REZISTENȚA LA ANTIBIOTICE A TULPINILOR MICROBIENE IZOLATE DIN DIFERITE PRODUSE PATOLOGICE [306995]

UNIVERSITATEA „DUNĂREA DE JOS” DIN GALAȚI

FACULTATEA DE MEDICINĂ ȘI FARMACIE

MEDICINĂ

LUCRARE DE LICENȚĂ

REZISTENȚA LA ANTIBIOTICE A TULPINILOR MICROBIENE IZOLATE DIN DIFERITE PRODUSE PATOLOGICE

Coordonator științific: Student: [anonimizat]

-2018-

~MULȚUMIRI~

CUPRINS

ABREVIERI

INTRODUCERE

PARTEA GENERALĂ

CAPITOLUL 1: ESCHERICHIA COLI

1.1 Caractere generale

1.2 [anonimizat]

1.3 Patogenie

1.4 Tratament

1.5 Diagnostic de laborator

CAPITOLUL 2: PSEUDOMONAS AERUGINOSA

2.1 Caractere generale

2.2 [anonimizat]

2.3 Patogenie

2.4 Tratament

2.5 Diagnostic de laborator

CAPITOLUL 3: KELBSIELLA

3.1 Caractere generale

3.2 [anonimizat]

3.3 Patogenie

3.4 Tratament

3.5 Diagnostic de laborator

CAPITOLUL 4: STAPHYLOCOCCUS AUREUS

4.1 Caractere generale

4.2 [anonimizat]

4.3 Patogenie

4.4 Tratament

4.5 Diagnostic de laborator

CAPITOLUL 5: ENTEROCOCCUS

5.1 Caractere generale

5.2 [anonimizat]

5.3 Patogenie

5.4 Tratament

5.5 Diagnostic de laborator

PARTEA SPECIALĂ

CAPITOLUL 6: MOTIVAȚIA CERCETĂRII ȘI OBIECTIVE

CAPITOLUL 7: MATERIAL ȘI METODĂ

CAPITOLUL 8: REZULTATE ȘI DISCUȚII

CAPITOLUL 9: CONCLUZII

ABREVIERI

INTRODUCERE

„O [anonimizat], așa cum o cunoastem noi. [anonimizat] a [anonimizat].”

Dr. [anonimizat] a bacteriilor rezistente este o [anonimizat], care au transformat medicina și au salvat milioane de vieți.(1)

La doar 70 [anonimizat]. (2) [anonimizat] o amenințare datorită utilizării excesive și necorespunzătoare a antibioticelor, precum și a nedezvoltării de noi medicamente. (1)

Se estimează că în 2016, la nivel global 700 000 [anonimizat] 10 milioane în următorii 35 [anonimizat] (3). SUA estimează pierderi de până la 100 trilioane dolari până în 2050, dacă eforturile de a opri creșterea alarmantă actuală vor eșua (3).

În Europa rezistența la antimicrobiene a devenit o amenințare severă a sănătății publice și a [anonimizat], [anonimizat], numeroase decese. În 2009, pierderile economice din această cauză au fost estimate la 1.5 miliarde de Euro și decesele evaluate la 25 000. Actualmente, [anonimizat].

În 2014 România se găsea printre țările cele mai vulnerabile în privința rezistenței la antimicrobiene. A înregistrat creșteri semnificative în intervalul 2011-2014 pentru 2 tulpini bacteriene și s-a aflat pe pozițiile dintre cele mai defavorabile pentru alte 2 tulpini dintre țările raportoare Rețelei Europeane de Supraveghere a Rezistenței Antimicrobiene (EARS-Net) . Tot în 2014, se afla într-o poziție critică și în privința consumului total de antibiotice – situația cea mai defavorabilă după Grecia, din totalul acelorași 30 de țări.

Conform datelor EARS-Net, unele dintre principalele tulpini rezistente în spațiul european sunt:

Escherichia Coli rezistentă la aminopeniciline, cefalosporine generația III și rezistență combinată la cefalosporine generația III + fluorochinolone + aminoglicozide.

Pseudomonas aeruginosa rezistentă la trei sau mai multe antimicrobiene din grupele piperacilină + tazobactam, ceftazidimă, fluorochinolone, aminoglicozide și carbapemene.

Klebsiella rezistentă la carbapemene și rezistență combinată la cefalosporine de generația III + fluorochinolone + aminoglicozide.

Staphylococcus aureus rezistent la meticilină, rifampicină și fluorochinolone.

Enterococii rezistenți la ampicilină, aminoglicozide și vancomicină (4).

Având în vedere toate aceste date, am considerat că studiul asupra rezistenței la antibiotice este mai necesar ca oricând și trebuie să constituie o temă de interes general. Efectele cauzate de această problemă afectează aproape toate specialitățile medicale și pot complica actul medical .

Așadar, această amenințare importantă pentru sănătatea publică trebuie analizată, abordată urgent și proactiv. Eforturile coordonate de a implementa noi politici, de a reînnoi acțiunile de cercetare și de a lua măsuri în vederea gestionării crizei, sunt mai necesare ca oricând.

PARTEA GENERALĂ

CAPITOLUL 1: ESCHERICHIA COLI

Germenii ce aparțin acestui grup, sunt microorganisme costituente ale florei normale a corpului, care în anumite condiții, pot avea caracter patogenic pentru om și animale. E. coli reprezintă flora dominantă a intestinului gros având un rol important în menținerea unei fiziologii normale a acestuia și în sinteza unor proteine din grupul B si K.

1.1 Caractere generale

Sunt bacili Gram negativi, nesporulați și în general lipsiți de capsulă, mobili, dar având și tulpini imobile. Au forma unor bastonașe, cu o lungime variabilă între 2 și 3 µ și o grosime de 0,5 µ.

Frotiu produs patologic E. coli

Acești germeni sunt puțin pretențioși, crescând abundent pe mediile de cultură obișnuite: bulion simplu, geloză nutritivă, apă peptonată. Formele „S” însamânțate pe bulion, tulbură uniform mediul, iar pe mediile gelozate, dezvoltă colonii cu diametrul de 2-3 mm, rotunde, bombate, cu margini regulate. Formele „R” ce cresc în bulion, se depun la fundul eprubetei iar cele din mediul gelozat, dau colonii uscate, turtite, cu margini dințate. Pe mediile slab diferențiate, ca AABTL (agar albastru de bromtimol lactoză), prezintă colonii galbene, iar pe mediul Levine (geloză lactozată cu eozină și albastru de metilen) au o culoare negricioasa cu luciu metalic.

Cultură E. coli pe mediul Levine

Aerobi în general, se dezvoltă în condiții optime la 37° si pH 7,2 – 7,6, adaptându-se ușor la variații de temperatură și reacții chimice. Au un bogat echipament enzematic, fermentează glucoza, zaharoza, lactoza, produc indol, produc lizindecarboxilază, nu produc urează, nici fenilalanindezaminază, nu lichefiază gelatina, și pot avea efecte hemolitice și dermonecrotice.

Are o structură antigenică complexă reprezentată de existența a trei antigene, după schema Kauffmann-White: „O” (166 serogrupuri), „K” (98 serotipuri – A, B, L, Vi), „H” (53 serotipuri). Astfel s-au împărțit în grupuri și tipuri serologice. După moartea bacteriei, se eliberează endotoxina (antigenul solubil).

