Realizarea Unui Biopreparat PE Baza Unui Consortiu DE Bacterii Fixatoare DE Azot
CUPRINS:
CAPITOLUL I. INTRODUCERE
CAPITOLUL II. STADIUL ACTUAL AL CUNOȘTINȚELOR IN DOMENIU
II.1. Rolul azotului și al fixãrii biologice
II.1.1. Tipurile de microorganisme fixatoare de azot
II.2.1. Incadrarea sistematicã a rizobiilor
II.2.2. Specificitatea de gazdã a rizobiilor
II.2.3. Efectele inoculãrii cu Rhizobium – formarea nodozitãților
II.2.3.1. Structura nodozitãților
II.2.3.2. Funcționarea nodozitãților
II.2.4. Fenomenul de quorum sensing la bacteriile fixatoare de azot din grupul Rhizobium
II.3. Genul Azospirillum
II.3.1. Specificitate și variabilitate
II.3.2. Efectele inoculãrii cu Azospirillum asupra plantelor
II.3.2.1. Modul de acțiune asupra plantelor
II.3.2.2. Efectele hormonale ale bacteriei asupra creșterii plantelor
II.3.2.3. Fixarea azotului
II.3.2.4. Imbunãtãțirea dezvoltãrii rãdãcinii
II.3.2.5. Efectele inoculãrii asupra dezvoltãrii rãdãcinilor
II.3.2.6. Colonizarea rãdãcinilor
CAPITOLUL III. MATERIALE ȘI METODE
III.1. Izolarea unor tulpini bacteriene din grupul Rhizobium
III.1.1. Urmãrirea dezvoltãrii culturii in mediul lichid
III.1.2. Estimarea numarului de microorganisme
III.2. Caracterizarea unei tulpini de Rhizobium cu microsistemul Biolog
III.3. Creșterea rhizobiilor pe diferite medii de culturã
III.3.1. Cultivarea bacteriilor din grupul Rhizobium pe mediu hidrogelifiat
III.4. Verificarea pãstrãrii caracteristicilor biologice ale rhizobiilor
III.5. Elaborarea unui model experimental pentru evidențierea fenomenului stingerii de QS la bacteriile PGPR
III.6. Caracterizarea unor tulpini de Rhizobium ce prezintã activitate ACC deaminazicã și care noduleazã fasolea
III.7. Estimarea eficacitãții fixãrii simbiotice a azotului prin determinarea hidrogenului
III.8. Cultivarea unor tulpini de Azospirillum brasiliense pe diferite medii de culturã
III.9. Testarea activitãții biologice a biomasei de Azospirillum
III.10. Tehnologia de realizare a inocului de laborator
III.11. Condiționarea biomaselor de Azospirillum și Rhizobium ca biopreparate aglomerate – Floculi
CAPITOLUL IV. REZULTATE ȘI DISCUȚII
IV.1. Izolarea și creșterea pe diferite medii
IV.2. Caracterizarea unei tulpini de Rhizobium la Biolog
IV.3. Cultivarea rhizobiilor pe diferite medii
IV.4. Verificarea pãstrãrii caracteristicilor biologice ale rhizobiilor
IV.5. Evidențierea fenomenului de QS la bacteriile inoculante
IV.6. Caracterizarea unor tulpini de Rhizobium care prezintã activitate ACC deaminazicã și care noduleazã fasolea
IV.7. Estimarea eficacitãții fixãrii simbiotice a azotului prin determinarea hidrogenului
IV.8. Cultivarea unei tulpini de Azospirillum brasiliense pe diferite medii de culturã
IV.9. Testarea activitãții biologice a biomasei de Azospirillum
IV.10. Condiționarea tulpinilor bacteriene FL220 și SP001 sub formã de agregate – floculi
CAPITOLUL V. CONCLUZII
CAPITOLUL VI. BIBLIOGRAFIE
CAPITOLUL I. INTRODUCERE
Unicitatea microorganismelor, natura lor adesea imprevizibilă și capacitățile biosintetice date de condiții specifice de mediu si culturale, le fac să fie cei mai probabili candidați pentru rezolvarea anumitor probleme dificile atât in stiință cât și in domeniile economice.
Diferitele căi pe care microorganismele au fost utilizate in ultimii 50 ani pentru progresul tehnologiei medicale, al sănătății umane și animale, al ingineriei genetice, protecției mediului, biotehnologiei agricole si a tratamentelor mai eficace ale reziduurilor agricole și menajere furnizeaza o extrem de impresionantă listă de realizari. Multe dintre aceste progrese tehnologice nu ar fi fost posibile prin utilizarea in exclusivitate a metodelor tehnice, chimice si fizice, sau daca ele nu ar fi fost practice sau economic fezabile.
Deși in ultimii ani tehnologiile microbiene au fost utilizate pentru soluționarea unor variate probleme agricole si de mediu, ele nu au fost larg acceptate de comunitatea științifică, deoarece adesea este dificil să se reproducă considerabil efectele lor benefice. Microorganismele sunt eficiente numai când se află in condițiile optime pentru metabolizarea substraturilor specifice incluzând apa, oxigenul (in funcție de natura microorganismelor), pH și temperatura mediului. Realizari semnificative au fost facute in sensul corelarii cu necesitățile pieței datorită noilor tehnologii.
Deoarece microorganismele sunt utile la eliminarea problemelor asociate cu utilizarea fertilizanților si pesticidelor de sinteza, ele sunt acum larg aplicate in exploatațiile agricole in sistem organic sau durabil (Higa, 1991; Parr si col., 1994).
De mulți ani, microbiologii si specialiștii in ecologie microbiană au tins să diferențieze microorganismele edafice in benefice si dăunătoare, in funcție de activitățile lor și de modul cum afecteaza calitatea solului, creșterea plantelor, recolta si sănătatea plantelor. Astfel, microorganismele benefice sunt cele care pot fixa azotul atmosferic, descompun resturile organice, detoxifică pesticidele, represeaza bolile plantelor și patogenii edafici, reciclează si sporesc accesibilitatea nutrienților plantelor, produc molecule organice simple pe care plantele le pot absorbi, complexează metalele grele, solubilizează nutrienții insolubili, produc polizaharide pentru imbunătățirea structurii solului și produc compuși bioactivi de tipul vitaminelor, hormonilor și enzimelor care stimulează creșterea plantelor.
Aceste microorganisme care măresc fertilitatea solului și care contribuie astfel la dezvoltarea plantelor au fost numite biofertilizatori și sunt frecvent utilizati ca inoculanți in practica agriculturii durabile.
Tipurile de microorganisme care produc compuși bioactivi de tipul vitaminelor, hormonilor și enzimelor sunt denumite fitostimulatori, și sunt studiate de asemenea pentru obținerea de biopreparate.
Microorganismle dăunatoare sunt acelea care pot induce boli la plante, stimulează patogenii de sol, inhibă germinarea semințelor, imobilizază nutrienții și produc substanțe toxice și de putrefacție care afectează negativ creșterea și sănătatea plantelor. Anumite microorganisme sunt insă antagoniste ale acestora, și pot preveni infecțiile. Mecanismul de prevenire constă in concurența celor doua categorii pentru accesul la nutrienți și/sau producerea unor metaboliți secundari – enzime extracelulare, antibiotice și alte componente inhibitoare de creștere. Alte microorganisme din sol produc substanțe care activează mecanismele naturale de apărare ale plantelor impotriva patogenilor. Aceste categorii de microorganisme descrise mai sus au primit denumirea generică de biopesticide.
Higa (1991) a dezvoltat conceptul de microorganisme eficace (ME), care se refera la culturi amestecate de microorganisme benefice ce se gasesc in mod natural in mediu și pot fi aplicate ca inoculanți pentru creșterea diversității microbiene in soluri și plante.
S-a demonstrat că, inocularea culturilor de ME in ecosistemul sol/plantă, poate imbunătăți calitatea și sănătate solului și poate duce la creșterea dezvoltării producției și calității culturilor. ME conțin specii selecționate de microorganisme benefice care sunt mutual compatibile unele cu altele și pot coexista in cultură lichida.
Biotehnologia agricolă, ca știință inovativă, duce la realizarea unor noi soiuri de plante, agenți de combatere biologică și tehnici de protecție a culturilor care optrimizează atât protecția cât și producția agricolă, oferind mijloace complementare produselor și metodelor tradiționale de cultivare a plantelor. Este important să se ajunga la un echilibru intre menținerea unor culturi sănătoase, profitabile și menajarea populațiilor care trăiesc in terenurile cultivate și in jurul acestora. De aceea, produsele de protecție a culturilor rezultate in urma unor procese biotehnologice sunt cele mai adecvate, ele fiind lipsite de nocivitate pentru om si mediu atât in timpul producției cât și al utilizării.
Producția agricolă este amenințată de declinul productivității terenului agricol ca rezultat al practicilor neconvenabile de exploatare a solului și apei și de eliberarea constantă a produselor chimice din ce in ce mai toxice pentru oameni si animale (Gregory, 1989).
O cale de evitare a acestui pericol o constituie utilizarea biofertilizanților, o alternativă ieftină și sigură pentru ingrășămintele chimice convenționale. Aceasta constă din includerea in microbiocenozele agricole a populațiilor de fixatori de azot simbiotici și/sau asociativi din genurile Rhizobium, Bradyrhizobium, Synorhizobium și Azospirillum, pentru care s-a demonstrat o rata de fixare a azotului atmosferic de până la 70% din necesarul de azot.
Biopesticidele, alături de biofertilizatori se constituie intr-o alternativă de mare insemnatate – control biologic – la utilizarea de pesticide și fertilizatori clasici de natura chimică.
Lucrarea a avut ca scop realizarea unui biopreparat mixt, cu acțiune complexă, de nutriție, stimulare și protecția plantelor. Lucrarea a fost realizată în cadrul proiectului PN2 MIMOSA – “Inoculanți microbieni pentru sisteme de agricultură durabilă”, iar experimentele aferente lucrãrii s-au desfãșurat in laboratorul de organisme utile – bacteriologie de la Institutul de Cercetare și Dezvoltare pentru Protecția Plantelor, București.
CAP.II. STADIUL ACTUAL AL CUNOȘTINȚELOR ÎN DOMENIU
II.1. Rolul azotului si a fixarii biologice
Azotul este un element care intră in alcătuirea proteinelor, acizilor nucleici și a multor alte molecule biologice fiind, deci, un element indispensabil pentru viață.
Studiile efectuate pe plan mondial au demonstrat că fertilizarea contribuie cu circa 40% la creșterea recoltelor per unitate de suprafață. Dintre ingrășăminte, azotul ocupă rolul principal prin aportul său in determinarea sporului de recoltă și prin ponderea sa. Prin urmare, satisfacerea nevoilor alimentare ale populației globului in continuă creștere, precum și furnizarea unora dintre materiile prime pentru industriile care și le iau de la agricultură, depind in mare măsură, de asigurarea cantităților corespunzatoare de azot alături de celelalte elemente necesare metabolismului plantelor.
Sursele de azot, așa cum sunt cunoscute la ora actuală, sunt reprezentate de ingrășămintele minerale, ingrășămintele organice (gunoaie, nămoluri și alte reziduuri) și formele alternative biologice (bacterii fixatoare de azot atmosferic simbiotice, nesimbiotice si asociative).
Agricultura durabilă, strategia mondială actuală a dezvoltării agricole, presupune practici ecologic sănătoase si economic atractive. Fixarea biologică a azotului este o tehnologie care răspunde ambelor deziderate, oferind mijloace de reducere a costurilor și a inputurilor energetice.
Practica utilizării leguminoaselor simbionte pentru imbunătațirea calității solurilor datează din timpurile prebiblice, dar a căpătat valoare comercială in secolul XIX, după descoperirea bacteriilor care produc nodozități.
Pentru aprecierea importanței procesului biologic de fixare a azotului trebuie să se țină seama de considerente majore, cum este cel al utilității pentru lumea vie (prin implicarea, alături de fotosinteză, in producerea de substanță organică primară, combustibil, fibre) și cel al utilității economice (reprezentând sursa naturală și preponderentă de azot accesibil plantelor de cultură, conservarea umidității solului, prevenirea eroziunii) (Bohlool, 1990).
Procesul de fixare biologică realizează reducerea azotului din atmosferă, unde se găsește in cantități mari, de aproape 77000 tone deasupra fiecărui hectar de sol, pe seama energiei solare inepuizabile, captată fotosintetic. Deci, procesul este neconsumator de energie fosila, supus autoreglarii sistemului in care se desfășoară și nepoluant pentru mediu.
In 1977 Hardy a facut următoarea estimare a evoluției in timp și a raportului dintre fixarea biologica de azot și alte surse:
Tabel 1. Estimarea evoluției in timp și a raportului dintre fixarea biologică de azot și alte surse.
Pentru spentru sisteme de agricultură durabilă”, iar experimentele aferente lucrãrii s-au desfãșurat in laboratorul de organisme utile – bacteriologie de la Institutul de Cercetare și Dezvoltare pentru Protecția Plantelor, București.
CAP.II. STADIUL ACTUAL AL CUNOȘTINȚELOR ÎN DOMENIU
II.1. Rolul azotului si a fixarii biologice
Azotul este un element care intră in alcătuirea proteinelor, acizilor nucleici și a multor alte molecule biologice fiind, deci, un element indispensabil pentru viață.
Studiile efectuate pe plan mondial au demonstrat că fertilizarea contribuie cu circa 40% la creșterea recoltelor per unitate de suprafață. Dintre ingrășăminte, azotul ocupă rolul principal prin aportul său in determinarea sporului de recoltă și prin ponderea sa. Prin urmare, satisfacerea nevoilor alimentare ale populației globului in continuă creștere, precum și furnizarea unora dintre materiile prime pentru industriile care și le iau de la agricultură, depind in mare măsură, de asigurarea cantităților corespunzatoare de azot alături de celelalte elemente necesare metabolismului plantelor.
Sursele de azot, așa cum sunt cunoscute la ora actuală, sunt reprezentate de ingrășămintele minerale, ingrășămintele organice (gunoaie, nămoluri și alte reziduuri) și formele alternative biologice (bacterii fixatoare de azot atmosferic simbiotice, nesimbiotice si asociative).
Agricultura durabilă, strategia mondială actuală a dezvoltării agricole, presupune practici ecologic sănătoase si economic atractive. Fixarea biologică a azotului este o tehnologie care răspunde ambelor deziderate, oferind mijloace de reducere a costurilor și a inputurilor energetice.
Practica utilizării leguminoaselor simbionte pentru imbunătațirea calității solurilor datează din timpurile prebiblice, dar a căpătat valoare comercială in secolul XIX, după descoperirea bacteriilor care produc nodozități.
Pentru aprecierea importanței procesului biologic de fixare a azotului trebuie să se țină seama de considerente majore, cum este cel al utilității pentru lumea vie (prin implicarea, alături de fotosinteză, in producerea de substanță organică primară, combustibil, fibre) și cel al utilității economice (reprezentând sursa naturală și preponderentă de azot accesibil plantelor de cultură, conservarea umidității solului, prevenirea eroziunii) (Bohlool, 1990).
Procesul de fixare biologică realizează reducerea azotului din atmosferă, unde se găsește in cantități mari, de aproape 77000 tone deasupra fiecărui hectar de sol, pe seama energiei solare inepuizabile, captată fotosintetic. Deci, procesul este neconsumator de energie fosila, supus autoreglarii sistemului in care se desfășoară și nepoluant pentru mediu.
In 1977 Hardy a facut următoarea estimare a evoluției in timp și a raportului dintre fixarea biologica de azot și alte surse:
Tabel 1. Estimarea evoluției in timp și a raportului dintre fixarea biologică de azot și alte surse.
Pentru satisfacerea necesarului de hrană de la sfârșitul secolului XX-inceputul secolului XXI, se impune creșterea coeficientului de utilizare de către plante a ingrășămintelor cu azot, elaborarea și implementarea unor tehnologii economice de producere industrială a ingrășămintelor chimice și creșterea eficienței biologice prin optimizarea proceselor naturale (fotosinteză si fixarea biologică de azot).
Capacitatea de a fixa azotul atmosferic este o insușire care aparține atât unor procariote (bacterii fototrofe sau heterotrofe, cianobacterii și actinomicete), libere sau asociate cu plantele, grupate sub denumirea generica de microorganisme diazotrofe, cât și, in pofida a ceea ce se credea până nu de mult, unor eucariote din regnul vegetal.
Numeroase cercetări au semnalat prezența și abundența unor diverse grupe de microorganisme fixatoare de azot, in cele mai diferite condiții de mediu. Fixarea de azot de către heterotrofele libere, in mediile naturale, nu este semnificativă decăt in prezența unor surse corspunzatoare de energie și carbon. Cele mai mari cantități de azot sunt fixate in rizoplanul și rizosfera anumitor plante datorită exsudatelor lor radiculare.
Condiția obligatorie pentru ca un organism să poata realiza reducerea azotului atmosferic, in condiții normale de temperatura și presiune, este deținerea unei informatii genetice pentru sinteza și controlul unui sistem enzimatic complex denumit “nitrogenază”. Sistemul enzimatic nitrogenazic este format din doua componente proteice diferite, care funcționează asociat intr-un ciclu catalitic. Sinteza sistemului enzimatic nitrogenazic este guvernată de un grup de gene cunoscute sub denumirea de gene nif.
Desfășurarea procesului de fixare biologică a azotului este condiționată de numerosi factori endogeni și exogeni. Acești factori pot fi clasificați, după gradul de participare, in factori primari, secundari și tertiari.
In categoria factorilor primari sunt cuprinși factorii endogeni implicați direct in reacția centrală a fixării: concentrația de nitrogenaza, gradul de saturare al nitrogenazei cu substratul de reacție și concentrația produsului rezultat – amoniul. Nivelul cantitativ al nitrogenazei diazotrofilor nu este factor limitativ pentru fixare la temperaturi in jur de 200C, dar devine limitativ cănd temperaturile scad sub acest nivel (Hardy și Havelka, 1976).
Alături de factorii primari, alti determinanți ai procesului de fixare sunt reprezentați de căile de asimilare ale amoniacului produs, mecanismele de represie enzimatică, mecanismele de excludere a ionilor de hidrogen din apropierea nitrogenazei, sistemul enzimatic pentru conversia molibenului intr-o formă catalitic activă.
Factorii primari indispensabili pentru desfășurarea procesului de fixare a azotului trebuie priviți in strânsă interdependență cu un factor secundar, fotosinteză. In cursul perioadei de creștere, atât intensitatea fotosintezei cât și activitatea de fixare a azotului de către nodozități merg paralel și ating valori maxime inaintea infloritului. După aceasta se instaleaza o competiție privind repartizarea produșilor asimilați intre organele reproducatoare și nodozități, tradusă prin diminuarea progresivă a activitaății de fixare a azotului.
Dependența strânsă a procesului de fixare a azotului atmosferic de fotosinteză se manifestă și prin variații nictemerale. Analiza acestora indică faptul că activitatea maximă coincide cu perioada de fotosinteză cea mai intensă.
Condiționarea fixării azotului de fotosinteză, in cazul rizocenozelor diazotrofe, se face prin intermediul exsudării prin rădăcini a unei părți din produșii de fotosinteză. Nivelul cantitativ și diversitatea calitativă a exsudatelor radiculare sunt determinate de tipul de fotosinteză a plantelor. Bogația exsudatelor radiculare ale plantelor favorizează dezvoltarea bacteriilor diazotrofe in detrimentul altor grupe de microorganisme cu necesități mai variate.
Factorii terțiari sunt reprezentați, mai ales, de factorii determinanți pentru procesul de fotosinteză alături de care intervin, prin mecanisme diferite, o serie de alți factori de mediu, unii generali, altii particulari. (Balandreau, 1975).
Factorii generali care acționează asupra fixării azotului, prin intermediul fotosintezei, ating maximum de corelare in cazul simbiozelor de la leguminoase și sunt: intensitatea energiei luminoase, dimensiunea complexului fotosintetizator (densitatea plantelor, suprafața foliară totală), potențialul hidric, competiția intre maturarea plantei și necesitățile de funcționare ale nodozităților, creșterea concentrației in dioxid de carbon.
Importanța acestor factori a fost demonstrată (Pate si col. 1981) prin reducerea drastică și imediată a fixării, ca urmare a diminuării fotosintezei prin iluminare redusă sau dupa defoliere. Marirea capacității fotosintetizatoare, prin diverse mijloace, stimulează fixarea azotului. Iluminarea suplimentară a plantelor de soia determină o crestere a activitătii de fixare de la 125 kg la 165 kg N/ha/perioada de vegetație, imbogătirea cu dioxid de carbon a atmosferei a mărit de peste 5 ori nivelul de fixare a azotului prin dublarea masei și activității nodozităților, precum și prin extinderea fazei exponențiale de creștere a plantelor. In condiții de camp, este dificil de mărit capacitatea de fotosinteză dar, trebuie acordat atenție afectării, in sens negativ, a procesului de fixare de către densități ridicate ale plantelor și căderi ale acestora.
Reducerea experimentală sau eliminarea consumului asimilatelor către vărfuri vegetative sau boli, au drept consecințe canalizarea produșilor de fotosinteză spre nodozități și indirect creșterea activității de fixare.
Importanța factorului lumină este primordială, dar acesta devine limitant numai când celelalte condiții, in special temperatura, sunt optime pentru fixare.
