Raport științific și tehnic in extenso Etapa de execuție nr. 4 / 2017 Realizare model funcțional ligament și diseminare rezultate Rezumat. Etapa a 4… [308733]

Raport științific și tehnic in extenso

Etapa de execuție nr. 4 / 2017

Realizare model funcțional ligament și diseminare rezultate

Rezumat.

Etapa a 4 a proiectului s-a desfășurat în perioada decembrie 2016-septembrie 2017 și a avut ca obiectiv realizarea modelului funcțional al ligamentului funcționalizat și diseminarea rezultatelor obținute.

Activitățile care s-au desfășurat pentru realizarea acestor obiective au fost următoarele:

Analiza postoperatorie a [anonimizat],

[anonimizat] a [anonimizat],

Realizare protocol operator pentru implantare ligament artificial pe subiecți umani

Diseminare prin elaborarea unui articol științific și participarea la 2 congrese medicale și o conferință științifică în domeniul chimiei și ingineriei chimice și

Brevetarea soluției originale.

La realizarea etapei au participat toți partenerii implicați în proiect și obiectivele planificate au fost îndeplinite.

[anonimizat] a rezultatelor etapei și gradul de realizare a obiectivelor

Activitatea 4.1. Analiza postoperatorie a mobilității și funcționalității articulației cu ligament artificial

UMF Carol Davila și partenerul cofinanțator au analizat mobilitatea articulației operate comparativ cu cea neoperată.

În figura 1 [anonimizat].

Figura 1

În figura 2 este prezentat membrul posterior operat în extensie maximă comparativ cu membrul neoperat.

Figura 2

[anonimizat], acestea putând fi realizate la amplitudine maximă.

La interval de o [anonimizat] 3 săptămâni când acesta a început sprijinul parțial pe membrul operat păstrând mersul șchiopătat până la aproximativ 6 săptămâni, după care s-a observat o mobilizare normală a acestuia.

Activitatea 4.2. Selectarea compozițiilor corespunzătoare a ligamentelor

În etapa anterioară s-au selectat 3 compoziții de colagen tip I din piele bovină sub forma de 1) gel, 2) hidrolizat de colagen și 3) amestec de gel și hidrolizat de colagen. Ligamentele funcționalitate cu colagen tip I [anonimizat].

[anonimizat] 100 X este prezentată în figura 3.

Figura 3

[anonimizat] (dreapta sus) cu țesut de granulație cu celule gigante multinucleate în jurul fragmentelor de material sintetic. Numeroase fibroblaste activate ce pot fi considerate precursoare ale unei proliferări tisulare.

Figura 4 [anonimizat] 100 x

Figura 4

Fragment de membrană sinovială cu minimă hiperplazie a sinoviocitelor și discrete depozite de fibrină în suprafață.

În imaginea cu genunchiul implantat cu grefa de ligament mixt sintetic biologic (fig.5) [anonimizat]ii de fibre sintetice, depunere observată și la analiza microscopică a secțiunilor de ligament.

Figura 5

În urma testelor fizico-chimice, morfologice, mecanice și a testelor pe animale, a fost selectată ca fiind compoziție optimă de acoperire amestecul din hidrolizat de colagen și gel de colagen în proporție 50:50 reticulate cu glutaraldehidă. Este de menționat că această compoziție asigură lucrabilitate maximă și o funcționalizare omogenă a ligamentului LARS, inclusiv în interiorul acestuia deoarece hidrolizatul de colagen este mai puțin vâscos și are, de asemenea, o solubilitate mai bună. Luând în considerare aceasta compoziție optimă, în continuare este descris procedeul de realizare a modelului funcțional de ligament din polimeri sintetici acoperit cu colagen tip I.

Activitatea 4.3. Realizare model funcțional ligament din polimeri sintetici acoperit cu colagen tip I

În etapa anterioară s-au realizat și caracterizat modelele experimentale de ligamente LARS funcționalizate.

