Proteinele Laptelui, Componente Esentiale Pentru Tehnologia Branzeturilor
2. MEMORIU TEHNIC
Fabricarea unor produse de calitate are implicații favorabile asupra promovării progresului tehnic, economisirii muncii sociale la producător și la consumator, asupra creșterii gradului de complexitate pe piețele externe și, în general, asupra venitului național.
Pentru promovarea calității este necesar să se desfășoare o activitate amplă și organizează de control astfel ca să se asigure un produs conform documentației tehnologice, care să corespundă indicatorilor de calitate. Ca urmare, în acest scop, sunt necesare programe speciale care să nu se limiteze numai la sectoarele de producție propriu-zise, ci la întregul proces, începând cu proiectarea și terminând cu valorificarea produselor. Programul de asigurare a calității este un sistem de prevenire, depistare și remediere a deficiențelor calitative ale produselor.
Majoritatea metodelor de analiză dau indicații asupra calității produsului la un moment dat, dar calitatea (produsului) alimentului este foarte labilă, fiind influențată de numeroși factori fizici (temperatură, lumină, vapori de apă), chimici( oxigen, metale grele), biologici (enzime, microorganisme).
Dacă privim alimentele ca sisteme variabile este necesar un procedeu de apreciere a calității dinamic, care să răspundă și la modul de evoluție a principalelor substanțe nutritive, gustative și a diferiților componenți mai importanți.
Orice produs alimentar, în condiții optime de păstrare își menține un timp limitat caracterele de comestibilitate. De aceea, el trebuie să ajungă la consumator cu mult înainte ca să atingă limita de necomestibilitate, fie datorită degradărilor senzoriale, fie mai grav, datorită alterărilor chimice și microbiologice. Ca urmare, produsul trebuie să se încadreze în termenul de garanții, ținând seama de toate etapele pe care le parcurge de la fabricație la consumator : depozitarea în fabrică, timpul de transport, păstrarea în depozitele comerciale, timpul probabil de menținere în magazine până la vânzare, păstrarea probabilă la consumator.
Activitatea de control a calității se desfășoară concomitent pe trei direcții:
– în faza de pregătire a fabricației, prin alegerea și programarea instalațiilor tehnologice corespunzătoare, a dispozitivelor de verificare, aparatură de măsură și control, instruirea personalului asupra cerințelor calitative etc.;
– verificarea calității produselor, începând de la reacția materiilor prime și a materialelor, la fluxul de fabricație, până la produsul finit și controlul depozitării, ambalării și expediției.
– urmărirea comportării produsului la beneficiari.
În funcție de faza în care se efectuează controlul poate fi:
– controlul de recepție, la faza de recepționare a materiilor prime, materialelor auxiliare, ambalajelor etc.
controlul finit pentru produsul finit;
Controlul de calitate are scopul de a preîntâmpina apariția a diferitelor rebuturi, nerespectării ale tehnologiei prescrise sau a instrucțiunilor de lucru.
În esență, controlul în industria alimentară urmărește :
– de a preîntâmpina introducerea unor materii prime necorespunzătoare, în fluxul tehnologic;
– de a preveni deprecierea semifabricatelor în cursul procesului de fabricație;
– de a evita introducerea în consum a acelor produse care nu corespund calitativ normelor în vigoare.
– de a găsi cauzele și locurile în care se ivesc defecțiuni în vederea unor remedieri mai urgente.
Controlul de calitate se execută în conformitate cu un plan de control dinainte stabilit, pe baza documentației întocmite de sectorul de concepție, odată cu lansarea în producție a produsului respectiv. Planul de control poate fi : sub formă de fișă sau schemă de control, referitor la recepția materiilor prime, a materialelor, a procesului tehnologic, a produselor finite etc.
Acest plan reprezintă principalul mijloc de lucru al controlorilor tehnici, cuprinzând instrucțiuni care trebuie respectate întocmai, fără interpretări echivoce. În fișa de măsurători se menționează etapele fluxului de fabricație care sunt supuse controlului, modul de efectuare a controlului și frecvența efectuării controlului.
Toate aceste elemente au fost considerate în elaborarea lucrării și anume elaborarea schemei de control pentru tehnologia brânzei proaspete de vaci;
Capitolul 2 se referă la definirea controlului și a avantajelor sale.
Capitolul 3 cuprinde descrierea tehnologiei fabricării brânzei proaspete de vaci, iar în capitolul 4 s-au prezentat variantele tehnologice de control : pentru materia primă – laptele ; pentru produselor auxiliare – preparatele enzimatice ; pentru produsul finit – brânza proaspătă de vaci și pentru fluxul tehnologic. Ultimul capitol al proiectului, capitolul 5 cuprinde bibliografia.
3. TEHNOLOGIA ABORDATĂ
TEHNOLOGIA FABRICĂRII BRÂNZEI PROASPETE DE VACI
3.1. DESCRIEREA TEHNOLOGIEI ABORDATE
Materia primă folosită în procesul de fabricare a brânzei proaspete de vaci este laptele de vacă .Acesta este un lichid secretat prin glandele lactifere de mamifere , în perioada de lactație ; materialele auxiliare folosite sunt preparatele enzimatice ( cheagul și pepsinea) folosite la coagularea laptelui , unii acizi stabili ( de exemplu acidul lactic) , iar produsul finit care rezultă este brânza proaspătă de vaci.
Prin prelucrarea tehnologică a laptelui integral – laptele normal din care nu s-a extras nici un argument și care nu conține nici un fel de adaosuri se obțin diferite produse conform schemei prezentate în figura 1:
Fig. 1 : Schema tehnologică a prelucrării laptelui
Prin prelucrarea laptelui integral se obține laptele pasteurizat care este laptele încălzit la temperatura de 62 o C, timp de 6 minute, în aparate speciale (pasteurizate), în scopul distrugerii microorganismelor patogene în stare vegetativă și apoi răcit imediat la temperatura de 4-6 oC. Pasteurizarea nu trebuie să modifice structura fizică a laptelui, compoziția sa, echilibrul fizico- chimic și nici componenții săi biochimici (diastazele și vitaminele) .
Prin procesul de sterilizare al laptelui integral se obține laptele sterilizat care este laptele supus unui tratament termic la temperaturi cuprinse între 103 și 140o C, timp de 15 minute, în scopul distrugerii complete a bacteriilor. Caracteristicelor organoleptice ale laptelui sterilizat nu trebuie să difere prea mult de ale laptelui proaspat ; el poate fi păstrat timp îndelungat în condiții normale de temperatură.
Prin concentrare sub vid se obține laptele concentrat, din care prin uscare se obține laptele praf.
Din laptele integral se mai obțin : laptele smântinit ; smântâna prin închegarea ei se obține brânzeturile creme ; diferite sortimente de brânzeturi ca : brânzeturi grase fermentate – din care prin topire, în prezența emulgatorilor rezultă brânzeturile topite ; cașul gras ; brânzeturi semigrase fermentate.
În figura 2 sunt prezentate căile de obținere a brânzeturilor – care sunt produse nefermentate sau fermentate alcătuite , în principal din cazeină ce formează matricea proteică, în care sunt înglobate : grăsime , o cantitate variabilă de lactoză, săruri minerale și vitamine.
Fig. 2 Principalele căi de obținere a brânzeturilor
Brânza se poate obține prin coagularea laptelui de vacă, de lioviță sau de oaie prin adăugarea de cheag, de pepsine(preparate enzimatice) sau de acizi slabi( de exemplu acidul lactic) și care conține majoritatea componenților laptelui.
Tehnologia generată de fabricare a brânzeturilor include următoarele operații :
controlul laptelui – material primă ;
curățirea laptelui ;
normalizarea laptelui ;
însămânțarea laptelui cu culturi lactice ; adaosul de CaCl2 și naturarea lui ;
închegarea (coagularea) laptelui ;
prelucrarea coagulului;
formarea și presarea brânzeturilor;
naturarea brânzeturilor;
depozitarea și condiționarea brânzeturilor;
Dacă se are în vedere felul laptelui; conținutul cu grăsime, rezistența pastei și procesul de fabricație, brânzeturile sunt clasificate după cum urmează:
1o. După felul laptelui avem :
Lapte de vacă : Trapist, Șvaițer, brânză proaspătă de vacă ;
Lapte de oaie : telemea de oaie, brânză de burduf etc. ;
Lapte de bivoliță : telemea din lapte de bivoliță, brânză Homorod ;
2o. După conținutul de grăsime :
Slabe : Brânza proaspătă de vaci, dietetică;
Semigrase: brânză de vacă ,,Delicia ,,, brânză Bran ;
Foarte grase : cașcaval Dobrogea, Șvaițer ;
Grase : cașcaval Pentelae, telemea de vacă ;
3o.După corezistența pastei :
Moi : brânza Camembert ;
Semitari : brânza Trapist ;
Tari : brânza Șvaițer, brânza Cedar etc. ;
4o.După procesul de fabricație :
Proaspete : brânza proaspătă de vaci, cremă Caraiman ;
Naturate : brânza Trapist, Șvaițer, etc.
În saramură : telemea de vacă, oaie, etc.
Cu pastă opărită : cașcaval cu adaosuri, topite afumate;
Topite : Topite simple, topite cu adaosuri, topite afumate ;
Frământate : brânza de Moldova, brânza de burduf.
Brânzeturile proaspete a căror tehnologie de fabricare va fi studiată în acest proiect, se obțin prin coagularea laptelui, ca o consencință a acidifierii acestuia cu bacterii sau prin acidifiere și acțiunea unei enzime coagulante (de regulă cheag).
Tehnologia de fabricare a brânzii proaspete de vaci include operațiile menționate în figura 3.
Figura 3 : Schema tehnologică de obținere a brânzei proaspete de vaci
2-3%
1,2%
însămânțare lapte
termostatice 25-27oC /14-16h
însămânțare lapte și
termostatice la 25-26oC/12-24h
1,2%
însămânțare lapte și
termostare la 25-26o C/12-24h
1-1,5%
Principalele operații tehnologice ale fabricării brânzei topite proaspete de vaci :
1.Recepția laptelui – materia primă
Laptele destinat fabricării brânzeturilor trebuie să îndeplinească condițiile :
să provină de la animale sănătoase, hrănite rațional cu furaje de calitate, care să nu transmită laptelui gust și miros străin ;
să corespundă din punct de vedere microbiologic ( număr redus de germeni totali și în principal bacterii sporogene anaerobe de tip Clostrideine, bacterii hitirice, care sunt agenții balonării târzii a brânzeturilor) ;
aciditatea să fie de 16-20oT pentru laptele de vacă și de 21-25oT pentru laptele de oaie ;
se va evita folosirea laptelui în primele 8-10 zile de la fătare și în ultimele 10-15 zile de lactații ;
să nu conțină antibiotice și antiseptice care au acțiune de inhibare asupra microorganismelor care asigură acidifierea și naturarea ;
Recepția laptelui este de două feluri :
recepție cantitativă ;
recepție calitativă ;
a) Recepția cantitativă se realizează la nivelul unităților de prelucrare tehnologică, prin măsurarea cantității de lapte primit după mulgere și colectare.Cantitatea de lapte poate fi determinată în două moduri diferite în funcție de capacitatea de recepționare :
masurare grasimetrică, metodă care se aplică, de regulă în cazul unor capacități foarte mari de recepționare a laptelui ; această metodă implică folosirea unor cântare industriale pentru autoturisme ;
măsurare volumetrică, este cea mai răspândită, fiind mai precisă dacă se cunoaște valoarea densității laptelui.Volumul laptelui variază în funcție de temperatura acesteia și de volumul laptelui are loc la temperatura de 20oC și în absență de spumă și se face cu un contor etalonat numit galactometru, instrument asemănător cu un debitmetru și care permite accelerarea debitului laptelui, transportat din cisterne în rezervoarele unității de prelucrare, în funcție de densitatea laptelui.
b) Recepțiea și naturarea ;
Recepția laptelui este de două feluri :
recepție cantitativă ;
recepție calitativă ;
a) Recepția cantitativă se realizează la nivelul unităților de prelucrare tehnologică, prin măsurarea cantității de lapte primit după mulgere și colectare.Cantitatea de lapte poate fi determinată în două moduri diferite în funcție de capacitatea de recepționare :
masurare grasimetrică, metodă care se aplică, de regulă în cazul unor capacități foarte mari de recepționare a laptelui ; această metodă implică folosirea unor cântare industriale pentru autoturisme ;
măsurare volumetrică, este cea mai răspândită, fiind mai precisă dacă se cunoaște valoarea densității laptelui.Volumul laptelui variază în funcție de temperatura acesteia și de volumul laptelui are loc la temperatura de 20oC și în absență de spumă și se face cu un contor etalonat numit galactometru, instrument asemănător cu un debitmetru și care permite accelerarea debitului laptelui, transportat din cisterne în rezervoarele unității de prelucrare, în funcție de densitatea laptelui.
b) Recepția calitativă a laptelui constă în verificarea calității laptelui primit, prin examinarea proprietăților sale.Astfel, o analiză completă a calității laptelui cuprinde :
un examen al proprietăților organoleptice ;
un examen al proprietăților fizico-chimice ;
un examen al încărcăturii microbiene ;
Compararea datelor măsurate, cu normele prescrise, permite aprecierea atât a calității laptelu, cât și a gradului său de prospețime.Pentru o analiză a calității laptelui este necesar să se procedeze la prelevări de probe conform standardelor, și anume probe a câte 500 ml de lapte prelevate în recipiente sterile și uscate.
2. Curățirea laptelui are drept scop îndepărtarea impurităților pe cale centrifugală. Curățitorul centrifugal are distanța dintre talere mai mică, numărul de talere este mic și sunt lipsite de orificii. Poate fi cu sau fără descărcare automată a manualului în tolă.
În funcție de rezultatele analizelor preliminare, se mai poate face o curățire a laptelui și prin filtrare – operație care constă în eliminarea mecanică a impurităților solide ( prin, resturi de furaje, sedimente de natură diversă ) și prin care se dorește evitarea surselor potențiale de alterare a calității laptelui.
3. Normalizarea laptelui se face la un conținut de grăsime care să asigure în produsul finit ( brânză proaspătă de vaci ) pacientul de grăsime standardizat ( tabelul 1)
Corelația dintre conținutul de grăsime din brânză și din laptele normalizat
Tabelul 1
La normalizarea laptelui pe lângă conținuturile în grăsime, se are în vedere și conținutul de proteine, practic consumul specific depinde de conținutul de proteine. După stabilirea componentelor de amestec, normalizarea se realizează în tancuri sau vane în care se introduce laptele integral și apoi laptele smântinit.
4. Pasteurizarea laptelui destinat fabricării brânzeturilor este necesară pentru :
distrugerea bacteriilor dăunătoare și a celor patogene;
uniformizarea calității brânzeturilor prin faptul că se folosesc bacterii lactice și alte culturi în vederea dirijării procesului de maturare.
îmbunătățirea consumului specific, datorită reținerii în masă de brânză a unei părți din proteinele serice ( lactolbemina și lactoglobumina )
Pasteurizarea este modalitatea cea mai răspândită de sterilizare a laptelui.
În fabricarea brânzeturilor se deosebesc frecvent două modalități de pasteurizare a laptelui:
pasteurizarea joasă sau de lungă durată – cea mai des folosită – realizată la o temperatură de 63-650 C, timp de 20-30 minute, care se face în vane sau cazane;
pasteurizare înaltă sau de scurtă durată – rar folosită, deoarece poate provoca modificări de structură la anumiți componenți din lapte, realizată la o temperatură de 71-740C , timp de 15 secunde , în pasteurizatoare cu plăci;
Parametrii de pasteurizare sunt aleși în funcție de tipul de brânză ce urmează a fi folosit. Astfel:
• pentru brânzeturi proaspete și cele de tip cremă, laptele este pasteurizat în utilaje de pasteurizare cu plăci (T = 90-950C )
• pentru brânzeturi cu pastă moale sau tare se aplică o pasteurizare înaltă (T = 63-650C, 15 secunde);
• pentru celelalte tipuri de brânzeturi, există diferite variante de condiții de pasteurizare cum ar fi: T = 720C, instantaneu (2-3 secunde ) ; T = 700C, timp de 15 secunde ; T = 680C timp de 40 secunde.
5. Răcirea laptelui se face prin mai multe metode și anume:
• răcirea cu apă
• răcirea cu un anumit amestec de apă cu gheață
• răcirea în vană
• răcirea cu schimbări de căldură cu plăci
Metoda de răcire a laptelui în vană este un procedeu folosit în unitățile cu capacități mari de recepție ( 2000 l / zi ). Laptele este pompat în vane de inox, ce au capacități cuprinse între 300 și 2000 de litri, prevăzute cu sisteme de agitare, ce funcționează la un regim de 30-40 rotații/minut. (figurile 4și 5 ). Acest tip de utilaje au o funcționare discontinuă, caracteristicile tehnice ale lor depinzând de capacitatea de prelucrare a laptelui.
Figura 4:Dispozitiv de răcire Figura 5 : Dispozitiv de răcire în
cu vană simplă în bazin vană cu pereți dubli
6.Însămânțarea laptelui:
Prin pasteurizarea laptelui microflora naturală a acestuia este distrusă fiind necesară o însămânțare a laptelui cu culturi de producție specifice sortimentului de brânză ce se fabrică. Culturile starter de producție sunt obținute din cultura selecționată sub formă lichidă sau liofilizată, prin pasaje succesive.
Cultura selecționată cultura primară cultura secundară cultura terțiară cultură starter de producție;
Culturile starter folosite la fabricarea brânzeturilor proaspete sunt formate din : Lactococcus lactis subsp. Lactis, Lactococcus lactes subs. Cremores pentru formare aciditate. Pentru a se evita proteoliza, care conduce la micșorarea randamentului și la apariția de miros și gust nedorit, Lactococcus lactis subsp este eliminat din culltura starter de producție.
Cultura starter de bacterii lactice se folosește după o prealabilă păstrare la frig (0<10o C) timp de 5-6- ore în intervalul maximum de 48 de ore, de la preparare. Proporția de cultură starter de producție adăugată laptelui destinat fabricării brânzeturilor depinde de : calitatea laptelui, felul brânzei, activitatea bacteriilor lactice, anotimp.
Adaosul de CaCl2 în laptele supus maturării este necesară pentru: restabilirea echilibrului în săruri de Calciu pentru a îmbunătăți coagulabilitatea laptelui pasteurizat; îmbunătățirea consumului specific și evitarea defectelor de structură a bobului și a cașului .La un adaos de CaCl2 crește aciditatea laptelui cu circa 10 C, la un adaos de 50 ml CaCl2 /100 l lapte.
7.Pregătirea laptelui pentru coagulare.
Constă în răcirea lui la 23…………28o C pentru produsul de lungă durată și la 33-35o C pentru cel de durată mijlocie. Pentru brânza de vaci adaosul de masă de producție este de 0,5-1% pentru produsul de lungă durată și 5% pentru produsul de durată mijlocie, iar adaosul de CaCl2 este de 12-15g/100 l lapte sub formă de soluție (dizolvată în 2 l apă).
8.Maturarea laptelui:
Înainte de coagulare este necesară pentru:
mărirea capacității de hidratare a proteinelor afectate de pasteurizare ;
întărirea globulelor de grăsime;
modificarea stării sărurilor minerale;
eliminarea gazelor din lapte ,etc;
Maturarea laptelui se face la o temperatură de 23……….28oC, timp de 1-2 ore până când aciditatea crește cu 3-4oC.
9.Închegarea laptelui (coagularea) este operația de bază la fabricarea brânzeturilor, deoarece se separă cazeina. Coagularea laptelui poate fi realizată:
• cu ajutorul acidului lactic, se modifică starea coloidală a cazeinei, adică odată cu scăderea pH-ului și trecerea unei părți din calciul legat de cazeină sub formă de sare de calciu în zer, are loc destabilizarea micelelor de cazeină care precipită sub forma de acid cazeinic:
Ca(PO4) + 4CH2CHOH – CaOH CaH4 (PO4) + 2 (CH3 – CHOH)2Ca
Coloidal Solubil
Coagularea acidă este aplicată la fabricarea brânzei proaspete de vaci, când coagularea are loc sub acțiunea acidului lactic rezultat prin fermentarea lactozei de către bacteriilor lactice.
• cu ajutorul enzimelor coagulante, când procesul este prezentat schematic astfel :
Cazeină + Enzimă coagulantă Paracazeină
Paracazeină + Săruri de calciu solubile Paracazeinat de calciu (precipitat)
10.Prelucrarea coagulului și scoaterea lui din cazan
Prelucrarea coagului rezultat la închegarea laptelui în vederea eliminării unei cantități mai mari sau mai mici de zer, trebuie să se cunoască modul de stabilire a coexistenței coagulului și factorii care influențează deshidratarea coagulului în timpul prelucrării(conținutul de grăsime, conținutul de săruri de calciu, pasteurizarea, aciditatea laptelui etc.).
Coagularea se va efectua în cuve cu pereți dubli timp de 16-18 ore la o temperatură de 23-28o C, până ce aciditatea zerului atinge 50-60o T.
Materialele auxiliare folosite în tehnologia de fabricare a brânzei proaspete de vaci și a brânzeturilor în general, sunt preparatele enzimatice. Acestea sunt folosite la coagularea laptelui și pot fi clasificate astfel :
• preparate enzimatice de origine animală (cheag sau climuzină, pepsină bovină, pepsină de porc sau de pasăre);
• preparate enzimatice de origine microbiană, uleito;
Pentru brânza proaspătă de vaci adaosul de enzimă coagulantă și coagularea se fac în condițiile prezentate în tabelul 2:
Condiții de închegare pentru brânza proaspătă
Tabelul 2
Coagulul din vană se prelucrează astfel :
tăiere coagul în coloane cu secțiunea pătrată având latura de 6-8 cm în cazul vanelor mecanizate și 8-12 cm în cazul vanelor și cazanelor nemecanizate.
repaus 0,5 – 1 oră pentru separarea zerului care se elimină;
11.Scurgere zer ( autopresare- presare )
La terminarea fazei de prelucrare a coagulului, masa de particule de coagul trebuie să se unească și să formeze bucăți de diferite forme cilindrice, paralelipipedice specific sortimentului de brânză respectiv. Trecerea coagulului din vană în forme trebuie să fie rapidă pentru ca particulele de coagul să nu se răcească și să nu capete la suprafață pojghiță tare care să împiedice lipirea între ele. După separarea zerului coagulul se scoate din vană și se introduce în saci de sedilă. Sacii se strâng la gură și se așează pe crinta pentru scurgerea zerului. În prima fază se așează pe un singur rând, apoi se suprapun câte 2-3 ori, apoi se suprapun câte 2-3, apoi câte 4 saci; în timpul scurgerii sacii se întorc de 2-3 ori pentru a ușura eliminarea zerului, în brânzeturi, scurgerea zerului se face în două etape și anume :
autopresare : – pentru brânzeturile moi variază între 10 și 24 ore;
– pentru brânzeturile tari între 8 și 10 ore;
presare : – pentru brânzeturile semitari și tari la temperatura de 20….25oC.
12. Pastificarea brânzei:
Se realizează în mașină specială (plastificator), în scopul obținerii unei paste fine și untoase. Pastificarea se face concomitent cu răcirea brânzei la 6……10oC, în vederea opririi proceselor fermentative, respectiv creșterii acidității. În cazul brânzei proaspete de vaci cu adaosuri la malaxare se pot adăuga:
zahăr și arome (vanile, cacao) sau zahăr și gem (vișine, căpușune) sau zahăr și fructe pentru brânzeturi proaspete cu arome.
NaCl și condimente(piper, chimen, boia, mărar) pentru brânzeturi tip aperitiv.
13.Ambalarea
Brânza proaspătă se poate ambala în :
bidoane metalice (aluminiu, inox) cu capacitate de maximum 5 kg;
pahare din carton parafinat sau din plastic cu conținut net de 100, 200, 250, 500 g;
pachete învelite în foiță metalizată sau în hârtie pergament cu conținut net de 50,100,200,250,500g;
14. Depozitarea:
Brânzeturile proaspete se depozitează în camere frigorifice curate, dezinfectate, bine aerisite, în absența substanțelor toxice sau cu miros pătrunzător la temperatura de 2…8o C și f=75-80% pentru maximum 48 de ore.
3.1.1.Chimismul tehnologiei abordate:
Proprietățile chimice ale laptelui depind într-o mare măsură de cele ale corespondenților săi esențiali, numiți constituenți cheie, și printre care se numără : cazeina , lecitina și lactoza, apa fiind considerată solventul sau mediul în care au loc toate procesele(figura 6) :
Figura 6 : Constituenții cheie ai laptelui
Aceste substanțe joacă un rol primordial în menținerea stabilității emulsiilor și suspensiilor, în care sunt implicate materia grasă și proteinele. Stabilitatea stărilor normale, în care trebuie să se afle cazeina, lecitina și lactoza, este strâns legată de compoziția chimică a plasmei și de alți factori cum ar fi : temperatura și prezența în lapte a unor agenți chimici și prin urmare, pot provoca o modificare a proprietăților organoleptice ale laptelui sau obținerea unui produs lactat derivat.
A.Cazeina și procesul de coagulare.
Cazeina reprezintă ceea ce numim de regulă, masa albă a laptelui.Acest compus pe bază de sulf și de radicali fosforici este principala componentă a laptelui și joacă un rol important în procesele tehnologice de obținere a produselor lactate acide și a brânzeturilor.
Cele trei forme α, β, γ, ale cazeinii se deosebesc prin interacțiunea lor cu enzimele din cheag și căldură. În prezența unor enzime din cheag, variantele α, β, precipită, obținându-se așa numitul produs secundar în fabricarea untului(zara).Sub efectul unui aport termic, acesta din urmă precipită sub formă de urdă, împreună cu unele proteine serice (figura 7) :
Figura 7.
Stabilitatea chimică a celor trei forme de coezină poate fi influențată de modificarea pH-ului, în special la valori mai mari de 4,6.Pentru ca procesul de coagulare a coeziunii să aibă loc, trebuie ca cele două fracțiuni α, β și să se afle într-o proporție de peste 90 %.
