Relatiile Celulelor Dendritice Si Nkin Cadrul Sci Ului LA Specia Canina
CUPRINS
CAPITOLUL 1. JUSTIFICAREA SUBIECTULUI LUCRĂRII DE LICENȚĂ
CAPITOLUL 2. DATE GENERALE DE BIBLIOGRAFIE REFERITOARE LA SUBIECT
2.1. Locul ocupat de celula dendritică în hematopoieza la canine
2.2. Locul ocupat de celula NK în hematopoieza la canine
2.3. Morfofuncțiile celulelor dendritice la canine
2.4. Implicarea în cadrul SCI a celor două subsisteme celulare
2.5. Nivelul de implicare al celulelor dendritice și NK în răspunsul imun pentru specia
canină
CAPITOLUL 3. MATERIALE ȘI METODOLOGIA DE LUCRU
CAPITOLUL 4. REZULTATE ȘI DISCUȚII
CAPITOLUL 5. CONCLUZII
CAPITOLUL 6. BIBLIOGRAFIA UTILIZATĂ ÎN TEXT
CAPITOLUL 7. IMAGISTICA
CAPITOLUL 1
JUSTIFICAREA SUBIECTULUI LUCRĂRII DE LICENȚĂ
Celula dendritică, descoperirea pentru care profesorul american Ralph Steinman a luat premiul Nobel postmortem în 2011, ar putea sta la baza unor tratamente antivirale și anticancer inovatoare, chiar și la specia canină.
Cu 30 de ani în urmă, profesorul doctor Ralph Steinman, directorul Centrului de Imunologie al Universității Rockefeller din New York, a folosit pentru prima oară termenul de celulă dendritică pentru a defini un set de celule asemănătoare ca aspect cu neuronii, dar total diferite din punctul de vedere al localizării și al rolului lor. Profesorul Steinman le-a descoperit la nivelul splinei, dar de-a lungul timpului s-a dovedit că ele se găsesc în toate țesuturile limfoide (țesuturi responsabile cu formarea de limfocite și de anticorpi) și în majoritatea celor non-limfoide din organism. Celulele dendritice se găsesc, de asemenea, în concentrații mai mari, în țesuturile care intră în contact direct cu mediul extern. De asemenea, ele pot fi identificate, într-o formă imatură, în sânge, la canini.
Acționând ca niște polițiști, celulele dendritice sunt printre primele care intră în contact cu invadatori cum sunt virusurile, bacteriile sau chiar celulele canceroase. Ele detectează și identifică particule ale inamicului, numite antigeni, pe care le preiau, le procesează și le prezintă celulelor imunitare cu rol de atac. Așadar, am putea compara celulele dendritice cu polițiștii care, pe baza unui obiect personal al infractorului (antigenii), îi determină pe câinii-polițist (celulele imunitare T și B) să acționeze. Potrivit specialiștilor, ele au un rol esențial în crearea legăturii dintre imunitatea înnăscută și cea așa-numită adaptativă sau dobândită. De altfel, se pare că celulele dendritice sunt extrem de importante în ceea ce privește memoria sistemului imunitar. Astfel, atunci când organismul se confruntă de mai multe ori cu aceiași agenți patogeni, el este tot mai pregătit, angrenând în luptă tot mai multe celule imunitare. Stau la baza terapiilor inovatoare anticancer.
În momentul de față sunt în studiu mai multe tipuri de terapii inovatoare și de vaccinuri antivirale sau chiar anticancer care au drept țintă celulele dendritice. Una dintre aplicațiile care deja există pe piață este vaccinul gripal modern, cu ac mic și subțire, care se utilizează în prezent în Franța. Dimensiunile acului sunt suficiente pentru activarea celulelor dendritice din piele. Acestea preiau antigenii din vaccin și îi transportă în cei mai apropiați noduli limfatici, unde antrenează celulele imunitare T să lupte împotriva eventualilor invadatori ulteriori. Însă în ceea ce privește tratamentele anticancer la canini, terapiile trebuie să fie mai complexe de atât, iar în prezent există o varietate de studii clinice care le testează.
În corp există două tipuri de celule dendritice: mieloide (mDC) și plasmacitoide (pDC). Primele au un rol major în activarea celulelor imunitare T, dar și în combaterea infectării rănilor, iar cele plasmacitoide produc cantități crescute de interferon-alfa, proteine care antrenează în număr mare celulele imunitare de atac și care, astfel, limitează înmulțirea agenților patogeni sau a celulelor maligne. Interferonul este folosit ca parte a tratamentului în cazul hepatitei C, dar și în cazul infecției cu virusul imunodeficienței dobândite (HIV), chiar și la canini. Problema întâmpinată de oamenii de știință din mai multe centre de cercetare care au încercat să creeze vaccinuri HIV eficiente a fost că celulele dendritice plasmacitoide din organism sunt eficiente doar împotriva infecțiilor virale ușoare și medii, în cazul celor severe mai mult îngreunând activitatea sistemului imunitar. Acesta este motivul pentru care cercetătorii de la Colegiul Imperial din Londra au încercat o altă abordare pentru împiedicarea infecției cu HIV. Ei au observat că celulele dendritice plasmacitoide acționează pozitiv doar la început, după primele contacte cu virusul. Apoi, activitatea lor devine nocivă, împiedicând celulele T să-și facă treaba așa cum ar trebui. De aceea, specialiștii testează în prezent vaccinuri HIV la canini, cu particule virale cărora le-a fost îndepărtat învelișul de colesterol, cel care punea în acțiune celulele dendritice. Este ca o armată care și-a pierdut armele, dar care încă mai are steaguri. O altă armată poate să o recunoască și să o atace, a declarat Adriano Boasso, coordonatorul studiului.
Mai multe studii au dovedit că activitatea exagerată a celulelor dendritice este principala cauză a instalării alergiilor și a bolilor autoimune. Rezultatele lor au arătat că acei canini cu afecțiuni autoimune prezintă un număr mare de celule dendritice active fie în fluxul sangvin, fie în leziunile bolii respective. Așadar, tratamentele moderne ale acestor afecțiuni vizează adormirea celulelor dendritice.
La începutul anilor '80 se știau încă puține lucruri despre mecanismele de recunoaștere și de contracarare a diferiților agresori. Însă, o dată cu începerea studiilor amănunțite asupra celulei dendritice, progresele în cercetarea medicală au explodat.
Celula dendritică, un element celular crucial, este, pe scurt, un suport pentru vaccinurile celulare, motiv pentru care prezentul studiu își dovedește utilitatea. De asemenea, ea este punctul de pornire al antitumoralelor pe bază de celule activate.
CAPITOLUL 2
DATE GENERALE DE BIBLIOGRAFIE REFERITOARE LA SUBIECT
Sistemul imun este o rețea anatomică și funcțională complexă de celule și țesuturi, care operează sincron pentru a preveni sau neutraliza agresiunile biologice asupra organismului. Istoric, interesul în imunologia cancerului rezidă din percepția activității potențiale a sistemului imun ca o armă împotriva celulelor canceroase. Termenul de glonț magic utilizat pentru a descrie numeroase viziuni asupra terapiei cancerului a fost introdus de Paul Ehrlich la sfârșitul secolului XIX ca o referire la anticorpii care anihilează atât microbii cât și celulele tumorale.
Teoria supravegherii imune a tumorilor, enunțată inițial de Ehrlich, apoi reluată de Burnett și Thomas recunoaște rolul major în controlul apariției și proliferării tumorilor. Această teorie ar putea explica creșterea frecvenței tumorilor, paralel cu diminuarea eficacității apărării imune o dată cu vârsta. Descoperirea la necropsii a unor tumori la pacienții aparent asimptomatici sugera controlul spontan al acestora de către sistemul imun. Totuși, teoria supravegherii imune a fost dificil de demonstrat experimental, devenind una dintre cele mai controversate în imunologia tumorală. În timp ce modelul supravegherii imune a funcționat pentru tumorile induse viral sunt puține dovezi în sprijinul eficacității controlului tumorilor non-viral induse. Mai recent, o dată cu noile modele experimentale realizate și creșterea volumului cunoștințelor de genetică au fost obținute modele experimentale indicând că atât rezistența naturală, cât și cea adaptativă prezintă un rol în controlul dezvoltării și progresiei tumorale, pe baza unei relații mult mai complexe între imunitatea dobândită și cea înnăscută. Interacțiunea dintre tumoră și organismul-gazdă implică sistemul imun la niveluri variate și poate determina consecințe diferite. Acestea includ protecția gazdei prin rolul de supraveghere a sistemului imun, perturbarea funcțiilor b#%l!^+a?sistemului imun și favorizarea dezvoltării tumorii datorită inflamației cronice. Mai mult, tumorile își recrutează celulele sistemului imun și își stimulează progresia.
Conceptul central al terapiei imune a cancerului se bazează pe teoria duală conform căreia tumora exprimă un profil antigenic distinct de celula normală și, astfel, sistemul imun este capabil să recunoască aceste diferențe antigenice, dar și participarea acestuia la favorizarea progresei tumorale.
Celulele tumorale diferă de celulele normale, atât prin compoziția antigenică, dar și prin comportamentul biologic. Instabilitatea genică, una din emblemele de bază a fenotipului malign poate determina apariția de antigene tumoral-specifice. Cea mai frecventă alterare genetică în cancer este mutația, care provine din defectul mecanismelor de reparare a ADN în cadrul celulelor tumorale. Recunoașterea celulelor tumorale ca anormale, reprezintă elementul fundamental a stimulării imune.
În prezent, există numeroase date ce susțin că tumorile autologe pot fi recunoscute de sistemul imun al gazdei. Observațiile actuale demonstrează existența unor răspunsuri imune antitumorale.
Argumente epidemiologice: frecvența cancerelor observate în cursul diferitelor situații clinice asociate unui deficit imunitar de tip celular. Aceste pot fi deficite imunitare primare cu origine genetică:
Deficite imune mostenite:
Sindromul de ataxie teleangiectazie (anomalii cantitative și calitative ale limfocitului T ca urmare a hioplaziei timice), pacienții foarte sensibili la radiațiile ionizante și prezintă o incidență crescută a limfoamelor și leucemiilor cu celule T.
Sindromul Wiskott-Aldrich, boală genetică în relație cu factorul IX manifestată prin exeme, trombopenie și infecții repetate prin anergia limfocitelor T contra diferitelor antigene; mutația genei WASP este la originea sindromului asociat și cu un risc crescut de limfoame și leucemii.
Trisomia 21 este cea mai frecventă dintre toate deficitele funcționale ale limfocitelor T asociată cu o involuție timică precoce.
Deficitele imune dobândite:
Sindromul imunodeficienței imune dobândite (S.I.D.A.) unde sarcomul Kaposi, limfoamele non-hodgkiniene și limfoamele Burkitt sunt frecvent observate, risc crescut o dată cu intensitatea imundepresei (CD4 mai puțin de 200/mm3).
Tratamentele imunosupresoare sunt asociate cu incidența crescută a unor cancere. Incidența cancerelor este crescută la caninii cu deficite imune și există o creștere a incidenței b#%l!^+a?tumorilor maligne la pacienții, care urmează un tratament cronic imunosupresiv pentru menținerea allogrefelor de organ.
Fenomenul de grefă contra gazdă (graft versus host) survenit în cursul alogrefelor de măduvă fără depleția de limfocite T este asociat cu un risc mai scăzut de recidivă leucemică față de alogrefele cu depleția de celule imune. Pare, astfel că limfocitele T citotoxice și celulele NK ale donatorului exercită un efect antileucemic care reduce riscul de recidivă.
Regresia spontană a tumorilor asociată unui răspuns imunitar parțial sau complet a putut fi observat la 1% până la 2% din pacienții cu cancer renal sau melanoame. În anumite situații clinice a putut fi evidențiată prezența unei reacții citotoxice, care a indus regresia spontană a tumorii.
Argumente experimentale: punerea în evidență a caracterului imunogenic a tumorilor utilizând canini singenici cu același fond genetic. La acest tip de canini, tumorile chimic induse (metilcolantren) grefate s-au dezvoltat mai rapid la caninii singenici naivi față de cei la care au fost prealabil purtători de asemenea tumori. Imunizarea caninilor cu tumori iradiate protejează parțial contra transplantului acelorași tumori în comparație cu caninii neimunizați. În acest tip de experimente, acest tip de imunitate a putut fi transferat prin limfocitele T.
Recent s-a demonstrat că, caninii deficienți pentru genele RAG (indipensabile pentru rearanjamentele genelor imunoglobulinelor și receptoruln evidență a caracterului imunogenic a tumorilor utilizând canini singenici cu același fond genetic. La acest tip de canini, tumorile chimic induse (metilcolantren) grefate s-au dezvoltat mai rapid la caninii singenici naivi față de cei la care au fost prealabil purtători de asemenea tumori. Imunizarea caninilor cu tumori iradiate protejează parțial contra transplantului acelorași tumori în comparație cu caninii neimunizați. În acest tip de experimente, acest tip de imunitate a putut fi transferat prin limfocitele T.
Recent s-a demonstrat că, caninii deficienți pentru genele RAG (indipensabile pentru rearanjamentele genelor imunoglobulinelor și receptorului T) fiind deficienți în limfocitele T mature, prezintă o o frecvență accelerată a tumorilor spontane și chimio-induse.
Existența infiltratului limfocitar intra- și peritumoral în tumorile primare a fost b#%l!^+a?propus ca un indicator de prognostic favorabil: limfocitele infiltrative tumoral (tumour infiltrating lymphocytes – TIL) prezintă o capacitate citotoxică de circa 100 de ori mai mare asupra celulelor țintă față de limfocitele ucigașe activate (lymphokine-activated killer cells – LAK).
Analizele ultrastructurale au arătat că celulele tumorale, recunoscute de TIL prezintă în scurt timp necroză si moarte celulară prin apoptoză, în timp ce tumorile nerecunoscute de TIL nu sunt afectate.
Celulele maligne exprimă antigene de rejet, codate de oncogene, aceste celule transformate fiind rejetate la canin.
Celulele tumorale, care exprimă nivele crescute de antigene MHC clasă I sau cele la care expresia acestor antigene este indusă prin interferon y, prezintă creșterea tumorigenicității, deoarece TAA sunt prezentate sistemului imun, astfel încât răspunsul imun antitumoral este crescut.
Identificarea unor clone de limfocite T citotoxice (CTL) la pacienții canini cu cancer este posibilă, iar restimularea TIL cu celule tumorale autologe determină stimularea proliferării și a citotoxicității acestora.
Fenotipul celulei maligne este conferit de totalitatea antigenelor tumorale, care pot b#%l!^+a?fi sintetizate chiar de către celulele tumorale. Studiile istorice pe modele animale cu tumori induse chimic și viral au relevat faptul că tumorile sunt capabile să inducă răspunsuri imune antitumorale spontane eficace. Tehnicile disponibile actual, precum clonarea moleculară și cromatografia în gaz – spectroscopia de masă (GC-MS) au permis identificarea unui număr din ce în ce mai mare de molecule asociate unei mari varietăți de cancere. Aceste antigene pot fi ținta unui răspuns terapeutic imun și sunt colectiv numite antigene asociate tumorilor (tumor-associated antigens, TAA).
Unele dintre aceste molecule sunt sintetizate în celulele tumorale într-o densitate mai mare față de celulele normale, ca rezultat al unor evenimente unice celulare și moleculare asociate procesului carcinogenezei. Aceste antigene se numesc antigene specifice tumoral (tumor-specific antigens, TSA). TSA pot apărea pe baza expresiei produșilor genelor alterate. Exemple de TSA sunt: proteinele mutate p53 și Ras asociate cu o varietate de carcinoame și proteinele de fuziune Bcr-Abl asociate cu leucemia mieloidă cronică (LMC). Pentru ca o moleculă tumoral-derivată să fie fie recunoscută de sistemul adaptativ ca TAA, este necesar ca aceasta să ajungă la suprafața celulei.
Mai mult, în numeroase cancere, proteinele celulelor normale sunt exprimate la un nivel crescut anormal și servesc ca TAA. Exemplele includ oncoproteina Her2/neu (ErbB2), antigenul prostatic specific (PSA) și familia de antigene asociate melanomului (MAGE).
Fiind exprimate într-o densitate mai mare pe celulele tumorale față de celulele normale, TSA sunt ținte posibile pentru imunoterapie. De asemenea, aceste antigene pot fi utilizate pentru a produce anticorpi monoclonali specifici, care pot distruge celulele tumorale.
Imunitatea adaptativă poate fi divizată în două elemente-cheie: brațul celular sau răspunsul imun mediat celular (numit și răspuns Th1), care implică celulele T și răspunsul umoral (răspuns Th2), care implică imunoglobuline sau anticorpi produși de celulele B.
Relația dintre celulele tumorale, expresia complexului major de histocompatibilitate (major histocompatibility complex, MHC) și sistemul imun al gazdei este complexă. Sistemul MHC, o moleculă prezentă la suprafața celulelor care servește ca ligand pentru TCR, este un component critic în inițierea răspunsului imun adaptativ, deoarece, spre deosebire de imunoglobuline, receptorul celulei T (TCR) nu recunoaște un antigen în starea sa nativă, ci numai în asociație cu moleculele MHC self.
În răspunsul imun, antigenele sunt recunoscute de două seturi distincte de receptori limfocitari: imunoglobulinele, care servesc ca receptori pentru antigene pentru limfocitele B și receptorii antigen-specifici ai limfocitelor T (TCR).
Celulele B au originea în măduvă. Când aceasta este stimulată de antigen fie direct, fie indirect, prin interacțiunile cu celula T (helper) se activează specific și se diferențiază în celule plasmocitare, formatoare de imunoglobuline (Ig) – anticorpi.
Anticorpii sunt compuși dintr-o regiune variabilă, care se leagă la antigen și de o porțiune constantă (Fc), care determină izotipul imunoglobulinei, ce se fixează de diferite tipuri de receptori (RFc) (ex. RFc activatoare pentru IgG – RFcy IIB). b#%l!^+a?
Contactul celulelor B circulante în stare de repaus cu antigenul, cu participarea celulelor T helper CD4+ (sau Th2), induce diferențierea celulelor B în celule mature care sintetizează anticorpi, respectiv plasmocite. Aproape toate substanțele când sunt administrate ca antigene, determină un răspuns în anticorpi. Toate celulele B exprimă inițial IgG și IgM pe suprafața lor, acestea acționând ca antigene legate de receptor. După stimularea antigenică, primul anticorp produs este IgM. Pe modelele tumorale murine, s-a demonstrat că anticorpii reprezintă efectorii majori implicați în rejetul tumorilor.
Diferite mecanisme participă la activarea antitumorală. Astfel, legătura dintre un anticorp cu un antigen exprimat de către tumoră poate induce apoptoza sau poate activa proliferarea celulară.
Imunitatea mediată celular este susținută de către celulele T. Spre deosebire de Ig, receptorii celulelor T (TCR) nu recunosc antigenul în starea lui nativă.
MHC este o componentă critică a inițierii răspunsului imun adaptativ deoarece, TCR recunoaște antigenul numai când antigenul este prezentat în asociație cu moleculele MHC self.
Complexul uman MHC, cunoscut ca human leuocityte antigen (HLA) complex este format din locus-urile A, B și C, numite împreună antigene MHC de clasa I și DP, DQ și DR care constituie antigenele MHC clasa II.
Celulele T CD8+ recunosc peptidele MHC de clasa I, iar celulele T CD4+ recunosc peptidele MHC de clasa II. Celulele T sunt produse pornind de la progenitorul hematopoietic din măduvă, care suferă diferențierea în timus înainte de a fi eliberat ca celulă T matură. Aproximativ 95% din celulele T produse vor muri în timus. Procesul stringent de selecție a celulelor T le face pe acestea capabile să recunoască molecula MHC self și abrogă posibilitatea de reactivitate autoimună.
Categoriile majore de celule T implicate în răspunsul imun sunt:
Celulele T citotoxice, caracterizate de expresia moleculelor CD8 (LT-CD8+). Peptidele produse prin degradarea via proteasom a proteinelor citosolice, apoi transportate la nivelul reticulului endoplasmatic prin intermediul unui transportor (TAP), se leagă la moleculele MHC clasa I. Recunoașterea complexelor MHC clasa I – peptide la suprafața celulei tumorale de către LT-CD8+ poate conduce la liza celulei tumorale prin mecanisme diverse: eliberarea de enzime și citokine (perforine și granenzime); exocitoza granulelor cu inducerea unui semnal de moarte celulară; interacțiunea moleculei Fas-L exprimată de LT-CD8+ și a moleculei Fas pe celula tumorală (antrenează apoptoza pe calea caspazelor).
Celulele T helper (sau Th2), caracterizate de expresia moleculei CD4 pe suprafața acestora (LT-CD4+), răspund la antigen prin eliberarea de b#%l!^+a?citokine care susțin activarea celulelor T citotoxice și producția de anticorpi. Antigenele sunt recunoscute prin intermediul receptorului T specific (TCR), care spre deosebire de Ig de la suprafața celulelor B sau receptorul BCR, este fixat de membrana celulară: legarea acestuia este asociată cu transmiterea unui semnal către nucleu; răspunsul celulei, poate fi, conform programului genetic: activitate citotoxică sau eliberare de citokine.
Celulele T reglatorii (LTreg) reprezintă o populație T heterogenă, educată la nivelul timusului înalt specializată pentru funcția supresivă. Aceste celule fac legătura între mecanismele central și periferic ale toleranței pentru self, în sensul selecției negative intratimice a celulelor T autoreactive și totodată al acțiunii LTreg în periferie pentru controlul acestora. Celulele LTreg servesc ca reglatori negativi ai imunității mediate celular, jucând un rol important în reglarea autoimunității.
Celulele T cu memorie sunt subpopulații de celule T helper și citotoxice, ce implică menținerea memoriei. Acestea sunt generate consecutiv expunerii inițiale la antigen și pot rămâne dormante perioade lungi de timp. Pot fi însă rapid activate după modificarea antigenică subsecventă și contribuie astfel la răspunsurile imune secundare.
În numeroase situații tumorale, se poate observa un răspuns mixt umoral și celular. În anumite cazuri, anticorpii și LT-CD8+ cooperează pentru eliminarea tumorilor. Fixându-se pe celula tumorală, anticorpii pot permite o opsonizare mai bună a acesteia de către celulele dendritice și ameliorarea prezentării antigenelor tumorale și inducerii LT-CD+ antitumorale.
Alte componente celulare importante ale răspunsului imun sunt: celulele killer native (NK) și celulele dendritice (DC). Acestea vor fi prezentate în secțiunile dedicate din cuprinsul acestul capitol al cercetării noastre.
Una dintre întrebările fundamentale ale imunologiei este următoarea: dacă tumorile sunt imunogenice, de ce sistemul imun canin nu inițiază spontan răspunsuri imune terapeutice? Au fost comunicate exemple de regresie spontană tumorală după episoade de febră și infecții. Totuși, aceasta nu este regula și, în absența altor tipuri de tratamente, tumorile tind să progreseze. Există mai multe explicații pentru faptul că tumorile nu pot genera răspunsuri imune, sau uneori le inhibă (mecanismele de evaziune tumorală).
Există dovezi clare conform cărora, sistemul imun natural de supraveghere joacă un rol minor față de cel preconizat inițial de teoria supravegherii imune.
În anumite circumstanțe, prezentarea Ag poate rezulta în absența unui răspuns imun și indivizii devin ulterior nereactivi la modificările antigenice. În inducerea acestui fenomen, numit toleranță imună, sunt implicați doi parteneri: celula tumorală și micromediul tumoral. Dovezile din modele tumorale murine, cât și din tumorile canine au demonstrat cu certitudine capacitatea celulelor maligne de a induce toleranța la Ag tumorale, aceasta părând să reprezinte cea mai importantă strategie de autoprotecție față de sistemul imun al gazdei, pe care o utilizează tumorile, prin mai multe mecanisme: procesul selecției timice (numit și toleranță centrală); prezentarea antigenelor în absența altor semnale secundare (co-stimulante), face celulele T incapabile să reacționeze la antigene specifice (toleranța b#%l!^+a?periferică); anumite citokine (IL-10, TGF-ß) pot juca un rol supresiv, ca și alți factori de micromediu inflamator (NO), care promovează dezvoltarea toleranței periferice a celulelor T.
Toleranța tumorilor față de Ag tumorale operează predominant la nivelul celulelor T.
Tumorile voluminoase sunt asociate cu anomalii sistemice ale funcției imunologice. Activarea sau inhibiția celulelor T depinde de prezența sau absența unor citokine în micromediul lor imediat. Tumorile produc numeroase citokine imunosupresive (factorul transformant de creștere ß-TGFß, IL-10, factorul endotelial vascular de creștere – VEGF), cu efecte precum: inhibiția creșterii și diferențierii celulelor T; inducția anergiei celulelor T; blocarea producției de activatori ai citokinelor; inhibarea prezentării antigenelor; modificarea răspunsului imun derivat din citokine ale celulei T helper 1 (Th1 – IL-2, IFNy) la cel obișnuit, mediat T helper 2 (Th2 – IL-6, IL-10), care la rândul său inhibă răspunsul Th1. Citokinele își exercită efectul antitumoral prin: restaurarea hematopoiezei normale; creșterea apărării imune; stimularea și producția efectelor celulare antitumorale; expansiunea clonală a celulelor maligne prin inducția diferențierii.
Celulele tumorale inhibă expresia moleculelor MHC pe suprafața lor. Aceasta poate fi datorată modificării în secvența proteinelor MHC de clasă I, care afectează folding-ul sau stabilitatea, ca și defectele mecanismelor de procesare a Ag (inhibarea proteinelor tumoral- asociate – TAP1 și TAP2). Absența expresiei moleculelor MHC de clasă I împiedică recunoaștere celulelor tumorale de către celulele T. Totuși, tumorile deficitare în MHC pot fi mai susceptibile la liza de către celulele NK. Pierderea parțială/completă a moleculelor MHC, asociate sau nu celulelor APC, reprezintă unul din mecanismele de evadare tumorală de sub activitatea celulelor T CD8+. S-a insistat asupra heterogenicității expresiei moleculelor MHC de clasă I și a Ag tumorale la nivelul metastazelor sincrone la același pacient, chiar în cadrul aceleiași tumori.