Dintre factorii de mediu generali, tensiunea de oxigen are un rol limitant, reacția de fixare desfășurându-se numai in condiții de anaerobioză. Expunerea indelugată la oxigen inactivează, in mod ireversibil, sistemul enzimatic nitrogenazic.
Prezența in sol a unei cantități adecvate de molibden asimilabil reprezintă o necesitate generală pentru bacteriile fixatoare de azot libere sau simbiotice. De asemenea, insuficiența sulfului in sol restrânge sinteza sistemului enzimatic in a cărui structura intră acest element.
Un alt factor general care condiționează desfășurarea procesului de fixare a azotului atmosferic este nivelul azotului mineral din sol.
Efectele inhibitoare ale azotului mineral asupra simbiozei la leguminoase au fost demonstrate, dar s-au acumulat și dovezi practice care susțin că doze mici de azot combinat, dacă sunt corect aplicate in timp, pot stimula formarea de nodozități și fixarea de azot (Obaton și col. 1982). O explicație a acestei contradicții ar putea fi aceea că, multe organisme cultivate, mai ales soiurile inalt productive, posedă un potențial de creștere care nu poate fi satisfăcut nici de cele mai eficiente tipuri de simbioză. Stimularea fenomenului de simbioză se poate produce indirect, prin favorizarea dezvoltării plantei, iar stadiile din ciclul de dezvoltare care beneficiază de fertilizare sunt reprezentate de faza anterioară instalării simbiozei și faza de umplere a bobului, cănd simbioza este in declin.
O altă explicație, sustinuță de numeroase dovezi experimentale, atât in cazul lui Rhizobium, cât și in cazul unor diazotrofi liberi cum este Azospirillum, este reprezentată de selecția spontană a unor tulpini mutante, derepresate față de amoniu, care ar putea avea implicații practice deosebit de interesante pentru creșterea productivității culturilor.
Asupra sistemelor simbiotice, aciditatea solului exercită un efect complex, explicat printr-o acțiune directă, insoțită de multiple efecte colaterale. Acțiunea directă, se manifesta la inceputul formării nodozităților, in stadiul numit “acido-sensibil” si constă in inhibarea activității pectinazei sau formării mucigelului, secretat de rădăcinile leguminoaselor. Mucigelul inglobează in mod specific bacteriile simbiotice și le protejeaza de pH-ul acid al solului. Efectele colaterale se adreseaza plantelor care, in mediu acid, suferă fenomene de intoxicatie prin absorbție mărită de metale grele. De asemenea bacteriile, in condiții de aciditate, pierd capacitatea de fixare a azotului molecular.
Necesitățile in calciu ale sistemelor simbiotice de la leguminoase sunt ridicate și sunt mult mai mari decât cele ale partenerilor analizați separat. Cerințele față de calciu sunt maxime in faza de inițiere a nodozităților, intervenția sa specifică exercitându-se asupra mitozelor.
Aciditatea, deficiența de calciu, excesul de aluminiu și mangan se corelează in anumite tipuri de soluri, mai puțin propice pentru simbioza la leguminoase, cum sunt solurile podzolice din Romania. Amendarea cu calciu corectează o parte din aceste deficiențe. Solurile cernoziomice asigură instalarea și evolutia unei simbioze eficiente in fixarea azotului.
Rolul jucat de temperatură in desfășurarea proceselor de fixare a azotului este incă discutat. Se consideră că fixarea este mult mai activa in regiunile tropicale și subtropicale comparativ cu regiunile temperate. S-a demonstrat că, 24-30 0C constituie intervalul de temperatură optim la care simbioza este funcțională in regiunile temperate. Acesta coincide cu temperaturile optime pentru dezvoltarea plantelor.
II.1.1.TIPURILE DE MICROORGANISME FIXATOARE DE AZOT.
Identificarea și selectarea microorganismelor asociate cu plante și ameliorarea genetică, sunt strategii alternative de obținere a recoltelor care beneficiază de fixare de N procariotă. Fixarea de N(fixare fără formare de nodozități) de la bacterii asociate este o metodă corespunzătoare pentru exploatarea fixării de Nîn plante neleguminoase (Bitton, 2002). S-a recunoscut și folosul bacteriilor Nfixatoare în bioremediere. Fixarea de Npoate diminua consumul de azot necesar consorției bacteriene folosit pentru degradarea combustibilului diesel.
Proprietatea de fixare biologică a N condiționată de prezența unui sistem enzimatic specific: nitrogenaza, este limitată la câteva genuri de bacterii (Bains, 2004).
După modul lor de viață, microorganismele fixatoare de azot, se împart în două grupe mari:
Microorganisme libere fixatoare de azot
aerobe: Azotobacter; Azomonas; Beijerinckia; Derxia; Azotococcus; Methylococcus; Methylosinus; Aquaspirillum peregrinum, A. fasciculus; Streptomyces thermoautotrophicus; toate cianobacteriile care formează heterochiști; Gloeocapsa.
facultativ anaerobe: Bacillus polymyxa, B. macerans; Klebsiella pneumoniae, K. aerogenes, K. oxytoca; Citrobacter freundii; Enterobacter cloacae, Erwinia herbicola; tulpini de Escherichia coli și de Salmonella typhimurium la care în condiții de laborator au fost încorporate gene nif.
microaerofile: Xanthobacter autotrophicum; Azospirillum lipoferum, A. brasilense, A. doebereinerae, A. largimobile, A. halopraeferens, A. amazonense, A. irakense; Thiobacillus ferrooxidans; numeroase specii de cianobacterii care nu formează heterochiști; Rhizobium japonicum (Bull, 2004).
anaerobe: Clostridium, Clostridium pasteurianum; Desulfovibrio; Chromatium;
Desulfotomaculum; Chlorobium; Propionibacterium; Thiopedia; Thiocapsa;
Ectothiospira; Rhodomicrobium;Rhodospirillum; Rhodopseudomonas;
Rhodophila; Rhodobacter; Heliobacterium; Heliobacillus, Heliophilum;
Methanosarcina; Methanococcus; Methanobacterium; Methanospirillum;
Methanolobus .
Dintre microorganismele libere fixatoare de azot aerobe cele mai importante aparțin familiei Azotobacteraceae.
Reprezentanții acestei famili se prezintă morfologic sub forma unor celule mari, predominant bastonașe, până la oval, dar care își pot schimba aspectul morfologic în funcție de vârsta culturii și de condițiile de cultivare. Celulele sunt grupate adesea în perechi și sunt mobile datorită prezenței flagelilor peritrichi sau polari. Există și forme imobile. Nu formează endospori. Unele specii formează microchiști rezultați din îngroșarea peretelui celulei vegetative și acumularea unor substanțe de rezervă. Chisturile se formează în condiții de lipsă de substanțe nutritive și deshidratare, sunt rezistente și asigură o stare latentă parțială. În condiții favorabile chisturile germinează. Cele mai multe tulpini prezintă o capsulă mucilaginoasă care înconjoară una sau mai multe celule și care este cu atât mai mare cu cât conținutul mediului de cultură în glucide este mai ridicat. Această capsulă înconjoară și protejează coloniile de celulele în sol. Unele tulpini produc pigmenți fluorescenți. Sunt microorganisme heterotrofe, capabile să fixeze azotul molecular într-un mediu fără azot, dar în prezența unei surse organice de carbon (Szabó, 1989).
Speciile din genul Azotobacter sunt cei mai importanți reprezentanți ai bacteriilor fixatoare de azot obligat aerobe, saprofite, libere din sol. Pot fi determinate în toate regiunile geografice și din toate tipurile de sol. Microchiștii de Azotobacter sunt rezistente față de deshidratare și de radiațiile ultraviolete, dar nu și față de căldură (pereții nu conțin acid dipicolic). Cea mai răspândită specie a genului este Azotobacter chroococcum, care prezintă o mare variabilitate morfologică. Celulele tinere au aspectul unor bastonașe groase de 2 µm x 4 µm, cu capetele rotunjite, izolate sau în perechi, ciliate peritrich. Celulele adulte sunt ovalare sau cu aspectul unor coci mari de 2 µm x 1,2 µm și conțin numeroase granulații. Celulele bătrâne sunt aproape sferice, numărul flagelilor scade și celulele își pierd mobilitatea. Datorită prezenței capsulei gelatinoase preparatele de Azotobacter chroococcum au un aspect deosebit: celulele se găsesc întotdeauna la o anumită distanță între ele. Este aerob și facultativ microaerofil. Formează la suprafața mediilor lichide o peliculă colorată brun până la negru, datorită melaninei. Temperatura optimă de dezvoltare este de 25-28C și pH-ul=7-7,5. Este Gram-negativ în stadiul tânăr și Gram-variabil la maturitate. Valorifică amidon și manită. Fixează cel puțin 10 mg N la 1 g de carbohidrați consumați. Exigența față de molibden poate fi înlocuită cu vanadiu. Nu prezintă activitate proteolitică. Este catalaz pozitiv. Ca sursă de azot valorifică nitrați, amoniac și aminoacizi. Azotobacter chroococcum se întâlnește aproape în toate solurile, frecvența cea mai mare fiind în solurile cultivate, fertile (Dunca și al., 2004).
Din genul Azomonas dintre speciile libere fixatoare de azot se remarcă Azomonas agilis, A. insignis, A. macrocytogenes.
Multe specii din familia Pseudomonaceae trăiesc saprofit în sol. Ele cuprind mai ales bacterii în formă de bastonaș, nesporogene. Formele mobile prezintă cili polari. Speciile de Pseudomonas au fost considerate incapabile să fixeze N, dar studiile recente au dovedit capacitatea fixării de N și la unele specii de Pseudomonas. Pseudomonas stutzeri (în prealabil denumit Alcaligenes faecalis) este larg utilizat ca inoculant a orezului în China. În urma inoculării orezului, Pseudomonas stutzeri colonizează agresiv rădăcinile și gena nifH se exprimă în aceste bacterii asociate cu rădăcina.
Klebsiella pneumoniae se găsește în soluri și ape, în tubul digestiv la om și animale. Este specia patogenă a înbolnăvirilor sistemului respirator și urogenital. Este imobilă, Gram negativă, chemoorganotrofă, catalaz pozitivă și oxidaz negativă, are capsulă. Din glucoză formează gaz, din lactoză acid. Utilizează glucoza și citratul ca sursă de carbon, iar amoniacul ca sursă de azot.
Din grupa bacteriilor libere anaerobe, fixatoare de azot molecular o importanță deosebită prezintă genul Clostridium.
Clostridium pasteurianum se prezintă în stadiu vegetativ sub formă de bastonașe drepte sau ușor curbate de 0,5-0,8/3,4-13,2 µm și sub formă de fus în stadiu sporulat. Sporii sunt deformanți și dispuși central, terminal și subterminal. Sporul matur este înconjurat de o capsulă gelatinoasă, de formă triunghiulară, cu capetele puțin rotunjite. În unele condiții de cultivare, această bacterie dă forme cu aspecte din cele mai bizare: filamente lungi cu spori la unul din capete sau uneori se observă desfacerea celulelor într-o serie de formațiuni asemănătoare cocilor. În celulele tinere citoplasma este omogenă, înainte de a începe sporularea apare în ea glicogen și incluziuni de amidon. Clostridium pasteurianum este mobil, cu flageli dispuși peritrich, uneori imobil. Este strict anaerob sau anaerob-aerotolerant. Temperatura optimă de dezvoltare este de 28-30C. Se dezvoltă bine în medii ce conțin hidrați de carbon fermentescibili. Este o bacterie butirică adevărată producând în cursul fermentării hidrațiilor de carbon acid butiric, acid acetic și gaze.
Numeroase alte specii de Clostridium pot fixa azotul dar în cantități reduse. În general, s-a constatat că speciile de Clostridium fixatoare de azot atmosferic au o răspândire mai mare decât speciile aerobe de Azotobacter. Datorită modului lor de viață și a pH-lui optim relativ scăzut, ele se pot găsi în solurile mai puțin aerisite, precum și în solurile de pădure și pășune, compacte și acide. Ele sunt prezente însă și în solurile cultivate, bine aerisite și bogate în humus. În acest caz, sunt prezente aproape exclusiv în interiorul particulelor structurale ale solului. În majoritatea cazurilor ele acceptă, ca și fixatorii de azot aerobi, o simbioză cu bacteriile celulozolitice.
Microorganisme simbiotice fixatoare de azot:
Bacterii simbiotice care produc nodozități: Rhizobium, Bradyrhizobium, Sinorhizobium, Azorhizobium – leguminoase; Rhizobium – neleguminoase (Trema cannabina); actinomicete (Frankia) – angiosperme neleguminoase (Alnus, Myrica, Ceanothus, Comptonia, Casuarina); cianobacterii (Nostoc, Anabaena) – Cycas, Bowenia etc (Zarnea, 1984).
Cianobacterii simbiotice cu alte organisme eucariote: Nostoc – fungi (licheni) Peltigera, Collenia; Nostoc – hepatice (Anthocera, Blasia etc.); Anabaena – Pteridophyta (Azolla); Nostoc – angiosperme (Gunnera).
Simbioze asociative: Paspalum – Azotobacter paspali; Digitaria decumbens – Spirillum lipoferum (bacteriile cresc pe / și în rădăcini fără să producă nodozități).
Simbioze cu bacterii celulozolitice (la termite, rumegătoare etc.).
Speciile de bacterii fixatoare de azot care produc nodozități pe rădăcini și pe tulpini, valide, descrise în literatura de specialitate sunt: Rhizobium leguminosarum bvs. trifolii, viciae și phaseoli, R. galegae, R. tropici, R. etli, R. gallicum, R. giardini, R. huautlense, R. mongolense, Synorhizobium meliloti, S. fredii, S. saheli, S. teranga, S. medicae, Mesorhizobium loti, M. huakuii, M. ciceri, M. tianshanense, M. mediterraneum, M. plurifarium, M. amorphae, Allorhizobium undicola, Bradyrhizobium elkanii, B. japonicum, B. liaoningense, Azorhizobium caulinodans (Berner și al., 2005).
Bacteriile implicate în fixarea simbiotică la leguminoase aparțin familiei Rhizobiaceae (genurile Rhizobium, Bradyrhizobium).
În general, toate solurile normale conțin bacterii de nodozități aparținând genului Rhizobium. Aceasta nu înseamnă însă că oricare specie de plantă leguminoasă găsește în mod sigur specia de Rhizobium cu care să intre în relații simbiotice (Eliade și col.,1975).
II.2.1. INCADRAREA SISTEMATICĂ A RIZOBIILOR.
Speciile de rhizobii care produc nodozități pe rădăcini și pe tulpini, valide, descrise în literatura de specialitate sunt: Rhizobium leguminosarum bvs. trifolii, viciae și phaseoli, R. galegae, R. tropici, R. etli, R. gallicum, R. giardini, R. huautlense, R. mongolense, Synorhizobium meliloti, S. fredii, S. saheli, S. teranga, S. medicae, Mesorhizobium loti, M. huakuii, M. ciceri, M. tianshanense, M. mediterraneum, M. plurifarium, M. amorphae, Allorhizobium undicola, Bradyrhizobium elkanii, B. japonicum, B. liaoningense, Azorhizobium caulinodans (Berner și col., 2005).
Bacteriile implicate în fixarea simbiotică la leguminoase aparțin familiei Rhizobiaceae (genurile Rhizobium, Bradyrhizobium).
In stare liberă, rizobiile se prezintă ca bacterii de forma bacilară, fără endospori, gram-negative, aerobe și mobile datorită prezenței a 1-6 flageli.
Unicitatea acestor bacterii constă in faptul că pot induce structuri specifice la leguminoase, așa numitele nodozități situate pe rădăcini sau tulpini.
Conform ultimelor studii taxonomice, in grupul rizobiilor sunt incluse genurile Rhizobium, Sinorhizobium, Mezorhizobium, Bradyrhizobium si Azorhizobium (de Lajaudie si col., 1994; Jarvis si col., 1997; Haukka, 1997).
Bacteriile difera intre ele, unele formând nodozități cu un număr limitat de leguminoase, altele avand un cerc larg de plante gazdă.
Distincția făcută intre Rhizobium și Bradyrhizobium se bazează, in principal, pe rata de creștere pe extractul de drojdii și capacitatea de a utiliza diferite surse de carbon.
Genul Rhizobium constă din specii care prezintă rate mari de creștere pe extractul de drojdii și care utilizează numeroase zaharuri, polioli și acizi organici.
Genul Bradyrhizobium are creștere lentă, are necesitățile nutriționale mai specializate și prefera pentozele.
Genul Azorhizobium se caracterizeaza prin capacitatea de a forma nodozități pe tulpini (Dreyfus si col., 1988; Martínez-Romero, 1994).
Speciile genului Rhizobium sunt răspândite, de regulă, în rizosferă.
Celulele bacilare au diametrul de 1-1,4 x 0,6-0,8 µm. Sunt Gram negative, ciliate și foarte mobile. În nodozitățile rădăcinilor leguminoaselor celulele iau forma literelor T, X și Y.
Sunt bacterii aerobe, heterotrofe și nu formează spori. Temperatura optimă de dezvoltare este de 25C.
Rhizobium leguminosarum pe medii de cultură formează colonii albicioase și mucilaginoase. Celulele au diametrul de 0,5-0,9 µm și o lungime de 1,2-3 µm. Celulele sunt flagelate peritrich. În sol se găsesc pe rădăcinile plantelor de Pisum, Lathyrus, Vicia, Lens (Dunca et al., 2004).
Celulele de Rhizobium leguminosarum var. phaseoli sunt mai mici decât la Rhizobium leguminosarum. Celulele sunt flagelate peritrich. Coloniile sunt gri albicioase și mai puțin mucilaginoase ca la Rhizobium leguminosarum. În sol se găsesc pe suprafața rădăcinilor de Phaseolus vulgaris și Phaseolus coccineus.
Rhizobium leguminosarum var. trifolii prezintă de asemenea celule flagelate peritrich. Celulele sunt în majoritatea cazurilor piriforme și prezintă vacuole. Se găsesc în nodozitățile rădăcinilor de Trifolium sp. și în sol.
La Rhizobium meliloti bacteroizii din noduli au aspect de bastonaș. Celulele au 2-3 flageli peritrichi. Se găsesc în nodozitățile rădăcinilor de Melilotus, Medicago și Trigonella.
Rhizobium lupini este formată din celule care se deplasează cu ajutorul a 2-3 flageli. Se găsește în sol și în nodozitățile rădăcinilor de Serradella, Lupinus și Ornithopus.
La Rhizobium loti bacteroizii din noduli au tot aspect de bastonaș, celulele au un flagel polar. Formează nodozități la următoarele plante: Lotus corniculatus, Lotus tenuis, Lupinus densiflorus, Anthyllis vulneralia, Mimosa etc.
II.2.2. SPECIFICITATEA DE GAZDĂ A RIZOBIILOR.
Primul cercetător care a vorbit despre rizobiile cu creștere rapidă din nodulii prezenți la leguminoasele erbacee și lemnoase a fost Trinick. De atunci, chiar dacă simbionții cu creștere lentă par să fie mai numeroși in majoritatea ecosistemelor tropicale, tipurile cu creștere rapidă au fost semnalate frecvent, și uneori chiar le domină pe celelalte.
Persistența rizobiilor cu creștere rapidă pare să depindă de speciile legumicole prezente și de condițiile ecologice ale arealului. Arealele unde tipul cu creștere rapidă domină pare să fie cu precadere mediul arid, cu soluri sărace, din Africa, Australia și America de Nord. Speciile de Acacia sunt deseori dominante in areale ca Africa și Australia, și se pare că acest gen este nodulat de rhizobii cu creștere rapidă. Este dificil de spus dacă dominanța tipului cu creștere rapidă se datorează mai mult condițiilor de mediu decăt preferinței pentru gazde.
Unii autori susțin fapul că, anumite condiții adverse de mediu ar favoriza bacteriile cu creștere rapidă intrucăt acestea pot raspunde rapid fluctuațiilor condițiilor de mediu. Rizobiile cu creștere rapidă par a fi, in general, capabile să utilizeze un grad mare de surse de carbon, comparativ cu bradyrhizobiile. Tipul cu creștere rapidă pare sa fie de asemenea mai tolerant la temperaturi mari și la secetă decât tipul cu creștere lentă.
S-a observat rezistența crescută a izolatelor rizobiene la antibiotice, posibil rezultat al adaptării la mediul deșertic, unde actinomicetele producatoare de antibiotice sunt prezente in numar mare. In concordanță cu acest studiu, intr-un mediu desertic, rata creșterii rapide, producerea de acizi, toleranta la temperaturi ridicate si rezistenta crescuta la antibiotice par sa fie caracterele ideale.
Studiind legăturile dintre condițiile de mediu și abundența rizobiilor, s-a ajuns la ipoteza că, prezența unei anumite populații de rizobii este corelata cu:
prezența unei leguminoase – gazdă potrivită;
precipitațiile anuale scăzute;
surse de legume si biomasa de lăstari;
temperatura solului.
Influența plantei gazdă in evoluția rizobiei este evidenta, dar nu se știe căt de importantă.
