Profiluri genice de virulență și rezistență la tulpini de [311079]
UNIVERSITATEA DIN BUCUREȘTI
FACULTATEA DE BIOLOGIE
ȘCOALA DOCTORALĂ DE BIOLOGIE
TEZĂ DE DOCTORAT
Conducător științific: PROF. DR. GRIGORE MIHĂESCU
Îndrumător științific: PROF. DR. CARMEN MARIANA CHIFIRIUC
Doctorand: [anonimizat]-CARMINA DRĂGULESCU
2016
TEZĂ DE DOCTORAT
Profiluri genice de virulență și rezistență la tulpini de
Staphylococcus aureus izolate în România
Conducător științific: PROF. DR. GRIGORE MIHĂESCU
Îndrumător științific: PROF. DR. CARMEN MARIANA CHIFIRIUC
Doctorand: [anonimizat]-CARMINA DRĂGULESCU
2016
Cuprins
Listă de abrevieri
Introducere
Capitolul I. Implicațiile speciei Staphylococcus aureus în patologia umană
I.1. Caracteristici de cultivare și identificare
I.2. [anonimizat]-[anonimizat]
I.3 Interacțiunea agentului infecțios cu organismul gazdă
I.4. Determinismul genetic și mecanismele biochimice de rezistență la antibiotice
I.4.1. Antibioticele β-lactamice și mecanismele de acțiune
Rezistența enzimatică a S. aureus mediată de β-lactamaze
Rezistența prin modificarea țintei (proteinele de legare a penicilinei – PBP)
Determinismul genetic al rezistenței la β-[anonimizat]
I.4.2. Rezistența la aminoglicozide
I.4.3. Macrolide, lincosamide, streptogramine B – mecanisme de acțiune și rezistența tulpinilor de S. aureus
I.4.4. Tetracicline – mecanisme de acțiune și rezistența tulpinilor de S. aureus
I.4.5. Linezolid – mecanisme de acțiune și rezistența tulpinilor de S. [anonimizat] – Profiluri genice de virulență și rezistență la tulpini de Staphylococcus aureus izolate în România
2.1. Scopul și obiectivele lucrării
2.2. Materiale și metode
2.2.1. Evidențierea genelor codificatoare ale factorilor de virulență
Proteina A (SpA)
[anonimizat] (PVL)
Enterotoxine (A, B, C, D)
Toxina sindromului de șoc toxic (TSST- 1)
2.2.2. Evidențierea genelor de rezistență
Evidențierea genei blaZ
Evidențierea genei mecA
Evidențierea genei de acetilare (aacA) și de fosforilare (aphD)
[anonimizat]
2.2.3. Tipizarea moleculară a tulpinilor de S. aureus prin Pulse Field Gel Electrophoresis (PFGE)
2.2.4. Tipizarea SCCmec
2.3. Rezultate
2.3.1. Profilurile genelor de virulență și semnificație clinică a factorilor codificați
2.3.2. Profilurile genelor de rezistență ale tulpinilor de S. aureus izolate
2.4. Discuții
2.5. Concluzii
2.6. Bibliografie
2.7. Anexe
2.8. Lista lucrărilor publicate/ [anonimizat]
S. aureus – Staphylococcus aureus
MRSA – S. [anonimizat] – Vancomycin resistant S. aureus
α – alfa
β – [anonimizat] – Unitatea Medicala A
UMB – Unitatea Medicala B
UMC – Unitatea Medicala C
UMD – Unitatea Medicala D
PCR – [anonimizat]-α – tumor necrosis factor – α
IL-6 – interleukina-6
IFN-γ – interferon-γ
RCT – receptorul T celular
CMH I – complexul major de histocompatibilitate I
TSST-1 – toxina sindromului de șoc toxic 1
Th – limfocite T helper
CMH II – complexul major de histocompatibilitate II
IL-1 – interleukina-1
IL-2 – interleukina-2
MSCRAMMs – Microbial Surface Components Recognizing Adhesive Matrix Molecules.
Introducere
Staphylococcus aureus (S. aureus) este un patogen oportunist implicat în diverse infecții tegumentare sau în infecții sistemice, invazive, ce duc la complicații la persoanele imunocompromise și cu factori de risc ce predispun la infecții grave. Prin acumularea de noi elemente genetice mobile (profagi, plasmide, insule de patogenitate, transpozoni) ce poartă atât gene de virulență, cât și de rezistență la antibiotice, tulpinile de S. aureus devin progresiv tot mai rezistente, atât calitativ cât și cantitativ. Captarea elementelor genetice mobile, dar și mutațiile la nivelul unor gene țintă a schimbat profilul cromosomal și extracromosomal, rezultând astfel bacterii multirezistente și virulente (''superbug''). S. aureus rezistent la meticilină (SARM/ MRSA) este rezistent la mai multe clase de antibiotice, făcând astfel ca infecțiile comune să fie greu de tratat și controlat. Existența unor variante de colonii mici (Small Colony Variants – SCVs), cu mutații ale unor gene implicate în metabolism îngreunează și mai mult tratamentul infecțiilor cu S. aureus, mai ales cele cu implicare osoasă (osteomielită).
Capitolul I. Implicațiile speciei Staphylococcus aureus în patologia umană
Staphylococcus a fost identificat în puroiul recoltat dintr-un abces al articulației genunchiului (Ogston, 1984). Aglomerările bacteriene sub formă de ciorchine, le-a denumit Staphylococcus (lb. greacă – staphyle = ciorchine de strugure). Ulterior agentul infecțios a fost cultivat și datorită pigmentului galben-portocaliu al coloniilor, Rosenbach (1884) l-a denumit S. aureus.
S. aureus este ubicuitar, comensal. În funcție de tulpină, S. aureus poate supraviețui de la câteva ore, până la câteva săptămâni sau chiar luni pe suprafețe uscate (Cimolai, 2008). Se adaptează foarte ușor diferitelor condiții de mediu ca urmare a unui potențial înalt de variabilitate genetică, care explică importanța S. aureus ca agent infecțios pentru om și animale (Cole și colab., 2001; Fluit, 2012; Hasman și colab., 2010), fiind principala cauză de bacteriemie, de infecție a plăgilor chirurgicale, dar și de colonizare a materialelor protetice.
Se estimează că 20% din populația umană este purtătoare de S. aureus pe termen lung (Kluytmans și colab., 1997) în microbiota tegumentară și a mucoaselor, cu precădere în nazofaringele purtătorilor sănătoși (Buiuc și Neguț, 2008; Kluytmans și colab., 1997; Cole și colab., 2001). La om, epiteliul scuamos al foselor nazale este habitatul primar (Peacock și colab., 2001). Se estimează că 60% sunt purtători tranzitorii, iar alți 20% nu poartă acest microorganism (Foster, 2004). Omul și animalele reprezintă rezervorul natural de S. aureus. Există, de asemenea, o prevalență în creștere a purtătorilor gastrointestinali de S. aureus, în special la copii, probabil legat de schimbarea modului de hrănire, mai ales la sugari (Lindberg și colab., 2011).
S. aureus produce o gamă largă de factori de virulență prin care inițiază procesele infecțioase, de la cele superficiale (tegumentare) până la cele grave: sindromul pielii opărite, fasciita necrozantă, abcese, keratite, impetigo, pneumonie necrozantă, osteomielite, endocardite, sindromul de șoc toxic, septicemie, infecții asociate cu implantarea dispozitivelor medicale etc. (Kobayashi și DeLeo, 2009; Bose și colab., 2014; Harris și colab., 2002).
Tulpinile MRSA au fost recunoscute din anii ’60 până în ‘90 ca patogeni asociați practicii medicale. Tulpinile MRSA asociate comunității au apărut în anul 1990 (Gordon și Lowy, 2008). În acord cu sursa și căile de transmitere (fig. 1), tulpinile MRSA sunt împărțite în trei categorii:
tulpini MRSA din spital (HA-MRSA);
tulpini MRSA circulante în comunitate (CA-MRSA) (Grundmann și colab., 2010);
tulpini MRSA circulante la animale (LA-MRSA) (Smith, 2015).
Tulpinile MRSA au devenit o problemă importantă de sănătate publică cu numeroase consecințe economice globale (Goetghebeur și colab., 2007). În ultimii ani au atins un nivel epidemic (Ma și colab., 2012), atât în comunitate, cât și în mediul de spital, iar unele clone au devenit endemice, fiind răspândite în anumite zone geografice (Vandenesch și colab., 2003; Rolo și colab., 2012).
În prezent, cel puțin 37000 de oameni mor anual în Europa datorită infecțiilor produse de cinci tipuri de microorganisme rezistente la antibiotice, printre care: tulpinile MRSA, S. aureus rezistent la vancomicină (VRSA) sau S. aureus rezistent la linezolid (ECDC/EMEA,2009,http://ecdc.europa.eu/en/publications/surveillance_reports/Pages/index.aspx). Printre cele mai frecvente cauze de producere a infecțiilor asociate asistenței medicale, tulpinile de S. aureus ocupă locul doi. S. aureus care se multiplică în alimente de origine animală, produce enterotoxine care constituie cauza importantă de apariție a toxiinfecțiilor alimentare.
I.1. Caracteristici de cultivare și identificare
Genul Staphylococcus face parte din Familia Micrococcaceae și cuprinde peste 40 de specii, dintre care peste 20 izolate de la om, specia S. aureus fiind cea mai frecvent implicată în patologia infecțioasă. Recent au fost descoperite alte 2 specii, S. argenteus sp. nov. și S. schweitzeri sp. nov. (Tong și colab., 2015). Este un coc Gram pozitiv, cu diametru de 0,5 – 1,5 μm, aerob, facultativ anaerob. Pe frotiul colorat Gram apar de culoare violet, grupate sub formă de ciorchine, fig. 2.
S. aureus se dezvoltă în 18-24 h pe medii nutritive simple, în mediul aerob la temperatura optimă de 37 ± 2ș C, pH optim de 7,5, dar tolerează variații mari. Coloniile, după 24 h de incubare, pe mediu solid, au aspect S (smooth), cremoase, rotunde, cu diametrul de 2-3 mm, marginea regulată, suprafața netedă, bombată și lucioasă, fig. 3.
S. aureus tulbură omogen mediul lichid, cu depozit granular în partea inferioară a tubului. Pe agar Columbia cu 5-8% sânge defibrinat (de berbec sau de bou), tulpinile de S. aureus produc o zonă circulară de hemoliză completă β (beta), datorată sintezei hemolizinei α (alfa), fig. 4.
Coloniile de S. aureus produc un pigment carotenoid, portocaliu sau galben citrin, dar acest caracter nu este constant și ca atare nu constituie un criteriu stabil de diferențiere.
Identificarea fenotipică
Genurile familiei Micrococcaceae se diferențiază de genurile familiei Streptococcaceae pe baza următoarelor criterii: morfologia celulelor, morfologia coloniilor pe mediul solid, caractere metabolice, rezistența la antibiotice, testul catalazei, fig. 5.
În prezența eritromicinei se testează producerea de acid din glucoză în aerobioză, sensibilitatea la nitrofurantoin/ furazolidon (F) 100 μg/ disc (diametrul zonei de inhibiție, mai mare de 15 mm) pe mediul agar Mueller Hinton, testul modificat pentru oxidază, testul sensibilității la bacitracină, fig. 6.
S. aureus se diferențiază de celelalte specii de Staphylococcus, cu excepția speciei argenteus, prin caractere de creștere și prin prezența următorilor factori:
proteina A;
factorul clumping (antigenul capsular – coagulaza legată) evidențiat prin testul rapid de latex-aglutinare pe lamă, fig. 7, cu reactivi de identificare rapidă de generația I și a II-a, cu și fără anticorpi monoclonali (AMC) anticapsulari;
coagulaza liberă evidențiată cu testul plasmei de iepure, fig. 8,
(Buiuc și Negut, 2008).
Diferențierea S. aureus de S. argenteus se face prin tipizarea genei rpoB și PCR pentru gena crtM ce codifică stafiloxantina (Mellman și colab., 2006).
I.2. Factorii de virulență
Bacteriile patogene au două proprietăți definitorii: patogenitatea și virulența. Patogenitatea definește capacitatea potențială a unui microorganism de a iniția un proces infecțios, decelabil din punct de vedere clinic, numai dacă este suficient de virulent pentru a depăși barierele de apărare a organismului și a pătrunde în țesuturi. Virulența este capacitatea unei tulpini a unui microorganism patogen aflat într-o anumită fază de creștere, de a se localiza (a coloniza), de a se multiplica și eventual de a invada celulele și țesuturile gazdei și/sau de a produce toxine, determinând o stare patologică la o gazdă receptivă.
Patogenitatea este o caracteristică determinată genetic. Virulența este un atribut cantitativ al patogenității diferitelor tulpini bacteriene. S. aureus își exprimă patogenitatea atât prin caracterele structurale, cât și printr-o multitudine de proteine/ enzime pe care le produce. Genele codificatoare ale enzimelor degradative sunt localizate atât pe cromosomul bacterian, cât și pe elemente genetice mobile (profagi, plasmide, transpozoni, insule de patogenitate etc.). Diferitele combinații ale factorilor de virulență, interacțiunea cu factorii locali ai situsului de infecție și variabilitatea răspunsului imun al gazdei explică diversitatea rezultatelor cu privire la aceste infecții. Pentru inițierea unui proces infecțios stafilococic este necesară cooperarea mai multor factori de virulență (Fournier și Philpott, 2005). Fiind un comensal oportunist, infecția cu S. aureus poate să rămână subclinică, poate să fie o infecție locală moderată sau o infecție severă, invazivă (Lowy, 1998). Este recunoscut rolul enzimelor citolitice și al superantigenelor, în inițierea și progresul infecțiilor prin liza celulelor epiteliului tegumentar, al mucoaselor și al celulelor tisulare.
Factorii de virulență pot fi atât structurali, cât și solubili. Au fost identificați circa 50 de factori de virulență cu diferite activități biologice (Cheung și colab., 2002). Unii dintre aceștia sunt recepționați de sistemul imunitar ca superantigene. Sinteza lor poate fi asociată cu fazele de creștere, astfel că majoritatea proteinelor asociate peretelui celular sunt sintetizate în faza exponențial logaritmică, iar exo-enzimele sunt sintetizate în faza staționară. Enterotoxina A și coagulaza sunt sintetizate în faza de creștere exponențială (Nienaber și colab., 2011).
Proteine ale suprafeței celulare cu rol de adezine
Structurile suprafeței celulare la S. aureus sunt capsula polizaharidică, peptidoglicanul (reprezintă 50% din greutatea celulei) și membrana citoplasmatică.
Peptidoglicanul (mureina) este format din catene polizaharidice formate prin alternarea resturilor de N-acetilglucozamină și acid N-acetil muramic legate între ele prin legături β-1, 4. Aceste lanțuri sunt unite prin punți peptidice. Componenta peptidică este reprezentată de tetrapeptide cu structura L-Ala-D-Glu-L-Lys-D-Ala. Punțile peptidice ce aparțin lanțurilor de glican adiacente sunt legate printr-un pentapeptid (Gly-Gly-Gly-Gly-Gly). Peptidoglicanul poate avea activitate endotoxică, stimulează sinteza citokinelor de către macrofage, activează sistemul complement și induce agregarea plachetelor sangvine. Diferențele din structura peptidoglicanului la diverse tulpini de S. aureus pot contribui la variații ale capacității de a produce coagularea intravasculară diseminată (Kessler și colab., 1991).
În peptidoglican sunt încorporate proteine și polizaharide. Polizaharidele caracteristice lui S. aureus sunt acizii teichoici (lb. gr., teichos = perete), lipoteichoici (polimeri de glicerol-fosfat sau de ribitol-fosfat), cu un capăt al lanțului legat de un glicolipid din membrana plasmatică, iar celălalt expus la exterior. Rolul acizilor teichoici este multiplu: conferă peretelui celular rigiditate și virulență ridicată, sunt implicați în transportul ionilor, sunt receptori pentru bacteriofagi, au rol important în atașare și colonizare (Lowy, 1998).
Proteinele de suprafață din structura peptidoglicanului legate covalent sau prin legături ionice sau interacțiuni hidrofobe sunt foarte importante pentru potențialul patogen al S. aureus. Relevanța lor pentru procesul infecțios a fost demonstrată experimental, comparând tipul sălbatic cu tulpinile fără sortază A sau B. Sortazele sunt enzime (cistein- transpeptidaze) cu rolul de a ancora proteinele de suprafață de peretele celular (Mazmanian și colab., 1999). Absența acestor proteine provoacă o scădere dramatică a virulenței (Weiss și colab., 2004). Sortazele clivează legătura peptidică între treonină (T) și glicină (G), și ancorează covalent proteina la peptidoglican (Perry și colab., 2002).
Factorul clumping – Clf (coagulaza legată) este o proteină asociată peptidoglicanului, care leagă fibrinogenul, mediind atașarea bacteriei la țesuturile traumatizate și la coagulul sangvin. Factorul clumping este ancorat de peretele celular printr-o secvență Leu-Pro-X-Thr-Gly (LPXTG). Au fost descrise 2 variante moleculare: ClfA și ClfB, codificate de genele clfA și clfB. Gena clfA codifică un polipeptid de aproximativ 933 aminoacizi (aa), iar gena clfB un polipeptid de aproximativ 913 aa. ClfA se leagă de lanțul γ al fibrinogenului, iar ClfB de lanțul α. Varianta ClfB ar avea rol în aderența S. aureus la celulele epiteliului nazal.
Proteinele care leagă fibronectina (FnBPA și FnBPB) sunt codificate de 2 gene distincte fnbA și fnbB. Gena fnbA codifică o proteină de aproximativ 1018 aa, iar gena fnbB aproximativ 940 aa. Cele două proteine sunt ancorate de peptidoglican printr-o secvență LPXTG. Cele două proteine se leagă de glicoproteinele membranei plachetare (complexul IIa/IIIb), le activează, aderă la fibrinogen (numai FnBPA) și la elastină, facilitează invazia în celulele endoteliale și epiteliale, sunt repelente pentru fagocite.
Proteina de legare a colagenului (Cna) mediază atașarea de fibrele de colagen de tip I și IV, predominante cantitativ în țesuturile conjunctive (Campoccia și colab., 2009; Patti și colab., 1993).
Proteina A (Jensen, 1958) face parte din familia moleculelor care au afinitate de legare pentru moleculele matricei de aderență intercelulară a țesuturilor (Microbial Surface Components Recognizing Adhesive Matrix Molecules – MSCRAMMs). Proteina A prezintă secvența LPXTG, se leagă cu mare afinitate la regiunea Fc a IgG (subclasele 1, 2, 4) inhibând astfel acțiunea fagocitelor profesioniste, are rol în aderență și colonizare prin interacția cu factorul von Willebrand (Hartleib și colab., 2000).
Molecula de proteină A are 5 domenii extracelulare (E, D, A, B, C), regiunile Xr și Xc ce străbat peretele celular și un domeniu alcătuit din 18-20 reziduuri hidrofobe care traversează membrana plasmatică. Este codificată de gena spa (Harmsen și colab., 2003; Mellmann și colab., 2006). Au fost identificate 16148 variante ale genei spa încărcate în baza internațională de date Ridom SpaServer (http://spa.ridom.de/index.shtml) și este în plină expansiune. Principalele 20 variante (tipuri) genice spa ale tulpinilor MSSA, PVL pozitive, în Europa sunt: t318, t435, t645, t002, t008, t284, t127, t159, t021, t590, t314, t005, t078, t189, t044, t105, t012, t355, t019, t131, iar la tulpinile MRSA, PVL pozitive sunt: t044, t008, t019, t437, t002, t355, t024, t657, t131, t852, t318, t012, t595, t021, t311, t690, t692, t068, t121, t304 (http://www.seqnet.org/).
Rareori se izolează tulpini de S. aureus netipabile prin tipizarea spa, respectiv detectarea polimorfismului în regiunea X a proteinei stafilococice A (Baum și colab., 2009).
Proteinele de suprafață a căror expresie este reglată de prezența fierului (IsdA, IsdB, IsdC, IsdH) sunt legate covalent de peretele celular (prin secvența LPXTG). Se leagă de una sau mai multe proteine care conțin fier: transferina, hemoglobina (Clarke și Foster, 2006; Visai și colab., 2009; Pilpa și colab., 2009). Proteina IsdB interacționează cu complexul glicoproteinelor IIb/ IIIa al membranei plachetelor sangvine (Miajlovic și colab., 2010).
Proteinele SdrC și SdrD au rol în aderența S. aureus la celulele epiteliale nazale. Proteina SdrC a fost identificată ca legându-se de β-neurexină (Barbu și colab., 2010), iar proteina SdrD se leagă de glicoproteina desmoglein-1 (Askarian și colab., 2016). O variantă a SdrD, numită Bsp leagă sialoproteina din oase (Tung și colab., 2000).
Proteina G de suprafață a S. aureus (SasG) codificată de gena sasG este implicată în formarea biofilmului, se leagă de matricea extracelulară (Clarke și Foster, 2006; Geoghegan și colab., 2010) și a fost descrisă ca fiind implicată în atașarea la celulele epiteliului nazal.
Autolizina (Aaa) codificată de gena aaa, este localizată la suprafața celulei, are multiple funcții și aderă la fibrinogen, fibronectină, vitronectină (Heilmann și colab., 2005).
Proteina de legare a elastinei (EbpS), un polipeptid de 23 kDa, este codificată de gena ebpS, leagă elastina solubilă și tropoelastina. Este o proteină ancorată în membrana plasmatică, nu are secvență semnal și nici secvență LPXTG.
Adezina intercelulară polizaharidică (polysaccharide intercellular adhesion – PIA) codificată de operonul ica (genele icaABDC), are rol în agregarea celulelor bacteriene, în formarea biofilmului, în rezistența la antibiotice și în rezistența la efectorii imunitari (O’Gara, 2007).
Proteina de legare la heparină (IsaB), se leagă de ADN dublu catenar, monocatenar și de ARN (Mackey-Lawrence și colab., 2009).
Proteina C de suprafață a S. aureus (SasC) codificată de gena sasC este implicată în agregarea celulelor, în formarea biofilmului și se leagă de matricea extracelulară (Clarke și Foster, 2006; Chavakis și colab., 2007; Schroeder și colab., 2009).
SraP (serine-rich adhesin for platelets) sau SasA este o glicoproteină de suprafață bogată în serină, de mari dimensiuni, atașată covalent de peretele celular. Se leagă de glicoproteinele membranei plachetare și determină agregarea (Siboo și colab., 2005).
Proteina Emp (extracellular matrix binding protein, 38.5 kDa) codificată de gena emp interacționează cu fibrinogenul, fibrina, vitronectina și cu colagenul. Este o adezină cu rol în formarea biofilmului (Clarke și Foster, 2006; Johnson și colab., 2008).
Proteina Ebh (extracellular matrix-binding protein homologue) se leagă de fibronectina matricei extracelulare a celulelor tisulare (Clarke și colab., 2002).
Proteina Pls (plasmin sensitive surface protein, codificată de gena pls), reduce aderența la fibronectină, fibrinogen, laminină și IgG, reduce invazia în celulele gazdei, se leagă de lipidele celulelor gazdei și este implicată în aderența la celulele epiteliului nazal (Clarke și Foster, 2006).
Proteina Sbi (Second immunoglobulin-binding protein = S. aureus binding protein of IgG, codificată de gena sbi) are o secvență de 436 aa. Poate să formeze un complex cu fragmentul Fc al imunoglobulinelor G, prin două domenii distincte (Zhang și colab., 1998). Se leagă de factorul H al sistemului complement și în asociație cu proteinele C3, C3b sau C3d formează complexul tripartit Sbi:C3:Factor H (Haupt și colab., 2008; Smith și colab., 2012; Koch și colab., 2012). Factorul H este activ în acest complex inhibând activarea complementului. Proteina Sbi este extracelulară, dar și ancorată de peretele celular prin intermediul acidului lipoteichoic (Smith și colab., 2012).
Proteina de legare la factorul von Willebrand (FvW) leagă și activează protrombina, leagă fibrinogenul și factorul von Willebrand, are activitate asemănătoare coagulazei libere și permite stafilococilor capturați în rețeaua de fibrină să disemineze în leziuni tromboembolice și să reziste opsonofagocitozei (McAdow și colab., 2012).
Proteina de legare a sialoproteinelor din oase (bone sialoprotein binding protein – Bbp, codificată de gena bbp) o variantă a lui SdrE, se leagă de sialoproteină (Campoccia și colab., 2009) și fibrinogen (Vazquez și colab., 2011).
Proteina de aderență extracelulară (Eap – extracellular adherence protein) sau proteina analogă complexului major de histocompatibilitate II (Map – MHC analogous protein), codificată de gena eap, aparține familiei SERAM (Secreted Expanded Repertoir Adhesive Molecule). Este legată necovalent de peretele celular, fără secvența LPXTG. Mai mult de 98% dintre tulpini produc această proteină. Are rolul de a se atașa de un număr mare de liganzi având afinitate pentru cel puțin 7 proteine plasmatice, printre care fibrinogenul, fibronectina, protrombina, factorul Von Willebrand, vitronectina, sialoproteine din țesutul osos și trombospondina (Palma și colab., 1999). În procesul infecțios cu S. aureus, proteina Eap inhibă aderența neutrofilelor și extravazarea, cu diminuarea angiogenezei și întârzierea cicatrizării. Eap induce sinteza citokinelor pro-inflamatorii: interleukina-6 (IL-6) și factorul de necroză tumorală-α -TNF-α în macrofage (CD14+). Este implicată în aderența celulelor de S. aureus la celulele gazdei, în internalizarea lor în celulele tisulare și în formarea biofilmului (Palma și colab., 1999; Bjerketorp și colab., 2002; Harraghy și colab., 2003; Haggar și colab., 2003; Haggar și colab., 2004; Athanasopoulos și colab., 2006; Scriba și colab., 2008; Cheng și colab., 2009; Thompson și colab., 2010; Edwards și colab., 2012).
Proteina CHIPS (Chemotaxis Inhibitory Protein of Staphylococci) este secretată de aproximativ 62% dintre izolatele de S. aureus. Se leagă specific de receptorii pentru C5a și de peptide formilate ale membranei neutrofilelor, blocând astfel recrutarea neutrofilelor la locul infecției (DeLeo și colab., 2009; Postma și colab., 2004; Rooijakkers și colab., 2005).
Proteina SCIN (Staphylococcal Complement Inhibitor) este cel mai eficient inhibitor al sistemului complement, blocând toate cele 3 căi: clasică, alternativă și lectinică. Blochează producerea de C5a (Rooijakkers și colab., 2005).
Enzime, alte proteine biologic active și toxine
Toate proteinele grupului sunt factori de virulență care permit S. aureus să evite acțiunea efectorilor sistemului imunitar înnăscut
Factori care lizează neutrofilele
Alfa toxina (alfa-hemolizina), codificată de gena hla, se leagă pe membrana plachetelor sangvine și a monocitelor, ceea ce conduce la eliberarea citokinelor pro-inflamatorii și la declanșarea cascadei coagulării. Toxina formează pori în membrană și perturbă astfel echilibrul ionic. Are rol important în formarea biofilmelor pe dispozitivele protetice (Caiazza și O’Toole, 2003).
Beta-toxina (beta-hemolizina) este produsă de 10-20% dintre izolatele de S. aureus umane și de majoritatea izolatelor de origine animală. Gena hlb codifică o proteină de aproximativ 330 aa cu funcție de sfingomielinază dependentă de ioni de magneziu, numită sfingomielinaza C, în funcție de conținutul în sfingomielină al membranelor celulelor țintă. Este cunoscută sub denumirea de toxina ”cald-rece’’.
Gamma toxina (gamma hemolizina) este produsă de 99% dintre tulpinile de S. aureus. Locusul hlg exprimă 3 proteine codificate de trei gene hlgA, hlgB, hlgC, litice pentru polimorfonucleare prin mecanismul formării porilor membranari (Chavakis, 2007; Peacock și colab., 2002; Prevost și colab., 1995).
Delta toxina (delta hemolizina), un peptid de 26 aa codificat de gena hld, este sintetizată de aproximativ 97% dintre tulpini. Este rezistentă la temperaturi ridicate. Lizează eritrocitele prin formarea porilor, se leagă de neutrofile și monocite (Chavakis, 2007; Peacock și colab., 2002; Verdon și colab., 2009).
Leucocidina Panton-Valentine (PVL) este o proteină/ toxină formatoare de pori produsă de anumite tulpini de S. aureus. A fost descrisă de Van de Velde (1894) și a fost asociată cu infecții ale tegumentului și ale altor țesuturi (Panton și colab., 1932). PVL este formată din 2 unități: componenta S și componenta F, transcrise separat. Este litică pentru leucocite, iar tandemul celor două subunități LukS-PV/ LukF-PV este sintetizat de tulpinile de S. aureus care produc infecții necrozante pulmonare și cutanate, infecții profunde și mai rar de cele care produc bacteriemii (Cribier și colab., 1992; Lina și colab., 1999; Limbago și colab., 2009; Loffler și colab., 2010; Kreienbuehl și colab., 2011). Genele codificatoare ale toxinei PVL sunt localizate în genomul unui fag lizogenic ce se poate transfera de la o tulpină la alta. Fagul lizogenizează atât tulpini MSSA, cât și MRSA din comunitate, ocazional din unități medicale (Guidance on the diagnosis and management of PVL-associated Staphylococcus aureus infections (PVL-SA) în England. Report prepared by the PVL sub-group of the Steering Group on Healthcare Associated Infection; David și Daum, 2010). Creșterea morbidității și mortalității asociate cu tulpini MRSA, PVL pozitive, reprezintă o problemă de sănătate publică la nivel mondial. PVL reprezintă un marker epidemiologic la tulpini de S. aureus comunitare. În Statele Unite ale Americii au fost descrise 2 clone MRSA asociate cu focare comunitare de infecții tegumentare și ale țesuturilor moi: USA400 (MW2, ST1) și USA300, frecvent pozitive pentru genele PVL (Maree și colab., 2007; Diep și colab., 2006; Diep și colab., 2008; Tenover și Goering, 2009).
