Referat De Literatură A. Anghel Final [603861]

FACULTATEA DE CHIMIE

REFERAT DE LITERATURĂ

Masterand: [anonimizat]:
Ș.l. dr.: SORANA IONESCU

2020

FACULTATEA DE CHIMIE
DEPARTAMENTUL DE CHIMIE FIZICĂ

REFERAT DE LITERATURĂ
FIBRILE DE TIP AMILOID -BETA LA
ALBUMINELE SERICE ÎN URMA
PROCESULUI DE GLICARE
MASTER: CHIMIA MEDICAMENTELOR ȘI PRODUSELOR
COSMETICE

Masterand: [anonimizat]:
Ș.l. dr.: SORANA IONESCU

2020

3
CUPRINS

REFERAT DE LITERATURĂ
1
Capitolul 1
Procese de glicare și fibrilare la albuminele serice
4
1.1. Introducere 4
1.2.Aspecte generale privind albuminele 5
1.3. Aspecte generale privind amiloizii și fibrilele amiloidale 8
1.4. Formarea fibrilelor amiloidale de către HSA și BSA 9
1.5. Interacția albuminelor serice glicate și non -glicate cu ciclodextrinele (CyD) 11

Capitolul 2
Metode spectroscopice de studiu al glicării și fibrilării albuminelor

15
2.1. Spectroscopia de absorbție 15
2.2. Spectroscopie de fluorescență 16
2.3. Spectroscopie de dicroism circular 17
2.4. Spectroscopie FTIR 18
2.5. Spectroscopia Raman 21
2.6. Concluzii 22
Bibliografie 22

4
Capitolul 1. Procese de glicare și fibrilare la albuminele serice

1.1.Introducere
Diabetul este întâlnit la 366 de milioane de oameni din întreaga lume și se estimează că va
afecta 552 de milioane de persoane până în 2030 [1]. Multe dintre complicațiile asociate diabetului
se datorează procesului de glicare a proteinel or, de aceea înțelegerea procedeului de formare și a
modului în care acesta afectează structura și proprietățile proteinelor reprezintă o temă de
actualitate, de o importanță extraordinară. Studiul acestor modificări ar putea conduce la schimbări
în ceea c e privește prevenția și tratamentul acestor afecțiuni.
Albuminele serice uman ă și bovin ă sunt proteine răspândite pe scară largă care pot forma
fibrile amiloidice în cazul unei destabilizări. Utilizarea unor proteine bine cunoscute cu un proces
de agregare ușor de controlat și compararea acestor procese pentru proteine similare din diferite
specii, ar putea ajuta la elucidarea manierei în care are loc agregarea implicată în multe boli
degenerative, de exemplu Alzheimer, Parkinson sau diabetul de tip II [2]. Mecanismul de formare al
fibrilelor amiloidice nu este încă bine descris, dar s -a constat c ă aceste fibrile apar atât în cadrul
microorganismelor, cât și al organismului uman, fapt ce atestă că proprietatea proteinelor de a
forma amilo izi a supraviețuit e voluției și deci, aceștia ar putea avea și acțiuni benefice. Sunt
necesare studii suplimentare pentru a clarifica mecanismul detaliat al amiloidogenezei fibrilare și
pentru a determina cinetica procesului, dar, în primul rând, este necesară determinarea po sibililor
factori -cheie ce asigură controlul procesului de agregare, pentru a preveni dezvoltarea patologiilor
și a bolilor cauzate de acestea sau, dimpotrivă, pentru a le utiliza în scopuri terapeutice, de exemplu,
pentru îmbunătățirea imunității antivira le sau a memoriei [3].
Având în vedere concentrațiile plasmatice și timpul de viață ridicat al BSA și HSA se poate
aprecia faptul că aceste două proteine sunt extrem de expuse amiloidogenezei, fiind astfel indicată
utilizarea acestora în cadrul studiilor r eferitoare la procesele glicooxidative. De asemenea, datorită
proprietăților farmacologice pe care le prezintă, având capacitatea de a transporta diverse
medicamente către celulele țintă, este important să se investigheze influența pe care o are formarea
fibrilelor de tip amiloid asupra acestor caracteristici.

5
1.2.Aspecte generale privind albuminele
Albumina serică umană (HSA) este o proteină multifuncțională, sintetizată exclusiv de către
hepatocite și secretată continuu în sistemul circulator, reprezentând aproximativ 60 -65% din totalul
de proteine plasmatice. Datorită unui număr mare de resturi acide (98 Glu + Asp) și bazice (83 Lys
+ Arg), proteina este foarte solubilă în medii apoase. Astfel, concentrația sa în plasmă este de cca.
0,6 mM (4% greutate / volum), dar soluții de 20% pot fi preparate pentru utilizare clinică. Prezența
multor reziduuri de aminoacizi ionizabili implică și faptul că HSA are o capacitate importantă de
tamponare. Conținutul inegal de reziduuri acide și bazic e determină o sarcină netă de cca. −15 la pH
fiziologic, fapt care face HSA importantă pentru efectul Donnan în capilare. În cele din urmă, în
anumite circumstanțe, proteina poate servi drept sursă de aminoacizi sau energie [4].
Albumina este o proteină mo nomerică, formată din nouă (mai precis opt și jumătate) bucle
duble formate de legături disulfură care implică resturi adiacente de cistină. Acestea pot fi grupate
în trei domenii omologe, fiecare conținând două bucle mai lungi, separate printr -o buclă mai scurtă.
Domeniile omologe sunt de obicei numerotate I, II și III, începând de la gruparea amino terminală.
În cadrul fiecărui domeniu, primele două bucle, buclele 1 -2, 4 -5 și 7 -8, sunt grupate în
subdomeniile IA, IIA și, respectiv, IIIA, iar buclele 3, 6 și 9 se numesc subdomenii IB, IIB și IIIB
(Figura 1)[5].
Albumina exercită mai multe funcții fiziologice și farmacologice, inclusiv proprietăți
antioxidante, de reglare a presiunii oncotice, activități pseudo -enzimatice și în special capacitate de
legare și transport pentru numeroși compuși endogeni și exogeni, precum medicamentele. Albumina
poate lega o gamă remarcabil de largă de compuși terapeutici. Forma legată de albumină a
medicamentului asigură stocarea temporară, precum și eliberarea controlată la receptorul țintă
pentru a preveni metabolizarea rapidă sau toxicitatea acestuia. Astfel, această proteină plasmatică
poate acționa ca un depozit circulant pentru multe medicamente [6].
Deși proprietățile HSA de legare a liganzilor sunt foarte versatile, de aceasta se leagă în
principal anionii organici și cationii anorganici. Această abilitate unică a proteinei se datorează unei
combinații favorabile de cavități hidrofobe și lanțuri laterale încărcate electric, dar și unei
flexibilități pronunțate, care, în tr-o mare măsură, este cauzată de legăturile polipeptidice inter – și
intra- domeniu destul de lungi și de buclele flexibile [7]
Capacitatea de legare a medicamentelor la albumina serică poate fi diminuată sau
îmbunătățită de alte medicamente, dar nu sunt cunoscute exemple clinic importante ale acestora din
urmă. În schimb, există multe medicamente care se îndepărtează parțial unul pe altul din situs -urile
de legare ale albuminei și unele dintre aceste interacțiuni conduc la potențarea acțiunii

