Rezolutia Cinetica Enzimatica a 2 (5 (4 Clorofenil) Tiofen 2 Il) 2 Hidroxiacetonitrilului

Diverse2

Rezolutia Cinetica Enzimatica a 2 (5 (4 Clorofenil) Tiofen 2 Il) 2 Hidroxiacetonitrilului

Byadmin ianuarie 1, 2024

Cuprins

Partea I

1.Obiectivele proiectului. Prezentarea generală

1.1.Tema de proiectare

1.2.Prezentarea generală a produsului

2.Prezentarea procesului. Studiu de literatură

2.1 Cianhidrine

2.2 Enantiomerie.Chiralitate.

2.3 Lipazele

2.4 Biocataliza

3. Analiza desfășurării procesului

3.1 Chimismul procesului

3.2 Studiul cinetic al procesului

3.3 Studiul termodinamic al procesului

3.4 Modelarea procesului

3.6 Lista cu utilajele și echipamentele necesare

3.7 Schema fluxului tehnologic

3.8 Descrierea fluxului tehnologic

3.9 Controlul și automatizarea procesului

4. Proiectarea tehnologică a utilajelor

4.1 Alegerea și descrierea utilajelor și echipamentelor

4.2 Dimensionarea bioreactorului

4.3 Dimensionarea pompei centrifuge

5. Aspecte ecologice și de protecția mediului

Partea a II-a: Cercetarea experimentală

1. Generalități

2. Materiale și metode

3. Partea experimentală

3.1. Sinteza cianhidrinei racemice

3.2. Acilarea chimică a cianhidrinei racemice

3.3. Acilarea enzimatică a cianhidrinei racemice

3.4. Acilarea enzimatică a cianhidrinei racemice la scară preparativă

3.5. Determinarea configurației absolute a (S)-2-(5-(4-clorofenil)tiofen-2-il)-2-hidroxiacetonitrilul

4. Concluzii

Bibliografie

Anexe

Partea I

1.Obiectivele proiectului. Prezentarea generală

1.1.Tema de proiectare

Să se proiecteze o instalație tehnologică pentru obținerea a 10 kg/șarjă de (S)-2-(5-(4-clorofenil)tiofen-2-il)-2-hidroxiacetonitril prin rezoluție cinetică enzimatică a amestecului racemic 2-(5-(4-clorofenil)tiofen-2-il)-2-hidroxiacetonitril.

1.2.Prezentarea generală a produsului

Formula structurală:

Formula moleculară: C12 H8 ClNOS

Masa moleculară: 249 [g/mol]

Compoziție elementală: C: 57%

H: 3%

Cl: 14%

N: 6%

O: 6%

S: 13%

Stare de agregare: solidă

Culoarea: galben

Punctul de topire: 121.6

Denumirea IUPAC: (S)-2-(5-(4-clorofenil)tiofen-2-il)-2-hidroxiacetonitril.

Utilizare: intermediar în industria farmaceutică.

2.Prezentarea procesului. Studiu de literatură

2.1 Cianhidrine

Cianhidrinele sunt compuși organici care conțin în molecula lor o grupare hidroxil și o grupare nitril, fiind precursori pentru obținerea acizilor carboxilici și a unor aminoacizi.

Reacția de formare implică tratarea unei cetone sau a unei aldehide cu acid cianhidric (HCN) în prezența unei baze în exces. Ionul cian (CN-) atacă carbonul din gruparea carbonil din cetonă sau aldehidă, urmând protonarea cu acid cianhidric, generându-se anionul CN-. Reacția este catalizată de baze si este reversibilă.

Cianhidrinele sunt intermediari importanți în sintezele organice datorită grupărilor funcționale pe care le dețin și care sunt extrem de reactive. Aceste grupări se atașează foarte rapid altor componente, ceea ce le conferă cianhidrinelor un mare avantaj.

Cianhidrinele se pot transforma ușor într-o gamă largă de compuși, cum ar fi -hidroxi-acizi [28], -hidroxi-esteri [29], -hidroxi-cetone [30], -hidroxi-aldehide [31] și -hidroxi-amine [32]. Ele au fost utilizate pentru o varietate de sinteze, spre exemplu pentru obținerea (R)-salbutamolului [22] (folosit în tratarea astmului bronșic), (R)-terbutalină [22] (folosit în tratarea astmului bronșic), (S)-amfetamină [23] (face parte din categoria drogurilor, medicamentelor care măresc viteza de reacție a corpului). În plus constituie un compus foarte important pentru sinteza unor insecticide.[15]

Adiția directă a acidului cianhidric la cetone sau aldehide este o metodă de sinteză des utilizată, insă sunt dezvoltate și alte metode, precum cele prezentate în Figura 1.

O metodă de obținere a cianhidrinelor, utilizată în mod frecvent, este adiția trimetilsilil cianurii (TMSCN) la un compus carbonilic în prezența unei baze sau a unui acid Lewis, fiind prezent și un catalizator precum iodura de zinc (ZnI2). În comparație cu HCN și KCN, TMSCN este un reactiv sigur și la îndemână, însă prezintă și anumite dezavantaje precum prețul destul de ridicat, de asemenea este toxic si volatil ceea ce aduce dificultăți privind utilizarea sa la scară mare.

Sinteza cianhidrinelor a fost studiată pe mai multe căi: adiția anionilor cianură (CN-) din acidul cianhidric sau cianuri alcaline la legături C=O (α-hidroxinitrili) asistată de catalizatori chimici; adiția anionilor CN- la aldehide sau cetone asistată de biocatalizatori și prin reacții de acilare a cianhidrinelor racemice respectiv a esterilor cianhidrici, cu ajutorul rezoluției cinetice enzimatice.

Figura 1. Metode de obținere a cianhidrinelor plecând de la compușii carbonilici.

Rezoluția cinetică enzimatică (KR) reprezintă o cale de diferențiere a celor doi enantiomeri din amestecul racemic, în vederea obținerii cianhidrinelor optic pure. Succesul acestei metode depinde de viteza de reacție diferită a celor doi enantiomeri în prezența unor biocatalizatori, cum ar fi o lipază sau un microorganism, sau a unui chemocatalizator ( acid sau bază, complex metalic). Prin tratarea cianhidrinei racemice cu un agent de acilare, în prezanța unei enzime selective, se va obține un enantiomer acilat și un enantiomer nereacționat.

2.2 Enantiomerie. Chiralitate.

În urma unor experimente s-a observat că unele substanțe organice precum acidul tartric, glucoza, și altele au proprietatea de a roti planul luminii polarizate, când sunt străbătute de către aceasta. Această proprietate poartă numele de activitate optică, iar substanțele respective poartă denumirea de substanțe optic active. După cum rotesc planul luminii polarizate la dreapta sau la stânga, substanțele optic active se numesc dextrogire sau levogire.[20]

Compușii organici își pastrează activitatea optică indiferent de starea lor fizică (solidă, lichidă, gazoasă sau în soluție). Pentru acestea, activitatea optică reprezintă o proprietate determinată de structura moleculei și se poate determina cu ajutorul polarimetrului.

În urma cercetărilor efectuate de Pasteur (1848) s-a ajuns la concluzia că substanțele optic active se gasesc sub formă de perechi de izomeri care rotesc planul luminii polarizate în sensuri opuse însă cu unghiuri egale, celelalte proprietați fizice rămânând nemodificate. Astfel de perechi de izomeri se numesc izomeri optici, antipozi optici sau enantiomeri.[20]

Moleculele organice care conțin un atom de carbon asimetric (atom de carbon care are toate cele patru valente satisfăcute cu radicali diferiți) se numesc molecule asimetrice; asimetria moleculară determinând apariția activitații optice pentru substanțele organice. Moleculele organice se comportă ca un obiect și imaginea sa în oglindă.

În cazul (S)-2-(5-(4-clorofenil)tiofen-2-il)-2-hidroxiacetonitrilului carbonul asimetric este:

Condiția necesară pentru apariția activitații optice este ca molecula substanței respective să nu fie superpozabilă prin mișcare de rotație sau translație în plan cu imaginea sa în oglindă, această proprietate poartă denumirea de chiralitate. O moleculă organică care nu este superpozabilă cu imaginea sa în oglindă se numește moleculă chirală, această moleculă neavând un centru de simetrie, axă alternantă sau plan de simetrie. Chiralitatea rezultă prin aranjarea spațială a liganzilor în jurul unui punct numit centru de chiralitate.

Nomenclatura R/S a compușilor cu chiralitate se stabilește utilizând formulele Fisher.

Figura 2.Stabilirea configurației pe baza formulei Fisher.