1.2 Rezistența față de factori fizici, chimici și biologici

E. Coli rezistă în mediul extern timp îndelungat. Germenii sunt omorâți de acțiunea termică (60° timp de 40-60 minute). Sunt sensibili la acțiunea dezinfectanților de tipul cloraminei, fenolului sau formolului. De asemenea, sunt sensibili și la acțiunea cloramfenicolului, streptomicinei, la concentrații ridicate de sulfamide, aminoglicozide, chinolone. Posedă un mecanism complex de reglare a metabolismului celulei bacteriene care îi permite să-si asigure o viață usoară: sintetizează doar acele enzime necesare utilizării compusilor din mediu. Va opri sinteza enzimelor necesare obținerii unor metaboliți atunci când acestia sunt prezenți în mediu de unde îi poate folosi ca atare. Este un microorganism care dezvoltă rezistență față de substanțele antibacteriene prin elaborarea de enzime care hidrolizează betalactaminele (penicilinaze, cefalosporinaze) sau prin mutații care afectează porinele devenind astfel rezistente față de aminozide.

1.3 Patogenie

Patogenitatea E. Coli s-a dovedit a fi legată de prezența antigenului „K” și a unor toxine, precum și de producerea hemolizinei și a factorului cititoxic necrotizant. În funcție de determinanții de patogenitate pe care îi au tulpinile de Escherichia coli pot cauza diferite afecțiuni.

La om și la animale, E. Coli se găsește în mod constant la nivelul tractului intestinal. În anumite condiții însă, ea poate dezvolta un caracter patogenic crescut, determinând astfel infecții urinare variate ca intensitate și localizare (cistite, pielite, pielo-nefrite etc.), infecții intestinale (enterite, colite, enterocolite), infecții periintestinale sau perirectale, peritonite, apendicite. Exista 6 patotipuri diareigene: ETEC (enterotoxigen), EHEC (enterohemoragic), EIEC (enteroinvaziv), EAggEC (enteroagregativ), EPEC (enteropatogen) și DAEC (enteroaderent difuz). E. Coli stă la baza etiologiei diareei maligne a nou-născutului. Boala este carcaterizată de deshidratare masivă și pierdere în greutate. Manifestat în primele zile de viață, prezintă o gravitate deosebită, atingând o mortalitate de pâna la 50-80%.

Odată pătruns în torentul circulator, bacteria poate da complicații generalizate (septicemii) sau localizate la nivelul diferitelor organe (plămân, endocard, cai biliare, meninge). Aceasta mai poate da și faringite, otite și conjunctivite.

Răspunsul imun al organismului este slab. Aceste infecții prezintă o tendință de cronicizare și recidivă.

1.4 Tratament

Tratamentul principal se face conform antibiogramei. Se mai poate administra ser anticolibacilar sau vaccin anticolibacilar. În plus și tratamentul cu bacteriofag anticoli poate da rezultate bune în aplicațiile locale.

1.5 Diagnosticul de laborator

Diagnosticul de laborator este bacteriologic si se bazează pe identificarea tulpinilor de Escherichia coli în variate produsele patologice: sânge, urină, materii fecale, bilă, puroi, exsudate, lichid cefalo-rahidian, alimente, vărsături, probe de organe recoltate de la cadavru.

Diagnosticul de laborator presupune cultivarea pe medii pentru enterobacterii.

Hemocultura – în starile septice, sângele se recoltează în condiții de perfectă sterilitate și se însămânțează la patul bolnavului în bulion simplu. Acest mediu însămânțat se introduce la termostat la 37°C timp de 18-24 ore. Ulterior, se practică o trecere pe mediul solid (gelozat), urmată de incubare la 37°C (18-24 ore) și identificare pe baza caracterelor morfologice, enzimatice, serologice. În cazul în care mediul este steril, se vor face treceri oarbe timp de 7 zile sau treceri pe medii adecvate dacă au fost înregistrate creșteri. Dacă după 7 zile nu se înregistrează nicio crestere, atunci rezultatul hemoculturii e considerat a fi negativ.

Coprocultura – materiile fecale sunt însămânțate fără îmbogățire prin dispersii pe medii solide selective slabe sau medii care să conțină lactoză și un indicator de pH (AABTL, Mc Conkey, Levine). Apoi se face indentificarea biochimică și serologică a tulpinei.

Urocultura – urina se rezoltează din mijlocul jetului în condiții aseptice. Se însămânțează pe mediile solide anterior amintite, dacă pe placă se dezolvă un număr de cel puțin 105 UFC/ml de colonii cu aceeași morfologie, se va replica o singură colonie pentru obținerea unei culturi pure, apoi se va trece pe mediile politrope pentru identificare biochimică și serologică.

După fiecare indentificare se va face antibiograma.

CAPITOLUL 2: PSEUDOMONAS

Pseudomonas aeruginosa reprezintă cea mai importantă specie, fiind numit și bacilul piocianic. Sunt bacili Gram negativi, foarte răspândiți în natură, de unde ajung pe tegumente, în cavitățile naturale și la nivelul tubului digestiv atat la om cât și la animale. Infecțiile cu bacilul piocianic se izolează frecvent în mediul intraspitalicesc, putând genera infecții nozocomiale grave.

Frotiu produs patologic Pseudomonas

2.1 Caractere generale

Sunt bacili Gram negativi, subțiri, drepți, cu o lungime de 2µ și o lățime de 0,5µ, dispuși izolați, în perechi sau în lanțuri scurte. De asemenea sunt în general mobili, nesporulați, necapsulați, în general aerobi.

B. piocianic crește ușor pe mediile obișnuite, elaborând pigment solubil în apă și difuzibil în mediul de cultură. Este în general arob și crește pe medii simple sub formă de colonii „S” sau „M” când sunt încapsulați. În bulion simplu sau apă peptonată, se observă o tulburare, formându-se o peliculă la suprafață care după câteva zile se îngroașă, se pliază, se fragmentează și cade la fund, iar mediul devine filant și vâscos. Pe geloză simplă crește sub formă de colonii rotunde, convexe, fluorescente, cu reflex metalic de culoare galben – verzui (în culturile tinere), iar după câteva zile pigmentul devine rosu, galben sau negru brun. Cultura de Ps. Aeruginosa asemănător florii de tei, datorită O-aminoacetofenei. Pe medii cu sânge, coloniile sunt gri, lucioase și produc hemoliză de tip beta, intensificată de temperatura camerei.

Cultură Pseudomonas pe geloză sânge Cultură Pseudomonas pe geloză simplă

Oxidează glucoza dar nu fermentează zharoza, lactoza, galactoza, glicerolul si amidonul. Reduce nitrații la nitriți. Reacția catalazei este pozitivă iar reacția indolului negativă. Unele tulpini au capacitatea de a produce o varietate de toxine, enzime și un factor de permeabilitate vasculară care contribuie la patogenitatea și virulența germenului. B. piocianic elaborează o serie de pigmenți ce au rol în respirația bacteriei:

– Piocianina este un pigment albastru, caracteristic doar speciei Ps. aeruginosa.

– Pioverdina este un pigment galben-verde fluorescent, produs de mai multe specii ale genului Pseudomonas.

– Piorubina este un pigment roșu elaborată de unele tulpini.

– Piomelanina este un pigment brun, rar întâlnit la tulpinile de Ps. aeruginosa.

O tulpina, poate elabora unul sau mai mulți pigmenți. Astfel, pe baza acestei proprietăți, s-au pus în evidență mai multe rase de bacili piocianici, cu stabilitate diferită.

2.2 Rezistența față de factori fizici, chimici și biologici

B. piocianic este distrus de căldură, în 15 minute, la 60°C. Are o rezistență bună în mediul extern, la uscăciune, la acțiunea razelor ultraviolete și la alcool. Este distrus de dezinfectante și antiseptice uzuale (fenol si formol). Are o rezistență crescută la majoritatea antibioticelor, dar poate fi sensibil la carbenicilină, mezlocilină, ticarcilină, ticalcilină – acid clavulanic, piperacilină, tobramicină, amikacină, imipenem, aztreonam, fluorochinolone sau cefalosporine de generația a treia (ceftazidim, cefsulodin). Rezistența naturală față de antibiotice este datorată impermeabilității membranei externe si producerii unei beta-lactamaze inductibile. Rezistența dobândită apare prin 2 mecanisme care uneori au acțiune sinergică:

– Structura lipopolizaharidului membranar este heterogenă, porinele membranei externe, al căror număr si dimensiuni variază, condiționează permeabilitatea pentru antibiotice.