6
farmacologic e. Medicamentele cu o afinitate ridicată pentru HSA pot concura între ele pentru
capacitatea limitată de legare a albuminei (inhibarea competitivă a legării). O astfel de concurență
scade cantitatea de medicament legată de albumină și are același efect asu pra fracției libere ca
scăderea afinității pentru situs -ul de legare a medicamentului dislocuit. Alternativ, medicamentele
dislocuite se pot lega de albumină în locusuri în care nu s -ar lega în mod obișnuit și induc
modificări structurale în conformația te rțiară a albuminei (inhibarea necompetitivă a legării). Astfel
de modificări pot modifica numărul și / sau afinitatea situs -urilor de legare [8].
Cele două mari situs -uri de legare pentru medicamente sunt numite situsul Sudlow I și II.
Locusul I Sudlow est e mare și flexibil și leagă preferențial compușii heterociclici voluminoși, cum
ar fi warfarina. În schimb, situs -ul II, numit și situs indol -benzodiazepină, este mic și mai puțin
flexibil și leagă acidul carboxilic aromatic conținut de medicamente, cum ar fi în cazul
ketoprofenului, format dintr -un centru hidrofob cu o grupare carboxil încărcată negativ la un capăt
al moleculei [6].

Figura 1- Structura HSA cu reprezentarea domeniilor, subdomeniilor și a situs -urilor I și II ale
lui Sudlow [9].

7
Albumininele serice umană și bovină (HSA și BSA) prezintă o omologie a secvenței de
aproximativ 80% și un model repetat de disulfuri, care se conservă. Din punct de vedere
spectroscopic, una dintre diferențele principale dintre cele două proteine este că HSA are un si ngur
rezidu u de triptofan (Trp -214), în timp ce BSA are două reziduuri de triptofan (Trp -134 și Trp -212)
în locații diferite , după cum se poate observa în Figura 2 [10].
BSA este o proteină globulară neglicată, una dintre puținele proteine plasmatice lip site de
carbohidrați, deoarece este sintetizată în ficat, fără grupări prostetice sau alți aditivi [11]. BSA este
o polipeptidă unică de 582 reziduuri de aminoacizi cu o greutate moleculară de 66.433 Da [12]. Nu
conține fosfor, și conține 17 grupări disulf ură și o grupă sulfhidril liberă [13] Una dintre
caracteristicile structurale ale BSA este conținutul său redus de triptofan, metionină, glicină și
izoleucină, în timp ce este abundentă în aminoacizi ionici, cum ar fi acidul glutamic și lisina.
Reziduurile ionizate conferă proteinei o sarcină totală ridicată, de 185 de ioni pe moleculă, la pH
neutru, contribuind la solubilitatea sa [11].
Lanțul de aminoacizi este alcătuit din trei domenii omologe, dar structural distincte (I, II și
III), împărțite în nouă bucle prin legăturile disulfură și dispuse în formă de inimă. Fiecare domeniu
este format din două subdomenii, A și B. Structura secunda ră a proteinei este în principal α –
elicoidală (74%), restul lanțului polipeptidic găsindu -se în regiunile extinse sau flexibile dintre
subdomenii. BSA prezintă situs -uri de legare discrete cu specificități diferite, cele mai importante
fiind denumite situs I și situs II, localizate în cavitățile hidrofobe din subdomeniile IIA și, respectiv,
IIIA. Markerii situs -urilor sunt molecule mici care au locații specifice de legare în structura
albuminei și sunt adesea utilizate în studiul interacțiunii diferiților l iganzi cu proteina. Markerii
situs-ului I includ warfarina, fenilbutazona, dansilamida și iodipamida, în timp ce ibuprofenul,
acidul flufenamic și diazepam sunt markeri ai situs -ului II [11].

Figura 2- Structura HSA și BSA cu reprezentarea resturilor de triptofan [14].

