Profiluri Genice de Virulenta Si Rezistenta la Tulpini de Staphylococcus Aureus, Izolate In Romaniadoc

=== Profiluri genice de virulenta si rezistenta la tulpini de Staphylococcus aureus, izolate in Romania ===

UNIVERSITATEA DIN BUCUREȘTI

FACULTATEA DE BIOLOGIE

ȘCOALA DOCTORALĂ DE BIOLOGIE

TEZĂ DE DOCTORAT

Conducător științific: PROF. DR. GRIGORE MIHĂESCU

Îndrumător științific: PROF. DR. CARMEN MARIANA CHIFIRIUC

Doctorand:

ELENA-CARMINA DRĂGULESCU

2016

UNIVERSITATEA DIN BUCUREȘTI

FACULTATEA DE BIOLOGIE

ȘCOALA DOCTORALĂ DE BIOLOGIE

TEZĂ DE DOCTORAT

Profiluri genice de virulență și rezistență la tulpini de Staphylococcus aureus izolate în România

Conducător științific: PROF. DR. GRIGORE MIHĂESCU

Îndrumător științific: PROF. DR. CARMEN MARIANA CHIFIRIUC

Doctorand:

ELENA-CARMINA DRĂGULESCU

2016

Cuprins

Lista de abrevieri

Partea teoretică

Introducere

Capitolul I. Implicațiile speciei Staphylococcus aureus în patologia umană

I.1 Staphylococcus aureus – caracterizare generală

I.2. Factorii de virulență

I.3 Interacțiunea agentului infecțios cu organismul gazdă

I.4. Determinismul genetic și mecanismele biochimice de rezistență la antibiotice

I.4.1. Antibioticele β-lactamice și mecanisme de acțiune

I.4.1.1. Rezistența enzimatică a S. aureus mediată de β-lactamaze

I.4.1.2. Rezistența prin modificarea țintei (proteinele de legare a penicilinei – PBP)

I.4.1.3. Determinismul genetic al rezistenței la β-lactamice

I.4.1.4. Rezistența la meticilină

I.4.1.4.1. Casetele SCCmec – substratul genetic al rezistenței la meticilină

I.4.2. Rezistența la aminoglicozide

I.4.3. Macrolide, lincosamide, streptogramine B – mecanisme de acțiune și rezistența tulpinilor de S. aureus

I.4.4. Tetracicline – mecanisme de acțiune și rezistența tulpinilor de S. aureus

I.4.5. Linezolid – mecanisme de acțiune și rezistența tulpinilor de S. aureus

Capitolul II – Partea experimentală – Profiluri genice de virulență și rezistență la tulpini de Staphylococcus aureus izolate în România

2.1. Scopul și obiectivele lucrării

2.2. Materiale și metode

2.2.1. Evidențierea genelor codificatoare ale factorilor de virulență

– Leucocidina Panton-Valentine (PVL)

– Proteina A (SpA)

– Enterotoxine (A, B, C, D, E)

– Toxina sindromului de șoc toxic (TSST- 1)

2.2.2. Evidențierea genelor de rezistență

– Evidentierea genei blaZ

– Evidențierea genei mecA

– Evidențierea genei de acetilare (aacA) și de fosforilare (aphD)

– Evidențierea genelor ermA, ermC

– Evidențierea genelor tetK și tetM

2.2.3. Tipizarea moleculară a tulpinilor de S. aureus prin pulse field gel electrophoresis (PFGE)

2.3. Rezultate

2.3.1. Profilurile genelor de virulență și semnificație clinică a factorilor codificați

2.3.2. Profilurile genelor de rezistență ale tulpinilor de S. aureus izolate

2.4. Discuții

2.5. Concluzii

2.6. Bibliografie

2.7. Anexe

2.8. Lista lucrărilor publicate/ prezentate la conferințe, publicate din teza de doctorat

S. aureus – Staphylococcus aureus

UMA – Unitatea Medicala A

UMB – Unitatea Medicala B

UMC – Unitatea Medicala C

UMD – Unitatea Medicala D

PCR – reactia de amplificare in lant

PTSAgs – pyrogenic toxin superantigens

TNF-α – tumor necrosis factor – α

IL-6 – interleukina 6

IFN-γ – interferon γ

RCT – receptorul T celular

CMH I – complexul major de histocompatibilitate I

TST-1 – toxina sindromului de șoc toxic 1

Th – limfocite T helper

CMH II – complexul major de histocompatibilitate II

IL-1 – interleukina 1

IL-2 – interleukina 2

Leucocidina Panton-Valentine (PVL) este o proteina/ toxina produsa de S. aureus care tinteste indeosebi leucocitele si macrofagele fiind formata din 2 unitati: componenta S si componenta F, transcrise separat. Are proprietati citolitice crescute, iar tandemul LukS-PV/ LukF-PV se intalneste in infectiile necrozante, profunde si mai rar in bacteriemii (Loffler et al., 2010).

Proteina A descoperita in anul 1958 de Jensen (Jensen, 1958) ca prima proteina de suprafata a S. aureus. La inceput a fost privita doar ca proteina de legare la imunoglobulina G (IgG), iar mai tarziu a fost recunoscut rolul in aderenta si colonizare prin interactia cu factorul von Willebrand (Hartleib et al., 2000). Face parte din familia MSCRAMM, prezentand motivul LPXTG (fig. ). Este structurata pe 5 domenii extracelulare (E, D, A, B si C), regiunile Xr si Xc ce strabat peretele celular si un domeniu alcatuit din 18-20 reziduuri hidrofobe care traverseaza membrana plasmatica.

Enterotoxinele stafilococice (SEs) sunt superantigene pirogenice – PTSAgs (pyrogenic toxin superantigens) înrudite structural, cu proprietăți toxice specifice, pirogene, superantigenice și sensibilitate la șocul endotoxic. Calitatea de superantigen a toxinelor constă în capacitatea de a stimula nespecific proliferarea limfocitelor T prin legarea la o regiune specifică variabilă a lanțului β a receptorului T celular (RCT). Consecutiv legării are loc eliberarea masivă a citokinelor proinflamatorii, caracteristice pentru un răspuns de tip Th1: TNF-α, IL-6 și IFN-γ, mediatoare ale patofiziologiei, sindromului de șoc toxic stafilococic (STSS). Enterotoxinele au activitate proteazică, sunt difuzibile și manifestă tropism față de mucoasa intestinală, fiind cauza frecventă a intoxicațiilor alimentare. Până în prezent se cunosc cel puțin 24 tipuri serologice de enterotoxine (A-V) (Blaiotta, G. și colab., 2004). Genele sea-sev sunt localizate pe cromosomul bacterian și pe insule de patogenitate egc (enterotoxin gene cluster) sau pe elemente genetice mobile: fagi, transpozomi, plasmide. Au calitate de superantigene, se leagă de moleculele complexului major de histocompatibilitate I (CMH I), își induc stimularea policlonală a limfocitelor T și manifestările de sindrom de șoc toxic; prezintă numeroase variante antigenice și sunt produse de 50% dintre tulpinile de S. aureus, atunci când contaminează produse alimentare bogate în glucide și proteine.