Studiile pe modele animale de tumori, după vaccinarea cu un singur TAA în circumstanțe diferite, au observat recidive tumorale datorită variantelor tumorale care nu mai exprimă sau exprimă variante modificate ale antigenelor-țintă. Acest mecanism de evaziune tumorală este datorat instabilității genice a tumorilor, de unde și necesitatea identificării vaccinurilor antitumorale, care să țintească Ag tumorale esențiale pentru supraviețuirea tumorii.
Celulele tumorale dezvoltă frecvent rezistența la apoptoza indusă de celulele imune. Unul dintre cele mai simple mecanisme este supraexpresia produsului genelor antiapoptotice, precum Bcl-2 și v-Rel. Mai mult, celulele tumorale, care exprimă ligandul Fas pot induce apoptoza limfocitelor tumoral-specifice. Astfel, interacțiunea moleculei Fas-ligand de pe suprafața celulelor LT-CD8+ cu molecula Fas de pe suprafața celulelor tumorale le distruge pe acestea din urmă via activarea căii caspazelor. S-a demonstrat pe diferite modele tumorale că supraexpresia c-Flip, o proteină inhibitorie a căii caspazelor protejează celulele tumorale de apoptoza Fas-indusă mediată de celulele LT-CD8+. Tumorile, care b#%l!^+a?supraexprimă c-Flip in vivo prezintă un avantaj selectiv de creștere, confirmând rolul acestei molecule în inhibarea activității citotoxice a LT-CD8. b#%l!^+a?
Ca regulă generală, când LT-CD8+ recunosc un complex antigenic pe celula tumorală induc fenomenul de liză a celulei țintă. În anumite cazuri, sunt exprimate pe suprafața membranei celulei tumorale molecule proapoptotice (Fas-ligand, B7H1), ce vor elabora un semnal de apoptoză contra LT-CD8+. B7H1 este exprimat preferențial în țesuturile maligne, iar expresia Fas-liganzilor este crescută în anumite tumori canine, dar aceste date rămân controversate.
În ultimii zece ani, celulele T reglatoare (Treg) au demonstrat un rol central în menținerea statusului de toleranță, ca și în inhibarea răspunsului imun la patogeni, și au fost recent identificate ca ținte potențiale pentru terapia cancerului. Răspunsurile la vaccinurile anti-tumorale sunt eficace când celulele Treg sunt depletizate.
Mai multe studii clinice au stabilit că celulele Treg sunt crescute în sângele periferic și în jurul tumorii la pacienții cu cancer, servind ca reglatori negativi ai imunității mediate celular și putând inhiba răspunsul celulelor T. Mecanismul exact prin care celulele T reg în cancer sunt crescute nu este cunoscut. Supresia se realizează prin eliberarea de citokine inhibitorii (IL-10, TGF-ß), prin contactul celular direct cu celulele T efectoare sau prin modularea celulelor APC.
Sunt disponibile dovezi experimentale conform cărora sistemul imun nu este alertat de prezența Ag, ci necesită un al doilea sistem de stimulare (numit co-stimulare) prin intermediul moleculelor exprimate de către APC. Legătura TCR cu antigenul nu este suficientă pentru activarea celulelor T. Al doilea semnal este furnizat de molecule co-stimulatorii exprimate pe APC pentru moleculele CD28 de pe suprafața celulelor T, după evenimente precum infecțiile bacteriene sau virale, leziuni tisulare și inflamații. Când tumorile exprimă mai ales Ag de tip self și nu sunt asociate cu injurii tisulare sau inflamație semnificativă, răspunsurile imune nu sunt evocate. Mai mult, prezentarea TAA de către celulele T în absența unei co-stimulări, le face pe acestea anergice la antigene specifice. Cele mai frecvente molecule co-stimulatorii sunt familia B7 (CD80, CD86), ligandul CD40L, molecule de adeziune intercelulară ICAM, Ag asociați funcției limfocitare LFA și moleculele de adeziune celulară vasculară. De natura legării TCR cu diferite molecule co-stimulatorii depinde direcția de dezvoltare a răspunsului de activare (B7-CD28), anergie (B7-CTLA4, Ag 4 asociat limfocitelor T: stare nespecifică de inactivare) sau imunotoleranță (inactivare Ag-specifică).
Anergia poate fi reversată în anumite circumstanțe, dacă Ag imunizant este administrat cu un adjuvant imunologic adecvat, precum factorii de stimulare a coloniilor granulocitar- macrofagice (GM-CSF), peretele bacterian sau DC maturate încărcate cu Ag.
Fenomenul de toleranță sistemică la antigenele tumorale debutează la nivelul micromediului tumoral. Mai multe molecule inhibitorii din micromediul tumoral joacă un rol inhibitor asupra răspunsurilor celulelor T, promovează apoptoza, cresc vascularizația și împiedică activitatea limfocitelor T citotoxice (CTL):
Radicalii liberi de oxigen (RLO) și/sau oxidul nitric, prin activarea b#%l!^+a?arginazei; RLO pot inhiba funcția celulelor T asociată cu inhibiția lanțului δ a TCR (componentă a complexului de semnalizare), fenomen asociat cu neresponsivitatea generalizată a celulelor T la pacienții cu cancer.
Indolamin – 2, dioxigenaza (IDO) produsă de către DC plasmocitoide, în tumoră sau la nivelul ganglionilor limfatici, inhibă răspunsul celulelor T prin catabolismul triptofanului.
TGFß, produs de o varietate de celule (inclusiv celulele tumorale), cu efecte fiziologice pleiotropice, este un inhibitor potent al proliferării celulare, blocând ciclul celular în faza G1.
Calea de semnal STAT3, activată constitutiv în numeroase tumori, implică tirozin-fosforilarea, cu activarea transcripției a numeroase gene; mai mulți receptori tirozinkinazici (EGFR, HER2/neu, src, cMet) activează calea STAT3, inhibând producția citokinelor proinflamatorii cu efecte imunosupresive și inducând eliberarea factorilor inhibitori a mai multor tipuri de celule din micromediul tumoral (DC, NK, granulocite). Factori care reglează calea STAT3, inducând un micromediu dormant includ: IL-10, VEGF, IL-6 și, posibil, IL-23.
Implicarea sistemului imun în cancerogeneză este susținută de multiple date experimentale și clinice, însă, deși activarea adecvată a celulelor T conduce în unele cazuri la regresia tumorală, rolul sistemului imun în controlul dezvoltării tumorale rămâne neclar.
Înțelegerea paradoxului creat de potențialul atât pro-, cât și anticarcinogenic reprezintă una dintre cele mai importante frontiere actuale ale imunologiei cancerului.
Capacitatea răspunsului imun (dobândit) de a crește carcinogeneza a devenit evidentă o dată cu observația clinică conform căreia inflamația cronică poate conduce la cancer. Unul dintre cele mai bune exemple este infecția cu virus hepatitic C (VHC), care conduce la un status cronic persistent la majoritatea pacienților. Hepatita cronică este asociată cu dezvoltarea carcinomului hepatocelular la o rată de 1% pe an. Spre deosebire de alte infecții cronice procarcinogenice (ex. HPV), genomul VHC nu prezintă oncogene proprii, sau gene care pot inactiva genele supresoare de tumori. De aici, dovada că răspunsul inflamator cronic este responsabil pentru geneza cancerului hepatocelular. Similar, răspunsul inflamator asociat cu infecția gastrică cu H. pylori pare să joace un rol central în geneza cancerelor de stomac. Pe modele animale, inducerea inflamației cronice la nivelul colonului și ficatului este asociată cu creșterea incidenței cancerului în aceste organe.
Astfel, dacă inflamația acută ar putea avea un efect anticarcinogenic, inflamația cronică este implicată la mai multe niveluri în carcinogeneza și progresia tumorală. Leziunile tisulare secundare unei infecții cronice sau inflamații crează un micromediu local, care poate induce direct transformarea celulară și susținerea unei creșteri celulare necontrolate.
Inflamația cronică poate induce o stare de imunosupresie, care blochează procesul imun față de celulele transformate. Aceasta poate fi rezultatul direct al acțiunii celulelor imune sau indirect (prin produșii sintetizați chiar și de celulele tumorale – citokine, chemokine, prostaglandine, RLO/NO). Trecerea de la un micromediu inflamator acut, b#%l!^+a?benefic, la unul cronic, nociv este un proces gradual, care depinde de localizarea și tipul tumorii, terenul genetic, durata expunerii nocive din mediul înconjurător, vascularizația, dar dacă se realizează un echilibru, aceasta va favoriza supravegherea imună.
În ultimul timp s-au acumulat dovezi conform cărora anumite tipuri de răspuns a celulelor T (Th1) pot fi potențial anticarcinogenice. Răspunsurile Th1 sunt caracterizate de producția de IFNy de către LT-CD4+, ca și inducția de răspunsuri ale LT-CD8+; IFNy- activează și componentele imunității dobândite, precum macrofagele, care vor distruge celulele tumorale. Răspunsurile Th1 sunt induse de semnalele STAT1 și sunt semnificativ stimulate de IL-12 (produsă de macrofage sau DC). IL-12 nu activează numai răspunsul Th1, ci și activitatea NK, care va contribui la atacul distructiv asupra celulelor tumorale. Recent, a fost descrisă o familie distinctă de citokine IL-12 (numită IL-23), ce modulează răspunsurile NK dependente și cele adaptative de tip TH1 și promovează creșterea distinctă a unei subpopulații de celule T helper, numită Th17. Probabil, manipularea terapeutică a căii STAT ar putea converti căile procarcinogenetice spre cele anticarcinogenetice ale răspunsului imun.
Progresele recente în înțelegerea aspectelor esențiale ale imunologiei celulare și a interacțiunilor imune tumoră-gazdă au condus la dezvoltarea unor terapii imune capabile să medieze rejetul celulelor canceroase metastatice la canini. Acestea includ modalități de abordare nespecifice, precum cele care implică imunizarea directă a pacienților cu o varietate de imunogeni, dar și modalități care implică transferul adaptativ al celulelor efectorii activate. Trei direcții principale ale imunoterapiei sunt disponibile actual:
Stimularea nespecifică a reacțiilor imune: stimularea celulelor efectorii; inhibarea celulelor reglatoare.
Imunizarea activă pentru a crește reacțiile anti-tumorale (vaccinurile anticanceroase).
Transferul pasiv al celulelor imune activate cu activitate antitumorală (imunoterapia adoptivă).
Utilizarea vaccinurilor în cancere au fost experimentate de mai mult de un secol. Teoria supravegherii imune și rezultatele reinjectării extractelor tumorale, bine demonstrate pe modele animale, au motivat strategiile de vaccinare umană. În ultimii zece ani, au fost caracterizate numeroase Ag tumorale canine (și răspunsul imun umoral și celular la acestea). Inițial, vaccinurile tumorale au utilizat extracte tumorale mixate cu un agent adjuvant, în speranța că unele TAA vor determina un răspuns imun eficace.
Pentru cancerele inițiate sau promovate de virusuri, este posibil ca un vaccin derivat din virusurile inactivate sau preparat din Ag să prevină debutul bolii maligne. Printre primele vaccinurile testate au fost și cele anti-virus Epstein-Barr (EBV). Virusul HVB, (implicat în etiologia hepatocarcinomului) și virusul HTLV-1 (asociat leucemiei cu celule T a adultului) ar putea fi ținta unor vaccinări.
O altă opțiune este stimularea expresiei antigenului țintă, în asociere cu antigenele de tip MHC, de către celula tumorală, pe baza transfecției de material genetic utilizând b#%l!^+a?virusuri recombinate. De exemplu, un agent care a demonstrat rezultate promițătoare este anticorpul monoclonal citolitic împotriva Ag limfocitic T4.
Transferul unor gene care codifică Ag tumoral-specifice poate fi utilizat pentru a scădea toleranța imună. O altă modalitate de abordare, este administrarea unor celule efectorii activate sau a APC încărcate cu antigen. Eficacitatea acestor celule poate fi crescută, dacă sunt manipulate genetic să exprime antigene, citokine sau molecule co-stimulatorii (terapia genică ex vivo). Astfel, pentru activarea eficientă a celulelor efectorii pot fi utilizate celulele dendritice autologe, care exprimă molecule co-stimulatorii (CD80 sau MHC clasa I și II). Rezultatele vaccinoterapiei, care stimulează răspunsul imun la pacienții canini cu cancer sunt, până în prezent, dezamăgitoare. Actual, nu există dovezi clinice convingătoare asupra eficacității vaccinurilor și corelării răspunsului imun cu un vaccin, eficacitatea clinică rămânând iluzorie. Mai multe vaccinuri anticanceroase, potențial eficace, sunt însă incluse în prezent în studii de fază III.
Celulele tumorale pot exprima antigene specifice, care sunt diferite sau într-o densitate mai mare față de celulele normale. Aceste antigene pot fi utilizate pentru a produce anticorpi monoclonali specifici (AcMo), făcându-le ținte posibile pentru imunoterapie. De asemenea, acești anticorpi pot fi utilizați ca vectori pentru radioizotopi, toxine sau citostatice, cu toxicitate sistemică minimă. Tehnologia AcMo a adus o contribuție importantă și la identificarea și diagnosticul tumorilor, contribuind la studiul antigenelor tumorale și la caracterizarea fenotipică a neoplaziilor hematopoietice și a tumorilor solide.
Prima generație de AcMo au fost produși prin imortalizarea celulelor B murine, rezultând o proteină cu efecte imunogenice limitate și capacitate redusă de a recruta mecanismele imune efectorii. Aceste neajunsuri au fost depășite prin himerizarea și umanizarea AcMo.
AcMo prezintă diferite efecte: citotoxicitatea celulară dependentă de anticorpi (ADCC) sau de complement (CDC), alterarea semnalelor de transducție (transmitere) în celulele tumorale, eliminarea antigenelor critice de suprafața celulelor. Pot fi direcționați spre o varietate de ținte: proteinele celulare de suprafață (atât din tumorile solide, cât și din celulele maligne circulante); Ag asociate stromei tumorale; Ag asociate vascularizației tumorale (VEGF); liganzii care susțin creșterea tumorală (EGF-R).
AcMo prezintă actual un loc în tratamentul cancerului. Până în prezent, opt astfel de molecule sunt înregistrate pentru utilizare în oncologie (de exemplu: rituximab și alemtuzumab în limfoamele non-Hodgkin de tip B, cetuximab, trastuzumab, panitumumab și bevacizumab în tumorile solide). Totuși, costul și efectele lor secundare limitează utilizarea acestora în practica clinică.
Identificarea de noi ținte funcționale și de noi epitopi pe țintele existente va extinde numărul cancerelor, care beneficiază de tehnologia anticorpilor monoclonali.
Scopul imunoterapiei active (vaccinarea) în terapia cancerului, este reprezentat de generarea sau amplificarea răspunsului imun împotriva celulelor tumorale. Rațiunea acestei terapii este reprezentată de posibilitatea exploatării funcțiile sistemului imun, cu efecte b#%l!^+a?adverse reduse sau fără toxicitate. Majoritatea tumorilor exprimă antigene specifice tumorale, prin urmare pot deveni ținte specifice pentru sistemul imun. Aceste ținte sunt reprezentate de proteine exprimate într-un anumit stadiu al diferențierii celulare (AFP, ACE) sau proteine exprimate în cantități reduse în celulele normale, dar la un nivel superior în celulele tumorale, cum sunt factorii de creștere, receptorii factorilor de creștere și proteine codate de oncogene.
Nu există, întotdeauna, un răspuns imun spontan împotriva antigenelor specifice tumorale sau, dacă există, acesta nu poate inhiba proliferarea celulelor tumorale, deoarece acestea au dobândit multiple mecanisme de eludare a sistemului imun. Pentru a fi eficient, sistemul imun trebuie să genereze un răspuns dirijat împotriva antigenelor specifice tumorale (care sunt self), fiind esențială tranziția de la toleranță la imunitate. Scopul unui vaccin antitumoral este de a genera un răspuns imun eficient antitumoral și o memorie de lungă durată. Deci, pentru a realiza acest deziderat, sunt necesare următoarele condiții: direcționarea b#%l!^+a?componentei celulare a sistemului imun către antigenele specifice tumorale; alterarea toleranței față de self; combaterea mecanismelor tumorale de eludare a sistemului imun
Utilizarea vaccinurilor în cancere au fost experimentate de mai mult de un secol. Teoria supravegherii imune și rezultatele reinjectării extractelor tumorale, bine demonstrate pe modele animale, au motivat strategiile de vaccinare. În ultimii zece ani, au fost caracterizate numeroase Ag tumorale canine (și răspunsul imun umoral și celular la acestea).
Inițial, vaccinurile tumorale au utilizat extracte tumorale mixate cu un agent adjuvant, în speranța că unele TAA vor determina un răspuns imun eficace.
Pentru cancerele inițiate sau promovate de virusuri, este posibil ca un vaccin derivat din virusurile inactivate sau preparat din antigene virale să prevină debutul bolii maligne. Printre primele vaccinurile testate au fost și cele anti-virus Epstein-Barr (EBV). Virusul HVB, (implicat în etiologia hepatocarcinomului) ar putea fi ținta unor vaccinări.
Înainte de intra în studiul celulelor dendritice și NK la canine, îmi propun să prezint succint MLT.
MLT reglează multe funcții imunitare, precum citotoxicitatea celulelor natural-killer (NK), producția de anticorpi, proliferarea limfocitară, producția de y-IFN, funcționarea celulelor Th2. Câteva experimente au arătat implicarea indirectă a MLT asupra sistemului imun prin sistemul endogen opioid, care este capabil sa controleze funcția limfocitelor si macrofagelor sau direct asupra funcției măduvei spinării.
Finocchiaro și colaboratorii au arătat ca leucocitele mononucleare din sângele periferic au capacitatea de a metaboliza 5-hidroxitriptamina în melatonină.
Pe lângă controlul asupra sistemului imunitar, MLT are rol antitumoral. Hormonul poate acționa singur sau sinergic cu IL-2 în limfocite. Pinealectomia stimulează creșterea unor tumori, iar injectarea MLT provoacă scăderea ratei de creștere a tumorii. Pe lângă efectul MLT în limfocite, MLT activează monocitele/macrofagele, inducând în acest tip de celule producerea b#%l!^+a?IL-1 si de intermediari reactivi ai oxigenului și răspunsul macrofagelor la stimularea cu LPS (lipopolysaccharide). Efectele MLT în limfocite și macrofage evidențiază proprietățile antitumorale ale neurohormonului.
Abilitatea MLT de a contracara imunodepresia sau/și a stimula funcția imună se poate explica prin existenta receptorilor specifici de legare la nivelul limfocitelor T helper. Un pas înainte pentru înțelegerea acțiunii circadiene a MLT a fost clonarea familiei de receptori pentru MLT cuplați cu proteinele G. Subtipurile receptorilor pentru MLT sunt: Mel 1a, Mel 1b, Mel 1c, cu domenii Kd între 20-160pM.
Situsuri cu activitate mare pentru MLT au fost descrise în omogenatele membranare de timus, bursa lui Fabricius si splină la un număr de păsări si mamifere, inclusiv la canine. O serie de studii au stabilit prezenta situsurilor de legare a 2I125 MLT în splina păsărilor și mamiferelor.
Situsuri de legare de pe splenocite sunt localizate mai degrabă la nivel nuclear, decât la nivel membranar și manifestă reversibilitate, afinitate mare, specificitate, sensibilitate la lumină, precum si dependență de timp și temperatură.
Datele care sprijină existența receptorilor de membrană includ studiul căii transducerii semnalului pentru MLT în limfocite, dar și semnificația fiziologică a situsurilor de legare a MLT în aceste celule. A fost studiată producția cAMP si cGMP în limfocite. MLT indică o creștere a producției cGMP în limfocite într-un mod dependent de doză. MLT singură nu poate să activeze sau să inhibe producția de cAMP la orice doză studiată. Efectul MLT în reglarea producției cAMP a fost studiat pe splenocite. Rezultatele arată că producția cAMP nu este afectată de MLT în orice condiții experimentale, dar este clar crescută de forskolin, un activator al adenilatciclazei. MLT inhibă parțial producția de cAMP stimulată de forskolin, deși efectul a fost observat la doze farmacologice de MLT.
Situsul central de acțiune al MLT este hipotalamusul. Nucleul suprachiasmatic si eminenta mediană / regiunea pars tuberalis conțin de asemenea situsuri de legare pentru MLT. Situsuri de legare pentru MLT s-au găsit și în talamus, subiculum și aria postrema.
Acțiunea imunofarmacologică a MLT pare sa fie mediată de celule T helper activate, care arată o sinteză crescută și/sau eliberare a citokinelor, IL-2, IFN y și peptide opioide. Limfocitele T par să fie ținta principală a MLT, la care concentrații fiziologice de MLT stimulează producția IL-2.
Stimularea imună si efectul antistres este neutralizat de opioidul antagonist naltrexona.
MLT se leagă la receptorii specifici pentru MLT de pe membrana celulelor Th și stimulează producția de IFN y, IL-2 și MIO, care upreglează răspunsul imun. Mesagerii secunzi nu sunt complet studiați, dar includ proteina G si inhibă producerea cAMP.
Efectul imunoterapeutic al MLT împotriva virusului encefalitei sau infecției bacteriene poate fi explicat prin creșterea IFN y și/sau IL-2, precum și o creștere a mielopoezei datorită acțiunii hematopoetice a MIO. Un mecanism care implică citokinele Th1 poate fi justificat prin capacitatea MLT de a reface statusul imunodeficitar secundar datorat vârstei, traumei hemoragice sau prin capacitatea de a avea acțiuni sinergice cu IL2 la pacienții canini cu cancer.
În privința abilității MLT de a contracara involuția timusului si imunodepresia produsă de stres sau tratamentului cu glucocorticoizi, mediatorii majori par sa fie MIO.
Pe baza a numeroase studii, care implică opioidele endogene în imunoreglare și a constatării că MLT are proprietăți analgezice și anticonvulsante, s-au luat în considerare peptidele opioide ca posibili mediatori în acțiunea imunologică a MLT. S-a observat că antagonistul specific opioid, naltrexona, este capabil să anuleze imunostimularea și efectul antistres al MLT. S-au mimat efectele imunologice ale MLT prin folosirea peptidelor opioide cunoscute, cum este dinorfina 1-13 si β-endorfina. Aceasta sugerează posibilitatea ca MLT să poată stimula celulele imunodependente activate să elibereze peptide opioide. Concentrații fiziologice de MLT pot stimula eliberarea peptidelor opioide prin activarea limfocitelor T helper. Aceste opioide imunoinduse de MLT (MIIO) mediază imunostimularea si efectul antistres al MLT.
Studii recente au arătat că opioidele induse de MLT (MIIO) pot media o interesantă acțiune hematopoetică a MLT. MLT apără organismul (sistemul sangvin) de acțiunea toxică a agenților chimioterapeutici administrați caninilor ce prezintă tumori. Studiile realizate au arătat implicarea IL-4 în această funcție, iar investigațiile mai complete au relevat faptul că presupusa IL-4 face parte dintr-un grup de opioizi, două polipeptide cu GM de 15 si 67 Kda care sunt recunoscute de anti-IL-4, anti-secvența opioid comună (Tyr-Gly-Gly-Phe) si Ac anti-dinorfină. b#%l!^+a?
Celulele Th2 determină eliberarea peptidelor, care conțin encefalină; structura moleculară a acestor substanțe previne efectul mediat de receptorii opioizi. Din contră, MIO exprimă la capătul NH2 terminal, o secvență comună cu opioizi, care este esențială pentru orice răspuns mediat de receptorii opioizi si acțiunea lor este naltrexon sensibilă, ceea ce indică efectul opioid. Aceste rezultate susțin faptul că MIO poate aparține unei noi clase de citokine T-helper sau unei familii de opioide. MLT crește secreția de IL-2 și y INF, dar nu și pe cea de IL-4, fiind posibil ca celulele Th1, mai mult decât Th2, să fie țintă pentru MLT. Ambele citokine, și IL-2 și IFNy sunt cunoscute pentru că stimulează activitatea NK și/sau alți parametri imuni.
Într-un studiu recent se observă că, concentrații fiziologice de MLT pot stimula producerea de IFNy de către limfocitele activate si că naltrexona contracarează efectele MLT. Aceasta poate sugera că MIIO sunt implicate în efectele MLT în producerea yIFN. Aceste studii relevă că yIFN este capabil să moduleze atât direct, în pinealocite, cât și indirect, via mecanisme neurale, sinteza MLT în glanda pineală. Aceste studii sugerează existența conexiunilor fiziologice bidirecționale între producerea celulelor imunocompetente activate și MLT.
Peptide opioide ale SNC au fost implicate atât în explicarea unor efecte ale MLT sau modulatori ai activității NK. Atât GH cât și PRL au fost raportați a crește activitatea NK și că ar fi influențați de MLT.
În ceea ce privește legarea opioidelor la celulele imunocompetente, rezultatul implică prezența situsurilor de legare în glanda timică. S-a observat că membrana timică prezintă situsuri de legare specifice pentru opioide cu afinitate mare, dar și cu afinitate mică.
Cancerul este asociat adesea cu o scădere a secreției de MLT și reactivitate imună. Strategii recente în imunoterapia cancerului sunt centrate în jurul mecanismelor de activare a citotoxicității naturale. Celulele NK și LAK lizează celulele maligne sau infectate viral, în timp ce celulele normale nu sunt afectate.
Interesant este că IL-2 poate potența activitatea NK și genera celule LAK de la NK. MLT pare să fie un bun candidat pentru combinația cu IL-2 în imunoterapia cancerului. Multe studii dovedesc că glanda pineală și MLT sunt efectori puternic oncostatici.