8
1.3. Aspecte generale privind amiloizii și fibrilele amiloidale
Amiloidul se referă la depunerile anormale fibroase, extracelulare, proteinacee găsite în
organe și țesuturi. Acesta este insolubil și este dominat structural de plăci β. Spre deosebire de alte
proteine fibroase, nu are în mod obișnuit un rol structural, de susținere sau de motilitate, dar este
asociat cu patologia observată într -o serie de boli cunoscute sub numele de amiloidoze. Aceste boli
includ A lzheimer, encefalopatiile spongiforme și diabetul de tip II, toate acestea fiind tulburări
progresive cu morbiditate și mortalitate ridicate associate [15].
Agregatele amiloidale și de tip amiloid sunt fibre alungite, neregulate, constând din structuri
β ale monomerilor separați, poziționate perpendicular pe axa fibrilei și stivuite strict unele peste
altele. Prin proprietățile lor fizico -chimice, fibrilele amiloidale amintesc mai degrabă de polimerii
sintetici decât de proteinele obișnuite, deoarece sunt s tabile la acțiunea agenților de denaturare și a
proteazelor. Stabilitatea mecanică a acestora poate fi comparată cu pânza unui păianjen, care, în
ciuda capacității sale de a se întinde, este mai puternică decât oțelul [3].
Formarea fibrilelor amiloidale e ste o reacție extrem de complexă. O proteină se poate
asambla în multiple fribrile distincte din punct de vedere structural. Heterogeneitatea structurală
pare, de asemenea, să fie predominantă în intermediarii de asamblare formați în momentele inițiale
ale reacției. Fibrilele amiloidale au ~ 10 nm în diametru și sunt compuse de obicei din 2 -6
protofilamente. Fibrele amiloidice ale tuturor proteinelor posedă același motiv structural, motivul β
încrucișat, în care catenele β sunt orientate perpendicular și pl ăcile β paralel cu axa fibrilară. În
motivele încrucișate β, separarea între catenele β -asociate prin legături de hidrogen este de ~ 0,48
nm, iar cea dintre straturile β -placă este de ~ 1,0 -1,3 nm [16]. Fibrele amiloidale sunt formate din
proteine solubile în mod normal, care se reunesc pentru a forma fibre insolubile, rezistente la
degradare. Ele sunt fibre extrem de puternice, foarte ordonate și organizate, care pot fi formate
dintr -un număr mare de proteine și peptide. Stabilitatea și insolubilit atea lor înseamnă că sunt utile
într-un număr mare de forme care apar în mod natural, precum și în bionanotehnologie. Cu toate
acestea, înseamnă, de asemenea, că sunt distructive și au capacitatea de a se acumula în țesuturile
bolnave [15].
Având în vedere gradul de implicare al acestor formațiuni în cazul diverselor patologii,
cercetarea proprietăților fizico -chimice, dar și a mecanismului de agregare au devenit teme
importante pentru comunitatea științifică din întreaga lume.

9
1.4. Formarea fibrilelor a miloidale de către HSA și BSA
Agregarea proteinelor pentru formarea structurilor amiloidale poate avea loc pe două cai,
denaturarea sau glicarea proteinei. În timpul glicării, carbohidrații se leagă covalent și neenzimatic
la grupele amino proteice, adică lisina, arginina și capătul N -terminal al aminoacizilor. După reacții
de oxidare, deshidratare și reamenajare, glicarea duce în final la aducți finali de glicare -avansată a
proteinei (AGE) [17].
In vivo, proporția de albumină glicată la persoanele săn ătoase este cuprinsă între 1% și
10%, iar în cazul diabetului zaharat, proporția poate crește de două până la trei ori. Această rată de
albumină glicată poate atinge chiar mai mult de 90% pentru pacienții cu diabet sever cu un control
diabetic slab [18]. După cum se poate observa în Figura 3 glicarea HSA are loc prin baza Schiff
rezultată în urma reacției grupării carbonil zaharice cu grupări amino ale HSA într -un mod
reversibil. Arg410 și Lys525 sunt principalele situs -uri ale glicării HSA. Alte situs -uri cu modificări
minore sunt Arg114, Lys186, Lys199, Arg218, Lys281, Arg428 și Lys439. Baza Schiff suferă o
rearanjare Amadori cu formarea ireversibilă a unei amine secundare (adică fructozamină) și
introducerea unei grupe carbonilice pe suprafața proteinei (contribuind la formarea HSA
carbonilată) [19].

Figura 3- Mecanismul de glicare a albuminei [20].

10
Incubarea albuminei cu glucoză în condiții fiziologice in vitro a dus la glicozilarea aceluiași
rest. După separarea albuminei serice umane glicozilate de forma nonglicozilată prin cromatografie
de afinitate cu boronat , au fost monitorizate caracteristicile emisiei fluorescente ale reziduului unic
de triptofan (Trp 214). Randamentul cuantic al fluorescenței triptofanului a tât pentru albumină
glicozilată in vivo cât și in vitro a fost redus cu 30% în raport cu albumina nonglicozilată și
lungimea de undă maximă a benzii de emisie de fluorescență s -a deplasat la lungimi de undă mai
scurte. Aceste observații arată că glicarea n onenzimatică produce o schimbare conformațională în
albumina serică umană. S -au comparat proprietățile de legare a ligandului a albumin ei glicate și
nemodificate. Afinitatea hemului a fost modificată prin glicozilarea albuminei in vivo, în timp ce
afinitat ea bilirubinei pentru albumină glicozilată a fost de aproximativ 50% din valoarea sa pentru
forma nonglicozilată. Afinitatea acidului cis -parinaric al aci zilor grași cu catenă lungă pentru
albumină glicozilată in vivo și in vitro a fost redusă de aproximat iv 20 de ori în raport cu albumină
neglicată. Aceste diferențe de afinitate sugerează faptul că lisina 525 joacă un rol cheie în legarea
liganzilor fiziologic importanți de albumină [21]. Glicarea HSA este asociată cu oxidarea
reziduurilor His și Trp, frag mentarea lanțului și pierderea atât a structurii secundare cât și a celei
terțiare.Glicarea scade fluorescența intrinsecă a HSA, inducând o schimbare conformațională care
modifică proprietățile fizico -chimice ale mediului Trp214. Nivelurile de glicare avan sată a HSA
sunt reduse de diclofenac, un medicament anti -inflamator nesteroidian, care interacționează non –
covalent cu proteina. Același comportament este observat și în prezența aspirinei. Glicarea HSA
modifică legarea liganzilor endogeni și exogeni la si tus-urile I și II ale lui Sudlow și interacțiunea
cu acizii grași. În special, glicarea Lys525 poate afecta conformația proteinei, modificând astfel
legarea ligandului la situsurile I și II ale lui Sudlow [19].
Albumina serică bovină și umană sunt proteine foarte similare care sunt afectate diferit de
condițiile care dau naștere unei structuri asemănătoare cu amiloid ul. BSA pare a fi mai stabilă
împotriva perturbației, menținând o cantitate mai mare a structurii native de α -helix și producând un
conținut mai scăzut de amiloid, de dimensiuni mai mici decât HSA în timpul procesului de formare
a fibrilelor [2].
Agregarea a 1 g / l BSA la temperaturi ridicate se realizează prin formarea unui intermediar
cu un conținut crescut de catene – β; formarea ireversibilă a β -catenelor intermoleculare are loc
numai la 70 ° C și peste. Modificările de structur ă secundar ă sunt în esență complete în primele70
de minute de incubare la 70 ° C, în timp ce modificările terțiare apar după mai mult timp. Având în
vedere faptul că agregarea necesită acces la stări degenerate, nu este neașteptat ca agregarea să fie
inhibată de adăugarea de liganzi precum Tween 80, triptofan și caprilat care stabilizează starea
originală. Reacția se desfășoară fără o fază de întârziere, depinde doar liniar de concentrația de