Toxina sindromului de șoc toxic (TSST-1) este un superantigen produs de anumite tulpini de S. aureus. Toxina activează un număr mare de limfocite T helper (Th), se leagă direct de moleculele complexului major de histocompatibilitate II (CMH II), fără a mai necesita internalizarea și prelucrarea, determinând activarea limfocitelor și eliberarea consecutivă a unor cantități mari de IL-2 și de IL-1 din macrofage.

Înainte de anul 1940, infectiile cu S. aureus și în particular, septicemiile, conduceau la 80% din cazuri la decesul pacientului. Descoperirea penicilinei G și utilizarea sa începând cu anul 1940 a condus la modificarea pronosticului acestor infectii. Aceasta descoperire a fost de scurta durata deoarece S. aureus a devenit rezistent la penicilina G prin producerea de penicilinaza. În anul 1960 a fost introdusa meticilina, o β-lactamina rezistenta la acțiunea penicilinazelor. 80% dintre tulpinile de S. aureus erau rezistente la penicilina G. După anul 1961 au apărut primele tulpini rezistente la meticilina (Lowy, 2003).

Mecanisme de acțiune

Beta-lactamicele actioneaza asupra sintezei peptidoglicanului. Se fixeaza de proteinele de legare a penicilinei (PBP) modificand structura peptidoglicanului fragilizand peretele bacterian. Apoi se poate observa o liza bacteriana. Aceasta activitate bactericida a beta-lactamicelor este datorata incapacitatii peptidoglicanului alterat de a menține presiunea osmotica intracitoplasmatica. S. aureus cuprinde 5 PBP (Tabelul ….) (Komatsuzawa și colab., 1999; Reynolds, 1988).

Tabelul …..

PBP la S. aureus

Au fost descrise doua mecanisme:

1. un mecanism fizic de segregare a noului peptidoglican într-un singur și același plan.

2. implica autolizinele codificate de gena lyt.

Rezistența a fost mai puțin frecventă înainte de introducerea antibioticelor în practica clinică pentru tratarea infecțiilor. Datorită presiunii selective a antibioticelor anumite tulpini au reușit să se dezvolte prin mecanisme de rezistență. Activitatea antibacteriană a fungului Penicillium notatum a fost observată (Fleming 1929) asupra unei culturi de S. aureus, ceea ce coincide cu descoperirea benzilpenicilinei. După introducerea benzilpenicilinei (penicilina G) în practica clinică, în anul 1942 a fost izolată prima tulpină rezistentă, mediată de producerea de β-lactamază (penicilinaza). Până în 1950, 40% din totalul izolatelor au devenit rezistente la penicilină G, iar până în 1960, numărul acestora a crescut la 80%. În prezent, majoritatea tulpinilor (98%) izolate din mediul spitalicesc și/ sau comunitar sunt rezistente la penicilină G prin producerea de penicilinaza. Penicilinazele sunt exoenzime secretate de stafilococ (Zygmunt și colab., 1992). Gena blaZ este reglata de către un represor constitutiv blaI și un antirepresor blaR1, molecula transmembranara care este activata de prezenta unei beta-lactamine. Gena pentru penicilinaza aparține unui transpozon, localizat pe o plasmida mare, ce poarta și alte gene de rezistenta la antibiotice (aminozide, macrolide), la antiseptice sau la metale grele. Se poate integra și în cromosom. Penicilinaza este un polipeptid de 257 aminoacizi (MM: 28 kDa) care scindează inelul β-lactamic al moleculei de penicilină G, făcând ineficient antibioticul.

La tulpinile hiperproducatoare de penicilinaza, oxacilina are o activitate diminuata, astfel ca tulpina poate să fie incadrata ca rezistenta. Aceste tulpini se numesc ''borderline'' (BORSA – Borderline Oxacillin Resistant Staphylococcus aureus). Acest mecanism conferă rezistență la toate antibioticele β-lactamice, făcând imposibilă utilizarea lor în clinică pentru tratamentul infecțiilor cu MRSA.

Penicilinazele de la stafilococ sunt sensibile la inhibitorii de beta-lactamaze: acid clavulanic, tazobactam, sulbactam (Drugeon, 2006).

–

Doua tipuri de rezistenta prin modificarea tintei exista la stafilococi:

1. achiziționarea unei PBP exogene: PBP2a;

2. modificarea sintezei PBP endogene.

Rezistenta prin producerea proteinei PBP2a a aparut la putin timp dupa introducerea meticilinei, prima penicilina semisintetica, un antibiotic ce era activ asupra tulpinilor de S. aureus producatoare de penicilinaza. Rezistenta este rezultatul producerii, atat la S. aureus, cat si la stafilococii coagulazo-negativi a unei proteine PBP numita straina (PBP2a) care nu prezinta nicio similaritate cu PBP de la S. aureus. Este foarte apropiata structural de PBP de la S. sciuri. Meticilina, la fel ca diversele beta-lactamice, inhiba situsul transpeptidazic al PBP2 conservand activitatea sa transglicolazica. PBP2a prezinta o activitate transpeptidazica de rezistenta la beta-lactamice. In prezenta unui antibiotic beta-lactamic, peptidoglicanul stafilococului continua sa fie sintetizat datorita activitatii transpeptidazice a proteinei PBP2a si a activitatii transglicolazice a proteinei PBP2 (Pinho si colab., 2001).

Proteina PBP2a este codificata de gena mecA, componenta a operonului mec, o parte din caseta cromosomală mec (SCCmec) (Oliveira și colab., 2006; Milheirico și colab., 2007; Shanshuang și colab., 2011). Aceasta gena poate sa fie reglata de genele mecI si mecR1. Aceste doua gene sunt similare cu genele blaI si blaR1 ce regleaza producerea de penicilinaza, dar si transcrierea genei mecA (Chambers, 1997).

Complexul genelor mec este situat pe un element genetic mobil ce se poate integra in cromosom la nivelul unui situs unic situat în apropierea originii replicarii și a genei de rezistenta la novobiocina. Se asociaza unui complex de doua gene de recombinaza din familia integrazelor-rezol denumite ccrA și ccrB (Hiramatsu și colab., 2001; Ito și colab., 2004) ce permit integrarea și excizia complexului mec-ccr, ce se comporta ca o insula de rezistenta la beta-lactamice sub denumirea de SCCmec (Staphylococcus cassette chromosomal).

Pana în prezent au fost descrise 11 tipuri de caseta cromosomala mec (International Working Group on the Staphylococcal Cassette Chromosome elements – IWG-SCC) prezentate în tabelul……

Tabelul …..

Cele 11 tipuri de SCCmec întâlnite la S. aureus

*O genă ccr sau genele ccr din complexul genei sunt indicate în paranteze.

Complexele genei ccr frecvent întâlnite la stafilococi sunt prezentate în tabelul….

Tabelul …..

Cele mai frecvente complexe ale genei ccr

**genele ccrA4B4 gasite in tipul SCCmec VIII au fost aproape identice cu cele din elementul SCC-CI de la S. epidermidis și a arătat identități de nucleotide cu cele gasite in tipul SCCmec VI de 89,6% și respectiv 94,5%.

Complexele genei mec frecvent întâlnite la stafilococi sunt prezentate în tabelul ….

Tabelul ….