2.1. Locul ocupat de celula dendritică în hematopoieza la canine
Celulele auxiliare sunt ansamblul celulelor implicate în răspunsul imun, în afară de limfocite. Celulele auxiliare reprezintă o populație heterogenă și îndeplinesc funcții pe ambele ramuri ale răspunsului imun: aferentă și eferentă.
Ramura aferentă reprezintă ansamblul proceselor de transmitere a informației, care se produc din momentul apariției Ag în organism și recunoașterea lui ca non-self, până la activarea completă a limfocitelor efectoare: LB și LTC. Pe calea aferentă, celulele auxiliare îndeplinesc funcții importante în: captarea și fagocitarea Ag; prelucrarea și fragmentarea Ag; prezentarea epitopilor pe membrană, în complex cu moleculele MHC II; secreția de citokine care activează limfocitele.
Ramura eferentă reprezintă ansamblul proceselor prin care sunt degradate și eliminate Ag solubile și corpusculate: captarea și fagocitarea complexelor imune; distrugerea celulelor țintă acoperite de anticorpi; degradarea resturilor celulelor distruse; secreția de citokine și alți mediatori proflogistici.
Celulele auxiliare pot fi: celule cu rol de APC, care se mai numesc și APC profesioniste: macrofagele, celulele dendritice, LB; celule fără rol de APC: PMN circulante (neutrofilele, eozinofilele, bazofilele) și mastocitele; APC ocazionale, adică celule care în anumite condiții de stimulare pot avea funcție de APC: neutrofilele, celulele endoteliale, celulele epiteliale.
APC sunt singurele celule care vin în contact cu Ag timodependente sub formă nativă. APC prelucrează aceste antigene și prezintă limfocitelor fragmente din ele.
APC au trei funcții: declanșează, întrețin și participă la reglarea intensității răspunsului imun. Pentru îndeplinirea acestor funcții, APC cooperează cu: limfocitele imunoreglatoare, care controlează intensitatea răspunsului imun: LTH, LTS, LTCS; limfocitele efectorii: LB (implicate b#%l!^+a?în RIU) și LTC (implicate în RIC)
Celulele dendritice sunt specializate în prezentarea Ag. Ele se caracterizează printr-o structură arborescentă, cu un corp celular cu puțină citoplasmă perinucleară și numeroase prelungiri ramificate, care pătrund printre celulele din jur. Aceste pseudopode au un aspect asemănător cu dendritele neuronilor: sunt foarte multe, de ordinul sutelor pe o celulă; sunt foarte subțiri și lungi, depășind de 4-5 ori diametrul celulei.
Datorită lungimii lor, pseudopodele celulelor dendritice permit supravegherea unor spații întinse de țesut cu ajutorul unui număr relativ mic de celule.
Celulele dendritice au rol de APC, pentru că pot să capteze și să prezinte Ag. Ele au pe suprafață principalii receptori implicați în funcția de APC: CR, Fc y R și pot să sintetizeze moleculele MHC II. Celulele dendritice îndeplinesc în cadrul răspunsului imun următoarele funcții: captează Ag de la porțile de intrare; transportă Ag spre organele limfoide secundare – ganglionii limfatici și splină; prezintă în organele limfoide secundare Ag spre LB și LT.
Toate celulele dendritice se produc în măduva hematogenă și apoi trec în sânge. Din sânge majoritatea intră în țesuturi și organe, la porțile de intrare a Ag. Acestea sunt celulele Langerhans și celulele dendritice interstițiale. Un număr mai mic dintre celulele dendritice intră direct în organele limfoide secundare, în regiunile cu LB așezate în foliculi limfoizi. Acestea sunt celulele dendritice foliculare.
Celulele dendritice din tegumente și submucoase se numesc celule Langerhans. Ele sunt așezate la porțile de intrare ale Ag în organism: în special subcutanat, în strat aproape continuu în stratul spinos al epidermului; la nivelul submucoaselor bucală, faringiană, bronșică, digestivă, a colului uterin.
Rolul celulelor Langerhans este de captare a Ag opsonizate, de aceea au receptorii de suprafață CR și Fc y R. Celulele Langerhans nu prezintă antigene, de aceea nu sintetizează b#%l!^+a?moleculele MHC II.
După ce celulele Langerhans captează Ag din țesutul subcutanat și submucos, ele trec în limfă și se transformă în celule cu văluri, care au numai rol de transport al Ag, așa că ele nu au pe suprafață nici receptori pentru Ag, nici molecule MHC II.
Celulele cu văluri ajung în ganglionii limfatici, în zonele populate cu LTH. Acolo ele se transformă în celule dendritice interdigitate, care prezintă Ag spre sute de LTH, cu ajutorul moleculelor MHC II.
Celulele dendritice interstițiale se găsesc în interstițiul organelor nelimfoide: ficat, rinichi, plămân, cord. Ele captează Ag, motiv pentru care au receptorii de suprafață CR și Fc y R.
Celulele dendritice interstițiale nu prezintă Ag, de aceea nu sintetizează moleculele MHC II. După ce celulele dendritice interstițiale captează Ag, ele trec în sânge și se transformă în celule dendritice sanguine. Ele ajung în pulpa albă a splinei, unde se transformă în celule dendritice interdigitate și prezintă Ag spre LTH.
Celulele dendritice foliculare. O mică parte din celulele dendritice produse de măduva hematogenă intră direct în organele limfoide secundare, respectiv în ganglionii limfatici și pulpa albă a splinei, în zonele populate cu LB.
Celulele dendritice foliculare captează și concentrează Ag solubile, pe care le prezintă spre LB, care sunt grupate sub formă de foliculi limfoizi.
Celulele dendritice foliculare au pe suprafață un număr mare de receptori FcyR și CR. Ele prezintă prelungiri filiforme acoperite cu antigene, care în 2-3 zile devin moniliforme, apoi se fragmentează în iccosomi (immune complexes coated bodies). Iccosomii sunt particule mici de citoplasmă învelite cu antigene. LB captează iccosomii, prelucrează Ag și le prezintă apoi spre LTH, pe moleculele MHC II. În această etapă LB au funcție de APC.
LB stimulate antigenic pot să aibă funcție de APC pentru că: au pe suprafață receptorii de captare a Ag: CR, Fc y R, BCR; produc MHC II.
Captarea Ag de către LB are următoarele caractere: LB captează numai Ag solubile, adică proteine simple; captarea Ag este în principal imunologic specifică (ea se face cu receptorii BCR, care recunosc determinanții antigenici conformaționali din Ag solubile); într-o măsură mai mică la captarea Ag participă și receptorii CR și Fc y R, astfel că LB fac și captare b#%l!^+a?imunologic nespecifică.
Neutrofilele se nasc în măduva hematogenă, din celula sușă comună pentru monocite și granulocite. Din seria granulocitară se diferențiază neutrofilele (peste 90%), eozinofilele și bazofilele.
Neutrofilele trăiesc sub 24 h, chiar dacă nu extravazează spre un focar inflamator. Cam jumătate din ele se deplasează lent, rostogolindu-se pe endoteliu.
În zonele cu procese inflamatorii neutrofilele extravazează prin diapedeză și sunt atrase prin chemotactism. Factorii chemotactici sunt: produșii bacterieni, anafilatoxinele, IL-8.
Neutrofilele posedă receptori Fc y R și CR. Ele fagocitează: complexe imune formate din antigene, anticorpi și fracțiunea C3b; bacterii opsonizate; mai puțin celule mici, de exemplu hematii
Dacă capacitatea lor de fagocitoză este depășită, neutrofilele deversează în exterior enzimele lizozomale și radicalii de oxigen producând leziuni tisulare.
Moleculele cu ajutorul cărora APC prezintă epitopii sunt de fapt Ag de histocompatibilitate din sistemul HLA, numite MHC (major histocompatibility complex), cu structură asemănătoare imunoglobulinelor.
Moleculele MHC au o structură antigenică proprie pentru fiecare organism. Ele sunt un fel de carte de vizită pentru fiecare celulă a organismului. Singurele organisme cu molecule MHC identice sunt gemenii univitelini și așa-numitele animale consangvinizate sau de linie pură (inbred), care au genomul identic. Din acest motiv grefele între gemenii univitelini se numesc izogrefe și sunt acceptate perfect de donor.
Moleculele MHC I se găsesc pe membranele tuturor celulelor din organism, cu excepția hematiilor. Ele sunt fabricate în reticulul endoplasmic.
Moleculele MHC I sunt formate din două lanțuri: α și β.
Lanțul α este mai greu și are următoarea structură: un segment scurt intracitoplasmatic; un segment transmembranar hidrofob; un segment lung extracelular, cu trei bucle (domenii) formate prin punți disulfurice. Fiecare domeniu are cam 100 de aminoacizi. Domeniile α1 și α2 sunt așezate la exterior. Ele au structură variabilă și se numesc domeniile polimorfe, adică variază de la celulă la celulă. Ele sunt așezate față în față și formează împreună o cavitate numită situsul combinativ pentru Ag. Acesta prezintă antigenele endogene. Domeniul α3 se află lângă membrană. El este identic pentru toate celulele din organism, motiv pentru care se numește domeniul constant sau monomorf. Domeniul α3 este specific pentru fiecare organism.
Lanțul β (β-2-microglobulina) are o greutate moleculară mică și este legat de domeniul α3. Lanțul β este constant pentru toți indivizii unei specii.
Domeniul α3 și lanțul β au o structură Ig-like, în timp ce domeniile α1 și α2 au o structură în foaie pliantă (β-sheet).
Moleculele MHC I au funcții în cooperarea celulară, prezentarea Ag și rejetul grefelor:
Când celula somatică respectivă cooperează cu LTC sau LTS, aceste limfocite recunosc mai întâi domeniul α3.
MHC I prezintă Ag endogene, adică Ag, care provin din citoplasma celulei: Ag virale și Ag canceroase.
MHC I au rol în rejectia grefelor: domeniul α3 monomorf de pe celula self este recunoscut de receptorul CD8 al LTC. Dacă celula este non-self, CD8 nu recunoaște domeniul α3 și celula este distrusă.
Moleculele MHC II se găsesc numai pe membranele celulelor cu rol de APC. Ele se sintetizează în reticulul endoplasmic.
Moleculele MHC II sunt formate din două lanțuri, α (mai greu) și β (mai ușor). Lanțurile au structură Ig-like. Fiecare dintre cele două lanțuri are: un segment scurt intracitoplasmatic; un segment transmembranar hidrofob; un segment lung extracelular, care are două domenii formate prin punți disulfurice. Fiecare domeniu are cam 100 de aminoacizi. Cele două domenii sunt așezate pereche. Domeniile α1 și β1 sunt așezate la exterior. Ele au b#%l!^+a?structură variabilă și se numesc domeniile polimorfe, adică variază de la celulă la celulă. Ele sunt așezate față în față și formează împreună o cavitate numită situsul combinativ pentru Ag. Structural domeniile α1 și β1 seamănă cu domeniile α1 și α2 ale MHC I. Situsul combinativ prezintă Ag exogene. Domeniile α2 și β2 sunt identice pentru toate celulele din organism și reprezintă domeniile monomorfe ale MHC II.
Moleculele MHC II au funcții în cooperarea celulară și în prezentarea epitopilor:
MHC II sunt foarte importante pentru cooperarea celulară a APC cu LTH, mai ales domeniul α2, care este recunoscut de receptorul CD4 al LTH.
MHC II prezintă spre LTH epitopii Ag exogene, care au fost captate și prelucrate de APC.
MHC II au importanță minoră în reacția de respingere a grefei, prin domeniul α2.
Moleculele MHC prezintă fragmentele peptidice și polizaharidice antigenice spre LT. LT pot să recunoască numai Ag prezentate de MHC.
Ambele tipuri de MHC sunt sintetizate în același sector celular, reticulul endoplasmic rugos, dar ele prezintă diferențiat Ag, pentru că se cuplează cu epitopii în regiuni diferite ale celulei.
Moleculele MHC I primesc în situsul combinativ fragmente polipeptidice, care rezultă prin degradarea intracitoplasmatică a Ag endogene: Ag virale și moleculele proprii modificate, de exemplu neoantigenele.
Ag se asociază cu situsul combinativ al MHC I în reticulul endoplasmic, în momentul formării moleculei MHC I. Molecula MHC I nu se mai desface, astfel că Ag endogen rămâne sechestrat definitiv în molecula MHC I.
Moleculele MHC II primesc și eliberează ușor Ag exogene. Sinteza MHC II se face în reticulul endoplasmic, dar încărcarea cu Ag exogene se face în fagolizozomi (endozomi). MHC II sunt recirculate între fagolizozomi și suprafața celulei APC. La fiecare recirculare ele primesc un nou fragment antigenic.
Clasificarea Ag în endogene și exogene strict după origine este incorectă. Corect Ag se clasifică astfel, indiferent de origine:
Ag endogene sunt toate Ag, care se cuplează cu moleculele MHC I în reticulul endoplasmic.
Ag exogene sunt toate Ag (indiferent de origine), care se cuplează cu moleculele MHC II în fagolizozomi.
Macrofagele (MF) provin din monocite, care se găsesc în sânge, în țesuturi și în cavitățile naturale ale organismului. Monocitele se formează în măduva hematogenă dintr-un precursor comun cu PMN.
Din punct de vedere funcțional monocitele sunt celule imature, în tranzit prin sânge de la locul de origine – măduva hematogenă, spre țesuturi. Ele reprezintă între 1 și 9% din totalul leucocitelor sanguine.
Monocitele rămân în circulație aproximativ 3 zile, după care sunt activate la contactul cu anumite substanțe, aderă de endoteliu, trec în interstițiu prin diapedeză și se localizează în diverse țesuturi și organe. Extravazarea este ireversibilă. Raportul estimat dintre MF tisulare și monocitele sanguine este de 400/1.
Monocitele aderă de endoteliu datorită unor molecule de adeziune de pe suprafață. Aderarea se face numai pe anumite zone ale endoteliului, situate în vecinătatea unui focar imun. Celulele APC din focarul imun, respectiv MF și celulele dendritice, eliberează o serie de citokine – IL-1, TNF α și IFN y – care stimulează celulele endoteliale din vecinătate. Acea zonă de endoteliu modificat se numește PEV (Plane Endotelial Vessel – endoteliu vascular plat). Celulele endoteliale din zona PEV exprimă pe suprafață anumiți receptori de adezivitate pentru monocite și limfocite: ICAM, VCAM, adezine. În țesuturi monocitele stimulate se deplasează sub acțiunea unor factori chemotactici.
Sub acțiunea unor citokine produse de limfocite, mai ales IFN y și IL-2, monocitele se a?maturează, transformându-se morfologic și funcțional în MF rezidente și apoi în MF activate. a?MF activate sunt capabile să realizeze funcția de APC. MF tisulare au o durată de viață de câteva luni.
Transformarea monocitelor în MF presupune schimbări importante: dimensiunea celulelor crește de 5-10 ori, astfel că MF au diametre de 25-50 microni; intracelular crește numărul și dimensiunea mitocondriilor și lizozomilor, iar aparatul Golgi se dezvoltă; celulele devin multinucleate prin fuzionare sau prin endomitoză; citoplasma emite numeroase pseudopode, care dau la microscopul electronic un aspect de meduză cu prelungiri fine și dantelate.
MF sunt prezente difuz în organism, la nivelul țesutului conjunctiv și în apropierea membranei bazale a vaselor sanguine mici. Ele se află în număr mare în zonele, unde există un aflux important de antigene: plămâni, ficat, splină și ganglionii limfatici.
Pe lângă MF din țesuturi există și MF libere în cavitățile seroase: MF peritoneale, pleurale și sinoviale. În anumite țesuturi și organe se găsesc forme particulare de MF, prezentate în tabelul 1.
Tabelul 1. Forme particulare de macrofage
Monocitele și MF se pot deplasa prin chemotactism, adică migrează direcționat spre diverși stimuli chemotactici, prezentați în tabelul 2.
Tabelul 2. Factorii chemotactici pentru monocite și macrofage
MF au funcții complexe, fiind implicate în apărarea nespecifică și specifică. Funcțiile MF derivă din capacitățile lor specifice: capacitate fagocitară mai mare, decât a neutrofilelor; capacitate de diferențiere a structurilor self de cele non-self; capacitate de diferențiere a structurilor self normale de structurile self senescente și self neoplazice.
MF au pe suprafață numeroși receptori pentru diverși liganzi: b#%l!^+a?
Receptorii Fc y R pentru IgG din complexele imune solubile și pentru IgG care au opsonizat bacteriile;
Receptorii CR1 pentru C3b din complexele imune solubile și pentru C3b care au opsonizat nespecific bacteriile;
Receptori pentru membrana bacteriilor și a levurilor;
Receptori pentru α-2-macroglobulină, care formează complexe cu enzime cum ar fi trombina și plasmina sau cu alte proteine pe care le transportă spre MF;
Receptori pentru glicocalixul celulelor self alterate.
MF se activează si fagocitează liganzii respectivi sub forma unor vezicule numite fagozomi, care se unesc cu lizozomii și formează fagolizozomii, în care substanțele endocitate sunt degradate de enzimele lizozomale, în principal hidrolaze și proteaze.
Prin substanțele exocitate (enzime și radicali de oxigen), MF activate au acțiune intens citotoxică asupra unor antigene corpusculate, care nu pot fi fagocitate și pe care MF neactivate nu pot să le distrugă: celule tumorale; bacterii: Lysteria monocytogenes, Mycobacterii; levuri: Candida; protozoare: Trypanosoma, Leishmania, Toxoplasma.
Pe lângă Ag corpusculate, sunt afectate și celulele normale din vecinătate, care se b#%l!^+a?apără parțial prin mecanisme protectoare, în special contra radicalilor de oxigen (catalază, glutation-peroxidază). În focarul imunologic se produce un grad de distrugere tisulară. Distrugerea excesivă a celulelor normale din vecinătate caracterizează hipersensibilitatea de tip IV întârziată.
MF participă la răspunsul imun datorită funcției lor de APC profesioniste. În funcția de APC, MF parcurg o serie de etape: captarea Ag; fagocitoza Ag; prelucrarea Ag; conservarea epitopilor; prezentarea epitopilor.
Captarea Ag. MF captează în special Ag corpusculate: bacterii, virusuri, paraziți mici, fragmente de celule self devenite antigenice. Captarea este un proces imunologic nespecific, adică se face la fel, indiferent de structura Ag. Captarea Ag se face prin receptorii membranari CR și Fc y R.
Ag corpusculate se află sub două forme: opsonizate sau neopsonizate. MF captează în special Ag opsonizate, adică acoperite cu molecule solubile cu rol de opsonine: C3b sau IgG.
Moleculele de C3b se găsesc permanent în lichidele interstițiale. C3b se produce continuu, în cantități mici, pe calea alternă a complementului. Moleculele C3b se depozitează pe toate suprafețele non-self, indiferent de specificitatea antigenică a acestora. După opsonizarea Ag corpusculate cu C3b, acestea sunt captate de MF, care au pe suprafață receptori pentru C3b, numiți CR (CR1 și CR3).
IgG se găsesc în cantități mari în lichidele interstițiale și în sânge. Moleculele de IgG recunosc determinanții antigenici de pe suprafața bacteriilor, de care se leagă prin fragmentul Fab. MF captează bacteriile opsonizate pentru că au pe suprafață receptori pentru fragmentul Fc al IgG, numiți Fc y R.
MF pot să capteze, cu eficiență scăzută, și bacterii neopsonizate, prin receptori care recunosc oligozaharidele din membrana bacteriană (fucoză și manoză).
Endocitarea Ag sau fagocitoza. Endocitarea este un proces complex, care se face prin emiterea de pseudopode mobilizate printr-un sistem contractil acto-miozinic. Pseudopodele se unesc înglobând Ag corpusculat într-o vacuolă numită fagozom.
Prelucrarea Ag endocitate. După fagocitarea Ag corpusculat receptorii membranari sunt reutilizați. Fagozomul se unește cu lizozomii din citoplasma MF, rezultând o veziculă numită fagolizozom sau endozom. Ag nativ endocitat este fragmentat de enzimele din lizozomi, în special de proteaze și hidrolaze. Problema este degradarea limitată a Ag. Dacă nu este degradat, sau dacă este degradat complet, Ag nu poate fi prezentat spre LT. De exemplu neutrofilele fagocitează Ag, dar îl degradează complet.
Din fragmentele rezultate este ales fragmentul cel mai imunogen, care se numește epitop.
Conservarea epitopului. În MF se conservă o cantitate mică din epitopi, care sunt eliberați progresiv în următoarele zile. Conservarea are rol în întreținerea răspunsului imun mai mult timp și în generarea unui răspuns imun mai intens printr-o stimulare mai puternică și prelungită a limfocitelor.
Prezentarea epitopului. Epitopul selectat este cuplat cu moleculele MHC II și este expus pe membrana MF. Prin expunerea cuplului MHC II-epitop se face prezentarea epitopului spre alte celule cu rol imun, în special spre LTH.
Toate MF din organism au funcție de celule fagocitare, dar numai o parte pot să sintetizeze MHC II. MF care nu sintetizează MHC II nu participă la răspunsul imun.
Rolul imun al MF este complex: inițial, MF captează și prelucrează Ag corpusculate; MF transportă Ag spre ariile timo-dependente, adică populate cu LT, ale organelor limfoide periferice: paracorticala ganglionilor limfatici și PALS internă a splinei; în final, MF prezintă în aceste arii epitopii spre LTH.
Procesul diferențierii limfocitelor este deosebit de important pentru studiul celulelor dendritice și nu numai, motiv pentru care în cele ce urmează îm propun prezentarea sa la canini.
Astfel, la canini, din măduva osoasă, limfocitele migrează în ficat și splină. Unele își dobândesc competenta imunitară chiar în măduva osoasă, în ficat sau în splină, organe care îndeplinesc funcțiile bursei la păsări, iar altele migrează în timus. Acesta este circuitul primar al limfocitelor, în care se produce diferențierea independentă de antigen, în cursul căreia limfocitele devin imunocompetente. Această etapă se desfășoară în organele limfoide primare (timus, bursa lui Fabricius și echivalenții bursali ai mamiferelor, deci și la canini). În cursul ei, limfocitele dobândesc receptori specifici de antigen.
Diferențierea liniei celulare B este ulterioară diferențierii liniilor eritrocitară și mieloidaă. La canini, primul organ în care are loc diferențierea celulelor B, este ficatul fetal. Inițial, ficatul primește celule precursoare ale liniei limfoide generate în sacul vitelin, dar ulterior el însuși devine sediul funcției hematopoetice. Aceiași funcție de stimulare a diferențierii limfocitelor B ar avea-o splina fetală și chiar sângele circulant, care străbătând diferite organe dobândește capacitatea de a induce maturarea limfocitelor B.
Studiul diferențierii limfocitelor B în ficatul fetal este îngreunat, deoarece ficatul nu se poate extirpa (așa cum se pot extirpa timusul și bursa lui Fabricius), iar numărul limfocitelor este mic comparativ cu al celulelor liniei eritrocitare.
Celulele precursoare ale liniei B generate în ficatul embrionar și ulterior în măduva osoasă, nu exprimă markeri imunoglobulinici de suprafață. Ele își dobândesc competența imunitară în măduvă, în ficat sau în splină. Maturarea (dobândirea competenței) constă în exprimarea receptorului imunoglobulinic membranar. În genomul lor are loc rearanjarea genelor V, D, J ale catenei H. O dată cu rearanjarea genică, limfocitele suferă o tranziție rapidă și devin limfoblaste mari, care se divid. Prin diviziune rezultă celule pre-B mici, care exprimă catena în citoplasmă, dar nu exprimă Ig de membrana. După sinteza catenei L, moleculele de imunoglobulină se exprimă pe suprafața limfocitului.
Rearanjarea într-o combinație funcțională a genelor unuia din cei doi cromozomi, împiedică recombinarea genelor în cromozomul pereche, sugerând o explicație pentru fenomenul excluderii alelice.
Prima imunoglobulină de suprafață a limfocitelor B este IgM, ca proteină integrată, cu o densitate de peste 200.000 de molecule/celulă. Limfocitele B, care exprimă pe suprafața lor numai molecule IgM sunt considerate imature. Alături de IgM, pot să coexiste IgA sau IgG. Pe măsură ce diferențierea limfocitelor B progresează, alături de IgM apare IgD, care treptat devine dominantă cantitativ. Limfocitele B mature, în repaus (neangajate) au pe suprafața lor, nivele mai înalte de IgD decât IgM. Acestea sunt celule imunocompetente.
Limfocitele B, care nu reușesc să genereze o rearanjare funcțională a genelor pentru sinteza catenelor H și L, sunt eliminate într-un stadiu timpuriu al diferențierii lor.
După stimularea antigenică, limfocitele B mature secretă IgM, IgG (una din subclase), IgA sau IgE. Nu se diferențiază o linie celulară, care să sintetizeze izotipul IgD.
Timusul la canini, este un organ limfoid voluminos, așezat în partea superioară a b#%l!^+a?mediastinului anterior. Are origine epitelială dublă: derivă din ectodermul perechii a III-a de pungi branhiale și din endodermul celei de III-a pungi faringiene. Primordiile epiteliale fuzionează și formează primordiul timic epitelial, care pierde legătura cu faringele și lumenul dispare.
La caninii tineri, zona corticală formează 80% din țesutul timic. Celulele epiteliale sunt de forma stelată, cu numeroase prelungiri fine, care se interconectează, formând un citoreticulum. Numărul limfocitelor este mai mare decât al celulelor epiteliale. Limfocitele sunt mici și pe secțiunile colorate cu hematoxilină, zona corticală este întunecată, datorită raportului nucleo-citoplasmatic înalt al limfocitelor imature. Majoritatea limfocitelor (80-85%) sunt imature, dublu pozitive (exprimă nivele înalte ale moleculelor CD 4 și CD8) și au un nivel scăzut de molecule RCT. Ele stau în ochiurile unei rețele de celule epiteliale și celule dendritice, care exprimă molecule CMH. Moleculele CMH au rol esențial în selecția pozitivă a limfocitelor, adică maturarea lor în celule T mature. O mică proporție a limfocitelor sunt blaste.
