).

Seleniul poate fi imobilizat prin formarea de complexe ternare de tipul Se-metal-ac. humici, ionul metalic cel mai des implicat fiind Fe(III). Se pot forma complexe și între Se și polizaharidele naturale, cu greutăți moleculare diferite, precum și între Se și ac. fulvici. Complexarea Se de către compușii organici duce la scăderea biodisponibilității acestuia pentru plante. Aceste procese au fost studiate în regiuni din nord-estul Chinei, unde conținutul solului în seleniu nu este mic, dar este crescut în substanțe organice, ceea ce duce la o Bd scăzută pentru plante, deci și la un aport alimentar scăzut pentru populația din zonele respective. Acest lucru a fost corelat cu incidența crescută în acele zone a bolilor datorate deficitului de Se: Keshan și Kaschin-Beck.

Trecerea Se dintr-o stare de oxidare în alta, mobilitatea și biodisponibilitatea sa sunt influențate semnificativ de prezența microorganismelor în mediu. Influența lor asupra biodisponibilității se manifesta prin controlul stărilor de oxidare ale Se, reflectându-se asupra solubilitații diferiților compuși cu Se. Bacteriile pot folosi selenitul și selenatul în metabolismul energetic, drept acceptori finali de electroni, prin reducere la Se sau Se-2. Se poate fi redus și încorporat în materia organica. Datorită similarităților dintre Se și S, Se poate fi încorporat în aminoacizi (selenocisteina, selenometionina) prin aceleași căi biochimice precum sulful. Unele microorganisme pot transforma acești aminoacizi pentru a produce H2Se, care este oxidat în final la Se elementar. S-a descoperit că unele bacterii sulfat-reducătoare care se găsesc în unele ape de suprafață au capacitatea de a reduce selenații la seleniuri, insolubile, explicându-se în acest fel concentrațiile scăzute de seleniu în aceste ape. Unele specii din această categorie ar putea fi utilizate pentru decontaminarea apelor poluate ce conțin cantități mari de compuși ai seleniului. Există și bacterii capabile sa oxideze Se elementar sau seleniurile la seleniți sau selenați.

Procesele vulcanice contribuie semnificativ la diferitele cicluri geochimice ale seleniului, fiind o sursă naturală de seleniu pentru atmosferă și hidrosferă. Se estimează că anual sunt emise în atmosferă între 300 și 1000 de tone de seleniu ca rezultat al proceselor vulcanice. Datorită proprietăților chimice asemănătoare între sulf și seleniu, alături de SO2 sunt emise și cantități însemnate de SeO2(g), Se reprezentând aproximativ 5 % din cantitatea de S emisă. O altă sursă importantă pentru atmosferă este reprezentată de unele procese industriale, în special arderea cărbunilor de pământ. Cantitatea de seleniu atmosferic ce se depune pe sol este influențată de proximitatea față de o sursă de emisie, regimul precipitațiilor din zona în cauză, etc.

Sursele terestre și marine de natură biologică contribuie deasemenea la cantitatea de seleniu din atmosferă. Majoritatea acestor compuși volatili ai seleniului de proveniență biologică este reprezentată de seleniura de metil (dimetilseleniură), rezultată din activitatea microbiană. Totuși, această formă are o durată de viață scurtă în atmosferă, reacționând cu ozonul sau cu radicalii hidroxil. Volatilizarea seleniurii de metil este influențată de temperatura, pH-ul și umiditatea solului, proprietățile oxido-reducătoare, etc. Acești parametri ai solului influențează și activitatea microorganismelor, deci și rata procesului de biometilare al seleniului.

Microorganismele care sunt capabile să biometileze seleniul sunt importante pentru decontaminarea solurilor selenifere sau a celor contaminate datorită unor acțiuni antropice. Procesele sunt complexe, constând intr-o serie de reacții enzimatice prin care seleniul trece de la starea de oxidare +VI sau +IV la –II, urmând o reacție de metilare prin care se pot forma mai mulți compuși de tip seleniură, cu unul sau două grupări metil, gazoși sau lichizi. Sunt posibile totuși și succesiuni de reacții neenzimatice, abiotice. Procesele de biometilare au loc și în mediul acvatic, cantitățile de compuși volatili ai seleniului rezultate fiind mult mai mari decât cele de pe suprafața solului. Unele microorganisme au fost studiate, în vederea manipulării lor pentru decontaminarea unor medii. Un exemplu îl reprezintă algele unicelulare de apă dulce din genul Chlorella sp. Aceste alge au o rată de transformare a selenaților în dimetilseleniură superioară algelor ce nu trăiesc în mediul acvatic.

Circuitul seleniului în natură este puternic influențat de activitățile antropice, mai ales în ultimele decenii, datorită industrializării masive și a intenselor lucrări de amenajare a teritoriului. Se estimează că anual aproximativ 88000 de tone de Se sunt eliberate în mediu datorită activităților antropice. Activitățile incriminate sunt, în ordinea importanței, arderea combustibililor fosili, urmată de extracția și prelucrarea diferitelor minereuri feroase și neferoase, ceea ce duce la eliberarea în mediu și a altor compuși mai mult sau mai puțin nocivi. Amenajările funciare și folosirea irigațiilor la scară largă au dus la modificarea circuitului Se în natură, ducănd la apariția unor zone cu soluri bogate în seleniu. Folosirea îngrășămintelor pe baza de fosfați a dus deasemenea la îmbogațirea solului în seleniu, acestea conținând în general cantități mari de seleniu (Navarro-Alarcon et Cabrera-Vique, 2008).

II.3. Seleniul ȋn produsele alimentare

Alimentele sunt principala sursă de seleniu pentru organism. Absorbția seleniului din alimente este în general bună și expunerea organismului la seleniu prin intermediul dietei variază între 11 și 5000 μg/zi, funcție de regiune. În medie, ingestia de Se din alimente se situează între 20 și 300 μg/zi.

Conținutul în seleniu al alimentelor este dependent de cantitatea de seleniu din sol, care diferă de la o țară la alta, de la o regiune la alta, dar depinde deasemenea și de posibilitatea plantei de a încorpora seleniul din sol.

Rata ingestiei de seleniu este dependentă de zona de rezidență și de consumarea sau nu a alimentelor de import. Valori mari ale seleniului în sol sunt reflectate în valori mari ale seleniului în lichidele biologice a locuitorilor zonei geografice respective. Persoanele care consumă cantități mici de proteine vor avea și o ingestie redusă de seleniu deoarece acesta se găsește în mod special în proteine. În unele regiuni în care solul este sărac în seleniu s-au implementat diferite strategii cu scopul de a oferi populației cantitatea necesară de seleniu, prin folosirea de îngrășăminte îmbogățite în seleniu sau prin suplimentarea hranei animalelor cu compuși ai seleniului. Totodată, zonele cu soluri bogate în Se și Fe sunt folosite pentru creșterea plantelor care acumulează aceste elemente, plante ce sunt apoi exportate (Reilly, 2006).

Au fost efectuate studii pentru a stabili corelațiile între concentrațiile Se în sol, doza medie zilnică consumată și concentrațiile Se în ser, urină și lapte matern, pentru o serie de țări. Totuși, aceste studii prezintă o mare heterogenitate, având în vedere variația concentrației Se în sol în funcție de regiune, obiceiurile alimentare diferite, predominanța unor anumite specii chimice ale Se într-un anumit tip de sol, etc.

Ȋn Tabelul 2.I este prezentatǎ relația de directă proporționalitate între doza medie zilnică ingeratǎ și concentrația în lichidele biologice. Totuși valorile raportului doză/concentrație ȋn lichid biologic nu sunt aceleași. În China, în regiunea Enshi, deși dozele zilnice sunt foarte mari, concentrațiile în laptele matern nu depășesc 120,5 µg/L, în schimb concentrațiile în urină sunt de același ordin de mărime precum dozele zilnice, demonstrând o rată de excreție accentuată (Dumont et al, 2006; Reilly, 2006).

Ȋn Tabelul 2.II este redatǎ concentrația seleniului ȋn diferite tipuri de alimente, provenind din țǎri diferite.

Dacă ne referim la alimentele de origine vegetală, conținutul acestora în seleniu depinde în primul rând de conținutul de Se în sol. Totuși, fiecare specie de plante are anumite particularități fiziologice, putând acumula cantități limitate de Se. Majoritatea plantelor conțin mai puțin de 5 mg/kg materie uscatǎ, chiar dacă solul conține cantități mari de Se. Majoritatea plantelor nu tolerează concentrații foarte mari de Se în sol, exceptȃnd plantele acumulatoare de Se. Unele specii din genurile Astragalus, Neptunia, Stanleya pot acumula Se în cantități de până la 10-15 g/kg materie uscatǎ, crescând pe soluri ce au concentrații normale de Se; aceste specii nu sunt folosite în scop alimentar (Fernández-Martínez et Charlet, 2009).

Tabelul 2.I. Concentrațiile Se în sol, doza medie zilnică de Se, Se în ser, urină și lapte matern pentru câteva țări (adaptare după Dumont et al, 2006)

Conținutul în Se al alimentelor de origine animală depinde în primul rând de alimentația animalelor de la care provin. S-a constatat că în medie, conținutul în Se al cărnii de porc este cu 48 % mai mare decât al cărnii de oaie, datorită diferențelor de asimilare ale acestui oligoelement de către cele două specii (Pedrero et Madrid, 2009). Această constatare a fost explicată prin faptul că, la animalele rumegătoare formele de seleniu sunt reduse la seleniuri insolubile de către microorganismele prezente în stomacul acestora, micșorându-se biodisponibilitatea.

Carnea, în special cea de porc și produsele obținute din cereale (în special pâinea) reprezintă principala sursă de Se pentru indivizii sănătoși din Sud-Estul Spaniei, unde aproximativ 55 % din rația zilnică de Se provine din aceste două categorii alimentare. Acest aport se datoreazǎ atât concentrației ridicate de Se cât și datorită consumului crescut (Navarro-Alarcon et Cabrera-Vique, 2008). Din acest motiv, vegetarienii și lactovegetarienii au un aport scăzut, ceea ce poate contribui la manifestarea deficienței de Se în organism.

Concentrațiile Se în laptele diferitelor specii descresc în următoarea ordine: om > oaie > capră > vacă. Aceste concentrații sunt invers proporționale cu proporția de grăsime pe care o prezintă laptele.

Fructele și legumele au în general cantități mici de seleniu, cu excepția unor specii acumulatoare. Acest fapt s-ar putea explica și datorită conținutului relativ mic în proteine, precum și conținutului mare de apă (în special fructele). Leguminoasele au în general un conținut crescut de Se, precum și cerealele.

Gătitul alimentelor, precum fierberea sau coacerea, pot micșora conținutul alimentelor în seleniu, datorită volatilizării; Totuși, în aceste procese având loc și pierdere de apă, este posibil să crească concentrația în seleniu, dar d.p.d.v. cantitativ sa fie mai puțin seleniu.

Absorbția și acumularea Se din sol de către plante sunt dependente de concentrația și formele chimice ale seleniului, precum și de prezența altor ioni în sol sau capacitatea fiecărei specii de a îl acumula. Există o competiție la nivelul absorbției între seleniți și sulfați, datorită faptului că ambii anioni sunt preluați din sol de același mecanism de transport prezent în mebrana citoplasmatică, de la nivelul rădăcinii (Pyrzynska, 2009).

Absorbția seleniului este dependentă de proprietățile geochimice ale solului, ceea ce influențează și proporția între formele sub care Se se găsește în sol. Absorbția Se(VI) este superioară celei a Se(IV), în primul rând datorită faptului că seleniții au o solubilitate în apă mai mică (Navarro-Alarcon et Cabrera-Vique, 2008).

În plante, Se(VI) este redus la Se(IV), care apoi este redus mai departe la anion seleniură, procese ce implică prezența glutationului redus. Seleniura este încorporată apoi în

aminoacizi, precum selenocisteina și selenometionina; SeMet poate fi metabolizată apoi până la γ-glutamil-Se-metil-selenocisteina. La concentrații normale în sol, seleniul este incorporat în proteine de către plante, mai ales prin intermediul Se-Cys și Se-Met. La concentrații crescute, compusul predominant devine Se-metilselenocisteina. Excreția Se de către plante sub forma diferiților compuși volatili este importantă deoarece plantele pot prelua cantități foarte mari de Se din sol pe care le transformă printr-o serie de reacții biochimice în compuși volatili. Acest proces se numește fitovolatilizare. Acest proces este o metodă de detoxifiere. Principalul compus rezultat este dimetilseleniura, care poate rezulta din două căi biochimice. Factorii care influențează procesul de volatilizare sunt: prezența Se-Cys (poate fi încorporată în proteine, Se nemaifiind disponibil pentru volatilizare) și compusul intermediar care este disponibil pentru a fi transformat în specii volatile (Se-Met are prioritate pentru a fi transformată în specii volatile) (Reilly, 2006).

Tabelul 2.II. Concentrația medie a Se în unele alimente, în funcție de țara de proveniență

(adaptare dupǎ Navarro-Alarcon et Cabrera-Vique, 2008)

II.3.1. Nucile de Brazilia – sursǎ de seleniu

Nucile de Brazilia (Bertholletia excelsa) sunt cunoscute pentru concentrația lor ridicată în seleniu. Copacii cresc în Bazinul Amazonului, în special în Brazilia, precum și în Peru, Bolivia, Columbia, Venezuela și Ecuador; conținutul în Se este dependent de concentrația acestuia în sol. Nucile culese din părțile centrale ale Braziliei conțin de până la 10 ori mai mult Se decât cele culese din partea de vest a Braziliei (Chang et al, 1995). Conțiunutul în seleniu poate varia chiar și între nucile culese din același copac.

O singură nucă conține Se în cantitate mai mare decât doza zilnică recomandată. Proteinele conținute de aceste nuci sunt bogate în selenoaminoacizi. Variația conținutului în

Se este dependentă de tipul de sol, pH, umezeala solului, vârsta copacului, poziția nucii la nivelul copacului.

Un studiu referitor la relația dintre ingestia nucilor de Brazilia și prevenirea cancerului de sân a ajuns la concluzia că aceste nuci sunt cel puțin la fel de eficiente ca Na2SeO3, când aceleași nivele de seleniu au fost administrate la șobolani. Protecția împotriva cancerului de sân conferită de nucile de Brazilia a fost asociată cu creșterea retenției de seleniu în ficat, rinichi, glanda mamară și plasmă. Nivelul acumulării seleniului în țesuturi a fost proporțional cu cantitatea de nuci de Brazilia adăugată în dietă (Chunheing et al, 2004).

Un studiu efectuat în Noua Zeelandă, țară cu soluri sărace în seleniu, a demonstrat echivalența terapeutică dintre nucile de Brazilia și selenometionina sub formă de supliment nutritiv. S-a stabilit că administrarea p. o. a 100 µg Se sub formă de selenometionină este la fel de eficace precum consumul a 2 nuci de Brazilia cu masa medie de 4 g. Studiul a fost efectuat pe 30 de bărbați și 30 de femei, cu vârste diferite, toți cu nivelurile plasmatice ale Se scăzute, timp de 12 săptămâni. Voluntarii au fost împărțiți în 3 grupuri; unui grup i s-au administrat tablete conținând doar excipienți (placebo), iar celorlalte 2 grupuri comprimate conținând 100 µg Se-Met, respectiv 2 nuci de Brazilia. Drept biomarkeri ai consumului de Se au fost luați în calcul concentrația serică a Se și activitatea GPx (Thomson et al, 2008).

II.3.2. Plantele acumulatoare de seleniu

Deși nucile de Brazilia sunt o bună sursă de seleniu, nu reprezintă un aliment des consumat. Cantitățile de nuci de Brazilia sunt relativ limitate. Pentru o dietă cu un conținut optim de seleniu, în mod natural, a fost necesară căutarea de alternative, cercetările îndreptându-se asupra plantelor acumulatoare de seleniu. Aceste plante pot acumula cantități mari de seleniu, fără a prezenta semne de toxicitate; aminoacizii cu seleniu sunt utilizați pentru producerea unor fitocompuși.

Când sunt crescute în zone cu soluri seleno-feroase, consumarea acestor plante poate duce la apariția efectelor toxice la om. Pe de altă parte, când sunt consumate în cantități optime, pot reprezenta o sursă importantă de Se pentru organism. Tipul ideal de plante pentru fitoremedierea solului este cel care poate să metabolizeze Se la compuși volatili, să fie rezistent la condiții dificile de mediu, să aibă o creștere rapidă și să producă o cantitate mare de biomasă. Calea de asimilare a Se anorganic în Se-cisteină se crede a fi aceeași ca în plantele non-acumulatoare de seleniu. Se-acumulatorii metabolizează în primul rând Se-Cys. Cele mai multe studii cu referire la Se-acumulatori au fost făcute pe Allium sativum

(usturoi), Allium cepa (ceapa), Brassica juncea (muștar indian), Brassica napus și pe unele ciuperci (Reilly, 2006; Navarro-Alarcon et Cabrera-Vique, 2008).

II.3.2.1. Usturoiul

Usturoiul (Allium sativum) face parte din familia Liliaceae și a fost cultivat și folosit drept condiment din cele mai vechi timpuri. S-au întreprins numeroase studii pentru confirmarea activității benefice a usturoiului asupra sănătății, aceasta datorându-se compușilor cu sulf și Se. La folosirea usturoiului în alimentație ca sursă de Se, trebuie avut în vedere faptul că dacă este supus proceselor culinare ce implică tratament termic, efectele sale benefice pentru organism pot fi diminuate, având în vedere stabilitatea relativ redusă a compușilor cu Se din usturoi. S-a demonstrat că administrarea de usturoi îmbogățit în Se are acțiune anticarcinogenǎ mult mai eficientă decât utilizarea de suplimente cu Se, ceea ce face foarte importantă studierea compușilor cu Se existenți în usturoi.

Utilizând metode cromatografice, s-au identificat compușii cu seleniu și proporția în care se găsesc aceștia în usturoi: γ-glutamil-Se-metil-selenocisteină – 73% din cantitatea totală de Se, selenometionină – 13%, γ-glutamil-selenometionină- 4 %, Se-metil-selenocisteină – 3 %, selenat – 2 %, selenocisteină – 0,5 % și selenocistationină – 0,5 % (Arnault et Auger, 2006). Dipeptidul γ-glutamil-Se-metil-Se-Cys, compusul în concentrația cea mai mare în usturoi, este principalul compus cu Se din extractul apos, servind în primul rând ca transportor de Se-metil-SeCys. Cercetările au scos la iveală activitatea anticancerogenică a acestor 2 compuși. Ambii compuși sunt bine absorbiți și sunt excretați prin urină.

Modificările ADN, ale lipidelor și proteinelor induse de ROS joacă un rol important în procesul de îmbătrânire și incidența unor boli, incluzând bolile cardiovasculare, neurodegenerative și neoplazice. Extractele proaspete din usturoi care sunt lăsate la maturat (la „îmbătrânit”) o anumită perioadă de timp conțin anumite substanțe cu proprietăți antioxidante. Aceste extracte maturate din usturoi (EMU) conțin o serie de compuși organosulfurici și organoselenici, lipo- și hidrosolubili, precum și flavonoide. Maturarea extractului duce la transformarea unor compuși antioxidanți instabili în compuși mai stabili, hidrosolubili, cu o Bd crescută. S-au efectuat numeroase studii, atât pe animale cât și clinice, demonstrându-se beneficiile administrării de EMU asupra reducerii incidenței bolilor cardiovasculare, cancerului, B. Alzheimer, etc. (Borek, 2001).

II.3.2.2. Ceapa

Ceapa (Allium cepa) are un conținut în seleniu mai mic decât usturoiul. Compușii cu Se nu sunt prezenți doar în bulb, ci și în partea verde superioară, așa-numita ceapă verde. Analiza acestor frunze a scos în evidență prezența în special a Se-metil-Se-Cys, alături de Se-(Cys)2 și Se-Met, dar în cantități mai mici (Shah et al, 2004).

II.3.2.3. Plantele din genul Brassica

Printre cele mai cunoscute plante din acest gen se numără: broccoli, varza de Bruxelles, muștarul (mai multe specii), varza, conopida, gulia etc. Conform studiilor ȋntreprinse, ȋn cazul ȋn care aceste plante sunt cultivate pe soluri selenoferoase, convertesc o mare parte din Se în selenoaminoacizi. Acești compuși înlocuiesc o serie de compuși ai sulfului din plantă, precum și o serie de fitosubstanțe conținând sulf.

Muștarul indian (Brassica juncea) este o plantă ideală pentru fitoremedierea solurilor bogate în seleniu. Acumularea de Se este dependentă de forma chimică sub care se află seleniul furnizat plantei. Selenații sunt asimilați cu randament maxim. Specia a fost modificată genetic, pentru a mări expresia genelor ce codifică enzima Se-cistein-metil-transferaza, în acest fel crescând cantitatea de Se-aminoacizi care sunt încorporați în proteine (Montes-Bayón et al, 2002).

Broccoli este o varietate a speciei B. oleracea, având capacitatea de a acumula cantități mari de Se. Totuși, s-a constatat că biodisponibilitatea Se din broccoli este în general mică. La analiza extractelor din broccoli, s-au găsit compuși tipici cu Se, precum Se-(Cys)2, Se-metil-Se-Cys, selenit, selenat, precum și câțiva compuși cu structurǎ ȋncǎ necunoscutǎ (Ge et al, 1996).

II.3.2.4 Astragalus bisulcatus

Astragalus bisulcatus este o plantă din familia Fabaceae, fiind cel mai important acumulator de seleniu. Crește în mod natural pe solurile bogate în seleniu din S-E Statelor Unite. Plantele pot conține până la 0,65 % Se raportat la materialul uscat, în părțile aeriene aflate în proces de creștere Principalul compus cu seleniu este metil-Se-Cys. Semințele acestor plante acumulează γ-glutamil-Se-metil-Se-Cys (Reilly, 2006; Navarro-Alarcon et Cabrera-Vique, 2008).

II.3.3. Ciupercile

Există unele specii de ciuperci acumulatoare de seleniu. Agaricus bisporus (sin. Psalliota bisporus , ciuperci Champignon) este o specie răspândită în toată lumea, fiind cea mai consumată specie cultivată. Altă specie acumulatoare este Boletus edulis (hrib cenușiu), răspândită în multe regiuni ale globului; aceasta conține totuși o mare cantitate de apă, comparativ cu alte specii. Analiza unor extracte din specia Lentinus edodes, foarte des consumată în zona Asiei de Est a evidențiat prezența în cantitate mare a Se-Met (Navarro-Alarcon et Cabrera-Vique, 2008).

II.3.4. Organismele marine

Peștii pot acumula Se din apă, plante și alte specii marine, în special prin hranǎ, dar și prin piele sau prin branhii. Concentrații între 3 și 5 µg Se/l se consideră a fi nivelul la care apare acumularea seleniului. Acumularea de Se din sursele nutritive (fitoplancton și zooplancton) este mai importantă decât cea din apă. Biodisponibilitatea Se pentru pești este influențată de forma sub care se găsește seleniul. In general, Bd variază în ordinea: Se-Met >selenit>Se-(Cys)2 (Reilly, 2006).

II.3.5. Drojdia de bere

Drojdia de bere (Saccharomyces cerevisae) are un conținut mare în proteine, aspect corelat cu abilitatea de a încorpora Se. În general, seleniul este adăugat în mediul de cultură ca Na2SeO3. Cu cât se adaugă mai mult Se cu atât este mai puternic inhibată creșterea celulară. Pe de altă parte, cantitatea de Se intracelular crește odată cu creșterea cantității de Se din mediu. Seleniul se găsește încorporat în proteinele din drojdie. Drojdia ȋmbogǎțitǎ ȋn seleniu este utilizatǎ pentru fabricarea unor suplimente alimentare cu seleniu. Câțiva factori farmacologici influențează biodisponibilitatea Se din suplimente, incluzând interacțiunile cu alți micronutrienți din suplimente, formulări în care de obicei apar aceste suplimente, efecte derivate din administrarea lor simultană cu alte medicamente și în final cu durata dintre administrări, doza și programul administrării (Ponce de Leon et al, 2002).

Drojdia de bere îmbogățită în Se este o sursă economică de Se datorită prețurilor de producție reduse și datorită capacității de a forma selenoproteine. Aceasta se poate folosi ca atare sau inclusă în suplimente. O altă posibilitate este aceea de a folosi drojdia selenioasă la fabricarea pâinii. Pâinea este în general săracă în Se și deci, folosirea de drojdie de bere în acest scop poate conduce la cantități mai mari de Se ingerate deoarece pâinea este un produs comun, consumat de multe persoane. În plus, Se din drojdia îmbogățită cu Se este mai stabil la temperaturi mari.

CAPITOLUL III

METABOLISMUL SELENIULUI ȘI SELENOPROTEINELOR

Seleniul este un oligoelement pentru care dozele optime și cele toxice sunt foarte apropiate. De aceea, este important de cunoscut concentrațiile sale în produsele alimentare, dar aceste date sunt relative, trebuind evaluată și biodisponibilitatea Se din aceste alimente sau suplimente nutritive. După ce a fost absorbit, concentrația seleniului în diferite organe, rata de excreție și forma în care se găsește depind de mai mulți factori: forma chimică sub care se găsește Se absorbit în organism, pH-ul gastric, prezența altor minerale în alimentele ingerate, starea de sănătate, vârsta, sexul, cantitatea totală de seleniu prezentă în organism la un moment dat, etc.

III.1. Absorbția seleniului

III.1.1. Absorbția gastrointestinalǎ. Biodisponibilitatea

Absorbția seleniului, la om, are loc în special la nivelul terminal al intestinului subțire. Proporția de seleniu ce se absoarbe din cantitatea ingerată (Bd medie) este de aprox. 80 %, dar depinde în mare măsură de compusul cu seleniu ingerat. În general, compușii organici sunt mult mai bine absorbiți decât ce anorganici. Selenometionina are o absorbție de aproximativ 90 %, pe când selenitul de sodiu doar 60-70 %. Forma sub care se găsește seleniul influențează și capacitatea organismului de a reține cantități suficiente de seleniu în timp. Deși selenometionina este absorbită mai ușor decât alte substanțe, nu prezintă o capacitate crescută de a asigura necesarul de Se pentru desfășurarea proceselor fiziologice. Se-Met este în principal încorporată în proteine, în locul Met, spre deosebire de selenocisteină. S-a constatat că Se se absoarbe mai bine din alimente decât din suplimentele nutritive, referindu-ne la același compus chimic. Seleniul din alimentele de origine vegetală are o biodisponibilitate mai mare decât cel prezent în alimentele de origine animală. Absorbția este favorizată de prezența în dietă a vitaminelor E și A și a proteinelor și este redusă de prezența sulfului, gumei guar, compușilor cu arsen și mercur și vitamina C. Mecanismele de absorbție ale seleniului din intestin nu sunt pe deplin elucidate. Se pare că selenatul este absorbit printr-un mecanism de transport activ Na+-dependent nespecific, fiind același și pentru sulf, pe când selenitul ar fi absorbit prin difuzie pasivă. Există competiție de absorbție între ambii anioni ai seleniului și compușii anorganici cu sulf. Selenometionina comportă un mecanism de transport activ de tip carrier, același cu metionina, având loc o competiție între acești doi analogi. Absorbția altor selenoaminoacizi nu este pe deplin elucidată. Pentru selenocisteină se presupune că ar fi vorba de un mecanism de transport pasiv (Reilly, 2006; Hatfield et al, 2006; Navarro-Alarcon et Cabrera-Vique, 2008).

Pentru evidențierea biodisponibilității diferiților compuși cu seleniu și a diferențelor de metabolizare ale acestora s-au facut numeroase studii, atât pe animale, cât și studii clinice. Un studiu efectuat în China pe 54 de șobolani femelă a arătat că biodisponibilitatea Se din drojdie (predominând sub formă de selenometionină) este superioară celei a Se administrat sub formă de selenit. Animalele au fost hrănite inițial timp de 13 zile cu hrană sǎracǎ în Se. Animalele au fost împărțite în 9 loturi a câte 6 șobolani fiecare, unul fiind lotul martor, hrănit pe toată perioada experimentului cu aceeași hrană deficentă în seleniu, fără suplimente. Timp de 10 zile animalelor li s-au administrat, în adiție la dieta de bază, pe fiecare lot în parte, cantități de 0,05 , 0,1 , 0,15 și 0,2 mg/kg de Se fie sub formă de selenit de Na și sub formă de drojdie îmbogățită în seleniu. Șobolanii au fost anesteziați și li s-au recoltat probe de sânge, precum și fragmente din ficat, rinichi și mușchi. Concentrația de Se a fost determinată fluorimetric. În ser, a fost stabilită și activitatea enzimelor SOD, GPx, determinându-se și concentrația malondialdehidei. S-au observat concentrații mai mari de Se precum și activități ușor crescute ale enzimelor menționate în cazul suplimentării alimentației cu drojdie, față de suplimentarea cu selenit de Na (Han F et al, 2009).

Studii clinice efectuate în statul Tennessee, SUA au demonstrat eficiența diferită a diferiților compuși cu Se asupra creșterii valorilor unor markeri biologici ai acestuia, stabilindu-se o ierarhie : Se-Met> drojdia > selenitul. Studiul a fost efectuat pe 81 de voluntari sănătoși, dintre care 59 femei și 22 bărbați; o parte au abandonat studiul înainte de finalizare. Acestora li s-au administrat, în mod randomizat, capsule conținând SeMet, drojdie, selenit de Na sau doar excipienți (capsule placebo), pe o perioadă de 16 săptămâni. La sfârșitul perioadei li s-au recoltat probe de sânge și urină, pe care s-au efectuat următoarele determinări: conc. Se în plasmă și urină, conc. selenoproteinei P, activitatea GPx. Datorită procedurilor folosite, doar conc. Se în urină a putut fi folosită pentru a estima Bd suplimentelor cu Se administrate (Burk et al, 2006).

Un studiu clinic efectuat pe 10 bărbați a demonstrat că absorbția selenatului de Na este superioară celei a selenitului de Na. Voluntarilor li s-a administrat 2 zile consecutiv lapte îmbogățit cu selenit sau selenat, corespunzând la 40 µg Se. Cei doi oxianioni aveau încorporați 2 izotopi diferiți ai seleniului: selenatul – 76SeO4 și selenitul 74SeO3. S-au recoltat probe de sânge și au fost colectate fecalele și urina din timpul studiului, timp de 10 zile după aceea; seleniul a fost determinat prin GC-MS; a fost determinatǎ și activitatea GPx. Deși absorbția selenatului a fost superioară, retenția în organism este mai bună pentru selenit (Van Dael et al, 2001).

În urma studiilor efectuate pe diverse animale s-au obținut uneori rezultate diferite privind biodisponibilitățile diferiților compuși cu Se. O explicație ar putea fi aceea că, deși s-au folosit aceleași specii, de ex. șobolani sau șoareci, aceștia provin din linii genetice diferite; markerii biologici aleși precum și metodele de dozare au fost diferiți. Referitor la studiile clinice, este de așteptat să existe diferențe metabolice interrasiale sau între grupuri de oameni din diferite regiuni ale lumii; procedurile și metodele folosite au fost deasemenea diferite.

III.1.2 Absorbția prin inhalație

Seleniul elemental, sub formă de particule suficient de mici, poate pătrunde pe cale respiratorie, determinând efecte toxice. Dioxidul de seleniu ajuns la nivel pulmonar este redus până la seleniu elementar, ducând deasemenea la manifestări toxice, la expunerea prelungită (Reilly, 2006).

III.1.3 Absorbția prin piele și mucoase

Sulfura de Se, folosită în diferitele sorturi de șampon antiseboreic are o absorbție redusă prin pielea intactă; absorbția crește dacă pielea este iritată. Acidul selenios se absoarbe în proporție semnificativă, după un contact prelungit cu pielea; are acțiune iritantă. Seleniul metalic nu se absoarbe prin piele, pe când dioxidul de Se poate forma cu apa sau cu transpirația acid selenios. Oxiclorura de Se este iritantă, putându-se absorbi (Reilly, 2006).

III.2 Transportul seleniului în organism

Seleniul absorbit este transportat în organism în majoritate legat de proteine, după reducerea în eritrocite la anion seleniură, proces ce implică enzima glutationreductază. La om, majoritatea cantității de seleniu circulă în organism legată de proteinele plasmatice din categoria β-globulinelor, și anume VLDL (very low density lipoproteins – încadrate la β-globuline). Totuși, s-a constatat că fracția proteică de care se leagă seleniul variază în funcție de alimentație. Dacǎ seleniul se gǎsește ȋn hranǎ preponderent sub formǎ de Se-Met, aprox. 50 % din Se se găsește legat de albumină. La alte specii din regnul animal s-a constatat că există proteine carrier specializate pentru transportul seleniului. La om se crede ca principalii transportatori extracelulari pentru Se sunt Selenoproteina P și GPx 3, deși conțin în special Se-Cys. S-au identificat și structuri polipeptidice cu masă mica care ar putea funcționa ca transportatori de Se (Reilly, 2006).

III.3 Distribuția și retenția seleniului în țesuturi

Eficacitatea reținerii seleniului în organism depinde în special de forma chimică ingerată. Deși Se-Met este absorbită și reținută mai eficient decât selenitul și selenatul, administrarea ei nu este eficientă pentru menținerea în timp a nivelului optim de Se în organism. Explicația ar fi că Se-Met este încorporată imediat în proteinele structurale din mușchi, nespecific, în locul Met, nefiind stocată pentru încorporarea în proteinele funcționale.

Cantitatea totală de seleniu din organismul uman variază între 2 și 20 mg, în funcție de aria geografică și de alți factori. S-a constatat că există o ierarhie a priorităților privind distribuția Se în diversele compartimente ale organismului, în funcție de aportul de Se din alimentație. În condițiile unui aport suficient, aprox. 30 % din cantitatea totală de Se din organism se găsește în ficat, 15 % în rinichi, 30 % în mușchi și 10 % în plasmă. În cazul unui aport insuficient, cantitatea de seleniu din ficat și mușchi poate să scadă semnificativ, în schimb rinichiul ramâne cu o cantitate relativ constantă, sugerând importanța acestui organ pentru metabolismul seleniului. Se poate constata că datorită masei mici a țesuturilor renale, comparativ cu masa musculară din întreg corpul, concentrația de Se în rinichi este superioară. Mușchii reprezintă un depozit important pentru Se; conc. Se în mușchi depinde în general de țara în care trăiește persoana în cauză. Cantitățile totale de Se prezente în diferite organe variază în ordinea: rinichi>ficat>splină,testicule>miocard>plămâni>creier. Cantitățile de Se și de GPx sunt de 2-3 ori mai mari în ficat față de eritrocite, consecințǎ a proceselor enzimatice multiple care au loc la nivelul ficatului (Reilly, 2006; Hatfield et al, 2006).

Nandakumaran et al (2003) au efectuat un studiu in vitro pe fragmente de placentă recoltate post-partum pentru evaluarea cineticii transportului Se, Cu, Zn și Fe de la mamă la făt. S-a constatat că Se comportă un mecanism de transport pasiv; rata de difuzie prin placentă a fost aproximativ aceeași comparativ cu celelalte elemente, raportat la concentrațiile serice normale, excepție făcând Fe.

Xing et al (2006) au determinat, în studiul lor făcut pe mostre de ficat recoltate de la 8 adulți sănătoși, distribuția Se și a altor oligoelemente în diferitele compartimente celulare, precum și la nivel de organite celulare. Pentru determinarea Se a fost folosită spectrometria de fluorescență. S-au obținut următoarele valori medii, pentru mitocondriile din hepatocit (µg/mg proteină): membrana externă – 3,93; spațiu intermembranar-1,42; membrana internă-2,63; mitosol-1,69; mitocondrie (ansamblu) – 3,07.

III.3.1. Seleniul în sângele total

Nivelul seleniului în sângele total variază în funcție de aria geografică; dacă o persoană își schimbă reședința dintr-o țară unde solul este în medie bogat în seleniu într-o țară cu solul sărac în seleniu, nivelul sanguin al acestuia va scǎdea treptat. Aria geografică din proximitatea localității unde își are o persoană locuința nu are foarte mare importanță decât dacă persoana consumă exclusiv alimente mai mult sau mai puțin prelucrate, produse din materii prime sau recoltate din acea zonă. În prezent industria alimentară și agricultura, din punct de vedere al circulației materiilor prime și a produselor semifinite și finite nu mai sunt restrânse la o anumită arie geografică, ci tind spre procesul de extindere la nivel național sau chiar globalizare (Reilly, 2006).

III.3.2. Seleniul în plasmă și ser

Aproximativ 75 % din Se prezent în sânge se regăsește în plasmă și ser. Nivelurile Se în plasmă și ser sunt relevante pentru estimarea aportului recent de compuși cu seleniu, iar conținutul de Se în erotrocite reflectă aportul de Se pe termen lung, mai mare de 120 zile (durata lor medie de viață). S-a constatat că, la nou-născuții cu un nivel al Se considerat suboptim, nivelul acestuia scade și mai mult în primele luni de viață, pentru ca apoi să crească treptat; de la vârsta de 60 de ani, nivelul seric al Se scade din nou (Reilly, 2006).

În unele cazuri, prezența unei afecțiuni poate să scadă nivelul seric, pe când în alte cazuri poate fi valabilă reciproca. Totuși, aceste date se bazează pe constatări clinice care au folosit subiecți și proceduri de lucru diferite; aparatura folosită pentru analiza cantitativă a fost deasemenea diferită. Nu se poate stabili cu siguranță o corelație între afecțiuni și concentrația serică a Se, aceasta din urmă putând fi influențată și de aportul alimentar, acest parametru nefiind luat întotdeauna în calcul în studiile raportate.

Un studiu efectuat pe 54 de bărbați nefumători, din SUA, timp de 48 de săptamâni, a arătat că, după începerea suplimentării cu Se sub formă de drojdie, concentrațiile plasmatice cresc brusc în primele săptămâni, pe parcurs panta atenuându-se, ajungând la un maxim la sfârșitul perioadei de suplimentare alimentară. La grupul placebo nu s-au înregistrat abateri semnificative de la valoarea de bază, pre-studiu. După oprirea suplimentării, nivelul plasmatic scade relativ repede, ajungându-se la o concentrație în platou superioară concentrației de bază. (Hawkes et al, 2008).

III.3.3. Seleniul în alte componente ale sângelui

Nivelul plasmatic al Se este folosit pentru evaluarea status-ului acestui element, dar nu întotdeauna aceste valori reflectă rezervele de Se ale organismului. Eritrocitele conțin cantități mari de seleniu, investigarea lor d.p.d.v. clinic fiind facilitată de faptul că sunt ușor de separat din plasmă. Eritrocitele conțin și o izoformă a GPx, a cărei activitate poate fi evaluată, de aici deducându-se indirect existența unei rezerve optime de Se pentru funcțiile organismului. Trombocitele conțin deasemenea cantități relativ mari de Se.

