Rezistența la carbapeneme a tulpinilor de Klebsiella pneumoniae izolate din secrețiile traheobronșice [310199]
Universitatea de Medicină și Farmacie Craiova
Facultatea de Medicină
LUCRARE DE LICENȚĂ
Rezistența la carbapeneme a tulpinilor de Klebsiella pneumoniae izolate din secrețiile traheobronșice
Coordonator științific:
Prof. univ. Dr. Bălășoiu Maria
Absolvent: [anonimizat]
2017
CUPRINS
Partea generală
1 KLEBSIELLA – NOȚIUNI generale
1.1 Încadrare taxonomică 5
1.2 Caractere morfologice 5
1.3 Caractere de cultură 5
1.4 Caractere metabolice 5
1.5 Caractere antigenice 6
1.6 Caractere de patogenitate: 7
1.7 Aspecte clinice 7
1.8 Epidemiologie și profilaxie 8
2 Rezistența la antibiotice a bacteriilor din genul Klebsiella
2.1 Fenotipuri de rezistență: 9
2.2 [anonimizat] 10
2.2.1 Clasificarea BLSE 10
2.2.2 Mecanisme de rezistență la carbapeneme a tulpinilor de Klebsiella pneumoniae 12
2.2.2.1 Producerea de carbapenemaze…………………………………………………………………………………..12
2.2.2.2 [anonimizat]-lactamaze…………………………………………………………………………….14
2.2.2.3 Epidemiologia carbapenemazelor………………………………………………………………………………..15
3 Farmacocinetica și farmacodinamica antibioterapiei
3.1 [anonimizat] 18
3.2 Carbapenemele 19
3.3 Polipeptide 21
3.4 Tigeciclina 22
3.5 Aminoglicozide 23
3.6 Fosfomicină 23
3.7 Rifampicină 24
3.8 [anonimizat] 24
3.9 Evaluarea clinică a terapiilor de asociere 27
4 Diagnosticul de laborator al infecțiilor produse de Klebsiella spp.
4.1 Detectarea producerii de BLSE 29
4.1.1 Screening-ul producerii de BLSE prin testul de sinergie dublu disc 29
4.1.2 Screeningul BLSE prin CMI 30
4.1.3 Confirmarea producerii de BLSE prin testul dublu disc 30
4.1.4 Detectarea producerii de BLSE prin E-test 31
4.2 [anonimizat] 32
4.2.1 [anonimizat] (cefalosporinaze inductibile) prin metoda difuzimetrică…………………………………………………………………………………………………………………………………………32
4.2.2 Confirmarea producerii de AmpC prin testul discurilor cu combinații 33
4.2.3 Confirmarea producerii de AmpC prin testul de sinergie dublu disc 33
4.3 [anonimizat]-lactamaze (MBL) 34
4.4 Testul Carba NP 35
4.5 Teste moleculare 36
II. CERCETĂRI PERSONALE
1 IntroducerE………………………………………………………………………………………….40
2 Material și Metode……………………………………………………………………………….41
2.1 [anonimizat] 41
2.1.1 Medii cromogene 42
2.1.1.1 CHROMagar KPC………………………………………………………………………………………………………42
2.1.1.2 Briliance CRE Agar (Oxoid)…………………………………………………………………………………………43
2.1.1.3 ChromID® CARBA agar (bioMérieux) si ChromID®OXA 48………………………………………………43
2.1.1.4 SUPERCARBA (Biomerieux)…………………………………………………………………………………………44
2.1.2 Testul Hodge modificat 45
2.2 Metode de confirmare fenotipică a producerii de carbapenemază .46
3 Rezultate și discuții………………………………………………………………………………48
3.1 Rezistența la antibiotice a tulpinilor de Klebsiella ..50
4 Concluzii……………………………………………………………………………………………….57
5 Bibliografie…………………………………………………………………………………………..58
I. PARTEA GENERALĂ
KLEBSIELLA – NOȚIUNI generale
Încadrare taxonomică:
Ordinul: Eubacteriales; familia: Enterobacteriaceae; tribul: Klebsiellae; genul: Klebsiella.
Din cele 10 specii ale genului, 4 sunt importante în patologia umană: Klebsiella pneumoniae, K. oxytoca, K. ozenae și K. rhinoscleromatis.
Caractere morfologice
Pe frotiul efectuat din cultură: bacili Gram-negativi, nesporulați, capsulați, groși, drepți sau ușor încurbați.
Pe preparat proaspăt între lama și lamelă, efectuat din cultură: bacili imobili, monomorfi.
Caractere de cultură
Se folosesc medii simple – geloză simplă; selective – Istrate-Meitert, Leifson, MacConkey și complexe – geloză sânge .
Geloză simplă – colonii mucoide, mari, opalescente, uneori cenușii, cu suprafață umedă care după incubare prelungită prezintă tendința de confluare și curgere pe suprafața mediului
Mediul Istrate-Meitert – colonii lactozo-pozitive, opace, galbene, mari, mucosae, filante, ,,în picătură de miere”(prin prezența capsulei); fenomenul de „cameleonaj” (24 ore lactozo(+) apoi devin lactozo (-) )
Geloză-sânge – colonii mucosae, filante în picătură de miere, fără hemoliză
Mediul MacConkey – colonii lactoză-pozitive roz-roșii
Mediul Leifson – colonii lactozo-pozitive roșii
Caractere metabolice
fermentează glucoza cu producere de gaz (cu excepția K. Rhinoscleromatis);
fermentează lactoza variabil;
nu fermentează insulina;
uneori, aciditatea produsă prin fermentare este tranzitorie (fenomenul de cameleonaj);
nu produce hidrogen sulfurat;
nu produce indol (cu excepția K. Oxytoca);
folosește citratul ca sursă unică de carbon;
reduce nitrații la nitriți;
produce urează;
produce acetoină din glucoză (reacția Voges-Proskauer pozitivă);
reacția roșu metil-negativă (concentrația de acid produsă prin fermentarea dextrozei nu depășește sistemul fosfat tamponat);
ornitindecarboxilază negativă, fenilalanindezaminază negativă;
lizindecarboxilază de regulă pozitivă;
Figura 1.1. Caractere metabolice și de cultură – Klebsiella Pneumoniae
Caractere antigenice
prezintă un antigen somatic O (pe baza căruia s-au descris 5 grupe antigenice) și un antigen capsular K (pe baza căruia s-au descries 80 fracțiuni antigenice)
prin reacția de umflare a capsulei cu ajutorul serurilor anticapsulare de tip se identifică 80 de serotipuri de Klebsiella
Figura 1.2. Structura antigenică a enterobacteriilor (modificată după Muray P., 1994)
Caractere de patogenitate:
germeni condiționat-patogeni:
Virulența depinde de capsulă (antigenul K de înveliș), ce îi conferă protecție antifagocitară;
Toxinogeneza se manifestă prin endotoxină (antigen somatic O); au fost evidențiate ocazional la Klebsiella enterotoxine termolabile responsabile de apariția scaunelor diareice.
Aspecte clinice
Enterobacteriile sunt comensale, intrând în componența florei intestinale normale la om și animale, iar în număr redus se găsesc și la nivelul mucoasei tractului respirator. Se mai pot izola din apă, sol, plante. Atunci când patogenitatea intrinsecă a enterobacteriilor condiționat-patogene se exacerbează prin alterarea statusului biologic al organismului uman, rezultă:
Infecții de tract respirator inferior, cu evoluție cronică;
Pneumonie, asemănătoare clinic cu pneumonia pneumococică (evoluție acută sau subacută, expectorații cu spută ruginie, gelatinoasă). Deseori se complică dând abces pulmonar cu localizare predilectă în zonele de parenchim cu edem;
Infecții de tract urinar;
Infecții septicemice și meningită (mai ales la copii mici, cu rezistență scăzută);
Rinită atrofică, fetidă (,,ozenă) – agent etiologic Klebsiella ozenae;
Rinosclerom (inflamație cronică cu formare de granulom distructiv la nivelul cavității nazale și faringelui) – agent etiologic Klebsiella rhinosleromatis.
Figura 1.3. Evidențierea Klebsiella pneumoniae la nivel pulmonar
Epidemiologie și profilaxie
K. pneumoniae este specia cel mai frecvent izolată din cadrul genului, fiind deseori cauza unor infecții nosocomiale la gazda imunocompromisă (post intervenții chirurgicale; prezența dispozitivelelor medicale invazive – bronhoscopie, cateter venos central, tubulatura de intubație, drenuri chirurgicale; prezența comorbidităților – diabet zaharat, hepatită cronică, tuberculoză, neoplazii, infecție HIV, alte boli cronice; afecțiuni acute – arsuri, traumatisme ce duc la pierderea unor suprafețe mari de piele; tratamente imunosupresoare etc.) și la vârstele extreme (vârsta înaintată sau nașterea prematură) .
Răspunsul imun umoral este slab și profilaxia nespecifică. Profilaxia se aplică în primul rând în infecțiile nosocomiale și constă în măsurile uzuale de limitare a infecțiilor: igiena mâinilor, screening-ul și izolarea pacienților care provin din zone endemice pentru tulpini cu factori de rezistență, aplicarea unor proceduri corespunzătoare pentru manevrele de îngrijire medicală invazive etc.
Rezistența la antibiotice a bacteriilor din genul Klebsiella
Fenotipuri de rezistență:
Au fost descrise următoarele fenotipuri de rezistență la antibiotice a Klebsiella Pneumoniae:
-Fenotipul sălbatic caracterizat printr-un nivel scăzut de rezistență la amino și carboxipeniciline, (activitate restaurată prin inhibitorii de beta-lactamază – IBL), cloramfenicol, tetraciclină, streptomicină, biseptol.
Tulpinile de spital sunt în general multirezistente la chimioprofilaxia antiinfecțioasă uzuală. Rezistențele dobândite sunt legate de mecanisme enzimatice (penicilinaze, cefalosporinaze, BLSE = beta-lactamaze cu spectru extins, metalo-enzime) sau neenzimatice (impermeabilitate, mecanism de eflux și alterarea sediului – țintă al activității inhibitorii a antibioticului).
Rezistența dobândită enzimatică se exprimă prin:
-Fenotipul producător de β-lactamaze și β-lactamaze cu spectru extins (BLSE) (descrise pentru prima dată în 1985 în mediul spitalicesc și derivate din betalactamazele cu spectru îngust prin modificarea a unul sau 2 aminoacizi din situsul activ al enzimei):
BLSE tip penicilinază (TEM, SHV) sensibilitate la imipenem, carboxipeniciline + IBL, ureido-penicline + IBL;
BLSE tip oxacilinază: OXA-2, OXA-10 sensibile la imipenem;
cefalosporinaze cromozomiale cu rezistență la toate beta-lactaminele, cu excepția cefepimului și imipenemului;
cefalosporinaze cromozomiale cu sensibilitate doar la imipenem;
carbapenemaze: sensibile doar la aztreonam.
Rezistența dobândită neenzimatică se exprimă prin:
pierderea porinelor (OmpF, OmpC) prin care se limitează intrarea antibioticelor în spațiul periplasmic;
diminuarea calitativă/cantitativă a permeabilității membranei bacteriene externe;
modificarea PBP (penicillin binding proteins) inserate pe fața externă a membranei celulare;
efluxul activ al antibioticelor din celula bacteriană – împiedică realizarea in celulă a unor concentrații eficiente de antibiotice.
Bacilii Gram negativi rezistenți la carbapeneme sunt rezistenți la toate β-lactaminele ca și la majoritatea claselor de agenți antimicrobieni.