Zona medulară este formată dintr-o rețea densă de celule epiteliale mai mari, de formă ovoidă, cu prelungiri citoplasmatice scurte, bogate în organite secretoare. În ochiurile rețelei se găsește un amestec de limfocite cu un singur marker, CD 4+ sau CD8+. Raportul celulelor CD 4+/CD8+ este 2/1. Limfocitele sunt situate printre celulele prezentatoare de antigen (celule dendritice, interdigitate și macrofage). Un număr mic (sub 1%) de limfocite timice exprimă RCT-8, diseminate în cortex și medulă.
În zona medulară, apar două tipuri de structuri, derivate din celule epiteliale: corpusculii Hassal formați din celule epiteliale dispuse concentric, cu aspect general de degenerescență și cavitățile chistice, căptușite de celule epiteliale columnare prevăzute cu microvili.
Timusul este bogat inervat, cu fibre adrenergice și colinergice, iar neurotransmițătorii: oxitocina, vasopresina și neurofizina sunt sintetizați endogen de celulele perivasculare medulare și de celulele nurse (celule epiteliale mari, asociate cu un număr mare de limfocite), ceea ce sugerează raporturile strânse ale timusului cu sistemul nervos.
În raport cu distribuția limfocitelor, timusul are patru regiuni funcționale: regiunea subcapsulară, bogată în limfocite imature (pre-T), abia intrate în timus; cortexul timic, în care limfocitele se divid cu o rată înaltă; joncțiunea cortico-medulară, formată dintr-un cordon de macrofage santinelă, cu rolul unei site celulare; regiunea medulară, cu relativ puține limfocite, care poartă markerii de suprafața proprii limfocitelor mature.
Timusul evoluează, atingând adeseori o dezvoltare maximă o dată cu maturitatea sexuală, după care începe involuția, asociată cu sensibilitatea sa la hormonii steroizi.
Figura nr. 1. Reprezentare schematică a arhitecturii generale a timusului
b#%l!^+a?
Atrofia glandei timice poate fi accelerată de corticosteroizi. Producerea unor cantități crescute de corticosteroizi sau terapia cu corticosteroizi accelerează atrofia timică. Fenomenul se numește involuție de stres, pentru că nivelul de corticosteroizi crește în stările de stres și în cele clinice. Steroizii au acțiune citolitică asupra timocitelor corticale. Limfocitele medulare sunt relativ rezistente, datorită enzimei 20 E-hidroxil steroid-dehidrogenazei.
Dezvoltarea repertoriului limfocitelor T, este un proces complex de evenimente de selecție pozitivă și negativă, ce implică interacțiunea moleculelor de suprafață și necesită influența micromediului timic. Limfocitele T au raporturi spațiale strânse cu celulele stromale epiteliale. Acestea furnizează semnale educaționale, care orientează maturarea limfocitelor în mai multe direcții: dobândirea RCT și a capacității de a recunoaște antigenele exogene; dobândirea toleranței față de self; eliminarea celulelor T self-reactive, precum și a celor care nu generează combinația genică a unui receptor funcțional.
Celulele pre-T se diferențiază în ficatul fetal și în măduva osoasă. Ele conțin o enzimă specifică – terminal deoxynucleotidil-transferaza (TdT) – cu localizare nucleară. În cortexul timic, limfocitele pre-T exprimă markerii CD2 și CD3 pe membrana citoplasmatică. Pe măsură b#%l!^+a?ce maturarea progresează, limfocitele fiind încă în cortexul timic, exprimă markerii CD4 și CD8. După expresia la mică densitate a moleculelor CD4 și CD8, se rearanjează genele care codifică RCT și celulele devin triplu pozitive (RCT+, CD4+, CD8+). Acestea suferă procesele de selecție, prin care se elimină celulele T autoreactive și se selectează celulele, care recunosc moleculele CMH I și CMH II. Când limfocitul T imatur migrează în zona medulară, se pierde fie markerul CD 4, fie CD8. În acest stadiu dispare markerul TdT.
Celulele CD4 + și CD8+ se dezvoltă din celule progenitoare dublu pozitive pentru cei doi markeri, iar acestea își au originea în celule dublu negative.
În zona corticală a timusului, limfocitele învață să tolereze selful, fenomen ce constă în selecția celulelor, care recunosc moleculele CMH exprimate pe suprafața celulelor epiteliale. Aproximativ 90% dintre celulele pre-T, care ajung în zona corticală, nu reușesc să traverseze joncțiunea cortico-medulară. Ele sunt supuse unui proces de selecție pozitivă, ce constă în supraviețuirea limfocitelor, care recunosc moleculele CMH ale celulelor epiteliale. Selecția pozitivă constă în supraviețuirea limfocitelor, care recunosc și interacționează cu b#%l!^+a?afinitate medie, cu moleculele CMH. Limfocitele, care nu generează un receptor, care să recunoască moleculele CMH, ca și cele care leagă cu mare afinitate moleculele CMH, potențial inductoare ale conflictelor autoimune (selecție negativă), sunt eliminate prin apoptoză.
În zona medulară, selecția limfocitelor continuă, prin eliminarea clonelor reactive față de self. Medula timică are particularități funcționale proprii, care favorizează inducerea toleranței față de self. În contrast cu cortexul, medula este deschisă circulației libere a proteinelor de origine sanguină și în structura ei se găsesc CPA (celule prezentatoare de antigen) originare în măduva osoasă (macrofage, celule dendritice, și interdigitate). Aceasta semnifică faptul că moleculele self din sânge ajung în timus și induc toleranța celulelor T imature. Moleculele self, care nu intră în sânge (de exemplu, moleculele tisulare), nu ajung în timus și nu induc selecția negativă. Față de aceste molecule este posibilă întreruperea stării de toleranță.
Prin selecție negativă, în zona medulară, sunt eliminate limfocitele T self-reactive, adică cele cu potențialul de a se activa față de antigenele self asociate moleculelor CMH. Eliminarea acestor celule este esențială pentru inducerea toleranței față de self. Sunt, de asemenea, eliminate celulele T, care nu generează o combinație genică pentru codificarea unui receptor funcțional de antigen. Se maturează limfocitele, care generează receptori specifici față de epitopii nonself.
Figura nr. 2. Diferențierea celulelor T în timus. Celulele autoreactive cu specificitate pentru antigenele self neexprimate în timus, pot să devină tolerante prin contactul extratimic cu antigenele. b#%l!^+a?
Selecția negativă este dependentă de cantitatea de antigen ce ajunge în timus. De exemplu, un antigen abundent (albumina) realizează o concentrație mare în timus și determină o selecție negativă completă, adică elimină întregul spectru de limfocite T – cu receptori de înaltă și joasă afinitate. De aceea, toleranța față de albumină nu va fi niciodată întreruptă și nu se cunosc maladii autoimune cu reactivitate limfocitară față de albumină. Alte molecule pătrund în timus, în cantități mici, pe cale sanguină și selecția negativă este incompletă, adică sunt eliminate numai celulele T cu receptor de mare afinitate pentru antigen. În condiții experimentale, prin injectarea antigenului la concentrații mari, toleranța față de aceste molecule poate fi întreruptă și se poate stimula reactivitatea autoimună.
Se consideră că exprimarea RCT și a moleculei CD 4, ce interacționează cu moleculele CMH II, inhibă exprimarea moleculelor CD8 sau diferențierea celulelor cu un singur marker (CD 4 ori CD8) este un proces stochastic.
Rezultatul final al diferențierii limfocitelor T în timus, constă în generarea receptorilor celulelor T, cu capacitatea de a tolera selful, asociat cu moleculele CMH și de a reacționa la moleculele nonself, ceea ce este esențial pentru interacțiunile celulare în cursul elaborării răspunsului imun.
Numărul celulelor T mature în organele limfoide secundare rămâne constant, la o valoare ridicată, în condițiile în care timusul involuează treptat. Constanta numerică a celulelor T este atribuită duratei lungi de viață a acestor limfocite, dar nu este exclusă producerea de novo în alte țesuturi (intestin, ficat, măduva osoasă).
Pe baza datelor experimentale acumulate, se poate deduce existența a cel puțin două mecanisme active asupra diferențierii limfocitelor în organele limfoide centrale. Mecanismele propuse nu se exclud. Coexistența și sinergismul lor demonstrează importanța organelor limfoide centrale în controlul procesului de diferențiere și complexitatea acestuia.
S-au conturat două ipoteze referitoare la factorii de diferențiere ai limfocitelor: ipoteza celulară și ipoteza hormonală (humorală).
În acord cu ipoteza celulară a micromediului epitelial al timusului, diferențierea limfocitelor T s-ar realiza prin contactul direct al pretimocitelor cu epiteliul timic. Experiențele de extirpare a timusului la caninii nou-născuți, cu sistem imunitar imatur au evidențiat că prezența timusului funcțional este o condiție esențială pentru funcția optimă a imunității mediate celular. Extirparea timusului la animalele nou-născute este urmată de instalarea sindromului de epuizare, în accepțiunea lui Miller, ale cărui simptome se manifestă progresiv mai intens și în esență reflectă incapacitatea organismului de a se apăra față de infecțiile virale și fungice (disfuncția imunității mediate celular). Grefa timusului (de la organisme singenice) le restabilește treptat starea normală.
Extirparea timusului la organisme mature a evidențiat că absența timusului este compatibilă cu viața, fără manifestarea unor deficiențe notabile. S-a dedus astfel, că mecanismele celulare de contact al limfocitelor cu celulele epiteliului timic ar fi active numai în primele faze ale maturării limfocitelor T, dar absolut necesare pentru diferențierea lor.
După datele actuale, mecanismul celular al influenței timice nu este suficient pentru diferențierea celulelor T. S-a emis ipoteza hormonală, care consideră că procesul de diferențiere și maturare imunitară ar continua după ce timocitele părăsesc timusul. Hormonul secretat de celulele epiteliului timic ar exercita o acțiune stimulatoare asupra diferențierii limfocitelor, atât intratimic cât și la distanță, după trecerea sa în circulație, asupra celulelor limfoide circulante sau localizate în organele limfoide secundare, continuând astfel influenta directă a epiteliului timic.
În favoarea existenței unui factor hormonal timic, s-au adus argumente experimentale, care pot fi grupate în două categorii: b#%l!^+a?
Experiențe de restabilire a funcției imunitare sub acțiunea factorilor timici: de exemplu, îndepărtarea timusului la caninul nou-născut este urmată de pierderea imunității mediate celular. Implantarea subtegumentară a unei grefe de timus, plasată într-o cameră specială cu pereți poroși, permeabilă pentru molecule, dar impermeabilă pentru celule, restabilește imunocompetența, ceea ce demonstrează că nu este strict necesar contactul limfocitelor cu celulele epiteliului timic. Este suficient ca mediatorul (mediatorii) chimic secretat de timus să fie prezent în organism pentru a se produce maturarea limfocitelor T.
Evidențierea factorilor timici prin metode biochimice: unii hormoni au fost izolați din timus, iar alții din sânge. Nu sunt întru-totul asemănători hormonilor convenționali, pentru că nu se pot substitui complet țesutului timic și pentru faptul că unele molecule din categoria hormonilor timici pot fi generate și în alte țesuturi. Factorii serici de origine timică dispar după timectomie și reapar după grefa de timus. Existența factorilor serici de origine timică argumentează în favoarea ipotezei că imunocompetența se dobândește atât în faza timică a limfocitelor, cât și la distanță, după ce limfocitele au părăsit timusul. Denumirea factorilor de imunocompetență variază mult, în funcție de origine, proprietăți biochimice, efecte biologice.
2.2. Locul ocupat de celula NK în hematopoieza la canine
Unul din mecanismele prin care organismul elimină celulele self alterate este acțiunea directă a celulelor citotoxice asupra celulelor țintă. Celulele citotoxice recunosc prin receptorii lor modificările, care fac celulele țintă indezirabile pentru organism. Acest mecanism poate fi subîmpărțit în două faze succesive: o primă fază de angajare a celulelor citotoxice și o a doua fază, efectoare, de atac asupra celulei țintă.
Există două tipuri principale de celule implicate în acest mecanism efector: celulele natural ucigașe (NK) și celulele T citotoxice, despre care am discutat în paginile anterioare. Aceste celule sunt capabile să distrugă celule țintă proprii, tumorale sau infectate viral, dar și celule alogene nonself.
La canini există, așadar, o populație de celule cu activitate citotoxică asupra celulele tumorale, ce aparțin clasei limfocitare (markeri: CD3-, CD56+, NKH1). Celulele NK sunt celule efectorii ale răspunsului imun înnăscut la tumori. Capacitatea lor de a ucide celulele tumorale nu este dependentă de o imunizare anterioară, astfel încât au fost numite celule killer native (natural killer, NK).
Este recunoscut că celulee NK (CD3-, CD56+) sunt particular eficace pentru a liza celulele tumorale, fără a exprima moleculele MHC de clasa I. NK pot fi activate prin recunoașterea directă a tumorii sau prin acțiunea citokinelor produse de către limfocitele T specific tumorale. NK utilizează aceleași mecanisme de liză tumorală, ca și limfocitele T citotoxice (CTL).
Depleția celulelor NK favorizează apariția metastazelor, fapt ce sugerează că acestea joacă un rol important în răspunsul anti-tumoral. Celulele NK produc un număr crescut de citokine precum IFNy, G-CSF, GM-CSF, IL-1 și TGFβ. Din acest motiv, rolul NK în imunitatea anti-tumorală depinde de stimularea concurentă a celulelor T și a macrofagelor ce produc citokine. Un interes deosebit pentru uciderea celulelor maligne îl prezintă celulele NK activate cu IL-2, numite celule killer activate de citokine (lymphokine-activated killer cells, LAK), b#%l!^+a?obținute prin cultura in vitro a limfocitelor periferice sau a limfocitelor infiltrative tumoral (tumor infiltrative lymphocytes, TIL) din tumorile pacienților tratați cu doze crescute de IL-2.
Imunitatea nespecifică operează în general cu eficiență limitată, motiv pentru care este în general urmată de imunitatea specifică, reprezentată de limfocitele T citotoxice selectate clonal și care proliferează în urma contactului specific cu antigenul. În cursul unei infecții virale tipice, celulele NK sunt activate de interferonii α și β. În consecință, se produce un răspuns citotoxic de tip NK în primele trei zile ale infecției, care distruge selectiv celulele invadate viral și împiedică propagarea infecției, pentru ca apoi rolul principal de efector citotoxic să fie cedat limfocitelor T. Răspunsul specific mediat de limfocitele T citotoxice necesită 5 până la 8 zile pentru a atinge maximul, după care scade ca urmare a eliminării patogenului.
În asemenea infecții, cele două principale tipuri celulare citotoxice se succed și se completează reciproc. De altfel, celulele NK și limfocitele T citotoxice se influențează reciproc, atât prin contact direct, cât și prin intermediul diferitelor citokine. S-a dovedit de asemenea existența unei subpopulații T CD8+, care prezintă aspecte fenotipice caracteristice atât limfocitelor T, cât și celulelor NK.
Celulele NK reprezintă o subpopulație limfocitară care provine dintr-un precursor medular comun cu limfocitul T si alcătuiesc pe lângă aceste celule și celulele B o a treia populație de tip limfocitar. Celulele mature sunt prezente în sânge si organele limfoide centrale și periferice. Generarea lor din precursorul comun se face în prezența IL-2 si IL-5. Celulele NK sunt celule mari cu diametrul de 16-20 μm și nucleul zimțat. Citoplasma conține granulații mari, înconjurate de membrană, care conțin mediatori citotoxici (perforină, granzime TNF). Aceste granulații mari citoplasmatice diferențiază celulele NK de limfocitele B si T și le conferă și denumirea de limfocite mari granulare (LGL).
Markeri imunologici prezenți pe suprafața acestor celule sunt: CD65 (N-CAM), receptorul FcyRll pentru IgG CD16, markerul CD2 prezent pe suprafața tuturor limfocitelor, CD8, receptori de tip imunoglobulinic (killer inhibitory receptor – KIR), receptori de tip lectinic (CD4 94-NKG2 și molecule de adeziune ICAM-1 (CD54) și LFA-1 (CD11a/CD18).
Celulele NK prezintă citotoxicitate spontană față de celulele infectate viral și celulele tumorale. Nu prezintă specificitate antigenică prin absența unui receptor specific de antigen și nici memorie imunologică. Nu prezintă capacitate fagocitară sau restricție MHC.
Celulele pot fi activate de diferite citokine în principal IL-2, care determină proliferarea și creșterea capacității citotoxice, devenind limfocite kiler activate de citokine (limphokine activate killer cells, LAK). În același timp, au fost identificate o altă populație de b#%l!^+a?limfocite cu activitate citotoxică specifică tumorilor umane, care a fost izolată din tumorile solide; aceste celule au fost denumite limfocite infiltrate tumoral (tumor-infiltrating lymphocyte – TIL), ele având fenotip predominant NK.
Celulele NK prezintă pe suprafața lor numeroase structuri macromoleculare cu rol receptor NK-R (natural killer cell receptor). Aceste structuri sunt de două tipuri, unele cu domenii imunoglobulinice și celelalte cu domenii lectinice de tip C.
Celulele NK prezintă o serie de particularități fiziologice, în cadrul celulelor limfocitare, care le apropie de imunitatea înnăscută. Limfocitele NK de repaus se găsesc într-o stare preactivă, echipamentul enzimatic de atac fiind pregătit să intervină în orice moment; nu necesită ca în cazul limfocitelor B si T o diferențiere finală spre stadiul de efector. Absența enzimelor RAG dovedește lipsa unor fenomene de recombinare genetică – caracteristice celorlalte limfocite. Aceste celule nu prezintă memorie imunologică.
Celulele NK (natural killer) reprezintă circa 15% din totalul limfocitelor sanguine. Ele derivă din măduva osoasă și au origine comună (același progenitor), ca și celulele T. In vitro, sunt neaderente și nefagocitare, ceea ce le aseamănă cu limfocitele. Din punct de vedere morfologic, celulele NK sunt mari, granulare (LGL, large granular lymphocytes), având citoplasma mai bogată decât celelalte limfocite, cu granulații azurofile.
Celulele NK nu au niciunul din receptorii de antigen caracteristici limfocitelor T sau B și b#%l!^+a?de aceea au fost denumite celule nule.
În dezvoltarea lor, celulele NK nu sunt dependente de timus. Celulele NK au viața scurtă și reprezintă o linie importantă, primordială în evoluție, cu rol esențial în mecanismele de apărare înnăscută a organismului: sunt active în respingerea grefelor și a celulelor modificate sub raport antigenic. Funcția celulelor NK este de a recunoaște și de a liza anumite celule tumorale și celule infectate cu virusuri. Celulele NK au lizat celulele liniilor B limfoblastoide transformate de EBV, deficiente în molecule CMH I, dar nu au mai lizat aceste ținte după transfecția cu genele HLA-B sau HLA-C. Mecanismul recunoașterii celulelor purtătoare de molecule nonself nu este cunoscut. Se admite că celulele NK recunosc moleculele CMH și se activează când receptorii lor nu întâlnesc moleculele CMH pe suprafața celulelor țintă sau când moleculele CMH au o densitate mai mică, decât cea normală. Efectul interacțiunii este liza celulei țintă.
Acțiunea definitorie a celulelor NK este citotoxicitatea. Ele lizează fără restricție CMH, celulele tumorale sau pe cele infectate cu virusuri.
Cel mai studiat receptor membranar al celulelor NK este receptorul de mică afinitate pentru Fc al IgG (CD 16).
O subpopulație distinctă a celulelor NK o reprezintă celulele K (killer). Ele sunt tot LGL, dar spre deosebire de celulele NK, exprimă receptorul de mare afinitate pentru Fc. Acțiunea lor principală este citotoxicitatea mediată de anticorpi (ADCC), față de celulele modificate antigenic.
Există mai multe ipoteze, care încearcă să explice acțiunea concertată a celor două forme de receptori pentru distrugerea celulelor țintă.
O primă ipoteză susține că receptorii inhibitori recunosc moleculele MHC self, în timp ce receptorii activatori detectează structurile MHC mimetice produse de anumite virusuri, cum este virusul citomegalic. Majoritatea adenovirusurilor au dezvoltat o tactică defensivă împotriva recunoașterii de către limfocitul T, care constă în inhibarea expresiei moleculelor MHC la suprafața celulelor gazdă. În felul acesta, peptidele non-self virale nu sunt detectate de limfocitul T citotoxic (care necesită prezentarea antigenică în asociere cu MHC de clasa l), dar face celula gazdă vulnerabilă la atacul celulei NK, care nu este inhibată de receptorii ei în absența ligandului MHC. Pentru a înlătura acest inconvenient, virusul a elaborat o proteină cu structură asemănătoare MHC de clasa l, care cuplează β2-microglobulina și mimează structuri MHC self la suprafața celulei gazdă. Aceste molecule mimetice pot cupla receptori activatori ai NK și declanșa activitatea litică a limfocitului.
O altă ipoteză sugerează posibilitatea ca diferite clone de celule NK să prezinte receptori activatori pentru anumite molecule MHC, diferite de moleculele MHC care cuplează receptorii inhibitori ai celulei. Absența selectivă a unei molecule MHC specifică pentru un receptor inhibitor permite activarea celulei NK prin receptorii activatori, care recunosc alte molecule MHC ale celulei țintă.
O ultimă ipoteză susține că receptorii activatori si inhibitori ar putea fi răspunzători de procese diferite din cadrul fiziologiei limfocitului NK. Receptorii inhibitori ar putea fi implicați în funcția efectorie citotoxică împiedicând liza celulelor care au la suprafață molecule MHC corespunzătoare calitativ și cantitativ, în timp ce receptorii activatori ar putea controla dezvoltarea ontogenetică si proliferarea limfocitelor NK.
2.3. Morfofuncțiile celulelor dendritice la canine
Organismul, ca sistem funcțional este echilibrat atâta timp cât informația antigenică pe care o primește, este identică cu cea proprie. Față de moleculele străine, care se abat de la modelul informațional propriu, sistemul imunitar răspunde prin activarea mecanismelor de recunoaștere pentru a îndepărta moleculele nonself.
Ansamblul fenomenelor complexe în cascadă, declanșate de interacțiunea specifică a sistemului imunitar cu antigenul, în cursul cărora celulele imunocompetente se activează, proliferează și se diferențiază în celule efectoare și celule de memorie, constituie răspunsul imun.
Funcționalitatea sistemului imunitar se suprapune parțial, modelului general al arcului reflex, deoarece presupune existența unui flux informațional care corespunde unui excitant specific (Ag) față de un receptor (limfocitele), o cale aferentă (celulele care înglobează și prelucrează Ag), un organ central (celulele limfoide dintr-un organ limfoid secundar) și efectorii răspunsului imun (anticorpi, celule efectoare).
La canini, sistemul imunitar este dotat, ca și sistemul nervos, cu inteligență (capacitatea de a recepționa un număr mare de stimuli (adică de a recunoaște un număr mare de determinanți antigenici diferiți) și de a prelucra informație chimică. Sistemul nervos prelucrează informație senzorială, iar sistemul imunitar recunoaște și prelucrează informație moleculară. Inteligența sistemului imunitar se manifestă discontinuu, în funcție de agresiunile antigenice asupra organismului.
Elaborarea răspunsului imun față de o substanță nonself este un proces fiziologic care se caracterizează printr-o mare eficiență și suplețe și are următoarele particularități generale:
Funcția imună are caracter adaptativ, care decurge din orientarea specifică a reacțiilor sale față de o substanță nonself. Caracterul adaptativ al răspunsului imun implică mobilizarea unor celule preprogramate care așteaptă să fie activate de un anumit antigen, corespunzător specificității lor.
Caracterul foarte economic al funcției imunitare derivă din specificitatea acțiunii sale. În timpul răspunsului imun se selecționează și se activează numai clonele de limfocite care au recunoscut specific epitopii antigenului, toate celelalte clone rămânând disponibile pentru alte interacțiuni.
Eficiența funcției imune derivă din caracterul foarte economic al mijloacelor celulare și moleculare pe care le mobilizează și din capacitatea de a amplifica efectorii săi, pe două căi:
Proliferarea masivă (circa 8 generații celulare) a celulelor selecționate sub acțiunea stimulatoare a substanței nonself. După activare se produc modificări funcționale calitative ale acestor celule, de diferențiere proliferativă și maturare, rezultatul fiind generarea celulelor efectoare cu mare capacitate de acțiune și a celulelor de memorie.
Celulele efectoare produc cantități mari de molecule de recunoaștere, sub forma receptorilor specifici față de substanța nonself.
Caracterul de rețea a celulelor activate în răspunsul imun, conectate prin mediatori moleculari (interleuchine) și care condiționează eficiența răspunsului imun.
Celulele sistemului imunitar cooperează stimulator cu numeroase alte categorii de celule, capabile la rândul lor să confere rezistență organismului. Cooperarea are loc, inclusiv cu factorii nespecifici (înăscuți) ai rezistenței (fagocitele, proteinele sistemului complement, molecule bactericide sau bacteriolitice din plasmă).
Răspunsul imun adaptativ necesită o perioadă de timp pentru activarea și proliferarea limfocitelor care au recunoscut antigenul, în timp ce reacțiile neadaptative sunt prompte.
Răspunsul imun adaptativ asigură protecția organismului și a descendenților săi, prin transferul placentar al anticorpilor și prin secreția lactată;
Răspunsul imun adaptativ are o proprietate fundamentală unică – memoria imună – consecință a experienței antigenice individuale, netransmisibilă la descendenți.
2.4. Implicarea în cadrul SCI a celor două subsisteme celulare
Rezistența animalelor are la bază multiple mecanisme, unele cu substrat natural, altele produse prin conflict. Imunitatea naturală conferă o stare refractară înnăscută, dependentă de specie, ale cărei componente biochimice, condiții fiziologice, acționează ca factori.
