Revista Română de Medicină de Laborator Vol. 2, Nr. 1, Martie 2006 [607978]

Revista Română de Medicină de Laborator Vol. 2, Nr. 1, Martie 2006
48
Principiile generale ale transplantului de celule stem
hematopoietice. Rolul laboratorului clinic în obținerea
unui grefon de celule stem hematopoietice de calitate
General Principles of Haematopoetic Stem Cell Transplantation. The Role
of the Clinical Laboratory in High Quality Grafts Harvesting
Andreea Delia Moicean
*
, Adriana Mariana Dumitrescu, Tatiana Pușcariu,
Georgeta Nițu, Dana Ostroveanu, Mihaela Camelia Ghiță, Virginia Nicoleta
Mirea, Dan Nicolae Coliță
Centrul de Hematologie și Transplant Medular “Ștefan Berceanu”, Institutul Clinic Fundeni,
București, România
Rezumat
Succesul transplantului de celule stem hematopoietice (TCSH) depinde de sensibilitatea celulei maligne
la citostatice și de calitatea grefonului administrat. Un grefon de celule stem hematopietice de calitate este un
grefon steril care conține cel putin 2,5 x 10
6
/kgc celule stem CD34+ viabile și funcționale. Pentru obținerea lui, o
echipă de transplant de celule stem hematopoietice are nevoie de laboratoare experimentate în domeniul
citometriei în flux, culturilor de celule hematopoietice, citomorfologiei și microbiologiei. În Centrul de
Hematologie si Transplant Medular din Institutul Clinic Fundeni, au fost obținute 47 grefoane de celule stem
hematopoietice din sângele periferic din 96 afereze efectuate la 38 pacienți și 9 donatori sănătoși. Procedura
utilizată constă din: administrarea programului de mobilizare, determinarea zilnică a numărului de leucocite,
determinarea numărului de celule stem CD34+ mobilizate în sângele periferic prin citometrie în flux, recoltarea
grefonului, prelucrarea grefonului în vederea conservării și testarea lui din punct de vedere calitativ in vitro,
criocongelarea programată cu azot lichid și crioconservarea grefonului. Pentru realizarea pragului de 2,5 x
10
6
/kgc celule CD34+ au fost necesare 1 – 3 recoltări per pacient. Viabilitatea obținută la testul direct a fost de
94 – 99% imediat după recoltare. Testarea in vitro a evidențiat 39 – 1074 x10
4
colonii GM-CSF /kgc/probă.
Examenele bacteriologice au fost negative în toate probele recoltate. Hemograma din grefon, ca și testele de
bacteriologie, viabilitate, citometrie în flux și culturi de celule hematopoietice au fost repetate la decongelarea
grefonului, înainte de administrare la pacient. Au fost administrate 43 grefoane, cu refacerea hematopoiezei în 7-
15 zile.
Cuvinte cheie:
transplant de celule stem hematopoietice, citomorfologie, citometrie în flux, culturi de
celule stem hematopoietice.

*
Adresa pentru corespondență: Andreea Delia Moicean, Aleea Sinaia 8, bl.73, apt.16, Sector 2, 022763
București,
Telefon 0723 254 064; e-mail: [anonimizat]

Revista Română de Medicină de Laborator Vol. 2, Nr. 1, Martie 2006
49
Abstract
The success of the haematopoetic stem cell transplantation (HSCT) depends on both the sensitivity of the
malignant cells to chemotherapy and the quality of the graft. A high quality HSC graft that can ensure the recov-
ery of the immune system and haematopoesis must be sterile and must provide at least 2.5 x 10
6
CD34+ positive
cells /kg of recipient weight. The achievement of such a graft needs a team work between the HSCT group and
performing laboratories. In the Center of Haematology and Bone Marrow Transplantation, Fundeni Clinical In-
stitute, between March 2000 and December 2005, 47 grafts were collected with peripheral blood aphaeresis from
38 patients and 9 healthy donors. The following procedures were used: stem cell mobilization program, daily
white blood cells (WBC) count, cytometry blood count of CD34+ stem cells, graft collecting, graft preparation
for preservation and in vitro quality tests, cryopreservation in liquid nitrogen. In order to obtain 2.5x 10
6
CD34+
stem cells /kg recipient weight, 1 to 3 aphaeresis were required. The cell viability just after harvesting tested by
direct means, was 94-99%. In vitro cell cultures showed 39 – 1074 x 10
4
colonies GM-CSF /kg weight/sample.
Microbiological screening tests were negative for all samples. Before graft infusion, cell counting, viability tests,
flow cytometry and stem cell cultures were repeated. 30 grafts were infused with the recovery of the haematopoe-
sis in 7-15 days.
Key words:
haematopoetic stem cell transplantation, cytomorphology, flowcytometry, haematopoetic
stem cell culture.