Sub acțiunea acizilor minerali sau a acidului lactic cazeina își pierde proprietățile de dispersabilitate și stabilitate și începe să precipite la pH=5,3, maximum de precipitare având loc la pH=4,6 (punctul izoelectric al cazeinei).Prin adaos de acizi minerali se elimină fosfatul de calciu de la suprafața micelelor, cazeina destabilizată precipitând sub formă de acid cazeinic :
(COO (COOH)n
(a) Cazeina Ca)n + 2nHCl Cazeină +nCaCl2
(COO (COOH)n
Cazeinat de calciu solubil Acid Cazeinic precipitat
O astfel de precipitare lentă a cazeinii are loc și sub acțiunea acidului lactic format prin fermentarea lactozei de către bacteriile lactice. Sub acțiunea acidului lactic, fosfatul de calciu asociat cu micelele de cazeină (fosfat tricalcic coloidal) trece în fosfat de calciu solubil.
(b) Ca3(PO4) + 4CH3CHOH – COOH CaH4(PO4)2 + 2(CH3-CHOH-COO)2Ca
(coloidal) acid lactic solubil
Cazeina poate fi coagulată și cu ajutorul enzimelor în prezența sărurilor de calciu, cu formarea unei rețele tridimensionale și păstrarea formei specifice ( la acidifiere forma specifică se pierde) :
(c) Fosfocazeinat de calciu + [cheag și săruri de calciu] fosfo- para cazeinat de
(solubil)
calciu + macropeptid
insolubil (solubil)
Există o fracțiune ipotetică denumită K, care constă într-un complex de interfața pentru celelalte trei forme structurale. K-cazeina conține galactoză și galactozamină, motiv pentru care poartă numele de glicoproteină, caracterizată printr-o mare solubilitate în medii ce conțin ioni de calciu la concentrații de ordinul a 0,4 mol/l, precum și printr-o putere stabilizatoare față de ionii de calciu pentru celelalte variante de cazeină. Cazeina K este un substrat specific al chimozinei din cheag și coagulează sub forma de para-k-cazeină.
Procesele de coagulare a diferitelor forme de cazeină sunt procese cinetice și termodinamice, în sensul că ele sunt favorizate de ridicarea temperaturii și de mărirea timpului, dar fiind, în primul rând catalitice, aceste procese se accentuează pe măsură ce crește aciditatea mediului.
B. Lecitina și emulsia de materie grasă.
Molecula de lecitină este alcătuită dintr-un radical organic cu caracter cinetic (hidrofobe), iar grupările hidrofile rămân la suprafața formând o peliculă hidrofilă.
Astfel, molecula de lecitină se interpune între cele două faze ( apoasă și grasă) și favorizează o anumită afinitate între acestea, ceea ce explică stabilitatea emulsiei de materie grasă în faza apoasă a laptelui.
Lecitina este cel mai important agent fosfolipidic, deoarece joacă un rol dublu care constă în asigurarea :
stabilității (coeziunii) particulelor de grăsime împiedicând aglomerarea lor (rol tensioactiv);
dispersiei omogene a acestor particule în faza apoasă (rol stabilizator);
În laptele proaspăt, există o dispersie omogenă și o granulometrie uniformă a particulelor de grăsime și de proteine. Stabilitatea emulsiei de materie grasă în masa apoasă, este însă foarte precară, deoarece lecitina reținută în lapte este un agent tensioactiv foarte sensibil la orice modificare a tensiunii superficiale. Principalul factor care poate modifica această tensiune superficială a plasmei din lapte este fără îndoială aciditatea laptelui, ale căror cauze sunt multiple și printre care se numără procesul de fermentație lactică.
C .Lactoza și procesele fermentative :
Din punct de vedere chimic, lactoza (C12H22O11) este un dizaharid format dintr-o moleculă de glucoză și o moleculă de galactoză. Lactoza este principalul zaharid al laptelui, pe lângă urmele de galactoză și glucoză, ce rezultă din procesul de hidroliz.
Sub acțiunea unor microorganisme, lactoza principalul zaharid al laptelui și urmele de galactoză și glucoză ce rezultă din procesul de hidroliză a acestuia, pot suferi o serie de procese fermentative de descompunere pentru a da naștere, la acid lactic, acid acetic, acid propionic, acid butiric și sau alcool etilic.
Lactoza, glucocid specific laptelui, constituie singura sursă de galactoză pentru om fiindu-i necesară în sintetizarea metabolică a galactocerebrozidelor, compuși implicați în dezvoltarea sistemului nervos central precum și evitarea tulburărilor de inteligență la copil.
a) Fermentația lactică : implică descompunerea lactozei în acid lactic, în prezența unor enzime secretate de bacterii lactice :
C12H22O11 ++ H2O 4CH3 – CHOH – COOH
Acest fenomen se traduce printr-o mărire a acidității laptelui, care are drept consecință declanșarea procesului de coagulare, proces valorificat în fabricarea produselor lactate acide dietetice, a smântânii, a brânzeturilor.
b) Fermentarea alcoolică are loc sub acțiunea unor enzime secretate de drojdii. Fermentația alcoolică a lactozei presupun descompunerea, într-o primă etapă, a lactozei cu glucoză și galactoză, apoi scindarea acestor zaharide cu formare de alcooli și bioxid de carbon.
Fermentația alcoolică este folosită în fabricarea chefirului, băutură obținută prin fermentarea mixtă lactică și alcoolică.
c) Fermentarea propionică : constă în transformarea lactozei în acid lactic, care sub acțiunea unor enzime se transformă în acid propionic, acid acetic, bioxid de carbon și hidrogen.
C12H22O11 + H2O 4CH3 – CHOH – COOH CH3- CH2 – COOH + CH3-
Lactoza acid lactic acid propionic
CHOH + CO2 + H2* .
acid acetic
Acest proces este folosit în fabricarea brânzeturilor de tip „pastă tare” cum ar fi brânza de tip Șvaițer, unele sortimente de brânză topită.
d) Fermentarea butirică : transformă lactoza în acid butiric, bioxid de carbon și hidrogen. Acest proces este folosit la maturarea anumitor tipuri de brânzeturi.
C12H22O11 + H2O C4H8O2 + 8CO2 + 14H2
Pe lângă procesele fermentative, lactoza poate suferi reacția de hidroliză enzimatice sau acidă cu formare de glucoză (C6H12O6).Se obțin astfel siropul de lactoză, caracterizat printr-un gust dulce mai intens și utilizat în fabricarea înghețatei.
În procesele fermentative, bacteriile lactice joacă un rol primordial determinând, în primul rând, acidifierea laptelui, conform schemei reacționale de mai jos :
C12H22O11 + H2O 4CH3 – CHOH – COOH
Lactoză acid lactic
2C6H12O6 + H2O 2CH3 – CHOH – COOH + CH3-CH2OH+CH3COOH +
glucoza acid lactic etanol acid lactic
CO2 + H2
D. Microorganismelor și procesele biochimice:
Reacțiile chimice decurg, în mod obligatoriu, în prezență de microorganisme.
Laptele proaspăt muls este un mediu favorabil dezvoltării microorganismelor, ce pot fi intrinseci ( microflora esențială) sau ectrinseci de igienă nesatisfăcătoare, microorganismele pot pătrunde în lapte la primul contact cu ugerul animalului și atmosfera, această etapă fiind principala cauză a infectării laptelui.
Microorganismele prezente în masa laptelui pot fi clasificate în :
folositoare : acestea declanșează unele procese biochimice ce modifică favorabil însușirile organoleptice ale laptelui și ale produselor lactate derivate ; în acest sens pot fi considerate drept reacții biochimice toate procesele fermentative ale lactozei în vederea obținerii produselor lactate acide;
dăunătoare : alterează calitatea laptelui și a produselor derivate producând defecte ale proprietăților senzoriale, ceea ce provoacă îngreunarea prelucrării: printre acestea se numără procesele necontrolate de balonare excesivă a produselor lactate, în special a brânzeturilor și de mucegăire a acestora.
patogene : provoacă sau transmit diverse boli consumatorului, cum ar fi câteva tipuri de bacili și în special cel al tuberculozei sau cel al febrei.
3.1.2.Cinetica și termodinamica tehnologiei abordate
3.1.2.1. Cinetica proceselor enzimatice.
Procesele pur enzimatice, ce au loc cu ajutorul enzimelor libere sunt privite drept fenomene catalitice.
Enzimele din laptele proaspăt muls rezultă din activitatea metabolică ce a avut loc în faza premergătoare operației de mulgere .Din punct de vedere tehnologic, prezența lor în lapte nu este avantajoasă, deoarece ele pot determina declanșarea unor procese catalitice nedorite, care afectează gradul de prospețime și calitatea laptelui.
Enzimele sunt biocatalizatori cu acțiuni specifice. Astfel orice component, esențial sau nu al laptelui, este considerat un substrat potențial pentru o enzimă sau o familie de enzime și prin urmare, poate suferi descompuneri catalitice. Astfel există lipaze pentru descompunerea grăsimilor, proteaze pentru degradarea proteinelor, amilaze și hidrolaze pentru scindarea zaharidelor etc. În continuare vom examina amănunțit principalele categorii de enzime prezente în lapte și principiul modului lor de acțiune:
A. Lipazele sunt implicate, în special, în convertirea selectivă a lipidelor. Această funcție a enzimelor se numește activitate lipolitică, adică scindarea lipidelor, activitate ce a constituit obiectul mai multor studii, deoarece ea stă la baza mai multor fenomene ce au loc în procesele de prelucrare a laptelui și de fabricare a produselor lactate. Cercetările intreprinse au pus în evidență două enzime de tip lipaze :
enzime cu o valoare optimă a pH – ului de 8,5-8,9;
enzime cu o valoare optimă a pH-ului de 6,5-6,9;
În funcție de originea lor și de mediul în care sunt preponderente enzimele sunt :
lipazele din plasmă care sunt asociate cu cazeinele;
lipazele din membranele ce înconjoară globulele de materie grasă. Lipazele acționează asupra fracțiunii preponderente din materia grasă și anume asupra gliceridelor din lapte cu formare de glicerină (glicerol) și de acizi grași :
Trigliceridă + H2O Glicerol + acizi grași (1)
Intensificarea unui astfel de proces de descompunere a grăsimilor este influențată de o serie de factori cum ar fi :
conținutul inițial de lipaze în lapte și în acest sens, trebuie semnalat faptul că laptele contaminat sau laptele de tip colastral conțin o proporție foarte mare de acest tip de enzime;
tipul de lapte : în laptele proaspăt muls la o temperatură de 35-36o C activitatea lipazelor este foarte redusă.
perioada de lactații : activitatea enzimelor crește o dată cu creșterea perioadei de lactație;
temperatura laptelui : ridicarea temperaturii la un nivel optim mărește activitatea lipolitică. O ridicare accentuată a temperaturii afectează, însă această activitate , iar temperaturile scăzute dezactivează lipazele fără a le afecta structura.
Pentru a permite o conservare îndelungată a laptelui, trebuie să se recurgă la o încălzire într-un regim de temperatură de 80o C pentru distrugerea totală a acestor enzime;
B. Esterazele – enzimele din această grupă au fost studiate de Forster, care a stabilit existența a trei categorii de esteraze:
esteraza A, care acționează selectiv asupra grupării fenil- acetil ;
esteraza B, care acționează într-un mod similar cu cel al lipozelor din lapte;
esteraza C, care manifestă o activitate față de gruparea fenil-propionat;
Aceste enzime se găsesc în lapte în cantități foarte mici și prezintă un interes scăzut pentru procesele de prelucrare.
C. Proteazele din lapte declanșează procesul de coagulare a laptelui și simultan o hidroliză lentă a cazeinii.
D. Fosfatazele sunt cele mai importante enzime din lapte, deoarece ele catalizează procesele de fermentare a lactozei și de hidroliză a esterilor fosforici:
Esteri ai acidului fosforic acid fosforic + alcooli
Asimilat se cunosc două tipuri de fosfotaze în lapte : fosfotaza acidă și fosfotaza alcalină. Activitatea acestor două enzime se deosebește prin modul lor de acțiune și în special prin valoarea optimă a pH-ului și cea a temperaturii la care ele prezintă o activitate maximă:
fosfataza acidă se întâlnește în lapte ușor smântinit, manifestă o mare stabilitate la temperatură și are o activitate maximă la un pH optim de 4,7;
fosfataza alcalină este rezistentă la ridicarea temperaturii și distrugerea sa este posibilă numai prin pasteurizare.
E. Catalaza este o enzimă specifică laptelui, fiind secretată de glandele mamare. Acțiunea sa caracteristică este descompunerea apei oxigenate în apă și oxigen (molecular inactiv), conform reacției :
H2O2 H2O + ½ O2
Activitatea catalazei este foarte imperativă și se exprimă cu ajutorul indicelui de catalază, indicator care caracterizează calitatea laptelui. Laptele patologic și laptele de tip colostral sunt caracterizați de valori ridicate ale indicelui de catalază.
Catalaza acționează într-un mod optim la un pH de 6,8-7. Ea poate fi distrusă printr-o simplă fierbere, timp de 30 de minute la temperatura de 65o C (prin fierbere).
F. Peroxidaza a fost prima enzimă descoperită în lapte, în 1881. Spre deosebire de celelalte enzime, a căror izolare este dificilă sau chiar imposibilă, peroxidaza a putut fi obținută în stare pură prin cristalizare .Peroxidaza este o enzimă ce distruge apa oxigenată:
H O – H
A + A + 2H2O
H O – H
3.1.2.2.Cinetica și termodinamica procedeelor de sterilizarea termică
Sterilizarea termică vizează distrugerea atât a microflorei esențiale cât și a celei de infecție și în special microorganismele de tip sporulat care rezistă la pasteurizare (mai cu seamă cele de tip Bacillus steareothamophillus). Cinetica de disparație a acestui bacil sporulat este o funcție logaritmică care se accentuează o dată cu ridicarea temperaturii, așa cum se arată în figura 8:
%
110o C
115o C
120o C
135o C
t (timp)
Figura 8 : Evoluția în timp a conținutului în microorganisme în
urma sterilizării la diferite temperaturi
Sterilizarea produce modificări parțiale ale structurii și a compoziției laptelui, intensitatea acestor procese depinde de severitatea condițiilor de sterilizare, adică de temperatură și de timp. Coeficientul de temperatură care se numește Q10 permite compararea cineticilor secundare ( Tabel 3).
Tabel 3 Coeficientul de temperatură
r(T + 10o C)
Q10 = , unde r = d[C]/dt
r(T)
r(T + 10o C) = viteza procesului la temperatura T+ 10oC;
r(T) = viteza procesului la temperatura T;
3.1.2.3. Cinetica procesului de coagulare a laptelui :
În stabilirea mecanismului procesului de coagulare a laptelui, s-au pus în evidență două etape :
prima etapă are o viteză de reacție apreciabilă chiar la o temperatură de 0o C și este independentă de acțiunea ionilor de Ca2+. În această etapă legătura peptidică este scindată de enzima coagulantă, punându-se în libertate partea anionică hidrofilă – glicomacropeptid cu masa moleculară 6754 și care conține 64 resturi aminoacide. Acest glicomacropeptid trece în plasma laptelui. Partea hidrofobă a k-cazeinii insolubilă în plasmă și numită și para-k-cazeină, rămâne atașată de fracțiunile αS1, αS2 și β ale cazeinii;
etapa ulterioară de coagulare propriu-zisă, neenzimatică, constă în asocierea moleculelor de cazeină astfel destabilizate prin scindarea glicomacropeptidii din k-cazeină. Agregarea micelelor cazeină începe atunci când aproape 80% din k-cazeină este hidrolizată. Prin îndepărtarea glicomacropeptidei, potențialul electric al micelelor de cazeină scade de la ––10……….-20 mV la –5…………-7 mV, valoare la care respingerea electrostatică este anulată, iar micelele formează inițial structuri de lanțuri ( filamente, prin condensare liniară) care apoi se agregă într-o rețea tridimensională care înglobează globulele de grăsimi și pungi de aer.
Agregarea micelelor de cazeină implică interacțiuni de tip Van-dar Waals, hidrofobe și electrostatice. Adaosul de CaCl2 favorizează fuzionarea micelelor de cazeină prin formarea de noi legături dintre grupările fosforil ale β – cazeinii și Ca2x. Tăria consitenței gelului este determinată de numărul de astfel de legături și este corelată cu randamentul în coagul și cu calitatea acestuia. Coagularea propriu-zisă este dependentă de temperatură, fiind caracterizată de un coeficient de temperatură de :
r(T + 10o C)
Q10 = = 1,3-1,6, unde r = d[C]/dt
r(T)
r(T + 10o C) = viteza procesului la temperatura T+ 10oC;
r(T) = viteza procesului la temperatura T;
Coagularea propriu-zisă nu are loc la temperaturi de sub 15o C, chiar dacă k-cazeina a fost scindată complet.
3.1.3. Factori care influențează procesul tehnologic:
Procesul tehnologic de obținere a brânzeturilor este unul complex și depinde de mai mulți factori ca :
aciditatea laptelui;
temperatura de congelare a laptelui;
temperatura de fierbere al acestuia;
temperatura laptelui în diferitele faze ale procesului tehnologic.
a) Aciditatea laptelui poate fi exprimată în valori de pH sau în aciditate titrabilă. Laptele proaspăt prezintă proprietăți amfotere cu un caracter ușor acid, și poate juca rolul de lichid tampon în tratarea diverselor intoxicări chimice. Acest efect se accentuează în domeniul de valori ale Ph-ului 4,5-5,5, în care dezvoltarea microorganismelor este optimă. Laptele proaspăt muls are o aciditate totală de 16-18o T ( reprezintă volumul de NaOH 0,1 N necesar pentru neutralizarea acidității din 100 ml lapte), iar la faza de recepție calitativă a laptelui în secțiile de procesare se cere o valoare a acesteia cuprinsă între valorile 19-24oT. Laptele este considerat normal pentru valori ale pH-ului cuprinse între 6,3-6,5.
Pentru alte valori ale pH-ului, laptele este considerat anormal și prezintă defecte a căror cauză ar putea fi : starea de sănătate a animalului. Valorile scăzute ale pH-ului se datorează prezenței în lapte a anumitor compuși, cum ar fi un exces de acid lactic, prezență de bioxid de carbon, prezență de fosfați și citrați etc. Acest fenomen de alterare a calității laptelui poate să aibă loc și la conservare, când aciditatea crește în mod natural și inevitabil sub acțiunea proceselor de fermentare a lactozei în acid lactic. În funcție de nivelul de aciditate laptele prezintă comportări diferite în procesele de prelucrare tehnologică, ceea ce determină modul de valorificare al acestuia. Astfel, de pildă :
pentru acidități mai mici de 18o T, laptele este destinat consumului direct;
pentru acidități cuprinse între 18 și 20 o T acesta este supus smântânirii și apoi se procesează spre obținerea de unturi și iaurturi dietetice;
pentru acidități mai mari de 20o T, laptele este folosit ca materie primă pentru fabricarea produselor lactate acide (chefir, iaurt) sau brânzeturi;
gradul de aciditate al laptelui influențează coagularea în sensul că viteza de coagulare crește odată cu creșterea redusă a acidității. Activitatea optimă a cheagului este la pH = 6,0-6,4 (media 6,2)
concentrația ionilor de H+ : laptele de vacă posedă un pH = 6,3-6,6, laptele de femeie 7,0.Acidul fosforic, citric și sărurile lor, precum și proteinele din lapte acționează cu tampon.
b) În tehnologie, temperatura de congelare este numită punctul crioscopic, la a cărei valoare apar primele cristale în masa laptelui.
Întrucât, laptele ar trebui să prezinte, în mod teoretic, un punct crioscopic mediu de circa (–0,555) oC, care corespunde, temperaturii de solidificare a componentului cel mai greu, acest parametru poate fi folosit pentru depistarea falsificărilor, în special prin diluarea cu apă. Un punct crioscopic apropiat de 0oC indică un conținut nare de apă.
Laptele normal fierbe la o temperatură de aproximativ 100,5o C valoare la care apar primele bule de gaz și care corespunde teoretic, punctului de fierbere a componentului cel mai ușor. Și punctul de fierbere poate fi folosit drept criteriu de evaluare a calității laptelui.
Laptele destinat fabricării brânzeturilor se poate pasteuriza :
la temperatura joasă :63…65o C, cu menținere 30-20 minute (se aplică la fabricarea brânzei praospete de vaci, Șvaițer) în cazane sau vase cu pereți dubli;
la temperatură înaltă : 72oC, cu menținere 15 secunde (aplicabilă la majoritatea brânzeturilor) în pasteurizatoare cu plăci;
pentru anumite brânzeturi (Tilsit, Olanda, Emmental) este suficientă o termizare la 62…62oC, în timp de 20-30 secunde (pentru distrugerea bacteriilor coliarogenes) urmată de bactofugație (pentru eliminarea bacteriilor butirice)
Poate fi maturat laptele crud sau laptele pasteurizat. Laptele crud poate fi maturat normal (12 ore la 15o C) în zona de munte, unde încărcătura microbiologică a laptelui este redusă. Laptele crud poate fi maturat și prin adaos de cultură de producție de 0,01% cu păstrare la 14…….16o C, timp de 12 ore.
Laptele pasteurizat trebuie întotdeauna maturat înainte de închegare. În acest caz, maturarea poate fi :
de scurtă durată, la o temperatură cu 2…3oC mai mare decât temperatura de închegare, timp de 30-40 minute caz în care aciditatea crește cu 0,5-1,5oT ( se adugă circa 1% maia de bacterii lactice).
de lungă durată, când laptele este răcit la temperatura de 10…12oC și se depozitează maximum 24 de ore. Cantitatea de cultură și bacterii lactice este mai mică de 0,3%.
Coagularea enzimatică a laptelui cu cheag (chimozina) este influențată de mai mulți factori, între care temperatura este unul important.
temperatura la care are loc acțiunea cheagului este optimă la 40…41o C. În practică, temperatura de coagulare variază între 25 și 42 o C, în funcție de sortiment. În funcție de temperatura de coagulare se stabilește și durata de coagulare (tabelul 4).
Temperaturile de închegare pentru diferite sorturi de brânzeturi
Tabelul4
De regulă temperatura de închegare în cazul brânzeturilor moi este mai scăzută, pentru a avea un grad mai redus de deshidratare a coagulului. Temperatura de coagulare poate fi mai ridicată pentru un anumit tip de brânză dacă laptele a fost insuficient maturat, aciditatea este mai redusă și conținutul de grăsime mai mare.
Alți factori de care depinde coagularea enzimatică sunt :
cantitatea de săruri de calciu influențează durata coagulării, dar și calitatea coagulului. La un nivel scăzut de săruri de calciu se mărește durata coagulării, iar coagulul are coexistență moale.
cantitatea de enzimă coagulantă determină viteza coagulării, atunci când concentrația este în anumite limite;
compoziția chimică a laptelui;
tratamentul termic preliminar al laptelui etc.;
Temperatura de prelucrare a coagulului este în funcție de tipul brânzei .Cu cât temperatura este mai ridicată cu atât zerul se elimină mai repede și în cantitate mai mare.
Depozitarea brânzeturilor se face în spații cu temperatura de 0……10oC și în acest interval de temperatură se constată o continuare a proceselor de maturare. Condițiile de depozitare (temperatură, umezeală, relativă) variază cu sortimentul de brânză și sunt în funcție de modul în care a fost fabricată brânza , de caracteristicile ei în momentul în care intră la depozitare.
c) Presiunea osmotică și punctul crioscopic.
Presiunea osmotică a laptelui animalelor homeoterme este aceeași cu sângele (circa 7,5 atmosfere). Pentru determinarea ei este necesar să cunoaștem scăderea punctului crioscopic al laptelui. Grăsimile și proteinele din lapte nu joacă nici un rol în scăderea punctului crioscopic deoarece ele nu sunt dispersate molecular ; numai lactoza și sărurile dispersate molecular și ionic influențează punctul crioscopic.
Punctul crioscopic al laptelui normal este în general (-0,53)-)-0,56)oC și pentru fiecare sutime de grad de depresiune a punctului crioscopic corespunde o presiune osmotică de 0,01212 atmosfere calculat din 22,42/1,85.
d) Tensiunea superficială se exprimă în dym/cm2 și este considerată ca fiind regulatorul forțelor electrostatice pe care le exercită un lichid asupra unei alte faze (diferite ca natură) cu care intră în contact. Aceasta se măsoară prin forța de a deslipi, sau a depinde un inel metalic în contact cu suprafața lichidului.
Cu cât tensiunea superficială este mai mare, cu atât capacitatea de udarea a laptelui este mai mică. Capacitatea unui lichid de a „uda” o fază diferită se mai numește și capacitate de înmuiere, așa cum este cazul plasmei din lapte, care hidratează stratul periferic al globulelor de materie grasă în faza de dispersie.
Un lapte normal prezintă o tensiune superficială de ordinul a 52-54 dym/cm2, iar la apă această mărime are o valoare de circa 70-80 dym/cm2. În consecință, un adaos de apă, de exemplu în vederea unei falsificări are drept efect mărirea tensiunii superficiale, care se traduce prin destabilizarea stării coloidale a cazeinei.
3.1.4. Descrierea tehnică la nivelul schemei tehnologice
Materia primă:
Laptele – materie primă în tehnologia brânzeturilor.
Materia primă folosită la obținerea brânzei proaspete de vaci este laptele. În general, prin noțiunea de „lapte” se înțelege laptele de vacă, dat fiind faptul că laptele este cel mai răspândit în toate țările lumii. Pentru că a defini celelalte soiuri, se folosesc denumiri specifice de lapte bivoliță, lapte de oaie, lapte de capră, având în vedere exploatarea mai puțin intensivă a acestei specii în producția de lapte, în comparație cu specia bovină. Acest fapt se datorează, în special, unor considerații tehnico-economice legate de adaptabilitatea acestui animal la condiții climaterice diferite, precum și productivitate.
Laptele proaspăt muls, manual sau prin cale automată și care nu a suferit nici un proces de prelucrare chimică sau fizică, este numit lapte crud integral. El este obținut direct de la mamifere crescute la scară agro – industrială sau în gospodării.
Laptele crud integral poate fi supus anumitor procese tehnologice în scopul de a fi valorificat. Compoziția sa determină tipul de procese de prelucrare și prin urmare, gama de produse derivate. Așadar, compoziția este factorul hotărâtor în adoptarea tehnologiei de valorificare.