Imunitatea câștigată este activă sau pasivă, indusă fie prin trecerea animalelor prin boală, fie postvaccinală specifică sau respectiv prin administrare de seruri (hiper-imune).
De obicei, animalele trecute prin boală se imunizează, iar rezistența specifică îndelungată se datorează prezenței agenților în organism, timp variabil. Această formă de imunitate nesterilă (preimunitate), asigură o protecție ce împiedică multiplicarea. Nivelul imunității în valuri, determinată de factori multipli, reflectă o succesiune de faze cu perioade imunogene, ce durează de la câteva luni la câțiva ani. Mecanismele specifice de apărare sunt mai puternice față de varietățile omoloage și slabe față de cele heteroloage ale aceleiași specii.
Experimental s-a constatat că se declanșează și imunitate sterilă. În cazul infecțiilor se instalează imunitate postinfectantă, în absența agenților din organism animal și care reinfectate cu aceeași specie rămân rezistente. Prin experimentări imunogenetice este relevat faptul că, complexitatea proceselor se derulează atât în sistemul umoral cât și în cel mediat celular. Hiperplazia și intervenția SRH (sistem reticulo-histiocitar), fagocitarea hematiilor parazitate de către macrofage, activitatea splinei în imunogeneză dovedesc intervenția sistemului imun mediat celular.
2.5. Nivelul de implicare al celulelor dendritice și NK în răspunsul imun pentru
specia canină
Bolile alergice prezintă o prevalență în continuă creștere, în special în rândul caninilor. Macrofagele, neutrofilele, eozinofilele și limfocitele joacă un rol foarte important în desfășurarea mecanismelor alergice. Răspunsul limfocitelor T este caracterizat de producerea de citokine din profilul Th2 (IL – 4, IL – 5, IL – 13) care vor constitui o parte din infiltrat. Date recente susțin teoria prin care celulele NK joacă un rol important în inițierea răspunsului alergen specific T dependent și prin urmare în dezvoltarea inflamației. Celulele NK influențează răspunsul imun adaptativ prin secreția de citokine, dar și prin alte mecanisme precum liza celulelor dendritice sau macrofage și prin urmare modulează prezentarea antigenică. Deasemenea celulele NK au efect protectiv împotriva infecțiilor prin secreția rapidă de INFy, și a altor imunomodulatori precum IL-1, IL-3, IL-5, IL-8, IL-10, precum și TGFβ, TNFα, TNFβ, GM-CSF, MIP-1α (macrophage inflamatory protein).
Din punct de vedere funcțional celulele NK sunt împărțite în două subseturi NK1 și NK2 corespunzând celor două profile T helper Th1 și Th2. În funcție de expresia moleculei CD 56 celulele NK se subîmpart în CD 56bright și CD 56dim. Celulele NK CD56bright sunt capabile să producă o mare cantitate de citokine din profilul 1 și 2 și de aceea sunt considerate imunomodulatoare, în timp ce CD56dim au o capacitate scăzută de a produce citokine, dar au efect citotoxic accentuat.
Prezența celulelor NK la nivelul interstițiului pulmonar în raport similar cu cel existent în sângele periferic a ridicat întrebări despre implicarea acestor celule în imunitatea pulmonară și deasemenea în cadrul alergiilor.
Celulele NK – componente ale răspunsului imun înnăscut, ar juca un rol important în perioada de sensibilizare precoce alergen specifică. Cum și în ce fel celulele NK sunt activate prin proprii mecanisme sau de alți factori că infecțiile virale rămâne să fie stabilit. Prin secreția de citochine ca: IFNy sau: IL-5, celulele NK pot influența celulele prezentatoare de antigen, maturarea celulelor dendritice și răspunsul eozinofilic în cadrul căilor aeriene. În același timp celulele NK pot juca un rol prin mecanism citolitic prin liza celulelor dendritice sau macrofage și prin aceasta influențând răspunsul celular T dependent.
b#%l!^+a?
CAPITOLUL 3
MATERIALE ȘI METODOLOGIA DE LUCRU
Pentru determinările parametrilor de transformare blastică a fost utilizat sânge venos recoltat. Lotul control a fost format din 5 donatori pentru prima cercetare, iar pentru a doua cercetare din 15 cazuri.
La nivelul primului studiu, lotul cu neoplazii a cuprins 4 pacienți diagnosticați si aflați înainte de tratamentul specific.
Materialele și metodele de lucru sunt, după cum urmează.
Materiale: mediu de cultură IC65 nesuplimentat cu bicarbonat; Heparină (Biochimie) 5000 UI/ml
Metoda. Sângele canin a fost recoltat prin puncție venoasă în mediu anticoagulant conținând 200 μl mediu de cultură IC65 si 10 UI de heparină pentru fiecare ml de sânge recoltat. Sângele a fost prelucrat la maxim două ore de la recoltare.
Principiul metodei. Prin centrifugare în gradient de densitate, limfocitele din sânge periferic pot fi separate de o serie de alte elemente celulare sanguine (trombocite, monocite, polimorfonucleare, hematii si eventualele celule moarte.) pe baza densității lor.
Pe acest principiu celulele cu densitate mai mică vor rămâne la extremitatea superioară a coloanei de gradient, celelalte tipuri de celule având o densitate mai mare vor străbate mai repede un câmp de gradient de densitate.
Sângele se repartizează în cuve de centrifugă pe un strat de mediu polimer lichid izoton, netoxic pentru celule, cu densitatea relativă 1,077. În urma centrifugării la 600g, se obține distribuția spațială de populații celulare sanguine.
Materiale: sânge canin periferic recoltat pe anticoagulant conform metodei descrise: mediu de separare a populațiilor celulare sanguine Ficoll – Odiston: 24 de părți Ficoll 400 (Pharmacia Fine Chemicals) 9% în apă distilată + 10 părți Odiston (Întreprinderea de Medicamente București) 34% în apă tridistilată, d = 1,077 la 18oC;
Metoda experimentală. Câte 3 ml de sânge recoltat pe anticoagulant se repartizează în cupe de centrifugă peste 3 ml Ficoll – Odiston; centrifugare 20 min la 600g, t = 18oC; de decartează fazele II.
Inelul limfomonocitar recoltat este distribuit în eprubete de centrifugă si se adaugă până la 10 ml mediu IC65 pentru a se îndepărta mediul de separare. Eprubetele sunt centrifugate 10 min la 40 C la o turație de 450 g . Operația de spălare se face de 3 x pentru îndepărtarea completă a mediului de separare.
Figura nr. 3. Izolarea limfocitelor din sânge prin centrifugare în gradient de densitate: a) repartizarea sângelui heparinat pe mediul de separare; b) distribuția spațială a populațiilor celulare sanguine după centrifugare în gradient de densitate.
Faza I: plasmă si trombocite
Faza II: celule mononucleare
Faza III: mediu de separare
Faza IV: granulocite polimorfonucleare si hematii.
Principiul metodei. Viabilitatea celulară a fost determinată prin testul excluziei eozinei. Eozina este un colorant vital care difuzează în interiorul celulelor moarte sau a celor care prezintă leziuni ale membranei plasmatice. În consecință, celulele moarte se colorează si pot fi distinse de cele vii prin vizualizare la microscopul optic. Pentru identificarea corectă a celulelor, acestea se tratează cu o soluție diluată de acid acetic, tratament care permite vizualizarea nucleului celular la microscopul optic (mărire de ordinul 300X).
Materiale: Eozină (Merck): soluție 0,5% în apă distilată; Acid acetic (Reactivul București): soluție 10% în apă distilată; cameră de numărare a celulelor de tip Burger-Türck cu indicele [concentrație suspensie celulară / celule numărate] de 104.
Metoda experimentală: 50μl din suspensia celulară obținută conform protocolului descris se amestecă în proporție 1/1 cu soluția de acid acetic. Se omogenizează si se aplică prin capilaritate în camera de numărare Burger-Türck;
Numărarea celulelor la microscopul optic. Se numără celulele aflate în cel puțin 3 arii de numărare si se face media aritmetică .
Stabilirea concentrației suspensiei de celule si a purității acesteia. Pentru numărarea celulelor la acest tip de cameră se aplică următoarea formulă: Nr. Celule numărate X 104 = Nr. celule / ml.
50μl din suspensia celulară obținută conform protocolului descris se amestecă în proporție 1/1 cu soluția de eozină. Se omogenizează si se aplică prin capilaritate în camera de numărare Bürger-Türck. Se stabilește procentul de celule moarte. Nu se consideră celule viabile cele care au incorporat eozină.
Pentru stabilirea procentului de celule vii se aplică următoarea metodă de calcul: Nr. celule colorate (moarte) + Nr. de celule necolorate (vii) =Nr. de celule citite.
Se aplică regula de trei simplă pentru a afla numărul de celule vii, 100 reprezintă numărul de celule total citite (vii + moarte).
Pentru efectuarea unui experiment corect este necesară o viabilitate de cel puțin 85%.
Limfocitele au pe suprafața membranei lor receptori specifici pentru lectine, antigene, limfokine etc. Prin intermediul acestora in vitro (dar și in vivo). Celulele recunosc lectinele sau antigenele de la care primesc semnale ce derepresează nucleul antrenând celula pe linia ciclului celular de diviziune, în cursul căreia are loc sinteza semiconservativă a ADN-ului si mărirea în volum a celulei (transformare blastică). Procesul poate fi evidențiat prin marcarea cu 3H-timidină a ADN-ului nou sintetizat. Încorporarea 3H-timidină se cuantifică prin înregistrarea radiațiilor β.
S-a aplicat metoda modificată conform următorului protocol: sânge s spălat de 2 ori în mediu IC65 prin centrifugare 10 min la 150g. Sedimentul celular rezultat s-a resuspendat în proporție de 5% în RPMI1640 tamponat cu NaHCO3 0.1M, pH=7.2, suplimentat cu 5% SFV. Sistemele experimentale cu volum final de 1ml conțin 1ml suspensie celulară sanguină 5% și 1,25μg/ml; 2,5μg/ml; 5μg/ml; 10μg/ml; 20μg/ml , PHA-M (Difco). S-au executate experimente, în care stimulatorul clasic PHA a fost aplicat concomitent cu PHA. Au fost aplicate probe de celule nestimulate (Martor) în triplicat. Probele au fost incubate 48 ore la 370 C în atmosferă de 5% CO2 după care au fost marcate cu 1m Ci [3 H]-Td (IFIN, București) cu activitatea specifică de 10 Ci/mmol. Probele au fost incubate încă 18 ore.
Pentru evaluarea [3 H]-Td incorporate, celulele au fost fixate pe filtre Sartorius (fibră de sticlă 13400) si au fost spălate pentru îndepărtarea [3 H]-Td neîncorporate în celule.
Radioactivitatea filtrelor a fost măsurată în lichid de scintilație (PPO 4g, POPOP 50mg / l toluen) la un cititor de radiații β.
Prelucrarea rezultatelor. Citirile de radioactivitate au fost exprimate în ppm. Rezultatele experimentale au fost prelucrate statistic ca media aritmetică + abaterea de la medie (X+Sx).
Pentru calcularea indicelui de stimulare IS se folosește următoarea formulă.
Limfocitele periferice cu funcție de NK au proprietatea de a liza in vitro linia mieloidă canină K562 marcată în prealabil cu Na2(51 Cr)O4 , proprietate care se cuantifică prin înregistrarea y – radioactivității eliberate din țintele lizate.
Linii celulare utilizate în experimentele de citotoxicitate: K562 – linie mieloidă canină utilizată în testele NK (Flow); aceste linii celulare utilizate ca ținte în experimentele de citotoxicitate au fost cultivate în RPMI1640 NaHCO3 0.1M pH=7.2, 5% SFV în atmosferă de 5% CO2 si pasate la două zile înainte de utilizare si cu o zi înainte de a fi introduse în experimentele de citotoxicitate. Înainte de utilizare 1×106 celule/ml au fost incubate 45 min la 37o C în 10 ml Na2 (51 Cr)O4 (1mCi/ml ROTOP, DDR). Celulele spălate de 3 ori în RPMI1640 si resuspendate într-o concentrație de 2.5 x 104 cel./ml sunt utilizate ca ținte în experimentele de citotoxicitate.
Mod de lucru. Metoda constă în cocultivarea celulelor efector obținute cu celulele țintă în rapoarte 10:1 si 100:1. Sistemele experimentale conțin într-un volum final de 0.4ml 2.5 x 104 celule țintă / ml cu 2.5 x 105 /2.5 x 104 celule efector / ml. Pentru favorizarea contactului celular se centrifughează 3 min. la 100g și se incubează 4 ore la 370 C în atmosferă umedă. Concomitent același sistem de lucru a fost utilizat după o incubare prealabilă.
Pe lângă probele de studiat realizate în triplicate se realizează si o serie de probe-control pentru măsurarea radioactivității eliberate spontan din țintele marcate utilizate în citotoxicitate (RS) si a radioactivității totale eliberate din țintele lizate cu 10% Triton X100 (RT).
După incubare din toate probele se extrag 0.2ml supernatant si se citesc la cititorul de radiații y. Probelor-control li se citesc atât sedimentele, cât si supernatantele.
Prelucrarea rezultatelor. Citirile exprimă pulsuri/min (ppm) și rezultatele sunt prezentate ca procent de eliberare al radioactivității din suspensiile celulare (%ER): % ER = (b2 – a2)/ (a3 – a2), unde: b1= media aritmetică a triplicatelor (ppm) – fond de radioactivitate; b2=b1 x 2; a1 = media aritmetică (ppm) a supernatantelor RS – fond de radioactivitate; a2=a1x2; a3 = media aritmetică (ppm) a sedimentelor RS – fond de radioactivitate +a1; % RS=a2/a3 x 100 (probe-control pentru eliberarea spontană); % RT=a2/a3 x 100 (probe-control pentru eliberarea totală).
Rezultatele au fost prelucrate statistic, calculându-se media aritmetică a experimentelor și abaterea de la valoarea medie (x + Sx).
Materialul celui de-al doilea studiu, a fost constituit din cadavrele aduse pentru examenul necropsic, precum și biopsiile tumorale provenite de la cabinetele veterinare sau de la disciplina de chirurgie. Examenul necropsic a constat în aprecierea dimensiunii, consistenței, aspectului pe secțiune, localizarea neoformațiunii, integritatea limfonodulilor regionali, urmând apoi recoltarea de fragmente pentru preparatele histologice. Fragmentele au fost recoltate din zonele periferice ale tumorii, din 2-3 părți ale acesteia, evitându-se însă zonele necrotice, necrotico-purulente sau chistice. Porțiunile recoltate au vizat întotdeauna și zonele marginale ale tumorii, în vederea prevelării și de țesut mamar limitrof. Fragmentele prelevate au fost fixate în formol neutru 10%, prelucrarea făcându-se ulterior prin technica la parafină. Secțiunile au fost colorate prin technica Tricrom Masson și hematoxilină-eozină.
Materialul celui de-al treilea studiu, a fost reprezentat de 3 canine female, care prezentau procese tumorale ale glandelor mamare. De la fiecare caz s-au prelevat fragmente de țesut tumoral sau chiar tumora în totalitate. Fragmentele recoltate au fost fixate în formaldehidă 10% sau lichid fixator Bouin, incluse în parafină, secționate la 5 micrometri și colorate prin metodele HEA, PAS, Pappenheim, Van Gieson.
Investigațiile întreprinse în cel de-al patrulea studiu, au avut drept scop urmărirea incidenței neoplasmelor spontane pe raza arealului de studiu, a principaleleor localizări în funcție de rasă, sex sau vârstă, precum și formele histopatologice ale acestora. Investigațiile au fost efectuate pe 54 tumori din diverse țesuturi și organe la câine de pe raza arealului menționat. Pentru examen histopatologic fragmentele prelevate din tumori au fost fixate în formaldehidă soluție 10%, a urmat tehnica la parafină, secționate la 6 micrometri și au fost colorate prin metoda tricromică Masson modificată cu albastru de metil pentru orientarea generală, respectiv metoda Giemsa pentru detalii celulare.
CAPITOLUL 4
REZULTATE ȘI DISCUȚII
În ceea ce privește studiul 1, rezultatele testului de transformare blastică efectuate la canini sănătoși se încadrează în valorile standard obținute în cazurile stimulării cu PHA.
Efectul stimulator, deși este prezent, este diminuat comparativ cu modulatorul clasic reprezentat de PHA. Trebuie remarcat însă că profilul curbei se păstrează, iar concentrația cu efectul cel mai pregnant este de 10 μg/ml
b#%l!^+a?
În experimentele care au folosit ca modulator tandemul PHA+, nu se remarcă o cumulare a efectului stimulator. Mai degrabă se poate afirma că PHA își păstrează efectul fără a fi influențată.
Valorile obținute indică o lipsă de reactivitate la acest tip de modulator comparativ cu stimularea lectinică, care si ea este mult diminuată fată de subiecții normali.
S-a încercat o potențare cumulată a efectului de tandem. Rezultatele, însă, indică o preponderență a efectului dat de PHA. Tandemul indică o creștere nesemnificativă a indicelui de stimulare blastică.
Al doilea model experimental este reprezentat de teste de citotoxicitate nespecifică de tip NK. Pentru evaluarea efectului asupra celulelor NK am făcut determinări de determinare a raportului optim de celule efector/celule țintă. Celulele efector au fost obținute de la canini normali. Procentele de eliberare a izotopului de 51Cr din celulele țintă ne-a făcut să alegem rapoartele E/T extreme, si anume 10:1, si 100:1. Am ales raportul minim de 10:1 din considerente ordin tehnic deși pe grafic apare valoarea 12,5.
Fig.nr.9
La cele două rapoarte E/T am făcut determinări de tipul doză răspuns. La raportul de 10:1 se are o tendință de stimulare a activității NK, comparativ cu valorile obținute curent în cazul folosiri celulelor nestimulate – valorile normale pentru nestimulate se încadrează între 5,9 si 11 procente de eliberare crom.
Același profil de stimulare a activității citolitice o are și în experimentele în care rapoartele au fost de 100:1. Valorile normale obținute în cazurile celulelor nestimulate la acest raport sunt de 30-60% procent eliberare crom.
În cazul subiecților normali experimentele au constat în evaluarea în paralel a efectului față de celule nestimulate. Valorile obținute pentru raportul E/T 10:1 indică o creștere cu aproximativ 4% mai mare în cazul folosirii la concentrația de 5µg/ml, decât la nestimulate. Aceeași tendință se poate observa si la rapoartele de 100:1, valoarea creșterii fiind cu aprox 5% mai mare comparativ cu nestimulatele. Creșterea activității celulelor NK se păstrează și în sistemele de lucru în care s-au folosit concentrații de 10 µg/ml. La raportul 10:1 creșterea este cu 5,5% mai mare, iar la raportul 100:1 creșterea este cu 12,3%.
Pentru evaluarea efectului citolitic în cazurile patologice am folosit celule efector provenite de la canini cu patologie neoplazică bine determinată. Sistemele de lucru au constat în experimente în care celulele efector au fost stimulate. În paralel au fost făcute determinări în care s-au folosit celule nestimulate.
Dacă la celulele provenite de la subiecții normali valorile obținute în urma stimulării au avut un anumit profil, la cele provenite de la lotul cu neoplasm gastric valorile sunt mai mari. În cazul modulării la o concentrație de 5µg/ml creșterile sunt cu 5,1% mai mari la stimulate decât la nestimulate la raportul 10:1, în timp ce la raportul 100:1 stimularea determină o creștere a procentului de eliberare crom cu 33,2%. La o concentrație ce două ori mai mare creșterile procentuale sunt cu 6,8% la raportul 10:1 și cu 43% la raportul 100:1.
În ceea ce privește studiul 2, rezultatele și discuțiile sunt după cum urmează.
Cazul 1: Cățea, rasa Cocker, 10 ani.
Anamneză și aspecte macroscopice: femela prezenta trei formațiuni tumorale mamare, localizate la nivelul lantului mamar stâng, respectiv în mamela abdominală posterioară și în mamela inghinală. Una dintre tumori avea aproximativ 1,5 cm diametru iar celelalte două erau mici, globuloase, cât un bob de mazăre (0,5 cm diametru).
Aspecte histologice: formațiune tumorală de natură malignă caracterizată de structuri tubulare care de obicei delimitează un lumen, unele structuri tubulare fiind chistizate, intraluminal evidențiindu-se un conținut cu tinctorialitate variabilă. Celulele tumorale prezintă nuclei mari, cu nucleoli evidenți, uneori chiar monstruoși. Se poate evidenția un pleiomorfism celular moderat, unele celulele din structurile tubulare fiind de dimensiuni mici, cu nuclei relativ uniformi, existând însă și structuri tubulare în care se poate evidenția un pregnant polimorfism b#%l!^+a?celular. Pe alocuri se pot evidenția poliferări tumorale cu celule mioepiteliale, precum și structuri ductale cu creșteri papilifere.
Diagnostic histologic: carcinom tubular complex.
Leziuni displazice/hiperplazice: hiperplazie lobulară tipul adenozis (o proliferare netumorală a ductelor intralobulare), la nivelul unui singur lobul mamar observându-se zone cu hiperplazie epitelială acinară, cu celule tinere și nuclei evidenți.
Cazul 2: Cățea, rasa Caniche, 12 ani.
Anamneză și aspecte macroscopice: formațiune tumorală mamară de aproximativ 2 cm diametru, limfonodurile inghinale fiind hipertrofiate, dense la palpare și mobile. Formațiunea tumorală a apărut în urmă cu 6-7 luni, în urmă cu un an cățeaua fiind operată pentru o formațiune proliferativă de la nivel vaginal. Tumora mamară nu era aderentă la piele, fiind însă aderentă la mamela inghinală.
Glanda mamara inghinală opusă prezenta o formațiune calcificată cât un bob de mazăre, de sub 1 cm diametru. Femela a fost sterilizată și avea endometrită hiperplastică și chiști ovarieni.
Aspecte histologice: formațiune tumorală malignă caracterizată de structuri tubulare, reprezentate din celule epiteliale în multistrat, cu numeroase protruzii papilare și/sau micropapilare intraductale. Din loc în loc se observă proliferări de celule mioepiteliale într-o masă de mucus care în unele zone are o tentă ușor bazofilă. Stroma conjunctivă este abundentă, pe alocuri infiltrată cu limfohistiocite.
Diagnostic histologic: carcinom tubulo-papilar complex.
Leziuni displazice/hiperplazice: se pot evidenția lobuli hipertrofiați cu hiperplazie lobulară de tipul adenozis simplu sau lobuli hipertrofiați datorită chisturilor acinare. Numeroși lobuli mamari sunt transformați în întregime în structuri cu aspect chistic. Unele ducte extralobulare sunt și ele chistizate (ectazii ductale extralobulare). La nivelul unor acini mamari se poate observa o hiperplazie acinară netumorală – epiteliozis tipic.
Cazul 3: Cățea, rasa Caniche, 9 ani.
Anamneză și aspecte macroscopice: formațiune tumorală mamară de mărimea unui ou de porumbel, cu aspect globulos, consistență moale, neoplasmul fiind aderent la piele, cu o perioadă evolutivă de aproximativ 5 luni.
Aspecte histologice: tumoră mamară malignă caracterizată printr-o poliferare tumorală mixtă epitelială și mioepitelială. Celulele epiteliale sunt dispuse sub formă de tubi, la nivelul acestora existând mai mult de două rânduri de celule tumorale, uneori chiar cu formarea de papile ductale. Componenta mioepitelială este bine reprezentată sub formă de noduli care de multe ori au tendința de a forma țesut cartilaginos. Stroma conjunctivă este groasă cu fibrocite și fibre groase de colagen, pe alocuri aceasta fiind infiltrată de limfocite, histiocite și macrofage.
Diagnostic histologic: carcinom tubular complex.
Leziuni displazice/hiperplazice: parenchimul mamar adiacent tumorii prezintă leziuni displazice și hiperplazice, evidențiindu-se chisturi acinare precum și hiperplazii lobulare cu aspectul de epiteliozis papilar tipic, aspect întâlnit atât la nivelul acinilor cât si la nivelul unui duct intralobular. Pe langă cele prezentate anterior, am evidențiat și o hiperplazie ductală de tipul epiteliozis papilar tipic într-un canal extralobular.
Cazul 4: Cățea, rasa Pitt-bull, 5 ani.
Anamneză și aspecte macroscopice: formațiune tumorală mamară de mărimea unei alune, globuloasă, localizată într-o glandă mamară pectorală, tumora fiind densă și aderentă la parenchimul mamar adiacent. Timpul de evoluție a tumorii a fost de câteva săptămâni.
Aspecte histologice: neoformațiune tumorală malignă, caracterizată prin poliferări cu aspect tubular și papilar intraductal. Proliferările papilifere intraductale prezintă sau nu o stromă conjunctivo-vasculară de susținere, în unele ducte papilele formând chiar punți transversale. Țesutul conjunctiv este cu aspect tânăr, nucleii fiind mari, evidenți, cu nucleoli proeminenți. În masa tumorii se pot întâlni hemoragii și focare necrotice.
Diagnostic histologic: carcinom tubulo-papilifer simplu.
Leziuni displazice/hiperplazice: în jurul tumorii se pot evidenția lobuli hiperplaziați cu aspect de adenozis tipul simplu și tipul complex, la nivelul ductelor intralobulare și chiar la nivelul acinilor observându-se hiperplazii de tipul epiteliozis atipic.
Cazul 5: Cățea, rasa Caniche, 6 ani.
Anamneză și aspecte macroscopice: formațiune tumorală localizată în mamela abdominală anterioară pe lanțul mamar stâng, dimensiunea fiind de aproximativ 1 cm, respectiv cât un bob de mazăre. Tumoara era bine circumscrisă și neaderentă la țesuturile din jur.
Aspecte histologice: neoformațiune tumorală cu un caracter malign caracterizată printr-o proliferare a celulelor epiteliale, în general cu aspect solid sau pe alocuri tubular, cu un epiteliu în multistrat care umple lumenul tubular.
