Proiectarea Unei Instalatii de Imobilizare a Peroxidazei din Hrean In Alcool Polivinilic

Cap.1. TEMA PROIECTULUI

Să se proiecteze o instalație de imobilizare a peroxidazei din hrean în alcool polivinilic.

Capacitatea coloanei: 55 kg/șarjă.

OBIECTIVE

Studiul imobilizării fizice și chimice a enzimelor

Elemente de proiectare a instalației

Studiul condițiilor de precipitare a soluției de alcool polivinilic

1.1.Prezentarea produsului

Denumirea produsului

Peroxidază din hrean imobilizată prin includere în alcool polivinilic.

Proprietăți fizice

Culoare albă

Formă sferică

Aspect lucios ( în stare umedă )

Aspect poros ( în stare uscată )

Proprietăți chimice

Peroxidazele alături de catalaze fac parte din subclasa 1.11 .Peroxidazele

sunt hemoproteine care utilizează apa oxigenată în calitate de oxidant și diferiți donori de hidrogen: clorura, iodura, palmitatul, NAD, NADH [1].

Masa moleculară: 34000D [1]

pH izoelectric: 7.2 [1]

pH optim de extracție: 5-6 [1]

Temperatura optimă de acțiune variază cu metoda fizico-chimică de determinare a vitezei, cu volumul și conținutul amestecului de reacție în funcție de viteza de instaurare a procesului de denaturare. Pentru peroxidază se preferă domeniul 0până la temperatura camerei pentru a preveni procesele de denaturare și autoliză[1].

În urma reacției dintre enzimă și apa oxigenată se formează trei complexe, care au proprietăți spectrele diferite:

complexul I de culoare verde

complexul II de culoare roz

complexul III de culoare roșie

Complexul I și complexul II sunt active din punct de vedere catalitic, complexul III este inactiv catalitic.

Maximele de absorbție a celor trei complexe sunt[1]:

Compoziția în aminoacizi a enzimei[1]:

Cap.2.STUDIU DE LITERATURĂ

2.1.Caracteristici generale ale HRP (horse-radish-peroxidation)

Sumar despre structură, mecanism și diversitatea substraturilor

Peroxidaza din hrean HRP, este o peroxidază hemoarhetipică. Este o glicoproteină globulară cu masa 42000D, din care miezul proteic: 34000D, restul greutății moleculare fiind reprezentat de gruparea prostetică (hemul), 2 ioni de calciu și glicani periferice.

Structura HRP include 2 domenii similare bine definite în cadrul apoproteinei. Fiecare domeniu conține ioni de Ca2+, care furnizează stabilitate structurii și controlează direct activitatea enzimei. Cele 2 domenii furnizează de asemenea hidrofobicitate pentru hem. O histidină ocupă poziția a cincea de coordinare a fierului. Această situație este similară cu cea întălnită la hemoglobină și mioglobină, deci această histidină este numită histidină proximală și domeniul proteic în care este situată este denumit domeniu proximal. Celălalt domeniu este denumit în analogie domeniu distal și conține o histidină necoordinată – histidină distală.

Mecanismul general de acțiune

HRP I – Complexul I

HRP II – Complexul II

AH – substratul reducător

Primul pas îl constituie descompunerea apei oxigenate. Un oxigen părăsește complexul sub formă de apă, în timp ce celălalt este reținut de gruparea ferică. Compusul I se formează prin 2 oxidări echivalente ale HRP în stare nativă. Una dintre aceste oxidări are loc la gruparea ferică, iar cealaltă la porfirină. Astfel porfirina este acceptată într-o stare de cation radicalic. Compusul I acceptă un electron de la substratul AH, formând Compusull II, care se află într-o stare de oxidare superioară enzimei în stare nativă. Compusul II acceptă un electron de la al doilea substrat generând enzima în stare nativă.

Structura peroxidazei din hrean

În continuare histidina proximală este deprotonată, ceea ce înseamnă un exces de sarcini negative în zona proximală, în timp ce 2 sarcini pozitive se găsesc în zona distală. Ca o consecință a acestei situații sarcina negativă se deplasează de la zona proximală la cea distală. Acest mecanism este numit „push-pull” pentru că histidina proximală „împinge” electronul spre porțiunea distală în timp ce H42 și R38 îl atrag.

Două etape ale formării complexului I au fost determinate experimental și parametrii lor termodinamici au fost calculați. Mecanisme similare erau deja cunoscute la unele sisteme model porfirinice. În orice caz studii recente ale dinamicii moleculare sugerează existența a cel puțin 2 mecanisme diferite, dependente de starea de protonare a H42. Cei 2 atomi de oxigen își schmbă rapid locurile dacă H42 este protonată, în opoziție cu situația când histidina distală este neutră, ceea ce permite o ancorare mai fermă a ligandului peroxidic la legătura de hidrogen dintre atomul de oxigen legat de fier și histidină.

Cum este de așteptat modificarea rezultă din scăderea semnificativă a afinității pentru apa oxigenată, ca și a vitezei de reacție. O parte din activitate este cunoscută de H42E modificată, în timp ce derivații imidazolici exogeni permit ca altă parte a activității să fie câștigată pentru H42A. De aceea se crede că histidina distală, dar nu poziția ei este esențială pentru activitatea catalitică. Pe de altă parte R38 nu pare să fie esențial pentru formarea Compusul I, deși mărește semnificativ afinitatea pentru apa oxigenată și viteza de reacție. Datorită rolului important jucat de R38 în clivarea legăturii O-O, este de înțeles de ce nici un astfel de rest nu este prezent în hemul cu oxigen, cu proteine legate, de aceea activitatea acestor peroxidaze e mai mică decât HRP.

Un alt element structural important este rețeaua legăturilor de hidrogen, care cuprinde în această ordine: – His42; -Asn70 și –Glu64; care mai încolo este de asemenea coordinată de calciul distal. Modificarea Asn induce reorientarea histidinei distale, pierderea legăturii de hidrogen a H42; H70, pierderea calciului.

Radicalul cationic porfirinic apare în aproape toate peroxidazele (de asemenea și în catalază și în sisteme cu model porfirinic). Excepții sunt peroxidazel citocromului C (Cc, P), peroxidaza tiroidică și lacoperoxidazele (toate peroxidazele care au radicalul cationic centrat într-un rest de aminoacid aromatic), izoenzima C2 a peroxidazei din germenii de grâu Mn-HRP I unde radicalul cationic e localizat pe un rest neidentificat cand este utilizat m-cloro-peroxobenzoatul, dar nu și când este utilizată apa oxigenată, și peroxidaza citocromului C551 și respectiv C550 din Pseudomonas aeruginossa și Paracoccus denitrificaus (care utilizează o a doua grupare hemică).

Forma modificată a F221W a HRP oferă posibilitatea delocalizării radicalice pe triptofan ca și în Cc. Într-adevăr, deși forma mutantă formează Compusul I cu o viteză identică cu a enzimei în stare nativă, transferul caracterului cationic urmează imediat aceasta trecere de la porfirină la triptofan. Oricum, aceasta nu afectează viteza reacției peroxidazei cu substratul tipic. Rezultate similare au fost obținute când tirozina a fost folosită în loc de triptofan.

Compusul II poate exista în două stări, pH – dependente. Forma bazică este mai puțin reactivă, în timp ce forma acidă este de spin jos, reactivă și instabilă. Semnificativ este că studii RR arată că histidina distală este deprotonată în intervalul de pH acid al Compusul II.

HRP I este ușor convertită în HRP II, utilizând reacții de lumină albă cu intensitate scăzută, la temperatură joasă. La temperatura camerei poate apărea și Compusul II descompus. S-a demonstrat că Compușii II și I sunt mai asemănătoare din punct de vedere structural, decât Compusul II cu celelalte stări. Dupa Compușii I și II, al treilea intermediar al HRP-ului este Compusul III – oxiperoxidaza. CompusulII este format cu Exces de apă oxigenată, sau prin tratament cu superoxizi; sau prin tratamentul feroHRP-ului cu oxigen. Compusul III trece încet în Complexul I și este mult mai puțin reactiv decât ceilalți 2 compuși. Se acceptă faptul că, Compusul III este un hibrid (de rezonanță), între Fe (II)-O2 și Fe(III)-O2.Când este produs prin tratarea HRP cu exces de apă oxigenată ,Compusul II trece prin 2 stări diferite.Formarea unei specii inactive(P670 șiP630) și cu o viteză mai mică, trece în stare inactivă a HRP-ului.

Formarea Compusului III implică în primul rând complexul Fe(III)-superoxid, care reacționează cu o a doua moleculă de apă oxigenată producând Compusul III.Unele resturi de aminoacizi din proteină sunt și ele oxidate în timpul acestor procese.

Compusul X (sau XII) și XI joacă un rol important în clorurarea catalizată în HRP. Mai târziu s-a arătat că ei sunt identici cu Compușii I și II (așa că etapa de clorurare are loc noncatalitic). [2]

2.2.Domenii de utilizare a peroxidazei

INDUSTRIA ALIMENTARĂ

Peroxidaza a fost introdusă în produsele de lapte fermentat, acțiunea ei asupra bacteriilor saprofite având efecte benefice în ceea ce privește calitatea la depozitare.Peroxidaza a fost introdusă în aluaturi și este folosită de asemenea în tratarea produselor cerealiere.Enzima a fost introdusă în preparatele de lapte praf.

INDUSTRIA POLIMERILOR

Prepararea de rășini fenolice cu ajutorul peroxidazei oferă o serie de avantaje: nu se folosește formaldehida în procesul de fabricație, condiții de lucru mult mai blânde, posibilitatea controlului proprietăților produsului prin alegerea mediului de reacție.

INDUSTRIA TEXTILĂ

Peroxidaza este folosită ca agent de înălbire și vopsire ( vopsirea fibrelor cheratinice se poate realiza cu derivați indolici în prezenșa peroxidazei, cu derivați aminici și fenoli aromatici ). În plus ea poate fi folosită și în prelucrarea lânii.

INDUSTRIA CELULOZEI ȘI HÂRTIEI

Peroxidaza poate fi folosită pentru înalbirea sau delignifierea lemnului, dar și pentru îndepărtarea cernelurilor de pe hârtia seciclată.

APLICAȚII ÎN ECOLOGIE

Purificarea apelor de amine aromatice și fenoli dar și de compuși alifatici se poate face prin tretarea cu peroxidază, compușii organici suferind reacțiide polimerizare, cue îi transformă în materiale insolubile.Peroxidaza poate fi folosită la purificarea solurilor cu fenoli clorurați. [5], [28].

2.3.Alcoolul polivinilic

Spre deosebire de ceilalți polimeri sintetici, alcoolul polivinilic se obține printr-o transformare polimer-analoagă, plecând de la poliacetatul de vinil asu poliformiatul de vinil. Dat fiind faptul că în cursul transformării acestora gradul de polimerizare practice nu variază, se deschid posibilități pentru o nouă serie de transformări în scopul obținerii unor produse valoroase.

Transformarea poliacetatului de vinil în alcool polivinilic s-a realizat pentru prima dată de către W.O.Herrmann și W.Haechel în anul 1924 prin introducerea pulberii de poliacetat intr-o soluție alcoolică de hidroxid de potasiu, la 20, sub agitare; după circa o oră se obține alcoolul polivinilic soluție în apă.[10], [11], [12]

În anul 1926 H.Stanginger arată, cu totul independent, faptul că prin saponificarea poliacetatului de vinil se realizează alcool polivinilic.[8]

În anul 1932 se descrie pentru prima dată obținerea acestui polimer prin tratarea esterilor săi în alcooli anhidrii (methanol, etanol, glicoli) cu cantități analitice de alcolați alcalini.[9]

În studiile menționate se arată că sistemul aflat în reacție trece printr-un stadiu de gel care se întărește prinsinereză, rezultând particule solide de alcooll polivinilic.

Fibrele dinsolubile de alcool polivinilic s-au fabricat pentru prima dată în Japonia în perioada 1939-1940.[13]

Alcoolul polivinilic se obține în present la scară industrială, prin saponificarea poliacetatului de vinil în soluție alcoolică. Saponificarea poate fi efectuată cu ajutorul acizilor:

sau alcaliilor:

La saponificarea cu alcalii, resturile de acid formează inițial esteri cu alcoolul solvent (în schema de mai sus se formează acetal de etil). Acești esteri se saponifică ulterior sub acțiunea alcaliilor, cu formarea de săruri (acetat), conform reacției:

CH3COOC2H5 + NaOH → CH3COONa + C2H5CH

Saponificarea poliacetatului de vinil se efectuează la cald și sub agitare intensă a soluției. Acizii și alcaliile se iau de obicei într-o propoli clorurați. [5], [28].

2.3.Alcoolul polivinilic

Spre deosebire de ceilalți polimeri sintetici, alcoolul polivinilic se obține printr-o transformare polimer-analoagă, plecând de la poliacetatul de vinil asu poliformiatul de vinil. Dat fiind faptul că în cursul transformării acestora gradul de polimerizare practice nu variază, se deschid posibilități pentru o nouă serie de transformări în scopul obținerii unor produse valoroase.

Transformarea poliacetatului de vinil în alcool polivinilic s-a realizat pentru prima dată de către W.O.Herrmann și W.Haechel în anul 1924 prin introducerea pulberii de poliacetat intr-o soluție alcoolică de hidroxid de potasiu, la 20, sub agitare; după circa o oră se obține alcoolul polivinilic soluție în apă.[10], [11], [12]

În anul 1926 H.Stanginger arată, cu totul independent, faptul că prin saponificarea poliacetatului de vinil se realizează alcool polivinilic.[8]

În anul 1932 se descrie pentru prima dată obținerea acestui polimer prin tratarea esterilor săi în alcooli anhidrii (methanol, etanol, glicoli) cu cantități analitice de alcolați alcalini.[9]

În studiile menționate se arată că sistemul aflat în reacție trece printr-un stadiu de gel care se întărește prinsinereză, rezultând particule solide de alcooll polivinilic.

Fibrele dinsolubile de alcool polivinilic s-au fabricat pentru prima dată în Japonia în perioada 1939-1940.[13]

Alcoolul polivinilic se obține în present la scară industrială, prin saponificarea poliacetatului de vinil în soluție alcoolică. Saponificarea poate fi efectuată cu ajutorul acizilor:

sau alcaliilor:

La saponificarea cu alcalii, resturile de acid formează inițial esteri cu alcoolul solvent (în schema de mai sus se formează acetal de etil). Acești esteri se saponifică ulterior sub acțiunea alcaliilor, cu formarea de săruri (acetat), conform reacției:

CH3COOC2H5 + NaOH → CH3COONa + C2H5CH

Saponificarea poliacetatului de vinil se efectuează la cald și sub agitare intensă a soluției. Acizii și alcaliile se iau de obicei într-o proporție mai mică decât echimolară. Pe măsură ce are loc saponificarea, polimerul își pierde solubilitatea în alcool și se precipită, în funcție de condițiile de reacție, sub formă de praf fin, de fire sau sub formă de gel. Precipitarea din soluție are loc la un grad de substituție de circa 60% a grupelor acetil prin grupe hidroxil. La continuarea încălzirii, procesul de saponificare se desfășoară eterogen, până la obținerea produsului aproape complet saponificat.

Acizii și alcaliile care se adaugă la saponificarea cu acizi sau cu alcalii îngreunează spălarea și stabilizarea alcoolului polivinilic format; afară de aceasta acizii sau alcalii reacționează cu alcoolul polivinilic, formând produși secundari. Tendința de a se elimina aceste dezavantaje a dus la elaborarea procesului de alcooliză catalitică, în prezența alcoolilor absoluți și a unor cantități reduse de alcaiil, conform schemei:

În acest scop, în soluția de poliacetat de vinil, de exemplu în alcool metilic absolut, se introduce metilat de sodiu (într-o proporție corespunzaătoare la 0,1-0,4% alcalii față de cantitatea necesară teoretic pentru saponificarea completă) și se efectuează reacția la temperatura camerei sau ~35oC; după câteva ore (6-24), alcoolul polivinilic se separă sub formă de cocoloașe amorfe, de fire sau de praf, în cazul când reacția s-a efectuat sub agitare.

Reglând cantitatea de catalizator (alcalii), cum și cantitatea de apă din alcool, se poate obține după un anumit interval de timp orice grad de saponificare. Alcoolul polivinilic obținut poate fi purificat mai ușor și este un produs mai stabil decâț cel obținut în cazul saponificării cu acizi. El poate fi purificat prin dizolvare în apă și prin precipitare într-un exces de acetonă. În locul metilalului de sodiu se pot utiliza hidroxizi alcalini anhidri, în special KOH.

În industrie se aplică în special saponificarea cu acizi și alcooliza catalitică cu alcalii.

Saponificarea cu acizi poate fi efectuată cu ajutorul unei serii de acizi: acid clorhidric, acid sulfuric, acid percloric etc. Natura acidului influentează foarte mutl caracteristicile polimerului.

Acidul clorhidric este puțin utilizat, deoarece cu el se obține un polimer colorat în galben (probabil din cauza formării unor produși de adiție instabili).

Cel mai ulilizat este acidul sulfuric. Cu el se obtin polimeri de culoare deschisă, sub formă de praf fin, care poate fi spălat și uscat cu ușurința. Îcazul utilizarii acidului sulfuric există însă dezavantajul formării de esteri acizi ai acidului sulfuric:

Acești esteri sunt instabili, iar la cald pun în libertate cu ușurinta acid sulfuric, care favorizează degradarea polimerului.

S-au propus și alți acizi (acidul fosforic, acidul percloric, acidul cloracetic), cu care, după cât se pare, nu se formează esteri instabili cu alcoolul polivinilic. Produsul obținut poate fi din această cauză mai stabil.

Viteza reacției de saponificare este determinată de concentrația ionilor hidrogeni în mediul de reacție și de temperatură. Este foarte important ca polimerul să se obțină sub formă de praf fin care să poată fi ușor separat și spălat. Gradul de dispersie și natura stării de agregare a polimerului precipitat sunt influentate de valoarea modulului mediului de reacție (raportul dintre cantitatea de polimer și cea de solvent) și de intensitatea agitării. Cu cât acest modul este mai mare și cu cât agitarea este mai intensă, cu atât gradul de dispersie al prafului este mai mare.

În cazul saponificării cu acid sulfuricse utilizează de exemplu următorul amestec de reacție (părți în greutate):

Poliacetat de vinil 20

Alcool 100

Acid sulfuric 1,0 – 2

Reacția se efectuează în reactorul emailat (sau într-un reactor de oțel/antiacid), prevăzut cu manta de abur, cu condensator cu reflux și cu agitator cu elice. Soluția de poliacetat de vinil și soluția alcoolică de acid sunt introduse prin câdere liberă din vasele de măsură (în greutate). Procesul are loc la temperatura de fierbere a amestecului alcoolic sau la o temperatură puțin mai joasă și durează 8020 ore (în funcție de temperatură și de cantitatea de acid sulfuric). După ce reacția s-a produs într-o măsură înaintată, produsul începe să se depună sub formă de suspensie fină. Reacția se continuă până la un conținut rezidual de grupe acetil în polimer de maximum 1,5-2,0%.

După terminarea reacției, alcoolul polivinilic precipitat se separă de soluția mamă în centrifugă, apoi se spală de mai multe ori cu alcool, în vasul de spălare, pentru îndepărtarea acidului sulfuric, a acetatului de etil și a celorlalți produși de reacție solubili. Pentru îmbunătățirea stabilității produsului, se recomandă ca spălarea să se facă cu soluții alcaline.

Praful spălat este trecut în uscătorul cu vid, cu rafturi, unde este uscat la 45-60oC.

Soluția mamă conține alcool, acetat de etil, acid sulfuric și acid acetic. Ea se supune recuperării și rectificării. Acetatul de etil poate fi saponificat cu alcalii, pentru regenerarea alcoolului.

Aceste operații se efectuează în cazanul de distilare și în coloana de rectificare, prevăzută cu deflegmator și legată cu condensator. Soluția de alcalii este introdusă în cazan din vasul de măsură. Alcoolul pur este trecut din recipient în colector. Alcoolul supus rectificării din vasul de colectare, este introdus în cazanul de distilare.

2.3.1.Considerații cinetice

Cinetica saponificării alkaline a poliacetatului de vinil a fost studiată de către W.O.Kenyon [11] și de I.Sakurada[14]. Primul a stability că viteza hidrolizei alkaline, nu este afactată de masa moleculară a poliacetatului de vinil și este de ordinul I față de concentrația acestuia și cea a hidroxidului:

V=k[PAcV][NaOH]

V-viteza de hidroliză

K -constanta vitezei de reacție de hidroliză

[PAcV]-concentrația inițială a poliacetatului de vinil

[NaOH]-concentrația hidroxidului.

I.Sakurada, [14] care a cercetat amănunțit transformarea poliacetatului în alcool polivinilic, publică încă în anul 1942 date privind acest proces, condus în metanol pur, în amestecuri metanol-apă, în etanol de 96% și amestec acetonă-apă.Studii ulterioare demonstrează că reacția de metanoliză a poliacetatului de vinil se supune ecuației reccțiilor de ordin I.

În literatură nu s-a indicat până în prezent o relație cinetică care să descrie transformarea poliacetatului de vinil în cazul în care metanoliza și saponificarea directă: au loc concomitent.

Caracterul autocatalitic al saponificării se explică prin ipoteza că pe măsură ce apar grupe hidroxilice pe catena polimerului, catalizatorul bazic sau acid se acumulează în zona acestora, conducând la o creștere locală a concentrației catalizatorului în vecinătatea imediată a grupelor acetilice nereacționate.

K.Fujii și colaboratorii [15] au constatat că viteza de hidroliză este puțin influențată de tacticitatea poliacetatului de vinil. Aceeași cercetători [16] stabilesc că efectul microstructurii devine sensibil numai atunci când lungimea secvențelor izotactice este mai mare decât o anumită lungime critică.

În anul 1966, scoala japoneză publică un studiu privind influența naturii bazei asupra vitezei de hidroliză; se constată astfel că constanta k crește în următoarea ordine: LiOH, NaOH, KOH, CsOH și că KOH imprimă cel mai pronunțat efect autocatalitic. [17]

W.Sliwka [18] s-a ocupat de cinetica saponificării într-un amestec metanol-apă.

Din analiza datelor din literatură privind cinetica saponificării poliacetatului de vinil se pot desprinde câteva observații:

atât alcooliza catalitică cât și saponificare cu hidroxizi alcalini pretintă un fenomen de autoaccelerare care este pus de unii cercetători pe seama efectului grupelor vecine, iar de alții pe pătrunderea lentă a ionilor OH- în „ ghemul „ macromolecular;

tacticitatea influențează viteza de saponificare în ceea ce privește factorul de autoaccelerare; acsta este mai mare la polimerii sindiotactici;

viteza de saponificare depinde de prezența sau absența unor compuși polari ce schimbă proprietățile mediului, respectiv aciditatea sau bazicitatea( mai ales apa). [14]

2.3.2.Structura și proprietățile alcoolului polivinilic

Proprietăți chimice

Alcoolul polivinilic, fiind un polimer care conține grupe alcoolice secundare echivalente, se caracterizează printr-o serie de reacții specifice alcoolilor secundari. Prin oxidare el formează grupe cetonice; el reactionează cu sodiul metalic, formând alcoolat de polivinil, din care se obțin eteri polivinilici, prin reacție cu halogenuri de alchili; el formează de asemenea esteri. Prin reacția alcoolului polivinilic cu aldehidele se obțin acetalii corespunzători.

