Ramoplanina

Introducere

Începând cu anul 1929, odată cu descoperirea penicilinei de către Alexander Fleming, un număr foarte mare de entități moleculare distincte de antibiotice au fost autorizate în terapia bolilor infecțioase de etiologie bacteriană.

Progresele realizate în cadrul cercetărilor care au drept scop descoperirea de noi antibiotice antibacteriene, nu ar fi fost posibile fără identificarea unor ținte (enzime, receptori membranari, situsuri ribozomale) implicate în metabolismul microbian, prin a căror inhibare apare un efect bacteriostatic sau bactericid.

Antibioticele antibacteriene acționează prin mecanisme variate, cele mai importante fiind bazate pe inhibiția biosintezei unor componente ale peretelui celular (peptidoglicanul) sau a unor etape din cursul biosintezei unor molecule (folați reduși) sau macromolecule (proteine, enzime, acizi nucleici). Alte ținte mai recent identificate, care oferă cercetătorilor posibilitatea dezvoltării de noi agenți antibacterieni sunt proteaza I (endopeptidază membranară cu rol în semnalizarea celulară), translocaza (enzimă care catalizează transferul unui precursor de peptidoglican pe un transportor membranar), peptidil-deformilaza (metalo-hidrolază cu rol în translație), enoil-ACP-reductaza și β-cetoacil-sintetaza (enzime cu rol în biosinteza acizilor grași bacterieni), respectiv lipida II, care se află la nivelul membranei celulare și este ancorată de peretele celular(1).

Lucrarea de față, sistematizează datele din literatura de specialitate a ultimilor ani, referitoare la cercetările realizate în domeniul dezvoltării de antibiotice antibacteriene care au ca țintă lipida II. Acest grup de antibiotice include lantibioticele (nisina, lacticina 3147, epidermina, galidermina), ramoplanina și manopeptimicinele. Activitatea antibacteriană a acestora este orientată în principal asupra bacteriilor Gram pozitive.

Teza de licență, structurată în 4 capitole principale, include informații specifice chimiei farmaceutice și anume: aspecte de structură, mecanism de acțiune, spectru antibacterian, posibilități de obținere, relații structură-activitate.

NECESITATEA DEZVOLTĂRII DE NOI MOLECULE DE ANTIBIOTICE ÎN CONTEXTUL REZISTENȚEI BACTERIENE ÎN CREȘTERE

Aspecte generale

Progreselor remarcabile realizate în domeniul cercetării și dezvoltării de compuși cu proprietăți antimicrobiene au condus la introducerea in terapia infecțiilor bacteriene a unui număr de peste 200 de antibiotice(1).

Cu toate acestea, bolile infecțioase de origine bacteriană dețin o pondere importantă în patologia generală a secolului XXI, cele mai frecvente fiind infecțiile respiratorii și bolile diareice. Aceste afecțiuni sunt o adevărată provocare pentru cei care profesează în domeniul medical, ridicând numeroase probleme în ceea ce privește instituirea unui tratament corect și eficient pentru pacient.

Statistic, mai mult de 20 de milioane de oameni își pierd viața anual datorită bolilor infecțioase bacteriene. Una dintre cauzele mortalității ridicate este pierderea eficacității inițiale a antibioticelor antibacteriene, fenomenul de rezistență bacteriană fiind din ce în ce mai des întâlnit(1). Rezistența la antibiotice este o problemă majoră de sănătate publică, cu manifestare la nivel global. În conformitate cu Centrul de Prevenire și Control al Bolilor, peste 2 milioane de oameni sunt diagnosticați anual în Statele Unite ale Americii cu infecții datorate bacteriilor rezistente. Ca rezultat al acestor infecții, 23.000 de persoane își pierd viața în fiecare an(2).

Principalii factori de risc pentru apariția unui număr tot mai mare de tulpini bacteriene rezistente la antibiotice sunt:

Utilizarea excesivă a noilor antibiotice cu eficacitate antibacteriană crescută ca terapie de primă intenție;

Utilizarea pe scară largă a antibioticelor în medicina veterinară;

Deseori, antibioticele sunt prescrise în mod eronat în infecții virale ale tractului respirator;

Utilizarea necorespunzătoare a antibioticelor prin administrarea unor doze prea mici sau prea mari față de cele adecvate pacientului în cauză;

Durata prea scurtă sau prea lungă a tratamentului cu antibiotice;

Neadaptarea tratamentului cu antibiotice cu rezultatele antibiogramei;

Creșterea numărului de bolnavi imunosupresați;

Spitalizarea îndelungată, cu riscul apariției de infecții nosocomiale, cauzate de bacterii patogene multi-drug rezistente;

Nerespectarea cu strictețe a măsurilor de control al infecțiilor de către personalul medical;

Numărul mic de molecule noi introduse în terapie în ultimii ani, datorită interesului scăzut al companiilor farmaceutice pentru dezvoltarea de antibiotice(1, 3, 4).

Mecanismele rezistenței bacteriene

Rezistența bacteriilor la antibiotice se instalează prin următoarele mecanisme (Figura 1):

Rezistența mediată enzimatic;

Rezistența prin modificarea structurală a situsului de legare al antibioticului;

Rezistența prin impermeabilizare;

Rezistența prin pomparea activă a antibioticului la exteriorul celulei bacteriene(1).

Figura 1. Mecanismele rezistenței la antibiotice

Rezistența mediată enzimatic este cel mai frecvent mecanism de rezistență. Este caracteristic beta-lactaminelor, aminoglicozidelor și cloramfenicolului.

Beta-lactamazele sunt enzime cu capacitatea de hidroliză a ciclului beta-lactamic al antibioticelor beta-lactamice, ceea ce duce la inactivarea completă a antibioticului. Bacteriile își pierd astfel sensibilitatea la beta-lactamine, prin sinteza de beta-lactamaze. Acestea sunt clasificate, pe baza mecanismului de hidroliză a ciclului beta-lactamic, în beta-lactamaze cu mecanism serinic, care inactivează majoritatea penicilinelor, cefalosporinelor și monobactamelor și metalo-beta-lactamaze, care prin intermediul atomului de zinc, reușesc să inactiveze carbapenemele. Aceste enzime au un rol important în dezvoltarea rezistenței bacteriene la antibiotice. Totuși, problema rezistenței prin secreția de enzime care inactivează beta-lactaminele a fost parțial contracarată prin utilizarea unor substanțe care au proprietatea de inhibare a beta-lactamazelor: acid clavulanic, sulbactam, tazobactam (Figura 2).

Figura 2. Inhibitori de beta-lactamaze

Necesitatea dezvoltării de noi molecule se explică prin faptul că unele beta-lactamaze sunt rezistente la inhibitorii de beta-lactamaze cunoscuți în prezent. Astfel, cercetătorii își îndreaptă atenția în direcția descoperirii de noi molecule de inhibitori sau spre obținerea de noi substanțe cu proprietăți antimicrobiene.

Enzimele modificatoare de aminoglicozide conduc la obținerea unor antibiotice cu structură chimică diferită, care își pierd capacitatea de a bloca sinteza proteică. Modificările care duc la inactivarea aminoglicozidelor au loc la nivelul grupărilor amino și hidroxil, prin mecanisme de acetilare, adenilare și fosforilare (Figura 3). Astfel, enzimele se clasifică în funcție de grupa transferată în: acetiltransferaze, adeniltransferaze și fosfotransferaze(1, 4).

Figura 3. Kanamicina și locurile de acțiune ale enzimelor modificatoare

Rezistența la cloramfenicol se datorează unei enzime, acetiltransferaza, care acetilează grupările OH din molecula acestuia. Sub acțiunea enzimei, cloramfenicolul este transformat în 3-acetil-cloramfenicol și 1,3-diacetilcloramfenicol, compuși lipsiți de activitate antibacteriană (Figura 4)(1).

Figura 4. Inactivarea cloramfenicolului sub acțiunea acetiltransferazei

Rezistența prin modificarea țintei se datorează unor mutații genetice în urma cărora apar modificări structurale la nivelul situsului de legare al antibioticului.

Sensibilitatea stafilococilor și pneumococilor la beta-lactamine este afectată prin modificarea proteinelor fixatoare de peniciline (PBP). Tulpinile de enterococi rezistenți la vancomicină sunt din ce în ce mai întâlnite. Aceste tulpini bacteriene devin rezistente prin modificarea secvenței D-alanină-D-alanină din structura precursorului de peptidoglican, cu o secvență D-alanină-D-lactat, legarea antibioticului de ținta sa moleculară fiind astfel imposibilă. Diminuarea legării de ribozomi, consecutiv modificării situsurilor proteice receptoare, conduce la instalarea rezistenței anumitor bacterii față de tetracicline, macrolide, lincosamide și aminoglicozide. Modificarea secvenței de aminoacizi din structura ADN-girazei, conduce la diminuarea afinității enzimei țintă pentru fluorochinolone și astfel la instalarea fenomenului de rezistență(1). Totodată, modificarea dihidropteroat sintetazei și a dihidrofolat reductazei, îngreunează acțiunea inhibitorie a sulfamidelor și trimetoprimului pentru aceste enzime(4).

Rezistența prin modificarea permeabilității membranei bacteriene pentru antibiotic se datorează unor alterări structurale ale învelișurilor bacteriene sau unor modificări la nivelul sistemelor de transport activ al antibioticelor în interiorul celulei bacteriene.

Unele tulpini bacteriene Gram negative devin impermeabile pentru betalactamine și chinolone prin diminuarea sintezei porinelor, cu diminuarea consecutivă a numărului de porine funcționale. Astfel, numărul de molecule de antibiotic pătrunse în celula bacteriană scade. În cazul bacilului Pseudomonas aeruginosa, dezvoltarea impermeabilității peretelui celular se datorează reducerii în dimensiune a porinelor, acestea devin foarte înguste și astfel nu mai permit pătrunderea în celulă a multor antibiotice.

De asemenea, membrana citoplasmatică constituie o barieră importantă pentru antibioticele hidrofile, cum sunt aminoglicozidele. Pentru a-și exercita efectul, aceste antibiotice trebuie să ajungă la locul de acțiune intracelular. Acest lucru se realizează prin transportul activ al antibioticelor prin membrană, cu ajutorul proteinelor transportoare. Pseudomonas aeruginosa a dezvoltat rezistență față de aminoglicozide prin modificări structurale la nivelul transportorilor(1, 4).