CLSI (Clinical and Laboratory Standards Institute) recomandă ca tulpinile de Klebsiella pneumoniae și Klebsiella oxytoca producătoare de BLSE să fie raportate ca fiind rezistente la peniciline, cefalosporine și monobactami, indiferent de datele de susceptibilitate in vitro. Astfel, clasele de agenți terapeutici rămași disponibili în tratamentul infecțiilor produse de BLSE sunt combinațiile beta-lactam/inihibitor de beta-lactamaze, aminoglicozidele, sulfonamidele, chinolonele și carbapenemele.
Mecanisme de rezistență la beta-lactamine
Producerea de β-lactamaze: mecanismul principal de rezistenta la β-lactamine la bacteriile Gram-negative.
Transfer de plasmide cu gene de rezistenta
β-lactamazele sunt enzime care au capacitatea de a hidroliza gruparea oximino a inelulului betalactamic al antibioticelor betalactamice, inactivând astfel penicilinele, oximino-cefalosporinele (ceftazidima, cefotaxima, ceftriaxona, etc.) și monobactamii.
Clasificarea BLSE
Betalactamaze mediate plasmidic:
penicilinaze cu spectru larg (tip TEM și SHV-1 apărute prin mutații punctiforme ale acestor beta-lactamaze cu spectru îngust prin modificarea a unul sau doi aminoacizi din situsul activ al enzimei și după anul 1995, variantele CTX-M) care hidrolizează penicilinele și cefalosporinele – Clasa A;
oxacilinaze (de tip OXA), care hidrolizează oxacilina și cloxacilina – Clasa D;
carbenicilinaze (de tip CARB), care hidrolizează preferenial carbenicilina.
Cefalosporinaze cromozomiale (ex: CMY-2): achizitia de gene de tip AmpC prin intermediul plasmidelor de la speciile natural producătoare (Enterobacter, Serratia, Morganella, Citrobacter freundii) – Clasa C;
Metalo-betalactamaze –hidrolizează majoritatea agenilor betalactami, inclusiv carbapenemii. Prezintă rezistență la inhibitorii de betalactamaze. – Clasa B.
Tabelul 2.1. Mecanisme de rezistență la beta-lactamine ale Klebsiella spp.
Abrevieri: AMP ampicillină; AMC amoxicilină/acid clavulanic; CLOT ceftolozan/tazobactam;
CAZ ceftazidim; FEP cefepim; FOX cefoxitin; CAZ+CLAV ceftazidim/acid clavulanic; FEP+CLAV cefepim/acid clavulanic; IMI+EDTA imipenem/acid etilendiaminotetraacetic; MRP+DPA meropenem/acid dipicolinic; CLOXA cloxacilină; AZT aztreonam
Tabelul 2.2. Clasificarea cefalosporinazelor AmpC detectate la genul Klebsiella,
CMI μg/ml
Mecanisme de rezistență la carbapeneme a tulpinilor de Klebsiella pneumoniae
Diminuarea calitativă/cantitativă a permeabilității membranei bacteriene + supraexprimarea unei enzime cu activitate hidrolitică slabă față de carbapeneme (BLSE, AmpC).
Producerea de Cefalosporinaze (ex: β- lactamaze tip AmpC cromozomiale sau plasmidice DHA-1, CMY-2) sau BLSE (ex: TEM,SHV, CTX-M) combinate cu pierderea porinelor (OmpF, OmpC) limitează intrarea carbapenemilor în spațiul periplasmic. Va fi hidrolizat ertapenemul mai mult decât imipenemul sau meropenemul.
Producerea de carbapenemaze
Carbapenemaze: KPC+++ (serin-betalactamază – Clasa A), IMP,VIM, NDM-1 (metalo-betalactamaze – Clasa B), OXA-48 (Clasa D), CMY (Clasa C). Carbapenemazele sunt un grup divers de betalactamaze active nu doar asupra oximino-cefalosporinelor și cefamicinelor dar și asupra carbapenemelor. Ele pot fi codificate plasmidic sau cromozomial.
Tabelul 2.3. Clasificarea carbapenemazelor după Ambler
Figura 2.1. Clasificarea carbapenemazelor după Ambler
Familia de enzime KPC conferă o rezistență mai crescută la cefalosporine de generația a treia decât la carbapeneme [1].
Tulpinile de Klebsiella pneumoniae intermediar sau rezistente la ertapenem sau meropenem trebuie considerate rezistente la toate carbapenemele [2]. KPC a fost identificată la tulpini de E. coli izolate de la nouă pacienți din New York. Trei dintre izolate posedau, de asemenea, ESBL: CTX M15 [3].
Carbapenemaza IMI-2 este prima carbapenemază inductibilă și codificată plasmidic.
Carbapenemazele din clasa D cuprind enzime clasificate ca oxa-tipuri (activitate oxacillinazică). Cel mai răspândit tip este OXA-48, care are o activitate carbapenemazică heterogenă [4]. Medicii trebuie să fie conștienți de potențialul eșec clinic (carbapenemaza OXA-55) al imipenemului în tratamentul infecțiilor grave. Fernandez et al raportează heterorezistență la carbapeneme în Acinetobacter baumannii cu MIC la imipenem 4-16 pg și prezența OXA-58 [5]. Yilmaz et al [6] raportează oxacilinaze (OXA-48) în 21 Enterobacteriaceae, în principal K.pneumoniae, dar, de asemenea, în E. coli și Enterobacter cloacae/aerogenes în Turcia, și avertizează că oxacilinazele se răspândesc la alte Enterobacteriaceae.
Secreția de metalo-beta-lactamaze
Răspândirea la nivel mondial a metalo-beta-lactamazelor dobândite (MBL) la bacteriile aerobe Gram negative este îngrijorarătoare. Producția MBL trebuie monitorizată cu atenție în izolatele clinice de P. aeruginosa, E. cloacae, S. marcescens și K. pneumoniae [7]. MBL sunt clasificate în 5 tipuri majore: IMP, VIM, SPM, și GIM și SIM. În Enterobacteriaceae numai enzimele IMP și VIM nu au fost încă identificate.
MBL hidrolizează majoritatea beta-lactaminelor (carbapeneme și cefalosporine cu spectru larg), cu excepția aztreonamului. Acest fenotip de rezistență multiplă beta-lactamică și sensibilitate la aztreonam poate fi folosit pentru identificarea acestor tulpini in laborator. Dacă tulpina este rezistentă la aztreonam aceasta se poate datora unor mecanisme de rezistență suplimentare (eflux, alte beta-lactamaze, ESBL etc.). Expresia MBL nu este inductibilă.
Enzimele MBL sunt rezistente la inhibitori de beta-lactamază și sensibile la agenți chelatori cum ar fi EDTA (2-MPA) și acid dipicolinic (DPA).
Prima producătoare de tulpina de E. coli producătoare de metalo-beta-lactamază a fost detectată în Barcelona, Spania, folosind discuri cu imipenem+EDTA și E-test [8]. Prima tulpină de Klebsiella producătoare de metalo-beta-lactamază a fost identificată în Franța [9]. Bacterii Gram negative producătoare de MBL au fost identificate în Australia [10]. Gena de rezistență bla-IMP4 pare a fi extrem de mobilă, acest focar implicând genuri diferite de bacterii Gram negative.
A fost demonstrată eficiența acidului dipicolinic (DPA) pentru detectarea metalo-beta-lactamazelor la Enterobacteriaceae și non-fermentativi [11]. S-a constatat că testul de sinergie între Imipenem și DPA a fost pozitiv pentru toate izolatele producătoare VIM de Klebsiella spp./ Enterobacter spp. și Proteus mirabilis, în timp ce testele bazate pe EDTA nu au putut identifica tulpinile de Proteus mirabilis producătoare de VIM.
Epidemiologia carbapenemazelor
Din păcate, utilizarea carbapenemelor a determinat apariția de Enterobacteriaceae rezistente față de acestea; ulterior, nivelul crescut de utilizare al carbapenemelor ca și insuficiența măsurilor de prevenire a transmiterii interumane a germenilor a facilitat în diverse regiuni geografice/unități sanitare creșterea incidenței infecțiilor/colonizărilor cu bacili gram-negativi nonfermentativi rezistenți la carbapeneme cât și cu CPE. Principala îngrijorare legată de emergența acestor tulpini bacteriene este creșterea dificultății de a trata infecțiile severe cauzate de acestea (inclusiv infecții cu risc de deces), întrucât foarte puține antibiotice rămân active împotriva lor; de multe ori rezistența acestor tulpini este completă față de beta-lactamine și se asociază cu rezistență la alte clase de antibiotice.
Rata deceselor în infecții sistemice determinate de CPE atinge 40%- 50%. Situația este cu atât mai îngrijorătoare cu cât extrem de puține antibiotice potențial active sunt în curs de testare pentru a fi utilizate în practica medicală. Dintre problemele actuale de rezistență bacteriană, cea mai severă din punctul de vedere al sănătății publice este CPE deoarece mecanismul de rezistență este ușor transferabil de la o bacterie la alta, iar enterobacteriile nu sunt implicate doar în infecții nosocomiale, cel mai adesea ele generând de fapt infecții comunitare; fenomenul de ”aclimatizare” în comunitate al enterobacteriilor cu mecanisme de rezistență la antibiotice apărute în mediu spitalicesc a fost deja descris în cazul E coli producătoare de ESBL (CTX-M15) și el se poate repeta pentru bacteriile producătoare de carbapenemaze.
Ratele de răspândire ale tulpinilor de Escherichia coli și Klebsiella pneumoniae producătoare de beta-lactamază cu spectru larg (ESBL) cresc pe toate continentele. Însă, cea mai mare amenințare în momentul de față este reprezentată de carbapenemaze.
Carbapenemazele produse de K. pneumoniae (KPC), care au fost izolate pentru prima dată în America de Nord, s-au răspândit acum în întreaga lume. Acestea se găsesc în numeroase Enterobacteriacee, precum și în Pseudomonas aeruginosa și Acinetobacter baumannii.
Dintre carbapenemazele de tip metalo-beta-lactamază (MBL), P. aeruginosa producătoare de VIM se găsesc în întreaga lume, iar acum se răspândesc tot mai mult Enterobacteriaceele producătoare de VIM. Enzimele VIM hidrolizează carbapenemi și cefalosporine, dar nu și aztreonam. Carbapenemazele de tip OXA sunt carbapenemazele cele mai frecvente din A. baumannii. La nivel global, A. baumannii este probabil organismul cu cea mai mare rezistență, fiind patogenul „numărul unu” care provoacă focare de infecție intra-spitalicești.
Noua carbapenemază New Delhi Metalobetalactamaza (MBL) 1 (NDM-1) este prezentă atât în infecțiile cu Enterobacteriacee dobândite în spital cât și în comunitate și aceasta s-a răspândit în numeroase alte țări.
Înainte de introducerea ertapenem, rezistența la imipenem era în creștere, însă ca urmare a introducerii ertapenem s-a observat o scădere semnificativă a procentului de tulpini rezistente la imipenem (MIC >4mcg/ml) [12]. Cercetătorii cred că aceasta poate avea legătură cu reducerea utilizării ciprofloxacinei și scăderea activității de pompă de eflux a MexEF-OprN indusă de ciprofloxacină, care are legătură cu rezistența la imipenem. Ei sugerează că limitarea utilizării ciprofloxacinei ar putea fi un mijloc de a controla ratele de infecții nozocomiale cu bacterii rezistente la carbapeneme.
Studiul pentru Monitorizarea Tendințelor privind Rezistența Antimicrobiană (SMART) a urmărit tendințele mondiale în ceea ce privește sensibilitatea patogenilor intra-abdominali gram-negativi din 2002 încoace [13]. Colecția de date SMART a fost acum extinsă pentru a include și izolații din infecțiile căilor urinare, iar primele date ale acestei noi analize au fost raportate la societatea americană de boli infecțioase.