Pentru funcționalizare au fost propuse următoarele compoziții:

– Proba I.1. – gel de colagen din dermă bovină, pH -7.4, c = 0.5%, reticulat

– Proba I.2. – colagen hidrolizat din dermă bovină, pH -7.4, c = 0.5%, reticulat

– Proba II.1. – gel de colagen + colagen hidrolizat din dermă bovină, pH -7.4, c = 0.5%, reticulat

Ținând cont de rezultate anterioare, din punct de vedere al abilitații de depunere pe ligamentul LARS, în această etapă s-au utilizat doar compoziția: gel de colagen + colagen hidrolizat din dermă bovină, pH -7.4, c = 0.5%, reticulată cu glutaraldehidă. Mai multe amănunte sunt prezentate în cererea de brevet.

În Figura 6 este prezentată o imagine a soluției optime pentru funcționalizare, pe baza de hidrolizat și gel de colagen.

Ligamentul LARS a fost furnizat de către P4 în vederea funcționalizarii. Ligamentul LARS a fost imersate în amestecul gel + hidrolizatul de colagen timp de 30 min (Figura 2), urmat de uscare la 300°C în etuvă. În Figura 7 este prezentat ligamentul LARS în timpul imersării. După uscare (Figura 8) probele au fost sterilizate cu raze X și trimise pentru analize către partenerul P1 si P4 și spre testare către CO.

Figura 8. Ligament LARS funcționalizat

Activitate 4.4. Caracterizarea fizico-chimică și structurală a ligamentului din polimeri sintetici acoperit cu colagen tip I

Analiza FTIR este concludentă și pune în evidență prezența structurilor colagenice de pe suprafața ligamentului sintetic, în special prin benzile din domeniul 1400 – 1650cm-1 benzi aferente grupărilor amidice specifice doar colagenului (polimerul sintetic nu absoarbe în această zonă) (Figura 9).

Analiza FTIR a fost înregistrată în 3 zone distincte, spectrele rezultate fiind practic identice s-a considerat faptul că depunerea a fost omogenă la scală macro și s-a recurs la analiza prin microscopie FTIR pentru evidențierea omogenității la scala micrometrică. Omogenitatea depunerii a fost analizată prin microscopie FTIR (Figura 10).

Figura 9. Spectrul FTIR corespunzător ligmentului funcționalizat

Astfel, depunerea structurilor colagenice a fost evidențiată prin înregistrarea imaginilor FTIR la 728cm-1 (aferentă ligamentului sintetic utilizat) și respectiv la 1647cm-1 (aferentă structurilor colagenice utilizate pentru modificarea suprafeței). Analiza comparativă a celor două imagini de microscopie FTIR evidențiază o omogenitate foarte bună chiar și la scală milimetrică.

Imaginile de microscopie electronică (Figura 11) au fost înregistrate pe proba funcționalizată conform procedeului descris în etapa anterioară. În scopul analizei, au fost analizate două zone caracteristice ligamentului și anume zona activă, centrală, neîmpletită a ligamentului precum și o zonă împletită. În ambele zone se poate observa ca fibrilele de PET are un diametru de ~20um și că acestea sunt extrem de netede cea ce, coroborat cu analiza FTIR confirmă omogenitatea depunerii structurii colagenice.

Figura 11. Imagini SEM relevante caracteristice ligamentului sintetic funcționalizat

Activitatea 4.5. Testare preclinică model funcțional

În cadrul etapei, s-au realizat de către INCDMTM încercări statice pentru determinarea rezistenței la tracțiune, deformației și alungirii specifice pe modelul funcțional al ligamentului artificial funcționalizat cu colagen, realizat de UPB în colaborare cu Institutul National de Cercetare-Dezvoltare pentru Textile si Pielărie București. Pentru încercările statice în vederea determinării rezistenței la tracțiune, deformației și a alungirii s-a utilizat un echipament universal de încercare HOUNSFIELD de tip H10KT, seria 0034, dotat cu o celulă de forță nr.:0198107, cu domeniul 1-10.000N, în clasa 0,5 producător Hounsfield Anglia.

În vederea fixării pe mașină s-a utilizat un sistem de prindere care asigură fixarea fermă fără a deteriora structura fibrelor ligamentului, împiedicând alunecarea acestuia în timpul încercării la tracțiune. Dispozitivul cu ligamentul montat în vederea încercării mecanice a celor două porțiuni, cea activă (a) și respectiv zona de legătură (b) este prezentat în figura 12.