Leucocidinele D, E și M (LukD, E, M codificate de genele lukD, lukE, lukM) sunt leucotoxine formatoare de pori, alcătuite din două subunități (Chavakis și colab., 2007; DuMont și colab., 2011). Leucocidina LukED are rol important în infecțiile sângelui (Powers și Wardenburg, 2014). Leucotoxinele ED, MF-PV, leucocidinele A și B (nume alternative H și G/ lukAB/ lukHG) lizează polimorfonuclearele prin formarea porilor membranari (DuMont și colab., 2011; Gravet și colab., 1998; Herron-Olson și colab., 2007; Choorit și colab., 1995; Ventura și colab., 2010).
Peptidele denumite generic modulina solubilă în fenol (PSM = phenol-soluble modulin) sunt toxine formatoare de pori sau cu activitate de detergent (Perret și colab., 2012; Tsompanidou și colab., 2013).
Factori ce conferă rezistență la antioxidanți
Pigmentul carotenoid (stafiloxantina) codificat de gena crtOPQMN dă culoarea caracteristică coloniilor de S. aureus, oferă protecție față de radicalii reactivi ai oxigenului și permite supraviețuirea bacteriei în interiorul fagocitelor (Chavakis și colab., 2007; Song și colab., 2009; Pelz și colab., 2005; Liu, 2005).
Catalaza (KatA) codificată de gena katA transformă peroxidul de hidrogen (H2O2) în apă (H2O) și oxigen (O2). Testul catalazei diferențiază genul Staphylococcus de Streptococcus și Enterococcus (Buiuc și Neguț, 2008). Este un factor de virulență esențial pentru supraviețuirea, persistența și colonizarea nazală (Cosgrove și colab., 2007).
Alchil hidroperoxid reductaza (AhpC) codificată de gena ahpC, inactivează peroxidul de hidrogen și are rol important în colonizarea nazală (Cosgrove și colab., 2007).
Thioredoxin și thioredoxin reductaza inactivează, de asemenea, radicalii reactivi ai oxigenului (ROS) (Chavakis și colab., 2007).
Factori antifagocitari și inactivatori ai complementului
La S. aureus, capsula (CPS) este foarte fină (microcapsulă), vizibilă numai la microscopul electronic și este produsă de aproximativ 90% din izolatele clinice. Este alcătuită din acizi hexozoaminouronici. Au fost descrise 11 tipuri serologice ale polizaharidului capsular. Tipurile 5 și 8 sunt cele mai frecvente, la aproximativ 75% dintre tulpinile izolate de la om.
Tipul 336, implicat în aproximativ 20% din infecții, nu are o capsulă propriu-zisă, deoarece sintetizează numai polizaharidul 336 (O’Riordan și Lee, 2004).
Tipul 5 include majoritatea tulpinilor MRSA (Lowy, 1998; Lee, 1996). Virulența capsulei constă în efectul repelent față de neutrofile, dar și în mascarea adezinelor de suprafață, favorizând astfel colonizarea și persistența bacteriilor pe suprafața mucoaselor (O’Riordan și Lee, 2004). Capsula este codificată de genele cap.
Proteina extracelulară de legare a complementului (Ecb), codificată de gena ecb, blochează proteinele complement C3 și C5, blochează chemotaxia și activarea complementului (Sharp și colab., 2012; Hammel și colab., 2007a, 2007b).
Proteina Efb (extracellular fibrinogen binding protein, codificată de gena efb) este o proteină bifuncțională, ce leagă specific fibrinogenul și proteina complementului C3, blochează activarea plachetelor sangvine (Koch și colab., 2012; Peacock și colab., 2002; Sharp și colab., 2012).
Coagulaza liberă (Coa) codificată de gena coa se leagă și activează protrombina, care clivează fibrinogenul solubil și-l convertește în fibrină insolubilă. Rețeaua de fibrină maschează antigenele celulei bacteriene, prevenind astfel recunoașterea ei (McAdow și colab., 2012; Peacock și colab., 2002).
Stafilokinaza (Sak), codificată de gena sak, activează plasminogenul, care se transformă în plasmină. Plasmina are activitate fibrinolitică, degradând fibrina din coagulul sangvin, favorizând dizolvarea coagulului și diseminarea S. aureus în țesuturi sau în sânge (Bokarewa și colab., 2006). Stafilokinaza degradează IgG și componentele sistemului complement C3b și C3bi, inhibând fagocitoza. Leagă defensinele și le neutralizează funcția protectoare (Bokarewa și colab., 2006; Rooijakkers și colab., 2005).
Adenozin-sintaza A (AdsA) codificată de gena adsA, este o proteină prin care S. aureus evită acțiunea fagocitelor (Thammavongsa și colab., 2009) prin scăderea atributelor citotoxice și a producției de chemokine în neutrofile.
Inhibitori ai activității peptidelor antimicrobiene
S. aureus devine rezistent la lizozim prin O-acetilarea peptidoglicanului sub acțiunea O-acetiltransferazei (OatA) (Chavakis și colab., 2007; Bera și colab., 2005).
Numeroase proteaze bacteriene degradează proteinele celulei și eliberează nutrienții: serin proteaza A, endoproteaza V8 (SspA) codificată de gena sspA, promovează invazia celulelor prin degradarea proteinelor de legare a fibronectinei, determină activarea lui SspB și clivarea, dar nu inactivează catelicidina LL-37 (Nickerson și colab., 2007; Sieprawska-Lupa și colab., 2004).
Proteinele asemănătoare serin-proteazelor (SplA-F) codificate de genele splA-F sunt serin-proteaze de tipul tripsinei, cu specificitate de substrat, secretate ca zimogen (Popowicz și colab., 2006).
Alte proteine biologic active
Hialuronidaza (HysA) codificată de gena hysA hidrolizează acidul hialuronic, un component major al matricei extracelulare a țesuturilor și ușurează invazia bacteriei în țesuturi. Hialuronidaza la S. aureus este un factor de virulență (Ibberson și colab., 2014).
Staphopaina A (ScpA) codificată de gena scpA și staphopaina B (SspB) codificată de gena sspB (Ohbayashi și colab., 2011; Shaw și colab., 2004; Imamura și colab., 2005) sunt cistein-proteaze care hidrolizează colagenul și fibrinogenul.
Staphostatina B (SspC) codificată de gena sspC este un inhibitor a lui SspB (Rzychon și colab., 2003; Nickerson și colab., 2010).
Staphostatina A (ScpB) codificată de gena scpB este un inhibitor a lui ScpA, conferind protecție în timpul secreției (Rzychon și colab., 2003; Nickerson și colab., 2010).
Lipazele (lip), codificate de gena lip (geh, beh), hidrolizează lipidele sebacee, cu eliberarea acizilor grași pe suprafața cutanată. Sunt importante pentru colonizare și persistență (Kraus și Peschel, 2008).
Lipazele (Fatty acid-modifying enzyme – FAME) hidrolizează acizii grași (Chamberlain și Imanoel, 1996).
Enolaza (proteina de legare la laminină) (Chavakis și colab., 2007).
Dezoxiribonucleazele (DN-azele) degradează ADN. S. aureus produce o DN-ază termostabilă (termonucleaza) codificată de gena nuc (Brakstad și colab., 1992; Mann și colab., 2009; Berends și colab., 2010). Rar se întâlnesc tulpini cu un nou tip de nuclează termostabilă omologă (NucM) (Schaumburg și colab., 2014) sau tulpini defective de gena nuc (van Leeuwen și colab., 2008).
Autolizina majoră stafilococică (Atl) codificată de gena atl are rol esențial ca proteină de legare a fibronectinei ce mediază fenotipul cu biofilm al S. aureus. Un nou mecanism de internalizare stafilococică implică autolizina majoră Atl și proteina înrudită de șoc toxic Hsc70 ca receptor al celulei gazdă (Houston și colab., 2011; Pasztor și colab., 2010; Hirschhausen și colab., 2010).
Un sistem secretor conservat tip VII, numit Ess, implicat în virulență a fost descris la S. aureus (EsaA, EsaB, EsaC, EsaD, EssA, EssB, EssC, EssD, EsxA, EsxB) (Kneuper și colab., 2014), iar proteinele stafilococice EsxA și B mediază eliberarea celulelor de S. aureus internalizate în celulele gazdei (Korea și colab., 2014).
Proteina Bap (biofilm associated protein), 2276 aa, codificată de gena bap este asociată peretelui celular, are rol în aderența intercelulară și este implicată în formarea biofilmului (Cucarella și colab., 2001).
Proteina Sok, codificată de gena sok, asociată peretelui celular, favorizează supraviețuirea bacteriei în fagocite (Malachowa și colab., 2011).
Toxine
Enterotoxinele stafilococice (SEs) sunt superantigene pirogenice (pyrogenic toxin superantigens – PTSAgs) înrudite structural, cu proprietăți toxice specifice, pirogenice, superantigenice și sensibilitate la șocul endotoxic. Calitatea de superantigen a toxinelor constă în capacitatea de a stimula nespecific proliferarea limfocitelor T prin legarea la o regiune specifică variabilă a lanțului β a receptorului T celular (RCT). Consecutiv legării are loc eliberarea masivă a citokinelor pro-inflamatorii, caracteristice pentru un răspuns de tip Th1: TNF-α, IL-6 și IFN-γ, mediatoare ale patofiziologiei sindromului de șoc toxic stafilococic (STSS). Toxinele sintetizate de S. aureus sunt, în primul rând, enterotoxine: au activitate proteazică, sunt difuzibile și au tropism bine exprimat față de mucoasa intestinală, fiind cauza frecventă a intoxicațiilor alimentare. Se cunosc cel puțin 24 tipuri serologice de enterotoxine (A-V) (Bergdoll și colab., 1967; Blaiotta și colab., 2004). Genele sea-sev sunt localizate pe cromosomul bacterian și pe insule de patogenitate egc (enterotoxin gene cluster) sau pe elemente genetice mobile: fagi, transpozoni, plasmide. Enterotoxinele stafilococice sunt globuline cu gr. mol. mică (26900-29600 Da). Exprimarea activității enterotoxice este strict corelată cu o punte disulfidică. Sunt solubile în apă și în soluții cloruro-sodice. Au calitate de superantigene, se leagă de moleculele complexului major de histocompatibilitate clasa II (CMH II) și de catena β a RCT (receptorul de Ag al limfocitelor T), induc stimularea policlonală a limfocitelor T și manifestările de sindrom de șoc toxic. Sunt produse de 50% dintre tulpinile de S. aureus, care cresc pe produse alimentare bogate în glucide și proteine (White și colab., 1989; Balaban și Rasooly, 2000; Dinges și colab., 2000). Enterotoxinele stafilococice SEA – SEE, SEG – SEI, SER – SET codificate de genele sea-e, seg-i, ser-set au demonstrat activitate emetică/ toxicitate gastroenterică și induc imunomodularea prin activitatea de superantigen (Peacock și colab., 2002; Blaiotta și colab., 2004). Proteinele stafilococice like (SEl) nu au activitate emetică în modelul animal (SElL și SelQ) și sunt codificate de genele selL, selQ sau urmează să fie testate (SElJ, SElK, SElM – SElP, SElU, SElU2 și SelV) și sunt codificate de genele selJ, selK, selM – selP, selU, selU2 și selV (Argudin și colab., 2010).
Toxina sindromului de șoc toxic (TSST-1) este un superantigen produs de aproximativ 5-25% dintre tulpinile de S. aureus, cu o gr. mol. de 22 kDa (Dinges și colab., 2000). Toxina activează un număr mare de limfocite T helper (Th), se leagă direct de moleculele complexului major de histocompatibilitate II (CMH II), fără a mai necesita internalizarea și prelucrarea, determinând activarea limfocitelor și eliberarea consecutivă a unor cantități mari de interleukină-2 (IL-2) și interleukină-1 (IL-1) din macrofage. În general, toxina nu este produsă de tulpinile implicate în septicemii, ci este produsă la locul infecției trecând apoi în sânge. TSST-1 este sintetizată de tulpinile de S. aureus din vaginul femeilor aflate în perioada menstruală (100%) și non-menstruală (50%) (Bergdoll și colab., 1981; McCormick și colab., 2012).
Toxinele exfoliative A, B, C și D (ETA, ETB, ETC, ETD) codificate de genele eta, etb, etc, etd sunt serin proteaze ce lizează specific domeniile extracelulare 3+4 ale glicoproteinei desmoglein-1 (DG-1) (codificată la om de gena DSG1) (în special ETB), ducând la formarea unor vezicule tegumentare, fiind exotoxine cu activitate de superantigen (Peacock și colab., 2002; Ladhani, 2003; Kato și colab., 2011).
I.3 Interacțiunea agentului infecțios cu organismul gazdă
Infecțiozitatea definește capacitatea unui microorganism de a depăși mijloacele de apărare ale organismului gazdă, de a coloniza țesuturile gazdei, adică de a stabili o localizare și de a forma un focar primar de infecție.
S. aureus poate cauza două tipuri majore de manifestări patologice:
– de natură toxică (intoxicații/ toxinoze);
– de natură invazivă (infecții).
Patogeneza intoxicațiilor stafilococice (toxinozelor) este directă și implică 4 etape:
Colonizarea cu o tulpină toxigenă sau ingerarea produselor alimentare contaminate cu toxină stafilococică preformată (enterotoxine stafilococice cu activitate emetică).
Secreția de toxine.
Absorbția toxinei în organismul gazdă.
Intoxicația.
Toxiinfecțiile alimentare survin ca urmare a ingerării produselor alimentare contaminate cu tulpini de S. aureus producătoare de enterotoxine și cu enterotoxine preformate (Washington și colab., 2006; Codiță, 1985). Enterotoxinele produse de anumite tulpini de S. aureus sunt super antigene, adică stimulează mai mult de 10% dintre clonele de celule T ale unei gazde umane. Ca urmare, răspunsul imun este mult amplificat și caracterizat prin eliberarea masivă de citokine, interleukine, TNF și IFN-γ. Enterotoxinele stafilococice stimulează în mod direct sistemul nervos vegetativ, asociate cu manifestări patologice ale tractului gastrointestinal (crampe abdominale, stare de rău general, vomă, urmate uneori de diaree).
Sindromul pielii opărite este determinat de toxine exfoliative (Bukowski și colab., 2010), ce duc la necroliza celulelor epiteliale.
În majoritatea cazurilor de sindrom de șoc toxic, tulpinile eliberează toxina în focarul infecției, apoi trece în fluxul sangvin (Bergdoll și colab., 1981). Sindromul de șoc toxic este indus de TSST, dar și de enterotoxina stafilococică. Cel mai frecvent, sindromul de șoc toxic stafilococic se manifestă la femei de vârstă fertilă, în perioada menstruală. Leziunile tegumentare precum arsurile chimice, termice, leziunile produse prin înțepătura de insecte, cele provocate de varicelă sau plăgile chirurgicale se pot complica, conducând la manifestarea acestui sindrom. Sindromul se asociază frecvent cu infecții musculo-scheletice, cu infecții respiratorii produse de S. aureus sau chiar cu bacteriemie stafilococică.
Patogeneza infecțiilor cutanate stafilococice este mult mai complexă și implică prezența unor etape mai discrete. Declanșarea unei astfel de infecții presupune următoarele etape:
Colonizarea epiteliilor, mucoaselor și endoteliilor
Invazia țesuturilor prin depășirea barierei epiteliale
Distrugerea țesuturilor invadate
I.3.1. Colonizarea epiteliilor, mucoaselor și endoteliilor
S. aureus aderă la țesuturile epiteliale și endoteliale ale organismului gazdă prin numeroase proteine de suprafață. Majoritatea fac parte din subfamilia de adezine MSCRAMMs (Microbial Surface Components Recognising Adhesive Matrix Molecules).
La gazda umană, habitatul primar pentru S. aureus este reprezentat de epiteliul foselor nazale anterioare (Peacock și colab., 2001). În acest proces sunt implicate cinci proteine de suprafață ale bacteriei: ClfB, IsdA, SdrC, SdrD și SasG. ClfB leagă citokeratina-10 de tip I și citokeratina-8, tot prin intermediul regiunii A, având un rol important în colonizarea nazală (O’Brien și colab., 2002; Walsh și colab., 2004; Haim și colab., 2010; Ganesh și colab., 2011). Persoanele colonizate la nivelul foselor nazale au un risc ridicat de a se infecta cu același tip de tulpină, așa cum persoanele cu deficit al funcției imunitare, se colonizează frecvent cu S. aureus (Vu și colab., 2015).
Pielea reprezintă o barieră fizică și imunologică importantă alcătuită din epiderm cu cele 4 straturi (cornos, granulos, spinos și bazal) și dermul cu cele 2 straturi (dermul papilar și reticular).
Stratul cornos situat la exterior este alcătuit din keratinocite diferențiate terminal legate între ele prin fibrile de keratină (Nestle și colab., 2009). Straturile granulos, spinos și bazal se leagă de stratul cornos și împreună formează epidermul. Keratinocitele, sub presiunea celulelor care rezultă prin diviziunea celor din stratul bazal, ajung în stratul cornos de unde sunt îndepărtate. Stratul cornos asigură bariera fizică a pielii și este alcătuit din keratinocite moarte ce nu conțin organite celulare (Nestle și colab., 2009). Procesul de reînnoire are loc în mod constant, epidermul având o rată înaltă a diviziunii celulelor. Sub epiderm se află straturile dermului: dermul papilar și reticular. Dermul este format din fibre de colagen și elastină, dar și din structurile ce străbat aceste straturi: foliculul pilos, glande sudoripare și sebacee (Krishna și Miller, 2012), fig. 9.
Pielea este colonizată cu microorganisme care fac parte din microbiota normală, cu specii diferite dependente de locație și de alți factori (temperatură, pH, umiditate, sebum, săruri și acizi grași). Microbiota normală cuprinde diferite specii de stafilococi, propionibacterii, corinebacterii și fungi. Anumite microorganisme ce colonizează tegumentul, în particular S. aureus și streptococii β-hemolitici de grup A, dar și bacteriile Gram negative, virusurile și fungii au potențialul de a produce infecții, mai ales atunci când bariera epitelială a fost distrusă (Moran și colab., 2013).
Stafilococii nu colonizează tegumentele intacte și nici mucoasele gazdei umane. Colonizarea gazdei umane depinde de gradul de virulență al tulpinii bacteriene, de factorii de apărare ai gazdei, dar și de competiția microbiotei. Astfel, aproximativ 20-30% din populația umană este colonizată permanent cu S. aureus (van Belkum și colab., 2009), 60% este colonizată intermitent (Kluytmans și colab., 1997) și 20% nu este colonizată cu acest microorganism (Foster, 2004). Gazda umană reprezintă rezervorul natural de S. aureus.
Purtătorii permanenți, cronici sunt cei cu leziuni acute sau cronice și cei expuși în mod repetat la infecții stafilococice. Colonizarea are frecvență mare la personalul de îngrijire medicală, la cei dializați, la diabetici, la cei care-și injectează droguri, cei cu disfuncții ale neutrofilelor (de aderență sau de metabolism oxidativ) (Washington și colab., 2006; Laupland și colab., 2008).
S. aureus poate determina infecții de la forme ușoare până la cele care periclitează viața: infecții tegumentare, ale țesuturilor moi, infecții musculo-scheletice, infecții ale tractului respirator (pneumonie), infecții ale sistemului nervos central, ale tractului urinar, infecții endovasculare, endocardită, sepsis etc. (Kobayashi și DeLeo, 2009; Bose și colab., 2014; Harris și colab., 2002). Infecțiile superficiale pot progresa în profunzime prin continuitate, pe cale limfatică sau sangvină, cu evoluție septicemică. De obicei se descriu infecțiile grave fără a menționa infecția superficială inițială.
Epiteliul mucoasei nazofaringelui, epiteliul axilei, vaginului, perineului sau al tractului gastrointestinal, dar și tegumentul lezat sau anexele tegumentului (glande sebacee, sudoripare sau foliculul pilos) sunt porți de intrare a S. aureus în organismul uman.
Implanturile sunt ușor colonizate cu stafilococi, făcând infecțiile dificil de controlat, din cauza heterogenității populaționale ca urmare a hipermutabilității. Variantele cu colonii mici (Small Colony Variants – SCVs) rezultă prin mutațiile unor gene implicate în metabolism, nu au virulență foarte înaltă, dar persistă pentru că invadează celulele tisulare (Melter și Radojevič, 2010; Proctor și colab., 2014; Johns și colab., 2015).
Colonizarea epiteliilor
Infecțiile cutanate sunt cauzate de invazia microbiană în straturile epiteliului pielii și în derm după distrugerea mecanică a barierei epiteliale. Infecțiile se pot iniția la nivelul foliculului pilos, fără o leziune aparentă a barierei epiteliale: foliculita sau furuncul. Infecția dermului și hipodermului determină celulita (Ki și Rotstein, 2008), iar a țesutului muscular, fasciita.
Infecțiile tegumentului și ale țesuturilor moi sunt cele mai comune, la toate grupele de vârstă. Majoritatea infecțiilor cutanate cu S. aureus sunt auto-limitante.
Diferitele etape ale unei infecții stafilococice cutanate necesită seturi diferite de factori de virulență.
Astfel, în etapa inițială, proteinele de suprafață ale bacteriei, ce leagă moleculele matricei extracelulare favorizează colonizarea țesuturilor gazdei, iar sinteza exoproteinelor bacteriene favorizează invazia țesuturilor adiacente.
Prima etapă a colonizării unui țesut este aderența celulelor bacteriene la celulele sensibile ale gazdei și reprezintă o etapă crucială având un caracter de specificitate, în sensul că epiteliile situate în diferite localizări anatomice leagă specii bacteriene diferite.
Aderența bacteriană este, de regulă, funcția adezinelor bacteriene, care se leagă de receptorii glicoproteici sau glicolipidici complementari de pe suprafața celulelor epiteliale. Aderența asigură colonizarea anumitor situsuri din organism urmată de multiplicarea bacteriilor.
Bacteriile aderă în special la epiteliile mucoaselor, dar și la epiteliile cheratinizate (keratinocite), la endotelii, la țesutul osos, la smalțul dentar etc.
Aderența la celulele gazdei este directă (prin intermediul adezinelor specifice) sau indirectă (prin intermediul glicocalixului sau al moleculelor matricei extracelulare, în special fibronectina). Adezinele bacteriene conferă specificitate tisulară, deși există agenți infecțioși ce pot coloniza diferite țesuturi, în funcție de poarta de intrare în organismul gazdă producând diferite tipuri de infecții. Structurile bacteriene de aderență, anatomice sau moleculare sunt de cele mai multe ori adaptative. Ele dispar prin cultivarea succesivă in vitro. Tulpinile bacteriene de laborator sunt mai puțin aderente la suport, comparativ cu tulpinile bacteriene izolate recent. Aderența este condiționată de complementaritatea sarcinilor electrice ale celor două suprafețe. Cele mai multe bacterii au o sarcină netă negativă a suprafeței lor, dar au și zone limitate electropozitive, precum și molecule cu caracter hidrofob.
Au fost detectate numeroase proteine de suprafață ale S. aureus implicate în aderență. S. aureus aderă la colagen, fibrinogen, fibronectină, laminină, trombospondină, elastină, vitronectină, sialoproteină prin intermediul adezinelor: factorul clumping, proteina de legare a fibronectinei, proteina de legare a colagenului și proteina A (McCarthy și Lindsay, 2010).
Colagenul este cea mai abundentă glicoproteină care conferă rezistență și asigură integritatea structurală a țesuturilor. S-au identificat 29 tipuri de colagen (Gordon și Hahn, 2010).
Fibronectina este o glicoproteină dimerică. Se găsește sub formă fibrilară în matricea extracelulară și sub formă solubilă în fluide. Are un rol important în aderența celulară, cât și în procesul de cicatrizare a țesuturilor lezate. Majoritatea tulpinilor de S. aureus prezintă la suprafață proteine de legare a fibrinogenului și fibronectinei.
De cele mai multe ori, S. aureus codifică mai multe adezine pentru același ligand. Unele adezine sunt sintetizate de majoritatea tulpinilor de S. aureus, indiferent de situsul de izolare, iar prezența altora se corelează strict cu situsul infecției.
Invazia țesuturilor
S. aureus eliberează un set de proteine-enzime cu acțiune litică asupra celulelor gazdei, alterând mediul intern:
– coagulaza leagă protrombina și transformă fibrinogenul în fibrină, favorizând instalarea patogenului în țesuturi, astfel protejându-l de sistemul imunitar;
– lipazele îi asigură supraviețuirea în glandele sebacee: acționează asupra acizilor grași;
– hialuronidaza hidrolizează acidul hialuronic, ușurând astfel diseminarea în matricea extracelulară. Alte enzime extracelulare, cu diverse roluri în patogeneza infecțiilor stafilococice sunt stafilokinaza, termonucleaza, proteaza serică etc.;
– sintetizează numeroase toxine cu acțiune asupra membranelor: hemolizine (alfa, beta și gamma), formatoare de pori în membrana celulelor sensibile: polimorfonucleare (PMN), monocite și macrofage.
Focarul infecțios
După depășirea barierei epiteliale, S. aureus aderă la matricea extracelulară, prin intermediul proteinelor de suprafață.
După câteva zile de la declanșarea procesului inflamator acut al organismului gazdă la infecția stafilococică, se formează un abces (Bae și colab., 2009). Inflamația se caracterizează prin creșterea temperaturii la nivelul situsului primar al infecției, edem, durere, eritem local, acumularea puroiului și necroza țesuturilor adiacente în infecțiile severe tegumentare și ale țesuturilor moi. Zonele de necroză se datorează mai ales acțiunii toxice a leucocidinelor stafilococice, în special a leucocidinei Panton-Valentine. Abcesul reprezintă o colecție purulentă formată din neutrofile vii și lizate, resturi de țesut, bacterii vii și lizate, delimitate de o capsulă fibroasă de colagen (Kobayashi și colab., 2015) sintetizat de fibroblaste. Abcesele se pot forma în epiderm, în derm și în țesuturi subcutanate (Kobayashi și colab., 2015). Celulele bacteriene sunt astfel protejate de acțiunea leucocitelor. Formarea abcesului este un mecanism de apărare al organismului, dar provoacă patologii semnificative ce pot duce la obstrucții vasculare. Capsula fibroasă se poate rupe, eliberând bacterii care se diseminează în țesutul adiacent, amplificând procesul inflamator.
Cele mai importante componente ale S. aureus implicate în răspunsul inflamator sunt peptidoglicanul, acizii teichoici, acizii lipoteichoici (LTA), alfa-toxina, o hemolizină extracelulară ce formează pori în membrana eritrocitelor și monocitelor.
alfa-toxina poate induce sinteza interleukina-1β (IL-1β), IL-6, interleukina-8 (IL-8) și recrutarea neutrofilelor (Onogawa, 2002; Yarovinsky și colab., 2008);
beta-hemolizina este o sfingomielinază ce lizează eritrocitele de oaie, dar nu și pe cele umane, fiind produsă de tulpinile izolate de la animale;
peptidele formilate – formil-metionil peptide, chemoatractante pentru neutrofile și macrofage;
peptidoglicanul activează sistemul complement;
polizaharidul capsular și proteina A inhibă opsonizarea celulelor bacteriene, conferindu-le protecție față de fagocite;
catalaza stafilococică asigură supraviețuirea S. aureus în mediul intracelular, prin conversia peroxidului de hidrogen în O2 și H2O.
Pentru a supraviețui în mediul intracelular, S. aureus poate utiliza și alte mecanisme de eludare a proceselor de apărare: generarea unor variante care, in vitro generează colonii mici (celule cu creștere lentă) și intracelular supraviețuiesc o perioadă mai lungă de timp. Astfel se explică reapariția anumitor tulpini de S. aureus după ani de latență, de exemplu în osteomielita cronică produsă de infecția cu S. aureus (Melter și Radojevič, 2010).
Răspunsul imun înnăscut și dobândit
Proteinele asociate peretelui celular și cele secretate pot acționa ca factori de virulență, ce poartă numele generic de "tabloul molecular asociat patogenului" sau PAMPs (Pathogen Associated Molecular Patterns).
Tegumentul este protejat de celule care mediază răspunsul imun înnăscut și dobândit (adaptativ):
în epiderm, celule dendritice specializate Langerhans (Nestle și colab., 2009);
în derm, celule dendritice, macrofage, mastocite, limfocite B și T, celule NK (Nestle și colab., 2009; Moran și colab., 2013; Ki și Rotstein, 2008; Moran și colab., 2006; Bae și colab., 2009; Kobayashi și colab., 2015; Men și colab., 2002; Kupper și Fuhlbrigge, 2004).
Sistemul imunitar înnăscut are rolul de a recunoaște un număr mare de patogeni, care expun un tablou bine conservat al antigenelor bacteriene (Aderem și Ulevitch, 2000; Janeway, 1992): peptidoglicanul, acizii lipoteichoici, acizii teichoici și forma alanilată a acestora (Fournier și Philpott, 2005).
Peptidoglicanul este cel mai conservat component al peretelui celular și stimulează sinteza citokinelor pro-inflamatorii și a chemokinelor (TNF-α, IL-1β, IL-6, IL-8) în monocite și macrofage (Heumann și colab., 1994; Mattsson și colab., 1993).
Antigenele PAMPs sunt recunoscute de receptorii familiei Toll-like (TLR) – structuri ce aparțin claselor denumite Pattern Recognition Receptors (PRRs) funcționând ca receptor semnal transmembranar, sau de receptorii NOD-like (nucleotide-binding oligomerization domain-like). Au fost identificați 10 receptori omologi ai familiei TLR (TLR2 + TLR1; TLR2 + TLR6; TLR2 + ?; TLR3; TLR4; TLR5; TLR7; TLR8; TLR9; TLR10) și alți 3 receptori (TLR11, TLR12, TLR13), ultimii doi nu au fost descriși la om (Takeda și Akira, 2005; Mahla, 2013).