Se poate observa ușor că alcoolul polivinilic se comportă în mare măsură în mod asemănător cu celuloza, care are de asemenea tendința spre reacții analoge, bazate pe reacția grupelor hidroxil primare și secundare cu acizii și cu alcoolii.

Alcoolul polivinilic are proprietatea de a da unele reacții putin caracteristice pentru compușii cu molecula mică și care sunt determinate de structura lui macromoleculară. Dintre aceste reacții ale alcoolului polivinilic fac parte în special reacțiile, de deshidratare, în legatură cu condițiile diferite de reacție ale grupelor lui funcționale. Astfel, S.N. Ușakov și R.K.Gavurina [10] au stabilit următoarele transformări la deshidratare:

1) formarea de grupe eterice interioare:

2) formarea de compuși nesaturați:

care se oxidează cu ușurință sub acțiunea oxigenului din aer; cu formare de peroxizi:

3) formarea de produși de ciclizare:

4) împânzirea catenelor:

Deshidratarea alcoolului polivinilic poate începe chiar la temperaturi de peste 100°C; procesul se accelerează în prezenta urmelor de acizi sau de alcalii. Deshidratarea provoacă modificarea profundă a proprietăților fizico-chimice ale alcoolului polivinilic, care se manifestă de obicei prin pierderea sau prin micșorarea solubilității în apă și prin creșterea fragilității și a rigidității, cum și prin ridicarea temperaturii de vitrifiere.

Catenele macromoleculare ale alcoolului polivinilic au aceeași structură ca și cele ale poliacetatului de vinil și anume în special structura 1,3 ("cap la coadă").

Cum s-a arătat mai sus, gradul de polimerizare al alcoolului polivinilic depinde practic de gradul de polimerizare al poliacetatului de vinil inițial. Totodatii s-a arătat ca în cursul proceselor de saponificare are loc totdeauna, deși într-o măsură redusă, scăderea vâscozității polimerului.

S-a arătat de asemenea că degradarea catenelor este cu atât mai intensă, cu cât temperarura de saponificare este mai înaltă și cu cât gradul de polimerilare al poliacelatului este mai mare. În cazul saponificării cu acizi, degradarea catenelor este mai puternică decât în cazul saponificării cu alcalii.

Se poate presupune că degradarea catenelor nu se produce pe seama legăturilor carbon-carbon (C-C) ale catenelor, ci prin ruperea legăturilor carbon-oxigen, mai putin slabile, conținute de asemenea, după cât se pare, într-un mic număr în polimer. S-a arătat că, după ruperea acestor legături, în procesul inițial, de saponificare a poliacetatului de vinil, reacțiile utlerioare de reacetilare și de saponificare secundara nu mai determină o scădlere apreciabilă a vâscozității polimerului.

Transformarea grupelor esterice ale poliacetatului de vinil în grupe hidroxil de alcool polivinilic mărește polaritatea polimerului, cum și fortele de atracție intermoleculară, determinate, după cum a arătat S. N. Jurkov de energia legăturilor de hidrogen dintre grupele hidroxil ale catenelor învecinate.

Datorită structurii lui chimice, alcoolul polivinilic este solubil în apă, în acizi (inclusiv în acid fosforic) în soluții apoase concentrate de alcooli polivalenți (glicerinii, glicol, dielilen-glicol etc.) și este insolubil în alcooli monovalenti, în cetone (acetona), cteri, esteri etc. Prin urmare, alcoolul polivinilic este unul dintre polimerii cei mai polari, mai hidrofili și mai solubili în apă.

Proprietăți fizice

Alcoolul polivinilic se prezintă sub formă de pulbere albă, cu ρ420 = 1,293, nu are gust și miros și este complet lipsit de toxicitate. El se caracterizează printr-o temperatură de vitrifiere ridicată (80°C) [9] și printr-o mare rezistență în stare neorientată, rezistența lui la tracțiune atinge 500-600 kgf/cm2; în cazul când este întins de 5-6 ori, rezistența lui crește la 4000-4 500 kgf/cm2.

Produsul tehnic conține totdeauna un mic numar de grupe ester reziduale (1-5%). În industrie se obțin însă polimeri speciali, cu un conținut mare (20% și mai mult) de grupe esteri (acetil). O dată cu creșterea conținutului de grupe ester, proprietățile polimerului variază foarte mult; la un conținut de 20% grupe ester, polimerul este solubil în apa rece, iar la un conținut de 50% insolubil chiar în apă caldă. Polimerii cu un conținut de 50-80% moli grupe acetil au, rata de alcoolul polivinilic, avantajul că sunt stabili la apa și în același limp au rezistenta mecanică și stabilitate termică mult mai mare decât poliacetatul de vinil. Prin urmare, pe baza produșilor de saponificare a esterilor polivinilici se pot obține atât alcool polivinilic, cât și o serie de polimeri cu un conținut variabil de grope acetal și hidroxil. Se pot obține polimeri conținând un anumit număr de grupe hidroxil laterale, alături de alte grupe, prin saponificarea copolimerilor acetatului de vinil cu alți compuși vinilici, de exemplu cu clorură de vinil, cu nitril acrilic ete.

După cât se pare, alcoolul polivinilic conține o cantitate variabila de fază crislalină (în stare întinsă, deasupra temperaturii de vitrifiere, peliculele de alcool polivinilic prezintă o rontgenogramă punctiformă, caracteristică fibrelor). Procesul de orientare favorizează la rândul lui procesele de cristalizare. Cristalitele elementare de alcool polivinilic sunt celule ortorombice, cu dimensiunile: a=7,82 Å; b=5,60 Å și c=2,52 Å (perioada de identitate).

Aspectul rontgenogramei alcoolului polivinilic și perioada lui de identitate de 2,52 Å indică o formă plană, în zig-zag, a catenelor carbonice, cu grupele glicolice în pozitia 1,3 situate în același plan ("cap la coadă").

2.3.3.Plastifierea și utilizarea alcoolului polivinilic

Alcoolul polivinilic se utilizează în special la obținerea acetalilor polivinilici; de asemenea, el se utilizează ca atare. Astfel, alcoolul polivinilic se utilizeaza în special la fabricarea produselor asemănătoare cu pielea și cu cauciucul, a furtunurilor și a garniturllor stabile la acțiunea benzinei, la fabricarea curelelor de transmisie, a fibrelor, a monofilamentelor (pentru scopuri medicinale), a pietrelor de polizat etc. Sub formă de coloid solubil în apă, el se utilizează ca emulgator (printre altele la efectuarea polimerizării în suspensie, în "perle"), ca adeziv, ca substanță pentru mărirea consistenței medicamentelor etc.[9], [10], [11], [12]

Ca mase plastice, se utillzează de obicei alcoolul polivinllic plastifiat.

Plastifianții folosiți în industrie la plastifierea alcoolului polivinilic pot fi împarțiți în:

1) plastifianti adevărați și

2) plastifianli indirecți

Alcoolul polivinilic este solubil în prima, însă în plastifianți indirecți nu se dizolvă în stare anhidra și se îmbibă foarte puțin; plastifianții indirecți sunt solubili în apă și în soluțiile apoase în

care alcoolul polivinilic sau se dizolvă, sau se îmbibă.

Din prima grupă de plastifianți face parte în primul rând apa.

Deși apa este aproape singurul solvent industrial al alcoolulul polivinilic, ea trebuie considerată de asemenea și ca un plastifiant al acestui alcool. Aceasta se explică prin faptul că produsele din alcool polivinillc conțin totdeauna cantități relativ mari de apă (corespunzător cu umiditatea relativă a aerului), care scad în măsură pronunțată temperatura de vitrifiere a polimerului. La introducerea altor plastifianți (nevolatili), se ține întdeauna seamă de conținutul de apă al polimerului care îmbunătățește de asemenea, în mare măsură compatibilitatea unui mare număr de plastifianți, cum și prelucrarea (plastifierea) produsului.

Se poate considera că tot din această grupă fac parte și diferiți acizi; totuși, după câtt se pare, nu a dobândit utilitate practică decât acidul fosforic deoarece el este greu volatil și nu provoacă esterificarea și degradarea polimerului. Experiența obținută la utilizarea adciului fosforic a arătat că acesta poate fi considerată ca unul dintre cei mai buni plastifianți tehnici ai alcoolulul polivinilic.

Din a doua grupă de plastifianți ai alcoolului polivinilic fac parte în primul rând alcoolii polivalenți – glicerina, glicolul, dietilen-glicolul, trietilen-glicolul și butilen-alcoolul. Tot din această grupă de plastiflanți fac parte unele amide ale acizlior (acetanilida) și amino-alcooli, cum sunt fenol-alcooli, dimetilol-urea etc.; tot acești plastifianți au o capacitate de gelifiere mai redusă.

Cei mai buni plastifianți ai alcoolului polivinillc pentru scopuri industriale sunt: glicerina, acidul fosforic, butilen-glicolul, amestecul de glicerină cu butilen-glicol și cu trietilen-glicol.

Ansamblul de proprietăți fizico-mecanice ale polimerului plastifiat este determinat în mare măsură de conținutul de plastifiant. Materialele cu un conținut de peste 65% moli plastifiant (plus umiditatea de echilibru) sunt elastoplasle tipice, iar într-o serie de cazuri ele pot fi utilizate în locul cauciucului; în cazul unuil conținut mai redus de plastifiant, se obțin materiale asemănătoare cu pielea.

Alcoolul polivinilic este practic perfect stabil la acțiunea hidrocarburilor alifatice și aromatice (benzina, benzen), fiind superior în această privință tuturor maselor plastice cunoscute. Din această cauză, el se utilizează, ca material asemănător cu cauciucul stabil la benzină, la fabricarea furtunurilor de benzină, a rezervoarelor de benzină etc:.

Alcoolul polivinilic plastifiat având rezistență mecanică mare, elasticitate și rezistență mare la uzură, se utilizează pe scara largă la fabricarea curelelor de transmisie a sacilor pentru presarea maselor plastice la presiuni joasă, a șnururilor, cum și a firelor pentru scopuri chirurgicale.

Se utilizează de asemenea fibre și țesuturi din alcool polivinilic. Fibrele se obțin trecând prin filtre o soluție apoasă de alcool polivinilic, într-o baie de precipitare (într-o soluție apoasă de sulfat de potasiu). Firele în stare umedă sunt supuse întinderii (300-400%), iar uneori (pentru reducerea solubilității în apă) sunt tratate timp de câteva minute cu aldehidă; în acest caz, pe suprafața firelor se formează acetatul respectiv. Țesăturile se pot obține fie numai din fibre de de alcool polivinilic, fie din fibre de alcoom polivinilic în în amestec cu fibre de alți polimeri. Ele se utilizează la filtrarea lichidelor nepolare etc.

Alcoolul polivinilic plastifiat care urmează a fi folosit la fabricarea peliculelor, a furtunurilor etc: se obține prin prelucrare pe valțuri de amestecare calde, pe care se trece alcool polivinilic îmbibat (maturat) în prealabil într-un amestec de plastifiant și apă.

Masa vălțuită se prelucrează, fie prin calandrare, obținându-se foi sau pelicule, fie prin extrudere, obținându-se furtunuri, tuburi sau bare. Prin extrudere se pot obține de asemenea pelicule; în acest scop, tubul care iese din filiera mașinii de extrudere se taie în direcție longitudinală, iar folia obținută se întinde concomitent într-una sau două direcții.

Peliculele se caracterizează prin rezistență și prin impermeabilitate la gaze. Ele au un coeficient de difuziune foarte mic față de difente gaze și se caracterizează printr-o mare stabilitate la acțiunea ozonului.

Un mare dezavantaj al maselor plastice din alcool polivinilic este solubilitatea lor în apă. S-au făcut încercari de a se elimina acest dezavantaj al alcoolului polivinilic, păstrându-se însă calitățile lui cele mai importante (în special stabilltatea la acțiunea benzinelor și a altor solvenți nepolari). În acest scop, suprafața obiectelor din alcool polivinillc se acoperă cu un lac protector sau se tratează chimic; se poate efectua de asemenea o transformare chimică profundă a întregii rnase, de exemplu prin limpezirea catenelor macromoleculare.

Acoperirea suprafeței obiectelor cu o peliculă protectoare de poliacetat de vlnil, de nitroceluloid etc., dă într-o serie de cazuri rezultate satisfăcătoare, dacă obiectele sunt supuse numai unei acțiuni temporare a umidități și dacă nu vin în contact cu solvenți nepolari.

Modificarea chimică a suprafeței sau trecerea întregii mase în stare insolubilă se pot efectua prin mai multe procedee: 1) prin tratarea chimică cu aldehide (de exemplu cu formaldehidă) a suprafeței obiectelor, cu transformare în acetalul respectiv; 2) prin încălzire la 150-160°C sau la temperaturi mai joase (110-130°C) în prezența urmelor de acizi, cel mai eficace fiind acidul fosforic în proporție de 1-5% (încălzirea în prezența acizilor provoacă proces de dezhidratare și trecerea polimerutul în stare insolubilă); 3) prin obținerea unor complecși insolubili cu unii compuși ai metalelor di- sau trivalente, în special cu soluții de săruri de bor, cu acid boric, cu săruri de crom (bicromati) și cu săruri cupro-amoniacale (chiar un conținut redus de acești compuși provoacă, sub acțiunea luminii sau la încâlzire, trecerea polimerului în stare insolubilă); 4) prin formarea unor structuri tridimensionale înpânzite cu ajutorul reacțiilor de sterificare, prin încălzirea alcoolului polivinilic cu acizi bibazici (oxalic, adipic, sebacic) sau cu dialdehide capabile să reacționeze cu două macromolecule învecinate de alcool polivinilic, conform schemei următoare:

Problema stabilității la apă a produselor din alcool polivinilic nu a fost însă rezolvată cu succes, deoarece noile procedeele propuse înrăutățesc în mare măsuri principalele caracteristici ale polimerului sau nu elimină îmbibarea acestuia în apă.

În concluzie trebuie să se menționeze și alte domenii, mai puțin importante, de utilizare a alcoolului polivinilic. Astlel, el se utilizează în industria textilă la încleierea țesăturilor, în industria produselor zaharoase la îmbunătățirea dospirii aluatului, la prepararea jeleurilor de fructe și a înghețatei, la fabricarea cașetelor farmaceutice, cum și ca medicament (impotriva bolii hipertonice). Alcoolul polivinilic se utilizează de asemenea în tipografie ca adaos la vopselele tipografice, cum și în fotografie la prepararea straturilor sensibile la lumină.[8], [9]

2.4.Metode de imobilizare a enzimelor

2.4.1. Definiția noțiuniide enzimă imobilizată

Prin enzimă imobilizată se înțelege catalizatorul heterogen obținut prin fixarea uneia sau a mai multor enzime, sau organitelor subcelulare și a celulelor întregi pe suporturi insolubile, cu păstrarea activități catalitice [4].

2.4.2.Aspecte generale

La scară industrială aplicarea enzimelor este dificilă datorită dificultăți de recuperare a acestora, după utilizarea lor. Acest dezavantaj poate fi eliminat prin înlocuirea enzimelor cu enzime imobilizate pe suporturi solide de diferite naturi. Astfel, vom face folosirea enzimelor mai economică și vom obține catalizatori de înaltă specificitate, bazândune pe proprietățile fizico-chimice ale enzimelor.

Comportamentul diferit al enzimelor în stare imobilizată de cele libere este caracterizat de următoarele noțiuni:

Microspațiul, spațiul intercitosolic, care este spațiul în contact cu enzima imobilizată;inaccesibil din punct de vedere experimental.

Macrospațiul, spașiul extracitosolic, care este spațiul din interiorul fazei lichide, singurul accesibil din punct de vedere experimental.

Obținerea enzimelor se face prin îmbinarea unor cercetări multidisiplinare, cum ar fi următoarele:

Cercetări de enzimologie și biologie moleculară, privind studiul structurii și stabilității enzimelor libere și insolubile;

Cercetări în domeniul compușilor macromoleculari și amaterialelor anorganice poroase în vederea obțineri de suporturi solide prin imobilizare;

Cercetări în domeniul chimiei-fizice și coloidale de culegere a materialelor optime de imobilizare pentru fiecare enzimă și suport în parte;

Cercetări de cinetica catalizei eterogene [5].

2.4.3.Istoricul procesului

Primele cercetări referitoare la imobilizarea enzimelor au fost realizate în anul 1916 de către Nelson și Griffin. Ei au descoperit că o enzimă fixată pe un suport își păstrează activitatea, arătând căinvertaza extrasă din drojdie se absoarbe pe cărbune activ și are activitate catalitică apropiată de cea a enzimei în stare nativă.

Mai târziu în anul 1948, Summer a arătat că ureeaza din soia devine insolubilă prin staționare timp de 1-2 zile, la temperatura camerei, într-o soluție care conține 30% alcool și clorură de sodiu.

În anul 1953 Grulhofer și Scheleith raportează imobilizarea carboxipeptidazei, pepsinei și ribonucleazei prin folosirea rășinilorpoliaminostirenice diazotate.

În anul 1965 are loc prima comunicar care a suscitat interes deosebit, imobilizarea aminoacilazer, care a deschis calea aplicării industriale a enzimelor imobilizate, în speță în scopul separări izomerilor optici ai aminoacizilor din amesteciri racemice.

Dacă ne referim la proveniența enzimelor imobilizate, atunci sunt preferate enzimele microbiene care au un preț de cosr redus, timpde producere scurt, permit industrializarea proceselor de obținere ți nu condiționează producția de enzime de alți parametri ( climă, altitudine, sezon ).

Pentru prima dată în lume, imobilizarea de celule bacteriene a fost prezentată de Chibata în anul 1973 [6], în scopul obțineri acidului L-aspartic.

În anii următori s-au continuat studiile, astfel că la ora actuală unul din domeniile principale ale biotehnologiei să fie reprezentat de obținerea, studiul și utilizarea biocatalizatorilor eterogeni sub formă de enzime imobilizate [4], [5], [30], [47].

2.4.4.Alegerea condițiilor optime de imobilizare

Acest aspect este deosebit de important, datorită faptului că în funcție de condițiile în care se realizează cuplarea va depinde activitater catalitică a preparatului obținut.Deoorece capacitatea catalitică a enzimei imobilizată diferă de valoarea aceluiași parametru specufică formelor libere, fiind de regulă ilnerioară acesteia, activitatea enzimatică a preparatelor imobilizate poartă numele de activitate remanentă.pentru ca aceasta să fie cât maimare posibil, alegerea suportului se face în așa fel încât procesul de cuplare , să inactiveze cât mai puțin enzima.alegerea suportului se face în funcție de:

-metoda de imobilizare ( legare covalentă, adsorbție pe suport solid, includere în geluri, …);

-ruperile funcționale pe care acestea le conține și care pot fi implicate în interacțiunile enzimă-suport.

Alegerea metodei optime se face în funcție deprocesul de transformare în care va fi folosit preparatul enzimatic. Dacă nu există eluție a enzimei, atunci imobilizarea va fi facută prin adsorbție plus alte metode fizice decuplare, datorită simplități și rapidități cu care pot fi efectuate.

Alegerea tehnici de imobilizare nu implică probleme mari, putandu-se utiliza imobilizarea în sistemul „coloană”, cât și în sistemul „baie”, caz în care apare condiția realizării unui contact cât mai intim între enzimă și suport.

Condițiile fizico-chimice de imobilizare, determină activitățile remanente, deci sunt importante. Formarea interacțiuni fizico-chimică, enzimă-suport depinde în mare măsură de tempetatură de cuplare a mediului, datorită pericolului de inactivare termică a enzimei. Cuplarea se realizează de obicei la 0-4C și la pH apropiat de pH-ul optim de acțiune al enzimei respective.dacă se realizează aceste condiții se obțin cele mai bune randamente.În general timpul de imobilizare este scurt nedepășind câteva ore.

Alegerea condițiilor optime de imobilizare implică și alți factori, care ajută la obținerea depreparate enzimatice cu caracteristici superioare:

-alegerea suportului optim enzimă-suport;

-alegerea unuitimp optim decuplare;

-stabilirea raportului optim suport-ligand.[5]

2.4.5. Metode de imobilizare a enzimelor

În conducerea reacțiilor chimice nu se utilizează enzime pure ci prepatate enzimatice sau în unele cazuri aceste preparate se imobilizează pe diferite suporturi solide.

Prima clasificare a metodelor de imobilizare a enzimelor a fost făcută de către G. Durand. El a făcut următoarea clasificare:

metode de imobilizare prin includere: entrapare-ENT și microcapsulare-MEC;

metode de imobilizare prin legare: adsorbție-ADS și covalentă-COV.

Mai tărziu metodele de imobilizare s-au împărșit în: – metode fizice

– metode chimice.

Dintre metodele fizice amintim:

Adsorbția pe suporturi insolubile în apă ( sticlă, cărbune, clei, rășini );

Microincapsularea îm membrane semipermeabile;

Imobilizarea în celule de ultrafiltrare;

Includerea în structuri macromoleculare.

Metodele chimice de imobilizare se referă la acele metode care conduc la formarea de legături covalente sau parțial covalente între grupuri funcționale neesențiale catalitic și un suport activ chimic insolubil în apă.Dintre Aceste metode amintim:

Legarea covalentă a enzimelor cu un polimer reactiv, care polimeriuează;

Cpolimerizareaenzimelor cu un monomer reactiv când se obțin polimeri lineari sau reticulați [4], [5], [18], [19].

2.4.5.1.Metode fizice de imobilizare

Adsorbția pe suporturi solide

Dintre metodele de fizice , imobilizarea prin adsorbție este cel mai des utilizată, reprezintă cel mai economic procedeu de imobilizare a enzimelor.

Adsorbția se realizează în principal prin două tipuri de mecanisme: în cel dintâi rolul de liant între suport și enzimă aparține forțelor Van der Waals; în cel de al doilea rolul de liant aparține unor forțe electrostatice, columbiene: Distincția dintre cele două mecanisme nu este netă, dar o promă indicație o poate furniza timpul necesar atingerii stării de echilibru ( mai mare în cel de al doilea caz ) și natura absorbantului.

Legătura suport insolubil-enzimă este relativ slabă. Desorbția se produce la modificarea pH-ului mediului de reacție, a tăriei sale ionoce, sau simpla ridicare a temperaturii. Aceasta constitue un dezavantaj major, preparatul imobilizat având o stabilitate redusă, iar produsele reacției fiind impurificate cu enzimă.desorbția permite însă regenerarea suportului într-o nouă formă activă.

Adsorbția se produce doar superficial, zona interioară a suportului nefiind utilizată. Preparatele enzimatice imobilizate astfel au o activitate specifică relativ redusă. Mărirea suprafeței specifice prin mărunțirea foarte fină a suportului duce la obținerea de preparate cu propietăți hidrodinamice slabe, care se colmatează rapid și nu permit prelucrarea soluțiilor concentrate de substrat, cu vâscozitate ridicată. Dacă materialul suport este încărcat electrostatic, vecinătatea electrică a enzimei se modifică, ducând la modificarea pH-ului optim de acțiune. De cele mai multe ori sporește stabilitatea termică, stabilitatea la depozitare și la acțiunea enzimele proteolitice.

