PROIECT DE DIPLOMĂ le de l [307347]

[anonimizat] /le de l

Îndrumători științifici

Șef lucrări dr. Cristian-Radu Sisea

Cercetător dr. [anonimizat]

2018

[anonimizat], SPECIALIZAREA HORTICULTURĂ

ZĂNESCU MARIA

PROIECT DE DIPLOMĂ

Conservarea fondului autohton de germoplasmă la prun după modelul European Prunus Database

Îndrumători științifici

Șef lucrări dr. Cristian Radu Sisea

Cercetător dr. [anonimizat]

2018

CUPRINS

CONSERVAREA FONDULUI AUTOHTON DE GERMOPLASMĂ LA PRUN DUPĂ MODELUL EUROPEAN PRUNUS DATABASE

Autor: Maria ZĂNESCU

Coordonatori științifici: [anonimizat]-Napoca,
Str. Mănăștur, Nr. 3-5, 400372,Cluj-Napoca, România; maria.zanescu@gmail.[anonimizat] P. domestica, P. salicina sau P. cerasifera reprezintă a [anonimizat] o importanță majoră în evoluția și dezvoltarea acestor culturi. [anonimizat]. [anonimizat], BIOCERA, [anonimizat] o activitate de catalogare a accesiunilor din colecția menținută la Râmnicu Vâlcea. Până în prezent, 87 [anonimizat], [anonimizat], [anonimizat], [anonimizat],[anonimizat], iar cea moleculară pe analiza a 10 markeri SSR. Descriptorii obținuți sunt înregistrați într-o [anonimizat], și urmează a fi completată cu date ale accesiunilor nou caracterizate.

[anonimizat], [anonimizat], SSR

CHARACTERIZATION OF ROMANIAN PLUM GENETIC RESOURCES USING THE EUROPEAN PRUNUS DATABASE AS A MODEL

Author: Maria ZĂNESCU

Scientific Coordinators: [anonimizat]-Napoca,
3-5 Manastur St., 400372 Cluj-Napoca, Romania; maria.zanescu@gmail.[anonimizat] P. domestica, P. salicina and P. [anonimizat]. [anonimizat] a database. [anonimizat], BIOCERA, [anonimizat] a registration process of the varieties kept at Râmnicu Vâlcea. Until now, 87 local and international accessions were selected and included in the study. The phenotypic characterization of the 87 [anonimizat] fruits, the shape of the seeds, the skin color, the kernel's adherence to the pulp, the flowering age, the plant's habitus, the shape of the fruit, the covering color or their susceptibility to cracking, while for the molecular analysis 10 SSR markers are used. The resulting descriptors are logged in a database, named Germplum, which is designed after the European Prunus Database for Plum Genetic Resources. The Germplum database is to be completed with data of newly characterized accessions.

KEYWORDS

Prunus, database, genetic resources, phenotype, SSR

Introducere

În România există o mare varietate de genotipuri, a căror importanță rezidă în identificarea și introducerea lor într-o bancă de gene, fiind folositoare ulterior în procesele de ameliorare, dar și pentru stabilirea parametrilor specifici colecției de germoplasmă.

Astfel, distribuirea de date și introducerea lor în diferite baze informatice, ca și schimbul de material biologic și explorarea florei spontane sunt operații necesare conservării și asigurării de continuitate a cultivarurilor mai puțin folosite.

Fondul de germoplasmă a prunului în România cuprinde în medie 1200 de probe, incluzând specii rustice, populații locale și soiuri, selecții clonale și portaltoi (Butac et al., 2011). Prin cultivarea repetată a anumitor soiuri cerute pe piața de consum se poate pierde variabilitatea genetică existentă în prezent.

Conservarea resurselor genetice românești de Prunus domestica, Prunus insititia, Prunus cerasifera, Prunus spinosa și Prunus salicina întâmpină dificultăți datorate atacurilor virale, în special de Plum pox virus. Crearea unei colecții de prun liberă de virusuri este un obiectiv greu de atins în orice țară (Botu M., 2008).

Comparativ cu ameliorarea soiurilor, producerea de noi portaltoi a fost dezvoltată la scară mai mică. Motivul este înmulțirea acestora prin drajoni sau sâmburi, estompând astfel diversitatea capacității genetice, mai ales că aceasta limitează cultivarea portaltoilor la condițiile în care au fost create.