Prima linie de apărare a organismului în infecția cu S. aureus o reprezintă astfel mediatorii sistemului imunitar înnăscut (neutrofile, monocite, macrofage, celule epiteliale, endoteliale și plachete sangvine), producerea și secreția unei game largi de citokine și chemokine, activarea celulelor inflamatorii și inițierea răspunsului imun adaptativ, dobândit. După recunoașterea PAMPs, PRRs declanșează mecanismele de apărare antiinfecțioasă prin recrutarea leucocitelor PMN care fagocitează patogenii.
Keratinocitele sunt foarte importante în răspunsul imun cutanat producând mari cantități de interleukină-1α (IL-1α), TNFα și peptide antimicrobiene: α-defensinele ca răspuns la diferiți stimuli, inclusiv la prezența bacteriilor (Kupper și Fuhlbrigge, 2004). Keratinocitele produc, de asemenea, un număr mare de chemokine și alte citokine imuno-regulatoare ca răspuns la stimulare. Keratinocitele recunosc prezența S. aureus folosind receptorii PRRs. TLR-2 de pe membrana keratinocitelor recunosc PAMPs – peptidoglicanul și lipopeptidele (Miller, 2008). Keratinocitele exprimă, de asemenea, receptorul IL-1 (IL-1R), care este activat de IL-1α și IL-1β (Miller și Cho, 2011).
Apărarea față de infecțiile cutanate cu S. aureus este mediată de limfocitele T CD4+. Celulele Th1 produc IFN-γ și stimulează răspunsul imun mediat celular. Celulele Th2 produc interleukina-4 (IL-4), interleukina-13 (IL-13) și stimulează răspunsul imun mediat umoral. Celulele Th17 produc pe lângă interleukina-17 (IL-17: IL-17A și IL-17F) și interleukina-21 (IL-21), interleukina-22 (IL-22), interleukina-26 (IL-26), ce stimulează recrutarea neutrofilelor în focarul infecțios (Krishna și Miller, 2012; Lacey și colab., 2016).
Acizii lipoteichoici stimulează secreția citokinelor și a chemokinelor: TNF-α, IL-1β, IL-8, interleukina-10 (IL-10), interleukina-12 (IL-12), leucotriena B4, proteina C5a, MCP-1 (monocite chemotactic protein-1), MIP-1α (macrophage inflamatory protein-1α) și CSF-G (factorul stimulator al creșterii coloniilor granulocitare) din monocite și macrofage, declanșând astfel un răspuns inflamator.
Calea de semnalizare Nod recunoaște patogenii intracelulari. S. aureus se poate internaliza și expune peptidoglicanul receptorilor Nod. Sinteza citokinelor printr-un mecanism independent de TLR este reglată de proteinele Nod1 și Nod2 (nucleotide-binding oligomerization domain proteins). Nod2 este exprimată de monocite și macrofage și recunoaște peptidoglicanul bacteriilor Gram pozitive (Ogura și colab., 2001). Peptidoglicanul intact ajuns în spațiul intracelular, vine în contact cu lizozimul degradându-l, iar produșii digestiei lizozomale vor activa proteinele Nod. Natura liganzilor rămâne încă necunoscută (Janaki și Coggeshall, 2011).
Stimularea răspunsului imun adaptativ
La câteva zile după contactul cu agentul patogen, răspunsul imun adaptativ, mediat de limfocitele B (răspuns umoral) și de limfocitele T (răspuns celular) devine protector. Anticorpii sunt specifici față de componentele antigenice ale S. aureus: anticorpi anti-toxine (α-toxina, β și γ-hemolizinele, leucocidina Panton-Valentine și enterotoxine), anti-factori de virulență (aureolizina, IsdA și superantigene), anti-proteine ale peretelui celular (ClfA/ B și proteina de legare a fibronectinei), anti-polizaharidul capsular, anti-acid lipoteichoic și anti-peptidoglican.
Anticorpii neutralizează toxinele, opsonizează celulele bacteriene, facilitând astfel fagocitoza, via receptorii pentru porțiunea Fc a anticorpilor – IgG1 și IgG3. IgA este un factor opsonizant esențial (Gorter și colab., 1987).
Evitarea răspunsului imun
Pentru a rezista în organism și a produce o infecție, S. aureus trebuie să contracareze răspunsul imun al gazdei prin sinteza a numeroase proteine imuno-modulatoare, care inhibă acțiunea efectorilor imunitari:
inhibiția funcției fagocitelor, blocarea cascadei sistemului complement, evitarea efectului moleculelor antimicrobiene produse de celulele gazdei, evitarea atacului intermediarilor reactivi ai O2 (Foster, 2005; Kraus și Peschel, 2008).
Unii factori de virulență contracarează efectorii sistemului imunitar pe mai multe căi, așa cum există mai mulți factori de virulență care țintesc același component sau aceeași activitate a sistemului imunitar (DeLeo și colab., 2009; Fedtke și colab., 2004; Rooijakkers și colab., 2005).
I.4. Determinismul genetic și mecanismele biochimice de rezistență la antibiotice
I.4.1. Antibioticele beta-lactamice și mecanismele de acțiune
Antibioticele β-lactamice conțin în molecula lor un inel tetraatomic, în care un atom de N și o grupare carbonil formează o legătură amidică. Prezența nucleului β-lactamic conferă proprietăți fizico-chimice și biologice specifice. Inelul tiazolidinic este cel de-al II-lea nucleu al structurii chimice. Penicilinele sunt derivați ai acidului 6-aminopenicilanic.
Familia antibioticelor β-lactamice cuprinde numeroase variante moleculare, clasificate în 4 grupe:
Peniciline
Cefalosporine
Carbapeneme
Monobactami.
După modul de sinteză se împart în:
peniciline de biosinteză: penicilina G, V, N;
peniciline de semi sinteză: meticilina, oxacilina, ampicilina, amoxicilina;
peniciline de sinteză chimică: peneme, carbapeneme.
Mecanisme de acțiune
Antibioticele β-lactamice inhibă ultima etapă a sintezei peptidoglicanilor (formarea punților interpeptidice). Ținta antibioticelor sunt enzimele PBP (engl. Penicillin Binding Protein) (tabelul 1), care catalizează reacțiile de legare încrucișată între polimerii peptidoglicanului și au funcții fiziologice de transpeptidaze, endopeptidaze și carboxipeptidaze. Antibioticele β-lactamice se fixează de proteinele-enzime (PBP) cu rol în sinteza peptidoglicanului. Rezultă astfel un peptidoglican fragil la liza osmotică.
Tabelul 1. PBP la S. aureus
Rezistența enzimatică a S. aureus mediată de β-lactamaze
Până în 1950, 40% din totalul izolatelor de S. aureus au devenit rezistente la penicilină G, iar până în 1960, numărul acestora a crescut la mai mult de 80%, atât în mediul spitalicesc, cât și mediul comunitar. În prezent, majoritatea tulpinilor (98%) izolate din mediul spitalicesc și/ sau comunitar sunt rezistente la penicilină G prin producerea de penicilinază. Kirby (1944) a demonstrat că penicilina a fost inactivată de tulpinile de S. aureus rezistente la penicilină. Bondi și Dietz (1945) au identificat rolul specific al penicilinazelor. Penicilinazele sunt exoenzime secretate de stafilococ în mediul extracelular (Zygmunt și colab., 1992), în cantități mari. Gena pentru penicilinază aparține unui transpozon, localizat pe o plasmidă mare, ce poartă și alte gene de rezistență la antibiotice (aminozide, macrolide) (Lowy, 2003), la antiseptice sau la metale grele. Se poate integra și în cromosom.
Penicilinaza este un polipeptid de 257 aa (MM: 28 kDa) care scindează inelul β-lactamic al moleculei de penicilină G, făcând ineficient antibioticul.
La tulpinile hiper-producătoare de penicilinază, oxacilina are o activitate diminuată, astfel că tulpina poate să fie încadrată ca rezistentă. Aceste tulpini se numesc ''borderline'' (BORSA – Borderline Oxacillin Resistant Staphylococcus aureus). Mecanismul enzimatic conferă rezistență la toate antibioticele β-lactamice, făcând imposibilă utilizarea lor în clinică pentru tratamentul infecțiilor cu MRSA.
β-lactamazele s-au clasificat în funcție de substratul pe care-l hidrolizează:
– penicilinaze – acționează asupra penicilinelor;
– cefalosporinaze – hidrolizează cefalosporinele.
În funcție de sensibilitatea la inhibitori, penicilinazele de la stafilococ sunt sensibile la inhibitori: acid clavulanic, tazobactam, sulbactam (Drugeon, 2006).
În funcție de modul de producere, penicilinazele sunt constitutive sau inductibile. În raport cu localizarea genelor codificatoare sunt cromosomale sau plasmidiale.
Al II-lea mecanism de rezistență constă în sinteza unei noi variante de PBP (PBP2a).
Determinismul genetic al rezistenței la β-lactamice
Rezistența la meticilină prin sinteza unei noi variante a proteinei de legare a penicilinei (PBP), PBP2a sau PBP2’, a apărut la puțin timp după introducerea meticilinei în terapia antiinfecțioasă, prima penicilină semisintetică, inițial activă față de tulpinile de S. aureus producătoare de penicilinază. PBP2a nu are nici-o asemănare cu PBP de la S. aureus. Este foarte apropiată structural de PBP de la S. sciuri. Meticilina, la fel ca diversele β-lactamice, inhibă situsul transpeptidazic al PBP2 conservând activitatea sa transglicozilazică. PBP2a are activitate transpeptidazică, ce-i conferă rezistență la β-lactamice. În prezența unui antibiotic β-lactamic, activitatea transpeptidazică și transglicozilazică a proteinei PBP2a asigură sinteza unui peptidoglican funcțional, protector față de liza osmotică (Pinho și colab., 2001). Proteina PBP2a este codificată de gena mecA, componentă a operonului mec, localizată pe cromosom, prin inserarea unui element genetic mobil – caseta cromosomală stafilococică mec (SCCmec) (Oliveira și colab., 2006; Milheirico și colab., 2007; Shanshuang și colab., 2011). Expresia sa este esențială pentru fenotipul de rezistență la meticilină.
Recent, omologi ai genei mecA au fost identificați în genomul de stafilococi și în unele specii bacteriene înrudite (tabelul 2). Până în prezent, au fost descrise patru grupuri de omologi mecA în funcție de gradul lor de omologie cu cea mai timpurie genă mecA identificată.
Tabelul 2. Lista omologilor genei mecA (după Ito și colab., 2012)
a Tulpinile prototip reprezentative pentru fiecare genă mec: S. aureus N315 pentru mecA, S. sciuri K11 pentru mecA1, S. vitulinus CSBO8 pentru mecA2, M. caseolyticus JCSC5402 pentru mecB și S. aureus LGA251 pentru mecC.
Casetele SCCmec – substratul genetic al rezistenței la meticilină
Complexul genei mec este localizat pe un element genetic mobil ce se poate integra în cromosom la nivelul unui situs unic situat în apropierea originii replicării și a genei de rezistență la novobiocină, ce se comportă ca o insulă de rezistență la β-lactamice sub denumirea de SCCmec (Staphylococcal Cassette Chromosome mec). Gena mec se asociază unui complex de două gene ce codifică recombinaze din familia integrazelor-rezolvazelor denumite ccrA și ccrB (Hiramatsu și colab., 2001; Ito și colab., 2004), ce permit integrarea și excizia complexului mec-ccr.
Până în prezent au fost descrise 11 tipuri și mai multe subtipuri de casetă cromosomală mec (International Working Group on the Staphylococcal Cassette Chromosome elements – IWG-SCC) prezentate în tabelul 3, iar cele mai frecvente complexe ale genei ccr și ale genei mec sunt prezentate în tabelele 4 și 5.
Tabelul 3. Cele 11 tipuri de casetă SCCmec ale tulpinilor de S. aureus
*O genă ccr sau genele ccr din complexul genei sunt indicate în paranteze.
Tabelul 4. Cele mai frecvente complexe ale genei ccr
**Genele ccrA4B4 găsite în tipul SCCmec VIII au fost aproape identice cu cele din elementul SCC-CI de la S. epidermidis și a arătat identități de nucleotide cu cele găsite în tipul SCCmec VI de 89.6% și respectiv 94.5%.
Tabelul 5. Cele mai frecvente complexe ale genei mec
Detectarea rezistenței la meticilină se poate face prin:
– metoda disc difuzimetrică, cu discul de cefoxitin/ moxalactam/ oxacilină;
– metode automate (Vitek2, Phoenix, Microscan etc);
– metode imunologice cu anticorpi monoclonali anti PBP2a fixați pe particule din latex;
– metode moleculare (PCR, Real-Time PCR). Metoda reacției PCR este de referință ("gold standard") pentru detectarea rezistenței la meticilină prin amplificarea genei mecA.
Metoda reacției de amplificare în lanț (PCR) de tip multiplex determină tipul SCCmec util în studiile de epidemiologie ale S. aureus rezistent la meticilină.
Rezistența la aminoglicozide
Aminoglicozidele sunt molecule cationice cu gr. mol. mică, hidrosolubile, foarte stabile, de spectru larg și cu activitate bactericidă rapidă. Ele diferă atât prin nucleul molecular (streptidina sau 2-deoxistreptamina = 2-DOS), cât și prin aminohexozele legate de nucleu (Vakulenko și colab., 2003). Grupările NH2 și OH libere, prin intermediul cărora aminoglicozidele se leagă de proteinele ribosomale sunt esențiale pentru activitatea anti microbiană. Pătrunderea unui aminozid în celula bacteriană Gram pozitivă se face în 3 etape:
a) trecerea prin peptidoglican este pasivă, rapidă și nespecifică;
b) EDPI (Energy dependent phase) permite translocarea prin membrana citoplasmatică. Acumularea lentă în citoplasmă depinde de concentrația extracelulară de antibiotic;
c) EDPII permite fixarea progresivă a aminoglicozidelor la proteinele ribosomale. Această etapă se caracterizează prin accelerarea transferului și o saturare a situsurilor ribosomale.
Gentamicina (CN), tobramicina (TOB), amikacina (AK) și streptomicina sunt folosite în mod curent pentru tratamentul infecțiilor cu bacterii Gram pozitive și negative.
Spectrul de activitate al diferitelor antibiotice aminoglicozidice este diferit. Cele noi (CN, TOB, AK) au un spectru mai larg decât cele din generația veche [streptomicină, kanamicină (K)].
Deși manifestă nefrotoxicitate/ ototoxicitate, iar apariția tulpinilor rezistente este relativ frecventă, aminoglicozidele rămân, în continuare, foarte importante pentru tratamentul unor infecții în situații speciale.
Particularități ale acțiunii anti microbiene ale aminoglicozidelor:
a) activitatea bactericidă este dependentă de concentrație;
b) manifestă efectul post antibiotic;
c) au o farmaco-cinetică relativ predictibilă;
d) manifestă efectul sinergic cu antibioticele antiparietale.
Aminoglicozidele se leagă de subunitatea 30S a ribosomului bacterian în zona înalt conservată a ARNr, la situsul în care se formează legătura specifică între codonul ARNm și anticodonul aminoacil-ARNt și inhibă sinteza proteinelor. Subunitatea 30S are rol esențial în traducerea cu mare fidelitate a mesajului genetic. Aminoglicozidele induc erori de citire a ARNm și astfel se sintetizează proteine nefuncționale sau sinteza proteinelor este stopată.
Tulpinile de S. aureus rezistente la aminoglicozide apar frecvent, prin următoarele mecanisme:
1. diminuarea ratei înglobării antibioticului;
2. modificarea țintei ribosomale;
3. efluxul antibioticului;
4. modificarea enzimatică a aminoglicozidelor.
Mecanismul major de rezistență este modificarea enzimatică a aminoglicozidelor, prin adăugarea unor grupări chimice la grupele amino sau hidroxil. S-au identificat peste 50 enzime catalizatoare, clasificate în 3 familii:
1. aminoglicozid-acetil-transferaze (AAC): acetilarea grupărilor amino (NH2);
2. aminoglicozid-adenilil-transferaze (ANT): adaugă AMP la gruparea OH la pozițiile 2', 3', 4' și respectiv 9;
3. aminoglicozid-fosfotransferaze (APH): adaugă grupări de fosfați la aminoglicozide.
Fiecare dintre cele 3 familii de enzime este împărțită în clase, în funcție de situsul pe care îl modifică.
Fiecare clasă conține numeroase izoenzime, grupate în subclase.
AAC cuprinde 4 clase de enzime, care acetilează grupări amino situate în pozițiile 3, 2', 6', fiind notate AAC(3), AAC(2'), AAC(6') (Dessen, 2001; Schito, 2006).
ANT cuprinde 5 clase de enzime.
APH cuprinde 7 clase de enzime. Sunt kinaze ce utilizează ATP ca substrat secundar și fosforilează grupările specifice OH, la toate clasele de antibiotice aminoglicozidice.
Genele codificatoare ale enzimelor ce modifică structura chimică a aminoglicozidelor sunt localizate pe plasmide și transpozoni.
Mecanismele neenzimatice de rezistență la antibioticele aminoglicozidice sunt:
1. sistemele de eflux;
2. mutațiile ARNr.
Rezistența la gentamicină (CN) se datorează enzimei inactivatoare 2-fosfotransferaza-6-acetiltransferaza, ce conferă rezistență la CN, TOB, NET, AK și K. Rezistența la CN este un indicator al rezistenței bacteriene la alte aminoglicozide.
Mecanisme de acțiune și rezistență ale tulpinilor de S. aureus la macrolide, lincosamide, streptogramine B
Macrolidele, lincosamidele și streptograminele (MLS) sunt antibiotice cu o structură chimică diferită, dar situate în același grup (tabelul 6). Macrolidele și lincosamidele au proprietăți antibacteriene, cel mai frecvent bacteriostatice.
Tabelul 6. Macrolide, lincosamide și streptogramine
Mecanisme de acțiune
MLS inhibă sinteza proteinelor prin fixarea pe ribosomul bacterian. Structura secundară a ARN 23S formează 6 domenii (I – VI). Contactele complexe între ARNr și proteine asigură organizarea tridimensională a moleculei (structura terțiară). Stabilitatea ansamblului este favorizată de interacțiunile cu diferite proteine. Structura ribosomului este foarte conservată la toate speciile bacteriene.
Eritromicina se leagă de subunitatea 50S a ribosomului bacterian.
Macrolidele sunt bacteriostatice, iar streptograminele sunt bactericide pentru S. aureus.
Mecanisme de rezistență
Rezistența la MLS (tabelul 7) este dobândită prin 3 mecanisme (Leclercq, 2002):
prin mutația proteinelor ribosomale;
celulele bacteriene își modifică ARN ribosomal prin metilare, reacție catalizată de metilazele codificate de genele plasmidiale sau localizate pe transpozoni (Tn1545, Tn551, Tn554, Tn917). Metilarea ARN ribosomal (Chabbert, 1956) constă în metilarea adeninei în poziția 2058 a ARN ribosomal 23S. Metilarea A 2058, împiedică legarea antibioticelor MLS cu ținta lor. Adenina 2058, fiind un punct comun de fixare a macrolidelor, lincosamidelor și streptograminelor B, rezistența la aceste trei grupuri de antibiotice este încrucișată, cunoscută sub numele de fenotip de rezistență MLSB. Rezistența este codificată de genele erm (erythromycin ribosome methylase). La Staphylococcus genele erm [erm(A), erm(B), erm(C), erm(F), erm(Q), erm(Y), erm(33)] sunt plasate atât pe plasmide, cât și pe transpozoni. Expresia genelor erm poate fi inductibilă sau constitutivă;
mutații ribosomale – au fost detectate mutații ale adeninei în poziția 2058, 2059 sau 2062 ale ARN ribosomal 23S. Raritatea acestei rezistențe la stafilococ poate fi explicată prin prezența mai multor copii rrn (5 sau 6 la S. aureus). Mutațiile în proteinele ribosomale L4 și L22 sunt responsabile în egală măsură de rezistență;
modificarea enzimatică – multe enzime sunt capabile de inactivarea MLS. Eritromicina poate fi inactivată de diverse enzime ca de exemplu, esteraze (clasa genelor ere) sau de fosfotransferaze (clasa genelor mph). Aceste gene au fost raportate la stafilococ. Lincosamidele sunt inactivate de către nucleotidiltransferaze (clasa genelor lnu). Rezistența la streptogramine se explică frecvent prin asocierea genelor de clasa vat și vgb ce codifică pentru acetilazele streptograminelor A și liazelor factorilor B;
efluxul activ prin dobândirea genei, la bacteriile Gram pozitive, prin două clase de pompe din familia ABC (ATP-binding cassette) și MFS (Major Facilitator Superfamily). Un transportor ABC codificat de gena plasmidială msr(A) este raportat la stafilococ. Transportorii ABC utilizează ATP ca sursă de energie și sunt alcătuiți dintr-un canal cu două domenii asociate membranei citoplasmatice și două domenii de legare la ATP situate pe suprafața internă a membranei. Gena msr(A) codifică o proteină ce posedă cele două domenii de legare la ATP caracteristice transportorilor ABC. Componenta trans-membranară a pompei nu este cunoscută, dar este o proteină codificată de o genă cromosomală a stafilococului. Efluxul streptograminelor A pare a fi mediat de o proteină Vga din aceeași familie.
Tabelul 7. Principalele fenotipuri de rezistență la MLS
a Risc de selecție mutant rezistent;
b Activitate bactericidă redusă;
c Rezistență la lincomicină și sensibilitate la clindamicină (interpretează I);
d Posibilitate de rezistență la lincomicină și la clindamicină în cazul prezenței genelor vga(A) sau vga(Av).
Tetracicline – mecanisme de acțiune și rezistența tulpinilor de S. aureus
Tetraciclinele (tabelul 8) reprezintă un grup de antibiotice naturale cu activitate față de un spectru larg de bacterii patogene Gram pozitive/ negative, chlamidii, micoplasme, ricketsii și câteva protozoare. Sunt bine absorbite și active după administrare orală. Din aceste motive au cea mai largă utilizare în clinica umană și veterinară. Utilizarea masivă și necontrolată a tetraciclinei, atât în terapia umană, cât și în cea veterinară (ca promotor de creștere) a condus la selectarea și diseminarea clonelor bacteriene rezistente (Poyart, 2006).
Tabelul 8. Principalele tetracicline
Structura chimică de bază a tetraciclinelor (https://it.wikipedia.org/wiki/Tetracicline)
Mecanismul de acțiune a tetraciclinelor
Pătrunderea în celula bacteriană
Tetraciclinele pătrund în celula bacteriană Gram negativă prin difuzie pasivă și prin transport activ mediat de transportori membranari. Tetraciclinele nu difuzează liber în celula bacteriilor Gram pozitive.
Tetraciclinele sunt inhibitoare ale fazei de alungire a catenei polipeptidice în timpul traducerii mesajului, exercitând astfel un efect bacteriostatic. Tetraciclina se fixează la nivelul subunității ribosomale 30S și în particular, de proteinele S7 și de nucleotidele G693, A892, U1052, C1054, G1300 și G1338 ale ARNr 16S, blocând astfel atașarea aminoacil-ARNt la situsul A (acceptor) al ribosomului bacterian.
Pe baza modului de acțiune, tetraciclinele au fost împărțite în două categorii:
1. inhibitoare ale sintezei proteinelor;
2. cele care interacționează cu membrana citoplasmatică.
Mecanismele rezistenței la tetracicline
Rezistența la tetracicline este una dintre cele mai frecvente atât la bacterii Gram negative, cât și la cele Gram pozitive.
Au fost descrise 3 mecanisme determinate genetic:
1. rezistența datorată pompelor de eflux este cel mai comun mecanism de rezistență: pompele, dependente de energie elimină tetraciclina din celulă. Genele de rezistență codifică sinteza proteinelor membranare care funcționează ca transportori ai tetraciclinei. Genele tet ce codifică proteinele de eflux sunt asociate cu plasmide conjugative, ceea ce explică distribuția largă a rezistenței. La Staphylococcus genele de eflux sunt localizate, în general, pe plasmide mici. Prototipul este pT181 purtătoare a genei tet(K) (Khan și Novick, 1983). Au fost descrise și gene tet(L) (Schmitz și colab., 2001);
2. rezistența datorată protecției ribosomilor prin intermediul proteinelor solubile. La Staphylococcus au fost descrise genele tet(M), tet(O), tet(W). Cele mai studiate au fost tet(M) și tet(O), localizate, de cele mai multe ori, pe elemente genetice mobile. Gena tet(M) este localizată pe transpozoni conjugativi, pentru care prototipul este Tn916 și tet(O), pe plasmide conjugative. Proteina TetM a fost purificată (72 kDa). In vitro se asociază cu ribosomii, având un rol protector față de acțiunea tetraciclinei. Legarea tetraciclinei la ribosom nu modifică funcționalitatea ribosomului. Proteina TetM se asociază cu ribosomii, facându-i insensibili la acțiunea tetraciclinei;
3. inactivarea enzimatică a antibioticului este o degradare oxidativă și nu un mecanism de rezistență propriu-zis.
Rezistența dobândită prin mutații ale genelor cromosomale este rară. Mutațiile sunt localizate în genele codificatoare pentru ARNr 16S sau la nivelul genelor proteinelor de transport membranar.
Izolatele MRSA rezistente la tetraciclină și sensibile la minociclină – până la 50% din izolatele MRSA (Schmitz și colab., 2001), posedă gena tetK, iar izolatele rezistente la minociclină posedă gena tetM sau ambele gene, tetK și tetM (Trzcinski și colab., 2000).
Linezolid – mecanisme de acțiune și rezistență a tulpinilor de S. aureus
Linezolidul este un antibiotic sintetic [(S)-N-({3-[3-fluoro-4-(morpholin-4-yl) phenyl]-2-oxo-1,3-oxazolidin-5-yl}methyl)acetamide] (Brickner, 1996), desemnat ca primul membru din clasa de antibiotice numită oxazolidinone.
Linezolidul poate inhiba sinteza proteinelor bacteriene prin legarea de subunitatea 50S a ribosomului bacterian, prin intermediul interacțiunii cu domeniul V al 23S ARNr de la bacteriile Gram pozitive, prevenind astfel formarea inițierii complexului terțiar ribosom N-formil metionil-ARNt-ARNm-70S. Astfel este stopată dezvoltarea bacteriilor prin perturbarea sintezei proteinelor. Efectul este bacteriostatic, nu bactericid. Astfel, linezolidul este diferit față de alți inhibitori ai sintezei proteice ca și cloramfenicolul, macrolidele, lincosamidele și tetraciclinele.
Proprietățile sale farmaco-kinetice și farmaco-dinamice îl recomandă pentru terapia pneumoniei nosocomiale și comunitare, a infecțiilor tegumentare complicate și a infecțiilor țesuturilor moi (Grau și colab., 2007), a osteomielitei (Aneziokoro și colab., 2005), a septicemiei (Pistella și colab., 2004) etc.
Prima alertă cu S. aureus rezistent la meticilină și la linezolid a fost raportată în 2001 în America de Nord (Tsiodras și colab., 2001). Ulterior, au fost raportate și alte tulpini de stafilococi și enterococi rezistenți la linezolid (Potoski și colab., 2006; Cai și colab., 2012; Chen și colab., 2013; Gu și colab., 2013).
În Statele Unite ale Americii sensibilitatea la linezolid a izolatelor clinice Gram pozitive a fost monitorizată din anul 2004 prin programul Linezolid Experience and Accurate Determination of Resistance (LEADER). Rezultatele au arătat că rezistența a rămas stabilă și extrem de scăzută (Jones și colab., 2007; Jones și colab., 2008). O rețea de supraveghere asemănătoare – "Zyvox Annual Appraisal of Potency and Spectrum Study" sau ZAAPS a funcționat în centrele medicale din Europa (Jones și colab., 2009; Flamm și colab., 2013; Tian și colab., 2014).
Au fost descrise 3 mecanisme de rezistență la linezolid:
a) mutații variate la nivelul buclei centrale a uneia sau mai multor alele ale regiunii domeniului V al genei 23S ARNr (Hong și colab., 2007; Lincopan și colab., 2009; Bongiorno și colab., 2010; Sorlozano și colab., 2010; De Almeida și colab., 2013);
b) metilarea ARN, catalizată de două metil-transferaze. Metiltransferaza 23S ARNr este codificată de gena cfr (de rezistență la cloramfenicol-florfenicol) (Mendes și colab., 2008; Quiles-Melero și colab., 2013; Campanile și colab., 2013; Huang și colab., 2014), 23S rRNA metiltransferaza metilează adenina în poziția 2503 în 23S ARNr (E. coli 23S rRNA gene numbering).
Gena cfr conferă rezistență la 5 clase de agenți anti microbieni: fenicoli, lincosamide, oxazolidinone, pleuromutiline și streptogramine A (Kehrenberg și colab., 2005; Long și colab., 2006; Shore și colab., 2010; Toh și colab., 2007). Gena este localizată pe o plasmidă (Shen și colab., 2013; Cai și colab., 2015) sau pe cromosom (Toh și colab., 2007; Kehrenberg și colab., 2007) și este transferabilă interspecific.
Gena cfr a fost identificată la stafilococii coagulază-negativi izolați de la animale (Kehrenberg și Schwarz, 2006; Schwarz și colab., 2000), dar și la un număr limitat de tulpini umane de S. aureus și stafilococi coagulază negativi (Mendes și colab., 2008; Toh și colab., 2007; Mendes și colab., 2010; Morales și colab., 2010);
c) mutații sau deleții ale genelor care codifică proteinele L3 (De Almeida și colab., 2013), L4 și L22 (codificate de genele rplC, rplD și rplV) (Holzel și colab., 2010; Long și Vester, 2012; Shaw și Barbachyn, 2011).
