Proprietatile Biofarmaceutice ale Bacteriocinelor

Proprietățile biofarmaceutice ale bacteriocinelor

Bacteriocinele cuprind molecule cu importanță biofarmaceutică datorită activității antimicrobiene pe care o manifestă, cu precădere împotriva unor tulpini patogene (de exemplu, Candida albicans, Bacillus cereus și/sau Staphylococcus aureus. Sunt sintetizate intracelular (la nivel ribozomal), dar prin mecanisme specifice sunt eliberate în mediul exterior. Studii recente au determinat că aceste molecule au proprietăți antibiotice, putând reprezenta o alternativă eficientă la utilizarea antibioticelor de sinteză, care determină apariția fenomenului de antibiorezistență. De asemenea, aceste efecte sunt exploatate în industria alimentară, putând înlocui parțial sau total conservații toxici, care sunt responsabili de inhibarea încărcăturii microbiene a unui produs. Aceste efecte au ca scop prelungirea duratei de viață a produselor în care sunt introduse.

Figura 1. Tulpină de Lactobacillus sp. la microscop

Tulpinile de bacterii lactice (Figura 1) produs pe lângă bacteriocine, o serie de alți compuși secundari, care au o acțiune semnificativă împotriva tulpinilor patogene. Principala grupă de compuși o reprezintă acizii organici (de exemplu, acid lactic, acid acetic) care scad pH. Bacteriocinele se încadează în grupa compușilor proteici, dar în final acțiunea se traduce, în final, prin inhibarea unor grupe largi de tulpini microbiene Gram pozitive și Gram negative. Efectul conservant manifestat prin creșterea perioadei de valabilitate este valabil, în general, pentru un consorțiu de tulpini lactice și mai rar prin acțiunea unei singure tulpini selecționate. Sinteza acestor compuși se face pe cale fermentativă.

Indiferent ce tulpini vor fi testate efectul inhibitoriu va reprezenta efectul combinat al mai multor metaboliți secundari sintetizați în mediu. Pentru efectul exercitat la nivel intestinal se adaugă și competiția față de situsurile de fixare care influențează capacitatea de colonizare și de remanență la nivel intestinal. Creșterea capacității de sinteză a acestor metaboliți secundari și creșterea numărului de celule viabile la nivel intestinal după încetarea administrării produsului (celule liofilizate de bacterii lactice – Figura 2) reprezintă creșterea capacității de reacție a organismului la prezența unor patogeni sau inhibarea acțiunii într-un produs alimentar. Ca o definiție generalistă, potențialul antimicrobian reprezintă suma acțiunilor diferiților compuși antimicrobieni pe care îi poate sintetiza într-un mediu definit în unitatea de timp. Toate acestea vor defini valoarea biologică a unei tulpini nou izolate și va reprezenta garanția unui efect cert în condițiile unei administrări in vivo.

Figura 2. Produs liofilizat PROBAC – bacterii lactice probiotice

În realitate, mulți factori fizico-chimici influențează în mod direct capacitatea de sinteză a tulpinilor producătoare de bacteriocine. Conform unor studii recente se consideră că spectrul de acțiune este mai redus decât al antibioticelor clasice. Cea mai eficientă modalitate este o activitate combinată sau stimulată de prezența unor compuși (molecule bioactive) care pot îmbunătății cantitatea de bacteriocină. În cazul prebioticelor, ar fi vorba și de o stimulare a multiplicării de biomă, care este direct proporțională cu cantitatea sintetizată și cu creșterea capacității inhibitorii. Pentru teste, in vitro, concentrația optimă de prebiotic (lactuloză, de exemplu) a determinat efectul maxim, manifestat prin prezența unui halou cu diametru aproximativ de 1.5 cm, după 24 de ore de incubare (Figura 3). Aceste rezultate au fost determinate împotriva unor tulpini cu potențial patogen, ca: Escherichia coli, Listeria innocua sau Bacillus cereus.