– Posedă numeroase plasmide transferabile prin conjugare sau prin transducție si mare parte a tulpinilor sunt lizogene. Se explică astfel numeroasele variații genetice ale tulpinilor de Pseudomonas aeruginosa, în special în ceea ce priveste polirezistența față de substanțele antibacteriene.

Se recomandă antibiograma.

2.3 Patogenitate

Ps. aeruginosa determină la om o mare diversitate de forme clinice, în funcție de virulența germenului și de posibilitățile de apărare a organismului. Caracterul de patogenitate este dat de multiplicare la poarta de intrare și mai puțin de toxigeneză. Afectează cu precădere persoanele cu sistemul imunitar în suferință. În infectiile la suprafață, cele cutanate, determina suprainfectarea unor plagi, supurație, ulcerație, întârziind cicatrizarea sau poate evolua rapid cu septicemie și moarte. Poate provoca meningite, infecții urinare, infecții digerstive, toxiinfecții alimentare, otite, sinuzite, faringite, infecții ale aparatului respirator (abces pulmonar, bronșită, pneumonii, bronhopneumonii, pleurezii, empieme), infecții ale aparatului circular (endocardită, pericardită, coronarite, arterite), infecții ale aparatului locomotor (osteomielita, artrite), infecții oculare (conjunctivite, keratite, ulcere corneene, infecții oculare postoperatorii), colecistite, angiocolite, metrite, febra puerperală, tiroidita necrozantă metastatică.

Persoanele cu sistem imun integru se apără față de colonizarea cu Pseudomonas aeruginosa prin mecanisme nespecifice: fagocitoză si complement seric. Mijloacele apărării nespecifice pot fi depăsite în urma ingestiei sau inoculării unei cantități mari de germen sau a unei tulpini foarte virulente. În aceste cazuri infecția se instalează și se generalizează înainte ca organismul să dezvolte un răspuns imun specific. Răspunsul imun este slab, de tip umoral.

2.4 Tratament

Antibioterapia, în funcție de antibiogramă, se face cu colimicină, neomicină, gentamicină, amikacină, tobramicină, carbenicilină, ticarciclină, polimixină B și cefsulodin, singure sau în asociație. Ca antiseptic, se utilizează acidul boric 1%, in tratamentul plăgilor supurate, dar și acidul acetic sau acidul mandelic. În infecțiile locale cu Ps. aeruginosa rezistent la antibiotice, are un rezultat bun vaccinul piocianic monovalent. În infecțiile generalizate, se recomandă aplicarea precoce a imunoterapiei combinată cu antibioterapie.

2.5 Diagnosticul de laborator

Se efectuează prin însămânțarea produsul patologic prin dispersie pe mediile uzuale (geloză) sau speciale. Pentru identificare se trece va face cercetarea caracterelor morfologice, biochimice si de metabolism, dintre care amintim: pigmentogeneza, mirosul caracteristic trimetilamina, creșterea la 41 – 42°C, capacitatea de a oxida gluconatul de potasiu în cultura agitată, lichefierea gelatinei și reacția citocromixidazei. După identificarea tulpinei se recomandă antibiograma deoarece acest gen capată ușor rezistențe la antibiotice si chimioterapice. Din această cauza, este foarte dificil de tratat infecția cu bacilul piocianic și ar putea fi necesar vaccinul antipiocianic sau chiar un autovaccin obținut din tulpina izolată.

CAPITOLUL 3: KELBSIELLA

În acest grup sunt cuprinși o serie de germeni condiționat patogeni ai tubului digestiv și ai căilor respiratorii superioare, care în anumite condiții favorizante pot provoca boli. K. pneumoniae este larg răspândită în natură dar este întalnită frecvent și în mediul intraspitalicesc, îndeosebi la copilul ce a urmat tratament prelungit cu antibiotice cu spectrul larg.

Frotiu produs patologic Klebsiella

3.1 Caractere generale

Acest gen apartine familiei Enterobacteriaceae și se prezintă sub formă de bacili scurți (1-2µ lungime și aproximativ 1µ lățime), cu capete rotunjite, Gram negativi, imobili, nesporulați, care de obicei posedă capsulă. Germenii acestui grup cuprind mai multe specii patogene pentru om:

– Klebsiella pneumoniae (izolat în infecțiile tractului respirator si urinar)

– Klebsiella ozaenae (izolat la pacienții suferind de ozenă)

– Klebsiella rhinoscleromatis (incriminat in etiologia rinoscleromului)

Enterobacteriile din genul Klebsiella cresc abundent la 37°C, timp de 18-24 ore, pe medii uzuale, fără cerințe nutritive speciale. În bulion, tulbură mediul după 24 de ore, formând la suprafață un inel care mai apoi se depune la fundul tubului, iar mediul capătă aspect gelatinos. Pe geloză dezvoltă colonii mari (2-4mm), alb cenușii, confluente, cu aspect mucos, vâscoase. Pe AABTL produc colonii cu aspect de picătura de miere (galbene, lucioase, care se scurg ușor).

Cultură Klebsiella pe geloză lactozată

Sunt aerobe și anaerobe facultativ. Se dezvoltă optim la 37°C, fermentează cu producere de gaz glucoza, inozita, glicerolul, celobioza, amidonul insolubil si fără producere de gaz lactoza, zaharoza și manita. Nu produce indol și H2S, nu lichefiază gelatina, reduc nitrații la nitriți și elaborează lizindecarboxilază. De asemeni, formează acetil-metil-carbinol (reacția Voges-Proskauer pozitivă), descompun ureea si crește în prezența malonatului de sodiu si a citratului.

În grupul Klebsiella se cunosc trei feluri de antigene: un atigen somatic „O” reprezentativ pentru formele „S”, un antigen somatic „R” pentru formele „R” și un antigen capsular „K”. Pe baza schemei de diagnostic propusă de Kauffmann și Ørskov s-a făcut o împărțire în 5 grupe serologice și 77 de serotipuri de tip „K”. Agentul solubil este endotoxina. Între antigenele de grup „O” de la Klebsiella si Escherichia există multiple înrudiri.

3.2 Rezistența la agenți fizici, chimici și biologici

Rezistența la agenți fizici și dezinfectanți este similară cu cea a salmonelelor. Klebsielele sunt omorâte prin încălzire la 55-60°C, timp de 30 de minute. În natură pot rezista multe saptămani, chiar luni dacă au temperatură și condiții favorabile. Sunt sensibile la antiseptice în concentrații obișnuite, aureomicină, teramicină și polimixină B și mai puțin sensibile față de streptomicină și cloramfenicol. Sunt rezistente la acțiunea penicilinelor și a sulfamidelor. Klebsiella spp. este sensibilă la cefalosporinele de generația a III-a, floxacine, colimicină si gentamicină.

3.3 Patogenie

Se regăsesc tipuri saprofite și tipuri cu o virulență marcată, ce nu pare să depindă de prezența capsulei deoarece sunt descrise și tulpini necapsulate cu o virulență crescută. Klebsiella pneumoniae este incriminată în etiologia proceselor pneumonice, bronșite, pleurezii, angine, rinite, otite, conjunctivite, dacriocistite, meningite, colecistite, apendicite, septicemii. K. pneumoniae și K. oxytoca sunt întâlnite în cazurile bolii diareice la copil și adult, în infecții nosocomiale, pneumonii și infecții urinare. K. ozaenae și K. rhinoscleromatis pot determina afecțiuni în sfera ORL.