Figura 2.2. Evoluția răspândirii carbapenemazelor la nivel mondial între anii 2007-2013
Farmacocinetica și farmacodinamica antibioterapiei
Strategii de tratament al infecțiilor cu KP-CR
Tratamentul se reduce la una din 3 strategii:
Prima opțiune este administrarea unui antibiotic de primă intenție (Ex. Meropenem, fluorochinolone, aminoglicozide) la o doză suficient de mare încât să învingă rezistența. Există însă tulpini de KP-CR ce necesită o concentrație minimă inhibitorie atât de înaltă încât ar produce efecte toxice.
A doua opțiune este utilizarea unui antibiotic ce are ca spectru de activitate bacteriile Gram-negative pentru care KP-CR încă nu a dobândit rezistență (Ex. colistină, tigeciclină, gentamicină, fosfomicină). Însă multe antibiotice de linia a doua sunt mai toxice decât cele de linia I sau au activitate farmacocinetică limitată în mediile cel mai des contaminate cu KP–CR: urină, sânge, secrețiile traheobronșice. În plus, agentul patogen poate dobândi rezistență la toate antibioticele de linia a doua dacă acestea sunt administrate în monoterapie.
Strategia finală de tratament este administrarea în asociere a antibioticelor de primă și secundă intenție în speranța că prin efectele sinergice nu va fi nevoie de doze mari, va fi suprimată creșterea rezistenței la antibiotice și nu va mai exista deficitul farmacocinetic al agenților individuali.
Tabelul 3.1. Algoritm de terapie empirică pentru infecțiile de KP-CR bazat pe factorii de risc individuali și pe datele epidemiologice
Carbapenemele
În pofida creșterii rezistenței la carbapeneme, acestea continuă să fie esențiale pentru tratamentul infecțiilor asociate asistenței medicale la pacienții cu o boală severă sau imunocompromiși. Prin administrare intravenoasă, carbapenemele ajung în lichidul pleural, sânge, urină, SNC, fiind astfel eficiente într-o gamă largă de infecții.
Reprezentanți: imipenem-cilastin, meropenem, ertapenem.
Structura chimică: antibiotice beta-lactamice al căror inel lactamic a suferit modificări.
Mecanism de acțiune: inhibă sinteza peretelui bacterian prin alterarea producției de peptidoglicani în urma legării de PBP-urile implicate în transpeptidarea acestuia.
Aplicabilitate clinică: Imipenemul utilizat în combinație cu cilastin (inhibitor specific și reversibil al dihidropeptidazelor renale, care inactiveaza imipenemul) este utilizat în infecții severe intraabdominale, urinare, osteo-articulare, pulmonare etc.
Din punct de vedere farmacodinamic, carbapenemele au activitate bactericidă asupra bacteriilor gram-negative atunci când concentrația medicamentului în formă liberă rămâne mai mare decât concentrația minimă inhibitorie a agentului patogen 40-50% din timpul de perfuzare (40–50% fTimp > MIC). Cel mai eficient mod este administrarea a doze mari de medicament în perfuzie continuă atunci când CMI sunt relativ scăzute (<4 μg/mL) sau moderat ridicate (8–16 μg/mL). Pe măsură ce carbapenemele sunt filtrate (nemodificate) la nivel renal cu valori ale timpilor de înjumătățire plasmatici între una și 2 ore, cea mai eficientă strategie de a asigura o concentrație a antibioticului care să depășească CMI a agentului patogen este administrarea în perfuzie continua sau prelungită [14]. (Fig. 3.1. A & B).
Figura 3.1. Concentrații de meropenem la pacienți septici în stare critică, fără disfuncție renală, prin administrare în perfuzie continuă sau dozare în bolus [15]
Concentrații în (A) Plasmă, (B) Țesutul subcutanat evidențiate la 10 pacienți în stare critică atunci când s-a administrat o doză initială de 500 mg, apoi 1000 mg la fiecare 8 ore prin perfuzie continua prelungită (pătrate negre); sau o doză inițială de 1500 mg urmată de 1000mg la fiecare 8 ore dozare intermitentă (cercuri albe).
(C) Simulări de dozare tip Monte Carlo, administrare de meropenem. S-a demonstrat că prin administrarea de doze mari de meropenem (6000mg/zi) în perfuzie continua prelungită (peste 4 ore) este atinsă o performanță farmacocinetică/farmacodinamică înaltă pentru CMI-uri de până la 8–16 mg/l.
Într-un studiu de cohortă a 41 pacienți infectați cu KP-CR [16], cele mai favorabile răspunsuri clinice au fost constatate la pacienți tratați cu un carbapenem în asociere cu alt antibiotic (de obicei colistină sau tigeciclină), deși aproape o treime din tulpinile izolate erau carbapenem-rezistente. Mortalitatea la 28 zile a fost 12,5% versus 66,7 % pentru cei tratați cu monoterapie (colistină sau tigeciclină), în pofida susceptibilității in vitro. Un alt studiu [17] a evidențiat faptul că în rândul pacienților infectați cu KP-CR și tratați cu carbapeneme (de obicei în asociere cu aminoglicozide sau tigeciclină) exista o rată a mortalității mult mai mică comparativ cu pacienții tratații cu alte combinații antibiotice (12 vs 41%), mai ales în cazurile în care CMI a agentului patogen este <4 mg/l.
Polipeptide
Reprezentanți: Colistina (polimixina E) și polimixina B
Mecanism de acțiune – Sunt bactericide dependente de concentrație; lezează membrana celulară, acționând ca niște detergenți tensioactivi.
Proprietăți PK – Absorbția din tubul digestiv este redusă; se elimină prin urină.
Spectrul de activitate este limitat la bacterii gram-negative.
Aplicații clinice – Administrate parenteral, au indicații în septicemii cu bacili gram-negativi sau în infecții urinare iatrogene (de obicei în asociere cu alte antibiotice sinergice). Administrate oral, sunt utilizate în tratamentul infecțiilor digestive cu germeni sensibili.
Colistina este o peptidă cationică antimicrobială care din cauza nefrotoxicității și a neurotoxicității a avut o utilizare clinică redusă până recent. Creșterea ratei rezistenței la carbapeneme a bacteriilor Gram-negative a reintrodus utilizarea acestui antibiotic în schemele de tratament (sub forma derivatului metansulfonat Colistimetat CMS). Colistina și polimixina B (care diferă printr-un singur aminoacid) sunt considerate astăzi cei mai activi agenți in vitro contra enterobacteriilor carbapenem-rezistente. Dozele ideale de colistină și polimixină B sunt inexacte și trebuie ajustate în caz de afectare renală sau boală severă (colistina și polimixina B suferă un proces de reabsorbție tubulară și sunt eliminate predominant prin clearance nonrenal, pe când derivatul CMS este eliminat la nivel renal). Prin clearance-ul renal al CMS, se atinge o concentrație crescută a antibioticului în urină, facându-l eficient în tratarea infecțiilor de tract urinar.
Deși neurotoxicitatea (manifestată prin parestezii, ataxie ) rămâne o problemă majoră fiindcă survine la ≥40% dintre pacienții tratați cu polimixine (50%–60% la cei tratați cu colistină vs 20%–40% la cei tratați cu polimixina B) [18], pacienții discutați în literatura medicală recentă sunt de obicei în stadii grave de boală, ventilați și sedați, neurotoxicitatea fiind astfel greu de detectat.
O altă problemă ce survine în tratamentul cu polimixine este rezistența medicamentoasă. Hemoculturi de la un pacient infectat cu K. pneumoniae carbapenem-rezistentă și tratat cu polimixină B în monoterapie au evidențiat creșterea CMI a polimixinei (de la 0.75 μg/mL la 1024 μg/mL) în doar 5 zile [19]. În plus, au fost raportate focare de infecție cu tulpini de KP-CR rezistente la colistină [20], [21].
În consecință, polimixinele sunt cel mai eficiente în cadrul unei terapii de asociere pentru infecții severe cu ECR. Un studiu retrospectiv a 15 studii cuprinzând 55 pacienți infectați cu bacterii producătoare de KPC a evidențiat răspuns clinic favorabil scăzut în monoterapia cu colistină față de terapia de asociere (14.3% [1 din 7] vs 72.7% [8 din 11]) [22]. Într-un studiu de cohortă recent a 36 pacienți cu septicemii cu ECR (toate în afară de 2 produceau atât OXA-48 cât și CTX-M), terapia de asociere ce includea colistină a dus la o mai bună rată de supraviețuire la 28 zile decât regimurile fară colistină (33.3% vs 5.5%) [23].
Tigeciclina
Tigeciclina este un derivat de minociclină cu spectru de activitate larg, incluzând multe tulpini de KP-CR [24]: bacterii Gram-pozitive, gram-negative, anaerobe, micobacterii atipice rezistente la tetraciclină. Din nefericire, rezistența la tigeciclină este în creștere în zonele endemice pentru infecții cu KP-CR, mai ales dacă este administrată în monoterapie [25].
Mecanism de acțiune: bacteriostatic ce acționează prin interferarea sintezei proteice, prin legare la nivel ribozomal (subunitatea S30).
Proprietăți PK: după administrare orală, absorbția intestinală este bună. Mecanismul principal al rezistenței microbiene este în principal cel al efluxului crescut sub acțiunea unei gene plasmidice.
Aplicabilitate clinică: Într-un studiu care a inclus un număr mic de pacienți infectați cu KP-CR, 71.4% (5 din 7) dintre acestia au avut un prognostic bun după tratamentul cu tigeciclinăix. Tigeciclina are eficiență maximă atunci când este utilizată în doze mari și/sau în terapii de asociere (de exemplu cu colistină) pentru infecții severe cu ECR. Însă concentrații plasmatice crescute de tigeciclină pot fi obținute doar pentru scurtă durată deoarece antibioticul se acumulează în mare parte intracelular, doar 22% fiind excretat în forma activă în sânge, lichidul pleural și tractul urinar [26].
Aminoglicozide
Reprezentanți: streptomicina, kanamicina, tobramicina, amikacina, gentamicina etc.
Structura chimică: Aminoglicozidele sunt derivați naturali sau de semisintetici din specii de Streptomyces sau Micromonospora formați din una sau două aminozaharide legate printr-o punte glicozidică de un aminociclitol central.
Mecanism de acțiune: bactericide dependente de concentrație și independente de inoculum ce se leagă de ribozomii 30S bacterieni, inducând o citire greșită a mARN-lui, ceea ce duce la sinteza de proteine anormale și nefuncționale.
Proprietăți PK: Concentrațiile din majoritatea țesuturilor sunt inferioare celor plasmatice (excepție făcând structurile pleuro-pulmonare și cavitatea peritoneală). Nu se absorb din tubul digestiv. Se elimină nemodificate prin urină. Modificarea dozelor este necesară în caz de afectare renală, chiar minimă.
Reacții adverse: Dintre toate antibioticele folosite curent în practică, aminoglicozidele au cel mai redus raport între nivelul de eficacitate terapeutică și pragul toxic.
Spectrul de activitate: Importanța lor clinică rezidă în primul rând din acțiunea pe enterobacteriile gram-negative și pe P. aeruginosa. Sunt rezistenți natural: streptococii, enterococii, bacteriile strict anaerobe, chlamidiile, micoplasmele și rickettsiile. Din cauza rezistenței dobândite, care este multifactorială, sensibilitatea unor bacterii este imprevizibilă în absența antibiogramei – enterobacteriile secretoare de BLSE, K. pneumoniae, Ps. aeruginosa.
Gentamicina este cel mai activ aminoglicozid in vitro asupra tulpinilor de KP-CR.