Figura 3. Efectul prebioticelor asupra sintezei de bacteriocine

(colonyQuant – schuett-biotec GmbH)

În cazul unei utilizări la scară industrială, sinteza de bacteriocine trebuie să parcurgă un proces de optimizare necesar eficientizării costurilor de producție. Maximizarea randamentului la nivel industrial se realizează, în primul rând, prin folosirea unor medii de cultură ieftine sau a unor stimulatori specifici. De asemenea, optimizarea implică și o etapă de modelare a parametrilor fermentativi care vor acționa direct asupra capacității de sinteză și, în mod secundar, asupra cantității de biomasă obținută.

Figura 4. Structura chimică a lantioninei

Un exemplu tipic de bacteriocină, este nizina, care exprimă o serie de proprietăți ce pot fi încadrate în categoria conservanților naturali, prin inhibarea genurilor Salmonella și/sau Listeria. Este sintetizată de către tulpini de Lactococcus lactis. Are o structură peptidică, utilizată cu precădere în industria laptelui, la obținerea produselor lactate fermentate. Conform standardelor actuale, se consideră că este degradată la nivelul intestinului subțire, pe cale enzimatică, fără efecte secundare asupra organismului uman. La ora actuală există mai multe forme, în funcție de compoziția chimică a polipeptidului și spectrul antimicrobian pe care îl exercită. Mediul ideal pentru sinteza și izolarea unor tulpini competitive îl reprezintă laptele și produsele adiacente, ce caracterizează cel mai bine efectul conservant pe care îl exercită.

Această moleculă obținută pe cale fermentativă conține în compoziția sa un aminoacid specific – lantionina (Figura 4) și face parte din grupa de molecule cu efect antimicrobian denumite lantibiotice. Din acest larg grup doar nizina este intens studiată și utilizată în scop alimentar, drept conservant alimentar. De asemenea, cercetări intense sunt realizate pentru a realiza în urma unor mutații induse molecule cu spectru și activitate nouă, determinându-se până acum o relație directă între structură și proprietățile pe care le exprimă.

În esență, acești compuși sunt competitivi, comparativ cu procesele industriale termice atât în industria alimentară cât și cea farmaceutică. Eliminarea acestor etape termice determină o scădere importantă a prețului final. Pe lângă nizină, sunt recunoscuți și alți compuși, cum ar fi: pediocina PA-1, lacticina 3147 și enterocina. Acești compuși au o importanță deoarece asigură o stabilitate microbiologică, în special cu importanță pentru industria alimentară. În industria farmaceutică trebuie stabilită o păstrare a integrității chimice a produsului în care sunt adăugate, deoarece este de presupus că pot exista modificări în lipsa unor studii clare.

În general, bacteriocinele sunt sintetizate și se împart în funcție de tipul bacterian care le sintetizează, după Yang și colab, 2014(CC-BY 3.0 Creative Commons License – https://creativecommons.org/licenses/by-sa/3.0/):

1. Bacteriocine sintetizate de către bacterii Gram negative.

Colicinele reprezintă compuși antimicrobieni care acționează asupra unor specii din același gen bacterian. Rolul lor este de a ajuta la folosirea unor nutrienți și situsurilor de fixare. Tulpina care le sintetizează produce concomitent anumite molecule proteice ce inactivează colicinele eliberate în mediu. Genele care codifică acesși compuși proteici sunt prezente la nivel plasmidial. Modul de acțiune se manifestă prin trei căi, toate ducând, în final, la moarte celulară:

Formarea de canale care schimbă echilibrul ionic, prin pierderea unor ioni esențiali;

Conțin gene de sinteză a unor enzime ce vor dezintegra DNA și RNA;

Conțin proteine care digeră precursorul peptinoglicanul.

Microcinele sunt sintetizate la nivel ribozomal, având o greutate mai mică de 10 kDa.