Cele mai frecvente complexe ale genei mec

Detectarea rezistenței la meticilina se poate face prin:

– disc difuzie utilizand discul de cefoxitin/ moxalactam/ oxacilina;

– metode automate (vitek2, Phoenix, Microscan etc);

– metode imunologice folosind anticorpi anti PBP2a fixati pe particule din latex.

– metode moleculare (PCR). Reacția PCR este considerată ''gold standard'' pentru detectarea genei mecA.

Cu ajutorul reacției de amplificare în lanț (PCR) de tip multiplex este posibila determinarea tipului SCCmec util în studii de epidemiologie la S. aureus rezistent la meticilina. Caseta de tip IV a fost descrisa la tulpini comunitare de S. aureus, dar și la cele din spital.

Aminozidele sunt molecule cationice cu greutate moleculara mica, hidrosolubile, foarte stabile, de spectru larg și cu o activitate bactericida rapidă. Ele sunt diferite atat prin nucleul molecular (streptidina sau 2-deoxistreptamina = 2-DOS), cat si prin aminohexozele legate de nucleu (Vakulenko si colab., 2003). Gruparile NH2 si OH libere, prin intermediul carora aminozidele se leaga de proteinele ribosomale sunt esentiale pentru activitatea antimicrobiana. Patrunderea unui aminozid in celula bacteriana Gram pozitiva se face in 3 etape:

a) trecerea prin peptidoglican este pasiva, rapida si nonspecifica;

b) EDPI (Energy dependent phase) permite translocarea prin membrana citoplasmatica. Acumularea lenta in citoplasma depinde de concentratia extracelulara de antibiotic;

c) EDPII permite fixarea progresiva a aminozidelor la proteinele ribosomale. Aceasta etapa se caracterizeaza prin accelerarea transferului si o saturare a situsurilor ribosomale.

Gentamicina (CN), tobramicina (TOB), amikacina (AK) si streptomicina sunt folosite in mod curent pentru tratamentul infectiilor cu bacterii Gram pozitive si negative.

Spectrul de activitate al diferitelor antibiotice aminozidice este diferit. Aminozidele mai noi (CN, TOB, AK) au un spectru mai larg decat cele vechi [streptomicina, kanamicina (K)].

Desi manifesta nefrotoxicitate/ ototoxicitate, iar aparitia tulpinilor rezistente este relativ frecventa, aminoglicozidele raman, in continuare, foarte importante pentru tratamentul unor infectii in situatii speciale.

Au cateva particularitati ale actiunii antimicrobiene:

a) activitatea bactericida este dependenta de concentratie;

b) manifesta efectul postantibiotic;

c) au o farmacocinetica relativ predictibila;

d) manifesta efectul sinergic cu antibioticele antiparietale.

Aminoglicozidele se leaga de subunitatea 30S a ribosomului bacterian in zona inalt conservata a ARNr, in locul in care se formeaza legatura specifica intre codonul ARNm si anticodonul aminoacil-ARN si inhiba sinteza proteinelor. Subunitatea 30S are rol esential in traducerea cu mare fidelitate a mesajului genetic. Aminoglicozidele induc erori de citire a ARNm si astfel se sintetizeaza proteine nefunctionale sau sinteza proteinelor este stopata.

Rezistenta la antibioticele aminoglicozidice este larg raspandita. Se produce prin urmatoarele mecanisme:

1. inglobarea scazuta a antibioticului;

2. modificarea tintei ribosomale;

3. efluxul antibioticului;

4. modificarea enzimatica a aminoglicozidelor.

Modificarea chimica a aminoglicozidelor reprezinta principalul mecanism de rezistenta bacteriana. Mecanismele mai rar intalnite sunt sistemele de eflux si mutatiile situsului ribosomal de legare la ARNr (Leclerc si colab., 1991).

Modificarea enzimatica a aminozidelor reprezinta mecanismul major de rezistenta. Modificarea chimica are loc la nivelul grupelor amino sau hidroxil. S-au identificat peste 50 enzime. Acestea se clasifica in 3 familii:

1. aminoglicozid-acetil-transferaze (AAC): acetilarea gruparilor amino (NH2);

2. aminoglicozid-adenilil-transferaze (ANT): adauga AMP la gruparea OH la pozitiile 2', 3', 4' si respectiv 9;

3. aminoglicozid-fosfotransferaze (APH): adauga grupari de fosfati la aminoglicozide.

Fiecare dintre cele 3 familii de enzime este impartita in clase, in functie de situsul pe care il modifica.

Fiecare clasa contine numeroase enzime, fiind clasificate in subclase.

AAC cuprinde 4 clase de enzime, care acetileaza grupari amino situate in pozitiile 3, 2', 6', fiind notate AAC(3), AAC(2'), AAC(6'). Subclasele contin de asemenea tipuri de enzime, notate cu cifre romane. In functie de tipul enzimei produse variaza fenotipul de rezistenta fata de diferitele aminoglicozide. AAC(3)-I confera rezistenta fata de CN, AAC(3)-II determina rezistenta fata de CN, netilmicina (NET) si TOB, iar AAC(3)-III induce rezistenta fata de CN, TOB si kanamicina (K). Izoenzimele care au functii identice si astfel confera fenotip de rezistenta identic se noteaza cu litere mici: AAC(6')-Ia si AAC(6')-Ib. Noua enzima bifunctionala ce modifica aminoglicozidele, intalnita la specii de stafilococ si enterococ: AAC(6')+APH(2'') prezinta o importanta speciala. Dispune de o terminatie amino, care catalizeaza acetilarea grupei 6'-amino si de o terminatie carboxil care catalizeaza fosforilarea grupei hidroxil 2''. Aceasta enzima inactiveaza majoritatea aminoglicozidelor (exceptie streptomicina, la tulpinile care nu poseda rezistenta de nivel inalt fata de aceasta), fapt pentru care nici un fel de aminoglicozid nu poate fi utilizat in terapie (Dessen, 2001; Schito, 2006).

ANT cuprinde 5 clase de enzime.

APH cuprinde 7 clase de enzime. Sunt kinaze ce utilizeaza ATP ca substrat secundar si fosforileaza gruparile specifice OH, la toate clasele de antibiotice aminoglicozidice.

Aceste enzime ce modifica structura chimica a aminoglicozidelor sunt codificate pe plasmide si transpozoni. Cel mai frecvent intalnite, cu importanta clinica la S. aureus sunt urmatoarele (Dessen, 2001; Fluit, 2001; Ida, 2001):

1. AAC(6')-Ie+APH(2'') codificata de gena aac(6')-Ie+aph(2'') ce confera rezistenta fata de aminoglicozidele folosite in tratamentul infectiilor stafilococice. Gena se afla situata pe transpozonul Tn4001, raspandit la numeroase tulpini de S. aureus si stafilococi coagulazo-negativi. Acest transpozon s-a intalnit pe diferite plasmide, pSK1, pSK23 (plasmid ce poarta si alte gene de rezistenta fata de antibioticele β-lactamice si metale grele) si in variate localizari cromosomale.

2. ANT(4')-I codificata de gena ant(4')-Ia si determina rezistenta fata de K, TOB, neomicina si amikacina (AK). Gena care se afla pe plasmide mici integrate pe plasmide conjugative mai mari (ex. PSK4'), se insereaza frecvent la S. aureus pe elementul SCCmec prin intermediul proceselor de recombinare mediate de secventa de insertie IS257.