2.3 Lipazele

Enzimele sunt substanțe de natură proteică care catalizează reacțiile biochimice din organismele vii, ele având un rol esențial în biosinteză și degradarea substanțelor din materia vie. Ele se întalnesc în toate organismele animale, vegetale precum și în microorganisme. În absența enzimelor procesele biochimice s-ar desfașura cu viteze mici, fapt pentru care ele se mai numesc și biocatalizatori, mărind viteza reacțiilor biochimice și micșorând energia de activare. Aproape toate reacțiile biochimice sunt catalizate de enzime.

Cea mai importantă însușire a unei enzime este selectivitatea, aceasta referindu-se la capacitatea enzimei de a alege între două sau mai multe substraturi, sau între două sau mai multe locuri din structura unui substrat, acest lucru are ca rezultat transformarea substratului preferat.

Enzimele sunt clasificate în funcție de tipul de reacție pe care o catalizează. Astfel Comisia Internațională de Enzimologie, organism afiliat IUPAC, a clasificat enzimele în șase clase importante:

1. Oxidoreductaze: sunt enzimele care catalizează reacții redox;

2. Transferaze: catalizează transferul intermolecular de diferite grupări chimice;

3. Hidrolaze: catalizează scindarea hidrolitică a unor legături chimice;

4. Liaze: catalizează reacții de adiție sau eliminare la molecula unui substrat;

5. Izomeraze: catalizează reacții de izomerizare;

6. Ligaze (sintetaze): catalizează reacții de condensare a două molecule; [2]

O reacție enzimatică simplă poate fi scrisă sub forma:

E + S → ES → EP → E + P

unde E, S și P reprezintă enzima, substratul și produsul, iar ES și EP sunt produși intermediari ai enzimei cu substratul respectiv cu produsul. Enzima interacționează cu substratul, formându-se inițial un complex enzimă-substrat parțial stabilizat. În prezența enzimei concentrația substratului scade, pe când concentrația produsului crește, variația celor două concentrații în timp este simetrică. În urma contactului dintre substrat și resturile de aminoacizi din situsul catalitic al enzimei, în cadrul complexului format are loc trasformarea substratului în produs legat de enzimă. Această transformare este esențială pentru substrat, acesta trecând sub formă legată de enzimă printr-o stare intermediară de complex activat enzimă-substrat, de energie maximă. Diferența dintre entalpia liberă a acestei stări intermediare și entalpia liberă a complexului format între enzimă și substrat, ne va furniza entalpia liberă de activare a reacției enzimatice. [1]

Activitatea enzimatică reprezintă capacitatea enzimei de a transforma un substrat, aceasta depinzând de o serie de condiții. În primul rând este foarte important să se cunoască natura substratului deoarece enzima are specificitate de substat, iar activitatea sa va fi diferențiată în funcție de natura acestuia. Activitatea enzimelor depinde și de: natura solventului, compoziția ionică (pH, ioni salini), temperatură, prezența sau absența unor cofactori enzimatici, prezența factorilor străini.

O serie de enzime sunt disponibile sub formă de enzime libere sau imobilizate. Enzimele se imobilizează prin legare chimică sau prin adsorbție pe diverse materiale suport și permit un schimb continuu de substrat și produs. Imobilizarea unei enzime atrage după sine modificări ale parametrilor reacției catalizată de enzima respectivă. Astfel, pot apărea modificări semnificative ale vitezei maxime de reacție, a constantei Michaelis-Menten (semnifică valoarea concentrației substratului la care viteza reacției enzimatice este jumătate din viteza maximă a acesteia), a temperaturii optime, a pH-ului optim și deasemenea se poate modifica efectul inhibitorilor reacției enzimatice. Toate aceste modificări nu depind doar de metoda de imobilizare a enzimei ci și de natura reacției enzimatice.

În ultima perioadă s-a dezvoltat interesul pentru producerea de enzime destinate proceselor de biosinteză. Utilizarea enzimelor purificate prezintă avantajul reproductibilității și al activității ridicate. Datorită progreselor făcute în domeniul ingineriei genetice, din tehnicile analitice de detecție, din tehnologiile de separare cromatografică la scară industrială, din tehnologiile fermentative, procesele de obținere a enzimelor purificate pot fi proiectate și realizate mai sistematic.[1]

Lipazele sunt cele mai folosite enzime comerciale, utilizarea e sau imobilizate. Enzimele se imobilizează prin legare chimică sau prin adsorbție pe diverse materiale suport și permit un schimb continuu de substrat și produs. Imobilizarea unei enzime atrage după sine modificări ale parametrilor reacției catalizată de enzima respectivă. Astfel, pot apărea modificări semnificative ale vitezei maxime de reacție, a constantei Michaelis-Menten (semnifică valoarea concentrației substratului la care viteza reacției enzimatice este jumătate din viteza maximă a acesteia), a temperaturii optime, a pH-ului optim și deasemenea se poate modifica efectul inhibitorilor reacției enzimatice. Toate aceste modificări nu depind doar de metoda de imobilizare a enzimei ci și de natura reacției enzimatice.

În ultima perioadă s-a dezvoltat interesul pentru producerea de enzime destinate proceselor de biosinteză. Utilizarea enzimelor purificate prezintă avantajul reproductibilității și al activității ridicate. Datorită progreselor făcute în domeniul ingineriei genetice, din tehnicile analitice de detecție, din tehnologiile de separare cromatografică la scară industrială, din tehnologiile fermentative, procesele de obținere a enzimelor purificate pot fi proiectate și realizate mai sistematic.[1]

Lipazele sunt cele mai folosite enzime comerciale, utilizarea lor fiind extrem de importantă în industria biotransformărilor substanțelor organice. Pot participa la reacțiile hidroliotice ale acilderivaților, dar și la reacțiile de condensare cu formare de acilderivați. Una dintre cele mai definitorii caracteristici o constituie formarea intermediarilor de tip covalent.[10]

Rolul lipazelor este acela de a hidroliza trigliceridele în digliceride, monogliceride, acizi grași și glicerol. Pot cataliza reacții de esterificare, interesterificare și transesterificare în medii neapoase. Acest lucru transformă lipazele în enzimele cele mai potrivite pentru utilizarea în industria detergenților, farmaceutică, cosmetică, precum și în industria alimentară.

Utilizarea cea mai comună a lipazelor o constituie rezoluția cinetică a racemaților, aplicată în reacții de acilare sau în reacții de dezacilare a unei funcțiuni esterice.

În studiul experimental al acestei lucrări s-a utilizat lipaza AK, izolată din Pseudomonas flourescens, aceasta fiind utilizată cu succes în rezoluția compusului racemic.

2.4 Biocataliza

Biocataliza reprezintă utilizarea catalizatorilor naturali precum enzime, în vederea obținerii diferiților compuși chimici. În cadrul procesului de biocataliză se pot folosi microorganisme, plante sau enzimele lor izolate, precum și enzime sintetizate artificial.

Din punct de vedere practic, biocatalizatorii sunt utilizați în sintezele organice fine, în cadrul proceselor fermentative sau în bioconversii, datorită avantajelor care atrag dupa sine costuri de producție mai scăzute și implică o dezvoltare economică durabilă.

Odată cu folosirea transformărilor biocatalitice în industrie, s-a dovedit faptul că acestea sunt mai avantajoase decât transformările catalizei normale. Unele dintre avantajele aduse de biocataliză sunt: reacțiile decurg cu randamente foarte bune, uneori și 100%, reacțiile se pot desfășura într-o singură etapă ceea ce duce la un consum mult mai mic de energie, evitarea folosirii unor substanțe periculoase, de asemenea prezintă selectivitate ridicată și condiții de lucru blânde.

Actuala dezvoltare a industriei compușilor bioactivi se orientează către compușii chirali, datorită naturii asimetrice a materiei vii.

Prezența enzimelor în transformările biocatalitice permite realizarea unor reacții care decurg în condiții mai speciale, reacții care prin procedee chimice obișnuite nu ar avea loc. Majoritatea enzimelor lucrează rapid, la un pH neutru și temperatură moderată ceea ce facilitează utilizarea lor, scazând energia necesară la scară industrială, acest aspect fiind foarte important pentru transformările compușilor care prezintă o anumită instabilitate la condițiile de reacție și tendință de polimerizare. Enzimele pot cataliza reacții de până la 1016 ori mai rapide decât aceleași reacții în condiții identice dar necatalizate enzimatic.

În ultimii ani s-a dezvoltat un interes deosebit pentru obținerea de substanțe active optic pure, folosite drept precursori într-o gamă largă de medicamente.

Pe lângă cristalizarea preferențială și cristalizarea diastereoizomerilor, există o a treia metodă folosită pentru rezoluția compușilor racemici: rezoluția cinetică enzimatică.