Unele studii din România afirmă că populațiile locale ale Prunus domestica, Prunus insititia, Prunus cerasifera și Prunus spinosa originare din zonele subcarpatice prezintă gene de interes pentru caracteristici fenotipice foarte valoroase (referitoare la vigoare, capacitate ridicată de fructificare, pretabilitate la soluri argiloase, rezistențe la ger și la unele boli și dăunători), fiind văzute ca material inițial competent pentru ameliorare (Botu I., 1978; Botu I., Turcu Elena, Achim Gh., 1989).

Conservarea materialului genetic se execută în bănci de gene. Conservarea ex-situ se realizează clasic în plantație, la containere și în azot lichid (Butac et al., 2011).

Proiectul de caracterizare a accesiunilor existente în România și introducerea acestora într-o bază de date a fost realizat prin colaborarea USAMV Cluj, ca și coordonator, cu partenerii P1- Universitatea din Craiova- SCDP Vâlcea și P2- Secerișul SRL, în materie de producție și cercetare.

Proiectul GERMPLUM își propune s

Aici intra date despre feno+molec

Feno cu toate măsurătorile

Molec cu -recoltare probe

-izolare adn

-cuanif

-dilutii

-pcr cu marker

-gel de agaroa

-electroforeza

-secv pt det intervalului allelic

Datele obținute în urma caracterizării fenotipice și cea moleculară pentru fiecare accesiune în parte au fost corelate și introduce ulterior în baza de date GERMPLUM. În activitățile de corelare și completare a datelor sunt implicați USAMV Cluj-Napoca, Univ. Craiova-SCPP Vâlcea.

Fig. 1- Afișul de prezentare al proiectului cu titlul “Conservarea fondului autohton de germoplasmă la prun după modelul European Prunus Database”

Capitolul I. Stadiul actual al cunoașterii

Descrierea genului Prunus

Prunus domestica este un aloploid al speciilor Prunus cerasifera și Prunus spinosa, originar din Europa de Sud și Asia de Vest care crește spontan în Balcani. Fructele sale reprezintă o importantă sursă financiară, datorită valorii nutritive deosebite.

În România, cultura prunului are un rol important, ocupând, la nivelul anului 2016, peste 65.000 ha, ceea ce reprezintă aproximativ 37.6% din suprafața totală cultivată cu pomi fructiferi. Această valoare îi atribuie României locul 3 la nivel mondial. În ceea ce privește producția de fructe, România se clasează pe locul 4 în clasamentul mondial.

În țara noastră, suprafețele cultivate cu prun sunt concentrate în județele Argeș, Vâlcea, Buzău, Prahova, Olt, Caraș-Severin și Hunedoara, datorită faptului că zonele favorabile trebuie să însumeze temperaturi medii anuale de 9-10 grade Celsius, și precipitații de 600-700 mm.

Fiind o specie cu importanță economică, conservarea și valorificarea resurselor genetice are un rol major în evoluția și dezvoltarea acestei culturi.

Alte specii ale genului Prunus existente în țara noastră sunt P. domestica, P. insititia, P. spinosa și P. cerasifera, iar populațiile sunt prezente sub formă cultivată, semicultivată sau spontană.

Accesiunile prezente în colecția ex-situ de la SC Secerișul SRL, aparținând speciei P. domestica se diferențiază prin adaptabilitatea la condițiile de mediu din România, rezistență medie față de boli și dăunători, productivitate, autosterilitate sau autofertilitate parțială, maturare a fructelor spre sfârșitul verii și începutul toamnei, fructe cu pulpă relativ fermă, cu sâmbure neaderent la pulpă.

Soiurile speciei P. insititia sunt caracterizate prin rezistență ridicată față de boli și adaptabilitate la condițiile prezente în zone deluroase, productivitate ridicată și constantă, fructe destinate prelucrării în alcool, mici și de formă sferică, cu sâmbure aderent la pulpă. Prunus insititia este internațional acceptată ca fiind o posibilă subspecie a Prunus domestica – Prunus domestica subsp. insititia (L.) C.K. Schneid. În România, încă este considerate o specie distinctă.

P. cersasifera și accesiunile acestei specii sunt plante cu vigoare mare, înflorire și fructificare timpurie, dar fructe inferioare calitativ, motiv pentru care acestea sunt folosite pentru distilate, iar specia este adeseori folosită ca portaltoi.