Posibilitatea reținerii enzimelor pe suport prin forțe columbiene determină utilizarea schimbătorilor de ioni ca material suport. Majoritatea enzimelor având punctul izoelectric în domeniul de pH acid indică o preponderență în structura lor a grupărilor încărcate negativ; se utilizează deci de preferință anioniții. Procesul de desorbție permite regenerarea catalizatorului enzimatic.

Pentru a favoriza cuplarea enzimei de schimbătorul de ioni se utilizează copolimer de etilenă și anhidridă maleică (M=30000) a cărui soluție în acetonă se adaugă treptat peste preparatul enzimat brut, la rece, în mediul tampon.

1 2 1 2

Stabilirea forțelor de atracție Van der Waals intre dipolii oscilanți induși în paturile electronice exterioare a celor două molecule vecine (1 și 2).

Reacția care se produce la deschiderea ciclului de anhidridă determină formarea unui număr mare de grupări carboxil adiacente legăturii amidice nou formate. Sporirea numărului de grupe (carboxil adiacente) încărcate negativ favorizează cuplarea cu schimbătorul de ioni. S-a preparat prin această metodă un conjugat de amiloglucozidă cu copolimer etilenă – anhidridă maleică, absorbit ulterior pe DEAE – celuloză sau DEAE -Sephadex, și cu copolimer stiren – anhidridă maleică absorbit ulterior pe Duolite.

O sporire a capacității de absorbție a suporturilor sintetice se realizează atunci când polimerul conține grupe funcționale carboxil și hidroxil așezate adiacent și capabile să formeze complecși chelatici cu metalele. Caracteristicile geometrice ale zonei active se pot modifica prin variația raportului între compuși, astfel încât să se producă împiedicări sterice care să determine selectivitatea plimerului adsorbant față de o enzimă sau alta.

Cantitatea de enzimă legată de suport în cazul adsorbției depinde de următorii parametrii :

Concentrația proteică a soluției enzimatice; masa de enzimă fixată crește proporțional cu concentrația până la o valoare limită când adsorbția se saturează. Valoarea acesteia este dată de următoarele relații :

m=K1*CK2 izoterma Freundlich

în care : m – masa legată

c – concentrația la echilibru

K1, K2 – constante de echilibru

m=(K1*K2*C)/(1+K2*C) izoterma Langmuir

Reprezentarea grafică a C/m în funcție de C permite obținerea valorilor K1 și K2 pentru fiecare imobilizat.

Timpul de contact: viteza de adsorbție este determinată de caracteristicile fizico-chimice ale adsorbantului și ale proteinei adsorbite ( dimensiunea moleculelor și ale particulelor suportului, prezența și natura sarcinilor electrice etc ). În condiții obișnuite, timpul necesar pentru obținerea preparatului enzimatic imobilizat este, în general, scurt, nedepășind câteva ore.

Temperatura de răcire: viteza de adsorbție, depinzând de caracteristicile difuzionale ale moleculei, va crește cu temperatura pâna la o valoare optimă a acsteia.

Influența pH-ului: s-a constatat experimental că adsorbția maximă este, de regulă, în vecinătatea punctului izoelectric al enzimei adsorbite.[7], [18]

Imobilizarea enzimelor prin microincapsulare

Tehnicile de microincapsulare realizează includerea enzimelor în microsfere cu pereți permeabili pentru substrat și produs de reacție, dar impermeabil pentru enzima.

Microincapsularea se poate realiza printr-un procedeu de polimerizare interfaciala. Prin polimerizare interfaciala se intelege sinteza unui copolimer insolubil în apa la suprafața picăturii. în proces sunt implicați doi monomeri, unul ce este solubil numai în faza organica, iar celalalt ce este solubil atât în faza organica cat și în faza apoasa (apa).

Așadar metoda bazata pe procedeul de polimerizare interfaciala reprezintă aplicare a principiului ca monomerii hidrofobi și hidrofili polimerizează la interfața.

Procedura consta mai întâi în emulsionarea soluției continind un monomer și enzima, în soluția unui solvent organic, insolubil în apa. Apoi sub agitare continua este adăugata soluția intr-un solvent organic a monomerului ce este insolubil în apa. Polimerizarea celor doi monomeri are loc la interfața dintre faza apoasa și organica a emulsiei. în acest fel enzimele din faza apoasa sunt închise în membrana unui polimer.

Monomerii utilizați fie polimerizează, fie policondenseaza.Componentii utilizați hidrofili au fost: polifenoli, poliamine, glicol. Componenta hidrofobica a fost reprezentata de poliizocianati, bishaloformiati etc.

Imobilizarea enzimelor prin polimerizare interfaciala a fost reprezentata în figura de mai sus.

Dimensiunea capsulelor poate fii ajustata.

In ceea ce privește acțiunea enzimelor imobilizate se constata o diminuare a acesteia. Chang a imobilizat prin acest procedeu enzime ca asparaginaza, ureeaza, anhidraza carbonica[18], [21], [30].

Imobilizarea prin includere în structuri macromoleculare

Se poate include enzima în rețeaua formată de legăturile covalente ale unui polimer reticulat.Dacă gradul de reticulare este mic, atunci ochiurile rețelei sunt mari, iar enzima poate evada din gel fiind antrenată de soluția de substrat.Dacă gradul de reticulare estemare, evaziunea enzimei este impiedicată, dar accesul moleculelor la enzimă, la centrii activi la rândul său îngreunat.Trebuie deci găsit raportul între monomer și agentul de reticulare care să nu permită evadarea enzimei în mediul de reacție dar să nu limiteze accesibilitatea la centrii activi ai enzimei.Practic procesul nu este utilizabil decât la masă moleculară a enzimei este mult mai mare decât a substratului.

Rețeaua tridimensională de legături covalente a polimerilor se poate înlocui cu structuri mai simple de geluri insolubile.

Imobilizarea enzimelor prin includere în geluri: este un procedeu ce presupune îngrădirea enzimei în spațiul interstițial al unui polimer insolubil, legat incrucisat. Au fost utilizați polimeri ca alginatii, poliacrilamida, polivinilalcoolul, amidonul.

Includere în geluri acrilamidă reticulată

Se utilizează frecvent gelurile de acrilamidă reticulate cu NN’ metilenbisacrilamidă; solubilitatea în apă a comonomerilor înlătură dezavantajul utilizării solvenților organici, permite lucrarea la pH-ul la care enzima are stabilitate maximă, precumși dispersarea uniformă a moleculelor de enzimă în structura gelului; consecința acestei distribuiri omogene este mărirea accesibilității la centrii activi și sporirea vitezei de reacție. Acrilamida se utilizează ca soluție în apă sau ca tamponul potrivit de concentrație între 40-50%, iar NN’ metilenbisacrilamida ca soluție 3%. Oxigenul acționând ca inhibitor de polimerizare se îndepărtează din sistem fie prin barbotare de gaz inert, fie efectuând polimerizarea în vid.Catalizatori de polimerizare sunt de obicei persulfații și -dimetilaminopropionitul-pentru gelurile cu grad de reticulare scăzut- și riboflavina-pentru fotopolimerizarea amestecurilor cu conținut ridicat de NN’ metilenbisacrilamidă. Se utilizează și radiopolimerizarea prin iradiere cu radiații . Reacția de polimerizare fiind exotermă, temperatura mediului de polimerizare se menține la o valoare care să nu ducă la denaturarea termică a enzimei.

Imobilizarea enzimelor are loc prin polimerizarea unei soluții apoase continind enzima și acrilamida. Polimerizarea are loc în prezenta N1N-metil-bisacrilamidei ce servește ca agent de legare incrucisata.Initierea acestei reacții are loc în prezenta persulfatuluide potasiu sau a riboflavinei.

Figură . Imobilizarea enzimelor prin includere în gel de poliacrilamida

Ca accelerator al reacției s-a adăugat 0,5 ml de dimetilpropionitril 5% și ca inițiator o soluție de persulfat de K1%.Amestecul a fost incubat la 23 grade C timp de 10 min.Dupa polimerizare s-a obținut un gel tare, în care a fost înglobata enzima.Marimea porilor gelului poliacrilamidic rezultat este cuprinsa intre 10-40A.De aceea moleculele relativ mici ale substratului ca și cele ale produșilor de reacție pot trece prin matricea gelului în timp ce moleculele mari ale enzimelor sunt reținute în rețeaua gelului de poliacrilamida.

Ulterior pentru inițierea polimerizării monomerului de acrilamida au fost folosite radiații X sau Y.

Compoziția amestecului de acrilamidă și NN’ metilenenbisacrilamidă influențează puternic randamentul de imobilizare. Pentru colinesterază rndamentul maxim de imobilizare, 56%, se obține la 5% reticulare și 15% concentrație de monomeri, valoare la care este maximă și activitatea specifică a preparatului imobilizar. Modificarea concentrației de NN’ metilenbisacrilamidă față de valoarea de optim 5%, micșorează rapid randamentul de imobilizare. La sporirea concentrației de acrilamidă randamentul de imobilizare sporește, dar odată cu depășirea valorii de maximum, 15%, randamentul și activitatea specifică a produsului scad treptat. O posibilă explicație este dată deacțiunea denaturantă a acrilamidei asupra colinesterazei.

Utilizarea gelurilor în reactoarele continui de tip coloană face necesară asigurarea unei rezistențe bune a preparatului la solicitări fizico-mecanice. Această rigiditate se obține la valori mari ale raportului acrilamidă/NN’ metilenbisacrilamidă,când însă enzima evadează ușor din structura gelului.Micșorarea acestui raport duce la formarea de geluri elastice. Formula gelului trebuie determinată deci experimental pentru fiecare enzimă și fiecare configurație de reactor.

Avantajele procedeului de imobilizare pri includere în geluri de poliacrilamidă reticulată sunt demonstrate de numărul ridicat de enzime, de uz industrial și semiindustrial, ale căror derivați insolubili s-au separat în acest mod: glucozoxidază, invertază, D-aminoacidoxidază, aminoacilază, -amilază, -amlază, amiloglucozidă, protează alcalină colinesterază.

Gelurile de poliacrilamidă reticulată se utilizează și la imobilizarea celulelor de microorganisme cu activitate biologică. Acestea sunt incluse în rețeaua tridimensională de legături covalente; polimerul având un grad de reticulare mai redus decât în cazul enzimelor solubile. Procedeul este deosebit de avantajos, deoarece necesită doar simpla separare a celulelor din ,mediul de biosinteză (prin filtrare, sedimentare centrifugare) nu și separarea enzimei de celule (mojararea cu cuarț, ultrasonare etc.), sau complicate operațiuni de purificare.

În acest mod s-a realizat producerea continuă a L-citrulinei cu celule de Pseudomonas putida, a acidului urocanic cu celule de Achromobacter liquidum, studierea catabolizmului L-argininei de către celulele de Streptococcus faecalis.

La imobilizarea celulelor de microorganisme se introduce în purtătorul macromolecular întregul echipament enzimatic al enzimatic al celulelor. În anumite condiții o parte a echipamentului enzimatic se inactivează. Principiul a fost utiliuat la imobilizarea celulelor de drojdie cu activitate invertazică pentru care sistemul enzimatic a fost inactivat prin autoliză, eliminând acțiunea fermentativă asupra zaharozei.

Este remarcabilă păstrarea activității unor sisteme biologice complexe prin înglobarea în geluri de poliacrilamidă reticulată; s-a realizat imobilizarea cromatoforilor din Rhodospirillum rubrum, în vederea preparării unui reactor de fotosinteză stabil în lucru. Transparența gelului permite pătrunderea fotonilor. Sistemul realizează regenerarea ATP-ului, întrucât cromatoforii din R. Rubrum produc, printr-un sistem ciclic de transport electronic fosforilarea fără producere echivalentă de reducători. Cromatoforii imobilizați efectuează fosforilarea la același pH cu cromatoforii în stare naturală, gelul de poliacrilamidă fiind neutru din punct de vedere electric. Temperatura optimă de reacție este cea mai scăzută pentru preparatul imobilizat datorită probabil unei sporiri ușoare a temperaturii interne a particulelor de gel datorită radiației luminoase.Procesul de inactivare este de 6 ori mai lent (la 25C) pentru cromatoforii imobilizați față de cei liberi.

S-au utilizat pentru înglobare și alți polimeri sintetici obținând preparate de amiloglucozidă imobilizată prin radiopolimerizarea N-vinil-pirolidinei (cu randamente de reținere a activități de circa 45%), -galactozidază și invertază (randamente sub 10%). Prin polimerizarea 2-hidroxietilmetacrilatul se obțin preparate cu proprietăți hidrodinamice deosebit de bune [7], [18],[26].

Includere în gel de amidon

Proprietatea amidonului de a gelifia îl face apt să rețină la solidificare fie celule de microorganisme cu activitate enzimatică, fie enzime solubile. Preparatele astfel obținute au propietăți mecanice slabe, pierd cu ușurință enzima prin eluare cu soluția de substrat și nu pot fi utilizate le rece. O oarecare îmbunătățire a propietăților mecanice se obține prin turnarea gelului de amidon încă fluid peste o spumă poliuretanică, procedeu utilizat la obținerea colinesterazei imobilizate pentru uz analitic [18].

Includerea în gel de K-carrageenan

Chibata a imobilizat enzime folosind K-carrageenan, un polizaharid extras din alge marine. în acest scop 100 mg enzima au fost dizolvate în apa distilata la 37…50 grade și 1,7 g K-carrageenan a fost dizolvat în 34 g ser fiziologic la 40-60 grade C.

Ambele soluții au fost amestecate la cald (30-35 grade) și amestecul răcit la 10 grade C. Pentru întărire, gelul rezultat este udat la rece cu KCI 0,3M.Dupa acest tratament gelul tare rezultat este granulat în particule de diferite marii potrivite pentru imobilizarea enzimelor. Daca preparatele imobilizate sunt tratate cu reactivi de tipul taninului glutaraldehidei, hexametilendiamidei se obțin enzime imobilizate mai stabile. Aceasta metoda a fost utilizata pentru imobilizarea unui număr mare de enzime deoarece procedeul este relativ simplu și se desfasoara în condiții blânde [30].

Imobilizarea în membrane de colagen

Aceasta tehnica e simpla și utilizează un suport care este foarte des utilizat în industrie. Astfel ca se prepara o dispersie de 15 g colagen / litru la un pH la care colagenul prezintă o umflare maxima (pH intre 2,5 și 4,5 sau intre 10 și 11,5). Aceasta dispersie fina este supusa uscării (grosimea stratului în stare umeda este de 6 mm) și se obțin membrane fine (grosimea stratului în stare uscata este de 0,1 mm ), care se pot reumfla în contact cu apa. De exemplu 4 litrii de celule furnizează 6 g colagen sau o membrana de 2,5 m.

Sunt trei metode prin care se realizează fixarea enzimelor pe aceste membrane. Prima dintre ele consta în impregnarea timp de 24 ore până la 36 ore a unei membrane performate și preechilibrate cu o soluție de enzima ce trebuie imobilizata. Cea de-a două metoda presupune amestecarea enzimei în momentul dispersiei colagenului, în condițiile în care enzima suporta pH-ul. A treia metoda consta în depunerea prin electroforeza a amestecului colagen-enzima pe un tambur metalic care se scoate la intervale regulate din soluție.

Aceasta tehnica e foarte simpla și puțin costisitoare. Este utilizabila atât pentru o enzima izolata cat și pentru un sistem plurienzimatic și pentru celule întregi. Se furnizează prin utilizare acesteia, un material sub forma de foi, special adaptate în configurația reactoarelor cu umplutura, spirale. în general enzimele imobilizate astfel au o mare stabilitate.

Enzimele sunt incluse intr-un ansamblu de interacțiuni necovalente, la început existind pirderi de enzima fixata inițial, aceasta se poate remedia, reticulind membrana cu glutaraldehida, în final ramane 30- 35% din cantitatea de enzima fixata inițial. Asemenea suporturi constituie obiectul atacurilor microbiene și al proteazelor [7].

Figură . Stabilirea interacției hidrofobe între două suprafețe conținând resturi de aminoacizi cu caracter hidrofob, prin eliminarea moleculelor de apă adiacente (porțiune hașurată reprezentând moleculele de apă ce se îngustează, dovedind eliminarea apei dintre suprafețele cu caracter hidrofob).

Imobilizarea prin includere în fibre

Principiul metodei consta în imobilizarea enzimei sau a materialului celular sub forma de emulsie, în fibre obținute prin coagularea unui polimer în soluție.

Polimerul organic, destinat sa formeze sfere, este dizolvat intr-un solvent organic nemiscibil cu apa. Se formează o emulsie cu soluția de enzima sau materia celulara ce trebuie imobilizata. Emulsia este apoi supusa unui proces de polimerizare la presiune de azot intr-un coagulat lichid (toluen sau eter de petrol). Se vor forma filamente de polimeri care conțin micropicaturi ale soluției enzimatice. Porozitatea fibrelor astfel obținute, trebuie sa se mentinaincluse, dar produșii și reactanții (substratul ) sa poată difuza rapid.

Exista o serie de polimeri care se utilizează frecvent:

Poliacetatul de celuloza în soluție de clorura de metilen, avind ca agent coagulant toluenul, prețul de cost e scăzut și rezistenta sa biologica mai buna decât cea a acizilor diluanți și a solvenților organici;

Nitroceluloza-in general intr-un amestec deacetat de etil și toluen, avind ca și agent de coagulare eterul de petrol;

Poli-(Y-metil L-glutamatul)- în soluție de dicloretan avind ca și agent de coagulare eterul de petrol, poate fi dimetilat cu usurinta, parțial furnizind un polimer ce conține grupuri COOH pentru anumite aplicații.

In timpul utilizării solvenților se observa o denaturare a unor enzime. Utilizarea e limitata la transformarea substraturilor de greutate moleculara redusa. Se pot obține activitatii foarte ridicate de exemplu daca se fixează 200 mg proteina per gram de polimer, constrângerile difuzionale sunt limitate la maxim, datorita raportului ridicat suprafata/volum [18].

2.4.5.2.Metode chimice de imobilizare

Imobilizarea enzimelor prin legături ionice

Imobilizarea enzimelor prin legături ionice se bazează pe formarea de legături ionice intre enzima și suportul insolubil. Ca suporturi insolubile sunt folosite polizaharidele și unii polimeri sintetici care au resturi ionice. Legarea enzimelor la suportul insolubil se realizează relativ sor în condiții mult mai blânde decât în cazul legării covalente. Forțele de legare dintre enzima și suport sunt mai slabe decât în cazul legării covalente, eluarea enzimei producindu-se prin mărirea puterii ionice a soluției sau prin variația pH-ului. Legarea prin legături ionice a enzimelor la suport insolubil nu determina schimbarea conformației la nivelul centrului activ, sau determina schimbări nesemnificative, deoarece enzimele imobilizate prin aceste legături prezintă în cele mai multe cazuri activitate catalitica mare.

Prima imobilizare a catalazei prin legături ionice, a fost realizata de Minz. Imobilizarea a avut loc prin trecerea soluției de catalaza printr-o coloana continind DEAE-celuloza. Prin trecerea apoi prin coloana a unei soluții de apa oxigenata, se constata ca aceasta nu este detectata în efluent, ceea ce constituie un indiciu al manifestării activitatii enzimei imobilizate.

In scopul separării eficiente a L-aminoacizilor din amestecuri racemice de sinteza, a fost studiata posibilitatea imobilizării aminoacilazei. Imobilizarea aminoacilazei a avut loc pe schimbători de anioni de tipul DEAE-celuloza, TEAE-celuloza, ECTEOLA-celuloza, DEAE-Sephadex.

De exemplu, DEAE-Sephadex (forma OH) a fost adăugata peste o soluție a aminoacilazei, în tampon fosfat 0,1M și amestecul a fost agitat 5 ore la 37 grad C. Prin acest procedeu simplu aminoacilaza a fost legata ionic de DEAE-Sephadex.

Se mai poate face mențiunea ca stabilitatea aminoacilazei imobilizate prin legături ionice pe schimbătorul de anioni este mare.

Alți autori au încercat sa imobilizeze enzime prin legături ionice, după ce în prealabil au mărit sarcina ionica a enzimelor prin tratamente chimice. Astfel, grupările anionice slabe ale glucoamilazei au fost modificate prin legare covalenta de un copolimer al etenei sau anhidridei maleice. Derivatul enzimatic polianionic se leagă puternic de schimbători de anioni de tipul DEAE-Sephadex, DEAE-celuloza. S-a observat ca glucoamilaza imobilizata este mult mai stabila. Pe de alta parte comparind glucoamilaza netratata și imobilizata cu glucoamilaza tratata și imobilizata s-a putut constata ca aceasta di urma este mult mai stabila [5], [7].

Imobilizarea enzimelor prin legături covalente

Aceste metode se bazează pe imobilizarea enzimei pe suport insolubil, prin legături covalente. Enzima participa la formarea de legături covalente, prin intermediul grupărilor amino (alfa și epsilon), a grupărilor sulfhidril, hidroxil, imidazol, fenol. în reacțiile de cuplare, aceste grupe funcționale reactioneaza cu grupările diazoniu, azida și izocianat ale suportului. Imobilizarea enzimei prin legare covalenta de suport poate modifica structura conformationala a centrului activ al enzimei, avind ca efect scăderea activitatii ei și (sau) modificarea specificitatii pentru substrat. Legarea enzimei fiind puternica, eluarea enzimei nu are loc decât în prezenta substratului, sau prin aducerea soluțiilor la tarii ionice mari. După modul de legare, metodele de imobilizare a enzimelor prin legături covalente, se pot clasifica in:

“Metode diazo”;

“Metode peptidice”;

“Metode alchil”.

“Metodele diazo” de imobilizare a enzimelor

Aceste metode se bazează pe cuplarea diazo a enzimelor la derivații diazoniu ai suportului. Suportul continind grupări amino aromatice, este tratat cu acid nitros. Derivatul diazoniu nou format este capabil sa reacționeze cu enzima. Enzima participa la cuplarea diazo prin grupările amino libere și prin grupările fenol ale tirozinei.

Suportul pentru cuplarea diazo poate fi reprezentat de derivați polizaharidici, copolimeri ai aminoacizilor, derivați ai poliacrilamidici, rasini stirenice, copolimeri ai etenei cu acidul maleic, derivați aminosilanici.

Reprezentarea schematica a reacției de cuplare a enzimei prin metoda diazo în scopul imobilizării ei.

Copolimeri ai aminoacizilor utilizați pentru cuplarea diazo a enzimelor

în scopul imobilizării lor

Polimerizarea anhidrididelor N-carboxiaminoacizilor e descrisa pentru prima data de Leuch, în 1906 și folosita apoi în sinteza chimică. Katchalscki folosește pentru imobilizarea enzimelor copolimeri ai aminoacizilor. A obținut astfel un copolimer al L-leucinei și al L-fenilalaninei prin reacția unei soluții echimoleculare a anhidridei N-carboxi-L-leucinei cu p-amino-L-fenilalanina, în prezenta unei cantitati mici de apa și la temperatura camerei.

