Rezistența la antibiotice a unor bacterii izolate din mediul clinic și natural în Sudul României [622869]

Rezistența la antibiotice a unor bacterii izolate din mediul clinic și natural în Sudul României

Abrevieri
ADN – acid deoxiribonucleic. Nucleotida este unitatea de bază a ADN-ului și este compusă prin
policondensarea unui glucid, baze azotate heterociclice și unui rest de acid fosforic
ARN – acid ribonucleic. Este un polinucleotid format prin copolimerizarea ribonucleotidelor. Un
ribonucleotid este format dintr-o bază azotată, o pentoză și o grupare fosfat
ARNr – este un constituent principal al ribozomilor (organite celulare la nivelul cărora se realizează
sinteza proteinelor). Prin transcripție sunt sintetizați precursori de talie mare ce vor fi ulterior scindați
în patru tipuri de ARNr: ARNr 28S, ARNr 5.8 S, ARNr 5S (ce intră în compoziția subunității mari a
ribozomului) și ARNr 18S (ce intră în compoziția subunității mici)
CMA – concentrația minimă activă. Este concentrația la care antibioticul poate induce anumite
perturbări în activitatea metabolică a microorganismelor, fară a afecta capacitatea de multiplicare și
viabilitatea microorganismelor
CMI – concentrația minimă inhibitorie a unui antibiotic este cea mai mică concentrație care inhibă
complet multiplicarea unei tulpini patogene
CMB – concentrația minimă bactericidă a unui antibiotic este concentrația minimă care omoară tulpina
GTP (Guanozin trifosfat). Este o nucleozidă purinică. Acesta poate acționa ca un substrat atât în sinteza
ARN-ului în timpul procesului de transcriere cât și a ADN-ului în timpul replicării
HGT – transfer pe orizontală al genelor. Este un proces prin care porțiuni mici din materialul genetic
pot fi transferate între bacterii ale aceleiași specii sau chiar între diferite specii.
LUCA (Last Universal Common Ancestor). Este considerat strămoșul comun al tuturor formelor de
viață de pe Pământ cu o vechime de 3,8 miliarde de ani
RPP – proteine ribozomale cu rol de protecție. Sunt proteine citoplasmatice solubile (~72 kDa) care
mediază rezistența la tetraciclină. Majoritatea genelor care codifică pentru RPP sunt localizate pe
plasmide și se transmit între specii diferite prin transfer lateral
pH- reprezintă logaritmul zecimal cu semn schimbat al concentrației ionilor din soluție. Prin noțiunea
de pH se exprimă cantitativ aciditatea sau bazicitatea unei soluții, pe baza concentrației de hidroniu
H3O+
QS – Sunt molecule de semnalizare celulară cu greutate moleculară mică. Atunci când moleculele
semnal ating un prag critic de concentrație, inhibă sau activează expresia genică. Acest tip de reglare a
expresiei genice a fost denumit mecanism de quorum sensing (QS) . Se întâlnește atât la bacteriile
Gram negative cât și la cele Gram pozitive
QSI – inhibitori naturali sau sintetici de QS. Sunt compuși naturali extrași din alge (furanone
halogenate), licheni, plante sau sintetici, care nu constituie un factor de presiune selectivă și de
inducere a rezistenței

Cuprins
Partea generală
Introducere
I. Stadiul actual al cunoașterii în domeniul rezistenței la antibiotice în mediul clinic și natural al
tulpinilor patogene
Originea și evoluția speciilor de bacterii rezistente
Cauzele apariției și răspândirii rezistenței
Evoluția filogenetică a genelor de rezistență la antibiotice
Genele care codifică pentru proteinele RPP
Genele Tet și Erm
Factorii care contribuie la diseminarea și întreținerea rezistenței la antibiotice
Mecanismele rezistenței bacteriene la antibiotice
Tipuri de rezistență
Rezistența naturală
Rezistența dobandită
Pseudorezistența

Mecanismele rezistenței la antibiotice
Mecanisme genetice

1. Mutații spontane la nivelul ADN-ului bacterian
2. Integrarea de material genetic exogen
Mutații
Recombinări cromozomiale
Elemente mobile: plasmide, transpozoni și integroni

3. Transferul de gene pe verticală
4. Transferul de gene pe orizontală

4.1. Transformare
4.2. Transducție
4.3. Conjugare

Mecanisme biochimice
Inactivare enzimatică

Mecanisme celulare

Alte ipoteze referitoare la dobândirea rezistenței la antibiotice

Biofilmul
Insulele de patogenitate
Factori favorizanți
Transmiterea rezistenței de la bacteriile Gram Negativ la tulpinile Gram Pozitiv

Istoricul bolilor infecțioase
Metode de diagnostic
Prevenția
Abordări terapeutice
Partea personală
Materiale
Metode
Rezultate și Discuții
Concluzii și perspective
Bibliografie

Introducere
Tema tezei de diserație abordează un subiect de mare actualitate, întrucât prezența bacteriilor rezistente
și multirezistente la antibiotice a devenit o problemă de sănătate publică la nivel mondial.
Subiectul este de interes întrucât datele din literatura de specialitate sunt insuficiente pentru țara
noastră, în special pentru zona sudică.
Antibioticele sunt utilizate pentru tratarea boliilor atât la oameni cât și la animale. Potrivit unor studii
(Levy, 1997; Oppegaard și colab. 2001 ) există mecanisme comune de rezistență la antibiotice în
populațiile bacteriene proporțional cu utilizarea de antibiotice, în special în agricultură (Levy, 1997;
Oppegaard și colab. 2001).
Utilizarea antibioticelor în scopuri profilactice sau terapeutice la om și în scopuri veterinare și agricole
a furnizat o presiune selectivă care favorizează supraviețuirea și răspândirea microorganismelor
rezistente sau multirezistente (Hooper, 2002; Mascaretti, 2003; Taber, 2002).
Bacteriile Gram negative s-au dovedit a fi cele mai des întâlnite, atât în mediul natural, cât și în spitale.
Pseudomonas aeruginosa și Acinetobacter baumannii sunt patogeni nosocomiali frecvenți, fiind
implicați în apariția mai multor infecții, dificil de controlat.
Având în vedere că pe plan european există programe de supraveghere a rezistenței la antibiotice, prin
lucrarea aceasta evidențiem profilul de sensibilitate la antibiotice a unor tulpini de bacili, izolați din
câteva surse naturale de apă din Estul României și din mediul clinic pentru a putea realiza o comparație
a profilelor genetice și a genelor care le conferă rezistență la antibiotice.
În cadrul acestei studiu comparativ se vor examina indicatorii de calitate a apei (pH, temperatură,
turbiditate, cantitatea de fosfor total) care ar putea să fie corelați cu rezistența la antibiotice a tulpinilor
în surse de apă (izvor din Sudul României) din care se adapă animalelele domestice.
Profilul genetic al bacteriilor depistate va fi comparat cu cel al unor bacterii din mediul clinic.
De asemenea, vom evidenția și concentrația minimă inhibitorie (CMI) a câtorva tipuri de antibiotice
pentru a putea obține informații cantitative despre susceptibilitatea bacteriană.
Având în vedere necesitatea utilizării unor metode specifice de diagnostic a bacteriilor implicate în
patologii, vom compara diferite metode de detectare a bacteriilor rezistente la antibiotice, cu scopul de
a evidenția eficacitatea, rapiditatea și specificitatea fiecăreia dintre acestea.
Utilizarea metodelor moleculare va completa evaluarea fenotipică a izolatelor și astfel vom putea avea
caracterizarea tulpinilor rezistente la terapie.
În partea a doua a lucrării, am izolat tulpini de bacterii din mediul natural și clinic pentru a identifica
genele implicate în rezistența la antibiotice, iar rezultatele experimentului vor fi prelucrate și analizate
prin mai multe tehnici și metode.
Secvențele obținute în cadrul experimentului vor fi comparate cu secvențele de nucleotide și de
proteine din baza de date NCBI GenBank.