Pentru testare s-a utilizat aceeași subrutină de încercare utilizată și în cazul testării modelului experimental pentru a putea face o comparație cu rezultatele obținute anterior

Figura 12. Dispozitivul de fixare a celor două porțiuni ale ligamentului

Încărcarea specimenului s-a realizat cu o viteză de tracțiune de 10mm/min. Încercarea s-a oprit la ruperea în proporție de minim 80% a fibrelor ligamentului.

S-a testat atât porțiunea superioară cât și pe cea inferioară a zonei de legătură a ligamentului.

În figura 13 a. este prezentat graficul de variație a forței pe zona superioară de legătură, iar în figura 13 c. se ilustrează modul de rupere al acestei zone.

În figura 13 b. este prezentat graficul de variație a forței pe zona inferioară de legătură, iar în figura 13 d. se ilustrează modul de rupere al acestei zone.

Din studiul curbelor caracteristice se constată o variație neuniformă a forței, neuniformitate care se datorează ruperii treptate a fibrelor ligamentului artificial, orice rupere de fibră determinând o scădere a valorii forței de tracțiune. Valoarea maximă a forței a fost de 1203N, iar alungirea procentuală a fost de 44,6% valori înregistrate pentru porțiunea de inferioară de legătură.

Figura 14 Curba caracteristică pentru zona de legătură la modelul experimental de ligament

Analizând curba caracteristică a deformării modelului funcțional față de modelul experimental (figura 14), în zona de legătură se observă o comportare mai bună a modelului funcțional prin o deformare mai uniformă și o rezistență la rupere mai mare. De asemenea modelul funcțional este mai rigid în zonele de legătură decât modelul experimental având o deformație procentuală mai mică.

În figura 15 sunt prezentate curba caracteristică a porțiunii active a modelului funcțional de ligament funcționalizat și modalitatea de rupere a acestuia.

Se remarcă faptul că pentru zona activă (figura 15.b) ruperea nu s-a produs în porțiunea de lucru, ci puțin mai jos, iar cele două fragmente nu s-au separat total, oprirea încercării fiind determinată de scăderea masivă a forței de tracțiune datorită ruperii unui număr mare de fibre componente.

Figura 15. Curba caracteristică și ruperea în zona activă a modelului funcțional de ligament funcționalizat

Figura 16 Curba caracteristică pentru zona activă la modelul experimental de ligament

Analizând curba caracteristică a deformării modelului funcțional față de modelul experimental, în zona activă (figura 16) se observă o comportare mai bună a modelului funcțional prin o deformare mai uniformă și o rezistență la rupere mai mare. De asemenea modelul funcțional este mai elastic decât modelul experimental având o deformație procentuală mai mare în zona activă.

Rezultatele încercărilor sunt centralizate în tabelul 1.

Tabelul 1- Rezultatul testelor statice

Rezultatele rezistenței la tracțiune relevă o îmbunătățire a caracteristicilor modelului funcțional față de modelul experimental. Pentru cele două zone ale ligamentului se constată aspectul neliniar al curbelor caracteristice, din cauza ruperii progresive a fibrelor ce compun ligamentul. Toate zonele testate au prezentat deformații similare, reliefând un comportament elastic prin alungirea procentuală ridicată.

Activitatea 4.6. Elaborare fișă de produs și specificație tehnică ligament sintetic din polimeri sintetici acoperit cu colagen tip I

Fișa de produs care cuprinde și specificații tehnice este prezentată în anexa la prezentul raport.