P. spinosa are un număr de 3 accesiuni, și prezintă o mare variabilitate a modului de fructificare și prezența spinilor.

P. salicina este răspândit preponderent în zonele cu climat mai blând. Soiurile și hibrizii interspecifici manifestă o mare variabilitate. Specia este caracterizată prin înflorire timpurie, cu maturarea fructelor în perioada iulie-august. Fructele sunt mari sau foarte mari, cu formă sferică, ușor turtită și sâmbure neaderent la pulpă.

Restul speciilor existente în colecție (P. americana, P. macrocarpa, P. nigra, P. maritima, P. besseyi, P. tomentosa, P. subhitella, P. sibirica) dispun de material genetic valoros în ameliorare, conținând gene pentru rezistență la ger (P. nigra, P. sibirica) și vigoare redusă pentru obținerea de cultivaruri dwarf (P. tomentosa, P. besseyi).

Importanța prunului ca specie și a fructelor

Prunul este un pom fructifer care apare în România sub formă cultivate și spontană.

Prunul este o specie rustică, ușor adaptabilă la condiții de mediu și cu cerințe reduse față de acestea. Se înmulțește ușor prin altoire și dă producții mai mari de fructe, în ciuda costurilor mai reduse de producție. Are o perioadă lungă de valorificare a fructelor, acestea fiind apreciate datorită diversității lor în ceea ce privește gustul, aroma, aspectul etc. (Mitre, 2001).

Fructele de prun reprezintă 40% din producția anuală de fructe în România, lucru care îi atribuie o deosebită importanță economică și socială.

Acestea au o valoare nutrițională deosebită, fiind o sursă importantă de zahăr și energie.

Posibilitățile de valorificare a fructelor de prun sunt numeroase: fructe proaspete sau uscate, dulceață, gem, distilate alcoolice.

Tabel nr. 1- Valoarea nutritivă a 100 g prune (V. Cociu 1997)

Biodiversitatea și importanța ameliorării prunului

Obiectivele principale ale ameliorării prunului au în vedere calitatea fructelor și rezistența la agenți fitopatogeni, baza genetică pentru realizarea acestor obiective fiind prezentă în populațiile sălbatice de prun și în varietățile locale vechi.

Folosirea speciilor sălbatice în ameliorare implică realizarea unor procese de backcross pentru accesiunile vechi care prezintă toleranță la boli și calitate superioară a fructelor. Acest proces este unul laborios și îndelungat; astfel, conservarea acestor genotipuri cu scopul exploatării lor ulterioare este o prioritate.

Cea mai importantă condiție pentru îndeplinirea obiectivelor este realizarea unui fond de germoplasmă care permite accesul public, având în vedere marea diversitate de genotipuri valoroase existente în România.

Fondul bogat de germoplasmă cuprinde aproximativ 1200 de accesiuni care includ specii rustice, populații locale, portaltoi, soiuri și selecții clonale. Conservarea ex-situ se face utilizând trei metode- conservarea în câmpuri de colecție, conservarea în containere și crioconservarea.

O strategie de identificare a accesiunilor identice este necesară, acestea cauzând erori în procesul de documentare sau realizare a colecțiilor de indivizi omogeni din punct de vedere genetic.

Astfel a fost demarată o acțiune de identificare a acestora, odată cu introducerea de date în bazele internaționale, procurarea materialelor biologice de la instituții cu scopuri asemănătoare și explorarea florei spontane.

Aceste idealuri au făcut necesar dezvoltarea unei baze de date specifică accesiunilor românești, în vederea evaluării resurselor existente, și a facilita selecția pentru ameliorare bazată pe factori fenotipici și genotipici.

Schema caracterizării fenotipice este cea utilizată în toate bazele de date și băncile de gene. Aceasta a fost elaborată pe baza metodologiei de lucru propusă de Biodiversity International (IPGRI) și FAO.

Colecția înființată în județul Dolj, la SC Secerișul SRL contribuie la păstrarea accesiunilor afectate de eroziune și vulnerabilitate genetică, și evaluarea acestora în vederea utilizării lor mai departe în viitoare programe de ameliorare. Astfel se pot realiza schimburi de genotipuri valoroase cu alte insituții cu scop asemănător, însă pe plan național se facilitează accesul la informații, la fel ca și la resurse genetice a soiurilor mai puțin folosite în ultimii ani, lucru esențial pentru modernizarea culturii de prun în România, dată fiind importanța acestei culturi și faptului ca are cea mai mare pondere dintre speciile pomicole.