Compoziția chimică a laptelui
În absența microorganismelor și enzimelor libere, laptele este un aliment alcătuit din două faze total nemisabile, dar aflate într-o stare de emulsie perfectă una cu alta:
faza apoasă care conține :
• proteinele, substanțe bio-organice, dar compatibile cu faza apoasă datorită gradului lor ridicat de hidratare precum și grupărilor anorganice terminale electrolitice, ce le asigură starea coloidală și compatibilitatea cu apa;
• zaharinele compuși organici solubili în apă;
• vitaminele hidrosolubili;
• sărurile și oligo-elementele minerale;
faza organică constituită din materia grasă, emulgată în faza apoasă și alcătuită din:
• gliceride;
• steride;
• acizi grași;
• fosfolipide, dintre care lecitina, care asigură interfața dintre cele două faze;
• vitamine liposolubile;
• pigmenți (caroten);
Din punct de vedere chimic, laptele conține următorii componenți:
• apa;
• substanța uscată negrasă;
• materia grasă;
Distribuția principalilor componenți ai laptelui este redată în figura 9:
Figura 9 : Principalii componenți ai laptelui
Compoziția chimică a laptelui după specia animalului de la care provine (tabelul 5):
Compoziția chimică a laptelui
Tabelul 5
Principalii componenți ai laptelui
A.1. Apa este principalul component al laptelui, care reprezintă 80% din masa totală a laptelui, proporție ce variază, în primul rând, în funcție de specia animalului (tabelul 1). Ați factori care influențează variația de apă sunt : rasa animalului pentru o specie dată, vârsta animalului, starea de sănătate, perioada de lactație, regimul alimentar, anotimpul, zona geografică, condițiile de creștere și de îngrijire.
Laptele cel mai concentrat și cel mai gras este cel de oaie și cel de bivoliță.
Apa este faza majoritară, în care au loc cvasitotalitatea proceselor chimice, biochimice și fizice. Tensiunea superficială a soluției apoase din lapte numită plasmă, joacă un rol determinat în stabilitatea emulsiei de materie grasă și a suspensiilor de proteine.
A.2.Substanțele azotate:
Apa din lapte este faza de dispersie a ceea ce se numește de regulă, substanța uscată, care rezultă din eliminarea totală a apei din lapte, printr-o deshidratare integrală.
Din eliminarea materiei grase din substanța uscată, rezultă substanța uscată negrasă, care în afară de substanțe minerale ( săruri de Ca, Mg, K, etc.), mai conține și elemente organice specifice laptelui, printre care putem enumera: lactoza, cazeina, lactaglobemina, enzime libere, urine de alți compuși.
Cea mai mare parte a substanței uscate, grase sau negrase, poate de asemenea fi obținută prin coagularea fie a laptelui normal, fie a laptelui smântânit și formarea unei mase floculante, numite coagul. În masa substanțelor azotate proteinele reprezintă, în medie, o proporție de circa 95%.
A. 2.1. Proteinele laptelui sunt substanțe macromoleculare formate din combinarea a circa 20 de aminoacizi elementari. Ele pot fi ușor separate de soluție, utilizând acid tricleracetic (ATCA) sau acid fosfotangtic și pot fi precipitate are o soluție concentrată de sulfat de amoniu.
În funcție de starea lor de dispersie, proteinele din lapte pot fi clasificate în două grupe :
cazeina aflată în stare de suspensie coloidală și care reprezintă 80%;
proteinele zerului sau proteinele serice, solubile în apă și anume:
• lactabemina, în proporție de 9-15% din masa proteinelor;
• lactoglobelina, în proporție de 3,3% din totalul proteinelor;
• proteozopeptanele, în proporție de 3,7% (solubile în zer);
Cele mai importante proteine din lapte pot fi clasificate în trei categorii, în funcție de structura lor chimică. Aceste trei categorii sunt :
baloproteine, care conțin numai α – aminoacizi (α – lactolbumina , β- lactoglobelina);
fosfoproteinele, care conțin acidul fosforic în gruparea proteică (α – cazeina, β-cazeina);
lipoproteinele, care conțin glucide drept grupare prostetică (k-cazeină).
a) Cazeina este o proteină specifică laptelui, fiind cea mai importantă componentă proteică a laptelui și poate fi identificată prin tehnica numită electroforeză. Acest compus joacă un rol foarte important cu procesele tehnologice de obținere a brânzeturilor.
Cazeina reprezintă ceea ce numim de regulă, masa albă a laptelui. Luată ca o utilitate, cazeina este o fosfoglicoproteină care reprezintă mai mult de 75% din azotul total al laptelui și se prezintă sub forma unui edificiu micelar de formă globulară care are legați sau asociați fosfați și citrate de calciu. În lapte, cazeina se găsește ca fosfocazeinat de calciu. Constituenții glucidi ai cazeinei (1,4%) sunt localizați într-o componență a cazeinei totale și anume în k-cazeinei.
Compoziția micelei de cazeină este arătată în tabelul 6:
Compoziția micelei de cazeină – Tabelul 6
Așa cum rezultă din tabelul 2 micela de cazeina este puternic mineralizată, atât cu macro cât și cu microelemente. Anumite macroelemente fac parte integrantă din micela de cazeină (fosforul și calciu organic).
Fosforul organic sub formă de fosfoserină și fosfotreomină (mai puțin) intră în structura moleculei de cazeină, restul fiind reprezentat de esterii fosforici cu treominei.
Calciul organic se leagă de cazeină prin intermediul grupărilor carboxilice și reprezintă 20% din totalul de calciu din lapte.
Oligoelementele sunt fixate sau în general absorbite pe micela de cazeină astfel :
fierul este asociat de micela de cazeină prin intermediul lactotransferinei ( proteina roșie ) care este o proteină minoră a laptelui și calea de transport a fierului din sânge în lapte;
zincul este legat parțial slab și parțial mai puternic de micela de cazeină, la precipitarea acidă a cazeinei fiind eliberat și trecut în zer;
cuprul este și el , asociat cu micelele de cazeină și este reținut în proporție de 35% la precipitarea acidă a cazeinei;
seleniul este asociat cu micelele de cazeină și reținut în proporție de 54% la precipitarea acidă a cazeine.
De cazeină sunt asociate și vitaminele , gradul de asociere fiind în funcție de vitamină și de fracțiunea cazeinică considerată.
Din punct de vedere structural, edificiul micelar de cazeină, cu diametrul mediu de 150 μm , este alcătuit din submicele care sunt legate între ele prin intermediul dusterelor de fosforil care la rândul lor, leagă calciul sub formă de fosfat de calciu coloidal.
Toți constituenții glucidici (1,45% din cazeina totală) sunt localizați în macropestidul conținut k-cazeină, macropeptid care este scindat din k-cazeina de către chimozină. Acest macropeptid conține 18,7 – 30,9% glucide totale din care : hexoze 5,1-15,2% ; hexozamine 2,3 – 4,3% și acid siatic 11,35%. Prin îndepărtarea calciului, micelele de cazeină se disociază în submicele. Având în vedere că în cazeină există un exces de grupări – COO- , cazeina în ansamblul ei este electronegativă și migrează către anod în câmp electroforetic. Caracterul acid este accentuat și de radicalii fosforici și de acidul siatic din moleculă.
Din punct de vedere nutrițional, cazeina este bine echilibrată în aminoacizi, în special lizina, dar este deficitară în aminoaciză cu sulf deficitul fiind de aproximativ 40%.
Cazeina poate fi hidrolizată enzimatică în oligopeptide solubile celesorbabile care –i conferă o eficaceitate nutrițională superioară deoarece, oligopeptidele respectiv care conțin fenilalamină, treomină, bestidină, alamină, tirozină, serivă și acid aspartic, sunt mult mai absorbabile din tractusul digestiv al omului în comparație cu aminoacizii respectivi. Fosfopeptidele intervin în creșterea absorbației intestinale a colidului prin mărirea solubilității acestuia, iar oligopeptidele care conțin fier (până la 20%) sunt și ele capabile să traverseze peretele intestinal și facilitează absorbția fierului.
Prin hidroliza enzimatică a cazeinii pot lua naștere și casomorfina care sunt peptide clasificate ca opioide, deoarece au o acțiune asupra sistemului nervos central asemănătoare opiaceelor. Peptidele care se formează din β- cazeină au următoarea secvență aminoacidă:
Tirozină-prolină-fenilalamină+prolină-glicină, iar cele rezultate din α-cazeină au următoarea secvență aminoacidă :
Tirozină-leucină-glicină-tirozină-lucină. Aceste peptide au același proprietăți biologice ca morfina și morfina și opaceele, deoarece se fixează competitiv pe aceiași receptori.
Din punct de vedere nutrițional, cazeina induce la om hipercolesterolemise în comparație cu proteinele din soia care induc hipocolesterolamine. Proprietățile hipercolesterolamice sunt în legătură cu grupările fosfoserinice din cazeină care au următoarele efecte :
captează fosfațiide calciu și în acest fel, fosfoserina evită o saturare a acizilor biliari cu aceste săruri minerale ;
efect asupra eficienței vitaminei A, fapt care se explică prin aceea că grupările hidroxilate ale retenolului pot reacționa cu grupările fosforilate ale cazeinii și deci, acestea intervin în absorbția vitaminei A.
Din punct de vedere tehnologic cazeinele sunt cele care intervin în fabricarea brânzeturilor, putând fi obținute următoarele cazeine, din laptele degresat : cazeina acidă, cazeina cheag, cazienați, coprecipități cu largi utilzări în industria alimentară și în alte industrii. Cazeinele și în principal cazeinații au importante proprietăți funcționale (de hidratare, de emulsionare, de spumare, etc.)
.b) Proteinele zerului
• Lactalbumina reprezintă circa 15% din conținutul total de proteine în lapte.Această proteină nu precipită sub acțiunea enzimelor coagulante din cheag, iar la încălzire îi conferă laptelui un gust de fiert. În procesul de coagulare, lactalbemina rămâne în plasmă, din care se poate extrage ulteior prin încălzire la o temperatură de 80oC sau pe cale chimică cu ajutorul sulfatului de magneziu.
La valori ale pH-ului cuprinse între 3-7 , β-lactoalbumina se află sub formă de dimer. Monomerul are o masă moleculară de 18 000 și este constituit din 162 de resturi de aminoacizi, prezentând două grupări : de sulf și o grupare de SH liberă.
Lactalbumina se află în lapte sub trei forme izometrice (α , β și γ), solubile în apă datorită tensioactivității lor intrinseci, precum și funcțiilor electrolitice terminale, ce intră în structura lor.
• Lactoglobulina se află în lapte în proporție redusă de circa 0,1% dar în anumite tipuri de lapte proprția sa poate să atingă câteva procente.Ea există sub două forme izomerice, numite englobulina și pseudoglobulina
• Proteazopeptonele se află în fracțiunea proteică a laptelui în cantități mai reduse și prezintă un interes biologic și tehnologic limitat din cauza valorii lor nutritive reduse.
• Substanțele azotate neproteice cele mai importante prezente în lapte sunt creatina, creatinina, hipoxantina, ureea, acidul uric, amoniacul, aminoacizii liberi. Substanțele neproteice azotate prezintă o importanță deosebită, având în vedere contribuția lor în definirea calității și valorii nutritive a unui tip de lapte.
A.3. Glucidele :
Lactoza este principalul component glucidic al laptelui pe lângă urmele de galactoză și glucoză, ce rezultă din procesul de hidroliză. Din punct de vedere chimic, lactoza este un dizaharid ( dioză ) format dintr-o moleculă de glucoză și o moleculă de galactoză.
Lactoza este un component al laptelui care determină, sub acțiunea microorganismelor, toate procesele fermentative, care au loc în lapte. Lactoza poate suferi o serie de procese fermentative de descompunere pentru a da naștere, în funcție de tipul de microorganisme implicate, la acid lactic, acid propionic, acid heteric sau alcool.
Cu o putere de îndulcire de 6,25 ori mai mică decât a zaharozei, lactoza îi conferă laptelui un gust dulceag care este mai pronunțat în zerul nefermentat, deoarece în lapte, acesta este mascat de prezența cazeinei. Laptele de vacă conține în jur de 4.3 – 4,8 %, lactoză raportată la cantitatea totală de substanță uscată.
A.4. Lipidele :
Materia grasă din lapte este un amestec complex, alcătuit de o multitudine de compuși, printre cere se numără gliceridele, steridele, fosfolipidele, acizii grași liberi, diverse tipuri de ceară etc.
• Gliceridele reprezintă cea mai importantă fracțiune din materia grasă în proporție de 88-89 % . Acești compuși sunt esteri formați în urma reacției acizilor grași cu glicerolul
Numărul de specii glicerice în lapte este foarte mare, fiind determinat atât de numărul variabil de molecule de acizi grași grefate pe o moleculă de glicerol ( trialcool ), cât și de diversitatea moleculelor de acizi grași.
• Steridele sunt esteri ai acizilor grași cu colesterol. Aceste substanțe se găsesc în lapte în proporții mici de circa 0,01 – 0,03 % și au un rol fiziologic foarte important în formarea vitaminei D a acizilor biliari și a hormonilor sexuali.
• Fosfolipidele cele mai importante sunt fosfotidil-colina, cefalina, sfingomielina și lecitina. Acești compuși joacă un rol impoetant în emulgarea și stabilizarea emulsiei de materie grasă în plasmă din lapte, prin angurarea interfeței dintre cele două faze. În procesul de separare a grăsimii din lapte, o proporție de circa 2/3 din fracțiunea fosfolipidică trece în smântână.
A.5. Vitaminele din lapte :
Principalele vitamine întâlnite în lapte sunt cele de tip A, D, B1, B2, B6, PP, și B12, și sunt împărțite în două faze :
• vitaminele hidrosolubile, dizolvate în plasmă
• vitaminele hiposolubile, dispersate în materia grasă.
Vitaminele contribuie la valoarea nutritivă a laptelui, prin acțiunea lor , alături de enzime și de alțifactori de nutriție, în procese metabolice ce au loc în organismul consumatorului.
A.6. Fracțiunea enzimatică din lapte
Enzimele sunt compuși proteici funcționalizați și joacă rol de catalizatori, foarte activi selectivi, în diferitele procese chimice și biochimice ce pot avea loc în lapte. Enzimele esențiale sunt localizate în special în celulele epiteliale ce provin din glandele mamare. Principalele grupe de enzime sunt :
• lipazele – activitatea lipolitică a fost determinată de mult în laptele diferitelor specii ( vacă, oaie, bivoliță, capră ). Diverși autori au apreciat că laptele conține o lipază principală ( pHoptim = 8,5 – 9,0) și alte lipaze care au pH-ul optim la 6,5 ; 7,0 ; 7,9 . Cantitatea de lipază în laptele de vacă, variază foarte mult, crescând în special spre sfârșitul perioadei de lactație. Lipazele acționează asupra fracțiunii preponderente din materia grasă și anume asupra gliceridelor din lapte cu formare de glicerină ( glicerol ) și de acizi grași :
Trigliceridă + H2O → Glicerol + acizi grași
• esterazele – enzimele din această grupă au fost studiate de Forster care a stabilit existența a trei categorii de esterazi
esteraza A , care acționează selectiv asupra grupării fenil-acetil.
esteraza B , care acționează într-un mod similar cu cel allipazelor din lapte.
esteraza C , care manifestă o activitate față de gruparea fenil-propionat.
Aceste enzime se găsesc în lapte în cantități foarte mici și prezintă un interes scăzut pentru procesele de prelucrare.
• amilazele – (α și β) –α- amilaza laptelui de vacă are aceleași caracteristici și proprietăți ca și cea produsă de organele digestive.
• fosfatazele sunt cele mai importante enzime din lapte, deoarece ele catalizează procesele de fermentare a lactozei și de hidroliză a esterelor fosforici
Esteri ai acidului fosforic → acid fosforic + alcooli
Se cunosc două tipuri de fosfataze în lapte: fosfataza acidă și fosfataza alcalină. Activitatea acestor două enzime se deosebește prin modul lor de acțiune și în special prin valoarea optimă a pH-ului și cea a temperaturii la care ele prezintă o activitate maximă:
fosfataza acidă se întâlnește în laptele ușor smântânit, manifestă o mare stabilitate la temperatură și are o activitate maximă la un pH optim de 4,7 .
fosfataza alcalină este rezistentă la ridicarea temperaturii și distrugerea sa este posibilă numai prin pasteurizare.
• reductazele au rolul de a reduce unii componenți din lapte. Această enzimă nu este secretată de glandele mamare, ci este de origine microbiană.
• peroxidazele – peroxidazele laptelui se caracterizează printr-o mare sensibilitate față de apa oxigenată, producând descompunerea ei și oxidarea receptorului. Aprecierea proprietăților biologice ale laptelui se bazează pe faptul că peroxidaza se descompune la temperatura de 80o C.
Peroxidaza este o enzimă care distruge apa oxigenată:
H O – H
A + A + 2H2O
H O – H
7. Caracteristicele fizice ale laptelui:
Cunoașterea caracteristicilor fiziodinamice ale unui tip de lapte este indispensabilă pentru determinarea și confirmarea naturii defectului eventual, precum și pentru alegerea căii de valorificare a acestui conținut. Determinarea acestor caracteristici permite depistarea posibilelor falsificări ale acestui produs.
1. Densitatea, este mărime fizică care exprimă masa unității de volum la 20o C, în g/cm3 și este strâns legată de compoziția chimică, și în special de conținutul de materie grasă. Densitatea poate furniza informații prețioase asupra calității și valorii nutritive ale laptelui. În tabelul 7 sunt redate valorile densităților laptelui în funcție de specia animalică:
Densitatea laptelui crud integral în funcție de specia animalică
Tabelul 7.
Densitatea laptelui poate fi influențată de toți factorii care au un impact direct asupra compoziției chimice și anume specia animalului, vârsta lui, regimul alimentar, perioada de lactație, starea de sănătate. În tabelul 8 sunt redate valorile densităților principalelor fracțiuni ale laptelui.
Densitatea principalelor fracțiuni ale laptelui
Tabelul 8.
Densitatea specifică a laptelui, descrește cu creșterea conținutului de grăsime, dar crește în paralel cu creșterea conținutului de proteină, lactoză, săruri. Laptele degresat are o densitate specifică mai mare decât laptele integral.
2. Potențial redox este un parametru caracteristic laptelui și preparatelor din lapte. Valorile sale sunt :
pentru laptele brut : +20V – +30V;
pentru laptele pasteurizat : +0,10V;
pentru brânza dulce : +0,10V;
pentru iaurt : -0,15 V;
pentru brânza Emmental :-0,30V. Potențialul redox are o mare importanță în producția și stocarea produselor din lapte (previne oxidarea și determină activitatea bacteriană).
3.Căldura specifică : este o posibilitate termofizică de mare importanță în evaluarea calității laptelui ; se exprimă prin numărul de calorii (sau de joule) necesare pentru a ridica cu 1o C valoarea temperaturii unei cantități de 1g de substanță (sau de mol).
Un lapte normal prezintă o valoare medie a căldurii cuprinsă între 0,92-0,94 cal/gk. Aceasta este strâns legată de compoziția laptelui și de structura componenților săi, fiind modificată de orice schimbare a acestora din dumă. În depistarea falsificărilor, se arată că valoarea căldurii specifice este foarte sensibilă la modificările cauzate de adăugarea de apă, de extragerea unei părți din conținutul de materie grasă sau de orice schimbare a structurii chimice a principalelor componenți ai laptelui prin proceduri fizice și chimice sau biochimice.
4. Conductibilitatea electrică : reprezintă valoarea rezistenței pe care o manifestă laptele la trecerea unui curent electric. Această mărime este exprimată în ohmi și prezintă valori cuprinse între 175-200 Ω pentru laptele normal. În afara acestui domeniu, valorile rezistenței electrice caracterizează un lapte anormal, care poate fi falsificat sau defectuos.
5.Indicele de refracție : este o mărime optică, ușor accesibilă prin măsurări simple, care poate furniza informații despre calitatea laptelui și este strâns legată de compoziția acesteia și de gradul de dispersie a emulsiilor și suspensiilor în masa acesteia. Un lapte normal prezintă valori ale indicelui de refacție în domeniul cuprins între 1,3410-1,3480 și pH-ul între 6,5-6,75, iar un lapte anormal prezintă valori necuprinse în acest domeniu(6,5-7,5).
6. Vâscozitatea laptelui : este un indice al stării în care se află cazeina și depinde de echilibrul existent între plasmă și emulsiile de materie grasă și suspensiile de proteină. Această mărime se exprimă în POISE. Laptele este de circa 2 ori mai vâscos decât apa, iar ridicarea temperaturii sau diluarea laptelui cu apă duce la scăderea valorii acestei temperaturi.
7. Aspectul, gustul și mirosul: laptele este un lichid albicios sau alb gălbui. Culoarea lui albicioasă se bazează pe reflectarea luminii de către grăsimea emulsionată și proteinele în stare coloidală.
Conform STAS 6345-88, privind analiza senzorială laptele este un lichid omogen, lipsit de impurități și sediment, are culoarea albă cu nuanță ușor gălbuie, uniformă, cu un strat de grăsime care prin agitare dispare fără a forma floare.
Laptele nu are miros pronunțat, el posedă un miros propriu nespecific. Gustul laptelui este slab –dulce. În bolile de uger, laptele are un gust sărat. Când animalul a fost hrănit cu anumite substanțe (brânză de sfeclă, sfeclă de apă și altele) în cantitate mare sau cu nutreț mucegăit, gustul este neplăcut și uneori amar.
8. Gradul de impurități al laptelui : poate fi exprimat în două moduri :
cantitatea de impurități solide pe unitate de valori de lapte;
numărul de microorganisme pe unitate de volum de lapte;
Determinarea cantității de impurități solide (I) se face prin analiză grasimetrică după filtrare, iar în funcție de valoarea acesteia și a numărului de microorganisme (N), laptele se clasifică în trei clase de calitate (tabelul 9) :
Clase de calitate de gradul de impuritate al laptelui
Tabelul 9
Materiale auxiliare :
În timpul operațiunilor tehnologice de prelucrare a laptelui și a coagulului se adaugă preparatele enzimatice, care sunt materialele auxiliare folosite la obținerea brânzeturilor.
Coagularea enzimatică a laptelui s-a realizat la început exclusiv cu cheag, însă creșterea producției de brânzeturi pe plan mondial a pus problema unui înlocuitor pentru cheag. Întrucât coagularea laptelui este inițiată prin scindarea legăturii peptidice dintre fenilamină 105 și metionină 106 din k-cazeină, oricare endopeptază care este capabilă să producă hidroliză este un înlocuitor potențial pentru cheag (chimozină).
O activitate proteolitică intensă determină:
obținerea unui coagul moale, friabil, care la prelucrare și formare se fărâmițează;
creșterea consumului specific, deoarece peptidele eliberate sub acțiunea proteolitică a preparatului enzimatic sunt solubile în zer;
fondarea unor produși de hidroliză care imprimă gust amar brânzei.
Preparatele enzimatice folosite la coagularea laptelui pot fi clasificate astfel :
preparate enzimatice de origine animală (cheag sau chimozină, pepsină bovină, pepsină de porc, pepsină de pasăre);
preparate enzimatice de origine fungică : Renilase (Mucor miehel), Supraren(Endothia parantica).
Preparate enzimatice : Milozyme (B.,polymixa);
Principalele preparate enzimatice de origine animală sunt cheagul și pepsina:
Cheagul este un preparat enzimatic din stomacul glandelor de vițel, miel, sacrificați în perioada de alăptare. Se mai numește pressure, și are ca principiu activ chimuzina cheagul industrial se obțin sub formă lichidă sau pulbere.
Pepsina este un preparat enzimatic care se obține din mucoasa roșie a stomacului de vită și de porc, unde se găsește sub formă inactivă de pepsinogen. Trecerea sub formă activă are loc sub influența HCL folosit la atracția enzimei din mucoasa roșie stomacală.
Produs finit
Brânza proaspătă de vaci este produsul finit al tehnologiei abordate. Brânza proaspătă de vaci se obține în urma executării operațiilor descrise la capitolul 3.1”Descrierea tehnologiei abordate”.
Conform STAS 3664/1992 brânza proaspătă de vaci trebuie să prezinte următoarele caracteristici:
C.1. Proprietățile organoleptice :
aspect și culoare : pastă omogenă, curată, fără eliminare de zer, culoare albă până la alb-gălbui, uniformă în toata masa;
consistență: pastă fină, cremoasă, nesfărmicioasă; se admite consistență slab grunjoasă la brânza de tip semigrasă și slabă;
miros : plăcut de fermentație lactică, fără miros străin;
gust : plăcut de fermentație lactică ; fără gust străin (acru, amar, de afumat, de drojdii, etc.).
C.2.Caracterisicele termofizice: ale brânzei sunt redate în tabelul 10:
Caracteristicele termofizice ale brânzei
Tabelul 10
C.3. Proprietățile fizice și chimice sunt tratate în tabelul 11:
Proprietățile fizice și chimice ale brânzei
Tabelul 11
C.4. Proprietățile microbiologice sunt prezentate în tabelul 12:
Proprietăți microbiologice
Tabelul 12
Recepția laptelui : este de două feluri
a) recepție cantitativă care se realizează la nivelul unităților de prelucrare tehnologică, prin măsurarea cantității de lapte primit după mulgeri și colectare.
b) recepție calitativă care constă în verificarea calității laptelui primit, prin examinarea proprietăților sale.
Laptele se recepționează în cisterne, autocisterne, butoaie.
Dacă se prelevează probe pentru analiză din laptele recepționat, acestea se pun în recipiente uscate, sterilizate și învelite ermetic, având o capacitate de 500 ml.
2) Curățirea laptelui : are drept scop îndepărtarea impurităților pe cale centrifugală. Utilajele folosite în acest scop sunt : curățitorul centrifugal , are distanța dintre talere mai mică, numărul de talere este mic și sunt lipsite de orificii. Un astfel de arătător poate fi și centrifuga cu tobă cilindrică și talere conice fără orificii.
Aceasta funcționează ca separator clarificator pentru sisteme eterogene lichide cu conținut redus de substanță solidă (particulele solide din lapte, vin, borș.). Între partea cilindrică a carcasei și talerele curente apare un spațiu destinat sedimentării particulelor solide, din amestecul de separat. În mod normal, în proiectare se consideră acest spațiu de 40-90 cm3 pentru fiecare 100 l/h lichid clarificat, spațiu care să asigure funcționarea în condiții normale fără oprire 2-3 ore. Pentru a se evacua faza limpezită sub presiune, se montează discul de presiune 4 (figura 10 b). Centrifuga poate funcționa și cu alimentare inferioară sub presiune (figura 10 c). În acest caz axul 4 are secțiune inelară.
Figura 10. Centrifuge verticale decantare cu tobă cilindrică
și talere.
Curățirea laptelui se mai poate face și prin filtrarea lui, operație care constă în eliminarea mecanică a impurităților solide și prin care se dorește implicit evitarea surselor potențiale de agenți de alterare a calității laptelui.