11
proteină și nu este accelerată prin însămânțare și nici agregatele care urmează n u prezintă
citotoxicitate. Ușurința cu care BSA formează fibrile evidențiază încă o dată natura omniprezentă a
fibrilării, care nu scutește nici măcar proteinele în întregime α -helix cu mai multe domenii; în
același timp, servește pentru a ilustra faptul c ă fibrilele pot tolera o cantitate mare de structură non –
β, probabil datorită capacității lor de a relega structura α -helix în părțile din afara miezului fibrilar
[22].
1.5. Interacția albuminelor serice glicate și non -glicate cu ciclodextrinele (CyD)
Ciclodextrinele (CyD) sunt formate din unități de glucopiranoză legate între ele într -un inel
formând o structură în formă de con. Cele mai frecvente sunt α -, β- și γ-CyD care conțin 6, 7 și,
respectiv, 8 unități de zahar, legate prin legături α – (1,4) -glico zidice (Figura 3). Ciclodextrinele pot
fi reprezentate topologic ca toroizi cu un exterior hidrofil și o cavitate interioară semipolară,
deschiderile mai mari și mai mici ale toroidului expun grupe hidroxil secundare și, respectiv,
primare la solventul pro tic. Interiorul toroidelor nu este în întregime hidrofob, ci considerabil mai
puțin hidrofil decât mediul apos, permițându -le să găzduiască alte molecule hidrofobe. În schimb,
exteriorul este suficient de hidrofil pentru a conferi solubilitate în apă CyD. Aceste două efecte duc
împreună la formarea complexelor supramoleculare de incluziune gazdă -oaspete cu o veridicitate a
moleculelor hidrofobe, care implică interacțiuni noncovalente într -un mediu apos. Astfel, prin
complexarea CyD, este posibilă îmbunătăți rea solubilității apoase și a biodisponibilității
medicamentoase după administrarea orală [10].

Figura 4- Structura chimică a ciclodextrinelor [23].

Prezența β-CyD induce o ușoară deplasare spre roșu în spectrul de fluorescență al HSA, ceea
ce sugerează că legarea β – CyD la HSA este însoțită de modificări în mediul dielectric al inelului

12
indolic al Trp. O deplasare batocromă indică întotdeauna că reziduurile Trp sunt, în medie, mai
expuse la solvent, în timp ce o deplasare hipsocromă este o consecință a expunerii reziduurilor de
Trp într-un mediu mai hidrofob. Intensitatea fluorescenței scade odată cu glicarea HSA, în timp ce
prezența β-CyD induce o creștere a intensității fluorescenței. Astfel, interacțiunea dintre β-CyD și
glucoză cu HSA contribuie la modificarea structurii ternare a HSA lângă locul de legare [24].
Spectrele de emisie ale soluțiilor tamponate apoase de HSA și BSA prezintă benzi unice,
largi și nestructurate, cu vârfuri la ∼345 nm și, respectiv, ∼350 nm. La adăugarea CyD, intensitățile
de fluorescență ale ambelor pr oteine scad considerabil. În cazul HSA, cât și BSA, eficiența stingerii
urmărește ordinea: γ -CD> β -CD> α -CD, după cum se poate observa în Figura 5. Mai departe,
observăm o deplasare batocromă detectabilă a maximului de emisie al HSA cu 5 nm și respectiv 7
nm în β – și γ -CD. Această schimbare se dovedește a fi mult mai mică pentru BSA (2 nm atât pentru
β- cât și pentru γ -CD). Pentru ambele proteine, cu toate acestea, nu se observă nicio schimbare
detectabilă în pozițiile benzii cu adăugarea de α -CD [10].

Figura 5- Variația spectrelor de emisie ale HSA (coloana stângă) și BSA (coloana dreaptă), în
funcție de concentrația de (a) α -Cyd, (b) β -CyD și (c) γ -CyD. ( Lungimea de undă de excitare,
λexc=280nm)[10].

13
Adăugarea de CyD produce creșteri în cadrul spectrelor de absorbție ale HSA și BSA, dar și
apariția unor peak -uri specifice complexelor HSA/BSA -CyD la aproximativ 320 nm (Figura 6).

Figura 6- Variația spectrelor de absorbție ale HSA (coloana stâng ă) și BSA (coloana dreaptă) în
funcție de concentrația de (a) α -Cyd, (b) β -CyD și (c) γ -CyD [10].
În funcție de dimensiunile cavității lor, CyD se leagă de aceste proteine de transport în
diferite poziții. Această legare duce la o schimbare a polarită ții în jurul fluoroforului intrinsec al
acestor proteine, adică restul triptofanului. Studiile de absorbție și de fluorescență în stare staționară
și cu rezoluție în timp dezvăluie că la o concentrație mare de CyD se desface considerabil structura
proteică , ceea ce ar putea afecta în mod normal funcția normală a acestor proteine. Anisotropia
fluorescenței și studiile de dicroism circular, relevă, totuși, schimbări structurale nesemnificative
induse de CyD. Astfel, deși CyD pot fi considerate ca sigure fizio logic în ceea ce privește acțiunea
lor asupra proteinelor serice, utilizarea lor la concentrații mai mari ar putea degrada capacitatea de
transport a proteinelor serice [10].