Rezultatele acestui studiu ar putea completa bazele de date de la nivel european sau mondial cu profilul
genetic al tulpinilor bacteriene care au exprimate gene de rezistență la antibiotice.
Obiective
1. Investigarea și compararea profilului de sensibilitate la antibiotice a unor tulpini de bacterii izolate
într-un spital și în câteva ape din Sudul României.
2. Optimizarea unor metode de detecție a tulpinilor patogene.
3. Evidențierea prin comparație a profilului genetic la bacteriile pe care le-am izolat din mediul
înconjurător și intraspitalicesc.
4. Investigarea mecanismelor de răspândire a genelor de rezistență (mutație spontană versus transfer
orizontal).
5. Determinarea CMI (concentrația minimă inhibitorie) a celor mai uzuale antibiotice pentru a putea
obține informații cantitative despre susceptibilitatea bacteriană a speciilor izolate.

I. Stadiul actual al cunoașterii în domeniul rezistenței la antibiotice în mediul clinic și natural al
tulpinilor patogene
Originea și evoluția speciilor de bacterii rezistente la antibiotice
Bacteriile au apărut pe Pământ acum câteva miliarde de ani, timp în care și-au perfecționat
mecanismele de adaptare la mediul extern, în special prin plasticitate și flexibilitate genetică. (Cupșa,
2007).
La ora actuală se crede că toate celulele au ca strămoș o celulă ancestrală comună, ultimul strămoș
comun universal (LUCA).
Evoluția omului a avut loc într-o relație simbiotică cu flora bacteriană endogenă (numărul celulelor
bacteriene depășește numărul de celule umane).
Diversitatea microorganismelor, variatele genotipuri și fenotipuri de rezistență la antibiotice, sunt
studiate pe baza metodelor moleculare de secvențiere a genelor.
O mare parte a antibioticelor își au originea în bacteriile existente (spre exemplu eritromicină,
streptomicină, vancomicină, daptomicină). (Baltz, 2005)
Aceste bacterii prezintă mecanisme de protejare împotriva propriilor produși, mecanisme care odată ce
sunt transferate patogenilor sau oportuniștilor anulează acțiunea antibioticelor.
Cauzele apariției și răspândirii rezistenței la antibiotice
Rezistența la antibiotice reprezintă capacitatea naturală sau dobândită a unui microorganism de a
supraviețui în prezența unuia sau mai multor antibiotice. (Depardieu și colab., 2007)
Rezistența la antibiotice poate să apară prin mai multe mecanisme: selecție naturală, mutații spontane
(ca rezultat al acțiunii factorilor de mediu) sau prin erori necorectate în procesul de replicare al ADN-
ului. (Curtis și colab., 2007)
Acest proces biologic natural duce la supraviețuirea celor mai rezistente tulpini (Fedesa, 2000).
Odată apărută rezistența la antibiotice, gena care codifică acest caracter se poate răspândi la alte celule
prin transfer de plasmide, transpozoni sau integroni.
O bacterie poate avea mai multe gene de rezistență la antibiotice exprimate, fiind numită
multirezistentă.
Rezistența la antibiotice poate fi indusă unui microorganism și pe cale artificială, prin tehnici de
transformare.
Rezistența se manifestă atât la nivel individual cât și populațional (comunitar sau nosocomial).
Un studiu filogenetic recent pe tema rezistenței la antibiotice arată că unele gene de rezistență la
antibiotice au o lungă istoria evoluționistă de diversificare, care a început cu mult înainte de „epoca
antibiotic“. (Ventola, 2015)

Problema rezistenței la antibiotice este actuală și face obiectul mai multor studii deorece există o
creștere semnificativă a numărului bacteriilor patogene rezistente la antibiotice.
De cele mai multe ori rezistența la antibiotice este asociată cu utilizarea și abuzul de antibiotice, atât la
oameni cât și la animale.
Cu toate acestea, rezistența dobândită prin transferul lateral de gene de rezistență la antibiotice este cea
mai fecvent întâlnită la bacterii taxonomic îndepărtate. (Penesyan și colab., 2015)
Evoluția filogenetică a genelor de rezistență la antibiotice
Transferul de gene pe orizontală între taxoni îndepărtați filogenetic este dificil de reprodus in vitro
deoarece la ora actuală nu se cunosc bacteriile și mecanismele genetice care au fost implicate, condițiile
de mediu la momentul transferului și rata de transfer (poate fi prea mică pentru a o reproduce într-un
experiment).
Totuși, datorită programelor și bazelor de date disponibile, este posibil să se efectueze o analiză
filogenetică a ascendenților unor specii de bacterii pentru a se confirma ipoteza transferului de gene pe
orizontală.
În urma experimentelor de cartare a genelor implicate în rezistența la antibiotice, s-a evidențiat faptul că
acestea sunt grupate în zone denumite "clusteri".
Localizarea acestor gene este de obicei cromozomală, dar există și cazuri când acestea sunt localizate în
plasmide (Hopwood, 1978; Kinashi și colab.,1987).
Genele care codifică pentru proteinele RPP
Analiza filogenetică a fost folosită pentru analiza istoriei evoluției genelor de rezistență la antibiotice,
care codifică pentru proteinele ribozomale cu rol de protecție (RPP).
Aceste proteine conferă rezistență la tetraciclină (Connell și colab., 2002, 2003).
Analiza filogenetică a evidențiat evoluția timpurie și independentă la opt grupuri de RPP cu mult
înainte de „era antibiotic“ (Aminov și colab., 2001).
Nu există dovezi care să susțină ipoteza transferului de gene de rezistență de la tulpinile bacteriene care
produc antibiotic la alte bacterii comensale. (Aminov și colab., 2001)
Recent, această analiză a fost refăcută cu un set de date actualizat. Această analiză a confirmat, încă o
dată, originea monofiletică a genelor Tet (gena care codifică pentru proteina RPP).
Analiza secvențelor de ADN de la bacteriile Streptomyces rimosus și Agrobacterium nu arată transferul
de gene orizontal. (Aminov și colab., 2007)
Deși încă nu a fost confirmat prin experimentele de clonare a genei și secvențiere, există indicii că
unele gene tet din specii de Streptomyces, în special cele care codifică RPP, pot fi detectate la
Mycobacterium (Pang și colab.,1994).

Genele de rezistență la antibiotice ale bacteriilor din sol codifică pentru proteine cu rol funcțional
(protecție împotriva antibioticelor sintetizate de către producători). Este greu de explicat prezența
acestora și modul de funcționare în bacteriile producătoare de antibiotice din alte nișe ecologice, cu
sau fără expunere limitată la microbioza din sol.
O posibilă explicație pentru acest fenomen ar putea fi faptul că aceste gene ar fi avut inițial alte funcții
metabolice în epoca preantibiotic. (Lafontaine și colab., 1998)
Antibioticele țintesc moleculele implicate în mecanisme importante din celulă, folosite pentru
susținerea și protejarea nevoilor celulare de bază, cum ar fi: procesele celulare vitale, păstrarea
integrității peretelui celular și biosinteza compușilor vitali pentru celulă. (Alekshun și Levy, 2007)
Rezistența la antibiotice a fost observată la multe tulpini bacteriene de colecție, izolate înainte de folosirea
acestor antibiotice în practica clinică, ceea ce întărește ideea că populațiile bacteriene vin în contact cu
asemenea compuși în mediul lor natural de viață.
De asemenea, unii metaboliți toxici chiar dacă nu sunt antibiotice puternice, pot spori activitatea altor
antibiotice față de care s-a instalat rezistența la numeroase tulpini bacteriene.
Genele Tet și Erm
Pe de altă parte, analiza filogenetică sugerează că răspândirea rapidă a genelor rezistente la antibiotice
între specii de bacterii patogene îndepărtate filogenetic este un eveniment evolutiv recent și este cel mai
probabil cauzat de tranferul pe orizontală între bacterii din „epoca de antibiotice“.