Filtrarea se realizează cu ajutorul unor filtre echipate cu site, cu straturi de material filtrant consumabile sau neconsumabile, de exemplu vată sau pânză de tifon. Tipurile de filtre , folosite pot fi clasificate după capacitatea de recepționare a laptelui, după regimul hidrodinamic a fluxului tehnologic.
Astfel se pot folosi :
filtre discontinue, pentru capacități mici de prelucrare (figura 11):
Figura 11. Filtre discontinue
filtre continue pentru capacități mari de recepționare (figura12):
Figura 12. Filtre continue
3) Normalizarea laptelui se face la un conținut de grăsime care să asigure în produsul finit (brânza topită de vaci) procentul de grăsime standardizat. Normalizarea se poate efectua în tancuri sau cazane în care se introduce laptele integral, apoi cel smântânit.
4) Pasteurizarea laptelui : pasteurizarea este o tehnică de tratament termic foarte economică și avantajoasă din punctul de vedere al calității produsului finit. Laptele folosit pentru fabricarea brânzeturilor proaspete este pasteurizat într-un pasteurizator cu plăci la temperatura T = 90-95oC (figura 13).
Figura 13 Pasteurizator cu plăci
Pasteurizatorul cu plăci e introdus pe scară mare în întreprinderele a căror producție principală e laptele pasteurizat este format dintr-o serie de plăci de oțel inoxidabil, pe suprafața cărora sunt executate canale. Plăcile sunt strânse una lângă alta și presate în grupuri separate de către o placă mai mare. Plăcile au pe una dintre fețe canale prin care circulă laptele, iar pe fața opusă circulă apă caldă sau abur. Plăcile sunt grupate astfel încât formează mai multe secțiuni care permit ca același aparat să execute întreaga operație de pasteurizare de la preîncălzire le răcire recuperându-se în același, timp o mare parte din căldură.
5) Răcirea, însămânțarea și coagularea laptelui se realizează în vane mecanizate (figura 14)
vane și cazane nemecanizate (figura 15)
6) Împachetarea : produsului finit – brânza proaspătă de vaci, se face în :
bidoane metalice (aluminiu, inox) cu capacitate de maximă kg;
pahare din carton parafinat sau din plastic, cu conținut de 100, 200, 250, 500g;
pachete învelite în foiță metalică sau hârtie pergament, cu conținut net de 50, 100, 200, 250, 500g;
3.1.5. Surse de poluanți, debite și concentrație, încadrare în norme
Pentru industria alimentară poluanți pot fi:
poluanți chimici (din aer, apă, sol);
poluanți microbiologi (bacterii, mucegaiuri, drojdii);
poluanți proveniți din utilaje;
3.1.5.1. Apa pentru industria de prelucrare a laptelui
Deoarece șine în contact cu materiile prime prelucrate sau reprezintă o materie primă de bază pentru obținerea unor produse alimentare, apa utilizată în industria alimentară trebuie să corespundă standardului de calitate pentru apă potabilă.
Apa este folosită în industria laptelui de consum, a produselor lactate și a brânzeturilor, prepararea siropurilor de zahăr, spălarea brânzeturilor la maturare, încălzire, pasteurizare, răcire, etc.), igienice(spălarea ambalajelor, utilajelor, spațiilor de fabricație) și sanitare.
În producerea laptelui pasteurizat, a untului , a brânzei și produselor lactate se permite numai folosirea apei curate, inodoră, incoloră, cu duritate maximă 15o germane și cât mai pură din punct de vedere microbiologic. Astfel apa nu trebuie să conțină bacterii feruginoase, sulfo-oxidante, sulfo-reducătoare sau produse ale activității acestora, care se depun pe pereții utilajelor și pot trece în produse, producând deprecierea acestora. Fierul și magneziul sunt permise doar în cantități nesemnificative (<0,05mg/l) pentru că sunt responsabile de gustul metalic și pot cataliza procesele de râncezire a grăsimilor, înrăutățind astfel calitatea produsului finit.
În tabelul 1 sunt prezentați indicatorii calitativi și care trebuie să îndeplinească apa folosită în industria laptelui cât și necesarul de apă.
3.1.5.2.Ape reziduale din industria de prelucrare a laptelui.
În centrul proceselor tehnologice de prelucrare a laptelui au loc pierderi importante de substanță uscată în apele evacuate. Datorită compoziției lor (proteine, lipide, lactoză), apele reziduale nu pot fi deversate la rețeaua de canalizare înainte să se realizeze purificarea lor, deoarece simpla deversare ar trebui la poluarea mediului înconjurător. Apele reziduale din fabricile de prelucrare a laptelui sunt formate din ape reziduale industriale, poluate, ape reziduale menajere provenind de la grupuri sanitare și ape reziduale convențional curate (de răcire, încălzire și de condensare), nepoluat.
În fabricile de produse lactate acide și în fabricile de îmbuteliere a laptelui de consum, apele reziduale industriale se compun numai din ape de spălare și de curățire rezultate la recepția laptelui sau la umplerea recipientelor, la curățirea camioanelor – cisternă , a pasteurizatoarelor și a vaporizatoarelor etc. Aceste ape conțin urme de lapte și uneori de substanțe chimice utilizate pentru curățire și dezinfecție.
În multe situații, mai ales în fabricile de capacitate mică, zerul obținut la fabricarea brânzeturilor este evacuat cu apele reziduale reprezentând un factor important de poluare, motiv pentru care se recomandă utilizarea lui pentru hrana animalelor sau valorificarea pe alte căi.
O atenție deosebită trebuie acordată din punct de vedere igienic, apelor de spălare a sălii de primire a laptelui și a bidoanelor, ca și sedimentului de la lactofugare, întrucât acestea prezintă riscul de a conține microorganisme patogene.
Volumul apelor reziduale industriale produse într-o fabrică de prelucrare a laptelui este funcție de tipul produs lactat ce urmează a fi prelucrat, de capacitatea de prelucrare, de gradul de reutilizare a apei etc. De exemplu , fabricile de brânzeturi, lapte praf și lapte concentrat produc volume mai mari de ape reziduale decât la pasteurizarea laptelui. (tabelul2 și 3).
Compoziția medie a apelor reziduale de la o
Fabrică de prelucrare a laptelui
Tabelul 2
Elaborarea Tehnologiei de Control
Calitatea este definită ca măsura, gradul în care un produs, prin totalitatea caracteristicilor tehnice, economice, sociale și de exploatare, satisfac nevoia pentru care a fost creat. Calitatea produsului reprezintă expresia finală a calității concepții, producției și utilizării, înglobând calitatea producției.
Spre deosebire de alte produse industriale, calitatea produselor alimentare are un cuprins mult mai larg și efecte mult mai profunde cu implicații nu numai economice și sociale ci și în sănătatea colectivităților pentru care se realizează produsele. Industria alimentară produce pentru consumul unor alimente care intervenind direct în metabolism por avea o influență determinantă asupra dezvoltării organismului.
Dacă pentru majoritatea mărfurilor industriale calitatea se caracterizează printr-o însușire dau grup de însușiri, de cele mai multe ori stabile, în timp, de natură fizică sau chimică, bine definite, un produs alimentar trebuie să îndeplinească o triplă condiții obligatorie: să fie solubil, să prezinte valoare nutritivă și să aibă calități senzoriale.
În aceste condiții se impune utilizarea unor metode complexe de control care apelează la analize fizice, chimice, biologice, senzoriale, de alegerea metodelor depinzând în mare măsură, calitatea producției și rezultatele economice ale întreprinderii. Un rol important, în alegerea metodelor, îl au diferențele dintre concentrațiile diferitelor componente, deoarece unele sunt prezente în cantități de zeci de grame iar altele sunt decelate în micrograme. În același timp, trebuie să se țină seama de alegerea metodelor de control și de prețul aparaturii și a analizelor. Aparatura de înaltă performanță costă de multe ori mai mult decât instalația industrială de producție și ca urmare, nu-și găsește justificare economică pentru controlul curent. Din această cauză, în prezent, în toate țările există orientarea de a se elabora pentru producție metode simple, rapide și cât mai ieftine.
4.1. Prezentarea Variantelor Tehnologice de Control
Caracteristic pentru industria alimentară este faptul că folosește o diversitate mare de metode de control a produselor, determinată de varietatea materialelor prime, materialelor auxiliare, produselor finite și a procesului tehnologic. Principalele metode de control folosite în industria alimentară se pot clasifica după cum urmează :
metode senzoriale (gust, aromă, temperatură, etc.)
metode fizice (densitate, temperatură, etc);
metode chimice (toți indicatorii chimici de calitate, etc.);
metode fizico-chimice (refractometrie, colorimetrie, etc);
metode biologice (prezența insectelor și a microorganismelor);
metode biochimice (determinări enzimatice);
Controlul materiei prime – laptele
A.1. Verificarea calității laptelui:
Înainte de utilizare, materia primă este supusă unui examen complet pentru a-i determina însușirile esențiale cu privire la procesul de coagulare. Acest examen este alcătuit din mai multe tehnici de analiză, printre care vom enunța câteva:
A.1.1. Testul de fermentație : permite aprecierea calității laptelui în baza calității coagulului. Procedura constă în alegerea unei probe de lapte și supunerea sa la o termostatare într-o cuvă la o temperatură de 38-40o C la trei timpi diferiți:
• t1 = 12 h;
• t2 = 24 h;
• t3 >=24 h;
Observații:
un lapte de calitate corespunzătoare produce:
• un coagul compact după t1 = 12 h;
• un coagul compact după t2 = 24 h , fără urme de gaz sau balonări;
un lapte impropriu fabricării de brânzeturi dă un coagul balonat, necompact, sub formă de fulgi sau de flacoane, după un timp t = 12 h;
un lapte impropriu consumului direct (pericol, risc de intoxicare) dă un coagul balonat după un timp de fermentare de 12 h.
A.1.2. Testul de coagulare : se bazează pe aprecierea aspectului corpului. Procedura constă în prelevarea unei probe de lapte însămânțat cu o cantitate mică de coagul dintr-o vană de închegare și termostatarea sa timp de 12 h la o temperatură de 38-40o C.
Observații :
un coagul normal se caracterizează prin :
• un aspect compact fără balonări;
• o consistență elastică;
un coagul anormal se caracterizează prin :
• un aspect spongios;
• o consistență moale cu balonări;
• un randament mic, chiar după un timp de peste 36 h;
A.1.3. Testul de coagulare a laptelui în vederea folosiri ca materie primă în fabricarea produselor acidolactice și brânzeturilor implică o procedură care constă în prelevarea unei cantități de 10 ml lapte, pasteurizarea ulterioară a acesteia la o temperatură de 93-95oC, timp de 20-30 minute, urmate de o răcire și de adăugarea unei cantități de 0,02 % coagul prelevat dintr-o vană de închegare și temperatura amestecului la o temperatură de 35o C, timp de 36 h. Observațiile se consemnează în tabelul 1:
Tabelul 1
Clasificarea calității materiei prime
A.2. Controlul organoleptic sau analiza superioară:
Analiza senzorială se face conform STAS-ului 6345-88 „Lapte și produse lactate”
A.2.1. Aparatura și materialele:
Vasele și materialele folosite pentru analiza senzorială trebuie să fie din același material și identic ca formă, culoare și dimensiuni, pentru a nu influența asupra caracteristicelor organoleptice ale probei de analizat și asupra examinatorului.
bon de apă electrică;
frigider;
termometru;
cuțit din oțel inoxidabil;
farfurii albe;
pahare din sticlă incoloră cu pereți netezi , de 100 cm3, 400 cm3 și 800 cm3;
recipienți din material emailat alb sau din argilă albă smălțuită pentru colectarea resturilor lichide și tăvi pentru cele solide;
agenți de eliminare a gustului remanent (apă distilată sau potabilă, mere);
A.2.2. Condiții generale pentru analiza senzorială:
Analiza senzorială se efectuează într-o încăpere curată, lipsită de mirosuri, trepidații și de zgomote. Încăperea trebuie să fie iluminată natural, fără lumină slabă directă ; trebuie să fie prevăzută cu un termometru și un higrometru. Temperatura încăperii trebuie să fie menținută la o valoare de 20 + /-2oC, iar umiditatea relativă a aerului 75+/-5%.
Analiza senzorială se efectuează de către o comisie formată dintr-un conducător și un număr impar de degustători, minim 3 și maxim 9. Membrii comisiei trebuie să fie de specialitate și să cunoască bine caracteristicile produselor ce se examinează, să aibă simțurile exersate , să fie testați în acest scop și să posede certificat de degustător. În timpul efectuării examenului de organoleptic, participanții trebuie să poarte halate albe, curate, iar îmbrăcămintea lor să nu aibă un miros care ar putea influența aprecierea.(tutun, produse chimice, parfum, etc.).
Caracteristicele se vor examina în ordinea următoare :
aspectul produsului la exterior ;
culoare ;
aspectul produsului în secțiune ;
consistența ;
mirosul ;
gustul ;
Aprecierea organoleptică asupra aspectului, culorii, gustului, fluidității și mirosului laptelui ne poate da unele indicații prețioase. Laptele grisos, filant, provenind de la animalele bolnave, culoarea albastră sau roz se datoresc bolilor microbiene, culoarea roșie indică prezența sângelui, prezența de microorganisme de tip Bacillus lactis.
Mirosul acru denotă un stadiu înaintat de alterare, iar un miros particular ne indică fie alimentarea animalului cu hrană alterată, fie că animalele au fost tratate cu medicamente, sau că laptele a fost păstrat alături de substanțe mirositoare.
Gustul acru arată că laptele este alterat, gustul metalic alcalin un proces de alterare microbiană care vizează substanțele proteice ; gustul sărat arată proveniența laptelui de la un animal bolnav de mamită(mastită).
Murdăriile, impuritățile, părul, bălegarul etc. arată o producere și o manipulare făcută în condiții neigienice etc.
Omogenitatea se apreciază prin trecerea laptelui dintr-un cilindru în altul, urmărindu-se modul de curgere. Tot cu această ocazie se apreciază și consistența, laptele trebuie să formeze un filon consistent și cu scurgere greoaie.
A.3. Controlul proprietăților fizice :
A.3.1. Determinarea greutății specifice a laptelui se face cu pinametrul, cu balanța Nohr.Westphall sau mai obișnuit cu termolactodensimetrul.
Un termolactodensimetrul cuprinde următoarele părți esențiale : testul, corpul cilindric, tija pe care sunt notate gradele cuprinse între 20-40 grade și, în fine, corpul termometrului cu scara temperaturilor.
Gradul lactodensimetric arată cu câte grame este mai greu un litru de lapte decât un litru de apă la aceeași temperatură : el este dat de sutimele și miimele cifrei care reprezintă densitatea laptelui.
De exemplu printre densitatea 1,028, gradul lactodensimetric este 28 și invers pentru gradul lactodensimetric 30,5, densitatea este 1,0305.
Înainte de determinare, laptele se omogenizează, apoi se lasă să curgă încet și cu grijă lactodensimetrul (când este spumă se îndepărteză cu hârtie de filtru), având grijă ca densimetrul să nu se lipească de peretele cilindrului. Se citește apoi diviziunea pe care o întretaie meniscul laptelui și temperatura.Această diviziune ne arată gradul laptelui.
Când determinarea nu s-a făcut exact la 15o , cifra se corectează cu 0,2 minus pentru fiecare grad de temperatură peste 15o.
Greutatea specifică a laptelui coagulat, căruia i s-a adăugat amoniac (NH3) pentru a-l aduce în formă lichidă, se calculează după formula :
MD1 – D2
D = , unde :
10
D = greutatea specifică a laptelui ;
D1 = greutatea specifică a amestecului de lapte + amoniac ;
D2 = greutatea specifică a soluției de amoniac.
Pentru a aduce laptele coagulat în formă lichidă, la 100 ml lapte se adaugă 10 ml amoniac concentrat și se agită până la lichefiere completă.
Greutatea specifică a laptelui ne poate arăta falsificarea prin diluare cu apă (când ea scade sub –1,033). Ea depinde de componentele laptelui : proteinele, lactoza și sărurile minerale măresc greutatea sa specifică, iar grăsimea o micșorează. De aceea dacă eliminăm grăsimea din lapte, greutatea sa specifică crește.
Prin diluarea laptelui cu apă, greutatea sa specifică scade cu atât mai mult cu cât cantitatea de apă, adăugată este mai mare.
A.3.2. Determinarea punctului crioscopic.
Sub scăderea punctului crioscopic al laptelui, se înțelege diferența dintre punctul crioscopic al apei distilate ,,lipsite de aer,, și acela al laptelui de laptelui de cercetat. Ea se înseamnă cu ,,D,,.
Laptele normal de vacă are punctul crioscopic la (-55)o (D • 102). Apropierea lui de zero este proporțională cu adăugarea de apă. Pe această bază, Winter a stabilit următoarea formulă :
D – D1
Volumul de apă adăugat laptelui = V · , unde :
D
V = volumul total al amestecului de lapte și apă ;
D = scăderea normală a punctului crioscopic al laptelui (-0,55)o.
D1 = scăderea punctului crioscopic găsit.
Determinarea se face cu aparatul electric pentru determinarea punctului crioscopic al laptelui după J Gaugl și K Jeschki, în serie, sau cu aparatul Beckmann, după prescripțiile date în cărțile de specialitate.
Punctul crioscopic al laptelui normal proaspăt muls este cuprins între (-0,53) și (-56)o, în medie (0,55)o.
A.3.3. Determinarea conductibilității electrice :
Executarea acestei determinări se face după metodele date în tratatele de specialitate.
La lapte se întrebuințează vase de conductibilitate în care electrozii sunt așezați perpendicular.
Deoarece conductibilitatea depinde de temperatura, se lucrează după metoda Kohbansch la o anumită temperatură cu ajutorul unui termostat.
Conductibilitatea crește aproape potențial cu temperatura. Ea variază la laptele amestecat de la mai multe vaci între : 45 x 10-4 și 55 x 10-4, la laptele unei singure vaci între 40 x 10-4 și 60 x 10-4.
Prin diluarea cu apă conductibilitatea electrică a laptelui scade. Substanțele coloidale influențează și ele conductibilitatea laptelui. În acest caz, conductibilitatea se corectează după următoarea formulă :
100 + 2,5 P
, unde :
100
P = numărul de grame de proteine în 100 ml
Această valoare se înmulțește cu valoarea găsită pentru conductibilitate
A.3.4. Determinarea vâscozității și tensiunii superficiale
Pentru determinării vâscozității laptelui se poate folosi vâscozimetrul lui Osmold , Hess sau stalagmometrul lui Tranbe. Din cauza influenței temperaturii asupra vâscozității măsurarea trebuie să se facă în baie de apă ( pentru vâscozimetrul lui Osmold și Hess). Înaite de întrebuințare, vâscozimetrul trebuie curățit cu bicromat de potasiuși acid sulfuric, apoi se verificăla o anumită temperatură de pildă la 20 0C cu ajutorul apei.
Vâscozitatea relativă a laptelui variază între 1,6 și 2,1 . Pentru determinarea ei, se face raportul dintre timpurile de scurgere a unui volum de lapte și a aceluiași volum de apă prin tuburi de același diametru și la aceeași temperatură.
Pentru această determinare, cel mai obișnuit vâscozimetru este cel al lui Tranbe (figura 1.) unde coloana orizontală este mult subțiată, pentru că laptele să poată curge prin B numai sub formă de picături. Se aspiră laptele adus al temperatura de 20o prin A până la semnul 1 de deasupra bilei. Apoi se lasă să curgă picătură cu picătură prin B, până când nivelul lui ajunge la 2 și se notează timpul în secunde. Această operație se repetă încă de 2 ori și se ia media timpului de scurgere. Se spală aparatul de apă alcalinizată cu carbonat de sodiu, se degresează cu alcool și apoi se usucă cu alcool-eter în părți egale și se repetă operația cu apă distilată de 20o, notându-se timpul în secunde. Operația se repetă de asemenea de cel puțin 3 ori.
A
1
2
B
Figura 1 : stalagmometrie
Vâscozitatea relativă a laptelui = t’/t , în care:
t’ = timpul în care se scurge laptele;
t = timpul în care se scurge apa;
Vâscozitatea relativă a unui lapte normal este de circa 1,75. O viscozitate scăzută, arată, fie adăugarea de apă, fie smântânire.
Pentru determinarea tensiunii superficiale, se poate întrebuința stalagmometrul ( de exemplu Tranbe);
Stalagmometrele sunt construite pe următorul principiu : mărimea particulelor, care se separă și curg din tubul capilar depinde de forța tensiunii superficiale a sistemului cercetat. Cu cât tensiunea este mai mare cu atât picăturile de lichid vor fi mai mari și mai grele.
Cu ajutorul acestor aparate se determină numărul picăturilor lichidului de cercetat (laptele) dintr-un anumit volum și numărul picăturilor aceluiași volum de apă.
Raportul dintre numărul picăturilor de apă și al celor de lapte, înmulțit cu greutatea specifică a laptelui și cu valoarea tensiunii superficiale a apei, dă valoarea tensiunii superficiale a laptelui, și se exprimă în depn/cm2.
Coagularea tensiunii superficiale a laptelui se face cu ajutorul formulei :
ad 72,7
Tensiunea superficială = în depn/cm la 20o, în
b
care:
a = numărul picăturilor de apă ce curg din stalagmometru;
d = greutatea specifică a laptelui;
b = numărul picăturilor de lapte;
72,7 = valoarea tensiunii superficiale a apei în depn/cm la 20o.
Tensiunea superficială a laptelui este mai mică decât a apei. La 20o, pentru apă este 72 depn/cm, iar pentru lapte este 49 depn/cm.
Se mai definește și o tensiune superficială relativă a laptelui care este raportul dintre numărul de picături rezultate din scurgerea volumului de apă cuprins între semnele 1 și 2 ale stalagmometrului (Tranbe) și numărul de picături d lapte ale aceluiași volum.
Numărul de picături de apă
Tensiunea superficială relativă =
Numărul de picături de lapte
Tensiunea superficială relativă a unui lapte fiert este în jurul lui 0,7. Dacă la lapte s-a adăugat apă sau s-a sustras grăsime, tensiunea superficială relativă este mărită tinzând spre 1
Substanțele tensio-active ale laptelui se concentrează în special în jurul bulelor de grăsime în laptele normal.
Tensiunea superficială a laptelui are o mare importanță pentru elaborarea teoriei și practicii de fabricare a untului, în special și a produselor lactate, în general.
A.3.5. Determinarea gradului de impurificare (STAS 6346-75)
A.3.5.1.Principiul metodei : se filtrează proba de lapte printr-un filtru stabilit ( lactofiltru) și se apreciază gradul de impurificare prin compararea filtrului cu etaloane.
A.3.5.2. Aparatură și materiale: – lactofiltru, compus dintr-o butelie de sticlă sau de metal, fără fund, la gura căreia este fixată o sită metalică ; diametrul suprafeței filtrante trebuie să fie de 28+/-2 mm.
rondele pentru filtrare tip dr. Gerber sau, în lipsa acestora, rondele de vată, tricot, sau pistă, avizate de Institutul de Cercetări pentru industrie și chimie alimentară.
A.3.5.3. Modul de lucru:
Se așează rondeaua pentru filtrare curată și uscată, pe sita metalică bine fixată în prealabil și se toarnă în butelia lactofiltrului 250 cm3 lapte.
După filtrarea laptelui se desface sita metalică, se scoate rondeaua se usucă la aer și se compară imediat, vizual cu etaloanele din tabelul 2:
Tabelul 2
A.3.5.4. Exprimarea rezultatelor
Rezultatele determinării se exprimă prin gradul de impurificare corespunzător etalonului din tabel al cărui aspect este asemănător cu acela al rondelei prin care s-a făcut filtrarea probei.
A.4. Controlul chimic
Controlul chimic constă în determinarea compoziției chimice a :
proteinelor prin metoda clasică numită și metoda Kjebdahl
grăsimilor prin metoda acid-buterometrică
umidității
a cenușei
vitaminelor etc
Metodele de determinare a compoziției chimice sunt prezentate în standardele române și internaționale.
Determinarea fluorescenței laptelui
Laptele de vacă proaspăt prezintă la lampa de cuarț o fluorescența galbenă-canar caracteristică . Această fluorescență se datorează lactoflavinei ( vitamina B2 ) care sub acțiunea luminii, trece în lumiflavină sau lumicrom în mediu neutru.
Prin șederea laptelui fluorescența galbenă se concentrează în smântână încât încetul cu încetul toată luminiscența se adună în stratul superficial de smântână. Nuanța devine cu atât mai clară cu cât laptele este mai bogat în grăsime. Restul lichidului pierde treptat fluorescența sa galbenă devenind albicios sau albăstrui. Această transformare se petrece în circa 20-24 de ore. Prin agitare laptele devine din nou fluorescent în toată masa lui. Prin iluminare mai îndelungată, ,fluorescența galbenă se distruge datorită proceselor de oxidare care au loc.
Încălzirea laptelui până la fierbere nu are nici o influență asupra fluorescenței. Prin acidulare și alcalinizare, fluorescența se micșorează ca prin neutralizare să revină. Laptele care nu este proaspăt are o fluorescență albastră, alb-albăstrui sau violet. Laptele care conține puroi, observat în straturi subțiri, prezintă la lampa de cuarț inele albăstrui caracteristice. Laptele cu streptococi dă o fluorescență verde. Laptele diluat cu apă sterilizată arată o nuanță galbenă deschis.
Pentru cercetarea fluorescenței, laptele se introduce într-o capsulă de cuarț.
A.5. Controlul microbiologic (STAS 6349-71)
Conform STAS 6349.71 se face analiza microbiologică a laptelui și produselor lactate. În prezentul standard sunt descrise următoarele determinări:
• determinarea numărului total de germeni;
• determinarea numărului de bacterii coliforme;
• determinarea numărului de bacterii caseolitice;
• determinarea numărului de drojdii și de mucegaiuri;
• determinarea încărcării laptelui în bacterii anaerobe sperulate;
• identificarea laptelui mastitic;
• testul de reducere pentru lapte;
În caz de necesitate, alte determinări se pot face după metodele prevăzute în dispozițiile legale sanitare și sanitar-veterinare sau, în lipsa acestora, după metodele stabilite prin convenție între părțile interesate.
A.5.2Pregătirea probelor în vederea analizei microbiologic:
Operația de deschidere a recipientelor cu probe sau a ambalajelor care constitue probele, recoltarea probei pentru analiză și însămânțarea mediilor de cultură trebuie executate în boxe special amenajate prevăzute cu lămpi ecotericide cu radiații ultraviolete pentru sterilizarea laptelui.