Transplantul de celule stem hematopo-
ietice este terapia standard cu intenție curativă
pentru leucemii acute și cronice, limfoame ma-
ligne inclusiv mielom multiplu și sindroame de
insuficiență medulară dobândite sau înnăscute.
Transplantul de celule stem hematopoietice este
definit de EBMT (Grupul European de Trans-
plant de Măduvă și Sânge) drept perfuzia de ce-
lule stem hematopoietice administrată unui pa-
cient după un regim de condiționare cu intenția
de a înlocui hematopoieza existentă de către ce-
lulele injectate
1
. În arsenalul terapeutic actual al
multor afecțiuni ale celulei stem hematopoietice
procedura de transplant este considerată cea mai
bună obțiune terapeutică, fără a fi nici pe depar-
te o procedură excepțională
1
. Transplantul de
celule stem hematopoietice (TCSH) este un tra-
tament fundamental pentru o multitudine de
boli severe congenitale sau dobândite ale siste-
mului hematopoietic, ca și pentru boli maligne
chimio- sau radiosensibile
2
. Indicațiile majore
ale transplantului de celule stem hematopoietice
(TCSH), după coeficientul de variație (CV) a
numărului de TCSH efectuate la 10 milioane de
locuitori în ultimul deceniu, conform ultimului
raport al EBMT sunt: leucemii acute și cronice, boala Hodgkin, limfoame nonhodgkiniene și
mielomul multiplu ( Tabelul 1 )
1
.
Procedura de transplant de celule stem
hematopoietice presupune un regim terapeutic
mieloablativ sau nonmieloablativ urmat de ad-
ministrarea grefonului (a transplantului). Regi-
mul de condiționare mieloablativ conține agenți
chimioterapici convenționali utilizați în doze
mari (“mieloablative”), combinați sau nu cu ra-
dioterapie și are drept scop eradicarea bolii ma-
ligne și crearea spațiului hematologic în care
celulele stem administrate din grefon să se cui-
bărească, iar prin diviziuni succesive și dezvol-
tare să refacă hematopoieza pacientului respec-
tiv. Toate combinațiile terapeutice mieloablati-
ve determină o profundă imunodeficiență celu-
lară și umorală a primitorului. Această imuno-
deficiență persistă până când celulele stem și
limfocitele mature din grefon repopulează și re-
constituie sistemul limfopoietic și hematopoie-
tic al primitorului. Regimul de condiționare
nonmieloablativ conține agenți cu acțiune pu-
ternic imunosupresoare, utilizați în doze con-
venționale și are drept scop crearea unui spațiu
“imunologic” care să permită celulelor stem din
grefon să se multiplice și să se dezvolte fără a