3.4 Tratament

Aproape toți membrii acestui gen sunt rezistenți la antibiotice betalactamice: penicilină, ampicilină, amoxicilină. Sunt frecvent sensibile la acțiunea cefalosporinelor, ceea ce le recomandă ca tratament de primă intenție în infecțiile date de Klebsiella spp. Totusi, în ultimii ani, s-au izolat tulpini de K. pneumoniae rezistente la cefalosporine, rezistență datorată prezenței unui grup de enzime numit „β-lactamaze cu spectru larg”, prescurtarea cunoscută fiind „SKBLs”. Tulpinile de K. pneumoniae care produc SKBLs sunt notate SKBL-KP. Aceste enzime au capacitatea de a inactiva cefalosporinele prin clivarea inelului β- lactamic al medicamentului. Genetic, producerea acestor enzime este codificată plasmidic.

Oricum, tratamentul infecțiilor cu Klebsiella spp. nu trebuie să fie empiric, ci bazat pe rezultatele antibiogramei.

3.5 Diagnosticul de laborator

În cazurile sede infecții cu Klebsiella se practică diagnosticul bacteriologic ce presupune izolarea și identificarea agentului etiologic din diverse prelevate. Cele mai des investigate sunt materiile fecale, urina, sputa, exudatul nazo-faringian și exudatele purulente. Datorită particularităților lor morfologice (capsula), examenul direct pe frotiuri colorate permite recunoașterea cu ușurință a klebsielelor. Însămânțarea pe medii obișnuite sau pe medii lichide face posibilă obținerea germenilor în culturi pentru o identificare ulterioară pe baza caracterelor biochimice și serologice. Tipizarea serologică se realizează prin folosirea fenomenului de umflare a capsulei, dupa schema propusă de Kauffman și Ørskov. Datorită acestei scheme s-a observat că serotipurile K4, K12, K16 și K18 sunt cele mai des întâlnite infecții extraenterale din țara noastră. În tabelul de mai jos (după Wilson și Miles, 1957) apar diferențele bichimice între K. pneumoniae, K. ozaenae și K. rhinoscleromatis.

CAPITOLUL 4: STAFILOCOCUL AURIU

Stafilococul auriu (lat. Staphylococcus aureus) este o bacterie patogenă din genul Staphylococcus, care poate produce grave la om și animale. Se deosebește de alte specii ale genului prin faptul că este coagulazo-pozitiv.

Colonizează nările si colonul de unde poate contamina tegumentul. Există starea de purtători sănătosi de Staphylococcus aureus fiind întâlnit mai ales portajul nazal, în proporție de 10-40% în colectivități si până la 40-70% în spital.

4.1 Caractere generale

Stafilococii sunt coci Gram-pozitivi, nesporulați, necapsulați. Pe frotiu efectuat din cultură pe mediu solid stafilococii apar dispusi în grămezi neregulate asemănătoare cu ciorchinii de strugure. Pe frotiul efectuat din cultură în mediu lichid sau din produs patologic stafilococii sunt dispusi extracelular, în lanțuri scurte, perechi sau coci izolați.

Frotiu produs patologic S. aureus

Sunt germeni nepretențiosi care pot fi cultivați pe medii nutritive simple dar și pe medii complexe. Mediile se incubează timp de 18-24 ore, la temperatura de 35-37șC, în aerobioză. Creste sub formă de colonii „S” pe medii solide; în medii lichide produce tulburare uniformă cu depozit moderat la fundul tubului. Stafilococii produc pigment nedifuzibil, care colorează doar colonia bacteriană nu și mediul de cultură, de culoare galben-auriu (S.aureus), albă (S.epidermidis) sau galben-citrin (S.saprophyticus). Pigmentogeneza (caracter variabil) este mai intensă la temperatura camerei si în prezența oxigenului. Pe mediile cu sânge apare hemoliză beta (datorată hemolizinei alfa) sau „cald-rece” (datorată hemolizinei beta).

Cultură S. aureus pe geloză simplă

Cultură S. aureus pe geloză sânge

Sunt germeni catalazo-pozitivi, oxidazo-negativi. Fermentează glucoza, manitolul, lactoza, zaharoza etc. cu producere de acid. Hidrolizează proteinele animale native: hemoglobina, fibrina, cazeina, gelatina etc., descompun fosfolipoproteinele.

În tabelul alăturat se clasifică structura lor antigenică.

4.2 Rezistența la agenți fizici, chimici și biologici

Stafilococii sunt rezistenți față de condițiile din mediul extern. Rezistă în culturi, la frigider câteva luni; în puroi uscat–2-3 luni. Sunt relativ rezistenți la antiseptice si dezinfectante (30’ la alcool 70ș; 10’ la fenol 2%), la radiații gamma, la acțiunea coloranților (violet de gențiană, fuxina acidă, verde malachit etc.). Pot fi distrusi în 60 minute la temperatura de 60șC, sunt sensibili la bacteriofagi, la radiațiile UV. Stafilococii sunt deosebit de rezistenți la antibiotice. Peste 95% din stafilococi sunt rezistenți la penicilină. Tulpinile de stafilococi rezistente la meticilină (oxacilină) sunt tulpini polirezistente exteriorizând rezistență concomitentă față de cefalosporine, eritromicină, clindamicină. Sunt încă sensibili la vancomicină desi în unele țări (Franța) au fost semnalate deja tulpini rezistente si față de acest antibiotic de rezervă.

4.3 Patogenie

Atributele de patogenitate, virulenta si toxinogeneza nu au putut fi individualizate distinct, mecanismele de agresivitate declanșându-se intr-o succesiune complexa de reacții biochimice care se întrepătrund si in care diversele enzime si toxine acționează ca inele dintr-o reacție biochimica ramificata si nu ca factori individuali de patogenitate.

Stafilococul auriu este implicat mai frecvent în infecții ale tegumentelor si mucoaselor cu potențial de generalizare si cu formare de puroi (infecții supurative). Determină următoarele procese infecțioase de tip invaziv:

– Foliculita (infecția foliculului pilos);

– Furuncul (abces în jurul foliculului pilos);

– Carbuncul sau furuncul antracoid (extinderea infecției la mai multe unități piloseba- cee si la țesutul celular subcutanat);

– Hidrosadenită (infecția glandei sudoripare);

– Panarițiu (infecție peri- sau subunghială);

– Mastită (infecția glandei mamare);

– Impetigo (infecție a epidermei, mai ales la copii mici, localizată pe față sau pe membre);

– Infecții ale plăgilor chirurgicale, muscate, tăiate;

– Angina stafilococică ce se poate complica cu otite, mastoidite, sinusite etc.;

– Infecții urinare, uretrită, cistită, pielonefrită;

– Anexite, infecții uterine post-abortum;

– Bacteriemie, septicemie, focare septicemice metastatice (apărute în urma disemină- rii de la nivelul focarului de infecție primar cu constituirea de metastaze septicemice viscerale:

· pulmonar – pleurezie, pneumonie;

· renal;

· osos, articular – osteomielita, artrite septice;

· meningo-cerebral;

· aparat cardio-vascular

· endocard – endocardita stafilococică (mortalitate 50%);

· pericard, endoteliu vascular.

Deosebit de periculoasă este infecția stafilococică cu localizare nasogeniană (stafilococia malignă a feței) din cauza riscului de apariție a tromboflebitei faciale cu extindere endocraniană prin intermediul sinusului cavernos;

De asemenea poate cauza și toxiinfecție alimentară stafilococică. Aceasta se datorează ingestiei enterotoxinei termorezistente (rezistă 30 minute la 100șC) elaborată în aliment de tulpini enterotoxigene de Staphylococcus aureus. Debutul este brusc, după o latență de 1-3 ore (3-6 ore), fără febră, cu colici abdominale, grețuri, vărsături, diaree apoasă. Refacerea este spontană si completă în 1-2 zile prin eliminarea toxinei din organism.