În cazul rezistenței prin pomparea activă a antibioticului în exteriorul celulei bacteriene, bacteriile utilizează pompe de eflux, prin intermediul cărora antibioticul este înlăturat din interiorul celulei, împiedicându-se astfel realizarea de concentrații intracelulare eficiente. Cea mai importantă pompă de eflux pentru rezistența bacteriilor la antibiotice este pompa RND (Resistance Nodulation and Cell Division)(1). Acest mecanism de rezistență bacteriană se întâlnește în cazul bacteriilor gram-negative, un exemplu fiind Pseudomonas aeruginosa rezistent la fluorochinolone(5). Cercetările actuale urmăresc descoperirea de compuși cu structură asemănătoare chinolonelor, capabili să țintească acești transportori și care pot inhiba pompele de eflux. Utilizarea de inhibitori ai pompelor de eflux, în asociere cu antibiotice anti-pseudomonas, urmărește contracararea rezistenței bacteriei la fluorochinolone(1).

Bacterii cu un nivel ridicat al rezistenței

Staphylococcus aureus

La scurt timp de la introducerea penicilinei în terapie, incidența cazurilor de infecții cu tulpini de S.aureus rezistente a crescut, atingându-se în prezent un procent de peste 90%. Ulterior, în anul 1961, la doar 2 ani de la descoperirea meticilinei, a fost izolată prima tulpină MRSA (Methicillin-resistant Staphylococcus aureus) în Marea Britanie.

Stafilococii dobândesc rezistență la β-lactamine prin sinteza de β-lactamaze și prin prezența unei mutații în cromozomul bacterian la nivelul genei mecA responsabilă de sinteza PBP2a cu afinitate scăzută pentru β-lactamine. Pe de o parte, sinteza de penicilinaze conferă rezistență la penicilinele cu spectru îngust, iar fenotipul legat de prezența acestor enzime este penicilină-rezistent-meticilină-sensibil. De asemenea, penicilinazele sunt inhibate de acidul clavulanic. Pe de altă parte, fenotipul asociat prezenței PBP2a este penicilină-rezistent-meticilină-rezistent, determinând rezistență incrucișată la toate beta-lactaminele(3). În plus față de rezistența la beta-lactamine, aceste tulpini sunt frecvent asociate cu rezistența și la aminoglicozide, tetracicline, macrolide, cloramfenicol și fluorochinolone(1).

Rezistența multiplă la antibiotice înregistrează o prevalență crescută de peste 60 de ani, în anul 1959 fiind descrise peste 40% tulpini rezistente la mai multe antibiotice, într-un spital din Seatle(3). În prezent, antibioticul de ales într-o infecție cu S.aureus multi-drug rezistent este vancomicina, deși concentrația minimă inhibitorie a acesteia este într-o continuă creștere, ceea ce duce implicit la o scădere a eficacității în unele infecții grave(1).

Enterococcus faecium și Enterococcus faecalis

În mod normal, Enterococcus faecium și Enterococcus faecalis se găsesc la nivelul intestinului omului și au un nivel scăzut de patogenitate. În funcție de statusul imun al pacienților, enterococii pot determina infecții urinare, genitale, biliare, endocardite și septicemii(6).

În prezent, se cunosc 6 tipuri de rezistență a enterococilor la vancomicină: VanA, VanB, VanC, VanD, VanE și VanG. Dintre acestea, 5 tipuri de rezistență sunt inductibile (VanA, B, D, E și G), iar rezistența VanC este constitutivă. VRE VanA este rezistent atât la vancomicină cât și la teicoplanină și apare datorită utilizării excesive a celor două glicopeptide. VRE VanB este rezistent doar la vancomicină, tulpinile fiind sensibile la teicoplanină. VRE VanC este parțial rezistent la vancomicină(1, 7).

Enterococii dobândesc rezistență la vancomicină prin alterarea secvenței de aminoacizi terminali D-Ala-D-Ala din constituția subunităților peretelui celular. Prin modificarea unui singur aminoacid din structura precursorului de peptidoglican, afinitatea antibioticului față de ținta sa moleculară scade. Secvența D-alanină-D-lactat nu mai permite realizarea uneia dintre cele 5 legături de hidrogen, prin care vancomicina se leagă de ținta sa, și astfel afinitatea de legare scade de 1000 de ori (Figura 5)(1, 5).

Secvența D-alanină-D-serină conferă un nivel mai scăzut al rezistenței la vancomicină, afinitatea antibioticului față de ținta sa moleculară fiind diminuată doar de 6 ori(5). Tratamentul curent care se instituie în infecțiile datorate enterococilor rezistenți la vancomicină constă în monoterapie cu linezolid(1).

Figura 5. Diminuarea interacțiunii vancomicinei cu ținta

Noi antimicrobiene active pe bacterii cu un nivel ridicat al rezistenței

În ultimii ani, companiile de medicamente au lansat pe piața farmaceutică, agenți terapeutici destinați utilizării în tratarea infecțiilor severe cu bacterii rezistente la antibioticele clasice. Daptomicina, tigeciclina, linezolid și combinațiile quinupristină/dalfopristină și ceftolozan/tazobactam sunt exemple de astfel de noi molecule autorizate în terapie.

Daptomicina este un antibiotic natural, obținut din culturi de Streptomyces roseosporus. Spectrul de activitate esre restrâns la bacteriile Gram pozitive, fiind un compus eficient împotriva tulpinilor de enterococi și stafilococi rezistenți la glicopeptide. Structural, daptomicina este o lipopeptidă macrolactonică, alcătuită din 13 aminoacizi, dintre care 10 sunt incluși într-un ciclu, iar 3 alcătuiesc catena laterală, acilată la capătul N-terminal cu un rest decanoil (Figura 6). Datorită masei moleculare mari, absorbția la nivelul tractului gastro-intestinal este redusă, astfel încât se administrează intravenos(8).

Figura 6. Structura daptomicinei

Tigeciclina face parte din clasa glicilciclinelor, care sunt derivate structural din tetracicline, fiind concepute cu scopul de a contracara bacteriile devenite rezistente la tetracicline (Figura 7). Tigeciclina este activă atât pe bacterii Gram pozitive, inclusiv MRSA, cât și pe bacterii Gram negative cum sunt cele din familia Enterobacteriaceae(9, 10).

Figura 7. Structura tigeciclinei

Linezolidul (Figura 8) este primul compus autorizat în terapie dintr-o nouă clasă de antibiotice active pe bacterii Gram pozitive, denumită clasa oxazolidinonelor(10). Această clasă se caracterizează printr-un mecanism de acțiune nou. Linezolidul acționează prin blocarea sintezei proteice în faza de inițiere, după o prealabilă fixare de ribozomi la nivelul subunității 50S(1, 10). De la autorizarea acestuia, începând cu anul 2000, au fost raportate cazuri izolate de VRE si MRSA rezistenți la linezolid(10).

Figura 8. Structura linezolidului

Quinupristina (Figura 9) și dalfopristina (Figura 10) sunt doi derivați semisintetici din clasa streptograminelor, care se utilizează în combinație, în raport masic de 30:70. Spectrul de activitate in vitro include bacterii Gram pozitive aerobe și anaerobe, bacterii Gram negative, precum și bacterii cu dezvoltare intracelulară, responsabile de numeroase infecții. Quinupristina/dalfopristina inhibă sinteza proteinelor bacteriene, prin fixarea fiecărui component de un situs diferit al subunității ribozomale 50S. Dalfopristina produce o modificare conformațională la nivel ribozomal, care duce la creșterea afinității ribozomilor pentru quinupristină. Fiecare din cele două streptogramine acționează bacteriostatic, dar efectul devine bactericid în urma asocierii acestora(10, 11). Combinația quinupristină/dalfopristină este activă pe Staphylococcus aureus meticilino-rezistent, Streptococcus pyogenes și Enterococcus faecium rezistent la vancomicină. Este un antibiotic de rezervă utilizat în infecții grave produse de bacterii multi-drug rezistente(1).

Figura 9. Structura quinupristinei

Figura 10. Structura dalfopristinei

Ceftolozan (Figura 11) este o nouă cefalosporină antipseudomonas din generația 5, care se utilizează în asociere cu tazobactam, un inhibitor ireversibil al beta-lactamazelor cu spectru larg (BLSL). Combinația ceftolozan/tazobactam se utilizează pentru tratamentul infecțiilor datorate bacteriilor Gram negative rezistente la antibioticele convenționale. Este activă pe:

Pseudomonas aeruginosa, inclusiv tulpini multi-drug rezistente;

Eschericia coli, inclusiv tulpini ELBS-pozitive;

Klebsiella pneumoniae, inclusiv tulpini ELBS-pozitive(12).

Această combinație a fost aprobată de FDA pentru tratamentul infecțiilor de tract urinar, inclusiv pielonefrite, și pentru tratamentul infecțiilor intraabdominale complicate, în asociere cu metronidazol. Se comercializează sub denumirea de Zerbaxa®, pulbere pentru preparate injectabile(13).

Figura 11. Structura ceftolozanului

Rolul lipidei II în biosinteza peretelui celular

Peretele celular bacterian este prezent atât la bacteriile Gram pozitive, cât și la cele Gram negative(14). Peretele celular are o structură complexă și îndeplinește următoarele roluri:

Constituie o barieră selectivă cu rol protector;

Menține forma bacteriilor;

Intervine în creșterea, dezvoltarea și diviziunea bacteriilor(14, 15).

Componenta principală a peretelui bacterian este peptidoglicanul. Acesta este un heteropolimer repetitiv, cu greutate moleculară mare și cu o structură tridimensională. Peptidoglicanul este alcătuit din 2 componente: componenta glucidică și componenta peptidică.

Componenta glucidică este reprezentată de lanțuri lungi de glicani. Entitățile structurale ale glicanului sunt N-acetilglucozamina și acidul N-acetilmuramic, legate prin intermediul unor legături glicozidice β(1-4).

Componenta peptidică este formată din tetrapeptide legate de acidul N-acetilmuramic. Tetrapeptidele sunt constituite din L și D-aminoacizi: L-alanină, acid D-glutamic, acid diaminopimelic sau L-lizină, D-alanină(16).

Biosinteza peptidoglicanului (Figura 12) începe în citoplasma celulei, la nivelul membranei. Aici are loc transferul subunității de acid N-acetilmuramic-pentapeptid de pe UDP pe un alt transportor, bactoprenil pirofosfat, cu formarea lipidei I. Ulterior, prin adăugarea N-acetilglucozaminei, are loc formarea lipidei II. Astfel lipida II este constituită din întreaga subunitate a peptidoglicanului, conectată, prin intermediul grupării pirofosfat, la restul poliizoprenoid înglobat în membrana celulară(17, 18).

Lanțul poliizoprenoid este format din 11 unități de izopren: opt unități de izopren cu o conformație cis, urmată de două unități cu o conformație trans și o unitate terminală(19). Lipida II este transportată pe partea exterioară a membranei celulare, în spațiul periplasmatic, printr-un mecanism necunoscut până în prezent(17).