Celulele tumorale sunt agresive cu nucleii mari, nucleoli evidenți, supranumerari, observându-se mitoze și focare de necroză în masa tumorii. Stroma conjunctivă este discretă, pe alocuri fibroblastele având un aspect tânăr cu nuclei și nucleoli mari. În stroma conjunctivă se întâlnește un abundent infiltrat limfo-histiocitar și macrofagic.
Diagnostic histologic: carcinom solid.
Leziuni displazice/hiperplazice: în lobulii mamari peritumorali se observă displazie chistică acinară precum și atrofia de compresiune a lobulilor mamari iar la nivelul ductelor intralobulare se observă și o hiperplazie lobulară epitelială tipică.
Cazul 6: Cățea, rasa Caniche, 6 ani.
Anamneză și aspecte macroscopice: prezența unui nodul în lanțul mamar drept, la nivelul mamelei inghinale. Dimensiunea nodulului era de 1,5 cm diametru, consistența fiind cărmoasă. Neoformațiunea a fost extirpată împreună cu mamela inghinală, efectuându-se în același timp și ovario-histerectomia.
Aspecte histologice: neoformațiune tumorală malignă, reprezentată printr-un caracter proliferativ de tip papilifer, aspect întâlnit și în unii lobuli mamari, atât la nivelul ductelor intralobulare cât și la nivelul acinilor mamari. Datorită păstrării în unele zone a structurii lobulare, precum și datorită evidențierii în masa de proliferare a microfocarelor de necroză, se poate zice că avem de-a face cu focare de carcinom in situ și nu cu noduli hiperplazici. Stroma conjunctivă este abundentă, reprezentată de un țesut conjunctiv matur, pe alocuri cu infiltrat mononuclear.
Diagnostic histologic: carcinom tubulo-papilar simplu.
Leziuni displazice/hiperplazice: la nivelul unui duct galactofor se observă structuri cu aspect de papilom. Pe lângă lobulii transformați tumoral se pot observa și lobuli nemalignizați hiperplaziați, cu aspect de adenozis simplu. La nivelul unor acini se pot evidenția focare de hiperplazie epitelială lobulară respectiv epiteliozis tipic.
Cazul 7: Cățea, rasa Vijla maghiară, 5 ani.
Anamneză și aspecte macroscopice: formațiuni tumorale multiple cu aspect slăninos, culoare alb-sidefie, localizate la nivelul mai multor mamele. Unii noduli tumorali au aspect chistic cu conținut hemoragico-necrotic.
Aspecte histologice: neoformațiune tumorală de natură malignă, caracterizată prin proliferări epiteliale de tip tubular, în masa tumorii existând și o componentă tumorală benignă, respectiv un țesut cartilaginos care pe alocuri prezintă focare de mineralizare. Între structurile tubulare se pot evidenția atât celule mioepiteliale proliferate sub formă de noduli, precum și o stromă conjunctivă reprezentatǎ de un țesut conjunctiv tânăr. Prezența unor microfocare necrotice în masa tumorii denotă o leziune malignă.
Diagnostic histologic: carcinom complex în tumoră mixtă benignă.
Leziuni displazice/hiperplazice: în jurul tumorii, parenchimul mamar rămas prezintă o hiperplazie lobulară netumorală de tipul adenozis simplu. La nivelul unor acini mamari se pot observa atât hiperplazii epiteliale tipice (epiteliosis tipic), cât și hiperplazii ductale epiteliale la nivelul ductelor extralobulare. Unii acini de la nivelul unor lobuli sunt chistizați.
Cazul 8: Cățea, rasa Caniche, 9 ani.
Anamneză și aspecte macroscopice: femela prezenta trei formațiuni nodulare de diferite dimensiuni în parenchimul mamelelor inghinale, un nodul fiind cât un ou de găină iar celelalte două formațiuni având dimensiunea unei alune. Pe secțiune, nodulul cel mai mare exprima un material purulent, formațiunea fiind bine delimitată de o capsulă groasă.
Aspecte histologice: proliferare tumorală de natură malignă reprezentată de structuri tubulare discrete, celulele având în general un aspect fusiform, alungit sau stelat, unele structuri tubulare fiind chistizate și cu un conținut oxifil bogat în neutrofile. Pe alocuri se observă focare de metaplazie cartilaginoasă, ușor bazofile. Pe zone întinse întâlnim proliferări mioepiteliocitare cu aspect polimorf, iar stroma conjunctivă peritubulară prezintă macrofage cu un pigment brun.
Diagnostic histologic: carcinom complex în tumoră mixtă benignă.
Leziuni displazice/hiperplazice: displazie chistică acinară și hiperplazie lobulară cu aspect de epiteliozis tipic acinar, tipul papilar.
Cazul 9: Cățea, rasa Dog german, 8,5 ani.
Anamneză și aspecte macroscopice: formațiune tumorală mamară cu dimensiunea de 1 cm, de formă alungită, bine delimitată de țesuturile din jur, cu o ușoară reacție pe cordonul limfatic posterior. Formațiunea tumorală era localizată pe lanțul mamar drept, la nivelul mamelei abdominale posterioare. Cățeaua a născut o singură dată la vârsta 4 ani și, de atunci, a prezentat de două ori lactație falsă.
Aspecte histologice: formațiune tumorală malignă caracterizată de un aspect histologic tubulo-chistic, la nivelul unor chisturi evidențiindu-se structuri micropapilare cu sau fără stromă conjunctivă de susținere. Structurile papilifere se pot observa în majoritatea tubilor. Epiteliul tubular este în multistrat, cu nuclei mari, veziculoși, nucleoli evidenți, în masa tumorii întâlnindu-se și zone de proliferare mioepitelială, precum și focare de hemoragie și necroză. Stroma conjunctivă este în general, discretă pe alocuri evidențiindu-se și infiltrat limfohistiocitar.
Diagnostic histologic: carcinom tubulo-papilar complex.
Leziuni displazice/hiperplazice: la nivelul unui lobul mamar s-au evidențiat displazii de tipul chisturilor intralobulare. Într-o altă secțiune histologică la nivelul unui lobul mamar peritumoral se pot observa leziuni hiperplazice lobulare de tipul epiteliozis tipic, chiar cu formarea la nivelul unor acini de punți celulare.
Cazul 10: Cățea, metis, 10 ani.
Anamneză și aspecte macroscopice: formațiune tumorală mamară localizată pe lanțul mamar drept, între M4 și M5, de 5 cm diametru. În M4 era prezentă o altă tumoră de dimensiuni mai mici, nodulul fiind sub tensiune, neaderent la piele și la parenchimul mamar adiacent. Formațiunea localizată între cele două mamele era un chist purulent. Femela prezenta la nivel vulvar un material purulent, cenușiu.
Aspecte histologice: formațiune tumorală malignă caracterizată prin proliferări tumorale cu aspect tubular și cu o pregnantă proliferare mioepiteliocitară. Celulele tumorale epiteliale formează structuri tubulare, cu prezența mai multor straturi de celule care formează în unii tubi structuri papilare.
La nivelul unor tubi proliferativi componenta epitelială este slab reprezentată, predominând componenta mioepitelială. De asemenea, în masa tumorii se observă o stromă conjunctivă groasă, abundentă, în care se întâlnește pe alocuri infiltratul limfo-histiocitar sub formă de noduli.
Diagnostic histologic: carcinom tubular complex.
Leziuni displazice/hiperplazice: lobulii mamari prezenți peritumoral suferă o atrofie de compresiune, la nivelul acestora evidențiindu-se aspecte de hiperplazie lobulară, respectiv epiteliozis tipic în unii lobuli și atipic în alți lobuli.
Cazul 11: Cățea, rasa Cocker, 7 ani.
Anamneză și aspecte macroscopice: formațiune tumorală mamară localizată pe lanțul mamar drept, în glanda mamară inghinală.
Aspecte histologice: neoformațiune de natură malignă caracterizată de structuri tubulare cu o proliferare epitelială și mioepitelială, în lumenul unor tubi evidențiindu-se uneori un material ușor bazofil, în general invadat de granulocite neutrofile. Unii tubi sunt destinși cu aspect chistic, prezentând un conținut purulent. Celulele tumorale epiteliale sunt polimorfe, cu nuclei mari, nucleoli evidenți. Mioepiteliocitele întâlnite în unii tubi au aspect stelat, cu nuclei în general colțuroși. Tumora prezintă o stromă conjunctivă abundentă cu fibre groase de colagen, infiltrată pe alocuri cu celule histiocitare.
Diagnostic histologic: carcinom tubular complex.
Leziuni displazice/hiperplazice: la nivelul unor acini mamari se pot observa structuri displazice de natură chistică.
Cazul 12: Pisică, rasă Europeană, 10 ani.
Anamneză și aspecte macroscopice: formațiune nodulară mamară cu aspect chistic, consistență moale, cu chiști multipli de cca. 1-2 mm, ce prezintă un lichid citrin, limpede. Formațiunea a apărut în urmă cu un an pe lanțul mamar stâng, la nivelul mamelei abdominale posterioare.
Aspecte histologice: formațiune tumorală malignă caracterizată printr-o proliferare tumorală intralobulară, lobulul afectat fiind mult destins, datorită proliferării intraacinare și intraductale a celulelor epiteliale. Acestea sunt celule mari și polimorfe, cu nuclei mari, citoplasmă slab colorată, nucleoli evidenți.
Datorită prezenței microfocarelor de necroză în zonele de proliferare, avem de-a face cu o leziune malignă, respectiv cu un carcinom in situ.
Diagnostic histologic: carcinom lobular in situ.
Leziuni displazice/hiperplazice: lobulii mamari netransformați tumoral sunt măriți în volum, cu aspect de hiperplazie lobulară tipul adenozis simplu, iar la nivelul canalelor intralobulare se observă hiperplazii de tipul epiteliozis cu celule bine diferențiate care umplu lumenul ductului mamar. În ductele extralobulare se observă ectazii ductale, precum și hiperplazii epiteliale tipice.
Cazul 13: Cățea, metis, 10 ani.
Anamneză și aspecte macroscopice: cățeaua a fost sterilizată în urmă cu 2 ani. Tumora mamară a apărut în decursul ultimului an, având dimensiuni mari (cât o nucă de cocos) și o consistență cărnoasă la palpare.
Aspecte histologice: neoformațiune tumorală de natură malignă cu un caracter sarcomatos, caracterizată printr-o proliferare cu celule fusiforme sau cu aspect dendritic, care pe alocuri formează o matrice proteică parțial mineralizată, cu tendință de a forma lame cartilaginoase sau osoase.
Diagnostic histologic: sarcom mamar.
Leziuni displazice/hiperplazice: în țesutul conjunctiv din jurul tumorii se poate evidenția la nivelul unui lobul, atât în ductele lobulare cât și la nivel acinar, hiperplazii lobulare cu aspect papilar, celulele fiind bine diferențiate, diagnosticul fiind de epiteliosis tipic.
Cazul 14: Cățea, rasa Cocker, 8 ani.
Anamneză și aspecte macroscopice: cățeaua a fost sterilizată în urmă cu 3 ani, tot atunci efectuându-se și ablația mamelei inghinale drepte. În urmă cu 2 ani a apărut o altă tumoră la nivelul mamelei M4 de la nivelul aceluiași lanț mamar, dimensiunea fiind de aproximativ 1 cm diametru.
Aspecte histologice: neoformațiune tumorală malignă caracterizată atât prin proliferări epiteliale cu aspect tubular cât și prin proliferări mioepiteliale.
Structurile tubulare în general au un lumen discret, celulele tumorale în cele mai multe b#%l!^+a?cazuri umplând lumenul tubular, nucleii fiind mari, veziculoși, nucleolii supranumerari și evidenți. Celulele mioepiteliale proliferate au un aspect nodular, fiind delimitate de o stromă conjunctivă fină. În unele zone ale tumorii se întâlnesc hemoragii și infiltrat macrofagic abundent, celulele prezentând un pigment brun verzui în citoplasmă.
Diagnostic histologic: carcinom tubular complex.
Leziuni displazice/hiperplazice: la nivelul parenchimului mamar din vecinătatea tumorii, respectiv în ductele extralobulare, se observă hiperplazii ductale cu aspect papilifer fără atipii celulare (epiteliozis papilar ductal tipic), iar în stroma conjunctivă peritumorală se observă hemoragii.
Cazul 15: Cățea, rasa Caniche, 10 ani.
Anamneză și aspecte macroscopice: tumoră mamară recidivată. Prima ablație în urmă cu 1 an.
Aspecte histologice: formațiune tumorală de natură malignă caracterizată prin multiple formațiuni cu aspect chistic, cu prezența unor protruzii epiteliale intrachistice, papilele prezentând în general stromă conjunctivo-vasculară de susținere. În unele formațiuni chistice se poate observa un material oxifil cu macrofage și cristale de colesterol. Stroma conjunctivă a tumorii este abundentă, slab celularizată, cu fibre groase de colagen, proliferările epiteliale având un aspect tubular, chiar cu prezența de micropapile. De asemenea se pot evidenția la nivelul stromei conjunctive zone de calcificare intens bazofile.
Diagnostic histologic: carcinom papilar chistic în tumoră mixtă benignă.
Leziuni displazice/hiperplazice: la nivelul unui lobul mamar se pot observa hiperplazii epiteliale cu aspect tipic (epiteliozis ductal papilar tipic), proliferările fiind cu un aspect digitiform de tip punte la nivelul unui duct intralobular. Ca leziuni displazice secundare, întâlnim chisturi și ectazii ductale intra și extralobulare.
Tumorile mamare la cățea sunt hormonodependente iar riscul de apariție crește după fiecare ciclu estral. Celulele tumorale mamare, fie că sunt benigne, fie că sunt maligne, au receptori pentru estrogeni și progesteron, ceea ce provoacă hipertrofia parenchimului mamar, fapt evident după estrus. Incidența mai ridicată a tumorilor în perechile posterioare ale mamelelor, se corelează cu volumul mai mare al acestora și secreția mai abundentă în perioada de lactație.
În studiu a fost luat un număr de 76 de formațiuni tumorale mamare, din acestea fiind reținute, datorită evidențierii histopatologice de leziuni displazice/hiperplazice în țesutul mamar adiacent, un număr de 15 tumori de natură malignă. Cele 15 cazuri cu neoplasme mamare au provenit de la 14 cățele de diferite rase și vârste, precum și de la o pisică din rasa europeană.
În ceea ce privește rasele de câini la care s-au întâlnit displaziile mamare, sa observat o incidență crescută a acestor leziuni la rasa Caniche (6 cazuri), Cocker (3 cazuri), Rasa comună (2 cazuri) și Vijla maghiară, Pitt-Bull, Dog german (câte 1 caz).
Cei 15 subiecți au avut vârste cuprinse între 5 și 12 ani, cele mai multe leziuni displazice fiind întâlnite la femele în vârsă de 10 ani (5 cazuri), media fiind de 8,3 ani.
Mamelele la nivelul cărora s-au evidențiat cele mai multe hiperplazii/displazii au fost: M5 46,1%, M4 38,4%, M3 7,6% și M2 7,6%.
Referitor la tipurile de neoplasme în jurul cărora s-au întâlnit leziuni displazice, acestea au fost: carcinom tubular complex – 5 cazuri, carcinom tubulopapilar complex – 2 cazuri, carcinom tubulo-papilar simplu – 2 cazuri, carcinom solid – 1 caz, carcinom complex în tumoră mixtă benignă – 3 cazuri, carcinom lobular in situ -1 caz, sarcom mamar – 1 caz. Rezultatele investigațiilor noastre arată că leziunile displazice/hiperplazice mamare peritumorale sunt frecvent întâlnite, multe din acestea, după cum s-a observat în partea bibliografică a lucrării, putând reprezenta de fapt leziuni preneoplazice. Unele leziuni cum ar fi hiperplaziile lobulare sau ductale de tipul epiteliozis atipic sau adenozisul, de multe ori pot duce la erori de diagnostic. Din această cauză sunt necesare elemente de diagnostic diferențial al hiperplaziilor față de leziunile maligne carcinomatoase.
Investigațiile histologice efectuate de către noi au demonstrat necesitatea excizării și recoltării țesutului mamar adiacent tumorii datorită incidenței ridicate a acestor leziuni peritumorale hiperplazice, din care se pot dezvolta ulterior neoplasme mamare. Principalele leziuni displazice evidențiate au fost hiperplaziile lobulare, iar din acestea cele mai numeroase au fost leziunile de epitelioz tipic la 12 cazuri, iar la 1 caz s-a observat epiteliozisul slab diferențiat denumit și epiteliozis atipic. Acesta din urmă este foarte greu de diferențiat de carcinomul ductal in situ. Hiperplazia lobulară de tip adenozis simplu și complex a fost întâlnită la 6 din cazuri. Tot leziuni hiperplazice se pot întâlni și la nivel extralobular, respectiv la nivelul ductelor extralobulare, fiind întâlnite și aici modificări ca epiteliozisul tipic la 4 cazuri și leziuni de papilomatoză la 1 caz. Ca leziuni displazice, cele mai numeroase au fost chisturile mamare lobulare la 8 cazuri, iar la 3 cazuri s-a întâlnit ectazia ductală. Aceste leziuni pot fi confundate cu carcinoamele chistice mamare (destul de rar întâlnite), existând anumite criterii de diferențiere a celor două tipuri lezionale, cele două tipuri lezionale necesită un tratament complet diferit.
Studiul efectuat de noi indică faptul că leziunile displazice/hiperplazice sunt frecvent întâlnite în țesutul mamar adiacent tumorii, iar extirparea neoplasmului cu neîndepărtarea țesutului adiacent preneoplazic, poate duce la o recidivă tumorală nu din cauza rezecției incomplete a tumorii ci din cauza acestor hiperplazii care se pot maligniza. O altă problemă ar fi diferențierea leziunilor displazice/hiperplazice de cele tumorale. Astfel trebuie diferențiată hiperplazia epitelială de carcinomul ductal bine diferențiat; hiperplaziile papilare de carcinomul papilar; mastopatia fibrochistică de carcinomul chistic; proliferările ductale atipice de carcinomul in situ, hiperplazia hipersecretoare chistică de carcinomul hipersecretor chistic, adenozisul microglandular de carcinomul tubular, adenozisul sclerozat de carcinomul mamar, hiperplazia lobulară atipică (ALH) de LCIS, hiperplazia ductală atipică de carcinomul ductal in situ (1, 3, 4, 6, 8, 10, 11).
Anumite leziuni displazice/hiperplazice cresc foarte mult riscul apariției de tumori mamare, astfel adenozisul și adenozisul sclerozat, cicatricea radială, hiperplazia ductală epitelială tipică și papilomatoza cresc riscul apariției carcinoamelor de 1,5 – 2 ori, iar hiperplazia ductală și lobulară atipică (ADH și ALH) cresc riscul dezvoltării tumorilor maligne de 4-5 ori. Stabilirea tipului și subtipului de neoplasm mamar, precum și a leziunilor displazice/hiperplazice mamare are o importanță predictivă deosebită, deoarece în funcție de această clasificare histologică se poate aplica tratamentul precum și predicția speranței de supraviețuire a cățelei sau pisicii respective.
În ceea ce privește studiul 3, rezultatele și discuțiile sunt după cum urmează.
Cazul 1. Femelă de rasă comună în vârstă de 9 ani a prezentat două tumori localizate în lanțul stâng. Glanda mamară M3 stângă avea diametrul de 18 cm și un contur neregulat datorat multitudinii de chisturi mici, izolate sau conglomerate și prezenței chisturilor mari alternând cu structuri nodulare mici, gălbui și dure, care dau la palpare senzația de alice și bile de plumb. Chisturile mari sunt bine circumscrise, relativ mobile față de țesuturile adiacente, elastice și au un conținut galben-verzui sau brun-roșiatic sub tensiune.
Glanda mamară M5 stângă avea diametrul de 5 cm și se prezenta ca o masă tisulară bine delimitată, ușor indurată având în suprafața de secțiune zone gelatinoase și noduli albi-gălbui și cărnoși. Limfonodurile inguinale superficiale homolaterale apăreau mărite, având lungimea de 3 cm și grosimea de 1 cm. Un limfonod inguinal profund era de asemeni ușor mărit și avea o consistență fermă.
Cazul 2. Femelă de rasă comună în vârstă de 7 ani, a prezentat o tumoare localizată în M4 din lanțul drept, cu dimensiunile de 12 cm lungime, 8, 5 lățime și 10 cm înălțime. Aspectul exterior era comparabil cu un ciorchine de strugure, iar suprafața de secțiune cu un șvaițer datorită cavităților chistice pline cu o substanță gelatinoasă galbenă sau roșiatică.
Cazul 3. Femelă de rasă comună în vârstă de 6 ani, a prezentat o formațiune nodulară cu diametrul de 5 cm localizată în M5 lanțul drept, relativ bine circumscrisă, având zone albicioase și dure și structuri cavitare cu conținut gălbui.
Mastopatia debutează și evoluează în unitățile lobulare alveole-ducte terminale și se caracterizează prin hiperplazia de tip adenotic și dilatația chistică a unităților, asociate cu dezvoltarea țesutului fibros, colagenizare, hialinizare și metaplazie stromală. Conținutul chisturilor este variat fiind reprezentat de material proteic amorf sau din secreție glicoprotidică intens PAS pozitivă, în care se pot găsi celule epiteliale descuamate, lipofage cu citoplasma spumoasă, picături lipidice și grăsimi saponificate, detritus celular, depozite de calciu, cristale negative romboidale de colesterol libere sau compactate sub formă de tablete, rezultate din stagnarea secreției și dezintegrarea lipofagelor.
Dilatația saculară alveolară și ductulară generează chisturile mici, multiple și adiacente, delimitate de țesut conjunctiv dens care, prin ruperea pereților despărțitori, confluează în chisturi mai mari. Acestea sunt căptușite cu celule epiteliale secretorii (luminale) monostratificate, prismatice, cubice sau atrofiate prin compresiune, dublate de celule mioepiteliale, formând un tapet neted în forma nepapilară. În forma papilară, are loc hiperplazia epitelială cu pluristratificare urmată de formarea unor proeminențe intracavitare constituite din axe conjunctivo-vasculare ramificate, arborescente, acoperite cu epiteliu bimorfic ale cărui celule luminale pot fi bogate în glicogen. În unele chisturi voluminoase hiperplazia epitelială poate fi parțial sau complet dispărută datorită descuamării celulelor în cavitate. Se remarcă prevalența netă a celulelor mioepiteliale în procesul proliferativ; plasate între celulele epiteliale secretorii și membrana bazală, frecvent vacuolizate, prin multiplicare excesivă pot genera noduli adenomioepiteliomatoși stromali sau intrachistici.
În interstițiul tumorii, la periferia chisturilor se găsesc numeroase mononucleare (monocite-macrofage, limfocite, plasmocite), frecvente hemosiderofage, dar și celule gigante multinucleate care sugerează deversarea conținutului chisturilor în stromă și inițierea unor reacții inflamatorii de tipul granulomului de corp străin.
În unele câmpuri (cazul 1), stroma tumorii conține zone de metaplazie cartilaginoasă, bazofilă în HEA, PAS pozitivă și metacromatică la MGG și Pappenheim.
În ceea ce privește studiul 4, cele 22 tumori benigne se încadrează în grupa tumorilor epiteliale (54,54%): adenom (9 cazuri), papilom (3 cazuri), respectiv diferența (45,45%) aparține tumorilor mezenchimale: fibrom (6 cazuri), leiomiom (4 cazuri).
Se poate deduce faptul că în cazul tumorilor benigne se înregistrează o evoluție relativ asemănătoare la cele două sexe, existând o incidență maximă la aceeași categorie de vârstă (8-12 ani). Cu alte cuvinte, frecvența apariției tumorilor benigne nu este influențată de sex ci, în principal, de vârstă.
Adenomul este tumora benignă a epiteliilor glandulare; după organizarea celulelor hiperplaziate am identificat mai multe tipuri de adenoame: compacte, tubulare, chistice și papilifere. A fost diagnosticat în 9 cazuri: mamela (5 cazuri); pulmonar (3 caz) și prostată (1 caz).
Papilomul, tumora benignă epiteliilor pavimentoase stratificate de tip cornos, evoluează prin trei tipuri de papiloame: hipercheratozice, acantozice și fibropapilomul. A fost diagnosticat în trei cazuri la nivelul pielii, papilomul acantozic.
Fibromul, tumora benignă a țesutului conjunctiv, a fost diagnosticat de noi în structurile genitale la cățele. În ambele localizări tumorile au fost alcătuite din fibre conjunctive organizate sub formă de fascicule orientate în toate direcțiile.
Leiomiomul, tumora benignă a țesutului muscular neted, s-a diagnosticat în uter și vagin. Este constituit din fibre musculare netede inegale dispuse în fascicule sau cu orientări diferite.
59,37% din tumorile maligne au localizare mamară, în timp ce diferența (40,62%) au localizări diferite (tiroidă, testicul, țesut conjunctiv, subcutanat, etc.).
Frecvența tumorilor maligne în cazul femelelor crește odată cu vârsta, până în jurul vârstei de 12 ani, urmând apoi o descreștere mai mult sau mau puțin lentă.
În cazul tumorilor maligne la masculi, incidența este scăzută până în pragul vârstei de 4 ani, după care aceasta crește, și se menține la valori apropiate.
Adenocarcinoamele, tumori maligne ale epiteliilor glandulare, diferă prin aranjamentul celular și raportul dintre stromă și parenchim. Adenocarcinoamele identificate de noi se încadrează în tipurile tubular și papilar. Metastazele întâlnite în două cazuri au afectat limfonodurile lomboaortice și inghinale.
Carcinomul bronhoalveolar are o structură alveolară cu aspect glandular. Histoarhitectonica păstrează linii celulare tumorale atât din alveole cât și din bronhiile terminale.