Figura 1. În figura de mai sus este ilustrat transferul de gene de rezistență între bacterii Gram-pozitive
și bacterii Gram-negative. Dovada transferului constă în analiza secvențelor genei de interes. Spre
exemplu, gena Tet (M) se găsește atât la bacteriile Gram-pozitive cât și la bacteriile Gram negative.
Această genă este transferată de transpozonul Tn916. (După Brock biology of microorganisms, 2014)

Gena Tet (W) este prezentă la specii precum : Megaspaera elsdenii, Bifidobacterium longum,
Roseburia hominis, Mitsuokella multacida și Butyrivibrio fibrisolvens, fapt care confirmă ipoteza
transferului recent pe orizontală al genei între bacterii din intestinul uman, de la porcine și o bacterie
probiotic (Barbosa și colab., 1999; Kazimierczak și colab., 2006).
Marea majoritate a bacteriilor care poartă genele tet sunt orale, intestinale sau genitale. De aceea, riscul
transferului pe orizontală este mare (Salyers și colab., 2004).
În cazul genelor erm situația este asemănătoare, în special pentru variantele erm (B), erm (C), și erm
(G), demonstrând penetranța înaltă, fiind întâlnite la bacterii Gram negative și pozitive.
Analiza evoluției și răspândirii genelor tet în specii de bacterii care colonizează intestinul a evidențiat
faptul că aceste gene au fost răspândite rapid în rândul populației, atât în spitale cât și în comunitate, în
ultimii 30 de ani (Shoemaker și colab., 2001).
Această perioadă de timp coincide cu ¨epoca antibioticelor¨.
Rezultatele analizei moleculare a genelor erm (B) izolate de la om, porcine, păsări de curte și
Enterococcus faecium sugerează faptul că transferul orizontal al genelor de rezistență la antibiotice este
mai des decât transmiterea directă a tulpinilor rezistente (De Leener și colab., 2005).
Din punct de vedere clinic, este de interes analiza penetranței genelor de rezistență la antibiotice la
bacteriile patogene.
Analiza moleculară a genelor care codifică pentru tetraciclină din izolatele clinice arhivate sugerează că
acest proces ar fi putut apărea cu câțiva ani înainte de începutul utilizării antibioticelor (Atkinson și
colab., 1997; Cousin și colab., 2003).
Factorii care contribuie la diseminarea și întreținerea rezistenței la antibiotice
Conform studiului lui Chastre, factorii de risc care contribuie la apariția și răspândirea infecțiilor cu
bacterii rezistente sau multirezistente sunt:
a. tratamentul cu antibiotice cu cel puțin 90 zile anterior apariției simptomelor
b. internare în ultimele 3 luni
c. studii care indică frecvența crescută a tulpinilor curezistență în comunitate sau în spital
d. imunosupresia rezultată în urma tratamentului cu imunosupresoare sau a unei boli care influențează
răspunsul imun
e. terapia intravenoasă (cu sau fără antibiotice)
f. dializă
g. existența unor membri de familie purtători de tulpini patogene rezistente sau multirezistente
(Chastre, 2008)
Antibioticele se folosesc în numeroase contexte: de la tratamentul boliilor la hrănirea animalelor de
producție alimentară pentru stimularea creșterii.
Factorul evolutiv este foarte important, mai ales în contextul creșterii accentuate a producției și
consumului de antibiotice.
Presiunea impusă de mediu selectează tulpinile patogene cele mai rezistente, dar problema nu va înceta

să existe atunci când presiunea este îndepărtată. (Salyers și Amabile-Cuevas, 1997).
Deși unele studii sugerează faptul că dobândirea și transferul genelor de rezistență presupune consum
energetic ridicat pentru celula bacteriană și că genele de rezistență la antibiotice se vor inactiva odată
ce presiunea selectivă este eliminată, în natură există multe exemple care demonstrează plasticitatea
bacteriilor, în scopul reducerii metabolismului. (Lenski, 1997; Enne și colab., 2005; Ramadhan și
Hegedus, 2005).
Reducerea consumului energetic necesar transferului genelor poate fi unul dintre motivele pentru care
genele de rezistență la antibiotice supraviețuiesc procesului de selecție impus de prezența antibioticelor.
(Gilliver și colab.,1999).
Prin urmare, răspândirea de gene de rezistență la antibiotice în mediul înconjurător devine o problemă;
studiile arată că în zonele cu un nivel redus al utilizării antibioticelor în agricultură frecvența genelor de
rezistență este foarte scăzută (Osterblad și colab., 2001).
Tipuri de rezistență: naturală și dobândită
Rezistența la antibiotice a bacteriilor poate fi datorată unei trăsături specifice a unui microorganism
care o face în mod natural rezistentă (naturală), sau poate fi dobândită.
Rezistența naturală
Rezistența naturală reprezintă rezistența unei specii bacteriene la acțiunea unuia sau mai multor
antibiotice administrate în doze care pot inhiba creșterea sau distruge alte microorganisme.
Rezistența naturală este proprietatea intrinsecă a speciei, fiind determinată genetic. (Burton și
Engelkirk, 2002)
Rezistența dobândită
Rezistența dobândită poate fi definită ca acea rezistență necaracteristică unei specii bacteriene, dar
prezentă în anumite subpopulații din acea specie în circumstanțe date.
De exemplu, antibioticul acționează ca un presor selectiv (pacientul are o infecție în care majoritatea
populației bacteriene este sensibilă la agentul antimicrobian, dar există și tulpini rezistente). În aceste
condiții, tulpinile sensibile vor fi inhibate sau distruse în timp ce tulpinile rezistente vor supraviețui.
În practică, bacteria este considerată rezistentă când se înregistrează un raport subunitar între nivelul
seric mediu suportat de pacient și concentrațiile minime inhibitorii sau bactericide ale antibioticului.
(Todar, 2002).
În scopul de a dobândi rezistență la antibiotice, bacteriile dezvoltă mai multe mecanisme de apărare.
Toate mecanismele presupun fie modificarea materialului genetic existent, fie integrarea unui nou
material genetic.

Rezistența dobândită prezintă importanță clinică și epidemiologică din cauza transmiterii în cadrul
aceleiași specii dar și între specii îndepărtate taxonomic.
Clasificare
Potrivit lui Swartz (Swartz, 2000), există mai multe tipuri de rezistență dobândită, în funcție de diferite
criterii :
a. După momentul în care se instalează infecția, rezistența este:
– primară → starea de rezistență a bacteriei în momentul inițierii infecției
– secundară → dobândită de tulpina infectantă în urma terapiei
b. După numărul de antibiotice față de care se instalează rezistența:
– Monorezistență → rezistența microbiană față de un singur antibiotic
– Plurirezistența (multirezistența) → rezistența microbiană față de mai multe antibiotice
c. După viteza de instalare a rezistenței față de antibiotice:
– Rezistență rapidă de tip streptomicinic → apărută într-o singură treaptă (mutație unică, pe o singură
genă)
– Rezistență progresivă de tip penicilinic → apărută în mai multe trepte (mutații succesive)
d. După prezența sau absența antibioticului:
– rezistență inductibilă → rezistența apare numai în prezența antibioticului)
– rezistența constitutivă → rezistența este independentă de prezența sau absența antibioticului)
Pseudorezistența
Prin pseudorezistență se definește ineficiența unui tratament cu antibiotice cauzat de caracteristicile
organismului gazdă sau de utilizarea incorectă a antibioticelor.
Pseudorezistența este un fenomen temporar, reversibil, care apare numai in vivo.
Dezvoltarea rezistenței este favorizată de caracteristicile farmacocinetice ale antibioticelor și de o
terapie incorectă (doză insuficientă, durată prea scurtă sau lungă a tratamentului), dar și de concentrația
activă ineficientă a antibioticului la locul infecției (din cauza barierei seroase, țesuturilor
nevascularizate, inactivarea antibioticelor sau a pH-ului nefavorabil). (Swartz, 2000)
O altă cauză a eșecului terapeutic este rezistența relativă a bacteriilor, care sunt sensibile in vitro, dar
insensibile in vivo (datorită reducerii metabolismului) și statusul imun al pacientului.