Figura 12. Biosinteza peptidoglicanului

Următoarea etapă în biosinteza peretelui celular este reprezentată de transferul subunității de peptidoglican, de pe lipida II pe un primer de peptidoglican. Această etapă este catalizată de proteinele fixatoare de peniciline (PBP) situate la nivelul membranei celulare. Transportorul poliizoprenoid de care este atașată gruparea pirofosfat se desprinde și revine pe partea citoplasmatică a membranei celulare. După defosforilarea la forma monofosfat, acesta poate fi reutilizat în continuare pentru sinteza peretelui celular.

Lipida II (Figura 13) este un component minoritar al membranei citoplasmatice. Cu toate acestea, lipida II are un rol fundamental în biosinteza peretelui celular. Studiile ilustrează că un singur ciclu mediat de Lipida II, din cadrul biosintezei peretelui celular durează mai puțin de o secundă, de unde importanța lipidei II în creșterea, dezvoltarea și diviziunea accelerată a bacteriilor(19). Astfel lipida II reprezintă o țintă ideală pentru numeroase antibiotice precum vancomicina, ramoplanina, manopeptimicinele și lantibioticele(17).

Figura 13. Structura lipidei II

Noi antibiotice care acționează prin intermediul lipidei II

Marile companii de medicamente încearcă să depășească problema rezistenței la antibiotice prin cercetare avansată și accelerată, în vederea dezvoltării unor noi molecule cu activitate antibacteriană, cu un mecanism de acțiune diferit precum și cu proprietăți biofarmaceutice și farmacocinetice superioare antibioticelor utilizate în prezent în terapia antiinfecțioasă.

Cel mai frecvent, antibioticele își exercită acțiunea antibacteriană printr-un mecanism specific de acțiune: de exemplu, penicilinele și alte beta-lactamine inhibă biosinteza peptidoglicanului, prin acilarea unor sisteme enzimatice, denumite și proteine fixatoare de peniciline. Aminoglicozidele blochează inițierea sintezei proteice bacteriene, prin fixarea ireversibilă de ribozomi la nivelul subunităților 30S. Tetraciclinele blochează sinteza proteică în faza de elongație, prin împiedicarea fixării aminoacil-ARNt pe situsul acceptor de pe ribozomul 30S(20). Astfel, cele mai importante mecanisme se bazează pe inhibiția biosintezei unor componente ale peretelui celular sau pe blocarea unor etape din biosinteza proteinelor(1).

Cercetătorii își îndreaptă din nou atenția spre descoperirea de noi antibiotice în mediile de cultură ale unor specii de bacterii sau fungi, bazându-se pe originea naturală a acestora, ușurința cu care pot fi produse, spectrul de activitate și mecanismul diferit de acțiune(20).

O etapă importantă în cadrul cercetării de noi antibiotice constă în identificarea unei ținte noi, implicată în metabolismul bacterian, prin legarea căreia să apară efectul bacteriostatic sau bactericid dorit(1).

Lipida II este o țintă moleculară mai recent identificată, care oferă cercetătorilor posibilitatea dezvoltării de noi molecule cu activitate antibacteriană. Noii agenți aflați în cercetare care acționează prin intermediul lipidei II sunt lantibioticele, ramoplanina și manopeptimicinele(17).

LANTIBIOTICE

Definiție

Lantibioticele sunt un grup de antibiotice peptidice. Acestea fac parte din categoria peptidelor sintetizate la nivel ribozomal, care ulterior suferă modificări post-translaționale(21). Din punct de vedere structural, lantibioticele conțin numeroase resturi de aminoacizi cu sulf: lantionină și β-metil-lantionină. Lantionina (Figura 14) este alcătuită din două resturi de α-alanină legate prin intermediul unei punți tioeterice la nivelul atomilor de carbon din poziția beta, iar β-metil-lantionină dintr-un rest de acid aminobutiric și un rest de alanină(22).

Figura 14. Structura lantioninei

Istoric

Descoperirea primului lantibiotic, nisinul, datează încă din anul 1928(23). Acesta a fost inițial descris ca fiind o substanță care împiedică dezvoltarea unor colonii de streptococi de grup N. Berridge a fost primul cercetător care a identificat, în anul 1949, prezența mai multor resturi de lantionină în structura peptidică a nisinului(24). Structura completă a acestui lantibiotic a fost elucidată abia în anul 1971, ca rezultat al studiilor realizate de Gross și Morell(20). Începând cu anul 1985, un număr impresionant de lantibiotice au fost descoperite: epidermina, mersacidina, lacticina 481, pep 5, cinamicina și lacticina 3147. Acestea sunt molecule prototip pentru diferite subcategorii de lantibiotice(24).

Termenul “lantibiotic”, care conferă numele acestei clase de substanțe, a fost introdus de către Schnell și colaboratorii săi în anul 1988(25). Acest termen ilustrează faptul că fiecare entitate moleculară conține lantionină și totodată evidențiază originea naturală a acestor substanțe cu activitate antibacteriană(24).

Obținerea lantibioticelor prin biosinteză

Biosinteza lantibioticelor este realizată de anumite bacterii Gram pozitive. Acestea dețin echipamentul enzimatic necesar desfășurării procesului de biosinteză, care în final duce la obținerea unor compuși cu resturi neobișnuite de aminoacizi(10).

Precursorul lantibioticelor este biosintetizat la nivel ribozomal, sub forma unei prepeptide(26). Aminoacizii caracteristici acestei clase structurale derivă în urma unor modificări post-translaționale, care au loc asupra precursorului. Formarea acestor aminoacizi decurge în două etape (Figura 15). Inițial, resturi de serină și treonină, sunt supuse unei deshidratări enzimatice cu formare de dehidroalanină și respectiv acid dehidroaminobutiric. Consecutiv acestei deshidratări, are loc atacul nucleofil al atomului de sulf, din grupările tiolice ale unor resturi de cisteină din vecinătate, la dubla legătură din dehidroalanină, respectiv din acidul dehidroaminobutiric, cu formarea unor legături tioeterice. În urma acestor reacții enzimatice rezultă lantionina și β-metil-lantionina.

Figura 5. Biosinteza lantioninei și metil-lantioninei

În structura unui lantibiotic tipic apar 3 până la 6 resturi de lantionină sau metil-lantionină, precum și dehidroalanină și acid dehidroaminobutiric. De asemenea, anumite molecule conțin și alți aminoacizi cu sulf precum: S-aminovinil-D-cisteina, S-aminovinil-3-metil-D-cisteina și labionina, un aminoacid alfa, alfa disubstituit(25).

Acești aminoacizi formează inele ciclice în structura lantipeptidelor, prin intermediul unor punți tioeterice. Prezența acestor formațiuni ciclice conferă rigiditate moleculei și contribuie la creșterea stabilității sub acțiunea proteazelor și a stabilității termice(10).

Alte modificări structurale care apar frecvent în biosinteza lantipeptidelor, dar care nu conduc la formarea unor structuri ciclice, sunt: hidroxilarea asparaginei (în cinamicine și duramicine), precum și hidroxilarea prolinei (în microbisporocin). De asemenea, în lacticina 3147 și lactocina S, în urma unor reacții de epimerizare, se formează D-alanina(25).

Clasificarea lantibioticelor

Până în prezent, peste 95 de lantipeptide diferite au fost izolate din culturi ale bacteriilor Gram pozitive(25, 27). Clasificarea lantibioticelor se realizează ținând cont de mai multe criterii: din punct de vedere structural, funcțional și în funcție de calea de biosinteză(10, 25).

În anul 1991, Jung clasifică lantibioticele în două categorii: tip A și B, pe baza unor similitudini structurale și funcționale(10).

Structura lantibioticelor de tip A este constituită dintr-o polipeptidă liniară, care cuprinde un număr de până la 34 aminoacizi. Aceasta este încărcată pozitiv și are o masă moleculară mică, cuprinsă între 2 și 4 kDa(10, 28). Lantibioticele de tip A se împart la rândul lor în două subtipuri: subtipul A(I), al cărui structură constă dintr-o polipeptidă alungită, și subtipul A(II), caracterizat de o structură de tip “cap-coadă”, format atât dintr-o porțiune alungită (“coadă”) cât și dintr-o porțiune globulară (“cap”)(29).

Lantibioticele de tip B se caracterizează, din punct de vedere structural, printr-o formă globulară. Polipeptida este alcătuită dintr-un număr de maxim 19 resturi de aminoacizi, sarcina electrică netă a moleculei este zero sau negativă, iar masa moleculară este 2-3 kDa(10, 28).

Pe lângă aceste două clase principale, lantibioticele mai conțin un grup separat format din compuși cu două polipeptide în structură, ambele suferind modificări post-translaționale. Individual, aceste polipeptide fie sunt lipsite de activitate antibacteriană, fie prezintă o activitate scăzută, dar care, atunci când sunt utilizate sinergic, au acțiune antibacteriană puternică(29).

În ultimul timp, o evaluare mai amănunțită a modului de acțiune, precum și descoperirea de noi compuși cu proprietăți intermediare a făcut dificilă încadrarea acestora în cele două categorii ale clasificării lui Jung(10). Astfel, a fost propusă o nouă clasificare a lantibioticelor în funcție de calea de biosinteză, și mai exact în funcție de enzimele care catalizează reacțiile de formare a aminoacizilor caracteristici. Această clasificare împarte lantibioticele în patru clase, conform celor prezentate în tabelul I(25). De asemenea, noile lantibiotice în curs de descoperire și caracterizare pot fi încadrate în această clasificare(10).

Tabel I

Clasificarea lantibioticelor

Reprezentanții clasei I de lantibiotice se formează în urma acțiunii a două enzime distincte: LanB care catalizează reacția de deshidratare a serinei, și respectiv treoninei, și LanC care catalizează reacția de ciclizare cu formarea punților tioeterice(25). Când modificările post-translaționale asupra precursorului s-au încheiat, prepeptida este exportată cu ajutorul unui transportor ABC, LanT. Ultima etapă în biosinteza clasei I de lantibiotice o constituie înlăturarea secvenței leader prin acțiunea proteolitică a enzimei LanP. Membrii acestei clase de lantibiotice includ: nisina, Pep5 și epidermina (Figura 16)(10).