Într-un studiu de cohortă retrospectiv cuprinzând cazuri de bacteriemii cu KP-CR, tratamentul cu un aminoglicozid activ in vitro a fost corelat cu un clearance microbian mult mai mare decât tratamentul cu polimixină B sau tigeciclină [27]. Într-un studiu meta-analitic a 20 studii clinice, terapia de asociere formată dintr-un aminoglicozid și un carbapenem a prezentat cea mai scăzută rată a mortalității(11.1%) [28].
Fosfomicină
Mecanism de acțiune: bactericid dependent de timp; inhibitor non-beta-lactamic al peretelui celular bacterian (prin inhibiție enzimatică). Deși este utilizat mai ales în tratamentul infecțiilor urinare, are un spectru de activitate larg, ce include tulpini de KP-CR rezistente la tigeciclină și colistină. Au fost raportate cazuri de răspuns terapeuric favorabil în tratatea infecțiilor de tract urinar cu enterobacterii producătoare de KPC și NDM[29], [30]. La 3 pacienți infectați cu KP producătoare de KPC, a fost administrată fosfomicină intravenos ca ultima opțiune terapeutică rămasă; inițial a existat un răspuns favorabil, dar în final tratamentul a eșuat prin recădere și dobândirea rezistenței la antibiotic [31].
Proprietăți PK: Se pot obține concentrații înalte ale antibioticului în urină, plasmă, plămân, LCR și mușchi, iar nefrotoxicitatea este scăzută.
Rifampicină
Structura chimică: Rifampicina este un derivat sintetic al rifampicinei B, un antibiotic derivat din Streptomyces mediterranei.
Mecanism de acțiune: Acționează prin inhibiția sintezei ARN-ului bacterian blocând transcripția acestuia.Rifampicina acționează cel mai eficient în faza de diviziune bacteriană, dar poate acționa și asupra bacteriilor aflate în stare de repaus.
Rezistența se dezvoltă rapid, chiar în timpul tratamentului de scurtă durată, mai ales dacă este folosită în monoterapie.
Proprietăți PK: Absorbția orală este foarte bună precum și distribuția în țesuturile și lichidele organismului. Este metabolizată în ficat, unde intră în ciclul enterohepatic. Este excretată în principal prin fecale și o mică parte prin urină.
Reacții adverse: Sensibilizarea la rifampicină, mai ales în tratamentele intermitente, poate merge până la șoc. Toxicitatea hepatică este amplificată de bolile hepatice preexsitente sau de de administrarea concomitentă de izoniazidă.
Spectru de activitate larg, în primul rând asupra bacteriilor gram-pozitive și micobacteriilor, dar și asupra unor bacterii gram-negative, inclusiv specii enterale. A fost demonstrat faptul că rifampicina are efect sinergic cu colistina în tratatea infecțiilor cu KP-CR [32]. De asemenea, rifampicina este inclusă în terapii de asociere pentru infecțiile cu KP-CR prin material prostetic datorită capacitații sale de a penetra biofilme bacteriene intracelulare.
Antibiotice aprobate recent pentru tratarea infecțiilor cu KP-CR
Ceftazidim-avibactam – ceftazidim=cefalosporină de generația a III-a, avibactam=inhibitor nou de β-lactamază.
Cefalosporinele – sunt înrudite farmacologic cu penicilinele, având un inel beta-lactamic ca structură majoră. Cefalosporinele de generația a III-a au mai mare rezistență la degradarea beta-lactamazelor și sunt indicate în tratamentul infecțiilor cu enterobacterii gram-negative care nu răspund la CFS timpurii sau la penicilinele cu spectru larg.
Inhibitorii de beta-lactamaze – au structuri asemănătoare penicilinelor și se comportă ca molecule “sinucigașe”, împiedicând distrugerea inelului beta-lactamic al antibioticului asociat de către proteazele bacteriene printr-un mecanism de inhibiție competitivă.
Asocierea Ceftazidim-avibactam este indicată în tratamentul infecțiilor severe intraabdominale sau de tract urinar și doar la pacienții fără alte opțiuni terapeutice. Acționează asupra carbapenemazelor KPC și asupra OXA-48; nu acționează asupra metalo-β-lactamazelor precum NDM-1.
Alți agenți terapeutici: Ceftarolin – avibactam, Plazomicin, Eravaciclină.
Tabelul 3.2. Principalele caracteristici ale medicamentelor utilizate în tratarea Enterobacteriilor Carbapenem-Rezistente
Evaluarea clinică a terapiilor de asociere
Din cauza eficienței limitate și a toxicității diverselor antibiotice, mulți experți recomandă terapii de asociere în loc de monoterapie în infecțiile cu KP-CR. În lipsa unor studii comparative cuprinzătoare, sunt încă sub semn de întrebare combinațiile antibiotice adecvate răspunsului fiziologic al fiecărui bolnav, rolul exact al carbapenemelor în terapia de asociere, momentul în care terapia de asociere ar trebui începută.
Terapia empirică poate îmbunătăți rata de supraviețuire în rândul pacienților cu infecții cu microorganisme multidrog-rezistente (MDR), deoarece un tratament inițial nepotrivit este asociat cu mortalitate crescută, chiar în situația în care este ajustat la primirea rezultatelor microbiologice. În consecință, raționamentul logic este aplicarea unei terapii empirice prin antibiotice cu spectru larg și apoi optimizarea ei în funcție de rezultatele testelor de susceptibilitate la antibiotice.
Un alt argument pentru terapia de asociere este prospectul unui efect sinergic precum și stoparea formării rezistenței la un antibiotic. Cu toate acestea, efectul sinergic este o definiție microbiologică bazată pe studii in vitro și este dificil de demonstrat in vivo pentru infecții cu bacterii Gram-negative. Impactul terapiei de asociere în infecțiile cu KP a fost foarte puțin evaluat. Într-un studiu vechi a 230 pacienți cu bacteriemie cu KP, nu a fost observată nicio diferență în rata de mortalitate a pacienților primind terapie de asociere (18%) versus cei aflați in monoterapie (20%) [33]. Însă în cadul subgrupului de pacienți care erau hipotensivi la 72 ore de la recoltarea produselor biologice, mortalitatea a fost semnificativ mai scăzută pentru cei sub terapie de asociere (24%) față de cei cu monoterapie (50%).
Cel mai cuprinzător studiu retrospectiv realizat până în prezent, în care sunt incluși 889 pacienți cu infecții cu ECR, a evidențiat faptul că terapia de asociere cu 2 sau mai mulți agenți activi in vitro este asociată cu o rată a mortalității mai scăzută decât tratamentul cu un singur agent activ in vitro (27.4% [121 din 441] vs 38.7% [134 din 346]) [28]. Monoterapia a dus la o rată a mortalității aproximativ egală cu cea întâlnită în cadrul pacienților tratați cu agenți medicamentoși fără activitate in vitro (46.1% [48 din 102]).
Există un interes crescut pentru aplicabilitatea terapiilor de asociere în infecțiile cu KP din cauza abilității patogenului de a dobândi rezistență la diverse clase de antibiotice, cu o disponibilitate limitată a compușilor eficienți. Cercetarea continuă (sub forma trialurilor clinice radnomizate) este indispensabilă în stabilirea schemelor de tratament adecvate pentru infecțiile severe cu KP-CR, în funcție de profilul de rezistență al tulpinilor circulante și de răspunsul fiziologic al fiecărui pacient.
Numeroși agenți antimicrobieni noi activi împotriva KP-CR au avansat la Faza a III-a a trialurilor clinice. Ceftolozan este o cefalosporină nouă potentă care nu este degradată de cefalosporinazele AmpC cunoscute până în prezent și nu este afectată de mutațiile de la nivelul porinelor sau supraexpresia pompelor de eflux ale tulpinilor de KP-CR. Testat împreună cu tazobactam, antibioticul a demonstrat activitate promițătoare in vitro împotriva unor bacterii MDR Gram-negative, incluzând KP-CR [35].
În plus, crearea de noi inhibitori de β-lactamază, precum avibactam, al căror spectru include nu numai cefalosporinzele cât și majoritatea carbapenemazelor (cu excepția rarelor NDM-1 metalo-β-lactamaze), va restaura activitatea contra KP-CR a unor agenți vechi precum ceftazidim [36].
Alți noi inhibitori de β-lactamază și aminoglicozide de generație nouă (neoglicozide) ar putea extinde opțiunile terapeutice în viitorul apropiat. Cu toate acestea, rezistența, chiar și la acești agenți noi, este inevitabilă și nu trebuie ignorată nevoia de a îmbunătăți controlul infecției, screening-ul și detecția precoce a acestor patogeni rezistenți la antibiotice.
Rămân valabile conceptele fundamentale ale unei terapii antimicrobiene eficiente: inițierea tratamentului cât mai devreme, selecția unor compuși cu susceptibilitate cunoscută și care ajung la locul infecției, o doză care să asigure activitatea bactericidă în primele 24 ore, minimizarea efectelor toxice precum și îndepărtarea sau drenajul surselor de infecție.
Diagnosticul de laborator al infecțiilor produse de Klebsiella spp.
Detectarea producerii de BLSE
În prezent, nu există ghiduri CLSI pentru detectarea ESBL la alte specii decât Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Proteus mirabilis și Salmonella spp. BLSE sunt de asemenea prezente la alte Enterobacteriaceae, cum ar fi Enterobacter spp. Etc. (Pitout, 2003).
Screening-ul producerii de BLSE prin testul de sinergie dublu disc
Cele mai multe BLSE sunt inhibate de către acidul clavulanic, tazobactam sau sulbactam si pot fi usor de detectat prin testul dublu disc și testul de sinergie (Casals, 1990). Pe o placă cu geloză Mueller-Hinton se inoculează tulpina ca pentru testarea sensibilității și se aplică Ceftriaxon (CTR), Cefotaxim (CTX), Ceftazidime (CAZ), cefepim (FEP) și Aztreonam (AZT), la aproximativ 20 mm (30 mm de centrul comprimat la centru tabletă) de o tabletă care conține amoxicilina + clavulanat (AMC) folosind un dispenser (Figura 4.1). Se incubează 16-18 h la 35 ° C. Se pot folosi trusew de discuri specializate, de ex. ESBL screening kit, ROSCO Diagnostika, Denmark. Acestea saunt discuri cu diametru de 9 mm, cu o structură microcristalină care permite păstrarea timp îndelungat la temperatura camerei, fiind denumite de firma producătoare Neo-Sensitabs.
Extinderea zonei de inhibiție (sinergism) spre tableta care conține AMC, indică prezența unei beta-lactamaze cu spectru extins (BLSE).
Tulpinile cu beta lactamaze TEM rezistente la inhibitori (IRT) dau modele de rezistenta la antibiotice similar cu beta lactamazele TEM-1 sau 2 sau SHV-1, dar ele sunt rezistente la amoxicilină + clavulanat. IRT se găsesc în principal la E. coli și Klebsiella pneumoniae. Sunt R (rezistente) la amoxicilină + clavulanat. Diametrul zonei de Amoxicilina + clavulanat <17 mm. Sunt S (în general sensibile) la cefalosporine: cefazolin, cefoxitin, cefotaxim.
Figura 4.1. Klebsiella pneumoniae producătoare de BLSE. Se observă sinergia dintre cefotaxim (CTX), ceftazidim (CAZ) și Amoxicilină+Clavulanat (AMC).
Screeningul BLSE prin CMI
O altă posibilitate de screening pentru ESBL este utilizarea CMI inferioare valorilor prag pentru ceftazidim și aztreonam. Livermore și colab (Livermore, 1996) au arătat că majoritatea producătorilor BLSE au fost rezistente la ceftazidim la 2 µg/ml și aztreonam la 1 µg ml. Zonele corespunzătoare utilizând McFarland 0,5 de inoculare sunt 24 de mm (CAZ și CTR) și 27 mm (AZT). În consecință, Klebsiella spp, E. coli și Salmonella spp. Cu zone <24 mm pentru ceftazidim, cefepim și/sau ceftriaxon și/sau ≤ 27 mm pentru Aztreonam și/sau cefotaxim, ar trebui să fie suspectate de producție BLSE.