Coevoluția planta-rizobie a fost studiată de unii cercetatori care au izolat rizobii nodulante la fasole, din diferite regiuni ale globului. Pe parcursul acestor studii ei au intalnit cazuri de coevoluție datorită izolării geografice. Spre exemplu, au gasit in sudul Turciei un soi de fasole care forma o simbioză eficientă cu tulpini locale de rizobii, dar nu și cu alte tulpini din alte părți ale Turciei. De asemenea, este relativ ușor să găsești un centru de diversitate genetică presupus a fi centru de origine pentru plantele leguminoase. Posibil că aceste areale sa fie aceleași cu zonele in care rizobiile au coevoluat cu leguminoasele.
Studiile filogenetice bazate pe secventele 16S au arătat ca rizobiile cu creștere rapidă sunt mult mai diverse din punct de vedere genetic decăt cele cu creștere lentă, fapt reflectat de altfel si de divizarea lor in patru genuri diferite.
Noile specii din America, Rhizobium tropicii si Rhizobium etli au fost considerați simbionți primari pentru fasole, deși pentru Rhizobium tropicii – Leucaena leucocephala era cunoscută drept gazdă incă de la inceput. Mai tarziu s-a observat că ambele specii nodulează eficient un numar mare de leguminoase erbacee și lemnoase.
Rizobiile din Africa au fost testate până acum pe câteva plante erbacee, deși unele dintre tulpini au fost capabile să noduleze și alte specii precum Lotus cornicatus si Medicago sativa.
Specia Sinorhizobium este o tulpină cu un număr mare de gazde, care a fost timp indelungat studiată. S-a izolat din Lablab purpurens din Noua Guinee, și de atunci a fost testată pe 375 specii de leguminoase, nodulănd doar 205 dintre ele.
Fig.1. Acțiunea complexă a inoculanților pe bază de rizobii fixatoare de azot
II.2.3. EFECTELE INOCULARII CU RHIZOBIUM – FORMAREA NODOZITĂȚILOR.
Formarea nodozităților radiculare și manifestarea capacității de fixare a azotului atmosferic este rezultatul unei interacțiuni reușite intre bacterie și planta gazdă, ca urmare a parcurgerii unor etape succesive și obligatorii.
Nodozitățile fixatoare de azot atmosferic la plantele leguminoase se formează pe rădăcini, fiind un rezultat al unei creșteri tisulare anormale dar limitate, cu organizare armonioasă și diferențiată. În interiorul nodozității, bacteroizii fixează azotul molecular care este apoi utilizat de către planta-gazdă (Mihăescu & Gavrilă 1989 in Ghețea și al. 2002).
Acest proces este rezultatul a patru stadii fiziologice distincte: preinfecția, infecția și formarea nodozității, funcționarea nodozității, imbătrânirea.
Etapele inițiale ale procesului de infecție constau in: colonizarea radiculară, atașarea la radacini, răsucirea perișorilor sugători și formarea filamentului de infecție (Robertson si col.,1981).
In stadiul de preinfectie, celulele rizobiene libere migrează spre rizosfera plantei gazda datorită excretării, de către rădăcină, a unei game variate de compuși. După ajungerea in rizosfera, are loc recunoașterea intre gazda și bacterie, proces ce implică transmiterea unor semnale mutuale specifice pentru activarea și transcrierea genelor implicate in simbioză (Schell si col., 1988).
Atașarea bacteriilor la rădăcini are loc in zone speciale de infecție, care corespund regiunii perișorilor absorbanți tineri. Formarea filamentului de infecție in celulele perișorilor absorbanți e o etapa specifică și se produce ca urmare a unui proces de degradare a pereților celulari radiculari.
Celulele gazdei reactionează prin formarea unor structuri tubulare, așa numitele filamente de infecție, care inchid bacteriile aflate in diviziune.
Filamentele de infecție se dezvoltă in direcția centrilor meristematici de inducție din cortexul radicular si formează ramuri. In contact cu un centru meristematic, rizobiile sunt eliberate in citoplasma celulelor gazdei. In timpul eliberării, bacteriile se inconjoară cu o membrană peribacterioidă, care provine din plasmalema plantei. Bacteriile se diferențiază in bacteroizi, in care este indusă exprimarea complexului enzimatic reducator de azot.
Bacteriile eliberate intracelular sufera modificări morfologice importante care variază cu specia plantei, condițiile de infecție și creștere, vârsta și dimensiunea nodozităților, și ele reprezintă sediul fixării azotului atmosferic. În mod caracteristic, bacteroizii conțin leghemoglobină care protejeaza sistemul enzimatic. Bacteroizii conțin tot sistemul enzimatic necesar pentru reducerea azotului atmosferic la azot asimilabil plantelor. Pentru ca toate reacțiile de transformare și asimilare să aibă loc, planta trebuie sa transfere către nodozități substraturi bogate in carbon. De asemenea, e necesară difuzia oxigenului in cantități suficiente.
Tabel 2. Stadiile de dezvoltare a nodozităților, etapele parcurse și interacțiile dintre rizobii și planta gazdă.
II.2.3.1. STRUCTURA NODOZITĂȚILOR.
Intr-o secțiune longitudinală prin nodozitate, zona cea mai indepartată este meristemul apical. Imediat lângă acestă este așa numita zonă de invazie, alcatuită din celule mari, ce vor fi infectate de rizobii.
In zona simbiozei incipiente celulele sunt diferențiate in infectate și neinfectate. După zona incipientă urmează o zonă de simbioză activă, unde are loc reducerea și asimilarea azotului.
Regiunea proximală a nodozității este zona senescentă, unde apare degenerarea celulei vegetale și a bacteroizilor. Cortexul nodozităților inconjoară zonele centrale ale acestora. Cortexul nodozității e divizat de un endoderm periferic, intr-un cortex interior si unul exterior. In corexul interior sunt localizate ramificațiile vasculare, acesta fiind separat de regiunile centrale ale nodozităților printr-un perete de celule distincte, mici, neinfectate.
II.2.3.2. FUNCȚIONAREA NODOZITĂȚILOR.
Sistemul enzimatic nitrogenazic este format din două componente proteice diferite, care funcționează asociat intr-un ciclu catalitic. Sinteza sistemului nitrogenazic este guvernată de genele nif.
Morfologia nodozității rădăcinii este atât sub controlul plantei gazdă, cât și a bacteriei. Adaptările morfologice și biochimice observate la simbioza lui Rhizobium cu leguminoasele sunt atribuite proprietăților genetice și biochimice ale ambelor organisme.
Dintre plasmidele pe care le posedă bacteriile din genul Rhizobium, cele denumite Sym poartă majoritatea genelor implicate in specificitatea de gazdă (hsn), in nodulare (nod), și in fixarea azotului (fix/nif). Mai exista și alte gene cromozomale sau plasmidiale, care joaca un rol in simbioză, spre exemplu genele ce codifică sinteza exopolizaharidelor.
Proprietățile genetice ale plantelor gazdă determină dezvoltarea nodozităților. Exprimarea genelor plantelor diferă in nodozități față de rădăcinile neinfectate.
In stadiul de preinfectie, rizobiile interactionează cu genomul plantei, prin eliminare de factori de creștere difuzibili – fitohormoni, inducând centri meristematici in cortexul radicular (Schell și col. 1988).
Filamentele de infecție sunt formate de planta gazdă, ceea ce indică exprimarea anumitor gene. Produșii acestora sunt numiți noduline timpurii și pe baza compozitiei lor in aminoacizi se pare că sunt proteine ale peretelui celular (Gloudemans și col., 1998).
Deși plantele au numeroase mecanisme de apărare față de patogeni, la simbioza leguminoaselor cu rizobiile, absența reacțiilor defensive pe parcursul dezvoltării nodozităților indică o represie a genelor implicate in aceste procese.
Dintre factorii care reglează funcționarea nodozităților fac parte oxigenul, haem-ul și amoniul. Pentru exprimarea genelor nif si fix este necesară o concentrație scazută de oxigen, obligatorie și pentru activitatea nitrogenazică. Haem-ul este o componentă esențială a leghemoglobinelor care manifestă o mare afinitate pentru oxigen și funcționează ca purtător de oxigen in nodozități. Amoniul este produsul acțiunii nitrogenazice, se pare ca formarea sa determină creșterea ph-ului și are drept consecință activarea unor enzime.
II.2.4. FENOMENUL DE QUORUM SENSING LA BACTERIILE FIXATOARE DE AZOT DIN GRUPUL RHIZOBIA.
Quorum sensing (QS) este unul dintre mecanismele de comunicare intercelulară bacteriană cel mai intens studiat, termenul de QS fiind introdus de către Fuqua și col. în 1994, ca fiind un proces de detectare a densității celulare.
Quorum sensing (QS) este un mecanism prin care diferite microorganisme controlează procese specifice ca raspuns la densitatea populațiilor. Acest sistem de comunicare celulă la celulă se realizează pe calea producerii unor molecule specifice cunoscute sub numele generic de molecule semnal sau autoinductori.
Populația este astfel capabilă să-și modifice comportamentul ca o structură unitară care reacționeaza la un prag critic de densitate cunoscută sub numele de qvorat (Fray, 2002). La bacteriile Gram negative moleculele semnal sunt N-acil homoserin lactonele (AHL) care diferă intre ele prin structura lanțurilor laterale.
Mecanismul QS reglează sporularea, sinteza de antibiotice, induce factorul de virulența, diferențierea celulară și fluxul de nutrienți, competența patogenică etc. La densități mici ale populațiilor se produce un nivel scăzut de AHL. Când densitatea celulelor crește, având tendința de a forma un film biologic invaziv, AHL-ul produs in cantitate mare se acumuleaza in mediu și, când se atinge concentrația critică, difuzeaza in celule legându-se la receptorul specific fapt care duce la activarea sau represia exprimării genelor care determină competența ecologică a bacteriilor.
Dat fiind rolul important pe care acest fenomen il are in interacțiile patogene (Loh si col., 2002), inactivarea sau degradarea moleculelor AHL constituie o cale inovativă de modulare a acțiunii agroinoculanților.
Fenomenul de QS include producerea, emiterea și detectarea a unor mici molecule de semnal, numite „molecule de autoinducere”. Aceste molecule se acumulează în mediu odată cu creșterea densității celulare.
Atunci când aceste molecule semnal depășesc o concentrația critică, bacteriile le detectează, și răspund la ele printr-o expresie genetică sincronizată. Prin utilizarea acestor sisteme de semnal-răspuns, bacteriile pot să-și regleze diverse activității, care sunt eficiente doar dacă bacteriile acționează simultan.
Procese controlate prin QS includ bioluminescență, virulență, formare de biofilme, schimb de ADN sau formarea de spori (Bejerano-Sagie și Xavier, 2007).
Având în vedere rolul important pe care îl are fenomenul quorum sensing în comunicarea intra- și extraspecifică la bacterii, capacitatea de a împiedica producerea sau detectarea moleculelor de semnal ar fii în folosul organismelor gazde sau a bacteriilor concurente. În nișele în care populațiile de bacterii concurează pentru resursele limitate, capacitatea unei specii de a împiedica comunicarea prin QS la specia cealaltă, constituie un avantaj. De asemenea, capacitatea gazdei de a interfera cu comunicarea intercelulară bacteriană poate fii crucială în prevenirea colonizării de către bacteria patogenă, care utilizează quorum sensing-ul pentru coordonarea virulenței. Acele mecanisme care s-au dezvoltat pentru a interfera cu comunicarea intercelulară bacteriană au fost numite „quorum quenching”.
Probabil există și mecanisme analoage, menite să promoveze o funcție (un comportament) controlat prin quorum sensing, atunci când aceast comportament aduce beneficii acelor organisme care cohabitează cu bacteriile care utilează QS-ul. Însă despre aceste mecanisme se știe foarte puțin la ora actuală (Waters și Bassler, 2006).
Speciile din grupul Rhizobia sunt cunoscute datorită faptului că ele pot avea relații simbiotice cu plantele leguminoase, în urma cărora la rădăcinile plantei se formează nodozității fixatoare de azot.
La câteva specii, lângă bine cunoscutele molecule de semnal (flavonoide, factori Nod și exopolizaharide) implicate în formarea nodozităților, s-a evidențiat fenomenul quorum sensing bazat pe molecule de semnale de tip AHL, aceasta fiind legată de fenomene variate, ca eficiența formării nodozităților, dezvoltarea „simbiozomelor”, producerea de exopolizaharide și fixarea azotului. Toate aceste fenomene sunt importante în realizarea cu succes a simbiozei.
Relația simbiotică care se formează între bacteriile fixatoare de azot din grupul Rhizobia și plantele gazde (leguminoase) este rezultatul unor rețele complexe de semnalizare între gazdă și organismul simbiont. Până astăzi, multe aspecte ale schimbului de semnale sunt necunoscute, însă se pare că mecanismul QS joacă un rol cheie în procesul simbiotic, deoarece acest proces depinde de concentrația bacteriilor din jurul și din interiorul rădăcinii plantelor și a nodozităților. Creșterea densității celulelor bacteriene Rhizobia, determinată de procesul QS, este un component important în procesul de semnalizare.
Dintre bacteriile fixatoare de azot, fenomenul QS este cel mai bine studiat la specia Rhizobium leguminosarum. Au fost identificate nu mai puțin de patru sisteme quorum sensing (rai, rhi, cin, și tra) cu 6 tipuri de proteine receptoare de tip LuxR (raiR, rhiR, cinR, traR, bisR, expR). Împreună, aceste sisteme reglează genele implicate în formarea de biofilme, conjugație, simbioză, fixarea azotului (Waters și Bassler 2006, Pappas și col. 2004, Whitahead și col. 2001).
Fig.2. Rețea quorum sensing la Rhizobium leguminosarum
(Gonzáles și Marketon 2003, pp. 582).
Sistemul quorum sensing la bacteria R. etli este mai puțin cunoscută, dar și mai puțin complex, decât cel al speciei R. leguminosarum. Deși la R. etli au fost găsite șapte molecule de AHL diferite, doar două sisteme de quorum sensing au fost identificate: sitemele raiRI și cinRI, care sunt localizate pe cromozomă. Aceste două siteme sunt responsabile de sintetizarea tuturor moleculelor de AHL. Locusul cinRI codifică o moleculă de AHL cu catenă lungă (a cărei structură este încă necunoscută), care are rol în inhibarea creșterii bacteriene.
Locusul cinRI este responsabil de fixarea eficientă a azotului și de formarea simbiozei. Sistemul raiRI este reglat pozitiv de moleculele AHL produse de genele cinI, și la rândul lor genele raiI (omoloage cu genele luxI) sunt responsabile de sintetizarea a câtorva molecule AHL cu catene scurte (neidentificate încă). Locusul raiRI are rol și în controlarea fixării azotului și în inhibarea creșterii (Gonzáles și Marketon 2003).
II.3. GENUL AZOSPIRILLUM
Prima specie de Azospirillum a fost izolată de Beijerinck (1925) in Olanda, dintr-un sol nisipos sărac in azot și a fost denumită inițial Spirillum lipoferum. Ulterior, bacteria a fost izolată din unele alge marine și din filosfera unor plante tropicale. Döbereiner și Day (1976) au relatat larga distribuție in rizosfera multor buruieni tropicale. Dupa aceasta, bacteria a fost izolată de la rădăcinile a numeroase plante salbatice și cultivate, cereale și leguminoase din soluri tropicale, subtropicale si temperate.
Tarrand și col. (1978) a propus divizarea in două specii distincte: A.brasilense si A.lipoferum, pe baza diferențelor morfologice și fiziologice intre diferite tulpini pe baza experimentelor de omologie a ADN. Aceste 2 specii au fost primele descrise, iar in urma cercetărilor ulterioare s-au identificat ca specii distincte A. amazonese, A. halopraeferans, A. irakenses, A. largimobile. Aceasta din urma a fost mult timp considerată o specie sinonimă cu A. lipoferum. Recent, ea a fost denumită A. doebereinerae, in onoarea celui care a deschis studiul acestui gen bacterian.
Ca aspect, speciile de Azospirillum sunt bastonașe mai groase, curbate, cu mărimea între 0,8-1,0 x 25 μm, cu granule de PHB, care în celulele fixatoare de Npot să atingă 50% din masa uscată a celulei. Normal celulele sunt Gram negative, însă la Azospirillum brasiliense s-a observat o variabilitate în ceea ce privește caracterul Gram. Celulele sunt mobile, cu un singur flagel polar.
Dupa 1993, bacteria s-a bucurat de o atentie deosebită datorită capacității sale de stimulare a creșterii plantelor.
Fig.3. Azospirillum brasiliense
II.3.1. SPECIFICITATE SI VARIABILITATE
Una din cele mai controversate probleme referitoare la asocierea cu Azospirillum se referă la specificitatea planta – tulpină bacteriană și modul cum aceasta afecteaza creșterea plantelor. Diferențe specifice s-au inregistrat intre răspunsurile plantelor C3 și C4. Azospirillim lipoferum a fost specia predominantă care colonizează plantele C4, iar Azospirillum brasiliense a fost specia precominant asociată cu plantele C3 in zonele tropicale.
Plantele C3 si C4 sunt impărțite pe baza tipului de fotosinteză pe care o realizează. Plantele ce corespund tipului C3 reprezinta circa 300000 de specii răspandite in zonele cu climat termperat; la acestea produșii intermediari ai fotosintezei au 3 atomi de carbon. Tipul fotosintetic C4 se intălnește la aproximatic 1000 de specii originare in zonele tropicale, adaptate la condiții de iluminare intensă și la temperatură ridicată. Produșii intermediari de carbon formați in timpul fotosintezei au 4 atomi de carbon. Exemple: Zea mays, Sorghum vulgare, Beta vulgaris, etc.
O preferință similară a bacteriilor din genul Azospirillum pentru plantele gazda a fost observată și in zonele temperate.
Principalele dificultăți in determinarea specificității bacteriei sunt: lipsa testelor de comparație pentru tulpini obținute din diferite surse, experimentate pe anumite plante gazdă și numărul limitat de tulpini testate până in prezent.
Exista studii ce indică faptul că specificitatea nu este la nivel de specie ci la nivel de tulpină. O selecție rapidă pentru determinarea asocierii planta – tulpină bacteriană este esențială pentru prognoza succesului combinațiilor inainte de testarea in câmp.
II.3.2. EFECTELE INOCULĂRII CU AZOSPIRILLUM LA PLANTE
Inocularea cu Azospirillum poate avea ca rezultat o modificare semnificativă a unor parametri de creștere ai plantelor, fapt care poate sau nu să afecteze recolta. Majoritatea studiilor au fost realizate cu cereale, și doar foarte puține cu plante din alte familii. Cele mai evidente răspunsuri observate au fost: creșteri ale greutății uscate totale a plantelor, creșteri ale cantității de azot din tulpini și semințe, creșterea numărului de frați, inspicare și inflorire timpurie, creșterea numărului de spice si a numarului de seminte/spic, creșterea greutății semințelor, creșterea inălțimii plantelor și a mărimii frunzelor, mărirea ratei de germinație, o creștere marcantă a sistemului radicular, respectiv a lungimii și volumului rădăcinilor.
Din solurile aride din Iran au fost izolate și identificate 10 tulpini de Azospirillum care, in condiții de sera, cu sol steril, au determinat creșterea inălțimii, a greutății uscate a tulpinii și rădăcinii, ramificarea rădăcinii și, in general au imbunătățit sistemul radicular al hibrizilor de porumb și soiurilor de grâu cu care s-a lucrat. Majoritatea tulpinilor native au avut efecte mai bune asupra parametrilor biologici ai plantelor inoculate decât tulpinile străine utilizate ca standard (Rousta si col., 1998).
Efectul inoculării cu Azospirillum asupra creșterii totale a recoltei plantelor cultivate in câmp a fost, in general, de 10-30%, dar in câteva comunicări sunt date și valori extrem de mari, de 50-70%, in comparație cu martorii neinoculați. Chiar creșterile moderate, de până la 20% sunt considerate ca având valoare comercială pentru agricultura modernă, in cazul care se obțin in mod constant.
Efecte negative sau lipsa de efect a rezultatelor inoculării au fost rareori relatate (Albrecht și col.,1 981; Harris și col., 1989; Smith și col., 1984).
In 1985, Okon a evaluat rezultatul inoculării lui Azospirillum in experiențele efectuate in toată lumea și a tras concluzia că, in circa 65% din toate experiențele, rezultatele au fost pozitive. Creșteri de recoltă datorate inoculării cu Azospirillum au fost relatate in 75% din experimentele cu cereale, bumbac si legume (Bashan si col., 1989).
Semințele de orez germinate, tratate cu Azospirillum au generat plante mai inalte și mai viguroase decât cele provenite din semințe netratate, au avut o rată de supraviețuire la 100C in aer superioară și o coacere cu 3-5 zile mai timpurie (Chi și col., 1998).
Efectul tratamentului la Anacardia occidentale, in pepiniere cu Azospirillum, in momentul semănatului, comparativ cu plantele neinoculate și cu tratamentele cu alți biofertilizatori, au pus in evidență un efect de stimulare a răsăririi și a creșterii dar și de scădere a incidenței bolilor fungice (Kumar și col., 1998).
Rezultate diferențiate au fost obținute in ceea ce privește condițiile administrării biopreparatului in raport cu nivelul fertilizării cu azot. Astfel, Kapulnik și col.(1981), Lau-Wong (1987), Mertens și Hess (1984), O’Hara și col. (1987) au considerat inocularea cu Azospirillum ca un substitut parțial pentru fertilizarea cu azot, rezultatele cele mai bune fiind obținute in condițiile fertilizării suboptimale. Datele lui Bashan și col. (1989) sau ale lui Millet și Feldman (1986) arată că recolta a crescut și la inocularea in condițiile fertilizării cu niveluri mari de azot care, după Kolb si Martin (1988) poate influența numărul de bacterii din rizosferă.