Figura 16. Structurile lantibioticelor de clasa I

În biosinteza clasei II de lantibiotice, atât reacția de deshidratare cât și reacția de adiție a grupei tiol din cisteină la dubla legătură din dehidroalanină, respectiv acid dehidroaminobutiric sunt catalizate de aceeași enzimă, LanM (Figura 17). Domeniul C-terminal al enzimei, corespunzător ciclazei este identic cu cel din enzima LanC, dar domeniul N-terminal corespunzător dehidratazei nu prezintă asemănări cu enzima LanB, enzime implicate în biosinteza clasei I de lantibiotice. De asemenea, atât transportul prepeptidei cât și îndepărtarea secvenței leader sunt mediate de o singură proteină, LanT(P). Această clasă cuprinde lacticina 481, nukacina, mutacina II precum și un număr de salivaricine(25).

Figura 17. Enzimele implicate în biosinteza lantibioticelor de clasă I și II

Clasa III de lantipeptide se caracterizează prin lipsa activității antimicrobiene, dar prezintă funcție morfogenetică, importantă pentru cultura producătoare. Biosinteza acestora este realizată de o altă enzimă, LabKC, o protein kinază-ciclază. În urma acțiunii enzimei, rezultă labionina, un aminoacid α,α-disubstituit(24). Până în prezent, 11 astfel de peptide au fost descrise(25). Acestea cuprind peptidele SapB, SapT și Amf, produse de Streptomyces coelicolor, Streptomyces tendae și respectiv Streptomyces griseus(10).

O nouă lantionin-sintetază, intitulată LanL, a fost descoperită recent în culturi de Streptomyces venezuelae. Această sintetază este responsabilă de biosinteza clasei IV de lantipeptide care conține până în acest moment un singur reprezentant, venezuelina(25).

Mecanism general de acțiune

Mecanismul de acțiune al lantibioticelor de tip A diferă de cel al lantibioticelor de tip B.

Lantibioticele de tip A au un mecanism dual de acțiune. Prin legare de lipida II, pe de o parte inhibă biosinteza peptidoglicanului din structura peretelui celular, iar pe de altă parte formează pori în interiorul membranei celulare, prin care celula pierde constituenți citoplasmatici esențiali pentru supraviețuire.

Lantibioticele de tip B interacționează cu lipida II, formează complex lantibiotic-lipida II și împiedică activitatea enzimelor în procesul de biosinteză al peretelui celulalar. Important de menționat este faptul că acest grup de lantibiotice globulare nu formează pori intramembranari în urma interacțiunii cu lipida II(30).

Spectru de activitate

Spectrul de acțiune al lantibioticelor este limitat la bacteriile Gram pozitive. Activitatea asupra bacteriilor Gram negative, cum ar fi Escherichia coli sau Salmonella sp., este aproape inexistentă. Acest lucru se datorează lipsei intrării în celulă a lantibioticului. Bacteriile Gram negative au o membrană externă, cu rol de barieră impermeabilă pentru acești compuși. Doar în asociere cu substanțe care destabilizează membrana, EDTA sau citrat, lantibioticele pot prezenta activitate și asupra acestor bacterii(17). Recent, un lantibiotic cu spectru larg a fost izolat din culturi de Bifidobacterium longum, dar acesta este încă incomplet caracterizat.

Lantibioticele prezintă activitate antibacteriană bună in vitro. Multe studii de cercetare care urmăresc activitatea lantibioticelor la utilizarea sistemică sunt în desfășurare. Întrebările cercetătorilor se concentrează asupra naturii peptidice a compușilor, stabilității acestora în circulația sistemică precum și asupra capacității de distribuție în țesuturi(30).

Reprezentanți. Prezentare farmaco-chimică

Nisina

Nisina are o moleculă alcătuită din 34 de aminoacizi, fiind produsă de Lactoccocus lactis. L. lactis produce două variante ale nisinei: nisina A și nisina Z, care diferă din punct de vedere structural doar cu un aminoacid. Nisina A are în poziția 27 un rest de histidină, iar nisina Z un rest de asparagină. Cele două variante au proprietăți similare(31).

Nisina (Figura 18) a fost cercetată ca antibiotic de uz sistemic încă din 1952, când s-a dovedit a fi eficientă în tratarea șoarecilor infectați cu Streptococcus pyogenes sau Staphylococcus aureus. Mai târziu, studiile au demonstrat că nisina este mai eficientă decât vancomicina într-o infecție cu S. pneumoniae la șoareci. Aceste proprietăți nu pot fi valorificate terapeutic deoarece nisina este un compus instabil sub acțiunea proteazelor, cu un timp de înjumătățire foarte scurt, mai mic de o oră(30). Astfel se încearcă realizarea de modulări farmacologice asupra moleculei, care să ducă la îmbunătățirea proprietăților farmacocinetice.

Figura 18. Structura nisinei

Datorită caracterului predominant acid al moleculei, nisina este stabilă în soluții cu pH=2, și poate fi păstrată pe termen lung în condiții de temperatură cuprinse între 2-7ºC. La pH > 7, nisina este inactivată(22).

Mecanism de acțiune

Nisina se leagă de Lipida II și astfel intervine în biosinteza peretelui celular și formează pori în membrana citoplasmatică ducând la destabilizarea acesteia, cu pierderea de constituenți intracelulari și moarte celulară (Figura 19). De asemenea, în urma interacțiunii cu lipida II, nisina blochează biosinteza peretelui celular bacterian. Mecanismul dual de acțiune este responsabil de potența ridicată a nisinului împotriva bacteriilor Gram-pozitive(18, 32).

Figura 19. Modul de acțiune al nisinei

Nisina, precum și celelalte lantibiotice de tip A, au un mod particular de formare al porilor. Pe de o parte, studiile in vitro au arătat că nisina se leagă de membrana celulelor bacteriene datorită atracțiilor electrostatice între molecula de nisină încărcată pozitiv (+4) și numeroasele sarcini negative prezente la suprafața membranei citoplasmatice a bacteriilor Gram pozitive. Pe de altă parte, diferența semnificativă între activitatea in vitro utilizând modele membranare și activitatea in vivo, a ilustrat faptul că nisina utilizează o moleculă țintă de la suprafața membranei pentru a forma porii. Această moleculă țintă este lipida II. Interacțiunea între nisină și lipida II duce la creșterea activității antibacteriene, nisina fiind eficientă la o concentrație de ordin nanomolar in vivo, față de o concentrație de ordin micromolar in vitro. Astfel, în prezența lipidei II, lantibioticele formează pori intramembranari foarte stabili. Afinitatea acestor molecule pentru lipida II este mult mai mare decât pentru resturile lipidice încărcate negativ de la suprafața membranei.

Determinarea structurii complexului nisină-lipida II, prin rezonanță magnetică nucleară, a evidențiat prezența unui nou situs pentru grupări pirofosfat în structura nisinei. Prin intermediul acestui situs, nisina se leagă de gruparea pirofostat din resturile dizaharidice ale lipidei II(33).

Relațiile structură-activitate au pus în evidență grupările structurale responsabile de activitatea antibacteriană. Cele două cicluri din capătul N-terminal sunt responsabile de legarea lipidei II prin intermediul unor legături de hidrogen între azotul amidic al Dhb2, Ala3, Ile4, Dha5 și Abu8 și atomii de oxigen de la nivelul grupării pirofosfat. Peptida de legătură și capătul C-terminal sunt esențiale pentru a forma porii intramembranari(20, 24).

Totodată, peretele celular reprezintă ținta de acțiune și a altor clase de antibiotice. Antibioticele glicopeptidice se leagă de porțiunea terminală D-Ala-D-Ala din constituția lipidei II și astfel inhibă biosinteza peretelui celular. Datorită faptului că nisina nu interacționează cu aminoacizii terminali D-Ala-D-Ala din structura lipidei II, aceasta este activă pe bacteriile devenite rezistente la vancomicină, în cadrul cărora restul D-Ala a fost înlocuit cu D-Lac(20).

Mecanism de autoapărare

Bacteriile utilizează un mecanism de autoapărare cu ajutorul căruia se protejează de lantibioticele biosintetizate.

Nisina are două sisteme de apărare:

Lipoproteina NisI, orientată pe partea exterioară a membranei citoplasmatice, are rol de legare a nisinei de suprafața membranei;

Transportorul ABC NisFEG, o proteină membranară care transportă nisina de pe membrana citoplasmatică în spațiul extracelular(26, 32).

Spectru de activitate

Spectrul de activitate include Staphylococcus aureus, inclusiv MRSA, Bacillus cereus, Pseudomonas aeruginosa, Closridium perfringens, enterococi rezistenți la vancomicină și bacterii din genul Listeria: L. monocytogenes, L. inocua. Nu este activ asupra fungilor(17, 22, 31, 34).

Deoarece nisina acționează asupra lipidei II, prezentă doar în celula bacteriană, nu prezintă toxicitate ridicată pentru celula umană(17).

DL50 este 6950 mg/kg, aproapiată de aceea a clorurii de sodiu, la administrare orală. Cercetătorii au corelat valoarea ridicată a DL50 cu prezența enzimelor digestive în stomac, tripsina și chimotripsina, capabile să inactiveze rapid substanța după administrare orală(22).

2.7.2. Lacticina 3147

Lacticina 3147 este un lantibiotic natural, izolat din culturi de Lactococcus lactis, subspecia lactis DPC3147(25). Structural, aceasta este alcătuită din două peptide, LtnA1 și LtnA2, utilizate în amestec 1:1, cu activitate sinergică net superioară, comparativ cu activitatea fiecărui constituent utilizat singur (Figura 20).

Figura 20. Structura lacticinei 3147 (A – LtnA1, B – LtnA2)

Mecanismul de acțiune implică legarea peptidei LntA1 de lipida II, cu formarea unui complex lipidă II:LntA1. Ulterior, LntA2 recunoaște complexul format și interacționează cu acesta, conducând la formarea unui por intramembranar. Datorită acestui mecanism molecular de acțiune, compusul prezintă o eficiență crescută la o concentrație de ordin nanomolar. Astfel, activitatea antibacteriană superioară a lacticinei 3147 necesită prezența ambelor peptide, a căror interacțiune intermoleculară este stabilizată de lipida II(17, 18).

Lacticina 3147 este termostabilă și activă pe un interval larg de pH. Spectrul larg de acțiune și lipsa toxicității asupra celulelor eucariote constituie avantaje care permit utilizarea acesteia ca și conservant sigur în industria alimentară(35).

2.7.3. Epidermina și galidermina

Epidermina este un lantibiotic produs de culturi de Staphylococcus epidermidis, iar galidermina de Staphylococcus gallinarum. Ambele substanțe au o structură peptidică, tetraciclică, alcătuită din 22 de resturi de aminoacizi. Conțin un rest de acid dehidroaminobutiric, respectiv un rest de metil-lantionină și două resturi de lantionină, iar capătul C-terminal este reprezentat de aminoacidul S-aminovinil-cisteină. Diferența între epidermină și galidermină constă în prezența izoleucinei în poziția 6 în epidermină respectiv prezența leucinei în galidermină (Figura 21). Epidermina și galidermina au masa moleculară de 2164Da și aparțin clasei A(I) de lantibiotice(27).