Cefpodoxim 10 μg pot fi, de asemenea, utilizat în screeningul BLSE. Zona de inhibiție <17 mm ar trebui să ridice suspiciunea de tulpini cu producție de BLSE (Oliver A, 2002). Recent, CLSI a schimbat valorile prag pentru screening-ul BLSE prin cefpodoxim la ≥ 2 ≥ 8 μg/ml (Oliver, 2002).
Confirmarea producerii de BLSE prin testul dublu disc
Standardul CLSI (CLSI, 2015) recomandă utilizarea ceftazidim în asociere cu acid clavulanic: ceftazidim + clavulanat, ca un test de confirmare fenotipic pentru prezența BLSE. Antibiograma se efectuează folosind Mueller Hinton agar și inocul McFarland de 0,5. Se testează discuri cu ceftazidim + clavulanat, cefepim + clavulanat și ceftazidim/cefepim. O creștere în diametru a zonei de inhibiție de ≥ 5 mm pentru combinația ceftazidim + clavulanat sau cefepim + clavulanatului comparativ cu ceftazidim / singur cefepim este confirmare a prezenței unui ESBL (Figura 4.2).
Steward și colab (Steward, 2001) au arătat că sinergismul între cefepim și clavulanat (cefepim + clavulanat) este foarte util pentru a detecta BLSE la Klebsiella pneumoniae, diferențierea tulpinilor producătoare de BLSE (sinergia între cefepim și clavulanat) de tulpinile care produc AmpC sau hiper-producătoare beta-lactamază. Enterobacter spp., Serratia spp., Morganella morganii, Providencia spp., Citrobacter freundii și Pseudomonas aeruginosa produc beta-lactamază inductibilă AmpC codificată cromozomial. Nivelul de expresie ridicat al AmpC poate interfera cu detecția BLSE.
Cefepim nu este, practic, afectat de AmpC și, în consecință cefepim ar trebui inclus ca agent de screening BLSE pentru testarea Enterobacter spp., Serratia spp. Sinergia între AMC și cefepim va indica producția de BLSE (Thomson, 2001, Steward, 2001, de Gheldre, 2001, Tzelepi, 2,000, Bolmström, 2002). Tulpinile cu zone de cefepim <24 mm ar trebui să fie suspectate de producție BLSE. Schwaben și colab. (Schwaben, 2006) au constatat că sistemul expert avansat al Vitek 2 a identificat fenotipul BLSE în doar 62,5% din tulpinile de Enterobacter spp. și în mod eronat a raportat sensibilitate la cefalosporine în 28%. Discurile cefepim+clavulanat (și cefepim simplu) trebuie utilizate în testele de confirmare pentru BLSE, deoarece acestea sunt eficiente în detectarea BLSE la tulpinile de Klebsiella spp., E. coli etc. care pot produce AmpC sau sunt hiperproducătoare de beta-lactamază (Song Wonkeun, 2005).
Figura 4.2. Test dublu disk pentru Klebsiella pneumoniae producătoare de BLSE
Detectarea producerii de BLSE prin E-test
AB Biodisk (Solna, Suedia) a introdus o bandă față-verso BLSE E-test, care conține fie o combinație de ceftazidim și ceftazidim+acid clavulanic sau cefotaxim și cefotaxim+acid clavulanic. Ambele benzi au un gradient descrescător al ceftazidim sau cefotaxim singur la un capăt și un gradient descrescător al ceftazidim sau cefotaxim, plus acid clavulanic la celălalt capăt. O reducere cu peste 3 log în CMI pentru cefotaxim sau ceftazidim, în prezența acidului clavulanic este considerat un test pozitiv.
E-testul s-a dovedit a fi mai sensibil in detectarea BLSE decât testul dublu-disc în unele studii (Cormican, 1996) și mai puțin sensibil în altele (Vercauteren, 1997).
Figura 4.3. Dublu E-test pentru detectarea producerii de BLSE
Detectarea producerii de beta-lactamază AmpC
Screeningul pentru beta-lactamazele AmpC (cefalosporinaze inductibile) prin metoda difuzimetrică
Testul dublu disc este o metodă satisfăcătoare pentru detecția prezenței cefalosporinazei inductibile, în timpul efectuării antibiogramei de rutină. Discurile de hârtie care conțin un inductor, de exemplu cefoxitin (sau imipenem) și indicatori, cum ar fi piperacilină+tazobactam, cefotaxim sau ceftazidim sunt plasate aprox. la 20-25 mm. O distanță mai mare (30 mm), poate fi de preferat pentru ex Morganella morganii și Providencia spp. După incubarea peste noapte la 35 °C în aer, în prezența unei beta-lactamaze inductibile este indicată de turtirea zonei de inhibiție în jurul medicamentului indicator (piperacilină + tazobactam, cefotaxim/ceftazidim) adiacent inductorului (cefoxitin/imipenem) (Figura 4.4).
Dunne și colab (Dunne WM, 2005) au arătat că asocierea imipenem și piperacilină+tazobactam are cea mai mare sensibilitate (97.1%), urmată de imipenem și ceftazidim (94.2%).
Rezultatul trebuie raportat ca R (rezistent) pentru peniciline (cu excepția temocilinei), combinații de peniciline cu inhibitori, cefalosporine (cu excepția cefpirom și cefepim), cefamicină și monobactami, indiferent de mărimea zonei de inhibiție.
Figura 4.4. Demonstrarea prezei beta-lactamazei inductibile la Enterobacter cloacae. Se remarcă turtirea zonelor de inhibiție a cefotaxim (CFTAX) și ceftazidim (CEZDI) adiacente Cefoxitin (CFOXT) și Imipenem (IMIPM).
Confirmarea producerii de AmpC prin testul discurilor cu combinații
Într-o placă Petri cu mediu Muller-Hinton pe care s-a inoculat tulpina de cercetat se aplică discuri de cefotaxim, cefotaxim+acid boronic, ceftazidim, ceftazidime+acid boronic, cefotaxim+cloxacilină și ceftazidim+cloxacilină.
Interpretare: o zonă de inhibiție pentru cefotaxim+cloxacilină ≥ 5 mm decât cefotaxim simplu și/sau ceftazidime+cloxacilină ≥ 5 mm decât ceftazidim simplu indică prezența AmpC. O zonă de inhibiție pentru cefotaxim+acid boronic ≥5 mm decât cefotaxim simplu și/sau ceftazidim+acid boronic ≥5 mm decât ceftazidim simplu indică prezența AmpC (Figura 4.5).
Figura 4.5. Confirmarea producerii de AmpC de către E. coli prin testul discurilor cu combinații
Confirmarea producerii de AmpC prin testul de sinergie dublu disc
Pe o placă de agar MH se aplică un disc de cefotaxim (CTX) și unul de ceftazidim (CAZ) între care se aplică un disc de acid boronic (BOR), la o distanță de cca. 10 mm (de la o margine la alta). Dacă tulpina este total rezistentă la combinația de cefalosporine, distanța va fi redusă la 5 mm. Într-o altă zonă se aplică alte două discuri de cefotaxim și ceftazidim iar între ele cloxacilin. Pot fi utilizate și combinațiile cu clavulanat în loc de cefotaxim și ceftazidim (Adler, 2009).
Interpretare: Formarea unei zone tip gaură de cheie sau „fantomă” (sinergism) între acidul boronic și oricare dintre discurile de cefotaxim sau ceftazidim indică prezența unei beta-lactamaze AmpC. O zonă tip gaură de cheie sau „fantomă” între cloxacilin și ceftazidim și/sau cefotaxim indică prezența unei beta-lactamaze AmpC.
AmpC plasmidice diferă de cele cromozomiale AmpC prin faptul că sunt inductibile (cu câteva excepții). Tulpinile care produc beta-lactamaze AmpC codificate plasmidic (ACT-1, DHA-1, DHA-2, CFE-1, CMY-13) vor prezenta antagonism (zonă distorsionată) între cefoxitin sau imipenem și cefalosporine de generația a 3-a. Tulpinile de Klebsiella spp., Salmonella spp. și Proteus mirabilis care prezintă sinergism cu acid boronic și/sau cloxacilin posedă prezumptiv beta-lactamaze AmpC mediate plasmidic. Metoda nu poate distinge între beta-lactamazele cromozomiale și plasmidice la E. coli, dar testul este util pentru a selecta tulpini pentru analize ulterioare. AmpC mediate plasmidic sunt adesea multirezistente și pot prezenta colonii împrăștiate lângă marginea zonei de de inhibiție pentru cefalosporine de generația a 3-a și aztreonam.
Detectarea producerii de metalo-beta-lactamaze (MBL)
Detectarea precoce a microorganismelor producătoare de MBL este esențială pentru a preveni diseminarea acestor organisme. Tulpinile producătoare de MBL (în special Enterobacteriaceae) pot prezenta valori mici ale CMI pentru carbapeneme ceea ce face dificil detectarea în laborator pentru a tulpinilor MBL-pozitive.
Tulpinile suspecte MBL (rezistente la ceftazidim, fără sinergie între clavulanat și a cefalosporine de generația a 3-a, cu sensibilitate redusă la carbapeneme) trebui testate cu ajutorul testelor cu acid dipicolinic, imipenem, meropenem și EDTA.
Unele profiluri de rezistență pot sugera producția de MBL, de exemplu:
a) Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas. spp. și Acinetobacter spp.
Toate tulpinile non-sensibile la carbapeneme și rezistente la ticarcilină, ticarcilină+clavulanat sau ceftazidim trebuie testate pentru producerea de MBL.
b) Enterobacteriaceae
Pentru E. coli, Klebsiella spp., Proteus mirabilis, Salmonella spp. și Shigella spp. Toate tulpinile sensibile, intermediare sau rezistente la carbapeneme care sunt rezistente la cefoxitin și amoxicilină+clavulanat și sunt non-sensibile la ceftazidim (zona de inhibiție <18 mm) trebuie să fie testate pentru producerea de MBL (Gornaglia, 2007).
Modul de lucru pentru Enterobacteriaceae. Se aplică un disc cu acid dipicolinic (DPA) pe o placă de geloză Mueller Hinton (MH) inoculată. Se aplică un disc de meropenem și un disc de ertapenem de fiecare parte a DPA, la 5 mm de marginea acestuia. Pe o placă de geloză Muller-Hinton inoculată se aplică un disc de imipenem 10 µg + EDTA (IM10E) și un disc de imipenem de 10 µg.
Modul de lucru pentru non-fermentativi. Se aplică un disc cu acid dipicolinic (DPA) pe o placă de geloză Mueller Hinton (MH) inoculată. Se aplică un disc de meropenem și un disc de imipenem de fiecare parte a DPA, la 5 mm de marginea acestuia. Pe o placă de geloză Muller-Hinton inoculată se aplică un disc de imipenem 10 µg + EDTA (IM10E) și un disc de imipenem de 10 µg (Figura 4.6).
Interpretare:
• Prezența unei zone în gaură de cheie (zonă „fantomă”) între una sau ambele carbapeneme și acidul dipicolinic indică prezența unei MBL.
• O zonă de inhibiție pentru imipenem+EDTA (10µg+750 µg) >7 mm decât pentru imipenem de 10 µg indică prezența unei metalo-beta-lactamaze.
Figura 4.6. Detectarea MBL prin testul de sinergie dublu disc
Testul Carba NP
Test biochimic în format de plăcuță cu godeuri bazat pe hidroliza carbapenemului in vitro.