Prima rezolutie cinetică enzimatică a fost rezoluția acidului tartric sub acțiunea drojdiei de fermentație, aceasta fiind realizată de către Pasteur în anul 1858. Astfel această metodă a devenit cea mai cunoscută metodă de transformare catalitică cu ajutorul lipazelor, în care enzima face diferența între cei doi enantiomeri din amestecul racemic astfel încat unul din enantiomeri este transformat în produs mai repede decât celălalt (vitezele de formare ale produșilor vor fi diferite).

Rezoluția cinetică este de fapt o cale de diferențiere a doi enantiomeri dintr-un amestec racemic. Succesul acestei metode depinde de reacționarea diferită a celor doi enantiomeri în prezența unui compus chiral. Compusul chiral poate fi un biocatalizator precum o lipază sau un microorganism, sau un chemocatalizator: un acid, o bază sau un complex metalic.

Rezoluția cinetică are loc atunci cand kR este diferit de kS, ceea ce înseamnă că cele doua reacții decurg cu viteze diferite (Figura 3.). Ideal este ca un enantiomer să reacționeze mai repede decât celălalt, spre exemplu daca enantiomerul R este singurul care reacționează atunci kS = 0. În acest caz la o conversie de 50% a amestecului inițial, 50% va fi produsul sub formă de enantiomer pur iar restul de 50% va reprezenta substratul netransformat, tot sub forma unui enantiomer pur.

Figura 3. Rezoluția cinetică (KR)

Dezavantajul major al acestei metode constă în limitarea unei conversii de 50%, fapt care duce la consumarea unui singur enantiomer în reacție. Cu toate acestea, rezoluția cinetică enzimatică este metoda cea mai des folosită pentru separarea racemaților la nivel industrial.

3. Analiza desfășurării procesului

3.1 Chimismul procesului

Mecanismul general al lipazelor implică o triadă catalitică, conținând trei tipuri de aminoacizi: acid aspartic sau acid glutamic, histidină și serină (Figura 5). Această triadă catalitică este caracteristică serin hidrolazelor, care formeză una dintre cele mai bine caracterizate familii de enzime atât sub aspectul mecanismului de reacție cât și al structurii.

Reacția este compusă din două etape principale. În prima etapă, se realizează o legătură covalentă între atomul de carbon C1 al legăturii peptidice ce urmează a fi hidrolizată și serina din situsul catalitic. Printr-o stare de tranziție încărcată negativ la atomul de oxigen atașat de C1, are loc formarea intermediarului acil-enzimă. Formarea stării de tranziție este facilitată de rolul de bază generală a histidinei. Acest rol este potențat de restul de acid aspartic care stabilizează sarcina parțială pozitivă care apare la nucleul imidazolic al histidinei. Oxigenul serinic devine puternic nucleofil astfel încât poate genera o stare de tranziție tetraedrică la C1. Această stare de tranziție este stabilizată prin legături de hidrogen care fixează oxianionul de la C1. Legăturile de hidrogen se realizează în buzunarul oxianionic. Ruperea legăturii peptidice duce la formarea acil-enzimei.

În cea de-a doua etapă în prezența apei și sub influența aceleiași baze generale, va avea loc un atac nucleofil la C1. Ionul oxianionic este stabilizat prin prezența unor legături de hidrogen, în cea de-a doua stare de tranziție. Prin ruperea legăturii esterice dintre serină și segmentul peptidic N-terminal enzima se regenerează.[2]

Complex enzimă-substrat Intermediar tetraedric

Acil enzimă Acil enzimă

Intermediar tetraedric Complex enzimă-produs

Figura 5. Mecanismul de acțiune al lipazelor

3.2 Studiul cinetic al procesului

Activitatea enzimatică măsoară capacitatea enzimei de a transforma un substrat. Studiul activității presupune existența unor metode de a pune cantitativ în evidență reacția catalitică. Astfel, este necesară dozarea în dinamică fie a produsului de reacție, fie a substratului, fie a unui cofactor care poate fi pus în corelație cu formarea produsului sau cu consumul de substrat.[2]

Reacțiile enzimatice sunt și ele reacții chimice, de aceea evoluția lor în timp și factorii care influențiază această evoluție pot fi urmăriți respectând principiile cineticii clasice. Cinetica chimică poate fi utilă în explicarea unor mecanisme de reacție, în calculul timpului de reacție, al conversiilor, al condițiilor optime economice.

Brown (1902) propune un mecanism general prin care evidențiază formarea reversibilă a unui complex enzimă-substrat E-S, care mai departe se transformă în produs, implicând regenerarea enzimei.

Relația care arată dependența vitezei reacției enzimatice (v), de concentrația substratului(Cs):

(3.2.1)

În anul 1913 Michaelis și Menten introduc o ipoteză conform căreia viteza de formare a produsului din complexul enzimă-substrat este mult mai mică decât viteza de asociere-disociere a enzimei și substratului. Etapa limitantă de viteză este reacția de formare a produsului. Astfel, se poate defini o constantă de disociere a complexului ES:

(3.2.2)

În anul 1925, Briggs și Haldane au introdus ipoteza de staționaritate, potrivit căreia concentrația complexului enzimă-substrat atinge rapid o valoare constantă în dinamica sistemului, altfel spus viteza de formare a complexului E-S poate fi considerată egală cu viteza sa de descompunere. La evaluarea dinamicii concentrației complexului E-S se ține cont de toate cele trei reacții implicate.

(3.2.3)

Conform ipotezei lui Brown, care spune că concentrația totală de enzimă rămâne constantă în timpul reacției enzimatice, enzima inițială se va regăsi sub formă de complex E-S, dar și sub formă de enzimă liberă, atunci rezultă valoarea concentrației staționare a complexului E-S:

(3.2.4)

Expresia vitezei de reacție se poate scrie astfel:

(3.2.5)

(3.2.6)

KM reprezintă constanta Michaelis-Menten, aceasta oferind o idee asupra afinității enzimei față de substrat. Aceasta reprezintă concentrația de substrat la care se atinge jumătate din valoarea maximă a vitezei de reacție. Pentru majoritatea sistemelor enzimatice valoarea sa este foarte apropiată de cea a constantei de disociere a complexului E-S.[2]

3.3 Studiul termodinamic al procesului

Cunoașterea căldurilor de formare, capacităților calorice și constantelor de echilibru ale substanțelor ce intervin în proces ajută la calculele de proiectare ale instalației tehnologice.

Căldura de formare a unui compus organic este efectul termic al reacției de formare a unui mol de substanță din elemente în starea standard. Din căldurile de formare se calculează căldura de reacție.

Căldura de formare a unui compus organic se determină prin intermediul următoarei relații, cunoscându-se căldura de combustie:

(3.3.1)

unde: numărul atomilor de carbon, hidrogen, etc. din molecula substanței.

Constantele din relație reprezintă căldurile de combustie ale elementelor conținute în molecula substanței în [kcal/mol]. Căldura de combustie sau căldura de ardere este efectul termic al reacției de ardere a unui mol de substanță obținând în final oxizi stabili și apă.

Relația (3.3.1) poate fi folosită doar în cazul în care produsele de ardere ale substanțelor sunt CO2, Cl2, N2 , SO2 sub formă gazoasă, apă și Cl2 în stare lichidă.

Entalpia de formare se poate determina prin doua metode:

Metoda Karash

Metoda bilanțului de oxigen

Metoda Karash

La arderea unei hidrocarburi are loc deplasarea electronilor atomilor de carbon și hidrogen către atomul de oxigen, astfel având loc o degajare de căldură.

Căldura de combustie va avea următoarea formulă:

(3.3.2)

unde: n = numărul de electroni deplasați.

Constanta reprezintă căldura degajată prin deplasarea unui electron spre atomul de oxigen.

Această metodă se poate folosi doar în cazul în care substanțele organice sunt în stare lichidă.

Metoda bilanțului de oxigen

Se consideră un compus de forma: Cm Hn Np Oq Xr St.

Bilanțul de oxigen se scrie:

(3.3.3)

În acest caz se vor calcula căldurile de combustie prin metoda bilanțului de oxigen, folosind formula lui Roth, conform căreia:

(3.3.4)

unde: numărul atomilor de oxigen necesari pentru arderea completă a substanței.

Racemic 2-(5-(4-clorofenil)tiofen-3-il)-2 hidroxiacetonitril

→

Vinil acetat

→

(S)-2-(5-(4-clorofenil)tiofen-3-il)-2hidroxiacetonitril

→

(R)-2-(5-(4-clorofenil)tiofen-3-il) ciano-metil acetat

→

Acetaldehidă

În cazul acetaldehidei valoarea pentru căldura de formare se găsește în literatura de specialitate:

Estimarea entalpiei de reacție:

(3.3.5)

unde: numărul de moli

P,R = produs, reactant. (Tomoaia și colab.)