Același studiu ȋntreprins de Hawkes et al (2008) a demonstrat că nivelul Se în eritrocite crește treptat, relativ lent, atingându-se o concentrație în platou dupǎ aprox. 20 săptămâni; după încetarea suplimentării cu Se, concentrația în eritrocite scade lent; în săptămâna a 96-a seleniul are o valoare mai mare față de valoarea de bază.

III.4. Biotransformarea compușilor cu seleniu ȋn organism

În general, organismul uman metabolizează diferiții compuși cu Se la anion seleniură, în primă fază. Organismele din regnul animal sintetizează mulți metaboliți intermediari în timpul conversiei Se anorganic în Se organic sau invers. Ionul seleniură este un metabolit cheie, provenit din selenit, care trece prin etapa intermediară de selenodiglutation (formă oxidată a glutationului, similară celei normale, S fiind înlocuit de Se), care este redus de reductaze NADPH-dependente. Seleniura poate proveni și din Se-Cys, prin acțiunea unor liaze. Seleniura, printr-o activare prealabilă prin transformarea în selenofosfat, furnizează Se pentru biosinteza selenoaminoacizilor și selenoproteinelor (Reilly, 2006; Hatfield et al, 2006).

III.5. Excreția seleniului

Timpul de înjumătățire biologic al seleniului la om a fost estimat la 100 de zile, în medie. Această valoare poate fi influențată, după cum s-a mai menționat, de o serie de factori, precum forma chimică sub care este ingerat. Totuși, pentru Se existent în fiecare organ, există timpi de înjumătățire diferiți. Se este excretat din organism pe 4 căi: prin urină, prin respirație, în timpul expirului, prin încorporare în fanere și prin fecale.

III.5.1 Excreția urinară

Excreția urinarǎ este principala cale pentru eliminarea seleniului din organism. Rata excreției variază cu aportul de Se. S-a constatat că, atunci când aportul este suficient sau supraexcedentar, excreția renală este cea care controlează statusul Se în organism, pe când absorbția intestinală nu este controlată homeostatic. În cazul aportului redus, și excreția este redusă, pentru a păstra rezervele. Declanșarea procesului de economisire a Se în organism are o perioadă de latență redusǎ. În urină s-au identificat următorii compuși: Se-Met, Se-Cys, selenat, selenit și selenocolină. La șoareci, precum și la om s-a raportat și prezența unor selenocarbohidrați. În cazul unui aport crescut de Se, în urină apare un alt compus cu seleniu, ionul (metil)3Se+, care poate reprezenta până la 50 % din seleniul excretat prin urină. Se consideră că cest ion apare în cantitate mare doar în cazul intoxicațiilor cu Se, însă studiile mai recente tind să infirme acest lucru (Reilly, 2006; Navarro-Alarcon et Cabrera-Vique, 2008).

A fost efectuat un studiu clinic pe 5 pacienți (4 bărbați și o femeie) cu afecțiuni maligne, neoperabile, pentru a determina speciile chimice ale Se prezente în urina acestora după administrarea unor doze mari de Se-Met. Timp de 7 zile, pacienților li s-au administrat 2 doze zilnice de 4000 µg Se-Met, continuându-se în următoarele 21 de zile cu 4000 µg, într-o singură doză. Probe de urină s-au recoltat înainte de începerea experimentului, în ziua a 7-a, precum și pe parcursul celorlalte 3 săptămâni, în funcție de pacient. Principalii compuși identificați în urină au fost 3 selenomonozaharide. Ionul (metil)3Se+ a fost prezent în urme înainte de începerea suplimentării cu Se-Met, cu excepția unui pacient, rămânând în aceleași proporții pe parcursul studiului. Cantitatea de selenozaharuri a crescut considerabil din prima zi după administrarea de Se-Met. S-a concluzionat că ionul (metil)3Se+ nu poate fi considerat un biomarker pentru intoxicațiile acute cu Se. S-a considerat că profilul chimic al urinii nu a fost influențat de chimioterapia antineoplazică. Totuși, nu a fost evaluată influența procesului malign asupra biotransformării seleniului (Kuehnelt et al, 2007).

Hawkes et al (2008) au demonstrat în studiul lor efectuat pe 54 de americani, împărțiți în 2 grupuri: unul placebo și unul căruia i s-au administrat suplimente cu drojdie îmbogățită cu Se, faptul că nivelul Se în urină, din momentul începerii studiului, crește rapid în primele săptămâni, pentru ca apoi să se ajungă la o concentrație „în platou”. După terminarea suplimentării, concentrația Se în urină scade relativ rapid, dar ajunge la valoarea de bază, cea dinaintea începerii studiului, într-o perioadă mai mare de timp față de cea necesară creșterii inițiale.

Un alt studiu efectuat în SUA pe 11 bărbați, timp de 120 de zile, a fost inițiat pentru a evalua cinetica Se provenit din alimente în organism. Voluntarii au avut, pe toată perioada experimentului, o alimentație bazată pe carne de vită și orez, la care s-au adăugat diferite suplimente nutritive. Timp de 21 de zile au primit o rație alimentară, bazată pe necesarul individual, ce conținea aproximativ 47 µg Se/zi. După această perioadă inițială, subiecții au fost împărțiți în 2 grupuri: un grup a primit aproximativ 14 µg/zi iar celălalt aprox. 297 µg/zi. În grupul cu alimentația bogată în Se, excreția urinară a început să crească cu ziua a 3-a de la schimbarea dietei (ziua a 24-a de la începutul studiului), crescând gradual până la sfârșit. În cazul grupului cu dieta săracă în Se, excreția urinară a început să scadă începând cu ziua a 18-a (ziua 39 de la începutul studiului), ajungându-se la un platou după aproximativ 70 de zile de la începutul studiului. ( Hawkes et al, 2003 )

III.5.2. Excreția fecală

Seleniul excretat în fecale constă în primul rând din seleniul neabsorbit din alimentație, plus seleniul provenit din secrețiile biliare, pancreatice și intestinale. Unii autori au presupus că secreția biliară și reabsorbția intestinală ar putea reprezenta un mecanism în plus, pe lânga reglarea excreției urinare, pentru conservarea rezervelor de seleniu din organism, însă ipoteza rămâne de confirmat.

Excreția prin fecale depinde deasemenea de compusul chimic cu Se ingerat, precum și de ceilalți factori implicați în excreția urinară. S-a constatat că excreția prin fecale este mult mai intensǎ atunci când compusul ingerat este selenitul sau selenatul, față de Se-Met (Navarro-Alarcon et Cabrera-Vique, 2008).

III.5.3. Excreția pulmonară

Excreția pulmonară, prin aerul expirat, precum și excreția prin transpirație sunt căi minore, atunci când aportul de seleniu este normal. Excreția pulmonară devine importantă în intoxicațiile cu seleniu. Compușii cu seleniu sunt biotransformați, în faza finală având loc procese de metilare, pentru a forma compuși volatili. Principalul metabolit este dimetilseleniura, volatilă, precum și alți compuși metilați. Aceștia dau mirosul de usturoi al respirației, în intoxicațiile cu Se (Dumont et al, 2006; Reilly, 2006).

III.5.4. Acumularea de Se în fanere

Încorporarea de Se în fanere este de mică importanță pentru rezervele de Se ale organismului. Părul și unghiile reflectă însă statusul acestui oligoelement pe termen relativ lung. Analiza unor mostre de păr sau de unghii reprezintă o metodă neinvazivă pentru determinări cantitative. Trebuie avut în vedere totuși că mostrele de păr nu reprezintă o probă care să dea rezultate valide întotdeauna, deoarece numeroase produse de îngrijire a părului conțin compuși cu Se. Concentrația medie de Se din părul europenilor variază în medie între 0,3-0,6 µg/g (Dumont et al, 2006).

Ȋn medie, unghiile de la mâini cresc cu 0,1 mm/zi, iar cele de la picioare cu 0,03-0,05 mm/zi. Prin calcul, s-a dedus că o unghie de la mână poate da informații despre statusul Se în organism pe o perioadă de până la 6 luni înainte de recoltarea probei, iar cele de la picioare pe o perioadă de 12-18 luni. Unghiile au în compoziție în special keratină (keratine – sunt peste 30 de proteine cu această denumire comună), dând informații și despre statusul altor elemente în organism – arsen, cadmiu, crom, etc. Există dificultăți totuși în stabilirea precisă a perioadei în care a avut loc o expunere crescută la Se, dacă expunerea a fost de scurtă durata. În unele cazuri, deși s-a început suplimentarea cu Se (care a avut loc pe o perioadă lungă de timp) iar nivelul plasmatic și urinar al acestuia au atins o concentrație maximă relativ repede, în unghii nivelul maxim a fost atins abia după 10-12 săptămâni. Alți factori care interferă cu acumularea normală a Se în unghii sunt unele afecțiuni ale unghiilor, precum micozele, dar și hiperpigmentarea unghiilor, datorită contactului cu diferite substanțe (Slotnick et Nriagu, 2006).

III.5.5. Excreția seleniului în laptele matern

Variațiile în concentrația Se în laptele matern sunt datorate în special fluctuațiilor în consumul zilnic. Creșterea concentrației în lapte poate fi determinată atât de compușii anorganici cu Se, cât și de cei organici. Compușii anorganici nu sunt prezenți în lapte. Nivelul Se în lapte, la femeile cu o dietă normală, variază între 13 și33 µg/l.

Glandele mamare reglează cantitatea compușilor cu Se produsă și excretată în lapte, constatându-se că la începutul lactației cantitatea produsă este mai mare. În lapte, Se apare în majoritate sub forma selenoaminoacizilor încorporați în proteine; doar o mica porțiune este prezentă în fracțiunea lipidică. Prevalența speciilor cu Se este următoarea: Se-Cys>Se(Cys)2>Se-Met. Se pare că nivelul Se în lapte nu este influențat foarte mult de cantitatea ingerată de câtre mamă, protejând astfel copilul de un aport excesiv de seleniu (Dumont et al, 2006).

III.6. Selenoproteinele la mamifere

În proteine, Se poate să apara în mai multe forme: Se-Met- în special în proteinele structurale și Se-Cys- în proteinele cu rol funcțional; poate să fie prezent, în unele enzime, și sub forma unui cofactor, implicat direct în biocataliză.

Selenoproteinele au fost identificate atunci când s-a urmărit prezența Se în proteine, în timpul izolării. Proteinele ce conțin Se pot fi marcate metabolic cu 75Se, pentru ca apoi sa fieseparate și identificate, însă această metodă se poate aplica mai ales pentru proteinele ce se găsesc într-o cantitate mai mare.

Progresele înregistrate în decodificarea genomului uman au înlesnit descoperirea de noi selenoproteine. În momentul de față se cunosc aproximativ 25 de selenoproteine. Genele ce codifică selenoproteine au 2 caracteristici: o secvență TGA, ce codifică Se-Cys și o secvență pentru inserția Se-Cys în lanțul polipeptidic (SISeCys). Aceste secvențe prezintă o înaltă specificitate pentru fiecare selenoproteină (Hatfield et al, 2006).

În ultimii ani s-au identificat numeroase selenoproteine noi, uneori dându-li-se denumiri diferite de către diferiții autori.

III.6.1. Glutation peroxidazele

La om există 8 izoenzime ale glutationperoxidazei (GPx), dintre care 5 sunt selenoproteine. Prima descoperită a fost GPx1. GPx5, GPx7 și GPx8 nu sunt selenoproteine. Glutation peroxidazele reduc, deci detoxifică diferiții peroxizi la alcoolii corespunzători, după reacția generală:

R-OOH + 2 GSH R-OH + H2O + GSSG

Aparent, toate izoenzimele prezintă același mecanism catalitic, ce implică existența unui situs activ cu o structură tipica, alcătuit din Se-Cys, triptofan și glutamină. Glutation peroxidazele joacă un rol foarte important în apărarea organismului împotriva stresului oxidativ.

III.6.1.1. Glutationperoxidaza 1 (GPx1 / cGPx –cytosolic GPx)

Glutationperoxidaza a fost descoperită în 1957, fiind o enzimă citosolică, tetramericǎ. Este prezentă în cantitate mare în ficat și în eritrocite, concentrațiile depinzând de statusul Se în organism. Totuși, cea mai mare cantitate de apă oxigenata produsă în eritrocit este neutralizată de catalază. Se pare că GPx 1 joacă un rol important doar atunci când organismul este supus unui stres oxidativ crescut. S-a constatat că unele virusuri integrate în genomul uman, latente, pot să devină virulente în absența activitații GPx. Unele polimorfisme ale GPx sunt asociate cu diferite afecțiuni, în special riscul de dezvoltare a cancerului și afecțiuni vasculare (Hatfield et al, 2006).

Un experiment efectuat pe 2 loturi de șoareci – unul cu o dietă săracă în Se timp de 6 săptămâni înainte, celălalt cu o dietă normală (grup de control) – a demonstrat influența statusului Se asupra activităților diferitelor izoenzime ale GPx. Celor 2 loturi li s-a administrat intraperitoneal 50 µg Se sub formă de selenat, iar după un anumit timp animalele au fost sacrificate. Activitatea GPx 1 a scăzut la 1% din cea corespunzătoare grupului de control, și a crescut la doar 2,8 % după administrarea de seleniu (Cockell et al, 1996).

Cheng et al (2003) au efectuat un studiu pe 2 loturi de șoareci (constând în 2 experimente), alcătuite din animale cu un genotip normal și în animale modificate genetic, al căror genom nu conține genele pentru sinteza sau/și reglarea activitții GPx1, demonstrând importanța GPx1 în protecția celulară hepatică. În primul experiment li s-a administrat unor grupuri de șoareci – cu genotip normal și GPx-deficienți, atât Se-deficienți cât și cu statusul Se normal, o doză de selenit cu 6 h înainte de injectarea intraperitonială de paraquat. În al 2-lea experiment li s-au administrat aceleași doze, și au fost omorâți la intervale diferite după administrarea de paraquat, pentru a evalua variația activității GPx1 în timp. S-a constatat că administrarea de Se a oferit protecție crescută la șoarecii Se-deficienți cu genotip normal față de cei Se-deficienți și GPx-deficienți.

III.6.1.2. Glutationperoxidaza 2 (GPx2 / GI-GPx – gastrointestinal GPx)

Glutationperoxidaza 2 este prezentă în ficat și în tractul digestiv, lipsind în inimă și rinichi. Este un tetramer, fiind prezentă în citosol. Are ca substraturi hidroperoxizi precum hidroperoxizii ac. linoleic și cei derivați de la izopropilbenzen (cumen); nu acceptă substraturi hidroperoxizii derivați de la fosfatidilcolină. GPx2 este “conservată” în condițiile aportului insuficient de Se (Hatfield et al, 2006).

III.6.1.3. Glutationperoxidaza 3 (GPx3),(pGPx)

Glutationperoxidaza 3 se găsește în spațiul extracelular, în plasmă și intestin, fiind un tetramer. Cantitativ, este a 2-a selenoproteină prezentă în plasmă, dupa Selenoproteina P. Funcțiile fiziologice nu sunt pe deplin elucidate. Expresia sa este indusă de hipoxie; deficiența sa se pare că este asociată cu bolile cardiovasculare și cancerul. GPx3 plasmatică se găsește în special în zona tubului contort proximal, fiind utilizată ca marker al integrității tubulare.

Jacobson et al (2006) au făcut o investigație clinică în Australia pe 170 de voluntari sănatoși, de vârste diferite și aparținând ambelor sexe, pentru a stabili activitatea GPx plasmatice în corelație cu nivelul Se. Activitatea GPx a fost măsurată prin metoda ELISA, bazată pe anticorpi monoclonali. Cantitatea medie de Se conținută în pGPx a fost de 18,5 µg/ml iar cantitatea totală medie de Se prezentă în plasmă a fost de 108,9 µg/l. S-a constatat că activitatea pGPx a fost mai mare la bărbați decât la femei, precum și la fumători față de nefumători. Nu s-au observat diferențe semnificative între marii consumatori de alcool față de cei care nu consumă cantități mari. La consumatorii de nuci de Brazilia s-au obținut valori mari ale Se plasmatic.

III.6.1.4. Glutationperoxidaza 4 (GPx4 / PH-GPx)

Glutationperoxidaza 4 este un monomer, cu 2 izoforme – mitocondrială și citoplasmatică. Are cea mai larga bandă de substraturi, acționând chiar și pe hidroperoxizii fosfolipidelor. Poate acționa chiar și asupra hidroperoxizilor integrați în membrane, acționând astfel ca un antioxidant universal, cu rol în protecția biomembranelor. În testicul, joacă un rol important pentru fertilitate și nu pentru acțiunea antioxidantă. Înlăturarea genelor pentru GPx4 este letală în stadiul embrionar. În cazurile heterozigote, organismul este predispus la stresul oxidativ (Hatfield et al, 2006).

III.6.1.5. Glutationperoxidaza 5 (GPx5)

Nu conține Se, deci nu este o selenoproteină. Are un nivel de expresie scăzut, fiind prezenta în spermă; funcțiile sale nu sunt pe deplin elucidate (Hatfield et al, 2006).

III.6.1.6. Glutationperoxidaza 6 (GPx6)

S-a constata prezența ei doar la nivelul epitelilului olfactiv și în țesuturile embrionare. Forma omologă de la șobolan se pare că are rol în perceperea senzațiilor olfactive (Hatfield et al, 2006).

III.6.1.7. Glutationperoxidaza 7 (GPx7)

Nu este o selenoproteină. Se pare că are rol în protecția celulară, în timpul procesului malign (Hatfield et al, 2006).

III.6.1.8. Glutationperoxidaza 8 (GPx8)

Nu este o selenoproteină, fiind un tetramer. Este recent descoperită, funcțiile specifice și localizarea nefiind stabilite cu exactitate (Hatfield et al, 2006).

III.6.2. Deiodurazele (deiodinazele) hormonilor tiroidieni

La mamifere există 3 deioduraze (DI1,DI2,DI3), care activează sau inactivează hormonii tiroidieni prin dehalogenare reductivă. Funcția metabolică generală a hormonilor tiroidieni este cea de a controla metabolismul oxidativ. Sub acțiunea hormonilor tiroidieni, crește viteza metabolismului bazal, se diminuează rezervele energetice lipidice sau glucidice, catabolismul proteic este intensificat. Hormonii tiroidieni acționeaza pe receptori nucleari, înlesnind expresia unor gene. Se admite că doar T4(tiroxina) și T3 (triiodotironina) prezintă acțiune biologică, pe receptori. Glanda tiroidă are cea mai mare cantitate de Se și iod raportată la gram. Cele 3 deioduraze nu diferă doar d.p.d.v. structural, dar catalizează și reacții diferite.

III.6.2.1. Deioduraza 1 (DI 1)

Deioduraza 1 este o selenoenzimă dimerică. S-a raportat existența a cel puțin 2 izoforme anormale, cu incidență clinica. Este încorporată în membrana celulară, catalizând deiodurarea din poziția 5’; în anumite circumstanțe, poate cataliza și deiodurarea din poziția 5. DI 1 transformă T4 (tiroxina) în T3 (triiodotironina), hormonul tiroidian majoritar. DI 1 se găsește în cantități mari în ficat, rinichi, tiroidă și glanda pituitară. Conversia T4 la T3 are loc aproape exclusiv în afara tiroidei. Activitatea DI 1 este reglată prin mecanisme diverse de nivelul T3 și T4 din sânge, ingestia unor cantități mari de carbohidrați, etc (Hatfield et al, 2006).

III.6.2.2. Deioduraza 2 (DI 2)

Deioduraza 2 este o selenoenzimă integrată în membranele reticulului endoplasmatic, transformând T4 în T3. Este prezentă în SNC, tiroidă, miocard, placentă, mușchii scheletici și în țesutul adipos. Expresia sa este reglată de catecolamine. Prezența ei în creier este necesară, furnizând T3, deoarece T3 trece foarte puțin de bariera hematoencefalică. Spre deosebire de DI 1, expresia DI 2 este încetinită de creșterea concentrației T4. Are o durată de viață scurtă. Supresia exprimării enzimei la șoareci nu a avut urmări foarte grave, manifestându-se prin pierderi de auz și încetiniri în procesul de creștere (Hatfield et al, 2006).

Hoppe et al (2008) au făcut un experiment constând în administrarea de compuși ai 75Se la șobolani urmând ca după câteva zile animalele să fie sacrificate, pentru a recolta diverse linii celulare. S-au separat și identificat diversele selenoproteine prezente în fiecare linie celulară și în diferitele regiuni ale creierului, prin gel-electroforeză. Masele DI 1 și DI 2 sunt foarte apropiate, rezoluția metodei folosite nepermițând o separare foarte precisă. S-a identificat DI 2 în homogenatul obținut din lobul temporal al encefalului. În celulele gliale și în astrocite nu s-a identificat prezența DI 2, confirmându-se prezența în liniile de celule neuronale și endoteliale.

III.6.2.3. Deioduraza 3 (DI 3)

Deioduraza 3 a fost descoperită în 1995. Acționează la nivelul atomului de iod din poziția 5. Derivații de tironină rezultați nu pot interacționa cu receptorul nuclear al T3, neavând deci acțiune de hormon. Se pare că rolul principal al DI 3 este inactivarea T4 și T3. Exprimarea DI 3 este indusă de concentrația crescută de T 4.

III.6.3. Tioredoxinreductazele

Tioredoxinreductazele sunt implicate în biosinteza dezoxiribonucleotidelor. Ele reduc tioredoxina oxidată, cu legătură disulfurică, la forma ditiolică, consumând NADPH. Tioredoxina redusă este reoxidată pentru a furniza echivalenți reducători ribonucleotid reductazei. Filogenetic, au evoluat 2 clase mari de tioredoxin reductaze: o clasă cu masă mică

(~35 kD), prezentă la procariote și fungi și o clasă cu masă moleculară mare (~55 kD), prezentă la eucariotele superioare. Mamiferele au 3 izoenzime, toate fiind selenoenzime, deci biosinteza dezoxiribonucleotidelor din ribonucleotide este dependentă de Se. Aceste enzime au totuși o bandă largă de substraturi, nu doar ribonucleotide.

III.6.3.1. Tioredoxinreductaza 1 (TrxR1)

Tioredoxinreductaza 1 este o enzimă citoplasmatică, implicată în multe procese redox la nivel celular. S-a constatat că dacă enzima nu conține Se-Cys sau acest rest este blocat cu un agent chimioterapic, este capabilă să inducă apoptoză. Această izoenzimă prezintă la rândul ei 6 izoforme. Hridina et al (2009) au demonstrat în studiul lor că statusul Se în organismul șoarecilor influențează activitatea TrxR1 și al TrxR2.

În starea sa naturală, enzima este un dimer, atât la om cât și la alte specii. Se pot utiliza diferite tehnici de inginerie genetică pentru a obține TrxR1 recombinată cu ajutorul E. Coli , însă activitatea sa este inferioară celei extrase direct din organismul animal. S-a efectuat un experiment constând în obținerea TrxR1 recombinate de la șoarece, urmată de prelucrarea enzimei și determinarea activității sale. S-a demonstrat că prin prelucrare, enzima are activitate mai mare decât cea naturală, deasemenea fiind vorba despre un tetramer, spre deosebire de cea naturală, care este un dimer. Este posibil ca formele tetramerice să coexiste și în organismul viu, putând fi vorba de un mecanism de autoreglare a activității enzimei (Rengby et al, 2009).

III.6.3.2. Tioredoxinreductaza 2 (TrxR2)

Tioredoxinreductaza 2 se găsește în mitocondrii, atingând un nivel crescut în prostată, testicule, ficat, uter și intestinul subțire și un nivel mai scăzut în creier, mușchii scheletici, inimă și splină. S-au identificat 2 izoforme ale acestei enzime. Supresia expresiei aceste enzime la șoareci a dus la moarte în stadiul embrionar, cu semne de anemie severă, apoptoză la nivelul ficatului și malformații cardiace (Hatfield et al, 2006).

III.6.3.3. Tioredoxinreductaza 3 (TrxR3, Tioredoxin glutation reductaza)

Tioredoxinreductaza 3 este o enzimă prezentă la nivelul mitocondriilor, specifică pentru testicule. Funcțiile sale specifice sunt probabil acelea de a reduce tioredoxina și glutaredoxina 2. Este implicată în biocataliza mai multor reacții, atât cele specifice pentru sistemul tioredoxinreductazelor, cât și unele reacții aparținând sistemului glutationperoxidazelor.

Ge et al (2009) au reușit să obțină prin metode de inginerie genetică o variantă a TrxR3 ( TGR) de la șoarece modificată, care catalizează aceeași reacție precum GPx și prezintă o activitate comparabilă d.p.d.v. al ordinului de mărime. Modificarea a constat în înlocuirea unui rest de Cys cu Se-Cys din domeniul Grx al enzimei. Biosinteza enzimei a avut loc in vitro, în culturi de celule.

III.6.4. Selenoproteina de 15 kD (Sep15)

Sep15 are masa aproximativă de 15 kD, găsindu-se în special în prostată, testicule, creier, rinichi și ficat, deși cantități mici au fost detectate și în alte compartimente ale organismului. Se găsește în RE, formând un complex cu UDP-glucoza: glicoprotein glucoziltransferaza 1. Se pare că Sep15 are rol în „controlul calității” proteinelor biosintetizate în RE, nepermițând ieșirea din RE a proteinelor incomplet structurate. S-a observat existența a 2 izoforme anormale din această categorie, asociate cu incidența cancerului.

S-au adus numeroase argumente privind implicarea Sep15 în cancer. Gena pentru Sep15 se află situată la om pe cromozomul 1, poziția p31 (după Hatfield DL et al, 2006), un locus ce suferă frecvent mutații sau deleții în cancerele umane, cu implicații în supresia cancerului. S-a constatat că expresia Sep 15 nu este influențată atât de mult de statusul Se în organism, comparativ cu GPx sau TrxT.

III.6.5. Selenofosfat sintetaza 2 (SPS2)

Selenofosfat sintetaza 2 este o selenoenzimă, spre deosebire de SPS1. Catalizează reacția de formare a monoselenofosfatului: HSe- + ATP + H2O HSePO3-2 + HPO4 + AMP. Donorul de Se in vivo nu este totuși identificat încă. S-a ajuns la ipoteza că SPS1 și SPS2 servesc unor scopuri diferite, dar complementare: Se de proveniență anorganică, transformat în seleniura, este încorporat în monoselenofosfat via SPS2. Se-Cys liberă provenită din selenoproteine în timpul proteolizei este „reciclată” de SPS1. Se pare că SPS2, datorită restului de Se-cys din structura sa, este implicată în reglarea propriei sale biosinteze (Hatfield et al, 2006).

III.6.6. Metionin-R-sulfoxid- reductaza 1 (MsrB1 / Selenoproteina R / Selenoproteina X )

Resturile de Met din proteine pot fi oxidate la o serie de sulfoxizi ai Met. La majoritatea organismelor acești sulfoxizi pot fi reduși stereospecific înapoi la Met de către 2 clase de enzime: metionin-S-sulfoxid reductaza (MsrA) și metionin-R-sulfoxid reductaza (MsrB). Reducerea sulfoxizilor are o deosebită importanță pentru protecția celulară față de stresul oxidativ și implicit pentru întârzierea fenomenului de moarte celulară. La mamifere există 3 izoenzime ale MsrB, dintre care doar MsrB1 este o selenoenzimă, celelalte 2 având Cys în loc de Se-Cys și găsindu-se în mitocondrii sau/și reticulul endoplasmatic. MsrB1 se găsește în citosol sau nucleu și are activitatea cea mai mare. S-a constatat că izoenzimele MsrB au în componență Se (sunt selenoenzime) doar la vertebrate, acest lucru putând fi privit ca un proces evolutiv, seleniul conferind avantaje pentru biocataliza reacțiilor (Hatfield et al, 2006).

III.6.7. Selenoproteina P (SelP)

Selenoproteina P este singurul reprezentant care are mai multe resturi de Se-Cys. SelP umană are 10 resturi de Se-Cys; formele prezente la alte specii pot să aibă mai puține resturi de SelP. Este forma majoră prezentă în plasmă, fiind sintetizată în ficat și transportă Se la alte organe și țesuturi. Este posibil ca, tocmai datorită rolului său fiziologic presupus – de transportator al Se, să conțină 10 resturi de Se-Cys. S-a constatat că în creier sunt sintetizate cantități de SelP, în mod independent. Din punct de vedere stuctural, este o glicoselenoproteină. Totuși ipoteza conform căreia SelP ar fi o proteină de transport se pare că este infirmată, datorită faptului că Se este legat covalent, iar expresia proteinei este aproape ubiquitară. SelP are capacitatea de a se lega de heparină și de membranele celulare. S-a stabilit că SelP se leagă de biomembrane în următoarea ordine: creier>rinichi>testicule>ficat. Unele studii sugerează că SelP prezintă și acțiune antioxidantă.

Nivelul SelP în plasmă este influențat de o serie de factori, precum fumatul, vârsta, sexul, aria geografică, etc. Vârsta și sexul au influența cea mai mică asupra nivelului plasmatic.

S-au făcut studii cu privire la legarea SelP de heparină, s-a sugerat că există interacțiuni de natură electrostatică care facilitează legarea SelP de proteoglicanii din endoteliul vascular. Aceasta ar putea contribui la o protecție extracelulară în țesuturi împotriva oxidanților precum peroxinitritul sau hidroperoxizii (Moschos MP, 2000).

S-a încercat să se stabilească o corelație între nivelul plasmatic al Se și nivelul SelP, în cele mai multe cazuri relația de liniaritate respectându-se, cu abateri mici. La indivizii provenind din zone în care nivelul Se în sol este mic, abaterile de la relația de proporționalitate sunt mai mici; același lucru s-a observat și la voluntarii ce prezintă boli intestinale, ducând la malabsorbția Se.

Scharpf et al (2007) au făcut un studiu pentru a evalua capacitatea unor linii celulare de a sintetiza SelP. S-au recoltat diferite tipuri de celule, atât de la oameni decedați, din diferite regiuni ale creierului, cât și de la șoareci și maimuță – celule hepatice, renale, precum și unele tipuri celulare maligne. Celulele au fost cultivate in vitro, pe medii de cultură conținând sau nu selenit (marcat cu 75Se). Detecția SelP cât și a ARNm pentru SelP, după incubarea liniilor celulare, a fost făcută prin metode imunochimice. Prezența ARNm pentru SelP a fost detectată în aproape toate liniile celulare luate în calcul, cu excepția unor linii celulare renale de la maimuță și a unor linii celulare maligne. Biosinteza de SelP are loc în aproape toate zonele creierului uman, atingând un maxim în canalul ependimal.

III.6.8. Selenoproteina W (SelW)

Este cea mai mică selenoproteină prezentă la mamifere (~9,5 kD), fiind descoperită în 1993. Inițial a fost identificată la șobolan, în mușchi, pentru ca apoi să se constate prezența ei în majoritatea celorlalte țesuturi. În ficat, tiroidă, pancreas, ochi și glanda pituitară există în cantități foarte mici. Este prezentă în citosol, dar cantități mici sunt asociate și cu membranele.

S-au identificat 4 izoforme ale SelW, ulterior constatându-se că acest fapt se datorează asocierii cu unii compuși cu masă mică, glutationul în special. Această descoperire ar sugera că SelW are avea o funcție în metabolismul redox. Nivelul SelW în țesuturi depinde de aportul de Se, dar cinetica nu este aceeași ca în cazul GPx (Hatfield et al, 2006).

Expresia redusă a SelW este asociată cu aportul scăzut de Se, manifestându-se prin apariția unei miopatii –„Boala mușchilor albi”, ce se manifestă prin calcifierea mușchilor scheletici și a miocardului. Mecanismele prin care se produce această calcifiere rămân necunoscute (Whanger, 2000).

Au fost efectuate studii in vitro, pe mioblaste L8 de la șobolan, pentru a evidenția biosinteza și expresia SelW. Nu s-au observat inițial diferențe în cantitatea de ARNm pentru SelP prezentă în celulele din mediul de cultură, în timpul perioadei de diferențiere față de perioada de proliferare. Mai departe, celulele diferențiate au fost incubate în medii cu adaos de Se sau sărace în Se. În mediile cu adaos de Se s-a observat o creștere a nivelului de ARNm pentru SelW, în timp ce nivelul ARNm – SelW din celulele cultivate în medii sărace în Se a rămas constant pentru o perioadă, pentru ca apoi să scadă progresiv (Gu et al, 2002).

III.6.9. Selenoproteina N (Sel N)

Selenoproteina N a fost descoperită prin metode bioinformatice. Prezintă 2 izoforme, ambele prezente în mușchii scheletici, creier, plămân și placentă; izoforma 2 este întotdeauna mai abundentă. Funcțiile specifice ale acestei selenoproteine nu sunt încă pe deplin elucidate. Mutațiile interesând gena pentru SelN sunt asociate cu diferite miopatii.

SelN are o masă de aproximativ 65 kD, fiind o glicoselenoproteină transmembranară, situată la nivelul reticulului endoplasmatic. Acest organit celular joacă un rol fundamental pentru metabolismul celular – depozitarea calciului, biosinteza de proteine funcționale și structurale, etc. Nu se cunoaște încă în care dintre aceste funcții este implicată SelN.

S-a constatat ca aceeași mutație produsă la nivelul genei pentru SelN se poate manifesta clinic sub forma unor miopatii cu simptomatologie diferită, apariția simptomelor fiind influențată de prezența altor factori genetici sau ținând de mediu (Hatfield et al, 2006).

Okamoto Y et al (2005) au depistat existența a 2 mutații ale genei pentru izoforma 1 a SelN la un număr de pacienți japonezi corelate cu manifestarea „sindromului coloanei vertebrale rigide și distrofia musculară tip 1 „. S-a presupus că, în cazul existenței unor mutații constând în înlocuirea unor nucleotide cu altele, ARNm-ul pentru SelN rezultat în urma transcripției este mai stabil la degradarea indusă de prezența unor secvențe non-sens în structura sa. În cazul acestor pacienți s-a constatat că traducerea mesajului genetic are loc, biosintetizându-se SelN trunchiată, confirmându-se prezența unor fragmente din SelN izof. 1.

III.6.10. Selenoproteina S (SelS)

Selenoproteina S este o selenoproteină transmembranară, situata la nivelul RE. Analizele structurale au indicat faptul că formează un singur helix transmembranar, având multiple situsuri pentru fosforilare sau glicozilare, pentru modularea covalentă a activității sale. Se pare că expresia sa este ubiquitară, fiind corelată cu nivelul plasmatic al glucozei. Unele studii au demonstrat importanța sa pentru metabolismul glucidic, făcându-se o posibilă corelație între anomaliile genetice referitoare la expresia acestei proteine și incidența diabetului de tip II și a intoleranței la glucoză. Studiile mai recente au sugerat implicarea SelS în transportul proteinelor cu defecte structurale biosintetizate în RE înspre citosol, unde sunt degradate nespecific.

Transcripția genei pentru SelS este indusă de stress și unele citokine proinflamatoare. La om, gena pentru SelS se află în cromozomul 15. Variațiile în structura genei sau a locusului acesteia sunt asociate cu modificarea nivelurilor circulante ale IL-1β, IL-6 și factorul TNF-α (Hatfield et al, 2006).

Un studiu clinic efectuat în Finlanda pe 2 grupuri de persoane cu antecedente de boli cardio-vasculare a arătat corelația dintre variațiile genetice interesând expresia SelS și incidența bolilor cardio-vasculare. Voluntarilor li s-a facut anamneza în legatură cu manifestările clinice anterioare ale bolilor de care erau suferinzi și li s-au luat probe biologice pentru a investiga parametrii biochimici (HDL-Col, proteina C-reactivă, IL-6, TNF-α ). De asemenea, li s-a determinat și genotipul. Făcând corelații între structura și poziționarea genelor, pe de o parte, și incidența unor boli, s-a stabilit existența câtorva genotipuri predispuse la infarct de miocard și angină pectorală instabilă. Diferențele interindividuale cu privire la structura genomică – cu referire doar la gena interesată – au constat în variații ușoare ale locusului genei pe cromozomul 15 și în variații mici în structura genei (Alanne et al, 2007).

III.6.11. Alte selenoproteine

Selenoproteina H. Este o globulină, gena ce o codifică fiind localizată pe cromozomul 11 la om. Este prezentă în multe țesuturi; este posibil să fie implicată în unele reacții redox (Hatfield et al, 2006).

Selenoproteina I. Este o proteină integrată în totalitate în membrane, fiind prezentă în multe țesuturi. Funcțiile sale specifice nu sunt încă elucidate (Hatfield et al, 2006).

Selenoproteina K. Este o proteină membranară, cu o structură neobișnuită pentru mamifere, în sensul că nu are o structură secundară foarte complexă. Formează un singur helix transmembranar, dar funcțiile sale sunt necunoscute (Hatfield et al, 2006).

Selenoproteina O. Are o largă răspândire, având omologi atât la animale, fungi, procariote, cât și la plante. Doar formele prezente la vertebrate conțin Se-Cys, la celelalte organisme Se-Cys fiind înlocuită cu Cys. Funcțiile sale sunt necunoscute (Hatfield et al, 2006).

Selenoproteina M. Prezintă o oarecare similaritate structurală cu Selenoproteina de 15 kD. Este sintetizată în multe țesuturi, cu nivelurile cele mai mari în creier, iar cele mai mici în ficat și splină. La nivel celular, se găsește în RE. Se presupune că ar avea rol în desfășurarea unor reacții redox.

Hwang et al (2005) au efectuat experimente pe animale transgenice purtând gena umană pentru preselenina 2 (implicată în boala Alzheimer) pentru a stabili influența prezenței acesteia asupra expresiei altor gene, precum și corelația dintre SelM și boala Alzheimer. S-a constatat, printre altele, că prezența genei mutante pentru preselenina 2 (hPS2m) are un efect supresiv asupra expresiei genei pentru SelM (hSelM), având ca rezultat biosinteza unor cantitți foarte mici de SelM. În plus, s-a constatat că SelM biosintetizată la aceste animale are o structură ușor diferită față de SelM normală.

Selenoproteina T. Este o proteină mică cu posibile funcții redox (Hatfield et al, 2006).

Selenoproteina V. Are o similaritate structurală cu SelW, fiind prezentă doar în testicule. Se presupune că ar avea funcții redox (Hatfield et al, 2006).

III.7. Reglarea biosintezei selenoproteinelor

Principalul factor care reglează expresia selenoproteinelor este statusul Se în organism. Deficiența organismului în Se are drept consecință o scădere generală a biosintezei de selenoproteine, deși neuniformă. Acest proces de reglare este bine controlat, existând anumite priorități pentru Se disponibil. Există o ierarhie privind expresia diferitelor selenoproteine și retenția Se în diferite organe, în funcție de Se disponibil. De exemplu, în condiții de carență severă, expresia GPx1 poate scădea până la 99 %, pe când expresia GPx4 nu scade mai mult de 75 %.

Schimbările în rata biosintezei selenoproteinelor sunt însoțite de modificări ale cantităților de ARNm corespunzătoare; aceste modificări nu sunt întotdeauna corelate cu activitatea selenoenzimelor respective, ceea ce sugerează un mecanism de adaptare la deficiența de Se.

Alte mecanisme de adaptare la deficiența de Se sunt modificarea turn-over-ului selenoproteinelor și modificarea stabilității ARNm-urilor pentru diferitele selenoproteine.