Identificare in situ și conservare ex situ

În cadrul partenerului P2 (S.C. Secerișul S.R.L.) a fost înființată sub supervizarea Universității din Craiova – S.C.D.P. Vâlcea o colecție de conservare on farm a materialului genetic provenit și înmulțit în pepiniera din colecția națională de la aceeași universitate.

Resursele genetice au fost altoite pe portaltoiul ‚Mirobolan galben’ și plantate timp de doi ani consecutivi în proporții diferite, datorită condițiilor meteorologice neprielnice. După executarea lucrărilor de pregătire a terenului, respectiv scarificarea și arătura adâncă, au fost plantați pomi la distanțe de 5 x 4 m, respectiv cu o densitate de 500 pomi/ha, fiecare accesiune având reprezentanți în medie 9 pomi.

Așezarea lineară a plantelor, diferențiate în funcție de proba reprezentată s-a dovedit a fi foarte funcțională.

Colecția este împrejmuită cu un gard de protecție și prevăzută cu sistem de irigare prin picurare, necesar datorită regimului deficitar de precipitații din zonă.

Stabilirea colecției la câteva sute de metri de alte culturi ale genului Prunus asigură un risc de infecție cu patogeni specifici prunului mai redus. Scopul colecției este analiza comportării soiurilor în condițiile date, respectiv evaluarea în baza descriptorilor internaționali acceptați (I.P.G.R.I., U.P.O.V., EURISCO).

Materialul genetic va fi folosit ca sursă de gene pentru studii genetice și programe de ameliorare genetică a soiurilor și portaltoilor de prun. Colecția ex-situ servește la conservarea în siguranță a resurselor genetice provenite din colecțiile de la ICDP Pitești – Mărăcineni, UCv – SCDP Vâlcea și SCDP Bistrița.

Fig. 2,3,4,5- Imagini din colecția ex-situ din loc. Plenița, jud. Dolj

Fig. 6,7,8,9- Imagini din colecția ex-situ din loc. Plenița, jud. Dolj

Markeri moleculari

Markerii moleculari sunt secvențe de ADN sau gene care marchează un locus cunoscut în interiorul cromozomului. Acestea pot fi utilizate în identificarea anumitor indivizi sau specii, selecția și multiplicarea anumitor gene de interes.

Dintre utilizările markerilor genetici, caracterizarea fondului de germoplasmă și stabilirea variabilității genetice au caracter indispensabil în lucrarea de față.

Markerii utilizați în identificarea caracteristicilor moleculare la prun, în vederea introducerii în baza de date sunt de tipul microsateliților (Simple Sequence Repeats-SSR). Acestea sunt repetiții de secvențe scurte de ADN, cu polimorfism accentuat și codominanță care permite identificarea tuturor alelelor.

Microsateliții sunt utilizați din ce în ce mai mult datorită caracterelor sale foarte informative, codominanță și multitudinea de alele pe care acești markeri le pot reproduce și transfera în cadrul aceleiași specii (Mason, 2015).

În mare, markerii SSR sunt utili speciilor rustice, în studiul diversității și distanțelor genetice, pentru estimarea migrației de gene, în studii evoluționare. Cu toate acestea, în cazul plantelor cultivate, microsateliții sunt folosiți pentru dezvoltarea hărților de linkage, a celor pentru determinarea locusurilor responsabile de caracteristicile cantitative, analiza gradului de înrudire între genotipuri, selecții asistate de markeri și ADN fingerprinting (Jonah et al., 2011; Kalia et al., 2011).

Capitolul II. Material, metode și rezultate

Descrierea proiectului

Proiectul GERMPLUM a fost inițializat de Universitatea de Șiințe Agricole și Medicină Veterinară, împreună cu Universitatea din Craiova-Stațiunea de Cercetare pentru Pomicultură Vâlcea și SC Secerișul SRL pentru a facilita accesul la informații privind caracteristicile fenotipice ale pomilor și fructelor, sistemele de cultură și tehnologiile de producție folosite și caracterele moleculare.

Aceste informații formează baza de date, pusă în funcțiune cu ocazia colaborării partenerilor proiectului, după cum urmează- colecția a fost înființată în cadrul SC Secerișul SRL, analizele fenotipice efectuate de Univ. Craiova-SCPP Vâlcea, iar cele moleculare de către USAMV Cluj-Napoca.

Material și metode

Dezvoltarea unei baze de date pentru resursele genetice la prun are ca principiu conservarea in situ a accesiunilor pomicole la partenerul P2 al proiectului, dar și analiza descriptorilor fenotipici și moleculari pentru a oferi acces publicului la informație.