In condiții tropicale, aplicarea tulpinii A.brasilense la cultura de batat, pe sol nisipos, pentru inlocuirea fertilizarii cu azot a aratat ca plantele au produs o recolta mai mare, au avut o creștere vegetativă mai viguroasă și un conținut de azot mai mare in rădăcini și frunze decăt cele neinoculate (Saad si col, 1998). In același experiment s-a pus in evidența necesitatea stabilirii compatibilității soi-tulpină bacteriana, precum și a aplicării inițiale de ingrășământ cu azot la 1/3 sau mai puțin din doza recomandata in scopul asigurării necesarului de azot până la inceperea activității asocierii planta-bacterie.
Una dintre problemele majore ale experimentarilor, o constituie identificarea căii de inoculare care sa aibe rezultate favorabile, constante și repetabile, de aceea impunându-se clarificarea: modului de acțiune al bacteriei ca favorizant de creștere al plantelor; interacțiilor și competiției lui Azospirillum cu alte microorganisme din rizosfera; modului cum sunt influențate supraviețuirea și activitatea bacteriei in rizosfera de către diferiți factori din mediu.
II.3.2.1. MODUL DE ACȚIUNE ASUPRA CREȘTERII PLANTELOR
Sunt implicate mai multe moduri de acțiune printre care:
fixarea azotului contribuind la aprovizionarea cu azot a plantei;
efecte hormonale, care alterează metabolismul și creșterea plantei;
imbunătațirea creșterii sistemului radicular având ca rezultat imbunatațirea aportului de nutrienți si apă;
activitatea nitrat reductazică care marește acumularea de azotat in plantele inoculate.
II.3.2.2. EFECTELE HORMONALE ALE BACTERIEI ASUPRA CREȘTERII PLANTELOR
Numeroase tulpini de Azospirillum produc hormoni vegetali in cultura lichida. Principalul hormon produs este acidul indolil-3-acetic (AIA). Alți hormoni, detectați in cantități mult mai mici dar la niveluri semnificative biologic au fost acidul indollactic, indol-3-butiric, indol-3-etanol, indol-3-metanol, compuși indolici neidentificați, mai multe gibereline, acid abscizic și citokinine.
Hormonii vegetali afectează capacitatea de fixare a azotului de către Azospirillum. La plantule, aplicarea externă de hormoni, sintetici sau purificați de la cultura bacteriana a reprodus in totalitate efectele bacteriei asupra dezvoltării și morfologiei rădăcinii. In mod special s-au observat modificări ale lungimii rădăcini, producerea mai multor peri radiculari și ramificarea perilor radiculari, producerea mai multor rădăcini laterale, mărirea ratei de diviziune celulară și deferențiere in țesuturile meristemice.
Inocularea cu Azospirillum a imbunătățit echilibrul hormonal al unei mutante de gr1u, defectivă hormonal. Cantități mai mari de IAA și IBA au fost identificate in rădăcinile de porumb inoculate comparativ cu plantele neinoculate. Aceste rezultate sugerează implicarea indirectă a lui Azospirillum in reglarea hormonală a plantei.
II.3.2.3. FIXAREA AZOTULUI
Toate tulpinile sălbatice de Azospirillum fixează cu eficacitate azotul atmosferic fie ca bacterii libere, fie in asociere cu plantele și iau parte la unele reacții din ciclul azotului. Ca urmare a inoculării apare o creștere a azotului total in lăstarii i semințele plantelor inoculate. Prin urmare, fixarea de azot este primul mecanism important de acțiune care imbunătățește creșterea plantelor.
Incorporarea de azot atmosferic in planta gazdă a fost evaluată prin testul de reducere al acetilenei și prin utilizarea izotopului 15N2. Dovada că fixarea azotului contribuie la echilibrul azotului in plante se bazează pe observația banală a creșterii activității nitrogenazice in rădăcinile inoculate (Rao și Rajaamamohan Rao, 1983; Yahalom și col., 1984).
Această activitate enzimatică este suficient de mare a fi luată in considerare ca responsabilă de creșterea azotului total in recolta plantelor inoculate, dacă se consideră că tot azotul fixat este incorporat in plante (Sarig și col.,1984; Mertens si Hess, 1984). De asemenea, s-a arătat că niveluri mici sau chiar neglijabile de activitate nitrogenazică au apărut in plante care au răspuns pozitiv la inoculare (Venktewarlu și Rao, 1983). Cantitatea de azot fixată determinată nu explica creșterea conținutului de azot total din plantele inoculate.
II.3.2.4. IMBUNĂTĂȚIREA DEZVOLTĂRII RĂDĂCINII
Pe lângă creșterea sau scăderea multor parametri radiculari, inocularea plantelor cu Azospirillum afectează numeroși parametri foliari. Aceste modificări au fost atribuite direct efectelor bacteriene pozitive asupra absorbției de substanțe minerale de către planta: activitatea nitrat reductazică care mărește acumularea de azotat in plantele inoculate.
Absorbția mărită de substanțe minerale se crede că ar fi datorată unei măriri generale de volum a sistemului radicular și nu unui mecanism specific de creștere a absorbției de ioni. S-a sugerat că inocularea cu Azospirillum poate favoriza posibilitatea ionilor de a deveni accesibili in sol, ajutănd planta să evite limitarea nutrienților. Acest lucru poate explica acumularea de compuși cu azot in plantă fără vreo fixare aparentă de azot. Planta poate absorbi azotul mai eficient de la sursele limitate din sol, avănd ca rezultat, pentru a atinge o anumită recoltă, o micșorare a cerințelor de fertilizare cu azot. Dovada care susține creșterea absorbției minerale de către rădăcinile inoculate e furnizată de creșterea activității de eflux protonic a rădăcinilor de grâu inoculate cu Azospirillum.
In afară de absorbția imbunătățită de substanțe minerale, inocularea cu Azospirillum a imbunătățit starea hidrică in plantele de sorg stresate. Plantele inoculate au fost mai puțin stresate hidric, avănd mai multă apă in foliaj, un potențial hidric foliar mai mare și o temperatură a foliajului mai mică decât plantele neinoculate. Extracția totală de umiditate din sol de către plantele inoculate cu Azospirillum a fost mai mare, iar apa a fost extrasă din apele mai adănci din sol. Prin urmare, recolta de sorg a crescut la plantele inoculate, fapt atribuit, in principal, utilizării imbunătățite a umidității solului (Sarig și col., 1988). Este probabil ca absorbția imbunătățită de substanțe minerale și apa are un rol vital in asocierea Azospirillum-plantă.
II.3.2.5. EFECTELE INOCULARII ASUPRA DEZVOLTARII RADACINILOR
Cele mai importante efecte ale inoculării cu Azospirillum la plante sunt modificările morfologice ale sistemului radicular. S-a constatat că aceste modificări sunt legate de nivelul concentrației inoculului, respectiv că, depășirea nivelurilor optime are efect inhibitor, iar dozele suboptimale nu au efect. Nivelul optim stabilit pentru inocularea semințelor sau plantulelor multor cereale, legume și plante industriale este 105-106 ufc/ml, pentru porumb 107 ufc/ml, pentru tomate in vitro mai mult de 108 ufc/ml.
Efectele pozitive ale inoculării au fost demonstrate cu privire la:
– creșterea in lungime a rădăcinii, in special a zonei de elongație;
– creșterea numărului și lungimii rădăcinilor laterale;
– creșterea numărului și densitații, precum și apariția timpurie a perilor radiculari;
– creșterea suprafeței radiculare;
– intensificarea diviziunii celulare in meristemul radicular;
– modificări ale aranjamentului celulelor in cortex;
– stimularea exudării radiculare.
Ca urmare a studiilor efectuate, s-a emis ipoteza că modificarile morfologice la nivelul sistemului radicular al plantelor in sensul creșterii volumului acestuia, duc in final, la creșterea recoltei.
II.3.2.6. COLONIZAREA RĂDĂCINILOR
Azospirillum este un colonizator atât extern cât și intern al rădăcinilor. In forma de colonizare externă, bacteria poate fi gasită sub forma de mici agregate, dar și ca celule izolate. Pot fii colonizate atât rădăcinile vii cât și cele moarte. La colonizarea interna, celulele bacteriene pot penetra in spațiile intercelulare radiculare. Studiile de microscopie electronică au arătat că bacteriile de la suprafața rădăcinilor sunt conectate cu rădăcina și unele de altele, printr-o rețea de material fibrilar, de natură proteică.
Atașarea prin fibrile de natură bacteriană depinde de metabolismul bacteriei și explică de ce colonizarea este realizată numai de celulele vii. Atașarea lui Azospirillum la suprafața rădăcinii apare rapid, in câteva secunde sau minute de expunere a materialului vegetal. Majoritatea zonelor colonizate devin saturate in două ore după inoculare, in funcție de tulpină și faza de creștere a bacteriei (Eyers și col, 1988). Unul dintre mecanismele sugerate ca fiind implicate in legarea bacteriilor la rădăcini il constituie legarea prin lectine, presupunându-se că aglutininele pot fi localizate in materialul fibrilar și ajută la ancorarea celulelor.
Modul de colonizare al rădăcinii poate să varieze in funcție de tulpina de Azospirillum, specia de planta, condițiile de mediu și alți factori. Interacția intre aceste variabile crează diferite grade și modele de colonizare, diferite mărimi ale populației și diferite locuri de colonizare.
CAPITOLUL III. MATERIAL ȘI METODE
III.1. IZOLAREA UNOR TULPINI BACTERIENE DIN GRUPUL RHIZOBIUM
Grupul Rhizobium face parte din familia Rhizobiaceae. Acesta cuprinde celule fară endospori, de formă bacilară, in stadiile tinere. Sunt microorganisme aerobe gram negative, utilizează numeroase substanțe hidrocarbonate, și produc, in cursul creșterii, un bogat exudat polizaharidic. Toate speciile incită hipertrofii corticale, tulpinale sau radiculare, fapt care constituie specificitatea de gen. Toate speciile fixează azotul liber, nu utilizeaza citratul și nu produc 3-ketolactaza, caracteristici care au fost utilizate pentru a deosebi genul Rhizobium de genul Agrobacterium. Bacteriile cresc bine pe medii lipsite de surse de azot. Grupul Rhizobium a fost iniția clasificat în funcție de ritmul de creștere pe mediul cu extract de drojdii în doua genuri: genul Rhizobium (ex. Rhizobium leguminosarum), cu creștere rapidă și flageli peritrichi și genul Bradyrhizobium (ex. Bradyrhizobium japonicum), cu creștere lentă și un flagel polar sau subpolar.
Studiile de biologie moleculară au determinat reclasificarea grupului Rhizobium și apariția unor noi genuri: Azorhizobium, Mesorhizobium, Ensifer / Sinorhizobium. La modul general continuă să se folosească pentru toate aceste genuri apelativul comun de rhizobii (cași denumirea generică de Rhizzobium), delimitând speciile de procariote care, în regiunile temperate, formează in mod obișnuit nodozități la plantele leguminoase. Din aceste nodozități bacteriile pot fi izolate.
Metodologia de izolare a speciilor de Rhizobium se orientează în primul rând după obiectul de la care se pornește – solul sau nodozitățile radiculare. În cazul izolării din sol, se prepară un extract de sol dintr-o suspensie de 1:1 000. Un mediu nutritiv eficient pentru Rhizobium se suplimentează cu o soluție de cristal violet foarte diluată (1: 80 000), în vederea inhibării dezvoltării bacteriilor Gram pozitive și a actinomicetelor. Mediul nutritiv se repartizează în tuburi cu capilar subțire care, ulterior, se introduc în extractul de sol. Speciile de Rhizobium se retrag în tuburile capilare. Din masa de Rhizobium astfel obținută, se inoculează o anumită cantitate pe mediul nutritiv suplimentat cu cristal violet. Prin inoculări repetate și analizate la microscop, se obțin, în final, culturi pure de Rhizobium.
Prelevarea probelor de nodozități trebuie să se efectueze de la plante pe cât posibil sănătoase, de pe terenuri netulburate. Este esențială descrierea și marcarea locului din care se ridică materialul biologic ce urmează să fie analizat. Numărul nodozităților necesare variază în funcție de scopul prelevarii. În general, sunt suficiente 15-20 nodozități/plantă culese din regiunea de vârf a sistemului radicular principal. Prelevarea nodulilor poate varia in funcție de specie astfel că, speciile stolonifere pot să aibă nodozități dispuse pe rădăcinile adventive situate la 1-2 cm de la suprafață, iar la speciile de plante lemnoase, nodozitățile pot fi așezate în sol la adâncimi mai mari, la o anumită distanță de la trunchiul copacului.
La experimentele de izolare pe care le-am realizat, s-au folosit nodozități provenite de pe rădăcinile unor specii de plante leguminoase, au fost dezinfectate prin imersie in acool etilic 60%, timp de 2 minute. Apoi au fost imersate in cloramină 1%, dupa care s-au spălat de trei ori in apa distilată sterilă.
După dezinfectare, nodozitățile au fost mojarate in căteva picături de ser fiziologic steril. Din suspensia obținută in urma mojarării se ia o incărcătură microbiana si se insămanțează pe plăci Petri cu mediul Lazareva agarizat, prin tehnica de epuizare a ansei. Coloniile izolate au fost repicate de 3 ori pentru asigurarea puritații izolatelor.
Componentele mediului de creștere Lazareva sunt urmatoarele:
– manitol – 10 g/l,
– K2HPO4 – 0,5 g/l,
– MgSO4x7H2O – 0,2 g/l,
– NaCl – 0,2 g/l,
– CaSO4 – 0,1 g/l,
– MnSO4 – 0,005 g/l,
– (NH4)2MoO4x 2H2O – 0,002 g/l
– extract de drojdii – 1 g/l,
– agar-agar – 20 g/l,
– 1000 ml apa distilată;
pH-ul mediului este 6,8; mediul se sterilizează prin autoclavare la 0.8 atm timp de 20 de minute.
III.1.1 URMĂRIREA DEZVOLTĂRII CULTURII IN MEDIUL LICHID
Izolatele din nodozități, dupa purificare, au fost inoculate in flacoane cu mediu Lazareva lichid, si incubate la 30°C timp de 7 zile, in condiții de aerare. Experiența a fost organizată in 3 repetiții, fiecare variantă cuprinzănd trei flacoane/tulpina bacteriană.
La 4 si 7 zile s-au facut observații asupra nivelului de creștere. Pentru aceasta, s-au centrifugat 30ml suspensie bacteriană timp de 15 minute la 5000 rpm. Supernatantul a fost indepartat, iar sedimentul – biomasa umedă a fost cantărit. Rezultatele au fost extrapolate la 1l de mediu.
III.1.2. ESTIMAREA NUMĂRULUI DE MICROORGANISME
S-a făcut prin tehnica unităților formatoare de colonii. Probele prelevate aseptic au fost diluate serial (x 10), iar diluțiile 10-7 , 10-8, si 10-9 au fost inoculate pe plăci Petri cu diametrul de 9 cm, conținând mediul Lazareva agarizat. S-au numarăt numai plăcile care au între 30 și 100 colonii pe placă.
III.2. CARACTERIZAREA UNEI TULPINI DE RHIZOBIUM CU MICROSISTEMUL BIOLOG
Pentru identificarea taxonomică și caracterizarea tulpinilor microbiene izolate din diverse medii sunt realizate în prezent studii detaliate, folosindu-se biologia moleculară a acizilor nucleici (procent molar de guanină + citozină in ADN cromozomal, polimorfismul fragmentelor de restricție pe ADN cromozomal, profilul plasmidial si tiparul polimorfic al fragmentelor rezultate în urma tratării cu enzime de restricție, amplificarea specifică a genei care codifică pentru ARN ribozomal de 16S și secvențializarea acestei enzime etc.), alte tehnici chemotaxonomice (tiparul electroforetic al proteinelor totale sau al unor forme moleculare multiple ale enzimelor, profilul acizilor grași membranari, profilul micosterolilor, spectrul de glicolipide membranare etc.) și testele caracterizare fenotipică.
Până în deceniul șapte al secolului trecut clasificarea bacteriilor se realiza doar prin folosirea informațiilor fenotipice – caracteristicile morfologice, structurale, fiziologice si biochimice ale tulpinilor de microorganisme studiate. Incepând cu anii 80 ai secolului trecut au luat o amploare deosebită cercetările de caracterizare a bacteriilor la nivel molecular, cristalizându-se în final taxonomia moleculară, care se bazează în mod special pe informații genotipice ( și în primul rând pe secvențierea genelor care codifică molecule de 16s ARN ribozomal).
Informațiile genotipice nu sunt însă foarte relevante din punct de vedere al utilizării practice, unde esențiale sunt caracteristicile fenotipice ale bacteriilor. Din acest motiv la jumătatea deceniului trecut s-a argumentat in favoarea unei abordări de tip integrator în ceea ce privește identificarea și încadrarea taxonomică a tulpinilor bacteriene, descriindu-se taxonomia polifazică (Vandamme, 1996). In cadrul acestui sistem integrativ taxonii bacterieni sunt definiți pe baza informațiilor obținute de diverse discipline, reunind astfel atât date fenotipice (cunoscute ca făcând parte din taxonomia convențională), cât și date de nivel molecular (date de biologia moleculară menționate mai sus, dar și date derivate din abordările moleculare integrative de tip –omică: transcriptomică, proteomică, metabolomică.
Pentru reducerea volumului considerabil de muncă, materiale și timp necesar realizării testele utilizate pentru caracterizarea fenotipică a microorganismelor au fost propuse o serie de micrometode integrate unor seturi standardizate, larg accesibile comercial (kit-uri microtest). S-a deschis astfel calea unei standardizării internaționale a testelor de fiziologie microbiana, astfel că rezultatele obținute sunt comparabile de la un laborator la altul. Pe plan mondial s-au impus 2 sisteme microtest pentru determinări fiziologice / biochimice necesare caracterizării fenotipice a bacteriilor:
– Sistemul API, produs de compania Biomerieux din Franta,a aparut pe piața in anul 1970, revoluționând lumea bacteriologiei. Sistemul API cuprinde benzi cu diferite teste biochimice și baze de date necesare identificării și caracterizării bacteriilor. Api cuprinde 15 sisteme de identificare acoperind practic toate grupele de bacterii și peste 600 de specii diferite.Testele biochimice de identificare și caracterizare se realizează pe baza reacțiilor de culoare, ce apar ca urmare a metabolismului bacteriilor de testat ce se inoculează.
Kiturile Api sunt ușor de folosit și interpretarea rezultatelor se face rapid,după 18-24 ore de la aplicarea suspensiei bacteriene pe benzi.
Fig.4. Benzi Api
– Sistemul Biolog, produs de compania americana Biolog Inc., a aparut pe piață in 1989. Sistemul utilizeaza microplăci de titrare cu 95 de godeuri in care exista diferite surse de carbon impreuna cu un colorant tetrazolic, care in urma exprimării metabolismului bacterian formează un precipitat violet, generănd astfel reacția de culoare. Există diferite tipuri de microplaci: GN2, GN2-Ent, GP, YT, s.a.,iar tiparele de amprentare metabolică sunt comparate și identificate folosind softul bazei de date Microlog . Citirea prealabila a plăcilor se poate face cu un reader automat sau se poate realiza o citire manuală.
In cadrul proiectului, pentru caracterizarea fenotipică a tulpinilor bacteriene s-a folosit microstația Biolog, existentă in dotarea laboratorului de microorganisme utile din cadrul ICDPP.
Protocolul de lucru a fost urmatorul:
S-a insămanțat pe mediul special BUG (Biolog Universal Growth) repartizat in plăci Petri, una din culturile izolate anterior si s-a lăsat la incubat 16-24 ore la 30°C.
S-a calibrat Biologul, apoi, din placa Petri s-a pelevat cu o ansă sterilă de unică folosință puțină masă bacteriană si s-a omogenizat in lichidul de inoculare specific (pentru bacterii gram negative). S-a omogenizat masa bacteriană până când lichidul inoculat a atins o turbiditate standard, specifică de asemenea tipului gram negativ. Operațiunea s-a realizat cu atenție, și s-a verificat după fiecare omogenizare turbiditatea lichidului inoculat la Biolog. După ce s-a atins turbiditatea corespunzătoare lichidul inoculat s-a turnat intr-o cuvă sterilă, de unde, cu o micropipetă s-a insămănțat microplaca GN Biolog cu căte 150 µl suspensie in fiecare godeu.
Placa se incubează 4-6 ore sau 16-24 ore si apoi se realizeaza citirea manuală sau automată, cu cititorul plăci.
Interpretarea rezultatelor s-a facut cu ajutorul softului bazei de date specifice pentru gram negative Microlog.
Fig.5. Sistemul Biolog – aparatul ce măsoară turbiditatea inocului.
Fig.6. Sistemul Biolog – Cititorul automat de plăci
III.3. CREȘTEREA RHIZOBIILOR PE DIFERITE MEDII
Cultivarea microorganismelor pe medii lichide, aerate și agitate are deja o lungă tradiție, iar experiența obtinută in devzoltarea și optimizarea proceselor de biosinteză este deseori folosită pentru accelerarea realizării tehnologiilor de obținere a biopreparatelor cu rhizobii.