Sunt produse sub forma a unor molecule precursor, în principal de către Enterobacteriaceae. Acesți compuși au o rezistență la temperaturi ridicate, pH extrem și proteaze. Mecanismele de acțiune sunt similare cu cele ale colicinelor. Se împarte în funcție de masa moleculară în:

Clasa I cu masa moleculară mai mică de 5 kDa;

Clasa II cu masa moleculară cuprinsă între 5 – 10 kDa. Aceste pot avea două subclase: IIa și IIb.

2. Bacteriocine sintetizate de către bacterii Gram pozitive.

Acești compuși sunt similari microcinelor și sunt produse, majoritar, de către tulpini de bacterii lactice. Acestea diferă din punct de vedere a greutății moleculare, structurii chimice sau spectrul de acțiune antimicrobian. În general, se acceptă că sunt împărțite în următoarele clase:

Clasa I: are o greutate moleculară mică, sub 5 kDa. Acestea conțin lantibiotice, β metillantionina și alți aminoacizi;

Clasa II: are o greutate moleculară medie, sub 10 kDa. Se împart în:

Clasa IIa cu o secvență fixă în regiunea N terminală (cornobacteriocina X);

Clasa IIb ce conțin două peptide diferite pentru formarea unui complex activ (lactacina F);

Clasa IIc ce sunt peptide circulare (cornociclina A);

Clasa IId sunt bacteriocine liniare (lactococina O);

Clasa IIe sunt bacteriocine neribozomale (microcina E492) bogate în serină în regiunea carboxi terminală.

Clasa III: are o greutate moleculară mare, peste 30 kDa. Sunt compuși proteici instabili la temperatură. Aceste bacteriocine se împart în:

Clasa IIIa care sunt enzime bacteriolitice ce lizează celulele sensibile (enterolizina A);

Clasa IIIb sunt proteine nelitice (cazeicina 80).

Pe lângă potențialul antimicrobian cunoscut, cercetările recente au evidențiat și o

semnificativă importanță în domeniul farmaceutic, în sensul inhibării proliferării celulelor canceroase maligne. Până în acest moment s-a demonstrat prin teste in vitro, asupra unor linii celulare, o inhibare a multiplicării. S-a remarcat faptul că o serie de compuși peptidici sintetizați de către Escherichia coli au capacitatea de a inhiba cancerul colorectal. De asemenea, bacteriile probiotice cu capacitate de a sintetiza bacteriocine previn apariția tumorilor canceroase la nivel intestinal. Mecanismul de acțiune nu este pe deplin elucidat, dar presupune o acțiune combinată a mai multot factori, care nu sunt neapărat comparabili din punct de vedere al acțiunii biologice. De aici, se înțelege că proprietățile probiotice ale tulpinilor utilizate sunt un factor obligatoriu în acțiunea anticanceroasă. Extrapolarea rezultatelor in vitro la o acțiune directă, in vivo, sunt greu de cuantificat. Rezultatele depind de structura microbiologică a microbiotei, de medicația fiecărei persoane la un moment dat, dar și de rezistența la tranzitul gastrointestinal.

Figura 5. Bioscreen C MBR

Metodele cele mai simple de evidențiere a efectului inhibitoriu îl reprezintă testele de inhibare pe mediu agarizat. Aceste cercetări determină efectul avut prin modificarea pH, ceea ce va determina limitele și produsele care pot fi protejate microbiologic cu aceste molecule proteice. Se pot determina bacteriocinele care sunt compatibile și dacă acidul lactic are un rol direct în exprimarea acestor proprietăți antimicrobiene. De asemenea, conform acelorași studii (Vijayakumar și Muriana, 2015; (Creative Commons Attribution License (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/)) se urmărește o corelare a momentului sintezei și a efectului exprimat, cu producția de biomasă. Pentru astfel de studii de corelare sunt necesare echipamente de laborator sofisticate (de exemplu, Bioscreen C MBR – Figura 5) care urmăresc productivitatea celulară în timp real. Acest sistem de monitorizare in vitro a proliferării microbiene este adaptat pentru a lucra cu cantități mici de mediu, dar doar pentru tulpinile ce tulbură omogen mediul de cultură. Se pretează produselor aflate sub formă de pulbere (liofilizată sau atomizată), adăugat în mediul de cultură ca un component suplimentar, termosensibil.