Galidermina și epidermina interacționează cu lipida II și astfel inhibă biosinteza mureinei, componenta peretelui celular bacterian(10).

Comparativ cu nisina, un lantibiotic alcătuit din 34 de resturi de aminoacizi, galidermina și epidermina conțin doar 22 de resturi și astfel, aceste molecule sunt prea scurte pentru a forma pori transmembranari. Capacitatea de a forma pori a nisinei contribuie de asemenea la o creștere a citotoxicității. Astfel, galidermina prezintă un avantaj având o toxicitate mai redusă față de nisină(27).

Spectrul de activitate al acestor substanțe include bacterii Gram pozitive: streptococi și stafilococi. De asemenea, s-a observat că au efect antibacterian asupra Propionibacterium acnes(36).

Figura 21. Structura galiderminei

Cercetătorii au reușit obținerea de analogi structurali prin biotehnologie, utilizând tehnologia ADN-ului recombinant (Figura 22). Unul sau mai mulți aminoacizi specifici pot fi înlocuiți prin mutageneză direcțională. Secvența de aminoacizi a peptidei se modifică prin efectuarea unor schimbări de baze la nivelul genei. Astfel, structura peptidei obținute este diferită. Acest lucru permite verificarea unor ipoteze privind specificitatea de substrat a enzimelor modificatoare și obținerea de analogi cu proprietăți diferite.

Din structura galiderminei s-a dedus structura genelor corespunzătoare. Obținerea de analogi prin biotehnologie presupune alegerea codonilor care sintetizează aminoacizii de interes și introducerea acestora în structura genei corespunzătoare.

Figura 22. Modificările efectuate asupra secvenței de aminoacizi din structura galiderminei

S-a observat că, în lichidul de cultură bacteriană, nu se formează analogi ai galiderminei atunci când:

Hidroxiaminoacizii implicați în legături tioeterice sunt înlocuiți cu aminoacizi fără grupare OH;

Exemple: S3N sau S19A

Resturile de cisteină implicate în legăturile tioeterice sunt eliminate;

Exemple: C21 sau C22

Un aminoacid cu ciclu în structură este înlocuit cu un aminoacid cu structură complet diferită.

Exemplu: Y20G

Totodată, randamentul biosintezei scade când resturile de serină din pozițiile 16, respectiv 19, implicate în realizarea legăturilor tioeterice, sunt înlocuite cu resturi de treonină.

O serie de modificări la nivelul porțiunii liniare a peptidei conduc la intensificarea activității antibacteriene sau la creșterea stabilității. Prin înlocuirea leucinei din poziția 6 cu valină, se obține un analog mai activ decât compusul părinte. Stabilitatea la acțiunea proteolitică a tripsinei crește atunci când alanina din poziția 12 este înlocuită cu leucină sau când acidul dehidrobutiric din poziția 14 este înlocuit cu prolină.

Substituția acidului dehidroaminobutiric din poziția 14 cu dehidroalanina conduce la obținerea unui analog cu activitate antimicrobiană similară galiderminei, iar înlocuirea acestuia cu serină, la un analog cu activitate antimicrobiană mai redusă. Din punct de vedere al stabilității, ambele peptide obținute sunt mai sensibile la degradarea sub acțiunea tripsinei.

Obținerea de analogi structurali prin biotehnologie reprezintă o metodă importantă pentru evidențierea elementelor structurale necesare biosintezei galiderminei(27).

2.7.4. Pep 5

Pep5, produs de S.epidermidis 5, este cel mai mare lantibiotic izolat, având masa moleculară 3488Da. Lantibioticul prezintă 8 sarcini pozitive(10).

Pep5 conține două resturi de lantionină, un rest de metil-lantionină și două resturi de acid dehidroaminobutiric. Capătul N-terminal este blocat de gruparea 2-oxobutiril, care derivă dintr-un rest de treonină.

Spectrul de activitate este îngust, bacteriile din genul Staphylococcus fiind cele mai sensibile la acțiunea lantibioticului(20).

Aplicațiile lantibioticelor

Dintre cele peste 95 de lantibiotice identificate până în prezent, unele molecule prezintă activitate biologică impresionantă. De asemenea, aceste peptide au anumite proprietăți favorabile pentru un efect farmacodinamic optim: masa moleculară mică, stabilitate termică, lipsa toxicității, tendința scăzută de a dezvolta rezistență și imunogenicitatea scăzută, care fac posibilă utilizarea acestora în diferite domenii medicale și farmaceutice(25).

Lantipeptidele sunt intens studiate privind posibila utilizare a acestora în tratamentul:

Infecțiilor datorate bacteriilor multi-drug rezistente;

Infecțiilor pielii;

Mastitei;

Ulcerului peptic;

Cariilor dentare;

Herpesului și a febrei Dengue;

Hipertensiunii arteriale;

Alergiilor și al inflamațiilor(22).

Lantibiotice în uz comercial

Nisina este primul și singurul lantibiotic comercializat astăzi. Este un aditiv alimentar utilizat de peste 50 de ani care previne contaminarea alimentelor cu Listeria monocytogenes sau specii din genul Clostridia. Se găseste comercializat sub denumirea Nisaplin®(25). Ca aditiv alimentar, nisina prezintă numeroase avantaje:

Stabilitate termică crescută;

Nu prezintă gust sau miros;

Este degradată de enzimele digestive și astfel nu distruge flora saprofită de la nivel intestinal(32).

Totodată, în prezent se comercializează produse destinate îngrijirii animalelor. Wipe Out®, produs de Immu Cell, se utilizează pentru prevenția mastitei cauzate de S.aureus și Streptococcus agalactiae la bovine(25).

Antibiotice

Cea mai importantă aplicație a lantibioticelor este tratamentul infecțiilor datorate bacteriilor multi-drug rezistente. Lantibioticele inhibă multiplicarea unui număr semnificativ de bacterii Gram pozitive patogene multi-drug rezistente: stafilococi, streptococi, enterococi și clostridria.

Un număr de molecule au făcut obiectul unor studii in vitro și in vivo privind activitatea acestora ca antimicrobiene, iar câteva molecule sunt în fază preclinică sau clinică de dezvoltare.

Un exemplu de moleculă aflată în studiu clinic de fază I este NVB 302, a companiei Novacta Biosystems Limited. NVB 302 este un derivat semisintetic de tip carbox-amidic al lantibioticului de clasă II, deoxi-actagardina B(25). Studiul urmărește posibilitatea utilizării lantibioticului în tratamentul colitei asociată bacilului Clostridium difficile(30). În urma administrării la 64 de voluntari sănătoși, s-a observat că NVB302 este bine tolerat, absorbția sistemică este neglijabilă, iar cea mai mare parte din doză se elimină prin fecale(37).

Un alt derivat, NVB 333 este un potențial candidat pentru tratarea infecțiilor nosocomiale datorate bacteriilor Gram pozitive, spectrul de activitate incluzând stafilococi și enterococi rezistenți la antibioticele de rezervă daptomicină și linezolid. Microbisporocina (NAI-107) este cel mai activ lantibiotic identificat până acum. Experimentele in vivo au evidențiat eficiența acestei molecule în tratarea endocarditei cauzată de MRSA la șobolani(25).

Derivatul sintetic al lantipeptidei mutacina 1140 (Mu1140-S) se află în studii preclinice pentru tratamentul infecțiilor cu bacterii Gram pozitive, fiind o moleculă activă in vivo pe MRSA, VRE, C.difficile, Mycobacterium tuberculosis și Bacillus anthracis(38). Timpul de înjumătățire, determinat în urma administrării la șobolani, este de 1,6 ore, mai lung comparativ cu nisina. Mu1140-S nu este bine tolerat dacă este administrat injectabil rapid. În cel mult cinci minute de la administrare apare o reacție de hipersensibilitate asemănătoare sindromului omului roșu, care apare la injectarea rapidă a vancomicinei. Intensitatea reacției poate fi scăzută când Mu1140-s se administrează prin perfuzare lentă sau poate fi prevenită prin administrare de difenhidramină(30).

Nisina este activă pe bacterii patogene la om, fiind eficientă în tratamentul mastitei, ulcerului peptic și enterocolitelor de origine infecțioasă. Totodată este activă și pe bacterii patogene la animale, fiind în curs de dezvoltare pentru tratamentul mastitei la bovine (Mast Out®, Immu Cell)(25).

Epidermina și galidermina se utilizează pentru tratarea acneei juvenile, în locul terapiei convenționale cu eritromicină sau vitamina A. De asemenea, acești compuși pot fi utilizați în eczeme, foliculite, impetigo. Mersacidina și actagardina se remarcă prin activitatea pe Staphylococcus aureus, inclusiv meticilino-rezistent(20).

Profilactice, probiotice și aditivi

Galidermina și lacticina 3147 sunt active pe Propionibacterium acnes, bacterie responsabilă de apariția acneei. Astfel, aceste substanțe se pot utiliza ca aditivi în cosmetice și alte produse de îngrijire personală.

Un experiment in vitro a evidențiat faptul că epidermina și pep5 previn aderarea stafilococilor coagulazo-negativi, în special a S.epidermidis, de suprafața cateterelor. Astfel, aceste substanțe se pot utiliza ca profilaxie în vederea reducerii infecțiilor asociate cateterelor.

Lacticina 3147 și mutacinele inhibă dezvoltarea unor culturi de Streptococcus mutans, bacterie implicată în apariția cariilor dentare.

Salivaricinele au efect antibacterian pe Streptococcus pyogenes. Infecțiile cauzate de această bacterie ar putea fi prevenite prin repopularea florei de la nivelul cavității bucale cu tulpini producătoare de salivaricine. De asemenea, BLIS Technologies au dezvoltat gume de mestecat și comprimate pentru supt care conțin culturi de S.salivarius producătoare de salivaricine. Acestea se comercializează ca produse de îngrijire orală pentru profilaxia cariilor dentare, parodontozei și a infecțiilor cavității bucale(25).

Nisina este utilizată ca aditiv în industria alimentară. Asocierea nisinei cu natamicina este frecvent utilizată pentru a evita contaminarea cu bacterii și fungi a alimentelor, în special a brânzeturilor. S-a observat că activitatea nisinei nu este influențată de activitatea natamicinei(39).

Alte aplicații în domeniul medical și farmaceutic

Lantibioticele din subgrupa cinamicinei influențează metabolismul celulei eucariote(25).