O forță selectivă importantă o reprezintă cantitatea mare de antibiotice utilizate în agricultură, precum
și în terapia și profilaxia din medicina umană și veterinară (Hardy, 2002).
Mecanismele de dobândire a rezistenței bacteriene la antibiotice
La ora actuală, sunt cunoscute mai multe mecanisme care le conferă bacteriilor rezistență la antibiotice.
Cele mai studiate mecanisme sunt cele genetice, biochimice și celulare.
Aceste mecanisme pot să inactiveze antibioticul prin modificarea chimică a structurii compusului activ,
prin eliminarea din celulă, sau prin modificarea situsului țintă care nu mai este recunoscut de antibiotic.
Inactivarea enzimatică a antibioticului reprezintă mecanismul cel mai des întâlnit în natură.
O strategie alternativă utilizată de multe bacterii este modificarea situsului țintă al antibioticului.
Mecanismele genetice
Rezistența la antibiotice poate fi indusă la bacterii prin mecanisme de variație genetică, atât de natură
endogenă (mutații și translocări), cât și exogenă (recombinări cromozomiale, transfer de plasmide
rezistente, transpozoni sau integroni).
Mutații spontane la nivelul ADN-ului bacterian
Mutațiile apar fie în genele structurale, determinând modificări ale moleculelor țintă sau a sintezei
enzimelor ce inactivează antibioticul, fie în genele reglatorii cu rol în activarea pompelor de eflux
pentru antibiotic și/sau modificarea porilor membranei celulare.
Genele de rezistență sau represorii lor pot fi activați sau inactivați prin migrarea secvențelor de inserție.
Acest tip de rezistență se întâlnește la tulpinile de Streptococcus pneumoniae rezistente la peniciline
și/sau cefalosporine, tulpinile de Streptococcus aureus cu rezistență la oxacilină, mutațiile determinând
modificări ale moleculelor țintă.
Rata mutațiilor spontane in vivo este de aproximativ 10−8(variază între10−5−1011 ), dar poate
crește de 200 de ori în condiții de stres oxidativ, în prezența antibioticelor. (Livermore, 2003)
Acest fenomen se întâlnește la tulpinile de E.coli rezistente sau, în cazul fibrozei chistice, la tulpinile de
Pseudomonas aeruginosa cu multirezistență la cefalosporine, aminoglicozide și cloramfenicol.
Din cauza mutațiilor apare multirezistența prin activarea pompelor de eflux în asociere cu alterarea
porinelor, sau modificări ale moleculelor țintă. (Livermore, 2003)
Integrarea de material genetic exogen
Integrarea de material genetic exogen se realizează prin recombinări cromozomiale, prin elemente
mobile sau prin transferul genelor de rezistență între specii diferite sau intraspecie.
a. Recombinări cromozomiale

Acest tip de rezistență apare ca urmare a unor mutații în secvențele nucleotidelor cromozomului
bacterian, ceea ce determină sinteza de proteine sau alte macromolecule care interferă cu activitatea
antibioticelor.
Mutațiile cromozomiale pot fi spontane sau induse de agenți mutageni (în special de antibiotice), se
transmit și pe verticală (fără contact cu antibioticul) și sunt definitive. (Kuhn și col., 2003)
Totuși, se presupune că numărul de mutanți rezistenți va scădea după încetarea expunerii la antibiotic
(Swartz, 2000).
Într-o populație expusă la un antibiotic, dezvoltarea rezistenței cromozomale este, de obicei, un proces
gradual, realizat prin mutații succesive. Rar însă, pentru unele antibiotice o singură mutație poate
determina rezistență (care se reflectă într-o creștere a CMI).
Apariția mutanților rezistenți este mult mai puțin frecventă in vivo decât in vitro, probabil datorită
faptului că mutațiile care duc la rezistență sunt, de obicei, asociate cu alte modificări celulare, care pot
fi dezavantajoase bacteriei. (Kuhn și col., 2003)
Din acest motiv, unii oameni de știință privesc dezvoltarea rezistenței determinată de mutații
cromozomale ca pe o mică problemă, comparativ cu rezistența transferabilă. În practică, aceste mutații
au importanță redusă, datorită faptului că apar rar ( ~10% din totalul mutațiilor). (Jackson și col., 2004).
b. Rezistența transferabilă prin elemente mobile
Bacteriile au sisteme de transfer genetic deosebit de eficiente, capabile de a interschimba și acumula
genele rezistenței.
Unele gene, inclusiv cele care induc rezistența, se pot transfera între elementele ADN-ului cromozomal
și extracromozomal ale bacteriilor. Mutațiile extracromozomiale sunt mult mai frecvente ( ~90%), deci
au mare importanță clinică.
Genele se pot transmite între bacterii care aparțin aceleiași specii sau unor specii și genuri diferite
(transfer orizontal), care împart același ecosistem. Odată ce s-au activat gene ale rezistenței în elemente
mobile transferabile, bacteriile care poartă aceste gene vor rămâne donori potențiali pentru alte bacterii.
(Agerso și col., 2005).
În ultimii ani, un număr important de gene ale rezistenței au fost asociate cu transferul de ADN
extracromozomal prin plasmide, transpozonii sau integroni. S-a demonstrat că aceste elemente mobile
transmit determinanți genetici ai unor mecanisme ale rezistenței antimicrobiene și au importanță în
diseminarea genelor rezistenței între bacterii diferite. (McDermott ,2002)
Plasmide
Plasmidele sunt molecule de ADN extracromozomal, replicabil, care conțin genele rezistenței. (Marble,
1999)
Replicarea plasmidială are loc independent de ADN-ul cromozomal. Plasmidele sunt importante în
evoluția bacteriană, deoarece ele au rol în replicare, reglarea metabolismului, rezistența la toxinele

bacteriene (bacteriocine), antibiotice și bacteriofagi, astfel asigurând o șansă mai bună de supraviețuire
și propagare.
Cu toate acestea, plasmidele nu sunt necesare pentru supraviețuirea bacteriei. Au fost identificate la
majoritatea speciilor bacteriene, având capacitatea de a fi transferate (conjugative) sau co-transferate
(non-conjugative) de la o bacterie la alta.
Genele codificate de plasmide sunt mai mobile decât genele cromozomale deoarece plasmidele pot fi
transferate în interiorul unei specii sau între diferite specii bacteriene (Swartz, 2000).
Printre cele mai răspândite și bine studiate plasmide sunt plasmidele de rezistență (R-plasmide), care
conferă rezistență la antibiotice sau la alți inhibitori de creștere. În general, genele de rezistență codifică
pentru proteine care inactivează antibioticul. (Diaz și col., 2006).
Achiziția de noi determinanți ai rezistenței poate apărea mult mai rapid prin R-plasmide decât prin
mutație genetică.
Mai multe gene de rezistență la antibiotice pot fie codificate pe o singură plasmidă R, iar o bacterie
multirezistentă poate conține mai multe plasmide R diferite.
O singură R-plasmidă poate codifica simultan pentru rezistență la peste 10 antibiotice diferite. Spre
exemplu, plasmida R100 determină rezistența la sulfonamide, streptomicină, cloramfenicol și
tetraciclină. (Diaz și col., 2006)
Plasmidele din izolate umane și veterinare par a fi foarte asemănătoare, sugerându-se chiar transmiterea
lor de la animale la om.
Diseminarea plasmidelor poate apărea prin distribuire clonală și prin transfer intra- și inter-special, ceea
ce duce la o înmulțire graduală a microorganismelor transportoare a uneia sau mai multor gene
codificate pe plamida R. (Diaz și col., 2006)
Rezistența plasmidică față de unul sau mai multe antibiotice (multirezistență) este dependentă de
genotipul speciei, având transmitere atât pe orizontală, cât și pe verticală. (Johnson și col., 1994).
Transpozonii
Transpozonii sunt secvențe scurte de ADN care pot transfera material genetic între plasmide, între
plasmide și cromozomul bacterian sau între o plasmidă și un bacteriofag (Henderson, 2000).
Spre deosebire de plasmide, transpozonii nu sunt capabili să se replice independent, ei trebuie să fie
menținuți într-un replicon funcțional (cromozom sau plasmidă).
Transpozonii la bacteriile Gram-negative sunt non-conjugativi, în timp ce la bacteriile Gram-pozitive
pot fi atât conjugativi cât și non-conjugativi. (Kehrenberg și col., 1998)
Totuși, dacă un transpozon al bacteriilor Gram-negative este parte a ADN-ului unei plasmide
conjugative, transferul orizontal este posibil. Transpozonii, inclusiv aceia care transportă genele
rezistenței, sunt preluați de către plasmide și apoi încorporați în ADN-ul bacterian. (Ribera și col.,