S-a determinat că o combinare a bacteriocinelor cu uleiuri esențiale reprezintă un mijloc eficient de combatere a tulpinilor patogene de Listeria monocytogenes și Salmonella enterica. Compatibilitate ridicată s-a observat și în combinarea bacteriocinelor cu extracte vegetale din plante medicinale, inhibiția realizându-se și datorită componentei fenolice din aceste produse. Din acest motiv, utilizarea drept antibiotice naturale a căpătat un interes major în ultima perioadă (enterocina AS-48). Fiind o bacteriocină circulare ea este un model de adaptare structurală și potențare a activității antimicrobiene în industria alimentară și farmaceutică. Interesul major pe care îl exercită este în cel biomedical, care împreună cu alți compuși naturali, pot manifesta un spectru antimicrobian larg. Activitatea maximă manifestată este la temperaturi ce nu depășesc cu mult 400C, dar studiile ulterioare vor trebui axate pe găsirea unor modalități de stabilizare și la temperaturi mari.

Bibliografie selectivă.

1. R.H. Perez, T. Zendo, K. Sonomoto, 2014, Novel bacteriocins from lactic acid bacteria (LAB): various structures and applications, Microbial Cell Factories, 13, S3.

2. https://ro.wikipedia.org

3. P. Saranraj, M.A. Naidu, P. Sivasakthivelan, 2013, Lactic acid bacteria and its antimicrobial properties: A Review, International Journal of Pharmaceutical & Biological Archives, 4, 6, 1124 – 1133.

4. P. Rattanachaikunsopon, P. Phumkhachorn, 2010, Lactic acid bacteria: their antimicrobial compounds and their uses in food production, Annals of Biological Research, 1, 4, 218-228.

5. M.A. Yusuf, 2013, Lactic Acid Bacteria:Bacteriocin Producer: A Mini Review, IOSR Journal Of Pharmacy, 3,4, 44-50.

6. E. Vamanu, 2011, Inhibiting Potential of the bacteriocine produced by Enterococcus faecium VL47 strain in the presence of prebiotics, International Journal of Dairy Science, 6, 6, 314-322.

7. A.M. Embaby, Y. Heshmat, A. Hussein, H.S. Marey, 2014, A sequential statistical approach towards an optimized production of a broad spectrum bacteriocin substance from a soil bacterium Bacillus sp. YAS 1 strain. The Scientific World Journal, vol. 2014, Article ID 396304.

8. http://www.food-info.net

9. L.G. Stoyanova, T.D. Sul’timova, S.G. Botina, A.I. Netrusov, 2006, Isolation and identification of new nisin-producing Lactococcus lactis subsp. lactis from milk, Applied Biochemistry and Microbiology, 42, 5, 492-499.

10. https://en.wikipedia.org/wiki/Lanthionine

11. J.N. Hansen, 1994, Nisin as a model food preservative, Critical Reviews in Food Science and Nutrition, 34, 1, 69-93.

12. A. Sobrino-López, O. Martín-Belloso, 2008, Use of nisin and other bacteriocins for preservation of dairy products, International Dairy Journal, 18, 4, 329–343.

13. S.C. Yang, C.H. Lin, C.T. Sung, J.Y. Fang, 2014, Antibacterial activities of bacteriocins: application in foods and pharmaceuticals, Frontiers in Microbiology, 5, Article 241.

14. P.P. Vijayakumar, P.M. Muriana, 2015, A microplate growth inhibition assay for screening bacteriocins against Listeria monocytogenes to differentiate their mode-of-action, Biomolecules, 5, 1178-1194.

15. M.J.G. Burgos, R.P. Pulido, M. del Carmen López Aguayo, A. Gálvez, R. Lucas, 2014, The cyclic antibacterial peptide enterocin AS-48: isolation, mode of action, and possible food applications, International Journal of Molecular Science, 15, 12, 22706-22727.