Tot de etilogie stafilococică, sunt și toxiinfecțiile cutanate:

– „Sindromul pielii opărite stafilococice”, cunoscut si sub denumirea de boala exfoliativă generalizată (boala Ritter), este necroza de origine toxică (toxina exfoliativă) a epidermului. Apare inițial eritem perioral care se extinde apoi la tot corpul. Apariția bulelor mari cu lichid clar este urmată de ruperea straturilor superficiale ale epidermei. Vindecarea are loc la intervale de 10 zile de la apariția anticorpilor protectori.

– Impetigo bulos este forma localizată a bolii Ritter.

– Sindrom de soc toxic stafilococic (STTS): hipertermie, hipotensiune, vărsături, diaree, mialgii, conjunctivită, insuficiență hepatică si renală acută, rash scarlatiniform, descuamarea tegumentelor palmare si plantare, stare de soc. Inițial apariția acestui sindrom a fost legată de utilizarea tampoanelor intravaginale ca mai apoi să se identifice si după infecții ale plăgilor chirurgicale, după osteomielite, abcese, pneumonii stafilococice postgripale etc.

Infecțiile respiratorii cu stafilococ pot fi localizate oriunde la nivelul tractului, determinând: rinofaringite, faringo-amigdalite, traheite, bronșite, pneumonii, empiem, sinuzite.

S. aureus ajunge la nivelul sistemului nervos central fie pe cale hematogenă, fie prin extindere directă de la o infecție a țesuturilor vecine, determinând abces cerebral, meningită purulentă, empiem subdural, abcese epidurale spinale sau tromboflebită intracraniană septică.

Stafilocul auriu este una dintre cauzele cele mai frecvente de endocardită bacteriană acută, atât pe valve native, cât și pe protezele valvulare, valvele cele mai frecvent afectate fiind valvele mitrale și aortice. Endocardita stafilococică are o rată crescută de mortalitate (40-60%), atât prin tulburările cardiace pe care le antrenează, cât și prin diseminarea hematogena a infecției cu apariția septicemiei, meningitei, abceselor cerebrale și abcese în diferite alte organe etc.

În ce privește infecțiile musculo scheletale, S. aureus poate determina: osteomielită, artrită septică și polimiozită.

Stafilococii coagulază negativi (SCN) sunt patogeni oportunisti, caracter apărut în decursul ultimelor decenii ca urmare a utilizării pe scară largă a unui număr tot mai mare de proceduri medicale invazive (sonde, catetere) si a inserțiilor protetice (valve cardiace, proteze vasculare, proteze articulare etc.).

– S.epidermidis are cel mai înalt potențial patogen dintre SCN fiind agentul etiologic major al infecțiilor nosocomiale. A fost izolat de la pacienți cu bacteriemie, mediastinită, infecții articulare, infecții urinare, cistite, uretrite, pielonefrite etc. Este un germen periculos pentru pacienții din secțiile de chirurgie cardio-vasculară, dializă, nou-născuți, ortopedie, pe de o parte prin infecțiile de pace-maker, de grefă vasculară, de valve protezate, ale protezelor articulare și prin spectrul de rezistență față de antibiotice pe de altă parte.

– S.saprophyticus este frecvent agent etiologic al infecțiilor de tract urinar la femei tinere, uretritelor negonococice, prostatitelor, infecțiilor de plagă, septicemiilor.

– S.haemolyticus poate cauza endocardite, septicemii, peritonite, infecții de tract urinar, de plagă chirurgicală, infecții ale oaselor si articulațiilor.

– S.lugdunensis colonizează cateterele, tuburile de dren cauzând endocardite pe proteze valvulare sau chiar pe valve indemne, septicemii, infecții ale protezelor vasculare, infecții cutanate si ale plăgilor, abcese cerebrale, peritonite etc.

– S.schleiferi colonizează cateterele, tuburile de dren cauzând empiem cerebral, bacteriemie, infecții de cateter, infecții de plagă etc.

4.4 Tratament

În infecțiile minore nu este necesară antibioterapia sistemică fiind suficient drenajul chirurgical al leziunii, aplicații topice cu acid fusidic, bacitracină etc. Pentru purtătorii asimptomatici de Staphylococcus aureus care lucrează în domeniul sanitar, de alimentație, în colectivități de copii este indicată aplicarea în cavitatea nazală anterioară a pomezilor antistafilococice de tipul Mupirocin pentru a preîntâmpina răspândirea stafilococului patogen în anturajul lor. În infecțiile severe este necesară antibioterapia condusă după antibiogramă cu doze mari de antibiotic pentru a asigura concentrația bactericidă a antibioticului în focar înaintea selectării de clone rezistente.

4.5 Diagnostic de laborator

Produsul de examinat variază în raport cu sindromul clinic: puroi, spută, materii fecale, probe de alimente, sânge, urină etc. Din prelevatele necontaminate se realizează frotiuri colorate Gram si examinate la microscopul optic. Izolarea stafilococului se face pe geloză-sânge, sau pe mediul hiperclorurat pentru produsele intens contaminate. La baza identificării izolatelor stau caracterele morfo-tinctoriale, de cultură, a testului catalazei si coagulazei.

CAPITOLUL 5: ENTEROCOCI

Au fost inițial clasificați în sistemul Lancefield ca streptococi de grup D, mai apoi s-a recomandat ca termenul “enterococi” să fie utilizat în mod specific pentru streptococii care se dezvoltă atât la 10°C cât și la 45°C, la un pH de 9.6, în prezența NaCl 6.5%, supraviețuiesc la 60°C timp de 30 de minute și hidrolizează esculina. Cuprind trei specii: E. faecalis, E. faecium, E. bovis.

Se regăsesc la om și animal în flora comensală a tractului digestiv si genito-urinar, de unde ajung în mediul extern. Pot fi prezenți și în tractul biliar ceea ce arată capacitatea lor de a supraviețui la concentrații mari de bilă.

Enterococii au o rezistență mare la antibiotice, fiind considerați microorganisme care provoacă cele mai grave infecții nosocomiale.

Frotiu produs patologic Enterococcus

5.1 Caractere generale

Enterococii sunt sferici, ovalari sau cocobacilari așezați în perechi sau lanțuri scurte, Gram pozitivi, în majoritate imobili, necapsulați, nesporulați.

Produc hemoliză pe mediile cu geloză-sânge iar pe agar cu bilă-esculină și azidă de sodiu, coloniile sunt albe-cenușii cu halou negru. Pentru izolarea enterococilor din produse patologice contaminate se folosesc medii de cultură selective: agar bilă-esculină-azid sau agar Columbia cu supliment de colistin si acid nalidixic. Pe mediile solide formează colonii de tip S α-, β- sau nehemolitice.

Cultură Enterococcus pe geloză sânge Cultură Enterococcus pe mediu ABE

Sunt bacterii catalază si oxidază negative. Cresc în bulion îmbogățit cu 6,5% NaCl, hidrolizează esculina în prezența a 40% bilă sau săruri biliare, produc pyrolidonyl-arylamidază, leucinaminopeptidază. Pe baza fermentării manitolului, sorbozei, sorbitolului si a capacității de hidroliză a argininei, enterococii sunt clasificați în 5 grupe în cadrul cărora speciile se diferențiază în funcție de fermentarea arabinozei, rafinozei si zaharozei.

În ce privește structura antigenică, toate speciile ce aparțin genul Enterococcus au un antigen de suprafață care corespunde serogrupului D în clasificarea Lancefield a streptococilor.