2003)
De cele mai multe ori, pe aceeași plasmidă se găsesc mai mulți transpozoni, determinând transferul mai
multor determinanți ai rezistenței în cursul unei singure conjugări.
Transferul intracelular al transpozonilor între plasmide, între cromozomul bacterian și plasmide poate
duce la o rapidă dezvoltare a rezistenței în interiorul unor populații bacteriene.
Exprimarea genelor rezistenței localizate pe tranpozoni (spre exemplu, producția de enzime specifice)
poate să necesite prezența antibioticului.
Mai mult de atât, prezența antibioticului va stimula transferul rezistenței. Antibioticele crează un mediu
în care achiziția de determinanți ai rezistenței este avantajoasă, iar rata transferului genelor rezistenței
crește. (Kehrenberg și col., 1998)
Integronii
Integronii au fost inițial descoperiți pe plasmidele conjugative.
Integronii sunt elemente cromozomiale naturale ale exprimării genelor. Sunt compuși din două regiuni
conservate și o regiune variabilă interpusă, care conține casete ale genelor de rezistență la antibiotice
(Hall și Collis, 1995).
Casetele genelor sunt elemente care includ o singură genă și un situs de recombinare. Au fost
identificate mai mult de 40 de casete, dintre care majoritatea conțin gene ale rezistenței (Agerso și col.,
2005).
De exemplu, modelul rezistenței caracteristice la cromozomul de Salmonella typhimurium DT104 este
asociat cu prezența integronilor (Swartz, 2000).
Una dintre regiunile conservate ale integronului conține gena integrazei, care este responsabilă pentru
inserția specifică la situsul din casete (Swartz, 2000).
Integronii pot fi localizați în ADN-ul cromozomal, dar mai des sunt localizați în plasmide (Diaz și col.,
2006) sau transpozoni și sunt, prin urmare, elemente mobile.
Transferul de gene pe verticală
Frecvența mutațiilor spontane care conferă rezistență la antibiotice este de aproximativ 10−8−10−9
Acest lucru înseamnă că una din fiecare 10−8−10−9bacterii are potențialul de a dezvolta rezistență la
antibiotice prin procesul de mutație.
În cazul E. coli se estimează că rezistența la streptomicină este dobândită la o rată de aproximativ
10−9când este expus la concentrații mari de streptomicină. (Livermore, 2003)
Deși mutația spontană este foarte rară, rata de creștere foarte rapidă și numărul mare contribuie la
dezvoltarea într-un timp scurt a mecanismelor de rezistență.

Odata ce genele de rezistență s-au dezvoltat, ele sunt transferate direct la toate bacteriile în timpul
replicării ADN-ului. Acest proces este cunoscut sub numele de transfer de gene pe verticală sau
evoluție verticală.
Acest proces se desfășoară după principiile darwiniste de selecție naturală: o mutație spontană în
cromozomul bacterian conferă rezistență unei singure bacterii dintr-o populație de bacterii.
În mediu selectiv al antibioticului, tipul sălbatic (non mutant) este ucis și mutantul rezistent crește.
Transferul genelor pe orizontală
Transferul lateral sau pe orizontală al genei (HGT) este un proces prin care porțiuni mici din materialul
genetic pot fi transferate între bacterii ale aceleiași specii sau chiar între diferite specii.
Efectele combinate ale creșterii rapide la populații mari de celule, procesul epigenetic de mutație și
selecție, precum și capacitatea de a transfera gene, pot explica frecvența mare de apariție a rezistenței
care apare la unele bacterii.
Așa cum am precizat mai sus, elementele genetice mobile extracromozomiale implicate în trasnferul
genelor de rezistență sunt plasmidele, transpozonii și integronii.
Există cel puțin trei mecanisme posibile de transfer pe orizontală (HGT), echivalente cu cele trei
procese generice de schimb de material genetic între bacterii.
Acestea sunt transformarea, transducția (mediat de bacteriofag) sau conjugarea (prin pili de
conjugare).
Integrarea genei de rezistență este urmată de recombinări între specii înrudite sau între specii
îndepărtate taxonomic.

Figura 2. Transfer vertical și orizontal (După Brock biology of microorganisms, 2014). Transferul pe
verticală apare atunci când celula se divide. Transferul pe orizontală apare atunci când o celulă schimbă
material genetic cu o alta celulă. La procariote, transferul pe orizontală apare prin unul din cele trei
mecanisme : conjugare, transformare și transducție.
1. Conjugarea se produce atunci când există contact direct celulă-celulă între două bacterii (care nu
trebuie să fie înrudite filogenetic) și se transferă ADN plasmidial. Acest proces este considerat a fi
mecanismul principal al transferului genelor pe orizontală și se realizează prin intermediul plasmidelor,
transpozonilor și integronilor.
2. Transformarea apare atunci când materialul genetic este preluat direct de un alt microorganism, în
urma distrugerii unei bacterii (Kehrenberg, 2000; Furushita, 2003).
3. Transducerea apare atunci cand bacteriofagii transferă ADN între două bacterii strâns înrudite
filogenetic.
Mecanismele biochimice de rezistență
Principalele mecanisme biochimice sunt : inactivarea enzimatică a antibioticelor, impermeabilitatea
membranei celulare față de antibiotice, efluxul de antibiotic, modificări ale moleculelor țintă (subunități
ribozomale, modificări ale enzimelor țintă sau modificarea precursorilor peretelui celular)
Inactivarea enzimatică a antibioticelor este un mecanism de rezistență întâlnit la betalactamine,
aminoglicozide, cloramfenicol și macrolide. (Slavcovici, 2009)

Plasmidele rezistente și, mai rar, cromozomii, codifică enzimele de inactivare a antibioticelor. Se
cunosc mai multe categorii de enzime de inactivare: a antibioticelor betalactamice, a antibioticelor
aminoglicozide, a cloramfenicolului.
Betalactamazele
Sunt enzime descoperite la majoritatea speciilor bacteriene, care au capacitatea de a hidroliza inelul
betalactam al antibioticelor betalactamice, ceea ce duce la inactivarea completă a antibioticului.
Nivelul de rezistență mediat de betalactamaze este determinat de mai mulți factori, cum ar fi: rata de
hidrolizare a antibioticului, afinitatea enzimelor față de antibiotic, cantitatea de betalactamaze produse
în celulă, rata de difuzie a antibioticului prin membrana externă.
Rezistența enzimatică este constitutivă sau inductibilă, genele fiind localizate plasmidic sau
cromozomial. (Slavcovici, 2009)
Genele de rezistență sunt localizate la nivelul transpozonilor sau plasmidial și sunt transferate prin
conjugare.
La bacilii Gram-negativ betalactamazele sunt extrem de variate, acesta fiind mecanismul major al
rezistenței lor.
Rezistența prin betalactamaze se asociază frecvent și cu alte mecanisme de rezistență, determinând
apariția tulpinilor multirezistente, în special în cazul infecțiilor nosocomiale.
Inactivarea enzimatică a aminoglicozidelor (prin foforilare, acetilare, nucleotidare) are loc în timpul
transportului transmembranar.
Enzimele de modificare a aminoglicozidelor
Aminoglicozidele sunt modificate la nivelul grupărilor amino și hidroxil prin mecanisme de fosforilare,
acetilare sau adenilare, in final aceste modificări duc la inactivarea antibioticelor.
Nucleotidiltransferaza, acetiltransferaza, fosfotransferaza sunt codificate de gene plasmidice sau
transpozoni.
Enzimele de inactivare a cloramfenicolului
Rezistența este de natură plasmidială și este cauzată de producerea de către bacterie a unei enzime,
acetiltransferaza, care provoacă acetilarea antibioticului, determinând inactivarea lui.
Rezistența enzimatică se întâlnește în infecțiile cauzate de stafilococi, streptococi și enterobacteriacee.

Mecanisme celulare de dobândire a rezistenței la antibiotice
Reducerea permeabilității membranei externe
Lipopolizaharidele membranei externe, la tulpinile Gram-negativ, opresc pasajul antibioticelor
hidrofobe.
Pasajul antibioticelor hidrofile este facilitat de existența porilor membranari.
Permeabilitatea membranei externe față de antibiotice este în strânsă legatură cu numărul porinelor,
mărimea și proprietățile fizico-chimice ale antibioticelor.
Reducerea permeabilității membranei prin mutații care afectează porinele determină rezistența la
betalactamine și aminoglicozide.
Acest mecanism de rezistență se întâlnește la Enterobacteriacee, Pseudomonas aeruginosa, Serratia sp.
Și Bacteroides sp.
Reducerea permeabilității membranei citoplasmatice
Pasajul antibioticelor prin membrana citoplasmatică are loc prin transport activ (cu consum de energie),
bazat pe diferența de potențial electric de la nivelul membranei celulare.
Acest tip de rezistență apare frecvent la aminoglicozide și este cauzat de mutațiile cromozomiale care
afectează permeabilitatea membranei.
Acest mecanism de dobândire a rezistenței la antibiotice a fost identificat la stafilococi, E.Coli, și
Salmonella sp.
Rezistența prin eflux de antibiotic
Efluxul de antibiotic se realizează la nivel membranar prin sisteme de transport cu consum de energie și
este o cauză importantă a rezistenței sau multirezistenței la enterobacteriacee (apare la E. coli,
Pseudomonas aeruginosa, S. pneumoniae, streptococi și stafilococi). (Issam Raad, Hend Hanna și
colab., 2007)
Rezistența prin eflux de antibiotic determină rezistența tulpinilor de Str. pyogenes, Str. pneumoniae, S.
aureus (prin gena mef și msr) la macrolidele clasice, azalide și streptogramine B.
Mecanismele de eflux în asociere cu prezența betalactamazelor, contribuie la rezistența tulpinilor de
Pseudomonas aeruginosa la toate betalactaminele.
Alte ipoteze referitoare la dobândirea rezistenței la antibiotice
Insulele de patogenitate și evoluția virulenței
Insulele de patogenitate se găsesc atât la bacterii Gram pozitive cât și Gram negative. Acestea sunt
regiuni ADN de până la 200 kb care conțin mai multe gene de rezistență.