Stafilococii coagulază-negativi reprezintă un rezervor neglijat al rezistenței mediată de cfr, frecvent raportată în America de Nord (U.S.A., Mexic), America de Sud (Brazilia), Europa (Grecia, Spania, Italia, Franța, Irlanda) și Asia (India) (Gu și colab., 2013; Potoski și colab., 2006; Mendes și colab., 2010; Mutnick și colab., 2003).
Au fost identificate mai multe tipuri de plasmide ce poartă gena cfr (Shen și colab., 2013; Cai și colab., 2015) transferabilă, fiind singurul mecanism de transmitere a rezistenței la linezolid.
În multe secții din spital și mai ales în unitățile de terapie intensivă, presiunea antibioticului, datorată utilizării adecvate sau neadecvate, precum și dificultatea detectării mecanismelor de rezistență prin metode fenotipice au condus la creșterea prevalenței tulpinilor rezistente în întreaga lume (Shorr și Lipman, 2007), ceea ce favorizează astfel dezvoltarea rezistenței multiple la microorganismele din genul Staphylococcus (Mackenzie și colab., 2007).
Capitolul II. Profiluri genice de virulență și rezistență la tulpini de Staphylococcus aureus izolate în România
Scopul și obiectivele lucrării
Scopul: Caracterizarea fenotipică și genotipică a tulpinilor de Staphylococcus aureus izolate din diferite probe biologice de la subiecți umani și de pe suprafețe neanimate.
Obiectivele:
Caracterizarea fenotipică a tulpinilor de S. aureus
Identificarea tulpinilor de S. aureus izolate din diferite probe biologice;
Testarea sensibilității la antibiotice conform standardului EUCAST;
Detectarea fenotipului de rezistență inductibilă la macrolide, lincosamide și streptogramine B;
Caracterizarea genotipică a tulpinilor de S. aureus
Evidențierea genelor codificatoare ale factorilor de virulență, inclusiv tipizarea spa prin metoda PCR și secvențiere;
Evidențierea genelor de rezistență la antibiotice prin metoda PCR și secvențiere;
Investigarea epidemiologiei moleculare a tulpinilor de S.aureus
Investigarea clonalității tulpinilor de S. aureus izolate din focare TIA și focare intraspitalicești prin metoda PFGE;
Investigarea tulpinilor de S. aureus prin metoda tipizării SCCmec.
Materiale și metode
Am analizat 228 tulpini de S. aureus și 1 tulpină de Staphylococcus hominis izolate din alimente, de la pacienți cu diferite infecții cutanate, de la purtători sănătoși, de la copii nou-născuți sau de câteva luni, de pe suprafețe contaminate, astfel:
22 tulpini, au fost izolate de la Unitatea Medicală A (UMA) din București;
69 tulpini, au fost trimise de Direcția de Sănătate Publică Prahova, fiind implicate în toxiinfecții alimentare (TIA);
6 tulpini, au fost trimise de Direcția de Sănătate Publică Iași, fiind implicate în TIA;
32 tulpini, izolate de la Unitatea Medicală B (UMB) din Vrancea;
28 tulpini, izolate de la Unitatea Medicală C (UMC) din Suceava;
42 tulpini, izolate de la Laboratorul de Analize Medicale din Institutul Cantacuzino = Unitatea Medicală D (UMD);
29 tulpini comunitare, izolate de la Unitatea Medicală E (UME) din București fiind izolate de la pacienții ce s-au prezentat la camera de gardă a unității medicale;
1 tulpină (423/ 22633) de S. hominis a fost izolată de la Unitatea Medicală F (UMF) din București.
Tulpinile au fost colectate în anii 2010 (UMA), 2011 (DSP Prahova și DSP Iași), 2012 (UMB), 2013/2014 (UMC), 2014 (UMD), 2015 (UME), 2013 (UMF).
Tulpinile de S. aureus din mediul de spital (de la UMA, UMB, UMC) au fost izolate din următoarele probe biologice: exsudat nazal (10), exsudat faringian (5), bont ombilical (14), secreție oculară (1), secreție pustulă (2), secreție plagă (1), lochia (1), tegument axilă (31), tegument (7), secreție purulentă (1), abces (3), masă radiantă sală nașteri (1), masă ginecologică sală nașteri (1), alte surse (3).
Tulpinile de la DSP Prahova și DSP Iași au fost izolate din exsudat nazal (16), exsudat faringian (5), alimente (37), lichid de vomă (1), materii fecale (16).
Tulpinile de S. aureus din comunitate (de la UMD și UME) au fost izolate din secreție purulentă din diferite infecții de piele și țesuturi moi: furunculoză, foliculită, hidrosadenită, acnee, abces, celulită, plagă deschisă, panarițiu, pustule.
Tulpina de la UMF a fost izolată din sânge.
Identificarea tulpinilor de S. aureus și S. hominis
Tulpinile au fost însămânțate pe agar Columbia (Oxoid) cu 7% sânge defibrinat de berbec. Identificarea s-a realizat prin metoda bacteriologică clasică: frotiu colorat Gram, testul catalazei și al oxidazei. Confirmarea speciei s-a realizat aplicând următoarele metode:
testul rapid de latex aglutinare [coagulaza legată – cu reactivul Slidex Staph Plus, Slidex Staph (BioMerieux, Franța) și Staphytect (Oxoid, Basingstoke, United Kingdom)];
testul coagulazei libere – cu plasma de iepure (BioMerieux, Franța; BioRad Laboratories);
metoda moleculară triplex PCR pentru amplificarea genei nuc, ce codifică termonucleaza (marker specific pentru S. aureus).
Tulpina de S. hominis a fost identificată cu sistemul automat de identificare Vitek2 (BioMerieux, Franța), folosind carduri de identificare GP.
Sensibilitatea tulpinilor de S. aureus și S. hominis la antibiotice
Sensibilitatea tulpinilor de S. aureus și S. hominis la antibiotice a fost determinată prin metoda disc difuzimetrică Kirby Bauer, pe agar Mueller Hinton.
Materiale:
agar Mueller Hinton Oxoid (Basingstoke, United Kingdom);
discuri impregnate cu antibiotice (Oxoid): benzylpenicilină (P, 1U), cefoxitin (FOX, 30 μg), eritromicină (E, 15 μg), clindamicină (DA, 2 μg), kanamicină (K, 30 μg), tobramicină (TOB, 10 μg), gentamicină (CN, 10 μg), norfloxacin (NOR, 10 µg), ciprofloxacin (CIP, 5 μg), tetraciclină (TE, 30 μg), rifampicină (RD, 5 μg), cloramfenicol (C, 30 μg), sulfamethoxazole-trimethoprim (SXT, 1.25/ 23.75 μg), quinupristin-dalfopristin (QD, 15 μg), linezolid (LZD, 10 μg), mupirocin (MUP, 200 μg), telithromicină (TEL, 15 μg) și acid fusidic (FD, 10 μg);
tampoane cu bumbac și tijă din lemn;
densimat;
tuburi 12/ 120;
ser fiziologic steril;
tulpina de referință S. aureus ATCC 29213 (tulpina de control).
Tehnica de lucru
Pentru realizarea antibiogramei s-a folosit o cultură de 18-24 h însămânțată pe medii de cultură neselective (agar Columbia cu 7% sânge defibrinat de berbec).
Din cultura de 18-24h s-a preparat o suspensie cu turbiditatea echivalentă standardului 0.5 McFarland. Suspensia a fost însămânțată pe plăcile cu agar Mueller Hinton și după o incubare de 18-24 h la temperatura de 35ș ± 2șC s-au măsurat diametrele zonei de inhibiție a creșterii corespunzătoare fiecărui antibiotic.
Metoda dublului disc (D-test) s-a aplicat prin plasarea discului de E la o distanță de 20 mm de DA pentru detectarea fenotipului de rezistență la macrolide, lincosamide, streptogramine B inductibil (MLSBi) (fig. 10).
Figura 10. Detectarea fenotipului de rezistență inductibilă la macrolide, lincosamide și streptogramine B (MLSBi) al tulpinilor de S. aureus izolate din UMA, UMB, UMC, UMD, UME.
Pentru anumite izolate discul de TEL s-a plasat la o distanță de 20 mm față de cel de E pentru observarea rezistenței induse la TEL.
Citirea și interpretarea rezultatelor
Se citesc diametrele zonelor de inhibiție a creșterii bacteriene din jurul discurilor și se interpretează după recomandările și criteriile de interpretare ale standardelor EUCAST (European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing) disponibile pe site-ul www.eucast.org pentru anul 2010, 2013, 2014, 2015, în funcție de valorile citite, cu:
Sensibil (S);
Intermediar (I);
Rezistent (R).
Cuantificarea Concentrației Minime Inhibitorii (CMI) prin metoda microdiluțiilor în mediu lichid Mueller Hinton și cu benzile E-test (AB Biodisk, Solna, Sweden).
Materiale:
bulion Mueller Hinton (BMH);
antibiotic pulbere: vancomicină (Sigma Aldrich);
tulpinile de testat cultivate pe agar Columbia (Oxoid) cu 7% sânge defibrinat de berbec;
tulpina de referință S. aureus ATCC 29213.
Tehnica de lucru
Antibioticul pulbere a fost diluat în apă distilată sterilă conform standardului utilizat pentru realizarea unei soluții stoc de concentrație 1029 µg/ ml.
Pentru testare, s-au realizat câte șase diluții alese în așa fel încât să cuprindă break-point-urile specificate în standardul EUCAST, corespunzătoare testării bacteriilor genului Staphylococcus.
S-a calculat volumul inițial de antibiotic (vi), astfel:
vi = (cf x vf)/ ci
vi = μl antibiotic din ci 1029 μg/ ml
ci = 1029 μg/ ml
cf = 32 μg/ ml
vf = 300 μl,
pentru obținerea celei mai mari concentrații de antibiotic dorită [concentrația finală (cf) – pentru primul godeu – într-un volum final de 300 µl – volum final (vf), din concentrația inițială (ci) din soluția stoc existentă, din care se vor face următoarele diluții binare].
Tabelul 9. Concentrațiile antibioticului vancomicină pentru testarea sensibilității tulpinilor de S. aureus
S-au obținut diluții binare cuprinse între 32 și 1 μg/ ml.
Din cultura crescută pe mediu se prepară o suspensie bacteriană în soluție salină fiziologică sterilă cu turbiditate echivalentă standardului 0.5 McFarland (1-3 x 108 UFC). Inoculul bacterian se diluează 1/ 100 (1 x 106). 10 μl din suspensia bacteriană 1/ 100 se vor adăuga în fiecare godeu.
Citirea și interpretarea rezultatelor
Se apreciază creșterea sau absența creșterii bacteriene prin vizualizarea godeurilor, comparativ cu martorii de creștere bacteriană (M+ al reacției), respectiv cu martorul de mediu (M-).
CMI: cea mai mică concentrație de antibiotic care inhibă complet creșterea microorganismului (creștere nedetectabilă cu ochiul liber).
CMB: cea mai mică concentrație de antibiotic care inhibă complet creșterea microorganismului – detectată prin însămânțare.
Tabelul 10. Criterii de interpretare a activității antimicrobiene a vancomicinei prin metoda microdiluțiilor in mediu lichid Mueller Hinton la S. aureus
Cuantificarea CMI la vancomicină și linezolid prin E-test la S. hominis
Banda E-test (AB Biodisk, Solna, Sweden) este un reactiv cu un gradient predefinit de antibiotic pentru cuantificarea valorilor CMI. Plăcile cu mediu agar Mueller Hinton au fost însămânțate cu o suspensie bacteriană cu turbiditate cunoscută echivalentă cu 0.5 McFarland. Se lasă la temperatura camerei pentru uscare timp de 10 – 15 minute. Apoi s-a aplicat banda E-test, după care s-a incubat timp de 18 – 24h.
Citirea și interpretarea rezultatelor
După incubare, creșterea bacteriană este vizibilă, iar de-a lungul benzii, centrată simetric apare o elipsă. Valoarea concentrației de antibiotic marcată pe bandă, deasupra punctului de intersectare a elipsei zonei de inhibiție cu banda E-test reprezintă valoarea CMI.
Tabelul 11. Criterii de interpretare a activității antimicrobiene a vancomicinei și linezolidului prin metoda E-test la stafilococii coagulază negativi
Rezistența la linezolid a fost definită ca CMI > 4 μg/ mL. Sensibilitatea la vancomicină a fost definită ca CMI ≤ 4 μg/ mL conform standardului EUCAST Clinical Breakpoint Table v. 3.1.
Extracția ADN
Extracția ADN s-a realizat utilizând kitul ''NucleoSpin Tissue'' (Macherey-Nagel, Germany) conform indicațiilor producătorului sau prin metoda lizei enzimatice și termice (cu lizostafin 1U/ µL, proteinază K 2 mg/ mL, 5 min./ 100°C).
Evidențierea genelor codificatoare ale factorilor de virulență prin metoda PCR și secvențiere
Tipizarea spa (spa-typing)
Gena pentru proteina A s-a evidențiat prin metoda simplex PCR, țintind gena spa. S-a utilizat protocolul de lucru SeqNet stabilit de cei de la Ridom SpaServer (http://www.ridom.de/doc/Ridom_spa_sequencing.pdf).
Secvențe forward și reverse ale genei spa analizate cu programul Ridom StaphType software v. 2.2.1 pentru izolatul din UMD.
Produșii de amplificare au fost migrați prin electroforeză în gel de agaroză 1,5%, 100V, timp de 48 minute, colorat cu bromură de etidium și vizualizat pe trans-iluminator cu UV. Ampliconii astfel obținuți au fost purificați utilizând kitul Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up System (Promega Corporation, Madison, WI, USA). Ampliconii purificați au fost introduși în reacția de secvențiere utilizând kitul BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing (Applied Biosystems), apoi purificați utilizând kit-ul DyeEx 2.0 Spin (Qiagen). Fracțiunea depusă a fost denaturată și supusă metodei Sanger de secvențiere cu echipamentul ABI PRISM 3130 Genetic Analyzer (Applied Biosystems). Analiza și încadrarea în tipuri spa a secvențelor astfel obținute s-a realizat utilizând softul Ridom StaphType software versiunea 2.2.1 (Ridom GmbH, Wurzburg, Germany).
Tabelul 12. Secvența primerilor pentru amplificarea și secvențierea genei spa
Gena pentru leucocidina Panton-Valentine (PVL) a fost pusă în evidență prin metoda reacției PCR în sistem triplex, după un protocol optimizat ''in house'' (Drăgulescu și colab., 2007), țintind genele lukS/F-PV. S-a utilizat termocycler-ul ''Corbett Research''. Amestecul de reacție s-a realizat în volum final de 25 μl și conține 5 x tamponul enzimei Taq DNA polimeraza Promega (Promega Corporation, Madison, WI, USA), 1,5 mM MgCl2, 0,2 mM dNTPs, primeri nucF și nucR (0,2 μM din fiecare), mecA1 și mecA2 (0,2 μM din fiecare), lukS/F1 și lukS/F2 (0,4 μM din fiecare) (tabelul 13), 1,5 U enzimă Taq DNA polimerază Promega, apă distilată sterilă liberă de DN-aze, RN-aze până la volum final de 25 μl.
Tabelul 13. Secvența primerilor pentru amplificarea genei lukS/ F – PV ce codifică leucocidina Panton-Valentine în reacția triplex PCR
Tabelul 14. Programul de amplificare pentru reacția triplex PCR nuc, lukS/ F – PV, mecA
Enterotoxine stafilococice (A, B, C, D, E)
Genele codificatoare au fost evidențiate prin metoda reacției simplex PCR pentru fiecare genă: seA, seB, seC, seD, seE. Amestecul fiecărei reacții s-a realizat în volum final de 25 μl și conține 5x tamponul enzimei Taq DNA polimerază Promega (Promega Corporation, Madison, WI, USA), 1,5 mM MgCl2, 0,2 mM dNTPs, primeri SEA1/ SEA2, respectiv SEB1/ SEB2; SEC1/ SEC2; SED1/ SED2; SEE1/ SEE2 (0,4 μM din fiecare) (tabelul 15), 1,25 U enzimă Taq DNA polimerază Promega, apă distilată sterilă liberă de DN-aze, RN-aze până la volum final de 25 μl.
Tabelul 15. Secvența primerilor pentru amplificarea genelor seA – seE, ce codifică enterotoxinele A-E în fiecare reacție simplex PCR
Tabelul 16. Programul de amplificare pentru reacțiile simplex PCR seA-seE
Gena pentru toxina sindromului de șoc toxic-1 (TSST1) a fost evidențiată prin metoda reacției simplex PCR pentru gena tst1. Amestecul reacției s-a realizat în volum final de 25 μl și conține 5x tamponul enzimei Taq DNA polimerază Promega (Promega Corporation, Madison, WI, USA), 1,5 mM MgCl2, 0,2 mM dNTPs, primeri TSST1 și TSST2 (0,4 μM din fiecare) (tabelul 17), 1,25 U enzimă Taq DNA polimerază Promega, apă distilată sterilă liberă de DN-aze, RN-aze până la volum final de 25 μl.
Tabelul 17. Secvența primerilor pentru amplificarea genei tst1 în reacția simplex PCR
Tabelul 18. Programul de amplificare pentru reacția simplex PCR tst1
Evidențierea genelor de rezistență la antibiotice prin metoda PCR
Gena blaZ
Rezistența la penicilină mediată prin producerea de penicilinază a fost pusă în evidență prin simplex PCR pentru gena blaZ. Amestecul reacției s-a realizat în volum final de 25 μl și conține 5x tamponul enzimei Taq DNA polimerază Promega (Promega Corporation, Madison, WI, USA), 1,5 mM MgCl2, 0,2 mM dNTPs, primeri blaZ1 și blaZ2 (0,4 μM din fiecare) (tabelul 19), 1,25 U enzimă Taq DNA polimerază Promega, apă distilată sterilă liberă de DN-aze, RN-aze până la volum final de 25 μl.
Tabelul 19. Secvența primerilor pentru amplificarea genei blaZ în reacția simplex PCR
Tabelul 20. Programul de amplificare pentru reacția simplex PCR blaZ
Evidențierea genei mecA prin amplificare genică reprezintă standardul detectării și confirmării rezistenței la meticilină (oxacilină, cefoxitin). Detectarea genei s-a realizat prin metoda reacției PCR în sistem triplex.
Evidențierea genei de acetilare (aacA) și de fosforilare (aphD)
Rezistența la gentamicină a fost evidențiată prin metoda reacției simplex PCR pentru genele aacA-aphD.
Amestecul reacției s-a realizat în volum final de 25 μl și conține 5x tamponul enzimei Taq DNA polimerază Promega (Promega Corporation, Madison, WI, USA), 1,5 mM MgCl2, 0,2 mM dNTPs, primeri aacA-aphD1 și aacA-aphD2 (0,4 μM din fiecare) (tabelul 21), 1,25 U enzimă Taq DNA polimerază Promega, apă distilată sterilă liberă de DN-aze, RN-aze până la volum final de 25 μl.
Tabelul 21. Secvența primerilor pentru amplificarea genelor aacA-aphD în reacția simplex PCR
Tabelul 22. Programul de amplificare pentru reacția simplex PCR aacA-aphD
Evidențierea genelor ermA, ermC
Genele ermA și ermC au fost puse în evidență prin metoda reacției simplex PCR. Amestecurile reacțiilor s-au realizat în volum final de 25 μl și conțin 5x tamponul enzimei Taq DNA polimerază Promega (Promega Corporation, Madison, WI, USA), 1,5 mM MgCl2, 0,2 mM dNTPs, primeri ermA1 și ermA2, respectiv ermC1 și ermC2 (0,4 μM din fiecare) (tabelul 23), 1,25 U enzimă Taq DNA polimerază Promega, apă distilată sterilă liberă de DN-aze, RN-aze până la volum final de 25 μl.
Tabelul 23. Secvențele primerilor pentru amplificarea genelor ermA și ermC în reacțiile simplex PCR
Tabelul 24. Programul de amplificare pentru reacțiile simplex PCR ermA și ermC
Genele tetK și tetM au fost evidențiate prin reacțiile simplex PCR. Amestecurile de reacție s-au realizat în volum final de 25 μl și conțin 5x tamponul enzimei Taq DNA polimerază Promega (Promega Corporation, Madison, WI, USA), 1,5 mM MgCl2, 0,2 mM dNTPs, primeri tetK1 și tetK2, respectiv tetM1 și tetM2 (0,4 μM din fiecare) (tabelul 25), 1,25 U enzimă Taq DNA polimerază Promega, apă distilată sterilă liberă de DN-aze, RN-aze până la volum final de 25 μl.
Tabelul 25. Secvența primerilor pentru amplificarea genelor tetK și tetM în reacțiile simplex PCR
Tabelul 26. Programul de amplificare pentru reacțiile simplex PCR tetK și tetM
Genele cfr și domeniul V 23S ARNr au fost evidențiate prin metoda reacțiilor simplex PCR. Amestecurile reacțiilor s-au realizat în volum final de 25 µl și conțin 5x tamponul enzimei Taq DNA polimerază Promega (Promega Corporation, Madison, WI, USA), 1,5 mM MgCl2, 0,2 mM dNTPs, primeri cfr-fw și cfr-rv, respectiv 23S ARNrF și 23S ARNrR (0,4 μM din fiecare) (tabelul 27), 1,25 U enzimă Taq DNA polimerază Promega, apă distilată sterilă liberă de DN-aze, RN-aze până la volum final de 25 μl.
Tabelul 27. Secvența primerilor pentru amplificarea si secvențierea genelor cfr și 23S ARNr în reacțiile simplex PCR si de secvențiere
Tabelul 28. Programul de amplificare pentru reacțiile simplex PCR cfr și 23S ARNr
Produșii de amplificare au fost migrați prin electroforeză în gel de agaroză 1,5%, 100V, timp de 48 minute, colorat cu bromură de etidium și vizualizat pe transiluminator cu UV.
Produșii de amplificare au fost purificați cu kit-ul Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up System (Promega Corporation, Madison, WI, USA). Ampliconii purificați au fost introduși în reacția de secvențiere utilizând kitul BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing (Applied Biosystems), apoi purificați cu ajutorul kit-ului DyeEx 2.0 Spin (Qiagen). Fracțiunea depusă a fost denaturată și apoi supusă metodei Sanger de secvențiere cu echipamentul ABI PRISM 3130 Genetic Analyzer (Applied Biosystems). Secvența rezultată a genei cfr a fost comparată cu secvența cfr din baza de date, iar gena 23S ARNr a domeniului V a fost secvențiată pentru identificarea eventualelor mutații implicate în rezistența la linezolid. Ampliconul secvenței ADN pentru gena 23S ARNr a domeniului V a fost aliniată cu secvența de nucleotide corespunzătoare unei tulpini de referință de S. aureus cu sensibilitate la linezolid (GenBank accession number X68425.1), folosind BioEdit Sequence Alignment Editor.
Pentru reacțiile de amplificare prezentate anterior s-au folosit ca martor pozitiv mai multe tulpini de referință sau din Colecția de Culturi Bacteriene a laboratorului Infecții Nosocomiale și Rezistența la Antibiotice: 33/ 2009 pentru genele nuc, lukS/F și mecA; IC13456 pentru gena eta; IC13455 pentru gena etb; IC13454 pentru gena tst1 (Colecția de Culturi Bacteriene); S. aureus National Collection of Type Cultures, U.K. (NCTC) 10652 pentru gena seA; S. aureus NCTC 10654 pentru gena seB; S. aureus NCTC 10655 pentru gena seC; S. aureus NCTC 10656 pentru gena seD; S. aureus Food Research Institute, U.S.A. (FRI) 326 pentru gena seE; 5681/ 2010 pentru genele blaZ, ermC, aacA-aphD, tetK; 39/ 2008 pentru genele ermA, tetM (Colecția de Culturi Bacteriene).
Electroforeza în gel de agaroză
Produșii de amplificare obținuți după fiecare reacție PCR au fost migrați prin electroforeză în gel de agaroză 1,5% sau 2%, 100V, timp de 48 minute, colorat cu bromură de etidium și vizualizat pe transiluminator cu UV. Documentarea gelului s-a realizat cu echipamentul cu UV Vilber Lourmat.
Tipizarea moleculară a tulpinilor de S. aureus prin electroforeză în câmp pulsator – pulse field gel electrophoresis (PFGE)
Metoda PFGE este considerată standardul de referință în epidemiologia tulpinilor de S. aureus.
Principiul metodei constă în înglobarea celulelor bacteriene într-un bloc de agaroză 2%, lizarea peretelui celular, eliberarea ADN cromosomal, digestia ADN cu o enzimă de restricție SmaI 10U/ μL (Promega Corporation, Madison, WI, USA) ce recunoaște situsul CCC^GGG și migrarea fragmentelor de diferite dimensiuni într-un gel de agaroză 1,2% în câmp electric alternativ ce își schimbă periodic sensul.
Câmpul electric pulsatoriu alternează cu 120° la fiecare 90 de secunde, pentru 18-24 ore la 14°C.
Metoda PFGE a fost realizată după o variantă optimizată a protocolului standardizat Harmony (Murchan și colab., 2003) în sistem CHEF Mapper (BioRad).
Interpretarea rezultatelor s-a făcut după criteriile stabilite de Tenover și colab. (1995), iar clonalitatea tulpinilor a fost evaluată utilizând programul BioNumerics software versiunea 6.6 (Applied Maths), cu coeficientul Dice și metoda de analiză UPGMA (toleranță 1,5% și optimizare 1,5%). Pentru stabilirea pulsotipurilor s-a ales arbitrar un prag de asemănare de 80% între profilurile de benzi obținute la analiză.
Pentru determinarea clonalității și a detectării sursei focarului s-a aplicat metoda PFGE tulpinilor de S. aureus izolate din cinci focare: în UMA, DSP Prahova și Iași, UMB și UMC.
Tipizarea SCCmec
A fost realizată prin metoda reacției multiplex PCR după schema propusă de Milheirico și colab. (2007). Tulpinile de referință au fost utilizate pentru controlul pozitiv al reacției: COL (SCCmec tip I), BK2464 (SCCmec tip II), ANS46 (SCCmec tip III), MW2 (SCCmec tip IVa), WIS (SCCmec tip V), HDE288 (SCCmec tip VI).
Rezultate
Profilurile genelor de virulență ale tulpinilor de S. aureus
Tulpinile izolate din mediul de spital de la UMA și UMC au prezentat următorii factori de virulență (fig. 11): toate tulpinile (n = 50) au fost pozitive pentru gena nuc (fig. 12), iar prevalența tulpinilor de S. aureus pozitive pentru genele lukS/ F a fost de 26% (13/ 50).
Figura 11. Diagrama distribuției genelor de virulență în tulpinile de S. aureus izolate din mediul de spital.
Figura 12. Electroforeza în gel de agaroză 2% a ampliconilor nuc (279 pb.), lukS/F (433 pb.), mecA (532 pb.) obținuți prin metoda reacției triplex PCR. Legendă: 1 – 5 tulpini de S. aureus izolate din UMC; MP – tulpina 33/ 2009 (martor pozitiv); M – marker de greutate moleculară 100 pb. Promega.
Tulpinile izolate din comunitate de la UMD și UME au prezentat următorii factori de virulență (fig. 13): toate tulpinile izolate au fost pozitive pentru gena nuc, prevalența tulpinilor de S. aureus pozitive pentru genele lukS/F a fost de 29.58% (21/ 71), pentru gena tst1 a fost de 8.45% (6/ 71) (fig. 14), pentru gena seA a fost de 4.23% (3/ 71) (fig. 15), pentru gena seB a fost de 1.41% (1/ 71), pentru gena seC a fost de 9.86% (7/ 71).
Figura 13. Diagrama distribuției genelor de virulență în tulpinile de S. aureus izolate din comunitate.
Figura 14. Electroforeza în gel de agaroză 1,5% a ampliconilor tst1 (350 pb.). Legendă: 1 – 18 tulpini de S. aureus izolate din UME; MP – tulpina IC13454 (martor pozitiv); M – marker de greutate moleculară 100 pb. Promega.
Figura 15. Electroforeza în gel de agaroză 1,5% a ampliconilor seA (120 pb.). Legendă: 1 – 11 tulpini de S. aureus izolate din UMD; MP – tulpina S. aureus National Collection of Type Cultures, U.K. (NCTC) 10652 (martor pozitiv); MN – martor negativ (H2O); M – marker de greutate moleculară 100 pb. Promega.
Cele 69 tulpini izolate de DSP Prahova provin dintr-un focar de TIA și au fost pozitive pentru enterotoxinele A, B, C, D astfel: prevalența tulpinilor de S. aureus pozitive pentru ambele gene seA și seD a fost de 55.07% (38/ 69); pentru gena seA, de 10.14% (7/ 69); pentru gena seB, de 1.45% (1/ 69); pentru gena seC, de 2.90% (2/ 69); pentru gena seD, de 1.45% (1/ 69).
Cele 6 tulpini izolate de DSP Iași provin dintr-un focar de TIA și au fost pozitive pentru enterotoxinele A, B, C, D astfel: 2 izolate (33.33%) au fost pozitive pentru ambele gene seA și seD (fig. 16).
Figura 16. Diagrama distribuției genelor de virulență în tulpinile de S. aureus izolate de DSP Prahova și DSP Iași.
Profilurile rezistenței la antibiotice ale tulpinilor de S. aureus
Tulpinile izolate din mediul de spital (UMA, UMB, UMC) au prezentat următoarea distribuție a rezistenței la antibiotice (fig. 17).
Figura 17. Diagrama distribuției rezistenței la antibiotice în tulpinile de S. aureus izolate din mediul de spital.
Suplimentar pentru un număr de 28 tulpini izolate de la UMC s-a realizat testarea sensibilității la MUP. Toate tulpinile au fost sensibile.