Reglarea biosintezei selenoproteinelor și stabilirea unei ierarhii de priorități privind utilizarea Se disponibil este influențată de diferențele în structura regiunii netraductibile (3’UTR) din ARNm-urile fiecarei selenoproteine. În regiunea 3’UTR este inclusă și Se-CysIS, comună pentru toate eucariotele (cu diferențe minore), însă restul de secvențe conținute în 3’UTR diferă între ARNm-urile specifice pentru diferitele selenoproteine. Diferențele din structura 3’UTR se pare că sunt responsabile pentru ratele diferite de traducere și pentru stabilitatea diferită a ARNm-urilor.

După cum s-a menționat, ARNt[Ser]Se-Cys, prezintă 2 izoforme, una metilată în poziția 34, cealaltă nu. Forma metilată se pare că este implicată în biosinteza selenoenzimelor inductibile în caz de stress oxidativ crescut. Alte teorii susțin că doar forma metilată este activă. Metilarea în poziția 34 ar putea fi deci un alt factor reglator al biozintezei selenoproteinelor.

Polimorfismele constând în înlocuirea unei singure baze (eng. Single nucleotide polymorphisms – SNP ) reprezintă o altă modalitate de control a biosintezei selenoproteinelor. SNP-urile constau în înlocuirea unui singur nucleotid din genom cu un altul. SNP-urile reprezinta aproximativ 90% din alterările pe care le suferă genomul, apărând odată la fiecare 100-300 de baze. Din 3 SNP-uri, 2 constau în înlocuirea citozinei (C) cu timina (T). Multe dintre modificări nu au nici o consecință asupra metabolismului, dar unele se pare că au un rol important în modificarea funcțiilor celulare (Hatfield et al, 2006).

Se presupune că SNP-urile pot fi responsabile de diferențele interindividuale prin care organismul folosește Se din alimentație pentru biosinteza de selenoproteine. Aceste diferențe interindividuale constau atât în variații privind biodisponibilitatea cât și în ierarhii de prioritate diferite privind utilizarea Se disponibil în organism.

Hadley et Sunde (2001) au ȋntreprins un studiu pe șobolani masculi pentru a evalua variația expresiei unor selenoenzime în funcție de cantitatea de Se din organism. În primul experiment, unui grup de șobolani i s-a administrat o dietă bazală conținând 0,008 µg Se/g iar celuilat 0,2 μ Se/g, sub formă de selnit de Na. În al doilea experiment șobolanilor li s-a administrat o doză de Se ce a crescut gradual, de la 0,02 la 0,3 µg Se/g. După terminarea perioadei de 28 de zile, cât a durat regimul la care au fost supuși șobolanii, aceștia au fost sacrificați, recoltându-se ficatul. La șobolanii cu o dietă deficitară în Se, activitatea GPx1 hepatice a fost de 2 %, cea a GPx4 de 43 % iar cea a TRR de 16 % comparativ cu cei care au beneficiat de un aport normal de Se. ARNm-ul pentru GPx1 a scăzut, d.p.d.v. cantitativ la 20 % față de lotul martor; ARNm-ul pentru GPx4 a scăzut nesemnificativ, la 81 % , cel pentru SelP nu a înregistrat variații semnificative, iar pentru TRR s-a înregistrat o scădere la 65 % față de lotul martor. În cel de-al doilea experiment s-a constatat că activitatea GPx1 plasmatice a crescut liniar odată cu creșterea cantității de Se administrată, atingând un platou pentru valori de 0,075-0,1 μg/g. Activitatea GPx1 hepatice a crescut deasemenea liniar, însă a ajuns la un platou pentru un aport de Se de 1 µg Se/g. Activitatea GPx4 hepatice a crescut liniar, atingând un platou la aproximativ 0,05 μg Se/g administrate. Curba activității TRR în funcție de cantitatea de Se administrată a prezentat abateri de la relația de liniaritate, având un aspect ușor sigmoidal; pentru TRR s-a observat un punct de inflexiune clar pentru o rație de 0,07 µg/g, lucru foarte important, arătând că activitatea optimă a enzimei se poate realiza și în condițiile unui aport relativ scăzut de Se. Pentru ARNm-urile hepatice corespunzând selenoenzimelor menționate s-au observat variații asemănătoare cu cele pentru activitățile enzimatice, variind totuși rațiile de Se la care se ajunge la concentrații în platou. Deficitul de Se nu a avut niciun efect asupra procesului de creștere.

Gan et al (2002) au derulat un studiu similar cu precedentul pentru a evidenția influența suplimentării excesive cu Se a șobolanilor masculi maturi asupra activității unor selenoenzime. Animalele au fost împărțite pe grupuri; unui gup i s-au administrat 20 μg Se/kg intraperitoneal iar celorlate două 40, respectiv 80 μg Se/kg, sub formă de selenit de Na, timp de 15 zile. Grupului martor i s-a administrat ser fiziologic. După această perioadă animalele au fost sacrificate, recoltându-se organele. S-a măsurat concentrația Se în rinichi, ficat și testicule pentru cele 3 grupuri plus grupul de control, constatându-se existența unei relații de directă proporționalitate între cantitatea administrată și concentrația în organe. Concentrația cea mai mare s-a observat în rinichi. Activitatea GPx1 și nivelul ARNm pt. GPx1 din ficat și testicule nu au crescut liniar odată cu creșterea dozei de Se administrată. Pentru grupul căruia i s-a administrat 20 µg/kg s-a constatat o creștere semnificativă față de grupul de control, însă pentru grupurile cu 40 μg/kg și 80 µg/kg s-a constatat o scădere progresivă a celor 2 parametri. În rinichi însă nu s-au observat diferențe semnificative privind activitatea GPx1 și nivelul ARNm-GPx1 între grupul de control și celelalte 3 grupuri. Activitatea TRR și nivelul ARNm-TRR din ficat și rinichi nu au variat semnificativ la grupul căruia îi corespunde doza de 20 μg/kg față de grupul martor, însă pentru grupurile cărora le corespund 40 µg/kg și 80 μg/kg s-a observat o scădere semnificativă. Activitatea TRR în testicule nu a variat semnificativ între cele 4 grupuri. Datele au demonstrat în acest caz că nivelul Se influențează atât transcrierea cât și traducerea (translația).

Gu et al (2002) au realizat un studiu in vitro pe mioblaști L8 de la șobolani și au demonstrat influența statusului Se asupra expresiei SelW, după cum s-a menționat anterior. S-a constatat prezența SelW atât în celulele diferențiate cât și în cele nediferențiate. Pentru celulele în curs de diferențiere s-a constatat o scădere a nivelului ARNm-SelW pentru celulele cultivate în mediu deficient în Se, față de cele cultivate într-un mediu cu o concentrație optimă de Se. La concentrații de Se în mediu din ce în ce mai crescute nu s-a observat o creștere semnificativă a cantității totale de ARNm-SelW, sugerând că transcrierea genei pentru SelW este independentă de statusul Se în organism. Transcrierea a fost blocată prin introducerea în mediu a unui agent chimic, constatându-se că există diferențe între durata de viață a ARNm-urilor din celulele cultivate în medii având concentrații diferite în Se, în cazul celor cultivate în medii mai bogate în Se constatându-se o durată de viață mai mare. Datele au sugerat că Se are rol în stabilizarea ARNm-ului pentru SelW dar nu influențează în nici un fel transcrierea.

Venardos et al (2004) au studiat efectul suplimentării cu Se asupra expresiei unor selenoenzime în inima de la șobolan, în condiții de post-ischemie. Șobolanii au fost împărțiți în 4 grupuri, în funcție de dietă: un grup de control, cu o rație de Se considerată normală, un grup cu o dietă fără Se și 2 grupuri cu o dietă conținând Se sub formă de selenit de Na corespunzând la 50 µg Se/kg, respectiv 1000 μg/kg. După perioada de 5 săptămâni, cât a durat regimul, animalele au fost sacrificate și s-au recoltat inimile, acestea fiind aduse imediat în condiții de ischemie. S-a determinat prin PCR (reacție polimerazică în lanț) cantitatea de ARNm corespunzând GPx1, GPx4, TrxR1, TrxR2, Gsr (glutation reductaza), atât pre- cât și post-ischemie. Cantitatea de ARNm pentru GPx1 a crescut proporțional cu doza de Se, fiind de aprox. 50 % la grupul cu dietă fără Se față de grupul martor și de 200 % la grupul cu doza de 1000 µg/kg. ARNm-GPx4, TrxR1 și TrxR2 au variat similar. ARNm-Gsr nu a fost influențat de cantitatea de Se administrată.

CAPITOLUL IV

TOXICOLOGIA SELENIULUI

Încă de la descoperirea sa de către Berzelius, seleniul a fost considerat drept un element toxic. De-abia în ultimele decenii s-a descoperit importanța sa pentru procesele fiziologice. D.p.d.v. al clasificării toxicologice, seleniul este încadrat la toxici minerali. În funcție de doză, timp de expunere, forma chimică implicată, intoxicația cu Se se poate manifesta sub o multitudine de efecte asupra organismului și simptome clinice.

IV.1. Toxicodinamia compușilor seleniului

Mecanismele toxicodinamice prin care seleniul își manifestă toxicitatea nu sunt pe deplin cunoscute. Se consideră că mecanismul diferă de la un compus al Se la altul. Seleniul, pătruns în organism în cantitate mare pe cale digestivǎ, va înlocui sulful din unii compuși endogeni importanți pentru funcționarea organismului. În cazul ingestiei pe termen lung, o posibilă explicație pentru apariția simptomelor ar fi înlocuirea Met din proteine cu Se-Met. Se-Met este încorporată nespecific în proteine; înlocuirea unor resturi de Met cu Se-Met va avea consecințe negative asupra funcționalității acelei proteine, mai ales dacă este vorba despre o enzimă și restul de Met înlocuit face parte din situsul activ sau dintr-un domeniu reglator. Deformarea unghiilor și părului, după expunerea pe termen lung la cantități mari de Se s-ar explica prin același mecanism, keratinele conținând cantități mari de Met și alți compuși cu S (Reilly, 2006).

Se pare că principalul mecanism toxicodinamic este formarea de specii reactive ale oxigenului în țesuturi, atunci când Se este prezent în concentrații mari. S-a constatat că selenitul, în cantități mari, formează anionul superoxid (O2-) după ce reacționează cu glutationul. Anionul superoxid poate reacționa cu oxigenul, producând alte specii reactive ale oxigenului, precum H2O2, HO·, HO-, ONOO- și NO2· (Figura 4.1). În plus, aceste reacții duc la depleția GSH. Anionul superoxid poate reacționa și cu Fe+3 din feritină, formând radicali și anioni hidroxil, prin Reacția Fenton. S-a raportat că și alte specii ale Se, precum Se-Cys, difenil-diseleniura, reacționează cu GSH in vitro, formând anionul superoxid. Atunci când capacitatea de apărare antioxidantă a organismului este depășită, selenitul și alți compuși ai Se acumulați în țesuturi manifestă acțiune oxidantă.

Există și alte mecanisme toxicodinamice, în adiție la generarea de ROS. Grupările tiol situate în sau lângă situsul activ sau alte domenii reglatoare ale unor enzime pot reacționa cu compușii Se, activitățile proteinelor/enzimelor implicate fiind disturbate. Se reacționează cu aceste grupări, formând legături de tipul -S-Se-S- sau aducți de tipul -S-Se. Capacitatea de legare la ADN a unor factori de transcriere, precum NF-kB și AP-1 poate fi perturbată. Alte proteine a căror funcționare s-a constatat a fi perturbată de interacțiunea Se cu grupările tiol sunt: Na+/K+ ATP-aza, receptorul pentru glucocorticoizi, lipoxigenaza, glicerol-3-fosfat dehidrogenaza, protein kinaza C. Unele dintre aceste proteine, precum NF-kB, AP-1, protein kinaza C au un rol important în comunicarea (semnalizarea) intercelulară. Perturbarea proceslui de comunicare (semnalizare) intercelulară de către Se poate duce la disfuncționalități privind procesul de apoptoză controlată al celulelor (Hatfield et al, 2006; Reilly, 2006).

Nu se cunoaște nici un antidot specific pentru intoxicațiile cu compuși ai seleniului, tratamentul în aceste cazuri fiind simptomatic: în caz de intoxicație acută prin ingerare se practicǎ lavaj gastric, administrarea de protectoare hepatice, vitamina C, diuretice, monitorizarea funcției cardiace și renale; este contraindicată administrarea de dimercaptopropanol (DMP).

Fig. 4.1. Generarea de specii reactive ale oxigenului (ROS) prin reacția

selenitului cu GSH (după Hatfield et al, 2006)

IV.2. Toxicitatea acutǎ a seleniului

De-a lungul timpului au fost descrise mai multe cazuri de toxicitate acută datorită ingestiei de alimente provenind din regiuni selenifere sau datorită ingestiei accidentale sau voluntare de suplimente nutritive cu seleniusau produse pentru curățirea puștilor.

Simptomele sunt diverse, putând include tulburări digestive (diaree) și semne neurologice (convulsii, comă). În timpul expunerii profesionale la Se și compușii săi, intoxicațiile pot avea loc ca urmare a unei inhalații masive de gaze, chiar de vapori sau de praf sau a unei depuneri pe piele. În acest caz principalele simptome descrise sunt iritația cutanată, oculară sau respiratorie, de intensități variabile, în funcție de produse, pigmentarea în roz a epidermei, mirosul usturoiat al respirației fiind caracteristic pentru intoxicația prin inhalare.

Toxicitatea variază în funcție de compus. Dacă sunt ingerați, Se elemental și seleniurile nu produc efecte toxice foarte pronunțate, datorită biodisponibilității foarte mici. În caz de existență a unor leziuni ulceroase este posibilă o absorbție mai crescută a acestor compuși. Seleniul elementar sub formă de nanoparticule prezintă o toxicitate mai scăzută.

Selenitul și selenatul prezintă toxicitatea cea mai mare când sunt ingerați, având o Bd relativ crescută și proprietăți redox ce le conferă un mecanism de acțiune similar trioxidului de As.

Oxiclorura de Se poate fi la originea arsurilor cutanate cu vezicule, necroză; în caz de inhalare leziunile pulmonare sunt mai puțin severe decât la hidrogenul seleniat.

Dioxidul de Se este puternic iritant pentru căile respiratorii superioare, antrenând o tuse însoțită uneori de dispnee, dar și pentru ochi, provocând conjunctivită cu colorarea în roz a pleoapelor și blefaroconjunctivită. Prin contact cu pielea pot să apară semne de iritație cutanată asociate uneori cu o necroză, dar și o dermatită eczematiformă.

Doza letală medie (DL50) de selenit de Na se consideră a fi de 4 mg/kg. Doza toxică, de la care apar simptome clinice de intoxicație acută este între 1-5 mg/kg. Ingestia de 15 ml de soluție pentru curățat puștile ( 2 % acid selenios) este fatală (Reilly, 2006; Hatfield et al, 2006).

Salbe et Levander (1990) au efectuat studii pe șobolani masculi Met-deficienți, pentru compararea toxicității și retenției tisulare a selenatului de Na cu cea a

Se-Met. Animalele au fost împărțite în mai multe grupuri, cărora li s-a administrat 0,1 , 0,5 sau 2,5 μg Se/g sub formă de selenat sau Se-Met. Dieta a fost suplimentată sau nu cu Met. După sacrificarea animalelor și analiza organelor, s-a constatat că, la o doză de 2,5 µg/g, nivelul Se în inimă, creier și testicule era mult mai mare în cazul șobolanilor cărora li s-a administrat Se-Met, comparativ cu grupurile cărora li s-a administrat selenat de Na. În rinichi, nivelul Se a fost mai crescut la șobolani cărora li s-a administrat selenat, față de cei cărora li s-a administrat Se-Met. S-a constatat deasemenea că selenatul de Na, la o doză corespunzând la 2,5 μg/g, a manifestat inhibiție asupra creșterii, comparativ cu Se-Met corespunzând la aceeași cantitate de Se. S-a concluzionat că selenatul este mai toxic decât Se-Met, d.p.d.v. al proceselor de creștere.

Wang et al (2007) au efectuat un experiment pe șoareci masculi pentru evaluarea toxicității Se-Met, comparativ cu Se elementar sub formă de nanoparticule (Nano-Se), cu diametrul de 20-60 nm. S-au făcut mai multe determinări biochimice, precum și analize histopatologice și s-a calculat doza letală, atât pentru grupurile cărora li s-a administrat Se-Met, cât și pentru cele cărora li s-a administrat Se elementar. Pentru Se-Met s-a dedus că DL50 a fost de 25,6 mg Se/kg iar pentru Nano-Se de 92,1 mg/kg. La doze mari, s-a observat o inhibiție a procesului de creștere de către ambii compuși, dar la aceeași cantitate echivalentă de Se, Se-Met a avut un efect mai pronunțat. Analizele histopatologice hepatice și activitatea enzimelor hepatice GOT, GTP și LDH au demonstrat toxicitatea superioară a Se-Met față de Nano-Se. Deasemena, s-a constatat că retenția în țesuturi este mai mare pentru Se-Met, față de Nano-Se, în special la doze crescute și toxice. Capacitatea Nano-Se de a crește expresia GST (Glutation-S-transferaza) s-a dovedit a fi superioară celei a Se-Met, la aceeași cantitate echivalentă de Se, indiferent de domeniul dozelor (subtoxice, toxice). Biodisponibilitatea Nano-Se a fost mai mică decât a Se-Met, dar nu acesta a fost factorul determinant pentru toxicitatea scăzută a Nano-Se.

Toxicitatea Nano-Se a fost evaluată și în comparație cu Se-metilSe-Cys, pe șoareci masculi. S-a stabilit că DL50 pentru Se-metil-Se-Cys este de 14,6 mg/kg, exprimată în Se, pentru Nano-Se obținându-se acceași valoare determinată anterior – 92,1 mg Se/kg. S-au efectuat aceleași determinări biochimice și analize histopatologice ca în studiul anterior. Nu s-au constatat diferențe notabile privind influența celor 2 forme ale Se, în doze echivalente, asupra activității enzimelor. S-a concluzionat că Nano-Se are o toxicitate mult mai mică decât Se-metilSe-Cys, introducerea lui în suplimentele nutritive putând constitui un avantaj (Zhang et al, 2008).

Spiller et Pfiefer (2007) au raportat rezultatele obținute în urma investigării circumstanțelor, simptomatologiei și autopsiei a 2 persoane decedate în urma intoxicației cu Se. În primul caz a fost vorba de o femeie de 37 de ani, anterior sănătoasă, care s-a prezentat la medic cu o serie de simptome constând în greață, vomă, diaree, stare de slăbiciune generală, începând cu 10 zile înainte de prezentarea la medic, fiind internată în spital pentru rehidratare, simptomele dispărând. După o perioadă de câteva zile de la externare, simptomele au reapărut; după ~ 14-16 ore de la reinițierea simptomelor, pacienta a acuzat dureri abdominale și în zona toracelui, prezentând hipotensiune severă, iar la scurt timp a decedat. S-a făcut autopsia, rezultatele obținute în urma examinărilor și analizelor standard neindicând o posibilă cauză a morții. După 4 luni de la înnmormântare cadavrul a fost exhumat și s-a repetat autopsia, urmărindu-se de această dată și prezența unor elemente toxice. S-a confirmat prezența Se în cadavru, estimându-se că este vorba de o otrăvire, având ca scop omuciderea. Cel de-al doilea caz, un bărbat de 36 de ani a prezentat aproximativ aceleași simptome, cantitatea de Se depistată în organism după autopsie fiind totuși mult mai mare în acest caz.

Kamble et al (2009) au raportat un caz de intoxicație acută cu Se al unei fete de 22 ade ani care a ingerat aproximativ 100 de ml dintr-un mediu nutritiv îmbogățit în Se ( 4 g selenit/L), folosit în Microbiologie. Pacienta s-a prezentat a 2-a zi după ingerare la spital cu o serie de simptome: anxietate, vomă, dureri abdominale, tahicardie, anurie. Analizele de laborator de la internare au arătat o serie de modificări, printre care nivelul crescut al ureei și creatininei serice. Biopsia la nivel renal a evidențiat zone de necroză la nivelul tubilor contorți, în zona proximală. Pacientei i s-a administrat tratament simptomatic și a fost supusă hemodializei, având o recuperare aproape completa.

IV.3. Toxicitatea cronicǎ a seleniului

În cazul unui aport crescut de Se pe o perioadă mare de timp, apar o serie de simptome și modificări metabolice, mai mult sau mai puțin caracteristice. Simptomatologia și efectele asupra organismului pot varia foarte mult, în funcție de doză, compusul chimic al Se implicat, timpul expunerii, prezența/absența altor micronutrienți din alimentație, particularități genetice, etc. Chiar doze mari de Se, considerate subtoxice, ingerate pe o perioadă mare de timp, pot duce la apariția unor modificări fiziologice de o gravitate moderată, nespecifice pentru intoxicația cu Se.

Simptomele sunt în general aceleași, indiferent de natura intoxicației, putând totuși varia în funcție de specia chimică a Se și calea de pătrundere în organism.

IV.3.1. Intoxicații de natură profesională și iatrogenă

Întoxicațiile profesionale privesc expunerile mai ales prin inhalare. Ele asociază simptome nespecifice: astenie, iritabilitate, pierdere în greutate, tremurat și câteodată pierderea mirosului; foarte frecvent apar tulburări gastro-intestinale, vomă, diaree, dureri epigastrice. Semnele de iritație cutanată, nazală sau oculară sunt adesea prezente.

Unele simptome sunt specifice intoxicației cu Se, ca mirosul usturoiat al respirației și al transpirației, gustul metalic în gură, transpirația excesivă, colorarea în roz a pleoapelor, modificări la nivelul epidermei (unghii casante, striate sau moi, colorarea tegumentelor, căderea părului), paloare sau icter cutanat.

Există și cazuri de intoxicații iatrogene, acestea fiind cele mai frecvente. Se pot produce prin administrarea pe termen lung de suplimente nutritive cu Se, în doze mai mari decât cele recomandate. Există și cazuri în care, datorită unor erori în procesul de fabricație, suplimentele nutritive sunt cu mult supradozate față de formula prevăzută. În cazul administrării pe termen lung, posibilitatea de manifestare a simptomelor clinice este crescută în cazul în care, înafară de aportul crescut de Se adus prin suplimente nutitive, alimentele consumate conțin cantități mari de Se (Reilly, 2006).

Sutter et al (2008) au raportat un caz de intoxicație involuntară cu Se dintr-un supliment nutritiv. Este vorba de o femeie de 55 de ani din SUA, care a consumat timp de 7 săptămâni un nectar (sirop) cu adaos de micronutrienți, în dozele recomandate, după această perioadă prezentându-se la medic, cu o serie de simptome constând în diaree, crampe musculare, alopecie, dureri articulare, lipsa concentrării, unghii casante. Pacienta a sustținut că a consumat aproximativ 30 ml/zi. Conținutul declarat în Se pt. produsul respectiv a fost de 7,33 µg/ml. La analiza chimică a produsului s-a stabilit concentrația de 800,5 μg/ml pentru Se. S-au găsit concentrații mari și pentru alte microelemente, necorespunzătoare, incluzând cromul. S-a calculat că pacienta a ingerat zilnic 24.015 µg Se, în ultimele 7 săptămâni.

Ȋn Tabelul 4.I sunt redate limitele de expunere pentru cei mai importanți compuși ai seleniului.

Tabelul 4.I. Limitele de expunere pentru unii compuși ai Se (după Olson, 2004)

IV.3.2. Cariile dentare

Unul dintre simptomele posibil asociate cu aportul crescut de seleniu îl reprezintă incidența crescută a cariilor dentare. Acest lucru a fost pentru prima dată raportat de cercetătorii chinezi, în provincia Hubel. La aceeași concluzie au ajuns și alți cercetători care au monitorizat populația din alte zone în care solul este bogat în Se, precum Dakota de S. Totuși, nu s-a ajuns la o concluzie definitivă conform căreia excesul de Se contribuie la dezvoltarea cariilor dentare, în zonele implicate solul și apele având și un conținut crescut de fluoruri. Se pare că etiologia cariilor dentare este multifactorială, putând fi implicate mai multe micro- și oligo-elemente (Reilly, 2006).

IV.3.3. Scleroza laterală amiotrofică (B. Charcot)

Scleroza laterală amiotrofică (SLA) cunoscută și sub denumirea de B. Charcot sau B. Lou Gehrig este o afecțiune caracterizată prin reducerea progresivă a numărului neuronilor motori din creier și măduva spinării. Este o boală progresivă, invalidantă, fatală în cele din urmă. Mersul, vorbitul, mâncatul, înghițitul și alte funcții devin mai dificile cu timpul. Este o afecțiune destul de rară, afectând 1 sau 2 persoane din 100.000. Afectează în special bărbații de peste 50 de ani.

Corelația dintre aportul crescut de Se și incidența acestei boli a fost făcută pentru prima dată în anii `70, când unele studii au raportat existența unor niveluri mari de Se în organismul unor pacienți din Dakota de S. Au existat controverse pe această temă, alte studii finalizându-se cu rezultate contrare. Alte ipoteze tind să sugereze implicarea altor micronutrienți în etiologia acestei boli, precum Hg și Cd. Se pare că etiologia SLA este multifactorială, printre altele putând fi vorba și de unele anomalii genetice (Reilly, 2006).

Vincenti et al (1996) au făcut o monitorizare clinică pe 5182 de subiecți, provenind dintr-o zonă unde populația a fost expusă consumului de apă potabilă cu nivel crescut de Se pe termen lung. S-a confirmat că incidența B. Charcot este legată de aportul crescut de Se.

IV.3.4. Seleniozele endemice

Încă din anii `30 s-a întrevăzut posibilitatea ca unele simptome ale animalelor din zonele unde solul era bogat în Se să fie legate de efectele toxice ale acestui element. Prin analogie, s-a presupus că și unele simptome prezente la o parte din populația trăind în aceleași zone ar putea fi legate de ingestia crescută de Se.

O serie de monitorizări clinice efectuate de-a lungul timpului au confirmat corelația dintre simptome și nivelurile crescute de Se în urină, păr și unghii, pentru indivizii trăind în regiuni selenifere. Există numeroase areale geografice în lume cu soluri selenifere, arii întinse existând în Dakota de S (SUA), Venezuela, Columbia, câteva provincii din China, precum Hubei și Shaanxi.

Aceste selenioze se manifestă în general prin decolorarea și căderea părului, unghii casante, căderea unghiilor, carii dentare, apariția de dermatite eczematiforme în special pe scalp, leziuni cutanate. Cazurile cele mai grave prezintă tulburări SNC, ce se manifestă inițial prin parestezii și dureri ale extremităților. Majoritatea prezintă și tulburări digestive.

S-a constatat că nivelul Se în cerealele și celelalte alimente consumate de populația din zonele respective este chiar de câteva zeci de ori mai mare decât nivelul din alimentele consumate în alte zone. În aceste cazuri este vorba în special de alimente de origine vegetală provenind din plante cultivate în regiunile respective, unde biodisponibilitatea Se din sol este mare (Reilly, 2006).

În Venezuela și Brazilia, incidența seleniozei a fost corelată cu un consum crescut de Nuci de Brazilia, cunoscute pentru conținutul ridicat în Se. Aceste nuci sunt produse de Bertholletia excelsa, un arbore care acumulează Se din sol, stocându-l în nuci, chiar dacă solul nu este selenifer, ci are un conținut mediu de Se.

Yang et al (1989) au efectuat monitorizări clinice în zonele cu soluri selenifere din China în încercarea de a stabili doza zilnică minimă de la care apar efectele toxice ale Se, observând că un aport zilnic mai mare de 850 μg/zi este asociat cu semnele clinice ale seleniozei. Nu a fost luată în calcul totuși biodisponibilitatea Se, fiind posibil ca Se din alimentația persoanelor monitorizate să fi avut o Bd mică.

Longnecker et al (1993) au ȋntreprins monitorizări clinice pe indivizi sănătoși selectați aleator din Dakota de S pentru identificarea unor cazuri cu simptomatologie asemănătoare seleniozei și evidențierea unor eventuale corelații cu aportul crescut de Se. Indivizii au fost monitorizați pe o perioadă de 2 ani, atât d.p.d.v. clinic cât și al parametrilor biochimici; s-a estimat și cantitatea de Se ingerată zilnic din alimente. S-a stabilit că doza medie zilnică ingerată a fost > 200 μg/zi, iar la 50 % dintre subiecți > 400 μg/zi. Rezultatele au fost oarecum contrare decât cele preconizate. Nu s-au observat modificări biochimice accentuate relevante. La unii subiecți s-a putut face corelația între prezența unor parestezii ușoare și aportul crescut de Se. Înafară de aceasta nu s-a putut deduce influența aportului de Se la aceste doze asupra apariției vreunui simptom clinic.

CAPITOLUL V

SELENIUL ȘI PATOLOGIA UMANĂ

Datorită faptului că intră în structura a numeroase selenoenzime și selenoproteine, Se este implicat în desfășurarea a aproape tuturor proceselor fiziologice din organsim, statusul său în organism fiind un factor favorizant pentru apariția sau protector față de diversele afecțiuni. Se poate presupune că un deficit absolut de Se nu este compatibil cu viața, deși nu există zone în care aportul prin alimentație să fie 0, indiferent de conținutul în Se al solului. (Se este un element ubiquitar, chiar dacă în concentrații extrem de mici).

V.1. Implicațiile seleniului ȋn carcinogenezǎ

Cancerul reprezintă o boală cu etiologii și manifestări morfo-fiziopatologice și clinice diverse, având ca mecanism proliferarea celulară anarhică, necontrolată și neîntreruptă.

Majoritatea studiilor epidemiologice au arătat existența unei relații de inversă proporționalitate între statusul Se și riscul de dezvoltare al cancerului. Doar pentru câteva dintre selenoproteinele descoperite până în prezent se cunosc toate funcțiile specifice. Efectul anticarcinogenic al Se nu poate fi explicat în totalitate doar prin prisma cunoștințelor despre selenoproteine din momentul actual. Se cunoaște rolul în prevenția apariției cancerului cel puțin pentru o parte dintre selenoproteine: GPx-azele, TrxR-azele și deiodurazele.

Acțiunea anticarcinogenă a Se are loc la nivel sistemic, celular și nuclear. Aceste acțiuni implică și sistemul imun, de aceea nu pot fi interpretate prin prisma unui singur mecanism. Acțiunea anticarcinogenă a Se depinde și de compusul cu Se luat în considerare, doza și factorul etiologic al cancerului.

Etiologia unor cancere implică mutații la nivelul ADN induse de ROS. De aceea glutation-reductazele și tioredoxin-reductazele, majoritatea fiind selenoenzime, joaca un rol important în prevenția apariției sau regresia cancerelor, prin mecanisme genetice și epigenetice precum: neutralizarea H2O2 și a hidroperoxizilor lipidici, blocarea producerii ROS și a malonildialdehidei, modularea sistemului de semnalizare redox, esențial pentru dezvoltarea multor tipuri de cancere. Acest mecanism se pare că funcționează și în cazul acțiunii radiațiilor UV, presupunându-se că acestea generează H2O2 fotochimic.

Intrând în structura deiodurazelor, Se joacă un rol important în reglarea metabolismului hormonilor tiroidieni. S-a demonstrat că hormonii tiroidieni au o acțiune relativ antagonistă cu estrogenii asupra dezvoltării cancerului de sân, constatându-se deasemenea că incidența cancerului de sân este mai mare în zonele cu soluri deficiente în iod.

S-a demonstrat că seleniul, probabil prin acțiunea antioxidantă a GPx-azelor și TrxR-azelor, modulează, prin modificarea statusului redox, transcripția genei p53 (genă care codifică un factor de transcripție ce monitorizează stabilitatea genomului)., facilitând repararea leziunilor ADN-ului induse de factori chimici sau fizici.

S-a evidențiat acțiunea anticarcinogenă pentru câțiva dintre metaboliții intermediari ai Se, incluzând selenodiglutationul (GSSeSG), hidrogenul seleniat (H2Se) și derivații metilați ai seleniurii. GSSeSG poate să împiedice legarea la ADN a AP-1 (un factor de transcripție nuclear oncogen) și să inducă apoptoza (Hatfield et al, 2006; Reilly, 2006).

Ȋn fig. 5.1. sunt redați principalii metaboliți ai seleniului implicați ȋn prevenția cancerului și principalele mecanisme de acțiune.

Figura 5.1. Metaboliții intermediari ai Se implicați în prevenția cancerului (după Hatfield et al, 2006) Abrevieri: CH3SeO2H – ac. metil-seleninic; CH3SeCN – metilselenocianat; DNA SSBs – mutații într-o singură catenă din dublul helix (DNA single strand breaks); PKC- protein kinaza C; MMP- metaloproteinaza-2 matriceală; VEGF – factorul endotelial de creștere (proliferare) vasculară; PSA-antigenul prostatic; AR-receptorul pentru hormoni androgeni

Hidrogenul seleniat se pare că are un rol important în prevenția carcinogenezei, prin producerea de anion superoxid și apă oxigenată, inducând apoptoza celulelor canceroase. Metaboliții metilați ai hidrogenului seleniat prezintă și ei acțiune anticarcinogenică.

S-a demonstrat că și metilselenolul (CH3SeH) și precursorii săi – metilselenocianatul (CH3SeCN) și Se-metilSe-Cys prezintă acțiune anticarcinogenă. Inducerea apoptozei de către acești compuși se pare că este independentă de gena p53, nemanifestând nici un efect asupra transcripției acesteia.

Activitatea anticarcinogenică a metaboliților și compușilor sintetici cu Se este cu siguranță legată atât de reacția acestor compuși cu unele proteine-cheie cât și de modificarea statusului redox. Compușii cu Se sunt capabili să reacționeze cu grupările tiol dintr-o serie de selenoproteine/selenoenzime, formând legături de tipul –S-Se-S- și –S-Se-, interferând cu funcțiile acestor enzime/proteine. S-a dovedit pentru unele cazuri că efectul antitumoral al Se se explică prin inhibarea activității unor enzime precum ribonucleaza sau protein kinaza C (PKC). Inhibarea PKC are o importanță deosebită, acest sistem enzimatic fiind implicat în activarea unor factori nucleari de transripție și în legarea unor promotori.

Generarea de anion superoxid de către Se prin reacția cu GSH, mecanism implicat în toxicitatea seleniului, poate explica și acțiunea anticarcinogenă, inducând apoptoză la nivelul celulelor tumorale, chiar la un nivel normal al seleniului (Hatfield et al, 2006).

Nu există dovezi că formele comune sub care se găsește Se în alimente – Se-Cys și Se-Met au acțiune anticarcinogenă directă. Totuși, acești aminoacizi pot fi metabolizați mai întâi la H2Se apo la CH3SeH.

Deoarece CH3SeH este instabil in vitro iar biosintetizarea la nivel celular din Se-Cys sau Se-Met implică prezența mai multor enzime, a căror activitate este scăzută în unele tipuri celulare precum celulele din sân și prostată, pentru efectuarea de experimente in vitro s-a impus folosirea unui alt compus ce poate fi adăugat în mediul de cultură – acidul metilseleninic (AMS) – CH3SeO2H, care este convertit in vivo, după pătrunderea în celulă, la CH3SeH (Ip et al, 2002).

Mutațiile existente la nivelul genelor ce codifică unele selenoenzime cheie sunt deasemenea asociate cu incidența cancerului, selenoenzimele exprimate prezentând modificări d.p.d.v. al cineticii de reacție, al turn-over-ului, etc.

S-a constatat că o serie de alte elemente prezente în alimente și în apa potabilă interacționează cu absorbția Se, formând seleniuri insolubile sau manifestând o competiție de absorbție cu Se. Alte elemente sunt inhibitori ai selenoenzimelor sau enzimelor implicate în repararea ADN iar unele sunt generatoare de ROS. În cazul unui aport crescut din aceste elemente – Cd, Pb, Zn, Cr), necesarul de Se al organismului este mai mare, pentru a menține efectul protector anticarcinogenic (Schrauzer, 2000).

V.2. Implicațiile seleniului ȋn diabetul zaharat

Diabetul zaharat este un sindrom metabolic plurietiologic, cu expresie clinică variată, al cărui element definitoriu este hiperglicemia, determinată de carența relativă sau absolută de insulină. Criteriile actuale de diagnostic iau în considerare glicemia à jeun de peste 7 mmol/L (126 mg %) sau glicemia la 2 ore de la începerea testului de toleranță orală la glucoză, sau în orice moment, peste 11,1 mmol/L (200 mg %). Hiperglicemia se datorează scăderii captării și utilizării glucozei de către țesuturi, consecință a scăderii nivelului insulinei, unei producții hepatice crescute de glucoză sau unei tulburări metabolice periferice, independente de modificările insulinemiei.

Datorită incidenței crescute și a gravelor efecte asupra stării generale de sănătate, în cazul în care nu este tratat, diabetul reprezintă o problemă de sănătate publică de primă importanță.

După cum s-a menționat, toate acțiunile insulinei la nivel celular sunt inițiate prin legarea insulinei la receptorul specific. După cuplarea insulinei la receptor, complexul receptor-insulinǎ (RI) se comportă ca o enzimă alosterică tipică, suferind modificări conformaționale. Prezentând activitate kinazică, produce fosforilarea diferitelor substraturi endogene, care sunt în general enzime, modulându-le activitatea. Cele mai multe studii in vitro pentru evaluarea implicațiilor Se în mecanismele de acțiune ale I au fost efectuate utilizând selenatul. S-a constatat că adăugarea de selenat în mediul de cultură al unor linii celulare duce la creșterea fosforilării porțiunii intracelulare a RI, ducând mai departe la activarea porțiunii tirozin-kinazice. Unele studii au demonstrat că RI este cuplat și cu fosfatidilinozitol-3 kinaza, acesta fiind mesagerul secund pentru numeroase acțiuni ale insulinei ( translocarea transportatorilor glucozei, reglarea glicogen-sintetazei, a enzimei glicogen-sintetazo-3 kinaza, G6PDH, etc.). In vitro, adăugarea de selenat a crescut activitatea fosfatidilinozitol-3 kinazei, precum și captarea (transportul) glucozei din mediul de cultură. Mecanismele prin care Se se comportă ca un insulino-mimetic nu sunt încă pe deplin elucidate, dar există dovezi că Se activează o serie de proteine cheie din lanțul de transmitere informațională al insulinei (Stapleton, 2000).