Imediat înainte de deschiderea recipienților și a efectuării însămânțărilor se vor spăla și dezinfecta mesele pe care se lucrează. În încăperea în care se face analiza microbiologică nu se admite în timpul lucrului prezența persoanelor străine.
A.5.3. Determinarea numărului total de germeni:
Prin determinarea numărului total de germeni se stabilește gradul de contaminare a produsului.
A.5.3.1.Materiale și medii nutritive:
cutii Petri stabilite, cu diametrul de 10 cm ;
pipete gradate, sterile de 1 cm3 și 10 cm 3, cu valoarea diviziunii de 0,1 cm3 și respectiv 1 cm3.
mediu solid : triptonă – extract de drojdie – glucoză – agar sau mediu agar – buliere de carne – peptonă – lactoză distribuit în eprubete de 10-12 cm3
apă de robinet sterilă;
A.5.3.2.Obținerea diluțiilor:
Din proba de lapte sau alte produse lactate lichide, agitată bine de circa 25 ori se ia o pieptă 1 cm3 și se introduce într-o eprubetă sterilă în care în prealabil s-au introdus 9 cm3 apă de robinet sterilă (diluție 1/10). Din această probă se ia altă pipeta 1 cm3 și se introduce în altă eprubetă care conține 9 cm3 apă (diluție 1/100). În mod analog se obțin diluțiile 1/1000,1/10 000,1/100 000 și 1/1 000 0000.
În cazul produselor solide se pornește de la diluția 1/10 sau 1/100 pentru că produsul este în prealabil diluat prin operația de solubilizare.
A.5.3.3. Însămânțarea:
Se fac însămânțări în câte 2 cutii Petri pentru fiecare diluție, introducându-se câte 1 cm3 diluție, după care se introduc în fiecare cutie Petri câte 10……12 cm3 mediu topit și răcit la 45….48oC. Se organizează conținutul imprimând cutiilor 5 mișcări liniare și 5 mișcări de rotație, urmate de alte 5 mișcări de rotație în sensul opus primelor. Pe capacul cutiilor Petri se marchează înainte de însămânțare diluția și data.
A.5.3.4. Incubarea se face la o temperatură de 30oC +/-1oC, timp de 7 ore +/- 3 ore. Dacă nu este posibil incubarea se face la 37oC +/-0,5oC, timp de 48 ore +/-3 ore.
A.5.3.5. Numărul coloniilor:
Se vor număra coloniilor crescute pe mediile din cutiile Petri. Se iau în considerare numai cutiile unde numărul coloniilor se află între 30 și 300. La fiecare diluție se va face media aritmetică a numărului coloniilor crescute, după care ținându-se seama de diluție se calculează numărul coloniilor, raportat de 1cm3 sau 1 g produs.
A.5.4. determinarea încadrării laptelui în bacterii sperulate(Poba WEINZIRL):
Metoda este recomandată pentru laptele crud destinat fabricării brânzeturilor.
A.5.4.1. Materiale și ustensile :
baie de apă termoreglabilă;
pipete gradate, sterilizate;
termometru;
eprubete sterile de 16 x 160 mm conținând câte 2 cm3 parafină și sterilizate la 120oC timp de 30 de minute.
A.5.4.2. Modul de lucru:
În 5 eprubete cu parafină, notate în prealabil, se introduc cu o pipetă sterilă câte 5 cm3 lapte de cercetat, fără a atinge pereții eprubetelor.
Toate eprubetele se cufundă o altă eprubetă cu lapte în care se introduce termometrul. După atingerea temperaturii durata de menținere este de 10 minute. În timpul încălzirii stratul de parafină se topește și se ridică deasupra. Apoi eprubetele se răcesc brusc în apă rece.
A.5.4.3. Incubarea:
Tuburile se incubează la 37oC+/-0,5oC timp de 48 de ore +/-3 ore observându-se producerea de gaz, care poate să disloce stratul de parafină în una, două sau mai multe eprubete.
A.5.4.4. Interpretarea rezultatelor:
Se consideră că proba Weinzirl este pozitivă când, gazul dezvoltat împinge în sus stratul de parafină solidă.
Aprecierea calității laptele se face prin calificativele:
laptele bun : nici o eprubetă cu gaz;
laptele satisfăcător : o eprubetă cu gaz;
laptele prost : 2 sau mai multe de 2 eprubete cu gaz;
B. Controlul materialelor auxiliare – preparatele enzimatice:
B.1.Condițiile de inocuitate pe care trebuie să le îndeplinească preparatele enzimatice sunt :
numărul total de germeni (NTG), maximum 5 · 104 /g;
coliforme , maximum 30/g;
Escheridia coli – absentă /25g;
Salmonella – absentă/25 g;
Activitate antibiotică de origine microbiană – absentă ;
Alfatoxină B1 , ochratoxină A, sterimgmatocistină, toxina T-2 în cazul preparatelor de origine microbiane – absente ;
Metale grele : – arsenui < 3 mg/kg;
– plumb < 10 mg/kg;
– alte metale grele < 40 mg/kg (exprimată la Pb)
În operația de maturare a laptelui are loc un adaos de culturi intermediare (maiana).
Cultura primară se obține prin inocularea laptelui pasteurizat și răcit cu cultură pură (inocul) primită de la laboratorul de specialitate,. Felul culturii, proporția de inoculare, temperatura și durata de termostare diferă în funcție de felul produsului pentru fabricarea căruia se folosește cultura respectivă. Imediat după însămânțarea laptelui și termostarea lui care are loc la 25 – 27oC, timp de 14-16 h, cultura se răcește și se depozitează la 1..2oC până a doua zi.
Cultura secundară se obține din cultura primară. Cultura secundară reprezintă a doua transplantare (pasaj) și se constitue ca un stadiu mai avansat de reactivare a culturii pure (inocul). Durata de însămânțare a laptelui 1,2% și cea de termostare este de 12-14 h și se realizează la o temperatură de 25-26oC. Și această cultură se păstrează la 1…2oC, timp de 1-2 ore.
Cultura terțiară se prepară din cultura secundară, după aceeași tehnică ca și în cazul culturii primare. Însămânțarea laptelui 1,2 % și termostarea sa are loc la o temperatură de 25-26oC, timp de 12-14h.
Cultura starter sau de producție se inoculează zilnic și tot zilnic se controlează chimic, senzorial și microbiologic. La folosirea culturii starter se au în vedere următoarele:
cultura să fie pură (să nu conțină decât microorganisme specifice);
cultura să fie activă (să producă fermentația specifică în timp normal și să asigure o anumită aciditate);
cultura să-și mențină în timp însușirile esențiale;
cultura să fie menținută 5-6 ore, înainte de folosire, la 1..2o C, pentru a se favoriza acumularea substanțelor aromatizante.
cultura să nu fie mai veche de 48 de ore;
În legătură cu obținerea culturilor de producție se fac precizările :
în unele cazuri impuse de producție sau de calitatea necorespunzătoare a culturii, trebuie să se mărească necesarul de pasaje (culturi ) intermediare, în același condiții ca la cultura secundară, în vederea corectării unor defecte;
dacă cultura primară prezintă caracteristici foarte bune, ea poate fi folosită direct la prepararea culturii de producție.
B.2. Controlul calității culturilor intermediare și al culturilor starter de producție.
Calitatea acestor culturi se stabilește având în vedere următoarele criterii de control:
– criteriul caracteristicilor senzoriale, care se face după coagulare și păstrare la rece, având în vedere următoarele :
• coagulul să fie compact, cu slabă eliminare de zer, ne admițându-se coagulul neomogen, cu separare mare de zer, prezența de flacoane de cazeină, crăpături, numeroase bule de gaz, ș.a;
• consistența să fie cremoasă;
• gustul și mirosul să fie evidențiate și să caracterizeze cultura respectivă;
criteriul microbiologic, care implică stabilirea proporției dintre microorganismele componente, prezența drojdiilor, mucegaiurilor sau a bacteriilor de contaminare;
criteriul chimic, care implică efectuarea următoarelor determinări : aciditate volatilă, substanțe de aromă (diacetil, acetoină).
B.3. Defectele culturilor starter de producție:
Aceste defecte pot fi clasificate:
folosirea unui lapte de calitate proastă;
folosirea de culturi pure (inocul) necorespunzătoar;
condiții de preparare neadecvate;
Defectele se referă la :
aciditatea redusă cauzată de termostarea la o temperatură mai joasă decât cea indicată sau inocularea cu o cantitate mai mică de cultură pură (inocul), inclusiv cultura intermediară.
coagularea întârziată însoțită de acidifiere lentă, care se datorează prezenței în lapte a unor inhibatori (antibiotice) sau a bacterofagelor ; coagul spongios cu separare mare de zer, care se datorează acidității prea mari ca rezultat al unei termostări la temperatură ridicată și pe o durată mare;
filanță care apare la culturile starter de producție pentru iaurt sau unt și care se datorează degenerării culturii folosite la obținerea sau prezenței în aceasta a lui Lb. acidophilus, respectiv a unor streptococi care produc polizaharide în apă.
prezentarea de gaze în cantitate mare (CO2 + H2), care se datorează contaminării culturii starter de producție cu microorganisme capabile să fermenteze lactoza, cum sunt bacteriile coliforme, sau cu drojdii, caz în care apare gust și miros de drojdie sau de fructe. Cantitățile de CO2 normale sunt rezultatul acțiunii bacteriilor aromatizate care degradează acidul citric;
exprimarea slabă a gustului și mirosului, care este consecința dezvoltării necorespunzătoare a bacteriilor aromatizate sau a reducerii diacetilului și acetonei în 2,3 butilenglicol (substanță fără gust și miros), în condițiile în care cultura starter de producție a fost păstrată pentru a o perioadă mai mare la temperaturo scăzute;
defectele de gust amar, care poate apărea în condițiile dezvoltării în cultură a unor bacterii puternic proteolitice ( Sfr. Liqusfacieus sau bacterii sporogene), gustul lesietic, care se datorează prezenței în cultura starter de producție a lui Str. lactis subp malignus).
C. Controlul analitic pe fluxul tehnologic
C.1. Determinarea substanțelor azotate proteine și neproteice : în lapte se găsesc dintre substanțele cu azot cele trei proteine : cazeina, lactaleremina, și globulina.
C.1.1. Azotul total din combinațiile organice, prin încălzire cu acid sulfuric concentrat, în prezența CuSO4 (catalizator) și a K2SO4 (fondant), este trecut în sulfat de amoniu (etapa de mineralizare).
NH3 + H2SO4 conc. 2NH3 + Na2SO4 + 2H2O conc. (excesiv)
Prin distilarea în mediu puternic alcalin (exces de alcalii concentrate : KOH, NaOH), amoniacul este pus în libertate din sulfatul de amoniu :
(NH4)2SO4 + 2NaOH conc. 2NH3+ Na2SO4 + 2H2O
după ce în prealabil a fost neutralizat excesul de acid sulfuric concentrat:
H2SO4 + 2NaOH = Na2SO4 + 2H2O
Amoniacul pus în libertate în urma distilării este captat într-un volum exact măsurat de soluție acidă (H2SO4, HCl , 0,1 N), care este în exces față de cantitatea de NH3 din probă.
Excesul de acid care nu a reacționat cu amoniacul va retirat cu un volum bine determinat de soluție titrată alcalină (NaOH , 0,1 N sau KOH0,1N), în prezența unui indicator adecvat.
Reacțiile care au loc în acest caz sunt :
2NH3 + H2SO4 exc. (NH4)2SO4 + H2SO4 exc.
H2SO4exc. + 2NaOH Na2SO4 + 2H2O
C.1.1.2. Aparatură și reactivi:
acid sulfuric concentrat (q = 1,84 g/cm3);
amestec oxidant format din 100 g K2SO4 + 10g CuSO4;
acid sulfuric ON;
NaOH 0,1N;
NaOH 33%;
roșu de metil (interval de viraj pH = 4,4 – 6,2) soluție alcoolică 0,2% sau soluție de indicator Thașiro (pT =5,4) preparată după rețeta : 0,2 g roșu de metil și 0,1 g albastru de metilen, fin majorate se dizolvă în 1 000 ml alcool etilic 95%. Soluția se păstrează în sticle bune la întuneric și la rece.
Culoarea indicatorului : – în mediu acid – roșu violet;
– în mediu bazic – verde;
– la punctul de echivalență cenușie cu valență albăstruie;
– aparat de distilare Parnas – Wagner (figura 1) sau o instalație obișnuită pentru distilarea amoniacului (figura 2)
Figura I: Aparat de distil Figura II : Aparat pentru distilarea
Parnas – Wagner amoniacului
C.1.1.3. Modul de lucru : se cântărește cu precizie (la balanța analitică) pe o bucată de celeofan (5 x 5 cm) o probă de 0,3 – 0,5 g fin mărunțită (pentru produse deshidratate, pentru carne și produse din carne, pentru pește ouă și brânzeturi). Se strâng cu grijă colțurile bucăți de ceolofan și se introduce proba într-un balon de 100 ml.
Se adaugă 5 ml H2SO4 conc. (q = 1,84 g/cm3) o spatuliță de amestec oxidant. În gura balonului se așează o pâlnie mică (d=5 cm). Se mineralizează proba (la început cu flacără mică, pentru evitarea spumării, apoi cu flacără mai puternică) până ce soluția devine limpede .
Se mai încălzește 15-30 minute. Mineralizatul rece este de culoare verde – albăstrui. În mod normal mineralizarea durează maxim 1 oră.
Conținutul balonului Kyldahl se răcește și se trece cantitativ într-un flacon cotat de 100 ml cu cantități mici de apă distilată pentru diluarea probei. (Atenție! Reacția este exotermă). Se răcește conținutul flaconului cotat până la temperatura camerei și se va aduce la semn cu apă distilată.
Din flaconul cotat se măsoară cu pepita un volum de 10-20 ml soluție diluată de (NH4)2SO4 și se introduce în flaconul de distilare. Se adaugă soluție de NaOH 33% până la reacție alcalină (verificate în prealabil pe o probă separată în prezența unui indicator). În condițiile de lucru menționate, 10 ml NaOH 33% sunt suficienți. Se adaugă repede 200-300 ml de apă distilată în balonul de distilare.
Observație : pentru a evita pierderea de NH3 în momentul adăugării NaOH 33%, se introduce în prealabil vârful refrigerentului în vasul Erlenmanger, care conține 15-20 ml soluție de H2SO4 0,1 N, 1-2 picături de indicator și 50-75 ml apă distilată.
Se încălzește balonul de distilare și se distilă 10-15 minute din momentul începerii fierberii.
La sfârșitul distilării se scoate capătul refrigerentului din soluție (se coboară vasul de prindere) și se continuă distilarea încă 5 minute ( pentru spălarea interioară a refrigerentului), iar tija exterioară a refrigeratorului se spală cu apă distilată folosind o pipetă.
Observație: 1o – sfârșitul distilării se verifică cu hârtie roșie de turnesol, care nu trebuie să se încălzească în contact cu o picătură de distilat. Dacă se produce modificarea culorii hârtiei indicatoare, rezultă că distilarea este incompletă și se va repeta, mărindu-se durata distilării.
2o – dacă se folosește pentru distilarea aparatul Parnas – Wagner, procedeul de lucru comportă o serie de particularități, care vor fi precizate în timpul lucrului.
Conținutul vasului Erlenmanyer se titrează cu NaOH 0,1 N în prezența roșului de metil până la virajul la portocaliu.
C.1.1.4. Calculul rezultatelor :
Pentru determinarea azotului total se folosește relația de calcul :
v1 N1 v2 N2 100 100
%N = ( – ) EN2
1 000 1 000 m a
în care:
v1 = volumul de soluție titrată de H2SO4 introdusă în vasul Erlenmayer pentru prinderea NH3, nul;
N2 = normalitatea H2SO4 (ex. 0,1N)
v2 = volumul soluției titrate de NaOH folosită la titrarea excesului de acid, ml;
N2 = normalitatea soluției de NaOH (ex. 0,1 N);
EN2 = echivalentul gram al azotului (EN2 = 14);
M = volumul de mineralizat măsurat pentru o distilare, ml;
100 = volumul flaconului cotat în care a fost trecut mineralizatul, ml;
a = cantitatea de probă supusă mineralizării, g;
100 = coeficient pentru raportarea la 100%;
Conținutul de proteine se determină amplificând conținutul procentual de azot total cu un coeficient, care depinde de natura produsului. Astfel pentru că lapte și brânzeturi valoarea coeficientului este de 6,38, ținând cont de faptul că 100 g proteină din lapte conține 15,67 g azot .
Deci 100 g proteină ……………………………15,67 g azot
X g proteină ……………………………..1 g azot
100
X = = 6,38
15,67
C.1.2. Proteine totale :
C.1.2.1. Principiu.
Proteinele se precipită cu o soluție de sulfat de cupru. Precipitatul format din proteine se mineralizează din kyldal și amoniacul rezultat se distilă în modul arătat mai sus (la total).
C1.2.2. Reactivi necesari :
soluție Fehling I : 34,63 g sulfat de cupru în 500 ml de apă.
Soluție NaOH sau KOH n/1;
C.1.2.3. Modul de lucru:
25 g se diluează cu 400 ml apă și se tratează cu 10 ml Febling I. Se adaugă apoi 4 ml normali, se cugetă bine și se lasă să se depună. După depunere, lichidul de deasupra se varsă peste un filtru și precipitatul se spală prin decantare de mai multe ori. Precipitatul se aduce pe filtru, se spală bine și se mineralizare după Kyldal.
Azotul găsit se înmulțește cu 6,37, pentru a obține proteinele totale din lapte (deoarece are un conținut de 15,65% azot și lactalbumină 15,77%).
C.1.3. Cazeina : precipitarea cazeinei din probe se face în mediu acid, după care este determinat conținutul de azot al probei și transformat în echivalenți de cazeină.
C.1.3.1. Reactivi :
acid acetic, soluție diluată 1+9 (vol.)
reactivi specifici determinării conținutului de azot total;
probe de lapte;
C.1.3.2. Modul de lucru :
Într-un pahar Berzelius se introduce 10 g probă de lapte, 90 ml apă distilată la 40-42o C și imediat 1,5 ml acid acetic diluat. Se agită și se lasă în repaus timp de 3-5 minute. Se decantează lichidul pe un filtru spălat în prealabil cu acidul diluat, iar precipitatul se mai spală de 2-3 ori cu apă rece care se decontează, la sfârșit trecându-se porțiuni ( filtratul trebuie să fie limpede sau aproape limpede). Dacă prima porțiune filtrată nu este limpede, se repetă filtrarea. Filtratul obținut se păstrează pentru determinarea albuminului. În precipitat se determină conținutul de azot total și se înmulțește de 6,38 pentru a obține în picături acid acetic soluție sub agitare, până când lichidul de deasupra precipitatului rămâne aproape limpede.
C.1.4. Albumina:
C.1.4.1. Principiu :
Albumina din filtratul acid obținut la precipitarea cazeinei este precipitată în mediu neutru determinând conținutul de azot total al probei și înmulțind rezultatul cu factorul de conversie corespunzător.
C.1.4.2. Reactivi necesari :
hidroxid de sodiu, soluție 10%;
acid acetic, soluție diluată 1+9 (vol.);
reactivi specifici determinării azotului total;
filtrat acid de la precipitarea cazeinei;
C.1.4.3. Modul de lucru
Filtratul obținut la C.1.3. „ Cazeină” est neutralizat cu NaOH soluție, se adaugă 0,3 ml acid acetic soluție diluată și se încălzește pe baia de abur până la precipitarea completă a albuminei. Precipitatul este filtrat (filtrul este spălat în prealabil cu soluție acidă), spălat cu apă rece și se determină conținutul de azot total al probei. Rezultatul obținut este înmulțit cu 6,38 pentru a obține echivalentul în albumină.
C.2. Determinarea conținutului de grăsime prin metoda butirometrică
C.2.1 Principii
Fracțiunea de albumină a laptelui este separată de grăsime într-un butirometru prin adaos de acid sulfuric concentrat la cald. Separarea fazelor este ușurată prin adăugare de alcool amilic, iar conținutul de grăsime este determinat prin citire, direct pe scala gradată cu unități specifice. Metoda este rapidă, suficient de precisă și reproductibilă.
C.2.2. Reactivi
acid sulfuric concentrat ;
alcool amilic (d20 = 0,811 g/cm3)
C.2.3.Modul de lucru:
a) Pregătirea probelor : probele de lapte se aduc la temperatura de 20oC, fără grasă omogenă. De aceea laptele trebuie încălzit încât și sub o agitare foarte lentă la 35-40oC, după care este lăsat să se răcească al 20oC.
b) Determinarea conținutului de grăsime în lapte : într-un butirometru se pipetează 10 ml acid sulfuric ; 10,47 ml lapte (cu pipetă specială!) și 1 ml alcool amilic, astfel încât să nu ocupe gâtul betirometrului și lichidul nu se amestecă. Butirometrul se închide și se agită energie, se răstoarnă, până la completa dizolvare a albuminelor, după care – încă fierbinte- se centrifughează timp de 5 minute la 1 100 rot/min.
Cu ajutorul dopului se normalizează nivelul coloanei de grăsime, după care butirometrul se mai introduce pentru 5 minute în baia de apă la 65 +/- 2oC. Citirea nivelului coloanei de grăsime pe scală se face atunci când linia de separație acid sulfuric , grăsime este continuă și linie delimitată, scala butirometrului fiind gradată direct în procente de grăsime.
C.3. Determinarea lactozei prin metoda polarimetrică
C.3.1 Principiul metodei de bază : se bazează pe proprietatea lactozei de a reduce ionii de mercur bivalenți la ioni de mercur monovalenți, care la rândul lor reduc acidul fosfomolframic și determinarea rotației specifică a lactozei în exces la polarimetru.
C.3.2. Reactivi
soluție mercur – acid azotic : se dizolvă 20 g mercur într-un volum de acid azotic concentrat ce reprezintă de două ori greutatea mercurului și se diluează apoi cu cinci volume de apă distilată;
soluție iodură mercurică : se dizolvă 33,2g iodură de potasiu și 13,5g clorură mercurică în 200 ml acid acetic glacial și 640 ml apă distilată.
acid fosfomolframic, soluție 5%;
mercur;
acid azotic concentrat;
iodură de potasiu;
clorură mercurică : acid glacial; probe de lapte;
C.3.3. Modul de lucru:
În două baloane cotate de 100 ml, respectiv de 200 ml se cântăresc câte 65,8 ml lapte după care în fiecare flacon se pipetează 20 ml soluție mercur – acid azotic sau 30 ml iodură mercurică soluție, iar în cel de 200 ml se pipetează 15 ml acid fosfomolframic soluție și se aduce la un semn cu apă distilată. Cele două flacoane se agită timp de 15 minute se filtrează și soluțiile obținute se citesc la polarimetru. Este de preferat ca soluția din balonul de 200 mm să fie citită în tubul de 200 mm, pentru a se reduce erorile.
Procentul de lactoză din probe se determină astfel : se scade valoarea citită pentru soluția din balonul de 200 ml din cea obținută pentru soluția din balonul de 100 ml. Rezultatul obținut se înmulțește cu 2, se scade din valoarea citită pentru soluția din balonul de 100 ml iar rezultatul obținut se împarte la 2.
C.4. Determinarea acidității laptelui
C.4.1. Principiul metodei
Creșterea acidității laptelui este urmarea fermentației lactozei sub influența florei microbiene acidolactice. Din acest motiv valoarea acestui parametru chimic este un indiciu al prospețimei laptelui.
Aciditatea laptelui se poate determina prin metoda titrimetică, care constă în saturarea funcțiilor acide cu soluție alcalină (NaOH) în prezența unui indicator (fenolftaleina).
În cazul laptelui, aciditatea se exprimă în :
grade Fhorner, care reprezintă volumul de NaOH 0,1N (ml) necesare pentru neutralizarea acidității din 100 ml lapte;
grade Soxhlet Henkel, care reprezintă volumul de NaOH 0,25 N(N/4) în ml, necesar pentru neutralizarea acidității din 100 ml lapte;
Cel mai frecvent aciditatea se exprimă în grade Thorner(„T” ) și de aceea mai jos vom prezenta această metoda de determinare.
C.4.2. Reactivi necesari.
soluție de NaOH 0,1 N;
soluție fenolftaleină 1 %;
apă distilată fiartă și răcită;
C.4.3. Modelul de lucru
Într-un pahar Erlenmeyer de 100 de ml se pipetează 10 ml lapte. Se adaugă 20 ml apă fiartă și răcită (trecând-o prin pipeta folosită la măsurarea laptelui) și 3 picături de fenolftaleină, soluție 1%.
Se titrează cu soluție NaOH 0,1N sub agitare continuă, până la apariția unei colorații roz-pal ce persistă 1 minut.
C.4.4. Calculul rezultatului
Aciditate (ºT) ,
în care : v = volumul de soluție de NaOH 0,1N folosit la titrarea celor 10 ml lapte, ml.
C.5. Determinarea pH-ului se poate face pe cale electrometrică sau calorimetrică.
Pentru aprecierea pH-ului pe cale calorimetrică, se utilizează următorii indicatori, care au virajul în limitele de variație a acidității laptelui (tabel 3).
Tabelul 3
La 5 ml lapte adus într-o eprubetă de 130 x 3, se adugă din primul indicator 6 picături, din al doilea indicator 4 picături și din al treilea indicator 3 picături și se agită.
Culoarea soluției se compară cu o scală de culori. În locul soluțiilor de indicatori se poate întrebuința hârtia indicatoare Lyphan L626.
C.6. Separarea și purificarea proteinelor
Separarea și purificarea proteinelor este indispensabilă studierii structurii și proprietăților lor, întâmpină de cele mai multe ori dificultăți considerabile, mai ales faptului că majoritatea proteinelor reprezintă combinații macromoleculare, de cele mai multe ori cu o structură foarte labilă, care în cursul izolării și purificării poate fi modificată mai mult sau ma puțin profund. Aceste modificări pot altera structura proteinei și pot conduce și la pierderea proprietăților biologice ori la modificarea unor parametri fizico-chimici.
Pe de altă parte, solubilitatea proteinelor ridică probleme în alegerea procedeului de purificare, în sensul că proteinele insolubile spre exemplu, deși pot fi ușor separate de componentele lipidice, glucidice sau de proteinele solubile, de regulă sunt separate foarte greu unele de altele. Acest lucru se datorește faptului că metodele de purificare se bazează pe procese ce se petrec în soluție. La rândul lor, proteinele solubile reprezintă de cele mai multe ori amestecuri complexe de proteine a căror separare este laborioasă și, în unele cazuri, imposibilă prin procedee obișnuite.