5.2 Rezistența față de factori fizici și chimici

Germenii din genul Enterococcus au o capacitate deosebită de a supraviețui în variate condiții adverse. Sunt foarte rezistenți la antibiotice ceea ce pune probleme deosebite în mediul de spital transformându-i în importanți agenți etiologici ai infecțiilor nosocomiale.

Enterococii sunt în mod natural rezistenți la cefalosporine, sulfamide, lincosamide, aztreonam, clindamicină, trimetoprim-sulfametoxazol si față de dozele uzuale de aminoglicozide. Au o mare capacitate de a dobândi rezistență față de unele antibiotice: rezistență de nivel înalt față de aminoglicozide, penicilină si vancomicină. Au toleranță față de antibioticele cu acțiune pe peretele celular (penicilină, vancomicină) care doar le inhibă nu le distrug. Față de penicilină au dezvoltat 2 mecanisme de rezistență: prin betalactamază si prin modificarea afinității proteinei de legare a penicilinei (PLP5). Penicilinele de semisinteză au efect bacteriostatic asupra enterococilor. Rezistența dobândită față de vancomicină are implicații serioase asupra tratamentului si controlului infecțiilor cauzate de tulpini de enterococ vancomicinorezistent (VRE).

5.3 Patogenie

În patogenitatea tulpinilor de enterococ sunt implicați următorii factori de virulență:

– Hemolizina / bacteriocina (acționează ca bacteriocină asupra altor coci Gram pozitivi);

– Factorul de agregare (determină agregarea enterococilor, poate media aderența enteroco- cilor la celulele epiteliului urinar și la țesutul endocardic);

– Gelatinaza (prezentă în procesul endocarditei);

– Acidul lipoteichoic (determină un răspuns inflamator exagerat din partea gazdei).

Enterococii sunt bacterii condiționat patogene care pot determina: infecții ale tractului urinar (nosocomiale sau comunitare), endocardită subacută, infecții mixte ale plăgilor chirurgicale sau ale ulcerelor de decubit, peritonite, infecții biliare, abcese intraabdominale.

Specia mai frecvent implicată în patologia umană este E.faecalis (90%) urmată de E.faecium (8%).

5.4 Tratament

Tratamentul infecțiilor cauzate de enterococi este indicat a se face sub controlul antibiogramei dată fiind rezistența acestora față de acțiunea substanțelor antibacteriene. În infecțiile urinare poate fi utilă nitrofurantoina sau fluorochinolonele. Este utilă asocierea unui antibiotic cu acțiune asupra peretelui celular cu un aminoglicozid datorită efectului sinergic si bactericid al acestei asociații. Pentru tulpinile vancomicino-rezistente sunt disponibile 2 antibiotice noi, quinuprisin/dalfopristin si linezolid, desi s-au semnalat deja tulpini rezistente si față de aceste substanțe antimicrobiene.

5.5 Diagnosticul de laborator

Produsele patologice din care poate fi izolat enterococul sunt urina, materiile fecale, secreții din plăgi. Semnificația clinică a prezenței enterococilor în prelevatele patologice trebuie stabilită cu grijă dată fiind usurința cu care contaminează prelevatele. Examenul microscopic este util pentru prelevatele în mod curent sterile. Izolarea bacteriei se face pe agar cu sânge de berbec sau pentru prelevatele contaminate pe medii selective: agar bilă-esculină-azid sau medii cu supliment selectiv colistin+acid nalidixic pe care sunt inhibate bacteriile Gram negative. Identificarea se face pe baza caracterelor microscopice, biochimice. Identificarea preliminară se face pe baza următoarelor reacții pozitive: testul la bilă esculină; toleranța la 6,5% NaCl, producerea de pyrolidonylarylamidază, leucinaminopeptidază, sensiblitate la vancomicină. Identificarea definitivă are la bază caracterele fenotipice: fermentarea zaharurilor, hidroliza argininei, testul toleranței la telurit, testul mobilității, pigmentația, utilizarea piruvatului din mediul de cultură

Obligatoriu, după izolarea si identificarea tulpinii de enterococ se efectuează antibiograma testând antibiotice beta-lactamice, aminoglicozide, glicopeptide. Este indicată deteminarea CMI si a producerii de beta-lactamază în vederea conducerii unui tratament eficient care să ducă la vindecarea pacientului si totodată să evite selectarea de tulpini rezistente.

PARTEA SPECIALĂ

CAPITOLUL 6: MOTIVAȚIA CERCETĂRII ȘI OBIECTIVE

6.1 Motivația cercetării

„Dacă nu suntem atenți, în scurt timp vom fi într-o eră post-antibiotice … și pentru anumiți pacienți și anumiți microbi, suntem deja acolo.”

Tom Frieden – Director of the CDC)

Bacteriile multidrug rezistente (MDR) sunt recunoascute ca una dintre cele mai importante probleme actuale din sănătatea publică. Societatea de Boli Infecțioase din America (IDSA) afirmă că rezistența antimicrobiană este "una dintre cele mai mari amenințări la adresa sănătății umane la nivel mondial" (5).

Mai multe probleme stau la baza pericolului determinat de creșterea bacteriilor MDR. Primul și cel mai important, rezultatele la pacienții infectați cu bacterii MDR sunt mai rele comparativ cu pacienții infectați cu organisme mai sensibile (6,7). Atfel, creșterea ratelor de rezistență antibacteriană are un impact negativ asupra tuturor aspectelor medicinei moderne și amenință cu scăderea randamentului multor realizări, cum ar fi îngrijirea cancerului, transplantul și procedurile chirurgicale (8). În al doilea rând, costurile extraordinare sunt asociate cu aceste infecții. În Statele Unite, costurile suplimentare anuale asociate infecțiilor cauzate de organismele rezistente în comparație cu organismele susceptibile sunt estimate între 21 și 34 miliarde de dolari1. În al treilea rând, prevalența anumitor bacterii MDR este strâns legată de utilizarea antibioticelor cu spectru larg, atât pentru terapia empirică, cât și pentru terapia definitivă (9). Această utilizare crescută duce la rândul ei la rate mai mari ale bacteriilor MDR, creând astfel un ciclu vicios. .

De obicei, bacteriile MDR sunt asociate cu infecții nosocomiale. Cu toate acestea, unele bacterii MDR au devenit cauze destul de răspândite ale infecțiilor dobândite în comunitate.

Studiile de specialitate efectuate în ultimele decenii au raportat un număr tot mai mare de infecții, ceea ce face ca testarea sensibilitățiii/rezistenței bacteriilor la antibiotice sa fie una dintre cele mai importante proceduri de laborator în privința managementul bolilor infecțioase. De asemenea, apariția și amplificarea rezistenței la antibiotice a microorganismelor împreună cu efectele ce survin în urma lor, impun un studiu riguros si continuu asupra acestei probleme.

6.2 Obiectivele cercetării

Scopul studiului a constat în determinarea prevalenței infecțiilor cu E. Coli, Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella, Staphylococcus aureus și Enterococcus , în rândul populației infantile, precum și determinarea rezistenței la antibiotice a acestor tulpini microbiene izolate din diferite produse patologice.

Obiectivele lucrării sunt:

Determinarea prevalenței infecțiilor cu E. Coli, Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella, Staphylococcus aureus și Enterococcus la copiii din Județul Galați;

Izolarea și identificarea corectă a tulpinilor de E. Coli, Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella, Staphylococcus aureus și Enterococcus implicate în patologia infecțioasă pediatrică;

Determinarea rezistenței la antibiotice a tulpinilor de E. Coli, Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella, Staphylococcus aureus și Enterococcus;

Compararea rezultatelor obținute cu date din literatura de specialitate;

Analizarea rezultatelor antibiogramei efectuată pentru E. Coli, Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella, Staphylococcus aureus și Enterococcus.