Provenind din microbiocenoze complexe si solicitante, rizobiile din biopreparate prezintă uneori specializări metabolice care, folosite in scopuri tehnologice pot conduce la soluții inovatoare.
Intre aceste specializări metabolice utile din punct de vedere tehnologic se inscrie și capacitatea de a utiliza produșii de metabolism ai altor microorganisme, capacitate care a fost folosită pentru a crește bradyrizobii pe melase fermentate cu drojdii.
Inițial, in această etapă a proiectului s-au cultivat bacteriile izolate pe mediile Fred si Waksman, Bond, Van Schreven, Vincent, Burton, Wright, si Lazareva, in vederea stabilirii necesităților nutriționale și a surselor de nutrienți.
pH-ul mediilor a fost ajustat la valoarea 7 cu NaOH respectiv HCl 0,1N. Flacoanele cu mediu au fost sterilizate 20 de minute la autoclav la 121 C. Experiența a fost organizată in trei repetiții, fiecare variantă cuprinzănd trei flacoane de mediu cu tulpina bacteriană.
După ce au fost inoculate flacoanele s-au incubat la 30°C, iar observațiile privind creșterea bacteriilor s-au efectuat după 4 si 7 zile de la inoculare. S-a notat densitatea optică a creșterii bacteriene in mediul de cultură.
Tabel 3. Compoziția mediilor de cultură pentru bacteriile din genul Rhizobium
III.3.1. CULTIVAREA BACTERIILOR DIN GRUPUL RHIZOBIUM PE MEDIU HIDROGELIFIAT
A fost elaborat in cadrul acestei etape a proiectului un model experimental, care a presuspus incercarea de cultivare a rizobiilor pe un hidrogel superabsorbant numit Aquasorb.
Acesta este un fixator de apă care, atunci cănd este incorporat in sol sau in substrat, absoarbe cantități mari de apă si nutrienți. Spre deosebire de majoritatea produșilor care se hidratează, Aquasorb are proprietatea de a elibera ușor apa absorbita și nutrienții, in acest fel permițând plantei să aiba apă și nutrienții disponibili, funcționând in cicluri absobție-eliberare de apă. Produsul are proprietatea de a absorbi de 500 de ori greutatea lui in apă.
Fig.7. Formarea rețelei de hidrogel
Ca materiale s-au folosit pungi urinare cu evacuare sterile, Aquasorb, mediu Lazareva lichid, compresor.
Procedura a fost relativ simplă, in pungile urinare, sterilizate in prealabil s-au introdus cate 4 g de hidrogel. Pungile au fost ambalate apoi individual precum și căte 4. După dubla ambalare a acestora, produsele au fost trimise la sterilizat .
Sterilizarea s-a realizat cu radiații γ, la instalația IRASM, din cadrul IFIN-HH, la o doza de >25 kGy, timp de 37h 36min.
După sterilizare, in pungile urinare s-au introdus câte 300 ml de mediu Lazareva lichid. După ce s-a gonflat hidrogelul, pungile au fost inoculate cu tulpinile rhizobiene. Pentru asigurarea unor condiții de aerare corespunzătoare, cu ajutorul unui compresor probele trebuie gonflate cu aer steril. Astfel prelucrate probele au fost puse la incubat la 27ºC, 4 zile.
III.4. VERIFICAREA PĂSTRĂRII CARACTERISTICILOR BIOLOGICE ALE RHIZOBIILOR
S-a realizat in această etapă verificarea menținerii caracteristicilor biologice ale tulpinii Rhizobium leguminosarum FL20, prin reproducerea infectiei la nivel de laborator.
Peste culturile bacteriene de pe mediul agarizat s-a adaugat apă distilată sterilă in vederea obținerii unei suspensii cu titrul de 106 ufc/ml. Cu această suspensie bacteriana s-au tratat semințe de fasole. Semințele au fost imediat semănate in vase de vegetație și depozitate in camera de creștere. La faza fenologică optimă de formare a nodozităților au fost recoltate cate 5 plantuțe din fiecare vas pentru a stabili caracterul infecțios al tulpini. S-au realizat izolările și s-a evidențiat prezența tulpinii cu care au fost inoculate semințele de fasole.
III.5.ELABORAREA UNUI MODEL EXPERIMENTAL PENTRU DETERMINAREA FENOMENULUI STINGERII DE QUORUM SENSING LA BACTERIILE PGPR
Mecanismul QS regleaza sporularea, sinteza de antibiotic, induce factorul de virulența, diferențierea celulară și fluxul de nutrienți, compețența patogenică etc.
La densități mici ale populațiilor se produce un nivel scăzut de AHL. Cănd densitatea celulelor crește, având tendința de a forma un film biologic invaziv, AHL produs in cantitate mare se acumulează in mediu și, când se atinge concentrația criticâ, difuzează in celule legându-se la receptorul specific fapt care duce la activarea sau represia exprimării genelor care determină competența ecologica a bacteriilor.
Dat fiind rolul important pe care acest fenomen il are in interactiile patogene (Loh si col., 2002), inactivarea sau degradarea moleculelor AHL constituie o cale inovativă de modulare a acțiunii agroinoculanților.
Ca metodă pentru modelul experimental propus, s-a folosit un procedeu de evidențiere a moleculelor de AHL, secretate de unele tulpini bacteriene, cu ajutorul unor bacterii biosenzor, de tipul Chromobacterium violaceum CV026.
Chromobacterium violaceum este o bacterie Gram negativă, nesporulantă, facultatuv anaerobă, care trăiește în solurile și apele din zona tropicală și subtropicală ale globului. Pe mediile de cultură (ex. nutrient agar, MacConkey agar etc.) C. violaceum formează colonii ușor convexe, netede, de culoare violet-întunecat, care este datorată producerii unui pigment violet insolubil în apă, numit violaceină.
Unele tulpini ale speciei C. violaceum sunt patogene, cauzând infecții piogenice sau septicemice la mamifere, incluzând și omul. Totodată violaceina are efecte antibiotice, antitumorale și activitate anti-Trypanosoma cruzi.
Fig.8. Colonii de Chromobacterium violaceum ATCC 31532
Pornind de la studiul literaturii, au fost elaborate modele experimentale pentru evidențierea sensibilității de grup la bacteriile fixatoare de azot și la populațiile bacteriene cu acțiune de favorizare a creșterii plantelor.
Modelele experimentale elaborate au implicat folosirea unor bacterii biosenzor, aplicate într-un al doilea strat de agar care este depus peste bacteriile de testat inoculate în striuri ale mediului agarizat specific.
Tulpinile bacteriene folosite în cadrul experimentelor preliminare asociate elaborării modelelor experimentale pentru evidențierea sensibilității de grup sunt prezentate in tabelul 4.
Tabel 4. Lista tulpinilor utilizate în cadrul experimentelor preliminare asociate elaborării modele experimentale
Tulpinile biosenzor au fost cultivate pe mediul agarizat Luria Bertani (LB) cu următoarea compoziție: 10g bactotriptona; 5g extract de drojdii; 10g NaCl; 20g agar-agar; pH 7.2, sterilizat 20 minute la 121 OC.
Tulpinile din grupul Rhizobium s-au cultivate pe mediu Lazareva cu următoarea compoziție: manitol – 10 g/l, K2HPO4 – 0,5 g/l, MgSO4x7H2O – 0,2 g/l, NaCl – 0,2 g/l, CaSO4 – 0,1 g/l, MnSO4 – 0,005 g/l, (NH4)2MoO4x 2H2O – 0,002 g/l extract de drojdii – 1 g/l, agar-agar – 20 g/l, pâna la 1000 ml apa distilata; pH 6,8.
Culturile de Pseudomons sp. si Bacillus sp. au fost crescute pe mediu PDA , pH 6.8-7.0, sterilizat 20 minute la 121 OC.
Fig. 9. Procedura de determinare prezenției mecanismului de quorum sensing
Pentru realizarea stratului superior de acoperire care contine tulpina senzor CV 026, s-a preparat un mediu LB semisolid prin adaugare de 0.5% (g/v) agar. In cazul în care s-a folosit ca tulpină indicator Agrobacterium tumefaciens WCF47 în mediu agarizat s-au adăugat și 80 g/ml X-gal. Un rezultat QS pozitiv a fost indicat de prezența pigmentarii microorganismului indicator in vecinatatea organismului testat.
Biotestul pentru evidențierea QS a fost realizat conform procedurii descrise in figura 9. In centrul plăcii petri cu mediu agarizat s-au însămânțat bacteriile test sub forma unor striuri. Plăcile au fost incubate peste noapte, la 300C pentru a ajunge in faza staționară de creștere. Peste creșterea bacteriană, in placa petri s-a realizat un al doilea strat de mediu LB semisolid, racit la 450 C . In acest strat a fost practicat al doilea striu, perpendicular pe direcția primelor bacterii, în care s-au inoculat 50 µl de suspensie de bacterii biosenzor cu titrul de 109 ufc/ml. S-a incubat peste noapte la 300 C si s-a examinat pentru aparitia culorii (violete în cazul bacteriei Chromobacterium violaceum 026 ; albastre la Agrobacterium tumefaciens WCF47). S-a apreciat ca rezultat pozitiv, respectiv producere de AHL, prezența culorii in jurul striului de creștere bacteriană.
Pentru evidențierea tulpinilor cu activitate de stingere a cvorumului a fost elaborată o modificare a metodei descrise mai sus, care a constat in lăsarea in prealabil a unui interval de timp, in care posibilele enzime care degradează AHL, sintetizate de tulpinile cu capacitate de modulare a QS, să aiba timp să acționeze asupra moleculei semnal produsă de tulpinile de agroinoculanți.
In placa petri cu mediu Luria Bertani, au fost realizate godeuri cu diametrul de 6 mm, asezate in perechi la distanta de 10mm. Plăcile au fost incubate peste noapte la 300 C, după care s-a realizat al doilea strat cu tulpina indicator și s-a reluat o incubare de 16 ore, moment in care s-a apreciat apariția culorii datorată prezenței moleculelor de AHL nedegradate in mediu.
După incubarea peste noapte, bacteriile biosenzor din cel de-al doilea strat au dezvoltat o reacție de culoare specifică. In cazul bacteriilor cu activitate de favorizare a creșterii și dezvoltării plantelor (din genul Bacillus) s-a folosit ca bază, tulpina indicator / biosenzor Chromobacterium violaceum Cv 026, evidențiindu-se producerea de violaceină, iar în cazul bacteriilor din grupul Rhizobium s-a folosit ca indicator, tulpina de Agrobacterium tumefaciens WCF47. Moleculele de N-acil-homoserin-lactonă, AHL, au fost detectate prin reacția cromogenică a -galactozei raportor cu substratul X-gal, care generează o culoare albastră.
III.6. CARACTERIZAREA UNOR TULPINI DE RHIZOBIUM CE PREZINTĂ ACTIVITATE ACC DEAMINAZICĂ ȘI CARE NODULEAZĂ FASOLEA
Fasolea este una plantele leguminoase care formează nodozități fixatoare de azot cu mai multe specii din genul Rhizobium (R. leguminosarum bv. phaseoli; R. giardinii bv. phaseoli; R. gallicum bv. phaseoli; R. lusitatum; R. etli; R. tropici; R. mongolese).
Unele din tulpinile care nodulează fasolea prezintă o activitate semnificativă a ACC-deaminazei. Acidul 1-aminociclopropan carboxilic (ACC) este precursorul biosintetic al etilenei, iar etilenă (și implicit ACC) exercită (pe lânga alte efecte inhibitorii) și un semnficativ efect de reducere a formării nodozităților plantelor. Producerea de ACC-deaminază reprezintă una din căile utilizate de bacterii pentru creșterea numărului de nodozități. Datorită producerii de ACC-deaminază și de fitohormoni aceste tulpini de Rhizobium au și o acțiune semificativă de stimulare a creșterii plantelor neleguminoase, cum sunt ar fi de exemplu cele din familia Brassicaceae (Noel și. col, 1996) sau Poaceae (Matiru și Dakora, 2004).
Experimentul și-a propus identificarea și caracterizarea fenotipică prin microsistemul Biolog a unor tulpini de Rhizobium care nodulează fasolea și care prezintă activitate ACC deaminazică.
S-a procedat la izolarea unor noi tulpini de Rhizobium specifice pentru Phaseolus vulgaris prin tehnica diluțiilor asociată tehnicii capturii pe rădăcini de măzăriche păroasă. 1 g de sol s-au omogenizat cu 99 ml sol fiziologic sterilizat prin autoclavare. Din omogenizat s-au prelevat 0,1 ml care au fost diluați aseptic. Din diluțiile zecimale s-au prelevat 0,1 ml care au fost depuși pe rădăcinile unei plantule rezultate din semințe de Vicia villosa sterilizate la suprafață prin spălări succesive cu hipoclorit 2%, alcool etilic 30% și apă distilată sterilă.
Semințele sterilizate au fost germinate pe apă agarizată. Plantulele inoculate au fost cultivate apoi în vase de vegetație cu mediu semiagarizat lipsit de azot. Nodulii formați au fost reluați, s-au separat cei de culoare roz, care au fost sfărâmați aseptic în ser fiziologic steril. Din suspensia rezultată s-au realizat diluții zecimale. Din diluții s-au prelevat 0,1 ml, care au fost răspândite uniform pe suprafața unui mediu manitol – roșu de Congo. Coloniile de Rhizobium au fost identificate prin culoarea roz formată (spre deosebire de contaminanți care preluau tot roșul de Congo) și purificate prin pasaje repetate pe mediu Lazareeva.
Tulpinile izolate au fost testate în privința eficacității fixării azotului prin determinarea numărului de nodozități formate pe plantele test. Ca tulpină etalon s-a folosit tulpina de Rhizobium leguminosarum bv. phaseoli FL 220.
Pentru izolarea bacteriilor s-a folosit mediul manitol (YEM) – roșu de Congo, cu următoarea compoziție: extract de drojdie: 0,2 g; manitol: 10 g; NaCl 0.1 g; 0.01g CaCO3; roșu de Congo 2,5 ml dintr-o soluție 1%, 15 g agar apă până la 1000ml.
Tabel 5. Soluția nutritivă Crone modificată de Bryan (soluție nutritivă fără azot), utilizată pentru cultivarea plantelor inoculate cu rhizobii.
Tabel 6. Soluția de oligo și microelemente care se adaugă la soluția Crone
Mediul agarizat fără azot pe care au fost cultivate plantulele de măzăriche păroasă a fost mediul nutritiv Crone modificat de Bryan (Hewit, 1965), a cărui formulă este prezentat în tabelul 5 (macroelemente nutritive), la care se adaugă 5 ml/l din soluția de (oligo și microelemente nutritive) prezentată în tabelul 6 și se agarizează cu 10 g/l.
Pentru cultivarea in laborator a bacteriilor din genul Rhizobium s-a utilizat mediul Lazareva având urmatoarea compozitie: 10 g manitol, 0,5 g K2HPO4, 0,2 g MgSO4x7H2O, 0,2 g NaCl, 0,1 g CaSO4 , 0,005 g MnSO4 , 0,002 g (NH4)2MoO4x 2H2O, 1 g extract de drojdii, 20 g agar-agar, 1000 ml apa distilata; pH 6,8.
Mediul de cultură special folosit pentru selectarea rhizobiilor cu activitate ACC deaminazica este mediul DF, cu următoarea compoziție: glucoza 2g/l, acid gluconic 2g/l, acid citric 2g/l, KH2PO4 4g/l, MgSO4 0.2g/l, NaCl 0.1g/l, pH 6.8, solutie micronutriente 10 ml , Agar 18g/l.
Soluția micronutriente: CaCl2 200mg/l, FeSO4 200mg/l, H3BO3 15mg/l,
ZnSO4 20mg/l, Na2MoO4 10mg/l, KI 10mg/l, NaBr 10mg/l, MnCl2 10mg/l, CoCl2 5mg/l, CuCl2 2mg/l, AlCl3 2mg/l, NiSO4 2mg/l.
Determinarea încadrării taxonomice a rhizobiilor izolate. S-a realizat cu ajutorul sistemelor microtest Biolog. Plăci Petri cu mediu special BUG (Biolog Universal Growth), au fost inoculate cu tulpinile de testat, izolate anterior din nodulii de pe rădăcinile de Vicia Villosa. Plăcile au fost incubate peste noapte la termostat la 28°C. După 24 de ore, au fost inoculate microplăcile GN astfel: din fiecare placă s-au prelevat cu anse sterile, de unică folosință, cantitătăți mici de masă bacteriană, care au fost omogenizate in flacoane cu lichid de inoculare, specific tipului gram negativ. Turbiditatea lichidului s-a verificat la Biolog după fiecare omogenizare, până la atingerea valorii 52 de unități. Cu o micropipetă, s-au insămânțat căte 150 µl suspensie in microplăcile GN,apoi au fost lăsate la incubat 16-24 ore. Citirea plăcilor s-a facut la microstația Biolog iar interpretarea rezultatelor s-a realizat cu ajutorul softului bazei de date pentru bacterii gram negative de la Microlog.
Identificarea tulpinilor de Rhizobium cu activitate ACC-deaminazică . S-au realizat suspensii bacteriene pentru fiecare tulpină de testat. S-a luat 1 ml suspensie și s-a transferat in 50ml mediu DF broth suplimentat cu 2g/l sulfat de amoniu ca sursa de azot. S-a lasat la incubat timp de 24 ore la 30°C.
Apoi s-a transferat 1 ml in 50ml mediu DF broth suplimentat cu 0.3033 ACC ca sursă de azot, si s-a incubat din nou 24 ore la aceeași temperatură.
Diluții din ultima cultură au fost etalate pe placi petri cu mediu DF solid suplimentat tot cu ACC, plăcile s-au incubat 48 ore la temperatura camerei.
S-au prelevat coloniile izolate și apoi s-a facut testarea proprietăților de favorizare a creșterii plantelor.
Evidențierea proprietăților de stimulare a creșterii plantelor s-a realizat prin biotestarea efectului fitostimulator al tulpinilor bacteriene asupra rădăcinilor de rapită și prin eficiența formării de nodozități la plante de fasole.
Biotestarea in vitro a efectului fitostimulator al biopreparatelor utilizate pentru stimularea creșterii plantelor. Semințele de rapiță (cv. Triangle) au fost sterilizate la suprafață prin metoda descrisă de Dobbelaere et al. (1999), prin spălări repetate cu Domestos (Unilever South-East Europe) și clătiri cu apă distilată. Semințele astfel dezinfectate au fost plasate pe discuri de hârtie de filtru sterile (depuse în plăci Petri 9 cm) și umectate cu 1,5 ml de apă sterilă. După 24 ore de incubare la întuneric la 25°C semințele / achenele au fost inoculate cu 0,1 ml suspensie de bacterii în tampon fosfat salin steril. Martorul a fost tratat cu tampon fosfat steril. După 72 de ore de incubare la întuneric a fost măsurată lungimea rădăcinilor.
Teste de formare a nodozităților. Testele biochimice de caracterizare fenotipică au fost completate cu teste de determinare a reacției diferitelor plante test (din familia leguminoaselor) la inoculare. S-a testat eficiența de formare a nodozităților de către izolatele bacteriene la plante de fasole, linte și naut. Semințele sterilizate au fost bacterizate cu suspensii bacteriene ale tulpinilor testate, apoi au fost semănate in vase de vegetație, in nisip sterilizat la etuvă. După 28 de zile, s-a realizat determinarea activității nitrogenazice cu ajutorul aparatului Qubbit (care determină hidrogenul produs de nitrogenază.
III.7.ESTIMAREA EFICACITĂȚII FIXĂRII SIMBIOTICE A AZOTULUI PRIN DETERMINAREA HIDROGENULUI
Ca și fotosinteza, fixarea N2 este un fundamental proces biologic esențial in ciclul global al nutrienților. Biologic, fixarea azotului in plantele leguminoase necesită dezvoltarea unei simbioze intre bacteria din sol si radacina plantei. Cea mai comună endosimbioză găsită in rădăcinile leguminoaselor o formează bacteriile din grupul Rhizobium.
Determinarea acumulării de azot fixat a fost inițial realizată prin determinarea comparativă a azotului total în plantele provenite din semințe inoculate și din semințe neinoculate.
Diferitele metode de testare folosite urmăresc atât stabilirea modului în care s-a realizat păstrarea caracteristicilor biologice după cultivarea pe medii industriale și condiționare, cât și verificarea eficacității diferitelor biopreparate în diferite condiții agropedoclimatice.
Una din metodele de laborator recent dezvoltată pentru testarea eficacității tulpinilor de rhizobii în condiții de laborator este metoda de dozare a hidrogenului produs de nitrogenază în condițiile trecerii peste nodozitați a unui sistem gazos din care lipsește azotul. Mai jos sunt prezentate primele rezultate obținute in cadrul testelor efecuate la ICDPP. Scopul acestui experiment a fost de a demonstra că activitatea nitrogenazică și rata fixării azotului in legume poate fi determinată prin măsurarea ratei evoluției H2 din nodozitățile rădăcinii. Experimentul introduce metoda analizei schimbului de gaze pentru măsurarea proceselor fiziologice și arată cum aceasta metodă poate elucida parametrii biochimici prin intermediul nodozităților fără a fi necesară extracția din țesuturi.