Extracția proteinelor solubile din materialele biologice se realizează cu soluții saline sau, mai rar, cu soluții diluate de glicerină sau de acetonă. Din soluțiile astfel obținute, proteinele pot fi separate de celelalte componente prin dializă, utilizndu-se membrane semipermeabile de colodiu. Dacă pentru accelerarea îndepărtării ionilor străini se face apel și la un proces de electroliză, operațiunea poartă numele de electrodializă. La sfârșitul operațiunii de dializă proteinele insolubile în apă distilată precipită. Soluția proteinelor separate prin dializă este prelucrată în continuare în vederea purificării proteinelor, cel mai adesea pe următoarele căi:
fracționare cu ajutorul sărurilor;
fracționare cu ajutorul etanolului sau acetonei;
electroforeză;
cromatografie cu ajutorul schimbărilor de ioni;
adsorbție pe geluri;
filtrare pe geluri;
metode speciale (gaz cromatografic, cromatografie de afinitate, metoda focalizării izoelectrice etc.)
C.6.1. Fracționare cu ajutorul sărurilor
Metoda constă într-o precipitare a proteinelor, adăugând treptat la extractul proteic total sau în soluțiile obținute după dializă, cantități din ce în ce mai mari de săruri neutre (de obicei sulfat de amoniu, sulfat de sodiu, fosfat de amoniu), fie sub formă de cristale sau sub formă de soluții saturate. Sarea se adaugă în porțiuni mici și după fiecare adaos precipitatul obținut se separă prin centrifugare. În concentrații mari sărurile neutre scad solubilitatea proteinelor determinând precipitarea lor. Între solubilitatea și tăria ionică a unei sări neutre există relația :
lgS = β – ks · μ , unde :
β = constanta de intersectare a dreptei care exprimă grafic relația matematică cu axa ordonată pe care se înscrie lg S;
ks = constanta de precipitare caracteristică pentru o problemă cu o stare neutră dată;
μ = tăria ionică a soluției dată de raportul .
μ = ½ ECi·Zi2, unde:
Ci = concentrația în moli/1 000 g de apă;
Zi = soluția în funcție de pH-ul soluției
Precipitarea fracțională a proteinelor cu ajutorul sărurilor neutre se bazează pe faptul că la concentrații mari ionii sării prin numărul și afinitatea lor pentru apă îndepărtează o mare parte a moleculelor de apă. Precipitarea proteinelor este un fenomen reversibil : introducerea în sistem a unei cantități suficiente de apă provoacă dizolvarea precipitatului ceea ce denotă că structura terțiară a proteinelor nu a fost modificată. Procedeul este folosit și la scară industrială pentru prepararea unor proteine biologic active.
C.6.2. Electroforeza: proteinele conțin în molecula lor sarcini electropozitive și electronegative datorită prezenței grupărilor ionizabile ale aminoacizilor constituenți. În mediu alcalin proteinele au tendința de a fi încărcat electronegativ datorită reacției:
OH-
R – COOH ↔ RCOO- + H2O
iar în mediu acid cu sarcini net electropozitive datorită reacției :
H2O
R – NH 2 ↔ R – NH3 + H2O
Pe baza acestei comportări dacă un amestec de proteine este plasat într-un câmp electric, proteinele cu sarcină negativă migrează spre anod, cele cu sarcină pozitivă spre catod, iar cele pentru care pH soluției reprezintă tocmai pH izoelectric vor rămâne pe linia de start. Viteza cu care are loc migrarea unei proteine depinde de raportul dintre sarcinile electronegative și electropozitive din macromoleculă, precum și de forma și dimensiunile moleculei și este așadar o proprietate caracteristică a unei proteine la un pH dat. Pe baza acestei proprietăți electroforeza este o metodă utilizată frecvent pentru separarea proteinelor.
C.6.3. Cromatografia cu ajutorul schimburilor de ioni: metoda se bazează pe utilizarea unor coloane cronatografice umplute fie cu dietilaminoetilceluloză cu cu caracter slab bazic, fie cu carbometilceluloză cu caracter slab acid. Dacă spre exemplu soluția unor proteine este trecută printr-o coloană cu dietilaminotilceluloză, unele proteine sunt legate și pot fi ulterior eludate succesiv din coloană prin creșterea concentrației elementului în săruri. Se realizează astfel o bună separare a proteinelor din amestecul lor.
C.6.4. Absorbția pe geluri:
Anumite proteine pot fi absorbite de geluri de fosfat de calciu sau hidroxid de aluminiu cu o eficacitate cu atât mai mare cu cât pH-ul este mai scăzut și tăria ionică este mai mică. Eludarea proteinei are loc pe măsură ce crește pH-ul sau tăria ionică. Absorbția pe geluri este adesea utilizată și în scopul concentrării soluților diluate ( de exemplu absorbția pe geluri de Sephadex G-25).
C.6.5. Filtrarea pe geluri:
Metoda utilizează geluri speciale, care funcționează ca site moleculare separând proteinelor pe baza dimensiunii lor.
Teoria gel filtrării a fost introdusă și dezvoltată de Flodin și Porath (1959) și volumul total al coloanei de gel este egal cu :
Vt = Vo + Vi + Vg, unde:
Vt = volumul total al coloanei de gel;
Vo = volumul spațiului gel reprezentat de volumul de apă care se află în afara particulelor de gel;
Vi = volumul spațiului din interiorul particulelor de gel, plin cu apă;
Vg = volumul ocupat de particulele gelului;
Repartiția unei substanțe date între apa din volumul spațiului gol și apa din volumul spațiului interior este dată de un coeficient de distribuție kd. Valoarea kd este dată de porozitatea particulelor de gel, o substanțe care are kd=0 este complet exclusă din lichidul ce se află în interiorul particulelor de gel. Când Kd unei substanțe este cuprins între 0 și 1 aceasta este numai parțial exclusă din interiorul particulelor de gel.
Comportarea oricărei substanțe pe o sită moleculară poate fi riguros exprimată prin ecuația :
Vl = Vo + kd – Vi ,
unde : Vl = volumul de eluție.
Metoda gel filtrării este utilizată cu succes pentru separarea proteinelor cu mase moleculare apropiate și pentru determinarea masei moleculare a diferiților lioplimuri (în acest caz este necesară etalonarea coloanei cu ajutorul unor substanțe cu masă moleculară cunoscută și eventual determinată prin alte metode).
C.6.6. Metode rapide de determinare a proteinelor
C.6.6.1. Metoda antrenării cu vapori în mediu puternic alcalin (metoda Kofranyi) se aplică la analiza laptelui, dar și pentru determinarea proteinelor din cereale. La încălzirea probelor în mediu puternic alcalin se antrenează cu vapori sub formă de NH3 o cantitate constantă din azotul total. NH3 este prins în soluție acidă (HCl, H2SO4, acid boric) și determinat prin titrare. Se folosește instalația Parnas-Wagner, iar calculul se face după formele empirice.
C.6.6.1.1 Determinarea proteinelor din lapte prin metoda Kofranyi
Într-un balon se pun 10 ml lapte, 10 ml NaOH 10N, 10 ml BaCl2 10% pentru prevenirea spumării. Se distilă prin antrenare cu vapori 10 minute de la apariția primelor picături. Distilatul se captează în 25 ml soluție H2SO4 0,025N care conține și indicator. După epuizarea timpului proba este titrată cu NaOH 0,025N până la portocaliu sau de la mov până la verde.
Calculul:
%P = 0,19092 x v, în care
v = volumul de H2SO4 0,025N corespunzător reacției cu NH3
C.6.2. Metode calorimetrice și spectrofometrice pentru determinarea proteinelor
Se bazează pe reacțiile specifice pe care le dau proteinele cu reactivi caracteristici în condiții bine determinate. Metodele sunt expeditive, sensibile, dar au o precizie mai puțin bună ca metodă Kjeldahl. Se recurge la o curbă de etalonare: A = f (concentrația proteinelor), unde A = absorbanță (A > μA).
Absorbanța este proporțională cu concentrația de proteine din probă. Concentrația de proteine din probă va fi deteminată prin metoda Kjeldahl.
C.6.2.1. Determinarea proteinelor pe baza reacției xantoproteice
Tratarea probei cu HNO3 concentrat se face când se formează compuși colorați în galben . Apariția culorii galbene se datorează prezenței în proteină a acizilor aromatici: fenil-alanina, tirozina, triptofanul, care conțin nucleul benzenic capabil să se nitreze cu formare de nitroderivați. Nitrarea se face cu benzen și cu fenol.
H NO2
nitrobenzen (galben)
p-nitrofenol
Intensitatea culorii galbene se obține spectrofotometric la = 430nm.
C.6.2.1.1. Determinarea proteinelor din lapte pe baza reacției xantoproteice
Laptele se diluează 1/10. Se măsoară un volum de 0,5 ml lapte diluat, 1 ml HNO3 concentrat (ρ = 1,41 g/cm3) și se fierbe 20-30 de secunde. Neutralizarea se face cu o soluție de NaOH concentrat 30%, măsurându-se un volum de 1,6 ml.
Lichidul galben este filtrat pentru o claritate absolută. Se supune spectrofotometrării într-o cuvă față de apă distilată. Paralel se face o curbă de etalonare.
Curba de etalonare – se măsoară probe de 1 ml lapte diluat; 0,5 ml; 0,2 ml; 0,1 ml; 0,05 ml; 0,02 ml; 0,01 ml și se precipită cu acid tricloracetic (TCA). Se obține un precipitat pp1, pp2, pp3 … ppn. se filtrează și se spală și se supune mineralizării Kjeldahl. Se distilează în aparatul Parnas-Wagner.
Dacă soluția galbenă se supune legii Bouguier-Lambert Berr rezultă că A = K x C, adică absorbanța este proporțională cu concentrația proteinelor (o dependență liniară)
A (nA)
C1 C2 Cx C3 … C7 C (mg/ml)
C.6.2.2 Determinarea proteinelor pe baza reacției BIURETULUI
Sebazează pe reacția de culoare pe care o dau proteinele cu compuși ce au legături peptidice în structura lor cu –CO-NH-, cu CuSO4 în mediu puternic alcalin.
Denumirea de “reacția biuretului” vine de la faptul că cel mai simplu compus ce dă o reacție este Biuretul obținut prin încălzirea ureei. Biuretul încălzirea ureei (carbodiamida)
NH2 O O H H O
O = C ║ ║ │ │ ║
NH2 C – NH2 C – N N – C
NH HN Cu NH
NH2 C – NH2 C – N N – C
O = C ║ ║ │ │ ║
NH2 O O H H O
biuret
2Na+ + Na2SO4 + H2O
Culoarea violetă se obține și în cazul proteinelor care au legătură peptidică. Se determină spectrofotometric la = 550 nm. Se aplică pentru proteinele din lapte, carne și produse vegetale.
Modul de lucru
O cantitate de 2 g se mărunțește fin într-un mojar cu 6 ml soluție Cu SO4 5%. Se pun 6 ml soluție NaOH concentrată 30% și se mărunțește până la obținerea unei paste omogene. Se adaugă 30 ml apă distilată și se omogenizează bine. Se lasă să se decanteze 20-30 de minute, după care se centrifughează 15 minute la 4000 rotații/minut până rezultă un supernatant limpede.
Soluția violetă se supune spectrofotometriei la = 550 nm în cuvă în raport cu apa distilată. Evaluarea cantitativă a proteinelor se face pe baza curbei de etalonare.
A (nA)
C1 C2 Cx … Cn Concentrația proteinelor
C.6.2.3. Determinarea proteinelor prin metoda Lowry folosind reactiv Folin-Ciocîlteu
Principiul metodei
Metodele spectrofotometrice se bazează pe reacția de culoare a două sisteme:
pe reacția biuretului proprie legăturii peptidice din molecula proteinei;
pe compușii colorați în urma reducerii reactivului specific care constă din acid fosfomolibdenic, fosfowolframic de către acizii aromatici (tirozina și triptofanul). Spectrofotometrarea are loc la = 760 – 790 nm.
Metoda se aplică numai soluțiilor diluate de proteine 10-15 ml p/mg.
Are o sensibilitate mare, este mai puțin selectivă deoarece reactivul Folin-Ciocîlteu este dat și de alți compuși, de o serie de antibiotice (Streptomicina, clor-cromazina) și compuși chimici (fenoli, acid uric, guanidina).
Prepararea reactivului Folin-Ciocîlteu este laborioasă. Este sensibil la lumină, la praf și se ține în sticle brune, închise etanș și ferite de lumină și praf. Determinarea proteinelor se face pe baza curbei de etalonare funcție de concentrația tirozinei.
Aparatură și reactivi
spectrofotometru
reactiv fenolic: într-un balon cu fund rotund de 1500 ml, prevăzut cu slif se adaugă: wolframat de sodiu (Na2Wo4 x 2 H2O) 100 g, molibdat de sodiu (Na2MoO4 x 2H2O) 25 g, apă distilată 600 ml. După dizolvare se adaugă: acid fosforic 25% (d = 1,75) 50 ml, acid clorhidric concentrat (d = 1,18) 100 ml. Se montează un refrigerent ascendent, cu bule și se fierbe liniștiti timp de 10 ore. După acest interval se adaugă sulfat de litiu 150g, apă distilată 50 ml, câteva picături (cca 8-10) brom. Se fierbe soluția fără refrigerent 15 minute pentru a îndepărta excesul de brom. Reactivul se răcește, se transvazezază într-un balon volumetric de 1000 ml și se aduce la semn cu apă distilată. Se filtrează prin vată de sticlă. Soluția se păstrează în sticle brune, bine închise și ferite de praf. Soluția are concentrația aproximtivă de 2N (după Folin -Ciocîlteu).
Reactiv fenolic de lucru (1N). se titrează reactivul fenolic 2N cu NaOH 0,1N în prezența fenolftaleinei. După aflarea normalității exacte se diluează reactivul pentru obținerea unei soluții de 1N, care se păstrează la rece în sticle brune, bine închise
Soluție de carbonat de sodiu 0,181M (2%): carbonat de sodiu anhidru 2g, apă distilată 100 ml
Soluție de sulfat de cupru 0,04M (1%)
soluție de tartrat de sodiu și potasiu 0,071M (2%)
soluție standard de proteină 0,1 g/100 ml
soluție de lucru Folin. Soluție sulfat de cupru 0,5 ml, soluție de tartrat de sodiu și potasiu 0,5 ml, soluție carbonat de sodiu 50 ml
Mod de lucru: se realizează conform tabelului 1
Tabelul 1
Controlul rezultatelor
Concentrația în g proteină/100 ml = Xx C(S), unde
C(S) = concentrația standardului în grame la 100 ml;
EP = extincția probei;
EB = extincția blancului;
ES = extincția standardului.
C.7. Separarea electroforetică a proteinelor
Electroforeza este una din cele mai eficiente metode pentru studiul proteinelor din diverse sisteme naturale biologice, alimente. Ea permite separarea, identificarea și dozarea fracțiunilor proteice din sisteme dozabile.
Principii – deplasarea controlată a particulelor globale proteice încărcate electric la o valoare de pH într-un câmp electric din exterior prin doi electrozi. Sarcinile electrice ale proteinelor și încărcarea lor se datorează prezenței în moleculele lor a –NH2, -COOH (aminoacizi care se prezintă ca niște amfoteri și în soluție ca amifoni).
Tehnici electroforetice
electroforeza pe hârtie
electroforeza pe gel: de amidon
de agaro-agaroză
de poli-acril-amidă sunt metode care permit separarea unor fracțiuni proteice mai numeroase și cu diferențe mai mici de migrare
C.7.1. Electroforeza pe hârtie
Tehnica cromatografică este complicată și trebuie multă atenție și experiență. Etapele sunt nuemroase:
extragerea proteinelor – proba se mărunțește fin, iar pentru extracția proteinelor se folosește soluție tampon cu pH și tărie ionică (0) bine determinate (pH = 7,7; 0 = 0,01)
se face o mojarare intensă și omogenatul se centrifughează 30 de minute (2500-3000 de rotații/minut)
pregătirea benzilor electroforetice – se folosește o hârtie specială de tip Whatmamn, Schleichey-Schuel care se taie la dimensiunile camerei electroforetice
pregătirea aparaturii – aparatura constă dintr-un redresor de ciurent alternativ care difuzează o tensiune continuă de o anumită valoare
poate asigura o anumită densitate de curent = mA/cm
camera electroforetică este o incintă închisă formată din:
loc de electroforeză: vas de plastic în care se pune soluția tampon de migrare (pH = 8; = 0,1)
stativ pentru benzi din material plastic astfel încât capetele hârtiei electroforetice să intre în bazinele cu soluție tampon
capac transparent pentru ca umiditatea sîă fie constantă; are un orificiu longitudinal pentru a putea pune probele pe hârtie. El se va obtura pe parcurs cu un dop de cauciuc lucrând la un pH alcalin (8,6); aplicarea probelor se va face de la catod la anod
aplicarea probelor se face cu un aplicator special 0,020-0,030 ml (20-30l probă). Proba se aplică longitudinal în zona catodică sub forma unei benzi, cantitatea de probă fiind determinată de concentrația proteinelor și de numărul de fracțiuni. Farcțiunile se vor deplasa spre anod cu viteze diferite în funcție de mobilitatea proprie.
,
unde:
Q = sarcina globală a particulei proteice
d = distanța dintre electrozi
r = raza particulei
= vâscozitatea mediului
Se observă că este invers proporțional cu dimensiunile particulei. Particulele proteice cu dimensiuni mari se vor deplasa ma puțin, iar cele cu dimensiuni mai mici se vor deplasa mai mult.
În acest fel, în funcție de dimensiuni și proba analizată, proteinelel se vor așeza de-a lungul spațiului consacrat migrării.
Prelucrarea benzilor – după expirarea timpului, se închide aparatura și stativul cu benzi de hârtie se usucă la etuvă 30 de minute la temperatura de 100-105C pentru fixarea proteinelor. Se scot din etuvă și se răcesc la temperatura camerei.
Relevarea probelor (cromatogramelor) – vizualizarea fracțiunilor proteice care au fost separate prin electroforeză, dar nu sunt vizibile. Se vizualizează cu soluție de coloranți (albastru de bromfenol în soluție de CH3COOH) în băi de vizualizare timp de 30 de minute – 1 oră. Excesul de colorant se îndepărtează prin spălare cu soluție de CH3COOH 2% până când pe hârtie rămân numai spoturile colorate. Colorația spotului reprezintă o intensitate proporțională cu concentrația fracțiunii proteice în probă
Interpretarea benzilor electroforetice se face:
calitativ
cantitativ
Din punct de vedere calitativ ne interesează natura (identificarea) fracțiunilor proteice separate. Aceasta se face pe baza distanței de migrare prin compararea cu standarde prelucrate în aceleași condiții.
Evaluarea cantitativă se face:
b.1. direct prin supunerea benzii electroforetice cu un microdensitometru, rezultând o curbă electrofoertică cu mai multe tipuri de benzi
A
d1 d2 d3 C
b.2. indirect prin eluție. Se decupează zonele decupate F1, F2… Fn. se taie sub formă de tăieței foarte fini, se pune în eprubetă și se adaugă 5 ml NaOH 0,1N și se produce eluarea lor timp de o oră agitând din 10 în 10 minute. Soluția da NaOH extrage colorantul. Se va filtra soluția și se va pune spectrofotometrării în VIS la = 550-660 nm. Se face pe baza unei curbe de etalonare. Dacă se supune legii Bouguier-Lambert Berr rezultă următoarea curbă
C.7.2 Electroforeza pe gel de amidon
Principiul metodei – constă în faptul că în calitate de mediu de susținere
(suport) se întrebuințează gelul de amidon preparat în mod special. În acset caz separarea electroforetică este considerabil sporită.
Materiale și reactivi
Amidon de cartofi
Soluție tampon fosfat pH = 7,4 (0,04M fosfat de potasiu)
Soluție tampon pH = 8,5 / 0,026M acid boric și 0,01M NaOH se aduc la 1 l cu apă distilată;
Colorant amido-negru 10B soluție saturată în amestecul format din alcool metilic, apă, acid acetic 5/5/1;
Acetonă;
Acid clorhidric concentrat
Soluție acetat de sodiu 1M
Prepararea gelului de amidon: 300 g amidon de cartofi se suspendă în 600 ml acetonă – HCl concentrat (100/1) la temperatura de 38,5. După ce se menține 45 de minute fără agitare, se adaugă 150 ml soluție apoasă CH3-COONa 1M pentru stoparea reacției. Amidonul se filtrează prin pâlnie Büchner și se spală cu apă distilată pentru îndepărtarea acetonei. Amidonul se adaugă din nou în apă distilat, se lasă peste noapte și din nou se spală pe pâlnie Büchner, după care se deshidrratează cu acetonă și se usucă la 45-50ºC. amidonul astfel pregătiti se întrebuințează 14 g la 100 ml tampon borat.
La cantitatea cântărită de amidon se adaugă volumul necesar de soluție tampon și amestecul se încălzește la flacără în balon conic agitând energic cu mișcări circulare. Conținutul balonului se aduce la fierbere, particulele de amidon se dispersează și se obține o soluie omogenă, vâscoasă. Balonul se ia de pe flacără, se agită conținutul câtva timp și se racordează la o pompă de vid și se elmină aerul timp de 1-2 secunde. Soluția fierbinte de amidon se toarnă într-o cuvă de plastic cu adâncime de 1,3 mm și imediat se acoperă cu o placă de polietilenă. Excesul de gel se îndepărtează apăsând placa. După răcire, gelul poate fi întrebuințat pentru determinări.
Pregătirea soluției de proteine sacroplasmatice – proba se omogenizează cu tampon fosfat în raport de 1/5 timp de 20 de minute la 4000 rotații/minut. Omogenatul se centrifughează pentru îndepărtarea stromei.
Tehnica electroforetică – pe gelul de amidon care conține tampon borat (pH = 8,5) din cuva de plastic având dimensiunile 18 x 25 cm corespunzător mărimii camerei electroforetice se spotează 0,01-0,1 ml soluție cu proteine sacroplasmatice. Această cantitate se așează în secțiunea verticală a gelului perpendicular pe lungomea acestuia cu ajutorul unei micropipete. Se aplică pe placa de gel cca 6-7 probe.
Contactele electrice se aduc la capetele gelului cu ajutorul unor benzi de hâțrtie de filtru, un capăt fiind așezat la capetele gelului, iar celălalt fiind cufundat în soluția tampon. Se unește catodul cu anodul. Vasul cu soluție tampon se unește prin hârtie de filtru cu vasul în care se găsește electrodul Ag/AgCl în soluție saturată da NaCl.
Electroforeza proteinelor are loc la tensiunea de 1BV și intensitatea curentului de 25-30 mA timp de 5 ore la temperatura camerei.
La sfârșitul electroforezei gelul se secționează în lung în felii și suprafețe tăiate, se colorează cu Amido-negru 10B. excesul de colorant se îndepărtează spălând de 4-5 ori cu amestec de alcool metilic – apă – acid acetic în raport 5/5/1. Feliile de amidon având spoturile de proteine evidențiate se fixează prin scufundare în soluție de acetat de sodiu și pot fi fotografiate la lumină constantă a două becuri de 1000W care luminează fâșia de gel din 2 părți sub un unghi de 45º.
C.7.3. Electroforeza în gel de poliacrilamidă (PAGE)
În orice discuție asupra proprietăților gelului de poliacrilamidă este deosebit de utilă nomenclatura introdusă de Hjertére (1962) pentru a descrie compoziția gelului. Conform acestei nimenclaturi, T reprezintă concentrația totală de monomer (acrilamidă + Bis) exprimată în grame la 100 ml (masă per volum la sută), iar termenul C desemnează procentul de monomer total T,datorat agentului de reticulare (Bis).
Formarea și structura gelului de poliacrilamidă
Gelul se formează prin polimerizarea vinilică a monomerilor de acrilamidă CH2 = CO – NH – CH2 – NH – CO – CH = CH2. Reacția de polimerizare dă naștere în mod aleatoriu unor asemenea lanțuri de poliacrilamidă, ce încorporează o mică proporție de molecule Bis, acestea putând reacționa cu alte grupări ale altor lanțuri, determinând reticularea ce are ca rezultat formarea unor rețele cu structură generală. Concentrația de poliacrilamidă utilizată determină lungimea medie a lanțului de polimeri, în timp ce concentrația de Bis determină gradul de reticulare. Ambele concentrații decid astfel proprietățile fizice ale gelului, precum densitatea, elasticitatea, rezistența mecanică și dimensiunea porilor.
Efectele dimensiunii porilor
În mediile gelificate, trecerea oricărei particule este întârziată de însăși structura matrică într-o măsură ce depinde de mărimea relativă a praticulelor și a porilor din rețeaua gelului. Atât dimensiunile cât și sarcina moleculelor joacă un rol în procesul de separare. Poliacrilamida este formată din monomeri sintetici și are avantajul major al ușurinței cu care mărimea porilor, deci gradul de sitare moleculară, poate fi alterată prin simpla modificare a concentrației de acrilamidă și/sau a proporției de agent de reticulare.
Polimerizarea monomerilor de acrilamidă poate fi inițiată de lumina naturală, motiv pentru care acrilamida și Bis trebuie păstrate în flacoane de culoare închisă, ferite de lumină, la o temperatură scăzută 4ºC și nu trebuie păstrate mai mult de 1-2 luni.
Alegerea gelului și a sistemulu tampon adecvat
Un amestec de proteine și acizi nucleici care urmează a fi analizat prin PAGE constă aproape întotdeauna în molecule cu dimensiuni și sarcini nete diferite; ele pot fi separaet într-un anumit număr de zone sau benzi distincte. Deși există numeroși factori care intervin în separare, cei mai mulți nu sunt critici, putându-se realiza un oarecare grad de separare în condiții foarte diferite de pH, concentrații de acrilamidă și Bis, tărie ionică, gradient de potențial, timp de desfășurare. Cu toate acestea alegerea condițiilor pentru o separare optimă este dificilă și necesită frecvent încercări preliminare prin care să se testeze influența modificării acestor fapte.