Compararea genomurilor bacteriilor patogene cu cele ale rudele lor inofensive dezvăluie adesea insule
cromozomiale care codifică pentru factori de virulență. (Van der Poll și Opal, 2008).
Secvența lor diferă mult de a altor gene cromozomale, ceea ce denotă ca sunt achiziții relativ recente în
evoluție.
Ar putea să apară prin integrarea unui element genetic exogen – fagul. Insulele de patogenitate sunt
prezente în anumite tulpini ale bacteriei Gram pozitive Staphylococcus aureus. (Van der Poll și Opal,
2008)
Rolul jucat de aceste insule în transferul lateral al genelor este încă neelucidat, dar este posibil să fie
cauzat de procentul ridicat de guanină și citozină.
Endosporii bacterieni
Endosporul este considerat în prezent o forma primitiva de citodiferentiere la procariote.
(V .Lazăr, 2015)
Starea de latență metabolică sau criptobioză determină rezistența sporilor la temperaturi de
peste 100 (pâna la 180 șC), uscăciune și radiații UV , la substanțe antimicrobiene
(antiseptice, antibiotice). De aceea au rol important în diseminarea bacteriilor în natură.
Importanța medicală a endosporilor este determinată de faptul că unele bacterii patogene
sunt sporogene (Clostridium botulinum, C. tetani sau C. perfringens). (V .Lazăr, 2015)
Printre speciile care colonizează omul, numai Clostridium sp. și Bacillus sp. produc
endospori. Aceste bacterii anaerobe se multiplică în intestin, sunt apoi eliminate și ajung în
apele uzate și sol, unde supraviețuiesc sub formă de spori.
Printre factorii care contribuie la rezistența la căldură se numără peretele gros și nivelul ridicat de
deshidratare. Atunci când un spor găsește condiții prielnice de dezvoltare (nutrienți, temperatură,
presiune osmotică, etc.) se întoarce la starea vegetativă și se pot reproduce.
Biofilmul
Biofilmul reprezintă o comunitate de microorganisme înglobate într-o matrice proprie secretată de
bacterii (matrice polizaharidică) sau la nivelul suprafețelor biotice sau abiotice. (Issam Raad, Hend
Hanna și colab., 2007)
Aderența este un factor determinant al colonizării unor situsuri specifice la plante și animale, o etapa
timpurie importantă în procesul infecțios, fiind o condiție sine qua non a colonizării organismelor
parazitate.
Recent s-a descoperit că aderența determină modificarea expresiei genice (activare/represie), așa încât
celulele biofilmului sunt diferite din punct de vedere fenotipic, de celulele libere din suspensie.

Biofilmul influențează nivelul de expresie fenotipică a tulpinilor rezistente.
Una din consecințele formării biofilmelor cu implicații medicale, este aceea că microorganismele
componente sunt mult mai rezistente la antibiotice și la mecanismele imunitare ale gazdei. (V . Lazăr,
2010)
Bacteriile aderă în general la epiteliile mucoaselor, a celule epiteliale cheratinizate, endoteliilor, oase,
dinți, dar și la suprafețele diverselor dispozitive implantate (catetere, proteze).
Formarea biofilmului are loc în mai multe etape:
a. aderarea microorganismelor la nivelul suprafeței
b. formarea matricei polizaharidice
c. creșterea și dezvoltarea biofilmului
Semnalizarea intercelulara este implicată în reglarea exprimării genelor și dezvoltarea de biofilme,
astfel că cercetările actuale au ca scop depistarea si testarea unor produși (de origine microbiană,
vegetală sau animală) care interferă cu semnalizarea intercelulară dintre microorganismele biofilmelor.
Acești compuși poartă numele de inhibitori de QS (QSI). (Lazăr, 2011)
Bacteriile care formează frecvent biofilm sunt: stafilococii, streptococii, enterococii, Ps.aeruginosa,
Klebsiella sp. și E.coli.
Din cauza stresului metabolic indus de radicalii de oxigen, a unui potențial redox scăzut și a
insuficienței substanțelor nutritive, apar tulpini patogene cu diverse fenotipuri de rezistență (rezistența
prin eflux, prin modificări ale moleculelor „țintă“ ).
Mai mult, biofilmul prezintă o structură care împiedică adsorbția antibioticelor și a componentelor
răspunsului imun în profunzimea biofilmului.
Un procent considerabil dintre infecțiile umane implică formarea de biofilme, de aceea terapia trebuie
sa se bazeze pe doze de antibiotice necesare omorârii bacteriilor din biofilme si nu pe cele care pot
ucide celulele libere. (V . Lazăr, 2011)
Transmiterea rezistenței de la bacteriile Gram Negativ la tulpinile Gram Pozitiv

Prevenția dobândirii rezistenței la antibiotice
Se realizează în mai multe feluri :
a. Prin vaccinare
b. Diagnostic bacteriologic rapid, asociat cu un tratament antibiotic corect. Diagnosticul rapid se poate
realiza prin introducerea testelor de diagnostic microbiologic cu acuratețe mare (PCR) și utilizarea
markerilor genetici.
c. Utilizarea rațională a antibioticelor
d. Utilizarea restrictivă a unor antibiotice care se adresează țintit bacteriilor rezistente pentru a limita
presiunea de selecție exercitată de antibiotic
e. Dozele și durata corectă a terapiei cu antibiotice
f. Implicare comunității medicale și a organizațiilor guvernamentale în supravegherea, prevenirea și
controlul rezistenței.
g. Colaborarea cu sectorul veterinar și industrial, în scopul reduceri iutilizării nejustificate de
antibiotice.
h. Educarea populației și promovarea mijloacelor simple, dar eficiente de igienă individuală.
Istoricul bolilor infecțioase
Bolile infecțioase au fost descrise de mii de ani, dar etiologia lor a fost elucidată abia acum un secol.
Medicul grec Hipocrate credea că infecțiile sunt cauzate de „modificări“ în aer. Teoria miasmatică
privind bolile infecțioase a rămas populară în lumea medicală până la începutul secolului XIX, în
ciuda faptului că A. Van Leeuwenhoek, folosind un microscop a descris bacterii încă din secolul al
XVII-lea.
Louis Pasteur a pus bazele microbiologiei moderne odată cu infirmarea teoria generației spontane și
acceptarea teoriei celulare (sau teoria germenilor). Deși această teorie mai fusese propusă anterior,
Pasteur are meritul de a fi dovedit printr-o serie de teste că infecțiile nu apar spontan, ci sunt produse de
microorganisme.
Pasteur a arătat că fermentația poate fi prevenită dacă aerul care ajunge la mediul de cultură este trecut
printr-un filtru sau printr-un tub lung ținut în flacără. Prin aceste experimente, Pasteur nu numai că a
infirmat definitiv teoria generației spontane, dar a și pus bazele tehnicilor moderne de sterilizare.
În 1884, medicul german Robert Koch a publicat Postulatele lui Koch. Scopul acestor postulate era de a
stabili o relație cauzală între un microb și boala pe care o cauzează.