Copolimerul a fost activat cu acid azotos pentru obținerea sării de diazoniu ce poate fi folosita la imobilizarea ureeazei și ribonucleazei.

Activarea copolimerilor de aminoacizi cu acid azotos urmata de

cuplarea diazo a enzimelor.

Ureeaza imobilizată cu activitate mare a fost obținuta prin agitarea unui amestec format dintr-o soluție de ureeaza și copolimer diazotat, la 4 grad C, timp de 20 de ore.

Derivați poliacrilamidici utilizați pentru cuplarea diazo a enzimelor în scopul imobilizării lor

Derivații poliacrilamidici sunt cunoscuți sub numele comercial de Bio-Gel sau Enzacryl. Acești derivați aminoaromatici pot fi cuplați prin metoda diazo, în scopul imobilizării enzimelor. Enzacrylul AA este un derivat continind grupări aminoaromatice și după diazotare poate fi utilizat la imobilizarea aminoacilazei, a alfa amilazei. Totuși se considera ca acest suport este relativ scump.

Activarea derivaților folosiți la imobilizarea enzimelor prin metoda diazo.

Rășini stirenice folosite la imobilizare prin metoda diazo

Poliaminostirenul și un copolimer al m-acrilat-amino-stirenului au fost utilizați la imobilizarea enzimelor. Grubhofer a imobilizat pepsina, ribonucleaza, prin folosirea poliaminostirenului diazotat. Autorul a umplut apoi coloane cu enzime imobilizate cu care a reușit realizarea unor reacții enzimatice continue.

Goldstein folosește la imobilizarea enzimelor prin metoda diazo un derivat al copolimerului etenei cu acidul maleic și anume derivatul diaminofenilen-metan, cu care reuseste sa imobilizeze tripsina papaina alfa-chimio-tripsina,subtilizinaza.

Derivații aminoalchil au fost incorporați în sticla poroasa (G-OH), prin refluxarea sticlei poroase cu gamma-amino-propil-trietoxisilan în toluen. Sticla poroasa reactioneaza în urma procedeului de aminoalchilare cu clorura de benzoil. Prin reducere produsul trece în p-amino-benzoil. Acesta din urma prin diazotare formează un derivat diazoniu care cuplează enzima.

Imobilizarea enzimelor pe derivați ai sticlei poroase.

Metode peptidice de imobilizare a enzimelor

Metodele peptidice de imobilizare a enzimelor reprezintă o aplicare practica a tehnicii de sinteza peptidica și se bazează pe formarea legăturilor peptidice intre enzima și suportul insolubil. Procedeele utilizate sunt:

Suportul insolubil continind carboxil poate fi transformat în derivați reactivi azide, izocianti, anhidride, care reactioneaza cu grupările amino libere ale enzimei, formind legături peptidice;

Prin folosirea unor reactivi de sinteza cum sunt carbodiimida, reactivul K a lui Woodward, legăturile peptidice formindu-se fie intre grupările amino ale enzimelor și carboxil ale suportului insolubil, sau intre grupările carboxil libere ale enzimelor și grupările amino ale suportului insolubil.

Imobilizarea enzimelor prin metode peptidice folosind ca suport

derivați ai acidului azidic

CM celuloza este transformata în metil ester și apoi în hidrazida, sub acțiunea hidrazinei. Hidrazida reactioneaza cu acidul nitros, formind derivatul azidic, care reactioneaza la temperatura scăzuta cu enzima, imobilizind-o.

Obținerea derivatului azidic al CM-celulozei, folosit la imobilizarea enzimelor prin legături peptidice.

Enzacrylul este hidrazida poliacrilamidei.Derivatul ei azidic este folosit la imobilizarea enzimelor.

Obținerea derivatului azidic al Enzacrylul AH, folosit la imobilizarea enzimelor prin legături peptidice.

Imobilizarea enzimelor prin legături peptidice folosind ca suport rășini carboxiclorurice

Rasinile carboxiclorurice preparate prin acțiunea clorurii de tionil asupra rasinilor carboxilice acide, pot reacționa cu enzimele la temperatura scăzuta, imobilizindu-le.Ca rasini carboxilice au fost utilizate pentru imobilizarea enzimelor Anberlite XM 64,Amberlite Irc 50.Prin aceasta metoda au fost imobilizate catalaza și lipaza. în 1956 Branderberger a folosit Amberlite Irc 50-carboxiclorura pentru imobilizarea lipazei, imobilizare considerata ca prima din categoria metodelor de imobilizare a enzimelor.

Imobilizarea enzimelor pe rasini carboxiclorurice.

Imobilizarea enzimelor prin legături peptidice folosind ca suport derivați izocianti

Derivații izociant se pot obține prin reacția fosgenului cu un suport continind grupări aminoaromatice, la PH alcalin sau prin încălzirea unui suport care conține grupări acide azidice, cu acid clorhidric.

Posibilitati de obținere a derivaților izocianat și folosirea lor la

imobilizarea enzimelor

Au fost imobilizate prin aceasta metoda catalaza, tripsina, alfa-chimiotripsina. Ca suport insolubil au fost utilizate polizaharide de tipul Sephadex, CM-celuloza, poliaminostiren [7].

Imobilizarea enzimelor prin legături peptidice folosind ca suport

polizaharide activate cu BrCN

Activarea polizaharidelor cu BrCN a fost utilizata pentru prima data de Axen, fiind în prezent folosita pentru imobilizarea unui număr de enzime. Aceasta metoda presupune tratarea polizaharidului cu BrCN, când se formează un intermediar ciano reactiv. Intermediarul conduce la carbonatul inert și la iminocarbonat, care este reactiv. Iminocarbonatul, specia activa reactioneaza apoi cu gruparea amino libera a enzimei, formindu-se izoureea N-substituita și carbonat N-substituit. Aceasta tehnica de imobilizare este simpla. Astfel, leucinaminopeptidaza legata de derivatul izocianat al fluorocromului a fost imobilizata folosind Sepharoxa activa cu BrCN. Imobilizarea leucinaminopeptidazei fluorescente este importanta în vizualizarea distribuției enzimei în matricea gelului.

Schema reacțiilor de cuplare a enzimei după activarea suportului polizaharid cu BrCN.

Imobilizarea enzimelor prin legături peptidice folosind ca suport

derivați ai anhidridei maleice

Copolimerul hexametilendiaminei, poate fi folosit pentru imobilizarea enzimelor. Imobilizarea enzimelor are loc prin formarea legăturilor peptidice intre anhidrida maleica și grupările amino ale enzimei.

Imobilizarea enzimelor prin legături peptidice folosind reactivi de condensare pentru legarea de suport

Pentru imobilizarea enzimelor prin formare de legături peptidice au fost folosii reactivii carbodiimidici și reactivul K a lui Woodward. Suporturile utilizate frecvent au fost AE-celuloza, CM-celuloza, CM-Sephadex, copolimerul acrilamidei și al acidului acrilic, derivați aminosilanici ai sticlei poroase, copolimerul alaninei și al acidului glutamic, polimerii acidului aspartic, ai acidului galacturonic și ai acidului metacrilic. Prin acest procedeu au fost imobilizate alcool-dehidrogenaza, amino-acrilaza, acetilcolinesteraza, alfa-chimiotripsina, glutamat dehidrogenaza, deoxiribonucleaza, leucinaminopeptidaza, peroxidaza, urează, tripsina.

Imobilizarea enzimelor are loc prin formarea legăturilor peptidice intre grupările amino libere ale enzimelor și grupările carboxil ale suportului când aceasta a fost CM-celuloza, CM-Sephadex sau prin formarea legăturilor peptidice intre grupările carboxil libere ale enzimelor și grupările amino ale suportului în cazul în care aceasta a fost AE-celuloza, sau sticla poroasa aminosilanizata.

Când suportul conține grupări carboxil, din reacția cu carbodiimidele rezulta derivați ai O-izoureei. Ulterior, grupările carboxil reactioneaza cu gruparea amino a enzimei, pe care o imobilizează.

Schema reacțiilor de imobilizare a enzimelor folosind ca agenți

de condensare carbodiimide.

Imobilizarea enzimelor prin legături tioamidice folosind ca suport izotiocianati

Principiul acestei metode este același cu cel al metodei care folosește derivați izocianati și se bazează pe formarea legăturilor tioamidice intre grupările amino libere ale enzimei și derivații tioizocianat ai suportului. Un suport continind grupări amino libere reactioneaza cu tiofosgenul, dind derivați tioizocianati, capabili sa imobilizeze enzime.

Schema reacțiilor de imobilizare a enzimelor prin legături tioaminice.

Imobilizarea enzimelor prin alchilare

Imobilizarea enzimelor prin alchilare, se bazează pe alchilarea grupărilor amino, a grupărilor sulfhidril și a grupărilor fenol ale enzimei cu grupări reactive ale suportului. Chibata descrie imobilizarea aminoacilazei pe cloracetil-celuloza și pe bromacetil-celuloza. Autorul arata ca atunci când enzima reactioneaza cu suportul reprezentat de bromacetil-celuloza în prezenta unui agent de precipitare de exemplu sulfatul de amoniu, se obține un preparat activ și stabil de enzima imobilizata. Același autor a preparat iodoacetil-celuloza prin tratarea bromacetil celulozei cu iodura de sodiu în alcool și a demonstrat ca activitatea aminoacilazei imobilizate pe iodacetil-celuloza a fost mai mare decât a aminoacilazei imobilizata pe bromacetil-celuloza.

Obținerea iodoacetil-celulozei urmata de imobilizarea enzimei.

Kathalski a reușit de asemenea imobilizarea ureeazei prin metode de alchilare. Grupările hidroxil terminale ale polietilen-glicolului au fost esterificate cu acid monoiodacetic. Prin reacția acestui compus cu fosgenul, se formează cloroformiatul care ulterior reactioneaza cu celuloza dind un derivat celulozic iodacetil al polietilenglicolului, ce poate fi folosit la imobilizarea ureeazei. Acesta reprezintă primul procedeu de imobilizare prin alchilare [19].

Suportul folosit pentru imobilizarea enzimei poate fi un derivat halogenat, de exemplu cloracetil-celuloza, bromacetil-celuloza, iodoacetil-celuloza, polietilenglicol-iodoacetil-celuloza, sau un derivat triazinil de tipul diclor-S-triazinil-celuloza, diclor-S-triazinil-Sephadex precum și derivați halogenați ai polimetacrilatului.

Ulterior s-a dovedit ca și copolimeri ai metacrilatului cu metacrilat-m-fluoro-dinitro-anilina pot fi utilizați pentru imobilizarea prin alchilare a invertazei și a altor enzime.

Imobilizarea enzimelor prin legături covalente folosind reactivi bifunctionali

pentru legarea la suport

Aceasta metoda se bazează pe formarea unor punți de legătura intre grupările amino ale suportului și grupările amino ale enzimei, prin intermediul unor reactivi multifuncționali. Cea mai des utilizata ca reactiv funcțional a fost glutaraldehida, multe enzime fiind imobilizate prin formarea bazelor Schift intre grupările amino ale suportului și ale enzimei. Astfel aldolaza gliceroaldehid difosfat dehidrogenaza și tripsina au fost imobilizate prin folosirea AE-celulozei, ca suport și a glutaraldehidei ca reactiv bifunctional.

Prezentam în figura de mai jos schema de principiu a acestei imobilizări:

Imobilizarea enzimelor pe suport, prin legături covalente, folosind glutaraldehida ca reactiv bifunctional.

Este posibila tratarea cu glutaraldehida a enzimelor adsorbite pe suporturi ce nu conțin grupări funcționale. Astfel, de exemplu, enzimele adsorbite fizic pe mărgele de sticla, cărbune, silice, alumina sau legate ionic de silice tratata cu polietilendiamina, au fost imobilizate în prezenta glutaraldehidei. Natura suportului utilizat pentru diferite enzime este extrem de diversa, ceea ce creează posibilitatea utilizării unei game largi de procedee pentru fixarea covalenta a enzimelor în cazul folosirii glutaraldehidei ca agent bifunctional.

Imobilizarea enzimelor pe suporturi solide, prin legături covalente folosind

reacția Ugi

In scopul imobilizării enzimelor s-au folosit și compuși izocianat, cu mare reactivitate. Ugi și colaboratorii au arătat ca prin reacția izocianinei cu grupările carboxilice, amino, aldehidice, cetonice, se formează un substituent N-amidic. Mecanismul procesului de imobilizare consta în aceea ca un compus amino-R3 reactioneaza cu un compus carbonil R1, R2 dind naștere unui ion imoniu, care se cuplează compusul izocianat-R4 și cu compusul carboxil-R5 și rezulta o amida.

Imobilizarea enzimelor pe suport prin folosirea reacției Ugi.

In calitate de suport în literatura de specialitate sunt menționate CM-Sephadex, CM-Sepharoza, derivați amino ai Sepharozei, AE-poliacrilamida, Enzacryl AA, poliizonitril-nylon, Enzacryl poliacetat.

Cuplarea enzimelor se realizează prin grupările lor amino când suportul participa cu grupările lui carboxil, sau prin grupările carboxil ale enzimei, când suportul participa cu grupările lui amino. Au fost folosii ca reactivi de cuplare perechile:

acetaldehida și 3-dimetilamino-propilizocianida;

acetaldehida și acidul acetic;

acetaldehida și ciclohexilizocianida;

glutaraldehida și ciclohexilizocianida.

Dintre enzimele larg utilizate în laboratoarele de biochimie pentru diverse investigații de interes teoretic și practic, care au fost imobilizate prin reacția Ugi, amintim: papaina, pepsina, tripsina și alfa-chimiotripsina [7].

Imobilizarea enzimelor pe suport disulfuric prin intermediul grupărilor sulfhidril

Pentru imobilizarea enzimelor au fost folosite și alte procedee bazate pe faptul ca majoritatea enzimelor conțin grupări tiol sau chiar punți disulfurice. Numărul acestor grupări variază de la o enzima la alta și grupările tiol (resturile de Cys ) sunt adesea citate ca facind parte din centrul catalitic activ al enzimei, în timp ce punțile disulfurice conferă apoenzimei (sau enzimei) o anumita conformație moleculara.

Pregătirea suportului consta în tratarea acesteia cu disulfura de 2,2’-dipiridil.Este absolut necesar ca suportul sa contina grupări tiol libere. Enzima continind și ea grupări sulfhidril libere se cuplează cu suportul activat.

Imobilizarea enzimelor prin cuplarea lor prin intermediul grupărilor sulfhidril de un suport tio-activ

Au fost utilizați derivați disulfurici ai suportului disulfura de agaroza-glutation-2-piridil cu numele comercial de Sepharoza tioactiva, disulfura de agaroza-mercapto-hidroxil-propileter-2-piridil, disulfura de agaroza-acid adipic-acid hidrazic-N-acetil-homocisteina-2-piridil, care s-au dovedit corespunzători pentru imobilizarea ureeazei.

O alta direcție în care s-au realizat cercetări a constat în posibilitatea tiolarii enzimelor care nu conțin grupări sulfhidril necesare realizării acestui tip de imobilizare.

In acest fel au fost tiolate și apoi imobilizate pe suporturi active enzime ca amilaza și chimiotripsina [18].

Imobilizarea enzimelor prin metode mixte de legare covalenta pe suport

Un exemplu al acestui tip de imobilizare, îl reprezintă imobilizarea papainei, tripsinei, glucozoxidazei și invertazei. Suportul a fost reprezentat de amidon cu acid periodic, sau poli-4-formil-metoxifenol-metaacrilat.

Imobilizarea enzimelor de poli-4-formil-metoxifenol-metaacrilat.

Imobilizarea enzimelor are loc prin intermediul bazelor Schift intre grupările amino ale enzimei și grupările aldehidice ale suportului [5], [7].

Metode de legare incrucisata a enzimelor în scopul imobilizării lor

Si în acest caz imobilizarea enzimelor se realizează prin formarea de legături covalente dar lipsește suportul, enzimele legindu-se covalent una de alta. Imobilizarea se realizează în acest caz prin intermediul reactivilor bifunctionali sau prin intermediul reactivilor multifuncționali. în aceasta calitate de reactiv bifunctional a fost utilizata glutaraldehida, când legarea covalenta se realizează prin intermediul bazelor Schift.

Prin folosirea în același scop a derivaților izocianati, legarea se realizează prin legături peptidice. Bis-diazobenzidina realizează imobilizarea enzimelor când se folosește ca reactiv de N,N’-polimetilen-bis-maleimida. Daca se folosește ca reactiv de legare incrucisata N,N’-polimetilen-bis-iodacetamina, imobilizarea enzimelor se realizează prin alchilare. Enzimele participa la formarea legăturilor covalente prin intermediul grupărilor epsilo-amino ale resturilor de lisina, grupărilor fenol ale resturilor de tirozina, grupărilor tiol nemodificate ale resturilor de cisteina și grupărilor imidazol ale resturilor de histidina.

Legarea incrucisata a enzimelor prin intermediul reactivilor bi și multifuncționali se desfasoara în condiții de reacție mult mai severe decât în metodele de legare covalenta a enzimelor de un suport definit. Din acesta cauza se constata frecvent o diminuare accentuata a activitatii enzimatice în preparatul obținut, pe de o parte, datorita modificării configurației centrului catalitic activ al enzimei, iar pe de alta parte modificărilor conformationale ale moleculei enzimatice survenite gratie numeroaselor interactii dintre grupările chimice reactive ale resturilor de aminoacizi din structura enzimei.

Printre cei mai utilizați reactivi de legare incrucisata a enzimelor, în scopul imobilizării lor se număra glutaraldehida.

Quiocho și Richards au tratat carboxipeptidaza A și cu glutaraldehida și au obținut enzima imobilizata prin legături intermoleculare, acest procedeu stiind la baza celei mai vechi metode de legare incrucisata a enzimelor în scopul imobilizării lor [5].

Imobilizarea enzimelor prin legături incrucisate folosind glutaraldehida ca agent de legare.

2.4.6.Tehnici de imobilizare a enzimelor și celulelor

Tehnici de imobilizare a enzimelor si celulelor intregi se impart in urmatoarele două grupe:

tehnici de imobilizare in sistemul ”coloană” care constau in trecerea solutiei enzimatice sau a suspensiei celulare printr-o coloană umpluta cu suportul de imobilizare ce a fost in prealabil activat si echilibrat;

tehnici de imobilizare in sistemul ”baie” ,in care caz imobilizarea se face sub agitare continua in vase speciale,apoi,după spălare, preparatul obținut se trece în coloana de reacție în vederea exploatarii.

Alegerea tehnicilor de imobilizare se face în functie de metoda de insolubizare utilizată.Astfel, imobilizarea prin adsorbție sau prin alte metode fizice se face cu precadere în sistemul ”coloană”, in timp ce imobilizarea prin includere în geluri, reticulare sau legare covalenta se face, în general, în sistemul ”baie” ,tehnică ce asigură crearea conditiilor optime pentru reacțiile chimice ce au loc.

În ceea ce privește tehnica de imobilizare în sistemul ”coloană”, singurele probleme mai dificile care se pun sunt cele legate de crearea condițiilor optime de fixare(pH, temperatură etc.) condiții care să nu ducă la inactivare enzimelor.Această tehnică este similară cromatografiei pe coloană executându-se în condiții identoce.

Tehnicile de imobilizare în sistemul ”baie” sunt ceva mai complexe din cauza condițiilor aspre în care au loc reacțiile chimice.În genelal, acste tehnici se aseamănă cu cele din sinteza chimică organică cu deosebire că se fac anumite modificări în scopul obținerii unor condiții mai blânde de reacție care să nu denatureze proteinele.de obicei, în cazul imobilizării prin legare covalentă directă , prin reticulare sau prin includere , formarea suportului are loc concomitent cu imobilizarea(în cazul suporturilor sintetice), reacțiile chimice respective executându-se în mod obligatoriu în condiții fiziologice normale de pH și temperatură.

Există suporturi ce conțin un număr mare și variat de grupări funcționale și care , din acest punct de vedere prezintă calități optime de imobilizare.Totuși , formarea de legături chimice între enzimă și suport necesită condiții aspre de reacție , motiv pentru care se recurge la folosirea liganzilor.S copul utilizării acestora este de a înlocui grupările funcționale ale suportului cu altele , la fel de reactive sau mai reactive , dar în condiții mai blânde.Astfel , reactivul Woodward (N-etil-fenil-5-izoxozalin-3’-sulfonat) asigură transformarea grupării carboxil în grupare ester reactivă în condiții relativ blânde.Un alt exemplu îl constitue activarea cu ayotit de sodiu a suporturilor conținând grupări aminice.

Utilizarea în calitate de ligand a clorurilor acide conduce la transformarea grupărilor carboxilice(-COOH) ale suportului în cloruri acide după care imobilizarea are loc prin legare covalentă însoțită de eliminarea unei molecule de HCl dintre clorura acidă și gruparea –NH2 din molecula enzimatică.Pentru a evita denaturarea enzimei este necesar să se neutralizeze continuu acidul clorhidric eliberat în proces [5].

2.4.7.Avantajele utilizării enzimelor imobilizate

Preparatele de enzime imobilizate, fata de cele libere sau solubile, prezintă o serie de avantaje printre care se amintesc următoarele:

refolosirea repetata a enzimei astfel încât cantitatile de enzima sa poată transforma cantitati mai mari de substrat;

se poate lucra în sistem continuu sau semicontinuu cu automatizarea procesului, ceea ce asigura un control precis al parametrilor de lucru;

are loc o creștere a vitezei de lucru prin controlul riguros al vitezei transportului de substrat și al concentrației acestuia;

se poate stopa reacția enzimatica la momentul dorit și se evita trecerea enzimei în produsul transformat;

costurile globale de producție sunt mai mici în comparație cu procedeele ce folosesc enzime libere;

se pot folosi enzime care nu sunt trecute pe lista GRAS (Generally Recognized As Safe ) pentru ca acestea nu ajung în produs.

Cu toate aceste avantaje trebuie precizat ca procesele enzimatice ce lucrează cu enzime imobilizate, deși au trecut cu succes încercările de laborator și pilot au totuși o mica incidența industriala, motivul fiind probabil acela ca reactoarele ce lucrează în acest caz sunt diferite de cele clasice.[5], [18], [28].

Cap.3. STUDII PRELIMINARE

Realizarea oricărui obiectiv de investiție presupune parcurgea următoarelor etape:

Preinvestitia-cuprinde totalitatea lucrărilor de studii, cercetare, proiectare pentru pregătirea investiției;

Investiția propriu zisa-in care se realizează toate lucrările de proiectare, construcție și montaj până la recepția preliminară pe șantier a instalației;

Punerea în funcțiune și atingerea parametrilor proiectați.[32]

3.1.Studii de marketing

Este un studiu de piața care urmărește evoluția producției, consumului și a prețului de vânzare pentru un anumit produs intr-un anumit teritoriu sau pe plan mondial.[32]

In prezent, unul din domeniile principale ale biochimiei îl constituie obținerea, studiul și utilizarea biocatalizatorilor heterogeni sub forma de enzime imobilizate.