Entropia reacției

Se vor folosi următoarele relații de calcul:

• pentru substanțe organice solide:

(3.3.6)

• pentru substanțe organice lichide:

(3.3.7)

unde: capacitate calorică.

Capacitatea calorică se poate estima cu ajutorul relației lui Kopp.

(3.3.8)

unde: căldura atomică a elementului

numărul de atomi din moleculă

Racemic 2-(5-(4-clorofenil)tiofen-3-il)-2 hidroxiacetonitril, C12 H8 ClNOS, solid:

Vinil acetat, , lichid:

(S)-2-(5-(4-clorofenil)tiofen-3-il)-2hidroxiacetonitril, C12 H8 ClNOS, solid:

(R)-2-(5-(4-clorofenil)tiofen-3-il) ciano-metil acetat, , lichid:

Acetaldehidă, :

Entalpia standard pentru acetaldehidă se găsește în literatura de specialitate:

Estimarea entropiei de reacție:

(3.3.9)

unde: numărul de moli

P,R = produs, reactant. (Tomoaia și colab.)

Calculul entalpiei libere de reacție (Gibbs):

(3.3.10)

3.4 Modelarea procesului

Procesul tehnologic poate fi definit ca o succesiune de operații ordonate în timp, cu ajutorul cărora se poate obține un produs necesar societății. Timpul necesar pentru ca materiile prime respectiv cele auxiliare să fi parcurse prin toate operațiile poartă numele de ciclu de fabricație.

Relațiile care leagă mărimile de intrare de cele de ieșire ale unui proces tehnologic, constituie modelul matematic al unui proces chimic. Pentru calculele tehnologice precum și în ceea ce privește proiectarea și exploatarea instalațiilor, este necesară cunoașterea atât calitativă cât și cantitativă a materialelor care circulă prin instalația tehnologică, acest lucru realizându-se prin scrierea bilanțului de materiale și a bilanțului termic.

3.4.1 Bilanț de materiale

Bilanțul de materiale reprezintă relația cantitativă a transformării materiilor prime și a celor auxiliare prezente într-un proces tehnologic dat, în vederea stabilirii consumurilor specifice și a circulației produselor prin instalația tehnologică.

Se dorește obținerea a 10 kg de produs final/șarjă.

Se impun următoarele randamente:

Reacția biochimică → η = 100%

Filtrare enzimă → η = 99%

Concentrare → η = 98%

Separare →η = 97%

Cristalizare → η = 97%

Filtrare → η = 98%

Substanțele ce intervin în procesul tehnologic sunt următoarele:

3.4.2 Bilanț termic

În majoritatea proceselor biochimice, care se petrec în biotehnologii, bilanțul energiilor se poate simplifica sub forma relației numită bilanț termic. Simplificarea constă în neglijarea lucrului mecanic, a variației energiei potențiale și cinetice, a energiei electrice, care foarte rar au un impact important asupra procesului.

Bilanțul termic are la bază principiul întâi al termodinamicii, conform căruia pentru un sistem izolat suma cantității de căldură intrată într-un sistem este egală cu suma cantității de căldură ieșite:

(3.4.2)

Sistemele nu sunt perfect izolate, fapt pentru care ecuația de bilanț de masă are următoarea formă:

(3.4.3)

unde:

căldura adusă în sistem de materiile prime;

căldura formată în sistem de procesele fizice sau chimice care pot interveni în sistem;

căldura primită de sistem;

căldura ieșită din sistem;

căldura consumată în sistem în procesele fizice și chimice desfășurate în sistem;

căldura pierdută în sistem;

Se va întocmi bilanțul termic pe condensatorul coloanei de rectificare, determinând cantitatea de agent de răcire pentru condensarea vaporilor de diclorometan și vinil acetat. Agentul de răcire care se utilizează este apa. Apa de răcire care circulă prin țevi se încălzește de la 5 la 20 , prin țevi circulă apa de răcire, iar în spațiul dintre țevi circulă vapori în condensare.

Se consideră: → Temperatura de intrare a apei de răcire:

→ Temperatura de ieșire a apei de răcire:

→ Temperatura de intrare a vaporilor de diclormetan

→ Căldura specifică a vaporilor de vinil acetat și diclormetan:

Se cunosc: → Temperatura de fierbere a diclormetanului: ;

→ Temperatura de fierbere a vinil acetatului: ;

→ Căldura specifică a apei la temperatura medie ():

→ Densitatea apei la ,

Bilanțul termic pentru condensator se scrie:

(3.4.4)

(3.4.5)

Se consideră: (3.4.6)

3.5 Schema bloc a procesului

3.6 Lista cu utilajele și echipamentele necesare

Vezi Anexa 1.

3.7 Schema fluxului tehnologic

Legendă:

1, 4, 9, 12 – rezervor diclormetan 3, 6, 14 – vas de măsură diclormetan 8, 17 – filtru Nutsche 13- coloană de separare

2, 5, 10 – pompă centrifugă 7- bioreactor 11 – coloană de rectificare 16- cristalizator

3.8 Descrierea fluxului tehnologic

Reacția biochimică are loc în bioreactorul (7), care este prevăzut cu un agitator și încălzire prin manta. Se introduc materiile prime necesare, iar după finalizarea reacției, masa de reacție obținută este trecută prin filtrul Nutsche (8), acesta reținând enzima, pe stratul poros.

Enzima depusă pe filtru este spălată de trei ori cu diclormetan, iar masa de reacție este depozitată într-un rezervor de unde, cu ajutorul pompei centrifuge, este vehiculată în coloana de re/ctificare(11), unde are loc evaporarea solventului, diclormetanul. La blazul coloanei de rectificare se colectează produsul.

Amestecul celor două substanțe optic pure se introduce în coloana de separare(13), folosindu-se ca si eluent diclormetanul. Din coloana de separare se colectează doua fracții: una conținând diclormetan și enantiomerul optic pur (R), iar cealaltă diclormetan și enantiomerul optic pur (S).

Fracția formată din diclormetan și enantiomerul optic pur (S) este răcită și introdusă în cristalizator(16), pentru separarea produsului de eluent. Produsul astfel obținut este trecut prin filtru Nutsche(17), în vederea izolării acestuia.

3.9 Controlul și automatizarea procesului

Automatizarea unui proces tehnologic constă în dotarea instalației tehnologice cu echipamente tehnice speciale, folosite pentru o mai bună conducere a procesului.

Se numește reglabilitate a unui proces, capacitatea procesului de a fi reglat cu un sistem de reglare standard. De la un sistem chimic se urmăresc două astepte: obținerea unei conversii dorite și precise a reactantului, precum și obținerea unei selectivități a procesului cât mai mare într-un timp cat mai scurt.

În unele cazuri este recomandabil înlocuirea reglării manuale cu cea automată, aceasta prezentând o serie de avantaje foarte importante în industria chimică, cum ar fi: creșterea calității produselor finale, micșorarea timpului de lucru, folosirea eficientă a energiei electrice și a celei termice, suplinirea forței de muncă.

Sistemele chimice sunt controlate prin intermediul a cinci parametrii: debit, presiune, nivel, temperatură și concentrație. Concentrația poate fi măsurată fie direct fie indirect, prin intermediul densității, vâscozității, conductibilității sau pH-ului. Reglarea acesteia reprezintă o caracteristică foarte importantă în industria chimică, produșii finiți sunt caracterizați printr-o înaltă puritate, însă analizatoarele fiind scumpe și destul de rare, de multe ori se optează pentru celelalte tipuri de reglare, scăzând astfel costurile de producție. Deasemenea reglarea temperaturii este important întrucât cu ajutorul acestui parametru se stabilește valoarea constantei de viteză sau echilibrul termodinamic necesar.

La reacțiile catalitice se impune evitarea supraîncălzirilor locale, acestea ducând la distrugerea catalizatorului. În cazul acestui tip de proces reglarea temperaturii din interiorul bioreactorului constituie un aspect esențial deoarece o creștere necontrolată a acesteia poate duce la denaturarea enzimei, inactivarea ei. Modificarea temperaturii în interiorul reactorului este un proces lent, fapt pentru care realizarea unei reglări potrivite se face într-un regulator de tip PID.