Activitatea 4.7. Diseminarea rezultatelor prin publicarea de articole științifice în reviste de specialitate obținute

și

Activitatea 4.10. Diseminare prin participarea la congrese, simpozioane, manifestări științifice în domeniu

În această etapă diseminarea s-a efectuat prin participarea tuturor partenerilor. Au fost elaborate lucrări prezentate la conferințe internaționale și au fost publicate articole în reviste de specialitate, după cum urmează:

Articole

M. Yipel, M. V. Ghica, M. G. Albu Kaya, A. Spoiala, M. Radulescu, D. Ficai, A. Ficai, C. Bleotu, C. Nitipir, Trends in materials science for ligament reconstruction 2017 Current Stem Cell Research & Therapy 2212-3946, Factor impact 2,684, volum 12-2017 facicola 2, numar de acces: WOS:000390784200006, DOI: 10.2174/1574888X106661511 0210595

Congrese

D.A. Kaya, M.G. Albu Kaya, Z. Vuluga, N. Duran, F. Ayanoglu, I. Titorencu, Natural antimicrobial and biocompatible coatings for metallic implants, Congresul de Medicina Dentara cu participare-Internationala-a-XXII-a Editie a Zilelor Stomatologice Banatene, 4-6 mai 2017, Timisoara.

Prof. Dr. Popescu Gheorghe Ion, Dr Baciu C, Dr. Soare G, Dr. Andrei B, Dr. Apostolescu R, Mixed Synthetic and Biological Grafts in Cruciate Ligament Reconstruction, Congresul National de Ortopedie si traumatology cu participare internationala a XVII-a editie 18-21 Octombrie, Timisoara http://www.sorot.ro/

Conferinte

A.G. Simonca, M.M. Marin, I. Rau, M.V. Ghica, M.G. Albu Kaya, C. Chelaru, C. Dinu-Pirvu, New treatment for dentistry regeneration based on metronidazole release from collagen/strontium sponges, 20th Romanian International Conference on Chemistry and Chemical Engineering – RICCCE”, 6 – 9 septembrie 2017, Poiana Brasov

Activitatea 4.8. Realizarea protocolului operator pentru implantare ligament artificial pe subiecți umani

UMF Carol Davila și partenerul cofinanțator au realizat protocolul operator pentru subiecți umani. Acesta cuprinde etapele de pregătire a intervenției, intervenția propriu-zisă și urmărirea postoperatorie a subiecților umani.

Prima etapă după admisia pacientului în sală de operație este poziționarea și stabilizarea acestuia pe masa de operație, astfel încât să avem o mobilitate completă a articulației genunchiului în cauză, cu extensie completă și flexia mai mult de 120°, pe toată durata intervenției chirurgicale.

Poziția pacientului pe masa chirurgicală se face în decubit dorsal, aplicarea unui suport stabilizator lateral la nivelul coapsei și un suport la nivelul piciorului montat în flexie peste 90°. Aplicarea de ciorap compresiv antitrombotic pe membrul inferior contralateral și suport protectiv de silicon la nivel calcanean.

La rădăcina coapsei membrului inferior afectat se va monta banda hemostatică Tourniquet, iar după dezinfecția riguroasă a întregului membru inferior și poziția elevată, aceasta se umflă la o presiune egală cu dublul tensiunii arteriale sistolice. Se practică izolarea câmpului operator cu “sterile drape set” destinat intervenției de reconstrucție ligamentară și apoi după o noua dezinfecție locală la nivelul genunchiului se practică cele 2 portale operatorii (fig17)

Fig. 17

Efectuarea corectă a celor 2 portale cât și efectuarea unui portal accesor sunt cruciale în buna vizualizare și desfășurare a reconstrucției ligamentului încrucișat anterior.

Portalul antero-lateral (AL) este destinat vizualizării întregii cavități articulare și stabilirii exacte a diagnosticului intraoperator cât și tratamentului chirurgical al meniscurilor. Portalul anteromedial (AM) este considerat în general abord de lucru dar în anumite situații are și rol în vizualizare.

Fig. 18

Portalul accesor antero-medial este folosit ca abord de lucru în spațiul intercondilian (notch), cât și pentru efectuarea tunelului femural.

Pentru alegerea poziției portalului antero-lateral se ia ca reper polul inferior al rotulei, iar incizia se realizează în apropierea marginii laterale a tendonului rotulian. Introducerea opticului în genunchi prin acest portal oferă o buna vizualizare a spațiului intercondilian când genunchiul este în hiperflexie cât și o bună vizualizare inferior a inserției tibiale a ligamentului încrucișat anterior.