3. APH(3')-III codificata de gena aph(3')-IIIa localizata pe transpozonul Tn5405, integrat cromosomal sau plasmidic, duce la rezistenta fata de neomicina si K.

Mecanismele neenzimatice de rezistenta la antibioticele aminoglicozidice sunt:

1. sistemele de eflux;

2. mutatiile ARNr.

Rezistenta la CN se datoreaza prezentei enzimei inactivatoare 2-fosfotransferaza-6-acetiltrasferaza. Enzima confera rezistenta la CN, TOB, NET, AK si K. Rezistenta la CN este un indicator al rezistentei bacteriene la alte aminoglicozide.

Descoperite acum mai bine de 60 ani, tetraciclinele reprezinta un grup de antibiotice naturale cu activitate antibacteriana fata de un spectru larg de microorganisme patogene Gram pozitive/ negative, cat si asupra clamidiilor, micoplasmelor, ricketiilor si catorva protozoare. Sunt bine absorbite si active dupa administrare orala. Din aceste motive au cea mai larga utilizare in clinica umana si veterinara. Utilizarea masiva si necontrolata a tetraciclinei, atat in terapia umana, cat si in cea veterinara (ca promotor de crestere) a condus la selectarea si diseminarea clonelor bacteriene rezistente (Poyart, 2006).

Principalele tetracicline sunt prezentate in tabelul…..

Tabelul….

Principalele tetracicline

Structura chimica de baza a tetraciclinelor este prezentata in Fig……

Fig…… Structura chimica de baza a tetraciclinelor (https://it.wikipedia.org/wiki/Tetracicline)

Mecanismul de actiune a tetraciclinelor

Penetrarea in bacterii

Intervin doua procese in cursul penetrarii: difuzia pasiva si absorbtia activa la nivelul membranei citoplasmatice. Tetraciclinele nu difuzeaza liber in celula bacteriilor Gram pozitive.

Actiunea la nivelul ribosomului

Tetraciclinele sunt inhibitori ai fazei de elongare a catenei polipeptidice in timpul traducerii (sintezei proteice), exercitand astfel un efect bacteriostatic. Tetraciclina se fixeaza la nivelul subunitatii ribosomale 30S si in particular, de proteinele S7 si de nucleotidele G693, A892, U1052, C1054, G1300 si G1338 ale ARNr 16S, pentru prevenirea atasarii aminoacil-ARNt la situsul A (acceptor) al ribosomului bacterian.

Pe baza modului de actiune, tetraciclinele au fost impartite in doua categorii:

1. cele care inhiba sinteza proteinelor;

2. cele care interactioneaza cu membrana citoplasmatica.

Mecanismele rezistentei la tetracicline

Rezistenta la tetracicline este una dintre cele mai frecvente atat la bacterii Gram negative, cat si la cele pozitive.

Au fost descrise 3 mecanisme diferite determinate genetic:

1. activitatea pompelor de eflux – elimina tetraciclina din celula si este dependenta de energie fiind cel mai comun mecanism de rezistenta. Este mediat de produsele de sinteza ale genelor de rezistenta – proteine ale membranei citoplasmatice care functioneaza ca transportori ai tetraciclinei. Genele tet ce codifica proteinele de eflux sunt asociate cu plasmide conjugative, ceea ce explica distributia larga a rezistentei. La Staphylococcus genele de eflux sunt localizate, in general, pe plasmide mici de replicare. Prototipul este pT181 purtator al genei tet(K) (Khan si Novick, 1983). Au fost descrise si gene tet(L) ();

2. protectia ribosomilor – intermediul proteinelor solubile. La Staphylococcus au fost descrise genele tet(M), tet(O), tet(W). Cele mai studiate au fost tet(M) si tet(O). Aceste gene sunt de cele mai multe ori localizate pe elemente genetice mobile. Gena tet(M) este localizata pe transpozoni conjugativi in care prototipul este Tn916 si tet(O) pe plasmide conjugative. Proteina TetM a fost purificata (72 kDa) si s-a observat ca in vitro se asociaza cu ribosomii. In vitro are un rol protector fata de actiunea tetraciclinei, observandu-se ca legarea tetraciclinei la ribosom nu este alterata, iar aceasta legare nu modifica functionalitatea ribosomului. Proteina se asociaza cu ribosomii, facandu-i insensibili la actiunea tetraciclinei;

3. inactivarea enzimatica – degradarea oxidativa si nu are semnificatie ca mecanism de rezistenta.

Rezistenta dobandita prin mutatii ale genelor cromosomale este rara. Mutatiile sunt localizate in genele codante pentru ARNr 16S sau la nivelul genelor proteinelor de transport membranar.

Izolatele MRSA rezistente la tetraciclină și sensibile la minociclină (până la 50% din izolatele MRSA (Schmitz si colab., 2001) posedă gena tetK, în timp ce izolatele rezistente la minociclină posedă gena tetM sau ambele tetK și tetM (Trzcinski si colab., 2000).

Linezolidul este un antibiotic sintetic [(S)-N-({3-[3-fluoro-4-(morpholin-4-yl) phenyl]-2-oxo-1,3-oxazolidin-5-yl}methyl)acetamide] (Brickner, 1996), desemnat ca primul membru din clasa de antibiotice numita oxazolidinone. A fost descoperit prin anii 1990 si apobat de catre U.S. Food and Drug Administration (FDA) pentru uz clinic in 2000.

Linezolidul poate inhiba sinteza proteinelor bacteriene prin legarea de subunitatea 50S a ribosomului bacterian, prin intermediul interacțiunii cu domeniul V al 23S ARNr de la bacteriile Gram-pozitive, prevenind astfel formarea initierii complexului tertiar ribosomal N-formil metionil-ARNt-ARNm-70S. Astfel este stopata cresterea bacteriilor prin perturbarea sintezei proteinelor. Efectul este bacteriostatic, nu bactericid. Astfel, linezolidul este diferit fata de alti inhibitori ai sintezei proteice ca si cloramfenicolul, macrolidele, lincosamidele si tetraciclinele. Are avantajul ca pe langa prevenirea sintezei proteinelor stafilococice are si efect inhibitor asupra cresterii celulare bacteriene.

Proprietatiile sale farmacokinetice si farmacodinamice il califica pentru utilizarea lui in pneumonii nosocomiale si comunitare, infectii complicate de piele si tesuturi moi (Grau si colab., 2007), osteomielita (Aneziokoro si colab., 2005), sepsis (Pistella si colab., 2004) etc.

De la introducerea linezolidului s-a spus ca rezistenta va fi rara si nu va conduce la rezistenta incrucisata (Zhou si colab., 2015).

Prima alerta cu S. aureus rezistent la meticilina si la linezolid a fost raportata in 2001 in America de Nord (Tsiodras si colab., 2001). Dupa acest an, stafilococii si enterococii rezistenti la linezolid au fost raportati (Potoski si colab., 2006), (Cai si colab., 2012), (Chen si colab., 2013), (Gu si colab., 2013).