Prevalența rezistenței la penicilină a tulpinilor izolate din mediul de spital a fost de 97.56% (80/ 82). Prevalența tulpinilor MRSA a fost de 84.15% (69/ 82), iar la E de 81.71% (67/ 82). La 55 izolate (67.07%) de S. aureus am identificat fenotipul de rezistență MLSBi, aceste tulpini fiind raportate rezistente la DA. Prevalența rezistenței la K a fost de 86.59% (71/ 82), la CN, de 60.98% (50/ 82), la TOB, de 60.98% (50/ 82), la CIP, de 1.22% (1/ 82), la TE, de 64.63% (53/ 82), iar 1 tulpina (1.22%) a fost intermediară la TE. Prevalența rezistenței la C a fost de 1.22% (1/ 82), la QD, de 67.07% (55/ 82), fiind raportate rezistente în corelație cu fenotipul MLSBi. Toate tulpinile de S. aureus izolate din mediul de spital au fost sensibile la RD, SXT, VA, LZD.
Tulpinile izolate din comunitate (UMD și UME) au prezentat următoarea distribuție a rezistenței la antibiotice (fig. 18).
Figura 18. Diagrama distribuției rezistenței la antibiotice în tulpinile de S. aureus izolate din comunitate.
Suplimentar pentru un număr de 42 tulpini izolate de la UMD am evaluat sensibilitatea la C, iar pentru 29 tulpini izolate de la UME am evaluat sensibilitatea la NOR. Prevalența rezistenței la C a fost de 4.76% (2/ 42), iar la NOR de 6.90% (2/ 29).
Prevalența rezistenței la penicilină a tulpinilor izolate din comunitate a fost de 94.37% (67/ 71). Prevalența tulpinilor MRSA a fost de 42.25% (30/ 71), iar la E de 49.30% (35/ 71). 4 tulpini au fost intermediare la clindamicină (DA), iar la 30 izolate (42.25%) de S. aureus am identificat fenotipul de rezistență MLSBi, aceste tulpini fiind raportate rezistente la DA. Prevalența rezistenței la K a fost de 50.70% (36/ 71), la CN, de 5.63% (4/ 71), la TOB, de 7.04% (5/ 71), la CIP, de 5.63% (4/ 71), la TE, de 42.25% (30/ 71), iar 2 tulpini (2.82%) au fost intermediare la TE. Prevalența rezistenței la RD a fost de 1.41% (1/ 71), 9 tulpini fiind intermediare. Prevalența rezistenței la QD a fost de 42.25% (30/ 71), 3 tulpini fiind intermediare, iar la FD a fost de 11.27% (8/ 71). Toate tulpinile de S. aureus izolate din comunitate au fost sensibile la SXT, VA, LZD, MUP.
Profilul genelor de rezistență al tulpinilor de S. aureus izolate din diferite surse
Cele 48 de tulpini izolate din mediul de spital (de la UMA și UMC) rezistente fenotipic la P au fost pozitive pentru gena blaZ (fig. 19).
Figura 19. Electroforeza în gel de agaroză 1,5% a ampliconilor blaZ (173 pb.). Legendă: 1 – 22 tulpini de S. aureus izolate din UMC; MP – tulpina 5681/ 2010 (martor pozitiv); MN – martor negativ (H2O); M – marker de greutate moleculară 100 pb. Promega.
Cele 39 de tulpini rezistente la FOX au fost pozitive pentru gena mecA, situată în caseta cromosomală SCCmec de tip IV (16 tulpini) și IVE (23 tulpini) (fig. 20), cele rezistente fenotipic la E și DA (cu MLSBi) au fost pozitive pentru gena ermC, un izolat a fost pozitiv pentru gena ermA, iar o tulpină rezistentă numai la E a fost pozitivă pentru gena ermC. Cele rezistente la CN au fost pozitive pentru genele aacA-aphD (fig. 21), iar cele rezistente și intermediare la TE au fost pozitive pentru gena tetK (fig. 22).
Figura 20. Electroforeza în gel de agaroză 2% a ampliconilor SCCmec. Legendă: 1 – 11 tulpini de S. aureus izolate din UMA; M – marker de greutate moleculară 100 pb. I – VI tipurile SCCmec; MN1 și MN2 – martor negativ (cu H2O); M – marker de greutate moleculară 100 pb. Promega.
Figura 21. Electroforeza în gel de agaroză 1,5% a ampliconilor aacA-aphD (227 pb.). Legendă: 1 – 9 tulpini de S. aureus izolate din UMA; MP – 5681/ 2010; MN – martor negativ (H2O); M – marker de greutate moleculară 100 pb. Promega.
Figura 22. Electroforeza în gel de agaroză 1,5% a ampliconilor tetK (360 pb.). Legendă: 1 – 3 tulpini de S. aureus izolate din UMC; MP – tulpina 5681/ 2010 (martor pozitiv); MN – martor negativ (H2O); M – marker de greutate moleculară 100 pb. Promega.
Cele 67 de tulpini izolate din comunitate (de la UMD și UME) rezistente fenotipic la P au fost pozitive pentru gena blaZ. Cele 30 izolate rezistente la FOX au fost pozitive pentru gena mecA, situată în caseta cromosomală SCCmec de tip IV (9 tulpini) și IVE (20 tulpini). O tulpină nu a putut fi încadrată în nici un tip SCCmec. Toate tulpinile rezistente fenotipic la E și DA (cu MLSBi) au fost pozitive pentru gena ermC (fig. 23). Tulpinile rezistente fenotipic la TE au fost pozitive pentru gena tetK, iar o tulpină a fost pozitivă pentru gena tetM. Tulpinile intermediare la TE au fost negative pentru genele tetK și tetM. Două tulpini rezistente la CN au fost pozitive pentru genele aacA-aphD, iar alte două tulpini rezistente au fost negative.
Figura 23. Electroforeza în gel de agaroză 1,5% a ampliconilor ermC (299 pb.). Legendă: 1 – 16 tulpini de S. aureus; MP – tulpina 5681/ 2010 (martor pozitiv); MN – martor negativ (H2O); M – marker de greutate moleculară 100 pb. Promega.
Încadrarea tulpinilor de la UMA, DSP Prahova, DSP Iași, UMB și UMC în pulsotipuri PFGE
Tulpinile MRSA de la UMA s-au încadrat în două pulsotipuri PFGE notate A și B cu un indice de asemănare > 90%. Tulpinile încadrate în pulsotipul PFGE A, cât și cele încadrate în pulsotipul PFGE B au un indice de asemănare de 100% (0 benzi diferență) ceea ce demonstrează clonalitatea acestora.
Analiza profilurilor de macro-restricție în cadrul tulpinilor trimise de DSP Prahova și DSP Iași, la un indice de asemănare de 80% a evidențiat existența mai multor pulsotipuri distincte notate A, B, C, D, E, F, G, dintre care unul comun unor tulpini producătoare de enterotoxine A și D izolate din exsudat faringian, din exsudat nazal, din coproculturi și din alimente, dar și unor tulpini producătoare de enterotoxină A, izolate din coproculturi și din alimente (fig. 24).
Figura 24. Dendrograma tulpinilor de S. aureus trimise de DSP Prahova și DSP Iași. Legendă: chenar albastru – tulpini de la DSP Prahova; chenar roșu – tulpini de la DSP Iași.
Analiza profilurilor de macro-restricție în cadrul tulpinilor de S. aureus de la UMB, la un indice de asemănare de 80%, au fost încadrate în trei pulsotipuri PFGE notate A, B, C și 2 subtipuri (notate A1 și A2).
Un procent de asemănare ≥ 80% între pulsotipurile PFGE (diferență de până la 5 fragmente ADN) indică că tulpinile sunt înrudite genetic.
Din punct de vedere epidemiologic, asemănarea poate sugera o sursă comună a tulpinilor.
27 de tulpini au prezentat subtipul A1 (asemănare 100%), 3 tulpini subtipul A2 (asemănare 80%, 5 fragmente ADN diferență față de subtipul A1), 1 tulpină pulsotipul PFGE B (asemănare < 80%, 10 fragmente ADN diferență față de pulsotipul PFGE A) și 1 tulpină pulsotipul PFGE C (asemănare < 80%, 14 fragmente ADN diferență față de pulsotipul PFGE A). Tulpinile cu subtipul A1 reprezintă o clonă. Tulpinile cu subtipul A2 pot fi înrudite genetic cu cele din subtipul A1.
Cele 28 tulpini de S. aureus de la UMC izolate din cele 2 focare, la un indice de asemănare de 80% între profilurile de benzi obținute la analiză, s-au distins 10 pulsotipuri (tipuri) notate cu A, B, C, D, E, F, G, H, I, J și 6 subtipuri (notate D1, D2, E1, E2, G1, G2). Între tipurile identificate există un grad mic de asemănare (44.87%).
Tulpinile încadrate în pulsotipul A prezintă un indice de asemănare de 100% (0 benzi diferență) ceea ce demonstrează clonalitatea acestora;
Tulpinile încadrate în pulsotipul D cu un indice de asemănare de 87.45% (3 benzi diferență) sunt strâns înrudite între ele;
Tulpinile încadrate în pulsotipul E cu un indice de asemănare de 90.91% (2 benzi diferență) sunt strâns înrudite între ele;
Tulpinile încadrate în pulsotipul G cu un indice de asemănare de 85.72% (3 benzi diferență) sunt strâns înrudite între ele (fig. 25).
Rezultatele sugerează posibilitatea unei circulații endemice a unor tulpini provenind din multiple surse.
Figura 25. Dendrograma tulpinilor de S. aureus izolate de la UMC.
Distribuția tipurilor spa a tulpinilor de S. aureus izolate din UMA, UMC, UMD și UME
Cele 50 tulpini de S. aureus izolate de la UMA și UMC au fost încadrate în următoarele tipuri spa (fig. 26): t127 (48%, 24/ 50), t008 (24%, 12/ 50), t002 (6%, 3/ 50), t015 (6%, 3/ 50), t616 (4%, 2/ 50) și alte 6 tipuri spa cu 2% (1 tulpină din fiecare): t056, t279, t330, t620, t1556 și un tip spa nou t13462, introdus pentru prima dată în baza internațională de date Ridom SpaServer (fig. 27).
Figura 26. Electroforeza în gel de agaroză 1,5% a ampliconilor spa (diferite dimensiuni). Legendă: 1 – 14 tulpini de S. aureus izolate din UMC; M – marker de greutate moleculară 100 pb. Promega.
Figura 27. Diagrama distribuției tipurilor spa în tulpinile de S. aureus izolate de la UMA și UMC.
Cele 71 tulpini de S. aureus izolate de la UMD și UME s-au încadrat în următoarele tipuri spa: a prevalat t127 (36.62%, 26/ 71), urmat de t044 (7.04%, 5/ 71), t005 (4.23%, 3/ 71), t008 (4.23%, 3/ 71), t284 (4.23%, 3/ 71), t019 (2.82%, 2/ 71), t021 (2.82%, 2/ 71), t2881 (2.82%, 2/ 71) și alte 25 tipuri spa cu 1.41% (1 tulpină din fiecare): t002, t012, t015, t053, t084, t091, t174, t223, t280, t355, t435, t437, t559, t582, t620, t701, t728, t948, t1211, t1889, t5841, t7585 și trei tipuri spa noi t14512, t14513, t15296 introduse pentru prima dată în baza internațională de date Ridom SpaServer (fig. 28).
Figura 28. Diagrama distribuției tipurilor spa în tulpinile de S. aureus izolate de la UMD și UME.
O tulpină izolată de la UME a prezentat o mutație punctiformă la nivelul semnăturii 3’ schimbând astfel structura inițială 3’TAYATGTCGT în 3’TAYATATCGT.
Relațiile evolutive ale tipurilor spa în tulpinile din mediul de spital de la UMA și UMC sunt prezentate în figura 29. Tulpinile s-au grupat într-un singur cluster notat cluster 1 [4 (8% din totalul tulpinilor); 2 (18% din toate tipurile spa: t015 și t620)].
Relațiile evolutive ale tipurilor spa în tulpinile comunitare de la UMD și UME sunt prezentate în figura 30. Tulpinile s-au grupat în 7 clustere ce cuprind următoarele tipuri spa: cluster 1 [spaCC582/ 021 – 7 (10% din totalul tulpinilor); 5 (15% din toate tipurile spa: t012, t019, t021, t582, t1889)]; cluster 2 [spaCC14512 – 5 (7% din totalul tulpinilor); 3 (9% din toate tipurile spa: t008, t701, t14512)]; cluster 3 [spaCC620 – 3 (4% din totalul tulpinilor); 3 (9% din toate tipurile spa: t015, t620, t7585)]; cluster 4 [spaCC127 – 28 (39% din toate tulpinile); 3 (9% din toate tipurile spa: t127, t174, t948)]; cluster 5 – 4 (6% din totalul tulpinilor); 2 (6% din toate tipurile spa: t005, t223)]; cluster 6 – 2 (3% din totalul tulpinilor); 2 (6% din toate tipurile spa: t002, t053)]; cluster 7 – 4 (6% din totalul tulpinilor); 2 (6% din totalul tipurilor spa: t284, t435)].
Tabelul 29. Principalele pattern-uri de rezistență ale tulpinilor de S. aureus izolate de la UMB
Tabelul 30. Corelația între profilul de rezistență la antibiotice, MSSA/ MRSA, tipul spa și PVL la tulpinile de S. aureus de la UMA și UMC
(I)* – Intermediar
Tabelul 31. Corelația dintre profilul de rezistență MSSA/ MRSA, tipul spa și PVL la tulpinile de S. aureus de la UMD și UME
(I)* – Intermediar
Analiza fenotipică și genotipică a unei tulpini de S. hominis izolată din UMF
Din UMF s-a izolat o tulpină de S. hominis rezistentă la linezolid.
Izolatul a fost sensibil la SXT și VA (valoarea CMI = 3 µg/ mL) (fig. 31) și rezistent la P, FOX, E, DA, K, CN, TOB, CIP, TE, RD, C, QD, LZD.
Valoarea CMI la linezolid a arătat o rezistență de nivel înalt (>128 µg/mL) (fig. 32).
Figura 31. Sensibilitatea la vancomicină a tulpinii de S. hominis evaluată prin metoda E-test.
Figura 32. Sensibilitatea la linezolid a tulpinii S. hominis evaluată prin metoda E-test.
PCR pentru gena cfr
Un amplicon de mărimea așteptată a fost obținut prin PCR pentru gena cfr (fig. 33). Secvența ampliconului genei cfr a fost comparată cu secvența salvată în baza de date National Center for Biotechnology Information (NCBI).
Figura 33. Electroforeza în gel de agaroză 1,5% a ampliconilor cfr (746 pb.). Legendă: 1 – tulpină izolată din UMF; MN – martor negativ (H2O); M – marker de greutate moleculară 100 pb. Promega.
Prin secvențierea și compararea secvenței genei regiunii domeniului V 23S ARNr (fig. 34) cu secvența genei 23S ARNr de la S. aureus (GenBank accession no. X68425.1), o singură mutație punctiformă a fost detectată în poziția 2603, prin substituirea nucleotidului G cu T (fig. 35).
Această mutație a fost deja detectată ca fiind implicată în rezistența la linezolid.
Figura 34. Electroforeza în gel de agaroză 1,5% a ampliconilor 23S ARNr (420 pb.). Legendă: 1 – tulpină izolată din UMF; MN – martor negativ (H2O); M – marker de greutate moleculară 100 pb. Promega.
Figura 35. Mutația punctiformă în poziția 2603 în regiunea domeniului V a genei 23S ARNr (BioEdit Sequence Alignment Editor).
2.4. Discuții
Studiile de epidemiologie au arătat o creștere a incidenței infecțiilor cu S. aureus nu numai în mediul de spital, dar și a infecțiilor asociate comunitare (Dryden, 2009).
Infecțiile tegumentare și ale țesuturilor moi cauzate de S. aureus reprezintă un grup foarte heterogen, unele simple localizate în focarul infecției inițiale, altele complicate prin invazia celulelor bacteriene în țesuturile adiacente sau chiar la distanță pe calea mediului intern. Evoluția procesului infecțios este condiționată, în primul rând, de factorii protectori ai organismului gazdă, dar și de factorii bacterieni (factorii de virulență). Rezistența la antibiotice, devenită ea însăși un factor de virulență, complică managementul acestor infecții.
La nivel European, MRSA este considerat cel mai important patogen implicat în infecțiile tegumentare și ale țesuturilor moi. Terapia trebuie inițiată empiric înainte de primirea rezultatului de la laborator (Lee și colab., 2004).
În anul 2008, în Europa tulpinile MRSA reprezentau aproximativ 44% în infecțiile de spital (Kock și colab., 2010). Alte studii Europene au arătat o prevalență de 26.7% a tulpinilor de S. aureus rezistente la oxacilină. Au fost raportate prevalențe diferite ale tulpinilor MRSA în diferite țări, nivelul rezistenței variind de la 40% în Marea Britanie, Belgia, Grecia, Irlanda și Islanda la 0.6% în Suedia (Sader și colab., 2006). Procente de 25% sau mai mari au fost raportate în Bulgaria, Croația, Cipru, Grecia, Israel, Italia, Malta, Portugalia, Irlanda, România, Spania, Turcia și Marea Britanie (Kock și colab., 2010). Datele au fost obținute prin sistemele de supraveghere și criteriile de control al focarelor (Humphreys, 2007). Prevalența tulpinilor MRSA în spital (HA-MRSA) a fost la un nivel înalt în Australia (Humphreys, 2007), Africa de Nord, Orientul Mijlociu și Asia de Est (Ippolito și colab., 2010).
Tipul spa t030 a fost descris ca MRSA prevalent în Turcia (Alp și colab., 2009). Clona ST239/ t030 puternic asociată cu tipul SCCmec III este acum diseminată în multe țări din Asia și, particular, în China, deși ar putea să provină din țări Europene (Chen și colab., 2014).
În Europa, tulpinile MRSA din comunitate (CA-MRSA) au fost semnalate la începutul acestui deceniu. În America de Nord și de Sud, Asia și Malta au fost raportate cele mai înalte prevalențe la purtătorii de CA-MRSA (>50%). Prevalențe intermediare (25 – 50%) au fost raportate în China, Australia, Africa și în câteva țări din Europa, precum Portugalia (49%), Grecia (40%), Italia (37%) și România (34%). Alte țări Europene, incluzând Olanda și țările Scandinave au raportat, în general, prevalențe scăzute (Alaklobi și colab., 2015). Tulpinile CA-MRSA prezintă o prevalență înaltă în Statele Unite ale Americii, Canada (Carroll, 2008) și Australia (Kock și colab., 2010). Atât în Europa, cât și în Statele Unite ale Americii s-a înregistrat o creștere dramatică a numărului de raportări ale prevalenței MRSA în infecții asociate comunității. Înainte de anul 2000, în Statele Unite ale Americii procentul tulpinilor MRSA izolate din infecții tegumentare și de țesuturi moi a fost foarte scăzut (3%) și s-a ridicat în câteva regiuni la 30% și apoi la 64% între anii 2001-2004, cu 97% dintre tulpini aparținând clonei USA300 (Moran și colab., 2006).
Alte clone USA includ USA400 (ST1), USA1000 (ST59) și USA1100 (ST30) (Pan și colab., 2005).
În China, cea mai comună clonă printre tulpinile CA-MRSA raportată în infecțiile tegumentare și de țesuturi moi la copii a fost ST59-MRSAIV/V-t437 (Wu și colab., 2010; Li și colab., 2013). În Beijing, un studiu recent a raportat clona ST398 în fermele de animale având o prevalență ridicată în infecțiile tegumentare și de țesuturi moi, dintre care 64.3% sunt purtătoare de gene lukS/F-PV (Zhao și colab., 2012). În Japonia, cea mai comună clonă printre tulpinile MRSA asociate infecțiilor tegumentare și a țesuturilor moi a fost MLST-CC8/spa-CC008-SCCmec-IV (Maeda și colab., 2012). În New York, US CC8 este cea mai comună clonă în infecțiile tegumentare și de țesuturi moi cu S. aureus, mai ales dintre S. aureus PVL pozitiv (Kaltsas și colab., 2011).
Înainte de anul 2003, Vandenesch și colab., (2003) au semnalat un număr limitat de clone cu distribuție geografică preferențială. Ulterior, o diversitate genetică înaltă a fost raportată în Europa printre tulpinile MSSA din comunitate (CA-MSSA) (Rolo și colab., 2012) și CA-MRSA. Distribuția geografică a tulpinilor CA-MRSA nu este unitară: unele se găsesc în anumite zone geografice, iar altele sunt ubicvitare, după cum anumite tulpini MRSA predomină în spitale, iar altele în mediul comunitar (Diep și colab., 2006).
Clona Europeană de S. aureus cu cea mai înaltă prevalență a fost ST80. În Statele Unite ale Americii, clonele prevalente au fost ST8 (USA300) și ST1 (USA400), iar în Oceania ST30. Studiul lui Tristan și colab., (2007) sugerează schimbul intercontinental a numeroase clone continent-specifice: clona ST8 din Statele Unite ale Americii către Europa, clona ST1 din Statele Unite ale Americii către Europa și Asia, clona ST59 (USA1000) din Statele Unite ale Americii către Asia, clona ST80 din Europa către Asia (Hsu și colab., 2005) și clona ST30 din Oceania către Europa. Caracterul epidemic al tulpinilor CA-MRSA, în special al clonei USA300 răspândită pe scară largă nu este înțeles. Tulpinile USA300 poartă tipul SCCmec IV conferind rezistență la clasa de antibiotice β-lactamice și o insulă de patogenitate, ACME (Arginine Catabolic Mobile Element – element genetic mobil ce conferă proprietatea de a cataboliza arginina), ce inhibă producerea celulelor polimorfonucleare. Legătura fizică dintre caseta SCCmec și ACME sugerează că selecția pentru rezistența la antibiotice și pentru patogenitate pot fi interconectate (Diep și colab., 2008).
Cele mai frecvente 20 tipuri spa și tipuri ST printre tulpinile MSSA și MRSA izolate în Europa, inclusiv în România sunt raportate în studiul propus de Grundmann și colab., (2014).
Principala clonă Europeană, t044/ ST80 a fost detectată în Austria, Belgia, Bulgaria, Chile, Croația, Cipru, Republica Cehă, Finlanda, Franța, Germania, Grecia, Ungaria, Islanda, Iran, Irlanda, Italia, Iordania, Liban, Olanda, Norvegia, România, Spania, Suedia, Elveția, Emiratele Arabe Unite, Marea Britanie (baza de date EU Ridom SpaServer), în Danemarca, unde tulpinile MRSA sunt rare în spitale (Faria și colab., 2005). ST30 este, de asemenea, clona majoră în Asia și Oceania (Ho și colab., 2007; Vlack și colab., 2006) și este denumită clona Pacific Sud-Vest (Vlack și colab., 2006).
Clonele ST1 și ST30, PVL pozitive, pot fi considerate pandemice. Au fost detectate în America, Europa și Asia. Câteva clone specific continentale semnalate în 2003 (clona ST8), s-au diseminat transcontinental, ca și tulpinile CA-MRSA, PVL-pozitive (Tristan și colab., 2007; Vandenesch și colab., 2003). În 2002, leucocidina Panton-Valentine (PVL) a fost asociată cu 1.6% dintre tulpinile de S. aureus în Marea Britanie și Țara Galilor (Holmes și colab., 2005). În prezent, prevalența tulpinilor CA-MRSA, PVL pozitive, variază considerabil de la un continent la altul. Spre deosebire de Statele Unite, în cazul în care tulpinile CA-MRSA sunt implicate, în prezent, în majoritatea infecțiilor cu S. aureus în comunitate, în Europa de Nord, prevalența tulpinilor CA-MRSA, PVL-pozitive este mai mică, aprox. 1-3% (Del Giudice și colab., 2006), iar în Grecia și țările situate la granițele sudice ale Europei (Algeria), este o prevalență mai mare.
Inițial tulpinile CA-MRSA, PVL-pozitive au fost sensibile la majoritatea agenților anti microbieni, apoi au achiziționat noi determinanți de rezistență anti microbiană. În Asia (Singapore, Republica Populară Chineză) sau Africa (Algeria) majoritatea tulpinilor CA-MRSA, PVL-pozitive, au determinanți multipli de rezistență anti microbiană (Tristan și colab., 2007). Un studiu din 1999 a arătat prevalența rezistenței la aminoglicozide (Schmitz și colab., 1999), iar un alt studiu din 2001 a arătat distribuția genelor de rezistență la tetraciclină la tulpinile MRSA și MSSA din Europa (Schmitz și colab., 2001).
În țările cu prevalență înaltă, tulpinile CA-MRSA, PVL-pozitive, constituie cauza majoră a creșterii numărului de infecții asociate îngrijirilor medicale. Genele pentru PVL au variabilitate a secvenței bazelor. Clona cea mai frecvent izolată în Europa, ST80 conține haplotipul H2, care este descris ca alelă ancestrală din care s-au diversificat celelalte variante. Aceste tendințe, deși în mare parte regionalizate, conduc spre o incidență crescută a tulpinilor CA-MRSA și o sensibilitate scăzută la agenții anti microbieni. Acestea trebuie să fie luate în considerare atunci când se aleg opțiunile de tratament empiric (Vandenesch, 2008).
Tulpinile CA-MRSA de multe ori cauzează infecții tegumentare mai severe. S-a demonstrat o asociere epidemiologică a tulpinilor de S. aureus, PVL-pozitive cu pneumonia necrozantă (Lina și colab., 1999). În Statele Unite ale Americii, tulpinile CA-MRSA, PVL-pozitive, cu o prevalență înaltă, determină infecții necrozante, iar în Europa majoritatea infecțiilor pulmonare necrozante sunt cauzate de tulpinile MSSA, PVL-pozitive, mai virulente decât clonele CA-MRSA, PVL-pozitive (Sicot și colab., 2013).
Cu toate acestea, se cunosc puține lucruri despre situația din România. În studiile recente din România procentele de MRSA în spitale sunt foarte mari, variind între 30-85%. Au fost identificate tulpinile CA-MRSA (Coman și colab., 2002; Grigore și colab., 1997; Dorneanu și colab., 2006; Szekely și colab., 2008; Dorobăț și colab., 2010; Ionescu și colab., 2010; Kock și colab., 2010; Năstase și colab., 2010; Nica și colab., 2010; Vremeră și colab., 2012; Ionescu și colab., 2015). În acord cu raportul Sistemului European de Supraveghere a Rezistenței la antibiotice ECDC (EARS-Net), în România, procentele de MRSA în infecțiile invazive a fost de 49.5% în 2011, 53.3% în 2012, 64.5% în 2013 și 56% în 2014 (http://ecdc.europa.eu/en/publications/Publications/antimicrobial-resistance-europe-2014.pdf). Tipul spa t030 a fost raportat ca MRSA prevalent în România (Grundmann și colab., 2010), fiind cea mai răspândită clonă MRSA în spitalele din România, raportată în numeroase studii (Oprea și colab., 2008; Ionescu și colab., 2010), devenind astfel endemică (Szekely și colab., 2012). În spitalele din România clona ST239 a fost raportată de sistemul de supraveghere structurat Seqnet.org (Grundmann și colab., 2014) și de alți autori (Cîrlan și colab., 2005). Tipul spa t127 raportat frecvent în spitalele din România (Oprea și colab., 2008; Szekely și colab., 2012; Codiță și colab., 2012), a fost raportat de Franco și colab., (2011) ca fiind asociat cu animalele (porc).
Tulpinile MSSA/ MRSA, PVL-pozitive au fost ocazional descrise în România (Ionescu și colab., 2010; Năstase și colab., 2010; Codiță și colab., 2008). Monecke și colab., (2014) au raportat prevalențe înalte ale tulpinilor PVL pozitive în țara noastră (31% MRSA, 14% MSSA). Un studiu (Vremeră și colab., 2012) arată procente relativ înalte ale tulpinilor PVL-pozitive (23.93%), mai ales ale tulpinilor CA-MRSA (51.11%) în regiunea de Nord-Est a României. În România, majoritatea tulpinilor CA-MRSA, PVL-pozitive, au fost rezistente la eritromicină (91.30%) și sensibile la clindamicină, fluoroquinolone, rifampicină, cloramfenicol sau acid fusidic (Vremeră și colab., 2012).
În România, un studiu și o comunicare au prezentat rapoarte de caz cu sepsis fatal datorat clonei CA-MRSA, PVL-pozitive, tip spa t044 (Szekely și colab., 2010; Alexandrescu și colab., 2009).
Se cunoaște că administrarea constantă a linezolidului este asociată cu dezvoltarea rezistenței la tulpinile de stafilococ coagulază negative. Unele rapoarte semnalează infecția sau colonizarea cu tulpini de stafilococ coagulază negative rezistente la linezolid la pacienții fără expunere anterioară la linezolid (Potoski și colab., 2006) precum și a contaminării mediului cu stafilococ rezistent la meticilină cu sensibilitate redusă la glicopeptide (Perdelli și colab., 2008). Multe studii au arătat că tigeciclina, comparativ cu vancomicina și linezolidul, este un antibiotic sigur și mult mai eficient la pacienții spitalizați cu infecții serioase cauzate de MRSA (Florescu și colab., 2008; Kreis și colab., 2013). Mai mult decât atât, rezistența la tigeciclină a fost rară la tulpinile care cauzează infecții semnificative clinic (Dabul și Camargo, 2014; Hope și colab., 2010).
În România, rapoartele privind consumul de substanțe anti microbiene indică faptul că unele dintre acestea rezervate pentru uz spitalicesc, incluzând linezolidul, pot fi achiziționate de la farmacii comunitare (http://www.cnscbt.ro/index.php/analiza-date-supraveghere/infectii-nosocomiale-1/238-raport-privind-supravegherea-in-rezistenta-microbiana-si-consum-antibiotice-2012/file – Raport privind Consumul de antibiotice, Rezistența microbiană și Infecții Nosocomiale în România – 2012 – CARMIN-ROM 2012), ceea ce ar fi o premisă a erodării eficienței linezolidului față de cocii Gram pozitivi (enterococi, stafilococi). În 2013, incidența tulpinilor de Enterococcus faecalis cu sensibilitate redusă la linezolid a fost de 8.2%, cea mai mare din Europa (Popescu – date nepublicate).