Poziționarea corectă a portalului antero-medial este foarte importantă în desfășurarea cu succes a intervenției chirurgicale, astfel se introduce artroscopul pe portalul antero-lateral cu genunchiul în flexie între 70-90 de grade și cu ajutorul unui ac de seringa introdus cât mai aproape de marginea medială, direcționat oblic extern către spațiul intercondilian ajustând poziția superior și inferior astfel încât să fie paralel cu plafonul notch-ului intercondilian. Apoi se introduce lama de abrazor acționată rotațional electric la 1500 de rotații pe minut cu care se îndepărtează ligamentul mucos și bontul de ligament încrucișat anterior rupt.

După efectuarea notch-plastiei și abrazare a fațetei interne a condilului lateral se identifică amprenta inserției LIA nativ, (Fig 19)

Figura 19 Figura 20

apoi cu ajutorul ghidului femural se introduce broșa ghid cu diametrul de 2.7mm simultan cu creșterea flexiei genunchiului la aproximativ 120°. Se perforează ambele corticale osoase după care se realizează tunelul primar cu burghiul de diametru 4,5 mm în ambele corticale pentru a permite trecerea completă a butonului de fixare pe corticala externă a femurului, acesta având un diametru de 1,5 mm și lungime 10 mm.

Lungimea ideală a tunelului femural este de aproximativ 40 mm și un minim de 35 mm, pentru a permite o inserție a ligamentului în tunelul osos de minim 20 mm și maxim 35 mm. Diametrul tunelului de inserție se stabilește în funcție de lungimea și diametrul grefei, având în dotare burghie cu mărimi între 6,5 mm și 13 mm crescătoare din 0,5 mm în 0,5 mm (Fig.21,22).După forarea tunelului se măsoară lungimea exactă a tunelului din orificiul de intrare până la suprafața corticalei osoase cu ajutorul jojei și se marchează reperele lungimii pe grefă de ligament și introducerea prin tunel până la suprafața tegumentară cu ajutorul broșei ghid al firului de tracțiune a grefei, păstrând bucla firului în interiorul tunelului.

Figura21 Figura 22

Pregătirea inserției tibiale se face după o inspecție atentă a originii ligamentului, apoi abrazarea bontului cu păstrarea parțială a acesteia (Fig.23)

Figura23 Figura 24

Se introduce rigla și se măsoară dimensiune inserției tibiale (Fig.24), cunoscând faptul că aceasta se află între marginea anterioară și posterioară a inserției cornului anterior al meniscului lateral.

Punctul ideal de inserție a grefei este situat imediat posterior de ligamentul intermeniscal. Poziția și traiectoria tunelului tibial este stabilită după poziționarea genunchiului în flexie 70°-90° și introducerea ghidului tibial prin portalul antero-medial orientat la 55° cu vârful țintitorului la 2-3 mm anterior de marginea posterioară a inserției cornului anterior al meniscului lateral (Fig 25).

Figura 25

După stabilirea finală a poziției ghidului tibial se introduce broșa transtibial până la vizualizarea acesteia în interiorul articulației genunchiului (Fig.26). Poziția finală a broșei putând fi verificată intraoperator imagistic prin fluoroscopie (Fig.27)

Figura 26

Figura 27

După confirmarea poziției potrivite a broșei ghid se practică tunelul tibial cu burghiul canulat având diametrul egal cu cel al grefei ligamentare. Mici ajustări ale grosimii tunelului pot fi făcute cu un burghiu de 5 mm.

Având ambele tuneluri forate se desface steril grefa de ligament mixt sintetic-biologic se verifică diametrele și lungimea acesteia după care se poate iniția introducerea grefei ligamentare montată pe sistemul de fixare ajustabil, tractat în tunelul femural cu ajutorul buclei firului tractor. După așezarea butonului pe suprafața corticalei femurale se tracționează treptat grefa ligamentară până când în spațiul articular intercondilian rămâne doar porțiunea centrală fibrilară.(Fig.28,29).