14
În cazul proteinelor glicate, putem spune că prezența β- CyD sau a trehalozei inhibă calea
formării AGE prin interfernța în procesul de glicare a HSA. În acest fel, β-CyD și trehaloza sunt
capabile să îmbunătățească stabilitatea prin interacțiunea cu HSA ș i să modifice interacțiunile solut –
proteină. Lanțurile laterale hidrofobe ale proteinei interacționează cu cavitatea β-CyD ce conduce la
un strat de acoperire hidrofil care crește stabilitatea proteinei. Cu toate acestea, astfel de interacțiuni
pot afecta structura tridimensională generală a proteinei. Interacțiunile trehalosei cu diferite lanțuri
laterale ale HSA și formarea legăturilor de hidrogen au contribuit la efectele sale de stabilizare.
Trehalosa a redus mobilitatea proteinei și, prin urmare, a pre venit glicarea și desfășurarea HSA.
Astfel, prezența trehalozei și a ciclodextrinelor în alimente poate inhiba reacțiile de glicare sub
hiperglicemie oferind protecție împotriva efectelor patogene ale AGE -urilor în timpul diabetului și
consumului de alimen te procesate [24].

15
Capitolul 2. Metode spectroscopice de studiu al glicării și fibrilării albuminelor

Proprietățile albuminelor serice depind de structura acestora, de aceea este necesară
monitorizarea schimbărilor structurale produse, sau nu, de diverși agenți chimici sau fizici. Aceste
determinări se pot face prin diverse tehnici, o parte dintre acestea fiind prezentate mai jos.
2.1. Spectroscopia de absorbție
Metodele colorimetrice, cum ar fi testele bazate pe acidul tiobarbituric (TBA),
nitrotetrazoliu albastru (NBT) și Roșu Congo, dar și analize bazate pe hidrazine au fost folosite
pentru a măsura proteinele serice glicate. De exemplu, testul NBT se bazează pe capacitatea
cetoaminelor N -substituite de a reduce colorantul nitrotetrazoliu albastru într -o soluție bazică,
generând Formazan, ce poate fi cuantificat fotometric , absorbanța sa fiind măsurată la 530 nm
[18,25]. Testul acidului tiobarbituric (TBA) este o metodă colorimetrică comun ă care arată
cantitatea de cetoamină legată de albumină. Această analiză se bazează pe eliberarea, prin hidroliză,
de glucoză legată de albumină sub formă de 5 -hidroximetilfurfural (5 -HMF), care poate reacționa
cu acidul tiobarbituric, formându -se un cromo for galben a cărui absorbanță în soluție apoasă poate
fi măsurată la 443 nm [18,26]. Cu toate acestea, ambele metode anterioare prezintă unele
dezavantaje majore și suferă de un grad ridicat de nespecificitate [18].
Roșul Congo este un colorant al amiloiz ilor utilizat frecvent și un inhibitor slab al acestora.
Roșu Congo are proprietăți spectrofotometrice izbitoare. În soluție apoasă, spectrul său de absorbție
prezintă o absorbanță maximă la 490 nm (albastru / verde), ceea ce conduce la o soluție de culoar e
roșie, la concentrație scăzută și pH neutru. Când sunt legate de fibrilele amiloidale bogate în catene –
β, moleculele de Roșu Congo adoptă o orientare specifică (adică, cu axa lungă a moleculei situate
paralel cu axa fibrilă) și devin restricționate torsi onal. Aceasta induce o creștere caracteristică a
absorbției și o schimbare roșie a absorbanței maxime de la 490 la 540 nm [27]. În Figura 7 sunt
prezentate spectrele de absorbție ale sistemului Roșu Congo -BSA înainte de incubarea la 70◦C, ce
conduce la for marea fibrilelor amiloidale prin denaturarea proteinei. Se observă că, după incubare
are loc o deplasare batocromă a maximului de absorbție al complexului Roșu Congo -BSA, dar și
creșterea absorbanței acestuia. Pentru evidențierea faptului că această creșt ere este datorată exclusiv
legării moleculelor de Roșu Congo de fibrilele amiloidale formate de BSA, este reprezentat în
figură și spectrul de absorbție al proteinei după incubare.

16

Figura 7-Spectrul de absorbție al sistemului Roșu Congo -BSA fără incubare (●) și după
incubare timp de 2 ore la 70◦C (○); Spectrul de absorbție al BSA incubată timp de 2 ore la 70◦C
(x) [22].
2.2. Spectroscopie de fluorescență
Spectroscopia de fluorescență și fluorescența în timp real sunt considerate a fi instrumente
de cercetare în domeniul biochimiei și biofizicii. Aplicațiile biochimice ale fluorescenței utilizează
adesea fluorescența proteică intrinsecă. În proteine, cei tr ei aminoacizi aromatici – fenilalanină,
tirozină și triptofan – sunt fluorescenți. O caracteristică valoroasă a fluorescenței proteice intrinseci
este sensibilitatea ridicată a triptofanului la mediul său local. Modificările spectrelor de emisie ale
tripto fanului apar adesea ca răspuns la tranzițiile conformaționale, legarea substratului sau
denaturarea. Aceste interacțiuni pot afecta mediul local care înconjoară inelul indolic. Tirozina și
triptofanul prezintă anisotropii ridicate, care sunt adesea sensibi le la conformația proteinelor și la
extinderea mobilității în timpul de viață al stării excitate. De asemenea, triptofanul este foarte
sensibilla stingerea colisională, aparent datorită unei tendințe a indolului aflat în stare excitată de a
dona electroni. Triptofanul poate fi stins prin adăugare de stingători externi sau prin grupări
apropiate din proteine. Există numeroase studii despre utilizare a spectrelor de emisie, anizotropiei și
stingerea reziduurilor de triptofan în proteine pentru a studia structura și funcția acestora [28].
Fibrilele amiloidale se pot lega de diverși coloranți precum Tioflavina T, această proprietate
ajutând la confirma rea formării unor structuri de tip amiloid de către diverse proteine în urma
denaturării sau glicării. Prin analiza fluorescenței Tioflavinei T se observă ca proteinele denaturate
prin încălzire formează fibrile de tip amiloid, înregistrându -se o creștere a fluorescenței acestui
colorant specific amiloizilor. Tioflavina T prezintă fluorescență slabă cu lungimea de undă de
excitare și maximul de emisie de 350 și respectiv 440 nm, în timp ce la interacțiunea cu fibrilele
amiloidale se observă o creștere a flu orescenței la lungimea de undă de excitare și emisie de
aproximativ 450, respectiv 480 nm. În general, fluorescența caracteristică tioflavinei T este
considerată specifică pentru fibrilele amiloide și nu apare la legarea la proteinele precursoare sau la