Duramicina stimulează secreția de clorură la nivelul celulelor epiteliale ale căilor respiratorii. În trial clinic de fază II, lantibioticul a demonstrat o eficacitate și o siguranță bună în tratamentul fibrozei chistice la administrare inhalatorie(40). Totodată, duramicina inhibă fosfolipaza A2 la nivelul celulei eucariote, împiedicând formarea mediatorilor proinflamatori și poate fi utilizată pentru efectul antiinflamator și antialergic. Ancovenina este un inhibitor natural al enzimei de conversie a angiotensinei I, fiind o alternativă terapeutică pentru tratarea hipertensiunii arteriale.

Anumite lantipeptide posedă activitate antivirală. Cinamicina este activă pe retrovirusuri de tipul herpes simplex. De asemenea, labirintopeptinele au efect împotriva virusului Dengue, agentul cauzator al febrei Dengue. S-a observat o relație de dependență doză-efect în ceea ce privește inhibiția primelor etape din ciclul de replicare al virusului Dengue. Acest lucru se realizează prin legare directă a labirintopeptinelor de glicoproteina E prezentă la nivelul învelișului viral(25). În plus, labirintopeptinele prezintă activitate biologică împotriva durerii neuropate(40).

Nisina și lacticina 3147 sunt potențiali agenți contraceptivi. De asemenea, faptul că aceste substanțe au și proprietăți antimicrobiene conferă un real avantaj, deoarece ele nu doar că pot preveni sarcinile nedorite, dar sunt capabile să reducă și incidența bolilor cu transmitere sexuală(41).

RAMOPLANINA

Ramoplanina este produsul de fermentație al unor specii de actinomicete, aparținând genului Actinoplanes(17).

Caracteristici structurale

Ramoplanina nu este un compus chimic unitar, fiind formată din mai multe molecule: A1, A2, A3 (Figura 23).

Figura 23. Ramoplanina

Dintre acestea, compusul majoritar este reprezentat de ramoplanina A2. Aceasta se obține cu un randament de 72% din totalul produsilor de fermentație, iar ramoplaninele A1 și A3 reprezintă aproximativ 12 și respectiv 16%(42).

Stuctural, sunt lipoglicodepsipeptide caracterizate prin prezența în moleculă a 17 resturi de aminoacizi(43). Conțin numeroase molecule de hidroxi-fenil-glicine cu o configurație atât D cât și L, precum și subunități de aminoacizi β-hidroxilați: D,L-allo-treonină, treo-β-hidroxi-asparagină. La unul din resturile de L-hidroxi-fenil-glicină se leagă un dizaharid format din două subunități de α-D-manoză legate O-glicozidic (1→2). De asemenea, cele trei ramoplanine se deosebesc prin lungimea lanțului lateral acil (R1) prezent pe restul de asparagină.

Macrociclul lactonic este alcătuit din 49 de atomi și se formează în urma legării covalente a capetelor N- și C-terminal reprezentate de restul de 3-cloro-4-hidroxi-fenil-glicină și β-hidroxi-asparagină(42).

Mecanism de acțiune

Ramoplanina interacționeză cu lipida II, blocând biosinteza peptidoglicanului. Astfel, antibioticul intervine în cursul procesului de sinteză a peretelui celular bacterian. Efectul ramoplaninei este bactericid(44, 45).

Spectru de activitate

Ramoplanina prezintă activitate antimicrobiană pe bacterii Gram pozitive, atât in vitro cât și in vivo. Spectrul de activitate include enterococi, streptococi, stafilococi, bacterii multi-drug rezistente: MRSA și VRE, Listeria monocytogenes și Clostridium dificille(46). Ramoplanina nu prezintă activitate pe bacteriile Gram negative. În tabelul II sunt reprezentate câteva bacterii susceptibile la ramoplanină, precum și valorile concentrației minime inhibitorii (CMI) a antibioticului(42).

Tabel II

Bacterii susceptibile la ramoplanină și concentrațiile minime inhibitorii

Ramoplanina în studii clinice

Rezultatele studiilor clinice de fază I arată că ramoplanina are un profil de siguranță și tolerabilitate bun, la toate nivelurile de doze la care a fost testată.

Într-un studiu clinic de fază II, s-a evaluat gradul de eliminare al enterococilor rezistenți la vancomicină care se găsesc la nivelul tractului gastrointestinal. Riscul de apariție a infecțiilor sistemice cauzate de enterococi rezistenți la vancomicină este mai crescut la pacienții imunodeprimați: pacienți sub chimioterapie, transplant de organ sau pacienți aflați la terapie intensivă. Prin eliminarea enterococilor rezistenți la vancomicină de la nivelul florei intestinale, cercetătorii cred că incidența unei infecții sistemice scade(42).

Studiul clinic de fază II a evidențiat reducerea semnificativă a colonizării tractului gastrointestinal cu VRE la pacienți spitalizați. Rezultatete demonstrează faptul că administrarea a 400 mg ramoplanină de două ori pe zi, timp de 7 zile, duce la eradicarea bacteriei în 90% din cazuri. Ramoplanina este nonabsorbabilă după administrare orală. Reacțiile adverse sunt diaree, durere abdominală, dispepsie, flatulență(42, 45).

Ramoplanina se află în studii clinice de fază III, care se desfășoară în peste 40 de locații din Statele Unite ale Americii. Lipsa absorbției sistemice după administrarea orală limitează mult utilizările ramoplaninei la diareea de etiologie bacteriană. O altă posibilă aplicație este utilizarea topică a ramoplaninei în tratamentul acneei, a rănilor deschise și grefelor de piele(42).

Semisinteza analogilor ramoplaninelor A1-3

O serie de modulări chimice aduse ramoplaninelor A1-3 au dus la obținerea de analogi semisintetici cu activitate antimicrobiană îmbunătățită. De asemenea, prin obținerea derivaților semisintetici s-au evidențiat anumite grupări structurale importante pentru mecanismul de acțiune.

Ciabatti și colaboratorii au încercat obținerea de derivați ai ramoplaninelor A1-3, prin hidrogenarea catalitică în prezența oxidului de platină, a dublei legături din restul acil al capătului N-terminal. Compușii obținuți, destinați utilizării în tratamentul topic al rănilor deschise, au arătat activitate antimicrobiană excelentă împotriva mai multor specii de bacterii Gram pozitive. În plus, Ciabatti și colaboratorii au reușit obținerea agliconilor ramoplaninelor A1-3 utilizând iodura de trimetilsilil în dimetilformamidă (DMF). Agliconii au activitate antibacteriană echipotentă sau ușor crescută față de compușii de plecare, împotriva unor culturi de S.epidermidis, S.aureus și P.acnes. Astfel, prezența restului glucidic nu este esențială pentru activitate, întrucât în urma deglicozilării, agliconul păstrează activitatea ramoplaninei. Dar, eliminarea dizaharidului din structura ramoplaninei crește susceptibilitatea agliconului la hidroliza acidă.

Pentru a evalua importanța celor două resturi de ornitină (Orn4 și Orn10) în realizarea mecanismului de acțiune, McCafferty și colaboratorii au modificat catena laterală a resturilor de Orn prin guanidilare, aminare reductivă și acetilare. Figura 24 ilustrează modificările care s-au realizat asupra ramoplaninei A2, compușii rezultați și concentrațiile minime inhibitorii ale acestora.

Figura 24. Derivați semisintetici ai ramoplaninei A2

S-a observat o reducere semnificativă a activității antimicrobiene prin pierderea sarcinii pozitive în urma acetilării și implicit a legării analogului de ținta sa moleculară. Prin conservarea sarcinii pozitive în urma guanidilării sau aminării reductive, se observă o reducere a activității comparativ cu ramoplanina A2, dar semnificativ mai mică decât în cazul acetilării.

Cele două resturi de ornitină din poziția 4 și respectiv 10 interacționează cu gruparea pirofosfat și cu gruparea carboxil terminală din structura lipidei I, respectiv lipidei II. Prezența sarcinii pozitive pe aceste resturi de aminoacizi este esențială pentru activitatea antibacteriană. Se observă o reducere a activității antibacteriene în ordinea amină primară > guanidină > amină secundară.

De asemenea, s-a observat că structura ciclică este esențială pentru activitate și totodată și mărimea ciclului. În urma hidrolizei macrolactonei la forma lineară a ramoplaninei A2, activitatea antimicrobiană a compusului rezultat s-a diminuat de peste 2000 de ori față de compusul părinte. Forma lineară a ramoplaninei A2 nu se leagă de intermediarii lipidici ai biosintezei peptidoglicanului. Astfel, s-a observat că pentru legarea de lipida I/II, secvența Hpg3-Orn10 trebuie să adopte o conformație tridimensională specifică, acest lucru fiind facilitat de gruparea esterică ciclică dintre Asn2 și Chp17. Modificarea numărului de resturi de aminoacizi din ciclu a condus la o reducere a activității de până la 100 ori(42).

Alți cercetători au încercat obținerea de analogi stucturali prin înlocuirea resturilor de aminoacizi. S-a observat că prin înlocuirea β-OH-Asn cu acidul diaminopropionic rezultă un compus cu activitate antibacteriană mai intensă față de ramoplanină datorită creșterii stabilității ciclului macrolactonic. Pe de altă parte, înlocuirea β-OH-Asn cu acidul diaminobutiric a condus la o scădere a activității antibacteriane, datorită extinderii ciclului cu o grupă metilenică. Astfel, se observă că mărimea ciclului de 49 atomi este esențială pentru activitate(43).

Sinteza totală a agliconului ramoplaninei A2

Sinteza chimică totală a agliconului ramoplaninei A2 a fost realizată de Boger și colaboratorii. Sinteza după Boger presupune obținerea a trei subunități peptidice protejate:

D-Hpg-D-Orn-D-alloThr-Hpg-D-Hpg-alloThr-Phe (Figura 25-A);

Leu-D-Ala-Chp-L-treo-β-OH-Asn-Asn (Figura 25-B);

D-Orn-Hpg-D-alloThr-Hpg-Gly (Figura 25-C).

Figura 25. Subunitățile peptidice necesare sintezei agliconului ramoplaninei A2

Urmează apoi condensarea subunităților cu formarea peptidei lineare, constituită din 17 aminoacizi. Acest intermediar este supus ciclizării între aminoacidul din poziția 9 și cel din poziția 10, cu obținerea macrolactonei.

Dezvoltarea unei metode de sinteză chimică totală a agliconului reprezintă un început promițător pentru descoperirea de noi analogi, derivați ai ramoplaninelor naturale, precum și alte antibiotice peptidomimetice cu proprietăți fizico-chimice, farmacocinetice și farmacodinamice superioare(42).