Direct din colonii (sau antibiogramă difuzimetrica), produs patologic (hemocultură)
Sensibilitate și specificitate 100%
Diferențiază tulpinile producătoare de carbapenemaze de tulpinile rezistente prin alt mecanism
Poate fi utilizat pentru atribuirea carbapenemazei uneia din cele 3 clase de beta-lactamaze (serin-, metalo- sau OXA). Înainte de a putea fi recomandat ca metodă de diagnostic acest test necesită validare prin determinarea sensibilității pentru fiecare tip de carbapenemază și a specificității în cazul tulpinilor producătoare de cantități mari de AmpC.
Testul are limite la tulpinile cu carbapenemaze OXA-48.
Desfășurarea testului:
Solutie imipenem, roșu fenol și ZnSO4
30 μl suspensie bacteriana enzimatică +100 μl sol imipenem + roșu fenol
Incubare la 370C max. 2h
Rezultat în 2 ore – o reacție de culoare (indicatorul de pH roșu fenol se schimbă în galben în cazul în care carbapenemul a fost hidrolizat)
Figura 4.7. Interpretare test Carba NP
Teste moleculare
MALDI TOF (" Matrix Assited Laser Desorbtion Ionisation"= ionizarea prin desorbție laser asistată de o matrice) este tot mai frecvent disponibil în laboratoarele de diagnostic și detectează producerea de carbapenemaze prin detectarea modificărilor de masă care urmează hidrolizei moleculei de carbapenem. Testarea se realizează în mai puțin de 4 ore. La fel ca în cazul testului carbaNP, necesită validare înainte de a putea fi recomandat ca metodă de diagnostic.
Metode de confirmare genetică a producerii de carbapenemaze:
– numeroase teste PCR sau RT-PCR, utilizând formatul simplu sau multiplex. Sunt detectate gene precum blaCTX-M, blaTEM, blaSHV.
– electroforeza in camp pulsator (pulsed field gel electrophoresis = PFGE) a fragmentelor de ADN genomic obținute cu enzima de restricție XbaI. Se demonstrează clonalitatea și înrudirea epidemiologică a tulpinilor din focar.
Figura 4.8. Citire PFGE: 2-5, 7-10- tulpini K.pneumoniae
Metodele au la bază tehnicile de biologie moleculară prin mai multe tehnici și în final hibridizarea moleculară pentru a studia diferite mutații care pot da informații cu privire la sensibilitatea/rezistența tulpinilor studiate. Una dintre tehnici este INNO-LIPA Rif. TB (LIPA= Line Probe Assay). Metoda permite concomitent identificarea M.tuberculosis, precum și testarea sensibilității la Rifampicină, după o amplificare genetică a unui ADN provenit fie din culturi mycobacteriene, fie de produse clinice. Principiul INNO-LIPA este hibridizarea ADN-unui rezultat dintr-o amplificare prin PCR cu sonde nucleotidice specifice, imobilizate sub forma de linii (benzi) paralele, pe fâsii de nitroceluloza. Sondele nucleotidice sunt cuplate cu biotină, după hibridizare se adaugă streptavidină conjugată cu fosfatază alcalină, acest conjugat atașându-se pe produșii de hibridizare rezultați anterior. Incubarea în prezența unui cromogen conduce, în cazul existenței hibridizării, la aparitia unor benzi colorate. În cazul testării rezistenței la rifampicină se urmarește aparitia unei/unor mutații, la nivelul genei care codifică pentru subunitatea β a ARN polimerazei (gena rpoB).
Deoarece trăsăturile de rezistență la antibiotice sunt codificate genetic, putem testa uneori pentru genele specifice care conferă rezistență la antibiotice. Cu toate acestea, deși sistemele de detecție pe bază de acid nucleic sunt în general rapide și sensibile, este important de reținut faptul că prezența unei gene de rezistență nu este echivalentă neapărat cu eșecul tratamentului, deoarece rezistența clinică depinde, de asemenea de modul și nivelul de exprimare al acestor gene. Cei mai utilizați markeri genetici sunt spa (Engelthalter, 2013) (Staphylococcal Protein A gene), mecA (Aleixandre-Gorriz, 2014), mecC (Gomez, 2015), SCCmec cassette for S. aureus (Apfalter, 2003), vanA for Enterococcus (Kang, 2014).
Reacția de polimerizare în lanț (PCR) este una din tehnicile moleculare cele mai frecvent utilizate pentru detectarea anumitor secvențe de ADN de interes. Aceasta implică mai multe cicluri de denaturare a ADN-ului probei, hibridarea cu primeri specifici pentru secvența țintă (dacă este prezentă), și extinderea acestei secvențe facilitată de o polimerază termostabilă care duce la replicarea unei secvențe de ADN, într-o manieră exponențială, până la un punct care va fi detectabilă prin electroforeză pe gel cu ajutorul unei substanțe chimice intercalată în ADN care prezintă fluorescență în lumină UV.
Hibridizarea ADN. Aceasta se bazează pe faptul că pirimidinele ADN (citozină și timidină) se asociază în mod specific cu purinelor (guanină și adenină, sau uracil pentru ARN). De aceea, o sondă marcată cu o secvență specifică cunoscută se poate asocia cu secvența complementară din ADN denaturat din proba de testat. Dacă apare această "hibridizare", sonda va marca ADN-ul cu un marker radioactiv, substrat antigenic, enzimă sau compus chemiluminescent. Dacă secvența țintă nu este prezentă (izolatul nu are gena specifică de interes), sonda nu se atașează și nici un semnal va fi detectat.
Modificările PCR și hibridizării ADN. Au fost introduse o serie de modificări care îmbunătățesc și mai mult sensibilitatea și specificitatea acestor proceduri standard. Exemple de astfel de dezvoltări au fost utilizarea de 5'-fluorescență marcat oligonucleotide marcate 5’ cu compuși fluorescenți, dezvoltarea de balize moleculare, dezvoltarea de matrice ADN și cipuri ADN.
II. CERCETĂRI PERSONALE
Introducere
Importanța temei
Infecțiile nosocomiale cu Enterobacteriacae generatoare de carbapenemaze au înregistrat o creștere constantă a incidenței globale în ultimul deceniu, iar aceste enzime se găsesc cel mai des la tulpinile de Klebsiella pneumoniae. Au fost înregistrate focare de infecție cu tulpini de Klebsiella pneumoniae producătoare de KPC în multe țări de pe glob, dar este de subliniat faptul că au devenit endemice în Statele Unite, Grecia, Israel și China. Carbapenemele au fost utilizate până recent pentru tratarea cu succes a infecțiilor cu enterobacterii, inclusiv a celor producătoare de beta-lactamaze cu spectru extins (BLSE). Dar carbapenemazele conferă multirezistență la antibioticele cu spectru larg, în consecință majoritatea enterobacteriilor producătoare de carbapenemaze sunt rezistente la carbapeneme.
Din momentul în care primul caz de infecție cu o tulpină de Klebsiella Pneumoniae carbapenem-rezistentă (KP-CR) a fost consemnat în 1996, incidența infecțiilor prin acest agent patogen a crescut dramatic, precum și rata mortalității. În Statele Unite, informațiile furnizate de CDC evidențiază o creștere semnificativă a ratei infecțiilor cu KP-CR de la <1% în 2000 la 8% in 2007. În Europa, baza de date EARS-Net informează că în decursul anului 2010, rata infecțiilor cu CR-KP varia de la 0.2% (Germania) la 59.5% (Grecia), fiind observate proporții crescute în țările sud-europene.
Motivația alegerii temei
Scopul acestei lucrări este de a studia spectrul etiologic al infecțiilor de tract respirator inferior la pacienții spitalizați în unitatea de Terapie Intensivă a SCJU Craiova și de a determina profilul de rezistență la antibiotice a tulpinilor izolate, folosindu-se în special carbapeneme în această secție, pe o perioadă îndelungată de timp. Un alt obiectiv a fost detectarea fenotipurilor de rezistență la carbapeneme a tulpinilor de Klebsiella în scopul ajustării terapiei și prevenției transmiterii nosocomiale a acestora.
Material și Metode
S-au luat in studiu un număr de 1007 de secreții traheobronșice provenite de la 730 de pacienți (460 bărbați și 270 femei) spitalizați în clinica de Terapie Intensivă a Spitalului Clinic Județean de Urgență Craiova, în perioada 01.01.2015-31.12.2016. Produsele au fost colectate conform protocolului de monitorizare a colonizării traheobronșice specific secției de Terapie Intensivă: 1 produs la intrarea în secție și ulterior la fiecare 7 zile. Produsele au fost inoculate pe o varietate de medii. S-au folosit medii de cultură complexe (aerobe, anaerobe, cu C02 5%) precum: geloză-sânge, geloză-șocolat și medii pentru identificarea biochimică. Tulpinile au fost identificate prezumtiv pe baza caracterelor de cultură și biochimice clasice, iar confirmarea s-a efectuat utilizând analizorul automat VITEK 2 – Biomerieux. Mecanismele de rezistență au fost investigate folosind teste de screening (medii cromogene ChromID Carba – Biomerieux, testul Hodge) și teste de confirmare: testele dublu disc pentru carbapenemaze (KPC+MBL+OXA-48 Confirm ID kit – ROSCO Diagnostica).
Metode de detectare ale carbapenemazelor la bacteriile gram-negative
Screening-ul Enterobacteriaceae producătoare de carbapenemaze (EPC) se realizează prin antibiograma difuzimetrică și/sau determinarea CMI-ului carbapenemelor față de agentul patogen (interpretate conform testelor EUCAST sau CLSI). Ertapenemul estre cel mai bine hidrolizat în caz de producere de carbapenemază, dar sensibilitatea față de acest antibiotic este diminuată și prin alte mecanisme de rezistență (producerea de BLSE sau AmpC asociat cu pierderea porinelor). Imipenemul este un predictor slab al producerii de carbapenemază.
Tabelul 2.1. EUCAST: valorile-prag ale CMI și ale diametrelor standard pentru determinarea sensibilității clinice și demonstrarea producerii de carbapenemază
* la tulpinile producătoare de OXA48 au fost descrise diametre de până la 27mm
Tabelul 2.2. CLSI 2015: valorile-prag ale CMI și ale diametrelor standard prin metoda microodiluțiilor; testarea producerii de carbapenemază se recomandă în cazul în care la unul din carbapeneme rezultatul testării este în categoria non-susceptibil (intermediar sau rezistent)
Enterobactriaceae – suspiciunea de producere de carbapenemază:
Intermediar sau rezistent la o carbapenemă
Cel mai bun indicator- ertapenemul
Rezistența la una sau mai multe cefalosporine generația a III-a (Ceftazidim, Cefoperazonă, Cefotaxim, Ceftizoxim, Ceftriaxon)
Medii cromogene
În ultimii ani provocările ridicate de infecțiile de spital au condus la apariția a numeroase medii cromogene pentru detecția rapidă a tulpinilor cu multirezistență, în scopul instituirii cât mai precoce a precauțiilor de contact care să prevină răspândirea acestora, cât și a modificării tratamentului antimicrobian în sensul schimbării carbapenemelor cu alte antibiotice la care tulpina izolată are sensibilitate cunoscută, până la realizarea testării la antibiotice.
CHROMagar KPC
Mediul conține meropenem + substanțe cromogene.
Dezavantaje:
Concentrațiile crescute de meropenem nu permit detectarea tulpinilor care hidrolizează slab carbapenemele, cum ar fi cele producătoare de OXA-48.
Mediul necesită rehidratare și turnare în plăci.
Performanțele sunt mai scăzute față de alte medii: sensibilitate 43%, specificitate: 68% [34].