Hwang et al (2007) au efectuat un studiu pe șoareci diabetici (insulino-dependent) fără obezitate pentru a monitoriza evoluția diabetului în contextul suplimentării cu Se. Au fost constituite 2 grupuri, în funcție de glicemie: un grup diabetic ( > 250 mg/dL) și unul nediabetic (< 250 mg/dL). Fiecare grup a fost subîmpărțit în 2 subgrupuri: primele subgrupuri din grupul diabetic si nediabetic au primit intraperitoneal timp de 3 săptamâni o soluție de selenit de Na (5 μmol/kg masă corporală), celelalte subgrupuri primind același volum de apă distilată. S-au determinat o serie de parametri biochimici, inclusiv glicemia și insulinemia și s-a măsurat expresia anumitor proteine și enzime din pancreas și ficat implicate în transducerea mesajului insulinei. În grupul diabetic, s-a constatat că masa corporală a șoarecilor ce au primit Se a crescut semnificativ pe parcursul experimentului, comparativ cu șoarecii care nu au primit Se. În grupul nediabetic Se nu a influențat în nici un fel glicemia și insulinemia. În grupul diabetic, șoarecii care au primit Se au înregistrat niveluri mult mai scăzute ale glicemiei, comparativ cu cei netratați; insulinemia animalelor din acest grup nu a fost afectată de administrarea de Se. În grupul diabetic, administrarea de Se a redus considerabil nivelurile LDL, TG, Col total, precum și nivelurile GTO, GTP și al fosfatazei alcaline. În cazul șoarecilor diabetici, s-a constatat că administrarea de Se a crescut expresia proteinei ce constituie RI, probabil și numărul receptorilor.

Campbell et al (2008) au investigat efectele Se, adăugat în mediul de cultură, asupra metabolismului celulelor β pancreatice. Au fost utilizate: linia celulară Min6, de la șoarece și insule Langerhans intacte, izolate de la șobolan. După transfecția celulelor Min6 cu o secvență ADN conținând gena pentru Ipf1 (Insuline promoter factor – necesar pentru diferențierea celulelor embrionare pancreatice), celulele au fost cultivate în medii adecvate, cu adaosul a 30 nmol/l de selenit de Na, selenat de Na sau sulfit de Na. S-a constatat că adăugarea de selenit de Na în mediul de cultura a crescut semnificativ activitatea GPx. S-a determinat nivelul ARNm pentru Ipf1, constatându-se că expresia Ipf1 a crescut semnificativ în cazul adăugării de săruri de Se în mediul de cultură (selenitul manifestând o acțiune mai puternică). În cazul adăugării de sulfit nu s-a observat nici o diferență. S-a observat deasemenea și o creștere a nivelului ARNm pentru insulină, în cazul prezenței Se în mediul de cultură. După incubarea insulelor Langerhans de la șobolan s-a constatat o creștere semnificativă, atât a conținutului (rezervelor) de insulină, cât și a secreției, în cazul prezenței selenitului de Na în mediul de cultură. S-a concluzionat că Se este implicat în reglarea biosintezei și secreției de insulină de către pancreasul endocrin.

DZ comportă o serie de complicații acute și cronice, în cazul în care nu este tratat. Aceste complicații se datorează în special hiperglicemiei, dar și hiperinsulinemiei (dacă este cazul). Un nivel crescut al glucozei în sânge duce la accelerarea procesului de glicozilare neenzimatică (glicare), activarea căii „poliol„, creșterea producției de ROS. Unele complicații cronice ale DZ sunt cataracta, retinopatia diabetică, cheiropatia, microangiopatia diabetică, ateroscleroza, etc.

O dietă bogată în fructoză, datorită căilor particulare de metabolizare ale acesteia, induce modificări metabolice semnificative: dislipidemii și fenomenul de insulino-rezistență, modificări similare cu cele care apar în DZ Tip 2. Faure et al (2007) au studiat implicațiile administrarii de Zn și/sau Se și Vit. E asupra insulino-rezistenței și stresului oxidativ la șobolanii supuși unei diete bogate în fructoză. Șobolanii au fost împărțiți în 5 grupuri: un grup de control care a primit o dietă conținând în majoritate carbohidrați, dar fără fructoză, un grup cu o dietă bogată în fructoză, un grup cu dieta bogată în fructoză și cu adaos de Zn, un grup cu dieta bogată în fructoză și suplimentată cu Zn, Se și Vit. E și un grup cu aceeași dietă bogată în fructoză care a primit apă cu adaos de metformin. Șobolanii au fost supuși acestor diete timp de 6 săptămâni, după care au fost sacrificați și au fost colectate diverse probe biologice și s-au determinat diferiți parametri biochimici. S-a constatat că animalele din grupul hrănit cu fructoză prezentau fenomenul de insulino-rezistență, comparativ cu grupul de control. Comparativ cu celelalte grupuri hrănite cu fructoză, insulino-rezistența a fost mai mică în grupul suplimentat cu Se, Zn și Vit. E, apropiindu-se de grupul de control. Nu s-au observat diferențe semnificative privind glicemia între grupuri. Nivelul seric al TG a fost crescut pentru toate grupurile hănite cu fructoză, înafară de grupul care a primit metformin, în acest caz nivelul TG apropiindu-se de nivelul TG din grupul de control. Peroxidarea lipidică a fost crescută în toate grupurile, înafară de grupul care a primit metformin, unde valorile au fost apropiate de cele din cazul grupului de control. S-a concluzionat că Se în combinație cu Zn și Vit. E are un efect benefic asupra remedierii fenomenului de insulino-rezistență și a stresului oxidativ.

Majoritatea studiilor in vitro și pe animale întreprinse pentru evidențierea unei legături între Se și DZ au sugerat că Se are un rol benefic pentru metabolismul glucidic, cu reducerea glicemiei și a patologiei asociate hiperglicemiei. Totuși, aceste studii s-au referit în general la diabetul insulino-dependent, demonstrând acțiunea insulino-mimetică a Se, la doze relativ mici. Dacă în diabetul de tip 1 Se se pare că ar avea un rol benefic (este necesară efectuarea de studii clinice intervenționale la scară mare pentru confirmare), în DZ de tip 2 se pare că ar avea o acțiune nocivă, putând fi chiar un factor etiologic pentru această boală, la doze crescute, administrate pe termen lung. Este totuși necesară efectuarea de studii pentru aflarea mai multor lucruri despre acest fenomen.

Mecanismele prin care Se, administrat în doze relativ mari și pe perioade mari de timp crește riscul apariției DZ Tip 2 nu sunt cunoscute pe deplin. Unele studii au demonstrat că Se manifestă efect supresor asupra biosintezei de IGF, implicat în controlul glicemiei. Dozele mari de Se pot stimula secreția de glucagon, ducând la hiperglicemie.

Stranges et al (2007) au raportat că administrarea de suplimente cu Se pe termen lung crește incidența DZ tip 2. Un studiu clinic anterior, întreprins începând cu 1983, (Studiul Clark – Clark et al, 1996) a constat în administrarea de 200 μg Se/ zi sau comprimate placebo unor pacienți bolnavi de cancer de piele (peste 1200 subiecți). Scopul a fost evaluarea efectului suplimentării cu Se pe termen lung asupra evoluției și incidenței cancerului de piele. Subiecții au fost monitorizați d.p.d.v. medical și după încetarea studiului. Pe parcursul studiului, cât și pe parcursul câtorva ani după, cât timp pacienții au fost examinați periodic, s-au raportat 97 de noi cazuri de diabet tip 2. (incidența de 10,5 cazuri la 1000 persoane). Din cele 97 de cazuri, 58 au apărut la pacienții care au primit suplimente cu Se, iar 39 la cei care au primit comprimate placebo. Analizele statistice au sugerat că riscul de apariție al DZ tip 2 este cu atât mai mare cu cât nivelul seric bazal al Se, înainte de administrarea de suplimente, era mai crescut.

V.3. Efectul imunomodulator al seleniului

Sistemul imun folosește generarea de ROS pentru acțiunea bactericidă. În doze limitate, eliberarea de ROS generează inflamație și distruge celulele microbiene, dar generarea cronică de ROS poate duce la stress oxidativ crescut, în organismul gazdă. Gazda se apără împotriva ROS prin sistemele antioxidante. Cum majoritatea enzimelor cu rol antioxidant sunt selenoenzime, este evidentă importanța Se.

S-a raportat că suplimentarea cu Se crește eficiența vaccinurilor împotriva malariei, crește numărul LyB producătoare de anticorpi, crește numărul neutrofilelor, crește activitatea GPx din limfocite, având și un efect de creștere a nivelului Se din ganglionii limfatici și neutrofile. În unele cazuri totuși, administrarea unor cantități mari de Se a dus la scăderea imunității.

Efectul modulator al Se asupra sistemului imun implică mai multe mecanisme:

1) Detoxifierea organismului de hidroperoxizii organici și apa oxigenată; 2) Reglarea biosintezei eicosanoizilor, ducând la biosinteza prioritară a LT și prostacicline, în loc de TX și PG; 3) Reglarea „down„ a expresiei citokinelor și factorilor de adeziune; 4) Reglarea „up„ a expresiei receptorilor pentru IL-2, ducând la creșterea activității limfocitelor și celulelor NK; 5) reglarea metabolismului și funcțiilor celulare de către cele peste 25 de selenoproteine cunoscute până în prezent;

Protecția împotriva stressului oxidativ este probabil cel mai important mecanism prin care Se exercită o acțiune imunostimulatoare. În același timp cu producerea de oxid nitric (NO) de către neutrofile și monocite, se formează și anionul peroxinitrat (ONOO-), un oxidant puternic. GPx-azele și TrxR-azele sunt implicate în protecția față de acest anion.

Conversia acidului arahidonic la PG este mediată de COX. Această enzimă necesită un nivel bazal de peroxizi pentru a funcționa. Dacă nivelul peroxizilor este prea mare, este inhibată activitatea COX. Activitatea antiinflamatoare a Se s-ar putea explica prin capacitatea sa de a inhiba 5- și 15- lipoxigenazele, enzime cu rol intermediar în biosinteza LT .

În majoritatea studiilor, suplimentarea cu Se a dovedit a avea un efect benefic asupra imunității mediate celular, observându-se o creștere a rezistenței la infecțiile bacteriene și virale, cât și la proliferarea diverșilor paraziți.

Stresul oxidativ induce câteva citokine pro-inflamatoare: IL-1, IL-6, IL-8 și TNF-α, posibil prin activarea unor factori de transcripție. Suplimentarea cu Se s-a constatat că reduce expresia acestora, reducând astfel răspunsul inflamator.

Înafară de rolul de atenuare a inflamației, Se augmentează „performanța„ LyB și LyT, mecanismul constând probabil în reglarea „up„ a expresiei receptorului pentru IL-2, ducând la creșterea numărului de receptori cu afinitate mare pentru IL-2 pe suprafața limfocitelor. Procesul este urmat de proliferarea și diferențierea în celule efectuare citotoxice.

Conform datelor prezentate, ar fi de așteptat ca Se să aibă efecte benefice asupra unor afecțiuni inflamatorii precum artrita reumatoidă. Au fost efectuate câteva studii clinice pentru validarea acestei supoziții, constatându-se că nu există o relație certă între artrita reumatoidă și activitatea GPx-azelor de la acești pacienți.

Studiile efectuate in vitro au arătat că modularea răspunsului imun este dependentă de forma chimică sub care se găsește Se în mediul de cultură. Acest lucru se pare că este valabil și in vivo, Se, de la absorbție și până la excreție trecând printr-o serie de metaboliți intermediari, în care Se se găsește în diverse stări de oxidare (Reilly, 2006; Hatfield et al, 2006; Navarro-Alarcon et Cabrera-Vique, 2008).

V.4. Seleniul – element antitoxic și citoprotector

Numeroasele studii efectuate au confirmat efectul protector al Se împotriva toxicitații induse de diverse substanțe chimice. Mecanismele prin care Se își manifestă acțiunea antitoxică și citoprotectoare sunt multiple, drept urmare a faptului că Se este cofactor sau intră în structura multor selenoenzime/selenoproteine.

Mulți agenți chimici exogeni au ca mecanism toxicodinamic principal generarea de ROS. Deoarece principalele enzime cu rol în neutralizarea ROS sunt GPx-azele iar Se este cofactor pentru aceste enzime, în cazul acestor substanțe acțiunea protectoare a Se poate fi explicată prin asigurarea activității catalitice optime a acestor enzime.

Arsenul și compușii săi sunt recunoscuți ca fiind toxici. Arsenul metaloid, în starea de oxidare 0 nu este toxic, fiind prezent în organism în cantități infime, provenind din mediu. Importanță toxicologică o prezintă unii compuși ai As folosiți în industrie, agricultură, farmacie, în care As se găsește sub formă de As+3 sau As+5. Printre cei mai toxici compuși oxigenați ai As sunt anhidrida arsenioasă (șoricioaică) -(As2O3 – insecticid), arsenitoacetatul de Cu ( verde de Paris) (3 Cu(AsO2)*Cu(CH3-COO)2 – insecticid), arseniații de Na, K și Ca (Na2HAsO4, K2HAsO4, CaHAsO4 – insecticide). Un alt compus toxic este hidrogenul arseniat (AsH3), un gaz incolor, cu miros aliaceu.

Intoxicațiile cu hidrogen arseniat sunt de obicei accidentale și au loc în metalurgie și industria chimică. Intoxicațiile cu compușii oxigenați ai As pot fi voluntare (crime, sinucideri), cele mai frecvente fiind cele cu anhidrida arsenioasă, fiind facilitate de toxicitatea puternică și de lipsa de culoare și miros a acesteia. S-au semnalat și intoxicații alimentare (pești, legume, fructe impurificate cu As) sau terapeutice (supradozare de soluții Fowler, Pearson, Boudin – folosite în trecut în scop terapeutic).

Hidrogenul arseniat, după absorbția pe cale respiratorie este vehiculat în special legat de hematii. Compușii oxigenați pot pătrunde în organism pe cale digestivă, transcutanată sau respiratorie. Viteza absorbției este în funcție de solubilitate, dar în general lentă. În sânge As se leagă de hematii (combinându-se stabil cu globina din Hb) și mai puțin de albuminele plasmatice. Se distribuie în toate organele, dar se acumulează în special în tegumente, fanere, oase, unde persistă un timp. Eliminarea are loc lent prin urină, fecale, tegumente, fanere.

Toxicitatea depinde de starea de oxidare (compușii de As+5 devin toxici în urma reducerii lor în organism la As+3) și de solubilitate (compușii mai solubili sunt mai toxici). Principalul mecanism toxicodinamic este reprezentat de acțiunea tioloprivă. Inhibarea enzimelor tiolofore (succinatdehidrogenaza, piruvat oxidaza, etc.) și a .transportului de protoni conduce la dereglarea respirației celulare și a unor metabolisme intermediare. Compușii cu As sunt toxici și pentru capilare, ficat, SNC, sânge, iar pentru tegumente sunt iritanți și caustici, determinând ulcerații și pigmentare.

Au fost efectuate numeroase studii pentru a evalua interacțiunile dintre Se și As, evidențiindu-se efectul benefic al Se în cazul prezenței unor concentrații toxice de compuși cu As.

Huang et al (2009) au demonstrat în studiul lor pe celule stem de la șoarece că unii compuși anorganici ai As influențează expresia selenoproteinelor, în mod diferit pentru fiecare tip. Au fost folosite celule stem din subtipul ES CGR8, cultivate într-un mediu adecvat. Adaosul de arsenit (în doze mai mari de 0,5 μM) și de arsenat ( în doze mai mari de 2 μM) a dus la inhibarea proliferării celulare. Adaosul de selenit în doză de 0,5 μM a dus la creșterea semnificativă a proliferării celulare. În cazul prezenței în mediu a arsenitului sau a arsenatului s-a constatat o generare crescuta de ROS; prezența simultană a selenitului a dus la o scădere a ROS în celule. În cazul celulelor tratate cu srsenit sau arsenat s-a constatat o expresie crescută a factorului Nrf2 față de cultura martor; adăugarea de selenit a dus la o acumulare crescută a acestui factor în celulele expuse la As. Co-administrarea de selenit în mediul de cultură al celulelor expuse la arsenit sau arsenat a dus la o scădere a ratei apoptozei, apropiindu-se de nivelul corespunzător lotului martor. S-au determinat nivelurile ARNm pentru diferitele selenoproteine. În cazul celulelor tratate cu arsenit s-a constatat o reglare „up” a expresiei SelT, GPx1, GPx3, GPx4 și TrxR1 iar în cazul arsenatului a TrxR1, GPx1 și GPx4. În contrast cu această constatare, s-a constatat o reglare „down”, în cazul tratării cu ambii compuși ai As, pentru SelI, SelM, GPx2, SelK, SelS, Sep15, și SelH. În cazul co-admnistrării de selenit, s-a constatat o creștere ușoară a nivelului ARNm pentru selenoproteinele reglate „down”, atât în cazul arsenitului cât și al arsenatului. Selenitul a dus la o creștere a expresiei selenoproteinelor reglate „up” de către compușii arsenului.

Chattopadhyay et al (2003), în studiul lor pe șobolani femelă, au evaluat efectele coadministrării de selenit de Na împreună cu arsenitul de Na asupra funcțiilor aparatului reproducător. Au fost folosiți 54 de șobolani femelă, împărțiți în 3 grupuri: unul martor, unul care a primit doar arsenit de Na în apa de băut timp de 28 de zile (0,4 ppm/100g masă corp./zi) și un grup care a primit atât arsenit de Na cât și selenit de Na (0,6 mg/100g masă corp./zi). După cele 28 de zile, animalele au fost sacrificate și s-au recoltat unele organe, determinându-se și unii parametri biochimici. Șobolanii din grupul care a fost expus la arsenit, ca monoterapie, au înregistrat scăderi ale nivelului plasmatic pentru hormonului luteinizant (LH), FSH, estradiol, precum și ale activității GPx-azelor din uter și din ovar. La acest grup s-a observat deasemenea o scădere a masei uterine și ovariene, precum și acumularea de As în țesuturi. Grupul care a primit selenit de Na, coadministrat cu selenitul de Na a înregistrat modificări minime ale parametrilor menționați anterior, comparativ cu grupul de control. S-a concluzionat că admnistrarea de selenit de Na împreună cu arsenitul de Na are rol protector față de toxicitatea arseniului asupra aparatului reproducător; nu s-a evidențiat un rol protector al seleniului față de toxicitatea arseniului asupra altor organe.

Yang et al (2002) au derulat un studiu clinic intervențional într-o regiune din China – Mongolia Interioară, selectând drept subiecți fermieri din mai multe sate, de ambele sexe, care au fost expuși în ultimele două decenii la As, prin intermediul apei potabile. Voluntarii au fost împărțiți în 2 grupuri: un grup care a primit comprimate placebo și un grup care a primit comprimate conținând 100 μg Se-Met, sub formă de drojdie îmbogățită cu Se, timp de 6 luni. Subiecții selectați prezentau semne clinice de arsenim: hiperkeratoză, pigmentări sau depigmentări ale pielii, precum și un nivel ridicat de As în sânge, păr și unghii. De-a lungul perioadei de suplimentare, au fost colectate mostre de păr și unghii; deasemenea, s-au recoltat și probe de sânge, urmărindu-se anumiți parametri biochimici. La sfârșitul studiului s-a constatat că nivelul seric mediu al Se a crescut de la 0,13 la 0,186 μg/ml iat concentrația de Se din păr de la 0,431 la 0,502 μg/g pentru grupul ce a primit comprimate cu se, în timp ce la grupul placebo nu s-a observat nici o variație. În grupul ce a primit seleniu, nivelul seric al As a scăzut de la 0,051 la 0,015 μg/ml iar concentrația din păr de la 2,57 la 0,68 μg/g. S-a constatat deasemenea și o amelioarare semnificativă a semnelor clinice, în cazul subiecților din grupul ce a primit Se.

Cadmiul este unul dintre metalele cele mai toxice, fiind un toxic cumulativ. Se acumulează preferențial în ficat și rinichi. Este un toxic celular, acțiunea sa principală fiind cea tioloprivă, cu dereglarea respirației celulare și a unor metabolisme intermediare. Unele studii au sugerat că acțiunea toxică a Cd se manifestă și prin interferarea metabolismului unor oligoelemente esențiale, precum Zn.

Jihen et al (2008) au efectuat un studiu pe șobolani masculi pentru a evalua efectual coadministrării de Se și/sau Zn asupra toxicității Cd. Au fost constituite 5 grupuri, fiecare constând în 15 exemplare: I – grupul de control, nu a primit Cd; II – animalele au primit 200 ppm Cd sub formă de CdCl2, în apa de băut; III – a primit 200 ppm Cd + 500 ppm Zn (sub formă de ZnCl2); IV – 200 ppm Cd + 0,1 ppm Se (sub formă de selenit de Na); V – 200 ppm Cd +500 ppm Zn + 0,1 ppm Se. După cele 5 săptămâni, cât a durat studiul, animalele au fost sacrificate, recoltându-se de la fiecare animal ficatul și rinichii, pentru analize histopatologice și biochimice. Coadministrarea de Se (gr. IV) nu a influențat semnificativ acumularea Cd în rinichi și ficat, comparativ cu animalele din grupul care a primit doar Cd (gr. II). Administrarea simultană de Cd și Zn (gr. III) a dus la o acumulare crescută a Cd în ficat și rinichi, comparativ cu gr. II. Administrarea de Cd, Zn și Se a dus deasemenea la o acumulare crescută a Cd, comparativ cu gr. II, totuși mai redusă față de grupul II ( Cd+Zn). Deși coadmnistrarea de Zn, ca monoterape, sau Zn + Se a dus la creșterea acumulării Cd în țesuturi, analizele histopatologice au evidențiat un efect benefic al acestor 2 elemente asupra leziunilor induse de Cd, astfel: în cazul administrării de Cd+Zn+Se, leziunile tisulare au fost practic inexistente în ficat, cele de la nivel renal fiind relativ minore. Administrarea de Cd+Zn a dus la leziuni hepatice relativ mai puțin grave decât în cazul grupului care a primit doar Cd (gr.II), referitor la leziunile renale neobservându-se diferențe importante. Administrarea de Se și Cd s-a tradus prin leziuni hepatice c și renale de o mai mică gravitate dec în cazul gr. II. Mercurul este considerat un element toxic, fiind practic ubiquitar în mediu, dar în cantități infime. Prezintă importanța d.p.d.v. toxicologic atât mercurul ca atare, în starea de oxidare 0, datorită vaporilor săi, cât și unele săruri ale Hg+2, precum și compușii organomercurici.

Hg+2 este un toxic celular, având acțiune tioloprivă, în primul rând, cu inhibarea activității succinatdehidrogenazei, aminooxidazei, etc. Organul cel mai afectat este rinichiul, din cauza acumulării Hg+2 la acest nivel. Compușii organomercurici manifestă în special neurotoxicitate, fiind liposolubuli și volatili.

S-a sugerat că toxicitatea ionului metilHg+ este datorată afinitații crescute pentru seleniu, formând legături chimice stabile cu acesta. Țesuturile țintă ale acestui compus toxic sunt cele din SNC și sistemul neuroendocrin. Acest lucru se explică prin prezența unor selenoproteine/selenoenzime la acest nivel, cu rol important în fiziologia SNC. Din moment ce ionul metilHg+ are capacitatea de a inhiba ireversibil activitatea selenoenzimelor, neurotoxicitatea acestui compus depinde de raportul molar dintre Hg și Se din țesutul respectiv. Deoarece afinitatea Hg pentru Se este mult mai mare dec cea pentru sulf, un raport molar Hg:Se >1 se va traduce prin toxicitatea crescândă a Hg, în funcție de raport. Au fost efectuate mai multe studii care au evidențiat acțiunea protectoare a Se față de toxicitatea Hg, constatându-se o atenuare graduală a leziunilor tisulare și a modificărilor parametrilor biochimici induse de intoxicația cu Hg, odată cu scăderea raportului molar Hg:Se (Berry et Ralston, 2008).

PARTEA PERSONALĂ

CAPITOLUL VI

EVALUAREA EXPERIMENTALĂ A TOXICITĂȚII SELENITULUI DE SODIU

VI.1. Introducere

Seleniul este un microelement esențial pentru animale și oameni, dar ȋn doze mari, ȋn cazul expunerii acute sau cronice, poate avea efecte toxice grave (Reilly, 2006).

Unele dintre sǎrurile seleniului, precum selenatul de sodiu și selenitul de sodiu sunt utilizate pentru suplimentarea nutriției animalelor, ȋn vederea accelerǎrii creșterii și pentru prevenirea bolilor cauzate de carența de seleniu (Kamal, 1994).

Compușii seleniului sunt ȋn general ușor absorbiți din tractul gastrointestinal. Aparent absorbția nu este controlatǎ homeostatic, deoarece nu au fost observate diferențe semnificative privind absorbția ȋntre șobolanii ce prezentau carențǎ de seleniu și cei ce nu prezentau carența și cǎrora li s-au administrat doze toxice de seleniu (Brown et al, 1972, citat de Jacevic et al, 2011).

Activitatea biologicǎ și toxicitatea poate varia semnificativ ȋntre diferiții compuși ai seleniului. Au fost ȋntreprinse numeroase studii ȋn acest sens, dar rezultatele au fost contradictorii ȋn unele cazuri. Ȋn general compușii organici sunt absorbiți mult mai ușor decȃt ce anorganici, ȋnsǎ toxicitatea compușilor anorganici este de obicei superioarǎ (Reilly, 2006; Hatfield et al, 2006).

Ȋn cazul administrǎrii unor doze mari, compușii seleniului sunt rapid distribuiți ȋn organele principale. La nivel hepatic, mulți compuși ai seleniului sunt biotransformați ȋn metaboliți excretabili. Metaboliții ce pot fi identificați ȋn urinǎ includ glucide ce conțin seleniu iar ȋn cazul aerului expirat – dimetilseleniura. Biotransformarea reprezintǎ aparent mecanismul major prin care este menținutǎ homeostazia seleniului ȋn timpul expunerii excesive la seleniu, existȃnd deasemenea o fazǎ rapidǎ, precum și o fazǎ mai lentǎ de eliminare. Timpul de ȋnjumǎtǎțire ȋn cazul fazei rapide este de 1-3 zile, depinzȃnd de compusul cu seleniu, iar ȋn cazul fazei lente, timpul de ȋnjumǎtǎțire este de 30-110 zile (Hogberg et Alexander, 2007).

Toxicitatea relativǎ ȋn cazul administrǎrii pe cale oralǎ a seleniului depinde de solubilitatea compușilor, seleniurile puțin solubile și seleniul elemental fiind mult mai puțin toxici ȋn comparație cu sǎrurile solubile, precum selenații, seleniții și seleniul organic (Hall, 2012).

DL50 variazǎ ȋntre 1,5 și 6 mg/kg corp pentru majoritatea compușilor seleniului și a speciilor de animale. Sistemul nervos central (SNC) reprezintǎ organul țintǎ ȋn cazul acestor doze, dar ficatul, inima și plǎmȃnii pot fi deasemenea afectate. Au fost descrise cazuri de intoxicație acutǎ și la oameni, unele fiind fatale. Ȋn cazul oamenilor au predominat efectele la nivel gastrointestinal și la nivelul SNC (Hogberg et Alexander, 2007).

Ȋn cazul aportului excesiv de seleniu au fost observate tulburǎri ale funcției de reproducere ȋn cazul mai multor specii. Disfuncționalitǎți ale funcției de reproducere au fost observate chiar fǎrǎ apariția celorlalte semne specifice intoxicației cu seleniu, la doze de 5-10 ppm, ȋnsǎ dovezile experimentale directe lipsesc. O ratǎ scǎzutǎ a concepției și o ratǎ crescutǎ a resorbției fetale la oi, vaci și cai au fost observate dupǎ ce animalele au fost hrǎnite cu furaje naturale conținȃnd 20-50 mg Se/kg de hranǎ. Atȃt ȋn cazul șobolanilor expuși la niveluri de seleniu de 3 ppm, sub formǎ de grȃu ȋmbogǎțit ȋn seleniu, cȃt și ȋn cazul celor expuși la niveluri de seleniu de 3 ppm, ȋn apa de bǎut, s-a observat o ratǎ scǎzutǎ a concepției. (Hall, 2012).

Atȃt carența, cȃt și deficitul de seleniu afecteazǎ negativ spermatogeneza, motilitatea și viabilitatea spermatozoizilor, ȋn cadrul modelelor experimentale. Ȋn cazul unor specii, seleniul se acumuleazǎ ȋn fetus, ȋn detrimentul femelei gestante. Acumularea seleniului ȋn fetuși poate avea drept consecințǎ avortul (Hall, 2012). S-a observat cǎ ȋn cazul vitelor ce aveau concentrații de seleniu ȋn lichidele biologice similare cu cele observate ȋn cadrul seleniozei cronice și concentrații hepatice fetale de seleniu caracteristice toxicozei, rata avorturilor a fost de 7 % (Yaeger et al, 2008).

Deși existǎ suficiente date care sǎ demonstreze efectul teratogen al seleniului la diferite specii de pǎsǎri, ȋn cazul cailor, oilor și al altor specii existǎ puține studii efectuate specific ȋn acest scop, deși existǎ studii de caz; totuși, este posibil ca plantele toxice consumate sǎ fi jucat un rol important. Totuși, la rumegǎtoare, efectele nocive asupra reproducției cauzate de seleniul ȋn exces sunt datorate interferențelor la nivelul absorbției și retenției cuprului, ducȃnd la carențǎ de cupru. La pǎsǎri, selenioza are efecte majore asupra procesului de reproducție. Malformațiile embrionare și moartea embrionilor reprezintǎ sechele frecvente observate ȋn cazul intoxicației cu seleniu (Hall, 2012).

Nu au fost ȋntreprinse studii pȃnǎ ȋn prezent ȋn vederea stabilirii exacte a diferențelor privinf farmacocinetica seleniului ȋntre diferite specii. Absorbția, distribuția și excreția sunt considerate a fi relativ similare la oameni și alte specii, iar expunerea cronicǎ la seleniu a oamenilor și diferitelor specii animale se manifestǎ prin efecte similare la nivel dermic, endocrin și neurologic (Agency for toxic substances and disease registry, 2003).

Ȋn cazul injectǎrii intraperitoneale ȋn doze de 3,25 – 3,5 mg Se/kg corp la șobolani, 75 % dintre animale au decedat ȋn interval de 2 zile. Ȋn cadrul aceluiași experiment, dozele corespunzȃnd selenatului de sodiu au fost de 5,5 – 5,75 mg Se/kg iar ȋn cazul selenocisteinei, de 4 mg Se/kg corp (Wilber, 1980). Alți compuși ai seleniului, precum sulfura de seleniu, avȃnd DL50 de 138 mg/kg corp la șobolan ȋn cazul administrǎrii orale, sau dimetilseleniura, cu DL50 la șobolani de 1600 mg/kg corp la șobolan, ȋn cazul administrǎrii intraperitoneale, sunt mai puțin toxici. Animalele cǎrora li se administreazǎ doze letale dezvoltǎ simptome precum respirație cu miros de usturoi și iritabilitate, urmate de somnolențǎ. Poate apare dispneea, apoi opistotonusul; apar spasme tetanice, apoi spasme clonice, ȋnainte de moartea animalelor (Hogberg et Alexander, 2007).

Toxicitatea seleniului a fost demonstratǎ experimental ȋncǎ de la ȋnceputul secolului XX. Ȋn același timp, au fost raportate cazuri de intoxicație cu seleniu la animale ȋn zonele selenifere. Manifestǎrile observate ȋn cazul vitelor care au consumat plante conținȃnd aproximativ 25 ppm Se timp de cȃteva zile sau sǎptǎmȃni au fost denumite la ȋnceput „boala alcalinǎ”. Acesta a fost primul studiu bine documentat ce a descris intoxicația cu seleniu din surse naturale la mamifere. Alte seturi de experimente efectuate peșobolani, ȋntr-o zonǎ seleniferǎ din Dakota de Sud, SUA, ȋn cadrul cǎrora șobolanii au fost hrǎniți cu nutrețuri provenind din acea zonǎ seleniferǎ, au demonstrat cǎ aceste nutrețuri au fost extrem de toxice. Ȋn cadrul acestor experimente s-a demonstrat deasemenea cǎ majoritatea „componentei toxice” din aceste nutrețuri este asociatǎ cu fracțiunile proteice, seleniul putȃnd fi ȋndepǎrtat din hidrolizatul proteic; hidrolizatul proteic din care a fost extras seleniul nu a avut efect toxic asupra șobolanilor. Majoritatea seleniului din plante se gǎsește sub formǎ de selenoaminoacizi, precum metilselenocisteina și selenometionina. Totuși, au existat nelǎmuriri ȋn legǎturǎ cu faptul cǎ exista posibilitatea ca toxicitatea plantelor respective sǎ se fi datorat și altor factori, ȋn afarǎ de seleniu. Drept urmare, a fost ȋntreprins un alt experiment, ȋn cadrul cǎruia dieta bazalǎ a șobolanilor a fost suplimentatǎ cu selenit, indicȃnd faptul cǎ seleniul a fost singurul factor cauzal al toxicitǎții la șobolani și prin deducție, agentul etiologic al „bolii alcaline” la vite. Nivelul ridicat al seleniului ȋn plante a fost o consecințǎ a nivelului crescut de seleniu ȋn solul pe care au fost crescute. Douǎ tipuri majore de toxicitate a seleniului datoratǎ factorilor de mediu au fost descrise: 1) toxicitatea seleniului ce se regǎsește ȋn mod natural ȋn elementele de mediu (determinatǎ ȋn principal de conținutul de seleniu din sol sau sedimente) și 2) toxicitatea seleniului datoratǎ activitǎților antropice (determinatǎ de eliberarea seleniului ȋn elementele de mediu, ȋn primul rȃnd ȋn sol, prin fertilizarea solului cu ȋngrǎșǎminte conținȃnd seleniu sau prin suplimentarea alimentației animalelor). Ȋn ultima perioadǎ, un al treilea tip de toxicitate a seleniului a fost observatǎ – consumul unor suplimente nutritive sau consumul de hranǎ conținȃnd niveluri inadecvate de seleniu (Nogueira et Rocha, 2011).

Existǎ biomarkeri ce pot fi utilizați pentru evaluarea expunerii la seleniu, atȃt ȋn cazul expunerii la niveluri scǎzute, cȃt și ȋn cazul expunerii laniveluri crescute. Seleniul poate fi detectat ȋn sȃnge, fecale, urinǎ și fanere. Atȃt carența de seleniu, cȃt și expunerea la niveluri crescute de seleniu sunt asociate cu anumite tulburǎri. Ȋn scopul efectuǎrii de comparații, pot fi determinate concentrațiile medii ale seleniului ȋn sȃngele total, elementele figurate, urinǎ, pǎr, unghii și placentǎ (Agency for toxic substances and disease registry, 2003).

Biomarkerii convenționali pentru evaluarea statusului seleniului ȋn organism, precum concentrațiile tisulare ale seleniului și modificǎri ale morfologiei unghiilor au o specificitate și sensibilitate scǎzutǎ. Biomarkerii moleculari au un potențial superior pentru evaluarea efectelor fiziologice asociate aportului crescut de seleniu, ȋnsǎ pȃnǎ ȋn prezent studiile privind efectele aportului excesiv de seleniu asupra transcripției nu au constatat existența unor biomarkeri a cǎror expresie sǎ fie corelatǎ axact cu statusul seleniului (Raines et Sunde, 2011).

Studiile efectuate pe șobolani au evidențiat existența unui numǎr de 14 pȃnǎ la 242 de gene a cǎror expresie a fost influențatǎ de aportul de seleniu de 1 μg/g, ȋn comparație cu aportul deficitar de seleniu, ȋnsǎ singurele gene a cǎror expresie a fost modulatǎ ȋn manierǎ consecventǎ au fost cele ale selenoproteinelor, sugerȃnd faptul cǎ efectele specifice ale seleniului asupra expresiei au fost cauzate de deficitul de seleniu și nu de aportul excedentar de seleniu. Studiile efectuate pe diverse linii celulare și țesuturi canceroase ȋn scopul evidențierii efectelor seleniului asupra transcripției s-au concretizat ȋn rezultate diferite, cu puține similaritǎți ȋntre studii. Lipsa de corelație ȋntre nivelurile expresiei diferitelor gene ȋn funcție de aportul crescut de seleniu sugereazǎ faptul cǎ utilizarea acestor gene ca biomarkeri specifici ai statusului seleniului nu este utilǎ (Raines et Sunde, 2011).

Selenitul de sodiu are un efect cataractogen la șobolanii tineri. Șobolanii ȋn vȃrstǎ de 10 zile cǎrora li s-a injectat subcutanat o dozǎ unicǎ de 10-40 μmol/kg corp de selenit de sodiu au dezvoltat cataractǎ la nivelul ochilor. Nu au fost observate leziuni la nivel ocular ȋn cazul șobolanilor ȋn vȃrstǎ de 2 luni cǎrora li s-a administrat subcutanat o dozǎ unicǎ de 20 μmol/kg corp de selenit de sodiu (Kamal, 1994).

Scopul acestui studiu a fost de a evalua și compara toxicitatea a douǎ doze de seleniu, administrat prin gavaj sub formǎ de selenit de sodiu, la șobolani, prin determinarea unor parametri biochimici și hematologici și prin efectuarea de examene histologice.

VI.2. Materiale și metode

Toate procedeele experimentale folosite pe animale ȋn acest studiu au fost ȋn concordanțǎ cu reglementǎrile etice. Studiul a primit avizul etic din partea Comisiei de etica cercetǎrii din cadrul UMF `Grigore T. Popa` Iași.

În cadrul experimentului au fost folosiți 15 șobolani masculi rasa Wistar, cu vârsta de aproximativ 8 luni (sursa de proveniențǎ – Institutul Cantacuzino București – Stațiunea Bǎneasa). Șobolanii au fost aclimatizați timp de 11 zile. În timpul aclimatizării și al perioadei experimentale șobolanii au primit hrană standard și apă, ad libitum și au fost cazați în cuști colective (câte o cușcă pentru fiecare lot) în condiții ambientale relativ constante, temperatura fiind de 18-25ș C. După aclimatizare șobolanii au fost cântăriți (masa corporală inițială 325-450 g) și au fost alocați aleatoriu în unul dintre cele 3 loturi (n=5).

Seleniul (Se+4) a fost administrat sub formǎ de soluții, prin gavaj. Soluțiile au fost preparate din selenit de sodiu (Sigma Aldrich, p.a.) și apǎ purificatǎ.

Loturile de animale, corespunzând diferitelor tratamente, au fost:

– control (apă purificată, în zilele 1-4);

– Se1 (Se+4 – 1 mg/kg corp zilnic, în zilele 1-10);

– Se3 (Se+4 – 3 mg/kg corp zilnic, în zilele 1-10);

Animalele au fost recântǎrite în ziua a 11-a pentru a evalua creșterea/scǎderea ȋn greutate, apoi au fost sacrificate. Pentru anestezie, animalele au fost injectate i.p cu ketaminǎ (100 mg/kg corp, sol. inj. – uz veterinar). Dupǎ instalarea efectului anestezicului animalele au fost imobilizate, apoi a fost deschis toracele și o parte din zona abdominalǎ.

Sângele a fost recoltat ȋn vacutainere (pentru biochimie și pentru hematologie), prin puncție cardiacǎ, ȋn vederea determinǎrii parametrilor biochimici și hematologici.