Adenocarcinomul folicular se identifică microscopic ușor datorită dispunerii celulelor în foliculi. Celulele tumorale sunt relativ mari, formând foliculi de diferite dimensiuni, forme și conținut coloid.
Leiomiosarcomul, tumora malignă a fibrelor musculare netede, se caracterizează prin fascicule celulare ai căror nuclei apar mult alungiți, au indicele mitotic ridicat și uneori cu microfocare de necroză.
Carcinomul cu celule scuamoase este un neoplasm cu înalt grad de malignitate, frecvent asociat cu dermatoza solară, fiind tumora celulelor stratului malpighian din epiderm. Se recunoaște după prezența perlelor cheratozice, în centrul cărora se observă cheratina lamelară pe cale de necroză.
Fibrosarcomul este tumora malignă a fibroblastelor, dar cu participarea și a altor celule mezenchimale, respectiv a colagenului. Se constată o structură formată din fibroblaste cu aspect fusiform sau/și stelat, separate prin fascicule de colagen puțin abundent.
Sarcomul rotundocelular se recunoaște după parenchimul tumoral alcătuit din celule rotunde mici, cu nucleu mare, bogat în cromatină, iar citoplasma săracă, din care cauză hiperplaziile tumorale par a fi formate numai din nuclei. Stroma este foarte redusă.
Seminomul, tumora malignă a parenchimului testicular, a fost identificat sub două forme: seminom intratubular și seminom de tip difuz.
Adenocarcinomul de prostată la câine evoluează insidios și cu malignitate crescută. Se dezvoltă din epiteliul ductelor sau al acinilor. Se recunoaște după hiperplaziile de celule rotunde sau ovale ce se dezvoltă pe o fină tramă conjunctivă în lumenul alveolelor glandulare (tipul alveolar papilar).
Datele obținute de noi privind incidența tumorilor spontane la câine în perioada investigată corespunde cu datele prezente din literatura de specialitate.
Gradul de malignitate al tumorii diagnosticate histopatologic nu se corelează uneori cu aspectele macroscopice, mai evident în cazul tumorilor maligne epiteliale, adenocarcinoame.
Datorită numărului mic de cazuri investigate, nu s-a putut stabili o relație directă între incidență și anumite rase.
Rezultatele comparative ale anchetelor epidemiologice efectuate în ultimii 30 de ani, arată o schimbare spectaculoasă a localizărilor în diferite țesuturi și regiuni anatomice. Astfel, dacă în trecut, tumorile pielii la câine erau cele mai frecvente (28,1%), astăzi acestea au fost depășite de cele cu localizări mamare care au atins procente între 57% și 45%. Femelele sunt afectate într-un procent dublu față de masculi datorită incidenței mai mari a localizărilor mamare, uterine și vaginale.
b#%l!^+a?
CAPITOLUL 5
CONCLUZII
La nivelul primului studiu, imfocitele după ce primesc un stimul pentru care au receptori de membrană intră in ciclul de diviziune celulară, proces caracterizat printr-o activitate metabolică complexă si prin modificări morfologice cunoscute sub numele de transformare blastică.
În vederea investigării efectelor asupra celulelor sistemului imun, am imaginat două modele de lucru. Modelul transformării blastice a limfocitelor stimulate cu un modulator clasic PHA comparativ cu același sistem de lucru, dar în care am folosit ca modulator. Este știut că PHA determină indici de transformare blastică ridicați. Deși în anumite cazuri stimularea cu modulatori în tandem determină o creștere a valorii indicelui de stimulare peste valorile maxime ale celui mai puternic stimulator, în cazul nostru acest fenomen nu apare. Probabil că PHA este un competitor puternic si legarea de glicoproteinele membranare este în principal cea care determină fenomenul de încorporare a 3H-Td sau dimensiunile moleculei de PHA ecranează receptorii si nu mai permit acesteia din urmă să aibă acces la ei. Același comportament se poate observa si în cazurile patologice. Deși diminuat din cauza expunerii la Ag răspunsul fată de PHA păstrează o anumită proporție în aceste cazuri.
Dacă mecanismele de transformare blastică țintesc o anumită populație de celule în special limfocitele T, mecanismele ce citotoxicitate pot ținti limfocitele Tc(CD8), dar si celulele NK (CD16/56). Datorită faptului că aceste celule (NK) acționează în principal asupra celulelor neoplazice și infectate viral, am încercat studierea efectului în testele de citotoxicitate NK.
În acest caz poate fi remarcată o creștere a activității citolitice cu ≈3-4% la raportul E/T 10:1 și cu 6-26% la raportul E/T 100:1 în urma stimulării. Această creștere depășește valorile normale obținute la celulele nestimulate 6-11% la raportul de 10:1 și 30-60% la raportul de 100:1.
O creștere si mai mare a citotoxicității NK se poate observa însă în cazurile patologice. Această creștere este de aproximativ 33% în cazul stimulării cu 5μg/ml și de aproximativ 42% în cazul stimulării cu 10μg/ml. la raportul 100:1.
Deși în literatură este cunoscut efectul de stimulare a celulelor CD4 care produc ulterior IL2 si IFNy în sistemele de lucrul imaginate de noi citotoxicitatea este marcantă fără intervenția acestor modulatori. Trebuie deci remarcat că aceste celule NK sunt influențate în mod direct, fără intervenția celulelor CD4 producătoare de IL-2.
În concluzie se poate spune că există un efect de stimulare a transformării blastice acționând probabil asupra celulelor CD4, sistemele de lucru folosite de noi având un procent de aproximativ 43% celule Th asupra cărora se poate acționa – procent mult mai mic comparativ cu adresabilitatea PHA.
În ceea ce privește studiul 2, au fost luate și examinate histologic un număr de 76 de tumori maligne, din care 15 prezentau leziuni hiperplazice/displazice în țesutul mamar adiacent, cele 15 cazuri provenind de la 14 cățele și de la o pisică.
Rasele de câini cu tumori mamare care prezentau leziuni displazice/hiperplazice au fost: Caniche (6 cazuri), Cocker (3 cazuri), Rasă comună (2 cazuri), Vijla maghiră, Pitt-Bull, Dog german (câte 1 caz).
Cele 15 cazuri au avut vârste cuprinse între 5-12 ani, cele mai multe leziuni displazice fiind la vârsta de 10 ani (5 cazuri), media fiind de 8,3 ani.
Mamelele la nivelul cărora s-au evidențiat cele mai multe hiperplazii/displazii au fost: M5 46,1%, M4 38,4%, M3 7,6% și M2 7,6%.
Tipurile de neoplasme diagnosticate: carcinom tubular complex (5 cazuri), carcinom tubulo-papilar complex (2 cazuri), carcinom tubulo-papilar simplu (2 cazuri), carcinom solid (1 caz), carcinom complex în tumoră mixtă benignă (3 cazuri), carcinom lobular in situ (1 caz), sarcom mamar (1 caz).
Leziunile displazice/hiperplazice evidențiate au fost: hiperplazii lobulare: adenozis simplu (6 cazuri), epiteliosis tipic (12 cazuri), epiteliosis atipic (1 caz); hiperplazii ductale: epiteliosis tipic (4 cazuri), papilomatoză (1 caz); displazii chistice: 8 cazuri; ectazii ductale: 3 cazuri.
Pentru a efectua un examen histopatologic cât mai complet recomandăm ca prelevarea probelor să se facă și cu parenchimul mamar adiacent tumorii, deoarece anumite leziuni hiperplazice cresc foarte mult riscul apariției de tumori mamare: adenozisul, hiperplaziile ductale epiteliale tipice, papilomatoza ductală, de 2 ori, iar hiperplazia ductală și lobulară atipică (ADH- ALH) de 4 – 5 ori.
Terapia chirurgicală a tumorilor mamare trebuie să aibă în vedere și excizia acestor leziuni hiperplazice care sunt puncte de recidivă pentru tumorile mamare.
În legătură cu studiul 3, mastopatia sclerochistică a fost identificată la trei femele de rasă comună în vârstă de 6-9 ani, leziunile de dimensiuni mari (între 5 și 18 cm) fiind localizate în mamelele caudale, multiple într-un singur caz și caracterizate prin consistența chisturilor și a unor noduli mici, gălbui, duri.
Microscopic, mastopatia se dezvoltă în TDLU și se particularizează prin hiperplazia de tip adenotic a epiteliului bimorfic și dilatația chistică a unităților lobulare, asociate cu colagenizare, hialinizare și metaplazie condroidă stromală.
Hiperplazia epitelială marcată, topirea membranelor bazale și tendința de invazie a stromei, creșterea raportului N/C și a indicelui mitotic, anizocarioza pledează pentru potențialul de transformare carcinomatoasă a mastopatiei.
La studiul 4, histopatologic din totalul de 54 de tumori spontane la câine: 20 cazuri au fost diagnosticate la sexul mascul (37,03%); 34 cazuri au fost diagnosticate la sexul femel (62,96%).
Tumorile epiteliale benigne (adenoame, papiloame) par a fi mai numeroase (54,54%) în timp ce tumorile mezenchimale benigne (fibroame, leiomioame) sunt ușor mai reduse (45,45%).
În cazul tumorilor benigne se înregistrează o evoluție asemănătoare la cele două sexe. Cu alte cuvinte, frecvența apariției tumorilor benigne nu este influențată de sex ci, în principal, de vârstă.
În cazul tumorilor maligne raportul dintre tumorile epiteliale (carcinoame, adenocarcinoame) și tumorile mezenchimale (sacroame, fibrosarcoame) este net în favoarea tumorilor epiteliale (81,25%).
Frecvența tumorilor maligne în cazul femelelor crește odată cu vârsta până în jurul vârstei de 12 ani. În general, tumorile diagnosticate au fost încadrate în categoria neoplaziilor maligne (59,25%).
CAPITOLUL 6
BIBLIOGRAFIA UTILIZATĂ ÎN TEXT
Affolter, V. K., P. F. Moore, “Canine Cutaneous and Systemic Histiocytosis of Dermal and Dendritic Origin”. Am J Dermatopathol. 2000, 22, pp. 40-48.
Affolter, V. K., P. F. Moore, “Localized and Disseminated Histiocytic Sarcoma of Dendritic Cell Origin in Dogs”. Vet Pathol. 2002, 39, pp. 74-83.
Andoniou, C. E., S. L. H. van Dommelen, V. Voigt et al., “Interaction between Conventional Dendritic Cells and Natural Killer Cells is Integral to the Activation of Effective Antiviral Immunity”. Nature Immunology. Vol. 6, no. 10. 2005, pp. 1011-1019.
Baines, S. J., E. F. McInnes, I. McConnell, “E-cadherin Expression in Canine Cutaneous Histiocytomas”. Vet Rec. 2008, 162, pp. 509-513.
Bajenoff, M., B. Breart, A. Y. Huang, H. Qi, J. Cazareth, V. M. Braud, R. N. Germain, N. Glaichenhaus, “Natural Killer Cell Behavior in Lymph Nodes Revealed by Static and Real-Time Imaging”. J. Exp. Med. 2006, 203, pp. 619-631.
Banchereau, J., R. M. Steinman, “Dendritic Cells and the Control of Immunity. Nature. Vol. 392, no. 6673. 1998, pp. 245-252.
Berg-Brown, N. N., L. T. Nguyen, P. Ohashi, “Cancer and the Immune System”, I. F. Tannock, R. P. Hill, R. G. Bristow, L. Harrington (eds.), The Basic Science of Oncology. 4th edition. McGraw-Hill Medical Publishing Divison. New York. 2005, pp. 431-452.
Bostock, D. E., “Neoplasms of the Skin and Subcutaneous Tissues in Dogs and Cats”. Br Vet J. 1986, 142, pp. 1-19.
Brodey, R. S., “Canine and Feline Neoplasias”. Adv Vet Sci Comp Med. 1970, 14, pp. 309-354.
Brown, D. E., M. A. Thrall, D. M. Getzy et al., “Cytology of Canine Malignant Histiocytosis”. Vet Clin Pathol. 1994, 23, pp. 118-123.
Brown, M. G., A. O. Dokun, J. W. Heusel et al., “Vital Involvement of Natural Killer Cell Activation Receptor in Resistance to Viral Infection”. Science. 2001, 292, pp. 934-937.
Cerwenka, A., L. L. Lanier. “Natural Killer Cells, Viruses and Cancer”. Nat Rev Immunology. 2001, 1, pp. 41-49.
Choudhury, A., H. Harlin, H. Melstedt. “Fundamentals of Tumor Imunology”. H. Melstedt, D. Schrijvers, D. Bakaloukos, R. Greil (eds), European Society for Medical Oncology – Handbook of Principles of Translational Research. Informa Healthcare, Geneva. 2007, pp. 39-45.
Colonna, M., G. Trinchieri, Y. J. Liu, “Plasmacytoid Dendritic Cells in Immunity”. Nature Immunology. Vol. 5, no. 12. 2004, pp. 1219-1226.
Cooper, M. A., T. A. Fehniger, A. Fuchs, M. Colonna, M. A. Caligiuri, NK Cell and DC Interactions. Trends Immunology. 2004.
Craig, L. E., M. E. Julian, J. D. Ferracone, “The Diagnosis and Prognosis of Synovial Tumors in Dogs: 35 Cases”. Vet Pathol. 2002, 39, pp. 66-73.
Cruz-Arambulo, R., R. Wrigley, B. Powers, “Sonographic Features of Histiocytic Neoplasms in the Canine Abdomen”. Vet Radiol Ultrasound. 2004, 45, pp. 554-558.
Danilenko, D. M., P. F. Moore, P. V. Rossitto, “Canine Leukocyte Cell Adhesion Molecules (LeuCAMS): Characterization of the CD11/CD18 Family”. Tissue Antigens. 1992, 40, pp. 13-21.
Danilenko, D. M., P. V. Rossitti, M. van der Vieren et al., “A Novel Canine Leukointegrin, Alpha D Beta 2, Is Expressed by Specific Macrophage Subpopulations in Tissue and a Minor CD8+ Lymphocyte Subpopulation in Peripheral Blood”. J Immunol ogy. 1995, 155, pp. 35-44.
Delves, P. J., I. M. Roitt, Encyclopedia of Immunology, vol. 1-4. sec. ed. Acad. Press. 1998.
Ericksson, M., J. C. Ryan, M. C. Nakamura et al., “Ly49A Inhibitory Receptors Redistribute on Natural Killer Cells during Target Cell Interaction”. Immunology. 1999, 97, pp. 341-347.
Fant, P., M. Caldin, T. Furlanello et al., “Primary Gastric Histiocytic Sarcoma in a Dog – A Case Report”. J Vet Med. 2004, 51, pp. 358-362.
Ferlazzo, G., C. Münz, “NK Cell Compartments and Their Activation by Dendritic Cells”. Journal of Immunology. Vol. 172, no. 3. 2004, pp. 1333-1339.
Fernandez, N. C., A. Lozier, C. Flament et al., “Dendritic Cells Directly Trigger NK Cell Functions: Cross-Talk Televant in Innate Anti-Tumor Immune Responses in Vivo”. Nature Medicine. Vol. 5, no. 4. 1999, pp. 405-411.
Fernandez S. P., C. Wasowski, L. M. Loscalzo, R. E. Granger, G. A. Johnston, A. C. Paladini, M. Marder, “Central Nervous System Depressant Action of Flavonoid Glycosides European”. Journal of Pharmacology. 2006, 539, pp. 168-176.
Friedrichs, K., C. Thomas, M. Plier et al., “Evaluation of Serum Ferritin as a Tumor Marker for Canine Histiocytic Sarcoma”. J Vet Intern Med. 2010, 24, pp. 904-911.
Friedrichs, K., K. Young, “Histiocytic Sarcoma of Macrophage Origin in a Cat: Case Report with a Literature Review of Feline Histiocytic Malignancies and Comparison with Canine Hemophagocytic Histiocytic Sarcoma”. Vet Clin Pathol. 2008, 37, pp. 121-128.
Gerosa, F., B. Baldani-Guerra, C. Nisii, V. Marchesini, G. Carra, G. Trinchieri, “Reciprocal Activating Interaction between natural killer cells and dendritic cells”. Journal of Experimental Medicine. Vol. 195, no. 3. 2002, pp. 327-333.
Ghilezan, N., „Rolul sistemului imun în cancerogeneză, progresie și rezistență tumorală”. V. Nagy (ed), Principii de cancerologie generală. Ed. Medicală Universitară Iuliu Hațieganu. Cluj-Napoca. 2007, pp. 48-60.
Glick, A. D., M. Holscher, G. R. Campbell, “Canine Cutaneous Histiocytoma: Ultrastructural and Cytochemical Observations”. Vet Pathol. 1976, 13, pp. 374-380.
Gross, T. L., P. J. Ihrke, E. J. Walder, Veterinary Dermatopathology; A Macroscopic Evaluation of Canine and Feline Skin Diseases. St Louis. 1992.
Hafeman, S., C. London, R. Elmslie et al., “Evaluation of Liposomal Clodronate for Treatment of Malignant Histiocytosis in Dogs”. Cancer Immunol Immunother. 2010, 59, pp. 441-452.
Hayden, D. W., D. J. Waters, B. A. Burke et al., “Disseminated Malignant Histiocytosis in a Golden Retriever: Clinicopathologic, Ultrastructural, and Immunohistochemical Findings”. Vet Pathol. 1993, 30, pp. 256-264.
Jamieson, A. M., P. Isnard, J. R. Dorfman, M. C. Coles, D. H. Raulet, “Turnover and Proliferation of NK Cells in Steady State and Lymphopenic Conditions”. J. Immunology.2004, 172, pp. 864-870.
Jung, S., D. Unutmaz, P. Wong, G. Sano, K. de los Santos, T. Sparwasser, S. Wu et al., “In Vivo Depletion of CD11c(1) Dendritic Cells Abrogates Priming of CD8(1) T Cells by Exogenous Cell-Associated Antigens”. Immunity. 2002, 17, pp. 211-220.
Kelly, D. F., “Canine Cutaneous Histiocytoma: A Light and Microscopic Study”. Vet Pathol. 1970, 7, pp. 12-27.
Klahn, S. L., B. Kitchell, N. Dervisis, “Evaluation and Comparison of Outcomes in Dogs with Periarticular and Nonperiarticular Histiocytic Sarcoma”. J Am Vet Med Assoc. 2001, 239, pp. 90-96.
Kohn, B., P. Arnold, B. Kaser-Hotz et al., “Malignant Histiocytosis of the Dog: 26 Cases (1989-1992)”. Kleintierpraxis. 1993, 38, pp. 409-424.
Looringh van Beeck, F. A., D. M. Zajonc, “Two Canine CD1a Proteins are Differentially Expressed in Skin”. Immunogenetics. 2008, 60, pp. 315-324.
Lucas, M., W. Schachterle, K. Oberle, P. Aichele, A. Diefenbach, “Dendritic Cells Prime Natural Killer Cells by Trans-Presenting Interleukin 15”. Immunity. 2007, 26, pp. 503-517.
Male, D., B. Champion, Anne Cook, Advanced Immunology. J. B. Lippincot Company. 1987.
Mays, M. B., J. A. Bergeron, “Cutaneous Histiocytosis in Dogs”. J Am Vet Med Assoc. 1986, 188, pp. 377-381.
Miron, L. „Rolul sistemului imun în cancer”. L. Miron (ed.), Oncologie generală. Ed. Egal. Bacău. 2000, pp. 105-125.
Moore, P. F., “Malignant Histiocytosis of Bernese Mountain Dogs”. Vet Pathol. 1986, 23, pp. 1-10.
Moore, P. F., “Systemic Histiocytosis of Bernese Mountain Dogs”. Vet Pathol. 1984, 21, pp. 554-563.
Moore, P. F., V. Affolter, T. Olivry et al., “The Use of Immunological Reagents in Defining the Pathogenesis of Canine Skin Disease Involving Proliferation of Leukocytes”. K. W. Kwochka, T. Wilemse, C. von Tscharner (eds.). Advances in Veterinary Dermatology. Butterworth-Heinemann. Oxford. 1998.
Moore, P. F., M. D. Schrenzel, V. K. Affolter et al., “Canine Cutaneous Histiocytoma Is an Epidermotropic Langerhans Cell Histiocytosis that Expresses CD1 and Specific Beta 2-Integrin Molecules”. Am J Pathol. 1996,148, pp. 1699-1708.
Moore, P. F., V. K. Affolter, “Canine Hemophagocytic Histiocytic Sarcoma: A Proliferative Disorder of CD11d+ Macrophages”. Vet Pathol. 2006, 43, pp. 632-645.
Moretta, A., “Natural Killer Cells and Dendritic Cells: Rendezvous in Abused Tissues”. Nature Reviews Immunology. Vol. 2, no. 12. 2002, pp. 957-964, 2002.
Moretta, L., G. Ferlazzo, C. Bottino et al., “Effector and Regulatory Events during Natural Killer-Dendritic Cell Interactions”. Immunological Reviews. Vol. 214, no. 1. 2006, pp. 219-228.
Naranjo, C., R. Dubielzig, K. Friedrichs, “Canine Ocular Histiocytic Sarcoma”. Vet Ophthalmol. 2007, 10, pp. 179-185.
Newlands, C. E., D. M. Houston, D. Y. Vasconcelos, “Hyperferritinemia Associated with Malignant Histiocytosis in a Dog”. J Am Vet Med Assoc. 1994, 205, pp. 849-851.
Palmeiro, B. S., D. O. Morris, M. H. Goldschmidt et al., “Cutaneous Reactive Histiocytosis in Dogs: A Retrospective Evaluation of 32 Cases”. Vet Dermatol. 2007, 18, pp. 332-340.
Pardoll, D. M., “Cancer Immunology”. M. D. Abelofff, J. O. Armitage, J. E. Niederhuber, M. B. Kastan, W. G. McKenna (eds), Abeloff’s Clinical Oncology. 4th edition. Churchill Livingstone Elsevier. Philadelphia. 2008, pp. 77-93.
Patrick S., M. J. Larkin, Immunological and Molecular Aspects of Bacterial Virulence. J. Wiley & Sons. 1995.
Piccioli, D., S. Sbrana, E. Melandri, N. M. Valiante, “Contact-Dependent Stimulation and Inhibition of Dendritic Cells by Natural Killer Cells”. Journal of Experimental Medicine. Vol. 195, no. 3. 2002, pp. 335-341.
Pires, I., F. L. Queiroga, A. Alves et al., “Decrease of E-cadherin Expression in Canine Cutaneous Histiocytoma Appears to Be Related to Its Spontaneous Regression”. Anticancer Res. 2009, 29, pp. 2713-2717.
Poirier, V. J., A. E. Hershey, K. E. Burgess et al., “Efficacy and Toxicity of Paclitaxel (Taxol) for the Treatment of Canine Malignant Tumors”. J Vet Intern Med. 2004, 18, pp. 219-222.
Prlic, M., B. R. Blazar, M. A. Farrar, S. C. Jameson, “In Vivo Survival and Homeostatic Proliferation of Natural Killer Cells”. J. Exp. Med. 2003, 197, pp. 967-976.
Ramos-Vara, J. A., M. A. Miller, “Immunohistochemical Expression of E-cadherin Does Not Distinguish Canine Cutaneous Histiocytoma from Other Canine Round Cell Tumors”. Vet Pathol. 2011, 48, pp. 758-763.
Ranson, T., C. A. Vosshenrich, E. Corcuff, O. Richard, W. Muller, J. P. Di Santo, IL-15 is an Essential Mediator of Peripheral NK-Cell Homeostasis. Blood. 2003.
Rassnick, K., A. Moore, D. Russell et al., “Phase II, Open-Label Trial of Single-Agent CCNU in Dogs with Previously Untreated Histiocytic Sarcoma”. J Vet Intern Med. 2010, 24, pp. 1528-1531.
Restifo, P. N., P. F. Robbins, S. A. Rosenberg. “Principles of Immunotherapy”. V. T. Jr. DeVita, T. S. Lawrence, S. A. Rosenberg, R. A. DePinho, R. A. Weinberg (eds), DeVita, Hellman, and Rosenberg’s Cancer-Principles and Practice of Oncology. 8th edition. Wolter Kluwer/Lippincott Williams & Wilkins. Philadelphia. 2008, pp. 351-367.
Ricklin, M. E., P. Roosje, “Characterization of Canine Dendritic Cells in Healthy, Atopic, and Non-allergic Inflamed Skin”. J Clin Immunology. 2010, 30, pp. 845-854.
Roitt, I. M., Essential Immunology. Ninth edition. Blackwell Science. 1997.
Rosin, A., P. Moore, R. Dubielzig, “Malignant Histiocytosis in Bernese Mountain Dogs”. J Am Vet Med Assoc. 1986, 188, pp. 1041-1045.
Rothwell, T. L. W., C. R. Howlett, D. J. Middleton et al., “Skin Neoplasms of Dogs in Sydney”. Aust Vet J. 1987, 64, pp. 161-164.
Ruddon, R. W., “Tumor Immunology”. R. W. Ruddon (ed.), Cancer Biology. 4th edition, Oxford University Press. New York. 2007, pp. 400-429.
Samter, M., D. W. Talmage, M. M. Frank, K. G. Austen, H. N. Claman, Immunological Diseases. Vol. I, II. Fourth ed. Boston, Toronto.
Scherlie, P. H., S. L. Smedes, T. Feltz et al., “Ocular Manifestations of Systemic Histiocytosis in a Dog”. J Am Vet Med Assoc. 1992, 201, pp. 1229-1232.
Scott, D. W., D. K. Angurano, M. M. Suter, “Systemic Histiocytosis in 2 Dogs”. Canine Pract. 1987, 14, pp. 7-12.
Sheehan, Catherine, Clinical Immunology, Principles and Laboratory Diagnosis. Sec. edition. Lippincot. Philadelphia, New York. 1997.
Shortman, K., S. H. Naik, “Steady-State and Inflammatory Dendritic-Cell Development”. Nat Rev Immunol. 2007, 7, pp. 19-30.
Shortman, K., C. Caux, “Dendritic Cell Development: Multiple Pathways to Nature’s Adjuvants”. Stem Cells. 1997, 15, pp. 409-419.