Figura 2.1. Mediul CROMagar KPC. E. coli – colonii roz-roșii, Klebsiella, Enterobacter, Citrobacter – colonii albastru-metalic
Briliance CRE Agar (Oxoid)
Mediul are pe ansamblu performanțe bune: sensibilitate 94%, specificitate 71%. Sensibilitatea variază în funcție de tipul de carbapenemază: 100% pentru KPC, NDM, GIM, 90% pentru VIM, 84% pentru OXA-48. Specificitatea este scăzută datorită supraexpresiei AMPc și ESBL.
Figura 2.2. Mediul Briliance CRE agar KPC. E. coli – colonii roz-pal, Klebsiella, Enterobacter, Citrobacter – colonii albastre
ChromID® CARBA agar (bioMérieux) si ChromID®OXA 48
Mediu cromogen (Agar selectiv cu Antibiotice) – screening enterobacterii producatoare carbapenemază in 18-24 ore
Sensibilitate mare 97.4% și Specificitate mare 99.7%
Produse patologice: hemoculturi, LCR, lavaj bronho-alveolar, culturi infecții perinatale, spută, uroculturi, tampoane rectale, coproculturi etc.
Figura 2.3. Mediul ChromID Carba. K. pneumoniae OXA-48 (colonii verzi), E. coli KPC (colonii roșii)
SUPERCARBA (Biomerieux)
Mediul conține ertapenem+cloxacilin+zinc.
Mediul folosește concentrații scăzute de carbapeneme pentru a detecta tulpinile producătoare de OXA-48.
Cloxacilinul inhibă creșterea tulpinilor care supraexprimă AMPc.
Zincul este folosit pentru detectarea tulpinilor producătoare de metalobetalactamaze (NDM).
În comparație cu alte medii cromogene are sensibilitate crescută (96,5%) și specificitate moderată (61%).
Figura 2.4. Mediul SUPERCARBA (Biomerieux)
Tabelul 2.3. Performanțele comparative ale unor medii cromogene utilizate pentru detectarea tulpinilor bacteriene producătoare de carbapenemaze
Testul Hodge modificat
Testul Hodge modificat arată capacitatea unei tulpini de a hidroliza carbapenemele, fapt observat prin apariția unei indentații în zona de inhibiție a creșterii bacteriene a tulpinii cu care mediul (agar Mueller Hinton) se însămânțează inițial.
Sensibilitatea maximă este obținută pentru enterobacterii producatoare de carbapenemaze clasa A Ambler (KPC) si clasa D (OXA-48), însă testul rămâne subiectiv.
Sensibilitate este scazuta pentru NDM-1 (50%) .
Specificitate este redusă în special la tulpinile producătoare de AmpC care dau rezultate slab pozitive.
Desfășurarea testului:
Inocularea mediului
Metoda standard difuzimetrica
Uscarea 3-10 minute
Depunerea unui disc de ertapenem 10μg / meropenem 10μg
Inocularea cu ansa perpendicular pe disc -2-2,5 cm:
tulpina de studiat
tulpini martor negativ ( Ex. Klebsiella pneumoniae ATCC BAA-1706), martor pozitiv (Ex. Klebsiella pneumoniae ATCC BAA-1705)
Incubare 35±20C atmosfera obisnuita
Citire 16-20h
Figura 2.5. Interpretare test Hodge
Metode de confirmare fenotipică a producerii de carbapenemază
Studiul sinergiei carbapenemelor cu diverse substanțe:
a) sinergia carbapenem-acid boronic identifică carbapenemazele serinice tip KPC, însă testele pot fi pozitive și în cazul producerii de beta-lactamaze tip AmpC. Diferențierea între acestea se face prin faptul că β-lactamazele tip AmpC pot fi inhibate de cloxacilină, dar nu și cele KPC.
Placa inoculată Mueller Hinton agar (McFarland 0.5) și
Discuri:
Interpretare:
Meropenem+Acid boronic: Zona inhibiție ≥ 5 mm decât Meropenem și Meropenem+ Cloxacillină indică prezența KPC (sau alta din clasa A)
Meropenem+Acid boronic și Meropenem+Cloxacilină: Zona inhibiție ≥ 5 mm decât Meropenem indică hiperproducția AmpC + pierderea porinei sau eflux
Meropenem+Acid dipicolinic: Zona inhibiție ≥ 5 mm decât Meropenem indică prezența unei metalo-β-lactamaze (MBL)
Absența sinergiei cu temocilina și cu celelalte substanțe descrise anterior caracterizează carbapenemazele de tip OXA-48; dacă este utilizat discul cu temocilină (disponibil în anumite seturi de testare), se constată o lipsa a zonei de inhibiție a creșterii bacteriene în jurul acestuia.
Tabelul 2.4. Sinergia/lipsa sinergiei carbapenemelor cu diverse substanțe
În concluzie, se suspectează Enterobacterii proucătoare de carbapenemază dacă Ertapenem zonă ≤ 22 mm și/sau meropenem zonă < 23 mm:
MBL în caz de
Rezistență la ceftazidim;
Lipsa sinergiei cefalosporine/clavulanat;
Sensibilitate redusă la carbapeneme.
KPC în caz de
Test metalo-β-lactamaze negativ;
Sinergie între acidul boronic și carbapeneme;
Lipsa sinergiei între cloxacilină si carbapeneme.
OXA în caz de
Test metalo-β-lactamaze negativ;
Lipsa sinergiei între acidul boronic/cloxacilină și carbapeneme (una sau ambele);
Test sinergie negativ (sau slab pozitiv) între clavulanat și carbapeneme (una sau ambele);
Test Hodge modificat pozitiv.
b) sinergia carbapenemelor cu EDTA indică prezența metalo-beta-lactamazelor.
Figura 2.7. E-test MBL: în dreapta avem diluții ale Imipenemului (IP) de la 4 la 256 μg/ml, iar în stanga Imipenem+ EDTA (IPI). O scădere a CMI Imipenem ≥3 diluții în prezența EDTA = test pozitiv
Rezultate și discuții
S-au izolat specii bacteriene din cele 1007 secreții traheobronșice recoltate; 571 (56,70%) au fost pozitive, fiind identificate 985 tulpini bacteriene, de la același pacient izolându-se frecvent mai multe tulpini bacteriene. Astfel: s-au izolat 252 tulpini (25,58%) Klebsiella spp., 182 (18.48%) au fost bacili Acinetobacter spp., Pseudomonas spp., Stenotrophomonas maltophilia, Burkholderia cepacia, stafilococi coagulazo-negativi și 113 tulpini (11,47%) au aparținut speciei Staphylococcus aureus.
Figura 3.1. Incidența infecțiilor bacteriene de tract respirator inferior în secția de ATI
Tabelul 3.1. Speciile bacteriene izolate din secrețiile traheobronșice analizate
Figura 3.2. Speciile bacteriene izolate din secrețiile traheobronșice analizate
Rezistența la antibiotice a tulpinilor de Klebsiella
Din punct de vedere al rezistentei la antibiotice s-a folosit o gama largă de substanțe antimicrobiene având în vedere necesitatea tratamentului rapid și incidenței crescute a tulpinilor multirezistente în unitatea de Terapie Intensivă. De remarcat că în general tulpinile de Klebsiella carbapenem-rezistente au avut rezistențe multiple la antibiotice, care au fost cuantificate prin calcularea indexului de rezistență (număr antibiotice rezistente / număr de antibiotice testate). Astfel la tulpinile carbapenem-sensibile indexul de rezistență a fost în medie 35%, pe când la cele carba-rezistente acesta a fost de 74% (Figura 3.3).
Figura 3.3. Diferențele între distribuția indexului de rezistență al tulpinilor de Klebsiella carbapenem-sensibile comparativ cu cele carbapenem-rezistente
Rezistențele la carbapeneme au fost ridicate, înregistrându-se un procent de 66,91% la meropenem, 58,33% la imipenem și 58,00% la ertapenem (Figura 3.4). De remarcat că 29 tulpini de Klebsiella (11,50%) au fost rezistente la toate cele 3 carbapeneme (imipenem, ertapenem și meropenem).
Figura 3.4. Rezistența la Carbapeneme a tulpinilor de Klebsiella izolate
Testele fenotipice de detectare a carbapenemazelor au fost pozitive pentru 214 din cele 252 tulpini (84,92%) (Figura 3.5, Tabelul 3.2).
Figura 3.5. Reprezentarea grafică a proporției tulpinilor secretante de carbapenemaze
Tabelul 3.2. Fenotipuri secretante de carbapenemaze
Din totalul de 214 tulpini carbapenemaze pozitive, fenotipul KPC (clasa A) a fost întâlnit la 80 tulpini (31,75%) (Figura 3.6).
Figura 3.6. Reprezentarea grafică a proporției tulpinilor secretante de carbapenemaze KPC
Fenotipul secretor de metalo-beta-lactamaze (cea mai cunoscută fiind NDM-1) a fost detectat la 64 tulpini (25,40%) (Figura 3.7).
Figura 3.7. Reprezentarea grafică a proporției tulpinilor secretante de carbapenemaze MBL
Fenotipul secretor de cefalosporinaze AmpC (care în cantități mari pot hidroliza carbapenemele) a fost detectat la 24 tulpini (9,52%) (Figura 3.8).
Figura 3.8. Procent tulpini secretante de carbapenemaze AmpC
În final, 99 tulpini (39,29%) au fost pozitive la testul cu temocilină care sugerează prezența carbapenemazelor tip OXA-48. Acest procent ridicat nu este surprinzător, studii anterioare arătând prevalența ridicată a tulpinilor de Klebsiella pneumoniae secretante de carbapenemază OXA-48 în SCJU Craiova [37].
Figura 3.9. Procent tulpini secretante de carbapenemaze OXA-48 like
Rezistența la antibiotice a tulpinilor de Klebsiella izolate din secția de Terapie Intensivă a SCJU Craiova a fost în general ridicată la aproape toate clasele de antibiotice (Figura 3.10). Aceasta se explică prin prezența tulpinilor de spital multirezistente și prin transferul orizontal de gene de rezistență.
Figura 3.10. Rezistența la antibiotice a tulpinilor de Klebsiella spp. izolate
Rezistența la cefalosporine a tulpinilor de Klebsiella a fost extrem de ridicată, datorită producerii de beta-lactamaze cu spectru extins și a cefalosporinelor. Se observă că cea mai scăzută rezistență s-a întâlnit la cefalosporinele de generația a IV-a (cefepim – 70,59%) și a III-a (ceftriaxon – 60,8%). De remarcat că rezistența la cefalosporinele de generația I a fost extrem de crescută – 92,86% la cefazolin. De asemenea se remarcă rezistența relativ scăzută la aztreonam (74,31%), explicată prin incapacitatea unor carbapenemaze de a hidroliza acest compus.
Figura 3.11. Rezistența la peniciline și cefalosporine a tulpinilor de Klebsiella spp. izolate
Tulpinile de Klebsiella izolate au prezentat rezistențe moderate la aminoglicozide, care rămân o alternativă terapeutică viabilă în infecțiile cu tulpini secretante de carbapenemaze. Cea mai scăzută rezistență s-a înregistrat la amikacină (20,32%), urmată de tobramicină (39,00%) și gentamicină (45,38%) (Figura 3.12).
Figura 3.12. Rezistența la aminoglicozide a tulpinilor de Klebsiella spp. izolate
Rezistența la chinolone a tulpinilor izolate a fost relativ crescută (Figura 3.13). Rezistența la ciprofloxacin (63,27%) a fost similară cu cea la norfloxacin (66,67%), pe când rezistența la moxifloxacin a fost ceva mai scăzută (58,74%).
Figura 3.13. Rezistența la chinolone a tulpinilor de Klebsiella spp. izolate
Concluzii
Tulpinile de Klebsiella secretante de carbapenemaze au prezentat o incidență crescută în secția de Terapie Intensivă a SCJU Craiova.
Dintre acestea, a predominat fenotipul secretant de carbapenemaze OXA-48, urmat de fenotipul KPC și MBL.