Natura însăși a probei oferă de obicei o imagine a condițiilor capabile să aigure o bună separare. De pildă, investigarea unui amestec de proteine virale sau acizi nucleici cu greutăți moleculare mari ar putea impune alegerea unui gel cu pori mari avțnd o concentrație T de poliacrilamidă sub 5%, pentru a se evita efectul excesiv de sită moleculară. La fel, T = 15-20% sau chiar mai mult, ar putea constitui o alegere logică pentru polipeptide cu greutate moleculară mică, aceste concentrații accentuând diferențele minore de dimensiuni în cadrul aceluiași nivel de greutate moleculară. Pentru acele separări bazate îndeosebi pe diferențele de sarcină gelurile cu pori mari vor fi preferate chiar și pentru molecule comparativ mai mici.
La amestecarea unui amestec de proteine, este puțin probabilă alegerea acelui set de condiții care să poată garanta cel mai bun grad de separare a fiecărei componente de celellate; de aceea toate separările trbuie realizate în condițiile unui compromis parțial. Dacă într-un gel s eobține o singură bandă, aceasta nu constituie în sine dovada prezenței unei singure componente omogene. Pentru a face dovada omogenității, trebuie realizat un al doilea sau chiar un al treilea experiment în geluri cu dimesniuni diferite ale porilor; la pH-uri diferite, care să genereze efecte de sită moleculară diferite ori cu pH-uri diferite, care la rândul lor să modifice contribuția datorată sarcinii moleculare.
Tăria ionică a sistemului tampon trebuie menținută la un nivel suficient pentru a păstra proba în soluție. Cu cât este mai concentrat tamponul, cu atât este mai redusă rezistența electrică, iar cu cât este mai mare curentul transportat la tensiunea aplicată, cu atât este mai mare căldura generată. Cel mai adesesa însă, o tărie ionică excesivă impune utilizarea unor gradienți de tensiune scăzuți, pentru a evita încălzirea exceivă. Aceasta duce la timpi prea lungi de electroforeză, cu risc crescut de denaturare și împrăștirere datorită difuziei. În majoritatea sistemelor tampon, tăria ionică are valori cuprinse între 0,05-0,1M, dar se pot folosi și concentrații scăzute până la 0,025M sau crescute până la 0,5M. cele care depășesc valoarea de 0,5M sunt comune sistemelor tampon puternic acide.
Geluri plate sau geluri cilindrice
La început PAGE s-a realizat pe plăci de gel, apoi s-au introdus gelurile cilindrice în tuburi subțiri de sticlă, în așa numita metodă a electroforezei-disc. Există trei forme geometrice curente pentru realizara PAGE și anuem plăcile orizontale, plăcile verticael și cilindrii verticali (baghetele) de gel. Fiecare își are avantajele și dezavantajele sale. În plăcile de gel orizontale se obișnuiește ca probele să fie aplicate prin decuparea unui șanț în care s einserează o bucățică de hârtie de filtru impregnată cu o cantitate cunoscută din soluția probă, așa cum se procedează adesea în electroforeza în gel de amidon. Metoda are avantajul de a putea plasa proba în orice punct de pe placă astfel că, plasând-o la mijloc, migrarea componentelor spre unul sau ambii electrozi poate fi detectată simultan. Un alt avantaj al plăcilor orizontale este acela că utilizarea lor necesită o aparatură necositisitoare, utilizabilă și în alte sisteme electroforetice plane (de exemplu geluri de amidon sau agar, hârtie, celuloză) sau în focalizrea izoelectrică. Gelurile plate verticale sau cilindrice sunt mai lesne de folosit în tampoane multifazice. În această configurație, pot fi vizualizate doar acele componente care se deplasează spre unul dintre electrozi, ceea ce impune fie controlul pH-ului pentru ca toate componentele să migreze în aceeași direcție, fie realizarea a două experimente separate, cel de-al doilea cu electrozii inversați. Rezoluția este similară pentru gelurile plate și pentru cele verticale, de regulă, însă placa impune să fie de pus mai mult material, ceea ce este în avantajul muncii preparative.
Un avantaj însemnat al folosirii gelurilor – placă este numărul total de șanțuri practicabile pe o singură placă, care să facă posibilă migrarea paralelă a mai multor probe în condiții identice și, deci, compararea lor nenechivocă. Acest lucru are o mare utilitate în testele screening în care trebuie procesat și comparat un număr mare de probe, în investigațiile clinice sau atunci când se procedează la aplicări multiple în fronturi diferite; gelul este apoi tăiat și examinat prin diverse metode (un fragment este supus colorării specifice pentru proteine, altul pentru activitatea enzimatică, al treilea pentru autoradiografie etc).
Când se recurge la un nuritaj pentru geluri cilindrice, fiecare probă este procesată pe un cilindru separat încât, pentru compararea riguroasă a diferitelor probe, condițiiile trebuie să fie identice în toate gelurile aflate în lucru, ceea ce e geru de realizat.
Aplicarea probei și electroforeza
Atunci când se folosesc geluri și tampoane omogene, de regulă nu are loc în cursul etapelor inițiale cele electroforezei concentrarea componentelor probei în zone înguste, așa cum se întâmplă în cazul tampoanelor multifazice. Capătă astfel importanță utilizarea unor volume comparativ mici de probă (5-25 μl penrtu un gel cilindric cu diametrul standard de 5 mm). La peste 20-25 μl, grosimea stratului de probă are un efect evident asupra delimitării și rezoluției benzilor. Pentru cele mai multe mintaje verticale (cu geluri cilindrice sau plate) proba se aplică prin tampon în incinta superioară a electrodului cu ajutorul unei microseringi sau al unei micropipete de unică folosință, astfel ca proba să aibă o densitate mai mare decât a tamponului. Acest lucru se realizează prin adăugarea de sucroză sau uree în cantități mici de 2-10% ,ori de glicerol 5-10%. Intră în uzul curent adăugarea la probă în această etapă a unei cantități foarte mici de colorant trasor care migrează cu o viteză mai mare decât oricare din componentele macromoelculare ale probei și indică momentul stopării electroforezei atunci când colorantul ajunge la 5 cm de capătul inferior al gelului.
Odată adăugată proba electroforeza trebuie să înceapă imediat pentru a preveni difuzia componentelor probei.
Metode de colorare a gelului
Imediat ce colorantul trasor a atins poziția dorită, curentul este întrerupt, iar gelul este îndepărtat din apartul de electroforeză în vederea localizării componenetelor separate. îN ceea ce privește sistemele plate este în general lesnicioasă demontarea aparatului și introducerea gelului într-o baie de colorare. Penrtu acelel echipamente care folosesc geluri cilindrice, tuburile care le conțin sunt îndepărtate din aparat, iar gelul este extras din tubul de sticlă cu ajutorul uni seringi umplută cu apă ori soluție de glicerol și prevăzută cu un ac subțire și lung de 6-8 cm. Acesta este introdus ușor între gel și peretele de sticlă al eprubetei care în acset timp este rotită cu mâna, până ce seringa este golită treptat, apa injectată servind drept lubrifiant. Procesul poate fi reluat la ambele capete ale tubului, dacă e necesar însă, de obicei, gelul alunecă liber la retragerea acului sau poate fi ușor împins cu ajutorul unei perii de cauciuc montată la capătul tubului. Ca să prevină degradarea gelulu unii cercetători folosesc ace rotunjite sau ferestruite la vârf.
Proteinele
Cel dintâi colorant folosit pentru proteine a fost Amido-Black 10B (numit uneori și Negru de naftalen 10B, albastru-negru de naftor B sau negru BufFalo) utilizat îndeosebi la lucrările cantitative. Gelurile sunt introduse în amestecul de colorare minimum 24 de ore, timp în care pot fi necesare mai multe schimbări ale colorantului. Soluția colorată se poate păstra și refolosi de câteva ori. Limita inferioară de detecție corespunde la circa 1 μg per bandă. O posibilă dificultate o constituie faptul că solventul în care este preparat colorantul suferă o ușoară denaturare; dacă în mod normal aceasta nu este o problemă, în unele cazuri în care sunt implicați compuși sau proteine deosebit de solubile cu greutate moleculară mică, se poate produce o slabă fixare a proteinelor în gel. Dificultățile astfel generate pot fi corectate, în general, prin includerea unei etape preliminare de fixare, în care gelurile sunt imersate în TCA 12,5% timp de 1-3 ore, înaintea colorării obișnuite. Ca o variantă la obișnuita fixare prin precipitare cu TCA sau acid sulfosalicilic, zonele separate pot fi imobilizate prin legarea lor la matricea de gel cu formaldehidă. Metoda ar putea fi utilă pentru peptide, glicopeptide, proteine puternic bazice etc, compuși ce nu sunt suficient fixați cu agenții de precipitare obișnuiți. Colorarea are loc pe baie de abur (acoperită) prin cufundarea gelului timp de o oră într-un amestec format din 0,8 g Coomassie Blue R250, 180 ml etanol, 420 ml apă, 100 ml formaldehidă 35%.
Pentru gelurile care conțin și SDS operația este urmată de încă o oră de colorarea într-un amestec cu conținut redus de formaldehidă pentru a preveni retracția gelului, amestec constând din 1,2 g Coomassie Blue R250 în 250 ml etanol, 750 ml apă, în 10 ml formaldehidă 35%. Amestecul de solvenți pentru decolorare a constat din 250 ml etanol, 750 ml apă și 10 ml formaldehidă 35% fără colorant.
Fosfoproteinele
Multe proteine se colorează în roșu sub acțiunea colorantului nucleic bromură de 1-etil-2-3-(1-etilnafto-1,2d-tiazolin-2-yliden)-2-metilpropenil-nafto-1,2d-tiazol, prescurtat , din fericire, colorant total; fosfolipidele sunt colorate în albastru cu același colorant, încât el poate fi utilizat pentru diferențierea lor. Sensibilitatea este variabilă, dar se încadrează în general între 1 și 5 g pentru fosfoproteine. Unele proteine nefosforilate nu se colorează deloc. O colorație pentru fosfoproteine mai puțin sensibile, dar mai precise, a fost descrisă de Cutting și Roth (1973) ea bazându-se pe verdele de metil și pe molibdat. Metoda poate identifica până la un nmol de fosfat, ceea ce într-o bandă care conține 30 g proteină, corespunde la aproximativ o grupare fosfat pentru fiecare 300 de resturi de aminoacid.
Lipoproteinele
Pot fi colorate înaintea electroforezei pentru a le deosebi de proteine. În acset scop, cel mai des folosit este Sudan Black B. Se amestecă un volum de soluție saturată de Sudan Black B în etilen-glicol cu 2 volume soluție de lipoproteine, iar amestecul se păstrează la 4C cel puțin 24 de ore. Amestecul se aplică direct pe gelul pregătit pentru electroforeza în cursul căreia colorantul în exces rămâne în origine. După electroforeză, localizarea lipoproteinelor electroforetice este posibilă cu ajutorul unui colorant preparat prin dizolvarea a 500 mg Sudan Black B în 20 ml acetonă și adăugarea unui amestec de 15 ml CH3COOH și 80 ml H2O. amestecul se agită 30 minute, apoi se centrifughează. În el se colorează peste noapte gelurile, apoi se decolorează prin 3 spălări succesive cu un amestec de 150 ml CH3COOH, 200 ml acetonă și 650 ml H2O.
Decolorarea
Prin cele mai multe metode de colorare se colorează gelul în totalitatea lui, nu doar zonele ce conțin benzile cu substanțele de analizat. Absorbția nespecifică de fond, trebuie redusă într-o etapă de decolorare în așa fel încât benzile să poată fi vizualizate și cuantificate. După mai multe colorări, legăturile formate între moleculele de colorant și materialul separat sunt relativ slabe, așa că trebuie avut grijă să nu se reducă intensitatea benzilor sau chiar să se decoloreze complet prntr-o decolorare excesivă.
Există două modalități de decolorare a gelurilor, prin spălare sau prin electroforare ulterioară, prima fiind și cea mai utilizată. Metoda spălării constă în simpla îndepărtare a excesului de colorant prin cufundarea gelului într-un volum mare de solvent adecvat, timp de 24 de ore sau mai mult. Viteza de difuzie a moleculelor de colorant în afara gelului este mărită prin agitare și prin schimbarea frecventă a amestecului de solvenți, pentru a menține cel mai ridicat gradient posibil de concentrație între gel și solvent. Decolorarea este accelerată și prin suspendarea unui săculeț ce conține cărbune activ sau o rășină schimbătoare de ioni (Dowex 1 pentru coloranții acizi sau Dowx 50 pentru cei bazici) în baia de decolorare, pentru a absorbi moleculele de colorant pe măsură ce difuzează din gel.
Determinarea cantitativă a componentelor separate
Măsurătorile cantitative se încadrează în două categorii: cea caer necesită doar măsurători relative, ca în monitorizarea desfășurării unei metode de izolare sau a unei reacții chimice în procedurile screeninig și cea care reclamă exprimarea rezultatelor în termeni absoluți; concentrație, unități de activitate etc. Metodele cantitative apelează de obicei densitometrie. Ele pot fi uitlizate direct, scanând chiar și gelurile colorate sau necolorate, ori indirect prin scanarea negativelor fotografiilor gelurilor.
C.7.4. Electroforeza pe geluri de agaroză și geluri compozite pe poliacrilamidă-agaroză
Gelurile preparate din polizaharidul agar, produs în mod natural, au constituit unele din primele medii utilizate în depășirea problemelor ridicate de convenția asociată electroforezei în soluție liberă.âdatorită grupărilor sulfat sau carboxil, gelurile de agar au suferit de pe urma unei electrodosmoze accentuate, în condițiile în care se folosesc tampoane neutre sau alcaline; în plus, pot apărea pierderi de proteină determinate de absorbție. Comerțul pune la dispoziție zaharidul agaroză purificată, ce nu prezintă aceste neajunsuri. Când e necesar, agaroza poate fi supusă și altor purificări prin cromatografia schimbătoare de ioni. Agarul însuși mai este rareori folosit în aplicațiile electroforetice.
Gelurile de poliacrilamidă cu T < 3-3,5% sunt foarte fragile și greu de manevrat și, pentru a îndepărta acest inconvenient, Uriel și Berges (1966) au introdus conceptul de gel compozit din agaroză și poliacrilamidă pentru separarea proteinelor.
Prepararea gelurilor din agaroză
Concentrațiile tipice de agaroză se încadrează în limitele de 0,4-2,5%, gelurile fiind preparate după cum se prezintă în continuare.
Cantitatea de agaroză se dizolvă în tampon, prin încălzire pe baia de apă clocotită timp de câteva minute, până la limpezirea soluției și dispariția flocoanelor vizibile de agaroză. Trebuie evitată posibila carbonizare pe care o produce încălzirea directă. Se adaugă apă, până la reconstituirea volumului inițial, dacă este necesar. Se poate folosi orice sistem tampon la o tărie ionică de 0,03-0,1. Soluția încălzită este apoi răcită la circa 50ºC și aplicată în montajul de geluri sau în matrița pentru geluri, care trebuie în prealabil preîncălzită la aceeași temperatură.
Temperatura normală de gelificare a agarozei este de circa 45ºC, deși în prezent există și o formă de gelificare la mai puțin de 37ºC, pentru cazurile care o cer. Din cauza elasticității reduse a gelurilor de agaroză și a dificultății implicite de a le preleva din tuburile de sticlă, montajul cu geluri cilindrice este rareori folosit. Metodele imunoelectroforetice apelează aproape întotdeauna la plăci orizontale.
Colorația pentru proteine și glicoproteine
Tehnicile de colorare postelectroforetică descrise pentru PAGE poti fi aplicate și în cazul agarozei, dar colorarea și decolorarea pot fi adeseori accelerate prin uscarea prealabilă a plăcilor de gel. Aceasta se realizează prin așezarea gelurilor pe o placă de sticlă, acoperirea lor cu hârtie de filtru, presarea lor până la formarea unei pelicule subțiri și uscarea lor în curent de aer cald. Se recurge adeseori la timpi scurți de colorare și decolorare, de numai câteva minute. După decolorare, gelurile pot fi uscate în mod similar și păstrate ca înregistrări pemanente. Metodele de evidențiere a glicoproteinelor prin oxidare cu periodat nu sunt mulțumitoare, datorită puternicei colorații de fond a matricei de agaroză, deși în cazul filmelor subțiri de agaroză a fost aplicată cu mult succes o variantă ce recurge la spălarea abundentă după colorare cu etanol acid, pentru îndepărtarea colorației de fond.
Prin metoda lui Willoughby și Lambert (1983), gelul este mai întâi fixat prin imersare 30 minute într-un amestec alcătuit din 17,3 g acis sulfosalicilic, 25 g TCA și 25 g sulfat de zinc în 500 ml soluție, este apoi clătit de 2 ori cu apă și o soluție de etanol 35% ce conține 10% CH3COOH, timp de 15 minute. Gelul trebuie agitat ușor în decursul tuturor acestor etape.
El se acoperă cu hârtie de filtru umezită cu etanol care se acoperă apoi cu mai multe straturi de hârtie uscată, punând deasupra, pentru presare, o placă de sticlă și o greutate de 0,5Kg.
Pentru etapa de colorare, se amestecă două soluții, fiecare stabilă câte 1-2 săptămâni. Gelurile sunt colorate într-o incintă verticală specială din material plastic, cu capacitatea de 100 ml. Pentru folosire, se adaugă ușor, sub agitare, 68 ml soluție A, se formează treptat un precipitat alb care devine cenușiu și, în 5-7 minute, negru. Gelul este lăsat în amestec până la colorarea dorită, dar ar trebui îndepărtat înaintea înnegririi precipitatului.
Prepararea gelurilor compozite de poliacrilamidă-agaroză
Gelurile compozite se pot forma în două moduri diferite: fie că soluția caldă de tampon ce conține agaroză și toate celelalte ingrediente pentru un gel de poliacrilamidă sunt menținute la peste 35ºC, până ce poliacrilamida polimerizează, iar agaroza se solidifică prin răcire ulterioară, fie că soluția este răcită la 20ºC, astfel încât agaroza să solidifice prima. Uriel și Berges (1966, 1974) au utilizat primul procedeu și au lăsat amestecul la incubat la 45-50ºC, timp de 30-40 minute, până ce acrilamida a polimerizat și l-au înghețat apoi 20-40 minute, pentru solidificarea agarozei. Ei au preparat în acest fel geluri ce conțin agaroză 0,8% și acrilamidă 2,5-9% (T%). Deși neîndoielnic satisfăcătoare, nu pare să aibă rost utilizarea unor geluri care să conțină 4% sau mai mult monomer de acrilamidă, fiindcă la aceste concentrații gelurile ce conțin doar poliacrilamidă au proprietăți mecanice și de separare absolut satisfăcătoare și sunt mai simplu de preparat.
Deoarece prezența agarozei nu pare să înfluențeze separarea, tampoanele, aparatura, condițiile electroforetice, metodele de colorare și metodele de determinare cantitativă pot fi aplicate în totalitate gelurilor compozite în același mod ca și gelurilor alcătuite doar din poliacrilamidă.
C.7.5. Determinarea unor compuși azotați neproteici
Aminoacizi și metode pentru determinarea lor
Aminoacizii sunt substanțe organice în a căror structură se întâlnesc concomitent două grupări funcționale: amino și carboxil și cu următoarea formulă generală
H
│
R – C – COOH
│
NH2
Un număr de 20 de α-aminoacizi majoritari, numiți și aminoacizi standard, se găsesc frecvent în structura proteinelor naturale. În afară de aceștia, din hidrolizatele unor anumite proteine specializate au fost izolați o serie de aminoacizi rari, mai puțin răspândiți, care derivă tot din cei standard.
Peste 150 de aminoacizi, care se găsesc în natură sub formă liberă sau combinată, dar niciodată în proteine, alcătuiesc grupa aminoacizilor neproteici.
Metodele de determinare a aminoacizilor sunt:
metode chimice (metoda formol-titrimetrică);
cromatografie (cromatografia pe hârtie).
C.7.5.1. Metoda forrmol-titrimetrică
Se bazează pe caracterul amfoter și pe faptul că gruparea aminică reacționează cu aldehida formică rezultând metilen derivați cu carcter acid.
H
CH2 – COOH + C == O CH2 – COOH
│ H – H2O │
NH2 N == CH2
metilen derivat
Acești compuși se pot titra cu soluția unei baze tari NaOH în prezența unui indicator fenolftaleina până la viraj roz.
CH2 – COOH + Na OH CH2 – COONa + H2O
│ – H2O │
NH == CH2 N == CH2
Reacțiile decurg complet numai din condițiile unui exces de aldehidă formică. Reacția nu este foarte specifică deoarece sărurile de amoniu reacționează cu CH2O după reacția:
4NH3 + 6CH2O → N4(CH2)6 + 6H2O
hexametilen tetramină
Sărurile de amoniu și NH3 trebuie identificate și îndepărtate. Reacția este deranjată de ioni CO32- și PO43- care trebuie îndepărtate prin Ba2+.
CO32- + Ba2+ BaCO2 ↓
PO43- + Ba2+ Ba3(PO4)2 ↓
Aminoacizii aromatici se pot determina foarte selectiv în prezența altor aminoacizi pe cale spectrofotometrică: absorbție moleculară în UV (100-400 mm). Lungimile de undă proprii aminoacizilor sunt:
fenil-alanina λ = 260 mm
Titrozina și triptofanul λ = 280 mm
La concentrații mici este respectată legea Bougouer-Lambert-Berr:
A = K-C
Curba de etalonare se face pentru fiecare aminoacid cu soluția martor.
C.7.5.2. Separarea aminoacizilor prin cromatografia pe hârtie (metoda Awapara)
Pregătirea probei – probe mici se mojarează cu nisip de cuarț, calcinat și 10 ml alcool etilic 94%. Proba se supune centrifugării 30 de minute și filtratul se colectează într-un vas de cristal. Reziduul și 10 ml alcool etilic se mojarează și se centrifughează. Se colectează în același vas. Se pun pe baia de apă la 60º; reziduul se dizolvă în 5 ml de apă distilată.
Purificarea cu eter etilic – se pun 3 ml în capsul ade porțelan și se separă. Prin aspirare cu o pipetă se îndepărtează eterul, iar peste stratul apos se pun 3 ml eter etilic. Stratul apos se aduce la sec pe baie de apă la 60ºC și se ia atent numai 0,5 ml după ce se aduce la semn.
Pregătirea hârtiilor cromatografice – hârtia cromatografică are o dimensiune de 50 cm, deoarece durata separării cromatografice este mare și numărul aminoacizilor este mare. Loțiunea hârtiei cromatografice depinde și de numărul probelor
Aplicarea probelor: probele se aplică cu o micropipetă 10-15μl într-un spot cu Φ 0,5-0,7 cm (5-7 mm). Spoturile aplicate la linia de start se usucă și apoi hârtia se pune în camera cromatografică unde are loc o developare descendentă. Developantul folosit este: butanol, acid acetic, H2O în proporție 4:1:5. Este propriu unui sistem de developare 16-18 ore. Se usucă la temperatura camerei și se pune în camera de developare folosind: butanol, acid acetic și apă 4:1,5:0,5. În cursul developării are loc separarea aminoacizilor pe baza migrării lor diferențiate. Migrarea este impusă de natura și proprietăților aminoacizilor și de afinitatea lor față de faza staționară și faza mobilă. Aminoacizii se vor amplasa pe o linie verticală
Prelucrarea cromatogramelor .Relevarea – se scot cromatogramele, se usucă la temepratura camerei și la etuvă, temperatura de 60ºC timp de 15 minute. Spoturile sunt invizibile și pnetru relevarea lor se folosesc soluții de coloranți dizolvate în acetonă. Se folosește soluție de ninhidrină 0,5% + acid acetic 1% dizolvată în acetonă 95%.
Soluția se pulverizează pe suprafața hârtiei cromatografice uscate și se usucă la temperatura camerei; se vor obține diferite cromatograme – pete albastru-violet pentru majoritatea aminoacizilor. Excepție fac prolina și hidroxiprolina, care sunt de culoare galbenă.
Interpretarea rezultatelor se face:
calitativ
cantitativ
Analiza cantitativă se face prin comparare cu amestecul standard de aminoacizi aplicat pe cromatogramă odată cu probele de aminoacizi, astfel încât tot procesul cromatografic să fie identic
b.1. se va determina concentrația fiecărui aminoacid. Se poate face o interpretare directă a cromatogramelor prin densitometru
b.2. se mai face și indirect prin eluție prin decuparea spoturilor și eluarea cu un volum v ml de alcool etilic. Timpul de eluare este de 15 minute, v = 75% alcool etilic 5-10 ml; soluțiile colorate în albastru se vor evalua spectrofotometric la λ = 530 mm. Soluțiile galbene se spectrofotometrează la λ = 440 mm. Se vor obține absorbanțe diferite. Se face o curbă de etalonare pentru fiecare aminoacid.
C.7.6. Determinarea substanțelor minerale totale – cenușii totale (STAS 6357-75)
Determinarea cenușii totale se afce prin două metode:
metoda 1, prin incinerare la 800º C, obligatoriu în caz de litigiu;
metoda 2, prin incinerare la 530º C, pentru determinări curente.
C.1. Metoda 1
Principiul metodei – evaporarea probei la sec, carbonizarea reziduului uscat, incinerarea la 400ºC, extragerea substanțelor solubile în apă și filtrare; incinerarea reziduului la 800ºC și uscarea l a130ºC, după adăugarea extractului apos.
Aparatura
etuvă electrică până la 200ºC;
cuptor electric până la 1000ºC;
creuzet de platină sau, în lipsă, creuzet de porțelan.
Reactivi și materiale
alcool etilic 96%;
eter de petrol cu interval de distilare cuprins între 30-60ºC;
acid acetic glacial;
carbonat de sodiu anhidru;
hârtie de filtru cantitativă pentru filtrare rapidă, liberă de cenușă.
Modul de lucru pentru brânzeturi
Se cântăresc circa 5 g din probă, cu precizie de 0,0001 g într-un creuzet adus la masă constantă și se adaugă 0,5 g carbonat de sodiu. Se încălzește creuzetul l aflacără mică până la carbonizarea ușoară și apoi se incinerează la 400±20ºC timp de 2 ore.
După răcirea creuzetului cu cenușa care mai conține încă puncte carbonizate, se extrag substanțele solubile prin tratări repetate cu apă fierbinte. Filtrul cu reziduul insolubil se incinerează la 800±25ºC. creuzetl cu cenușa obținută se lasă să se răcească în exicator până la masă constantă. Se efectuează în paralel două determinări. În alt creuzet adus la masă constantă se face o determinare martor, fără proba de analizat, folosindu-se aceiași reactivi și în aceleași cantități ca la determinarea cu proba de analizat.