Eficienta economica a utilizării enzimelor imobilizate este mare, fiind exprimata și de un cost global mai mic comparativ cu cazul utilizării enzimelor libere.

Datorita posibilitatii de folosire repetata a enzimelor imobilizate astfel încât aceiași cantitate de enzima transforma cantitati mari de substrat, se reduc considerabil costurile de materii prime.

Dezvoltarea cercetărilor privind obținerea enzimelor imobilizate este dictata atât de considerente fundamentale, cat mai ales aplicative. în ultimele 2-3 decenii s-a acordat o atenție tot mai mare tehnologiilor enzimatice plecind de la dezvoltarea extensiva și intensiva a metodelor de imobilizare și stabilizare a enzimelor. Cercetările efectuate pe plan mondial sunt numeroase și au scopul de a substitui treptat sintezele chimice sau transformările și tratamentele chimice aplicate industrial.

Enzimele imobilizate au multiple aplicații în biotehnologie și medicina:

La hidroliza zaharozei, amidonului, peptidelor și proteinelor, defosforilarea nucleotidelor;

La umplerea coloanelor cromatografice, asigurind păstrarea capacitati catalitice timp îndelungat;

In sinteza organica fina, reprezentind o soluție de grefare a unor grupări funcționale cu randament maxim, fara formare de izomeri secundari;

La prepararea unor medicamente cu acțiune prelungita și cu un grad de toxicitate scăzuta;

La coagularea laptelui și obținerea unor preparate cu brânza nefermentata (s-au utilizat chimiotripsina sau renina insolubilizata);

In fabricarea biodetergentilor ( conțin amilaza, lipaza și proteaze insolubile);

In tehnica fotografiei “fara argint”;

La obținerea vinului spumant de fermentație.

Materiile prime utilizate la imobilizare peroxidazei din hrean au diferite preturi în funcție de firma producătoare:

Na2SO4 anhidru (granulata)-Merk

1 kg 21,83 Euro

Alcool polivinilic Fluka

PH(1% apa)=6,0-7,5

50g 15 Euro

1 kg 204 Euro

Alcool polivinilic Merk-index 11,231

1kg 156,83 Euro

Peroxidază

10 ml 1000 Euro

3.2.Studii de soluție tehnologică

3.2.1.Alegerea variantei optime

In ceea ce privește factorii ce trebuie luați în considerare la folosirea enzimelor imobilizate trebuie avut în vedere următoarele:

Eficienta economica a imobilizării exprimata de costul enzimei, al suportului și al metodei (tehnologiei de imobilizare);

Activitatea enzimei imobilizate: ca funcție de tehnica de imobilizare, de caracteristicile materialului suport ce determina viteza de difuziune a substratului spre enzima și al produșilor de transformare în afara suportului;

Caracteristicile substratului ce trebuie transformat;

Stabilitatea enzimei ce trebuie menținuta pe un timp cat mai îndelungat;

Contaminarea microbiologica a sistemului enzima-suport în timpul utilizării reactorului.[32]

Varianta de imobilizare utilizata în aceasta lucrare este includerea peroxidazei în gel de alcool polivinilic sub forma de sfere. Aceasta metoda este preferata deoarece este frecvent utilizata în condițiile în care sunt minimalizate pierderile de sarcina și în egala măsura frecările din interiorul reactorului, evitindu-se astfel o denaturare mecanica a enzimei.

Unele caracteristici, avantaje, dezavantaje ale unor tehnici de imobilizare a enzimelor sunt prezentate în următorul tabel:[31]

3.3.Studiul de profil și amplasament

Studiul de profil și amplasament (SPA) stabilește capacitatea instalației, profilul producției chimice și amplasamentul intr-un anumit teritoriu.[32]

3.3.1.Criterii de alegere a amplasamentului optim

Asigurarea cu materii prime: alcool polivinilic folosit ca și suport al imobilizării este procurat din import. Restul substanțelor necesare sunt asigurate de piața interna. Nu necesita condiții deosebite de transport și depozitare;

Asigurarea cu utilitati:

Utilitati primare: apa curenta (rețea) și energie (rețea);

Utilitati secundare: apa demineralizata (produs în întreprindere) și aer comprimat (rețea).

Investițiile destinate asigurării cu materii prime dețin o pondere de 30-40% din investiția totala.

Desfacerea produselor finite : este un criteriu important, deoarece produsul obținut reprezintă materia prima pentru instalații chimice;

Natura terenului : instalația e amplasata pe un teren de categoria întâi : foarte bun la fundare la adâncimi de 2-4 m, Ta=3-4 kg/cm 2 format din pietriș, bolovani, marna, nisip;

Condiții climatice și seismice: zona geografica pe care se afla instalația nu ridica probleme deosebite din punctul de vedere al cutremurelor fiind o zona seismica din categoria VIII. Distribuția precipitațiilor este de 600-800mm/an.Din punct de vedere al distribuției vanturilor, terenul se afla în zona V, unde vântul bate 1500h/an cu o viteza mai mare de 4m/s;

Poluare și factori ecologici : acest factor nu este determinat în alegerea amplasamentului optim deoarece nu se lucrează cu afluenți toxici;

Calificarea personalului: operarea și intretinerea mecanica a instalatiilor se realizează de către un personal cu o buna calificare profesionala.[32]

3.4.Studiul de prefezabilitate

3.4.1.Date generale

Denumirea investiției : instalația pentru imobilizare peroxidazei din hrean prin includere în alcool polivinilic;

Proiectant : stud. Ioana Mihăilă

Ordonatorul principal de credite: BCR– Sucursala Cluj-Napoca;

Amplasamentul : Cluj- Napoca;

Fundamentarea necesitații și oportunitatii investițiilor: considerente biochimice și economice.

3.4.2.Estimarea costurilor

Valoarea total estimata pentru realizarea, amplasarea și pornirea instalației este justificata de avantajele utilizării enzimelor imobilizate;

Cheltuielile cu studii pregătitoare sunt recuperate relativ repede, prin procesul de producție;

Cheltuielile cu avizele necesare sunt mici datorita faptului ca instalația de imobilizare este practic nepoluanta și nu necesita condiții deosebite de funcționare.[32]

3.4.3. Date tehnice ale investiției

Suprafața terenului necesara pentru amplasarea instalației este de 900mp;

Situația juridica a terenului: terenul aparține investitorului în conformitate cu extrasul funciar;

Utilajele de baza sunt:

Reactor;

Decantor vertical;

Vasele de amestecare;

Rezervoare;

Pompe;

Uscător;

3.4.4.Finanțarea investiției

Surse proprii : 5%;

Credite bancare : 60% BCR, sucursala Cluj-Napoca;

Fonduri speciale : 35% program PHARE

Cap.4. PROIECTARE TEHNOLOGICĂ

4.1.Chimismul procesului

Studiile au arătat că peroxidaza din hrean acționează în trei etape(Maehly, 1960):

Formarea complexului I

HRP + H2O2 Complex I + H2O

Complex I + H2O HRP + H2O2

Transformarea Complexului I în Complexul II

Complex I + AHComplex II + A

unde:

AH – donorul în formă redusă

A – donorul în formă oxidată

Refacerea enzimei prin reducerea Complexului II

Complex II + AHHRP + H2O + A

Formarea produsului

2AA2 , [46]

Restul enzimei participă la urmatoarea reacție:

4.2. Studii fizico-chimice

4.2.1. Modelarea cinetică a procesului

Peroxidaza face parte din clasa de enzime 1.11. Enzimele sunt foarte buni catalizatori, catalizatori chimici fiind tot mai mult înlocuiți cu enzimele.

Reacțiile catalizate de enzime pot fi reversibile de tipul:

E + S E + P

Sau ireversibile de tipul:

E + S ES E + P

Unde:

E – enzimă;

S – substrat;

P – produs.

În secvențele de reacții metabolice în care produsul unei reacții devine substrat pentru reacția următoare, echilibrul este deplasat într-un sens preferențial, impus de necesitățile metabolismului celular.

Mecanismul de acțiune al enzimelor poate fi exprimat și interpretat în termeni cinetici. Cinetica chimică, în speță, cinetica enzimatică, studiază procesele chimice sub raportul vitezelor de reacție, respectiv al evoluției în timp a transformărilor caracteristice unei reacții.

Viteza de reacție

O reacție chimică reprezintă un proces dinamic în care, pornindu-se de la o stare inițială se ajunge la o stare finală. Acest proces se desfășoară în timp cu o anumită viteză (v). Viteza de reacție este mărimea care operează cinetica enzimatică, se definește ca fiind cantitatea de substrat care se transformă în unitatea de timp, și se exprimă prin relația:

v = –

În reacțiile:

S + E ES P + E , avem: v = k, unde X reprezintă cantitatea de substrat transformată.

Vitaza de reacție constitue un parametru de exprimare cantitativă, a activități enzimatice.

Ordinul de reacție

Reacțiile enzimatice se diferențiează printr-un anumit ordin cinetic de reacție, care exprimă dependența vitezei de reacție de concentrația reactanților. Reacțiile frecvent întâlnite sunt de ordinul zero și de ordinul întâi.

În cazul reacției: SP , avem: v = – = = k

Unde:

k – constanta vitezei de reacție, care are o valoare determinantă în condiții standard dereacție;

n – ordinul de reacție.

Pentru n = 0, v =k= k, avem reacție de ordinul zero.

Pentru n = 1, v =k =k, avem reacție de ordinul întâi.

Dacă expresia vitezei de reacție este: v = k, reacția are ca ordin de reacție suma .

Reacțiile de ordin zero sunt cele în care viteza de reacție este constantă, în acest caz, enzimaeste saturată cu substrat, iarviteza este maximă. Reacțiile de ordinul întâi sunt cele în care viteza de reacție crește direct proporțional cu concentrația reactantului, conform relației: v = – = k

Ordinul unei reacții se poate stabili experimental, măsurând viteza de reacție la diferite concentrații ale reactantului (S) și determinând valoarea lui n.

Factori care influențează cinetica reacțiilor enzimatice:

Concentrația enzimei

Viteza de reacție ințială este direct proporțională cu concentrațiile crescânde ale enzimei; laconcentrații mari de enzimă, viteza de reacție este constantă.

Concentrația substratului. Constanta Michaelis (KM)

Temperatura

În gen eral activitate optimă a enzimelor se manifestă în domeniul de temperatură 35-40C.

PH-ul

Valoare optimă de pH depinde de natura și originea enzimei, de mediul de reacție și de forța ionică a acestui mediu în care enzima își desfășoară activitatea.

Viteza reacției enzimatice este maximă la pH-ul optim, la care enzima are capacitatea deplină pentru a-și exercita funcția catalitică.

Radiațiile ionizante

Efectori enzimatici: activatori și inhibitori.[3], [46]

4.2.3. Bilanțul de materiale

Bilanțul de material constituie baza tuturor calculelor tehnologice cu ajutorul cărora se estimează consumurile specifice de materiale, se determină numărul și dimensiunile principale ale aparatelor necesare realizării procesului, în condițiile capacității de producție impusă.

Urmărirea circulației curenților de materiale în procesul tehnologic prezintă importanță pentru optimizarea acestora în instalații, pentru realizarea condițiilor de intensificare a procesului sau pentru obținerea indicatorilor necesari în proiectare.

4.3.Schema de operații

4.4.Schema de proces și control

4.4.1. Automatizarea reactorului

Automatizarea reactoarelor are drept scop reglarea principalilor parametri ce determină evoluția corespunzătoare a procesului: concentrația.

Principalele elemente în reglarea func

Automatizarea reactoarelor are drept scop reglarea principalilor parametri ce determină evoluția corespunzătoare a procesului: concentrația.

Principalele elemente în reglarea funcionării unui reactor sunt:

a) reglarea debitelor de reactanți – dacă raportul celor două debite de reactanți trebuie menținut constantă, FA / FB = const., mărimea prescrisă va fi:

Xp = FA / FB = k*FB

Se fixează debitul FB printr-un ventil cu acționare manuală. Orice variație a acestui debit este sesizată cu traductorul cu diafragmă montat pe conducta de alimentare cu B.

Semnalul este amplificat de k ori și este transmis regulatorului corespunzător alimentării cu A, care prin intermediul traductorului de pe conducta de alimentare cu A, citește, compară și acționează asupra ventilului de reglare.

Semnalul dat de traductor fiind neliniar, caracteristicile ventilului de reglare trebuie astfel alese încât să se realizeze compensarea neliniarității.

Reglarea raportului de debite are o însemnătate deosebită deoarece există acumulările unuia dintre reactanți și astfel pericolul ambalării reacției într-o asemenea măsură încâț să nu mai poată fi controlată și să determine grave accidente, chiar explozii.

b) bucla de reglare a temperaturii – reglarea temperaturii fiind un proces relativ lent este necesară o bandă de proporționalitate mică, deci un factor de amplificare mare.

k = 100/BP

Procesul fiind lent prezintă constante de timp mari; reglarea temperaturii trebuie prevăzută cu un regulator PID (proportional-integral-derivativ).

Traductoarele utilizate în reglarea temperaturii pot fi: termorezistențe, termocupluri și termistori convenabili aleși.

c) bucla de reglare a nivelului – reglarea nivelului prezintă o importanță deosebită mai ales în cazul proceselor continue.

La o eventuală acumulare de lichid există pericolul ca transferul termic să nu mai corespundă și să aibă loc acumularea sau stingerea reacției. Se recomandă folosirea regulatorului PI, componenta D a regulatorului mărind zgomotul de fond, reglarea nivelului putând determina oscilații.

d) bucla de reglare a presiunii – reglarea presiunii este necesară în cazul implicării în procesul chimic a unor componente gazoase.

Ca traductoare pentru măsurarea temperaturii se pot utiliza manometre de diferite tipuri: cu celulă BArton, cu balanță inelară, cu tub Bourdon.

4.4.2.Reglarea debitului pompelor

Reglarea debitului pompelor volumetrice – reflux și aspirând un volum constant pot fi utilizate la dozarea unor fluxuri de materiale. Utilizarea lor este mai mare în cazul în care sursa apei este ajustabilă.

Pentru amortizarea pulsațiilor pe conducta de refulare se pun vase amortizoare, 4 vase de volum mai mare. Dacă nu se folosesc amortizoare, pulsațiile pompei pot distruge sistemul mecanic al rotometrului. reglarea debitului poate fi făcută prin recircularea unei părți de fluid de la refulare, sau prin ștrangularea refulării, având un by-pass care se deschide sub acțiunea unui regulator de presiune. Reglarea debitului unei pompe cu roți dințate, se poate face prin ștrangularea directă a conductei de refulare deoarece prin vidul relativ creat se produce un fenomen de cavitație care distruge rotorul pompei.[43]

4.5.Utilități

Cele mai importante utilități necesare sunt: energia electrică, aerul uscat, aburul, apa recirculată, apa potabilă.

Energia electrică – este folosită pentru funcționarea tuturor motoarelor electrice, pentru acționarea pompelor, a ventilatoarele, sistemelor de agitare.

Se asigură realizarea ventilației, încălzirea, iluminatul, și pentru obținerea unor părți însemnate din utilități.

Aerul uscat –ca fiind inert pentru manipulări de produse, suflări, necesitând o presiune de 4-5 atm, pentru diferite scopuri.

Aburul – se utilizează pentru încălzirea masei de reacție în diferite etape ale sintezei. Datorită temperaturilor necesare, relativ mici, se utilizează abur de joasă presiune.

Apa recirculată – se utilizează pentru răcirea masei de reacție, acolo unde e cazul prin intermediul mantalei vaselor. Debitul apei se reglează astfel încât să fie atinsă temperatura necesară.

Apa potabilă –poate proveni din fântâni de adâncime, temperatura ei se menține între 10-15C în tot timpul anului ; ea mai poate proveni și de la rețeaua de apă sau de la întreprinderi (pentru apă deminerallizată).

Ventilație. Încălzire. Iluminat.

Ventilația – are rolul de a menține condiții corespunzătoare de lucru prin schimbarea aerului din secție și pentru a preveni accidentele de lucru în cazul unor emanații de gaze din instalații.

Pentru realizarea unei ventilații corespunzătoare este necesar să se cunoască natura și cantitatea de substanțe nocive degajate, precum și modul de generare a acestora.

Pentru asigurarea unei ventilații corespunzătoare, ventilației naturale i se va adăuga și o instalație de ventilație artificială.

În funcție de spațiul supus ventilării se disting mai multe tipuri de ventilație:

Ventilație generală (când întreg spațiul este ventilat);

Ventilație parțială (când numai o parte din încăpere este ventilată);

Ventilație locală (când o mică parte din încăpere este ventilată).

Secțiile se vor prevedea cu un sistem de ventilație pentru crearea microclimatului de lucru corespunzător normelor.

Încălzirea încăperilor din secția întreprinderilor se face în scopul menținerii unor temperaturi corespunzătoare desfășurării normale a procesului.

Pentru încălzire se construiesc instalații de încălzire centrală, ca agent termic folosindu-se aburul sau apa.

Iluminatul – se poate face natural sau artificial. Construcția clădirilor va asigura iluminatul natural în timpul zilei, cu ajutorul ferestrelor transparente și/sau acoperișurilor de sticlă. Clădirile și încăperile în care se lucrează sunt astfel amplasate încât să se asigure un timp cât mai îndelungat iluminatul natural al locurilor de muncă.

Iluminarea artificială se realizează cu ajutorul lămpilor sau tuburilor fluorescente.

Cap.5.PROIECTARE DE DETALIU

5.1. Alegerea echipamentelor și utilajelor

5.1.1.Alegerea reactorului

Alegerea utilajului (echipamentului de lucru) folosit într-un caz dat depinde în mare măsură de forma în care se găsește materia primă de dificultățile prelucrării ei, de prețul ei și al utilajelor [31].

Considerente de acest gen au condus la menținerea în exploatare, respectiv la realizarea unor echipamente foarte specializate și specifice unui domeniu industrial precum industria alimentării.

Pe baza acestor considerente s-a ales ca utilaj pentru imobilizarea peroxidazei din hem în alcool polivinilic, reactor cu agitare cu operare în regim discontinuu.

5.1.2.Alegerea tipului de pompă

Pompa este o mașină care transformă energia mecanică primită de la sursa de alimentare, în energie hidraulică. deoarece pompele sunt destinate transportului de lichide la distanță și nivele diferite. Utilizarea lor s-a impus aproape pretutindeni unde s-a ivit necesitatea unui astfel de transport. deoarece diversitatea instalațiilor hidraulice deservite de pompe este foarte mare, pompa trebuie să posede anumite calități valabile pentru orice tip de instalație.

Dintre acestea, principalele sunt:

1. Siguranța în funcționare

2. Asigurarea parametrilor hidraulici solicitați

3. Întreținerea simplă, acces ușor.

Într-o instalație, pompa este elementul motor al acestuia, de aceea dotarea instalației cu tipul de pompă adecvat este foarte importantă pentru funcționarea corectă a instalației.

5.2.Dimensionarea utilajelor cheie

Calculele de predimensionare și dimensionare stabilesc:

– Dimensiunile dependente de capacitate (D, H)

– Dimensiunile dependente de fenomene termice (cantități de căldură, suprafață de schimb termic, pierderi de căldură)

– Dimensiuni dependente de fenomene fizico-chimice (cinetică, conversie, fază de trecere, productivitate specifică)

– Dimensiuni dependente de parametrii fizico-mecanici (grosime de pereți, elemente interioare)

– Dimensiunile conductelor de legătură (strețuri) în funcție de debitul de intrare și ieșire a fluxului de materiale

– Dimensiuni strețurilor pentru aparate auxiliare (supape, membrane de siguranță, guri de vizitare, inspecție, racord de manometru etc [ ].

5.2.1. Dimensionarea mecanică a reactorului cu agitare

Vasul în care are loc imobilizarea peroxidazei din hrean în alcool polivinilic este compus din:

– fund elipsoidal

– corp cilindric

– capac plan

Stabilirea caracteristicilor dimensionale ale vasului și a parametrilor de lucru

a) Volumul de lucru al vasului de reacție

Vl = Ku·V

Vl – volum de lucru

Ku – coeficient de umplere

V – volumul total

În acest caz Ku = 0.7 [35], p. 24.

V = V1 + V2 + V3

V1 – volumul părții cilindrice

V2, V3 – volumele capacului, fundului

V1 =

Alegem D = 1800 mm, tabelul 2.1.[35], STAS 7153-74

Hc = 0.8·D = 0.8·1800 = 1440 mm

V1 = = 3.662 m3

Vf = ==0.763 m3

b=375 mm, conform tabelului 2.13 pag. 59 [35]

h = 25 mm conform tabelul 2.10 pag. 52 [35]

Vcapac=0 m3

V = 3.662 + 0.763 = 4.425 m3

Vl = 0.7·4.425 = 3.097 m3

b) presiunea nominală "pn" [atm]

pn = 1 atm

Presiunea nominală reprezintă presiunea maximă admisibilă de lucru a fluidului din recipient.

c) temperatura minimă "tm" [oC]

tm = 15oC

Temperatura minimă este temperatura cea mai mică pe care o poate atinge peretele recipientului în timpul funcționării.

d) temperatura de calcul "tc" [oC]

tc= 50oC

Temperatura de calcul este temperatura maximă pe care o poate atinge peretele recipientului datorită presiunii și temperaturii mediului de reacție în condiții de funcționare

e) presiunea de lucru "pr" [MPa]

pr = 0.1 MPa

Presiunea de lucru sau de regim este presiunea fluidului în partea cea mai de sus a recipientului în exploatare normală.

f) presiunea de calcul "pc" [MPa]

pc = 0.1 MPa

Presiunea de calcul este presiunea folosită la determinarea grosimii de rezistență a peretelui recipientului

pc = pr = pn

g) înălțimea lichidului din vas

Această înalțime se măsoară de la locul îmbinării zonei cilindrice a fundului elipsoidal cu partea cilindrică a recipientului.

VL=Vl-Vf=3.097 – 0.763 = 2.334 m

HL===0.917 m

i) Presiunea hidrostatică "ph" [MPa]

ph = 9,81·10-9·HL·ρ

ph = 9.81·10-9·0.917·1293 = 1.164MPa

Alegerea materialelor

a) Alegerea tipului de material pentru confecționarea părților componente ale reactorului se face în funcție de temperatura de calcul "tc", de presiunea de lucru "pr" și de agresivitatea chimică a mediului de reacție.

Pentru construirea recipientului s-a ales conform Lazăr oțel de tip OL 37 2K STAS 500/2-80, pentru recipiente ce funcționează la temperaturi medii, iar mediul de reacție nu conține substanțe letale sau explozive conform STAS 500/2-80.

Caracteristicile dimensionale ale oțelului OL 37 2K

b) Ansamblarea demontabilă între capacul recipientului și corpul recipientului se face cu flanșă, șurub și piuliță. Alegerea tipului dimensional al flanșei se face în funcție de diametrul nominal al vasului de reacție. Materialul pentru flanșă, șurub și piulițe se alege în funcție de presiunea mediului din recipient.

Alegerea tipului suprafeței de etanșare pentru flanșă se face în funcție de presiunea din recipient. Caracteristicile dimensionale ale garniturii sunt date tot de diametrul nominal al flanșei.