Diagnostic
Bacteriile sunt componenta predominantă a florei, proliferează pe mucoase, îndeosebi, în
tractul gastrointestinal, unde se găsesc peste 400 de specii diferite. Peste 99% dintre bacteriile din flora
normală sunt anaerobe, îndeosebi Gram negative.
O infecție are două tipuri de surse: o sursă primară și secundară. Prin sursă primară de infecție
înțelegem locul în care agentul patogen este prezent și se reproduce.
Sursele secundare de infecție sunt obiecte, materiale sau persoane care contribuie la transmiterea
agenților patogeni de la sursa primară la alte persoane.
Identificarea agenților patogeni se bazează pe caracteristicile morfologice, fiziologice și chimice ale
acestora. (Tabel 1)
Infecțiile pot fi diagnosticate, fie direct, prin detectarea agentului patogen sau indirect, prin detectarea
anticorpilor produși. Printre metodele directe clasice se numără examinarea microscopică, cultura.
Pentru detecția directă se pot folosi și anticorpi monoclonali sau policlonali.
În diagnosticul de laborator este o necesitate ca prelevarea de probe și transportul acestora să se
efectueze în condiții optime, pentru a nu fi contaminate.
Transportul trebuie să fie efectuat în containere speciale, pe medii care conțin substanțe nutritive pentru
bacterii, pentru a favoriza o creștere selectivă a bacteriilor de interes, sau pe medii simple.

Tabel 1. Principiul esențial al identificării bacteriene constă în încadrarea taxonomică a bacteriilor din
cultură pe baza analizei morfologice (spre exemplu colorare), fiziologice (determinate cu medii
indicatoare) sau a caracteristicile chimice. Metodele moleculare genetice de diagnostic vor juca un rol
important în viitor.
Tehnici moleculare de diagnostic
Obiectivul principal al tehnicilor moleculare de identificare bacteriană îl reprezintă detecția directă a
secvențelor de nucleotide în materialul testat.
Aceste metode sunt folosite, în special, pentru detecția bacteriilor care sunt foarte dificil de cultivat sau
au o rată mică de proliferare.
În principiu, se poate utiliza orice secvență de ADN a unei specii pentru genotipare, dar de cele mai
multe ori se analizează regiunile specifice ale genelor care codifică pentru ARNr 16S și ARNr 23S.
O anumită regiune a ARNr 16S se întâlnește în toate bacteriile. Între aceste secvențe extrem de bine
conservate sunt și altele, care sunt specifice pentru o specie sau gen.
Folosind primeri care pot recunoaște regiunile conservate ale ADNr 16S, secvența de interes poate fi
amplificată, iar mai apoi secvențiată. Secvența astfel obținută este apoi identificată prin compararea cu
secvențele înregistrate în baze de date.
Detecția directă a antigenelor specifice pentru anumite specii sau genuri se poate realiza cu ajutorul

anticorpilor mono sau policlonali prezenți în probă, ceea ce permite un diagnostic rapid (spre exemplu,
în meningita acută se pot evidenția antigene bacteriene în lichidul cerebrospinal).
Cu toate acestea, această tehnică nu este la fel de sensibilă ca metodele clasice.
Abordări terapeutice
Microorganismele patogene posedă o serie de caracteristici care le permit să inducă boli infecțioase.
Aparitia patogenilor rezistenți la antibiotice (spre exemplu enterococii care sunt rezistenți la toate
antibioticele cunoscute) întărește ideea că am intrat în era ¨postantibiotice¨.
De obicei, bolile infecțioase apar ca urmare a două capacități majore a microorgansimelor, determinate
de genele exprimate în plasmida R:

(1) capacitatea agentului patogen să se atașeze și să colonizeze un țesut specific al gazdei
(2) producția de toxine, enzime și alte molecule care scad imunitatea gazdei. Multe bacterii produc, de
asemenea, proteine care inhibă sau distrug specii înrudite sau chiar diferite tulpini ale aceleiași specii.
Acești agenți, numite bacteriocine, sunt analoage cu antibioticele, dar au un spectru mai restrâns de
activitate decât antibioticele. Genele care codifică pentru bacteriocine și proteinele necesare pentru
prelucrarea și transportul acestora sunt, de obicei, găsite în plasmide.
Alte plasmide conferă proprietăți metabolice speciale celulelor bacteriene, cum ar fi capacitatea de a
degrada poluanți toxici.
Substanțele chimice sunt folosite în mod curent pentru a controla creșterea microbiană. Un agent
antimicrobian este un produs chimic natural sau sintetic, care ucide sau inhibă creșterea
microorganismelor.
Compușii care au capacitatea să ucidă microorganismele sunt numiți agenți bactericizi, fungicizi sau
viricizi, în funcție de tipul de microorganism. Există și agenți are nu ucid, ci doar inhibă creșterea
microorgansimelor. Aceștia poartă numele de compuși bacteriostatici, fungistatici și viristatici.
Activitatea antimicrobiană a unui antibiotic se realizează prin măsurarea a 3 parametri, care variază în
funcție de concentrația antibioticului și de timpul său de acțiune:
a. CMA – concentrația minimă activă. Este concentrația la care antibioticul poate induce anumite
perturbări în activitatea metabolică a microorganismelor, fară a afecta capacitatea de multiplicare și
viabilitatea lor
b. CMI – concentrația minimă inhibitorie a unui antibiotic este cea mai mică concentrație care inhibă
complet multiplicarea unei tulpini patogene
c. CMB – concentrația minimă bactericidă a unui antibiotic este concentrația minimă care omoară
tulpina
Din punct de vedere microbiologic, organismele rezistente sunt acelea care posedă orice tip de
mecanism al rezistenței sau gene ale rezistenței. Concentrația minimă inhibitorie (CMI) a unui
antibiotic dă informații cantitative despre susceptibilitatea bacteriană.

De obicei, un organism este considerat susceptibil atunci când CMI este mai mic decât limita indicată
de diversele laboratoare abilitate pentru astfel de standarde (Sockett. și col., 2006).
Înainte de a administra un antibiotic trebuie să cunoaștem CMI determinată in vitro, dar și calitățile
farmacocinetice (de exemplu, posibilitatea realizării concentrației active la nivelul locului de infecție).
Tehnica de evidențiere a sensibilității la antibiotice a unei tulpini microbiene se numeste antibiogramă.
Dupa determinarea spectrului de sensibilitate la antibiotice prin tehnici calitative (tulpina microbiană de
testat este pusă în contact cu diferite antibiotice într-o anumită concentrație), se pot folosi teste
cantitative pentru determinarea valorii CMI (tulpina microbiană este pusă în contact cu concentrații
crescătoare ale aceluiași antibiotic).

Bibliografie
1.Agerso Y ., D. Sandvang (2005) – Class 1 integrons and tetracycline resistance genes în
alcaligenes, arthrobacter, and Pseudomonas spp. isolated from pigsties and manured soil, Appl.
Envirom. Microbiol., 71(12): 7941-7;
2.Aminov, R. I., & Mackie, R. I. (2007). Evolution and ecology of antibiotic resistance genes.
FEMS microbiology letters , 271(2), 147-161.
3.Aminov, R. I., Garrigues-Jeanjean, N., & Mackie, R. I. (2001). Molecular ecology of
tetracycline resistance: development and validation of primers for detection of tetracycline resistance
genes encoding ribosomal protection proteins. Applied and environmental microbiology , 67(1), 22-32.
4.Angelescu Mircea (1998) – Terapia cu antibiotice, Ed. Medicală, București.
5.Atkinson BA, Abu-Al-Jaibat A & LeBlanc DJ (1997) Antibiotic resistance among enterococci
isolated from clinical specimens between 1953 and 1954. Antimicrob Agents Chemother 41: 1598–
1600.
6.Barbosa TM, Scott KP & Flint HJ (1999) Evidence for recent intergeneric transfer of a new
tetracycline resistance gene, tet(W), isolated from Butyrivibrio fibrisolvens, and the occurrence of
tet(O) in ruminal bacteria. Environ Microbiol 1: 53–64.
7.Burton R.W. Gwendolyn and Engelkirk G. Paul (2002) – Microbiology for the Health Sciences,
7th Edition, Chapter 9, Using antimicrobial agents to control microbial growth in vivo, 226-248.
8.Collis H., (1995) – Integrons and Mobile Gene Cassettes, Molecular Microbiolg, .15:593-600;
9.Connell SR, Trieber CA, Stelzl U, Einfeldt E, Taylor DE &Nierhaus KH (2002) The
tetracycline resistance protein Tet(O) perturbs the conformation of the ribosomal decoding centre. Mol
Microbiol 45: 1463–1472.
10.Cousin S, Whittington WL & Roberts MC (2003) Acquired macrolide resistance genes in
pathogenic Neisseria spp. isolated between 1940 and 1987. Antimicrob Agents Chemother 47: 3877–
3880.
11.De Leener E, Martel A, De Graef EM, Top J, Butaye P, Haesebrouck F, Willems R & Decostere
A (2005) Molecular analysis of human, porcine, and poultry Enterococcus faecium isolates and their
erm(B) genes. Appl Environ Microbiol 71:2766–2770.
12.Diaz M.A., Cooper R.K., Cloeckaert A., Siebeling R.J. (2006) – Plasmid-mediated high level
gentamicin resistance among enteric bacteria isolated from pet turtles in Louisiana, Appl.
Envirom.Microbiol, 72 (1): 306-12;
13.Enne VI, Bennett PM, Livermore DM & Hall LM (2004) Enhancement of host fitness by the
sul2-coding plasmid p9123 in the absence of selective pressure. J Antimicrob Chemother 53:958–963.
14.FEDESA (2000) – Antibiotics for animals. A FEDESA perspective on antibiotics, Animal