Revista Română de Medicină de Laborator Vol. 2, Nr. 1, Martie 2006
50
trezi reacții imune ca urmare a diferențelor an-
tigenice între grefon și gazda care să ducă la
compromiterea transplantului.
Caracteristica fundamentală a TCSH în
raport cu transplantul de organe este aceea că
grefa este un concentrat de celule progenitoare
obținut prin tehnici specifice, care trebuie men-
ținute vii și perfect funcționale până la adminis-
trarea lor bolnavului. Administrarea grefonului
de celule stem hematopoietice se poate face la
câteva zile, la câteva luni sau câțiva ani de la
recoltare. Dacă administrarea grefonului se face
mai târziu de 24 – 48 de ore de la recoltare, gre-
fonul este congelat programat în vapori de azot
și păstrat în azot lichid la –180
0
C. Inghețarea
celulelor stem hematopoietice fără riscul distru-
gerii lor prin cristalizarea apei din compoziție
constituie elementul tehnic cel mai important și
mai sensibil al programului de transplant
6
.
După decongelare, celulele progenitoa-
re colectate se administrează bolnavului în per-
fuzie. Pentru reușita grefei este necesară
perfuzarea a minimum 2,5 milioane de celule
progenitoare vii pentru fiecare kilogram de gre-
utate corporală. În bolile hematologice maligne, utiliza-
rea TCSH convențional permite oncohematolo-
gilor să administreze bolnavului doze foarte
mari de medicamente citostatice, asociate sau
nu cu iradierea totală corporală, în intenția de a
eradica infimul procentaj de celule tumorale ca-
re au supraviețuit tratamentului inițial al bolii
(“boala minimă reziduală”) și care pot conduce
la recădere. Aceste tratamente ar fi fatale în ab-
sența unei grefe reușite de celule progenitoare
și, de aceea, calitatea biologică a grefonului re-
prezintă cheia de boltă a procedurii. În procedu-
ra de TCSH nonmieloablativ, eradicarea bolii
minime reziduale este realizată prin distrugerea
celulelor tumorale restante în urma reacțiilor
imune de citotoxicitate față de celulele gazdei
ale limfocitelor donatorului infuzate odată cu
grefonul (celulele tumorale exprimă antigenele
gazdei).
După tipul donatorului, TCSH poate fi
realizat prin două modalități tehnice de grefare:
cu celule recoltate de la un donator compatibil,
“potrivit” în ceea ce privește antigenele tisulare
majore de histocompatibilitate (HLA) realizân-
du-se allogrefa sau allotransplantul și cu celule
Tabelul 1. Clasificarea indicațiilor TCSH după CV
CV

TCSH allogen

TCSH autolog

<

50

LAM RC 1 sau nu RC1

LAL RC 1 sau nu RC1
LMC FC 1 sau nu FC1
SMD
LNH
MM

BH
LNH
58
–

80

MM

LLC
LAM RC1

LAM nu RC1
> 80

BH

LA
L RC1 sau nu RC1

LMC FC1 sau nu RC1
SMD
LLC
LAM = leucemie acută mieloblastică; LAL = leucemie acută limfoblastică; LMC = leucemie mieloidă
cronică; SMD = sindrom mielodisplazic; LNH = limfom nehodgkinian; MM = mielom multiplu; LLC
= leucemie limfatică cronică; BH = boala Hodgkin; RC1 = prima remisiune completă; FC1 = prima
fază cronică. CV = coeficient de variație a indicației. Un CV mic denotă uniformitate de păreri în ceea
ce privește indicația de transplant pentru boala respectivă.