De la fiecare animal au fost recoltați rinichii si un fragment de ficat, organele fiind fixate ȋn formol tamponat. Dupǎ fixare, piesele au fost prelucrate la parafinǎ. Secțiunile obținute au fost colorate cu hematoxilinǎ – eozinǎ, apoi au fost analizate cu un microscop Olympus CX41 (obiective 10X, 20X, 40X) și fotografiate cu o camerǎ digitalǎ integratǎ Olympus DP21.

Sângele din vacutainerele pentru biochimie a fost centrifugat dupǎ coagulare timp de cinci minute la 3500 rotații/minut, pentru obținerea serului. Parametrii biochimici au fost determinați din ser utilizând un analizor automat de biochimie RX Imola® și kituri ELITech® pentru determinarea fiecǎrui parametru biochimic. Pentru evaluarea integrității celulelor hepatice prin măsurarea indirectă a permeabilității membranei hepatocitare au fost determinate activitățile enzimatice ale alanin-aminotransferazei (ALT) și aspartat-aminotransferazei (AST), precum și nivelul seric al fierului. Pentru investigarea activităților hepatice au fost determinate nivelurile serice ale bilirubinei totale, bilirubinei directe, colesterolului total, HDL-colesterolului, LDL-colesterolului și activitatea gamma-glutamil-transpeptidazei (GGT). Pentru evaluarea funcției renale au fost determinate nivelurile serice ale ureei, creatininei și acidului uric.

Principiul determinǎrii activitǎților ALT și AST la analizorul automat s-a bazat pe mǎsurarea scǎderii absorbanței la 340 nm, invers proporționalǎ cu activitatea enzimelor, datoratǎ consumului de NADH și formǎrii NAD+; ALT catalizează transferul grupării amino de pe un aminoacid (alanină) pe alt aminoacid (alfa-oxoglutarat) iar AST catalizeazǎ transferul grupǎrii amino de pe acid aspartic pe α-oxoglutarat, ambele reacții consumând NADH. Dozarea fierului s-a bazat pe o metodǎ colorimetricǎ cu ferozinǎ; ionul feric din ser este disociat de pe transferinǎ ȋn mediu acid și redus simultan la ion feros, care reacționeazǎ cu ferozina, formând un compus colorat cu absorbanțǎ maximǎ la 546 nm; absorbanța este direct proporționalǎ cu nivelul seric al fierului. Dozarea bilirubinei totale s-a bazat pe metoda colorimetricǎ Jendrassik-Grof: ȋn prezența cafeinei bilirubina este eliberată de pe albumină și reacționează cu acidul sulfanilic diazotat cu formarea unui compus albastru (absorbanța maximǎ la 578 nm) a cărui intensitate de culoare este direct proporțională cu bilirubina totală. eterminarea bilirubinei directe (conjugate) se bazează pe capacitatea bilirubinei directe de a reacționa direct cu acidul sulfanilic și reactivul de diazotare (fără accelerator – cafeina); se formează un compus colorat în roșu (absorbanța maximǎ la 546 nm), intensitatea culorii fiind direct proporțională cu nivelul bilirubinei directe în ser. Colesterolul total s-a determinat printr-o metodǎ enzimaticǎ end-point, principiul fiind urmǎtorul: esterii colesterolului sunt hidrolizați sub acțiunea colesterol esterazei, formându-se colesterol și acizi grași; colesterol oxidaza acționeazǎ asupra colesterolului format, rezultând colestonǎ și peroxid de hidrogen; produsul final de reacție este chinonimina, formată sub acțiunea preoxidazei asupra peroxidului de hidrogen, în prezența 4-aminoantipirinei și a fenolului. Intensitatea culorii chinoniminei formate (determinarea absorbanței se face la 600 nm) este direct proporțională cu nivelul colesterolului total din probă. HDL-colesterolul s-a determinat direct, fǎrǎ pretratarea probei; determinarea constǎ în douǎ reacții distincte: 1) eliminarea din particulele lipoproteice a chilomicronilor, VLDL, LDL sub acțiunea colesterolesterazei, colesteroloxidazei și a catalazei, cu formare de peroxid de hidrogen și O2 și 2) măsurarea specifică a colesterolului, după eliberarea lui din particulele lipoproteice sub acțiunea unui detergent; primele douǎ reacții enzimatice sunt identice cu cele de la determinarea colesterolului total, dar asupra peroxidului de hidrogen acționează peroxidaza, cu formare de compus colorat care apoi este măsurat, absorbanța fiind direct proporționalǎ cu nivelul HDL-colesterolului din probǎ; în cazul determinǎrii HDL-colesterolului acțiunea catalazei este inhibată cu azidǎ de sodiu. Principiul metodei utilizate pentru dozarea LDL-colesterolului la anlizor a fost similar celui pentru determinarea HDL-colesterolului. Reacția se desfășoară în douǎ etape succesive: 1) eliminarea chilomicronilor, VLDL, HDL prin acțiunea colesterolesterazei, a colesteroloxidazei și catalazei și 2) măsurarea specifică a LDL-colesterolului după eliberarea lui din particulele lipoproteice sub acțiunea unui detergent; ȋn etapa a doua a reacției acțiunea catalazei este inhibată de către azida de sodiu. Principiul metodei utilizate pentru determinarea GGT constǎ ȋn convertirea 2-γ-glutamyl-3-carboxi-4-nitroanilidei de cǎtre GGT din probǎ, ȋn prezența glicilglicinei, cu formare de p-nitroanilinǎ, un compus colorat în galben; viteza creșterii absorbanței la 405 nm este direct proporționalǎ cu activitatea GGT din probă. Ureea a fost determinatǎ prin metoda cineticǎ enzimaticǎ cu ureazǎ: ureea este hidrolizată în prezența apei de către urează la ion amoniu și CO2 ; amoniul produs reacționeazǎ cu -cetoglutaratul și NAHD în prezența glutamat-dehidrogenazei, cu formare de glutamat și NAD+; modificarea absorbanței (la 340 nm) datorită formării de NAD+ în locul NAHD-ului consumat este proporțională cu nivelul de uree din ser. Determinarea acidului uric s-a bazat pe o metodǎ colorimetricǎ enzimaticǎ: acidul uric este convertit de către uricază la alantoină și peroxid de hidrogen; peroxidul de hidrogen, sub influența catalitică a peroxidazei, formează cu 4-aminofenazona un compus colorat în roșu violet, chinonimina, intensitatea culorii (mǎsuratǎ la 550 nm) fiind direct proporțională cu nivelul de acid uric. Creatinina a fost determinatǎ printr-o metodǎ colorimetricǎ cineticǎ, dupǎ urmǎtorul principiu: creatinina formeazǎ cu acidul picric ȋn mediu alcalin un compus colorat a cărui rată de formare este măsurată, fiind direct proporțională cu nivelul de creatininǎ din ser.

Sângele recoltat ȋn vacutainerele pentru hematologie a fost folosit pentru determinarea hemoleucogramei complete, utilizând un analizor automat de hematologie SySmex® XT 1800. Ȋn cadrul hemoleucogramei au fost determinați o serie de parametri hematologici, incluzând numǎrul total de globule albe, numǎrul de eritrocite, hemoglobina (concentrația de hemoglobinǎ), hematocritul, hemoglobina eritrocitarǎ medie, concentrația hemoglobinei eritrocitare medii.

Valorile obținute au fost prelucrate statistic utilizând Microsoft Excel 2007 cu Data Analysis add-on. Valorile obținute pentru parametrii investigați au fost exprimate ca media ± eroarea standard a mediei.

VI.3. Rezultate

Ȋn Figura 6.1 sunt redate creșterile/scǎderile relative ale masei corporale medii pentru șobolanii din cele patru loturi, la sfȃrșitul perioadei experimentale (ȋnainte de sacrificare), ȋn comparație cu ȋnceputul perioadei experimentale.

Figura 6.1. Evoluția masei corporale

Figura 6.2. Activitatea ALT. Barele de eroare reprezintǎ eroarea standard a mediei;

* = diferit semnificativ comparativ cu lotul Control

Activitǎțile serice ale transaminazelor sunt redate ȋn fig. 6.2, respectiv 6.3. Nivelurile serice ale fierului sunt redate ȋn fig. 6.4.

Nivelurile serice ale bilirubinei totale și bilirubinei directe sunt prezentate ȋn fig. 6.5 și fig. 6.6. Activitatea sericǎ a gamma-glutamil transpeptidazei este redatǎ ȋn fig. 6.7.

Concentrațiile serice ale colesterolului total, HDL-colesterolului și LDL-colesterolului sunt redate ȋn fig. 6.8, 6.9 și 6.10.

Concentrațiile serice ale ureei, creatininei și acidului uric sunt redate ȋn fig. 6.11, 6.12 și 6.13.

Numǎrul de leucocite determinat ȋn cazul celor trei loturi de studiu este prezentat ȋn fig. 6.14. Numǎrul de eritrocite, concentrația hemoglobinei și hematocritul sunt prezentate ȋn fig. 6.15, 6.16, respectiv 6.17. Valorile hemoglobinei eritrocitare medii și concentrația hemoglobinei eritrocitare medii sunt redate ȋn fig. 6.18, respectiv 6.19.

Figura 6.3. Activitatea AST. Barele de eroare reprezintǎ eroarea standard a mediei;

* = diferit semnificativ comparativ cu lotul Control

Figura 6.4. Nivelul seric al fierului. Barele de eroare reprezintǎ eroarea standard a mediei;

* = diferit semnificativ comparativ cu lotul Control

Figura 6.5. Nivelul seric al bilirubinei totale. Barele de eroare reprezintǎ eroarea standard a mediei;

* = diferit semnificativ comparativ cu lotul Control

Figura 6.6. Nivelul seric al bilirubinei directe. Barele de eroare reprezintǎ eroarea standard a mediei;

* = diferit semnificativ comparativ cu lotul Control

Figura 6.7. Activitatea sericǎ a gamma-glutamil transpeptidazei. Barele de eroare reprezintǎ eroarea standard a mediei; * = diferit semnificativ comparativ cu lotul Control

Figura 6.8. Nivelul seric al colesterolului total. Barele de eroare reprezintǎ eroarea standard a mediei; * = diferit semnificativ comparativ cu lotul Control

Figura 6.9. Nivelul seric al HDL-colesterolului. Barele de eroare reprezintǎ eroarea standard a mediei; * = diferit semnificativ comparativ cu lotul Control

Figura 6.10. Nivelul seric al LDL colesterolului. Barele de eroare reprezintǎ eroarea standard a mediei; * = diferit semnificativ comparativ cu lotul Control

Figura 6.11. Nivelul seric al ureei. Barele de eroare reprezintǎ eroarea standard a mediei; * = diferit semnificativ comparativ cu lotul Control

Figura 6.12. Nivelul seric al creatininei. Barele de eroare reprezintǎ eroarea standard a mediei; * = diferit semnificativ comparativ cu lotul Control

Figura 6.13. Nivelul seric al acidului uric. Barele de eroare reprezintǎ eroarea standard a mediei; * = diferit semnificativ comparativ cu lotul Control

Figura 6.14. Numǎrul de leucocite (WBC). Barele de eroare reprezintǎ eroarea standard a mediei; * = diferit semnificativ comparativ cu lotul Control

Figura 6.15. Numǎrul de eritrocite (RBC). Barele de eroare reprezintǎ eroarea standard a mediei; * = diferit semnificativ comparativ cu lotul Control

Figura 6.16. Concentrația hemoglobinei (HGB). Barele de eroare reprezintǎ eroarea standard a mediei; * = diferit semnificativ comparativ cu lotul Control

Figura 6.17. Hematocritul (HCT). Barele de eroare reprezintǎ eroarea standard a mediei; * = diferit semnificativ comparativ cu lotul Control

Figura 6.18. Hemoglobina eritrocitarǎ medie (HEM). Barele de eroare reprezintǎ eroarea standard a mediei; * = diferit semnificativ comparativ cu lotul Control

Figura 6.19. Concentrația hemoglobinei eritrocitare medii (CHEM). Barele de eroare reprezintǎ eroarea standard a mediei; * = diferit semnificativ comparativ cu lotul Control

Ȋn fig. 6.20 și fig. 6.21 sunt redate secțiuni hepatice din cadrul lotului de control, iar ȋn fig. 6.22 o secțiune renalǎ din cadrul aceluiași lot.

Figura 6.20 Lotul de control – ficat Figura 6.21. Lotul de control – ficat

Figura 6.22. Lotul de control – rinichi

Ȋn fig. 6.23 și fig. 6.24 sun redate secțiuni hepatice din cadrul lotului Se1 iar ȋn fig. 6.25 și fig. 6.26 secțiuni hepatice din cadrul lotului Se3.

Ȋn fig. 6.27 și fig. 6.28 sunt redate secțiuni renale de la șobolani din lotul Se1 iar ȋn fig. 6.29 secțiuni renale din cadrul lotului Se3.

Ȋn tabelul 6.I și tabelul 6.II sunt cuantificate leziunile hepatice din cadrul lotului Se1, respectiv Se3.

Fig. 6.23. Secțiuni hepatice din cadrul lotului Se1. A. Hepatocite cu degenerare hidropicǎ ȋn stadii incipiente; aspect intracitoplasmatic granular; o celulǎ prezentȃnd corpi apoptotici; cellule intens acidofile. B. Degenerare hidropicǎ intensǎ; vacuole ușor colorate ce nu afecteazǎ poziția nucleului pot fi observate ȋn citoplasmǎ; venula din spațiul portal este ectaziatǎ, cu edem perivascular (colorație HE; A – x 400; B – x 200)

Fig. 6.24. Secțiuni hepatice din cadrul lotului Se1. A , B. Degenerare hidropicǎ intensǎ; capilare ce sunt dificil de observant; cellule acidofile cu nuclei picnotici (colorație HE; A,B – x 200)

Fig. 6.25. Secțiuni hepatice din cadrul lotului Se3. Degenerare hidropicǎ intensǎ; halou perinuclear; ectazia venulelor și edem perivascular (A, B). Numǎr mare de celule ovale ȋn spațiul portal (A) și ȋn spațiul intralobular (B); (colorație HE; A,B – x 400)

Fig. 6.26. Secțiuni hepatice din cadrul lotului Se3. Zone cu degenerare hidropicǎ ce alterneazǎ cu zone de necrozǎ și grupuri de cellule intens acidofile cu nuclei picnotici (colorație HE; A – x 100; B – x 200)

Fig. 6.27. Secțiuni de rinichi din lotul Se1. A. Tubi contorți proximali cu degenerare hidropicǎ; lumen foarte ȋngust; tub contort distal cu epiteliu atrofiat; congestive ușoarǎ; corpuscul Malpighi modificat; B. Ectazia tubilor colectori din zona medularǎ; congestive (colorație HE; A,B – x 200)

Fig. 6.28. Secțiuni de rinichi din lotul Se1 A. Celule intens acidofile cu nuclei picnotici dispuse ȋn grupuri de mǎrimi variabile, ȋn zona corticalǎ. B. Degenerare hidropicǎ și cellule desprinse ȋn lumenul tubilor contorți proximali. C. Cilindri hialini ȋn lumenul tubilor contorți proximali. D. Congestie ȋn medulla renalǎ (colorație HE; A, D – x 100; B,C – x 400)

Tabelul 6.I. Leziunile hepatice observate ȋn lotul Se1

Fig. 6.29. Secțiuni de rinichi din lotul Se3. A. Ectazie vascularǎ și congestie ȋn zona corticalǎ; B. Degenerare hidropicǎ intensǎ și cilindri hialini; C. Atrofia tubilor contorți distali și a tubilor contorți proximali, cu degenerare hidropicǎ intensǎ; D. Celule implicate probabil ȋn regenerarea rinichiului (colorație HE; A – x 60; B – x 400; C – x 100; D – x 400)

Tabelul 6.II. Leziunile hepatice observate ȋn lotul Se3

VI.4. Discuții

Administrarea de selenit de sodiu a influențat rata de creștere a masei corporale (fig. 6.1). Ȋn cazul lotului Se1 rata medie de creștere a masei corporale a fost mai redusǎ ȋn comparație cu lotul de control, ȋn timp ce ȋn cazul lotului Se3 a fost observatǎ chiar o scǎdere a masei corporale. Rezultatele altor studii au demonstrat deasemenea cǎ seleniul, sub formǎ de selenit sau alți compuși, pot reduce rata de creștere a masei corporale. Unele organizații și cercetători individuali consideră că inhibarea creșterii este cel mai bun indicator pentru evaluarea efectelor toxice ale seleniului (Orskov et Flyvbjerg, 2000; Jia et al, 2005). La niveluri de 4 și 5 mg de seleniu ca selenit / kg de alimente, o scădere semnificativă a creșterii în greutate a fost observată la șobolani, în timp ce la concentrații similare de seleniu ca nano-Se scăderea a fost aproape nesemnificativǎ (Jia et al, 2005). Selenitul a suprimat creșterea la șoarece, ȋn cazul dozelor orale zilnice de 2,4 și 6 mg seleniu / kg corp timp de 12 sau 15 zile în timp ce nano-Se se pare că nu a interferat cu rata de creștere normală, la aceleași doze (Zhang et al, 2005 ). Interesant, chiar și la doze mai mari administrate pentru o perioadă mai lungă de timp selenitul a produs numai întârzierea creșterii sau stagnarea (Zhang et al, 2005), în comparație cu studiul de față, caz ȋn care, la doze de 3 mg seleniu / kg corp timp de 10 zile a fost observatǎ chiar o pierdere în greutate, față de greutatea corporală inițială. Totuși, este posibil ca această incoerență se poate datora faptului că la ȋn cadrul prezentului experiment au fost folosiți șobolani, nu șoareci iar sensibilitatea celor două specii la acest compus poate fi diferită.

Selenitul de sodiu a determinat o creștere semnificativǎ a activitǎții serice a transaminazelor, proporționalǎ cu doza (Control < Se1 < Se3) (fig. 6.2, fig. 6.3). Aceste activitǎți crescute ale transaminazelor, ȋn cazul acestor valori, pot sugera existența unui proces incipient de necrozǎ la nivel hepatic. Ȋn cadrul altui studiu, dozele mari de selenit de sodiu ȋncorporate ȋn hranǎ au determinat deasemenea o creștere a activitǎții AST la șobolani; aceastǎ modificare s-a corelat satisfǎcǎtor cu modificǎrile histopatologice, ȋn ficat fiind observatǎ steatozǎ și necrozǎ (Jacobs et Forst, 1981). La doze de 4 și 5 mg seleniu sub formǎ de selenit de sodiu / kg de hranǎ o creștere moderatǎ a activitǎților serice ale AST și ALT a fost observatǎ la șobolanii masculi (Jia et al, 2005).

Selenitul a determinat o creștere a nivelurilor serice ale fierului; ȋn cadrul prezentului studiu aceastǎ modificare poate fi explicatǎ prin eliberarea fierului din celulele hepatice și renale afectate și din eritrocite. Ȋn opoziție cu aceste rezultate, dozele de 1 mg seleniu sub formǎ de selenit /kg corp, administrate pe cale oralǎ timp de 10 zile, au dus la o scǎdere a fierului seric la oaie (Kojouri et al, 2011). Totuși, baza de comparație nu este ȋn totalitate validǎ deoarece experimentul a fost efectuat pe altǎ specie.

Nivelurile serice ale bilirubinei totale și directe au fost crescute ȋntr-o manierǎ dependentǎ de dozǎ (Control < Se1 < Se3), sugerȃnd afectarea hepaticǎ și colestaza.

Activitatea GGT a fost crescutǎ doar ȋn cazul lotului Se3, ȋn comparație cu lotul de control. Activitatea GGT reprezintǎ un marker specific pentru leziunile de la nivelul canaliculilor biliari (Leonard et al, 1984), dar poate sugera și alte tipuri de leziuni, ȋn anumite condiții. Ȋn cadrul prezentului experiment, creșterea activitǎții GGT se coreleazǎ cu creșterea nivelurilor bilirubinei totale și directe, sugerȃnd existența unui fenomen de colestazǎ.

Nivelurile serice ale colesterolului total, HDL-colesterolului și LDL-colesterolului au fost crescute ȋn cazul loturilor Se1 și Se3, comparativ cu lotul de control. Aceste modificǎri se coreleazǎ cu cele ale altor parametri biochimici, sugerȃnd existența unui proces de colestazǎ și a leziunilor la nivelul parenchimului hepatic. Ȋn cadrul unui studiu anterior a fost demonstrat faptul cǎ administrarea de selenit de sodiu crește colesterolul total la șobolani (Schroeder et Mitchener, 1971).

Nivelurile serice ale ureei, creatininei și acidului uric pot fi utilizate ca markeri pentru evaluarea funcției renale. Ȋn cadrul acestui studiu selenitul de sodiu nu a determinat aparent nici o modificare semnificativǎ și coerentǎ a acestor parametri.

Administrarea de selenit de sodiu a dus la o scǎdere a numǎrului de leucocite. Efectul selenitului asupra numǎrului de leucocite este dependent de dozǎ, perioada de expunere/administrare și de specie. Alte studii ȋntreprinse ȋn aceastǎ direcție au avut deseori rezultate contradictorii. La doze ȋntre 0,5 și 2 mg/kg corp timp de 15 zile, administrare intraperitoneal, selenitul a redus semnificativ numǎrul de leucocite la șoareci, ȋntr-o manierǎ dependentǎ de dozǎ (Al-Fartosi, 2008). Ȋn cadrul altui studiu, selenitul a crescut ușor numǎrul de leucocite la șoareci (Reddy et al, 2013). Ȋn cazul administrǎrii pentru o lungǎ perioadǎ de timp, selenitul a redus numǎrul de leucocite la oaie, ȋn timpul gestației (Pisek at al, 2008). La doze de 1 mg Se/kg corp pe cale oralǎ, sub formǎ de selenit de sodiu, timp de 10 zile, numǎrul de leucocite a crescut ușor, la oi (Sadeghian et al, 2012).

Atunci cȃnd seleniul este administrat la doze mai mari decȃt necesarul nutrițional, dar mai mici decȃt cele toxice, nu afecteazǎ numǎrul de leucocite sau ȋl crește ȋntr-o mǎsurǎ foarte micǎ. Ȋn acest caz, o posibilǎ explicație ar putea fi legatǎ de rolul seleniului ca antioxidant și efectul sǎu protector ȋmpotriva leziunilor provocate de stressul oxidativ (Sadeghian et al, 2012).

Selenitul de sodiu a redus numǎrul de eritrocite și concentrațiile hemoglobinei ȋntr-o manierǎ dependentǎ de dozǎ (Control > Se1 > Se3). Numǎrul de eritrocite și concentrația hemoglobinei au fost deasemenea scǎzute la șoareci, sub influența selenitului de sodiu (Al-Fartosi, 2008). La concentrații de 2-5 mg seleniu/kg de hranǎ, sub formǎ de selenit de sodiu, aceeași scǎdere dependentǎ de dozǎ a numǎrului de eritrocite și a concentrației hemoglobinei a fost observatǎ la șobolani, perioada experimentalǎ fiind de 13 sǎptǎmȃni (Jia et al, 2005). Mecanismele toxicodinamice prin care selenitul reduce numǎrul eritrocitelor pot fi diverse. Unul dintre mecanisme poate fi hemoliza, ceea ce duce la reducerea numǎrului de eritrocite circulante. Ȋn cadrul unui experiment in vitro capacitatea de hemolizǎ a selenitului de sodiu a fost evidențiatǎ utilizȃnd sȃnge uman (Brandao et al, 2005).

O ușoarǎ scǎdere a hematocritului și a hemoglobinei eritrocitare medii a fost observatǎ ȋn cazul loturilor Se1 și Se3, ȋn relație cu scǎderea numǎrului de eritrocite și a concentrației hemoglobinei.

Ȋn cazul lotului Se1 au fost observate modificări histopatologice reversibile, caracteristice pentru intoxicația acută și subacută, constând în principal în degenerare vacuolară sau hidropică a hepatocitelor (fig. 6.23, 6.24). Hepatocitele și-au mǎrit volumul datorită acumulării intracitoplasmatice de apă și incapacitatea de a menține homeostazia hidricǎ și ionicǎ, avȃnd un aspect granular. Nucleii au fost dispuși ȋn mod normal, situate în centrul celulelor; capilarele sinusoidale au fost comprimate. O cuantificare aproximativǎ a modificărilor induse la nivel hepatic a fost realizatǎ prin numărarea celulelor anucleate, celulelor prezentȃnd corpi apoptotici și a celulelor intens acidofile cu nuclei picnotici și raportarea la 100 de celule (tabelul 6.I). Intensitatea degenerǎrii hidropice a fost de la mică până la moderată iar a edemului perivascular a fost scăzută (tabelul 6.I).

În cazul lotului Se3, leziunile hepatice au constat în principal în ectazia venulelor centrolobulare centrolobular și a venulelor din spațiul portal, cu edem perivascular, pereți arteriolari foarte subțiri și un lumen larg (fig. 6.25). Degenerarea hidropică a fost intensǎ și a fost caracterizatǎ de un halou perinuclear mare. Au fost observate mici zone de necroză (fig. 6.25). Severitatea necrozei a fost evaluată de la redusǎ la foarte mare (tabelul 6.II). În comparație cu lotul Se1, o diferență este că celulele ovale au fost prezente în număr mare în spațiul portal și au fost, de asemenea, distribuite intralobular (tabelul 6.II), în grupuri de 3/5 și 6/8, fiecare constând în 4/9 celule (fig 6.26, tabelul 6.II). Comparativ cu lotul Se1, intensitatea degenerǎrii hidropice și a edemului perivascular a fost considerabil mai mare (tabelul 6.I, tabelul 6.II).

În rinichii șobolanilor din lotul Se1 au fost observate celule intens acidofile în majoritatea cazurilor, cu nuclei picnotici aranjați în grupuri de 5 până la 9. Celulele acidofile au alternat cu degenerarea hidropicǎ a tubilor contorți proximali și distali (fig. 6.27, fig. 6.28). Ȋn lumenul tubilor contorți proximali au fost observați cilindri hialini ȋn cazul a 3 animale (fig. 6.28). Corpusculii Malpighi au fost modificați la nivel glomerular. Tubii uriniferi din medulǎ au fost ectaziați; congestia a fost observatǎ atȃt ȋn cortex cȃt și ȋn medulǎ (fig. 6.27, fig. 6.28).

În rinichii șobolanilor din lotul Se3 venele erau ectaziate, cu edem perivascular. Congestia a fost observată atât în cortex, cȃt și ȋn medulǎ. Grupuri de 18-40 celule intens acidofile au fost observate în cortex, în zona tubilor contorți proximali. Leziunile au fost mai severe decât în cazul lotului anterior, principala problemă fiind degenerarea hidropică accentuată a nefrocitelor din tubii contorți proximali. Lumenul tubilor contorți proximali a fost foarte îngust. Cilindrii hialini au fost observți la 25-30 din 100 tubi contorți proximali, ȋn cazul a 4 animale. Atrofia a fost observată în cazul unor tubi contorți distali. Au fost observate celule similare cu celulele ovale care sunt găsite în ficat în cazul unui șobolan, probabil având un rol în procesul de regenerare a nefrocitelor (fig. 6.29).

Seleniul este un microelement esențial pentru toate speciile de mamifere (Rayman, 2000). Deasemenea, compușii seleniului sunt toxici atȃt la animale cȃt și ȋn cazul culturilor celulare (Spallholz, 1994). Este cunoscut faptul cǎ seleniul, la doze superioare celor nutriționale, inhibǎ metastazarea celulelor tumorale (Tanaka et al, 2000) și are aefect supresor asupra celulelor canceroase din prostatǎ transplantate la șoareci (Corcoran et al, 2004). Majoritatea acestor studii au utilizat doze de seleniu de 2-4 ppm ȋn hranǎ sau ȋn apa de bǎut (ȋn cazul șobolanilor sau al șoarecilor), doze ce se apropie sau ating nivelurile toxice subcronice de seleniu. Toxicitatea seleniului depinde nu doar de cantitatea de element consumatǎ/ingeratǎ, ci și de forma sa chimicǎ. Teoria unanim acceptatǎ pȃnǎ ȋn prezent este cǎ seleniul ȋn starea de oxidare zero (seleniul elemental) este inert din punct de vedere biologic. Ȋntr-adevǎr, seleniul elemental (seleniu roșu sau negru) ce se formeazǎ ȋn cadrul metabolismului unor bacterii avȃnd dimensiunea particulelor mai mare de 300 nm are o biodisponibilitate scǎzutǎ (Combs, 1996). Totuși, ȋn cadrul altor studii a fost demonstrat faptul cǎ seleniul roșu elemental cu dimensiunea particulelor de 20-60 nm a avut o biodisponibilitate similarǎ cu selenitul, ȋn sensul inducerii activitǎții enzimatice a selenoenzimelor ȋn culturi celulare sau la șobolanii ce aveau carențǎ de seleniu (Zhang et al, 2001). Ȋn cadrul altui studiu s-a demonstrat cǎ dimensiunea particulelor de seleniu elemental cuprinse ȋntre 5 și 200 nm nu a avut nici un effect asupra expresiei selenoenzimelor, atȃt ȋn culture celulare, cȃt și ȋn ficatul șoarecilor, in vivo (Zhang et al, 2004).

Selenitul a fost utilizat intens ȋn cadrul a numeroase studii, ȋn vederea comparǎrii toxicitǎții, biodisponibilitǎții și acțiunii chemopreventive cu a altor compuși ai seleniului. Formele organice ale seleniului, precum selenometionina, sunt mai toxice ȋn cazul administrǎrii/consumului pe termen lung, datoritǎ ȋnglobǎrii nespecifice ȋn proteine (Spallholz et Hoffman, 2002). Efectul chemoprotector al metilcisteinei de origine naturalǎ a fost intens investigat ȋn ultimii ani; totuși, toxicitatea pe termen scurt este superioarǎ celei a selenometioninei (Cao et al, 2004).

Intoxicațiile cu seleniu au fost intens studiate la animale. Ȋntȃrzierea creșterii este o caracteristicǎ cunoscutǎ a intoxicației cu seleniu. Mecanismele prin care seleniul cauzeazǎ ȋntȃrzieri ȋn procesul de dezvoltare includ scǎderea nivelurilor hormonului de creștere și ale somatomedinei. A fost sugerat faptul cǎ inhibarea creșterii ar putea fi cel mai bun indicator al efectelor toxice ale seleniului. Ȋn cazurile cele mai severe, seleniul induce necrozǎ la nivel hepatic (Ǿrskov et Flyvbjerg, 2000).

Efectele toxice ale seleniului pe termen scurt au fost studiate ȋn cadrul altui studiu la doze de 5 mg/kg corp timp de 10 zile (Anikina, 1995). Creșterea activitǎții glutation-peroxidazei și a glutation-reductazei ȋn țesuturile hepatice au fost corelate cu oxidarea peroxidicǎ. Toxicitatea subcronicǎ indusǎ de selenitul de sodiu la vite a fost mediatǎ deasemenea prin dereglarea echilibrului oxidativ, fapt indicat de nivelurile scǎzute ale glutationului, creșterea de 3 ori a peroxidǎrii lipidice și creșterea glutation-reductazei, SOD și CAT (Kaur et al, 2003). Totuși, mecanismul molecular care mediazǎ toxicitatea seleniului nu este ȋncǎ pe deplin cunoscut pe deplin. A fost sugerat faptul cǎ toxicitatea seleniului ar putea fi legatǎ de oxidarea tiolilor de importanțǎ biologicǎ. Toxicitatea seleniului ar putea fi datoratǎ și interacțiunii selenitului cu glutationul, cu formarea de selenotrisulfuri, fapt ce duce la producerea de radical superoxid și peroxid de hidrogen (Seko et Imura, 1997). Aceste constatǎri vin ȋn sprijinul ipotezei conform cǎreia proprietǎțile pro-oxidante ale seleniului joacǎ un rol important ȋn manifestarea toxicitǎții sale. Un studiu efectuat anterior (Zhang et al, 2001) a evidențiat faptul cǎ efectul pro-oxidant al nano-seleniului elemental a fost semnificativ mai redus comparativ cu selenitul. Este posibil ca acest fapt sǎ fie datorat reactivitǎții de 12 ori mai scǎzute a nano-seleniului cu glutationul, comparativ cu selenitul. Ȋn același studiu, coadministrarea de nano-Se și glutation a evidențiat efecte pro-oxidante mai reduse comparativ cu selenitul și glutationul coadministrate, evaluarea efectuȃndu-se prin mǎsurarea viabilitǎții celulelor HepG2. Rezultatele acestor studii efectuate in vitro sunt ȋn concordanțǎ cu rezultatele studiilor experimentale efectuate in vivo, conform cǎrora nano-Se a avut o toxicitate acutǎ de 7 ori mai micǎ decȃt selenitul, la șoareci.

Selenitul, selenocisteina și dioxidul de seleniu au capacitatea de a iniția oxidarea grupǎrilor tiol din proteine (Kim et al, 2003). Reacția cu grupǎrile tiol poate altera activitatea multor altor enzime ce conțin gruparea sulfhidril, precum și funcționalitatea proteinelor structurale din organism (Spallholz et Hoffman, 2002). Datoritǎ unei rate de reacție mai scǎzute cu glutationul, se poate presupune cǎ nano-Se poate avea un efect inhibitor mai redus asupra activitǎții SOD și catalazei, ȋn comparație cu selenitul.

Ficatul reprezintǎ organul țintǎ ȋn intoxicația cu seleniu. Funcțiile hepatice alterate reprezintǎ una dintre principalele caracteristici. Ȋn cadrul unui studiu, activitatea ALT la șobolanii masculi cǎrora li s-a administrat seleniu ȋn doze de 4 și 5 ppm ȋn hranǎ au fost semnificativ crescute, ȋn comparație cu lotul de control. Ȋn afarǎ de creșterea activitǎții ALT și AST, concentrațiile serice ale proteinelor totale și ale albuminei au fost semnificativ mai scǎzute ȋn comparație cu lotul de control la șobolanii femelǎ ce au primit selenit sau proteine cu un conținut ridicat de seleniu la doze de 5 ppm, ȋn timp ce doar activitatea ALT ȋn cazul lotului cu nano-Se, la doza de 5 ppm a fost mai mare decȃt activitatea observatǎ ȋn cadrul lotului de control (Jia et al, 2005).

Un studiu ȋntreprins pentru evaluarea toxicitǎții subacute a demonstrat faptul cǎ dozele de 1-5 mg/kg corp de selenat de sodiu administrate pe cale oralǎ la șobolani timp de 30 de zile a rezultat ȋn nefromegalie și atrofie hepaticǎ (Nakamuro et al, 1974, citat de Jia et al, 1974). Ȋn cadrul studiului efectuat de Jia X et al, 2005, masele relative ale ficatului, splinei și inimii ȋn cazul șobolanilor masculi ce au consumat selenit și proteine cu un conținut ridicat de seleniu, la doze de 4 și 5 ppm Se, au fost mai mari ȋn comparație cu lotul de control. Administrarea de proteine cu un conținut ridicat de seleniu (3, 4 și 5 ppm Se) la șobolani a dus la atrofie hepaticǎ la șobolanii femelǎ. Nano-Se a cauzat mǎrirea volumului splinei și atrofie hepaticǎ, doar la dozele cele mai mari.

Suprafața neregulatǎ/marmoratǎ reprezintǎ o altǎ caracteristicǎ a leziunilor hepatice produse de seleniu (Scot, 1973, citat de Jia et al, 2005). Jia et al (2005) au observat existența acestei modificǎri la toate loturile, ȋn cazul celor mai mari (4 și 5 ppm). Totuși, efectele observate ȋn cazul selenitului și a proteinelor cu un conținut ridicat de seleniu au fost mai pronunțate ȋn comparație cu nano-Se. La dozele de 3 ppm Se nu au fost observate modificǎri degenerative la nivel hepatic ȋn cazul șobolanilor care au primit nano-Se, ȋn timp ce ȋn cazul loturilor care au primit selenit și proteine cu un conținut crescut de seleniu modificǎrile degenerative au fost moderate. Ȋn cazul loturilor care au primit 5 ppm seleniu sub formǎ de selenit și proteine cu un conținut ridicat de seleniu a fost observatǎ deasemenea necrozǎ la nivel renal.

VI.5. Concluzii

Modificǎrile patologice ale parametrilor biochimici și hematologici și ale structurii histologice la nivel renal și hepatic a fost proporționalǎ cu doza de selenit administratǎ. Activitatea sericǎ a transaminazelor și nivelurile serice ale bilirubinei totale, bilirubinei directe și ale colesterolului total au crescut proporțional cu doza administratǎ, iar numǎrul eritrocitelor, concentrația hemoglobinei și valorile hematocritului au scǎzut proporțional cu doza administratǎ.

Cele mai frecvente tipuri de modificǎri observate la nivel hepatic au fost degenerarea hidropicǎ, ectazia vascularǎ și edemul perivascular și prezența unor zone de necrozǎ. Celulele ovale au fost prezente în mod semnificativ numai în ficatul șobolanilor care au primit cea mai mare dozǎ de selenit (3 mg Se+4/ kg corp), ȋn acest caz reprezentȃnd o dovadǎ a intensitǎții leziunilor hepatice, deoarece celulele ovale sunt activate numai ȋn cazul leziunilor hepatice severe în anumite condiții, în scopul de a susține creșterea compensatorie.

CAPITOLUL VII

EVALUAREA EFECTULUI PROTECTOR AL SELENIULUI ȊN INTOXICAȚIA SUBACUTĂ CU PLUMB SAU CADMIU LA ȘOBOLANI

VII.1. Introducere

Cadmiul este un element ubiquitar cu efect toxic asupra sistemelor biologice, prin diferite mecanisme. Mecanismele moleculare care mediazǎ toxicitatea nu sunt pe deplin cunoscute. Studiile recente efectuate pe diverse specii de mamifere au demonstrat faptul cǎ acest element stimuleazǎ formarea speciilor reactive ale oxigenului (Amaruso MA et al,1982). Acest fapt are drept consecințǎ accelerarea proceselor de peroxidare lipidicǎ, lezarea structurii ADN, modificarea homeostaziei calciului, precum și reducerea capacitǎții de protecție antioxidantǎ a organismului (Stohs et Bagchi, 1995; Sugiyama, 1994).

Rinichii reprezintǎ principalul organ-țintǎ al acțiunii toxice a cadmiului. Intoxicația la mamifere induce ȋn primul rȃnd disfuncții la nivel tubular (Friedman et Gesek, 1994),

fiind de asemenea ȋnsoțitǎ de o reducere marcatǎ a metabolismului energetic la nivel renal, modificarea compoziției minerale și disfuncționalitǎți ale transportului transmembranar (Blumenthal et al, 1994).