CAPITOLUL 7: MATERIAL SI METODA

7.1 Lot de studiu

Studiul nostru este unul retrospectiv și s-a desfășurat în perioada 1.01.2017 – 31.09.2017 în cadrul laboratorul de bacteriologie al Spitalului Clinic de Urgență pentru Copii ” Sfântul Ioan ” din Galați, pe un număr de 10300 produse patologice : materii fecale, urocultura, sânge, puroi, secreție vaginala, secretie nazala, secretie laringo-traheala (S.L.T), secreție otică și secreție uretrală recoltate de la pacienți cu vârste cuprinse între 0-18 ani, internați în secțiile spitalului.

7.2 Metode

7.2.1 Recoltarea și prelucrarea diferitelor tipuri de probe

Coprocultura – recoltarea materiilor fecale, în vederea realizării coproculturii, se face din proba emisă spontan, în recipiente speciale din plastic numite coprorecoltoare. Este important ca recoltarea să se facă înaintea începerii unui tratament antibiotic. Cu ajutorul linguriței coprorecoltorului se prelevează din 3-4 zone diferite ale bolului fecal, în special din zonele cu mucozități, striuri de sânge sau din porțiunile cu consistență mai moale. Materiile fecale sunt însămânțate fără îmbogățire prin dispersii pe medii solide selective slabe sau medii care să conțină lactoză și un indicator de pH (AABTL, Mc Conkey, Levine). Apoi se face indentificarea biochimică și serologică a tulpinei.

Urocultura – pentru efectuarea uroculturii se recoltează prima urină de dimineață, în recipiente sterile de unică folosință cu capac etanș, din jetul mijlociu, după o toaletă riguroasă cu apă și săpun a organelor genitale externe. La copii foarte mici, recoltarea se efectuează în punguțe urinare sterile , după o prealabilă toaletă locală. Probele recoltate, complet și corect etichetate sunt transportate la laborator în maximum 2 ore. urina se rezoltează din mijlocul jetului în condiții aseptice. Se însămânțează pe mediile solide anterior amintite, dacă pe placă se dezolvă un număr de cel puțin 105 UFC/ml de colonii cu aceeași morfologie, se va replica o singură colonie pentru obținerea unei culturi pure, apoi se va trece pe mediile politrope pentru identificare biochimică și serologică.

Puroi – din colecțiile închise se recoltează prin puncție cu o seringă sterilă cu acul gros și cu bizoul scurt, după aseptizarea în prealabil a locului de puncție cu alcool 70 % sau tinctură de iod. Puroiul se introduce într-un recipient steril. Din colecțiile deschise se recoltează după curățarea plăgii cu soluție Ringer lactozată sau ser fiziologic steril, îndepărtându-se prima cantitate de puroi eliminată. Recoltarea se face cu un tampon, ansă, compresă sterilă sau cu pipeta Pasteur și se introduce în recipiente sterile. Proba recoltată a fost însămânțată pe AABTL(agar albastru bromtimol-lactoza), geloză chocolat și geloză sânge. Probele au fost termostatate pentru 24 ore la 37°C.

Hemocultura – în starile septice, sângele se recoltează în condiții de perfectă sterilitate și se însămânțează la patul bolnavului în bulion simplu. Acest mediu însămânțat se introduce la termostat la 37°C timp de 18-24 ore. Ulterior, se practică o trecere pe mediul solid (gelozat), urmată de incubare la 37°C (18-24 ore) și identificare pe baza caracterelor morfologice, enzimatice, serologice.

Secreția vaginală – se introduce cu grijă tamponul de exsudat pe valva posterioară și se recoltează o mică cantitate din secretia vaginală exprimată pe aceasta; se retrage tamponul. Se extrage valva și se deverseaza secreția la unul din capetele unei lame de microscop (ștearsă în prealabil cu alcool și uscată). Peste lama cu produs se suprapune o a doua lamă și se execută o mișcare energică de alunecare pe axul lung al celor doua lame. Secreția astfel întinsă trebuie să fie uniformă pe cele doua lame, subțire și să cuprindă cca 4/5 din lungimea lamei. Cele doua lame se lasă la uscat la loc ferit de curenți de aer cald sau umezeală.

Secreții otice – se poziționează pacientul pe scaun, cu urechea examinată îndreptată spre sursa de lumină. Pentru secrețiile otice interne se colectează fluidul cu un tampon flexibil cu ajutorul unui speculum auditiv. Pentru secrețiile otice externe tamponul este introdus cu grijă în conductul auditiv extern după care se rotește riguros. Tamponul, pentru ambele tipuri de secreție, este introdus în mediul de cultură și transportat la laborator în cel mult 2 ore. Obligatoriu se recoltează două tampoane din același loc. Proba recoltată a fost însămânțată pe AABTL, geloză chocolat și geloză sânge. Probele au fost termostatate pentru 24 ore la 37°C.

Secreții nazale – recoltarea se face cu un tampon mai subtire fixat pe un portampon, cu care se poate patrunde in nazo-faringe. recoltarea se face dimineata cu tamponul faringian se sterg fosele nazale, apoi tamponul se introduce in eprubeta. Exsudatul faringin si nazal trebuie insamantate cat mai repede dupa recoltare daca sunt recoltate in laborator sau trebuie recoltate pe mediu de transport daca pacientul le aduce de la distanta mare.

7.2.2 Diagnosticul bacteriologic

Diagnosticul bacteriologic se pune be baza caracterelor macroscopice, microscopice (prezentate în partea generală) și biochimice.

Izolarea în cultură pură a bacteriilor din genul Escherichia coli, Klebsiella și Pseudomonas s-a făcut pe mediul gelozat lactozat AABTL (agar albastru de brom timol lactoză), geloza lactozata, pe geloză sânge, pe mediul MacConkey. Pentru izolarea bacteriilor din genul Staphilococcus aureus s-a folosit mediile cu geloză simplă, geloză sânge și mediul Chapman iar pentru genul Enterococcus – geloză sânge și mediul ABE.

Escherichia coli E. coli pe geloză lactozată E. coli pe mediul Levine

E. coli pe geloză sânge E. coli pe mediul Mc Conkey

Klebsiella

Cultură Klebsiella pe geloză lactozată Cultură Klebsiella pe geloză sânge

Cultură Kelbsiella pe mediul Mc Conkey Cultură Klebsiella pe AABTL

Pseudomonas

Ps. aeruginosa pe mediul nutrient Agar Ps. aeruginosa pe geloză simplă

Staphilococcus aureus

Cultura S. aureus pe geloză sânge Cultură S. aureus pe geloză simplă

Enterococcus

Cultura Enterococcus pe geloză sânge

În ceea ce privește carcaterele biochimice, identificarea bacililor gram negativi studiați (E. coli, Klebsiella, Pseudomonas) s-a realizat folosind ansa cu firul drept și s-a făcut trecerea unei singure colonii cu aspect sugestiv la examenul macroscopic și microscopic pe medii de cultură multitest, turnate în tuburi.

Mediile de cultură multitest au fost:

Mediul multitest MIU (mobilitate-indol-uree) este un mediu semisolid care conține uree, triptofan, roșu fenol (indicator de pH). Hidroliza ureei va duce la alcalinizarea mediului (culoarea virează de la galben la roșu). Producerea de indol din triptofan va fi indicată de înroșirea reactivului Ehrlich. Dacă bacteria este imobilă apare opacifierea mediului numai pe traiectul de însămânțare, iar dacă bacteria este mobilă opacifierea este în toată coloana de mediu. În privința producerii de urează, o bacterie este ureazo negativă dacă culoarea coloanei rămâne galbenă și pozitivă dacă culoarea devine roșie. O bacterie este indol pozitivă dacă apare schimbarea culorii hârtiei de la roșu la violet și indol negativă dacă hârtia rămâne albă.