Linezolidul a fost recent inclus oficial în categoria a 5-a OMS a antibioticelor recomandate pentru terapia tulpinilor de Mycobacterium tuberculosis cu rezistență multiplă, care ar putea avea un impact semnificativ în România, cu prevalență deja ridicată a tuberculozei (Lange și colab., 2014).
Pe de altă parte, mobilitatea genelor de rezistență are rol important în diseminarea tulpinilor de interes clinic. Sorlozano și colab., (2010) au raportat mutația G2603T din regiunea domeniului V a genei 23S ARNr la tulpini de S. hominis izolate în anul 2010 din infecții în secția ATI din Granada. Numeroase grupuri de cercetători, din Brazilia (Lincopan și colab., 2009; Chamon și colab., 2014; Cidral și colab., 2015) și din China (Zhou și colab., 2015) au raportat această mutație la tulpini de S. epidermidis, S. haemolyticus, S. hominis și S. capitis.
În studiul prezentat, sursa a rămas necunoscută, în ciuda izolării acestei tulpini de S. hominis rezistentă la linezolid, deoarece spitalul nu a implementat screening-ul, doar pentru S. aureus. Chiar dacă nu avem date care să susțină implicarea tulpinii S. hominis în sepsis, având în vedere că s-a izolat dintr-o singură probă de sânge, menționăm că rezistența la linezolid a fost conferită de un element genetic mobil ce se poate transfera cu ușurință, ceea ce are implicații epidemiologice semnificative.
În prezent, tulpinile de Staphylococcus rezistente la linezolid sunt izolate sporadic. Perioada mare de spitalizare, mai ales în secțiile de Terapie Intensivă, folosirea adecvată sau neadecvată a antibioticelor și dificultatea detectării anumitor fenotipuri sau genotipuri de rezistență pot accelera diseminarea tulpinilor de Staphylococcus rezistente la linezolid. Pentru a păstra eficacitatea terapeutică a acestui agent antimicrobian de rezervă pentru o perioadă mai lungă de timp, se recomandă utilizarea rațională a linezolidului și supravegherea tulpinilor de Staphylococcus spp. folosind metodele cele mai rapide și sensibile de testare a sensibilității la antibiotice.
Concluzii
Toate tulpinile de S. aureus analizate au fost pozitive pentru gena nuc.
Prevalenta tulpinilor de S. aureus izolate din mediul de spital, pozitive pentru genele lukS/ F –PV a fost de 26% (13/ 50), iar a celor izolate din comunitate a fost de 29.58% (21/ 71); pentru gena tst1 a fost de 8.45% (6/ 71); pentru gena seA a fost de 4.23% (3/ 71); pentru gena seB a fost de 1.41% (1/ 71); pentru gena seC a fost de 9.86% (7/ 71).
Prevalenta tulpinilor de S. aureus izolate de DSP Prahova (focar TIA) pozitive pentru ambele gene seA și seD a fost de 55.07% (38/ 69); pentru gena seA, de 10.14% (7/ 69); pentru gena seB, de 1.45% (1/ 69); pentru gena seC, de 2.90% (2/ 69); pentru gena seD, de 1.45% (1/ 69).
Prevalenta tulpinilor de S. aureus izolate de DSP Iasi (focar TIA) pozitive pentru ambele gene seA și seD a fost de 33.33%.
Prevalenta rezistentei la penicilina a tulpinilor izolate din mediul de spital a fost de 97.56% (80/ 82), iar a celor din comunitate a fost de 94.37% (67/ 71).
Prevalenta tulpinilor MRSA in mediul de spital a fost de 84.15% (69/ 82), iar in comunitate a fost de 42.25% (30/ 71).
Tulpinile din mediul de spital au prezentat o prevalenta a rezistentei la E de 81.71% (67/ 82). 55 izolate (67.07%) de S. aureus au prezentat fenotipul de rezistenta MLSBi, aceste tulpini fiind raportate rezistente la DA. Prevalenta rezistenței la K a fost de 86.59% (71/ 82), la CN, de 60.98% (50/ 82), la TOB, de 60.98% (50/ 82), la CIP, de 1.22% (1/ 82), la TE, de 64.63% (53/ 82), iar 1 tulpina (1.22%) a fost intermediara la TE. Prevalenta rezistentei la C a fost de 1.22% (1/ 82), la QD, de 67.07% (55/ 82), fiind raportate rezistente in corelatie cu fenotipul MLSBi. Toate tulpinile de S. aureus izolate din mediul de spital au fost sensibile la RD, SXT, VA, LZD, iar tulpinile izolate din comunitate au avut o prevalenta a rezistentei la E de 49.30% (35/ 71). 4 tulpini au fost intermediare la DA, iar 30 izolate (42.25%) de S. aureus au prezentat fenotipul de rezistenta MLSBi, aceste tulpini fiind raportate rezistente la DA. Prevalenta rezistenței la K a fost de 50.70% (36/ 71), la CN, de 5.63% (4/ 71), la TOB, de 7.04% (5/ 71), la CIP, de 5.63% (4/ 71), la TE, de 42.25% (30/ 71), iar 2 tulpini (2.82%) au fost intermediare la TE. Prevalenta rezistentei la RD a fost de 1.41% (1/ 71), 9 tulpini fiind intermediare. Prevalenta rezistentei la QD a fost de 42.25% (30/ 71), 3 tulpini fiind intermediare, iar la FD a fost de 11.27% (8/ 71). Prevalenta rezistentei la C a fost de 4.76% (2/ 42), iar la NOR de 6.90% (2/ 29). Toate tulpinile de S. aureus izolate din comunitate au fost sensibile la SXT, VA, LZD, MUP.
48 de tulpini izolate din mediul de spital (de la UMA și UMC) și 67 de tulpini izolate din comunitate (de la UMD și UME) rezistente fenotipic la P au fost pozitive pentru gena blaZ.
39 de tulpini izolate din mediul de spital, rezistente la FOX au fost pozitive pentru gena mecA, situata in caseta cromosomala SCCmec de tip IV (16 tulpini) și IVE (23 tulpini), iar 30 tulpini izolate din comunitate, rezistente la FOX au fost pozitive pentru gena mecA, situata in caseta cromosomala SCCmec de tip IV (9 tulpini) și IVE (20 tulpini). O tulpina nu a putut fi incadrata in nici un tip SCCmec.
Tulpinile izolate din mediul de spital, rezistente fenotipic la E și DA (cu MLSBi) au fost pozitive pentru gena ermC, un izolat a fost pozitiv pentru gena ermA, iar o tulpina rezistenta numai la E a fost pozitiva pentru gena ermC, iar toate tulpinile izolate din comunitate, rezistente fenotipic la E și DA (cu MLSBi) au fost pozitive pentru gena ermC.
Tulpinile izolate din mediul de spital, rezistente la CN au fost pozitive pentru genele aacA-aphD; doua tulpini izolate din comunitate, rezistente la CN au fost pozitive pentru genele aacA-aphD, iar alte doua tulpini rezistente au fost negative.
Tulpinile izolate din mediul de spital, rezistente și intermediare fenotipic la TE au fost pozitive pentru gena tetK, iar tulpinile izolate din comunitate, rezistente fenotipic la TE au fost pozitive pentru gena tetK, o tulpina a fost pozitiva pentru gena tetM, iar tulpinile intermediare la TE au fost negative pentru genele tetK și tetM.
Tulpinile de S. aureus izolate din mediul de spital (de la UMA și UMC) au fost incadrate in urmatoarele tipuri spa: a prevalat t127 (48%, 24/ 50), urmat de t008 (24%, 12/ 50), t002 (6%, 3/ 50), t015 (6%, 3/ 50), t616 (4%, 2/ 50) și alte 6 tipuri spa cu 2% (1 tulpina din fiecare): t056, t279, t330, t620, t1556 și un tip spa nou t13462, introdus pentru prima data in baza internationala de date Ridom SpaServer.
Tulpinile de S. aureus izolate din comunitate (de la UMD și UME) s-au incadrat in urmatoarele tipuri spa: a prevalat t127 (36.62%, 26/ 71), urmat de t044 (7.04%, 5/ 71), t005 (4.23%, 3/ 71), t008 (4.23%, 3/ 71), t284 (4.23%, 3/ 71), t019 (2.82%, 2/ 71), t021 (2.82%, 2/ 71), t2881 (2.82%, 2/ 71) și alte 25 tipuri spa cu 1.41% (1 tulpina din fiecare): t002, t012, t015, t053, t084, t091, t174, t223, t280, t355, t435, t437, t559, t582, t620, t701, t728, t948, t1211, t1889, t5841, t7585 și trei tipuri spa noi t14512, t14513, t15296 introduse pentru prima data in baza internationala de date Ridom SpaServer.
O tulpina izolata din comunitate (de la UME) a prezentat o mutatie punctiforma la nivelul semnaturii 3’ schimband astfel structura initiala 3’TAYATGTCGT in 3’TAYATATCGT.
Cea mai prevalenta clona de S. aureus izolata din mediul de spital a fost t127, iar din comunitate t127. Studiul nostru a aratat ca S. aureus t127 din comunitate a fost implicat in numeroase focare intraspitalicesti, in ultimii ani. Obtinerea anumitor pulsotipuri PFGE la tulpinile de S. aureus t127 și compararea, in viitor, cu profilul de benzi obtinut in urma tipizarii tulpinilor de S. aureus provenite de la fermele de animale ne va ajuta, sa intelegem mai bine care este sursa și modalitatea de transmitere a acestor clone.
Studiile anterioare au aratat o posibila legatura intre tulpinile de S. aureus t127 izolate de la om și animal, iar acest lucru sprijina dezvoltarea, in viitor, a numeroase studii printr-o abordare integrala și complexa, concept numit ‘’O singura sanatate’’.
Genele responsabile pentru producerea PVL au fost detectate la tulpinile cu tipurile spa t008 și t044, dar și la urmatoarele tipuri spa: t019, t021, t127, t284, t355, t435, t437, t1211, t1889, t5841, t14513. Izolarea și identificarea clonelor comunitare t008 și t044, PVL pozitive ne ajuta sa intelegem și sa prevenim diseminarea lor in comunitate și in mediul de spital.
Detectarea genelor pentru PVL, TSST și SEs ale tulpinilor S. aureus prin utilizarea metodelor moleculare și testarea sensibilitatii la antibiotice a aratat diferente intre tulpinile izolate din mediul de spital și din comunitate.
Detectarea genelor de virulenta și rezistenta la antibiotice poate sprijini o supraveghere sporită și intervenții în domeniul sănătății publice, cu scopul de a preveni diseminarea clonelor implicate în pneumonie necrozanta, in infecții supurative, complicate de piele, in soc toxico-septic și in toxiinfectii alimentare atat in comunitate, cat și in mediul de spital.
Supravegherea sistematica a tulpinilor de S. aureus izolate din mediu de spital și din comunitate este necesară și ar trebui să se facă în mod constant pentru un tratament adecvat, împreună cu măsurile necesare pentru a limita diseminarea unor clone virulente si/ sau rezistente, anume S. aureus t008 sau t044, PVL pozitive, incluzand o abordare integrată numita’’O singura sănătate’’.
Rezultatele studiului nostru au confirmat faptul că izolarea și caracterizarea tulpinilor de S. aureus/ MRSA ramane o constrângere de sanatate publica de prima urgenta.
Identificarea rapida, stoparea diseminarii impreuna cu utilizarea rationala a antibioticelor contribuie la prevenirea selectarii de clone multirezistente.
Studiul nostru cu tulpina de S. hominis rezistenta la linezolid datorata prezentei genei cfr și a mutatiei punctiforme G2603T in regiunea domeniului V a genei 23S ARNr reprezinta primul studiu din Romania și al 2-lea raport cu mutatia G2603T la S. hominis in Europa.
2.6. Bibliografie
Aderem A. and Ulevitch R.J., 2000, Toll-like receptors in the induction of innate immune response, Nature, 406, 782-787.
Alaklobi F., Aljobair F., Alrashod A., Alhababi R., Alshamrani M., Alamin W., Lytvyn L., Alrouki F., Mertz D., 2015, The prevalence of community-associated methicillin-resistant Staphylococcus aureus among outpatient children in a tertiary hospital: A prospective observational study in Riyadh, Saudi Arabia, Internat. J. Ped. and Adolescent Med., 2, 136e140.
Alexandrescu V., Codiță I., Băețel A., Drăgulescu E.C., Coldea I.L., Caz letal de gripă sezonieră suprainfectată cu S. aureus rezistent la meticilină producător de leucocidină Panton-Valentine – România 2009, Simpozionul tematic „Ziua Europeană a Informării despre Antibiotice”, 18 noiembrie 2009, I.N.C.D.M.I. Cantacuzino, București, România, 14 – oral presentation.
De Almeida L.M., De Araújo M.R.E., Sacramento A.G., Pavez M., De Souza A.G., Rodrigues F., Gales A.C., Lincopan N., Sampaio J.L.M., Mamizuka E.M., 2013, Linezolid Resistance in Brazilian Staphylococcus hominis Strains Is Associated with L3 and 23S rRNA Ribosomal Mutations, Antimicrob. Agents Chemother., 57, 4082–4083.
Alp E., Klaassen C.H., Doganay M., Altoparlak U., Aydin K., Engin A., Kuzucu C., Ozakin C., Ozinel M.A., Turhan O., Voss A., 2009, MRSA genotypes in Turkey: persistence over 10 years of a single clone of ST239, J. Infect., 58(6), 433.
Aneziokoro C.O., Cannon J.P., Pachucki C.T., Lentino J.R., 2005, "The effectiveness and safety of oral linezolid for the primary and secondary treatment of osteomyelitis", J. Chemother., 17, 643–650.
Argudin M.A., Mendoza M.C., Rodicio M.R., 2010, Food Poisoning and Staphylococcus aureus Enterotoxins, Toxins, 2, 1751-1773.
Askarian F., Ajayi C., Hanssen A.-M., van Sorge N.M., Pettersen I., Diep D.B., Sollid J.U.E. and Johannessen M., 2016, The interaction between Staphylococcus aureus SdrD and desmoglein 1 is important for adhesion to host cells, Scientific Reports, 6, 22134. DOI: 10.1038/srep22134.
Athanasopoulos A.N., Ecnomopoulou M., Orlova V.V., Sobke A., Schneider D., Weber H., Augustin H.G., Eming S.A., Schubert U., Linn T., Nawroth P.P., Hussain M., Hammes H.P., Herrmann M., Preissner K.T., Chavakis T., 2006, The extracellular adherence protein (Eap) of Staphylococcus aureus inhibits wound heating by interfering with host defense and repair mechanisms, Blood, 107, 2720–7.
Bae I.G., Tonthat G.T., Stryjewski M.E., Rude T.H., Reilly L.F., Barriere S.L., Genter F.C., Corey G.R., Fowler V.G. Jr., 2009, Presence of genes encoding the panton-valentine leucocidin exotoxin is not the primary determinant of outcome in patients with complicated skin and skin structure infections due to methicillin-resistant Staphylococcus aureus: Results of a multinational trial, J. Clin. Microbiol., 47, 3952-3957.
Balaban N., Rasooly A., 2000, Staphylococcal enterotoxins, Intl. J. Food Microbiol., 61, 1–10.
Barbu E.M., Ganesh V.K., Gurusiddappa S., Mackenzie R.C., Foster T.J., Sudhof T.C. and Hook M., 2010, beta-Neurexin is a ligand for the Staphylococcus aureus MSCRAMM SdrC, PLoS Pathog., 6, e1000726.
Baum C., Haslinger-Loffler B., Westh H., Boye K., Peters G., Neumann C. and Kahl B.C., 2009, Non-spa-Typeable Clinical Staphylococcus aureus Strains Are Naturally Occurring Protein A Mutants, J. Clin. Microbiol., 47(11), 3624–3629.
Bera A., Herbert S., Jakob A., Vollmer W., Gotz F., 2005, Why are pathogenic staphylococci so lysozyme resistant? The peptidoglycan O-acetyltransferase OatA is the major determinant for lysozyme resistance of Staphylococcus aureus, Mol. Microbiol., 55, 778–787.
Berends E.T., Horswill A.R., Haste N.M., Monestier M., Nizet V. and von Kockritz-Blickwede M., 2010, Nuclease expression by Staphylococcus aureus facilitates escape from neutrophil extracellular traps, J. Innate Immun., 2, 576-586.
Bergdoll M.S., Chu F.S., Borja C.R., Huang I.-Y., and Weiss K.F., 1967, The Staphylococcal Enterotoxins, Japan. J. Microbiol., 11 (4), 358-368.
Bergdoll M.S., Crass B.A., Reiser R.F., Robbins R.N., Davis J.P., 1981, A new staphylococcal enterotoxin, enterotoxin F, associated with toxic-shock-syndrome Staphylococcus aureus isolates, Lancet, 1(8228), 1017-1021.
Bjerketorp J., Nilsson M., Ljungh A., Flock J.I., Jacobsson K. and Frykberg L., 2002, A novel von Willebrand factor binding protein expressed by Staphylococcus aureus, Microbiology, 148, 2037-2044.
Blaiotta G., Ercolini D., Pennacchia C., Fusco V., Casaburi A., Pepe O., Villani F., 2004, PCR detection of staphylococcal enterotoxin genes in Staphylococcus spp. Strains isolated from meat and dairy products. Evidence for new variants of seG and seI in S. aureus AB – 8802, J. Applied Microbiol., 97, 719–730.
Bokarewa M.I., Jin T., Tarkowski A., 2006, Staphylococcus aureus: staphylokinase, Int. J. Biochem. Cell Biol., 38, 504–9.
Bondi J.A. and Dietz C.C., 1945, Penicillin resistant staphylococci, Proc. Royal Soc. Exper. Biol. Med., 60, 55–58.
Bongiorno D., Campanile F., Mongelli G., Baldi M.T., Provenzani R., Reali S., Lo Russo C., Santagati M., Stefani S., 2010, DNA methylase modifications and other linezolid resistance mutations in coagulase-negative staphylococci in Italy, J. Antimicrob. Chemother., 65, 2336-2340.
Bose J.L., Daly S.M., Hall P.R. and Bayles K.W., 2014, Identification of the Staphylococcus aureus vfrAB Operon, a Novel Virulence Factor Regulatory Locus, Infect. Immun., 82, 1813. DOI: 10.1128/IAI.01655-13.
Brakstad O.G., Aasbakk K. and Maeland J.A., 1992, Detection of Staphylococcus aureus by Polymerase Chain Reaction Amplification of the nuc Gene, J. Clin. Microbiol., 30, 1654-1660.
Brickner S.J., 1996, "Oxazolidinone antibacterial agents", Curr. Pharmaceut. Design, 2, 175–194.
Bukowski M., Wladyka B. and Dubin G., 2010, Exfoliative Toxins of Staphylococcus aureus, Toxins, 2, 1148-1165.
Buiuc D., Neguț M., Codiță I., 2008, Identificarea stafilococilor, Tratat de microbiologie clinică, Editura Medicală București, 562-583.
Cai J.C., Hu Y.Y., Zhang R., Zhou H.W., Chen G.X., 2012, Linezolid-resistant clinical isolates of meticillin-resistant coagulase-negative staphylococci and Enterococcus faecium from China, J. Med. Microbiol., 61, 1568-1573.
Cai J.C., Hu Y.Y., Zhou H.W., Chen G.-X., Zhang R., 2015, Dissemination of the Same cfr-Carrying Plasmid among Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus and Coagulase-Negative Staphylococcal Isolates in China, Antimicrob. Agents Chemother., 59, 3669-3671.
Caiazza N.C. and O’Toole A.G., 2003, Alpha-toxin is required for biofilm formation by Staphylococcus aureus, J. Bacteriol., 185, 3214-3217.
Campanile F., Mongelli G., Bongiorno D., Adembri C., Ballardini M., Falcone M., Menichetti F., Repetto A., Sabia C., Sartor A., Scarparo C., Tascini C., Venditti M., Zoppi F., Stefani S., 2013, Worrisome Trend of New Multiple Mechanisms of Linezolid Resistance in Staphylococcal Clones Diffused in Italy, J. Clin. Microbiol., 51, 1256–1259.
Campoccia D., Speziale P., Ravaioli S., Cangini I., Rindi S., Pirini V., Montanaro L. and Arciola C.R., 2009, The presence of both bone sialoprotein-binding protein gene and collagen adhesin gene as a typical virulence trait of the major epidemic cluster in isolates from orthopedic implant infections, Biomaterials, 30, 6621-6628.
Carroll K.C., 2008, Rapid diagnostics for methicillin-resistant Staphylococcus aureus: current status, Mol. Diagn. Ther., 12(1), 15-24.
Chamberlain N.R. and Imanoel B., 1996, Genetic regulation of fatty acid modifying enzyme from Staphylococcus aureus, J. Med. Microbiol., 44, 125-129.
Chamon R.C., Iorio N.L., Cavalcante F.S., Teodoro C.R., de Oliveira A.P., Maia F., dos Santos K.R., 2014, Linezolid-resistant Staphylococcus haemolyticus and Staphylococcus hominis: single and double mutations at the domain V of 23S rRNA among isolates from a Rio de Janeiro hospital, Diagn. Microbiol. Infect. Dis., 80(4), 307-310. doi: 10.1016/j.diagmicrobio.2014.09.011.
Chavakis T., Preissner K.T., Herrmann M., 2007, The anti-inflammatory activities of Staphylococcus aureus, Trends Immunol., 28, 408–418.
Chen H., Wu W., Ni M., Liu Y., Zhang J., Xia F., He W., Wang Q., Wang Z., Cao B., Wang H., 2013, Linezolid-resistant clinical isolates of enterococci and Staphylococcus cohnii from a multicentre study in China: molecular epidemiology and resistance mechanisms, Int. J. Antimicrob. Agents, 42, 317-321.
Chen Y., Liu Z., Duo L., Xiong J., Gong Y., Yang J., Wang Z., Wu X., Lu Z., Meng X., Zhao J., Zhang C., Wang F., Zhang Y., Zhang M., Han L., 2014, Characterization of Staphylococcus aureus from Distinct Geographic Locations in China: An Increasing Prevalence of spa-t030 and SCCmec Type III, PLoS ONE, 9(4), e96255. doi:10.1371/journal.pone.0096255.
Cheng A.G., Kim H.K., Burts M.L., Krausz T., Schneewind O. and Missiakas D.M., 2009, Genetic requirements for Staphylococcus aureus abscess formation and persistence in host tissues, FASEB J., 23, 3393-3404.
Cheung A.L., Projan S.J. and Gresham H., 2002, The genomic aspect of virulence, sepsis and resistance to killing mechanism in Staphylococcus aureus, Curr. Infect. Dis. Rep., 4, 400-410.
Choorit W., Kaneko J., Muramoto K. and Kamio Y., 1995, Existence of a new protein component with the same function as the LukF component of leukocidin or gamma-hemolysin and its gene in Staphylococcus aureus P83, FEBS Lett., 357, 260-264.
Cidral T.A., Carvalho M.C., Figueiredo A.M.S., Melo M.C.N., 2015, Emergence of methicillin-resistant coagulase-negative staphylococci resistant to linezolid with rRNA gene C2190T and G2603T mutations, APMIS, 123(10), 867–871. DOI:10.1111/apm.12426.
Cimolai N., 2008, "MRSA and the environment: implications for comprehensive control measures", Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis., 27, 481–93. doi:10.1007/s10096-008-0471-0.
Cîrlan M., Saad M., Coman G., Bilal N.E., Elbashier A.M., Kreft D., Snijders S., van Leeuwen W., van Belkum A., 2005, International spread of major clones of methicillin resistant Staphylococcus aureus: nosocomial endemicity of multi locus sequence type 239 in Saudi Arabia and Romania, Infection, Genetics and Evolution, 5, 335-339.
Clarke S.R., Harris L.G., Richards R.G., Foster S.J., 2002, Analysis of Ebh, a 1.1-Megadalton Cell Wall-Associated Fibronectin-Binding Protein of Staphylococcus aureus, Infect. Immun., 70(12), 6680–6687.
Clarke S.R., Foster S.J., 2006, Surface adhesins of Staphylococcus aureus, Adv. Microb. Physiol., 51, 51.
Codiță I., 1985, Enterotoxinele stafilococice, Bacteriol. Virusol. Parazitol. Epidemiol., 3, 233-240.
Codiță I., Oprea M., Szmal C., Drăgulescu E.C., Trașcă M., Brehar Cioflec D., Chicin G., Șerban R., Pistol A., Panton-Valentine leukocidin positive, t008 spa-type meticillin-resistant Staphylococcus aureus in a Romanian western county hospital, 18th European Congress of Clinical Microbiology and Infections Diseases, 19-22 april 2008, Barcelona, Spain – publication only.
Codiță I., Drăgulescu E.C., Dinu S., Lixandru B.E., Șerban R.I., t127 spa type MDR MRSA strains isolated in 2010/2011 from pediatric and new born units in Bucharest, 7th Conference of the Romanian Association of Medical Laboratories with international participation, 10 – 12th May 2012, Brașov, România, Romanian Review of Laboratory Medicine, 21(2/4), May 2011 (abstract) – oral presentation.
Cole A.M., Tahk S., Oren A., Yoshioka D., Kim Y.H., Park A., Ganz T., 2001, "Determinants of Staphylococcus aureus nasal carriage", Clin. Diagn. Lab. Immunol., 8, 1064–9. doi:10.1128/CDLI.8.6.1064-1069.2001.
Coman G., Cîrlan M., Petraru E., Dahorea C., Butnaru F., 2002, Antibiotic resistance phenotypes of S. aureus from pediatric infections, Rev. Medico-Chirurgicala, 106, 46-52.
Cosgrove K., Coutts G., Jonsson I.M., Tarkowski A., Kokai-Kun J.F., Mond J.J., and Foster S.J., 2007, Catalase (KatA) and Alkyl Hydroperoxide Reductase (AhpC) Have Compensatory Roles in Peroxide Stress Resistance and Are Required for Survival, Persistence, and Nasal Colonization in Staphylococcus aureus, J. Bacteriol., 189, 1025-1035.
Cribier B., Prevost G., Couppie P., Finck-Barbancon V., Grosshans E., Piemont Y., 1992, Staphylococcus aureus leukocidin: a new virulence factor in cutaneous infections? An epidemiological and experimental study, Dermatology, 185, 175-80.
Cucarella C., Solano C., Valle J., Amorena B., Lasa I., and Penades J., 2001, Bap, a Staphylococcus aureus Surface Protein Involved in Biofilm Formation, J. Bacteriol., 183(9), 2888-2896.
Dabul A.N., Camargo I.L., 2014, Molecular characterization of methicillin-resistant Staphylococcus aureus resistant to tigecycline and daptomycin isolated in a hospital in Brazil, Epidemiol. Infect., 142(3), 479-483. doi: 10.1017/S0950268813001325.
David M.Z., Daum R.S., 2010, Community-associated methicillin-resistant Staphylococcus aureus: epidemiology and clinical consequences of an emerging epidemic, Clin. Microbiol. Rev., 23, 616–687.
DeLeo F.R., Diep B.A. and Otto M., 2009, Host defense and pathogenesis in Staphylococcus aureus infections, Infect. Dis. Clin. North A., 23, 17-34.
Diep B.A., Gill S.R., Chang R.F., Phan T.H., Chen J.H., Davidson M.G., Lin F., Lin J., Carleton H.A., Mongodin E.F., Sensabaugh G.F., Perdreau-Remington F., 2006, Complete genome sequence of USA300, an epidemic clone of community-acquired meticillin-resistant Staphylococcus aureus, Lancet, 367(9512), 731-9.
Diep B.A., Carleton H.A., Chang R.F., Sensabaugh G.F., Perdreau-Remington F., 2006, Roles of 34 virulence genes in the evolution of hospital- and community-associated strains of methicillin-resistant Staphylococcus aureus, J. Infect. Dis., 193(11), 1495-1503.
Diep B.A., Chambers H.F., Graber C.J., Szumowski J.D., Miller L.G., Han L.L., Chen J.H., Lin F., Lin J., Phan T.H., Carleton H.A., McDougal L.K., Tenover F.C., Cohen D.E., Mayer K.H., Sensabaugh G.F., Perdreau-Remington F., 2008, "Emergence of multidrug-resistant, community-associated, methicillin-resistant Staphylococcus aureus clone USA300 in men who have sex with men", Ann. Intern. Med., 148, 249–57.
Diep B.A., Stone G.G., Basuino Li, Grabber Ch.J., Miller A., Shelley-Ann des Etages, Jones A., Palazzolo-Balance A.M., Perdreau-Remington F., Sensabaugh G.F., Deleo F.R., and Chambers H.F., 2008, The Arginine Catabolic Mobile Element and Staphylococcal Chromosomal Cassette mec Linkage: Convergence of Virulence and Resistance in the USA300 Clone of Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus, J. Infect. Dis., 197, 1523-1530.
Dinges M.M., Orwin P.M., Schlievert P.M., 2000, Enterotoxins of Staphylococcus aureus, Clin. Microbiol. Rev., 13, 16–34.
Dorobăț O.M., Bădicuț I., Tălăpan D., Tenea C., Rafila A., 2010, Antibiotic resistance of Gram-positive cocci isolated in 2008, Bacteriol. Virusol. Parazitol. Epidemiol., 55, 83-92.
Dorneanu O., Miftode E., Vremeră T., Năstase E., Filip O., Luca V., 2006, Prevalence and characteristics of Staphylococcus aureus isolated from infections in Northeast Romania, J. Prev. Med., 14, 66-70.