Deși existǎ un consens cu privire la faptul cǎ efectele neurotoxice ale plumbului reprezintǎ un risc major pentru sǎnǎtatea publicǎ, dovezile referitoare la carcinogenitatea acestui element pentru oameni sunt ȋncǎ insuficiente (Schrauzer, 2008). Totuși, se presupune cǎ plumbul poate crește riscul de a dezvolta cancer sau poate ȋnlesni indirect dezvoltarea cancerului. Unul dintre mecanismele prin care plumbul ar putea crește riscul de a dezvolta cancer poate fi reprezentat de interacțiunile sale cu seleniul, anulȃndu-i efectele protectoare anticarcinogene (Schrauzer, 2000). Acest fapt a fost demonstrat de un alt studiu (Schrauzer et al, 1981) ȋn care șoarecii femelǎ C3H au fost infectați cu virusul carcinogen MMTV, un model experimental pentru cancerul mamar uman. Totuși, nivelurile de plumb utilizate ȋn acel studiu, de 5 și 25 ppm, sub formǎ de acetat, dizolvat ȋn apa de bǎut, au fost mai mari decȃt nivelurile atinse ȋn mod normal ȋn cadrul expunerii non-profesionale a oamenilor. Ȋn plus, concentrațiile de seleniu de 1 ppm din hranǎ au fost mai mari decȃt cele prezente ȋn mod normal. Pentru ca modelul experimental sǎ fie mai adecvat pentru simularea expunerii oamenilor la plumb și seleniu, au fost efectuate studii suplimentare, ȋn cadrul cǎrora șoarecilor femelǎ infectați cu virusul MMV le-a fost suplimentatǎ hrana cu douǎ niveluri diferite de seleniu (0,15 și 0,65 ppm) și au fost expuși la Pb ȋn concentrații de 0,5 ppm ȋn apa de bǎut, pe ȋntreaga perioadǎ de viațǎ. Ȋn plus fațǎ de evaluarea efectelor plumbului asupra creșterii, dezvoltǎrii tumorilor și ratei de supraviețuire, au fost determinate nivelurile unor microelemente ȋn organele și țesuturile animalelor (Schrauzer et al, 2008).

Scopul acestui studiu a fost de a evalua potențialul protector al seleniului ȋn intoxicația cu plumb sau cadmiu la șobolani, ȋn cazul expunerii subacute, elementele fiind administrate prin intermediul apei de bǎut.

VII.2. Materiale și metode

Procedeele experimentale implicȃnd utilizarea animalelor de laborator au fost ȋn concordanțǎ cu reglementǎrile etice. Studiul a primit avizul etic din partea Comisiei de etica cercetǎrii din cadrul UMF `Grigore T. Popa` Iași.

În cadrul experimentului au fost folosiți 36 de șobolani masculi rasa Wistar cu masa corporalǎ inițialǎ cuprinsǎ ȋntre 250 și 400 g (sursa de proveniențǎ – Institutul Cantacuzino București – Stațiunea Bǎneasa). Șobolanii au fost aclimatizați timp de 10 zile. În timpul aclimatizării și al perioadei experimentale șobolanii au primit hrană standard și apă, ad libitum și au fost cazați în cuști colective (câte o cușcă pentru fiecare lot) în condiții ambientale relativ constante, temperatura fiind de 18-25ș C. Talajul a fost schimbat odatǎ la douǎ zile sau ori de cȃte ori a fost necesar. După aclimatizare șobolanii au fost alocați aleatoriu în unul dintre cele 8 loturi (n=6), fiind transferați ȋn cuștile colective corespunzȃnd fiecǎrui lot (cȃte o cușcǎ colectivǎ pentru fiecare lot), apoi au fost cȃntǎriți și marcați. Toate datele legate de marcaje, alocarea ȋn loturi și greutatea (masa) fiecǎrui animal au fost consemnate, pe ȋntreg parcursul experimentului.

Elementele de interes – seleniul (Se+4), plumbul (Pb+2) și cadmiul (Cd+2) au fost administrate prin intermediul apei de bǎut, sub formǎ de selenit de sodiu (Sigma Aldrich, p.a.), acetat de plumb trihidrat (Chemical Company – Romȃnia, p.a.), respectiv clorurǎ de cadmiu hemipentahidrat (Chemical Company – Romȃnia, p.a.). Sǎrurile au fost dizolvate ȋn apǎ distilatǎ, soluțiile rezultate fiind introduse ȋn dozatoarele de apǎ cu piston corespunzȃnd fiecǎrei cuști. Apa de bǎut din dozatoare a fost schimbatǎ zilnic. Volumul de apǎ rǎmas din ziua precedentǎ a fost mǎsurat cu un cilindru gradat. Prin diferențǎ și prin raportare la intervalul de timp dintre momentul mǎsurǎrii din ziua precedentǎ și momentul mǎsurǎrii din ziua curentǎ a fost calculat volumul de apǎ consumat de șobolanii corespunzȃnd fiecǎrui lot în decurs de 24 de ore.

Experimentul s-a desfǎșurat pe parcursul a 56 de zile, animalele fiind cȃntǎrite la intervale de 7 zile. Aportul zilnic aproximativ (raportat la kg corp) pentru fiecare element (Se, Pb, Cd) a fost calculat pe baza volumului de apǎ consumat în decurs de 24 de ore de fiecare lot de șobolani, a masei totale a șobolanilor dintr-un lot și a concentrațiilor elementelor de interes din apa de bǎut.

Loturile de studiu și concentrațiile elementelor de interes ȋn apa de bǎut au fost:

– Control (apǎ distilatǎ);

– Se (Se+4 – 0,2 mg/l);
– Cd (Cd+2 – 150 mg/l);
– Pb (Pb+2 – 300 mg/l);
– Cd+Se (Cd+2 – 150 mg/l + Se+4 – 0,2 mg/l);
– Pb+Se (Pb+2 – 300 mg/l + Se+4 – 0,2 mg/l);

Animalele au fost sacrificate dupǎ 56 de zile. Pentru anestezie, șobolanii au fost injectați i.p cu ketaminǎ, ȋn dozǎ de 100 mg/kg corp (Ketamine 10 %, sol. inj. uz veterinar – Kepro V.B., Olanda). Dupǎ instalarea efectului anestezicului animalele au fost imobilizate, urmǎtoarea procedurǎ constȃnd ȋn deschiderea toracelui și a unei pǎrți a zonei abdominale. Sângele a fost recoltat ȋn vacutainere (pentru biochimie și pentru hematologie) prin puncție cardiacǎ, ȋn vederea determinǎrii parametrilor biochimici și hematologici.

De la fiecare animal a fost recoltat unul dintre rinichi și un fragment de ficat; de la unele animale au fost recoltare și fragmente de aortǎ, unul dintre testicule sau cerebelul; organele au fost fixate ȋn formol tamponat. Dupǎ fixare, piesele au fost prelucrate la parafinǎ. Secțiunile obținute au fost colorate cu hematoxilinǎ – eozinǎ, apoi au fost analizate cu un microscop Olympus CX41 (obiective 10X, 20X, 40X) și fotografiate cu o camerǎ digitalǎ integratǎ Olympus DP21.

Sângele din vacutainerele pentru biochimie a fost centrifugat dupǎ coagulare timp de cinci minute la 3500 rotații/minut, pentru obținerea serului. Serul obținut a fost transferat ȋn tuburi tip Eppendorf, tuburile fiind menținute la ~ -33◦ C pȃnǎ ȋn momentul determinǎrii parametrilor biochimici. Sȃngele din vacutainerele pentru hematologie a fost analizat ȋn decurs de cȃteva ore de la momentul recoltǎrii.

Parametrii biochimici au fost determinați utilizând analizoarele automate de biochimie RX Imola® (Randox Laboratories, UK) și Accent 200 (Cormay, Polonia). Au fost folosite kituri Cormay și kituri ELITech. Pentru determinarea hemogramei a fost utilizat un analizor automat de hematologie. Pentru determinarea nivelului seric total al triiodotironinei a fost utilizat un analizor de imunologie prin chemiluminiscențǎ.

Pentru evaluarea integrității celulelor hepatice prin măsurarea indirectă a permeabilității membranei hepatocitare au fost determinate activitățile enzimatice ale alanin-aminotransferazei (ALT), aspartat-aminotransferazei (AST), lactat-dehidrogenazei (LDH), fosfatazei alcaline (PA), precum și nivelul seric al fierului. Pentru investigarea activității hepatice au fost determinate nivelurile serice ale bilirubinei totale, bilirubinei directe, colesterolului total, trigliceridelor, proteinelor serice totale și albuminei. Pentru evaluarea funcției renale au fost determinate nivelurile serice ale ureei și creatininei. Pentru investigarea metabolismului calciului și magneziului a fost determinat nivelul calciului seric total și al magneziului seric. Pentru evaluarea activitǎții tiroidei a fost determinat nivelul triiodotironinei totale.

Determinarea activitǎții serice a ALT și AST la analizorul automat s-a bazat pe mǎsurarea scǎderii absorbanței la 340 nm, invers proporționalǎ cu activitatea enzimelor, datoratǎ consumului de NADH și formǎrii NAD+; ALT catalizează transferul grupării amino de pe un aminoacid (alanină) pe alt aminoacid (alfa-oxoglutarat) iar AST catalizeazǎ transferul grupǎrii amino de pe acid aspartic pe α-oxoglutarat, ambele reacții consumând NADH. Determinarea activitǎții lactat-dehidrogenazei s-a bazat pe o metodǎ cineticǎ; ȋn mediu acid și ȋn prezența NADH piruvatul este transformat ȋn lactat sub influența LDH, cu formarea NAD+; reacția este monitorizatǎ la 340 nm. Determinarea activitǎții PA s-a bazat pe mǎsurarea creșterii absorbanței la 405 nm, direct proporționalǎ cu activitatea PA, datoratǎ formǎrii 4-nitrofenolului; 2-amino-2-metil-1-propanolul reacționeazǎ cu p-nitrofenilfosfatul și cu apa, ȋn raport echimolecular, rezultȃnd 4-nitrofenol și 2-amino-2-metil-1-propanolfosfat. Dozarea fierului s-a bazat pe metoda colorimetricǎ cu ferozinǎ; ionul feric din ser este disociat de pe transferinǎ ȋn mediu acid și redus simultan la ion feros, care reacționeazǎ cu ferozina, formând un compus colorat cu absorbanțǎ maximǎ la 546 nm; absorbanța este direct proporționalǎ cu nivelul seric al fierului. Ureea a fost determinatǎ prin metoda cineticǎ enzimaticǎ cu ureazǎ: ureea este hidrolizată în prezența apei de către urează la ion amoniu și CO2; amoniul produs reacționeazǎ cu -cetoglutaratul și NAHD în prezența glutamat-dehidrogenazei, cu formare de glutamat și NAD+; modificarea absorbanței (la 340 nm) datorită formării de NAD+ în locul NAHD-ului consumat este proporțională cu nivelul de uree din ser. Creatinina a fost determinatǎ printr-o metodǎ colorimetricǎ cineticǎ, dupǎ urmǎtorul principiu: creatinina formeazǎ cu acidul picric ȋn mediu alcalin un compus colorat a cărui rată de formare este măsurată, fiind direct proporțională cu nivelul de creatininǎ din ser. Dozarea bilirubinei totale s-a bazat pe metoda colorimetricǎ Jendrassik-Grof: ȋn prezența cafeinei bilirubina este eliberată de pe albumină și reacționează cu acidul sulfanilic diazotat, cu formarea unui compus albastru (absorbanța maximǎ la 578 nm), a cărui intensitate de culoare este direct proporțională cu bilirubina totală. Determinarea bilirubinei directe (conjugate) se bazează pe capacitatea bilirubinei directe de a reacționa direct cu acidul sulfanilic și reactivul de diazotare (fără accelerator – cafeina); se formează un compus colorat în roșu (absorbanța maximǎ la 546 nm), absorbanța fiind direct proporțională cu nivelul bilirubinei directe în ser. Colesterolul total s-a determinat printr-o metodǎ enzimaticǎ end-point; esterii colesterolului sunt hidrolizați sub acțiunea colesterol esterazei, formându-se colesterol și acizi grași; colesterol oxidaza acționeazǎ asupra colesterolului format, rezultând colestonǎ și peroxid de hidrogen; produsul final de reacție este chinonimina, formată sub acțiunea preoxidazei asupra peroxidului de hidrogen, în prezența 4-aminoantipirinei și a fenolului. Intensitatea culorii chinoniminei formate (determinarea absorbanței se face la 600 nm) este direct proporțională cu nivelul colesterolului total din probă. Determinarea nivelulului seric al trigliceridelor s-a bazat pe o metodǎ enzimaticǎ colorimetricǎ; trigliceridele sunt hidrolizate sub influența lipoprotein lipazei, cu formare de glicerol (glicerinǎ) și acizi grași liberi; sub influența glicerol kinazei și ȋn prezența ATP se formeazǎ glicerol-3-fosfat, care apoi este oxidat sub acțiunea glicerol-3-fosfat oxidazei la dihidroxiaceton-fosfat, cu formare de H2O2; ȋn prezența H2O2 și sub acțiunea peroxidazei 4-amino-antipirina se condenseazǎ cu N-etil-N-(3-sulfopropil)-3-metoxianilina, rezultȃnd un derivat quinoniminic colorat, absorbanța fiind direct proporționalǎ cu nivelul seric al trigliceridelor. Dozarea nivelului seric al proteinelor serice totale s-a bazat pe reacția biuretului; proteinele formeazǎ un complex colorat cu ionii cuprici, ȋn mediu alcalin; absorbanța la 546 nm este direct proporționalǎ cu nivelul seric al proteinelor. Determinarea nivelului seric al albuminei s-a bazat pe reacția cu verde de bromcrezol; verdele de bromcrezol formeazǎ cu albumina ȋn mediu acid un complex colorat, absorbanța la 630 nm fiind direct proporționalǎ cu nivelul albuminei. Principiul metodei utilizate pentru determinarea nivelului seric al calciului constǎ ȋn reacția dintre o-crezolftaleinǎ și calciu ȋn mediu alcalin, rezultȃnd un complex colorat ȋn violet; absorbanța la 570-580 nm este direct proporționalǎ cu nivelul calciului. Determinarea magneziului se bazeazǎ pe reacția dintre ionii de magneziu și EGTA, rezultȃnd un complex colorat ȋn violet; absorbanța la 520 nm este direct proporționalǎ cu nivelul magneziului. Determinarea activitǎții amilazei se bazeazǎ pe mǎsurarea variației absorbanței la 405 nm, ca urmare a formǎrii 2-cloro-4-nitrofenolului din 2-cloro-4-nitrofenil-α-maltotriozidǎ, sub acțiunea amilazei.

Valorile obținute au fost prelucrate statistic utilizând Microsoft Excel 2007. Valorile au fost exprimate ca media ± eroarea standard a mediei. Valorile individuale obținute ȋn cazul fiecărui animal care prezentau o abatere semnificativǎ de la medie au fost eliminate, recalculându-se media pe baza valorilor rǎmase. Ȋn acest caz s-a considerat cǎ abaterea semnificativǎ nu se datoreazǎ variabilitǎții normale a rezistenței interindividuale la toxicitatea seleniului, ci este determinatǎ de alți factori patologici.

VII.3. Rezultate

Ȋn Fig. 7.1. este redat consumul de apǎ mediu raportat la kilogram corp pentru cele 6 loturi de studiu.

Figura 7.1. Consumul de apǎ mediu timp de 24 de ore al șobolanilor, raportat la masa corporalǎ

Ȋn Fig. 7.2. este redat consumul de apǎ mediu raportat pentru un animal.

Ȋn Tabelul 7.I este redat aportul mediu estimat al celor trei elemente pentru fiecare lot de studiu.

Ȋn Figura 7.3 este ilustratǎ evoluția corporalǎ relativǎ medie pentru cele 6 loturi, raportatǎ la masa corporalǎ de la ȋnceputul experimentului.

Ȋn Fig. 7.4 și Fig. 7.5 sunt redate activitǎțile serice ale ALT, respectiv AST.

Ȋn Fig. 7.6 este redatǎ activitatea LDH.

Ȋn Fig. 7.7 este redatǎ activitatea fosfatazei alcaline pentru cele șase loturi de studiu.

Ȋn Figura 7.8 sunt prezentate nivelurile serice ale fierului ȋn cazul celor șase loturi.

Ȋn Figura 7.9 sunt prezentate nivelurile serice ale ureei.

Figura 7.2. Consumul de apǎ mediu timp de 24 de ore al șobolanilor, raportat pentru un animal

Tabelul 7.I. Aportul mediu de elemente pe parcursul perioadei experimentale

Figura 7.3. Evoluția masei corporale medii a șobolanilor, raportatǎ la masa corporalǎ medie inițialǎ

Ȋn Figura 7.10 sunt prezentate nivelurile serice ale creatininei.

Ȋn Fig. 7.11 și Fig. 7.12 sunt redate nivelurile serice ale bilirubinei totale, respectiv ale bilirubinei directe.

Nivelurile serice ale colesterolului total sunt redate ȋn Fig. 7.13.

Nivelurile serice ale trigliceridelor sunt prezentate ȋn Fig. 7.14.

Nivelurile proteinelor serice totale sunt redate ȋn Fig. 7.15.

Nivelurile albuminei serice sunt prezentate ȋn Fig. 7.16.

Concentrațiile serice ale calciului și magneziului sunt prezentate ȋn Fig. 7.17 și 7.18.

Activitatea sericǎ a amilazei este prezentatǎ ȋn Fig. 7.19.

Nivelurile serice ale triiodotironinei sunt redate ȋn Fig. 7.20.

Numǎrul de leucocite, numǎrul de hematii și concentrația hemoglobinei sunt prezentate ȋn Fig. 7.21, 7.22, respectiv 7.23.

Ȋn Fig. 7.24 – 7.81 sunt prezentate secțiuni din ficat, rinichi, suprarenalǎ, aortǎ, inimǎ, testicul, tiroidǎ și cerebel pentru cele 6 loturi.

Figura 7.4. Activitatea ALT

Figura 7.5. Activitatea AST

Figura 7.6. Activitatea LDH

Figura 7.7. Activitatea PA

Figura 7.8. Nivelul seric al fierului

Figura 7.9. Nivelul seric al ureei

Figura 7.10. Nivelul seric al creatininei

Figura 7.11. Nivelul seric al bilirubinei totale

Figura 7.12. Nivelul seric al bilirubinei directe

Figura 7.13. Nivelul seric al colesterolului total

Figura 7.14. Nivelul seric al trigliceridelor

Figura 7.15. Proteinele serice totale

Figura 7.16. Albumina sericǎ

Figura 7.17. Nivelul seric al calciului

Figura 7.18. Nivelul seric al magneziului

Figura 7.19. Activitatea sericǎ a amilazei

Figura 7.20. Nivelul seric al triiodotironinei

Figura 7.21. Numǎrul de leucocite

Figura 7.22. Numǎrul de hematii

Figura 7.23. Hemoglobina

Figura 7.24. Cd – cerebel

Figura 7.25. Cd – cerebel

Figura 7.26. Cd – scoarțǎ cerebralǎ

Figura 7.27. Cd – testicul

Figura 7.28. Cd – testicul

Figura 7.29. Cd – testicul

Figura 7.30. Cd – testicul

Figura 7.31. Cd – testicul

Figura 7.32. Cd – testicul

Figura 7.33. Cd – testicul

Figura 7.34. Cd – testicul

Figura 7.35. Cd – testicul

Figura 7.36. Pb – testicul

Figura 7.37. Pb – testicul

Figura 7.38. Pb – testicul

Figura 7.39. Pb – testicul

Figura 7.40. Pb – rinichi

Figura 7.41. Pb – suprarenala

Figura 7.42. Pb – rinichi

Figura 7.43. Pb – tiroidǎ

Figura 7.44. Pb – tiroidǎ

Figura 7.45. Pb – tiroidǎ

Figura 7.46. Pb – tiroidǎ

Figura 7.47. Pb – rinichi

Figura 7.48. Pb – rinichi

Figura 7.49. Pb – rinichi

Figura 7.50. Pb – ficat

Figura 7.51. Pb – cord

Figura 7.52. Pb – ficat

Figura 7.53. Pb – ficat

Figura 7.54. Pb – ficat

Figura 7.55. Cd – suprarenalǎ

Figura 7.56. Cd – suprarenalǎ

Figura 7.57. Cd – suprarenalǎ

Figura 7.58. Cd – ficat

Figura 7.59. Pb+Se – testicul

Figura 7.60. Se – aortǎ

Figura 7.61. Pb+Se – tiroidǎ

Figura 7.62. Pb+Se – ficat

Figura 7.63. Pb+Se – rinichi

Figura 7.64. Pb+Se – tiroidǎ

Figura 7.65. Pb+Se – ficat

Figura 7.66. Pb+Se – rinichi

Figura 7.67. Pb+Se – cord

Figura 7.68. Pb+Se – cord

Figura 7.69. Pb+Se – ficat

Figura 7.70. Pb+Se – suprarenalǎ

Figura 7.71. Pb+Se – suprarenalǎ

Figura 7.72. Pb+Se – rinichi

Figura 7.73. Cd+Se – ficat

Figura 7.74. Cd+Se – rinichi

Figura 7.75. Cd+Se – rinichi

Figura 7.76 – Cd+Se – suprarenalǎ

Figura 7.77 – Cd+Se – tiroida

Figura 7.78. Cd+Se – rinichi

Figura 7.79. Cd+Se – suprarenalǎ

Figura 7.80. Cd+Se – aortǎ

Figura 7.81. Cd+Se – cord

VII.4. Discuții

Nu s-au observat diferențe semnificative ȋntre consumul de apǎ corespunzor loturilor de control, Se, Pb și Pb+Se, pentru un anumit moment. Consumul de apǎ a fost semnificativ redus ȋn cazul lotului Cd, comparativ cu celelalte loturi, la ȋnceputul și la sfarșitul perioadei experimentale. Consumul de apǎ ȋn cazul lotului Cd+Se a fost semnificativ scǎzut comparativ cu celelalte loturi pe tot parcursul perioadei experimentale. Consumul de apǎ pentru lotul de control, Se, Pb și Pb+Se au scǎzut treptat spre sfȃrșitul perioadei experimentale.

Tendința evoluției consumului de apǎ ȋn cazul raportǎrii la fiecare animal (fig. 7.2) a fost aproximativ similarǎ cu cea observatǎ ȋn cazul raportǎrii la masa corporalǎ.

Se observǎ o reducere evidentǎ a ratei de creștere ȋn cazul loturilor Cd și Cd+Se, ȋn comparație cu lotul de control (fig. 7.3). Ȋn cazul lotului Pb reducerea ratei de creștere a fost mai puțin semnificativǎ.

Aportul de Cd (lotul Cd) a determinat o creștere semnificativǎ a activitǎții transaminazelor serice, ȋn comparație cu lotul de control; ȋn cazul lotului Pb activitǎțile transaminazelor au fost deasemenea semnificativ crescute, ȋnsǎ creșterea a fost mai micǎ decȃt ȋn cazul cadmiului. Ȋn cazul loturilor Pb+Se și Cd+Se activitǎțile transaminazelor au fost mai reduse ȋn comparație cu loturile Cd, respectiv Pb.

Administrarea de cadmiu (lotul Cd) a dus la scǎderea activitǎții LDH ȋn comparație cu lotul de control. Coadministrarea de seleniu (lotul Cd+Se) a dus la o creștere a activitǎții LDH, ȋn comparație cu lotul de control.

O scǎdere semnificativǎ a activitǎții fosfatazei alcaline ȋn comparație cu lotul de control se observǎ doar ȋn cazul loturilor Cd și Cd+Se.

Ȋn comparație cu lotul de control, ȋn cazul tuturor celorlalte loturi se observǎ o scǎdere a nivelurilor serice ale fierului.

Atȃt cadmiul (Cd) cȃt și Pb au determinat o creșterea a nivelurilor serice ale ureei, comparativ cu lotul de control; coadministrarea de seleniu a dus la o reducere a acestor niveluri (Cd+Se, respectiv Pb+Se).

Nu se observǎ diferențe semnificative ȋntre nivelurile serice ale creatininei pentru fiecare lot; ȋn cazul cȃtorva loturi se observǎ ușoare scǎderi ale nivelurilor creatininei, comparativ cu lotul de control.

Ȋn cazul loturilor Se, Cd, Pb se observǎ ușoare scǎderi ale bilirubinei totale și directe, comparativ cu lotul de control. Bilirubina totalǎ a fost crescutǎ ȋn cazul loturilor Cd+Se și Pb+Se, comparativ cu lotul de control.

Colesterolul total a fost deasemenea crescut ȋn cazul loturilor Se, Cd, Pb, ȋn comparație cu lotul de control; ȋn cazul loturilor Cd+Se și Pb+Se nivelurilor fiind mai scǎzute.

Nivelurile trigliceridelor au fost crescute ȋn cazul loturilor Cd, Pb și Cd+Se, comparativ cu lotul de control (Fig. 7.14).

Nivelurile proteinelor serice totale nu au variat semnificativ ȋntre loturi (Fig. 7.15).

Nivelul albuminei serice a fost ușor scǎzut ȋn cazul loturilor Cd+Se și Pb+Se, comparativ cu lotul de control (Fig. 7.16).

Concentrațiile serice ale calciului au fost mai reduse ȋn cazul tuturor loturilor ȋn comparație cu lotul de control (Fig. 7.17).

Concentrațiile serice ale magneziului au fost mai mari ȋn cazul tuturor loturilor, ȋn comparație cu lotul de control (Fig. 7.18).

Activitatea sericǎ a amilazei a fost ușor crescutǎ ȋn cazul loturilor Se, Cd, Pb, comparativ cu lotul de control (Fig. 7.19).

Ȋn Figura 7.20 sunt prezentate nivelurile serice ale triiodotironinei.

Practic ȋn cazul tuturor loturilor se observǎ o scǎdere a numǎrului de leucocite, ȋn comparație cu lotul de control (Fig. 7.21).

Nu s-au observat diferențe semnificative ȋntre numǎrul de hematii observat ȋn cazul loturilor de studiu (Fig. 7.22).

Concentrația hemoglobinei nu a variat semnificativ ȋntre loturi (Fig. 7.23).

VII. Concluzii

Seleniul a manifestat aparent o acțiune protectoare fațǎ de toxicitatea hepaticǎ și renalǎ a plumbului sau cadmiului. Ȋn comparație cu loturile care au primit doar plumb, respectiv doar cadmiu, coadministrarea de seleniu ȋmpreunǎ cu plumb sau cadmiu a dus la o scǎdere a activitǎților transaminazelor și a nivelurilor serice ale ureei. Intensitatea și frecvența leziunilor hepatice și renale a fost mai redusǎ ȋn cazul loturilor care au primit cadmiu și seleniu sau plumb și seleniu, comparativ cu cele care au primit doar cadmiu, respectiv doar plumb.

CAPITOLUL VIII

CORELAȚII ȊNTRE CONȚINUTUL ȊN SELENIU AL SOLULUI ȘI CONCENTRAȚIILE ACESTUIA ȊN CEREALE (PORUMB)

VIII.1. Introducere

Seleniul este recunoscut ca fiind un element esențial pentru oameni și animale (Rayman, 2000), din cauza rolului său esențial în sistemele antioxidante (Tapiero et al, 2003) și de prevenire a cancerului (Reid et al, 2008). Un aport zilnic adecvat de Se este necesar pentru menținerea sănătǎții. Cu toate acestea, la nivel mondial, în multe regiuni, cum ar fi în centrul Chinei, Finlanda și Suedia, s-a estimat cǎ aportul de seleniu prin consum de alimente este în general mai mic decât 40 μg/zi, cantitate recomandată de către Organizația Mondială a Sănătății (Navarro-Alarcon et Cabrera-Vique, 2008). Această condiție poate fi atribuită conținutul insuficient de Se în mediu (ȋn primul rȃnd ȋn sol), rezultând ȋn conținutul redus de seleniu ȋn alimente (Navarro – Alarcon et Cabrera-Vique, 2008).

Aportul de seleniu ȋn cazul oamenilor provine ȋn primul rȃnd din alimentație și poate fi estimat prin determinǎri ale compoziției produselor alimentare și prin coroborarea datelor cu diverse modele de rații alimentare. Aportul de seleniu prin intermediul apei potabile și al aerului respirabil este nesemnificativ, cu excepția zonelor ȋn care concentrațiile seleniului ȋn elementele de mediu sunt ridicate, datoritǎ unor factori naturali sau antropici. Aportul de seleniu la nivel global poate varia ȋntre 3 și 7000 μg/zi (Chilimba et al, 2011).

Seleniul este un element esențial și pentru alge și plantele superioare, nu doar pentru organismele animale. Existǎ dovezi clare ale faptului cǎ prezența seleniului este necesarǎ pentru creșterea algelor (Price NM et al, 1987). Ȋn cazul plantelor existǎ controverse și incertitudini cu privire la caracterul sǎu de microelement esențial. Existǎ unele dovezi conform cǎrora seleniul este necesar pentru plantele acumulatorare de seleniu, endemice ȋn zonele cu soluri selenifere, dar nu existǎ nici o dovadǎ ȋn cazul plantelor ce nu acumuleazǎ seleniu (Terry N et al, 2000).

Concentrația seleniului ȋn sol depinde ȋn mare mǎsurǎ de concentrația sa ȋn roca de substrat a solului/roca mamǎ. Deși seleniul poate avea mai multe stǎri de oxidare, principalele forme active ale seleniului ȋn soluri sunt selenitul (SeO3-2) și selenatul (SeO4-2). Acești anioni, ȋn special selenitul, sunt adsorbiți pe argile și pe unii oxizi. Acumularea de seleniu ȋn sol poate fi legatǎ direct de prevalența acestora ȋn solul respectiv. S-a constatat deasemenea cǎ nivelul de seleniu ȋn sol este proporțional ȋntr-o anumitǎ mǎsurǎ cu nivelul de materie organicǎ din sol (Shand CA et al, 2012).

Conținutul de seleniu ȋn sol poate varia ȋntre 0,005 mg/kg, ȋn unele zone din Finlanda și 8 g/kg, ȋn zona Tuva din Rusia (Zhao et al, 2005). Conținutul mediu de seleniu ȋn sol la nivel mondial este de 0,383 ± 0,255 mg/kg (Kabata Pendias et Pendias, 2001)

Preluarea seleniului din sol și acumularea de cǎtre plante depinde ȋn primul rȃnd de predominanța diferitelor specii chimice ale seleniului și ȋntr-o mai micǎ mǎsurǎ de concentrația seleniului total ȋn sol (Zhang et Moore, 1996; Harada et Takahashi, 2008, Wang et al, 2012).

Plantele pot prelua seleniul din sol sub formǎ de selenat, selenit și diferite forme de seleniu organic. Mecanismele pentru fiecare dintre aceste specii nu sunt ȋncǎ pe deplin cunoscute. Preluarea selenatului are loc printr-un mecanism activ, prin intermediul mecanismelor de transport ale sulfatului. Selenitul este preluat deasemenea printr-un mecanism activ, dar prin intermediul sistemului de transport pentru fosfat (Li, 2008). Specia chimicǎ dominantǎ ȋn sol este selenitul sau selenatul, ȋn funcție de potențialul redox și pH. Selenatul este specia dominantǎ ȋn solurile alcaline iar selenitul ȋn solurile acide și neutre (Elrashidi et al, 1987; Li, 2008).

Experimentele efectuate au arǎtat cǎ plantele absorb selenatul ȋn cantitǎți mai mare comparativ cu selenitul, la concentrații echivalente ȋn seleniu. Deasemenea, nu toate formele de seleniu prezente ȋn sol pot fi absorbite de cǎtre plante (Zhao et al, 2005).

Ȋn solurile alcaline (pH 7,5-8,5) seleniul din formele imobile poate fi oxidat la selenat, devenind hidrosolubil. Aceastǎ formǎ este disponibilǎ pentru absorbție de cǎtre plante (De Temmerman et al, 2014).

Absorbția seleniului din sol de cǎtre plante este influențatǎ de unii factori pedoclimatici. Ȋn cadrul unui studiu efectuat ȋn Suedia au fost observate variații intra- și inter-sezoniere ale concentrației de seleniu ȋn grȃu. A fost obținutǎ o corelație pozitivǎ ȋntre conținutul de seleniu ȋn grȃu și volumul de precipitații din perioada de creștere. Deasemenea, concentrația seleniului ȋn grȃu a fost direct dependentǎ de concentrația acestuia ȋn sol (Johnsson, 1991; Spadoni et al, 2007).

Aplicarea foliarǎ a ȋngrǎșǎmintelor conținȃnd selenit sau selenat poate crește statusul seleniului ȋn plante. Aplicare de ȋngrǎșǎminte cu seleniu pe sol reprezintǎ o metodǎ convenabilǎ de remediere a solurilor deficiente ȋn seleniu (De Temmerman et al, 2014).

Spectrometria de absorbție atomicǎ ȋn flacǎrǎ cu generare de hidruri este o metodǎ generalǎ intens utilizatǎ pentru determinarea seleniului total, cȃt și a speciilor sale din soluri. Speciația seleniului este evaluatǎ prin aplicarea unor tratamente diferite soluțiilor obținute ȋn urma extracției/digestiei probelor de sol. Selenitul este determinat prin analiza directǎ a probelor, fǎrǎ nici un tratament. Selenatul plus selenitul sunt determinați dupǎ reducerea Se(VI) la Se(IV) ȋn HCl de concentrație 4-7 N la temperaturi ridicate. Selenatul este determinat prin diferențǎ. Seleniul total se determinǎ prin oxidarea tuturor speciilor seleniului la Se(VI), urmatǎ de reducerea Se(VI) la Se(IV) ȋn HCl 4-7 N la temperaturi ridicate apoi de determinarea efectivǎ a seleniului (Zhang et al, 1999).

Spectrometria de absorbție atomicǎ cu flacǎrǎ, fǎrǎ utilizarea unui generator de hidruri este dificil de utilizat pentru determinarea seleniului, ȋn general, ȋn primul rȃnd datoritǎ limitelor de detecție mari.

Metoda spectrofotometricǎ cu 3,3’-diaminobenzidinǎ pentru determinarea seleniului poate fi aplicatǎ cu rezultate bune din punct de vedere al performanței analitice și la probe de sol (Stanton et McDonald, 1965).

Existǎ puține date referitoare la conținutul de seleniu ȋn solurile din Romȃnia. Pȃnǎ ȋn prezent se cunosc nivelurile de seleniu ȋn solurile provenind din zone geografice disparate și relativ restrȃnse: centrul Dobrogei și sudul Cȃmpiei Romȃne (Lǎcǎtușu et al, 2010), zona Depresiunii Fǎgǎraș (Lǎcǎtușu et al, 2012b), Delta Dunǎrii (Lǎcǎtușu et al, 2012c) și vǎile rȃurilor Cǎlmǎțui și Buzǎu (Lǎcǎtușu et al, 2012d).

Porumbul (Zea mays L) este o plantǎ de culturǎ larg rǎspȃnditǎ la nivel global. Ȋn unele zone ale lumii reprezintǎ principala plantǎ de culturǎ din punctul de vedere al suprafețelor cultivate și al preponderenței ȋn alimentația oamenilor (Wuana et Okieimen, 2010).

Ȋn Romȃnia porumbul este cultivat practic pe ȋntreg teritoriul, acolo unde condițiile pedoclimatice și de relief o permit. Aceastǎ culturǎ fiind larg rǎspȃnditǎ, porumbul poate fi utilizat și ca indicator al disponibilitǎții elementelor din sol, ȋn vederea efectuǎrii de comparații ȋntre soluri.

Obiectivele acestui studiu au fost: determinarea conținutul total de seleniu ȋn solurile din zona Moldovei și ȋn porumbul (boabe) cultivat pe aceste soluri, stabilirea intervalelor ȋntre care se situeazǎ valorile obținute și evaluarea distribuției statistice, caracterizarea solurilor prin prisma unor parametri fizico-chimici generali, evaluarea dependenței dintre conținutul de seleniu total ȋn sol și cel ȋn boabele provenind de la plantele de porumb aferente și evidențierea unor eventuale corelații ȋntre parametrii fizico-chimici ai solurilor și conținutul total de seleniu ȋn sol și ȋn porumb (boabe).

VIII.2. Materiale și metode

Prelevarea și prelucrarea probelor de sol și porumb

Prelevarea a fost efectuatǎ ȋn ultima parte a lunii august 2012.

Probele de sol și de porumb au fost prelevate din 27 de locații situate ȋn județele Neamț, Bacǎu și Suceava (fig. 8.3, tabelul 8.I). Din fiecare locație a fost prelevatǎ cȃte o probǎ din 3 puncte de prelevare diferite (ȋntr-un singur caz doar douǎ probe – Z21), punctele de prelevare situȃndu-se la distanțe cuprinse ȋntre 50 și 1000 m unele de altele. Prelevarea s-a efectuat la distanțe de minimum 10 m de drumuri, de pe suprafețele cultivate cu porumb, de la adȃncimi cuprinse ȋntre 0 și 20 cm (din Orizontul A). Din fiecare punct s-a recoltat minimum 1 kg de sol. S-a recoltat minimum un știulete de porumb provenind de la planta ce creștea deasupra punctului de prelevare sau la 10-20 cm de acesta.

Solurile au fost uscate la temperatura camerei timp de 30-60 de zile, apoi au fost separate bucǎțile de resturi vegetale vizibile. Ulterior au fost mǎrunțite la mojar apoi trecute prin sita de 2 mm. Solurile cernute rezultate au fost stocate ȋn recipiente de polipropilenǎ ȋnchise etanș pȃnǎ ȋn momentul analizei.

Știuleții de porumb au fost uscați la temperatura camerei timp de 30-60 de zile, apoi au fost separate mecanic boabele de porumb. Boabele provenind din fiecare punct de prelevare au fost stocate ȋn recipiente ȋnchise etanș pȃnǎ ȋn momentul analizei.

Determinarea unor parametri fizico-chimici ai solurilor

Probele de sol au fost uscate la 105○ C la etuvǎ pȃnǎ la masǎ constantǎ, apoi granulația a fost adusǎ la mai puțin de 0,01 mm utilizȃnd o moarǎ cu bile, ȋn vederea determinǎrii parametrilor fizico-chimici.

pH-ul solurilor a fost determinat dupǎ o metodǎ potențiometricǎ standard (Bloom, 2000; Bulgariu et al, 2005; Pansu et Gautheyrou, 2006). Peste 10 g de sol au fost adǎugați 25 ml de apǎ bidistilatǎ, timpul de contact fiind de 30 de minute sub agitare. pH-ul a fost determinat apoi cu un pH-metru model pH-Meter Basic 20+ și un electrod de pH combinat (Crison Instruments, Spania).

Potențialul redox (Eh) a fost determinat dupǎ o metodǎ standard (Bloom, 2000; Pansu et Gautheyrou, 2006). Peste 10 g de sol au fost adǎugați 25 ml de apǎ bidistilatǎ, timpul de contact fiind de 30 de minute sub agitare. Potențialul redox a fost determinat cu un potențiometru model Basic 20+ și un electrod de platinǎ combinat (Crison Instruments, Spania).

Conductibilitatea electricǎ (CE) a fost determinatǎ dupǎ o metodǎ standard (Bloom, 2000; Pansu et Gautheyrou, 2006), utilizȃnd un conductometru model EC-meter GLP 31+ și o celulǎ conductometricǎ Pt1000 (Crison Instruments, Spania). Determinǎrile au fost efectuate pe suspensiile obținute ȋn urma menținerii ȋn contact sub agitare a cȃte 10 g de sol și 25 ml de apǎ. Pentru estimarea conținutului total de sǎruri solubile din sol (TSS) a fost utilizata o ecuație de dependențǎ semiempiricǎ a TSS fațǎ de CE: TSS(mg/kg) = CE (μS/cm) * 0,64 (Shirokova et al, 2000; Pansu et Gautheyrou, 2006).