In Statele Unite ale Americii (U.S.A.), sensibilitatea la linezolid a izolatelor clinice Gram pozitive a fost monitorizata din 2004 printr-un program numit Linezolid Experience and Accurate Determination of Resistance (LEADER). Rezultatele au aratat ca rezistenta a ramas stabila si extrem de scazuta (Jones si colab., 2007), (Jones si colab., 2008), (Jones si colab., 2009). O retea de supraveghere similara numita "Zyvox Annual Appraisal of Potency and Spectrum Study" sau ZAAPS a fost deschisa in centrele medicale din Europa (Flamm si colab., 2013), (Tian si colab., 2014).

Pana acum au fost descrise 3 mecanisme de rezistenta la linezolid:

a) mutatii variate la nivelul buclei centrale a uneia sau mai multor alele ale regiunii domeniului V al genei 23S ARNr (De Almeida L.M. si colab., 2013), (Bongiorno si colab., 2010), (Hong si colab., 2007), (Lincopan si colab., 2009), (Sorlozano si colab., 2010).

a. various mutations at the central loop of one or more alleles of the domain V region of 23S rRNA gene

b. methylation of RNA by two different enzymes – RlnM, with enhanced methyltransferase activity following a codon insertion in the methyltransferase gene rlmN in S. aureus (W. GAO & al. [27]) and 23S rRNA methyltransferase produced as a result of chloramphenicol-florfenicol resistance (cfr) gene acquisition (F. CAMPANILE & al. [28]), (Y. HUANG & al. [29]), (R.E. MENDES & al. [30]), (I. QUILES-MELERO & al. [31]); 23S rRNA methyltransferase methylates the adenosine at position 2503 in 23S rRNA (E. coli 23S rRNA gene numbering).

The cfr gene confers resistance to five classes of antimicrobial agents, i.e., phenicols, lincosamides, oxazolidinones, pleuromutilins, and streptogramin A, a phenotype that has been termed PhLOPSA (C. KEHRENBERG & al. [32]), (K.S. LONG & al. [33]), (A.C. SHORE & al. [34]), (S.M. TOH & al. [35]), it is plasmid borne or chromosomally located (S.M. TOH & al. [35]), (C. KEHRENBERG & al. [36]). It can be horizontally transmitted between species and this mode of transmission is difficult to prevent and stop (C. KEHRENBERG & al. [36]), (H. NIAN & al. [37]). The cfr gene was originally identified in CoNS from animals (C. KEHRENBERG & S. SCHWARZ [38]), (S. SCHWARZ & al. [39]). It has also been found in a very limited number of S. aureus and CoNS strains from humans (R.E. MENDES & al. [30]), (S.M. TOH & al. [35]), (R.E. MENDES & al. [40]), (G.. MORALES & al. [41]).

c. mutations or deletions in genes encoding the 50S ribosomal subunit proteins L3 (L.M. DE ALMEIDA & al. [22]), L4 and L22 (encoded by the rplC, rplD and rplV genes) (C.S. HOLZEL & al. [42]), (K.S. LONG & B. VESTER [43]), (K.J. SHAW & M.R. BARBACHYN [44]).

Little attention has been given to CoNS in research carried out in Romanian laboratories so far, though other authors reported the ability of these organisms to be involved in severe infections and to acquire linezolid resistance (D. BONGIORNO & al. [23]), (R.E. MENDES & al. [45]), (E. PETINAKI & al. [46]). They represent a neglected reservoir of cfr-mediated resistance, frequently reported among patients in many regions, including North America (USA, Mexico), South America (Brazil), Europe (Greece, Spain, Italy, France, Ireland), and Asia (India) (B. GU & al. [15]), (B.A. POTOSKI & al. [16]), (R.E. MENDES & al. [40]), (A.H. MUTNICK & al. [47]). Such strains have rarely been reported in China (W. ZHOU & al. [10]), (J.C. CAI & al. [13]), (H. CHEN & al. [14]), (X.J. YANG & al. [48]).

In several hospital wards, especially ICUs, the antibiotic pressure, due to both adequate and inadequate use of antibiotics and the difficulty in detecting certain resistance phenotypes led to a major increase in bacterial resistance rates worldwide (A.F. SHORR & J. LIPMAN [49]) and favored the development of multiple resistances in microorganisms such as Staphylococcus spp. (F.M. MACKENZIE & al. [50]).

The first autochthonous strain of CoNS suspected to be linezolid resistant received at the Reference Laboratory for Nosocomial Infections and Antimicrobial Resistance for confirmation was the target of this study which aimed to elucidate the molecular basis of this resistance phenotype.

Scopul acestei lucrari a fost de a caracteriza fenotipic si genotipic tulpinile de Staphylococcus aureus

Au fost luate în studiu ….. tulpini de S. aureus, izolate de la pacienți cu infecții cutanate, …. 22 tulpini provin de la Unitatea Medicală A (UMA) din București, 28 tulpini provin de la Unitatea Medicală B (UMB) din Suceava, 42 tulpini provin de la Laboratorul de Analize Medicale din cadrul Institutului Cantacuzino = Unitatea Medicală C (UMC) din București fiind izolate comunitare, 29 tulpini de la Unitatea Medicală D (UMD) din București fiind tot izolate comunitare de la pacienții ce s-au prezentat la camera de gardă a unității medicale. Aceste tulpini au fost colectate în anii 2010 (UMA), 2013/2014 (UMB), 2014 (UMC) și 2015 (UMD). În paralel, au fost folosite ca referință mai multe tulpini pentru fiecare metodă.

Extracția de material genetic bacterian. Extracția de ADN s-a realizat cu ajutorul kitului ''NucleoSpin Tissue'' (Macherey-Nagel, Germany) conform indicațiilor producătorului.

A fost pusă în evidență cu ajutorul reacției de amplificare în lanț (PCR) in sistem triplex, dupa un protocol optimizat ''in house'' (Dragulescu si colab., 2007), țintind gena lukS/F. S-a utilizat termocycler-ul ''Corbett Research'' (). Mix-ul reactiei s-a realizat în volum final de 25 μl și conține 5x tamponul enzimei Taq DNA polimeraza Promega (Promega Corporation, Madison, WI, USA), 1,5 mM MgCl2, 0,2 mM dNTPs, primeri nucF și nucR (5 pmoli/R din fiecare), mecA1 și mecA2 (5 pmoli/R din fiecare), lukS/F1 și lukS/F2 (10 pmoli/R din fiecare), 1,5 U enzimă Taq DNA polimeraza Promega, apă distilată sterilă liberă de DN-aze, RN-aze până la volum final de 25 μl. Secventa primerilor utilizati in reactie este prezentata in tabelul ….

Tabelul ……

Secvența primerilor utilizați în triplex PCR

Programul de amplificare este prezentat în tabelul….

Tabelul…..

Programul de amplificare

Produșii de amplificare au fost migrați prin electroforeză în gel de agaroză 2%, 100V, timp de 48 minute, colorat cu bromura de etidium și vizualizat pe transiluminator cu UV.