Figura 28 Figuar 29

Fixarea grefei în tunelul tibial se realizează cu șurub resorbabil după tensionarea grefei între 40-80 N cu ajutorul unui dinamometru cu genunchiul în flexie între 20° și 30°. După finalizarea fixării grefei se introduce artrocopul pe ambele portale pentru inspecția întregii cavități articulare în special al peretelui posterior al condilului femural extern și a plafonului acestuia să nu existe contact cu grefa ligamentară pentru a evita fricțiunea în timpul mișcărilor de flexie extensie, de asemenea se mai verifică cu ajutorul palpatorului tensiunea ligamentului în extensie completă.

În final se montează un drenaj aspirativ prin portalul antero-lateral, sutura portalelor pansamentul plăgilor operatorii și aplicarea de fașă elastică pe întreg membrul inferior.

Pacientul începe programul de recuperare din a doua zi postoperator după suprimarea drenajului aspirativ conform planului de recuperare stabilit de kinetoterapeut, fiind permis încărcarea parțială a greutății pe membrul inferior operat după prima săptămână.

Activitatea 4.9. Identificarea și atribuirea proprietății intelectuale și brevetare soluții originale.

Rezultatele semnificative rezultate în proiect au fost prezentate în cererea de brevet COMPOZIȚII DE ACOPERIRE ALE LIGAMENTELOR DIN POLIMER SINTETIC CU COLAGEN TIP I SI PROCEDEU DE OBȚINERE A ACESTUIA

Invenția se referă la compoziții de acoperire cu colagen tip I a unor ligamente din polimer sintetic (polietilen tereftalat – PET) utilizate în reconstrucția ligamentară și la un procedeu de obținere a acestuia.

Problema tehnică pe care o rezolvă invenția constă în realizarea unor compoziții cu colagen tip I din sub forma de hidrolizat, gel sau combinația acestora obținute din diferite țesuturi (ligament, piele) și surse animale (curcan, bovină) și stabilirea metodei de fixare pe ligamente din polimer sintetic (polietilen tereftalat – PET) pentru îmbunătățirea biocompatibilității pentru a fi utilizate în reconstrucția ligamentară.

Concluzii

La analiza postoperatorie a animalului de studiu în care a fost implantat modelul experimental de ligament funcționalizat cu colagen de tip I s-a constatat că mișcările de flexie-extensie efectuate sub anestezie generală nu au prezentat nicio limitare mecanică, acestea fiind realizate la amplitudinea maximă.

După o săptămână postoperator aspectul plăgilor era favorabil, mersul animalului de studiu era șchiopătat fără sprijin, iar după aproximativ 3 săptămâni acesta a început sprijinul parțial pe membrul operat păstrând mersul șchiopătat până la aproximativ 6 săptămâni după care s-a observat o mobilizare normală.

Ca urmare a rezultatelor testelor fizico-chimice, morfologice, mecanice și a analizei postoperatorie a animalului de studiu, a fost selectat amestecul din hidrolizat de colagen și gel de colagen în proporție 50:50 reticulate cu glutaraldehidă, ca fiind compoziția optimă de acoperire a ligamentului artificial.

Cu această compoziție a fost realizat modelul funcțional de ligament funcționalizat cu colagen, ce a fost supus testării preclinice care a constat în caracterizarea fizico-chimică și structurală și testarea la solicitări statice în vederea determinării rezistenței la rupere a zonei active și de legătură. Rezultatele rezistenței la tracțiune au arătat o îmbunătățire a caracteristicilor modelului funcțional față de modelul experimental. Pentru cele două zone ale ligamentului se constată aspectul neliniar al curbelor caracteristice, din cauza ruperii progresive a fibrelor ce compun ligamentul. Toate zonele testate au prezentat deformații similare, reliefând un comportament elastic prin alungirea procentuală ridicată.

Pe baza rezultatelor obținute care reliefează posibilitatea realizării unor prototipuri de ligamente funcționalizate cu colagen care accelerează recuperarea, UMF Carol Davila și partenerul cofinanțator au realizat un protocol operator pentru intervenții pe subiecți umani.

Rezultatele obținute în cadrul acestei etape au fost diseminate prin elaborarea unui articol științific publicat în revista Current Stem Cell Research & Therapy 2212-3946, cu factor de impact 2,684.

De asemenea s-au prezentat o lucrarea și 2 postere la manifestări științifice iî domeniile medical și chimie.