Figura 3.9.1 SRA a temperaturii din bioreactor

Nivelul lichidului poate oscila ușor, ceea ce duce apariția unui zgomot de fond în jurul valorii de regim staționar. Reglarea nivelului poate fi făcută prin strangularea debitului de alumentare sau celui de evacuare. În acest caz nivelul lichidului din bioreactor poate oscila datorită amestecării masei de reacție; acest lucru se poate controla prin intermediul debitului de evacuare. Ca urmare a apariției acestor oscilații, apare un zgomot de fond care deranjează stabilitatea SRA. Procesul fiind lent, perturbarea funcționării SRA se produce prin inchiderea si deschiderea repetată a elementului de execuție, ceea ce poate provoca uzarea pompei de vehicularea a lichidului. În cazul reglării adecvate a nivelului se folosește un regulator de tip PI.

Figura 3.9.2 SRA a nivelului din bioreactor

4. Proiectarea tehnologică a utilajelor

4.1 Alegerea și descrierea utilajelor și echipamentelor

4.1.1 Rezervoare de stocare și vase de măsură

Rezervoarele de stocare și vasele de măsură sunt recipiente cu pereți subțiri, care servesc la depozitarea temporară a materiilor prime și a celor auxiliare, într-o instalație tehnologică. Acestea se construiesc din laminate din oțel carbon sau din oțel aliat sau înalt aliat. Datorită construcției relativ ușoare se preferă, în majoritatea situațiilor, forma cilindrică a recipientelor.

Rezervoarele de stocare și vasele de măsură se pot amplasa atât vertical cât și orizontal.

4.1.2 Pompe centrifuge

Pompele centrifuge au o largă raspândire în industriile de proces, fiind cele mai utilizate pompe din industria chimică. O pompă centrifugă conține următoarele componente: conductă de aspirație, conductă de refulare, rotor, palete, canal colector, carcasă, material de etanșare, ax.

Într-o pompă centrifugă lichidul este alimentat în centrul unui rotor care se învârte cu o viteză mare, creându-se astfel o forță care împinge lichidul spre periferia rotorului sau în lungul axului pmpei. În acest fel energia mecanică a axului este transferată lichidului sub formă de energie cinetică. Pe măsură ce lichidul părăsește rotorul, energia cinetică formată se transformă în energie de presiune.

Pompele centrifuge prezintă o serie de avantaje cum ar fi: construcție simplă și gabarit redus, nu sunt sensibile la lichide cu impurități, se pot construi din materiale metalice sau nemetalice, pot transporta debite mai de fluid pe distanțe mari, dau debite uniforme.

Pe langă avantajele acestor tipuri de pompe, intervin și anumite dezavantaje cum ar fi: randament hidraulic mic, nu dau presiuni de refulare mari, pentru a funcționa pompa trebuie amorsată în lichid, sunt sensibile la transportul lichidelor calde.

4.1.3 Bioreactor

Bioreactorul este un recipient în care se desfășoara procese chimice, cu ajutorul implicării unor microorganisme sau substanțe biochimice active derivate din unele microorganisme. Procesul poate fi aerob sau anaerob.

Bioreactorul cu amestecare mecanică reprezintă unul dintre cele mai utilizate bioreactoare în industria chimică.Este construit dintr- un recipient cilindric din oțel inoxidabil, prevăzut cu două capace elipsoidale, imbinate cu ajutorul flanșelor. Conține un sistem de amestecare format dintr-un agitator, ales în funcție de înălțimea lichidului din vas și o serie de șicane.

Acest tip de reactor se caracterizează printr-o amestecare uniformă a masei de reacție și datorită operării în mod discontinuu are avantajul funcționării în șarje.

4.1.4 Filtre Nutsche

Filtrele Nutsche sunt filtre orizontale, cu capac, prevăzut la o oarecare distanță de fund; au un fund poros care susține mediul de filtrare (pânza) și permite trecerea filtratului. Construcția lor este simplă și sunt confectionate atât din materiale ceramice (porțelan, gresie), cât și din diferite metale, lemn, în funcție de condițiile de reacție și de agresivitatea substanțelor asupra materialelor.

Avantajele folosirii unui astfel de filtru sunt: construcția simplă, funcționarea simplă, preț de cost redus, posibilitatea de a fi construit din materiale anticorozive.

4.1.5 Coloane de rectificare

Industria chimică folosește pentru rectificare coloane cu talere clopote, coloane cu umplutură sau coloane cu talere perforate.

4.1.6 Condensator

Condensatorul reprezintă un utilaj pentru transferul termic care asigură trecerea căldurii de la o substanță la alta printr-un perete despărțitor. Apa de răcire circulă prin țevi, iar vaporii circulă în contracurent.

4.1.7 Cristalizator

Cristalizorul este un aparat care are rolul de a separa substanțe dizolvate, sub formă de cristale.

Acest aparat se utilizează pentru realizarea purificării unei substanțe prin dizolvări și cristalizări repetate.

4.1.8 Coloane de separare

Coloanele de separare au rolul de a purifica componenții unui amestec. Sistemul cel mai des utilizat este cromatografia de înaltă performanță (HPLC). HPLC este o metodă de analiză cantitativă utilizată pentru separarea și identificarea compușilor dintr-un amestec. Aceasta folosește o coloană încărcată cu diferite materiale (faza staționară), o pompă ce impinge fazele prin coloană și un detector care arată timpii de retenție ale moleculelor.

4.2 Dimensionarea bioreactorului

Bioreactorul are formă cilindrică, este prevăzut cu manta și agitator de tip ancoră. Capacul este demontabil, asamblat prin flanșe prinse cu șuruburi, iar fundul este nedemontabil, asamblat printr-un cordon de sudură.

Caracteristicile tehnico-funcționale ale procesului sunt:

• temperatura de lucru

• presiunea de lucru

Dimensionarea bioreactorului presupune calculul înălțimii și a diametrului acestuia. Pe baza volumului masei de reacție introduse în bioreactor, se determină volumul bioreactorului, utilizând tabele de specialitate (STAS). Volumul masei de reacție se determină din bilanțul de materiale, prin însumarea volumelor materiilor prime introduse în bioreactor.Acest volum reprezintă volumul util.

(4.2.1)

Substratul și enzima fiind solide se pot lua în considerare următoarele:

→ creșterea densității solventului cu 10%;

→ volumul ocupat de biocatalizator reprezintă 5% din volumul masei de reacție;

Din literatura de specialitate se alege un coeficient de umplere ku, cuprins între 0.7-0.89 (substanțele nu fierb, nu formează spumă). Se alege ku = 0.8.

Volumul total va fi:

Din STAS se alege valoarea volumului bioreactorului, valoarea cea mai apropiată de cea obținută prin calcul.

(4.2.2)

Raportul , reprezentând raportul dintre înălțimea și diametrul bioreactorului, este cuprins între valorile 1-3. Se alege .

Pentru dimensionarea capacelor și a fundurilor elipsoidale se alege o valoare pentru din domeniul . Se alege .

Volumul capacului:

Volumul zonei cilindrice:

Diametrul:

Se recalculează raportul :

Înălțimea totală a reactorului:

În urma calculelor, caracteristicile bioreactorului sunt următoarele:

• Înălțimea bioreactorului:

• Diametrul bioreactorului:

• Înălțimea capacului:

• Înălțimea fundului:

4.3 Dimensionarea pompei centrifuge

Pentru dimensionarea pompei centrifuge se va calcula puterea instalată a pompei care alimentează bioreactorul cu diclormetan.

Puterea instalată:

(4.3.1)

unde: puterea instalată a pompei;

puterea calculată a pompei;

coeficientul de siguranță al puterii;

Puterea calculată:

(4.3.2)

unde: debitul volumic de lichid vehiculat de pompă;

înălțimea manometrică a pompei în rețea;

randamentul total al pompei;

densitatea lichidului vehiculat;

accelerația gravitațională;

(4.3.3)

Se consideră:

(4.3.4)

unde: presiunile în spațiul de refulare și în cel de aspirație;

înălțimea geometrică de ridicare a lichidului;

pierderea de presiune;

(4.3.5)

unde:

Nu există nici un utilaj pe traseul pompei →

(4.3.6)

unde: 𝞴 = coeficient de frecare;

viteza lichidului în conducta de refulare;

lungimea conductei;

diametrul echivalent al conductei;

Viteza pentru lichidele în curgere liberă se alege din literatura de specialitate, din domeniul 0.5-2.5. Se alege .

Secțiunea conductei circulare:

Diametrul conductei:

Rugozitatea țevilor din oțel, sudate la coroziune nesemnificativă se consideră: .

Criteriul Reynolds:

Din diagrama de variație a coeficientului de frecare (Pavlov, pag. 26) se va determina 𝞴, considerând valorile pentru și . Se citește .