Valoarea rH a fost calculatǎ pe baza datelor experimentale (pH și Eh), pe baza ecuației rH = 34,4827*Eh + 2*pH (Bulgariu et al, 2012).

Conținutul aproximativ de materie organicǎ (materia organicǎ ȋn sol) a fost estimat prin pierderea la calcinare (Howard et Howard, 1990). Determinarea a fost efectuatǎ pe solul uscat la temperatura camerei, trecut doar prin sita de 2 mm. Cantitǎți de aproximativ 2 g de sol au fost cȃntǎrite ȋn capsule de platinǎ sau de silicat și au fost uscate la 105o C la etuvǎ pȃnǎ la masǎ constantǎ. Dupǎ rǎcire și cȃntǎrire capsulele au fost introduse ȋntr-un cuptor de calcinare prevǎzut cu controler timp-temperaturǎ. Programul a constat ȋntr-o fazǎ de creștere de 2 ore, perioadǎ ȋn care temperatura a crescut pȃnǎ la 550o C și o fazǎ staționarǎ de 2 ore, timp ȋn care temperatura a fost menținutǎ. Dupǎ rǎcire capsulele au fost cȃntǎrite din nou. Prin diferențǎ și prin raportare la masa de sol uscatǎ s-a calculat procentual conținutul aproximativ de materie organicǎ.

Precizia intermediarǎ ȋn cazul determinǎrii pH-ului, Eh și CE a fost evaluatǎ prin analizarea repetatǎ a unei probe de sol (n = 10), considerȃndu-se o probabilitate ≥ 95 %. Valoarea medie a pH-ului a fost de 5,890 ± 0,042 (media ± DS; intervalul de ȋncredere calculat: ± 0,030). Valoarea medie a Eh a fost de 0,301 ± 0,005 (media ± DS; intervalul de ȋncredere calculat: ± 0,003). Valoarea medie a CE a fost de 272,000 ± 3,768 (media ± DS; intervalul de ȋncredere calculat: ± 2,693).

Dezagregarea probelor de sol și determinarea conținutului total de seleniu

Aproximativ 10 g din fiecare probǎ de sol (granulația < 0,01 mm, uscate la 105oC în etuvă în condiții normale) au fost tratate cu HNO3 concentrat (HNO3 65 %, = 1,41 g / cm3, Merck Chemicals, Germania). Au fost adǎugați 10 mL HNO3 concentrat, probele fiind menținute la temperatura camerei (T = 26,5–34oC) timp de 10-12 ore (pentru dezagregarea carbonaților și parțial a materiei organice), după care s-a procedat la încălzire pe baie de apă în flacoane cu refrigerent de reflux timp de aproximativ 6 ore urmată de o încălzire pe baie de nisip la temperatura de 140-150oC (până la reziduu umed). După răcire probele au fost tratate cu HClO4 concentrat (72 %, = 1,67 g/cm3, Merck Chemicals, Germany) și lăsate în repaus la temperatura camerei aproximativ o oră după care au fost încălzire pe baie de apă ȋncǎ 3 ore, apoi pe baie de nisip (aproximativ 3 ore) la temperatura de 190-200oC până la reziduu umed. După răcire, peste reziduu au fost adǎugați 10 mL HCl 0,1 M (soluție preparată din: 1) HCl concentrat 37 %, = 1,190 g/cm3, Merck Chemicals, Germania și 2) apă bidistilată), probele fiind lǎsate ȋn repaus ȋncǎ o orǎ. Extractul a fost separat prin filtrare la vid (creuzet filtrant G3, cuarț). Spălarea reziduului a fost realizatǎ în două etape, cu câte 5 mL de HCl 0,1 M. Soluțiile au fost aduse la balon cotat de 25 mL cu HCl 0,1 M.

Seleniul a fost determinat printr-o metodǎ spectrofotometricǎ cu 3,3’-diaminobenzidinǎ, modificatǎ. La 5 ml soluție de analizat au fost adǎugați 5 ml soluție de 3,3’-diaminobenzidinǎ 0,1 % ȋn HCl 0,1 N (preparatǎ din 3,3’-diaminobenzidinǎ, reactiv de puritate spectralǎ, Fluka), s-a agitat energic, soluția fiind lǎsatǎ ȋn repaus la temperatura camerei timp de 50-60 de minute, dupǎ care au fost realizate citirile la spectrofotometru. Pentru citirea absorbanțelor a fost utilizat un spectrofotometru UV-VIS Reileigh UV 9200 (Beijing Reileigh Analytical Instrument Corporation, China), citirile efectuȃndu-se ȋn cuvǎ de cuarț de 1 cm. Citirile au fost efectuate la 348 nm, fațǎ de soluția de 3,3’-diaminobenzidinǎ 0,05 M ȋn HCl 0,1 % (martorul). Culoarea galbenǎ a soluției este stabilǎ 4-5 ore.

Pentru etalonare au fost preparate 15 soluții etalon cu concentrații cuprinse între 0,05–1,5 mg Se / L prin diluția (cu apă bidistilată) la baloane cotate de 25 mL a unei soluții standard de 10 mg Se/ L (Laboratory Reagents for Atomic Spectroscopy, BDH Chemicals Ltd, UK). Citirea absorbanțelor a fost realizatǎ ȋn aceleași condiții ca și probele de analizat. Ȋn fig. 8.1. este redat graficul curbei de calibrare.

Pentru determinarea lungimii de undǎ optime de lucru, ȋn prealabil a fost trasat spectrul de absorbție (fig. 8.2) al unei soluții ȋn care seleniul a fost adǎugat ȋn concentrație de 0,4 mg/l, utilizȃndu-se o soluție etalon de 1 mg/l.

Domeniul de liniaritate al metodei a fost situat ȋntre 0,05 și 1,5 mg Se/l.

Fig. 8.1. Curba de calibrare pentru determinarea spectrofotometricǎ a seleniului cu 3,3’-diaminobenzidinǎ

Fig. 8.2. Spectrul de absorbție al complexului ȋn cazul unei concentrații de seleniu de 0,4 mg/l

(concentrația soluției etalon utilizate: 1 mg Se/l)

Pentru estimarea factorului de recuperare și a unor parametri de performanțǎ analiticǎ ai metodei a fost utilizat geostandardul AS-1. S-a optat pentru acest geostandard deoarece are compoziția chimicǎ și mineralogică a matricii asemănătoare cu probele de sol analizate. Geostandardul utilizat conține toate microelementele (inclusiv microelemente) caracteristice rocilor andezitice (Cd, Co, Cr, Cu, Ga, Ge, La, Mo, Ni, Pb, Sn, Ti, V, Y, Zn etc.) în concentrație de 0,01 % (1 g / g).

Cantitǎți de aproximativ 0,1 g din materialul de referință au fost prelucrate ȋn același mod ca probele de sol iar seleniul a fost determinat ȋn același mod. Factorul mediu de recuperare al seleniului, ȋn urma adaosului unor cantitǎți diferite de seleniu, estimat în raport cu acest geostandard a fost cuprins între 99,14 – 99,61 % (media: 99.37 %).

Precizia intermediarǎ a fost evaluatǎ prin determinarea seleniului dintr-o probǎ de sol (n=10), considerȃndu-se o probabilitate ≥ 95 %. Concentrația medie obținutǎ a fost de 0,530 ± 0,042 mg/kg (media ± DS). Intervalul de ȋncredere calculat a fost de ± 0,038.

Digestia probelor de boabe de porumb și determinarea conținutului total de seleniu

Probele de porumb au fost mineralizate prin digestie umedǎ. Cantitǎți de aproximativ 20 g au fost tratate cu aproximativ 35-40 mL HNO3 concentrat (65 %, = 1,41 g / cm3, Merck Chemicals, Germania) și lǎsate ȋn repaus la temperatura camerei (T = 24–29oC) aproximativ o oră, probele fiind apoi menținute 2-3 ore pe baie de apă în flacoane cu refrigerent de reflux și pe baie de nisip la aproximativ 150oC până la reziduu umed. După răcire reziduul a fost reluat cu 20-30 mL amestec 1:1 (V:V)de HNO3 concentrat și HClO4 concentrat, la temperatura camerei aproximativ o oră, apoi pe baie de apă cu refrigerent de reflux 2-3 ore și ȋn final pe baie de nisip la 190-200oC până la digestia completă a probei. După răcire, probele au fost reluate cu 15 ml HNO3 1 % și lăsate în repaus la temperatura camerei aproximativ o oră. Extractele obținute au fost separate prin filtrare la vid (creuzet filtrant G3, cuarț), pentru eliminarea componentelor minerale insolubile (silice) din amestec, apoi au fost aduse la balon cotat de 25 mL cu HNO3 1 %. În fiecare balon a fost adǎugatǎ soluție de CsCl în calitate de tampon spectral. Soluțiile finale obținute au avut o concentrație de 0,1 % CsCl și 1 % HNO3.

Determinarea seleniului din soluțiile mineralizate obținute a fost efectuatǎ printr-o metodǎ de spectrometrie de absorbție atomicǎ. A fost utilizat un spectrometru de absorbție atomicǎ model Analytik Jena Vario 6 ȋmpreunǎ cu alte accesorii.

Nu a fost disponibil un material de referințǎ certificat cu o matrice avȃnd compoziția asemǎnǎtoare cu cea a probelor analizate. Pentru estimarea factorului de recuperare și a unor parametri de performanțǎ analiticǎ s-a utilizat Vitamax, capsule moi (Glaxo SmithKline, UK). Ȋn compoziția acestei forme farmaceutice seleniul (conținut declarat: 50 μg/capsulǎ) se gǎsește ȋn formǎ organicǎ (drojdie ȋmbogǎțitǎ ȋn seleniu – predominǎ selenometionina), matricea fiind deasemenea preponderent organicǎ. Au fost utilizate 3 capsule diferite. Factorul mediu de recuperare, dupǎ adiția unor cantitǎți variabile de seleniu, a fost cuprins ȋntre 98,61 și 99,44 % (media: 99,37 %).

Pentru evaluarea preciziei intermediare a fost analizatǎ o probǎ de porumb (n=10), considerȃndu-se o probabilitate ≥ 95 %. Concentrația medie a fost de 106,420 ± 1,533 μg/kg (media ± DS; intervalul de ȋncredere calculat: ± 1,096).

Prelucrarea statisticǎ

Pentru toate calculele statistice și pentru construcția reprezentǎrilor grafice a fost utilizat Microsoft Office Excel 2007 cu Data Analysis toolpack.

Fig. 8.3. Harta cu zonele aproximative de prelevare a probelor de sol și porumb

(segment de hartǎ – dupǎ Karpatia Terkepmuhely Kft, 2010)

TABELUL 8.I. Zonele de proveniențǎ ale solurilor analizate și clasificarea taxonomicǎ

VIII.3. Rezultate

Concentrațiile seleniului total din probele de sol și din probele de boabe de porumb corespondente, precum și rapoartele acestor concentrații și conținutul aproximativ de materie organicǎ al solurilor analizate sunt redate ȋn tabelul 8.II, fiind calculate și mediile pentru fiecare zonǎ de prelevare.

TABELUL 8.II. Concentrațiile seleniului ȋn soluri și ȋn boabele de porumb

Valorile unor parametri fizico-chimici ai solurilor analizate (pH, Eh, rH, CE, TSS) sunt prezentate ȋn tabelul 8.III, fiind redate și mediile pentru fiecare zonǎ ȋn parte.

Corelația ȋn ansamblu dintre concentrațiile de seleniu total din sol și concentrațiile de seleniu total din probele de porumb (boabe) este redatǎ ȋn fig. 8.2. A fost construitǎ atȃt o curbǎ de regresie liniarǎ (trasatǎ cu verde), cȃt și o curbǎ de regresie neliniarǎ (polinomialǎ de gradul 2, trasatǎ cu roșu). Ȋn fig. 8.2 sunt redate și ecuațiile corespunzǎtoare curbelor de regresie.

TABELUL 8.III. Parametrii fizico-chimici ai solurilor analizate

Fig. 8.4. Corelația dintre concentrația seleniului total din sol și concentrația seleniului total din boabele de porumb

Ȋn tabelul 8.III sunt redate corelațiile dintre concentrația totalǎ de seleniu din sol, concentrația totalǎ de seleniu din boabele de porumb și ceilalți parametri ai solului ce au fost determinați. Au fost calculați atȃt coeficienții de corelație (r) aferenți regresiei de tip liniar cȃt și rapoartele de corelație (η) aferente modelului de regresie polinomialǎ de gradul 2.

TABELUL 8.IV. Corelații ȋntre concentrația seleniului total din sol, concentrația seleniului total din boabele de porumb și parametrii fizico-chimici ai solului

Parametrii statistici de ansamblu referitori la concentrațiile seleniului total ȋn probele de sol și ȋn probele de boabe de porumb și la conținutul aproximativ de materie organicǎ al solurilor sunt redați ȋn tabelul 8.V iar cei referitori la parametrii fizico-chimici ai solurilor sunt redați ȋn tabelul 8.VI.

TABELUL 8.V. Parametrii statistici per ansamblu ai concentratiilor seleniului total ȋn sol, concentrațiilor seleniului total ȋn boabele de porumb și conținutului de materie organicǎ ȋn sol

TABELUL 8.VI. Parametrii statistici per ansamblu ai parametrilor fizico-chimici ai solului

Ȋn fig. 8.5 și fig. 8.6 sunt redate histogramele de frecvențǎ pentru concentrația seleniului total ȋn soluri, respectiv pentru concentrația seleniului total ȋn probele de boabe de porumb. Frecvența a fost calculatǎ pentru intervale de concentrație de 0,05 mg/kg ȋn cazul fig. 8.5 și de 8 μg/kg ȋn cazul fig. 8.6.

Fig. 8.5. Histograma de frecvențǎ pentru concentrația seleniului total ȋn sol

Fig. 8.6. Histograma de frecvențǎ pentru concentrația seleniului total ȋn boabele de porumb

VIII.4. Discuții

Concentrațiile seleniului total ȋn probele de sol s-au situat ȋntre 0,07 mg/kg și 0,68 mg/kg (tabelul 8.II). Din punct de vedere al zonelor de prelevare, cea mai micǎ concentrație medie a fost obținutǎ pentru zona Z12 (com. Brusturi, sat Brusturi, NT), de 0,11 ± 0,04 mg/kg. Concentrații aproape la fel de mici au fost obținute și pentru zonele Z13 (com. Brusturi, sat Groși, NT), Z14 (com. Boroaia, sat Boroaia, SV) și Z15 (com. Drǎgǎnești, sat Drǎgǎnești, NT), de 0,13 ± 0,03, 0,13 ± 0,03, respectiv 0,13 ± 0,04 mg/kg. Toate aceste zone sunt ȋnvecinate (Z12 – Z15). Concentrațiile cele mai mari au fost obținute ȋn cazul zonelor Z17 (orș. Roznov, NT) și Z21 (com. Drǎgǎnești, sat Șoimǎrești, NT), de 0,57 ± 0,08, respectiv 0,61 ± 0,04 mg/kg.

Concentrațiile seleniului total ȋn sol au avut o distribuție aproximativ gaussianǎ (fig. 8.5), deviatǎ ȋnsǎ spre stȃnga. Cele mai frecvente concentrații au fost cele cuprinse ȋntre 0,25 și 0,30 mg/kg.

Concentrațiile seleniului total ȋn probele de boabe de porumb s-au situat ȋntre 9,21 și 106,62 μg/kg (tabelul 8.II). Cea mai micǎ concentrație medie s-a obținut ȋn cazul zonei Z15 (com. Drǎgǎnești, sat Drǎgǎnești, NT), existȃnd corelație cu nivelul de seleniu din sol, ȋn aceastǎ zonǎ concentrațiile seleniului ȋn sol fiind printre cele mai mici determinate. Cea mai mare concentrație medie a seleniului total ȋn porumb (boabe) s-a determinat ȋn cazul zonei Z17 (orș. Roznov, NT), fiind de 106,26 ± 0,37 μg/kg, observȃndu-se corelația cu nivelul seleniului total din sol, ȋn aceastǎ zonǎ concentrația medie a seleniului total din sol fiind a doua ca mǎrime din seria de 27 de zone.

Distribuția valorilor concentrațiilor de seleniu total ȋn boabele de porumb a fost aproximativ de tip gaussian (fig. 8.6), observȃndu-se o deviație spre stȃnga, la fel ca ȋn cazul distribuției concentrațiilor din sol. Frecvența cea mai mare au avut-o probele avȃnd concentrații cuprinse ȋntre 32 și 40 μg/kg.

Concentrația medie a seleniului total pentru ȋntregul set de probe analizate a fost de 0,27 ± 0,14 mg/kg (tabelul 8.V), fiind cu aproximativ o treime mai micǎ decȃt concentrația medie a seleniului total ȋn soluri calculatǎ la nivel global (aproximativ 0,38 ± 0,25 mg/kg, dupǎ Kabata-Pendias et Pendias, 2001).

Concentrația medie obținutǎ ȋn cadrul acestui studiu ȋn cazul solurilor din zona Moldovei este practic egalǎ cu cea obținutǎ ȋn cazul solurilor din zona Depresiunii Fǎgǎraș (0,268 ± 0,133 mg/kg, dupǎ Lǎcǎtușu et al, 2012b), dar mai micǎ decȃt cea calculatǎ ȋn cazul solurilor din Nord-Vestul Deltei Dunǎrii (0,648 ± 0,239 mg/kg, dupǎ Lǎcǎtușu et al, 2012c) și de pe vǎile rȃurilor Cǎlmǎțui și Buzǎu (0,766 ± 0,225 mg/kg, dupǎ Lǎcǎtușu et al, 2012d). Totuși concentrația medie calculatǎ conform datelor din prezentul studiu este mai mare decȃt cea calculatǎ ȋn cazul solurilor din Sud-Estul Cȃmpiei Romȃne (0,237 ± 0,830 mg/kg, dupǎ Lǎcǎtușu et al, 2010) și din centrul și Sudul Dobrogei (0,143 ± 0,76 mg/kg, dupǎ Lǎcǎtușu et al, 2010). Toate aceste comparații se referǎ la concentrațiile medii ale seleniului total din orizontul A.

Concentrația medie a seleniului total din zona Moldovei, Romȃnia este comparabilǎ cu cele estimate ȋn solurile din Belgia (de la 0,25 la 0,46 mg/kg, ȋn funcție de clasa de sol – dupǎ De Temmerman et al, 2004) și cele din Iran (from 0,04 to 0,45 mg/kg, dupǎ Nazemi et al, 2010) dar mai micǎ decȃt cea din zona Murcia-Spania (0,37 ± 0,16 mg/kg, dupǎ Perez-Sirvent et al, 2010) și majoritatea celor din nordul Indiei (ȋntre 0,207 și 0,545 mg/kg – dupǎ Yadav et al, 2005).

Ȋn ultimele decenii seleniul a fost introdus ȋn compoziția unor ȋngrǎșǎminte chimice complexe, alǎturi de nutrienți de bazǎ și de alte microelemente. A fost evidențiat faptul cǎ aplicarea de seleniu sub formǎ de ȋngrǎșǎmȃnt duce la creșterea concentrației seleniului total ȋn sol și ȋn plantele cultivate pe acesta (Mikkelsen et al, 1989). Este posibil ca ȋn cazul unora dintre probele de sol și porumb boabe din experimentul curent conținutul total de de seleniu din sol și implicit din boabele de porumb sǎ fi fost influențate de aplicarea anterioarǎ a ȋngrǎșǎmintelor conținȃnd seleniu. Nu doar ȋngrǎșǎmintele chimice pot crește conținutul de seleniu al solurilor și plantelor de culturǎ, ci și fertilizatorii naturali, avȃnd un conținut ridicat de materie organicǎ și de seleniu. S-a constatat cǎ solurile prelevate din zonele de culturǎ au un conținut total de seleniu mai mare decȃt cele prelevate din zonele cu vegetație sǎlbaticǎ (Perez-Sirvent et al, 2010), fapt ce ar putea fi explicat prin utilizarea de ȋngrǎșǎminte cu seleniu.

Concentrația medie a seleniului total ȋn probele de boabe de porumb recoltate din zona Moldovei, Romȃnia a fost de 45,38 ± 23,77 mg/kg. Aceastǎ concentrație medie este de aproximativ 10 – 80 de ori mai micǎ decȃt cele calculate ȋn unele zone din China (Wang et al, 2012).

Corelația dintre concentrațiile de seleniu total ȋn soluri și concentrațiile acestuia ȋn boabele de porumb a fost bunǎ (fig. 8.4), evidențiindu-se dependența conținutului de seleniu ȋn porumb de cel din sol.

Corelațiile dintre parametrii fizico-chimici ai solului și concentrațiile seleniului total ȋn sol sau porumb boabe au fost ȋn mare parte nesemnificative (tabelul 8.IV), sugerȃnd faptul cǎ acești parametri nu influențeazǎ ȋn mod individual concentrația de seleniu din sol sau disponibilitatea sa pentru plante. Valori ale r sau η de 0,15-0,25 au fost obținute ȋn cazul corelațiilor dintre CE, pH și TSS și concentrațiile de seleniu din sol sau porumb, dar totuși semnificația statisticǎ este slabǎ. Lǎcǎtușu et al (2012c) au obținut o corelație inversǎ ȋntre concentrația seleniului total ȋn solurile din Delta Dunǎrii și pH, ȋn cazul unui model de regresie liniarǎ, r fiind de -0,464866.

pH-ul solurilor analizate a variat ȋntre 5,09 și 7,96, media fiind de 6,34 ±0,56 (aciditate slabǎ). Majoritatea solurilor au avut aciditate slabǎ sau au fost neutre. Ȋn alte zone din Romȃnia s-a constatat cǎ, per ansamblu, solurile au fost acide (ȋn Depresiunea Fǎgǎraș, dupǎ Lǎcǎtușu et al, 2012b) sau alcaline (ȋn Delta Dunǎrii și vǎile rȃurilor Cǎlmǎțui și
Buzǎu – dupǎ Lǎcǎtușu et al, 2012c, respectiv Lǎcǎtușu et al, 2012d).

Conținutul estimat de materie organicǎ al solurilor analizate s-a situat ȋn limite medii, conținutul mediu pe zone situȃndu-se ȋntre 2,62 și 7,72 %. Metoda de estimare a conținutului de materie organicǎ prin determinarea pierderii de masǎ ȋn urma calcinǎrii poate da unele erori, ȋn schimb este ușor de aplicat, fiind larg utilizatǎ ȋn analizele de rutinǎ pentru sol, ȋn ciuda faptul cǎ nu este foarte exactǎ (Howard et Howard, 1990).

Existǎ puține studii publicate pȃnǎ ȋn prezent referitoare la conținutul de seleniu ȋn plantele de porumb cultivate ȋn Romania și ȋn cereale, ȋn general. Ȋn zona Copșa Micǎ conținutul mediu de seleniu ȋn boabele de porumb a fost de 114 μg/kg iar ȋn grȃu de 133 μg/kg (Stanciu-Burileanu (Aldea) et al, 2010). Ȋn cadrul altui studiu a fost determinat conținutul de seleniu dintr-un sortiment de grȃu, conținutul fiind mult mai mic, de 24,18 μg/kg (Mencinicopschi G et al, 2012). Ȋn cadrul altui studiu ȋn cadrul cǎruia a fost determinat conținutul de seleniu din nutrețuri combinate și din diverse plante furajere provenind din exploatații agricole din Dobrogea s-a constatat cǎ aproximativ 93 % dintre produsele analizate au avut un conținut deficitar ȋn seleniu (Serdaru et al, 2003).

VIII.5. Concluzii

Concentrațiile seleniului total ȋn probele de sol analizate au variat ȋntre 0,07 și 0,68 mg/kg, cu o medie de 0,27 mg/kg. Aceastǎ concentrație medie este cu aproximativ o treime mai micǎ decȃt concentrația medie a seleniului total ȋn soluri, la nivel mondial. Aceeași concentrație medie a mai fost obținutǎ anterior și ȋn altǎ zonǎ din Romȃnia (Depresiunea Fǎgǎraș). Ȋn Romȃnia, ȋn cazul zonelor cu soluri preponderent aluvionare, concentrațiile medii ale seleniului determinate anterior au fost mai mari decȃt cele estimate ȋn cadrul prezentului studiu. Ȋn cazul zonelor cu alte tipuri de soluri concentrațiile au fost ușor mai mici.

Concentrațiile seleniului total ȋn probele de porumb (boabe) au variat ȋntre 9,21 și 106,62 μg/kg, cu o medie de 45,38 μg/kg.

Majoritatea solurilor au avut aciditate slabǎ sau reacție neutrǎ. Doar ȋn cȃteva zone de prelevare solurile au fost moderat acide iar cele foarte acide au fost prezente doar ȋn aproximativ 3 puncte de prelevare.

Corelația dintre concentrațiile seleniului total ȋn sol și concentrațiile seleniului total ȋn boabele de porumb este semnificativǎ și puternicǎ, luȃnd ȋn considerare ansamblul de valori obținute.

Corelațiile dintre parametrii fizico-chimici ai solurilor și concentrațiile seleniului total ȋn sol și porumb sunt nesemnificative Ȋn cazul anumitor zone corelația este mai slabǎ, fapt datorat probabil anumitor proprietǎți specifice ale solurilor respective și condițiilor microclimatice din zona respectivǎ.

CAPITOLUL IX

PRODUSELE ALIMENTARE DE ORIGINE VEGETALĂ – SURSE DE SELENIU PENTRU ORGANISM

IX.1. Introducere

Aportul de seleniu ȋn cantitǎți optime este absolut necesar pentru buna funcționare a organismului uman și a organismelor animale, ȋn general.

Deficitul de seleniu poate duce la apariția sau accentuarea unor boli cardiovasculare, la apariția cancerului (Foster et Sumar, 1997), la slǎbirea sistemului imunitar și la apariția hipotiroidismului (Reilly, 2006). Maladiile Keshan și Kashin-Beck sunt endemice ȋn unele zone din Asia, ȋn special ȋn China, zone ȋn care conținutul de seleniu ȋn soluri este foarte scǎzut (Reilly, 2006; Saxena et Jaiswal, 2007). Ȋn cantitǎți mari seleniul poate avea efecte toxice (Reilly, 2006). Existǎ unele zone ȋn lume unde conținutul de seleniu ȋn soluri este foarte ridicat. Ȋn aceste zone apar seleniozele endemice, ce se manifestǎ prin cǎderea pǎrului, unghii friabile, disfuncții gastrointestinale și neurologice și rash cutanat (Reilly, 2006; Yang et Zhou, 1994).

Aportul de seleniu prin alimentație la om depinde ȋn primul rȃnd de concentrațiile sale ȋn alimente și de cantitatea de alimente consumatǎ, din acest aspect rezultȃnd și importanța cunoașterii nivelurilor de seleniu ȋn produsele alimentare. Aportul de seleniu prin alimentație depinde deasemenea și de biodisponibilitatea sa (Reilly, 2006; Pappa et al, 2006).

Conținutul de seleniu ȋn alimente variazǎ din punct de vedere geografic ȋntre țǎri, cȃt și ȋn cadrul aceleiași țǎri. Nivelurile de seleniu ȋn soluri și biodisponibilitatea sa pentru plante se reflectǎ direct ȋn conținutul sǎu ȋn plantele cultivate pe solurile respective (Moreno-Rodriguez, 2005; Navarro-Alarcon et Cabrera-Vique, 2008). Biodisponibilitatea seleniului pentru plante depinde ȋn primul rȃnd de formele chimice ale seleniului prezente ȋn sol, dar este influențatǎ și de unii parametri fizico-chimici ai solului. Absorbția Se(VI) este ȋn general mai mare decȃt cea a Se(IV) (Moreno-Rodriguez, 2005; Aro et al, 1995). Conținutul de seleniu ȋn produsele alimentare de origine animalǎ depinde de conținutul sǎu ȋn furajele consumate de animale (Barclay et al, 1995; Navarro-Alarcon et Cabrera-Vique, 2008).

Un alt factor care influențeazǎ nivelurile seleniului ȋn produsele alimentare este conținutul de proteine din alimente, deoarece aminoacizii cu sulf pot fi ȋnlocuiți de cǎtre selenoaminoacizi (selenometionina, selenocisteina sau selenocistationina), datoritǎ aimilaritǎților fizico-chimice. Ȋn plante, compușii cu seleniu absorbiți sunt utilizați ȋn special pentru biosinteza de selenometioninǎ și selenocisteinǎ, care sunt apoi ȋncorporați ȋn proteinele vegetale. Seleniul din proteinele vegetale ce intrǎ ȋn compoziția nutrețurilor animalelor este preluat de acestea și acumulat, seleniul fiind ȋncorporat ȋn proteinele animale (Reilly, 2006; Navarro-Alarcon et Cabrera-Vique, 2008). Selenometionina este ȋncorporatǎ ȋn proteine ȋn mod nespecific, ȋn locul metioninei (Thomson, 1998; Reilly, 2006).

Activitǎțile agricole pot influuența conținutul de seleniu ȋn produsele alimentare. Ȋn unele zone se utilizeazǎ fertilizatori chimici ce conțin și seleniu, ȋn vederea creșterii nivelurilor de seleniu ȋn plantele de culturǎ și de a crește indirect aportul de seleniu al oamenilor (Aro et al, 1995; Pyykko et al, 1988).

Procesarea alimentelor sau a produselor intermediare poate duce la scǎderea conținutului de seleniu, prin diferite mecanisme. Prepararea termicǎ a alimentelor (fierberea, prǎjirea, coacerea etc) pot reduce conținutul de seleniu al alimentelor ȋn anumite situații, datoritǎ volatilizǎrii (Dumont et al, 2006).

Scopul acestui studiu a fost de a determina conținutul ȋn seleniu al unor produse alimentare de origine vegetalǎ și de a compara valorile obținute cu cele obținute ȋn cadrul altor studii.

IX.2. Materiale și metode

Prelucrarea probelor

Majoritatea produselor alimentare au fost achiziționate din piețele și supermarketurile din Municipiul Iași ȋn perioada aprilie-august 2013. O micǎ parte dintre produse au fost culese direct din zonele de culturǎ. Pentru fiecare tip de produs alimentar s-au achiziționat/prelevat ȋntre 1 și 3 produse individuale.

Produsele cu un conținut mare de apǎ și un conținut de seleniu estimat ȋn prealabil a fi mic, pe baza rezultatelor altor studii (ȋn special legumele, fructele, cartofii și ciupercile), au fost ȋn prealabil deshidratate. Unde a fost cazul, fructele și legumele au fost spǎlate cu apǎ distilatǎ și uscate cu șervețele de hȃrtie apoi s-a efectuat separarea pǎrților comestibile, care au fost apoi tǎiate ȋn fragmente. Produsele tǎiate au fost cȃntǎrite, apoi uscate la etuvǎ la 50-80o C pȃnǎ la masǎ constantǎ. Produsele deshidratate au fost cȃntarite din nou și pǎstrate ȋn recipiente etanșe pȃnǎ ȋn momentul analizei.

Digestia probelor și determinarea conținutului de seleniu

Determinarea seleniului din produsele alimentare s-a efectuat ȋn același mod ca pentru probele de boabe de porumb, dupǎ metodologia descrisǎ ȋn Capitolul VIII – „Corelații ȋntre conținutul ȋn seleniu al solului și concentrațiile acestuia ȋn cereale (porumb)”.

Prelucrarea statisticǎ

Pentru prelucrarea statisticǎ a datelor a fost utilizat Microsoft Office Excel 2007 cu Data Analysis toolpack. Pentru fiecare tip de produs alimentar, acolo unde a fost cazul, a fost calculat conținutul mediu ȋn seleniu și deviația standard, atȃt pentru produsul deshidratat supus analizei (unde a fost necesarǎ deshidratarea prealabilǎ), cȃt și pentru produsul ca atare. Unde a fost necesarǎ deshidratarea, concentrația de seleniu ȋn produsul ca atare a fost calculatǎ pe baza concentrației seleniului determinatǎ ȋn produsul deshidratat și pe raportul dintre masa produsului deshidratat și a produsului ca atare.

IX.3. Rezultate

Concentrațiile seleniului ȋn diferitele produse alimentare sunt redate ȋn tabelul 9.I și fig. 9.1. Ȋn tabelul 9.I sunt redate și cantitǎțile de probǎ analizate, precum și concentrațiile seleniului ȋn proba analizatǎ (produsul alimentar ca atare sau produsul alimentar deshidratat, acolo unde a fost necesarǎ deshidratarea).

Ȋn fig. 9.1A sunt prezentate separat, sub formǎ graficǎ, concentrațiile seleniului ȋn fǎina de grȃu și ȋn produsele derivate.

TABELUL 9.I. Concentrațiile seleniului ȋn unele produse alimentare de pe piața din Romȃnia

Fig. 9.1. Conținutul de seleniu ȋn unele produse alimentare de origine vegetalǎ de pe piața din Romȃnia; A – conținutul de seleniu ȋn fructe, legume, leguminoase și alte categorii de alimente; B – conținutul de seleniu ȋn fǎina de grȃu și ȋn produsele alimentare derivate

IX.4. Discuții

Pȃnǎ ȋn prezent existǎ foarte puține studii publicate referitoare la conținutul de seleniu ȋn produsele alimentare de pe piața din Romȃnia.

Nivelul mediu de seleniu din mere determinat (1,03±0,06 μg/kg) este aproximativ de același ordin de mǎrime cu cele gǎsite ȋn Grecia și Portugalia (1,4±0,2, respectiv 0,7 μg/kg – dupǎ Pappa et al, 2006; Ventura et al, 2009), dar mai mic decȃt cele din Australia și Croația (4,5, respectiv 8,8 ± 1,6 μg/kg – dupǎ Klapec et al, 2004; Pyrzynska et al, 2009).

Concentrația medie de seleniu determinatǎ ȋn cartofi (7,60±0,70 μg/kg) a fost mai mare decȃt cea din Arabia Sauditǎ, Portugalia și Slovenia (1,0±0,3, 3,9±3,2, respectiv 1,5±0,3 – dupǎ Al-Ahmary, 2009; Ventura et al, 2009; Smrkolj et al, 2005).

Conținutul mediu ȋn seleniu al ardeilor grași (0,57±0,05 μg/kg) a fost mai mic decȃt cel determinat ȋn Grecia (4,2±0,3 μg/kg – Pappa et al, 2006).

Nivelul seleniului ȋn varzǎ (4,3 μg/kg) a fost mai mic decȃt cele determinate ȋn Arabia Sauditǎ, Croația și Thailanda (Al-Ahmary, 2009; Klapec et al, 2004; Sirichakwal PP et al, 2005).

Concentrația medie a seleniului ȋn morcovi (4,11±0,12) a fost mai micǎ decȃt cea din Croația și Thailanda (Al-Ahmary, 2009; Klapec et al, 2004) și puțin mai mare decȃt ȋn Portugalia și Arabia Sauditǎ (Ventura et al, 2009; Al-Ahmary, 2009).

Concentrația seleniului a fost mai mare ȋn ceapa roșie decȃt ȋn ceapa galbenǎ. Concentrațiile seleniului ȋn ceapǎ au fost mai mari ȋn Arabia Sauditǎ, Grecia, Coreea de Sud și Croația, comparativ cu rezultatele prezentului studiu (Al-Ahmary, 2009; Pappa et al, 2006; Choi et al, 2009; Klapec et al, 2004).

Nivelul de seleniu din usturoi a fost mai mare decȃt cel determinat ȋn produsele din Grecia și Coreea de Sud (Pappa et al, 2006; Choi et al, 2009).

Concentrația seleniului ȋn roșii a fost foarte micǎ, fiind aproximativ egalǎ cu cea din Portugalia (Ventura et al, 2009), dar mai micǎ comparativ cu cele determinate ȋn Croația și Grecia (Kapec et al, 2004; Pappa et al, 2006).

Concentrația seleniului ȋn pǎtrunjel a fost de aproximativ 10 ori mai micǎ decȃt cea din Grecia și Arabia Sauditǎ (Pappa et al, 2006; Al-Ahmary, 2009).

Concentrația seleniului ȋn ciuperci a fost foarte micǎ ȋn comparație cu alte studii. Choi et al (2009) au gǎsit concentrații de aproximativ 20 de ori mai mari ȋn acceași specie de ciuperci, ȋn Coreea de Sud.

Nivelurile seleniului ȋn arahide au fost de aproximativ 10 ori mai mici comparativ cu cele din Arabia Sauditǎ și Coreea de Sud (Al-Ahmary, 2009; Choi et al, 2009).

Conținutul de seleniu ȋn orez a fost mai mic decȃt ȋn Arabia Sauditǎ și Thailanda (Al-Ahmary, 2009; Sirichakwal et al, 2005) și mai mare decȃt ȋn Grecia (Pappa et al, 2006).

Conținutul ȋn seleniu al fasolei boabe a fost aproximativ la fel cu cel din Grecia (Pappa et al, 2006) și mai mic decȃt cel din Slovenia (Smrkolj et al, 2005).

Concentrația seleniului ȋn mazǎrea verde (congelatǎ) a fost foarte redus.

Concentrațiile de seleniu ȋn fǎina de grȃu și ȋn produsele derivate (spaghete, biscuiți și pȃine) au fost neobișnuit de mari. Concentrația de seleniu ȋn fǎina de grȃu a fost mai mare decȃt cea din Coreea de Sud (Choy et al, 2009). Concentrația ȋn pȃine a fost mai mare decȃt ȋn Grecia și Arabia Sauditǎ (Pappa et al, 2006; Al-Ahmary, 2009). Ȋn cadrul unui alt studiu concentrația seleniului ȋntr-un sortiment de pȃine albǎ din Romȃnia a fost doar de 12 μg/kg iar cea ȋn fǎina albǎ de grȃu de 24 μg/kg (Mencinicopshi et al, 2012). Este posibil ca nivelurile ridicate de seleniu determinate ȋn prezentul studiu sǎ se datoreze aditivǎrii produselor cu premixuri conținȃnd compuși cu seleniu. Ȋn cazul pȃinii, pe lȃngǎ posibila suplimentare cu seleniu prin intermediul unor premixuri, este deasemenea posibil ca drojdia utilizatǎ ȋn procesul tehnologic sǎ aducǎ un aport suplimentar de seleniu ȋn pȃine.

IX.5. Concluzii

Concentrațiile seleniului ȋn produsele alimentare analizate au variat ȋn limite largi. Ȋn cele mai multe cazuri au fost situate ȋn intervalele medii observate ȋn cazul altor studii. Concentrații mari de seleniu, comparativ cu datele existente referitoare la produsele de pe piața din Romȃnia și din alte state, au fost obținute ȋn cazul fǎinii de grȃu și a produselor derivate (pȃine albǎ, biscuiți, spaghete).

Legumele au avut un conținut redus de seleniu.