A fost pusă în evidență cu ajutorul reacției PCR simplex țintind gena spa. Protocolul de lucru a fost stabilit de cei de la Ridom spaserver (http://www.ridom.de/doc/Ridom_spa_sequencing.pdf). Produșii de amplificare au fost migrați prin electroforeză în gel de agaroză 1,5%, 100V, timp de 48 minute, colorat cu bromura de etidium și vizualizat pe transiluminator cu UV. Ampliconii astfel obținuți au fost purificați utilizând kit-ul Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up System (Promega Corporation, Madison, WI, USA). Ampliconii purificați au fost introduși în reacția de secvențiere utilizând kitul BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing (Applied Biosystems), apoi purificați cu ajutorul kit-ului DyeEx 2.0 Spin (Qiagen), cu obținerea unor peleți supuși metodei Sanger de secvențiere cu echipamentul ABI PRISM 3130 Genetic Analyzer (Applied Biosystems). Analiza si incadrarea in tipuri spa a secventelor obtinute s-a realizat cu ajutorul softului Ridom StaphType software (Ridom GmbH, Wurzburg, Germany).

Secventele primerilor utilizati in reactia de amplificare in lant si secventierea ampliconilor obtinuti sunt prezentate in tabelul …..

Tabelul ……

Secventa primerilor utilizati

Au fost evidențiate cu ajutorul reacției PCR simplex pentru fiecare genă sea, seb, sec, sed, see. Mix-ul fiecarei reactii s-a realizat în volum final de 25 μl și conține 5x tamponul enzimei Taq DNA polimeraza Promega (Promega Corporation, Madison, WI, USA), 1,5 mM MgCl2, 0,2 mM dNTPs, primeri SEA1/ SEA2, respectiv SEB1/SEB2; SEC1/SEC2; SED1/SED2 (10 pmoli/R din fiecare), 1,25 U enzimă Taq DNA polimeraza Promega, apă distilată sterilă liberă de DN-aze, RN-aze până la volum final de 25 μl. Secventa primerilor utilizati in reactii este prezentata in tabelul ….

Tabelul ……

Secvența primerilor utilizați în fiecare simplex PCR

Programul de amplificare este prezentat in tabelul…..

Tabelul……

Programul de amplificare

Produșii de amplificare au fost migrați prin electroforeză în gel de agaroză 1,5%, 100V, timp de 48 minute, colorat cu bromura de etidium și vizualizat pe transiluminator cu UV.

S

A fost pusa in evidenta cu ajutorul reactiei PCR simplex pentru gena tsst-1. Mix-ul reactiei s-a realizat în volum final de 25 μl și conține 5x tamponul enzimei Taq DNA polimeraza Promega (Promega Corporation, Madison, WI, USA), 1,5 mM MgCl2, 0,2 mM dNTPs, primeri TSST1 și TSST2 (10 pmoli/R din fiecare), 1,25 U enzimă Taq DNA polimeraza Promega, apă distilată sterilă liberă de DN-aze, RN-aze până la volum final de 25 μl. Secventa primerilor utilizati in reactie este prezentata in tabelul ….

Tabelul ……

Secvența primerilor utilizați în simplex PCR

Programul de amplificare este prezentat în tabelul……..

Tabelul…..

Programul de amplificare

Produșii de amplificare au fost migrați prin electroforeză în gel de agaroză 1,5%, 100V, timp de 48 minute, colorat cu bromura de etidium și vizualizat pe transiluminator cu UV.

– Evidentierea genei blaZ

Rezistenta la penicilina mediata prin producerea de penicilinaza a fost pusa în evidenta prin PCR simplex pentru gena blaZ. Mix-ul reactiei s-a realizat în volum final de 25 μl și conține 5x tamponul enzimei Taq DNA polimeraza Promega (Promega Corporation, Madison, WI, USA), 1,5 mM MgCl2, 0,2 mM dNTPs, primeri blaZ 1 si blaZ 2 (10 pmoli/R din fiecare), 1,25 U enzimă Taq DNA polimeraza Promega, apă distilată sterilă liberă de DN-aze, RN-aze până la volum final de 25 μl. Secventa primerilor utilizati in reactie este prezentata in tabelul ….

Tabelul ……

Secventa primerilor utilizati in reactie

Programul de amplificare este prezentat in tabelul…..

Tabelul…..

Programul de amplificare

Evidentierea genei mecA prin amplificare genica reprezintă ''gold standard''ul detectarii rezistentei la meticilina (oxacilina, cefoxitin). Detectarea genei s-a realizat prin reactia PCR in sistem triplex descrisa in subcapitolul 2.2.1.

Rezistenta la gentamicina a fost pusa in evidenta cu ajutorul reactiei PCR simplex pentru gena aacA-aphD.

Mix-ul reactiei s-a realizat în volum final de 25 μl și conține 5x tamponul enzimei Taq DNA polimeraza Promega (Promega Corporation, Madison, WI, USA), 1,5 mM MgCl2, 0,2 mM dNTPs, primeri aacA-aphD 1 si aacA-aphD 2 (10 pmoli/R din fiecare), 1,25 U enzimă Taq DNA polimeraza Promega, apă distilată sterilă liberă de DN-aze, RN-aze până la volum final de 25 μl. Secventa primerilor utilizati in reactie este prezentata in tabelul ….

Tabelul ….

Secventa primerilor utilizati in reactie

Programul de amplificare este prezentat in tabelul…..

Tabelul…..

Programul de amplificare

Produșii de amplificare au fost migrați prin electroforeză în gel de agaroză 1,5%, 100V, timp de 48 minute, colorat cu bromura de etidium și vizualizat pe transiluminator cu UV.

, erm

Genele ermA-C au fost puse in evidenta cu ajutorul reactiei PCR simplex. Mix-urile reactiilor s-au realizat în volum final de 25 μl și conțin 5x tamponul enzimei Taq DNA polimeraza Promega (Promega Corporation, Madison, WI, USA), 1,5 mM MgCl2, 0,2 mM dNTPs, primeri ermA 1 si ermA 2, respectiv ermC 1 si ermC 2 (10 pmoli/R din fiecare), 1,25 U enzimă Taq DNA polimeraza Promega, apă distilată sterilă liberă de DN-aze, RN-aze până la volum final de 25 μl. Secventele primerilor utilizati in reactie sunt prezentate in tabelul ….

Tabelul ….

Secventele primerilor utilizati in reactii

Programul de amplificare este prezentat in tabelul…..

Tabelul…..

Programul de amplificare

Produșii de amplificare au fost migrați prin electroforeză în gel de agaroză 1,5%, 100V, timp de 48 minute, colorat cu bromura de etidium și vizualizat pe transiluminator cu UV.

Genele tetK si tetM au fost puse in evidenta cu ajutorul reactiei PCR simplex. Mix-urile reactiilor s-au realizat în volum final de 25 μl și conțin 5x tamponul enzimei Taq DNA polimeraza Promega (Promega Corporation, Madison, WI, USA), 1,5 mM MgCl2, 0,2 mM dNTPs, primeri tetK 1 si tetK 2, respectiv tetM 1 si tetM 2 (10 pmoli/R din fiecare), 1,25 U enzimă Taq DNA polimeraza Promega, apă distilată sterilă liberă de DN-aze, RN-aze până la volum final de 25 μl. Secventele primerilor utilizati in reactii sunt prezentate in tabelul ….

Tabelul ….

Secventa primerilor utilizati in reacție

Programul de amplificare este prezentat in tabelul…..

Tabelul…..

Programul de amplificare

Produșii de amplificare au fost migrați prin electroforeză în gel de agaroză 1,5%, 100V, timp de 48 minute, colorat cu bromura de etidium și vizualizat pe transiluminator cu UV.