Au existat fenotipuri de rezistență prin dublu mecanism: AmpC + KPC, OXA+KPC, MBL+KPC si OXA+MBL.
De menționat că toate aceste tulpini secretante de carbapenemaze au prezentat și fenotipuri de rezistență la celelalte clase de antibiotice: cefalosporine, aminoglicozide, chinolone. Rezistența tulpinilor secretante de carbapenemaze la alte antibiotice a fost semnificativ mai crescută față de tulpinile nesecretante.
Cunoasterea fenotipurilor de rezistenta are importanță pentru orientarea tratamentului, urmarirea epidemiologică a circulației tulpinilor de spital asociate îngrijirilor medicale și elaborarea de protocoale personalizate privind limitarea răspândirii acestora în unitățile sanitare.
Bibliografie
[1] E. Smith Moland, “Plasmid-mediated, carbapenem-hydrolysing beta-lactamase, KPC-2, in Klebsiella pneumoniae isolates,” J. Antimicrob. Chemother., vol. 51, no. 3, pp. 711–714, 2003.
[2] S. Bratu et al., “Emergence of KPC-possessing Klebsiella pneumoniae in Brooklyn, New York: epidemiology and recommendations for detection.,” Antimicrob. Agents Chemother., vol. 49, no. 7, pp. 3018–20, 2005.
[3] C. Urban et al., “Carbapenem-resistant Escherichia coli harboring Klebsiella pneumoniae carbapenemase beta-lactamases associated with long-term care facilities.,” Clin. Infect. Dis., vol. 46, pp. e127–e130, 2008.
[4] L. Poirel, A. Potron, and P. Nordmann, “OXA-48-like carbapenemases: The phantom menace,” J. Antimicrob. Chemother., vol. 67, no. 7, pp. 1597–1606, 2012.
[5] P. G. Higgins, F. J. Pérez-Llarena, E. Zander, A. Fernández, G. Bou, and H. Seifert, “OXA-235, a novel class D β-lactamase involved in resistance to carbapenems in Acinetobacter baumannii,” Antimicrob. Agents Chemother., vol. 57, no. 5, pp. 2121–2126, 2013.
[6] A. Carrër et al., “Spread of OXA-48-encoding plasmid in Turkey and beyond,” Antimicrob. Agents Chemother., vol. 54, no. 3, pp. 1369–1373, 2010.
[7] H. S. Sader, M. Castanheira, R. E. Mendes, M. Toleman, T. R. Walsh, and R. N. Jones, “Dissemination and diversity of metallo-beta-lactamases in Latin America: report from the SENTRY Antimicrobial Surveillance Program.,” Int. J. Antimicrob. Agents, vol. 25, no. 1, pp. 57–61, 2005.
[8] V. C. Moreira and D. Freire, “Klebsiella pneumoniae e sua resistência a antibióticos Abstract um número expressivo de antimicrobianos . As expressões de resistências em bactérias podem,” MOREIRA, V. C. et. al. Kleb. pneumoniae e sua Resist. a antibióticos. Disponível em <http//www.cpgls.ucg.br/6mostra/artigos/SAUDE/VANESSA%20CARVALHO%20M OREIRA.pdf> . Acesso em 08 agosto 2016., 2012.
[9] M. F. Lartigue, L. Poirel, C. Poyart, H. Réglier-Poupet, and P. Nordmann, “Ertapenem resistance of Escherichia coli.,” Emerg. Infect. Dis., vol. 13, no. 2, pp. 315–317, 2007.
[10] A. Y. Peleg, C. Franklin, J. Bell, and D. W. Spelman, “Emergence of IMP-4 metallo-beta-lactamase in a clinical isolate from Australia.,” J. Antimicrob. Chemother., vol. 54, no. 3, pp. 699–700, 2004.
[11] A. F. Sheikh et al., “Detection of metallo-beta lactamases among carbapenem-resistant pseudomonas aeruginosa,” Jundishapur J. Microbiol., vol. 7, no. 11, 2014.
[12] G. J. Lewis, X. Fang, M. Gooch, and P. P. Cook, “Decreased Resistance of Pseudomonas aeruginosa with Restriction of Ciprofloxacin in a Large Teaching Hospital’s Intensive Care and Intermediate Care Units,” Infect. Control Hosp. Epidemiol., vol. 33, no. 4, pp. 368–373, 2012.
[13] I. Morrissey, M. Hackel, R. Badal, S. Bouchillon, S. Hawser, and D. Biedenbach, “A review of ten years of the Study for Monitoring Antimicrobial Resistance Trends (SMART) from 2002 to 2011,” Pharmaceuticals, vol. 6, no. 11. pp. 1335–1346, 2013.
[14] G. L. Drusano, “Antimicrobial pharmacodynamics: critical interactions of ‘bug and drug,’” Nat. Rev. Microbiol., vol. 2, no. 4, pp. 289–300, 2004.
[15] J. A. Roberts, C. M. J. Kirkpatrick, M. S. Roberts, T. A. Robertson, A. J. Dalley, and J. Lipman, “Meropenem dosing in critically ill patients with sepsis and without renal dysfunction: Intermittent bolus versus continuous administration? Monte Carlo dosing simulations and subcutaneous tissue distribution,” J. Antimicrob. Chemother., vol. 64, no. 1, pp. 142–150, 2009.
[16] Z. A. Qureshi et al., “Treatment outcome of bacteremia due to KPC-producing Klebsiella pneumoniae: Superiority of combination antimicrobial regimens,” Antimicrob. Agents Chemother., vol. 56, no. 4, pp. 2108–2113, 2012.
[17] G. L. Daikos and A. Markogiannakis, “Carbapenemase-producing Klebsiella pneumoniae: (When) might we still consider treating with carbapenems?,” Clinical Microbiology and Infection, vol. 17, no. 8. pp. 1135–1141, 2011.
[18] D. S. Akajagbor, S. L. Wilson, K. D. Shere-Wolfe, P. Dakum, M. E. Charurat, and B. L. Gilliam, “Higher incidence of acute kidney injury with intravenous colistimethate sodium compared with polymyxin B in critically ill patients at a tertiary care medical center.,” Clin. Infect. Dis., vol. 57, no. 9, pp. 1300–3, 2013.
[19] H. S. Sader, D. J. Farrell, and R. N. Jones, “Susceptibility of Klebsiella spp. to colistin and polymyxin B: Results from the SENTRY Antimicrobial Surveillance Program (2006-2009),” International Journal of Antimicrobial Agents, vol. 37, no. 2. pp. 174–175, 2011.
[20] A. Antoniadou et al., “Colistin-resistant isolates of Klebsiella pneumoniae emerging in intensive care unit patients: First report of a multiclonal cluster,” J. Antimicrob. Chemother., vol. 59, no. 4, pp. 786–790, 2007.
[21] D. Marchaim et al., “Outbreak of colistin-resistant, carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae in Metropolitan Detroit, Michigan,” Antimicrob. Agents Chemother., vol. 55, no. 2, pp. 593–599, 2011.
[22] E. B. Hirsch and V. H. Tam, “Detection and treatment options for Klebsiella pneumoniae carbapenemases (KPCs): An emerging cause of multidrug-resistant infection,” J. Antimicrob. Chemother., vol. 65, no. 6, pp. 1119–1125, 2010.
[23] I. I. Balkan et al., “Blood stream infections due to OXA-48-like carbapenemase-producing Enterobacteriaceae: Treatment and survival,” Int. J. Infect. Dis., vol. 26, pp. e51–e56, 2014.
[24] T. Kelesidis, D. E. Karageorgopoulos, I. Kelesidis, and M. E. Falagas, “Tigecycline for the treatment of multidrug-resistant Enterobacteriaceae: A systematic review of the evidence from microbiological and clinical studies,” Journal of Antimicrobial Chemotherapy, vol. 62, no. 5. pp. 895–904, 2008.
[25] M. Nguyen et al., “Carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae bacteremia: Factors correlated with clinical and microbiologic outcomes,” Diagn. Microbiol. Infect. Dis., vol. 67, no. 2, pp. 180–184, 2010.
[26] B. A. Cunha, “Pharmacokinetic considerations regarding tigecycline for multidrug-resistant (MDR) Klebsiella pneumoniae or MDR Acinetobacter baumannii urosepsis,” Journal of Clinical Microbiology, vol. 47, no. 5. p. 1613, 2009.
[27] M. J. Satlin et al., “Comparative effectiveness of aminoglycosides, polymyxin B, and tigecycline for clearance of carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae from urine,” Antimicrob. Agents Chemother., vol. 55, no. 12, pp. 5893–5899, 2011.
[28] L. S. Tzouvelekis, A. Markogiannakis, E. Piperaki, M. Souli, and G. L. Daikos, “Treating infections caused by carbapenemase-producing Enterobacteriaceae,” Clinical Microbiology and Infection, vol. 20, no. 9. pp. 862–872, 2014.
[29] B. Kitchel, D. R. Sundin, and J. B. Patel, “Regional dissemination of KPC-producing Klebsiella pneumoniae,” Antimicrob. Agents Chemother., vol. 53, no. 10, pp. 4511–4513, 2009.
[30] G. Peirano, J. Ahmed-Bentley, N. Woodford, and J. D. Pitout, “New Delhi metallo-beta-lactamase from traveler returning to Canada,” Emerg. Infect. Dis., vol. 17, pp. 242–244, 2011.
[31] M. Souli et al., “In vitro interactions of antimicrobial combinations with fosfomycin against KPC-2-producing Klebsiella pneumoniae and protection of resistance development,” Antimicrob. Agents Chemother., vol. 55, no. 5, pp. 2395–2397, 2011.
[32] L. F. Chen and D. Kaye, “Current Use for Old Antibacterial Agents: Polymyxins, Rifamycins, and Aminoglycosides,” Medical Clinics of North America, vol. 95, no. 4. pp. 819–842, 2011.
[33] J. A. Korvick et al., “Prospective observational study of Klebsiella bacteremia in 230 patients: Outcome for antibiotic combinations versus monotherapy,” Antimicrob. Agents Chemother., vol. 36, no. 12, pp. 2639–2644, 1992.
[34] D. Girlich, L. Poirel, and P. Nordmann, “Comparison of the SUPERCARBA, CHROMagar KPC, and Brilliance CRE screening media for detection of Enterobacteriaceae with reduced susceptibility to carbapenems,” Diagn. Microbiol. Infect. Dis., vol. 75, no. 2, pp. 214–217, 2013.
[35] Chandorkar G, Huntington JA, Gotfried MH, Rodvold KA, Umeh O. Intrapulmonary penetration of ceftolozane/tazobactam and piperacillin/tazobactam in healthy adult subjects. J. Antimicrob. Chemother.67(10), 2463–2469(2012).
[36] Bush K. Improving known classes of antibiotics: an optimistic approach for the future. Curr. Opin. Pharmacol.12(5), 527–534(2012).
[37] M. Balasoiu et al., “Studiu comparativ privind rezistența la antibiotice a tulpinilor de Klebsiella izolate din secțiile de Terapie Intensivă,” The National Conference of Infectious Diseases – CNBICV15. Craiova, Romania, 2015.
Copyright Notice
© Licențiada.org respectă drepturile de proprietate intelectuală și așteaptă ca toți utilizatorii să facă același lucru. Dacă consideri că un conținut de pe site încalcă drepturile tale de autor, te rugăm să trimiți o notificare DMCA.
Acest articol: Rezistența la carbapeneme a tulpinilor de Klebsiella pneumoniae izolate din secrețiile traheobronșice [310199] (ID: 310199)
Dacă considerați că acest conținut vă încalcă drepturile de autor, vă rugăm să depuneți o cerere pe pagina noastră Copyright Takedown.