CAPITOLUL X

CONCLUZII GENERALE. ELEMENTE DE ORIGINALITATE. PERSPECTIVE DE CERCETARE

Ȋn partea generalǎ a lucrǎrii au fost prezentate aspecte generale legate de prezența seleniului ȋn elementele de mediu și ȋn produsele alimentare precum și de rolul sǎu ȋn organism. Pentru elucidarea unor aspecte privind corelațiile dintre nivelul seleniului în sol și în plantele de cultură a fost menționat nivelul mediu al seleniului ȋn solurile din cȃteva zone ale lumii, precum și factorii care pot influența nivelurile acestuia ȋn soluri. Au fost menționate unele categorii de produse alimentare cu un conținut ridicat de seleniu și unii factori care ar putea influența nivelurile de seleniu ȋn produsele alimentare. De asemenea, au fost prezentate date din literatura de specialitate referitoare la conținutul de seleniu ȋn diverse produse alimentare.

Farmacocinetica compușilor cu seleniu și interconversia acestora ȋn organism este importantă pentru a putea modula aportul exogen de seleniu în funcție de necesitățile organismului și biodisponibilitatea seleniului din alimentele ingerate. Au fost descrise principalele selenoenzime și selenoproteine și au fost menționate rolurile specifice ȋn organism ale acestora. Deasemenea, au fost descrise mecanismele toxicodinamice ale compușilor seleniului, sursele intoxicațiilor cu seleniu și patologia determinatǎ de aportul excesiv de seleniu. A fost evidențiat și rolul benefic al seleniului ȋn evoluția cȃtorva patologii cu etiopatogenie diferitǎ.

Ȋn desfǎșurarea cercetǎrilor personale din cadrul studiilor de doctorat s-a plecat de la ipoteza cǎ studiul seleniului reprezintǎ ȋncǎ o prioritate, deoarece existǎ ȋncǎ controverse legate de necesarul de seleniu, unele mecanisme fiziologice ȋn care este implicat precum și oportunitatea și riscurile asociate suplimentǎrii alimentației cu seleniu. Ȋn afarǎ de acestea, existǎ puține date cu privire la conținutul de seleniu ȋn solurile din Romȃnia și ȋn produsele alimentare de pe piața din Romȃnia.

Ȋn cadrul pǎrții personale (Capitolul VI) a fost evaluatǎ toxicitatea subacutǎ a selenitului de sodiu la șobolani. Intensitatea modificǎrilor patologice ale parametrilor biochimici și hematologici și ale structurii histologice la nivel renal și hepatic a fost proporționalǎ cu doza de selenit administratǎ. Activitatea sericǎ a transaminazelor și nivelurile serice ale bilirubinei totale, bilirubinei directe și ale colesterolului total au crescut proporțional cu doza administratǎ, iar numǎrul eritrocitelor, concentrația hemoglobinei și valorile hematocritului au scǎzut proporțional cu doza administratǎ. La nivel hepatic cele mai frecvente tipuri de modificǎri au fost degenerarea hidropicǎ, ectazia vascularǎ și edemul perivascular și prezența unor zone de necrozǎ. Celulele ovale au fost prezente în mod semnificativ numai în ficatul șobolanilor care au primit cea mai mare dozǎ de selenit (3 mg Se+4/ kg corp), ȋn acest caz reprezentȃnd o dovadǎ a intensitǎții leziunilor hepatice, deoarece celulele ovale sunt activate numai ȋn cazul leziunilor hepatice severe în anumite condiții, în scopul de a susține creșterea compensatorie.

Datele obținute ȋn cadrul studiului experimental ȋntreprins pentru evaluarea acțiunii potențial protectoare a seleniului ȋn intoxicația subacutǎ cu plumb sau cadmiu (Capitolul VII) sugereazǎ faptul cǎ seleniul a manifestat aparent o oarecare acțiune protectoare fațǎ de toxicitatea hepaticǎ și renalǎ a plumbului sau cadmiului. Comparativ cu loturile care au primit doar plumb, respectiv cadmiu, coadministrarea de seleniu ȋmpreunǎ cu plumb sau cadmiu a dus la o scǎdere a activitǎților transaminazelor și a nivelurilor serice ale ureei; intensitatea și frecvența leziunilor hepatice și renale a fost mai redusǎ ȋn cazul loturilor care au primit cadmiu și seleniu sau plumb și seleniu, comparativ cu cele care au primit doar cadmiu, respectiv doar plumb.

Ȋn Capitolul VIII sunt redate concentrațiile seleniului total ȋn soluri și ȋn plantele de culturǎ (porumb). Concentrațiile seleniului total ȋn probele de sol, cȃt și ȋn probele de porumb (boabe) au variat considerabil, ȋn funcție de zonǎ. Ȋn cazul solului, concentrațiile s-au situat ȋntre 0,07 și 0,68 mg/kg, cu o medie de 0,27 mg/kg. Aceastǎ concentrație medie este cu aproximativ o treime mai micǎ decȃt concentrația medie a seleniului total ȋn soluri, la nivel mondial. Aceeași concentrație medie a mai fost obținutǎ anterior și ȋn altǎ zonǎ din Romȃnia (Depresiunea Fǎgǎraș). Ȋn Romȃnia, ȋn cazul zonelor cu soluri preponderent aluvionare, concentrațiile medii ale seleniului determinate anterior au fost mai mari decȃt cele estimate ȋn cadrul studiilor proprii; ȋn cazul zonelor cu alte tipuri de soluri concentrațiile au fost ușor mai mici.

Concentrațiile seleniului total ȋn probele de porumb (boabe) au variat ȋntre 9,21 și 106,62 μg/kg, cu o medie de 45,38 μg/kg.

Corelația dintre concentrațiile seleniului total ȋn sol și concentrațiile seleniului total ȋn boabele de porumb a fost puternic directǎ, luȃnd ȋn considerare ansamblul de valori obținute. Corelațiile dintre parametrii fizico-chimici ai solurilor și concentrațiile seleniului total ȋn sol și porumb au fost ȋn general nesemnificative.

Ȋn Capitolul IX sunt prezentate concentrațiile seleniului total ȋn unele produse alimentare de origine vegetalǎ. Concentrațiile au variat ȋn limite largi, ȋn majoritatea cazurilor situȃndu-se ȋn intervalele medii observate ȋn cazul altor studii. Concentrații mari de seleniu, comparativ cu datele existente referitoare la produsele de pe piața din Romȃnia și din alte state, au fost obținute ȋn cazul fǎinii de grȃu și a tuturor produselor derivate (pȃine albǎ, biscuiți, spaghete). Legumele au avut un conținut redus de seleniu.

Printre elementele de originalitate aduse de cercetǎrile efectuate ȋn cadrul studiilor de doctorat pot fi enumerate:

realizarea unui model experimental pentru evaluarea toxicitǎții subacute a selenitului de sodiu la șobolan, ȋn funcție de doze;

realizarea unui model experimental pentru evaluarea potențialului protector al seleniului ȋn intoxicația cu plumb sau cadmiu la șobolan;

stabilirea unor corelații ȋntre conținutul de seleniu din sol, conținutul de seleniu ȋn porumbul cultivat pe solul respectiv și unii parametri fizico-chimici ai solului.

Determinarea conținutului de seleniu dintr-un numǎr semnificativ de produse alimentare de pe piața din Romȃnia și estimarea aportului de seleniu al populației pe baza conținutului de seleniu ȋn alimente și al unor modele de rații alimentare standard reprezintǎ una dintre perspectivele de cercetare deschise de aseastă teză de doctorat.

BIBLIOGRAFIE

Al-Ahmary KM. Selenium content in selected foods from the Saudi Arabia market and estimation of the daily intake. Arab J Chem 2009; 2:95-99.

Al-Fartosi KG. Effect of selenium and lead on some blood parameters of male mice. Journal of University of Duhok 2008; 11:62-66.

Alanne M, Kristiansson K, Auro K et al. Variation in the selenoprotein S gene locus is associated with coronary heart disease and ischemic stroke in two independent Finnish cohorts. Human Genetics 2007; 122:355-365.

Amaruso MA, Witz G, Goldstein BD. Enhancement of rat and human phagocyte superoxide anion radical production by cadmium in vitro. Toxicol Lett 1982; 10:133-138.

Anikina LV. Selenium as a Toxic Element. Toxicology Letters 1995; 78:18.

Arnault I, Auger J. Seleno-compounds in garlic and onion. J Chromatogr 2006; 1112:23-30;

Agency for toxic substances and disease registry. Toxicological profile for selenium. Atlanta: Agency for toxic substances and disease registry, 2003.

Aro A, Alfthan G, Varo P. Effects of supplementation of fertilizers on human selenium status in Finland. Analyst 1995; 120:841-843.

Barclay MNI, MacPherson A, Dixon J. Selenium content of a range of UK foods. J Food Compos Anal 1995; 8:307-318.

Berry MJ, Ralston NVC. Mercury toxicity and the mitigating role of selenium. EcoHealth 2008; 5:456-459.

Bloom PR. Soil pH and the pH buffering. In: Sumner M, editor. Handbook of soil science. Boca Raton: CRC Press, 2000.

Blumenthal S, Lewand D, Sochanik A et al. Inhibition of Na+-glucose cotransport in kidney cortical cells by cadmium and copper: protection by zinc. Toxicol Appl Pharmacol 1994; 129:177-187.

Borek C. Recent advances on the nutritional effects associated with the use of garlic as a supplement. J Nutr 2001; 131:1010-1015.

Brandao R, Lara FS, Pagliosa LB, Soares FA et al. Hemolytic effects of sodium selenite and mercuric chloride in human blood. Drug Chem Toxicol 2005; 28:397-407.

Brown DG et al. Effect of dietary selenium on the gastrointestinal absorption of 75SeO3 in the rat. Int J Vitam Nutr Res 1972; 42:588-591.

Bulgariu D, Rusu C, Bulgariu L. The pH determination in heterogeneous solid/aqueous solution systems. (I) Applications in analytical geochemistry. Analele Științifice ale Universitǎții din Oradea – fascicula Chimie 2005; 12:37-52.

Bulgariu D, Filipov F, Rusu C, Bulgariu L. Pedogeochemistry of hortic anthrosol from Copou greenhouse – Iași. Lucrǎri Științifice – Seria Agronomie 2012; 55:143-148).

Burk RF, Norsworthy B, Hill KE et al. Effects of chemical form of selenium on plasma biomarkers in a high-dose human supplementation trial. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev 2006; 15:804-810.

Cao S, Durrani FA, Rustum YM. Selective modulation of the therapeutic efficacy of anticancer drugs by selenium containing compounds against human tumor xenografts. Clinical Cancer Research 2004; 10:2561–2569.

Chang JC, Gutenmann WH, Reid CM et al. Selenium content of Brazil nuts from two geographic locations in Brazil. Chemosphere 1995; 30:801-802.

Chattopadhyay S, Pal S, Ghosh D et al. Effect of dietary co-administration of sodium selenite on sodium arsenite-induced ovarian and uterine disorders in mature albino rats. Toxicol Sci 2003; 75:412-422.

Cheng WH, Quimby FW, Lei XG. Impacts of glutathione peroxidase-1 knockout on the protection by injected selenium against the pro-oxidant-induced liver aponecrosis and signaling in selenium-deficient mice. Free Radical Biol & Med 2003; 34:918-927.

Chilimba ADC, Young SD, Black CR et al. Maize grain and soil surveys reveal suboptimal dietary selenium intake is widespread in Malawi. Sci Rep 2011; 1:72; doi:10.1038/srep00072.

Choi Y, Kim J, Lee HS, et al. Selenium content in representative Korean foods. J Food Compos Anal 2009; 22:117-122.

Chunheing T, Gali T, Piambo G.Analyses récentes de la composition de la noix du Brésil Bertholletia excelsa. Bois Forets Tropiq 2004; 280:91-98.

Clark LC, Combs GF, Turnbull BW et al. Effects of selenium supplementation for cancer prevention in patients with carcinoma of the skin. JAMA 1996; 276:1957-1963.

Cockell KA, Brash AR, Burk RF. Influence of selenium status on activity of phospolipid hydroperoxide GP in rat liver and testis in comparison with other selenoproteins. Nutr Biochem 1996; 7:333-338.

Combs GF, Garbisu C, Yee BC et al. Bioavailability of selenium accumulated by selenite-reducing bacteria. Biological Trace Element Research 1996; 52:209–225.

Corcoran NM, Najdovska M, Costello AJ. Inorganic selenium retards progression of experimental hormone refractory prostate cancer. Journal of Urology 2004; 171:907–910.

De Temmerman L, Waegeneers N, Thiry C, Du Laing G, Tack F, Ruttens A. Selenium content of Belgian cultivated soils and its uptake by field crops and vegetables. Article in press. Sci Total Environ 2014.

Dumont E, Vanhaecke F, Cornelis R. Selenium speciation: from food source to metabolites. A critical review. Anal Bioanal Chem 2006; 385:1304-1323.

Elrashidi MA, Adriano DC, Workman SM, Lindsay WL. Chemical equilibria of selenium in soils: a theoretical development. Soil Sci 1987; 144:141-152.

Faure P, Barclay D, Joyeux-Faure M et al. Comparison of the effects of Zn alone and Zn associated with Se and Vit. E on insulin sensitivity and oxidative stress in high-fructose-fed rats. J Trace Elem Med Biol 2007; 21:113-119.

Fernández-Martinez A, Charlet L. Selenium cycling and bioavailability: a structural chemist point of view. Rev Environ Sci Biotechnol 2009; 8:81-110.

Foster LH, Sumar S. Selenium in health and disease: a review. Crit Rev Food Sci Nutr 1997; 37:211-228.

Friedman PA, Gesek FA. Cadmium uptake by the kidney distal convoluted tubule cells. Toxicol Appl Pharmacol 1994; 128:257-263.

Gan L, Liu Q, Xu HB et al. Effects of selenium overexposure on glutathione peroxidase and thioredoxin reductase gene expressions and activities. Biol Trace Elem Res 2002; 89:165-175.

Ge H, Cai X, Tyson JF et al. Identification of selenium species in selenium-enriched garlic, onion and broccoli using high-performance ion chromatography with inductively coupled plasma mass spectrometry detection. Anal Commun 1996; 33:279-281.

Ge Y, Qi Z, Wang Y et al. Engineered selenium-containing glutaredoxin displays strong glutathione peroxidase activity rivaling natural enzyme. Int J Biochem & Cell Biol 2009; 41:900-906.

Gu QP, Ream W, Whanger PD. Selenoprotein W gene regulation by selenium in L8 cells. BioMetals 2002; 15:411-420.

Hadley KB, Sunde RA. Selenium regulation of thioredoxin reductase activity and mRNA levels in rat liver. J Nutr Biochem 2001; 12:693-702.

Hall JO. Selenium. In: Gupta RC (ed.). Veterinary toxicology – basic and clinical principles, 2nd ed. San Diego: Academic Press, 2012.

Han F, Daiwen C, Bing Y et al. Effects of different selenium sources and levels on serum biochemical parameters and tissue selenium retention in rats. Frnt Agric China 2009; 3:221-225.

Harada T, Takahashi Y. Origin of the difference in the distribution behaviour of tellurium and selenium in a soil–water system. Geochim Cosmochim Acta 2008; 72:1281–1294.

Hatfield DL, Berry MJ, Gladyshev VN, editors. Selenium – Its molecular biology and role in human health, 2nd ed. New York: Springer, 2006.

Hawkes WC, Richter BD, Alkan Z et al. Response of Se status indicators to supplementation of healthy North-American Men with high-selenium yeast. Biol Trace Elem Res 2008; 122:107-121.

Hogberg J, Alexander J. Selenium. In: Fowler BA, Nordberg GF, Nordberg M, Friberg L (eds.). Handbook on the toxicology of metals, 3rd ed. San Diego: Academic Press, 2007.

Hoppe B, Bräner AU, Kühbacher M et al. Biochemical analysis of Se-proteins expression in brain cell lines and in distinct brain regions. Cell Tis Res 2008; 332:403-414.

Howard PJA, Howard DM. Use of organic carbon and loss-on-ignition to estimate soil organic matter in different soil types and horizons. Biol Fertil Soils 1990; 9:306-310.

Hrdina J, Banning A, Kipp A, Loh G, Blaut M, Brigelius-Flohe R. The gastrointestinal microbiota affects the selenium status and selenoprotein expression in mice. J Nutr Biochem 2009; 20:638-648.

Huang Z, Li J, Zhang S, Zhang X. Inorganic arsenic modulates the expression of selenoproteins in mouse embryonic stem cell. Toxicol Lett 2009; 187:69-76.

Hwang D, Cho JS, Oh JH et al. Differentially expressed genes in transgenic mice carrying human mutant preselenin 2 (N 1411): Correlation of SelM with Alzheimer’s disease. Neurochem Res 2005; 30:1009-1019.

Hwang D, Seo S, Kim Y et al. Selenium acts as an insulin-like molecule for the down-regulation of diabetic symptoms via endoplasmic reticulum stress and insulin signaling proteins in diabetes-induced non-obese diabetic mice. J Biosci 2007; 32:723-735.

Ip C, Dong Y, Ganther H. New concepts in selenium chemoprevention. Cancer and Metastatis Reviews 2002; 21:281-289.

Jacobs M, Forst C. Toxicological effects of sodium selenite in Sprague‐Dawley rats. J Toxicol Environ Health Part A 1981; 8:575-585.

Jacobson GA, Narkowicz C, Tony YC et al. Plasma glutathione peroxidase by ELISA and relationship to selenium level. Clin Chim Acta 2006; 369:100-103.

Jia X, Li N, Chen J. A subchronic toxicity study of elemental nano-Se in Sprague-Dawley rats. Life Sciences 2005; 76:1989-2003.

Jihen EH, Imed M, Fatima H et al. Protective effects of selenium and zinc on cadmium toxicity in the liver and kidney of the rat: histology and Cd accumulation. Food Chem Toxicol 2008; 46:3522-3527.

Kabata Pendias A, Pendias H. Trace elements in soils and plants. 3rd ed. Boca Raton, Florida: CRC Press, 2001.

Kamal MA. NTP technical report on toxicity studies of sodium selenate and sodium selenite. National Institutes of Health, USA, 1994.

Kamble E, Mohsin N, Jha A et al. Selenium intoxication with selenite broth resulting in acute renal failure and severe gastritis. Saudi J Kidney Dis Transpl 2009; 20:106-111.

Karpatia Terkepmuhely Kft. Romȃnia – harta rutierǎ. Scara: 1:700000. Ediția. a 4-a. Budapesta, 2010.

Kaur R, Sharma S, Rampal S. Effect of sub-chronic selenium toxicosis on lipid peroxidation, glutathione redox cycle and antioxidant enzymes in calves. Veterinary and Human Toxicology 2003; 45:190–192.

Kim TS, Yun BY, Kim IY,Induction of the mitochondrial permeability transition by selenium compounds mediated by oxidation of the protein thiol groups and generation of the superoxide. Biochemical Pharmacology 2003; 66:2301–2311.

Kuehnelt D, Juresa D, Francesconi KA et al. Selenium metabolites in urine of cancer patients receiving L-SeMet at high doses. Toxicol Appl Pharmacol 2007; 220:211-215.

Jacevic V, Jokic G, Dragojevic-Simic V et al. Acute toxicity of sodium selenite in rodents: pathomorphological study. Mil. Med. Sci. Lett 2011; 80:90-96.

Johnsson L. Trends and annual fluctuations in selenium concentrations in wheat grain. Plant Soil 1991; 138:67-73.

Klapec T, Mandic ML, Grgic J, et al. Selenium in selected foods grown or purchased in eastern Croatia. Food Chem 2004; 85:445-452.

Lǎcǎtușu R, Aldea MM, Lǎcǎtușu AR et al. Selenium in rock-soil-plant system in the South-Eastern part of Romania. Res J Agric Sci 2010; 42:199-204.

Lǎcǎtușu R, Lungu M, Stanciu-Burileanu M et al. Selenium in the soil-plant system of the Fǎgǎraș depression. Carpath J Earth Environ Sci 2012; 7:37-46.

Lǎcǎtușu R, Stanciu-Burileanu MM, Rȋșnoveanu I et al. Selenium in soils of the Danube delta North-Western part. Present Environment and Sustainable Development 2012; 6:145-155.

Lǎcǎtușu R, Stanciu-Burileanu MM, Rȋșnoveanu I et al. Selenium in salsodisols located in the Cǎlmǎțui and Buzǎu rivers valleys. Soil Forming Factors and Processes from the Temperate Zone 2012; 11:33-42.

Leonard T, Neptun D, Popp J. Serum gamma glutamyl transferase as a specific indicator of bile duct lesions in the rat liver. Am J Pathol 1984; 116:262.

Li HF, McGrath SP, Zhao FJ. Selenium uptake, translocation and speciation in wheat supplied with selenate or selenite. New Phytologist 2008; 178: 92-102.

Longnecker MP, Taylor P, Levander OA et al. Selenium in diet, blood and toenails in relation to human health in a seleniferous area. Am J Clin Nutr 1991; 53:1288-1294.

Mencinicopschi G, Balint R, Balint L, Atudosei N, Mencinicopschi C. Fortifierea cu seleniu a fǎinii respectiv a pȃinii. Metode de determinare a conținutului de seleniu. Industrie alimentarǎ 2012; 4:197-212.

Miftode M. Seleniul și biosistemele. Iași: Ed. Gr. T. Popa, 2003.

Mikkelsen RL, Page AL, Bingham FT. Factors affecting selenium accumulation by agricultural crops. In: Jacobs LW, editor. Selenium in agriculture and the environment. Soil Science Society of America & American Society of Agronomy, 1989.

Montes-Bayón M, LeDuc DL, Terry N, Caruso JA. J Anal At Spectrom 2002; 17:872-879.

Moreno Rodriguez MJ, Cala Rivero V, Jimenez Ballesta R. Selenium distribution in topsoils and plants of a semi-arid Mediterranean environment. Environ Geochem Health 2005; 27:513-519

Moschos MP. Selenoprotein P. Cel Mol Life Sci 2000; 57:1836-1845.

Nakamuro K, Sayato Y, Tonomura M, Ose Y. Studies on selenium related compounds. III. Acute and subacute toxicity of sodium selenate. Eisei Kagaku 1974; 18:29–35.

Nandakumaron M, Dashti HM, Al-Saleh E et al. Transport kinetics of zinc, copper, selenium and iron in perfused human placental lobule in vitro. Mol Cel Biochem 2003; 252:91-96.

Navarro-Alarcon M, Cabrera-Vique C. Selenium in food and the human body: a review. Sci Total Environ 2008; 400:115-141.

Nazemi L, Nazmara S, Eshraghyan MR et al. Selenium concentration in soil of Iran. 19th World Congress of Soil Science, Soil Solutions for a Changing World; Brisbane, Australia: 1-6 august 2010 – DVD; http://www.iuss.org/19th%20WCSS/Symposium/pdf/0824.pdf.

Nogueira CW, Rocha JBT. Toxicology and pharmacology of selenium: emphasis on synthetic organoselenium compounds. Arch Toxicol 2011; 85:1313-1359.

Okamoto Y, Takashina H, Higuchi I et al. Molecular mechanism of rigid spine with musculardystrophy type 1 caused by novel mutations of SelN gene. Biomed Life Sci 2006; 7:175-183.

Olson KR. Poisoning & drug overdose, 4th ed. New York: McGraw-Hill, 2004.

Ǿarskov H, Flyvbjerg A. Selenium and human health. Lancet 2000; 356:942–943.

Pansu M, Gautheyrou J. Handbook of Soil Analysis. Mineralogical, Organic and Inorganic Methods. Berlin, Heidelberg: Springer-Verlag, 2006.

Pappa EC, Pappas AC, Surai PF. Selenium content in selected foods from the Greek market and estimation of the daily intake. Sci Total Environ 2006; 372:100-108.

Pedrero Z, Madrid Y. Novel approaches for selenium speciation in foodstuffs and biological specimens: a review. Anal Chim Acta 2009; 634:135-152.

Perez-Sirvent C, Martinez-Sanchez MJ, Garcia-Lorenzo ML et al. Selenium content in solis from Murcia region (SE, Spain). J Geochem Explor 2010; 107:100-109.

Pyrzynska K. Selenium speciation in enriched vegetables. Food Chem 2009; 114: 1183-1191.

Pyykko K, Tuimala R, Kroneld R, et al. Effect of selenium supplementation to fertilizers on the selenium status of the population in different parts of Finland. Eur J Clin Nutr 1988; 42:571-579.

Price NM, Thompson PA, Harrison PJ. Selenium: an essential element for growth of the coastal marine diatom Thalassiosira pseudonana (Bacilariophyceae). J Phycol 1987; 23:1-9.

Raines AM, Sunde RA. Selenium toxicity but not deficient or supernutritional selenium status vastly alters the transcriptome in rodents. BMC Genomics 2011; 12:26. http://www.biomedcentral.com/1471-2164/12/26, 2013.

Rayman MP. The importance of selenium to human health. Lancet 2000; 356: 233-241.

Reddy MVB, Sasikala P. Study on effect of sodium selenite on physiological and hematological alterations in Swiss albino mice. International Journal of Advanced Scientific and Technical Research 2013; 3:528-548.

Reilly C. Selenium in food and health. 2nd ed. New York: Springer, 2006.

Rengby O, Cheng Q, Vahter M et al. Highly active dimeric and low-activity tetrameric forms of Se-containing rat thioredoxin reductase 1. Free Radical Biol & Med 2009; 46:893-904.

Sadeghian S, Kojouri GA, Mohebbi A. Nanoparticles of selenium as species with stronger physiological effects in sheep in comparison with sodium selenite. Biol Trace Elem Res 2012; 146: 302-308.

Salbe AD, Levander OA. Comparative toxicity and tissue retention of selenium in Met-deficient rats fed sodium selenate or L-Se-Met. Miner. Trace Elem 1990; 120:207-212.

Saxena R, Jaiswal G. Selenium and its role in health and disease. Kuwait Medical Journal 2007; 39:10-18.

Scharpf M, Schweizer U, Arzherger T et al. Neuronal and ependymal expression of selenoproten P in the human brain. J Neural Transm 2007; 114:877-884.

Schrauzer GN, Kuehn K, Hamm D. Effects of selenium and lead on the genesis of spontaneous mammary tumors in mice. Biol Trace Elem Res 1981; 3:185–196.

Schrauzer GN. Anticarcinogenic effects of selenium. Cel Mol Life Sci 2000; 57:1864-1873.

Schrauzer GN. Effects of selenium and low levels of lead on mammary tumor development and growth in MMTV-infected female mice. Biol Trace Elem Res 2008; 125:268-275.

Schroeder HA, Mitchener M. Selenium and tellurium in rats: Effects on growth, survival, and tumors. J Nutr 1971; 101:1531-1540.

Scot ML. The selenium dilemma. J Nutr 1973; 103:803–810.

Seko Y, Imura N. Active oxygen generation as a possible mechanism of selenium toxicity. Biomedical and Environmental Sciences 1997; 10:333–339.

Serdaru M, Vlǎdescu L, Avram N. Monitoring of feeds selenium status in a Southeast Region of Romania. J Agric Food Chem 2003; 51:4727-4731.

Shah M, Kannamkumarath SS, Wuilloud JCA et al. Identification of selenium species in enriched green onions (Allium fistulum) by HPLC-ICP-MS and ESI-ITMS. J Anal At Spectrom 2004; 19:381-386.

Shand CA, Eriksson J, Dahlin AS, Lumsdon DG. Selenium concentrations in national inventory soils from Scotland and Sweden and their relationship with geochemical factors. J Geochem Explor 2012; 121:4-14.

Shirokova Y, Forkutsa I, Sharafutdinova N. Use of electrical conductivity instead of soluble salts for soil salinity monitoring in Central Asia. Irrigation and drainage systems 2000; 14:199-205.

Sirichakwal PP, Puwastien P, Polngam J, Kongkachuichai R. Selenium content of Thai foods. J Food Compos Anal 2005; 18:47-59.

Slotnick MJ, Nrigu JO. Validity of human nails as a biomarker of arsenic and selenium exposure: A review. Envir Res 2006; 102:125-139.

Smrkolj P, Pograjc L, Hlastan-Ribic C, Stibilj V. Selenium content in selected Slovenian foodstuffs and estimated daily intakes of selenium. Food Chem 2005; 90:691-697.

Spadoni M, Voltaggio M, Carcea M, Coni E, Raggi A, Cubadda F. Bioaccessible selenium in Italian agricultural soils: Comparison of the biogeochemical approach with a regression model based on geochemical and pedoclimatic variables. Sci Total Environ 2007; 376:160-177.

Spallholz JE. On the nature of selenium toxicity and carcinostatic activity. Free Radical Biology and Medicine 1994; 17:45–64.

Spallholz JE, Hoffman DJ. Selenium toxicity: cause and effects in aquatic birds. Aquatic Toxicology 2002; 57:27–37.

Spiller HA, Pfiefer E. Two fatal cases of selenium toxicity. Forensic Sci Int 2007; 171:67-72.

Stanciu-Burileanu (Aldea) MM, Stroe VM, Lǎcǎtușu R, Luca C. Analysis of selenium content of crops plant from Copșa Micǎ area. Analele Universitǎții din Craiova, seria Agriculturǎ – Montanologie – Cadastru 2010; 40:294-298.

Stanton RE, McDonald AJ. The determination of selenium in soils and sediments with 3,3’-diaminobenzidine. Analyst 1965; 90:497-499.

Stapleton SR. Selenium: an insulin-mimetic. Cel Mol Life Sci 2000; 57:1874-1879.

Stohs SJ, Bagchi D. Oxidative mechanisms in the toxicity of metal ions. Free Rad Biol Med 1995; 18:321-336.

Stranges S, Marshall JR, Natarajan R et al. Effects of long-term selenium supplementation on the incidence of type 2 diabetes. Ann Intern Med 2007; 147:217-223.

Sugiyama M. Role of cellular antioxidants in metal-induced damage. Cell Biol Toxicol 1994; 10:1-22.

Sutter ME, Thomas JD, Brown J et al. A case of selenosis caused by a nutritional supplement. Ann Internal Med 2008; 148:970-971.

Tanaka T, Kohno H, Murakami M, Kagami S, El-Bayoumy K. Suppressing effects of dietary supplementation of the organoselenium 1,4-phenylenebis(methylene)selenocyanate and the Citrus antioxidant auraptene on lung metastasis of melanoma cells in mice. Cancer Research 2000; 60:3713–3716.

Tapiero H, Townsend DM, Tew KD. The antioxidant role of selenium and selenocompounds. Biomed Pharmacother 2003; 57:134–44.

Terry N, Zayed AM, de Souza MP, Tarun AS. Selenium accumulation in higher plants. Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol 2000; 51:401-432.

Thomson CD. Selenium speciation in human body fluids. Analyst 1998; 123:827-831.

Thomson CD, Chiskolm A, McLachlan SK et al. Brazil nuts: an effective way to improve selenium status. Am J Clin Nutr 2008; 87:379-384.

Van Dael P, Davidsson L, Munoz-Box R et al. Selenium absorbtion and retention from a selenite- or selenate-fortified milk-based formula in men measured by a stable-isotope techinique. Brit J Nutr 2001; 85:157-163.

Venardos K, Ashton K, Headrick J et al. Effects of dietary selenium on post-ischemic expression of antioxidant mRNA, Mol Cel Biochem 2005; 270:131-138.

Ventura MG, Stibilj V, Freitas MC, Pacheco AMG. Determination of ultratrace levels of selenium in fruit and vegetable samples grown and consumed in Portugal. Food Chem 2009; 115:200-206.

Vincenti M, Guidetti D, Pinotti M et al. Amyotrophic Lateral Sclerosis after long-term exposure to drinking water with high selenium content. Epidemiology 1996; 7:529-532.

Wang H, Zhang J, Yu H. Elemental selenium at nano size possesses lower toxicity without compromising the fundamental effect on selenoenzymes: Comparison with Se-Met in mice. Free Radical Biol & Med 2007; 42:1524-1533.

Wang S, Liang D, Wang D, Wei W, Fu D, Lin Z. Selenium fractionation and speciation in agriculture soils and accumulation in corn (Zea mays L.) under field conditions in Shaanxi Province, China. Sci Total Environ 2012; 427-428:159-164.

Whanger PD. Selenoprotein W: a review. Cell Mol Life Sci 2000; 57:1846-1852.

Wilber CG. Toxicology of selenium: a review. Clin Toxicol 1980; 17(2):171-230.

Wuana RA, Okieimen FE. Phytoremediation potential of maize (Zea mays L). A review. Afr J Gen Agric 2010. 6:275-287.

Xing L, Chen C, Li B et al. Distribution and location of selenium and other elements in different mitochondrial compartments of human liver by neutron activation analysis. J Radioanal Nucl Chem 2006; 269:527-534.

Yadav SK, Singh I, Singh D, Han SD. Selenium status in soils of northern districts of India. J Environ Manag 2005; 75:129-132.

Yaeger MJ, Neiger RD, Holler L, Fraser TL, Hurley DJ, Palmer IS. The effect of subclinical selenium toxicosis on pregnant beef cattle. J Vet Diagn Invest 2008; 10:268–273.

Yang G, Yin S, Zhou R et al. Studies of saff maximal daily dietary selenium intake and the manifestations of clinical signs and certain biochemiacal alterations. J Trace Elem Electrol Health Dis 1989; 3:123-130.

Yang G, Zhou R. Further observation on the human maximum safe dietary selenium intake in a seleniferous area of China. J Trace Elem Med Biol 1994; 8:159-165.

Yang L, Wang W, Hou S et al. Effects of selenium supplementation on arsenism: an intervention trial in Inner Mongolia. Environ Geochem Health 2002; 24:359-374.

Zhang Y, Moore J, Frankenberger WT. Speciation of soluble selenium in agricultural drainage waters and aqueous soil-sediment extracts using hydride generation atomic absorption spectrometry. Environ Sci Technol 1999; 33:1652-1656.

Zhang J, Gao X, Zhang L, Bao Y. Biological effects of a nano red elemental selenium. BioFactors 2001; 15:27–38.

Zhang J, Wang H, Bao Y, Zhang L. Nano red elemental selenium has no size effect in the induction of selenoenzymes in both cultured cells and mice. Life Sciences 2004; 75:237-244.

Zhang J, Wang X, Xu T. Elemental selenium at nano size (nano-Se) as a potential chemopreventive agent with reduced risk of selenium toxicity: comparison with Se-Methylselenocysteine in mice. Toxicol Sci 2008; 101:22-31.

Zhang YQ, Moore JN. Selenium fractionation and speciation in a wetland system. Environ Sci Technol 1996; 30(8):2613–9.

Zhao C, Ren J, Xue C, Lin E. Study on the relationship between soil selenium and plant selenium uptake. Plant and Soil 2005; 277:197-206.

Zwolak I, Zaporowska H. Selenium interactions and toxicity: a review. Cell Biol Toxicol 2012; 28:31-46.

ANEXA 1 – Lucrǎrile publicate ȋn timpul studiilor de doctorat

(din tema tezei de doctorat)

Articole publicate în reviste cotate ISI

1. Șlencu BG, Solcan C, Ciobanu C, Avasilcǎi L, Cuciureanu R. Dose-dependent subacute toxicity of sodium selenite in male Wistar rats. Jokull 2013; 63(7):57-69.

Articole publicate în reviste indexate BDI, clasificate B+

1. Teodor V, Cuciureanu M, Șlencu BG, Zamoșteanu N, Cuciureanu R. Potential protective role of selenium in acrylamide intoxication. A biochemical study. Studia Universitatis "Vasile Goldis", Life Sciences Series 2011; 21(2):263-268.

2. Avasilcǎi L, Șlencu BG, Ciobanu C, Cuciureanu R. Effects of sodium selenite administration during diethylnitrosamine intoxication in rats. Studia Universitatis "Vasile Goldis", Life Sciences Series 2011; 21(2):275-280.

3. Șlencu BG, Ciobanu C, Cuciureanu R. Selenium content in foodstuffs and its nutritional requirement for humans. Clujul Medical 2012; 85(2):139-145.

4. Șlencu BG, Ciobanu C, Solcan C, Anton A, Ciobanu S, Solcan G, Cuciureanu R. Effect of selenium supplementation on serum iron, calcium and magnesium levels in rats exposed to cadmium or lead. Lucrǎri Științifice – Seria Medicinǎ Veterinarǎ 2013; 56:200-206.

Comunicǎri poster la manifestǎri științifice internaționale

1. Șlencu BG, Cuciureanu R. Spectrophotometric determination of selenium in foodstuffs from the Romanian market using 2,4-dinitrophenylhydrazine. 15th Panhellenic Pharmaceutical Congress; Atena, Grecia, 13-15 Mai 2011 – CD.

Comunicǎri poster la manifestǎri științifice naționale

1. Șlencu BG, Avasilcǎi L, Ciobanu C, Cuciureanu R. Dose- and dosing regimen- dependent effect of sodium selenite administration on some biochemical and haematological parameters in rats. Timmedica International Congress and Exhibition – 4th edition; Timișoara, Romănia, 16-18 iunie 2011 – CD – ISBN 978-606-8054-45-2.

2. Șlencu BG, Avasilcǎi L. Cuciureanu R. Potențialul protector al seleniului în intoxicația cu dietilnitrozaminǎ la șobolani. În: Hǎncianu M, editor. 50 de ani de învǎțǎmânt universitar farmaceutic la Iași; Iași, 6-8 octombrie 2011. Iași: Ed. “Gr. T. Popa” UMF Iași, 150-153 – ISBN 978-606-544-073-9.

3. Șlencu BG, Solcan C, Avasilcǎi L, Ciobanu C, Cuciureanu R. Cercetǎri privind toxicitatea selenitului de sodiu la șobolani. Actualitǎți și perspective în cercetarea farmaceuticǎ; Craiova, 26-28 septembrie 2012. Craiova: Sitech, 88-89 – ISBN 978-606-11-2833-4.

Comunicǎri orale la manifestǎri științifice naționale

1. Avasilcǎi L, Șlencu BG, Morariu ID, Ciobanu C, Dranca E, Cuciureanu R. Effect of diethylnitrosamine and sodium selenite administration on some biochemical and haematological parameters in rats. Timmedica International Congress and Exhibition – 4th edition; Timișoara, 16-18 iunie 2011 – CD – ISBN 978-606-8054-45-2.

ANEXA 2 – Alte lucrǎri publicate (din teme conexe)

Articole publicate ȋn reviste indexate BDI, clasificate B+

1. Ciobanu C, Șlencu BG, Cuciureanu R. Estimation of dietary intake of cadmium and lead through food consumption. Revista medico-chirurgicalǎ a Societǎții de Medici și Naturaliști Iași 2012; 116(2):617-62.

2. Ciobanu C, Șlencu BG, Cuciureanu R. FAAS determination of cadmium and lead content in foodstuffs from north-eastern Romanian market. Studia Universitatis "Vasile Goldis", Life Sciences Series 2013; 23(1):33-38.

3. Ciobanu C, Șlencu BG, Ciobanu S, Cuciureanu R. Cadmium and lead content in some foodstuffs from Romanian market. Lucrǎri Științifice – Seria Medicinǎ Veterinarǎ 2013; 56:207-214.