Tipizarea moleculara a

Metoda PFGE considerata ''gold standard'' in epidemiologia tulpinilor de S. aureus. Determinarea clonalitatii tulpinilor

Lowy F.D., 2003, Antimicrobial resistance: the example of Staphylococcus aureus, J. Clin. Invest. 111, 1265-1273.

Komatsuzawa H., Choi G.H., Ohta K., Sugai M., Tran M.T., Suginaka H., 1999, Cloning and characterization of a gene, pbpF, encoding a new penicillin-binding protein PBP2B, in Staphylococcus aureus, Antimicrob. Agents Chemother., 43, 1578-1583.

Reynolds P.E., 1988, The essential nature of staphylococcal penicillin-binding proteins, pp. 343-351. În Actor P., Daneo-Moore L., Higgins M.L., Salton M.R., Shockman G.D. (ed.), Antibiotics inhibition of bacterial cell surface assembly and function. American Society for Microbiology, Washington, D.C.

Zygmunt D.J., Stratton C.W., Kernodle D.S., 1992, Characterization of four β-lactamases produced by Staphylococcus aureus, Antimicrob. Agents Chemother., 36, 440-445.

Drugeon H.B., 2006, β-lactamines et Staphylocoques, Antibiogramme, 2-eme Edition, ESKA, 117-124.

Pinho M.G., Filipe S.R., de Lencastre H., Tomasz A., 2001, Complementation of the essential peptidoglycan transpeptidase function of penicillin-binding protein 2 (PBP2) by the drug resistance protein PBP2a in Staphylococcus aureus, J. Bacteriol., 183, 6525-6531.

Chambers H.F., 1997, Methicillin resistance in staphylococci: molecular and biochemical basis and clinical implications, Clin. Microbiol. Rev., 10, 781-791.

Poyart C., 2006, Tetracyclines, Antibiogramme, 2-eme Edition, ESKA, 325-333.

Drăgulescu E.C., Oprea M., Străuț M., Codiță I., 2007, Detectarea rapidă a tulpinilor de Staphylococcus aureus comunitar meticilino-rezistent folosind tehnica PCR multiplex, A XI-a Reuniune Anuală de Microbiologie, 24-26 mai, Mamaia, România – poster.

Strommenger B., Kettlitz Ch., Werner G., and Witte W., 2003, Multiplex PCR Assay for Simultaneous Detection of Nine Clinically Relevant Antibiotic Resistance Genes in Staphylococcus aureus, J. Clin. Microbiol., 41, 4089–4094.

Lina G., Piemont Y., Godail-Gamot F., Bes M., Peter M-O., Gauduchon V., Vandenesch F., and Etienne J., 1999, Involvement of Panton-Valentine Leukocidin–Producing Staphylococcus aureus in Primary Skin Infections and Pneumonia, Clin. Infect. Dis., 29, 1128–1132.

Milheirico C., Oliveira D.C., and de Lencastre H., 2007, Update to the multiplex PCR strategy for assignment of mec element types in Staphylococcus aureus. Antimicrob. Agents Chemother., 51, 3374–3377.

Brakstad O.G., Aasbakk K. and Maeland J.A., 1992, Detection of Staphylococcus aureus by Polymerase Chain Reaction Amplification of the nuc Gene, J. Clin. Microbiol., 30, 1654-1660.

Harmsen D., Claus H., Witte W., Rothgänger J., Claus H., Turnwald D., Vogel U., 2003, Typing of methicillin-resistant Staphylococcus aureus in a university hospital setting using a novel software for spa-repeat determination and database management, J. Clin. Microbiol., 41, 5442–5448.

Mellmann A., Friedrich A.W., Rosenkötter N., Rothgänger J., Karch H., Reintjes R., Harmsen D., 2006, Automated DNA sequence-based early warning system for the detection of methicillin-resistant Staphylococcus aureus outbreaks, PLoS Med., 3, e33.

Blaiotta G., Ercolini D., Pennacchia C., Fusco V., Casaburi A., Pepe O., Villani F., 2004, PCR detection of staphylococcal enterotoxin genes in Staphylococcus spp. Strains isolated from meat and dairy products. Evidence for new variants of seG and seI in S. aureus AB – 8802. J. Applied Microbiol., 97, 719–730.

Johnson W., Tyler M.S., Ewan S.D., Ashton E.P., Polland F.E. and Rozee K.R., 1991, Detection of genes for enterotoxins, exofoliative toxins and toxic shock syndrome toxin 1 in Staphylococcus aureus by polymerase chain reaction. J. Clin. Microbiol., 29, 426–430.

Murchan S., Kaufmann M.E., Deplano A., de Ryck R., Struelens M., Elsberg Zinn Ch., Fussing V., Salmenlinna S., Vuopio Varkila J., El Solh N., Cuny Ch., Witte W., Tassios P.T., Legakis N., van Leeuwen W., van Belkum A., Vindel A., Laconcha I., Garaizar J., Haeggman S., Olsson-Liljequist B., Ransjo U., Coombes G., and Cookson B., 2002, Harmonization of Pulsed-Field Gel Electrophoresis Protocols for Epidemiological Typing of Strains of Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus: a Single Approach Developed by Consensus in 10 European Laboratories and Its Application for Tracing the Spread of Related Strains. J. Clin. Microbiol., 41, 1574–1585.

Vakulenko S.B., Donabedian S.M., Voskresenskiy A.M., Zervos M.J., Lerner S.A., Chow J.W., 2003, Multiplex PCR for Detection of Aminoglycoside Resistance Genes in Enterococci, Antimicrob. Agents Chemother., 47, 1423-1426.

Leclerc D., Melancon P., Brakier – Gingras L., 1991, Mutations in the 915 region of Escherichia coli 16S ribosomal RNA reduce the binding of streptomycin to the ribosome, Nuc. Acids Res., 19, 3973-3977.

Khan S.A., Novick R.P., 1983, Complete nucleotide sequence of pT181, a tetracycline-resistance plasmid from Staphylococcus aureus. Plasmid, 10, 251-259.

Schmitz F.J., Krey A., Sadurski R., Verhoef J., Milatovic D., and Fluit A.C., 2001, Resistance to tetracycline and distribution of tetracycline resistance genes in European Staphylococcus aureus isolates, J. Antimicrob. Chemother., 47, 239–240.

Trzcinski K., Cooper B.S., Hryniewicz W., and Dowson C.G., 2000, Expression of resistance to tetracyclines in strains of methicillin-resistant Staphylococcus aureus, J. Antimicrob. Chemother., 45, 763–770.

Oliveira D.C., Milheirico C., de Lencastre H., 2006, Redefining a Structural Variant of Staphylococcal Cassette Chromosome mec, SCCmec Type VI, Antimicrob. Agents Chemother., 50, 3457-3459.

Milheirico C., Oliveira D.C., and de Lencastre H., 2007, Update to the multiplex PCR strategy for assignment of mec element types in Staphylococcus aureus, Antimicrob. Agents Chemother., 51, 3374–3377.

Milheirico C., Oliveira D.C., and de Lencastre H., 2007, Multiplex PCR strategy for subtyping the staphylococcal cassette chromosome mec type IV in methicillin-resistant Staphylococcus aureus: „SCCmec IV multiplex”, J. Antimicrob. Chemother., doi:10.1093/jac/dkm112.