Analizele fenotipice au fost efectuate asupra pomilor și fructelor, dar și asupra speciei ca încadrare și utilizare, iar cele moleculare asupra materialului biologic recoltat ca probă de la fiecare accesiune în parte.

Material biologic

Materialul biologic a fost recoltat din colecția in-situ de la SC Secerișul SRL, în anul 2015. Astfel, au fost identificate și înmulțite 75 de accesiuni autohtone, din care 32 de accesiuni rustice. Pe lângă acestea, au fost introduse în studiu 12 accesiuni străine pentru a servi la comparația dintre soiurile autohtone.

Accesiunile românești sunt într-un total de 185, aparținând de 16 specii ale genului Prunus. Din acestea, 53% aparțin speciei Prunus domestica L., 23.2% speciei Prunus insititia L., 7% sunt soiuri ale Prunus cerasifera Ehrh., iar 5.4% derivă din Prunus salicina Lindl..

Colecția ex-situ are o suprafață totală de 3 ha și cuprinde un total de 1130 de plante. Portaltoiul folosit este Mirobolan galben, iar pomii au fost plantați la distanțe de 5 x 3 m.

Media creșterilor în primul an este de 30-50 cm, fără a înregistra goluri.

Solul utilizat a fost ogorul negru, fertilizat cu îngrășăminte complexe NPK în proporții de 7:4:4.

Analiza fenotipică

Analiza fenotipică a fost realizată pe baza descriptorilor principali, la recoltare, dar și la conservarea în colecție. Descriptorii folosiți sunt clasificați în descriptori de pașaport, descriptori generali și cei specifici pentru prun.

Descriptorii de pașaport (sau de identificare) sunt

Codul institutului

Numărul accesiunii

Numărul de colectare

Genul

Specia

Subtaxa

Numele accesiunii

Țara de origine

Locul de colectare al probei

Latitudinea locului de colectare

Longitudinea locului de colectare

Altitudinea locului de colectare

Data de colectare a probei

Felul probei

Sursa de colectare

Codul institutului donor

Numele donatorului pentru probă

Alte remarci

Descriptorii generali se referă la:

Tipuri de cultură

Hibrid

Statutul de protecție al probei

Folosirea ca portaltoi

Starea probei la infecțiile cu viruși și micoplasme

Data obținerii verificării față de virusuri

Folosirea fructului

Modul de folosire al plantei

Descriptorii specifici ai prunului oferă informații cu privire la:

Maturitatea de recoltare

Mărimea fructului

Forma sâmburelui

Culoarea pieliței

Aderența sâmburelui la pulpă

Epoca de înflorire

Habitusul plantei

Forma fructului

Culoarea acoperitoare

Susceptibilitatea la crăpare

Susceptibilitatea la Plum pox virus pe fructe

Susceptibilitatea la Monilinia laxa

Fiecare dintre aceste caracteristici au fost analizate în funcție de anumite graduări. Acestea au valori cuprinse între 1-9, folosindu-se valoarea 0 sau 99 pentru cazuri care depășesc limitele.

Exemplificate în continuare sunt soiurile Andreea, Balada și Tuleu de Sinești.

Fig. 10, 11- soiul Andreea

Fig. 12, 13- Soiurile Balada, Tuleu de Sinești

Analiza moleculară

Analiza moleculară a fost efectuată la 30 de soiuri dintre cele descrise fenotipic, utilizând tehnica SSR.

Recentele cercetări făcute în domeniul markerilor moleculari cu polimorfism ridicat au facilitat diferențierea accesiunilor extrem de asemănătoare fenotipic, și implicit a duplicatelor cu atribute fenotipice diferite. Aceste tehnici de identificare la nivel genetic sunt independente de stadiul de dezvoltare al plantei și de condițiile de mediu. Astfel, eliminarea surplusului de soiuri și identificarea duplicatelor poate fi realizată prin analiza datelor din pașaport sau a celor moleculare (Spooner et al., 2005).

După obținerea de rezultate favorabile în Turcia, la Universitatea Ataturk, în studiul variabilității genetice a 18 genotipuri de cireș cu ajutorul a 10 markeri SSR, Ercisli et al. (2011), și considerând nivelul ridicat al polimorfismului markerilor SSR și particularitatea rezultatelor, protocoalele de lucru au fost adaptate pentru accesiuni din genul Prunus (Wünsch și Hormaza, 2002; Aranzana et al., 2002; Cantini et al., 2001; Xuan et al., 2008; Tsuda et al., 2009; Struss, 2003; Lisek et al., 2006; Schueler et al., 2003; Clarke și Tobutt, 2003; Ahmad et al., 2004, Bouhadida et al., 2009; Oz et al., 2013).