A fost elaborată fișa produsului ce conține și specificațiile tehnice ale acestuia

Rezultatele semnificative obținute în proiect au făcut obiectul unei cereri de brevet cu titlul: Compoziții de acoperire ale ligamentelor din polimer sintetic cu colagen tip I și procedeu de obținere a acestuia.

În cadrul etapei au fost realizate integral obiectivele propuse.

Bibliografie

1. Ganesh G, Redfern J, Greis P, Burks R. Revision anterior cruciate ligament reconstruction. Am J Sports Med. 2011; 39(1):199-217.

2. Marchant B, Noyes F, Barber-Westin S, Fleckenstein C. Prevalence of nonanatomical graft placement in a series of failed anterior cruciate ligament reconstruction. Am J Sports Med. 2010; 38(10):1987-1996.

3. Kato Y, Ingham JM, Kramer S, Smolinski P, Saito P, Fu F. Effect of tunnel position for anatomic single-bundle ACL reconstruction on knee biomechanics in a porcine model. Knee Surg Sports Traumatol Arthros. 2010; 18(1):2-10.

4. Hensler D, Working z, Illingworth K, Thorhauer E, Tashman S, Fu F. Medial portal drilling: effects on the femoral tunnel aperture morphology during anterior cruciate ligament reconstruction. J Bone Joint Surg Am. 2011; 93(22):2063-2071.

5. Siebold, R. The concept of complete footprint restoration with guidelines for single- and double- bundle ACL reconstruction. Knee Surg Sports Traumatol Arthros. 2011; 19(5):699-706.

6. Ferretti M, Ekdahl M, Shen W, Fu F. The topography of the femoral insertion of the anterior cruciate ligament: an anatomical study. Arthroscopy. 2007; 23(11):1218-1225.

7. Van Eck C, Morse K, Lesniak B, Kropf E, et al. Does the lateral intercondylar ridge disappear in ACL deficient patients. Knee Surg Sports Traumatol Arthros. 2010; 18(9):1184-1188.

8. Shino K, Suzuki T, Iwahashi T, Mae T, et al. The resident’s ridge as an arthroscopic landmark or anatomical femoral tunnel drilling in ACL reconstruction. Knee Surg Sports Traumatol Arthros. 2010; 18(9):1164-1168.

9. Bird J, Carmont M, Dhillon M, Smith N, Brown C, Thompson P, Spalding T. Validation of a new technique to determine midbundle femoral tunnel position in anterior cruciate ligament reconstruction using 3-D computed tomography analysis. Arthroscopy. 2011; 27(9):1259-1267.

10. 10.Lobenhoffer P, Bernard M, Agneskirchner J. Quality assurance in cruciate ligament surgery. Arthroscopie. 2003; 16:202-208. German

11. Passler H, Hoher J. Intraoperative quality control of the placement of bone tunnels for the anterior cruciate ligament. Unfallchirurg. 2004;107(4):263-72. German

12. 12.Bernard M, Hertel P, Hornung H, Cierpinski Th. Femoral insertion of the ACL. Radiographic quadrant method. Am J Knee Surg. 1997; 10:14-22.

13. 13.Columbet P, Robinson J, Christel P, Franceschi J-P, et al. Morphology of anterior cruciate ligament attachments for anatomic reconstruction: a cadaveric dissection and radiographic study. Arthroscopy. 2006; 22(9):984-992.

14. 14.Siebold, R, Benetos I, Sartory N, He z, et al. How to avoid the risk of intraoperative cartilage damage in anatomic four tunnel double bundle anterior cruciate ligament reconstruction. Knee Surg Sports Traumatol Arthros. 2010; 18(1):64-67.

15. Amis A, Jakob R. Anterior cruciate ligament graft positioning, tensioning and twisting. Knee Surg Sports Traumatol Arthros 1998; 6:S2-S12 (Suppl 1)

16. 16.Staubli HU, Rauschning W. Tibial attachment area of the anterior cruciate ligament in the extended knee position. Anatomy and cryosections in vitro complemented by magnetic resonance arthrography in vivo. Knee Surg Sports Traumatol Arthros. 1994; 2:138-146.