17
agregatele amorfe de protein ă [29]. Există o corelație bună între creșterea fluorescenței tioflavinei T
și pierderea structurii elicoidale proteice odată cu creșterea temperaturii. Formarea fluorescenței
tioflavinei T este dependentă de temperatură, dar mai puțin dependentă de concentrația de sare și
proteine. Modelele de difracție de raze X ale a fibrilelor albuminei serice bovine denaturate
sugerează că proteina avea o structură β -încrucișată similară celei a fibrilelor amiloidice. După
încălzire, proteina pierde structura elicoidală, cu câștigul concomitent de structuri catenare -β, iar
elipticitatea la 222 nm a arătat un răspuns liniar la temperatură. Intensitatea fluorescenței a crescut
la temperaturi mai mari, din cauza unui grad mai mare de denaturare pr oteică și urmează modelul
de pierdere a elipticității la 222 nm [30]. De asemenea, folosind microscopia electronică de
transmisie, s -a demonstrat că și albumina glicată condensează în agregate fibroase sau amorfe, care
se leagă de coloranții specifici amil oidului [17].
Măsurătorile de timp de viață al fluorescenței ajută la determinarea modificărilor care au loc
în jurul fluorofluorului proteic și pot fi folosite pentru a confirma schimbările structurale ce au loc
în urma glicării sau denaturării proteice.
În ciuda faptului că structura HSA este destul de complicată, a fost studiată pe scară largă
folosindu -se re stul unic Trp -214 care permite proteinei serice să acționeze ca fluorofor intrinsec.
Într-o soluție apoasă la pH neutru, Trp -214 prezintă de zexcităr i multi exponențiale , atribuite
existenței de izomeri conformaționali de rotație , numiți rotameri. Când soluția apoasă tamponată de
HSA este excitată la 295 nm, profilul de descompunere arată un model biexponențial care produce
valori ale timpului de viață de 4,5 ns (τ1) și 8,25 ns (τ2). Soluția tamponată apoasă de BSA arată, de
asemenea, o scădere biexponențială, cu valori de viață de 4,5 ns (τ1) și 7,5 ns (τ2) [10].
În cazul măsurătorilor de stingere a fluorescenței este evidențiat faptul că, în cazul BSA și
HSA, va interacționa cu stingătorul doar restul triptofanic aflat într -un mediu similar al celor două
proteine, al doilea rest al BSA rămânând neafectat.

2.3. Spectroscopie de dicroism circular
Spectroscopia de dicroism circular este utilizat ă pe scară largă pentru a monitoriza structura,
conformația și stabilitatea proteinelor. Se determină global structura secundară a proteinelor (ca
procent) , deși nu oferă detalii privind structura precisă. Tehnicile de fluorescență sunt mai sensibile
în de scifrarea modificărilor mici la nivel molecular [10].
Spectrele CD ale HSA și BSA prezintă două minime negative la 208 și 217 nm, ceea ce este
caracteri stic structurii α -helix a proteinelor [31]. O deplasare ascendentă a acestora , însemnând
scăderea în va loare absolută a valorilor negative, indică reducerea structurii de helix α (așa cum se
poate observa din spectrul de dicroism circular al BSA și BSA glicată prezentat în Figura 8), în timp
ce creșterea semnalului negativ indică o creștere a procentului de structură elicoidală [32].

18
Proteinele cu plăci -β bine definite au benzi negative la 218 nm și benzi pozitive la 195 nm, în timp
ce proteinele dezordonate au elipticitate foarte mică peste 210 nm și benzi negative aproape de 195
nm [33].
Studiul modificărilor în structura HSA după glicare implică radio -marcarea, teste
colorimetrice, spectroscopie de fluorescență, spectroscopie infraroșu, dicroism circular și
spectroscopie RMN. În plus, lucrările bazate pe imunoanalize, electroforeză și HPLC au furnizat
informații despre nivelurile totale de glicare sau despre cantitatea de aducți AGE specific i care sunt
prezen ți în albumină [31].

Figura 8- Spectrul de dicrosim circular al BSA ( ▪) și BSA ( ○ ) glicată [30].

2.4. Spectroscopie FTIR
Spectroscopia de absorbție a IR este sensibilă la modificările structurii secundare a
proteinelor, astfel încât a fost folosită nu numai pentru măsurarea albuminei glicate în condiții
statice, ci și pentru evaluările acumulă rii dinamice a albuminei glicate la incubarea albuminei cu
glucoză. Informațiile obținute din spectroscopia IR sunt, totuși, locale și sunt limitate la proprietățile
structurale ale proteinei individuale și la regiunile interfaciale de contact care sunt re levante pentru
formarea fibrilelor [2,34].
Au fost realizate diverse studii în cadrul cărora s -a analizat spectrul IR albuminelor pe
domeniul 1500 -1700 cm-1, observându -se după glicare o scădere a valorilor peak -urilor din acest
interval, fapt ce indică mo dificări structurale ale proteinelor. În special, în spectrul albuminei glicate
cu glucoză la concentrații patologice (25mM) se observă scăderea benzii corespunzătoare amidei
primare (1649 -1659 cm-1), care este un marker al structurii α -helix. [34].

19
Figura 9 arată spectrele FT -IR ale HSA și BSA obținute după incubare pentru diferite
perioade. Aceasta demonstrează schimbările dependente de temperatură care apar în timpul
incubării. Inițial, o bandă proeminentă, cu intensitate mare, centrată la aproximativ 1. 654 cm -1 este
observată pentru ambele albumine. Această bandă poate fi atribuită modurilor de vibrație ale amidei
primare a acestor proteine predominant α elicoidale. Odată cu creșterea timpului de incubație,
intensitatea acestei benzi este redusă și două benzi noi, centrate la 1.615 și 1.684 cm -1, apar și
continuă să crească. Aceste benzi apar datorită legăturilor de hidrogen intramoleculare formate de
catenele β associate structurii amiloidale. Acestea sunt cele mai marcante modificări care apar în
timpul amiloidogenezei ambelor albumin e [2].