Se alege tipul de flanșă: FLANȘĂ CU UMĂR, STAS 9801/6-79.

Caracteristicile mecanice OL 37.2

Flanșă pu-1800-M24 STAS 980114 OL 37.2

Garniturile de etanșare se execută din materiale cu următoarele caracteristici:

– presiune de strivire: q ≤ 1200 N/mm2

– factor de garnitură: m ≤ 2

Dimensiunea garniturii: Dn = 1800 mm; d1 = 1886 mm; d2 = 1825 mm

Șuruburile necesare strângerii flanșelor se confecționează din oțel OLC 35I, STAS 880-80.

Caracteristicile OLC 35I

Piulițele necesare strângerii flanșelor se confecționează din oțel cu marca OLC 25I, STAS 9880-80.

Caracteristicile mecanice OLC 25I

c) Alegerea și amplasarea tipurilor de racorduri pentru recipient se face STAS 10688-82 pentru tc < 200oC. Țevile pentru racorduri se confecționează dintr-un material astfel încât să prezinte garanție în ceea ce privește presiunea și temperatura de lucru și agresivitatea mediului din recipient.

Țevile pentru racorduri sunt confecționate din oțel cu marca OLC 35 STAS 8133-80.

Caracteristicile mecanice OLC 35

d) Suporții laterali pentru recipient sunt confecționați din oțel uzual STAS 500/2-80. În general marca oțelului utilizat la confecționarea suporților laterali este OL 37,2.

Simboluri:

σr – rezistența la rupere la 20oC [MPa}

σc20 – limita de curgere la temperatura de 20oC [MPa]

A – alungirea specifică la rupere [%]

m – coeficientul specific al garniturii

q – presiunea de strângere a garniturii [N/m2]

Calculul de verificare al elementului cilindric

a) Calculul tensiunii admisibile a materialului din care este confecționat recipientul σa20[MPa]

Tensiunile admisibile utilizate în calculul de rezistență ale elementelor de recipient se calculează conform schemei logice prezente în figura 2.4 [35].

σa20 = min

unde: cs1 = 1.5

cs2 = 2.4

σa20 = min

σa20 = min [160; 183,3]

σa20 = 160 [MPa]

Pentru t = 50 [oC]

σa50 = min

σc50, se va calcula prin interpolare

σc50 = 231 [MPa]

σa50 = min

σa50 = min [154; 183,3]

σa50 = 154 [MPa]

b) Calculul presiunii de încercare hidraulică

Presiunea de încercare hidraulică este presiunea maximă obținută la verificarea hidraulică a recipientului.

pph = 1.25xpm

pc = pm = 1 atm = 0.1 MPa

pph = 1.25×0.1

pph = 0.129 [MPa]

c) Calculul grosimii de rezistență pentru corpul cilindric

Grosimea de rezistență a elementului, So, în [mm], este grosimea rezultată din calculele de rezistență fără nici un fel de adaos.

pc = 0.1 MPa

D = 1800 mm

φ = 0.9, unde φ – coeficient de rezistență al îmbinării sudate, a cărui valori se aleg conform tabelului 2.6, p. 35 [35].

S0 =

S0 = 0.649 [mm]

Calculul adaosului pentru condiții de exploatare:

c1 = (vc1 + vc2 + vc3)x τ

unde: vc1 – viteza de coroziune pe fața interioară a elementului [mm/an]

vc2 – viteza de coroziune pe fața exterioară a elementului [mm/an]

τ – durata de funcționare [ani]

Rotunjirea Cr [mm], va ține seama de valoarea grosimii standardizate imediat superioară sumei S0 + C1

Abaterea negativă la grosime C2 se stabilește în funcție de grosimea standardizată și de clasa de calitate a semifabricatului din care se confecționează elementul.

C2 = 0.6

Grosimea de proiectare Sp [mm] este grosimea cea mai mică a unui element de recipient stabilită astfel încât să îndeplinească toate cerințele funcționale ale recipientului și se calculează cu relația:

Sp = S0 + C1 + Cr

Sp = 0.649 +0.75 =1.399

C1= v = 0.05=0.75

Conform [10], pag. 215, anexa 1.12, Sp= 7 mm

Cr=7 –1.399=5.601

d) Verificarea elementului cilindric la stabilitate

S0* = Sp – C1 – C2

S0* = 5.45 mm

= 0.003

0.8 < 0.116 NU →

0.8 > 19.275 NU → Cilindru scurt

0.003 > 0.010 → NU → Elastic

Peca =

Cst1 = 2.6

Peca =

Peca = 0.084 MPa

unde: Peca – presiunea exterioară de calcul

– grosimea de rezistență efectivă a elementului cilindric

Pec < Peca

0.1 < 0.084 NU

S0*=S0*+1

S0*=6.45 mm

Sp=S0* +C1+Cr

Sp=6.45+0.75+5.6=12 mm

S0*=Sp-C1-C2

S0*=12 -0.75-0.8=10.45 mm

=0.005

=1.5

0.8NU

0.8NU cilindru scurt

0.005>1.054NUelastic

Peca=

Peca=0.31

PecPeca

0.10.31

Elementul cilindric corespunde proprietății de stabilitate.

Calculul de dimensionare pentru fundul elipsoidal al recipientului

Notații suplimentare

D – diametrul interior al elementului [mm]

H – înălțimea părții bombate a fundului [mm]

h – înălțimea părții cilindrice a fundului [mm]

ke – factorul de formă al fundului

pc1, pc2 – presiuni de calcul la verificarea fundului la presiune exterioară [MPa]

R – raza interioară de curbură la centrul fundului [mm]

Sp – grosimea de proiectare a peretelui fundului [mm]

Ke1, Ke2 – coeficienți

Conform tabelului 2.13 p. 59 [35]

Di = 1800 mm

H = 450 mm

h = 25 mm

Conform figurii 2.18 p. 54 [35], valoarea factorului de formă Ke = 0.90

Calculul razei de curbură

R =

R =

R = 1800 mm

S0 =

S0 = = 0.649 mm

C1 = 0.75mm

C2 = 0.6 mm

Sp=S0 +C1

Sp = 1.399conform STAS 437, Sp=7 mm

Cr=7 –1.399=5.601

= 5.45

= 330.275

= 0.25 mm

Conform tabelului 2.17 p. 53 [35]

σef = 23.741 MPa

Condiția de rezistență σef ≤0,9·σc20

σef = 23.741≤ 216

Ke = 0.90, figura 2.18 p. 54 [35]

k2 = 1 + 6·Ke2

k2 = 1 + 6·0.902

k2 = 1.786

Presiunea de calcul la verificarea fundului elipsoidal:

pc1 = 0.09·Et

pc1 = 0.09·209.8·103

pc1 = 1.078 MPa

pc2 =

pc2 =

pc2 = 1.172 MPa

peca = min(pc1; pc2) = min(1.078; 1.172) = 1.078 MPa

pec < peca

0.1 < 1.078

Condiția de stabilitate pec < peca este îndeplinită, deci elementul elipsoidal este stabil.

Caracteristicile dimensionale ale elementului elipsoidal

Calculul dimensional al capacului plan al recipientului

Notații:

D – diametrul interior al elementului cilindric [mm]

Dc – diametrul de calcul al capacului plan [mm]

Dm – diametrul cercului pe care acționează reacțiunea garniturii [mm]

Ds – diametrul cercului de așezare a șuruburilor [mm]

Di – diametrul unui orificiu oarecare aflat în secțiunea de slăbire maximă a capacului [mm]

F – forța totală rezultată din aplicarea presiunii interioare [N]

Fa – forța de calcul din șuruburi [N]

K0 – coeficientul de slăbire pentru capace cu orificii

Kp, Kp1, Kp2 – factori de formă ai capacelor

ng – numărul orificiilor din secțiunea de slăbire maximă

sp – grosimea de proiectare a fundului [mm]

spg – grosipea de proiectare a capacului plan cu rol de flanșă în zona de strângere a garniturii [35], p. 60.

Grosimea de proiectare a capacului plan trebuie să aibă o valoare mai mare sau egală cu grosimea de proiectare a elementului cilindric [35], p. 60.

Se impune condiția ca diametrul maxim al unui orificiu practicat pe un capac plan să depășească 0.75 din valoarea diametrului de calcul.

di max ≤ 0.75·Dc [35], p.60

di max ≤ 0.75·1800, K0 = 0.85

di max ≤ 1350mm alegem di max = 1150 mm

K0 = 1 – 0.43

K0 = 1 – 0.43

Dc = D

K0 = 0.580

S0 =

Este necesar alegerea tipului de flanșă pentru calcularea d1, d2.

S-a ales flanșă PU, cu suprafață plană cu umăr conform figurii: CP-700-M24, STAS 9801/6-79/OL 372R.

Conform tabelului 2.30, p. 125 [35] se aleg în funcții de D =1800

di = 1800 mm

d1 = 1960 mm = De

d2 = 1910 mm=Ds

nxd3 = 72

d4 = 1830 mm

S1=10

unde:

d1 – diametrul interior al filetului șurubului [mm]

d2 – diametrul mediu al filetului șurubului [mm]

Ds – diametrul cercului de așezare a șurubului

nxd3 – numărul de șuruburi x diametrul șurubului

Se alege material de etanșare clingheritul care are grosimea de 3 mm și m = 2 și q = 11.2 N/m2, conform tabelului 2,43, p. 160 [35].

Se alege suprafața de etanșare plană cu umăr varianta A.

Garnitură A 1800-M24 STAS 9801/3-79.

Caracteristici garnitură:

d1 = 1886 mm

d2 = 1825 mm

b1 = (d1 – d2)/2

conform tabelului 2.43, p. 160 [35].

Alegerea șuruburilor

D – diametrul capului șurubului = 36 [mm]

dt – diametrul tijei = 24 [mm]

conform tabelului 2.39, p. 152 [10].

Piuliță M20 STAS 4971/79 cu D = 39.98 mm

Șaibă Growen N24 STAS 7066/2-80 cu

d1 = 24.5 mm

d2 = 35.5 mm, conform tabelului 2.41, p. 154 [35].

Calculul tensiunilor admisibile pentru mateialul șuruburilor:

css – coeficientul de siguranță care se ia în funcție de raportul

css = 2.3 conform [35] pag. 158

= 126.08 MPa

= 126.08 MPa

b1 =

Se alege b0 = = 12.5 mm conform tabelului 2.42, pag. 159 [35]

Verificarea garniturilor și a șuruburilor

Dm =

bo = bef

Dm = 1855 mm

F0 = π·Dm·bef·q

F0 = 3.14·1855·12.5·26

F0 = 1893027.5 N

FG = 2π·Dm·bef·m·pc

FG = 2·3.14·1855·12.5·2.75

Conform [ ] ,pag. 160, relația 2.34

M=2.75 și q=26 [N/mm2]

FG = 40044.812 N

F =

F =

F = 270120.462 N

FD =

FD =

FD = 254340 N

FT = F – FD

FT = 270120.462 – 254340

FT = 15780.42 N

Anec 0 =

Anec 0 = = 15014.490 mm2

Anec 0 = 15014.490 mm2

Anec 1 =

Anec 1 =

Anec 1 = 2460.067 mm2

Anec = max(Anec o; Anec 1)

Anec = max(15014.490 ; 2640.067)

Anec = 15014.490 mm2

d1 < dt

36 < 24 – NU

Aef = 72

Aef = 32555.5 mm2

Condiția de rezistență a șuruburilor este:

Aef > Anec

32555.5 > 15014.490 șurubul rezistă

FS =

FS =

FS = 2998813.43 N

bmin =

bmin =

bmin = 13.551 mm

bmin < b1

13.551 < 25 garnitura rezistă la prestrângere

Verificarea flanșelor, șuruburilor și a garniturii

aG =

aG = 27.5 [mm]

unde: aG – distanța radială dintre cercul de așezare a șuruburilor și cercul pe care este repartizată forța FG [mm]

aD =

aD = 55 mm

unde: aD – distanța radială dintre cercul de așezare a șuruburilor și cercul pe care este repartizată forța FD [mm]

aT =

aT = 41.25mm

unde: aT – distanța radială dintre cercul de așezare a șuruburilor și cercul pe care este repartizată forța FT [mm]

MS = FS·aG

MS = 29988813.43

MS = 82467369.33 N·mm

unde: MS – momentul încovoietor rezultat din acțiunea forței FS

M0 = MS

pentru OLC 35I

σ = min

σ

σ = min{193.33; 204.16}

σ = 193.33 MPa

σ = min

σse va calcula prin interpolare

σc50 = 287.24 MPa

σa50 = min

σa50 = min [191.494; 204,16]

σa50 = 191.494 MPa

M0 =

M0 = 81684200.18 N·mm

unde: M0 – moment încovoietor [mm·N]

Mi = FD·aD + FG·aG + FT·aT

Mi = 254340

Mi = 14750874.66 N·mm

unde: Mi – moment de încovoiere total [N·mm]

Mic = max(M0; Mi)

Mic = max(81684200.18 ; 14750874.66)

Mic = 81684200.18 N·mm

unde: Mic – momentul încovoietor de calcul din flanșă [N·mm]

K =

De – diametrul exterior al flanșei

De = 1960 mm conform tabelul 2.9, pag. 119 [35]

D = 1800 mm

K = = 1.08

Y =

Y =

Y = 22.443

KM =

KM =

KM = 0.146

unde: KM – factor de corecție a momentului Mic

h – grosimea minimă a talerului flanșei

KM < 1

Vom lua, conform schemei 2.89, p. 163 [35]

KM = 1

σT = 70.726 MPa

unde: σT – tensiunea efectivă din flanșă

σT <

70.726 < 191.494

În concluzie flanșa rezistă la condițiile de lucru, având înălțimea talerului 120 mm

Construcția și amplasarea racordurilor

Dimensiunile nominale ale racordurilor se aleg, în funcție de diametrul recipientului și de tipul constructiv.

Recipient cu Di = 1800 mm de tip RV1

R1 – intrare soluție 1

R2 – intrare soluție 2

R3 – racord de golire

R4 – intrare agent termic (100 mm)

R5 – ieșire agent termic (100 mm)

R6 – aerisire

R7 – termocuplu

Gi – gură de inspecție

Dimensionarea capacului se face conform figurii 2.25, p.62 [35].

K0 = 1

ng = 5

Dacă ng > 1 ; 5>1

K0=

K0=

K0=0.782

S0 =

Se alege Kp = 0.45 conform [35], pag. 61

S0 =

S0 = 0.026 mm

Sp = 0.026 + 0.75

Sp = 0.776mmconform STAS 437 Sp=7 mm

Cr=7 –0.776=6.224

S0* = Sp – C1 – C2

S0* = 7 –0.75 –0.8=5.45 mm

S0* = 5.45 mm

Kp1 =

Kp1 =

Kp1 = 1.557

Kp2 = 0.8

Kp2 = 0.8

Kp2 = 0.137

S0 =

S0 =

S0 = 0.544 mm

Sp = 0.544 + 0.75

Sp = 1.294 mmconform STAS 437 Sp=7 mm

Cr=7-1.294=5.706

S0* = 7-0.75 – 0.8

S0* = 5.45 mm

σef = 59.244

σef < x0.9

59.244 < 216 →

→ Spg = Kp2

Spg = 0.137

Spg = 19.117 mm

Spg < 0.85xSp

Spg = 0.85·Sp

Spg = 5.1 mm

unde: Spg – grosimea de proiectare a capacului plan cu rol de flanșă în zona de strângere a garniturii

Sp – grosimea de proiectare a fundulu

Capacul are dimensiunile: Sp=7 mm

Spg=5.1 mm

Calculul compensării orificiilor

Existența orificiilor în elementele de rezistență ale recipienților duce la micșorarea capacității de rezistență a acestora, datorită decupării de material, constituind în același timp puternici concentratori de tensiuni în zonele limitate orificiilor.

Se pune problema dacă orificiile de pe diametrul d sunt învecinate între ele.

Se apelează la geometrie. Unghiul dintre oricare două orificii mai apropiate este de 60ºC, deci avem triunghi echilateral și distanța dintre centrele a oricăror două orificii mai apropiate este de 575 mm.

a1=R-R1-R2

a1=575-50-50=475 mm

a1<aonsunt învecinate;

a2=R-R2-R6

a2=575-50-40=485 mm

a2<aonR2 și R6 sunt învecinate;

a3=R-R6-R7

a3=575-40-20=515 mm

a3<aonR6 și R7 sunt învecinate;

a4=R-R7-GI

a4=575-20-200=355 mm

a4<aonR7 și GI sunt învecinate;

a5=R-R1-GI

a5=575-50-200=325 mm

a5<aonR1 și GI sunt învecinate.

Un orificiu se consideră izolat dacă distanța față de orificiul cel mai apropiat satisface condiția:

ao>aon=2

aon=2=542.785 mm

Diametrul de dispunere al racordurilor pe capac este d=1150 mm

=575 mm raza cercului de dispunere a racordurilor

dR1==50 mm

dR2==50 mm

dR6==40 mm

dR7==20 mm

dGI==200 mm

Compensarea orificiilor pentru capac:

Sor =

d = 400 mm

Sor =

Sor = 0.15 mm

Sor* = Spr – c1 – 0,125Spr

Spr = Sor + c1 + cr

Spr = 10 mm

Sor* = 10 – 0.75 – 0.125·10

Sor* = 8 mm

Sor* > Sor

Sor* = Spr – c1 – c2

Sor* = 10– 0.75 – 1

Sor* = 8.25 mm

don = 2

don = 2

don = 423.474 mm

d < don

Orificiul necesită compensare

Kr=min(art/at;1)=1

Ki=min(ait/at;1)=1

Alegem inel de compensare din acelasi material ca si materialul recipientului

himax=

himax=

himax=28.337[mm]

hic=min(hi ; himax)

hic= min(20; 28; 337)

hic=20[mm]

Ari=hic()

Ari=20(8-0.75)1

Ari=145[mm2]

Adec=

Adec=

Adec=30.1125[mm2]

Sci=0;

hemax=

hemax=

hemax=70.843[mm]

hec=min(hemax; he)

hec= min(70.843; 100)

hec=70.843[mm]

Lmax=

Lmax=

Lmax=266.765[mm]

Ape=Lmax

Ape=266.765

Ape=1836.376[mm2]

Are=

Are=

Are=599.786[mm2]

Ai=

Ai=0[mm2]

Acom=2556.65[mm2]

Luăm ci=15[mm]

hemax=Sci+1.25

hemax=85.843[mm]

hec=min(hemax; he)

hec=85.843[mm]

Lmax=

Lmax=314.755[mm]

Ape=Lmax

Ape=

Ape=2166.734[mm2]

Are=575.274[mm2]

Ai=

Ai=

Ai=4721.325[mm2]

Acom=Ari+Are+Ape+Ai

Acom=145+575.274+2166.734+4721.325

Acom=7608.333[mm2]

;

Sci>0

Spi=Sci+Cr=15+0

Spi=15[mm], conform [35], pg 215, anexa I.12.

Lp=

Lp=

Lp=332.487[mm]

Orificiul este compensat cu inel, având dimensiunile :

Spi=15[mm]

Lp=332.487[mm]

Semnificația mărimilor :

Sp – grosimea de proiectare a elementului de recipient pe care se află orificiul

hic – lungimea de execuție a părții interioare a racordului, care participă la compensare [mm]

hi – lungimea de execuție a părții interioare a racordului și se stabilește constructiv, conform [35], pg 102, fig 2.50 rezultă hi=20[mm]

Ari – suprafața din partea interioară a racordului [mm2]

Adec – suprafața secțiunii transversale [mm2]

hec – lungimea părții exterioare a racordului, care participă la compensare [mm]

Lp – lățimea de proiectare a inelului de compensare [mm]

he – lungimea de execuție a părții exterioare a racordului și se alege constructiv, conform [10], pg 102, fig 2.50 ca fiind he=100 [mm]

Lmax – înălțimea maximă efectivă a inelului de compensare cu grosimea de calcul Sci [mm]

Spi – grosimea de proiectare a inelului [mm]

Ape – suprafața din grosimea elementului pe care se află orificiul [mm2]

Are – suprafața din partea exterioară a racordului [mm2]

Ai – suprafața inelului de compensare care participă la compensare [mm2]

Am – suprfața totală disponibilă a elementelor care participă la compensare în planul considerat [mm2]

Verificarea recipientului la proba hidraulică

Verificarea recipientului la proba hidraulică constă în umplerea acestuia cu un lichid, în general apă până la nivelul racordului cel mai de sus.

Verificarea la proba hidraulică are drept scop verificarea etanșeității acestuia la elementele sudate și a îmbinării cu flanșe.

Trecerea la proba hidraulică se consideră reușită dacă nu se constată:

– deformări plastice vizibile

fisuri sau crăpări în corp, capac, fund.

Suporți pentru recipienți

Așa cum s-a stabilit în subcapitolul de mai sus vasul de reacție este dotat cu suporți laterali confecționați din oțel Ol 37.2K STAS 500/2-80.

Pentru sprijinul vasului de reacție se folosesc suporți laterali STAS 5455-82, pentru temperaturi de lucru t < 200oC.

Suporturile se aleg standard în funcție de condițiile de sarcină totală de încărcare.

Numărul minim de suporți pentru recipient este 3.

Z =

G – greutatea maximă a aparatului

G1 – sarcina maximă pe care o poate prelua un suport

G = Gvas + Gangrenaj

Gvas = Gcorp + Gfund + Gcapac + Gmanta

Pentru calcularea greutății mantalei este necesară dimensionarea ei.

Mantalele se execută din oțel carbon, oțel slab aliat, în funcție de natura agentului termic utilizat. La recipientele din oțel aliat se pot prevedea mantale din oțel carbon cu condiția ca sudurile de racordare a mantalei la corpul recipientului să fie realizate cu material de adaos don oțel aliat de compoziție corespunzătoare.

Amplasarea racordurilor de intrare și ieșire a agentului termic se va face în așa fel încât să se evite spațiile moarte în spațiul de răcire sau înczire.

Dimensionarea de rezistență a elementelor constructive ale mantalei se face pe baza solicitării la presiune interioară, adică la presiunea agentului termic urmărind algoritmi de calcul corespunzători formei geometrice a elementului de manta.

Se va lua diametrul mantalei egal cu diametrul imediat superior diametrului nominal al carpului cilindric.

Dm = 1900 mm

Gcorp = oțel

Gcorp = 1294

Gcorp=4934.493 N

Gfund =

= 0.86

Gfund =

Gfund = 1456.114 N

Gcapac =

Gcapac =

Gcapac = 612.498 N

Gm =

Gm =

Gm = 75199.185 N

Gvas = 4934.493 + 1456.114 + 612.498 + 75199.185

Gvas = 82202.290 N = 82.202kN

Se aleg pentru dotarea vasului de reacție cu suporți laterali ce suportă o greuate de 40 kN pe suport msupor = 25.4 kg.

Caracteristicile dimensionale suport, [35], pag. 177.