Revista Română de Medicină de Laborator Vol. 2, Nr. 1, Martie 2006
51
prelevate chiar de la bolnav, într-un moment de
remisiune a bolii maligne, realizându-se auto-
grefa sau transplantul autolog. Fiecare din aces-
te metode are indicații specifice, beneficii,
avantaje și riscuri. În comparație cu allogrefa,
în transplantul autolog, complicațiile inerente
care apar până la revenirea la normal a funcții-
lor măduvei osoase (riscul de hemoragii, infec-
țiile severe, anemia) sunt mult mai puțin grave
și durează mai puțin, ceea ce conduce la o mor-
talitate legată de metodă mult mai mică.
În privința bolnavilor care pot fi supuși
procedurii de TCSH, aceștia pot fi copii și
adulți până la vârsta de 55 de ani (sau, excepți-
onal, peste), cu condiția ca aceștia să nu aibă in-
fecții active și să prezinte o stare fizică bună,
care să le asigure depășirea complicațiilor lega-
te de transplant. Este obligatoriu pentru include-
rea în procedură, ca boala de bază să fi fost în
prealabil bine controlată de terapia convențio-
nală cu medicamente anticanceroase (citostati-
ce), sau altfel spus, boala să fie în remisiune
completă.
Celulele stem hematopoietice prezintă
trei valențe biologice: capacitate de autoreplica-
re, capacitate de diferențiere și capacitate de
migrare și “homing” în structurile care oferă
condiții optime de multiplicare și diferențiere.
Celulele stem hematopoietice care constituie
grefonul de celule stem hematopoietice sunt o
minoritate de celule din măduva osoasă (mai
puțin de 1% din numărul total al celulelor din
acest organ). Ele pot fi identificate prin marke-
rul de suprafață care reacțioanează cu anticorpii
anti-CD34. La individul normal, celulele stem
hematopoietice asigură formarea și menținerea
în funcție a tuturor celulelor care compun sân-
gele (eritrocite, leucocite, trombocite și celule
ale seriei limfocitare). Prin capacitatea de
autoreplicare, celulele stem hematopoietice sunt
diferite de progenitorii hematopoietici comutați
care păstrează doar un potențial restricționat de
dezvoltare
3
. Migrarea se face prin pasaj sangu-
in, ocazie cu care celulele stem pot fi identifica-
te în sângele periferic în fracțiunea celulelor mononucleare, de unde pot fi recoltate prin
citafereză. În condiții bazale doar un foarte mic
număr de celule stem hematopoietice circulă în
sânge (0,5 – 5 celule CD34+/mmc). În 1976,
Richman și col. au observat fenomenul de creș-
tere a numărului de celule circulante formatoare
de colonii (CFC) în timpul refacerii din leuco-
penia indusă de ciclofosfamidă
4
. S-a demonstrat
ulterior o creștere a numărului celulelor CD34+
din sângele periferic după chimioterapie de 14
ori. Astfel a apărut ideea mobilizării celulelor
stem hematopoietice mediată de chimioterapie
5
.
Administrarea de citochine cum ar fi factorul de
creștere al coloniilor granulocitare (G-CSF) du-
ce la o creștere marcată (de 56 de ori) a numă-
rului de celule stem hematopoietice circulante
CD34+
3,30
. Față de metoda stimulului unic (fie
chimioterapia, fie factori de creștere), metoda
care combină stimularea prin chimioterapie în
tandem cu factori de creștere hematopoietici,
crește de 278 de ori numărul celulelor stem cir-
culante din sângele periferic și, implicit, cantita-
tea recoltată. În plus, în oncohematologie, con-
centratul de celule stem hematopoietice perife-
rice obținut după stimulare combinată cu chi-
mioterapie și factori de creștere este mai puțin
contaminat cu celule tumorale. Colectarea celu-
lelor stem circulante se face prin citafereza ce-
lulelor mononucleare din sânge cu ajutorul unui
separator celular în flux continuu sau disconti-
nuu. Citafereza poate fi repetată zilnic, cu con-
diția administrării zilnice a factorului de crește-
re hematopoietic.
Calitatea materialului biologic obținut
prin citafereză este apreciată prin: conținutul de
celule mononucleare (x10
8
), prin conținutul de
celule CD34 pozitive (x10
6
) și prin conținutul
de celule (x10
4
) capabile să formeze in vitro
unități granulo-monocitare (CFU-GM), fiabili-
tatea parametrilor enumerați fiind progresivă.
Procedura utilizată în Centrul de Hema-
tologie și Transplant Medular din Institutul Cli-
nic Fundeni constă în următoarele etape:
1. Administrarea unui regim de polichimiote-
rapie (Dexametazonă + Cytosar + Cisplatin sau