S-a lucrat cu plante de fasole, inoculate cu tulpinile de Rhizobium care nodulează fasolea caracterizate anterior – FL220, FL400. Microorganismele au fost cultivate pe mediu Lazareeva. Plantele au fost crescute pe soluție nutritivă Crone lipsită de azot.
Determinarea activității nitrogenazice prin producerea de hidrogen. S-a folosit dispozitivul experimental prezentat în figurile de mai jos. Acest dispozitiv experimental permite determinarea ratei de eliberare a hidrogenului de către tulpinile fără Hup (enzima de preluare a hidrogenului).
Fig.11. Ansamblu de laborator pentru determinarea activității nitrogenazice prin măsurarea hidrogenului produs în timpul fixării azotului
Rata eliberării de H2 furnizează o măsură a activității nitrogenazice aparente (ANA), deoarece doar o proporție din fluxul de electroni prin nitrogenază este folosit pentru reducerea protonilor. Pentru măsurarea activității nitrogenazice totale (TNA) este necesară expunerea rădăcinilor cu nodozități la un amestec de gaz lipsit de N2, cum ar fi amestecul Ar:O2 (80:20). Trecerea unui gaz lipsit de azot molecular permite determinarea nitrogenazei și în cazul tulpinilor care au hidrogenază de preluare (Hup). Rata de fixare a azotului de calculează conform formulei:
Rata de fixare N2 = (TNA-ANA)/3
Plantele de fasole crescute pe medii lipsite de azot au fost recoltate, iar sistemul radicular a fost introdus în cuvă și supus diferitelor amestecuri de gaze (aer; argon: oxigen 80:20).
III.8. CULTIVAREA UNEI TULPINI DE AZOSPIRILLUM BRASILIENSE PE DIFERITE MEDII DE CULTURĂ.
Unul dintre obiectivele prioritare ale agriculturii moderne este reprezentat de reuducerea dependenței culturilor agricole de fertilizarea chimică cu azot, avănd in vederea costurilor importante, atât de producție a ingrășămintelor chimice, căt și sociale (costuri ale poluării, datorate deopotrivă producției și utilizării). Activitatea biologică a azotului, aflat in cantități practic inepuizabile (circa 75% din volumul atmosferei) se realizează prin procesul de fixare datorat unei reacții enzimatice guvernată de sistemul nitrogenazic.
Incă din secolul XIX a fost semnalată capacitatea de fixare a azotului atmosferic la diferite grupe de microorganisme. In prezent sunt descrise aproximatic 200 de specii de microorganisme diazotrofe, libere sau incluse in sisteme asociate cu alte organisme vegetale.
Speciile de Rhizobium si Azospirillum au primit o atenție deosebită datorită efectelor pe care le produc ca urmare a inoculării.
La speciile de Azospirillum efectele benefice constau in sporuri medii de recoltă de 20%, in unele cazuri fiind chiar semnalate si sporuri de 60% datorate fixării azotului dar și stimulării creșterii plantelor și a modificărilor absorbției substantelor nutritive.
In vitro, bacteria iși păstrează viabilitatea in condiții de uscăciune severă datorită capacitătii sale de a produce forme de rezistența. Această calitate nu s-a manifestat in experientele de cămp, in condițiile in care nu era asociată cu rădăcinile unei plante gazdă. Azospirillum ca inoculant trebuie aplicat cu un titru destul de mare pentru a stabili marimi de populații fixatoare de azot, eficiente.
S-a demonstrat experimental faptul că administrarea lui Azospirillum ca inoculant imbunătățește răsărirea plantelor, inălțimea plantelor, momentul infloririi, substanța uscată totală, rezistența la secetă, conținutul in azot din masa vegetală și semințe, componentele recoltei și producția de boabe.
Obiectul cercetărilor din această etapă a fost stabilirea condiților optime pentru creșterea bacteriei pe diferite medii și a producerii de biomasă.
Ca material biologic s-a folosit tulpina SP 001 de Azospirillum brasiliense, izolată din rizosfera unei plante de grău, recoltată dintr-o solă cu monocultură indelungată. Tulpina face parte din colecția de microorganisme utile din cadrul ICDPP.
Mediile de cultură utilizate pentru aprecierea capacității de creștere a bacteriei au fost mediile lichide AFM 10, AFM 20, si Döbereiner semisolid, repartizate in baloane Erlenmeyer.
Rețele mediilor sunt prezentate in tabelul de mai jos.
Experiența a cuprins cele variante de mediu descrise mai sus, fiecare in 3 repetiții pentru fiecare din cele momente de timp alese pentru observații 24, 48 și 72 ore.
Fiecare balon Erlenmeyer a fost inoculat cu 10% suspensie bacteriană cu titrul calibrat la 109 ufc. După inoculare, baloanele au fost incubate la 28°C, in condiții de agitare continuă, pe un agitator la 140rpm.
La fiecare 24, 48, și 72 ore, baloanele inoculate au fost analizate in ceea ce privește creșterea bacteriană.
Au fost făcute de asemenea observații asupra variației pH-ului mediilor inainte si după inocularea bacteriilor, la cele trei intervale de timp de incubare, utilizănd un pH-metru de laborator.
Creșterea bacteriană a fost apreciată prin: cântarirea biomasei umede la balanța analitică și măsurarea nefelometrică a turbidității, estimată in NTU.
Centrifugarea mediilor inoculate s-a facut la 10000 rpm timp de 10 min, apoi s-a decantat supernatantul, iar sedimentul a fost cântărit.
Tabel 7. Compoziția mediilor de cultură testate pentru creșterea bacteriilor utile plantelor de cultură Azospirillum brasiliense, tulpina SP001
III.9. TESTAREA ACTIVITĂȚII BIOLOGICE A BIOMASEI DE BACTERII A. BRASILIENSE
Bacteriile Azospirillum sunt rizobacterii diazotrofe, favorizante ale creșterii și dezvoltării vegetale (PGPR – “plant growth promoting rhizobacteria”) cu o acțiune complexă asupra plantelor de cultură. Unele din efectele produse în țesuturile vegetale, și în special în cele radiculare, sunt datorate producerii de fitohormoni in situ de catre microorganismele din genul Azospirillum. In cadrul acestui test biologic s-a urmărit evidențierea activității fitohormonilor giberelici produși de bacterii utile plantelor de cultura din genul Azospirillum, pentru a se stabili prezervarea calității biologice de favorizant diazotrof dupa cultivarea pe mediile de cultura.
Evidențierea și estimarea activității fitohormonilor giberelinici s-a efectuat prin biotestul inducerii -amilazei din endospermul de orz cuplat cu tehnica difuziei radiale în gel.
Etapele procedurii utilizate au fost:
inducerea biosintezei -amilazei in endospermul boabelor de orz de către fitohormonii prezenți in extractele de testat;
difuzia radială in gelul de agar-amidon a enzimelor sintetizate sub acțiunea fitohormonilor și hidroliza consecutivă a amidonului;
evidențierea zonei de acțiune a enzimei prin colorarea substratului.
a) probă b) martor
Fig.10. Evidențierea activității fitohormonilor giberelinici
In cadrul acestui test s-au folosit următorii reactivi:
gel de agar – amidon. In 100 ml tampon fosfat pH 6,9 diluat cu 100 ml apă, 2,5 g agar si 1 g de amidon s-au dizolvat la cald și s-au fiert până când soluția a devenit limpede;
soluția tampon fosfat pH 6,9 a fost preparata astfel: 590 mg acetat de sodiu + 1,47 g veronal sodic + 1,4 g NaCl + 780 mg CaCl2 s-au dizolvat in apa disitilată, s-au adăugat 62 ml HCl 0,1 N și s-a adus la un volum final de 250 ml cu apă distilată;
soluție de developare: 45 ml iod 0,1 N cu 55 ml etanol absolut;
extract de biomasă bacteriană realizat prin osmoză inversă;
endosperm de orz din semințe curățate de palee și de la care s-a inlăturat, prin tăiere, partea care conține embrionul.
Modul de lucru a fost:
depunerea unui gel de agar-amidon in grosime de 2-3 mm pe suport reprezentat de lame microscopice;
practicarea in gel a unor godeuri cu diametrul de 3 mm;
depunerea in godeuri a endospermului de orz (jumătate de bob fara embrion) și a extractului de testat;
incubarea 72 h la temperatura camerei in incintă umedă;
colorarea cu soluție de developare a gelului;
observarea existenței unei zone de difuzie.
Fitohormonii giberelinici au fost extrași din mediul de cultură prin dializă inversă. Cultura de bacterii in mediul de cultură s-a centrifugat (7500 g, 30 min), iar supernatantul a fost concentrat, trecut in sacul de dializă șii supus extracției in acetat de etil (dializă inversă).
Interpretarea rezultatelor s-a făcut cu ajutorul unei curbe standard, obținută prin utilizarea in aceeași procedură experimentală a diferitelor concentrații de acid giberelic (GA3). Biotestul s-a realizat in trei repetiții, utilizănd ca martori extracte ale mediilor de cultură folosite pentru multiplicarea bacteriilor (AFM10, AFM20, Döbereiner).
III.10. TEHNOLOGIA DE REALIZARE A INOCULUI DE LABORATOR
Inoculul de laborator reprezintă cultura pură de microorganisme aduse in forma viabila și care este utilizată la insămânțarea ulterioară a mediilor de cultură.
Tehnologia a fost similară pentru bacteriile din genul Rhizobium și pentru cele din genul Azospirillum, și s-a realizat după cum urmează:
Un număr de cinci eprubete stoc din camera de depozitare a culturii de microorganisme au fost aduse lent la temperatura de 20-24C (temperatura camerei). S-au pregătit cinci eprubete cu cinci mililitri de mediu inclinat Lazareva insămânțat cu tulpina de Rhizobium leguminosarum bv. phaseoli FL20 din eprubetele stoc.
S-au incubat eprubetele inoculate la 28C timp de 3-5 zile și apoi s-a controlat microscopic puritatea culturii din eprubete.
Pentru realizarea inocului de Azospirillum la nivel de laborator s-au însămânțat cinci eprubete cu trei mililitri de mediu Döbereiner semisolid, din eprubetele stoc ale culturii SP001. Au fost incubate la 30 C timp de 5 zile, după care s-a verificat puritatea culturii din eprubete.
In ambele cazuri, culturile proaspete s-au multiplicat in 15 eprubete cu câte cinci mililitri de mediu inclinat Lazareva pentru Rhizobium, respectiv Döbereiner pentru Azospirillum, care constituie inoculul de laborator.
III.11. CONDIȚIONAREA BIOMASELOR DE RHIZOBIUM ȘI AZOSPIRILLUM CA BIOPREPARATE AGLOMERATE – FLOCULI
Optimizarea tehnologiei de utilizare a unor produse biologic active pentru stimularea creșterii și dezvoltării plantelor și a aprovizionării culturilor cu azot fixat a implicat și modificarea formei de condiționare a bacteriilor utile din genurile Azospirillum și (Brady)rhizobium. Formele uzuale (ca de ex. suspensie microbiană absorbită în turbă) nu aderă corespunzător la unele semințe tratate și/sau nu asigură o rată corespunzătoare de supraviețuire a bacteriilor inoculante și /sau de colonizare a rizosferei. Din acest motiv a fost stabilit, un protocol care a impus și o modificare a mediului de cultură pentru a favoriza formarea de agregate (floculi) de bacterii din genul Azospirillum, care să permită co-flocularea bacteriilor utile asiguând în final o mai bună rezistență la condițiile dificile de mediu (uscăciune, lipsă de substrat metabolic etc.) și o mobilitate ridicată a inoculului.
Mediul de cultură folosit pentru cultivarea bacteriilor utile din genul Azospirillum are avantajul de a favoriza pe de o parte acumularea de polibeta-hidroxibutirat, iar pe de altă parte flocularea microorganismelor în agregate având densități de peste 1015 ufc/ml. Acumularea de polibetahidroxibutirat asigură o bună rezistență a bacteriilor la factorii de stres (Kadouri și col. 2003), iar agregarea în floculi favorizează recoltarea și supraviețuirea bacteriilor (Neyra și col., 1997).
In fig.11. este prezentat aspectul microscopic al unei culturi de Azospirillum brasilense Sp001 pe mediu AFM 20.
Fig. 11. Aspectul în microscopie optică al culturii de 48 ore Azospirillum brasilense Sp001 in mediul lichid AFM 20, aerat si agitat.
Pentru asigurarea unui inocul bogat în bacterii cu mobilitate ridicată, s-a elaborat un procedeu tehnologic de co-floculare a bacteriilor agroinoculante din grupurile Azospirillum și Rhizobium cultivate pe mediu lichid, aerat și agitat.
Procedeul elaborat permite obținerea unui inocul bogat în bacterii (min 1011 ufc/ g de produs final) capabil să colonizeze rapid rizosfera plantelor de cultură.
Mod de lucru:
Cultivarea bacteriilor din grupul Rhizobium (R. leguminosarum bv. phaseoli izolatul FL20 ) pe mediu Lazareva hidrogelifiat timp de 7 zile.
Resuspendarea inoculului în mediu AFM 20S, ce conține acid malic în loc de glucoză, in proporție de 10% (s-au inoculat 10 ml de suspensie bacteriană in 100 ml mediu);
Cultivarea bacteriilor din grupul Azospirillum (Azospirillum brasiliense Sp001), în mediu lichid AFM20 aerat și agitat, timp de 2 zile. Agitarea a avut loc la 140 rpm, in vederea formării de flocoane;
Normalizarea suspensiilor de bacterii Rhizobium și Azospirillum, la o densitate optică de circa 0,4. Această densitate optică corespunde unei suspensii cu titrul de 108 ufc/ml.
Realizarea co-inocularii în raport de 1:1 pe mediu AFM 20S;
Cultivarea peste noapte, recoltarea biomasei floculante prin decantarea și uscarea acestei biomase în curent de aer în condiții blânde (max. 35°C).
Pentru cultivarea bacteriilor Azospirillum brasilense s-au folosit mediul lichid AFM20 si mediul semisolid Döbereiner, ale căror formule au fost prezentate deja. Mediul Dobereiner a fost folosit pentru menținerea bacteriilor, iar mediul AFM 20 pentru producerea biomasei de azospirillii necesară pentru condiționare.
CAPITOLUL IV. REZULTATE ȘI DISCUȚII
IV.1. Izolarea și creșterea pe diferite medii
Pe mediul Lazareva cu roșu de congo din plantele de soia au fost izolate si purificate 11 tulpini din trifoi s-au obținut 12 izolate, de la fasole 17 izolate FAP 23…40 si de la mazăre 9 izolate.
S-a constatat că viteza de creștere pe mediul Lazareva a fost de 4 zile pentru izolatele de la fasole, mazăre si trifoi si de 7 zile pentru cele de la soia.
Coloniile bacteriene realizate prin epuizare de ansă au fost observate dupa 4 si după 7 zile de incubare la termostat. Pe mediul nutritiv Lazareva, tulpinile bacteriene au prezentat caractere morfologice și culturale distincte și caracteristice pentru fiecare biovar. Caracteristicile morfologice inregistrate la fiecăre specie de Rhizobium izolată au fost confirmate de Manualul sistematic a lui Bergey.
Fig. 12. Aspectul unei plăci insămânțate cu Rhizobium leguminosarum bv. phaseoli FL20
Tabel 8. Caracteristicile tulpinilor bacteriene izolate din nodozitățile unor leguminoase
Analizând valorile densității optice obținute prin cultivarea tulpinilor selecționate pe cele 7 medii de cultură, cunoscute din literatură ca fiind specifice pentru bacteriile din genul Rhizobium, s-a constatat că pe substraturile care au inclus manitolul in compoziție tulpinile izolate de la soia au avut o dezvoltare mai bună decăt pe mediile cu zaharoză, și au atins valorile maxime (82 – 99,4) in 7 zile de la inoculare, după cum se observă in tabelele 9 si 10. Tulpinile izolate de la mazăre, fasole și trifoi au avut o creștere mai bună pe mediile cu zaharoză (88,8 – 96,4) au ajuns la creșterea maximă după 4 zile de la inoculare. S-a constatat că mediul Lazareva a asigurat o creștere foarte bună pentru tulpinile izolate de la soia și satisfăcătoare pentru tulpinile izolate de la mazăre, fasole și trifoi.
Bacterizarea plantelor gazdă cu tulpinile bacteriene pentru reproducerea infecțiilor la nivel de laborator, a determinat formarea unui număr mare de nodozități la colet, dintre care un procent foarte mare (peste 85%) erau active, stare exprimată și prin greutatea proaspătă și uscată a nodozităților; datele sunt prezentate in tabelul 11 de mai jos.
Tabel 9. Densitatea optică a creșterii bacteriene pe diferite medii de cultură inoculate cu tulpini izolate din nodozități – după 4 zile
Tabel 10. Densitatea optică a creșterii bacteriene pe diferite medii de cultură inoculate cu tulpini izolate din nodozități – după 7 zile
Tabel 11. Efectul inoculării plantelor cu tulpini din colecția de lucru
Cantitatea de biomasă obținută prin cultivarea tulpinilor selecționate pe diferite medii confirmă datele inregistrate prin determinarea densității optice.
IV. 2. CARACTERIZAREA UNEI TULPINI DE RHIZOBIUM LA BIOLOG
In fig. 13-17 sunt prezentate diferite aspecte din timpul determinărilor experimentale cu ajutorul microsistemului Biolog. Acest microsistem utilizeaza microplăci de titrare cu 95 de godeuri in care exista diferite surse de carbon impreuna cu un colorant tetrazolic, care in urma exprimării metabolismului bacterian formează un precipitat violet, generănd astfel reacția de culoare. Există diferite tipuri de microplãci specifice diferitelor tipuri de microorganisme (GN2, GN2-Ent, GP, YT, s.a.), iar tiparele de amprentare metabolică sunt comparate și identificate folosind softul bazei de date Microlog .
Protocolul de lucru a fost urmatorul:
S-a insămanțat pe mediul special BUG (Biolog Universal Growth) repartizat in plăci Petri, una din culturile izolate anterior si s-a lăsat la incubat 16-24 ore la 30°C.
S-a calibrat sistemul si din placa Petri s-a pelevat cu o ansă sterilă de unică folosință puțină masă bacteriană si s-a omogenizat in lichidul de inoculare specific (pentru bacterii gram negative).
S-a omogenizat masa bacteriană până când lichidul inoculat a atins o turbiditate standard, specifică de asemenea tipului gram negativ. Operațiunea s-a realizat cu atenție, și s-a verificat după fiecare omogenizare turbiditatea lichidului inoculat la Biolog.
După ce s-a atins turbiditatea corespunzătoare lichidul inoculat s-a turnat intr-o cuvă sterilă, de unde, cu o micropipetă s-a insămănțat microplaca GN Biolog cu căte 150 µl suspensie in fiecare godeu.
Citirea plăcilor s-a realizat cu un reader automat, iar interpretarea rezultatelor s-a facut cu ajutorul softului bazei de date pentru bacterii gram negative.
Identificarea și caracterizarea fenotipică au la bază reacțiile din godeurile microplăcii, respectiv sursele de carbon folosite de către bacteria testată.
Godeurile in care sursele de carbon au fost utilizate de către bacterie se colorează in violet. Reacția chimică are la bază prezența in godeuri a unui colorant tetrazolic, care acționează ca un acceptor final de electroni în lanțul respirator al bacteriei, formând un precipitat intens colorat de formazan.
Sursele de carbon din placa GN specifică bacteriilor gram negative sunt prezentate în tab. 12, iar în fig. 18 este prezentată citirea plăcii GN inoculată cu una din tulpinile de R. leguminosarum (FL20) folosită în cadrul proiectului.
Sistemul Biolog permite o caracterizare rapidă a tulpinilor izolate și o verificare simplă a păstrării caracteristicilor biologice după diferitele procedee de cultivare și de condiționare.
Tabel 12. Sursele de carbon din microplăcile GN
Fig. 18. Citirea plăcii GN inoculată cu tulpina R. leguminosarum FL20
IV.3. CULTIVAREA RHIZOBIILOR PE DIFERITE MEDII
S-a verificat faptul ca mediul Lazareva lichid poate fi folosit in scopuri industriale, deoarece asigură o creștere bună a tuturor rizobiilor și permite realizarea de șarje reproductibile, atăt din punct de vedere al timpului de fermentare, căt și al cantității de masă bacteriană realizată.
Tabel 13. Biomasa umedă rezultată după 4 zile, in urma cultivării pe diferite medii de cultură inoculate cu tulpini izolate din nodozități (g/l mediu) .
Tabel 14. Biomasa umedă rezultată după 7 zile, in urma cultivării pe diferite medii de cultură inoculate cu tulpini izolate din nodozități (g/l mediu).
Tulpinile de Rhizobium care au fost cultivate pe mediu lichid Lazareva condiționate cu Aquasorb in pungile urinare sterile su crescut normal și și-au păstrat viabilitatea.
Fig. 19. Aspectul unui pungi cu mediu de cultură hidrogelifiat
Testele preliminare realizate au demonstrat că hidrogelul utilizat nu suferă modificări în urma sterilizării prin radiații și că bacteriile din grupul Rhizobium cresc pe mediile hidrogelifiate. In fig. 19 este prezentat aspectul pungii cu hidrogel, iar în fig. 20 este ilustrată dinamica de creștere a rizobiilor pe mediu hidrogelifiat.
Fig. 20. Dinamica de creștere a rhizobiilor pe mediu hidrogelifiat.