Shanshuang Li., Skov R.L., Han X., Larsen A.R., Larsen J., Sorum M., Wulf M., Voss A., Hiramatsu K. and Ito T., 2011, Novel Types of Staphylococcal Cassette Chromosome mec Elements Identified in Clonal Complex 398 Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus Strains, Antimicrob. Agents Chemother., 55, 3046-3050.

International Working Group on the Classification of Staphylococcal Cassette Chromosome Elements (IWG-SCC), 2009, Classification of Staphylococcal Cassette Chromosome mec (SCCmec): Guidelines for Reporting Novel SCCmec Elements, Antimicrob. Agents Chemother., 53, 4961-4967.

Hiramatsu K., Cui L., Kuroda M., Ito T., 2001, The emergence and evolution of methicillin resistant Staphylococcus aureus, Trends Microbiol., 9, 493-496.

Ito T., Ma X.X., Takeuchi F., Okuma K., Yuzawa H., Hiramatsu K., 2004, Novel type V staphylococcal cassette chromosome mec driven by a novel cassette chromosome recombinase ccrC, Antimicrob. Agents Chemother., 48, 2637-2651.

Martineau F., Picard F.J., Lansac N., Menard C., Roy P.H., Ouellette M., and Bergeron M.G., 2000, Correlation between the resistance genotype determined by multiplex PCR assays and the antibiotic susceptibility patterns of Staphylococcus aureus and Staphylococcus epidermidis, Antimicrob. Agents Chemother., 44, 231–238.

Brickner S.J., 1996, "Oxazolidinone antibacterial agents". Curr. Pharmaceut. Design, 2, 175–194.

Grau S., Aguado J.M., Mateu-De Antonio J., Gonzales P., Del Castillo A., 2007, Economic evaluation of linezolid versus teicoplanin for the treatment of infections caused by gram-positive microorganisms in Spain, J. Chemother., 19, 398–409.

Aneziokoro C.O., Cannon J.P., Pachucki C.T., Lentino J.R., 2005, "The effectiveness and safety of oral linezolid for the primary and secondary treatment of osteomyelitis". J. Chemother., 17, 643–650.

Pistella E., Campanile F., Bongiorno D., Stefani S., Di Nucci GD, Serra P. & Venditti M., 2004, Successful Treatment of Disseminated Cerebritis Complicating Methicillin-resistant Staphylococcus aureus Endocarditis Unresponsive to Vancomycin Therapy with Linezolid, Scandinavian J. Infect. Dis., 36, 222-225.

Zhou W., Niu D., Cao X., Ning M., Zhang Z., Shen H., Zheng K., 2015, Clonal dissemination of linezolid-resistant Staphylococcus capitis with G2603T mutation in domain V of the 23S rRNA and the cfr gene at a tertiary care hospital in China, BMC Infectious Diseases, 15, 97. DOI10.1186/s12879-015-0841-z.

Tsiodras S., Gold H.S., Sakoulas G., Eliopoulos G.M., Wennersten Ch., Venkataraman L., Moellering Jr R.C., Ferraro M.J., 2001, Linezolid resistance in a clinical isolate of Staphylococcus aureus, Lancet, 358, 207–208.

Cai J.C., Hu Y.Y., Zhang R., Zhou H.W., Chen G.X., 2012, Linezolid-resistant clinical isolates of meticillin-resistant coagulase-negative staphylococci and Enterococcus faecium from China, J. Med. Microbiol., 61, 1568-1573.

Potoski B.A., Adams J., Clarke L., Shutt K., Linden P.K., Baxter C., Pasculle A.W., Capitano B., Peleg A.Y., Szabo D., Paterson D.L., 2006, Epidemiological profile of linezolid-resistant coagulase-negative staphylococci, Clin. Infect. Dis., 43, 165–171.

Chen H., Wu W., Ni M., Liu Y., Zhang J., Xia F., He W., Wang Q., Wang Z., Cao B., Wang H., 2013, Linezolid-resistant clinical isolates of enterococci and Staphylococcus cohnii from a multicentre study in China: molecular epidemiology and resistance mechanisms, Int. J. Antimicrob. Agents, 42, 317-321.

Gu B., Kelesidis T., Tsiodras S., Hindler J. & Humphries R.M., 2013, The emerging problem of linezolid-resistant Staphylococcus, J. Antimicrob. Chemother., 68, 4–11.

Jones R.N., Fritsche T.R., Sader H.S., Ross J.E., 2007, LEADER surveillance program results for 2006: an activity and spectrum analysis of linezolid using clinical isolates from the United States (50 medical centers), Diagn. Microbiol. Infect. Dis., 59, 309-317.

Jones R.N., Ross J.E., Castanheira M., Mendes R.E., 2008, "United States resistance surveillance results for linezolid (LEADER Program for 2007)", Diagn. Microbiol. Infect. Dis., 62, 416–426.

Jones R.N., Kohno S., Ono Y., Ross J.E., Yanagihara K., 2009, ZAAPS International Surveillance Program (2007) for linezolid resistance: Results from 5591 Gram-positive clinical isolates in 23 countries, Diagn. Microbiol. Infect. Dis., 64, 191-201.

Flamm R.K., Mendes R.E., Ross J.E., Sader H.S., Jones R.N., 2013, An international activity and spectrum analysis of linezolid: ZAAPS Program results for 2011, Diagn. Microbiol. Infect. Dis., 76, 206-213.

Tian Y., Li T., Zhu Y., Wang B., Zou X. and Li M., 2014, Mechanisms of linezolid resistance in staphylococci and enterococci isolated from two teaching hospitals in Shanghai, China, BMC Microbiol., 14, 292.

De Almeida L.M., De Araújo M.R.E., Sacramento A.G., Pavez M., De Souza A.G., Rodrigues F., Gales A.C., Lincopan N., Sampaio J.L.M., Mamizuka E.M., 2013, Linezolid Resistance in Brazilian Staphylococcus hominis Strains Is Associated with L3 and 23S rRNA Ribosomal Mutations, Antimicrob. Agents Chemother., 57, 4082–4083.

Bongiorno D., Campanile F., Mongelli G., Baldi M.T., Provenzani R., Reali S., Lo Russo C., Santagati M., Stefani S., 2010, DNA methylase modifications and other linezolid resistance mutations in coagulase-negative staphylococci in Italy, J. Antimicrob. Chemother., 65, 2336-2340.

Hong T., Li X., Wang J., Sloan C., Cicogna C., 2007, Sequential linezolid-resistant Staphylococcus epidermidis isolates with G2576T mutation, J. Clin. Microbiol., 45, 3277–3280.

Lincopan N., De Almeida L.M., Elmor De Araújo M.R., Mamizuka E.M., 2009, Linezolid resistance in Staphylococcus epidermidis associated with a G2603T mutation in the 23S rRNA gene, Int. J. Antimicrob. Agents., 34, 281–282.

Sorlozano A., Gutierrez J., Martinez T., Yuste M.E., Perez-Lopez J.A., Vindel A., Guillen J., Boquete T., 2010, Detection of new mutations conferring resistance to linezolid in glycopeptide-intermediate susceptibility Staphylococcus hominis subspecies hominis circulating in an intensive care unit, Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis., 29, 73–80.

https://it.wikipedia.org/wiki/Tetracicline