Se consideră lungimea conductei

Pierderea de presiune datorită rezistențelor locale:

(4.3.7)

unde: coeficientul rezistențelor locale.

Din literatura de specialitate (Pavlov, pag.502) se aleg valorile pentru coeficienții rezistențelor locale.

Se consideră

Puterea calculată:

În funcție de valoare puterii calculate, , se alege valoarea coeficientului de siguranță, ( . Se alege .

Puterea instalată:

5. Aspecte ecologice și de protecția mediului

Tehnologia prezentată în această lucrare prezintă un grad de periculozitate și toxicitate scăzut, neavând un impact negativ asupra mediului.

Avantajele utilizării proceselor biotehnologice sunt următoarele:

• lipsa intermediarilor toxici;

• temperaturile de lucru sunt apropiate de cele ale mediului ambient;

• se lucrează la presiuni mici;

Substanțele care intervin în procesul tehnologic și prezintă un risc de toxicitate sunt următoarele:

Diclormetan:

→ punct de fierbere 40;

→ inflamabil;

→ iritant pentru ochi, posibil cancerigen;

→ este nevoie de utilizarea unui echipament de protecție adecvat.

Acetat de vinil:

→ temperatura de fierbere 71-73;

→ lichidul și vaporii săi sunt extrem de inflamabili;

→ a se păstra departe de sursele de căldura, scântei, flăcări și alte surse de aprindere;

→ a se depozita într-un spațiu bine ventilat, la rece.

Partea a II-a: Cercetarea experimentală

1. Generalități

În cadrul acestei lucrări s-a urmărit obținerea enantiomerului (S) al amestecului racemic 2-(5-(4-clorofenil)tiofen-2-il)-2-hidroxiacetonitril. S-au determinat parametrii optimi: enzima, tipul de solvent necesar, precum și agentul de acilare cel mai convenabil în cazul procesului enzimatic studiat.

Figura 1. Schema generală de sinteză.

Figura 2. Posibile aplicații ale cianhidrinelor.

Cianhidrinele sunt intermediari foarte valoroși în sinteza organică. Sinteza lor din aldehide și cetone prochirale a atras întotdeauna atenția.

Cianhidrinele optic active sunt intermediari foarte importanți în sintezele de obținere a unor compuși folositori cum ar fi: aminoacizii sau hidroxiacizii. Ele au fost folosite cu succes pentru sintezele de obținere a (S)-salbutamol[22], (R)-terbutalin[22], (S)-amfetamine (Ecstasy)[23].[15]

Compușii care conțin inele heterociclice sunt frecvent folosiți în medicină, deoarece oferă o gamă largă și diversă de interacțiuni. Când o cianhidrină este grefată pe un schelet heterociclic o gamă largă de compuși activi pot fi preparați.

În acest fel, cianhidrinele chirale îndeplinesc criteriile necesare pentru obținerea multor medicamente, cum ar fi Clopidogrel. [13] Acesta ajută la prevenirea formării cheagurilor de sânge în cazul bolilor coronariene sau a bolilor vasculare.

Obținerea unei enantiopurități cât mai ridicate este criteriul cel mai important și deasemenea cel mai greu de realizat. Rezoluția cinetică enzimatică reprezintă o metodă extrem de atractivă pentru atingerea acestui obiectiv. Mulți compuși de o importanță deosebită au fost obținuți prin intermediul unei astfel de metode; spre exemplu fenilfuranul[24], furil-benzotiazolul[25], fenotiazina[26]. [13]

2. Materiale și metode

Substanțele folosite pentru realizarea acestei lucrări au fost puse la dispoziție de către Facultatea de Chimie și Inginerie Chimică a Universității Babes-Bolyai, Catedra de Biochimie. Materia primă folosită pentru sinteză, aldehida, a fost sintetizată de către grupul de cercetare de la Catedra de Biochimie. Solvenții și reactivii au fost achiziționați de la companiile Aldrich și Fluka, fiind păstrați pe sită moleculară.

Pentru verificarea produșilor de reacție s-a folosit cromatografia pe strat subțire, TLC, cromatografia lichidă de înaltă performanță, HPLC și rezonanța magnetică nucleară, RMN. Analizele HPLC (High Performance Liquid Chromatography) au fost efectuate pe un aparat Agilent HPLC 1200 Series prevăzut cu coloane chirale Chiralpak. Pentru separarea enantiomerilor s-a folosit o coloană Chiralpak IC, eluentul folosit fiind un amestec format din n-hexan-2-propanol în proporție de 97:3 (v/v). Pentru determinarea raportului enantiomeric s-a utilizat formula E = ln[(1-c)(1-eeS)]/ln[(1-c)(1 + eeS)], unde c = eeS/(eeS + eeP).

În cazul investigațiilor RMN s-au utilizat aparatele Bruker care operează la 400 MHz (100 MHz pentru 13C) și 600MHz (150 MHz pentru 13C) la 25ºC, folosind TMS ca standard intern, iar drept solvenți deuterați s-au folosit CD3CN și CDCl3 , obținându-se astfel spectrele de rezonanță magnetică nucleară 1H și 13C.

Utilizând cromatografia pe strat subțire, TLC, s-a putut urmări evoluția reacțiilor. În vederea acestei analize s-au folosit plăcuțe cromatografice Merck Kieselgel 60F254. Spoturile de pe plăcuțe au fost vizualizate folosind o soluție de acid fosfomolibdenic 5% în etanol și încălzire. Separarea compușilor la scară preparativă s-a realizat cu ajutorul coloanelor umplute cu silicagel Merck Kieselgel 60 (63 – 200 μm).

Rotațiile optice au fost determinate cu ajutorul unui polarimetru ADP220 Polarimeter Bellingham-Stanley. Solventul utilizat a fost cloroformul (CHCl3), iar temperatura de lucru 25.

3. Partea experimentală

3.1. Sinteza cianhidrinei racemice

Figura 3. Obținerea cianhidrinelor racemice.

Utilizată în mod frecvent este metoda de obținere a cianhidrinelor racemice prin adiția trimetil-silil cianurii (TMSCN) (160, 1,2 mmoli) la un compus carbonilic, în prezență de ZnI2 (3,2 mg, 20 μmol), în mediu organic de diclormetan sau acetonitril (5 ml). Reacția decurge la temperatura camerei, sub agitare mecanică, în mediu de argon, în absența urmelor de apă, care ar putea duce la descompunerea cianhidrinelor, respectiv la inactivarea catalizatorului folosit. Reacția este finalizată în momentul în care întreaga cantitate de aldehidă introdusă în reacție este transformată. Prin analizele cromatografice pe strat subțire (silicagel depus pe suport solid), având ca fază mobilă diclormetanul:acid acetic 99:1 s-a constatat finalizarea reacției dupa 4 ore.

După încheierea reacției se evaporă solventul, iar masa de reacție se redizolvă în metanol (aproximativ 5 ml). Sub acțiunea acidului clorhidric 10 care se adaugă are loc descompunerea trimetilsilil cianhidrinei formate în cianhidrina corespunzătoare și sarea de trimetilsiliciu. S-a observat încheierea reacției dupa aproximativ o ora, fapt evidențiat prin analiza cromatografică pe strat subțire. Metanolul se evaporă. Produsul de reacție, cianhidrina, se extrage din masa de reacție folosind acetatul de etil (3 x 10 ml). Dupa separarea fazelor, se colectează faza organică, peste care se adaugă o cantitate de sulfat de sodiu anhidru (Na2SO4 anh.), care va prelua apa din faza organică colectată. Se realizează o filtrare pentru a îndepărta cristalele de sulfat de sodiu, dupa care se evaporă solventul organic.

Purificarea compusului se realizează pe o coloană cromatografică, folosind ca și eluent un amestec de CH2Cl2 : Acid acetic, în raport de 99:1. Acidul acetic din amestec are rolul de a preveni descompunerea cianhidrinelor.

• rac 2-(5-(4-clorofenil)tiofen-2-il)-2-hidroxiacetonitril, randament 87 (substanță solidă, gri), p.t.= 121,6 .

1H NMR (600 MHz, CD3CN) δ 7.64 – 7.58 (m, 2H), 7.43 – 7.37 (m, 2H), 7.30 (d, J = 3.4 Hz, 1H), 7.21 (d, J = 3.4, 0.5 Hz, 1H), 5.84 (s, 1H).

13C NMR (151 MHz, CD3CN) δ 145.32, 140.25, 134.39, 133.35, 130.09, 128.90, 128.22, 124.72, 119.72, 59.54.

Figura 4. Separarea cianhidrinei racemice rac-2.

3.2. Acilarea chimică a cianhidrinei racemice

Figura 5. Obținerea esterilor acilați.