MANOPEPTIMICINE

Manopeptimicinele au fost izolate din culturi de Streptomyces hygroscopicus LL-AC98. Se prezintă sub forma unui amestec de cinci constituenți diferiți, α-ε (Figura 26). Inițial, amestecul a fost denumit complexul AC-98(47). Acesta s-a dovedit a fi activ împotriva unor bacterii Gram pozitive multi-drug rezistente: MRSA, VRE(48).

Figura 26. Manopeptimicinele

Aspecte structurale

Structura compușilor a fost pusă în evidență prin spectroscopie RMN, spectroscopie de masă și degradare chimică. Se caracterizează prin prezența a șase aminoacizi care alcătuiesc o structură ciclică(17). Hexapeptida de bază este formată din L-serină (Ser), glicină (Gly), β-metil-fenil-alanină (MePhe), D-tirozină (Tyr) și doi stereoizomeri ai acidului α-amino-β-[4′-(2′-iminoimidazolidinil)]-β-hidroxipropionic (Aiha-A și Aiha-B). Acest aminoacid caracteristic prezintă un rest de guanidină ciclică(43). Peptida este glicozilată cu resturi de manoză, iar uneori un rest lipofilic este atașat de ultima manoză din structura antibioticului(17). Totodată, abundența manozei este sugerată și de numele acestor substanțe, manopeptimicine.

Structura primară a agliconului este: C-[L-Ser-Gly-(2S3S)MePhe-D-Tyr-(2S3S4’S)AihaA-(2R3S4’S)AihaB]. Toți cei cinci reprezentanți prezintă un rest de manopiranoză legat N-glicozidic de aminoacidul AihaB. Manopeptimicinele diferă între ele la nivelul restului glicozidic. Cu excepția compusului MPM-β, restul manopeptimicinelor posedă în structură două resturi de manoză legate O-glicozidic (1-4) de D-tirozină. În plus, MPM y-ε prezintă un rest izovaleril legat de ultima manoză (Man-B) la nivelul C3 în MPM-y, C4 în MPM-δ și C5 în MPM-ε. Prezența și poziția acestui radical lipofil sunt benefice pentru acțiunea antibacteriană, acești compuși fiind mult mai activi decât manopeptimicina α(43).

Mecanism de acțiune și spectru de activitate

Manopeptimicinele acționează la nivelul peretelui celular bacterian, blocând sinteza acestuia în urma legării de Lipida II(47). Spectrul de activitate include bacterii Gram pozitive: S.aureus, E.faecium și S.pneumoniae, inclusiv bacterii multi-rezistente(17).

Relații structură chimică-activitate antibacteriană

Din studiul relațiilor între structura și activitatea manopeptimicinelor, s-au observat unele aspect ilustrate in figura 27:

Esterificarea grupei OH de pe C3 sau C4 al dizaharidului cu un rest acil este indispensabilă activității;

Obținerea manopeptimicinei β prin deglicozilarea manopeptimicinei α a condus la obținerea de precursori pentru sinteza de noi derivați de manopeptimicină;

Esterificarea grupei OH din poziția C6 de pe N-manoză sau esterificarea hidroxilului de pe restul de L-serină a dus la scăderea activității antimicrobiene;

Esterificarea grupei OH din poziția C6 de pe Man-A și mai ales Man-B a dus la intensificarea activității;

Singura farmacomodulare de la nivelul peptidei de bază constă în schimbarea β-hidroxi-fenil-alaninei cu ciclohexilalanină(43).

Figura 27. Relații structură chimică – activitate antibacteriană

Concluzii

Un număr de peste 200 de molecule distincte sunt autorizate de agențiile de reglementare pe piața de medicamente pentru tratamentul bolilor infecțioase de etiologie bacteriană.

Cu toate progresele realizate în cercetarea antibioticelor, infecțiile bacteriene dețin o pondere importantă în patologia generală a secolului XXI.

Una dintre cauzele mortalității ridicate în urma bolilor infecțioase este scăderea eficacității inițiale a antibiotioticelor, datorită rezistenței bacteriene.

Rezistența la antibiotice este un fenomen evolutiv, fiind astfel necesară cercetarea și dezvoltarea continuă de compuși cu proprietăți antimicrobiene.

Printre bacteriile foarte rezistente, responsabile de apariția unui număr mare de infecții nosocomiale, se numără stafilococul auriu rezistent la meticilină și enterococul rezistent la vancomicină.

În prezent, daptomicina, tigeciclina, linezolidul, combinațiile quinupristină/dalfopristină și ceftolozan/tazobactam sunt singurele alternative terapeutice în infecțiile severe cu bacterii rezistente la antibioticele clasice.

Cercetătorii mariilor companii de medicamente încearcă să depășească problema rezistenței bacteriene prin descoperirea unor noi molecule cu activitate antimicrobiană, cu mecanism de acțiune diferit și proprietăți superioare antibioticelor existente în prezent pe piața farmaceutică.

Identificarea unei ținte implicată în metabolismul celular, prin legarea căreia să apară efectul inhibitor asupra tulpinilor bacteriene, este o etapă importantă în cadrul cercetării și dezvoltării de noi antibiotice.

Lipida II este o țintă moleculară mai recent identificată și studiată, care oferă posibilitatea dezvoltării de noi compuși cu proprietăți antibacteriene. Deși este un component minoritar al membranei citoplasmatice, alcătuind sub 1% din totalul fosfolipidelor membranare, lipida II are un rol fundamental în biosinteza peretelui celular.

Lipida II este constituită din întreaga subunitate a peptidoglicanului și un transportor poliizoprenoid, atașat prin intermediul unei grupări pirofosfat. Subunitatea de peptidoglican este transferată de pe lipida II pe un primer de peptidoglican, iar transportorul poliizoprenoid se desprinde și poate fi utilizat în continuare pentru sinteza peretelui celular.

Lantibioticele, ramoplanina și manopeptimicinele sunt substanțe aflate în cercetare care inhibă sinteza peretelui celular bacterian prin blocarea lipidei II.

Lantibioticele reprezintă un grup de antibiotice peptidice cu un conținut ridicat de aminoacizi cu sulf: lantionină și metil-lantionină. Precursorul lantibioticelor este biosintetizat la nivel ribozomal, iar ulterior suferă modificări post-translaționale în urma cărora rezultă aminoacizii caracteristici acestei clase de compuși.

Formarea lantioninei si metil-lantioninei decurge în două etape: deshidratarea unor resturi de serină și treonină, urmată de atacul nucleofil al atomului de sulf din grupările tiolice ale unor resturi de cisteină din vecinătate, cu formarea legăturilor tioeterice. Ambele reacții sunt catalizate enzimatic.

Clasificarea lantibioticelor se realizează din punct de vedere structural, funcțional și în funcție de calea de biosinteză. Pe baza similitudinii structurale și funcționale, lantibioticele se împart în două categorii: tip A și B. Pe lângă aceste două clase principale, mai există un grup separat alcătuit din compuși cu două polipeptide în structură.

În funcție de calea de biosinteză, și mai exact în funcție de enzimele care catalizează reacțiile de formare ale lantioninei și metil-lantioninei, lantibioticele se clasifică în patru clase.

Mecanismul de acțiune implică interacțiunea lantibioticului cu lipida II, constituent al membranei citoplasmatice bacteriane. Lantibioticele de tip A au un mecanism dual de acțiune: blocarea sintezei peretelui celular și destabilizarea membranei celulare, prin formarea de pori intramembranari. Lantibioticele de tip B împiedică activitatea enzimelor în procesul de biosinteză al peretelui celular, dar nu formează pori intramembranari în urma interacțiunii cu lipida II.

Spectrul de acțiune al lantibioticelor cuprinde bacterii Gram pozitive: streptococi, stafilococi, enterococi și clostridia, inclusiv tulpini multi-drug rezistente. Activitatea pe bacterii Gram negative este aproape inexistentă deoarece acestea prezintă rezistență naturală la lantibiotice, asociată cu lipsa intrării în celulă a antibioticului.

Nisina prezintă un situs de legare al grupării pirofosfat din resturile dizaharidice ale lipidei II. Datorită faptului că nisina nu interacționează cu aminoacizii terminali D-Ala-D-Ala din structura lipidei II, aceasta este activă pe bacteriile care au dezvoltat rezistență la vancomicină.

Bacteriile utilizează un sistem de autoapărare cu ajutorul căruia se protejează de lantibioticele sintetizate. Nisina are două sisteme de apărare: lipoproteina NisI și transportorul ABC NisFEG.

Lacticina 3147 este alcătuită din două peptide: LtnA1 și LtnA2. Utilizate în amestec 1:1, acestea au activitate sinergică net superioară, comparativ cu activitatea fiecărui constituent utilizat singur.

Utilizând tehnologia ADN-ului recombinant, se pot obține analogi structurali cu proprietăți diferite, prin înlocuirea unuia sau mai multor aminoacizi specifici din structura peptidei. De asemenea, obținerea de analogi prin biotehnologie, permite verificarea unor ipoteze privind specificitatea de substrat a enzimelor și evidențierea elementelor structurale necesare procesului de biosinteză.

Până în prezent s-au identificat peste 95 de lantibiotice, anumite molecule având activitate biologică importantă. Totodata, masa moleculară mică, lipsa toxicității, tendința scăzută de rezistență bacteriană și imunogenicitatea scăzută sunt proprietăți care permit utilizarea lantibioticelor în domeniul medical și farmaceutic. Cea mai importantă aplicație este posibilitatea utilizării lantibioticelor în tratarea infecțiilor cu bacterii multi-drug rezistente.

Ramoplanina este un amestec de trei constituenți cu structură de tip lipoglicodepsipeptidă: A1, A2 și A3. În mediul de cultură al speciei producătoare, dintre cele trei ramoplanine, ramoplanina A2 se găsește în proporția cea mai mare, fiind obținută cu un randament de 72% din totalul produșilor de fermentație.

Ramoplanina acționează prin blocarea proceselor de transglicozilare din cursul formării peptidoglicanului, consecutiv legării de lipida II.

Ramoplanina se află în studii clinice de fază III, care se desfășoară în peste 40 de locații din Statele Unite ale Americii. Utilizările ramoplaninei se limitează la tulburări gastrointestinale și tratamentul colitei asociate bacilului Clostridium difficile, datorită lipsei absorbției sistemice după administrarea orală.

Obținerea derivaților semisintetici a permis evidențierea grupărilor structurale importante pentru activitate. De asemenea, a fost dezvoltată o metodă de sinteză chimică totală a agliconului ramoplaninei A2, acesta fiind un început promițător pentru descoperirea de noi derivați ai ramoplaninelor naturale, cu proprietăți farmaco-chimice, farmacocinetice și farmacodinamice superioare.