Calculul dipozitivelor de amestecare

Amestecarea în vasul de reacție se realizează cu ajutorul unui amestecător cu paletă. Caracteristicile dimensionale ale amestecătorului sunt fate în funcție de dimensiunile geometrice ale recipientului și anume diametrul. Materialul de construcție pentru amestecător și arborele acestuia se alege în funcție de mediul de reacție, vâscozitatea amestecului, temperatura și presiunea din recipient.

Caracteristicile dimensionale ale amestecătorului cu paletă.

d = 0.5xD

d = 0.5×1800

d = 900 mm

h = 0.9xd

h = 0.9×900

h = 810 mm

h1 = 0.1xD

h1 = 0.1×1800

h1 = 180 mm

h3 = 1.2xD

h3 = 1.2×1800

h3 = 2160 mm

n = 40 rot/min

Amestecătorul se confecționează din oțel OLC 35I STAS 880-80, caracteristicile mecanice ale oțelului au fost prezentate .

a) Calculul puterii necesare pentru acționarea amestecătorului

N = Np [kW]

Valoarea numărului caracteristic de putere Np, se stabilește în funcție de criteriul Reynolds din tabelul 3.18, pag. 209 [35].

Re = 16.25

Re = 16.25

Re = 28.97

Np = f(Re)

Np = 0.95

N = 0.95

N = 1.207 kW

Nef = [kW]

k = 1.5 pag.206

φ1 = 0.3

φ2 = 0

φ3 = 0

φ4 = 0

ηt = 0.292·0.973

ηt = 0.41·0.91

ηt = 0.95 [CP]

Nf =

Nf =

Nf = 1.490 kW

Conform [35] pag.215 avem:

m=4 și b==51 mm, =1.7, =0.1

Nef =

Nef = 2.477kW

Acționarea dispozitivelor de amestecare se face prin intermediul motoarelor electrice iar turația este adusă la turația de lucru cu ajutorul reductoarelor de turație. Alegerea motoreductorului se face în funcție de puterea efectivă necesară amestecării și turația de amestecare.

Reductoarele de turație pot funcționa într-o treaptă, două sau trei trepte. Legătura dintre motoreductor și arborele amestecătorului se face prin intermediul unui cuplaj. Se folosește un motoreductor tip 2I-A cu turația de ieșire 150 rot/min și putere de acționare Nef = 3 kW.

Simboluri:

– da – avergura amestecătorului [mm]

– ρ – densitatea mediului de reacție [kg/m3]

– η – vâscozitatea mediului de reacție [CP]

– d – diametrul arborelui [mm]

– m – numărul de inele de etanșare

– b – lățimea inelelor de etanșare [mm]

– µ – coeficient de frecare între arbore și umplutură

– pc – presiunea de calcul [MPa]

– N – puterea de calcul necesară acționării arborelui [kW]

– Np – coeficient de putere

– Nef – puterea efectivă de acționare [kW]

– ηt – randamentul sistemului de acționare al motorului

– φ1 – factor de majorare datorat rugozității pereților vasului

– φ2 – factor de majorare datorat recorectării unor teci pentru termometre sau termocuple

– φ3 – factor de majorare datorat recorectării de termoplonjoane

– φ4 – factor de majorare datorat recorectării de serpentive interioare.

[35], pag. 204

b) calculul și construcția arborelui amestecător

Pentru o funcționare sigură adispozitivelor de amestecare arborii nu trebuie să se rupă sau să sufere deformații permanente. Arborele amstecătorului este supus eforturilor de încovoiere datorită opririlor accidentale șî la tensiune datorată transmiterii mișcării de rotație.

Mt = 9,554×106

Mt=9.554

Ks=2.5 pag.229

Mt = 0.37·106 [N·m]

Fmax =

Fmax =

Fmax = 1096.294 N

dnec =

Marca oțelului din care e confecționat arborele: OLC 35I cu

σr = 580 MPa

σ0,2 = 360 Mpa

E = 206·103 MPa

σ-1 = 260 Mpa, [35], pag. 228.

Pentru oțeluri cu σr = (500 . . . 600) se va alege σa ≤ 40.

Alegem σa = 37 MPa, [35], pag. 229.

dnec =

dnec = 37.07

Se va alege din tabelul 3.32 [35] diametrul minimal al arborelui astfel încât dnorm > dnec.

d = 40 mm

Stabilirea lc1, lc2, lr

Pentru lr se recomandă valorile: 250; 325; 400 și 500 mm.

Vom lua lr = 325

lc1/lr ≤ 6

lc1/325 ≤ 6

lc1 ≤ 325×6

lc1 ≤ 1958 mm

Vom lua lc1 = 1800 mm

Mi max = Fmax x lc1

Mi max = 1800 mm

Mi max = 1973329.2 N·mm

Mech =

Mech =

Mech = 1998167.911 N·mm

σef =

σef =

σef = 7136.313 Mpa

σaiI =

c = 1.3 pag.230

σc = 360

σa i I =

σa i I = 276.9 MPa

σef < σa i I

dnec=

dnec=41.896 mm conform STAS 5567-76, d=50 mm

Stabilirea diametrelor treptelor arborelui STAS 5567-76, figura 3.16, [35], pag. 238.

dmin = min(d9; d10)

d9 – diametrul în zona de fixare a cuplajului

d10 – diametrul în zona de fixare a amestecătorului

d9 = 45 mm

d10 = 40 mm

dmin= min(45; 40)

dmin = 40 mm

ef=

=

=29.45

σef < σa

Lagăre necesare pentru arborele amestecătorului.

Arborele amestecătorului se sprijină pe turelă prin intermediul a 2 lagăre cu rulmenți. Lagărele pentru rezemarea dispozitivului de amestecare trebuie să asigure:

– sprijinirea axială a dispozitivului

– prelucrarea sarcinilor rapide din cele 2 reazeme

– deformarea liberă a arborelui în anumite condiții

Pentru realizarea acestor 2 deziderate în lagărul superior se montează doi rulmenți radial-axiali cu role conice atât arbore câț și în carcase ce se sprijină pe turelă.

În lagărul inferior se montează un rulment radial oscilant cu role butori fixat doar pe arbore permițând astfel mici depasări axiale ale arborelui și deformarea arborelui de încovoiere. Se poate spune că lagărul inferior preia eforturile la oscilații și încovoieri a arborelui.

Dispozitivele de rezervare se aleg din STAS 10868-77 în funcție de diametrul reductorului al arborelui.

Caracteristicile dimensionale STAS 3918-80

Ungerea lagărelor dispozitivelor de amestecare se face cu unsoare cu ajutorul ungătoarelor cu bile montate în carcasele lagărului. Pentru etanșarea lagărului se folosesc în partea inferioară inele, mansetă de rotație, iar în partea superioară inele de pâslă, montate în lăcașe STAS 7950-83 șî STAS 6577-70.

Caracteristici dimensionale pentru inele din pâslă

Caracteristici dimensionale locaș manșete de rotație STAS 7950/3-83.

Notații:

rt – momentul de tensiune maxim transmis arborelui [N·mm]

dnec – diametrul necesar pentru arborele amestecătorului

σa – tensiunea admisibilă la trosiune [MPa]

lc1 – lungimea arborelui până la primul lagăr [mm]

lc2 – lungimea arborelui de la lagărul superior la cuplaj [mm]

Fmax – forța maximă transmisă arborelui [N]

Mec – momentul încovoietor echivalent [N·mm]

σef – teniunea de încovoiere a arborelui [MPa]

σac – tensiunea admisibilă la încovoiere [MPa]

Iz – momentul de inerție a secțiunii arborelui

Gd – greutatea dispozitivului de amestecare

ng – turația critică a arborelui fără greutate proprie [rot/min]

fd – săgeata arborelui [mm]

nf – turația critică a arborelui fără amestecător [rot/min]

ncr – turația critică [rot/min]

E – modulul de elasticitate [MPa], [35], pag. 228

c) Calculul de dimensionare a penelor paralele

În construcția dispozitivului de amestecare se utilizează amplasarea prin pene paralele între arbore și amestecător.

Dimensiunile penelor se aleg din STAS 1008-81 în funcție de diametrul arborelui în dreptul amestecătorului și pe baza solicitării penei la forfecare.

Penele se execută din același material ca și arborele amestecătorului sau STAS 500/2-80. Asamblarea cu pene paralele se utilizează și la fixarea semicuplajului de arbore.

Calculul de dimensionare s-a făcut pentru asamblarea arborelui amestecătorului.

Mt = 0.37·106 N·mm

d = 50 mm

= 37 MPa

σa = 100 MPa

Valori STAS pentru pană: b = 16 mm; h = 10 mm; l = 45 – 180 mm

lc = = 32.88 mm

lc<lmax DA lSTAS=50 mm

σef =

σef = 18.5MPa

Condiția de rezistență σef < τ

18.5 < 37

d) Calculul cuplajului

Cuplajul este un ansamblu care face legătura între motorul electric și arborele amestecătorului.

Cuplajul utilizat este un cuplaj elastic cu brațuri STAS 5982/6-81. Cuplajul se alege în funcție de momentul de torsiune necesar de transmis, de diametrele capetelor de arbori și turația la care funcționează cuplajul.

Mt = Mc·cs

cs = 1.7

Mc = 9554

Mc = 288.291 [N·mm]

Mtc = 288.291·1.7

Mtc = 490.096 [N·mm]

Caracteristici dimensionale

Mn – momentul nominal al cuplajului [N·mm]

Mc – momentul de calcul determinat de puterea motorului K [N·mm]

e) Alegerea cutiei de etanșare

Cutia de etanșare are rol de a izola mediul din interiorul recipientului de mediul din exteriorul acestuia. Alegerea cutiei de etanșare se face în funcție de presiunea și temperatura din recipient. Caracteristicile dimensionale ale acestora se aleg STAS în funcție de diametrul arborelui amestecător. Cutia de etanșare se fixează pe capacul amestecătorului.

Caracteristici dimensionale

5.2.2.Proiectarea tehnologică

Proiectarea tehnologică a pompei centrifuge

Amestecul apă-alcool polivinilic 8% necesar procesului de imobilizare se introduce în reactor cu ajutorul unei pompe cu roți dințate.

Debitul pompei se determină împărțind volumul de materie primă la timpul de încărcare.

V = 43.509·10-3 m3

τ = 10 min

Qv =

Qv = 0.072·10-3 m3/s

Puterea necesară motorului pompei se calculează cu formula (1):

P = (1)

unde: Qv – debitul volumetric al motorului în m3/s

g = 9,81 m/s2 – accelerația gravitațională

– densitatea lichidului pompat în kg/m3

H – înălțimea totală de ridicare a pompei, în metri coloană de lichid pompat

η – randamentul total al instalației de pompare, care reprezintă produsul dintre randamentul pompei ηp și randamentul transmisiei ηt și randamentul motorului ηm

= p·t·m

Se consideră:

p = 0,8

t = 0,90

m = 0,95

= 0,8·0,9·0,95

= 0,726

unde: p1, p2 – presiunile la suprafața lichidului în spațiul de refulare și în spațiul

de aspirație [N/m2]

ρ – densitatea lichidului pompat [kg/m3]

Hg – înălțimea geometrică de ridicare a lichidului [m]

hp – pierderea de presiune pentru învingerea tuturor rezistențelor locale în conductele de aspirație și de refulare (inclusiv rezistențele locale la ieșirea lichidului din conductă în spațiul de refulare) [m]

g = 9,81 – accelerațoia gravitațională [m/s2]

[m]

Valoarea presiunii realizată de pompă p se calculează ca sumă a următorilor termeni:

p = pd + + pf + prl + pl + pst

unde: pd – presiunea consumată pentru producerea energiei cinetice la ieșirea din conductă [N/m2]

pf – presiunea pierdută pentru învingerea forțelor de frecare [N/m2]

prl – pierderile de presiune pentru învingerea rezistențelor locale din sistem [N/m2]

pt – diferența de presiune dintre spațiul în care se refulează lichidul și spațiul din care se aspiră [N/m2] – considerată zero

pr -ρgH – presiunea consumată pentru ridicarea lichidului [N/m2]

unde: w – viteza curentului [m/s]

Viteza de circulație se alege după caz avându-se în vedere limitele uzuale acceptate [36] p. 60.

Se alege: w = 0.5 m/s

= 133.25 [Pa]

[Pa]

Se calculează suprafața ca fiind

S = = = 0.144·10-3 m2

dech = 0.013 m

Conform STAS 403-57 diametrul conductei este dcond = 32 mm, cu diametrul nominal dn = 28 mm.

Se recalculează viteza lichidului cu formula:

w = 0.179 m/s

Coeficientul de frecare depinde de forma secțiunii țevii și de mărimea Re, dar și de rugozitatea pereților conductei.

Re =

Re =

Re = 55.538 → regim laminat

Rugozitatea absolută a țevilor trase și sudate la coroziune neînsemnată este:

e = 0,2 mm

=65

Din diagrama variației coeficientului de frecare λ, în funcție de criteriul Re și de rugozitate avem:

λ = 0.043 [36]

Lungimea totală a conductei este 150 m.

Δpf = 0.043

Δpf = 66112.5 [Pa]

Pe conductă considerăm următoarele rezistențe locale:

1 intrare în țeavă (cot ascuți): ξ = 0,5

1 ieșire din țeavă: ξ = 1

6 coturi de 90o standardizat din fontă cu filet pentru diametru nominal de trecere 28 mm: ξ = 1,5

2 ventile normale pentru un diametru dcot = 32 mm: ξ = 4,36

1 robinet de probă: ξ = 6,2

p = pd + + pf + prl + pl + pst

p =

p =+

p = 110666.672 Pa

Astfel înălțimea manometrivă de ridicare este:

În acest caz p1 = p2 = p0

H = Hg + hp

H = Hg +

H = 10 +

H = 20.58 m

Puterea N a motorului este:

N =

N =

N = 0.021 kW

De obicei motorul instalat are o putere mai mare decât cea calculată anterior, pentru a dispune de o rezervă la o eventuală supraîncărcare.

Ninst = β·N

în care:

Ninst – puterea instalată

N – puterea necesară

Coeficientul de siguranță se alege în funcție de N și este: 2,5.

Ninst = 2.5·0.021

Ninst = 0.052 kW [36].

Proiectarea tehnologică a reactorului

Pentru procesul de pulare este necesar ca în reactor să se mențină o temperatură de 50oC. Aceasta se face cu ajutorul agentului de încălzire care este apa.

Aria de transfer termic este:

At = Acil + A1

A1 – aria semielipsoidului

Acil – aria cilindrului

Acil = π·DHc+2R2

Al= π·R2 +

Acil = 3.14

Ac = 13.225 m2

A = 3.14·0.92 +

= 0.86

A1 = 3.002 m2

At = 13.225 +3.002

At=16.227 m2

Determinarea temperaturii aburului de încălzire

Se caută în STAS presiunea corespunzătoare la care trebuie adus amestecul și anume 50oC. Se ia apoi din tabel valoarea presiunii imediat superioare, se găsește temperatura corespunzătoare a aburului de încălzire.

50oC → 0.1258 ata

0.1258 ata = 0.127 at = 1.226 bar

760 mmHg = 1.03 ata

735 mmHg = x ata

────────────────────────────

x = = 0.99 ata

1 ata = 0.99 ata = 9.81·104 Pa = 735 mmHg

x ata……0.1258 ata ……..y Pa

─────────────────────────────

x = 0.127 at

y = 1.25·104 Pa·.9.81 = 12.26·104 Pa

y = 1.226 bar [36] p. 530, tabelul LVIII

Admitem din tabelul cu presiuni nominale

p = 3 bar = 0.307 ata [ ] p. 29

Interpolăm:

50o 0.1258

δ y

Δ xo 0.307 Y

70o 0.3177

20 ─────── 0.1919

x-50 ─────── 0.1812

─────────────────────────

x =

x = 18.850

x = 68.88oC

Temperatura aburului de încălzire 68.88oC.

Temperatura inițială a mediului de reacție este temperatura camerei. În acest caz vom lua 18oC.

Zona de încălzire I

Scriem bilanțul termic:

Qcedat = Qtransferat = Qprimit + Qpierderi

Qpierderi = 5% Qprimit

Qprimit = mCpΔT

Qprimit = 2530.92

Qprimit = 3.409·108 J

Admitem K = 1300 [W/m2·K], [36], tabelul 4.6, pag. 178

ΔTmed =

unde: ΔTM = 68.8 – 18

ΔTM = 50.8

ΔTm = 68.8 – 50

ΔTm = 18.8

ΔTmed =

ΔTmed = 32.19

Qprimit = K·A· ΔTmed·τ

τ =

τ =

τ = 8.36 minute

unde: τ – timpul încălzirii mediului de reacție

Qcedat = mv·r68,8ºC

unde: mv – masa aburului de încălzire

r68,8ºC – căldura latentă de vaporizare la 68.8oC

r68,8ºC = 2333 kJ/kg, [36], pag. 528, tabelul LVI.

Qcedat = Qprimit + Qpierderi

Qpierderi = Qprimit

Qpierderi = 3.409·108 J

Qpierderi = 0.170·108 J

Qcedat = 3.409·108 + 0.170·108

Qcedat =3.579·108 J

mv =

mv = 153.40 kg

Zona de menținere II

Pentru precipitarea alcoolului polivinilic este necesar menținerea mediului de reacție la temperatura de 50oC timp de 50 minute.

Qcedat = = K·A· ΔTmed·τ

K =

ΔT = 68.8 – 50

ΔT = 18.8

K =

K = 23.463 W/m2·K

Zona de răcire III

În această etapă mediul de reacție se va răci de la 50oC la 30oC pentru a nu se solidifica sulfatul de amoniu și apoi amestecul este separat printr-un filtru Nutsche.

ΔTmed =

Calculul constantei C se face utilizând următoarele date experimentale:

Tri = 15oC – temperatura de intrare a apei reci

Trl1 = 42oC – temperatura de ieșire a apei reci 1

Trl2 = 40oC – temperatura de ieșire a apei reci 2

Tc1 = 53oC – temperatura apei calde 1

Tc2 = 50oC – temperatura apei calde 2

Agentul de răcire circulă in echicurent și intră la temperatura de 15oC și iese la temperatura de 25oC.

C =

C = 3.35

= 0.57

ΔTr = 50 – 25 = 25

ΔTm = 30 – 15 = 15

ΔTmed =

ΔTmed = 27.8

Admitem K = 1000, [8] pag. 178, tabelul 4.6

Qcedat = Qprimit + Qpierderi

Qprimit = mCpΔT

Qprimit = 2530.92·4185(50-30)

Qprimit = 2.118·108 J

Qpierderi = Qprimit

Qpierderi = 2.118·108 J

Qpierderi = 0.105·108 J

Qcedat = 2.118·108 + 0.105·108

Qcedat = 2.223·108 J

Qcedat = = K·A· ΔTmed·τ

τ =

τ =

τ = 6.31 minute

unde: τ – timpul necesar răcirii

mr·Cpr·ΔTr = Qcedat

unde: mr – masa agentului de răcire

Cp1 – căldura specifică a apei

mr =

mr =

mr = 5335.7 kg

Calculul coeficientului total de transfer termic, K

Criteriul Reynolds caracterizează raportul dintre forțele de inerție și de frecare din fluid.

Transmiterea căldurii prin convecție pentru suprafețe plane sau cilindrice în aparate cu manta poate fi calculat cu relația [36], pag. 166.

Nu = C·Rem·Pr0.33

Nu =

Re =

p =

unde: D – diametrul vasului

n – turația ahitatorului

da – diametrul paletei agitatorului [m]

ηp, η – vâscozitatea lichidului la temperatura peretelui

– temperatura medie: [Pa·s]

Nu =

Din Nu vom calcula α.

Pr =

unde: λ – coeficient de conductivitate termică

Din:

λ = 0.57 kcal(m·hoC)

λ = 0.66 W/m·K

Cp = 4185 J/kg

υ = 0.55CP = 0.55·10-3 Pa

η = 0.47·10-3

ηp = 0.410-3

Pr =

Pr = 3.49

Re =

Re = 12051, 9 → regim turbulent

Γ =

Γ = 2

C = 0.38

m = 0.67, [36], pag. 167

Nu = 0.38·12051.90.67·3.490.33

Nu = 0.38·542.38·1.5·0.5·1.04

Nu = 160.75

Nu =

160.75 =

α = 122.17 W/m2·K

Calculăm coeficientul parțial α al aburului din manta.

T = 68.8oC

Re =

τ = 15 min

dmanta =100 mm = 0.1 m S =π·D·H = 3.14·0.1·1.623

S = 0.512 m2

Qv =

V =

mabur = 153.40 kg

ρabur = 0.137 kg/m3, [36] pag. 528

V =

V = 1116.78 m3

Qv =

Qv = 1.240 m3/sec

wabur=

wabur = 3.27 m/s

Re =

Re = 26475 → regim turbulent

Din [36] pag. 540, tabelul XII se alege în funcție de criteriul Reynolds, coeficientul parțial de transmitere a căldurii.

α =

Pentru gaze:

Nu = c·ε1·Re0,8

Nu = 0.018·ε1·Re0,8

= 13, [8] pag. 160, tabelul 4-3

ε = 1.18

Nu = 0.018·1.18

Nu = 73.353

α =

Coeficientul de conductivoitate temrică la gaze [W/m·K] la presiuni mici, poate fi calculat cu formula:

λ = β·Cv·η

unde: Cv – căldura specifică a gazului la volum constant [J/kg·K]

η – vâscozitatea dinamică a gazului [Pa]

– coeficient

K = – indicele adiabatic

K = 1.4, [36] pag. 497, tabelul V

β = 1.9

Cv = 197 kJ/kg

λ = 1.9·197·0.022·10-3

λ = 8.23·10-3 [W/m·K]

α =

α = 6.036 W/m2·K

K = , [36] pag. 174

Suma rezistentelor termice ale peretelui oțelului și depunerilor [36], pag. 135, tabelul XXVIII.

= 0.00047 m2K/W

q = K·ΔTmed =

Se obține ecuația:

0.0081·q0.5 + 0.00047·q + 0.1656·q0.32 – 32 = 0

Această ecuație se rezolvă grafic, dând valori lui q, din care la y = 0 se găsește 57300 W/m2.

K = = 1780 W/m2·K, [36], pag. 195, exemplul 4-19.

Proiectarea tehnologică a uscătorului

Pentru scarea biluțelor obținute în etapa de perlare se va folosi un uscător tip dulap la care s-au determinat parametrii critici prin măsurători experimentale și la care se cunoaște suprafața A, timpul de uscare se calculează cu relația:

, [32], pag. 93

Determinările trebuie făcute în aceleași limite de umiditate și aceleași condiții care există în uscătorul experimental; viteza de trecere a aerului, umiditatea, temperatura de intrare și ieșire a aerului, grosimea stratului de material supus uscării.

Timpul de uscare este aproximativ egal cu timpul de uscare din uscătorul de laborator.

Se determină suprafața necesară pentru uscătorul industrial utilizând datele experimentale din laborator.

Viteza de uscare reprezintă cantitatea de apă îndepărtată pe unitate de suprafață, a materialului în unitate de timp.

Linia de variație a umidității materialului funcție de timp se numește curba uscării, iar linia de variație a vitezei de uscare cu umiditatea materialului reprezintă curba vitezei de uscare.