La o soluție formată din cianhidrina racemică (5 mg) dizolvată în diclormetan (1 ml), peste care se adaugă clorură de acetil (5.70 , 4 eq) și o cantitate catalitică de 4-N,N-dimetilamino-piridină în piridină 1 (0.068 eq). Reacția se lasă peste noapte la temperatura camerei, sub continuă agitare. Produsul brut obținut după evaporarea solventului la vid, este purificat folosind cromatografia de lichide pe coloană cu silicagel, utilizând ca solvent diclormetanul.

Figura 6. Obținerea esterilor acilați folosind clorura de acetil.

Figura 7. Separarea pe HPLC a cianhidrinei O-acetilată racemice rac-3a.

Peste cianhidrina racemică (5 mg) dizolvată în diclormetan (1 ml) se adaugă clorură de butiril (8.25 , 4 eq) și o cantitate catalitică de 4-N,N-dimetilamino-piridină în piridină 1 . Reacția se lasă sub continuă agitare peste noapte, la temperatura camerei, dupa finalizarea ei produsul rezultat este purificat cu ajutorul cromatografiei de lichide pe coloană de silicagel, solventul fiind diclormetanul.

Figura 8. Obținerea esterilor acilați folosind clorura de butiril.

Figura 9. Separarea pe HPLC a cianhidrinei O-butirată racemice rac-3b.

Peste soluția formată din cianhidrina racemică (5 mg), în diclormetan (1 ml) se adaugă clorură de decanoil (29.4 , 4 eq) și o cantitate catalitică de 4-N,N-dimetilamino-piridină 1 în piridină. Dupa finalizarea reacției, lăsată peste noapte sub agitare și la temperatura camerei, produsul obținut este purificat prin intermediul cromatografiei de lichide pe coloană de silicagel, utilizând drept solvent diclormetanul.

Figura 10. Obținerea esterilor acilați folosind clorura de decanoil.

Figura 11. Separarea pe HPLC a cianhidrinei O-decanoată racemice rac-3c.

Tabel 1. Metoda de separare pe HPLC și timpii de retenție ai compușilor.

3.3. Acilarea enzimatică a cianhidrinei racemice

Figura 12. Reacția de acilare enzimatică.

Folosind drept substrat cianhidrina racemică, s-au urmărit activitățile catalitice a mai multor enzime, în vederea obținerii enantiomerilor optic puri. Enzimele folosite sunt disponibile comercial, la un preț rezonabil, sunt foarte stabile și sunt simplu de manevrat. S-au folosit: lipaza A din Candida antartica (Cal-A), lipaza B din Candida antartica (Cal-B), lipaza AK din Pseudomonas fluorescens, lipaza PS din Burkholderia cepacia.

Solvenții utilizați sunt: diclormetanul, acetonitrilul, metil-tetrahidrofuranul și metil terț-butil eterul, iar agenții de acilare: acetat de vinil, butirat de vinil, respectiv decanoat de vinil.

Reacțiile care au prezentat o conversie de aproximativ 50, în urma analizei cromatografice pe strat subțire, au fost injectate la HPLC. Toate reacțiile care au dus la această conversie au fost monitorizate prin analize HPLC pe o coloană chirală Chiralpak IC, respectiv IB, utilizând ca și eluent un amestec de n-hexan:2-propanol în raport de 97:3 (v/v), respectiv 96:4 (v/v).

Pentru analiza HPLC, probele luate din reacții (40), au fost diluate cu 300 l 2-propanol și filtrate înainte de injectare.

Figura 13. Reacția de acilare enzimatică folosind acetatul de vinil.

Se dizolvă substratul (2.5 mg) în solvent (0.5 ml), după care se adaugă enzima (12.5 mg) și acetatul de vinil (3.68 , 4 eq). La final se adauga în reacție 2 bucăți de sită moleculară. Reacțiile se agită la temperatura camerei, iar finalizarea lor, se observă prin analiză cromatografică pe strat subțire (TLC), urmată de injectarea pe HPLC.

Tabel 2. Screening-ul de enzimă, solvent pentru reacția de acilare selectivă, utilizând acetatul de vinil.

Figura 14. Reacția de acilare enzimatică folosind butiratul de vinil.

Se dizolvă substratul (2.5 mg) în solvent (0.5 ml), după care se adaugă enzima (12.5 mg) și butiratul de vinil (5.07 , 4 eq). La final se adauga în reacție 2 bucăți de sită moleculară. Reacțiile se pun sub agitare la temperatura camerei, iar finalizarea lor se observă prin analiză cromatografică pe strat subțire (TLC), urmată de injectarea pe HPLC.

Tabel 3. Screening-ul de enzimă, solvent pentru reacția de acilare selectivă, utilizând butiratul de vinil

Figura 15. Reacția de acilare enzimatică folosind decanoatul de vinil.

Se dizolvă substratul (2.5 mg) în solvent (0.5 ml), după care se adaugă enzima (12.5 mg) și decanoatul de vinil (8.95 , 4 eq). La final se adauga în reacție 2 bucăți de sită moleculară. Reacțiile se pun sub agitare la temperatura camerei, iar finalizarea lor se observă prin analiză cromatografică pe strat subțire (TLC), urmată de injectarea pe HPLC.

Tabel 4. Screening-ul de enzimă, solvent pentru reacția de acilare selectivă, utilizând decanoatul de vinil.

În cazul acilării enzimatice cu acetatul de vinil s-a înregistrat un raport enantiomeric mare (E 200), de asemenea s-au obținut produși cu excese enantiomerice mari atunci când s-a folosit diclormetanul. Datorită rezultatelor foarte bune obținute în cazul utilizării diclormetanului și a enzimei L-AK, acestea s-au folosit pentru realizarea acilării enzimatice la scară preparativă (Tabel 2.).

3.4. Acilarea enzimatică a cianhidrinei racemice la scară preparativă

Figura 16. Rezoluția cinetică a cianhidrinei racemice.

Se dizolvă 100 mg cianhidrină racemică în 20 ml diclormetan, se adaugă 500 mg enzimă (L-AK), și agentul de acilare ( acetatul de vinil, 147.43 ), iar în final 6-7 bucăți de sită moleculară. Reacția are loc la temperatura camerei, sub agitare, iar după 3 ore se observă finalizarea ei. Urmează o filtrare pentru îndepărtarea enzimei, urmată de evaporarea solventului, diclormetanul. Se separă cei doi produși rezultați în urma reacției, (S)-2-(5-(4-clorofenil)tiofen-2-il)-2-hidroxiacetonitrilul și (R)-(5-(4-clorofenil)tiofen-2-il)(ciano)metilacetatul, pe o coloană cromatografică, eluentul fiind diclormetan:Acid acetic 99:1.

• (R)-2-(5-(4-clorofenil)tiofen-2-il)-2-hidroxiacetonitril acetat, randament 89 (substanță solidă, alb-gălbuie), p.t = 60.6 .

1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.50 (d, J = 8.6 Hz, 2H), 7.37 (d, J = 8.6 Hz, 2H), 7.31 (d, J = 3.8 Hz, 1H), 7.19 (d, J = 3.8 Hz, 1H), 6.62 (s, 1H), 2.19 (s, 3H).

13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ 168.94, 147.03, 134.53, 132.77, 131.88, 130.74, 129.39, 127.34, 123.32, 115.34, 58.36, 20.58.

Tabel 5. Rotațiile optice ale enantiomerilor izolați R și S.

a10-1 deg cm2 g-1; c 1.0; CHCl3; T = 25

Figura 17. Separarea pe HPLC a produșilor obținuți în urma rezoluției cinetice la scară preparativă.

3.5. Determinarea configurației absolute a (S)-2-(5-(4-clorofenil)tiofen-2-il)-2-hidroxiacetonitrilul

Configurația absolută a (S)-2-(5-(4-clorofenil)tiofen-2-il)-2-hidroxiacetonitrilului a fost determinată cu ajutorul spectroscopiei 1H RMN, utilizând ambii enantiomeri ai acidului α-metoxi-α (trifluorometil)fenilacetic, MTPA, cunoscând configurația absolută.S-au realizat reacțiile de esterificare ale cianhidrinei optic pure rămasă netransformată în urma reacției de acilare enzimatică cu lipaza AK, folosind ambii enantiomeri, (R)-MTPA și (S)-MTPA.

Deplasările chimice ale grupării metoxi, ale celor doi esteri MTPA, au fost folosite drept semnale de referință în vederea determinării configurației absolute. Diferența dintre deplasările chimice ale semnalelor hidrogenului apare deoarece în unul dintre diastereomeri, hidrogenul și inelul fenil sunt de aceeași parte a planului MTPA, în timp ce în cazul celuilalt diastereomer sunt în planuri opuse.