Trei perechi de primeri pentru Prunus domestica (BPPCT 014; BPPCT 039; PacA33) au facilitat obținerea de produși specifici de ampificare, potriviți pentru încadrarea în intervalul alelic așteptat în funcție de perechea folosită. Numărul total al probelor analizate este de 104, fiind utilizați 13 perechi de primeri SSR.

În România, bazele de date on-line nu au oferit informații în legătură cu studiile efectuate cu ajutorul markerilor SSR. Singurul proiect de caracterizare moleculară a folosit ajutorul markerilor RAPD; datorită caracterului dominant al acestora, acestea nu pot oferi rezultate cu privire la relațiile genetice dintre genotipuri foarte similare.

Tabel nr. 3- Caracteristicile primerilor utilizați

Extracția ADN-ului

Utilizarea tehnicilor bazate pe reacția PCR necesită izolarea prealabilă a acizilor nucleici din țesuturile vegetale.

Procedeul implică îndepărtarea mecanică și enzimatică a peretelui celular și o serie de spălări cu scopul purificării acestuia.

Odată cu degradarea membranelor celulare, ADN-ul este eliberat în tamponul de extracție cu ajutorul unor detergenți (CTAB- bromură de cetiltrimetil amoniu) sau a unor enzime. Acizii nucleici extrași pot fi lezați de ADN-ze, astfel încât în tamponul de extracție trebuie inclus și un agent chelator, EDTA (acid etilen-diamin tetra acetic).

Pentru îndepărtarea ARN-ului, se introduc în amestec enzime de tip ARN-ze. Proteinele sunt îndepărtate cu ajutorul cloroformului, prin denaturare.

Ultima acțiune e etapei constă în evaluarea calității și cantității ADN-ului extras prin metoda spectofotometrică.

În extracția ADN-ului, se utilizează protocolul lui Lodhi și colab., (1994), îmbunătățit ulterior de Rodica Pop și colab. (2003).

Pentru obținerea unui stoc de ADN de calitate, au fost folosite patru protocoale pentru izolarea acizilor nucleici. Dintre cele patru, ultimul a înregistrat cantități superioare celorlalte trei.

Pentru unul dintre protocoalele folosite pentru extracția de ADN a fost folosit kitul DNeasy Plant Mini Kit (Qiagen, 2006), care se bazează pe proprietățile de legare ale membranelor de silicon și separarea prin centrifugare, pe când fundamentul metodei care utilizează CTAB constă în spălări repetate ale materialului biologic.

Acesta din urmă presupune realizarea operației în aproximativ o oră, folosind materiale de laborator disponibile în interiorul setului. Cu toate că economisirea timpului este un avantaj față de protocolul lui Lodhi și colab., (1994), metoda are și dezavantaje, concentrația de ADN obținută fiind mai scăzută.

Tabel nr. 4- Materialele necesare extracției de ADN

Descrierea modului de lucru din protocolul de extracție ADN:

Se mojarează 0,5 g material biologic în azot lichid până se obține o pulbere. Este important ca prin mojarare să nu se obțină o pulbere foarte fină.

Se tuburile Eppendorf se pipetează câte 700 μl tampon de extracție. În momentul utilizării în

tamponul de extracție se adaugă PVP (protocolul A și B), acid ascorbic și DIECA (protocolul C). Se transferă circa 100 mg din pudra obținută prin mojarare și se amestecă cu grijă, prin inversarea tuburilor Eppendorf.

Se incubează tuburile pentru 25 de minute la temperatura de 650C și apoi se lasă să se

răcească la temperatura camerei.

Se adaugă 700 μl cloroform : alcool izoamilic (protocolul A și C) și betamercaptoetanol

(protocolul B) și se omogenizează bine prin inversarea tuburilor de 20-25 ori pentru obținerea unei emulsii.

Se centrifughează pentru 15 minute la 11.000 rotații/minut la temperatura camerei.

Se transferă faza apoasă într-un nou tub eppendorf.

Pentru o extracție mai bună, respectiv pentru asigurarea unei purități superioare a soluției de ADN se repetă pașii 5-6-7.