Curba uscării

Atăviței = 0,011 m2

At = π·R2

R = 0,06 m

mnisip = 10g nisip + 5 g H2O

mnisip = 15 g

Sind =

Sind =

Sind = 19.8 m2

Date experimentale

u =

unde: ma – masa de apă îndepărată

map – masa de apă din probă

Se reprezintă grafic u = f(t) și se determină valoarea lui ucr și uech.

ucr = 0.97

ue = 0.13

Aerul este introdus la temperatura de 50oC având o umiditate foarte mică și se lasă în uscător până ajunge să aibă o umiditate de 50%.

x1 = 0.015 kg/kg aer uscat

x2 = 0.036 kg/kg aer uscat

x – conținutul de umezeală [36], p. 412, tabelul 10-1.

mbiluțe (ucr – ue) = maer uscat(x2 – x1)

27(0.97 – 0.13) = maer uscat(0.036 – 0.015)

maer uscat =

maer uscat = 1080 [kg]

maer uscat·Cp·ΔT = Q

unde: Q – căldura din baterie

C = 29.15 kJ/kmol = 1088 J/kg·K

Q = 1080·1088(50 – 20)

Q = 352.512·105 J

Nu = 2 + 0.6·P20,66·Re0,5, [32], pag. 94

Re =

– viteza de circulație a aerului

=

Dv =

Dv =

= 1.28

Dv =

Dv = 0.009 m/s2

= 0.6·10-3 m/s

Re =

Re = 48.87

Pr = 3.49, [36], pag. 195

Nu = 2+ 0.6·3.490.33·48.870.5

Nu = 83.3

Nu =

α = 13.09

unde: α – coeficientul parțial de transfer de masă

Partea de proiectare mecanică și tehnologică s-a întocmit după bilanțul de materiale.

5.2.3.Lista cu utilaje

Cap.6.Proiectare de montaj

6.1.Montaj utilaje

Utilajele tehnologice se amplasează astfel încât să corespundă fluxului tehnologic și circulației fluidelor prin pompare, presiune, cădere liberă.

La cota 0 se amplasează utilajele grele – vase de stocare, uscător, filtre – cele care produc vibrații – pompe centrifuge.

La cota 1 se amplasează utilajele cheie – reactor cu amestecare.

La cota 2 se amplasează reactoarele pentru amestecare.

La cota 3 se află vasele de măsură.

6.2.Montaj conducte

Montajul conductelor este precedată de o serie de lucrări pregătiroare: pregătirea conductelor prin suflare, curățirea de rugină și murdărie, degresarea.

Traseul a fost stabilit astfel încât să permită înlocuirea cât mai ușoară a porțiunilor de conductă șiporțiunilor de conductă și a garniturilor deteriorate în timpul exploatării precum și accesul la îmbinările cu flanșe.

Amplasarea conductelor se face pe sol și pe escade.

Cap.7.Aspecte ecologice și de protecția mediului

Pe parcursul procesului tehnologic atât materiile prime cât și produșii formați nu vor afecta mediul.

Apele reziduale trimise la canal vor fi tratate în prealabil conform standardelor prevăzute de lege.

Cap.8.Elemente de calcul economic

Orice instalație reclama investiții de inteligenta, munca, capital, iar scopul final este de a aduce profit. Aspectele economice ale procesului tehnologic și instalației sunt nu numai obiectul de studiu al economistului ci și al inginerului proiectant și tehnolog, care trebuie sa estimeze dimensiunile financiare ale investiției și profitului.

Elementele principale de calcul a investiției și profitului pot fi concretizate în următoarele puncte: Capitalul total investit: este suma capitalului fix investit plus capitalul circulant

CTI=CFI+CC

Capitalul fix investit : reprezintă costurile alocate pentru realizarea procesului egal cu costurile directe plus cele indirecte

CFI=5 mil euro

Costurile directe reprezintă cheltuielile cu materialele și munca pentru realizarea produsului constituind 70-85% din CFI (costuri directe =4,25 mil euro).

Costurile cu echipamentul montat în flux tehnologic, reprezintă 50-60% din CFI și conțin:

♦echipamentul achiziționat include aparatele și utilajele pentru formarea fluxului tehnologic, echipamentele de rezervă, alocații pentru modificări de aparatură (20-40%);

♦instalarea echipamentelor achiziționate inclusiv montaj, izolații, vopsiri (7-26%CFI sau 30-45% din costul utilajelor);

♦montarea și calibrarea instalațiilor, controlul lor (2,5-7%CFI);

♦țevăria incluzând conducte, vane, robineți, fitinguri (3-15%CFI);

♦echipamente electrice, motoare, întrerupătoare, panouri (3-9%CFI).

Costuri în afara instalației de fluz tehnologic:

♦clădiri(6-20%CFI) reprezentând: fundații, suprastructuri, căi de acces, ascensoare (există posibilitatea ca aceste costuri să fie trecute la cele legate direct de flux) ;

♦clădiri auxiliare: administrative, cantină, cabinet medical, garaje, posturi de pază și control, platforme de expediție și alimentare, laboratoare de cercetare și control;

♦ateliera de întreținere: mecanic, electric, instalatori;

♦clădiri pentru alte servicii: stații de încălzire sau frig, de ventilație, aerinstrumental, ape reziduale și tehnologice, comunicații interne și cu exteriorul;

♦cheltuieli cu terenul: amenajări, căi de acces, parcuri, arhitectură(1,5-5%CFI);

♦servicii și instalarea lor (8-35%CFI);

♦utilități: abur, apă potabilă și industrială, frig, energie electrică, aer uscat și condiționat, uleiuri, combustibili, ape reziduale;

♦aparatură anexă: turnuri de răcire, instalații de încălzire, stații de transformare și redresare, parcuri de rezervoare;

♦aparatura ce nu face parte din procesul tehnologic: medicală, de protecția muncii, de stingerea incendiilor, de salvare, de laborator, transport și comunicații interne;

♦ambalarea și distribuirea materiei prime și produselor;

♦cheltuieli cu achiziționarea terenului(1-2%CFI);

Costurile indirecte sunt cele care nu apar direct din procesul tehnologic (15-30%CFI):

♦aprobări și inginerie(4-20%CFI): costul proiectării, multiplicării, avize, modelări, simulări, consultanță, studii, schimburi de experiență, vize de studiu sau informare;

♦cheltuieli cu organizarea de șantier;

♦aparatură și echipamente de construcții;

♦vizarea construcțiilor;

♦securitate, pază, protecție medicală;

♦aprobări, licențe, taxe, subvenții;

♦taxe de contactare și subcontactare (1-5%CFI);

♦rezerve pentru corectarea unor erori de estimare: proiectare, achiziție și management (5-20%CFI);

Capitalul circulant se referă la fondurile alocatepentru funcționarea curentă a instalației (5-20%CFI):

♦materie primă pentru o perioadă dată;

♦produse finite și semifabricate stocate pentru aceeași perioadă;

♦materiale auxiliare;

♦fonduri lichide pentru salarii, deplasări, gratificații;

♦taxe curente;

♦costuri de pornire: modificări de proces, forță de muncă suplimentară, specialiști, pierderi de producție.â

Planificarea câștigurilor

Câștigul=Costul operării+Costuri generale

Costul de producție=Costul operării+Costuri generale

Costul operării=Costuri directe+Costuri fixe

Costuri fixe sunt constituite din:

■amortizare (10 % CFI);

■taxe locale (1-4 % CFI);

■asigurări (1-3 % CFI);

■chirii;

■profit.

Costuri generale=cheltuieli administrative + cheltuieli de desfacere și vânzare + cheltuieli de cercetare și dezvoltare + cheltuieli cu reclama.

Cap.9.PARTEA EXPERIMENTALĂ

Obiectivele acestei lucrări sunt:

Determinarea condițiilor de precipitare ale alcoolului polivinilic.

Imobilizarea peroxidazei în biluțele de alcool polivinilic, care pot fi folosite mai departe ca și catalizator în diferite procese.

Mod de lucru

Obținerea soluțiilor de alcool polivinilic

Se vor prepara trei soluții de alcool polivinilic de concentrații diferite: 4% alcool polivinilic, 5% alcool polivinilic și 8% alcool polivinilic.

Într-un pahar Erlenmeyer cu un volum de 300 ml se dizolvă 8 g alcool polivinilic în 200 ml apă și se obține o soluție de concentrație 4%.

Într-un pahar Erlenmeyer cu un volum de 300 ml se dizolvă 10 g alcool polivinilic în 200 ml apă și se obține o soluție de concentrație 5%.

Într-un pahar Erlenmeyer cu un volum de 300 ml se dizolvă 16 g alcool polivinilic în 200 ml apă și se obține o soluție de concentrație 8%.

Procesele de dizolvare durează fiecare trei zile, paharele fiind ținute pe baie de apă la o temperatură cuprinsă între 50C-70C sub agitare.

Obținerea soluțiilor de precipitare a alcoolului polivinilic

În urma studiului de literatură făcut despre precipitarea alcoolului

polivinilic se știe că, acesta precipită în apă dacă are până la 20% grupe acetalice, în acizi, inclusiv acid fosforic, în solvenți cu polaritate mare ca dimetil formamida, dioxan, fenol, piridină, formamidă și soluțiileapoase ale acestora.

Tot în urma studiului de literatură făcut am aflat că alcoolul polivinilic este insolubil în alcooli monovalenți, cetone, esteri, eteri, etc.

Scopul urmărit a fost de a obține biluțe de un anumit diametru cu o rezistență mecanică mare și porozitate ridicară.

Inițial s-a încercat precipitarea alcoolului polivinilic sub formă de biluțe în acetonă. S-a constatat că, alcoolul polivinilic precipită în acetonă dar nu sub formă de biluțe.

S-a schimbat mediul de precipitare, alegând o soluție saturată de sulfat de amoniu. S-a constatat că, soluția de sulfat de amoniu nu este un agent de precipitare prea bun, deoarece la suprafața biluțelor s-a format o peliculă de alcool polivinilic.

S-a schimbat din nou mediul de precipitare alegând de data aceasta o soluție de bicromat de potasiu. S-a constatat că, alcoolul polivinilic nici măcar nu precipită în această soluție.

S-a schimbat din nou mediul de precipitare alegând de data aceasta un amestec de acid boric cu sulfat de sodiu pentru a obține o sare de bor.

Neștiind compoziția în procente a amestecului , s-a determinat compoziția acestuia prin încercări.

S-a pornit de la o compoziție de:

10%Na2SO4

3%H3BO3

S-a constatat că , la această concentrație a soluției de precipitare, alcoolul polivinilic precipită în biluțe care se unesc între ele.

Amestecul conține

20%Na2SO4

3%H3BO3

La această concentrație a amstecului de precipitare, alcoolul polivinilic precipită atât în biluțe libere cât și în biluțe care se unesc.

Amestecul conține

30%Na2SO4

3%H3BO3

Concluziile sunt aceleași cu cele de la punctul 2.

Pentru a stabiliza biluțele de alcool polivinilic s-a încercat creșterea concentrației de acid boric și s-a ajuns la următoarea concentrație, care este și rețeta finală:

30%Na2SO4

8%H3BO3

Biluțele astfel obținute s-au scos din soluția de precipitare și s-au cântărit:

mbiluțe=4 g

După ce le-am cântărit le las la uscat o zi și apoi le cântăresc iar.

Se constată că, biluțele au scăzut în greutate cu două grame.

Determinarea curbei cinetice de umectare

Pentru a putea folosi biluțele obținute în procesul în care peroxidază este catalizator, trebuie determinată curba cinetică de umectare

Curba cinetică de umectare se determină în modul următor:

Biluțele obținute după ce au fost puse la uscat o zi se introduc într-un pahar Berzelius care conține apă. După zece minute se scot și se cântăresc, apoi se introduc iar în paharul cu apă. Aceaste operații se repetă din zece în zece minute.

Datele obținute se trec în tabelul următor:

S-au constatat următoarele: după 60 minute, biluțele încep să se unească între ele, își pierd forma sferică, în final rezultând un gel.

Obținerea perozidazei din hrean

Se cântăresc 250 g hrean curățat, care apoi se mărunțește. Hreanul mărunțit se pune într-un pahar, iar peste el se pune apă, pâna ce apa acoperă hreanul. Paharul se închide și se pune la rece până a doua zi.

A doua zi compoziția se filtrează, filtratul colectat se pune la rece, iar peste hreanul mărunțit se pune iar apă și se repetă operația de mai sus.

După ce am obținut preparatul enzimatic, trebuie să-i determinăm activitatea.

Dozarea peroxidazei din hrean printr-o metodă cronometrică

Pentru a determina activitatea peroxidazei din hrean prin această metodă se utilizează benzidina, al cărei produs de oxidare este colorat în albastru intens.

În amestecul de reacție este introdus și acidul ascorbic(vitamina C), care, în mod tipic pentru activitatea sa de antioxidant, reacționează cu produsul de oxidare al benzidinei imediat după formare, regenerând astfel benzidina. În acest fel culoarea albastră nu va fi observabilă decât după consumarea intregii cantități de acid ascorbic. Timpul necesar apariției culorii albastre va fi proporțional cu activitatea enzimei.

Reactivi necesari:

acid ascorbic, soluție 1-5 mM

apă oxigenată 0,2 M

suspensie de benzidină

Suspensia de benzidină se prepară prin adăugarea sub agitare energică a 2 ml soluție saturată de benzidină în alcool peste 98 ml soluție tampon pH 5,3 ( citrat ).

Prepararea soluției tampon acid citric-citrat de sodiu

Soluție stoc:

A-acid citric 0,1 M ( 21,01 g în 1000ml )

B-citrat de sodiu 0,1 M ( 29,41 g citrat*2H2O în 1000 ml )

X ml soluție A +Y ml soluție B, se aduce la 100 ml cu apă distilată

X=16 ml soluție acid citric

Y=34 ml soluție citrat de sodiu

Mod de lucru

Se introduc în vasul de reacție câte un ml suspensie benzidină, soluție acid ascorbic și apă oxigenată (în această ordine). Cât de repede posibil se adaugă 0.1 ml preparat enzimatic, concomitent cu pornirea cronometrului. Se agită amestecul până la apariția bruscă a culorii albastre, când se oprește cronometru și se notează timpul scurs. Activitatea enzimatică se calculează ca numărul de micromoli de acid ascorbic oxidat într-un minut.

Datele se trec în următorul tabel:

Activitatea peroxidazei se calculează cu ajutorul datelor de mai sus, astfel:

1.

C=md*100/ms

1%=(md*100)/(md+1)

md=0.01mol

n1=0.01/248

n1=4.072*10-11mol

4.072*10-11mol………………67 s

a1mol…………………….60 s

a1=3.646*10-11µmol

2.

1%=(md*100)/(md+1.25)

md=0.012µmol

n2=0.012/248

n2=5.091*10-11µmol

5.091*10-11µmol………………….60 s

a2µmol…………………………….60 s

a2=5.091*10-11µmol

3.

1%=(md*100)/(md+1.5)

md=0.0151µmol

n3=0.0151/248

n3=6.10*10-11µmol

6.10*10-11µmol………………………….52 s

a3µmol………………………………………………………….60 s

a3=7.038*10-11µmol

4.

1%=(md*100)/(md+1.75)

md=0.0176µmol

n4=0.0176/248

n4=7.127*10-11µmol

7.127*10-11µmol………………………..40 s

a4µmol………………………………………60 s

5.

1%=(md*100)/(md+1.9)

md=0.019µmol

n5=0.019/248

n5=7.738*10-11μmol

7.738*10-11μmol…………………34 s

a5μmol……………………………60 s

a5=13.655*10-11μmol

6.

1%=(md*100)/(md+2)

md=0.0202µmol

n6=0.0202/248

n6=8.145*10-11μmol

8.145*10-11μmol………………..32 s

a6μmol…………………………..60 s

a6=15.271*10-11μmol

unde:

n1….6=numărul de μmoli de acid ascorbic

a1….6=activitatea peroxidazie în μmoli

C=concentrația acidului ascorbic

Rezultatele obținute se trec în tabelul următor:

Imobilizarea peroxidazei

După determinările făcute la punctele de mai sus se trece la procedeul deimobilizate a peroxidazei în biluțe de alcool polivinilic.

Pentru această operație s-au amestecat 100 ml soluție alcool polivinilic cu 50 ml peroxidază purificată.

Soluția în care se va face imobilizarea este un amestec format din următoarele două soluții:

*soluție Na2SO4 de concentrație 30%

*soluție H3BO3 de concentrație 8%

Amestecul de peroxidază și alcool polivinilic se introduce într-o seringă, din care se adaugă încet, în picături, de la o înălțime de aproximativ 20 cm.

Se formează biluțe de diferite mărimi în funcție de diametrul acului și de presiunea aplicată.

Biluțele astfel obținute rămân în amestecul de precipitare patru zile, după care se decantează, se trec pe sub un jet de apă și se pun la uscat.

Temperatura de uscare a biluțelor este temperatura camerei, 19-21ºC.

9.1.Concluzii generale

În lucrarea de față s-a încercat înlăturarea unor dezavantaje de utilizare a enzimelor imobilizate în geluri: stabilitatea redusă a gelului, eventuala biodegradare a matricei gelului, necesitatea unor operații sterile și limitarea tot mai mare a transportului în condițiile în care se lucrează cu particule de gel mari.

În această lucrare dezavantajele au fost înlătureate și s-a reușit imobilizarea peroxidazei în gel de alcool polivinilic, care oferă avantaje remarcabile ce pot depăși dezavantajele menționate mai sus. Biluțele de peroxidază imobilizată se caracterizează printr-o excelentă stabilitate mecanică și sunt greu biodegradabile, datorită grosimi lor de 300-400 m ele oferă o mai bună rezervă nutritivă în comparație cu alte biluțe de gel de același volum.

Imobilizarea enzimelor în geluri conduce de multe ori la o creștere a productivități și stabilități produselor acestor enzime imobilizate. În multe cazuri enzimele imobilizate în geluri sunt mai bine protejate de factori externi și contaminare după includerea în gel.

BIBLIOGRAFIE

1. I. F. Dumitru, D. Iordăchescu, Introducere în enzimologie, Ed. Medicală, București, 1981

Radu L. Silaghi Dumitrescu, Departament of Chemistry of Georgia in Athens, Grecia

F. D. Irimie, Elemente de biochimie, vol. I, Ed. Erdelyi Hirado, Cluj-Napoca

Dumitru I. F.,Enzime-structură și mod de acțiune, Ed. Medicală, București, 1974

Dumitru C. Cojocaru, Enzimologie, Ed. Gama, Iași, 1997

I. Chibata, Immobilized Enzymes Redearch and Developement, Toky

R. A. Messing, Immobilized Enzymes for Industrial Reactors, Acad. Press, New York, 1975

Dorel Feldman, Tehnologia compușilor macromoleculari, Ed. Tehnică, București, 1974

Brag E. I. ,Tehnologia maselor plastice sintetice, Ed. Tehnologică, București, 1957

Ușakov S. N. ,Polivinilovîi spirt i evo pioizvodnîe, Tom. I. Izdat. Akaid. Nauk, SSSR, Moscova, 1960

Mayo-Smith, W. Manufacture of Plastics vol. I, New York, Reinhold Publ. Co. 1964, p. 256-300

Roff W. J. , Scott J. R. , Fibres Films, Plastics and Rubbers. London, Butterworths, 1971, p. 78

Brandsch I. ,Referat nepublicat, 1970

Fujii K. , Ukida J. , Matnemoto M. , In: J. Polymer Sci, B. 1, 1963, p. 687

Fujii K. , Ukida J. , Matnemoto M. , In: Makromol. Chem. , 65, 1963, p. 86

Sakaguchi Y. , Savada D. , Koidzumi M. , Tamaki K. , In: Chem. Hight. Polymers Japan. 23, nr. 260, 1966, p. 890-894

Sliwka K. , In: Angew. Makromol. Chem. , nr. 415, 1968, p. 310-351

Zarnea Gh. , Menicicopschi St. Brăgarea, bioingineria preparatelor microbiene, Ed. Tehnică, București, 1980

Cristea A. , Procese bioenergetice și oxido-reducere enzimatică, Ed. Științifică, București, 1980

B. Chance, In: Arch. Bioch. Biophys, 21, 416, 1949

B. Chance, In: Arch. Bioch. Biophys, 37, 335, 1952

B. Chance, R. R. Fergusson, In: Science, 122, 466, 1955

J. A. Thomas, D. R. Morris, L. P. Hager, In: J. Biol. Chem. , 245, 3129, 1970

R. W. Noble, Q. A. Wittennberg, J. Biol. Chem. , 242, 626, 1967

H. Theorell, Archiv. Kemi. Mineral, 16A, 2, 1942

26.R.W. Noble, Q. H. Gibson, J. Biol. Chem. , 245, 2411, 1970 27.Vasilescu I. , Enzimele, Ed. Academiei Republici Socialisre România, București, 1961

28. P. Raicu, I. Dumitru, Biotehnologii moderne, Ed. Tehnică, București, 1993

29. F.R. Bloom, C.J. Smith, J. Jessa, The use engineiring to everproduce free acid, Jan. 1983

30. I. Chibata, T. Tosa, T. Sato, Use of imobilized cell systems to prepare fine chemicals, In: Microbial tehnology, vol. II, 1974, p. 434-461

31. Dobre T., Separarea compușilor chimici din produși naturali, Ed. Matrix-România, București, 1997

32. A. Ozunu, R. Mișca, Introducere în proiectarea instalațiilor chimice, Ed. Genesis, 1995

33. A. Ozunu, Elemente de hazard și risc în industriile poluante, Ed. Accent, Cluj-Napoca, 2000

34. Bănescu A., Radulian D., Sistematizarea calculelor aparatelor în industria chimică, Ed. Tehnică, București, 1997

35. Lazăr I., Îndrumător de proiectare, Lito. UBB, Cluj-Napoca, 1988

36. Pavlov, C.F., Procese și aparate în ingineria Chimică, vol. II, Ed. Tehnică, București, 1963

37. Zarnea I., Microbiologie generală, Ed. Didactică și Pedagogică, București, 1970

38. Nenițescu C.D., Chimie organică, vol. I, Ed. Didactică și Pedagogică, București, 1980, p. 278-283

39. Avram M., Chimie organică, vol. I, Ed. Zecasin, București, 1999, p. 199-202

40. I. Mureșan, Chimie macromoleculară, Ed. Didactică și Pedagogică, București, 1973, p. 15-19

41. E. Bratu, Operații și utilaje din industria chimică, vol. II, Ed. Tehnică, București, 1970

42. Florea O., Jonescu G., Vasilescu P., Balaban C., Dima R., Operații și utilaje în industria chimică. Probleme, Ed. Didactică și Pedagogică, București, 1980, pag. 140-141

43. Agachi Ș., Automatizarea proceselor chimice, Ed. Casa Cărții de Știință, Cluj Napoca, 1994

44. Oniscu C., Tehnologia produselor macromoleculare, Ed. Tehnică, București

45. Iovu M., Chimie organică, Ed. Didactică și Pedagogică, București, p. 192

46. Tămaș M. Coruț, Biochimie medicală veterinară, Ed. Didactică, București, 1981

47. L. Dima, Enzime imodilizate, Ed. Mitron, Timișoara, 1999