Semnalul hidrogenului pentru cei doi diastereomeri a apărut la 7.3 pentru esterul (S)-MTPA-(+) și 7.31 pentru (R)-MTPA-(+). Acest lucru indică faptul că enantiomerul optic pur obținut prin reacția de acilare enzimatică este enantiomerul (S).

Pentru stabilirea configurației absolute a (S)-2-(5-(4-clorofenil)tiofen-2-il)-2-hidroxiacetonitrilului s-au efectuat două reacții de esterificare cu ambii enantiomeri ai acidului Mosher. S-au dizolvat 20 mg substrat în 2 ml CH2Cl2. S-au adăugat 18.7 mg (S)-MTPA, în prima reacție, respectiv 18.7 mg (R)-MTPA în cea de-a doua reacție. În ambele reacții se adaugă 19.8 mg diciclohexilcarbodiimidă (DCC) și câteva bucăți de sită moleculară.

Figura 7. Spectrele 1H-RMN suprapuse ale H în esterii (S,S) MTPA-1a (albastru) și (R,S) MTPA 1a (roșu).

4. Concluzii

În prezenta lucrare s-a realizat rezoluția cinetică enzimatică a 2-(5-(4-clorofenil)tiofen-2-il)-2-hidroxiacetonitril, mediată de L-AK. S-a urmărit obținerea enantiomerului (S) al amestecului racemic 2-(5-(4-clorofenil)tiofen-2-il)-2-hidroxiacetonitril. S-au determinat parametrii optimi: enzima, tipul de solvent necesar, precum și agentul de acilare cel mai convenabil în cazul procesului enzimatic studiat.

În urma acilării enzimatice a cianhidrinei racemice s-au determinat parametrii optimi care au condus la obținerea unor produși cu randamente de reacție mari și cu enantiopurități ridicate. L-AK s-a dovedit a fi optimă pentru reacția de acilare enzimatică, împreună cu diclormetanul folosit ca solvent și acetatul de vinil, ca agent de acilare.

În industria medicamentelor are o importanță deosebită puritatea enantiomerică a substanței. S-a efectuat studiul eficacității unei metode noi de separarea a amestecului racemic, prin intermediul folosirii HPLC-ului, pe o coloană chirală Chiralpak IC, IB utilizând ca și eluent un amestec de n-hexan:izopropanol în raport de 97:3 (v/v), 96:4 (v/v).

S-a proiectat instalația tehnologică la scară industrială pentru obținerea (S)-2-(5-(4-clorofenil)tiofen-2-il)-2-hidroxiacetonitrilului prin rezoluție cinetică enzimatică a amestecului racemic 2-(5-(4-clorofenil)tiofen-2-il)-2-hidroxiacetonitrilului, utilizând L-AK.

Bibliografie

[1] F.D. Irimie, C. Paizs, M. Toșa, Biotransformări în sinteza organică. Aspecte fundamentale, Ed.Napoca Star, Cluj Napoca, 2006;

[2] F.D. Irimie, Elemente de biochimie I, Ed.Erdelyi Hirado, Cluj Napoca, 1998;

[3] S. Agachi, Automatizarea proceselor chimice, Ed.Casa Cartii de Stiinta, Cluj Napoca, 1994;

[4] I. Lazar, Calculul si constructia recipientelor cu amestecator. Indrumator de proiectare, Universitatea Babes-Bolyai, Cluj Napoca, 1988;

[5] E.A. Bratu, Operatii unitare in ingineria chimica, vol.I, II, III, Ed.Tehnica, Bucuresti, 1984;

[6] I. Anghel, Inginerie mecanica pentru ingineri chimisti ,Ed.Risoprint, Cluj Napoca, 2001;

[7] C. F. Pavlov, P. G. Romankov, A. A. Noskov A. A., Procese si aparate in ingineria chimica, Ed. Tehnica, Bucuresti, 1981;

[8] L. C. Bencze, C. Paizs , M. Toșa, E. Vass, F.D. Irimie, Synthesis of enantiomerically enriched (R)- and (S)-benzofuranyl- and benzo[b]thiophenyl-1,2-ethanediols via enantiopure cyanohydrins as intermediates, Tetrahedron: Asymmetry, vol. 21, 2010, pag. 443-450;

[9] R. J. H. Gregory, Cyanohydrins in Nature and the Laboratory: Biology, Preparations, and Synthetic Applications, Chem. Rev., vol. 99, 1999, pag. 3649-3682;

[10] A. Ghanem, Lipase–catalyzed kinetic resolution of racemates: a versatile method for the separation of enantiomers, Kluwer Academic Publishers, 2004, pag. 193-230;

[11] M. Tomoaia, I. Albu, E. Chifu, Termodinamiă chimică, Ed. Presa Universitară Clujană, Cluj-Napoca, 2009;

[12] I. Bâldea, Cinetică chimică și reactoare chimice ideale, Ed. Presa Universitară Clujană, Cluj-Napoca, 2009;

[13] J. Holt, U. Hanefeld, Enantioselective Enzyme-Catalysed Synthesis of Cyanohydrins, Current Organic Synthesis, vol. 6, 2009, pag. 15-37;

[14] X. Qing, X. Yongli, G. Xiaohong, C. Peiran, Enzymatic kinetic resolution of racemic cyanohydrins via enantioselective acylation, Tetrahedron, vol. 66, 2010, pag. 624-630;

[15] L. Veum, M. Kuster, S. Telalovic, U. Hanefeld, T. Maschmeyer, Enantioselective Synthesis of Protected Cyanohydrins, European Journal Organic Chemistry, 2002, pag. 1516-1522;

[16] G. Lupușor, E. Merica, G. Gorea, V. B. Gorduza, Ingineria sintezei intermediarilor aromatici, Ed. Tehnică, București, 1971;

[17] I. F. Dumitru, D. Iordăchescu, Introducere în enzimologie, Ed. Medicală, București, 1981;

[18] T. Hudlicky, J. W. Reed, Applications of biotransformations and biocatalysis to complexity generation in organic synthesis, The Royal Society of Chemistry, vol. 38, 2009, pag. 3117-3132;

[19] N. N. Rao, S. Lutz, K. Wurges, D. Minor, Continuous Biocatalytic Processes, Organic Process Research & Development, vol. 13, 2009, pag. 607-616;

[20] S. Ifrim, I. Roșca, Chimie generală, Editura Tehnică, 1989;

[21] B. Franken, T. Eggert, K. E Jaeger, M. Pohl, Mechanism of acetaldehyde-induced deactivation of microbial lipases, BMC Biochemistry, 2011;

[22] F. Effenberger, J. Jäger, J. Org. Chem., 1997, 62, 3867-3873;

[23] F. Effenberger, J. Jäger, Chem. Eur. J., 1997, 3, 1370-1374;

[24] C. Paizs, P. Tähtinen, K. Lundell, L. Poppe, F. D. Irimie, L.T. Kanerva, Tetrahedron: Asymmetry, 2003, 14, 1895-1904.

[25] C. Paizs, M. Toșa, C. Majdik, P. Tähtinen, F.D. Irimie, L. T. Kanerva, Tetrahedron: Asymmetry, 2003, 14, 619-627.

[26] C. Paizs, P. Tähtinen, M. Toșa, C. Majdik, F.D. Irimie, L. T. Kanerva, Tetrahedron, 2004, vol. 60, 10533-10540.

[27] C. D. Nenițescu, V. Ioan, Manualul inginerului chimist, vol. II, Ed. Tehnică, 1952.

[28] F. Effenberger, J. Eichhorn, J. Roos, Tetrahedron: Asymmetry, 1995, vol. 6, 271-282;

[29] K. Tanaka, A. Mori, S. Inoue, J. Org. Chem., 1990, vol. 55, 181-185;

[30] L. R. Krepski, K. M. Jensen, S. M. Heilmann, J. K. Ramussen, Synthesis, 1986, 301-303;

[31] B. R. Matthews, H. Gountzos, W. R. Jackson, K. G. Watson, Tetrahedron Lett., 1989, vol. 30, 5157-5158;

[32] R. F. C. Brown, A. C. Donohue, W. R. Jackson, T. D. McCarthy, Tetrahedron, 1994, vol. 50, 13739-13752;

Anexe

Anexa 1: Lista cu utilaje și echipamente necesare

Anexa 2: Spectrele RMN

Spectru 1H RMN Cl-FT-CN

Spectru 1H RMN Cl-FT-CN Ac

Spectru 13C RMN Cl-FT-CN

Spectru 13C RMN Cl-FT-CN Ac