Se adaugă 0,5 volume soluție apoasă de NaCl 5 M și se omogenizează bine.

Se adaugă două volume de alcool etilic 95% rece (-200C) și se păstrează tuburile la frigider 15-30 de minute (4-60C). Soluția poate fi ținută la frigider o oră sau mai mult, dacă este necesar.

Se centrifughează 3 minute la 3000 rotații/minut apoi se crește turația la 11.000 rot/minut pentru 5 minute, la temperatura camerei. Această diferență de centrifugare ajută la sedimentarea ADN-ului în tubul de centrifugare.

Se îndepărtează supernatantul.

Se adaugă 700 μl alcool etilic 80% rece (0-40C), pentru spălarea pellet-ului. Se centrifughează 5 minute la 10.000 rotații/minut.

Se îndepărtează supernatantul. Se așteaptă până la evaporarea completă a alcoolului etilic, circa 20-30 de minute.

Se rehidratează pellet-ul în soluție de TE – 50 μl/tub.

Se tratează cu 1 μl RNA-ază/100 μl ADN soluție și se incubează la 37˚C timp de 15 minute. ADN-ul se păstrează în apă sterilă deionizată. Probele de ADN se pot păstra pe o perioadă mare de timp în frigider sau congelator.

Pentru caracterizarea cantitativă și calitativă a ADN-ului extras s-a folosit cuantificarea spectofotometrică. Această metodă este folosită datorită capacității moleculelor biologice (ADN, ARN) de a absorbi lumina ultravioletă. Există o corelație negativă între cantitatea de impurități (proteine, fenoli) și gradul de precizie al operației.

Rezultate extracție

Din graficul de mai jos rezultă utilitatea protocolului C de extracție a materialului genetic. Cele mai mici cantități de ADN au fost obținute utilizând protocolul A, și se observă superioritatea variantei C în ceea ce privește cantitatea obținută.

Grafic nr. 1- Rezultate obținute utilizând 3 protocoale diferite de obținere a materialului genetic, în comparație

Amplificarea PCR

Amplificarea ADN-ului cu ajutorul reacției de polimerază în lanț “permite să alegi o fracțiune de ADN de care ești interesat și să ai cât de mult vrei de ea” (Mullis, 1990).

Amplificarea unei secvențe de ADN presupune multiplicarea catenei existente prin alipirea de nucleotide. Reacția are mai multe etape:

Denaturarea catenei de ADN la 94-96oC prin ruperea legăturilor de hidrogen;

Alipirea markerilor forward/reverse, complementari cu secvențele 3’ sau 5’ ale regiunii;

Extensia catenei de ADN, prin alăturarea nucleotidelor din amestecul de reacție.

Fig. 14, 15- Etapele reacției de polimerază

Reacția PCR este realizată într-un tub de laborator prin amestecarea ADN-ului cu un set de reactivi si plasarea tubului într-un termociclu, care îl incubează la o serie de temperaturi preprogramate (Weier & Gray, 1988).

Aparatul este compus dintr-un bloc termic cu găuri în care sunt inserate tuburile cu soluții. Acestea sunt mai întâi încălzite peste punctul de topire a două catene complementare de ADN, permițându-le să se separe, etapă numită denaturare.

Ulterior, temperatura scade astfel încât primerii introduși în amestec să se lipească de segmentele urmărite și complementare lor.

Ca ultimă etapă, temperatura crește pentru ca ADN polimeraza să poată alătura nucleotidele din mixtură la catena legată de primerii forward și reverse. După fiecare repetiție, numărul de molecule de ADN se dublează.

Tabel nr. 6- Protocol de laborator al reacției PCR

Electroforeza în gel de agaroză și marcarea cu bromură de etidiu

Pentru separarea și identificarea fragmentelor de ADN se folosește electroforeza în gel de agaroză și poliacrilamidă. Electroforeza este o metodă de deplasare a particulelor de ADN încărcate electric prin migrare sub influența unui câmp electric.

Câmpul electric generat de cei doi electrozi este uniform, permițând particulelor încărcate electric a se deplasa înspre electrozii de sarcină opusă.

Gelul este preparat din agar extras din specii de alge roșii, completată de poliglucide, săruri și proteine. Gelul rezultat are structură poroasă, care permite deplasarea soluției spre polii de sarcină opusă. Acesta este turnat într-un cadru de plexiglas în care sunt fixați pieptenii cu dinți care vor forma godeurile.