Figura 9-Reprezentarea 3D a spectrelor FT -IR deconvolate ale BSA și HSA înregistrate la 80◦ C
[2].
Pentru a analiza diferențele dintre începutul și sfârșitul procesului pentru ambele proteine,
spectrele de diferență au fost obținute prin scăderea spectrelor BSA și HSA dobândite după
incubare timp de 0 și 200 min (Figura 10). Din forma plană a spectrului diferențial este clar că
benzile amidei primare ale ambelor proteine sunt similare la începutul incubării. Diferențele ușoare
se datorează intensității scăzute a maximului la 1.654 cm -1 pentru albumina bovină, acestea

20
devenind mult mai evidente la sfârșit ul incubării. Banda pozitivă centrată la 1.654 cm -1 indică
structura elicoială reziduală a BSA. Pe de altă parte, semnalul negativ în spectrele diferențiale la
1.615 cm -1 reflectă o agregare mai mică a BSA în comparație cu HSA. Aceste rezultate indică o
structură finală diferită a agregatelor obținute, deși sunt inițiate din structuri foarte similare [2].

Figura 10-Spectrele IR diferențiale ale benzii amidei primare a BSA și HSA după incubare la
25◦ C (A) și 80◦ C (B) timp de 200 de min. Spectrele originale sunt inserate în figură (BSA – linie
continuă, HSA -linie punctată)[2].

21
2.5. Spectroscopia Raman
Spectroscopia Raman poate fi utilizată pentru a analiza soluții apoase, deoarece benzile de
vibrație ale apei, intense în spectrul FTIR , sunt slabe în Raman, și, în general, oferă detalii spectrale
mai bune (datorită lărgimii mai mici a picurilor ). Această analiză a relevat faptul că glicarea
albuminei induce modificări ale spectrelor Raman caracteristice proteinei. Mai multe studii au
sugerat că glicarea albuminelor se întâmplă pe mai multe situs -uri corespunzătoare reziduurilor de
arginină, lisi nă și cisteină datorită proprietăților nucleofile ale acestora. Deoarece caracteristicile din
spectrele Raman ale albuminei (de exemplu, banda de la 1655 cm – 1 corepunzătoare amidei
primare, banda de deformare CH 2 la 1447 cm − 1, banda fenilalaninei la 1 002 cm − 1 și dubletul
corespunzător tirozinei la 828 cm −1 și 850 cm − 1) nu sunt asociat e proeminent cu reziduurile de mai
sus, este de așteptat să existe modificări minore [34].
După cum se observă din spectrele Raman corespunzătoare HAS și HAS glicate (Figura 11)
și cum era de așteptat spectrul albuminei glicate nu prezintă diferențe mari în comparație cu spectrul
albuminei (deși există modificări subtile în spectrul Raman în regiunea 780 –850 cm-1). Cu toate
acestea, aceste schimbări, deși relativ mici , sunt consecvente și, ca atare, furnizează informații
suficiente pentru a distinge probele de albumină și albumină glicată [35].

Figura 11-Spectrele Raman corespunzătoare albuminei (verde) și albuminei glicate (roșu) [35].

22
2.6.Concluzii
Proteinele plasmatice, HSA și BSA, sunt capabile să formeze agregate amiloidale , fie prin
denaturarea termică, fie prin procesul de glicare . Aceste agregate modifică proprietățile albuminelor
și sunt, de asemenea, implicate în apariția dive rselor boli degenerative, de aceea este imperativă
studierea mecanismului de formare a acestora și a efectelor pe care le au asupra proteinelor
plasmatice.

Bibliografie

[1] International Diabetes Federation, IDF Diabetes atlas. Brussels: International Diabetes
Federation, Executive Office, 2011, Chapter 2. The global burden, pg 26.
[2] De La Arada, I., Seiler, C. & Mäntele, W. A myloid fibril formation from human and bovine
serum albumin followed by quasi -simultaneous Fourier -transform infrared (FT -IR) spectroscopy
and static light scattering (SLS). Eur. Biophys . J. 41 (2012), 931:938.
[3] Dovidchenko, N. V., Leonova, E. I., Galzi tskaya, O. V., Mechanisms of amyloid fibril
formation. Biochem ., 79 (2014), 1515:1527.
[4] Albumin in medicine: Pathological and clinical applications. Eds. Otagiri, M., Giam Chuang,
V.T., Springer (2016), Kragh -Hansen, U., Chapter 1. Human Serum Albumin: A Multifunctional
Protein, pg 2.
[5] T Peters, Jr. All about Albumin: Biochemistry, Genetics, and Medical Applications, Academic
Press, 2008, Chapter 2. The Albumin Molecule Its Structure and Chemical Properties, pgs. 17:20.
[6] Baraka -Vidot, J., Planesse, C., Meilhac, O., Militello, V., Van Den Elsen, J., Bourdon, E., et al.
Glycation alters ligand binding, enzymatic, and pharmacological properties of human albumin.
Biochemistry,54 (2015), 3051:62.
[7] Albumin in medicine: Pathological and clinica l applications. Eds. Otagiri, M., Giam Chuang,
V.T., Springer (2016), Kragh -Hansen, U., Chapter 1. Human Serum Albumin: A Multifunctional
Protein, pg 7.
[8] Albumin structure, function and uses. Eds. Rosenoer ,V.M., Oratz, M., Rothschild, M.A.,
Pergamon Pr ess (1977), Sellers E.M., Koch -Weser J., Clinical implications of Drug -Albumin
Interaction, pgs.168 -169.