Revista Română de Medicină de Laborator Vol. 2, Nr. 1, Martie 2006
52
Endoxan în doză mare sau Ifosfamida +
Epirupicină + Dexametazonă) urmat de factori
de creștere (G-CSF) pentru mobilizarea celule-
lor stem CD34+ de la pacienți, în vederea recol-
tării autogrefonului pentru transplant. Pentru re-
coltarea grefonului de la donatorul sănătos în
vederea allotransplantului se utilizează un pro-
gram de mobilizare doar cu factori de creștere
(G-CSF).
2. Monitorizarea mobilizării celulelor stem în
sângele periferic prin urmărirea zilnică a numă-
rului de leucocite. Obișnuit, după chimiotera-
pie, pacientul prezintă o scădere progresivă a
numărului de leucocite prin scăderea numărului
de neutrofile, cu un nadir între zilele 7–12, în
funcție de durata chimioterapiei din programul
de mobilizare utilizat (în ziua 5 – 8 de adminis-
trare de factori de creștere). Ieșirea din această
neutropenie se face exploziv cu leucocitoză în
ziua 11 – 14 a programului de mobilizare (ziua
8 – 10 de administrare de factori de creștere).
La donatorul sănătos și, uneori, la donatorul pa-
cient, în primele 24 – 48 de ore de la adminis-
trarea primei doze de factori de creștere se con-
stată o leucocitoză importantă cu neutrofilie, ca
urmare a efectului secundar al G-CSF de
demarginație și mobilizare din depozite a
neutrofilelor. La donatorul sănătos, leucocitoza
datorată mobilizării celulelor stem hematopoie-
tice din măduvă în sângele periferic nu apare
mai devreme de ziua 4 – 5 de administrare a
factorului de creștere granulocitar. Odată cu
mobilizarea celulelor stem hematopoietice din
măduvă în sângele periferic, mononuclearele
din formula leucocitară (limfocite + monocite)
sunt în procent de 40 – 50%. O ușoară creștere
a numărului de reticulocite din sângele periferic
este inconstantă și fără semnificație. Switch-ul
formulei leucocitare corespunde concentrației
maxime în sângele periferic a celulelor stem
hematopoietice mobilizate și momentului celui
mai potrivit pentru o afereză cu randament ma-
xim de recoltare. În zilele următoare, în sângele
periferic sunt identificate, pe criterii morfologi-
ce, celulele precursoare granulocitului neutrofil (mieloblast, promielocit, mielocit, metamielo-
cit) cu reducerea treptată a procentului de mo-
nonucleare.
3. La depășirea pragului de 1000 leucocite/
mmc, monitorizarea mobilizării celulelor stem
în sângele periferic prin numărarea celulelor
CD34+ în sânge cu ajutorul citometrului în
flux;
4. Recoltarea grefonului de celule stem
CD34+ începe atunci când numărul de celule
CD34+ din sângele periferic depășește 10 – 15 x
10
6
/L. Procedura de recoltare constă în afereza
cu separator Haemonetics MCS+. Pentru un
randament adecvat al procedurii, pacientul tre-
buie să prezinte o cale venoasă de acces cu un
debit de cel puțin 30ml/min (vena jugulară in-
ternă, vena femurală sau vena subclavie). Paci-
entul este conectat la aparat prin intermediul
unui sistem închis de tuburi de unică utilizare.
Obișnuit, volumul prelucrat zilnic este de 10 li-
tri de sânge (30-80ml/min), utilizând drept anti-
coagulant soluție de citrat ACD-A, în proporție
de 1:12. În funcție de numărul de celule stem
CD34+ recoltate printr-o afereză, procedura se
repetă până la obținerea grefonului dorit. La 8
pacienți și la 5 donatori sănătoși s-a obținut un
grefon de > 3 x 10
6
celule CD34+/kg dintr-o
singură afereză.
5. Prelucrarea produsului recoltat. Aceasta
constă în:
a. standardizarea volumului la 150 ml
suspensie celulară per pungă prin adaos de
DMSO și albumină 4% până la o concentra-
ție finală de DMSO de 10%;
b. prepararea eșantioanelor de control din
produsul recoltat. Din aceste eșantioane se
realizeaza următoarele determinări:
i. numărarea celulelor CD34+/kgc prin
citometrie în flux (metodele ISHAGE și
PROCOUNT). Valorile obținute pentru o
afereză au variat între 0,04 și 19,24 x
10
6
/kgc primitor celule CD34+ la recolta-
re.
ii. teste de viabilitate directă cu albas-
tru de tripan 0,4%. Valorile obținute au