Drăgulescu E.C., Oprea M., Străuț M., Codiță I., 2007, Detectarea rapidă a tulpinilor de Staphylococcus aureus comunitar meticilino-rezistent folosind tehnica PCR multiplex, A XI-a Reuniune Anuală de Microbiologie, 24-26 mai, Mamaia, România – poster.
Drugeon H.B., 2006, β-lactamines et Staphylocoques, Antibiogramme, 2-eme Edition, ESKA, 117-124.
Dryden M.S., 2009, Skin and soft tissue infection: microbiology and epidemiology, Int. J. Antimicrob. Agents, 34(1), S2, S7.
DuMont A.L., Nygaard T.K., Watkins R.L., Smith A., Kozhaya L., Kreiswirth B.N., Shopsin B., Unutmaz D., Voyich J.M., Torres V.J., 2011, Characterization of a new cytotoxin that contributes to Staphylococcus aureus pathogenesis, Mol. Microbiol., 79, 814–25.
Edwards A.M., Bowden M.G., Brown E.L., Laabei M., Massey R.C., 2012, Staphylococcus aureus extracellular adherence protein triggers TNF alpha release, promoting attachment to endothelial cells via protein A, PLoS ONE, 7, 8.
European Centre for Disease Prevention and Control. Antimicrobial resistance surveillance in Europe 2014. Annual report of the European Antimicrobial Resistance Surveillance Network (EARS-Net). ECDC website. Available at http://ecdc.europa.eu/en/publications/Publications/antimicrobial-resistance-europe-2014.pdf.
Faria N.A., Oliveira D.C., Westh H., Monnet D.L., Larsen A.R., Skov R., de Lencastre H., 2005, Epidemiology of emerging methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) in Denmark: a nationwide study in a country with low prevalence of MRSA infection, J. Clin. Microbiol., 43, 1836-1842.
Fedtke I., Gotz F and Peschel A., 2004, Bacterial evasion of innate host defenses – the Staphylococcus aureus lesson, Int. J. Med. Microbiol., 294, 189-194.
Flamm R.K., Mendes R.E., Ross J.E., Sader H.S., Jones R.N., 2013, An international activity and spectrum analysis of linezolid: ZAAPS Program results for 2011, Diagn. Microbiol. Infect. Dis., 76, 206-213.
Florescu I., Beuran M., Dimov R., Razbadauskas A., Bochan M., Fichev G., Dukart G., Babinchak T., Cooper C.A., Ellis-Grosse E.J., Dartois N., Gandjini H. on behalf of the 307 study group, 2008, Efficacy and safety of tigecycline compared with vancomycin or linezolid for treatment of serious infections with methicillin-resistant Staphylococcus aureus or vancomycin-resistant enterococci: a Phase 3, multicentre, double-blind, randomized study, J. Antimicrob. Chemother., 62Suppl.1, i17-i28.
Fluit AC., 2012, Livestock-associated Staphylococcus aureus, Clin. Microbiol. Infect., 18, 735–44.
Foster TJ., 2004, The Staphylococcus aureus ''superbug'', J. Clin. Invest., 114, 1693–1696. doi:10.1172/JCI200423825.
Foster TJ., 2005, Immune evasion by Staphylococci, Nat. Rev. Microbiol., 3, 948–958.
Fournier B., Philpott D.J., 2005, Recognition of Staphylococcus aureus by the Innate Immune System, Clin. Microbiol. Rev., 18, 521–540.
Franco A., Hasman H., Iurescia M., Lorenzetti R., Stegger M., Pantosti A., Feltrin F., Ianzano A., Porrero M.C., Liapi M. and Battisti A., 2011, Molecular characterization of spa type t127, sequence type 1 methicillin-resistant Staphylococcus aureus from pigs, J. Antimicrob. Chemother., 66, 1231-1235.
Ganesh V.K., Barbu E.M., Deivanayagam Ch. C.S., Le B., Anderson A.S., Matsuka Y.V., Lin Sh.L., Foster T.J., Narayana S.V.L. and Hook M., 2011, Structural and biochemical characterization of Staphylococcus aureus clumping factor B: ligand interaction, J. Biol. Chem., 286, 25963-25972.
Geoghegan J.A., Corrigan R.M., Gruszka D.T., Speziale P., O’Gara J.P., Potts J.R., Foster T.J., 2010, Role of surface protein SasG in biofilm formation by Staphylococcus aureus, J. Bacteriol., 192.
Del Giudice P., Blanc V., Durupt F., Bes M., Martinez J.P., Counillon E., Lina G., Vandenesch F., Etienne J., 2006, Emergence of two populations of methicillin-resistant Staphylococcus aureus with distinct epidemiological, clinical and biological features, isolated from patients with community-acquired skin infections, Br. J. Dermatol., 154, 118-124.
Goetghebeur M., Landry P.A., Han D., Vicente C., 2007, Methicillin-resistant Staphylococcus aureus: A public health issue with economic consequences, Can. J. Infect. Dis. Med. Microbiol., 18, 27-34.
Gordon M.K., Hahn R.A., 2010, Collagens, Cell Tissue Res., 339, 247-256.
Gordon R.J. and Lowy F.D., 2008, Presence of methicillin resistant Staphylococcus aureus in hospitals, J. Clin. Infect. Dis., 46, 350-359.
Gorter A., Hiemstra P., Leijh P., van der Sluys M., van der Barselaar M., van Es L.A., Daha M.R., 1987, IgA and secretory IgA-opsonized Staphylococcus aureus induce a respiratory burst and phagocytosis by polymorphonuclear leucocytes, Immunology, 61, 303-309.
Gram-Positive Cocci. Part I: Staphylococci and Related Gram-Positive Cocci. In: Washington C. Winn. Jr. et al., Koneman’s Color Atlas and Textbook of Diagnostic Microbiology, 6th edition, 2006, Lippincott Williams & Wilkins, U.S.A.
Grau S., Aguado J.M., Mateu-De Antonio J., Gonzales P., Del Castillo A., 2007, Economic evaluation of linezolid versus teicoplanin for the treatment of infections caused by gram-positive microorganisms in Spain, J. Chemother., 19, 398–409.
Gravet A., Colin D.A., Keller D., Girardot R., Monteil H. and Prevost G., 1998, Characterization of a novel structural member, LukE-LukD, of the bi-component staphylococcal leucotoxins family, FEBS Lett., 436, 202-208.
Grigore L., Dumitrescu V., Sfartz S., Codiță I., 1997, The antibiotic resistance of Staphylococcus aureus strains isolated in units with an elevated nosocomial risk and in outpatient facilities in 1995, Bacteriol. Virusol. Parazitol. Epidemiol., 42, 51-54.
Grundmann H., Aanensen D.M., van den Wijngaard C.C., Spratt B.G., Harmsen D., Friedrich A.W., the european staphylococcal reference laboratory working group, 2010, Geographic Distribution of Staphylococcus aureus Causing Invasive Infections in Europe: A Molecular-Epidemiological Analysis, PLoS Med., 7(1), e1000215. doi:10.1371/journal.pmed.1000215.
Grundmann H., Schouls L.M., Aanensen D.M., Pluister G.N., Tami A., Chlebowicz M., Glasner C., Sabat A.J., Weist K., Heuer O., Friedrich A.W., on behalf of the ESCMID Study Group on Molecular Epidemiological Markers and the European Staphylococcal Reference Laboratory Working Group, 2014, The dynamic changes of dominant clones of Staphylococcus aureus causing bloodstream infections in the European region: Results of a second structured survey, Euro Surveill., 19(49), 20987.
Gu B., Kelesidis T., Tsiodras S., Hindler J. and Humphries R.M., 2013, The emerging problem of linezolid-resistant Staphylococcus, J. Antimicrob. Chemother., 68, 4–11.
Guidance on the diagnosis and management of PVL-associated Staphylococcus aureus infections (PVL-SA) in England. Report prepared by the PVL sub-group of the Steering Group on Healthcare Associated Infection.
Haggar A., Hussain M., Lonnies H., Herrmann M., Norrby-Teglund A. and Flock J.I., 2003, Extracellular adherence protein from Staphylococcus aureus enhances internalization into eukaryotic cells, Infect. and immun., 71, 2310-2317.
Haggar A., Ehrnfelt C., Holgersson J., Flock J.I., 2004, The extracellular adherence protein from Staphylococcus aureus inhibits neutrophil binding to endothelial cells, Infect. Immun., 72, 6164–7.
Haim M., Trost A., Maier C.J., G. Achatz G., Feichtner S., Hintner H., Bauer J.W., and Onder K., 2010, Cytokeratin 8 interacts with clumping factor B: a new possible virulence factor target, Microbiology, 156, 3710-3721.
Hammel M., Sfyroera G., Pyrpassopoulos S., Ricklin D., Ramyar K.X., Pop M., Jin Z., Lambris J.D. and Geisbrecht B.V., 2007a, Characterization of Ehp, a secreted complement inhibitory protein from Staphylococcus aureus, J. Biol. Chem., 282, 30051-30061.
Hammel M., Sfyroera G., Ricklin D., Magotti P., Lambris J.D. and Geisbrecht B.V., 2007b, A structural basis for complement inhibition by Staphylococcus aureus, Nat. Immunol., 8, 430-437.
Harmsen D., Claus H., Witte W., Rothgänger J., Claus H., Turnwald D., Vogel U., 2003, Typing of methicillin-resistant Staphylococcus aureus in a university hospital setting using a novel software for spa-repeat determination and database management, J. Clin. Microbiol., 41, 5442–5448.
Harraghy N., Hussain M., Haggar A., Chavakis T., Sinha B., Herrmann M., Flock J.I., 2003, The adhesive and immunomodulating properties of the multifunctional Staphylococcus aureus protein Eap, Microbiol.-SGM., 149, 2701–7.
Harris L.G., Foster S.J., and Richards R.G., 2002, An introduction to Staphylococcus aureus, and techniques for identifying and quantifying S. aureus adhesins in relation to adhesion to biomaterials: review, European Cells and Materials, 4, 39-60.
Hasman H., Moodley A., Guardabassi L., Stegger M., Skov R.L., Aarestrup F.M., 2010, Spa type distribution in Staphylococcus aureus originating from pigs, cattle and poultry, Vet. Microbiol., 141, 326–31.
Haupt K., van den Elsen M.J., Burman J., Halbich S., Richter J., Skerka C. and Zipfel P.F., 2008, The Staphylococcus aureus protein Sbi acts as a complement inhibitor and forms a tripartite complex with host complement factor H and C3b, PLoS Pathog., 4, e1000250.
Heilmann C., Hartleib J., Hussain M.S. and Peters G., 2005, The multifunctional Staphylococcus aureus autolysin aaa mediates adherence to immobilized fibrinogen and fibronectin, Infection and immunity, 73, 4793-4802.
Herron-Olson L., Fitzgerald J.R., Musser J.M. and Kapur V., 2007, Molecular correlates of host specialization in Staphylococcus aureus, PLoS One, 2, e1120.
Heumann D., Barras C., Severin A., Glauser M.P., Tomasz A., 1994, Gram-positive cells walls stimulate synthesis of tumor necrosis factor alpha and interleukin-6 by human monocytes, Infect. Immun., 62, 2715-2721.
Hiramatsu K., Cui L., Kuroda M., Ito T., 2001, The emergence and evolution of methicillin resistant Staphylococcus aureus, Trends Microbiol., 9, 493-496.
Hirschhausen N., Schlesier T., Schmidt M.A., Gotz F., Peters G. and Heilmann C., 2010, A novel staphylococcal internalization mechanism involves the major autolysin Atl and heat shock cognate protein Hsc70 as host cell receptor, Cell Microbiol., 12, 1746-1764.
Ho P.L., Cheung C., Mak G.C., Tse C.W., Ng T.K., Cheung C.H., Que T.L., Lam R., Lai R.W., Yung R.W., Yuen K.Y., 2007, Molecular epidemiology and household transmission of community-associated methicillin-resistant Staphylococcus aureus in Hong Kong, Diagn. Microbiol. Infect. Dis., 57(2), 145-151.
Holmes A., Ganner M., McGuane S., Pitt T.L., Cookson B.D. and Kearns A.M., 2005, Staphylococcus aureus isolates carrying Panton-Valentine leucocidin genes in England and Wales: frequency, characterization, and association with clinical disease, J. Clin. Microbiol., 43, 2384-2390.
Holzel C.S., Harms K.S., Schwaiger K., Bauer J., 2010, Resistance to linezolid in a porcine Clostridium perfringens strain carrying a mutation in the rplD gene encoding the ribosomal protein L4, Antimicrob. Agents Chemother., 54, 1351-1353.
Hong T., Li X., Wang J., Sloan C., Cicogna C., 2007, Sequential linezolid-resistant Staphylococcus epidermidis isolates with G2576T mutation, J. Clin. Microbiol., 45, 3277–3280.
Hope R., Mushtaq S., James D., Pllana T., Warner M. and Livermore D.M. on behalf of the tigecycline susceptibility testing group, 2010, Tigecycline activity: low resistance rates but problematic disc breakpoints revealed by a multicentre sentinel survey in the UK, J. Antimicrob. Chemother., 65, 2602–2609. doi:10.1093/jac/dkq370.
Houston P., Rowe S.E., Pozzi C., Waters E.M. and O’Gara J.P., 2011, Essential role for the major autolysin in the fibronectin-binding protein-mediated Staphylococcus aureus biofilm phenotype, Infect. and Immun., 79, 1153-1165.
Hsu L.Y., Tristan A., Koh T.H., Bes M., Etienne J., Kurup A., Thuan-Tong T, Tan-Hock T., 2005, Community associated methicillin-resistant Staphylococcus aureus, Singapore, Emerg. Infect. Dis., 11, 341-342.
Huang Y., Xu Y., Liu G., Mei Y., Xia W., Xu T., Gu B., Pan S., 2014, Emergence of linezolid resistance in a clinical Staphylococcus capitis isolate from Jiangsu Province of China in 2012, J. Thorac. Dis., 6, E48-E53.
Humphreys H., 2007, National guidelines for the control and prevention of methicillin-resistant Staphylococcus aureus— what do they tell us?, Clin. Microbiol. Infect., 13(9), 846-853.
Ibberson C.B., Jones C.L., Singh Sh., Wise M.C., Hart M.E., Zurawski D.V., Horswilla A.R., 2014, Staphylococcus aureus Hyaluronidase Is a CodY-Regulated Virulence Factor, Infect. and Immun., 82, 4253-4264.
Imamura T., Tanase S., Szmyd G., Kozik A., Travis J. and Potempa J., 2005, Induction of vascular leakage through release of bradykinin and a novel kinin by cysteine proteinases from Staphylococcus aureus, J. Exp. Med., 201, 1669-1676.
International Working Group on the Classification of Staphylococcal Cassette Chromosome Elements (IWG-SCC), 2009, Classification of Staphylococcal Cassette Chromosome mec (SCCmec): Guidelines for Reporting Novel SCCmec Elements, Antimicrob. Agents Chemother., 53, 4961-4967.
Ionescu R., Mediavilla J.R., Chen L., Grigorescu D.O., Idomir M., Kreiswirth B.N., and Roberts R.B., 2010, Molecular Characterization and Antibiotic Susceptibility of Staphylococcus aureus from a Multidisciplinary Hospital in Romania, MICROBIAL DRUG RESISTANCE, 16(4), 263-272.
Ionescu B., Ionescu D., Gheorghe I., Curuțiu C., Banu O., Bleotu C., Mihăescu G., Lazăr V., Grigore R., Bezirtzoglou E., Berteșteanu Ș., 2015, Virulence patterns of Staphylococcus aureus hospital strains isolated in Bucharest, Romania, Romanian Biotechnological Letters, 20(3), 10536-10546.
Ippolito G., Leone S., Lauria F.N., Nicastri E., Wenzel R.P., 2010, Methicillin-resistant Staphylococcus aureus: the superbug, Int. J. Infect. Dis., 14(Suppl 4), S7-S11.
Ito T., Hiramatsu K., Tomasz A., de Lencastre H., Perreten V., Holden M.T.G., Coleman D.C., Goering R., Giffard Ph.M., Skov R.L., Zhang K., Westh H., O’Brien F., Tenover F.C., Oliveira D.C., Boyle-Vavra S., Laurent F., Kearns A.M., Kreiswirth B., Ko K.S., Grundmann H., Sollid J.E., John J.F.Jr., Daum R., Soderquist B., and Buistx G. on behalf of the International Working Group on the Classification of Staphylococcal Cassette Chromosome Elements (IWG-SCC), 2012, Guidelines for Reporting Novel mecA Gene Homologues, Antimicrob. Agents Chemother., 56, 4997– 4999.
Ito T., Ma X.X., Takeuchi F., Okuma K., Yuzawa H., Hiramatsu K., 2004, Novel type V staphylococcal cassette chromosome mec driven by a novel cassette chromosome recombinase ccrC, Antimicrob. Agents Chemother., 48, 2637-2651.
Janaki K.I. and Coggeshall K.M., 2011, Cutting Edge: Primary innate immune cells respond efficiently to polymeric peptidoglycan, but not to peptidoglycan monomers, J. Immunol., 186, 3841-3845.
Janeway C.A. Jr., 1992, The immune system evolved to discriminate infectious nonself from noninfectious self, Immunol. Today, 13, 11-16.
Johnson M., Cockayne A., Morrissey J.A., 2008, Iron-regulated biofilm formation in Staphylococcus aureus Newman requires ica and the secreted protein Emp, Infect. Immun., 76, 1756–65.
Johnson W., Tyler M.S., Ewan S.D., Ashton E.P., Polland F.E. and Rozee K.R., 1991, Detection of genes for enterotoxins, exofoliative toxins and toxic shock syndrome toxin 1 in Staphylococcus aureus by polymerase chain reaction, J. Clin. Microbiol., 29, 426–430.
Jones R.N., Fritsche T.R., Sader H.S., Ross J.E., 2007, LEADER surveillance program results for 2006: an activity and spectrum analysis of linezolid using clinical isolates from the United States (50 medical centers), Diagn. Microbiol. Infect. Dis., 59, 309-317.
Jones R.N., Ross J.E., Castanheira M., Mendes R.E., 2008, "United States resistance surveillance results for linezolid (LEADER Program for 2007)", Diagn. Microbiol. Infect. Dis., 62, 416–426.
Jones R.N., Kohno S., Ono Y., Ross J.E., Yanagihara K., 2009, ZAAPS International Surveillance Program (2007) for linezolid resistance: Results from 5591 Gram-positive clinical isolates in 23 countries, Diagn. Microbiol. Infect. Dis., 64, 191-201.
Kaltsas A., Guh A., Mediavilla J.R., Varshney A.K., Robiou N., Gialanellia P., Henry M., Levi M.H., Fries B.C., 2011, Frequency of panton-valentine leukocidin-producing methicillin-sensitive Staphylococcus strains in patients with complicated skin and soft tissue infection in bronx, New York, J. Clin. Microbiol., 49(8), 2992-2995. doi: 10.1128/JCM.00704-11 PMID: 21653777.
Kato F., Kadomoto N., Iwamoto Y., Bunai K., Komatsuzawa H., Sugai M., 2011, Regulatory mechanism for exfoliative toxin production in Staphylococcus aureus, Infect. Immun., 79, 1660–70.
Kehrenberg C., Aarestrup F.M., Schwarz S., 2007, IS21-558 insertion sequences are involved in the mobility of the multiresistance gene cfr, Antimicrob. Agents Chemother., 51, 483-487.
Kehrenberg C., Schwarz S., 2006, Distribution of florfenicol resistance genes fexA and cfr among chloramphenicol-resistant Staphylococcus isolates, Antimicrob. Agents Chemother., 50, 1156-1163.
Kehrenberg C., Schwarz S., Jacobsen L., Hansen L.H., Vester B., 2005, A new mechanism for chloramphenicol, florfenicol and clindamycin resistance: methylation of 23S ribosomal RNA at A2503, Mol. Microbiol., 57, 1064-1073.
Kessler C.M., Nussbaum E., Tuazon C.U., 1991, Disseminated intravascular coagulation associated with Staphylococcus aureus septicemia is mediated by peptidoglycan-induced platelet aggregation, J. Infect. Dis., 164, 101-7.
Khan S.A., Novick R.P., 1983, Complete nucleotide sequence of pT181, a tetracycline-resistance plasmid from Staphylococcus aureus, Plasmid, 10, 251-259.
Ki V., Rotstein C., 2008, Bacterial skin and soft tissue infections in adults: A review of their epidemiology, pathogenesis, diagnosis, treatment and site of care, Can. J. Infect. Dis. Med. Microbiol., 19, 173-184.
Kirby W.M.M., 1944, Extraction of a higly potent penicillin inactivator from penicillin resistant staphylococci, Science, 99, 452–453.
Kluytmans J., van Belkum A., Verbrugh H., 1997, "Nasal carriage of Staphylococcus aureus: epidemiology, underlying mechanisms, and associated risks", Clin. Microbiol. Rev., 10, 505–520.
Kneuper H., Cao Z.P., Twomey K.B., Zoltner M., Jager F., Cargill J.S., Chalmers J., van der Kool-Pol M.M., van Diji J.M., Ryan R.P., Hunter W.N., Palmer T., 2014, Heterogeneity in ess transcriptional organization and variable contribution of the Ess/ Type VII protein secretion system to virulence across closely related Staphylococcus aureus strains, Molec. Microbiol., 93, 928-943.
Kobayashi S.D., DeLeo F.R., 2009, An update on community-associated MRSA virulence, Curr. Opin. Pharmacol., 9, 545–551.
Kobayashi S.D., Malachowa N., DeLeo F.R., 2015, Pathogenesis of Staphylococcus aureus abscesses, Am. J. Pathol., 185, 1518-1527.
Koch T.K., Reuter M., Barthel D., Bohm S., van den Elsen J., Kraiczy P., Zipfel P.F., Skerka C., 2012, Staphylococcus aureus Proteins Sbi and Efb Recruit Human Plasmin to Degrade Complement C3 and C3b, PLoS ONE, 7, e47638.
Kock R., Becker K., Cookson B., van Gemert-Pijnen J.E., Harbarth S., Kluytmans J., Mielke M., Peters G., Skov R.L., Struelens M.J., Tacconelli E., Navarro T.A., Witte W., Friedrich A.W., 2010, Methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA): burden of disease and control challenges in Europe, Euro. Surveill., 15(41), 19688.
Korea Ch.G., Balsamo G., Pezzicoli A., Merakou Ch., Tavarini S., Bagnoli F., Serruto D., Unnikrishnana M., 2014, Staphylococcal Esx Proteins Modulate Apoptosis and Release of Intracellular Staphylococcus aureus during Infection in Epithelial Cells, Infect. Immun., 82(10), 4144–4153.
Kraus D. and Peschel A., 2008, Staphylococcus aureus evasion of innate antimicrobial defense, Future Microbiol., 3, 437-451.
Kraus D., Herbert S., Kristian S.A., Khosravi A., Nizet V., Gotz F., Peschel A., 2008, The GraRS regulatory system controls Staphylococcus aureus susceptibility to antimicrobial host defenses, BMC Microbiol., 8.
Kreienbuehl L., Charbonney E., and Eggimann Ph., 2011, Community-acquired necrotizing pneumonia due to methicillin-sensitive Staphylococcus aureus secreting Panton – Valentine leukocidin: a review of case reports, Annals of Intensive Care, 1, 52.
Kreis C.A., Raschke M.J., Rosslenbroich S.B., Tholema-Hans N., Löffler B. and Fuchs Th., 2013, Therapy of intracellular Staphylococcus aureus by tigecyclin, BMC Infect. Dis., 13, 267.
Krishna S., Miller L.S., 2012, Innate and adaptive immune responses against Staphylococcus aureus skin infections, Semin. Immunopathol., 34, 261–280.
Krishna S., Miller L.S., 2012, Host-pathogen interactions between the skin and Staphylococcus aureus, Curr. Opin. Microbiol., 15, 28-35.
Kupper T.S., Fuhlbrigge R.C., 2004, Immune surveillance in the skin: mechanisms and clinical consequences, Nat. Rev. Immunol., 4, 211–222.
Lacey K.A., Geoghegan J.A. and McLoughlin R.M., 2016, The Role of Staphylococcus aureus Virulence Factors in Skin Infection and Their Potential as Vaccine Antigens, Pathogens, 5, 22; doi:10.3390/pathogens5010022.
Ladhani Sh., 2003, Understanding the mechanism of action of the exfoliative toxins of Staphylococcus aureus, FEMS Immunol. Med. Microbiol., 39, 181-189.
Lange Ch., Abubakar I., Alffenaar J.W.C., Bothamley G., Caminero J.A., Carvalho A.C.C., Chang K.Ch., Codecasa L., Correia A., Crudu V., Davies P., Dedicoat M., Drobniewski F., Duarte R., Ehlers C., Erkens C., Goletti D., Gunther G., Ibraim E., Kampmann B., Kuksa L., de Lange W., van Leth F., van Lunzen J., Matteelli A., Menzies D., Monedero I., Richter E., Rusch-Gerdes S., Sandgren A., Scardigli A., Skrahina A., Tortoli E., Volchenkov G., Wagner D., van der Werf M.J., Williams Bh., Yew W.-W., Zellweger J.-P. and Cirillo D.M., for the TBNET, 2014, Management of patients with multidrugresistant/extensively drug-resistant tuberculosis in Europe: a TBNET consensus statement, Eur. Respir. J., 44, 23–63.
Laupland K.B., Ross T. and Gregson D.B., 2008, Staphylococcus aureus Bloodstream Infections: Risk Factors, Outcomes, and the Influence of Methicillin Resistance in Calgary, Canada, 2000–2006. JID, 198, 336 – 343.
Lee M.C., Rios A.M., Aten M.F., Mejias A., Cavuoti D., Mccracken G.H. jr., and Hardy R.D., 2004, Management and outcome of children with skin and soft tissue abscesses caused by community-acquired methicillin-resistant Staphylococcus aureus, Pediatr. Infect. Dis. J., 23, 123, 127.
Lee J.C., 1996, The prospects for developing a vaccine against Staphylococcus aureus, Trends Microbiol., 4, 162-6.
Leclercq R., 2002, Mechanisms of resistance to macrolides and lincosamides: nature of the resistance elements and their clinical implications, Clin. Infect. Dis., 15, 482-492.
van Leeuwen W.B., Roorda L., Hendriks W., Francois P., Schrenzel J., 2008, A nuc-deficient methicillin-resistant Staphylococcus aureus strain, FEMS Immunol. Med. Microbiol., 54, 157.
Li T., Yu X., Xie J., Xu Y., Shang Y., Liu Y., Huang X., Qin Z., Parsons C., Hu L., Salgado C., Wang L., Yu F., 2013, Carriage of virulence factors and molecular characteristics of Staphylococcus aureus isolates associated with bloodstream, and skin and soft tissue infections in children, Epidemiol. Infect., 1, 5.
Limbago B., Fosheim G.E., Schoonover V., Crane C.E., Nadle J., Petit S., Heltzel D., Ray S.M., Harrison L.H., Lynfield R., Dumyati G., Townes J.M., Schaffner W., Mu Y., Fridkin S.K., Active Bacterial Core surveillance MRSA Investigators, 2009, Characterization of methicillin-resistant Staphylococcus aureus isolates collected in 2005 and 2006 from patients with invasive disease: a population-based analysis, J. Clin. Microbiol., 47, 1344–1351.
Lina G., Piemont Y., Godail-Gamot F., Bes M., Peter M-O., Gauduchon V., Vandenesch F., and Etienne J., 1999, Involvement of Panton-Valentine Leukocidin–Producing Staphylococcus aureus in Primary Skin Infections and Pneumonia, Clin. Infect. Dis., 29, 1128–1132.
Lincopan N., De Almeida L.M., Elmor De Araújo M.R., Mamizuka E.M., 2009, Linezolid resistance in Staphylococcus epidermidis associated with a G2603T mutation in the 23S rRNA gene, Int. J. Antimicrob. Agents., 34, 281–282.
Lindberg E., Adlerberth I., Matricardi P., Bonanno C., Tripodi S., Panetta V., Hesselmar B., Saalman R., Aberg N. and Wold A.E., 2011, Effect of lifestyle factors on Staphylococcus aureus gut colonization in Swedish and Italian infants, Clin. Microbiol. Infect., 17, 1209-1215.
Liu G.Y., Essex A., Buchanan J.T., Datta V., Hoffman, H.M., Bastian J.F., Fierer J., and Nizet V., 2005, Staphylococcus aureus golden pigment impairs neutrophil killing and promotes virulence through its antioxidant activity, J. Exp. Med., 202, 209-215.
Loffler B., Hussain M., Grundmeier M., Bruck M., Holzinger D., Varga G., Roth J., Kahl B.C., Proctor R.A., Peters G., 2010, Staphylococcus aureus Panton-Valentine Leukocidin Is a Very Potent Cytotoxic Factor for Human Neutrophils, PLoS Pathog., 6(1), e1000715. doi:10.1371/journal.ppat.1000715.
Long K.S. and Vester B., 2012, Resistance to linezolid caused by modifications at its binding site on the ribosome, Antimicrob. Agents Chemother., 56, 603–612.
Long K.S., Poehlsgaard J., Kehrenberg C., Schwarz S. and Vester B., 2006, The Cfr rRNA methyltransferase confers resistance to phenicols, lincosamides, oxazolidinones, pleuromutilins, and streptogramin A antibiotics, Antimicrob. Agents Chemother., 50, 2500–2505.
Lowy F.D., 1998, Medical progress – Staphylococcus aureus infections, N. Engl. J. Med., 339, 520–32.
Lowy F.D., 2003, Antimicrobial resistance: the example of Staphylococcus aureus, J. Clin. Invest., 111, 1265-1273.
Ma Y., Xu Y., Yestrepsky B.D., Sorenson R.J., Chen M., Larsen S.D., Sun H., 2012, Novel Inhibitors of Staphylococcus aureus Virulence Gene Expression and Biofilm Formation, PLoS ONE, 7, e47255. doi:10.1371/journal.pone.0047255.