IV.4. VERIFICAREA PĂSTRĂRII CALITĂȚIILOR BIOLOGICE ALE RHIZOBIILOR
In cazul rhizobiilor nu au fost evidențiate modificări semnificative ca urmare a cultivării pe medii hidrogelifiate. In fig. 21 sunt prezentate comparativ activitatea nitrogenazică (prin estimarea hidrogenului nitrogenazic) a nodozităților rezultate în urma inoculării plantelor de fasole cu bacterii Rhizobium leguminosarum bv. phaseoli, tulpina FL20, cultivată pe mediu Lazareeza, hidrogelifiat și agarizat.
Fig. 21. Activitatea nitrogenazică a rădăcinilor de fasole inoculate cu rhizobii cultivate pe medii Lazareeva. A. hidrogelifiat B. agarizat. C. martor neinoculat.
Datele obținute demonstrează faptul că nu se constată diferențe semnificative în cazul activității biologice a rhizobiilor cultivate pe medii hidrogelifiate sau agarizate. Preturile de cost ale hidrogelului fiind mult mai reduse decât cele ale agarului sunt astfel create condițiile pentru realizarea unor biopreparate pe medii semisolide, (hidro)gelifiate.
Aceste medii gelifiate au fost cele mai utilizate pentru producerea biopreparatelor pe bază de rhizobii. Aceste biopreparate sunt cele mai larg folosite și cele mai vechi. La câțiva ani după descoperirea simbiozei dintre rhizobii si leguminoase de către Hellriegel (1889) doi alți cercetători germani (Nobbe si Hiltner) au obținut patentul SUA 570 813/1895 pentru primul biopreparat pe bază de fixatori de azot în simbioză cu leguminoasele. Acest biopreparat conținea o tulpină de bacterii specifică pentru cultura unei anumite leguminoase, înmulțită pe un mediu artificial solidificat cu gelatină pe pereții unui flacon de sticlă cu capacitatea de 250 ml. In urma criticilor unor utilizatori (care pretindeau că gelatina, fiind o sursă semnificativă de azot fixat, inhibă capacitatea de fixare biologică a azotului) componenta de gelifiere a mediului de cultură a fost schimbată cu agar, un polizaharid algal care prezintă aceeași caracteristică de gelifiere funcție de temperatură ca si gelatina. S-a obținut astfel un produs a cărui denumire comercială (Nitragin, detinuta în prezent de Merck) a fost înregistrată la data de 6 decembrie 1898. Deși este un nume comercial înregistrat ca marcă (adică un substantiv propriu) Nitragin a devenit în limba română, ca si în alte cazuri (ness, xerox, adidasi sau, mai nou, pampersi) un nume (substantiv) comun, fiind utilizat ca denumire generică pentru biopreparatele cu rhizobii.
Inoculanții agricoli pe mediu agarizat prezentau însă o serie de dezavantaje (prețul de cost ridicat datorită prețului mare al agarului, termenul de valabilitate realtiv scăzut care impunea o activitate sezonieră de producție, manoperă multă la producere) fapt care a determinat căutarea unor soluții alternative. In 1907 s-a comercializat biopreparatul Azotogen, în care rhizobiile erau înmultite direct în borcane de pământ neutralizat cu praf de calcar. Un an mai târziu (1908) Coates a obținut un brevet pentru un biopreparat cu rhizobii care conținea bacteriile adsorbite pe făină sterilizată din plante de trifoi, mazăre, fasole sau semințe de bumbac. Doi ani mai târziu a obținut altul în care propunea făina de oase ca suport de crestere si condiționare pentru rhizobii. Ale suporturi au fost propuse de Diller, în 1920 (bioxidul de siliciu, carbonatul de calciu, fosfatul de calciu) si de Dugger în 1924 (compost, negru de fum, bentonită). Nici unul dintre suporturile de condiționare nu a cunoscut însă succesul turbei, propusă pentru prima oară în 1932 ca suport de condiționare a rhizobiilor. Tehnologia de producere a biomasei de rhizobii si de utilizare a turbei ca suport de condiționare a fost perfecționată în anii ‘60 de australieni, si apoi de britanici si de francezi.
Deși foarte larg utilizate aceste biopreparate inoculante pe turbă prezintă si o serie de dezavantaje. Un prim dezavantaj este legat de condițiile de producție si se referă la competititivitatea din ce în ce mai redusă a tulpinilor utilizate. Prima etapă în obținerea biopreparatelor pe turbă este producerea biomasei pe mediu lichid, aerat si agitat. Pentru a corespunde cerințelor acestei etape s-au eliminat din producția de inoculanti agricoli tulpinile cu crestere mai lentă si producere masivă de exopolizaharid, adică tocmai tulpinile cu competitivitate ridicată și activitati biologic mare.
Un alt dezavantaj practic al biopreparatelor pe turbă este legat de condițiile de aplicare, care solicită manoperă suplimentară pentru descărcarea sacilor cu sămânță, umectarea semințelor cu soluții de adezivi (care necesită condiții speciale de preparare, fiind de obicei hidrocoloizi dificil de dispersat în apă), tratarea semințelor cu biopreparat pe turbă, reînsăcuire, transport la câmp. In plus, în cazul anumitor tipuri de semănători (si în special a celei românești SPC), exhaustorul aspiră turba de pe sămânța de leguminoase.
Pentru a contracara aceste dezavantaje au fost dezvoltate în ultimii 15 ani noi tipuri de biopreparate inoculante. Două direcții principale au fost urmate: (i) producerea de biopreparate pe medii gelificate (biopreparate care sunt solide în etapele de producere, transport, recepție si lichide în etapa de utilizare) si (ii) producerea de biopreparate cu eliberare controlata, care permit o mai buna asigurare a colonizării.
Gelificarea mediilor de cultură prin adsorbția unui mediu de cultură specific într-un hydrogel cu capacitate de gonflare mare. Capacitatea de gonflare a hidrogelului superadsorbant variază între 50 si 200 ori masa inițială, ceea ce înseamnă max. 20 g pentru 1 kg (aprox . 1 litru) de mediu. Această capacitate de gonflare este controlabilă prin concentrația inițială de săruri ale acidului acrilic folosită pentru polimerizare, prin doza/concentrația de inițiator de polimerizare si prin tipul si mărimea cationului destinat neutralizării polianionului acrilat. Este de menționat aici că hidrogelurile superadsorbante acrilat-amidon sunt larg utilizate în adsorbenți de igienă personală, dar nu sunt încă utilizate ca gelifianti pentru biopreparate. Hidrogelurile (super)adsorbante acrilat – poliacrilamidă sunt: (i) compatibile cu mijloacele uzuale de sterilizare (autoclavare 30 min la 121C, sterilizare cu radiații gamma si/sau oxid de etilenă); (ii) neutre fată de rhizobii, permițând dezvoltarea microorganismelor la suprafața lor ca si mediile agarizate; (iii) lipsite de toxicitate pentru om, plante sau alte organisme netintă din mediu; (iv) lent biodegradabile (ca si agarul). Deși mai greoaie decât soluția deja clasică a gelifierii cu agar folosirea hidrogelurilor (super)adsorbante are avantajul de fi mult mai ieftină. Dacă 1 kg de agar, necesar pentru gelifierea a 50 litri de mediu, costă peste 250 EUR depozit furnizor (preț pentru agar industrial, de calitate redusă valabil numai pentru comenzi mari), prețul unui kg de hidrogel superadsorbant acrilat/ amidon nu depăseste 5 dolari SUA.
IV.5. EVIDENȚIEREA FENOMENULUI DE QS LA BACTERIILE INOCULANTE
In fig. 22 este reprezentat apsectul tulpinii indicator de Chromobacterium violaceum Cv 026, folosită în cadrul experimentelor de evidențiere a QS la rhizobiile studiate.
In fig. 23 este prezentat aspectul bacteriiilor biosenzor în prezența tulpinilor de rhizobii producătoare de AHL.
Fig. 23. Aspectul bacteriilor biosenzor (a- Chromobacterium violaceum Cv026; b – Agrobacterium tumefaciens WCF47) în prezența tulpinilor producătoare de AHL.
După incubarea peste noapte bacteriile biosenzor din cel de-al doilea strat au dezvoltat o reacție de culoare specifică. In cazul rizobiilor care au si o activitate de favorizare a creșterii și dezvoltării plantelor s-au folosit ca tulpini indicator / biosenzor Chromobacterium violacearum Cv026 (evidențiindu-se producerea de violaceină), si tulpina de Agrobacterium tumefaciens WCF47 (la care moleculele de N-acil-homoserin-lactonă, AHL, sunt detectate prin reacția cromogenică a -galactozei raportor cu substratul X-gal, care generează o culare albastră).
IV.6. CARACTERIZAREA UNOR TULPINI DE RHIZOBIUM CARE AU ACTIVITATE ACC DEAMINAZICĂ ȘI CARE NODULEAZĂ FASOLEA
Un aspect esențial în cadrul studiilor de izolare a tulpinilor de rhizobii care au activitate ACC deaminazică și care nodulează fasolea este cel metodologic, respectiv cel al modului în care sunt obținute mediile selective.
Procedeul descris în literatură prevede cultivarea pe mediu minimal DF care are următoarea compoziție: glucoza 2g/l, acid gluconic 2g/l, acid citric 2g/l, KH2PO4 4g/l, MgSO4 0.2g/l, NaCl 0.1g/l, pH 6.8, solutie micronutrientã 10 ml , Agar 18g/l.
Soluția micronutriente: CaCl2 200mg/l, FeSO4 200mg/l, H3BO3 15mg/l, ZnSO4 20mg/l, Na2MoO4 10mg/l, KI 10mg/l, NaBr 10mg/l, MnCl2 10mg/l, CoCl2 5mg/l, CuCl2 2mg/l, AlCl3 2mg/l, NiSO4 2mg/l.
Pentru a se evita formarea unor compuși greu solubili, degradarea ACC sau împiedicarea gelifierii s-a definitivat prin încercări repetate, următorul procedeu de lucru:
soluția de microelemente (cu exceptia FeSO4.7H20) s-a dizolvat în apă distilată sterilă, s-a adus la semn la cotat de 100 ml, s-a transvazat în flacon de sticlă brună și s-a depozitat la rece;
soluția de sulfat de fer (1 mg / 10 ml) s-a preparat separat, s-a transvazat în flacon de sticlă brună și s-a depozitat la rece;
mediul s-a preparat la 1 l, prin dizolvarea pe rând a fiecărui ingredient ( nu s-a trecut la adăugarea unui nou ingredient până când cel anterior nu era complet dizolvat). Ordinea de adăugare a fost: KH2PO4 4g/l, MgSO4 0,2g/l, NaCl 0,1 g/l glucoza 2g/l, acid gluconic 2g/l, acid citric 2g/l, 0,1 ml soluție microelemente, 0,1 ml soluție sulfat de fer, agar 18 g/l/
Sterilizarea se face la 121°C pentru max. 20 min.
ACC se prepară ca solutie 0,5 M, se sterilizează prin filtrare pe membrană de 0,2 m și se păstrează la – 20 °C. Soluția sterilă de ACC se adăugă chiar înainte de distribuirea mediului în plăci, în proporție 300 l la 50 ml mediu.
In cadrul acestui experiment privind activitatea ACC-deaminazică, au fost testate o serie de tulpini de Rhizobium care noduleaza fasolea, dintre are doar tulpinile R. leguminosarum bv. phaseoli FL220 și Rhizobium spp. FL400 au manifestat aceasta activitate.
In urma izolărilor făcute din nodulii de culoare roz formați pe rădăcinile plantulelor de măzăriche, prezența tulpinilor de Rhizobium s-a evidențiat pe mediul de cultură manitol-roșu de Congo, prin culoare roz a coloniilor bacteriene (fig. 24). Doar la tulpinile FL400 și FL220, in urma creșterii pe mediile DF lichid și DF solid suplimentate cu ACC ca unica sursă de azot s-a evidențiat manifestarea activității ACC deaminazice, in timp ce tulpina FL20 nu a crescut pe aceste medii specifice.
Creșterea tulpinilor selectate pe mediu minimal DF suplimentat cu ACC a fost slabă, ceea ce dovedește ca aceste tulpini au o activitate ACC-deaminazică redusă.
Fig.24. Coloniile de FL20, FL400 și FL220
Bacteriile selecționate prezintă însă o activitate semnificativă de stimulare a creșterii plantulele test. Această stimulare implică și activitatea ACC-deaminazică, care inhibă producerea de etilen (fitohormon care inhibă creșterea) în țesuturile vegetale.
Această activitate de fitostimulare a tulpinilor izolate fost evidențiată și prin stimularea creșterii plantulelor in vitro. Rezultatele acestei biotestării in vitro a efectului fitostimulator al tulpinilor cu activitate ACC-deaminazică (suspendate în mediu de cultură Lazareeva) pentru stimularea creșterii plantelor sunt prezentate în tabelul 15.
Tabel 15. Efectul fitostimulator in vitro al tulpinilor de Rhizobium cu activitate ACC-deaminazică.
*Valorile urmate de aceeași literă nu diferă semnificativ statistic pentru p<0.05
Lungimea rădăcinilor prezentată în tabelul 15 este cea a plantulelor formate din semințe de rapiță (cv. Triangle) și de măzăriche păroasă, sterilizate la suprafață (prin spălări repetate cu Domestos și clătiri cu apă distilată) și inoculate cu 0,1 ml suspensie de bacterii cu activitate ACC-deaminazică în mediu Lazareeva. Martorul mediu de cultură a fost mediul Lazareeva. Datele obținute demonstrează un efect stimulator in vitro semnificativ, asigurat statistic, al tulpinilor cu activitate ACC-deaminazică.
Tulpinile au fost caracterizate prin microetalare fenotipică in plăcile GN Biolog. In cazul tulpinii FL220, s-a confirmat prin microetalare fenotipică, apartenența acesteia la specia R. leguminosarum biovar. phaseoli. In cazul tulpinii FL400 nu s-a confirmat incadrarea taxonomică prin microetalarea fenotipică, fiind necesare studii suplimentare.
IV.7. ESTIMAREA EFICACITĂȚII FIXĂRII SIMBIOTICE A AZOTULUI PRIN DETERMINAREA HIDROGENULUI
In fig. 27 este prezentat dispozitivul experimental utilizat pentru estimarea eficacității fixării simbiotice a azotului prin determinarea hidrogenului produs de nitrogenază.
Fig. 27. Dispozitivul de laborator pentru măsurarea hidrogenului nitrogenazic
Rezultatele preliminare obținute demonstrează funcționalitatea metodei de estimare a eficacitații de fixare a azotului prin determinarea hidrogenului nitrogenazic.
Traditional, fixarea N2 a fost masurata prin metoda reducerii acetilenei, care necesita utilizarea unui gaz-cromatograf pentru a masura reducerea acetilenei la etilena de catre organismele fixatoare de azot. Gaz-cromatografele sunt scumpe, iar o concetratie de 10% de acetilena în mediu de reactie necesara metodei este exploziva. Pe langa acest motiv excelent pentru evitarea metodei, s-a dovedit recent ca reducera acetilenei inhiba reactia nitrogenazei.
In fig. 28 sunt prezentate activitățile nitrogenazice ale celor două tulpini de Rhizobium care nodulează fasolea și prezintă activitate ACC-deaminazică.
Fig. 35. Activitatea nitrogenazică determinată prin producerea de hidrogen de către sistemul nitrogenazic.
Datele obținute reliefează funcționalitate metodei, ca și faptul că, în condițiile experimentale date, tulpinile cu ACC-deaminazică au și o activitate nitrogenazică semnificativă.
IV.8. CULTIVAREA UNEI TULPINI DE AZOSPIRILLUM BRASILIENSE PE DIFERITE MEDII
Datele obținute in urmă căntăririi biomasei bacteriene de Azospirillum brasiliense tulpina Sp001 rezultată in urma cultivării pe cele 3 medii de creștere, precum și a măsurării densității optice / turbidității sunt prezentate in tabelul de mai jos:
Tablel 15. Acumularea biomasei de A. brasilene in mediile lichide testate, (masa medie a sedimentului bacterian) și a turbidității (NTU) (datele reprezinta media a trei repetitii)
Se remarcă faptul că, pe mediile testate, creșterea bacteriilor din genul Azospirillum se plafonează dupa 72 ore. Deoarece această plafonare nu este datorată de epuizarea surselor de azou și/sau carbon, este de presupus că inhibarea dezvoltării bacteriilor după 72 de ore se datorează acumulării metaboliților de excreție bacterieni.
Randamentele de conversie ale componentelor mediului de cultură in biomasă (tab. 16), sunt in general ridicate. Mediul care asigură conversia cea mai ridicată este mediul AFM 10. Totuși din punct de vedere practic sunt mai convenabile mediul AFM 20 și mediul Dobereiner.
Tabel 16. Randamentele de conversie a componentelor mediului de cultură
Mediul AFM 20 asigură un nivel rezidual de nutrienți care permite o supraviețuire optimă in cadrul etapelor de condiționare. Mediul Dobereiner este un mediu semisolid, care are ca principal avantaj practic selectivitatea – fapt care permite in procesul de tehnologie evitarea contaminărilor.
In concluzie, se propune ca mediul AFM 20 să fie utilizat in procesele tehnologice de biosinteză a biomasei de bacterii Azospirillum brasiliense SP001, iar mediul Dobereiner să se folosească pentru menținerea culturilor și pentru prepararea culturilor starter.
IV.9. TESTAREA ACTIVITĂȚI BIOLOGICE A BIOMASEI DE AZOSPIRILLUM
Efectuarea biotestului producerii de gibereline in laborator, a permis evaluarea influenței exercitate de mediile de cultură asupra calității de favorizant de creștere a tulpinii testate.
Tabel 17. Influența mediilor de cultură asupra calităților biologice a tulpinii SP001
Datele din tabel aduc dovezi ale existenței fitohormonilor giberelinici in extractele analizate. Diametrele zonelor de difuzie ale enzimelor giberelic induse sunt semnificativ mai mari la variantele incubate in prezența mediilor de cultură. Toate mediile testate asigură o capacitate ridicată de biosinteză a fitohormonilor giberelinici, comncentrația acestora in mediul de cultură depașind 100 ng echivalenți GA3/ ml.
Mediul de cultură care a asigurat bacteriilor cea mai ridicata capacitate de a sintetiza fitohormoni giberelinici a fost mediul AFM 20.
Rezultatele obținute demonstrează faptul ca se pastrează calitatea biologică de agent favorizant al creșterii vegetale a bacteriilor A. brasiliense Sp001, după cultivarea pe mediile AFM 10, AFM 20 și Dobereiner.
IV.10. CONDIȚIONAREA TULPINILOR BACTERIENE FL220 ȘI Sp001 SUB FORMĂ DE AGREGATE – FLOCULI
Pentru asigurarea unui inocul bogat în bacterii cu mobilitate ridicată, s-a realizat un procedeu tehnologic de co-floculare a bacteriilor agroinoculante din grupurile Azospirillum și Rhizobium cultivate pe mediu lichid, aerat și agitat.
Procedeul elaborat permite obținerea unui inocul bogat în bacterii (min 1011 ufc/ g de produs final) capabil să colonizeze rapid rizosfera plantelor de cultură.
In fig. 36 sunt prezentate aspecte din timpul condiționării tulpinilor FL220 sub formă de agregate / floculi.
Procedura de lucru utilizată pentru realizarea acestui biopreparat co-floculat este următoarea:
Cultivarea bacteriilor din grupul Rhizobium (R. leguminosarum bv. phaseoli izolatul FL220 ) pe mediu Lazareva hidrogelifiat timp de 7 zile.
Resuspendarea inoculului în mediu AFM 20S, ce conține acid malic în loc de glucoză, in proporție de 10% (s-au inoculat 10 ml de suspensie bacteriană in 100 ml mediu);
Cultivarea bacteriilor din grupul Azospirillum (Azospirillum brasiliense Sp001), în mediu lichid AFM20 aerat și agitat, timp de 2 zile. Agitarea a avut loc la 140 rpm, in vederea formării de flocoane;
Normalizarea suspensiilor de bacterii Rhizobium și Azospirillum, la o densitate optică de circa 0,4. Această densitate optică corespunde unei suspensii cu titrul de 108 ufc/ml.
Realizarea co-inocularii în raport de 1:1 pe mediu AFM 20S;
Cultivarea peste noapte, recoltarea biomasei floculante prin decantarea și uscarea acestei biomase în curent de aer în condiții blânde (max. 35°C).
Fig. 37. Aspecte din timpul condiționării sub formă de agregate / floculi. a) tulpina de Rhizobium leguminosarum bv. phaseoli FL220 pe mediul solid Lazareva si mediul lichid AFM S; b) tulpina de Azospirillum brasiliense Sp001 pe mediul semisolid Dobereiner și mediul lichid AFM 20.
Prin aplicarea procedeului rezultă un biopreparat mixt sub formă de floculi în care rata de supraviețuire este bună (fig. 38). Pentru cultivarea bacteriilor Azospirillum brasilense s-au folosit mediul lichid AFM20 si mediul semisolid Döbereiner, ale căror formule au fost prezentate deja. Mediul Dobereiner a fost folosit pentru menținerea bacteriilor, iar mediul AFM 20 pentru producerea biomasei de azospirillii necesară pentru condiționare.