Mediul multitest TSI (triple sugar-iron – trei glucide și fier) se însămânțează cu ansa cu fir drept, înțepând coloana dreaptă a mediului și făcând un zig-zag pe partea înclinată. Dacă fermentarea glucozei este pozitivă, culoarea mediului virează la galben. Dacă culoarea coloanei rămâne roșie, glucoza nu este fermentată. Dacă fermentarea a avut loc cu producere de gaze, apar bule vizibile în tub. Fermentarea lactozei/zaharozei este cosiderată pozitivă dacă în porțiunea înclinată culoarea virează la galben. Producerea de hidrogen sulfurat este pozitivă dacă între porțiunea dreaptă și cea înclinată se înnegrește zona.

G+, L-,Z-, H2S- G+, L+, Z+,H2S- G+, L-, Z-, H2S+

Mediul Simmons este un test de utilizare a citratului de sodiu ca unica sursa de carbon. Mediul are culoarea verde înainte de însămânțare iar bacteriile capabile să metabolizeze citratul de sodiu, alcalinizează mediul și acesta devine albastru.

Citrat – Citrat+

Mediul MILF (mobilitate, indol, lizindecarboxilază, fenilalanindezaminază) Decarboxilarea lizinei alcalinizează mediul, iar în absența lizindecarboxilazei mediul este ușor acidifiat prin fermentarea glucozei. Dezaminarea fenilalaninei generează acid fenilpiruvic și amoniac, care cu clorura ferică dau o culoare verde. Indolul format din triptofan înroșește reactivul Erlich. Mobilitatea și indolul se urmăresc exact ca la mediul MIU. În privința lizindecarboxilazei, culoarea mediului nemodificată reprezintă testul pozitiv, adică prezența enzimei, iar modificarea culorii mediului, reprezintă lipsa enzimei. Înverzirea inelară superficială și în lungul traiectoriei de însămânțare după adăugarea unei picături de soluție de clorură ferică semnifică fenilalanindezaminază prezentă.

Caracterele biochimice, de cultură și microscopice ale E. coli, Klebsiellei și Pseudomonas

Pentru stabilirea diagnosticului bacteriologic pentru cocii gram pozitivi studiați (Staphilococcus aureus și Enterococcus) s-au analizat caracteristicile macroscopice, microscopice și biochimice ce se regasesc în tabelul de mai jos.

Mediu Chapman – descompunerea manitolului Testul coagulazei
Stafilococ manito-negativ (sus) Staphylococcus aureus (jos)

Testul sensibilității la bacitracină Cultură Enterococcus

pe mediul ABE

7.2.3 Determinarea sensibilității la antibiotice a tulpinilor aflate în studiu

O parte a determinărilor s-au realizat prin metoda difuzimetrica Kirby-Bauer. Aceasta este o metoda simplă și rapidă, care permite determinarea spectrului de sensibilitate a microorganismului și a valorii C.M.I. (concentraței minime inhibitorii) pentru calcularea dozelor terapeutice de antibiotice. Metoda are mai multe variante, în practică folosindu-se curent tehnica discurilor impregnate cu antibiotice, standardizată, recomandată de NCCLS (National Committee for Clinical Laboratory Standardisation).

Pentru fiecare tulpină bacteriană, izolată în cultură pură, am realizat un inocul cu turbiditatea de 0,5 Mc Farland (1.5 x 108 CFU/ml), controlată nefelometric cu ajutorul echipamentului DensiCHEK.

DensiCHEK

Inoculul este însămânțat pe mediul Muller Hinton, cu un tampon de vată introdus în suspensia cu bacterii. Se așteaptă 15 min pentru ca inoculul să se absoarbă, apoi se aplică cu o pensă microcomprimatele cu antibiotice, la o distanță de aprox. 15 mm de la marginea plăcii și de aprox. 30 mm între comprimate.

Plăcile sunt lăsate în repaus 5 min, apoi sunt plasate în poziție răsturnată la exicator, la 37°C, pentru 18-24 ore în condiții de microaerofilie (5-10 % CO2). Substanța antimicrobiană impregnată în disc, difuzează în mediu și realizează în jurul discului, dacă tulpina este sensibilă la acel antibiotic, o zonă de inhibiție a creșterii.

Citirea rezultatelor se realizează prin măsurarea diametrelor zonelor de inhibiție a creșterii determinate de diferite antibiotice, cu ajutorul unei rigle gradate.

Interpretarea rezultatelor se face în funcție de dimensiunea zonelor de inhibiție a cresterii, folosind termenii de tulpina sensibilă(S), rezistentă(R) sau intermediar sensibilă(I), conform tabelelor furnizate de CLSI 2017 (Clinical laboratory and Standards Institute) și EUCAST 2017 (European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing).

Standardul CLSI 2017+EUCAST 2017 pentru antibiograma Staphylococcus aureus.

Standardul CLSI 2017+EUCAST 2017 pentru antibiograma Ps. aeruginosa

Standardul CLSI 2017+EUCAST 2017 pentru antibiograma Enterobacteriilor

Standardul CLSI 2017+EUCAST 2017 pentru antibiograma Enterococcus spp.

7.2.4 Prelucrarea statistică a datelor

Datele au fost obținute prin platforma software LIMS (Laboratory Information Management System) din cadrul Spitalului Clinic de Urgență pentru Copii ” Sfântul Ioan ” din Galați. Apoi s-au introdus în tabele de lucru în programul EXCEL, unde au fost sortate, filtrate după criterii diferite și analizate statistic. Pentru reprezentarea grafică a rezultatelor am utilizat graficele de tip pie, bar, column, bubble, scatter, line și box plots.

CAPITOLUL 8: REZULTATE ȘI DISCUȚII

Lotul inițial a cuprins un total de 10300 produse patologice, recoltate de la pacienți cu vârste cuprinse între 0-18 ani, în vederea izolării germenilor patogeni și ulterior a determinării sensibilității la antibiotice a tulpinelor patologice.

Din totalul de produse patologice, 1612 de probe au fost pozitive din care ponderea majoritara a fost de exudate nazale (45,7%), urmând apoi corpoculturile (14,8%), uroculturile (12,6%) și secrețiile lanringo traheale (S.L.T – 11,1%). Procente mai scăzute au fost înregistrate la puroi (4,9%), secreție vaginală (4,6%), secreție otică (4,2%) și secreția uretrală (1,4%).

Repartizarea lotului pe tipuri de produse patologice

Repartiția cazurilor în funcție de sex

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4378521/

https://antibiotic.ecdc.europa.eu/en/infographics-about-antibiotic-stewardship-programmes

Humphreys G , Fleck F. United Nations meeting on antimicrobial resistance in 2016. Bulletin of the WHO. Volume 94, Number 9, September 2016: http://www.who.int/bulletin/volumes/94/9/16-020916.pdf

https://ecdc.europa.eu/en/publications-data/antimicrobial-resistance-surveillance-europe-2014

Spellberg B, Blaser M, Guidos RJ, et al. Combating antimicrobial resistance: policy recommendations to save lives. Clin Infect Dis. 2011;52(Suppl 5):S397–428

Vardakas KZ, Rafailidis PI, Konstantelias AA, Falagas ME. Predictors of mortality in patients with infections due to multi-drug resistant Gram negative bacteria: the study, the patient, the bug or the drug? J Infect. 2013;66:401–14.

Bodi M, Ardanuy C, Rello J. Impact of Gram-positive resistance on outcome of nosocomial pneumonia. Crit Care Med. 2001;29:N82–6.

Perez F, van Duin D. Carbapenem-resistant Enterobacteriaceae: a menace to our most vulnerable patients. Cleve Clin J Med. 2013;80:225–33.

Ena J, Dick RW, Jones RN, Wenzel RP. The epidemiology of intravenous vancomycin usage in a university hospital. A 10-year study. JAMA. 1993;269:598–602.