Calculul și exprimarea rezultatelor
Pentru brânzeturi, conținutul de cenușă totală se calculează cu formula:
Cenușa totală = , unde
m2 = masa cenușei obținute la determinarea martor;
m2 = masa cenușei obținute în grame;
m2 = masa probei luate pentru determinare, în grame
D. Determinarea produsului finit – brânza proaspătă de vaci
D.1. Recoltarea probelor
La brânza proaspătă de vaci se deschid 10% din ambalaje care formează lotul (maximum 500 Kg în cazul ambalajelor de transport). În cazul ambalajelor mari (bidoane, tăvi), se iau probe de la suprafață și din profinzime din care se formează o probă medie. Din proba medie se recoltează 200-300 g, care se trimit la laboratoare. Dacă totul eset format din ambalaje mici (pachete până la 300 g) se recoltează 2% din numărul unităților de ambalaj, dar nu mai puțin de două și nu mai mult de cinci.
În funcție de forma, masa și tipul brânzeturilor, precum și în funcție de natura analizelor de executat, se utilizează pentru recoltarea probelor cuțitul, sonda sau se iau bucăți întregi. Examenul de laborator al brânzeturilor se face din punct de vedere organoleptic, fizico-chimic și bacteriologic (microbiologic).
D.2. Verificarea calității brânzei proaspete de vaci
Conform STAS-ului 3664-92 verificarea calității brânzei proaspete de vaci se face prin verificări de lot și verificări periodice.
D.2.1. Prin verificarea de lot se înțelege cantitatea de maximum 5000 kg brânză proaspătă de vaci de același tip, prezentă în același fel de ambalaje. Lotul poate conține brânză proaspătă de vaci provenită de la mai multe șarje de fabricație, prezentate distinct. La fiecare lot se verifică:
ambalarea și marcarea;
masa;
proprietățile organoleptice;
proprietățile fizice și chimice cu excepția substanțelor proteice, a metalelor, arseniului și pesticidelor, care se verifică periodic
D.2.2. Verificările periodice constau în:
verificarea conținutului de substanțe proteice care se execută trimestrial;
verificarea conținutului de metale, arsen și pesticide care se xecută trimestrial;
verificarea proprietăților microbiologice care se xecută trimestrial.
D.3. Examenul organoleptic
La acest tip de brânză se apreciază:
aspectul: dacă prezintă masă omogenă, prezența sau absența scurgerilor de zer, existența mucegaiurilor sau a impurităților;
consistența: se stabilesc caracteristicile pastei în funcție de sortiment;
culoarea: se apreciază culoarea la suprafață , cât și în profunzime, precum și uniformitatea ei;
mirosul și gustul: se apreciază aroma și gustul, care trebuie să fie caracteristice sortimentului și se depistează nuanțele nespecifice sau srăine (acru, amar, de drojdie, de mucegai etc).
D.4. Determinări fizico-chimice
În vederea aprecierii integrității s efac următoarele determinări: determinarea apei, a procentului de grăsime raoprtat la substanța uscată și a clorurii de sodiu.
Pregătirea probei pentru analize
Proba se mărunțește fin și se mojarează bine până la completa omogenizare. La brânzeturile cu coajă, aceasta se îndepărtează, după care se poate mărunți cu ajutorul unei răzătoare cu ochiuri mici. Determinările se execută imediat după mărunțire și omogenizare. În cazul brânzeturilor conservate în saramură, proba se aduce la temperatura camerei, se scurge de saramură, fără să se îndepărteze stratul superior și se așează pe o hârtie de filtru, în vederea îndepărtării umidității de la suprafață.
D.4.1.1. Determinarea cantității de apă
Această determinare se face prin uscare la etuvă, antrenare cu solvenți organici, sau uscare cu radiații infraroșii. În condiții de producție, ca metodă orienattivă poate fi folosită metoda rapidă de uscare cu ajutorul balanței tip “Lacta”.
`Uscarea la etuvă
Reprezintă metoda clasică, de referință, considerată cea mai exactă pentru produsele alimenatre de origine animală. Este indicat ca determinarea să se execute în dublu pentru fiecare probă luată în lucru.
Aparatură și reactivi
balanță analitică cu precizie de cântărire de 0,001 g
fiole de cântărire din sticlă sau aluminiu cu capac. Înainte de întrebuințare se face uscarea la etuvă până la greutate constantă și se păstrează în exicator;
exicator cu capac și substanță hidro-absorbantă;
etuvă electrică;
nisip de mare;
tăvițe emailate;
lingurițe, spatule, baghete de sticlă
Modul de lucru
Se numerotează fiolele, după care se cântăresc (tarează), notându-se tara fiecărei fiole. Când se folosește și nisip, tava include și nisipul, ca și bagheta de sticlă. În fiecare fiolă se introduc 5 g de produs tocat și omogenizat. Dacă se folosește nisipul, acesta se amestecă cu ajutorul baghetei pentru a îngloba cât se poate de uniform întreaga cantitate de produs. Nisipul se folosește la produsele fluide sau la cele sub formă de pastă, pentru a mări suprafața de evaporare, iar cantitatea de nisip va fi de circa 4 ori mai mare decât cantitatea produsului introdus în fiolă.
Se cântărește fiola cu produs și din cantitatea respectivă, scăznd tara, se află cantitatea exactă luată în lucru.
După cântărire, fiolele respective se introduc în etuvă, reglată în prealabil la temperatura de 103±2ºC. Timpul de expunere este condiționat de conținutul probabil de apă și de natura produsului introdus în fiolă (cuprins între 4 și 16 ore), cu excepția grăsimilor topite, unde timpul de expunere va fi de două ore și jumătate, deoarece expunerea îndelungată poate favoriza oxidarea grăsimii, deci câștig în greutate prin adiționarea oxigenului.
După epuizarea timpului stabilit, se scot fiolele din etuvă și se introduc în exicator. Se lasă să se răcească după care fiecare fiolă se cântărește, notându-se greutatea.
Se introduc din nou fiolele la etuvă și se mențin1/2-1 oră, după care se scot în exicator și se cântăresc. Se repetă aceste operații, până la greutate constantă. Pentru majoritatea produselor se consideră greutate constantă atunci când între două cântăriri succesive nu este o diferență mai mare de 0,005 g.
Calculul rezultatelor
Apă, % = , în care:
m = tara fiolei + produsul înainte de uscare;
m1 = tara fiolei + produsul după uscare;
m2 = cantitatea de probă luată în calcul.
Interpretare
brânzeturile cu pastă tare conțin între 42-55% apă
brânzeturile cu pasta moale conțin înte 55-80% apă.
D.4.1.2. Determinarea cantității de grăsime se determină prin:
extracție etero-clorhidircă în caz de litigiu
metoda acid-butirometrică, folosind butiromterul van Gulik sau butiromterul de lapte
Metoda acido-hetirometrică
Principiu
Constă în separarea grăsimii în butirometru prin centrifugare în prezența alcoolului amilic, după arderea prealabilă a ubstanței proteice cu acid sulfuric.
Aparatură și reactivi
butirometrul van Gulik;
centrifugă (turația 800-1200 rot/min);
pipetă cu bula de 10 ml (pentru acid sulfuric) și pipetă de 1 ml (pentru alcool amilic);
acid sulfuric, D = 1,520;
alcool amilic, D = 0,820.
Mod de lucru
Din proba de brânză bine mărunțită, se pun în păhărelul butirometrului 3 g. păhărelul bine fixat la dopul de cauciuc s eintroduce la partea inferioară a butirometrului.
Pe la partea superioară a butirometrului se introduce acid sulfuric până ce acoperă în întregime păhărelul cu brânză. Butirometrul se introduce în baia de apă la 65-70ºC, unde se menține până la descompunerea brânzei. Pentru a se grăbi arderea substanței proteice se agită din când în când, având grijă să nu ajungă particule de brânză în tija butirometrului.
După completa ardere a substanțelor proteice se introduce 1 ml alcool amilic și se completează cu acid sulfuric până la diviziunea 35. Se introduce butirometrul în baia de apă caldă, se agită prin răsturnare de câteva ori și se centrifughează 5 minute la 1000-1200 turații/minut. După centrifugare se introduce butirometrul din nou în baia de apă la 65-70ºC pentru 5 minute, după care se citește pe tija butirometrului numărul diviziunilor ocupate de coloana de grăsime.
Cantitatea de grăsime din brânză raportată la substanța uscată și exprimată procentual se calculează cu formula:
% grăsime în substanța uscată = , în care:
G = conținutul în grăsime determinat cu butirometrul (%)
A = conținutul în apă al produsului (%).
Interpretare
În funcție de tipul de brânzeturi, acestea pot conține grăsime (în S.U.) până la 60%.
D.4.1.3. Determinarea clorurii de sodiu
Principii
Precipitarea clorurilor din brânzeturi cu azotat de argint în prezența cromatului de potasiu (ca indicator).
Reactivi
azotat de argint, soluție 0,1N;
cromat de potasiu, soluția 10%.
Mod delucru
Într-un mojar se introduc 5 g de brânză care se mojareazăîmpreună cu 100 ml apă distilată (60-65ºC), până se obține o suspensie omogenă. Proba se lasă 10-15 minute în repaus, amestecând din când în când, după care se conținutul mojarului se filtrează prin hârtie de filtru, într-un balon Erlenmayer.
Din extractul apos filtrat se măsoară 10 ml într-un vas Erlenmayer (de 100 ml), se adaugă câteva picături de cromat de potasiu și se titrează cu azotat de argint, soluție de 0,1N sub agitare continuă. Punctul final al titrării se consideră momentul în care culoare virează brusc din galben deschis în portocaliu persistent. Din acset moment o picătură de azotat de argint în exces determină virarea culorii în cărămiziu roșcat.
Calculul rezultatelor
Se face cu formula:
Clorura de sodiu, % = , în care:
0,00585 = cantitatea de clorură de sodiu, ăn g, echivalentă la 1 ml azotat de argint, soluție 0,1N
V = volumul soluției de azotat de argint 0,1N, în ml, folosit la titrare;
10 = raportul între volumul total al extractului apos (100 ml) și volumul de extract luat pentru analiză (10 ml)
m = masa probei în g, luată pentru analiză
D.5. Examenul microbiologic
D.5.1. Pregătirea probelor
Din proba de analizat se cântăresc cu precizie 10 g produs, într-un mojar steril. Se omogenizează proba, adăug-nd 90 ml soluție de citrat de sodiu 2%, sterilă, ca diluant, încălzită în prealabil la 47±1ºC, realizându-se astfel o suspensie omogenă, care reprezintă diluția 1/10.
D.5.2. Determinarea numărului de bacterii cazeolitice (STAS 6349-71)
Bacteriile cazeolitice produc hidroliza cazeinei, iar determinarea numărului lor dă indicații asupra conservării produselor.
D.5.2.1. Materiale și mediu nutritiv
cutii Petri sterile, cu diametrul de 10 cm;
pipete gradate, sterile, de 1 cm3 și 10 cm3;
mediu nutritiv: triptonă – extract de drojdie – glucoză – agar, cu lapte degresat steril.
Incubarea
Cutiile Petri cu mediul însămânțat, se incubează la temperatura de 22-25ºC timp de 5 zile. În lipsă de termostat reglabil, incubarea se face la temperatura camerei timp de 3 zile.
D.5.2.2. Numărul caloriilor
Mediul din fiecare cutie Petri se acoperă cu un strat subțire de acid acetic 1% sau acid clorhidric 1% pentru câteva minute. Caloriile proteolitice produc în jurul lor o zonă clară care se intensifică la adăugarea acidului.
Se numără caloriile având în jurul lor zona clară, luându-se în considerare numai cutiile Petri în care au crescut pe mediu 15 … 60 colonii.
D.5.3. Determinarea numărului de drojdii și mucegaiuri
Numărul de drojdii și mucegaiuri indică condițiile igienico-sanitare în timpul procesului de producție și în decursul păstrării produselor și permite aprecierea conservabilității acestora.
D.5.3.1. Materiale și mediu nutritiv
cutii Petri sterile, cu diametrul de 10 cm;
pipete gradate, sterile, de 1 cm3 și 10 cm3;
mediu nutritivagar-malț sau agar-glucoză-cartof.
D.5.3.2. Însămânțarea
Se face ca la A.5.3.3.
D.5.3.3. Incubarea
Cutiile Petri cu mediul însămânțat se țin la temperatura camerei timp de 5 zile.
D.5.3.4. Numărul coloniilor
Se face ca la punctul A.5.3.5., numărându-se separat coloniile de drojdie și separat cele de mucegaiuri.
D.5.4. Defectele brânzeturilor
Defectele care pot apărea la brânzeturi se datoresc:
calității necorespunzătoare a laptelui din cauza infectării laptelui cu microorganisme dăunătoare, datorită unor nutrețuri sau din cauza stării de sănătate a animalului;
nerespectării tehnologiei de fabricație;
acțiunii unor dăunători (insecte, rozotoare).
Defectele ce se constată la brânzeturi pot fi clasificate după cum se prezintă mai jos:
Defectele de coajă
coajă prea groasă;
coajă cu crăpături care apare atunci când brânza este fabricată din lapte cu aciditate mare;
cancerul cojii, care este datorat infectării cojii brânzei cu bacterii de putrefacție;
infecatrea cojii cu mucegaiuri, care se dezvoltă bine când coaja are reacție neutră-alcalină;
coaja cu adâncituri;
parafina crăpată, desprinsă de coajă;
mucegai sub parafină.
Defectele de format
format neuniform, în cadrul aceleiași șarje de brânză, care este consecința folosirii de forme necorespunzătoare, a umplerii incorecte a formelor cu coagul și a presării neuniforme;
turtirea bucăților de brânză, consecința neîntoarcerii la timp a acestora și a conținutului ridicat de apă în brânză, în timpul maturării;
balonarea, care conduce la mărirea volumului: fețele inferioară și superioară se bombează, coaja poate crăpa, miezul se prezintă cu găuri de diferite mărimi.
Defectele de consistență se referă la:
pastă sfărâmicioasă, care apare atunci când aciditatea laptelui este ridicată sau atunci când s-a depășit aciditatea prescrisă în timpul prelucrării coagulului;
pastă cauciucoasă, care apare atunci când aciditatea brânzei este redusă, fapt ce influențează starea proteinelor;
pastă cu crăpături (pastă în straturi) apare din cauza acidității mari a laptelui;
pastă cu caverne – defectul se manifetsă sub formă de goluri mari în miez, inclusiv aproape de coajă
pastă tare, defect care se datorează presării puternice, brânza având un conținut redus de apă și o aciditate redusă;
pastă care curge, defect care apare l abrânzeturile moi și este cauzat de o autopresare executată la temperaturi scăzute.
Defecte de desen ale pastei se referă la brânzeturi tari și sunt:
brânza “oarbă” (fără desen) se datorează activității bacteriilor propionice;
desen prea bogat, apare la brânzeturile cu fermentație propionică;
desen neuniform, care este caracterizat prin repartizarea neuniformă a ochiurilor în masa brânzei și este însoțit de prezența pungilor de aer.
Defecte de gust și miros
gust acru, care se datorează folosirii unui lapte cu aciditate mare și reținerii în brânză a unei cantități mari de zer;
gust amar, care se datorează producerii de peptide amare de către unele bacterii lactice și enzime coagulante, în caz de adaosuri pre mari, inclusiv de către enzimele proteolitice elaborate de microflora psihotropă de infecție;
gust rânced-săpunos;
gust și miros amoniacal – apare în cazul brânzeturilor tari și se datorează dezvoltării la suprafața lor a bacteriilor alcalinogene care produc NH3 prin degradarea proteinelor;
gust de nutreț, se datorează folosirii unui lapte provenit de la vaci hrănite cu nutrețuri însilozate de proastă calitate;
gust prea sărat, se datorează sărării excesive a brânzeturilor.
Defecte de culoare care pot afecta atât coaja cât și miezul brânzeturilor și pot fi:
culoare cenușie-negricioasă, care poate fi cauzată de prezența fierului în lapte, folosirii unui lapte murdar;
culoare roșiatică se datorează dezvoltării la suprafața brânzeturilor cu crăpături a bacteriilor de tipul Bacterium casei fusei;
culoare albăstruie, întâlnită la brânzeturi moi (Romadour), care se datorează unui pigment secretat de unele bacterii cu activitate proteolitică.
Defectele provocate de insecte și rozătoare
musca brânzeturilor (Piophila casei) care depune pe suprafața brânzeturilro ouă, care s etransformă în larve ce pătrund în brânză, după care (4-6 zile) ies din brânză și se transformă în nimfă în locuri întunecoase, iar din nimfă (minimum 5 zile) apare musca;
căpușa brânzeturilor (Tygroglyphus farinae) care poate să trăiască la suprafața sau în interiorul cojii formând galerii. Aceste căpușe distrug coaja pe care o infestează și cu produse epidermice de năpârlire etc.
furnicile, care pot pătrunde în depozite, pot degrada brânzeturile, producând în special degradarea cojii;
rozătoarele, ce pot produce degradarea totală a brânzeturilro pe care le și pot consuma. Brânzeturile atacate de rozătoare sunt eliminate total din consum.
4.2. Consumul specific la fabricarea brânzeturilor
Consumul specific la brânzeturi (l lapte / kg brânză) este influențat de:
compoziția clinică a laptelui (în principal proteine și grăsime);
modul de aplicare a procesului tehnologic de fabricație;
pierderile de substanță uscată în zer (preteine, grăsime);
gradul de deshidratare al brânzei în timpul maturării și depozitării.
Consumul specific este bun dacă nivelul de proteine din lapte este de 3,3-3,4%, conținutul de substanță uscată negrasă > 8,5% și dacă aciditatea laptelui recepționat este normală. Pasteurizarea mărește randamentul în brânză cu aproximativ 4%. Creșterea pierderilor de proteine și grăsime în zer se datorează:
obținerii unui coagul moale datorită insuficienței de săruri de calciu în lapte, nerespectării regimului de coagulare (temperatură joasă, durată mare), folosire de cheag de calitate inferioară;
prelucrării necorespunzătoare a coagulului care conduce la “prfuirea” acestuia;
gradului de deshidratare al brânzei în timpul maturării și depozitării, care este mărit dacă temperatura de maturare / depozitare este mare și φ este mic.
Randamentul în brânză se determină cu relația:
R =
Consumul specific se determină cu relația:
Csp = , în care:
Cb = cantitatea de brânyă realiyată, în kg;
CL = cantitatea de alpte folosită la fabricarea brânyeturilor, în litri:
Consumul specific se poate calcula și cu relația:
Csp = , în care:
Gsub. = conținutul de grăsime în substanța uscată a brânyei, în %
A = conținutul de apă al brânzei, în %
C = coeficient de corecție – 1,036 pentru brânzeturi tari și semitari,
– 1,0 pentru brânzeturi moi
GZ = conținutul de grăsime în zer, în %
GLN = conținutul de grăsime în laptele normalizat, în %
P = coeficient privind pierderile de grăsimi, exprimat față de conținutul total de grăsime din lapte:
P = , unde:
p = 4,5 pentru brânzeturi tari și semitari;
p = 8 pentru brânzeturi moi;
p = 6 pentru brânză telemea.
Pentru calculul consumului specific l abrânya grasă de vacă se poate utiliya următoarea relație:
Csp = , unde:
GST = este conținutul de grăsime în substanța uscată, în %
1,0056 = coeficientul pierderilor în produs;
GL = grăsimea din lapte, în %;
GZ = grăsimea din zer, în %.
4 .3. Elaborarea instrucțiunilor de protecție a muncii și PSI
A.Organizarea locului de muncă
Mesele de laborator vor fi folosite numai pentru operații care nu produc degajări de substanțe nocive.lucrările cu substanțe nocive și acizi concentrați, sau lucrările în care se realizează încălzirea substanțelor toxice în mase deschise, trebuie efectuate numai sub nișă, al cărei tiraj se va controla în prealabil.
Mesele de lucru trebuie să rămână, la sfârșitul fiecărei zile de lucru curate, fără reactivi sau vase. Pe mese rămân numai aparatele montate care urmează să funcționeze în ziua următoare.
Fiecare reactiv trebuie pus numai în vase etichetate în prealabil. La primirea și folosirea substanțelor respective trebuie citite cu atenție etichetele.
B Manipularea sticlăriei
Înaintea începerii lucrărilor trebuie verificată calitatea sticlăriei care se va utiliza. Vasele care prezintă zgârieturi, crăpături bule de aer închise în masa sticlăriei, sau alte defecțiuni, vor fi restituite la magazie sau se vor folosi exclusiv pentru operații nepericuloase.
Spălarea vaselor se va face imediat după terminarea operației respectiv, cu lichide adecvate impurităților existente.
C. Manipularea aparatelor de laborator cu acțiune electrică
Instalațiile electrice vor fi explorate în așa fel încât să fie prevenite electrocutațiile, incendiile, aprinderile neprevăzute provocate de curenți de dispersie.
Se interzice conectarea aparatelor electrice dacă lipsește fișa; se interzice utilizarea conductorilor neizolați sau montați necorespunzător.
D. Manipularea substanțelor toxiceși caustice.
După folosire eterul, bromul, clorbenzenul anhidridaacetică clorurele acide și alte substanțe toxice nu se vor vărsa în chiuvete obișnuite. Se vor vărsa în vase speciale destinate acestui scop.
Toate manipulările cu gaze și vapori toxici se vor efectua sub nișă.
Acidul azotic concentrat se va manipula numai sub nișă. Se va evita contactul acidului cu substanțe organice, care se pot aprinde.
E. Măsuri de prevenire a incendiilor.
Să se fumeze numai în locurile fixate, în nici un caz în laboratoare. Țigările se vor arunca în scrumierele fixate acestui scop. Se interzice păstrarea lichidelor inflamabile în vase de plastic, deoarece din cauza încărcăturilor statice, se pot produce scântei care să aprindă lichidul
F. Măsuri de prim ajutor în caz de accidente.
În caz de electrocutare, dacă victima rămâne în atingere cu părțile conducătoare de curent, prima acțiune este deconectareapărții de instalații de care este prinsă victima; în toate cazurile de electrocutare se va chema medicul.
Arsurile provocate de acizi se vor spăla cu multă apă, apoi cu soluții de 5% de bicarbonat de sodiu. Arsurile provocate de alcooli se vor spăla cu multă apă, apoi se vor tampona cu vată îmbibată cu acid boric sau acid acetic diluat de 10 ori, apoi se spală cu apă. Pentru intoxicații acute se va chema medicul.
G. Condiții generale pentru luarea probelor din lapte ți produse lactate.
Luarea probelor trebuie efectuată de către persoane autorizate, cu pregătire tehnică și care nu suferă de maladiicontagioase. Luarea probelor pentru examenul microbiologic se ventricul stâng face de către persoane care cunosc tehnica luării probelor pentru microbiologie.
Fiecare probă trebuie sigilată ți prevăzută cu o etichetă pe care se va menționa:
denumirea produsului ;
numărul și codul de identificare a lotului din care a fost luată proba ;
data ;
numele și semnătura persoanelor autorizate care au luat probele ;
numărul procesului verbal ;
Probele prelevate în dublu. Una din ele este trimisă la laboratorul care va efectua analiza, iar cea de-a doua este păstrată la deținătorul produsului la o temperatură indicată până la obținerea rezultatului.
Probele trebuie să fie însoțite de un proces verbal întocmit și semnat de către persoanele care au luat proba și contrasemnat de reprezentanții tuturor părților interesate. În procesul verbal se menționează: locul, data și ora luării probelor; denumirea produsului; data fabricației; mărimea și numărul lotului; numărul probelor luate din lot ;numele și calitatea persoanelor care au luat probele; destinația probelor.
Ustensilele folosite pentru luarea probelor în vederea examenului senzorial și a analizelor fizice și chimice trebuie să fie curate, uscate și sterilizate.
Recipientele în care se introduc probele trebuie să fie confecționate dintr-un material impermeabil la apă și grăsimi, de preferință opac și să asigure păstrarea probelor fără să se producă modificări, care să influențeze rezultatele analizelor.
În cazul în care probele se introduc în recipiente transparente, acestea se păstrează la întuneric. Dopurile și capacele trebuie să fie impermeabile la apă și grăsimi și să nu modifice gustul , mirosul și aroma sau compoziția produsului. În cazul folosirii dopurilor de cauciuc, acestea trebuie să fie acoperite cu un material neabsorbant și inodor, înainte de închiderea recipientului cu proba.
Probele destinate analizei senzoriale, fizice și chimice pot fi păstrate cel mult 24 de ore. Probele destinate examenului microbiologic se pot păstra cel mult 6 ore.
În timpul transportului probelor trebuie luate măsuri pentru a se evita expunerea la lumina solară directă, la diferite mirosuri și trebuie să se asigure menținerea temperaturilor optime.
5. BIBLIOGRAFIE
CONSTANTIN BANU – “Procesarea industrială a laptelui”, Editura Tehnică, București 1998
REMUS RĂDULEȚ – “Lexiconul Tehnic Român” – vol. 12,15, Editura Tehnică, București 1958
ABDELKRIM AZZOUZ – “Tehnologie și utilaj în industria laptelui”, Editura Demiurg, Iași 2000
ALFA ALEXIA LUPEA – “Chimia și controlul alimentelor de origine animală”, Editura Politehnică, Timișoara 2000
CORNELIA ȘANDRU-COSTACHE – “Alimentele și analiza lor chimică”, Editura Medicală, București 1957
SAVU CONSTANTIN – “Controlul sanitar veterinar al alimentelor ”, Editura Ceres, București 1997
STAS-uri
GHEORGHE ILIESCU – “Caracteristici termofizice ale produselor alimentare”, Editura Tehnică, București 1982
I.F. DUMITRU – “Biochimie”, Editura Didactică și Pedagogică, București 1980
A. T. ANDREWS – “Electroforeza”, Editura Tehnică, București 1996
CONSTANTIN BANU – “Manualul inginerului în industria alimentară”, Editura Tehnică, București 1998, vol. I
Copyright Notice
© Licențiada.org respectă drepturile de proprietate intelectuală și așteaptă ca toți utilizatorii să facă același lucru. Dacă consideri că un conținut de pe site încalcă drepturile tale de autor, te rugăm să trimiți o notificare DMCA.
Acest articol: Proteinele Laptelui, Componente Esentiale Pentru Tehnologia Branzeturilor (ID: 155527)
Dacă considerați că acest conținut vă încalcă drepturile de autor, vă rugăm să depuneți o cerere pe pagina noastră Copyright Takedown.