Fig. 38. Supraviețuirea bacteriilor în bioprepatul mixt pe bază de Azospirillum brasilense Sp001 (x109 ufc/g) și Rhizobium leguminosarum bv. phaseoli FL 220 (x107 ufc/g). Estimări ale numărului de microorganisme prin diluții succesive și cultivare pe medii specifice, Lazareeva cu rosu de Congo și Dobereiner.
Tab. 18. Influența biopreparatului mixt FL220-Sp001 asupra fenomenelor de fitostimulare a plantelor de rapiță și măzăriche
Datele din literatură arată un efect sinergic al co-inoculării plantelor de leguminoase cu cele două tipuri de fixatori de azot. In cadrul acestei lucrări s-a urmărit influența exercitată de acest biopreparat mixt asupra proceselor de stimualre a creșterii (tab.18), întrucât amândouă tulpinile prezentau si activitate de stimulare a creșterii
Datele arată un efect aditiv, la limita sinergismului. Sunt necesare studii suplimentare pentru stabilirea păstrării acestei interacții sinergice pe parcursul păstrării biopreparatului, ca și al efectelor asupra fixării biologice de azot.
CAPITOLUL V. CONCLUZII
Au fost izolate mai multe tulpini de Rhizobium folosindu-se tehnica capturii pe rădăcini de leguminoase și a recuperării tulpinilor din nodulii eficienți (de culoare roz) pe mediul Lazareva cu roșu de Congo. Din plantele de soia au fost izolate si purificate 11 tulpini, din trifoi s-au obținut 12 izolate, de la fasole 17 izolate, iar de la mazăre 9 izolate. S-a constatat că viteza de creștere pe mediul Lazareva a fost de 4 zile pentru izolatele de la fasole, mazăre si trifoi si de 7 zile pentru cele de la soia.
Tulpinile izolate au fost selecționate după capacitatea lor de creștere pe diferite medii de cultură, în final optându-se pentru mediu Lazareeva și o serie de tulpini de rhizobii care nodulează fasolea.
A fost pusă la punct o procedură de caracterizare fenotipică a rhizobiilor prin utilizarea (micro)sistemului Biolog. Procedura pornește de la modul de lucru recomandat de producători și este adaptată condițiilor laboratorului în care s-a lucrat și specificului bacteriilor studiate.
Mediu Lazareeva a fost gelifiat prin folosirea a doi compuși macromoleculari, agarul (compus utilizat tradițional) și hidrogelul pe bază de poliacrilamidă – poliacrilat (Aquasorb).
Tulpinile de rhizobii cultivate pe medii hidrogelifiate si-au păstrat caracteristicile biologice de fixare a azotului atmosferic.
S-a evidențiat producerea de AHL și prezența sensibilității de grup (quorum sensing) la tulpinile de Rhizobium. S-au folosit ca tulpini indicator / biosenzor Chromobacterium violacearum Cv026 (evidențiindu-se producerea de violaceină), si tulpina de Agrobacterium tumefaciens WCF47 (la care moleculele de N-acil-homoserin-lactonă, AHL, sunt detectate prin reacția cromogenică a -galactozidazei raportor cu substratul X-gal, care generează o culoare albastră).
S-a elaborat un procedeu de selectare a tulpinilor de Rhizobium cu activitate ACC-deaminazică prin creștere pe mediu minimal DF cu ACC ca unică sursă de azot. Pentru a se evita formarea unor compuși greu solubili, degradarea ACC sau împiedicarea gelifierii s-a definitivat prin încercări repetate, următorul procedeu de lucru:
soluția de microelemente (cu excepția FeSO4.7H20) s-a dizolvat în apă distilată sterilă, s-a adus la semn la cotat de 100 ml, s-a transvazat în flacon de sticlă brună și s-a depozitat la rece;
soluția de sulfat de fer (1 mg / 10 ml) s-a preparat separat, s-a transvazat în flacon de sticlă brună și s-a depozitat la rece;
mediul s-a preparat la 1 l, prin dizolvarea pe rând a fiecărui ingredient ( nu s-a trecut la adăugarea unui nou ingredient până când cel anterior nu era complet dizolvat). Ordinea de adăugare a fost: KH2PO4 4g/l, MgSO4 0,2g/l, NaCl 0,1 g/l glucoza 2g/l, acid gluconic 2g/l, acid citric 2g/l, 0,1 ml soluție microelemente, 0,1 ml soluție sulfat de fer, agar 18 g/l/
Sterilizarea se face la 121°C pentru max. 20 min.
ACC se prepară ca soluție 0,5 M, se sterilizează prin filtrare pe membrană de 0,2 m și se păstrează la – 20 °C. Soluția sterilă de ACC se adăugă chiar înainte de distribuirea mediului în plăci, în proporție 300 l la 50 ml mediu.
Doar la tulpinile FL400 și FL220, in urma creșterii pe mediile DF lichid și DF solid suplimentate cu ACC ca unica sursă de azot s-a evidențiat manifestarea activității ACC deaminazice, in timp ce alte tulpini nu au crescut pe aceste medii specifice.
Bacteriile selecționate ca având activitate ACC-deaminazică prezintă o activitate semnificativă de stimulare a creșterii plantulele test (rapiță și măzăriche). Această stimulare implică pe lângă producerea de fitohormoni in situ și activitatea ACC-deaminazică, care inhibă producerea de etilen (fitohormon care inhibă creșterea) în țesuturile vegetale.
A fost pusă la punct o procedură de lucru pentru estimarea activității nitrogenazice prin determinarea producerii de hidrogen în condițiile utilizării de amestecuri gazoase lipsite de azot (ca de exemplu argon : oxigen 80 : 20). Datele obținute reliefează funcționalitate procedurii puse la punct, ca și faptul că, în condițiile experimentale date, tulpinile cu ACC-deaminazică au și o activitate nitrogenazică semnificativă.
In urma studiile de cultivare s-a decis ca mediul AFM 20 să fie utilizat in procesele tehnologice de biosinteză a biomasei de bacterii Azospirillum brasiliense SP001, iar mediul Dobereiner să se folosească pentru menținerea culturilor și pentru prepararea culturilor starter.
S-a realizat un biopreparat mixt pe baza unui consorțiu de bacterii fixatoare de azot, Azospirillum brasiliense Sp001 și Rhizobium leguminosarum bv. phaseoli FL 220. Biopreparatul s-a realizat prin co-floculare. Datele experimentale obținute arată un efect aditiv, la limita sinergismului. Sunt necesare studii suplimentare pentru stabilirea păstrării acestei interacții sinergice pe parcursul păstrării biopreparatului, ca și al efectelor asupra fixării biologice de azot.
CAPITOLUL VI. BIBLIOGRAFIE
1. ABDEL-SALAM, M. S. , KLINGMOLLER, W. -1988. Isolation of transposon induced auxin-negative mutations in Azospirillum lipoferum. In Azospirillum. IV. Genetics, physiology , ecology. Edited by W. Klingmuller. Springer- Verlag , Berlin, Heidelberg, pp. 40-48.
2. ABDEL-SALAM, M. S. , KLINGMULLER, W. 1987. Transposon Tn5 mutagenesis in Azospirillum lipoferum: isolation of indoleacetic \ acid mutants. Mol. Gen. Genet. 210: 165-170.
3. ALBRECHT, S. L., GASKINS, M. H., MILAM, J. R., SCHANK, S.C., SMITH, R. L. 1983. Ecological factors affecting survival and activity of Azospirillum in the rhizosphere. In Azospirillum. II. Experientia Suppl.48: 138-148.
4. ALBRECHT, S. L., OKON, Y., LONNQUIST, L. , BURRIS, R. H. 1981. Nitrogen fixation by corn-Azospirillum associations in a temperate climate. Crop Sci. 21: 301-306.
5. Antoun, H., Beauchamp, C.J., Goussard, N., Chabot, R., Lalande, R., 1998, Plant and Soil, 204, 57-67
6. Appels, M.A., 1989, The symbiosis between Rhizobium leguminosarum and Pisum sativum: regulation of nitrogenase activity, 138 pp.
7. Appleby, C.A., 1984, Ann. Rev. Plant Physiol., 35, 433-478.
8. AVlVI, Y., FELDMAN, M. 1982. The response of wheat to bacteria of the genus Azospirillum. Isr. J. Bot. 32: 237-245.
9. Andrighetti-Fröhner, C.R., Antonio, R.V., Creczynski-Pasa, T.B., Barardi, C.R.M., Simoes, C.M.O. 2003. Cytotoxicity and potential antiviral evaluation of violacein produced by Chromobacterium violaceum. Mem. Inst. Oswaldo Cruz, 98(6): 843-848.
10. Bassler, B.L. 2002. Small talk. Cell-to-cell communication in bacteria. Cell, 109: 421-424.
11. Bassler B.L., Losick, R. 2006. Bacterially speaking. Cell, 125: 237-246.
12. Bains W. (2004): Biotechnology, University Press, Oxford.
13. Berner D.J., Krieg N.R., Stanley J.T (editors) (2005): Bergeys Manual of Systematic Bacteriology (second edition), Springer Science and Business Media Inc., New York.
14. Bitton G. (2002): Encyclopedia of environmental microbiology, University of Florida.
15. Bull A.T. (2004): Microbial diversity and bioprospecting, ASM press, Washington.
16. Bejerano-Sagie, M., Xavier, K.B. 2007. The role of small RNAs in quorum sensing. Curent Opinion in Microbiology, 10:189-198.
17. CHI, N.T.P., THANH, H.H., DZUNG, N.N., MIRZA, M.S., LADHA, J.K., 1998, Responses of rice plants to inoculation with Azospirillum sp. under field conditions. In: Proc. 7th Int. Symp. with Nitrogen Fixation with Non-Legumes, 16-21 Oct.1986, Faisalabad, Pakistan, 1998, 237-240.
18. Ceccatto, V.M., Gomes, J.E., Sarriés, G.A., Moon, D.H., Tsai, S.M., 1998, Plant and Soil., 79-87.
19. Daniels, R., De Vos, D.E., Desair, J., Raedschelders, G., Luyten, E., Rosemeyer, V., Verreth, C., Schoeters, E., Vanderleyden, J., Michiels, J. 2002. The cin quorum sensing locus of Rhizobium etli CNPAF512 affects growth and symbiotic nitrogen fixation. J. Biol. Chem. 277:462-468.
20. DE-POLLI, H., BOHLOOL, B. B., and DOBEREINER., J. 1980. Serological differentiation of Azospirillum species belonging to different host plant specificity groups. Arch. Microbiol.126:217-222.
21. DOBEREINER., J., 1988. Isolation and identification of root associated diazotrophs. Plant Soil, 110: 207-2l2.
22. DOBEREINER., J., BALDANI,V. L. D. 1979. Selective infection of maize roots by streptomycin-resistant Azospirillum lipoferum and other bacteria. Can. J. Microbiol. 25: 1264-1269.
23. DOBEREINER., J., MARRIEL, I. E., NERY, M. 1976. Ecological distribution of Spirillum lipoferum Beijerinck. Can. J. Microbiol. 22: 1464-1473.
24. Dreyfus, B., Garcia, J.L., Gillis, M., 1988, Int. J.,Syst. Bacteriol., 38, 89-98.
25. DROZDOWICZ, A. , FERREIRA SANTOS, G. M. 1987. Nitrogenase activity in mixed cultures of Azospirillum with other bacteria. Zentralbl. Mikrobiol.142: 487-493.
26. Dunca S., Octăviță A., Ștefan M. (2004): Microbiologie aplicată, Editura Tehnopress, Iași.
27. Duta,F.P., de França,F.P., de Almeida Lopes,L.M., 2006, Optimization of culture conditions for exoplysaccharides production in Rhizobium sp. Using the response surface method, Electronic J. Biotechnology.
28. Eliade Gh., Ghinea L., Ștefanic Gh. (1975): Microbiologia solului, Editura Ceres, București.
29. FALLIK, E., OKON, Y., EPSTEIN, E., GOLDMAN, A., FISCHER, M. 1989. Identification and quantification of IAA and IBA in Azospirillum brasilense – inoculated maize roots. Soil Biol. Biochem. 21: 147-153.
30. EYERS, M. , VANDERLEYDEN, J., VAN GOOL, A. 1988a. Attachment of Azospirillum to isolated plant cells. FEMS Microbiol. Lett. , 49: 435-439.
31.Fuqua, W.C.,Winans S.C. 1994. A LuxR-LuxI type regulatory system activates Agrobacterium Ti plasmid conjugal transfer in the presence of a plant tumor metabolite. J. Bacteriol., 176:2796-2806.
32. Fuqua, C., Burbea, M., Winans, S.C. 1995. Activity of the Agrobacterium Ti plasmid conjugal transfer regulator TraR is inhibited by the product of the traM gene. J. Bacteriol. 177:1367-1373.
33. Gavrilă, L., Mihăescu, G. 1989. Biologia microorganismelor fixatoare de azot. Editura Ceres.
34. Ghețea, L., Dumitrescu, M., Toma, N. Aspecte moleculare și biochimice ale interacției gazdă – parazit în cadrul procesului tumorigen la plante. In: Dumitru I.F. (ed.) 2002: Romanian Biotechnological Letters, pp. 84-87.
35. González, J.E., Marketon, M.M. 2003. Quorum Sensing in Nitrogen-Fixing Rhizobia. Microbiology and Molecular Biology Reviews, 67:574-592.
36. Hardy, R.W.F., 1987, „Genetic Engineering for Nitrogen Fixation”, National Academy of Sience Washinghton D.C., 77-106.
37. Hellingwerf, K.J. 2005. Bacterial observations: a rudimentary form of intelligence? Trends in Microbiology, 134:152-158.
38. Higa, T. 1991. Effective microorganisms: A biotechnology for mankind. p.8-14. In J.F. Parr, S.B. Hornick, and C.E. Whitman (ed.) Proceedings of the First International Conference on Kyusei Nature Farming. U.S. Department of Agriculture, Washington, D.C., USA.
39. Hurst C.J., Knudsen G.R., McInerney M.J., Stetzenbach L.D., Walter M.V. (1997): Manual of environmental microbiology, ASM. Press, Washington.
40. Haukka K., 1997, Tezã de doctorat
41. Kavadiaa A., Vayenasb D.V., Pavlouc S., Aggelisa G.:Dynamics of free-living nitrogen-fixing bacterial populations in antagonistic conditions, Ecological modeling, (2007) 243–253.
42. KUMAR, D.P., HEGDE, M., BAGYARAJ, D.J., MADHAVA-RAO, A.R., 1998, Influence of biofertilizers on the growth of cashew (Anacardium occidentale L.) rootstocks.
43. Lyon, G.J., Wright, J.S., Christopoulos, A., Novick, R.P., Muir, T.W. 2002. Reversible and specific extracellular antagonism of receptor-histidine kinase signaling. J. Biol. Chem. 277:6247-6253.
44. MILLET, E., FELDMAN, M. 1986. Yield response of a common spring wheat cultivar to inoculation with Azospirillum brasilense at various levels of nitrogen fertilization. Plant Soil, 80: 255-259.
45. MERTENS, T., HESS, D. 1984. Yield increases in spring wheat (Triticum aestivum L.) inoculated with Azospirillum lipoferum under greenhouse and field conditions of a temperate region. Plant Soil, 82: 87-99.
46. Mclean, K.H., Winson, M.K., Fish, A., Taylor, A., Chhabra, S.R., Camera, M., Daykin, M., Swift, S., Lamb, J., Bycroft, B.W., Stewart, G.S.A.B. & Williams, P. 1997. Quorum sensing in Chromobacterium violaceum: exploitation of violacein production and inhibition for the detection of N-acylhomoserine lactones. Microbiology 143: 3703−3711.
47. Moré, M.I., Finger, L.D., Stryker, J.L., Fuqua, C., Eberhard, A., Winans, S.C. 1996. Enzymatic synthesis of a quorum-sensing autoinducer through use of defined substrates. Science, 272:1655-1658.
48. O'HARA, G. W., DAVEY, M. R., LUCAS, J. A. 1981. Effect of inoculation of Zea mays with Azospirillum brasilense strains under temperate conditions. Can. J. Microbiol. 27: 871-877.
49. O'HARA, G. W., DAVEY, M. R., LUCAS, J. A. 1987. Effect of nitrogen on the yield response of Pennisetum americanum, Triticum aestivum and Zea mays to inoculation with Azospirillum brasilense under temperate conditions. Biol. Fertil. Soils. 4: 67- 72.
50. OKON, Y. 1982. Azospirillum: physiological properties, mode of association with roots and its application for the benefit of cereal and forage grass crops. Isr. J. Bot. 31: 214-220.
51. OKON, Y., HADAR, Y. 1987. Microbial inoculants as crop-yield enhancers. CRC Crit. Rev. Biotechnol. 6: 61-85.
52. OKON, Y., HEYTLER, P.G., HARDY, R.W.F. 1983. N2 fixation by Azospirillum brasilense and its incorporation into host Seratia italica. Appl. Environ. Microbiol. 46: 694-697.
53. OKON, Y., KAPULNIK, Y. 1986. Development and function of Azospirillum -inoculated roots. Plant Soil, 90: 3-16.
54. Pappas, K.M., Weingart, C.L., Winans, S.C. 2004. Chemical communication in proteobacteria: biochemical and structural studies of signal synthases and receptors required for intercellular signalling. Molecular Microbiology, 53:755-769.
55. Parsek, M.R., Greenberg, E.P. 2005. Sociomicrobiology: the connections between quorum sensing and biofilms. Trends in Microbiology, 13:27-33.
56. Parr, J.F., S.B. Hornick, and D.D. Kaufman. 1994. Use of microbial Inoculants and organic fertilizers in agricultural production.
57. Pearson, J.P., Gray, K.M., Passador, L., Tucker, K.D., Eberhard, A., Iglewski, B.H., Greenberg, E.P. 1994 Structure of the autoinducer required for expression of Pseudomonas aeruginosa virulence genes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:197-201.
58. Pearson, J.P., Passador, L, Iglewski, B.H., Greenberg, E.P. 1995. A second N-acylhomoserine lactone signal produced by Pseudomonas aeruginosa. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:1490-1494.
59. Redfield, R.J. 2002. Is quorum sensing a side effect of diffusion sensing? Trends in Microbiology, 10(8):365-370.
60. SARIG, S., KAPULNIK, Y., OKON, Y. 1986. Effect of Azospirillum inoculation on nitrogen fixation and growth of several winter legumes. Plant Soil, 90: 335-342.
61. SARIG, S., BLUM, A., OKON, Y. 1988. Improvement of the water status and yield of field-grown grain sorghum (Sorghum bicolor) by inoculation with Azospirillum brasilense. J. Agric. Sci. l18: 271-277.
62. Scragg. A, 2005: Environmental biotechnology, University Press, Oxford.
63. Schultze M., Kondorosi A.: Regulation of symbiotic root nodule development, Annu. Rev. Genet., 32 (1998) : 33 – 57.
64. Szabó I.M. (1989): A bioszféra mikrobiológiája, Akadémiai Kiadó, Budapesta.
65. Thorne, S.H., Williams, H.D. 1999. Cell density-dependent starvation survival of Rhizobium leguminosarum bv. phaseoli: identification of the role of an N-acyl homoserine lactone in adaptation to stationary-phase survival. J. Bacteriol., 181:981-990.
66. Van Heerden P.D.R., De Beer M., Mellet D.J., Maphike H.S., Foit W.: Growth media effects on shoot physiology, nodule numbers and symbiotic nitrogen fixation in soybean, South African Journal of Botany (2007) in press.
67. Waters, C.M., Bassler, B.L. 2005. Quorum sensing: cell-to-cell communication in bacteria. Annu. Rev. Cell. Dev. Biol. 21:319-346.
68. Whitehead, N.A., Barnard, A.M.L., Slater, H., Simpson, N.J.L., Salmond, G.P.C. 2001. Quorum-sensing in Gram-negative bacteria. FEMS Microbiology Reviews, 25:365-404.
69. Wilkinson, A., Danino, V., Wisniewski-Dye, F., Lithgow, J.K., Downie, J.A.. 2002. N-Acyl-homoserine lactone inhibition of rhizobial growth is mediated by two quorum-sensing genes that regulate plasmid transfer. J. Bacteriol., 184:4510-4519.
70. Winzer, K., Hardie, K.R., Wiliams, P. 2002. Bacterial cell-to-cell communication: sory, can`t talk now – gone to lunch! Curent Opinion in Microbiology, 5:216-222.
71. Wisniewski-Dye, F., and J. A. Downie. 2002. Quorum-sensing in Rhizobium. Antonie Leeuwenhoek, 81:397-407.
72. Xavier, K.B., Bassler, B.L. 2005. Regulation of uptake and processing of the quorum-sensing autoinducer AI-2 in Escherichia coli. J. Bacteriol. 187:238-248.
73. Zarnea G. (1984): Tratat de microbiologie generală, Editura Academiei Române, București.
Copyright Notice
© Licențiada.org respectă drepturile de proprietate intelectuală și așteaptă ca toți utilizatorii să facă același lucru. Dacă consideri că un conținut de pe site încalcă drepturile tale de autor, te rugăm să trimiți o notificare DMCA.
Acest articol: Realizarea Unui Biopreparat PE Baza Unui Consortiu DE Bacterii Fixatoare DE Azot (ID: 155790)
Dacă considerați că acest conținut vă încalcă drepturile de autor, vă rugăm să depuneți o cerere pe pagina noastră Copyright Takedown.