Manopeptimicinele nu sunt antibiotice cu structură chimică unitară, ci un amestec de cinci constituenți diferiți: α, β, y, δ și ε. Manopeptimicinele sunt active împotriva unor bacterii Gram pozitive, inclusiv tulpini multi-drug rezistente: stafilococul auriu rezistent la meticilină și enterococul rezistent la vancomicină.

Bibliografie

1. Oniga O, Tiperciuc B, Nastasă C, Ionuț I. Chimia și acțiunea antibioticelor antibacteriene. Cluj-Napoca2013. 215 p.

2. ***. Antibiotic / Antimicrobial Resistance USA: Centers for Disease Control and Prevention; [cited 2014 octombrie 13]. Available from: http://www.cdc.gov/drugresistance/index.html.

3. Almaș A, Flonta M, Petrașcu M, Năstase V. Sensibilitatea la antibiotice a tulpinilor de Staphylococcus aureus izolate din infecții ale tegumentelor și părților moi2011; 84:[173-7 pp.].

4. Giedraitienė A, Vitkauskienė A, Naginienė R, Pavilonis A. Antibiotic resistance mechanisms of clinically important bacteria. Medicina (Kaunas). 2011;47(3):137-46.

5. Rennie RF. Current and Future Challenges in the Development of Antimicrobial Agents. Antibiotic Resistance. Handbook of Experimental Pharmacology: Springer Science & Business Media; 2012. p. 192.

6. Oliphant CM, Eroschenko K. Antibiotic Resistance, Part 1: Gram-positive Pathogens. The Journal for Nurse Practitioners. 2015;11(1):70-8.

7. Courvalin P. Vancomycin Resistance in Gram-Positive Cocci. Clinical Infectious Diseases. 2006;42(Supplement 1):S25-S34.

8. Humphries RM, Pollett S, Sakoulas G. A current perspective on daptomycin for the clinical microbiologist. Clin Microbiol Rev. 2013;26(4):759-80.

9. Cai Y, Wang R, Liang B, Bai N, Liu Y. Systematic review and meta-analysis of the effectiveness and safety of tigecycline for treatment of infectious disease. Antimicrob Agents Chemother. 2011;55(3):1162-72.

10. Piper C, Cotter PD, Ross RP, Hill C. Discovery of medically significant lantibiotics. Curr Drug Discov Technol. 2009;6(1):1-18.

11. Marco JA, Naranjo OR, Rodriguez de Castro F, Buendía B, Sanz Sanz J. Mechanisms of Resistance by Gram-Positive Bacteria (Streptococci and Enterococci). 2008. In: Antimicrobial Resistance and Implications for the Twenty-First Century [Internet]. USA: Springer Science+Business Media, LLC; [1-46].

12. Zhanel G, Chung P, Adam H, Zelenitsky S, Denisuik A, Schweizer F, et al. Ceftolozane/Tazobactam: A Novel Cephalosporin/β-Lactamase Inhibitor Combination with Activity Against Multidrug-Resistant Gram-Negative Bacilli. Drugs. 2014;74(1):31-51.

13. ***. Full Prescribing Information –  ZERBAXA (ceftolozane/tazobactam) for Injection, for intravenous use 2014 [cited 2015 martie 19]. Available from: http://www.accessdata.fda.gov/drugsatfda_docs/label/2014/206829lbl.pdf.

14. Silhavy TJ, Kahne D, Walker S. The bacterial cell envelope. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2010;2(5):a000414.

15. Wang J, Sintim HO. Antibiotics That Disrupt Cell Wall and Bacterial Membrane Formation and Integrity. Reference Module in Biomedical Sciences: Elsevier; 2014.

16. Vollmer W, Blanot D, de Pedro MA. Peptidoglycan structure and architecture. FEMS Microbiol Rev. 2008;32(2):149-67.

17. Breukink E, de Kruijff B. Lipid II as a target for antibiotics. Nat Rev Drug Discov. 2006;5(4):321-32.

18. Martin NI, Breukink E. Expanding role of lipid II as a target for lantibiotics. Future Microbiol. 2007;2(5):513-25.

19. de Kruijff B, van Dam V, Breukink E. Lipid II: A central component in bacterial cell wall synthesis and a target for antibiotics. Prostaglandins, Leukotrienes and Essential Fatty Acids. 2008;79(3–5):117-21.

20. Asaduzzaman SM, Sonomoto K. Lantibiotics: Diverse activities and unique modes of action. Journal of Bioscience and Bioengineering. 2009;107(5):475-87.

21. Krawczyk Joanna M, Völler Ginka H, Krawczyk B, Kretz J, Brönstrup M, Süssmuth Roderich D. Heterologous Expression and Engineering Studies of Labyrinthopeptins, Class III Lantibiotics from Actinomadura namibiensis. Chemistry & Biology. 2013;20(1):111-22.

22. Balciunas EM, Castillo Martinez FA, Todorov SD, Franco BDGdM, Converti A, Oliveira RPdS. Novel biotechnological applications of bacteriocins: A review. Food Control. 2013;32(1):134-42.

23. Ross AC, Vederas JC. Fundamental functionality: recent developments in understanding the structure-activity relationships of lantibiotic peptides. J Antibiot (Tokyo). 2011;64(1):27-34.

24. Dischinger J, Wiedemann I, Bierbaum G, Sahl H-G. Chapter 19 – Lantibiotics. In: Kastin AJ, editor. Handbook of Biologically Active Peptides (Second Edition). Boston: Academic Press; 2013. p. 119-28.

25. Dischinger J, Basi Chipalu S, Bierbaum G. Lantibiotics: Promising candidates for future applications in health care. International Journal of Medical Microbiology. 2014;304(1):51-62.

26. Nagao J-i, Asaduzzaman SM, Aso Y, Okuda K-i, Nakayama J, Sonomoto K. Lantibiotics: Insight and foresight for new paradigm. Journal of Bioscience and Bioengineering. 2006;102(3):139-49.

27. Götz F, Perconti S, Popella P, Werner R, Schlag M. Epidermin and gallidermin: Staphylococcal lantibiotics. International Journal of Medical Microbiology. 2014;304(1):63-71.

28. Zacharof MP, Lovitt RW. Bacteriocins Produced by Lactic Acid Bacteria a Review Article. APCBEE Procedia. 2012;2(0):50-6.

29. Asaduzzaman SM, Al-Mahin A, Bashar T, Noor R. Lantibiotics: A Candidate for Future Generation of Antibiotics. Stamford Journal of Microbiology; Vol 1, No 1 (2011). 2011.

30. Dawson MJ, Scott RW. New horizons for host defense peptides and lantibiotics. Current Opinion in Pharmacology. 2012;12(5):545-50.

31. Imran M, Revol-Junelles A-M, de Bruin M, Paris C, Breukink E, Desobry S. Fluorescent labeling of nisin Z and assessment of anti-listerial action. Journal of Microbiological Methods. 2013;95(2):107-13.

32. Nagao J-i. Properties and Applications of Lantibiotics, a Class of Bacteriocins Produced by Gram-positive Bacteria. Journal of Oral Biosciences. 2009;51(3):158-64.

33. Chatterjee C, Paul M, Xie L, van der Donk WA. Biosynthesis and mode of action of lantibiotics. Chem Rev. 2005;105(2):633-84.

34. Garde S, Gómez-Torres N, Hernández M, Ávila M. Susceptibility of Clostridium perfringens to antimicrobials produced by lactic acid bacteria: Reuterin and nisin. Food Control. 2014;44(0):22-5.

35. García-Ruiz A, Requena T, Peláez C, Bartolomé B, Moreno-Arribas MV, Martínez-Cuesta MC. Antimicrobial activity of lacticin 3147 against oenological lactic acid bacteria. Combined effect with other antimicrobial agents. Food Control. 2013;32(2):477-83.

36. Pag U, Sahl HG. Multiple activities in lantibiotics–models for the design of novel antibiotics? Curr Pharm Des. 2002;8(9):815-33.

37. ***. Novacta Biosystems Limited completes Phase I study of NVB302 against C. difficile infection in healthy volunteers UK: Novacta Biosystems; 2012 [cited 2015 februarie 27]. Available from: http://www.novactabio.com.

38. ***. Mu 1140 and other Lantibiotics: Oragenics; [cited 2015 februarie 27]. Available from: http://www.oragenics.com/lantibiotics/mu1140.

39. Ollé Resa CP, Gerschenson LN, Jagus RJ. Natamycin and nisin supported on starch edible films for controlling mixed culture growth on model systems and Port Salut cheese. Food Control. 2014;44(0):146-51.

40. Meindl K, Schmiederer T, Schneider K, Reicke A, Butz D, Keller S, et al. Labyrinthopeptins: a new class of carbacyclic lantibiotics. Angew Chem Int Ed Engl. 2010;49(6):1151-4.

41. Silkin L, Hamza S, Kaufman S, Cobb SL, Vederas JC. Spermicidal bacteriocins: Lacticin 3147 and subtilosin A. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 2008;18(10):3103-6.

42. McCafferty DG, Cudic P, Frankel BA, Barkallah S, Kruger RG, Li W. Chemistry and biology of the ramoplanin family of peptide antibiotics. Biopolymers. 2002;66(4):261-84.

43. Wolter F, Schoof S, Sussmuth RD. Synopsis of Structural, Biosynthetic, and Chemical Aspects of Glycopeptide Antibiotics. 2007. In: Glycopeptides and Glycoproteins: Synthesis, Structure, and Application [Internet]. Springer; [251].

44. Cudic P, Behenna DC, Kranz JK, Kruger RG, Wand AJ, Veklich YI, et al. Functional Analysis of the Lipoglycodepsipeptide Antibiotic Ramoplanin. Chemistry & Biology. 2002;9(8):897-906.

45. Farver DK, Hedge DD, Lee SC. Ramoplanin: a lipoglycodepsipeptide antibiotic. Ann Pharmacother. 2005;39(5):863-8.

46. Sheikh S, Sturzu A, Kalbacher H, Klose U, Nagele T, Amin B, et al. Ramoplanin imaging conjugates–synthesis and evaluation. Med Chem. 2014;10(1):18-26.

47. Koehn FE. New strategies and methods in the discovery of natural product anti-infective agents: the mannopeptimycins. J Med Chem. 2008;51(9):2613-7.

48. Fuse S, Koinuma H, Kimbara A, Izumikawa M, Mifune Y, He H, et al. Total Synthesis and Stereochemistry Revision of Mannopeptimycin Aglycone. Journal of the American Chemical Society. 2014;136(34):12011-7.