Health and the Resistance Debate, vol. February: 6;
15.Furushita M., Shiba T., Maeda T., Yahata M., Kaneoka A., Takahashi Y ., Torii K., Hasegawa T.,
Ohta M. (2003) – Similarity of tetracycline resistance genes isolated from fish farm bacteria tothose
from clinical isolates, Appl Envir. Microbiol, 69 (9): 5336-42;
16.Gilliver MA, Bennett M, Begon M, Hazel SM & Hart CA (1999) Antibiotic resistance found in
wild rodents. Nature 401: 233–234.
Hardy, B. (2002). The issue of antibiotic use in the livestock industry: what have we learned?. Animal
biotechnology, 13(1), 129-147.
17.Heinemann J.A. (1999) – How antibiotics cause antibiotic resistance, Drug Discov Today, 4 (2):
72-79;
18.Issam Raad, Hend Hanna et al – Comparative Activities of Daptomycin, Linezolid, and
Tigecycline against Catheter-Related Methicillin-Resistant Staphylococcus Bacteremic Isolates
Embedded in Biofilm Antimicrobial Agents and Chemotherapy, May 2007, p.1656-1660, V ol. 51, No. 5
19.Jackson C.R., Fedorka C.P.J., Barrett J.B., Ladely S.R. (2004) – Effects of tylosin use on
erythromycin resistance in enterococci isolated from swine, Appl. Envirom. Microbiol, 70 (7): 4205-
10.
20.Johnson A.P., Burns L., Woodford N., Threlfall E.J., Naidoo J., Cooke E.M., George R.C.
(1994) – Gentamicin resistance in clinical isolates of Echerichia coli encoded by genes of veterinary
origin, J. Med. Microbiol., 40 (3): 221-6.
21.Kazimierczak KA, Flint HJ & Scott KP (2006) Comparative analysis of sequences flanking
tet(W) resistance genes in multiple species of gut bacteria. Antimicrob Agents Chemother 50: 2632–
2639.
22.Kehrenberg C., Weckenthin C., Schwarz S. (1998) – Tn570, a transposon-like element
fromPasteurella multocida mediating tetracycline resistance, Antimicrob. Agents Chemother., 42 (8):
2116-8;
23.Kuhn F., Cottagnound M., Acosta F., Flatz L., Enteza J., Cottagnound P. (2003) – Cefotaxine
acts synergistically with levofloxacin in experimental meningitis due to penicillin-resistant
pneumococci and prevents selection of levofloxacin resistant mutants in vivo, Antimicrob Agents
Chemother., 47 (8): 2487-91;
24.Lafontaine DL, Preiss T & Tollervey D (1998) Yeast 18S rRNA dimethylase Dim1p: a quality
control mechanism in ribosome synthesis? Mol Cell Biol 18: 2360–2370.
25.Lau SK, Woo PC, To AP, Lau AT & Yuen KY (2004) Lack of evidence that DNA in antibiotic
preparations is a source of antibiotic resistance genes in bacteria from animal or human sources.
Antimicrob Agents Chemother 48: 3141–3146.
26.Lazar, V . (2011). Quorum sensing in biofilms–how to destroy the bacterial citadels or their

cohesion/power?. Anaerobe, 17(6), 280-285.
27.Lazãr, V ., & Chifiriuc, M. C. (2010). Architecture and physiology of microbial biofilms. Roum
Arch Microbiol Immunol , 69(2), 95-107.
28.Lazãr, V ., & Chifiriuc, M. C. (2010). Medical significance and new therapeutical strategies for
biofilm associated infections. Roum Arch Microbiol Immunol , 69(3), 125-138.
29.Lenski RE (1997) The cost of antibiotic resistance – from the perspective of a bacterium. Ciba
Found Symp 207: 131–140.
30.Levy MS, Balbinder E & Nagel R (1993) Effect of mutations in SOS genes on UV-induced
precise excision of Tn10 in Escherichia coli. Mutat Res 293: 241–247.
31.Livermore DM (1996) Are all beta-lactams created equal? Scand JInfect Dis Suppl 101: 33–43.
32.Madigan, M. T., Martinko, J. M., & Parker, J. (2014). Brock biology of microorganisms (V ol.
14). Upper Saddle River, NJ: prentice hall
33.Marble Michelle (1999) – Plasmid DNA associated with specific bands in PFGE patterns of
antibiotic –resistant Salmonella serotype enteritidis, Antimicrobial Agents and Chemotherapy Record
107, 5-7;
34.McDermott P.F., Zhao S., Wagner D.D., Simjee S., Walker R.D., White D.G. (2002) –The food
safety perspective of antibiotic resistance, Anim.Biotehnol., 13(1):71-84;
35.Osterblad M, Leistevuo J, Leistevuo T, Jarvinen H, Pyy L,Tenovuo J & Huovinen P (1995)
Antimicrobial and mercury resistance in aerobic gram-negative bacilli in fecal flora among persons
with and without dental amalgam fillings. Antimicrob Agents Chemother 39: 2499–2502.
36.Osterblad M, Norrdahl K, Korpimaki E & Huovinen P (2001) Antibiotic resistance. How wild
are wild mammals? Nature 409: 37–38.
37.Pang Y , Brown BA, Steingrube V A, Wallace RJ Jr & Roberts MC (1994) Tetracycline resistance
determinants in Mycobacterium and Streptomyces species. Antimicrob Agents Chemother 38:1408–
1412.
38.Ramadhan AA & Hegedus E (2005) Survivability of vancomycin resistant enterococci and
fitness cost of vancomycin resistance acquisition. J Clin Pathol 58: 744–746.
39.Ribera A., Roca I., Ruiz J., Gibert I., Vila J. (2003) – Partial characterization of a transposon
containing the tet (A) determinant in a clinical isolate of Acinetobacter baumannii, J. Antimicrob.
Chemother. 52 (3): 477-80;
40.Salyers AA & Amabile-Cuevas CF (1997) Why are antibiotic resistance genes so resistant to
elimination? Antimicrob Agents Chemother 41: 2321–2325.
41.Salyers AA, Gupta A & Wang Y (2004) Human intestinal bacteria as reservoirs for antibiotic

resistance genes. Trends Microbiol 12: 412–416.
42.Shoemaker NB, Vlamakis H, Hayes K & Salyers AA (2001) Evidence for extensive resistance
gene transfer among Bacteroides spp. and among Bacteroides and other genera in the human colon.
Appl Environ Microbiol 67: 561–568.
43.Slavcovici Adriana (2008). Antibiotic resistance of bacteria involved in severe infections
Romanian Journal of Infectious Disease. Revista Română de Boli Infecțioase 4, 65-72.
44.Sockett D.C., Valley Ann (2006) – Antimicrobial susceptibility testing, Wisconsin Veterinary
Diagnostic Laboratory, April 14;
45.Swartz N. Morton (2000) – Minireview: Impact of antimicrobial agents and chemotherapy, from
1972 to 1998, Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 2000- 2016;
46.Todar K. (2002) – Antimicrobial agents used in treatment of infectious disease, Textbook of
Bacteriology, Wisconsin-Madison,
Van der Poll, T., & Opal, S. M. (2008). Host–pathogen interactions in sepsis. The Lancet infectious
diseases, 8(1), 32-43.