Skorupski, K., C. Clifford, M. Paoloni et al., “CCNU for the Treatment of Dogs With Histiocytic Sarcoma”. J Vet Intern Med. 2007, 21, pp. 121-126.
Skorupski, K., C. Rodriguez, E. Krick et al., “Long-term Survival in Dogs with Localized Histiocytic Sarcoma Treated with CCNU as an Adjuvant to Local Therapy”. Vet Comp Oncol. 2009, 7, pp. 139-144.
Snyder, J., L. Lipitz, K. Skorupski et al., “Secondary Intracranial Neoplasia in the Dog: 177 Cases (1986-2003)”. J Vet Intern Med. 2008, 22, pp. 172-177.
Tartour, E., A. Gazagne, T. Friedman Wolf-Herve, “Immunologie des tummeurs”. R. Lacave, Ch. – J. Larsen, J. Robert (eds), Cancerologie fondamentale. John Liberty Eurotext. Paris. 2005, pp. 384-394.
Thoolen, R. J., J. H. Vos, J. S. van der Linde-Sipman et al., “Malignant Fibrous Histiocytomas in Dogs and Cats: An Immunohistochemical Study”. Res Vet Sci. 1992, 53, pp. 198-204.
Trinchieri, G., “Biology of NK Cells”. Adv Immunology. 1989, 47, pp. 187-376.
Trinchieri, G., “Etiology of Cancer: Inflamation". V. T. Jr. DeVita, T. S. Lawrence, S. A. Rosenberg, R. A. DePinho, R. A. Weinberg (eds). DeVita, Hellman, and Rosenberg’s Cancer – Principles and Practice of Oncology. 8th edition. Wolter Kluwer/Lippincott Williams & Wilkins. Philadelphia. 2008, pp. 191-202.
Uno, Y., Y. Momio, T. Watari et al., “Malignant Histiocytosis with Multiple Skin Lesions in a Dog”. J Vet Med Sci. 1993, 55, pp. 1059-1061.
Vail, D. M., L. D. Kravis, A. J. Cooley et al., “Preclinical Trial of Doxorubicin Entrapped in Sterically Stabilized Liposomes in Dogs with Spontaneously Arising Malignant Tumors”. Cancer Chemother Pharmacol. 1997, 39, pp. 410-416.
Vernau, K. M., R. J. Higgins, A. W. Bollen et al., “Primary Canine and Feline Nervous System Tumors: Intraoperative Diagnosis Using the Smear Technique”. Vet Pathol. 2001, 38, pp. 47-57.
Weber, G. F., “Interactions with the Immune System”. G. F. Weber (ed.), Molecular Basis of Cancer. Springer. 2007, pp. 389-412.
Weber, J. S., Dessureault, A. Scott. “Tumor Immunology and Immunotherapy”. A. E. Chang et al. (eds). Oncology – An Evidence-Based Approach. Springer. New York. 2006, pp. 254-268.
Weir, D. M., J. Stewart, Immunology. Seventh edition. Longman Group. UK. 1993.
Weiss, D. J., “Flow Cytometric Evaluation of Hemophagocytic Disorders in Canine”. Vet Clin Pathol. 2002, 31, pp. 36-41.
Weiss, D. J., O. A. Evanson, J. Sykes, “A Retrospective Study of Canine Pancytopenia”. Vet Clin Pathol. 1999, 28, pp. 83-88.
Yager, J. A., B. P. Wilcock, Color Atlas and Text of Surgical Pathology of the Dog and Cat: Dermatopathology and Skin Tumors. M. Wolfe. London. 1994.
Yokoyama, W. M., S. Kim, A. R. French, “The Dynamic Life of Natural Killer Cells”. Annu. Rev. Immunology. 2004, 22, pp. 405-429.
Zaft, T., A. Sapoznikov, R. Krauthgamer, D. R. Littman, S. Jung, “CD11chigh Dendritic Cell Ablation Impairs Lymphopenia-Driven Proliferation of Naive and Memory CD81 T Cells”. J. Immunology. 2005, 175, pp. 6428-6435.
Zarnea, G., Tratat de microbiologie. vol. IV: Imunobiologie. Ed. Academiei Române. București. 1990.
Zarnea, G., Gr. Mihăescu, Imunologie. Ed. Universității. București. 1995.
CAPITOLUL 7
IMAGISTICA
Conglomerat de chisturi
Hiperplazie epitelială intrachistică
Conglomerat de chisturi cu secreție
Metaplazie cartilaginoasă stromată
Ecografie 1
Ecografie 2
Ecografie 3
Ecografie 4
Imagistică
Imagistică
Imagistică
Imagistică
Imagistică
Imagistică
Imagistică
Imagistică
Imagistică
Microscopie
Microscopie
Microscopie
Microscopie
Microscopie
Microscopie
Microscopie
Microscopie
Microscopie
Microscopie
Microscopie
Imagistică
Imagistică
Imagistică
Imagistică
Imagistică
BIBLIOGRAFIA UTILIZATĂ ÎN TEXT
Affolter, V. K., P. F. Moore, “Canine Cutaneous and Systemic Histiocytosis of Dermal and Dendritic Origin”. Am J Dermatopathol. 2000, 22, pp. 40-48.
Affolter, V. K., P. F. Moore, “Localized and Disseminated Histiocytic Sarcoma of Dendritic Cell Origin in Dogs”. Vet Pathol. 2002, 39, pp. 74-83.
Andoniou, C. E., S. L. H. van Dommelen, V. Voigt et al., “Interaction between Conventional Dendritic Cells and Natural Killer Cells is Integral to the Activation of Effective Antiviral Immunity”. Nature Immunology. Vol. 6, no. 10. 2005, pp. 1011-1019.
Baines, S. J., E. F. McInnes, I. McConnell, “E-cadherin Expression in Canine Cutaneous Histiocytomas”. Vet Rec. 2008, 162, pp. 509-513.
Bajenoff, M., B. Breart, A. Y. Huang, H. Qi, J. Cazareth, V. M. Braud, R. N. Germain, N. Glaichenhaus, “Natural Killer Cell Behavior in Lymph Nodes Revealed by Static and Real-Time Imaging”. J. Exp. Med. 2006, 203, pp. 619-631.
Banchereau, J., R. M. Steinman, “Dendritic Cells and the Control of Immunity. Nature. Vol. 392, no. 6673. 1998, pp. 245-252.
Berg-Brown, N. N., L. T. Nguyen, P. Ohashi, “Cancer and the Immune System”, I. F. Tannock, R. P. Hill, R. G. Bristow, L. Harrington (eds.), The Basic Science of Oncology. 4th edition. McGraw-Hill Medical Publishing Divison. New York. 2005, pp. 431-452.
Bostock, D. E., “Neoplasms of the Skin and Subcutaneous Tissues in Dogs and Cats”. Br Vet J. 1986, 142, pp. 1-19.
Brodey, R. S., “Canine and Feline Neoplasias”. Adv Vet Sci Comp Med. 1970, 14, pp. 309-354.
Brown, D. E., M. A. Thrall, D. M. Getzy et al., “Cytology of Canine Malignant Histiocytosis”. Vet Clin Pathol. 1994, 23, pp. 118-123.
Brown, M. G., A. O. Dokun, J. W. Heusel et al., “Vital Involvement of Natural Killer Cell Activation Receptor in Resistance to Viral Infection”. Science. 2001, 292, pp. 934-937.
Cerwenka, A., L. L. Lanier. “Natural Killer Cells, Viruses and Cancer”. Nat Rev Immunology. 2001, 1, pp. 41-49.
Choudhury, A., H. Harlin, H. Melstedt. “Fundamentals of Tumor Imunology”. H. Melstedt, D. Schrijvers, D. Bakaloukos, R. Greil (eds), European Society for Medical Oncology – Handbook of Principles of Translational Research. Informa Healthcare, Geneva. 2007, pp. 39-45.
Colonna, M., G. Trinchieri, Y. J. Liu, “Plasmacytoid Dendritic Cells in Immunity”. Nature Immunology. Vol. 5, no. 12. 2004, pp. 1219-1226.
Cooper, M. A., T. A. Fehniger, A. Fuchs, M. Colonna, M. A. Caligiuri, NK Cell and DC Interactions. Trends Immunology. 2004.
Craig, L. E., M. E. Julian, J. D. Ferracone, “The Diagnosis and Prognosis of Synovial Tumors in Dogs: 35 Cases”. Vet Pathol. 2002, 39, pp. 66-73.
Cruz-Arambulo, R., R. Wrigley, B. Powers, “Sonographic Features of Histiocytic Neoplasms in the Canine Abdomen”. Vet Radiol Ultrasound. 2004, 45, pp. 554-558.
Danilenko, D. M., P. F. Moore, P. V. Rossitto, “Canine Leukocyte Cell Adhesion Molecules (LeuCAMS): Characterization of the CD11/CD18 Family”. Tissue Antigens. 1992, 40, pp. 13-21.
Danilenko, D. M., P. V. Rossitti, M. van der Vieren et al., “A Novel Canine Leukointegrin, Alpha D Beta 2, Is Expressed by Specific Macrophage Subpopulations in Tissue and a Minor CD8+ Lymphocyte Subpopulation in Peripheral Blood”. J Immunol ogy. 1995, 155, pp. 35-44.
Delves, P. J., I. M. Roitt, Encyclopedia of Immunology, vol. 1-4. sec. ed. Acad. Press. 1998.
Ericksson, M., J. C. Ryan, M. C. Nakamura et al., “Ly49A Inhibitory Receptors Redistribute on Natural Killer Cells during Target Cell Interaction”. Immunology. 1999, 97, pp. 341-347.
Fant, P., M. Caldin, T. Furlanello et al., “Primary Gastric Histiocytic Sarcoma in a Dog – A Case Report”. J Vet Med. 2004, 51, pp. 358-362.
Ferlazzo, G., C. Münz, “NK Cell Compartments and Their Activation by Dendritic Cells”. Journal of Immunology. Vol. 172, no. 3. 2004, pp. 1333-1339.
Fernandez, N. C., A. Lozier, C. Flament et al., “Dendritic Cells Directly Trigger NK Cell Functions: Cross-Talk Televant in Innate Anti-Tumor Immune Responses in Vivo”. Nature Medicine. Vol. 5, no. 4. 1999, pp. 405-411.
Fernandez S. P., C. Wasowski, L. M. Loscalzo, R. E. Granger, G. A. Johnston, A. C. Paladini, M. Marder, “Central Nervous System Depressant Action of Flavonoid Glycosides European”. Journal of Pharmacology. 2006, 539, pp. 168-176.
Friedrichs, K., C. Thomas, M. Plier et al., “Evaluation of Serum Ferritin as a Tumor Marker for Canine Histiocytic Sarcoma”. J Vet Intern Med. 2010, 24, pp. 904-911.
Friedrichs, K., K. Young, “Histiocytic Sarcoma of Macrophage Origin in a Cat: Case Report with a Literature Review of Feline Histiocytic Malignancies and Comparison with Canine Hemophagocytic Histiocytic Sarcoma”. Vet Clin Pathol. 2008, 37, pp. 121-128.
Gerosa, F., B. Baldani-Guerra, C. Nisii, V. Marchesini, G. Carra, G. Trinchieri, “Reciprocal Activating Interaction between natural killer cells and dendritic cells”. Journal of Experimental Medicine. Vol. 195, no. 3. 2002, pp. 327-333.
Ghilezan, N., „Rolul sistemului imun în cancerogeneză, progresie și rezistență tumorală”. V. Nagy (ed), Principii de cancerologie generală. Ed. Medicală Universitară Iuliu Hațieganu. Cluj-Napoca. 2007, pp. 48-60.
Glick, A. D., M. Holscher, G. R. Campbell, “Canine Cutaneous Histiocytoma: Ultrastructural and Cytochemical Observations”. Vet Pathol. 1976, 13, pp. 374-380.
Gross, T. L., P. J. Ihrke, E. J. Walder, Veterinary Dermatopathology; A Macroscopic Evaluation of Canine and Feline Skin Diseases. St Louis. 1992.
Hafeman, S., C. London, R. Elmslie et al., “Evaluation of Liposomal Clodronate for Treatment of Malignant Histiocytosis in Dogs”. Cancer Immunol Immunother. 2010, 59, pp. 441-452.
Hayden, D. W., D. J. Waters, B. A. Burke et al., “Disseminated Malignant Histiocytosis in a Golden Retriever: Clinicopathologic, Ultrastructural, and Immunohistochemical Findings”. Vet Pathol. 1993, 30, pp. 256-264.
Jamieson, A. M., P. Isnard, J. R. Dorfman, M. C. Coles, D. H. Raulet, “Turnover and Proliferation of NK Cells in Steady State and Lymphopenic Conditions”. J. Immunology.2004, 172, pp. 864-870.
Jung, S., D. Unutmaz, P. Wong, G. Sano, K. de los Santos, T. Sparwasser, S. Wu et al., “In Vivo Depletion of CD11c(1) Dendritic Cells Abrogates Priming of CD8(1) T Cells by Exogenous Cell-Associated Antigens”. Immunity. 2002, 17, pp. 211-220.
Kelly, D. F., “Canine Cutaneous Histiocytoma: A Light and Microscopic Study”. Vet Pathol. 1970, 7, pp. 12-27.
Klahn, S. L., B. Kitchell, N. Dervisis, “Evaluation and Comparison of Outcomes in Dogs with Periarticular and Nonperiarticular Histiocytic Sarcoma”. J Am Vet Med Assoc. 2001, 239, pp. 90-96.
Kohn, B., P. Arnold, B. Kaser-Hotz et al., “Malignant Histiocytosis of the Dog: 26 Cases (1989-1992)”. Kleintierpraxis. 1993, 38, pp. 409-424.
Looringh van Beeck, F. A., D. M. Zajonc, “Two Canine CD1a Proteins are Differentially Expressed in Skin”. Immunogenetics. 2008, 60, pp. 315-324.
Lucas, M., W. Schachterle, K. Oberle, P. Aichele, A. Diefenbach, “Dendritic Cells Prime Natural Killer Cells by Trans-Presenting Interleukin 15”. Immunity. 2007, 26, pp. 503-517.
Male, D., B. Champion, Anne Cook, Advanced Immunology. J. B. Lippincot Company. 1987.
Mays, M. B., J. A. Bergeron, “Cutaneous Histiocytosis in Dogs”. J Am Vet Med Assoc. 1986, 188, pp. 377-381.
Miron, L. „Rolul sistemului imun în cancer”. L. Miron (ed.), Oncologie generală. Ed. Egal. Bacău. 2000, pp. 105-125.
Moore, P. F., “Malignant Histiocytosis of Bernese Mountain Dogs”. Vet Pathol. 1986, 23, pp. 1-10.
Moore, P. F., “Systemic Histiocytosis of Bernese Mountain Dogs”. Vet Pathol. 1984, 21, pp. 554-563.
Moore, P. F., V. Affolter, T. Olivry et al., “The Use of Immunological Reagents in Defining the Pathogenesis of Canine Skin Disease Involving Proliferation of Leukocytes”. K. W. Kwochka, T. Wilemse, C. von Tscharner (eds.). Advances in Veterinary Dermatology. Butterworth-Heinemann. Oxford. 1998.
Moore, P. F., M. D. Schrenzel, V. K. Affolter et al., “Canine Cutaneous Histiocytoma Is an Epidermotropic Langerhans Cell Histiocytosis that Expresses CD1 and Specific Beta 2-Integrin Molecules”. Am J Pathol. 1996,148, pp. 1699-1708.
Moore, P. F., V. K. Affolter, “Canine Hemophagocytic Histiocytic Sarcoma: A Proliferative Disorder of CD11d+ Macrophages”. Vet Pathol. 2006, 43, pp. 632-645.
Moretta, A., “Natural Killer Cells and Dendritic Cells: Rendezvous in Abused Tissues”. Nature Reviews Immunology. Vol. 2, no. 12. 2002, pp. 957-964, 2002.
Moretta, L., G. Ferlazzo, C. Bottino et al., “Effector and Regulatory Events during Natural Killer-Dendritic Cell Interactions”. Immunological Reviews. Vol. 214, no. 1. 2006, pp. 219-228.
Naranjo, C., R. Dubielzig, K. Friedrichs, “Canine Ocular Histiocytic Sarcoma”. Vet Ophthalmol. 2007, 10, pp. 179-185.
Newlands, C. E., D. M. Houston, D. Y. Vasconcelos, “Hyperferritinemia Associated with Malignant Histiocytosis in a Dog”. J Am Vet Med Assoc. 1994, 205, pp. 849-851.
Palmeiro, B. S., D. O. Morris, M. H. Goldschmidt et al., “Cutaneous Reactive Histiocytosis in Dogs: A Retrospective Evaluation of 32 Cases”. Vet Dermatol. 2007, 18, pp. 332-340.
Pardoll, D. M., “Cancer Immunology”. M. D. Abelofff, J. O. Armitage, J. E. Niederhuber, M. B. Kastan, W. G. McKenna (eds), Abeloff’s Clinical Oncology. 4th edition. Churchill Livingstone Elsevier. Philadelphia. 2008, pp. 77-93.
Patrick S., M. J. Larkin, Immunological and Molecular Aspects of Bacterial Virulence. J. Wiley & Sons. 1995.
Piccioli, D., S. Sbrana, E. Melandri, N. M. Valiante, “Contact-Dependent Stimulation and Inhibition of Dendritic Cells by Natural Killer Cells”. Journal of Experimental Medicine. Vol. 195, no. 3. 2002, pp. 335-341.
Pires, I., F. L. Queiroga, A. Alves et al., “Decrease of E-cadherin Expression in Canine Cutaneous Histiocytoma Appears to Be Related to Its Spontaneous Regression”. Anticancer Res. 2009, 29, pp. 2713-2717.
Poirier, V. J., A. E. Hershey, K. E. Burgess et al., “Efficacy and Toxicity of Paclitaxel (Taxol) for the Treatment of Canine Malignant Tumors”. J Vet Intern Med. 2004, 18, pp. 219-222.
Prlic, M., B. R. Blazar, M. A. Farrar, S. C. Jameson, “In Vivo Survival and Homeostatic Proliferation of Natural Killer Cells”. J. Exp. Med. 2003, 197, pp. 967-976.
Ramos-Vara, J. A., M. A. Miller, “Immunohistochemical Expression of E-cadherin Does Not Distinguish Canine Cutaneous Histiocytoma from Other Canine Round Cell Tumors”. Vet Pathol. 2011, 48, pp. 758-763.
Ranson, T., C. A. Vosshenrich, E. Corcuff, O. Richard, W. Muller, J. P. Di Santo, IL-15 is an Essential Mediator of Peripheral NK-Cell Homeostasis. Blood. 2003.
Rassnick, K., A. Moore, D. Russell et al., “Phase II, Open-Label Trial of Single-Agent CCNU in Dogs with Previously Untreated Histiocytic Sarcoma”. J Vet Intern Med. 2010, 24, pp. 1528-1531.
Restifo, P. N., P. F. Robbins, S. A. Rosenberg. “Principles of Immunotherapy”. V. T. Jr. DeVita, T. S. Lawrence, S. A. Rosenberg, R. A. DePinho, R. A. Weinberg (eds), DeVita, Hellman, and Rosenberg’s Cancer-Principles and Practice of Oncology. 8th edition. Wolter Kluwer/Lippincott Williams & Wilkins. Philadelphia. 2008, pp. 351-367.
Ricklin, M. E., P. Roosje, “Characterization of Canine Dendritic Cells in Healthy, Atopic, and Non-allergic Inflamed Skin”. J Clin Immunology. 2010, 30, pp. 845-854.
Roitt, I. M., Essential Immunology. Ninth edition. Blackwell Science. 1997.
Rosin, A., P. Moore, R. Dubielzig, “Malignant Histiocytosis in Bernese Mountain Dogs”. J Am Vet Med Assoc. 1986, 188, pp. 1041-1045.
Rothwell, T. L. W., C. R. Howlett, D. J. Middleton et al., “Skin Neoplasms of Dogs in Sydney”. Aust Vet J. 1987, 64, pp. 161-164.
Ruddon, R. W., “Tumor Immunology”. R. W. Ruddon (ed.), Cancer Biology. 4th edition, Oxford University Press. New York. 2007, pp. 400-429.
Samter, M., D. W. Talmage, M. M. Frank, K. G. Austen, H. N. Claman, Immunological Diseases. Vol. I, II. Fourth ed. Boston, Toronto.
Scherlie, P. H., S. L. Smedes, T. Feltz et al., “Ocular Manifestations of Systemic Histiocytosis in a Dog”. J Am Vet Med Assoc. 1992, 201, pp. 1229-1232.
Scott, D. W., D. K. Angurano, M. M. Suter, “Systemic Histiocytosis in 2 Dogs”. Canine Pract. 1987, 14, pp. 7-12.
Sheehan, Catherine, Clinical Immunology, Principles and Laboratory Diagnosis. Sec. edition. Lippincot. Philadelphia, New York. 1997.
Shortman, K., S. H. Naik, “Steady-State and Inflammatory Dendritic-Cell Development”. Nat Rev Immunol. 2007, 7, pp. 19-30.
Shortman, K., C. Caux, “Dendritic Cell Development: Multiple Pathways to Nature’s Adjuvants”. Stem Cells. 1997, 15, pp. 409-419.
Skorupski, K., C. Clifford, M. Paoloni et al., “CCNU for the Treatment of Dogs With Histiocytic Sarcoma”. J Vet Intern Med. 2007, 21, pp. 121-126.
Skorupski, K., C. Rodriguez, E. Krick et al., “Long-term Survival in Dogs with Localized Histiocytic Sarcoma Treated with CCNU as an Adjuvant to Local Therapy”. Vet Comp Oncol. 2009, 7, pp. 139-144.
Snyder, J., L. Lipitz, K. Skorupski et al., “Secondary Intracranial Neoplasia in the Dog: 177 Cases (1986-2003)”. J Vet Intern Med. 2008, 22, pp. 172-177.
Tartour, E., A. Gazagne, T. Friedman Wolf-Herve, “Immunologie des tummeurs”. R. Lacave, Ch. – J. Larsen, J. Robert (eds), Cancerologie fondamentale. John Liberty Eurotext. Paris. 2005, pp. 384-394.
Thoolen, R. J., J. H. Vos, J. S. van der Linde-Sipman et al., “Malignant Fibrous Histiocytomas in Dogs and Cats: An Immunohistochemical Study”. Res Vet Sci. 1992, 53, pp. 198-204.
Trinchieri, G., “Biology of NK Cells”. Adv Immunology. 1989, 47, pp. 187-376.
Trinchieri, G., “Etiology of Cancer: Inflamation". V. T. Jr. DeVita, T. S. Lawrence, S. A. Rosenberg, R. A. DePinho, R. A. Weinberg (eds). DeVita, Hellman, and Rosenberg’s Cancer – Principles and Practice of Oncology. 8th edition. Wolter Kluwer/Lippincott Williams & Wilkins. Philadelphia. 2008, pp. 191-202.
Uno, Y., Y. Momio, T. Watari et al., “Malignant Histiocytosis with Multiple Skin Lesions in a Dog”. J Vet Med Sci. 1993, 55, pp. 1059-1061.
Vail, D. M., L. D. Kravis, A. J. Cooley et al., “Preclinical Trial of Doxorubicin Entrapped in Sterically Stabilized Liposomes in Dogs with Spontaneously Arising Malignant Tumors”. Cancer Chemother Pharmacol. 1997, 39, pp. 410-416.
Vernau, K. M., R. J. Higgins, A. W. Bollen et al., “Primary Canine and Feline Nervous System Tumors: Intraoperative Diagnosis Using the Smear Technique”. Vet Pathol. 2001, 38, pp. 47-57.
Weber, G. F., “Interactions with the Immune System”. G. F. Weber (ed.), Molecular Basis of Cancer. Springer. 2007, pp. 389-412.
Weber, J. S., Dessureault, A. Scott. “Tumor Immunology and Immunotherapy”. A. E. Chang et al. (eds). Oncology – An Evidence-Based Approach. Springer. New York. 2006, pp. 254-268.
Weir, D. M., J. Stewart, Immunology. Seventh edition. Longman Group. UK. 1993.
Weiss, D. J., “Flow Cytometric Evaluation of Hemophagocytic Disorders in Canine”. Vet Clin Pathol. 2002, 31, pp. 36-41.
Weiss, D. J., O. A. Evanson, J. Sykes, “A Retrospective Study of Canine Pancytopenia”. Vet Clin Pathol. 1999, 28, pp. 83-88.
Yager, J. A., B. P. Wilcock, Color Atlas and Text of Surgical Pathology of the Dog and Cat: Dermatopathology and Skin Tumors. M. Wolfe. London. 1994.
Yokoyama, W. M., S. Kim, A. R. French, “The Dynamic Life of Natural Killer Cells”. Annu. Rev. Immunology. 2004, 22, pp. 405-429.
Zaft, T., A. Sapoznikov, R. Krauthgamer, D. R. Littman, S. Jung, “CD11chigh Dendritic Cell Ablation Impairs Lymphopenia-Driven Proliferation of Naive and Memory CD81 T Cells”. J. Immunology. 2005, 175, pp. 6428-6435.
Zarnea, G., Tratat de microbiologie. vol. IV: Imunobiologie. Ed. Academiei Române. București. 1990.
Zarnea, G., Gr. Mihăescu, Imunologie. Ed. Universității. București. 1995.
Copyright Notice
© Licențiada.org respectă drepturile de proprietate intelectuală și așteaptă ca toți utilizatorii să facă același lucru. Dacă consideri că un conținut de pe site încalcă drepturile tale de autor, te rugăm să trimiți o notificare DMCA.
Acest articol: Relatiile Celulelor Dendritice Si Nkin Cadrul Sci Ului LA Specia Canina (ID: 157815)
Dacă considerați că acest conținut vă încalcă drepturile de autor, vă rugăm să depuneți o cerere pe pagina noastră Copyright Takedown.