Primul godeu a fost încărcat cu un marker ADN cu o lungime cunoscută de 100 bp.

Soluție stoc TAE 50X:

TRIS BASE 242 g/l

Acid Acetic Glacial 57,1 ml/l

100 ml/l EDTA 0,5 M, pH 8

se păstrează la temperatura camerei

Soluția de lucru TAE 1X:

S-a obținut prin măsurarea a 20 ml din soluția stoc de TAE 50x, completându-se până la un volum de 1000 ml cu apă distilată, având următoarele concentrații la componentele de bază:

40 mM Tris- Acetate

1 mM EDTA

apă bidistilată sterilă

După migrarea probelor, gelul a fost imersat în soluție de bromură de etidiu timp de 30 de minute pe un agitator mecanic. După colorare, s-a realizat fotografierea gelului expus la UV, cu ajutorul aparatului BioSpectrum AC Imaging Sistem.

Poze de la aparat

Electroforeza în capilaritate

Electroforeza în capilaritate s-a efectuat concomitent cu electroforeza în gel de agaroză pentru a identifica alelele cuprinse în intervalul fiecărui marker

Tabel nr. 7- Dimensiuni ale alelelor la 6 soiuri de Prunus

Prelucrarea și interpretarea datelor

A fost realizată prin colaborarea USAMV Cluj-Napoca cu cei doi parteneri ai proiectului, SC Secerișul SRL și Univ. Craiova- SCPP Vâlcea. Introducerea în baza de date a fost efectuată de USAMV Cluj-Napoca.

Rezultate și concluzii

Rezultate și discuții

Obiectivele urmărite în desfășurarea proiectului sunt colectarea materialului biologic și înființarea unei colecții cu scop de conservare a fondului de germoplasmă, la fel ca și identificarea markerilor SSR necesari amprentării genetice și introducerea datelor într-o bază informatică după diseminarea rezultatelor.

Colecția on farm are funcția de a cuprinde cele mai valoroase cultivaruri autohtone, sub administrare privată. Aceasta va avea un rol important în special în asigurarea conservării unor soiuri afectate în ultima vreme de vulnerabilitate și eroziune genetică, unele din ele fiind pe care le dispariție (Carpatin, Ialomița, Tuleu timpuriu, Dâmbovița).

Scopul final al proiectului este și facilitarea accesului publicului la informații, prin intermediul bazei de date GERMPLUM, prima de acest fel care să cuprindă doar accesiuni ale Prunus domestica. Astfel, caracteristicile fenotipice și genetice vor fi puse la dispoziția entităților interesate, dar și corelate cu baza de date europeană pentru Prunus, din cadrul European Cooperative for Plant Genetic Resources.

Pentru fiecare accesiune va fi stocat material biologic sub forma plantației, dar și material genetic păstrat la unitățile partenere. Acesta va folosi în continuare nu doar la înmulțirea și perpetuarea soiurilor cu mai puțină importanță din punct de vedere al producției sau calității fructelor, dar cu gene de interes necesare ameliorării ulterioare a speciei.

O analiză SSR anterioară (Őz et al. 2013) a demonstrat existența unui număr mai mare de alele (10, respectiv 11) în locusurile UCD-CH13 și UDP96-019 la soiurile de prun autohtone decât la cele din estul Anatoliei. Comparând numărul de alele din accesiunile românești cu cele internaționale, se observă că cel mai mare număr mediu de alele per locus (14.11) a fost înregistrat la cele autohtone, pe când la cele străine, valoarea a fost mult mai mică (7.67). Cel mai mare număr de alele (31) a fost înregistrat în locusul 93 BPPCT-014, iar cel mai mic (7) în UDP96-01.

Tabel nr. 7- Dimensiuni ale alelelor la 6 soiuri de Prunus

Concluzii și recomandări

Marea diversitate de gene detectată cu setul de perechi de primeri utilizați va servi în continuare pentru viitoare programe de înmulțire și ameliorare și pentru strategii de conservare pe termen lung.

Inițiativele ca baza de date și conservarea genofondului sunt esențiale pentru prezervarea diversității genetice existente la noi în țară. În continuare, cu toate că cerințele pieței sunt de fructe cât mai calitative, iar cele ale cultivatorilor se bazează pe producție și calitate, nevoia de soiuri și cultivare deținătoare de gene valoroase este la fel de mare, fără acestea neputând avea loc transferul de gene și estompând astfel evoluția speciei.

Mulțumiri ??????