23
[9] Mondal, M., Lakshmi, P., Krishna, R., Sakthivel, N., Molecular interaction between human
serum albumin (HSA) and phloroglucinol derivative that sho ws selective anti -proliferative
potential. J Lumin.,192 (2017), 990:8.
[10] Ghosh, S., Paul, B.K., Chattopadhyay, N., Interaction of cyclodextrins with human and bovine
serum albumins: A combined spectroscopic and computational investigation. J Chem Sci.,1 26
(2014), 931:944.
[11]Topală T, Bodoki A, Oprean L, Oprean R., Bovine serum albumin interactions with metal
complexes. Clujul Med., 87 (2014), 215:219.
[12] Applied Food Protein Chemistry. Ed. Ustunol Z., Wiley Blackwell (2014), Farkye, N.Y., Shah,
N., Chapter 16. Milk Proteins, pg. 444.
[13] Proteins in Food Processing. Ed. Yada, R.Y., Woodhead Publishing (2018), Kilara, A.,
Vaghela, M.N., Chapter 4. Whe y Proteins, pg. 101.
[14] Belatik, A., Hotchandani, S., Carpentier, R., Tajmir -Riahi, H.A., Locating the binding sites of
Pb(II) ion with human and bovine serum albumins, PLoS One, 7 (2012), 1:9.
[15] Rambaran, R.N., Serpell, L.C. Amyloid fibrils: abnormal protein assembly, Prion., 2 (2018),
112:117.
[16] Kumar, S., Udgaonkar, J., Mechanisms of amyloid fibril formation by proteins, Curr.Sci., 98
(2010), 639:656.
[17] Bouma, B., Kroon -Batenburg, L.M.J., Wu, Y.P., Brünjes, B., Posthuma, G., Kranenburg, O., et
al., Glycation Induces Formation of Amyloid Cross -β Structure in Albumin, J Biol Chem., 278
(2003), 41810:41819.
[18] Rondeau, P., Bourdon, E., The glycation of albumin: Structural and functional impacts,
Biochimie., 93 (2011), 645:658.
[19] Fanali, G., D i Masi, A., Trezza, V., Marino, M., Fasano, M., Ascenzi, P., Human serum
albumin: From bench to bedside, Mol Aspects Med., 33 (2012), 209:290.
[20] Iannuzzi C, Irace G, Sirangelo I., Role of Glycation in Amyloid: Effect on the Aggregation
Process and Cytot oxicity. Explor New Find Amyloidosis., 2016, 167:185.
[21] Shaklai, N., Garlick, R.L., Bunn, H.F., Nonenzymatic glycosylation of human serum albumin
alters its conformation and function, J Biol Chem., 259 (1984), 3812:3817.

24
[22] Holm, N.K., Jespersen, S.K. , Thomassen, L.V., Wolff, T.Y., Sehgal, P., Thomsen, L.A., et al.,
Aggregation and fibrillation of bovine serum albumin, Biochim Biophys Acta – Proteins
Proteomics., 1774 (2007), 1128:1138.
[23] Nikitenko, N.A., Prassolov, V.S., Non -viral delivery and ther apeutic application of small
interfering RNAs. Acta Naturae., 5 (2013), 35:53.
[24] Sharifi, E., Sattarahmady, N., Habibi -Rezaei, M., Farhadi, M., Sheibani, N., Ahmad, F., et al.,
Inhibitory Effects of β -Cyclodextrin and Trehalose on Nanofibril and AGE For mation During
Glycation of Human Serum Albumin, Protein Pept Lett., 16 (2009), 653 -659.
[25] Anguizola, J., Matsuda, R., Barnaby, O.S., Hoy, K.S., Wa, C., DeBolt, E., et al. ,Review:
Glycation of human serum albumin, Clin Chim Acta., 425 (2013), 64:76.
[26] Murtiashaw, M.H., Young, J.E., Strickland, A.L., McFarland, K.F., Thorpe, S.R., Baynes,
J.W., Measurement of nonenzymatically glucosylated serum protein by an improved thiobarbituric
acid assay. Clin Chim Acta., 130 (1983), 177:187.
[27] Wu, C., Scott, J., Shea, J.E., Binding of congo red to amyloid protofibrils of the alzheimer
Aβ9-40 peptide probed by molecular dynamics simulations. Biophys J., 103 (2019), 550:557.
[28] Lakowicz, J.R., Principles of Fluorescence Spectroscopy, Springer (2006), Ch apter 16. Protein
Fluorescence, pgs. 529 -530.
[29] Groenning, M., Olsen, L., van de Weert, M., Flink, J.M., Frokjaer, S., Jørgensen, F.S., Study
on the binding of Thioflavin T to β -sheet -rich and non -β-sheet cavities. J Struct Biol, 158 (2007),
358–369.
[30] Pearce, F.G., Mackintosh, S.H., Gerrard, J.A., Formation of amyloid -like fibrils by ovalbumin
and related proteins under conditions relevant to food processing, J Agric Food Chem., 55 (2007),
318:322.
[31] Tian, J., Liu, J., He, W., Hu, Z., Yao, X., Che n, X., Probing the binding of scutellarin to human
serum albumin by circular dichroism, fluorescence spectroscopy, FTIR, and molecular modeling
method, Biomacromolecules, 5 (2004), 1956:1961.
[32] Shamsi, A., Mohammad, T., Khan, M.S., Shahwan, M., Husain, F.M., Rehman, M.T., et al.,
Unraveling binding mechanism of alzheimer’s drug rivastigmine tartrate with human transferrin:
Molecular docking and multi -spectroscopic approach towards neurodegenerative diseases.
Biomolecules, 9 (2019).

25
[33] Greenfield, N.J., Using circular dichroism spectra to estimate protein secondary structure, Nat
Protoc., 1 (2006), 2876 –2890.
[34] Pandey, R., Dingari, N.C., Spegazzini, N., Dasari, R.R., Horowitz, G.L., Barman, I., Emerging
trends in optical sensing of glycemic markers f or diabetes monitoring. TrAC Trends Anal.Chem.,
64 (2015), 100:108.
[35] Dingari, N.C., Horowitz, G.L., Kang, J.W., Dasari, R.R., Barman, I., Raman spectroscopy
provides a powerful diagnostic tool for accurate determination of albumin glycation. PLoS One., 7
(2012).