Revista Română de Medicină de Laborator Vol. 2, Nr. 1, Martie 2006
53
fost 97 – 99% la recoltare.
iii. teste de capacitate funcțională a ce-
lulelor mononucleare recoltate prin culti-
varea lor în agar moale pentru determina-
rea numărului de CFU-GM. Din eșantio-
nul recoltat, celulele mononucleare se se-
pară în gradient de densitate, într-un
amestec Ficoll-Hypaque cu densitate de
1.077g/ml. După două spălări succesive,
celulele se resuspendă în mediul de cultu-
ră și se numără într-o cameră de numărat
(hemocitometru). Se calculează numărul
de celule pentru o plăcuță de cultură și
apoi se cultivă celulele în monostrat de
metilceluloză, în prezența factorilor de
creștere hematopoietici. Culturile sunt in-
cubate timp de 12-14 zile la 37
o
C în at-
mosferă de CO
2
5% și umiditate maximă.
Pentru citirea coloniilor care apar în acest
interval de timp se folosește un micro-
scop inversat. Aglomerările de mai mult
de 40 de celule se consideră colonii, iar
acelea formate din mai puțin de 40 de ce-
lule se consideră grupuri (clusters).
iv. control bacteriologic (hemocultură)
pentru germeni aerobi și anaerobi și
fungi;
6. Congelarea programată în congelator cu
azot lichid MiniDigitCool (până la temperatura
de -196
o
C); 7. Stocarea în azot lichid în cuve ESPACE
200;

În Centrul de Hematologie și Trans-
plant Medular din Institutul Clinic Fundeni au
fost efectuate din 2001 până în decembrie 2005,
43 de transplanturi de celule stem hematopoie-
tice ( Figura 1 ).
Grefoanele administrate au dus la refa-
cerea hematopoiezei într-un interval de 7 – 20
zile de la administrare. TCSH nu este o proce-
dură chirurgicală. Este o perfuzie de produs
sanguin labil (PSL) obținut prin procedură spe-
cială, prelucrat după protocoale specifice pentru
obținerea unui grefon de calitate. Obținerea
unui grefon de calitate implică o monitorizare
susținută a donatorului (sănătos sau pacient) în
perioada de dinaintea recoltării și în timpul re-
coltării și determinări convenționale (de bacte-
riologie) sau de înaltă performanță (citometrie
în flux, culturi de celule stem hematopoietice)
din concentratul de celule care urmează a fi
transplantat.
Bibliografie:
1. Gratwohl A și col. Hematopoietic stem cell
transplantation for hematological malignamcies
in Europe. Leukemia. 2003; 17: 941-959.
0246810
2001 2002 2003 2004 2005
hematologie
pediatrie
02468101214
2001 2002 2003 2004 2005
Auto
Allo
RIC allo
Figura 1. Transplanturile efectuate la Institutul Clinic Fundeni, Centrul de Hematologie și Transplant
Medular “Ștefan Berceanu”, în perioada 2001-2005

Revista Română de Medicină de Laborator Vol. 2, Nr. 1, Martie 2006
54
2. Gratwohl A și col. Current trends in
haematopoietic stem cell transplantation in Eu-
rope. Blood. 2002; 100: 2374-2386
3. Craddock C Biological Basis of Haematopoietic
Stem Cell Transplantation in The EBMT
Handbook Blood and Marrow Transplantation,
revised editon 2000, p. 31-37
4. Richman C.M. și col. Increase in circulating
stem cells following chemotherapy in man.
Blood 1976; 47:1031-1039
5. Dreger P. și col. Source of Haemopoietic stem
Cells in The EBMT Handbook Blood and
Marrow Transplantation, revised editon 2000, p.
69- 90 6. Peters P. W și col. Collection, Cryopreservation
and Use of Pheripheral Blood Progenitor Cells
Primed with Colony-Stimulating Factor in
Marrow Transplantation: Practical and
Technical Aspects of Stem Cell Reconstitution,
editors Sacher R.A and AuBuchon J.P, Ameri-
can Association of Blood Banks Bethesda, Ma-
ryland 1992, p.51 – 67
7. Arland M. și col. Ifosfamide, epirubicin and
granulocyte colony-stimulating factor: a
regimen for successful mobilization of
peripheral blood progenitor cells in patients
with multiple myeloma Hematol Oncol
2001;19:59-66