Mackenzie F.M., Bruce J., Struelens M.J., Goossens H., Mollison J., Gould I.M. and on behalf of the Arpac Steering Group, 2007, Antimicrobial drug use and infection control practices associated with the prevalence of methicillin-resistant Staphylococcus aureus in European hospitals, Clin. Microbiol. Infect., 13, 269–276.
Mackey-Lawrence N.M., Potter D.E., Cerca N. and Jefferson K.K., 2009, Staphylococcus aureus immunodominant surface antigen B is a cell-surface associated nucleic acid binding protein, BMC Microbiol., 9, 61.
Maeda T, Saga T., Miyazaki T, Kouyama Y., Harada S., Iwata M., Yoshizawa S., Kimura S., Ishii Y., Urita Y., Sugimoto M., Yamaguchi K., Tateda K., 2012, Genotyping of skin and soft tissue infection (SSTI)-associated methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) strains among outpatients in a teaching hospital in Japan: application of a phage-open reading frame typing (POT) kit, J. Infect. Chemother., 18(6), 906-914. doi: 10.1007/s10156-012-0506-4 PMID: 23150115.
Mahla R.S., 2013, "Sweeten PAMPs: Role of Sugar Complexed PAMPs in Innate Immunity and Vaccine Biology.", Front Immunol., 4, 248. doi:10.3389/fimmu.2013.00248.
Malachowa N., Kohler P.L. and Schlievert PM., 2011, Characterization of a Staphylococcus aureus surface virulence factor that promotes resistance to oxidative killing and infectious endocarditis, Infect. Immun., 79, 342-352.
Mann E.E., Rice K.C., Boles B.R. and other authors., 2009, Modulation of eDNA release and degradation affects Staphylococcus aureus biofilm maturation, PLoS One, 4, e5822.
Maree C.L., Daum R.S., Boyle-Vavra S., Matayoshi K., Miller L.G., 2007, "Community-associated methicillin-resistant Staphylococcus aureus isolates causing healthcare-associated infections", Emerging Infect. Dis., 13, 236–42.
Martineau F., Picard F.J., Lansac N., Menard C., Roy P.H., Ouellette M., and Bergeron M.G., 2000, Correlation between the resistance genotype determined by multiplex PCR assays and the antibiotic susceptibility patterns of Staphylococcus aureus and Staphylococcus epidermidis, Antimicrob. Agents Chemother., 44, 231–238.
Mazmanian S.K., Liu G., Ton-That H., Schneewind O., 1999, Staphylococcus aureus sortase, an enzyme that anchors surface proteins to the cell wall, Science, 285(5428), 760-763.
Mattsson E., Verhage L., Rollof J., Fleer A., Verhoef J., van Dijk H., 1993, Peptidoglycan and teichoic acid from Staphylococcus epidermidis stimulate human monocytes to release tumor necrosis factor-alpha, interleukin-1 beta and interleukin-6, FEMS Immunol. Med. Microbiol., 7, 281-287.
McAdow M., Missiakas D.M., Schneewind O., 2012, Staphylococcus aureus secretes coagulase and von Willebrand factor binding protein to modify the coagulation cascade and establish host infections, J. Innate Immun., 4, 141–8.
McCarthy A. and Lindsay J., 2010, Genetic variation in Staphylococcus aureus surface and immune evasion genes is lineage associated: implication for vaccine design and host-pathogen interactions, BMC Microbiol., 10, 173.
McCormick J.K., Tripp T.J., Llera A.S., Sundberg E.J., Dinges M.M., Mariuzza R.A., and Schlievert P.M., 2012, "Functional Analysis of the TCR Binding Domain of Toxic Shock Syndrome Toxin-1 Predicts Further Diversity in MHC Class II/Superantigen/TCR Ternary Complexes", J. Immunol., 171, 185-1392.
Mellmann A., Friedrich A.W., Rosenkötter N., Rothgänger J., Karch H., Reintjes R., Harmsen D., 2006, Automated DNA sequence-based early warning system for the detection of methicillin-resistant Staphylococcus aureus outbreaks, PLoS Med., 3, e33.
Mellmann A., Becker K., von Eiff Ch., Keckevoet U., Schumann P. and Harmsen D., 2006, Sequencing and Staphylococci Identification, Emerg. Infect. Dis., 12(2), 333-336.
Melter O., Radojevič B., 2010, Small colony variants of Staphylococcus aureus—review, Folia Microbiol. (Praha)., 55, 548-58.
Men S., Akhan O., Koroglu M., 2002, Percutaneous drainage of abdominal abcess, Eur. J. Radiol., 43, 204-218.
Mendes R.E., Deshpande L., Rodriguez-Noriega E., Ross J.E., Jones R.N. and Morfin-Otero R., 2010, First report of linezolid-resistant Staphylococcal clinical isolates in Mexico caused by cfr: evidence of in vivo cfr mobilization, J. Clin. Microbiol., 48, 3041–3043.
Mendes R.E., Deshpande L.M., Castanheira M., Dipersio J., Saubolle M.A. and Jones R.N., 2008, First Report of cfr-Mediated Resistance to Linezolid in Human Staphylococcal Clinical Isolates Recovered in the United States, Antimicrob. Agents Chemother., 52, 2244–2246.
Mendes R.E., Deshpande L.M., Farrell D.J., Spanu T., Fadda G., Jones R.N., 2010, Assessment of linezolid resistance mechanisms among Staphylococcus epidermidis causing bacteraemia in Rome, Italy, J. Antimicrob. Chemother., 65, 2329-2335.
Miajlovic H., Zapotoczna M., Geoghegan J.A., Kerrigan S.W., Speziale P. and Foster T.J., 2010, Direct interaction of iron-regulated surface determinant IsdB of Staphylococcus aureus with the GPIIb/IIIa receptor on platelets, Microbiology, 156, 920-928.
Mihăescu G., Chifiriuc M.C., Dițu L.M., 2007, Caracterizarea principalelor clase de antibiotice, Antibiotice și substanțe chimioterapeutice antimicrobiene, ….., Editura Academiei Române, 190-201.
Miller L.S., 2008, Toll-like receptors in skin, Adv. Dermatol., 24, 71-87.
Miller L.S., Cho J.S., 2011, Immunity against Staphylococcus aureus cutaneous infections, Nat. Rev. Immunol., 11, 505–518.
Milheirico C., Oliveira D.C., and de Lencastre H., 2007, Multiplex PCR strategy for subtyping the staphylococcal cassette chromosome mec type IV in methicillin-resistant Staphylococcus aureus: „SCCmec IV multiplex”, J. Antimicrob. Chemother., doi:10.1093/jac/dkm112.
Milheirico C., Oliveira D.C., and de Lencastre H., 2007, Update to the multiplex PCR strategy for assignment of mec element types in Staphylococcus aureus, Antimicrob. Agents Chemother., 51, 3374–3377.
Monecke S., Muller E., Dorneanu O.S., Vremeră T., Ehricht R., 2014, Molecular Typing of MRSA and of Clinical Staphylococcus aureus Isolates from Iași, România, PLoS ONE, 9(5), e97833.
Morales G., Picazo J.J., Baos E., Candel F.J., Arribi A., Pelaez B., Andrade R., De La Torre M.A., Fereres J. and Sanchez-Garcia M., 2010, Resistance to linezolid is mediated by the cfr gene in the first report of an outbreak of linezolid-resistant Staphylococcus aureus, Clin. Infect. Dis., 50, 821–825.
Moran G.J., Abrahamian F.M., LoVecchio F., Talan D.A., 2013, Acute bacterial skin infections: Developments since the 2005 infectious diseases society of America (idsa) guidelines, J. Emerg. Med., 44, e397-e412.
Moran G.J., Krishnadasan A., Gorwitz R.J., Fosheim G.E., McDougal L.K., Carey R.B., Talan D.A., 2006, Methicillin-resistant S. aureus infections among patients in the emergency department, N. Engl. J. Med., 355, 666-674.
Murchan S., Kaufmann M.E., Deplano A., de Ryck R., Struelens M., Elsberg Zinn Ch., Fussing V., Salmenlinna S., Vuopio Varkila J., El Solh N., Cuny Ch., Witte W., Tassios P.T., Legakis N., van Leeuwen W., van Belkum A., Vindel A., Laconcha I., Garaizar J., Haeggman S., Olsson-Liljequist B., Ransjo U., Coombes G., and Cookson B., 2002, Harmonization of Pulsed-Field Gel Electrophoresis Protocols for Epidemiological Typing of Strains of Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus: a Single Approach Developed by Consensus in 10 European Laboratories and Its Application for Tracing the Spread of Related Strains, J. Clin. Microbiol., 41, 1574–1585.
Mutnick A.H., Enne V., R.N. Jones R.N., 2003, Linezolid resistance since 2001: SENTRY antimicrobial surveillance program, Ann. Pharmacother., 37, 769-774.
Năstase E., Dorneanu O., Vremeră T., Logigan C., Miftode E., Dorobăț C.M., 2010, MecA and pvl genes detection in Staphylococcus aureus strains isolated from lower respiratory tract infections, Rev. Med. Chir. Soc. Med. Nat. Iași, 114, 1162-1168.
Nestle F.O., Di M.P., Qin J.Z., Nickoloff B.J., 2009, Skin immune sentinels in health and disease, Nat. Rev. Immunol., 9, 679–691.
Nica M., Biolan T., Dascălu A., Mozes E., Toderan A., Calistru P., Ceaușu E., 2010, Bacterial strains isolated from systemic infections and reported for evaluation and antibiotic resistance surveillance by the ‘‘Dr. Victor Babeș’’ Clinical Hospital for Infectious and Tropical Diseases, Bucharest, Bacteriol. Virusol. Parazitol. Epidemiol., 55, 161-168.
Nickerson N., Ip J., Passos D.T. and McGavin M.J., 2010, Comparison of Staphopain A (ScpA) and B (SspB) precursor activation mechanisms reveals unique secretion kinetics of proSspB (Staphopain B), and a different interaction with its cognate Staphostatin, SspC, Mol. Microbiol., 75, 161-177.
Nickerson N.N., Prasad L., Jacob L., Delbaere L.T. and McGavin M.J., 2007, Activation of the SspA serine protease zymogen of Staphylococcus aureus proceeds through unique variations of a trypsinogen-like mechanism and is dependent on both autocatalytic and metalloprotease specific processing, J. Biol. Chem., 282, 34129- 34138.
Nienaber J.J.C., Sharma Kuinkel B.K., Clarke-Pearson M., Lamlertthon S., Park L., Rude T.H., Barriere S., Woods C.W., Chu V.H., Marín M., Bukovski S., Garcia P., Corey G.R., Korman T., Doco-Lecompte T., Murdoch D.R., Reller L.B., Fowler V.G. Jr.; International Collaboration on Endocarditis-Microbiology Investigators, 2011, Methicillin susceptible Staphylococcus aureus endocarditis isolates are associated with clonal complex 30 genotype and a distinct repertoire of enterotoxin and adhesins, J. Infect. Dis., 204, 704-713.
O’Brien L.M., Walsh E.J., Massey R.C., Peacock S.J., and Foster T.J., 2002, Staphylococcus aureus clumping factor B (ClfB) promotes adherence to human type I cytokeratin 10: implications for nasal colonization, Cellular Microbiol., 4, 759–770.
O’Gara J.P., 2007, ica and beyond: biofilm mechanisms and regulation in Staphylococcus epidermidis and Staphylococcus aureus, FEMS Microbiol. Lett., 270, 179-188.
O’Riordan K., Lee J.C., 2004, Staphylococcus aureus capsular polysaccharides, Clin. Microbiol. Rev., 17, 218–234.
Ogura Y., Inohara N., Benito A., Chen F.F., Yamaoka S., Nunez G., 2001, Nod2, a Nod1/Apaf-1 family member that is restricted to monocytes and activates NF-kB, J. Biol. Chem., 276, 4812-4818.
Ogston A., 1984, "On Abscesses". Classics in Infectious Diseases", Rev. Infect. Dis., 6, 122–28. doi:10.1093/clinids/6.1.122.
Ohbayashi T., Irie A., Murakami Y., Nowak M., Potempa J., Nishimura Y., Shinohara M. and Imamura T., 2011, Degradation of fibrinogen and collagen by staphopains, cysteine proteases released from Staphylococcus aureus, Microbiology, 157, 786-792.
Oliveira D.C., Milheirico C., de Lencastre H., 2006, Redefining a Structural Variant of Staphylococcal Cassette Chromosome mec, SCCmec Type VI, Antimicrob. Agents Chemother., 50, 3457-3459.
Onogawa T., 2002, Staphylococcal alpha-toxin synergistically enhances inflammation caused by bacterial components, FEMS Immunol. Med. Microbiol., 33, 15-21.
Oprea M., Drăgulescu E.C., Coldea I.L., Codiță I., Szmal C., Străuț M., Molecular characterization of Staphylococcus aureus isolates belonging of to most prevalent spa-types recovered from Romanian hospitals during 2006-2007, 18th European Conference of Clinical Microbiology and Infectious Diseases, 19-22 April, 2008, Barcelona, Spain, P1436.
Palma M., Haggar A and Flock J-I., 1999, Adherence of Staphylococcus is enhanced by an endogenous secreted protein with broad binding activity, J. Bacteriol., 181, 2840-2845.
Pan E.S., Diep B.A., Charlebois E.D., Auerswald C., Carleton H.A., Sensabaugh G.F., Perdreau-Remington F., 2005, Population dynamics of nasal strains of methicillin- resistant Staphylococcus aureus—and their relation to community- associated disease activity, J. Infect. Dis., 192, 811-818.
Panton P. N., Came M.B., Valentine F.C.O. and Lond M.R.C.P., 1932, Staphylococcal toxin, Lancet, i, 506–508.
Pasztor L., Ziebandt A.K., Nega M. and other authors., 2010, Staphylococcal major autolysin (Atl) is involved in excretion of cytoplasmic proteins, J. Biol. Chem., 285, 36794-36803.
Patti J.M., Boles J.O. and Hook M., 1993, Identification and biochemical characterization of the ligand binding domain of the collagen adhesin from Staphylococcus aureus, Biochemistry, 32, 11428-11435.
Peacock S.J., de Silva I., and Lowy F.D., 2001, What determines nasal carriage of Staphylococcus aureus?, Trends Microbiol., 9, 605–610.
Peacock S.J., Moore C.E., Justice A., Kantzanou M., Story L., Mackie K., O'Neill G., Day N.P., 2002, Virulent combinations of adhesion and toxin genes in natural populations of Staphylococcus aureus, Infect. Immun., 70, 4987–96.
Pelz A., Wieland K.P., Putzbach K., Hentschel P., Albert K. and Gotz F., 2005, Structure and biosynthesis of staphyloxanthin from Staphylococcus aureus, J. Biol. Chem., 280, 32493-32498.
Perdelli F., Dallera M., Cristina M.L., Sartini M., Ottria G., Spagnolo A.M., Orlando P., 2008, A new microbiological problem in intensive care units: environmental contamination by MRSA with reduced susceptibility to glycopeptides, Int. J. Hyg. Environ. Health., 211, 213–218.
Perret M., Badiou C., Lina G., Burbaud S., Benito Y., Bes M., Cottin V., Couzon F., Juruj C., Dauwalder O., Goutagny N., Diep B.A., Vandenesch F., Henry T., 2012, Cross-talk between Staphylococcus aureus leukocidins-intoxicated macrophages and lung epithelial cells triggers chemokine secretion in an inflammasome-dependent manner, Cell Microbiol., 14, 1019–36.
Perry A.M., Ton-That H., Mazmanian S.K., and Olaf Schneewind O., 2002, Anchoring of Surface Proteins to the Cell Wall of Staphylococcus aureus III. LIPID II IS AN IN VIVO PEPTIDOGLYCAN SUBSTRATE FOR SORTASE-CATALYZED SURFACE PROTEIN ANCHORING, J. Biol. Chemistry, 277, 16241–16248.
Pillai S.K., Sakoulas G., Wennersten C., Eliopoulos G.M., Moellering R.C. jr., Ferraro M.J., Gold H.S., 2002, Linezolid resistance in Staphylococcus aureus: characterization and stability of resistant phenotype, J. Infect. Dis., 186, 1603-1607.
Pilpa R.M., Robson S.A., Villareal V.A., Wong M.L., Phillips M. and Clubb R.T., 2009, Functionally distinct NEAT (NEAr Transporter) domains within the Staphylococcus aureus IsdH/HarA protein extract heme from methemoglobin, J. Biol. Chem., 284, 1166-1176.
Pinho M.G., Filipe S.R., de Lencastre H., Tomasz A., 2001, Complementation of the essential peptidoglycan transpeptidase function of penicillin-binding protein 2 (PBP2) by the drug resistance protein PBP2a in Staphylococcus aureus, J. Bacteriol., 183, 6525-6531.
Pistella E., Campanile F., Bongiorno D., Stefani S., Di Nucci GD, Serra P. and Venditti M., 2004, Successful Treatment of Disseminated Cerebritis Complicating Methicillin-resistant Staphylococcus aureus Endocarditis Unresponsive to Vancomycin Therapy with Linezolid, Scandinavian J. Infect. Dis., 36, 222-225.
Popowicz G.M., Dubin G., Stec-Niemczyk J., Czarny A., Dubin A., Potempa J. and Holak T.A., 2006, Functional and structural characterization of Spl proteases from Staphylococcus aureus, J. Mol. Biol., 358, 270-279.
Postma B., Poppelier M.J., van Galen J.C., Prossnitz E.R., van Strijp J.A., de Haas C.J., van Kessel K.P., 2004, Chemotaxis inhibitory protein of Staphylococcus aureus binds specifically to the C5a and formylated peptide receptor, J. Immunol., 172, 6994-7001.
Potoski B.A., Adams J., Clarke L., Shutt K., Linden P.K., Baxter C., Pasculle A.W., Capitano B., Peleg A.Y., Szabo D., Paterson D.L., 2006, Epidemiological profile of linezolid-resistant coagulase-negative staphylococci, Clin. Infect. Dis., 43, 165–171.
Powers M.E., Wardenburg J.B., 2014, Igniting the Fire: Staphylococcus aureus Virulence Factors in the Pathogenesis of Sepsis, PLOS Pathogens, 10, e1003871.
Poyart C., 2006, Tetracyclines, Antibiogramme, 2-eme Edition, ESKA, 325-333.
Prevost G., Cribier B., Couppie P., Petiau P., Supersac G., Finck-Barbancon V., Monteil H. and Piemont Y., 1995, Panton-Valentine leucocidin and gamma-hemolysin from Staphylococcus aureus ATCC 49775 are encoded by distinct genetic loci and have different biological activities, Infect. and immun., 63, 4121-4129.
Proctor R.A., Kriegeskorte A., Kahl B.C., Becker K., Löffler B. and Peters G., 2014, Staphylococcus aureus Small Colony Variants (SCVs): a road map for the metabolic pathways involved in persistent infections, Front. Cell. Infect. Microbiol., 4, 99. doi: 10.3389/fcimb.2014.00099.
Quiles-Melero I., Gómez-Gil R., Romero-Gómez M.P., Sánchez-Diaz A.M., De Pablos M., Garcia-Rodriguez J., Gutiérrez A., Mingorancea J., 2013, Mechanisms of Linezolid Resistance among Staphylococci in a Tertiary Hospital, J. Clin. Microbiol., 51, 998–1001.
Rolo J., Miragaia M., Turlej-Rogacka A., Empel J., Bouchami O., Faria N.A., Tavares A., Hryniewicz W., Fluit A.C., de Lencastre H., and the Concord working group, 2012, High Genetic Diversity among Community-Associated Staphylococcus aureus in Europe: Results from a Multicenter Study, PLoS ONE, 7(4), e34768 doi:10.1371/journal.pone.0034768.
Rooijakkers S.H.M., van Kessel Kok P.M and van Strijp J.A.G., 2005, Staphylococcal innate immune evasion, Trend Microbiol., 13, 596-601.
Rosenbach F.J., 1884, Mikro-Organismen bei den. Wund-Infections-Krankheiten des Menschen, JF Bergmann’s Verlag, Wiesbaden, Germany, 1–122.
Rzychon M., Sabat A., Kosowska K., Potempa J. and Dubin A., 2003, Staphostatins: an expanding new group of proteinase inhibitors with a unique specificity for the regulation of staphopains, Staphylococcus spp. Cysteine proteinases, Mol. Microbiol., 49, 1051-1066.
Sader H.S., Fritsche T.R., Jones R.N., 2006, Daptomycin bactericidal activity and correlation between disk and broth microdilution method results in testing of Staphylococcus aureus strains with decreased susceptibility to vancomycin, Antimicrob. Agents Chemother., 50(7), 2330, 2336.
Saitou N. and Nei M., 1987, The neighbor-joining method: A new method for reconstructing phylogenetic trees, Molecular Biology and Evolution, 4, 406-425.
Schaumburg F., Pauly M., Schubert G., Shittu A., Tong S., Leendertz F., Peters G., Becker K., 2014, Characterization of a Novel Thermostable Nuclease Homolog (NucM) in a Highly Divergent Staphylococcus aureus Clade, J. Clin. Microbiol., 52, 4036-4038.
Schmitz F. J., Fluit A.C., Gondolf M., Beyrau R., Lindenlauf E., Verhoef J., Heinz H.P., and Jones M.E., 1999, The prevalence of aminoglycoside resistance and corresponding resistance genes in clinical isolates of staphylococci from 19 European hospitals, J. Antimicrob. Chemother., 43, 253–259.
Schmitz F.J., Krey A., Sadurski R., Verhoef J., Milatovic D., and Fluit A.C., 2001, Resistance to tetracycline and distribution of tetracycline resistance genes in European Staphylococcus aureus isolates, J. Antimicrob. Chemother., 47, 239–240.
Schroeder K., Jularic M., Horsburgh S.M. and other authors, 2009, Molecular characterization of a novel Staphylococcus aureus surface protein (SasC) involved in cell aggregation and biofilm accumulation, PLoS One, 4, e7567.
Schwarz S., Werckenthin C. and Kehrenberg C., 2000, Identification of a plasmid-borne chloramphenicol-florfenicol resistance gene in Staphylococcus sciuri, Antimicrob. Agents Chemother., 44, 2530–2533.
Scriba T.J., Sierro S., Brown E.L., Phillips R.E., Sewell A.K., Massey R.C., 2008, The Staphyloccous aureus eap protein activates expression of proinflammatory cytokines, Infect. Immun., 76, 2164–8.
Shanshuang Li., Skov R.L., Han X., Larsen A.R., Larsen J., Sorum M., Wulf M., Voss A., Hiramatsu K. and Ito T., 2011, Novel Types of Staphylococcal Cassette Chromosome mec Elements Identified in Clonal Complex 398 Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus Strains, Antimicrob. Agents Chemother., 55, 3046-3050.
Sharp J.A., Echague C.G., Hair P.S., Ward M.D., Nyalwidhe J.O., Geoghegan J.A., Foster T.J., Cunnion K.M., 2012, Staphylococcus aureus surface protein SdrE Binds complement regulator factor H as an immune evasion tactic, PLoS ONE, 7.
Shaw K.J. si Barbachyn M.R., 2011, The oxazolidinones: past, present, and future, Ann. New York Acad. Sci., 1241, 48–70.
Shaw L., Golonka E., Potempa J., Foster S.J., 2004, The role and regulation of the extracellular proteases of Staphylococcus aureus, Microbiology, 150, 217-228.
Shen J., Wang Y., Schwarz S., 2013, Presence and dissemination of the multiresistance gene cfr in Gram-positive and Gram-negative bacteria, J. Antimicrob. Chemother., 68, 1697-1706.
Shore A.C., Brennan O.M., Ehricht R., Monecke St., Schwarz St., Slickers P. and Coleman D.C., 2010, Identification and Characterization of the Multidrug Resistance Gene cfr in a Panton-Valentine Leukocidin-Positive Sequence Type 8 Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus IVa (USA300) Isolate, Antimicrob. Agents Chemother., 54, 4978–4984.
Shorr A.F., Lipman J., 2007, Resistance in the intensive care unit: whose problem is it and how can intensivists help?, Crit. Care Med., 35, 299–301.
Siboo I.R., Chambers H. and Sullman P., 2005, Role of SraP, a serine-rich surface protein of Staphylococcus aureus, in binding to human platelets, Infect. Immun., 73, 2273-2280.
Sicot N., Khanafer N., Meyssonnier V., Dumitrescu O., Tristan A., Bes M., Lina G., Vandenesch F., Vanhems P., Etienne J., Gillet Y., 2013, Methicillin resistance is not a predictor of severity in community-acquired Staphylococcus aureus necrotizing pneumonia-results of a prospective observational study, Clin. Microbiol. Infect., 19(3), E142-E148.
Sieprawska-Lupa M., Mydel P., Krawczyk K., Wojcik K., Puklo M., Lupa B., Suder P., Silberring J., Reed M., Pohl J., Shafer W., McAleese F., Foster T., Travis J., Potempa J., 2004, Degradation of human antimicrobial peptide LL-37 by Staphylococcus aureus derived proteinases, Antimicrob. Agents Chemother., 48, 4673–9.
Smith E.J., Corrigan R.M., van der Sluis T., Gruendling A., Speziale P., Geoghegan J.A., Foster T.J., 2012, The immune evasion protein Sbi of Staphylococcus aureus occurs both extracellularly and anchored to the cell envelope by binding lipoteichoic acid, Mol. Microbiol., 83.
Smith T.C., 2015, Livestock-Associated Staphylococcus aureus: The United States Experience, PLoS Pathog., 11(2), e1004564. doi:10.1371/journal.ppat.1004564.
Song Y., Liu C.I., Lin F.Y, No J.H., Hensler M., Liu Y.L., Jeng W.Y., Low J., Liu G.Y., Nizet V., Wang A.H., Oldfield E., 2009, Inhibition of staphyloxanthin virulence factor biosynthesis in Staphylococcus aureus: in vitro, in vivo, and crystallographic results, J. Med. Chem., 52, 3869–3880.
Sorlozano A., Gutierrez J., Martinez T., Yuste M.E., Perez-Lopez J.A., Vindel A., Guillen J., Boquete T., 2010, Detection of new mutations conferring resistance to linezolid in glycopeptide-intermediate susceptibility Staphylococcus hominis subspecies hominis circulating in an intensive care unit, Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis., 29, 73–80.
Strommenger B., Kettlitz Ch., Werner G., and Witte W., 2003, Multiplex PCR Assay for Simultaneous Detection of Nine Clinically Relevant Antibiotic Resistance Genes in Staphylococcus aureus, J. Clin. Microbiol., 41, 4089–4094.
Szekely E., Lorinczi L., Bilca D., Fodor E., Soki J., Sabău M., 2008, Incidence, antibiotic resistance and clonal relations of MRSA strains isolated from a Romanian university hospital, Acta Microbiol. Immunol. Hung., 55, 1, 13.
Szekely E., Enache L.S., Marinescu S., Ungvari E., Toth A., Paszti J., 2010, Fatal sepsis due to community-associated methicillin resistant Staphylococcus aureus – a case report, Revista Română de Medicină de Laborator, 18(2/4), 29-33.
Szekely E., Man A., Mare A., Vas K.E., Molnar S., Bilca D., Szederjesi J., Toma F., Lorinczi L., 2012, Molecular epidemiology and virulence factors of methicillin-resistant Staphylococcus aureus strains in a Romanian university hospital, Revista Română de Medicină de Laborator, 20(4/4), 371-382.
Takeda K., Akira S., 2005, Toll-like receptors in innate immunity, Internat. Immunol., 17(1), 1–14. doi:10.1093/intimm/dxh186.
Tenover F.C., Arbeit R.D., Goering R.V., Mickelsen P.A., Murray B.E., Persing D.H., and Swaminathan B., 1995, Interpreting Chromosomal DNA Restriction Patterns Produced by Pulsed-Field Gel Electrophoresis: Criteria for Bacterial Strain Typing, J. Clin. Microbiol., 33(9), 2233–2239.
Tenover F.C. and Goering R.V., 2009, Methicillin-resistant Staphylococcus aureus strain USA300: origin and epidemiology, J. Antimicrob. Chemother., 64, 441–446.
Tamura K., Stecher G., Peterson D., Filipski A., and Kumar S., 2013, MEGA6: Molecular Evolutionary Genetics Analysis version 6.0., Molecular Biology and Evolution, 30, 2725-2729.
Thammavongsa V., Kern J.W., Missiakas D.M. and Schneewind O., 2009, Staphylococcus aureus synthesizes adenosine to escape host immune responses, J. Exp. Med., 206, 2417-2427.
Thompson K.M., Abraham N., Jefferson K.K., 2010, Staphylococcus aureus extracellular adherence protein contributes to biofilm formation in the presence of serum, FEMS Microbiol. Lett., 305, 143–7.
Tian Y., Li T., Zhu Y., Wang B., Zou X. and Li M., 2014, Mechanisms of linezolid resistance in staphylococci and enterococci isolated from two teaching hospitals in Shanghai, China, BMC Microbiol., 14, 292.
Toh S.M., Xiong L., Arias C.A., Villegas M.V., Lolans K., Quinn J., Mankin A.S., 2007, Acquisition of a natural resistance gene renders a clinical strain of methicillin-resistant Staphylococcus aureus resistant to the synthetic antibiotic linezolid, Mol. Microbiol., 64, 1506-1514.
Tong S.Y.C., Schaumburg F., Ellington M.J., Corander J., Pichon B., Leendertz F., Stephen D. Bentley S.D., Parkhill J., Holt D.C., Peters G. and Giffard Ph.M., 2015, Novel staphylococcal species that form part of a Staphylococcus aureus-related complex: the nonpigmented Staphylococcus argenteus sp. nov. and the non-human primate-associated Staphylococcus schweitzeri sp. nov., International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiol., 65, 15–22. DOI 10.1099/ijs.0.062752-0.
Tristan A., Bes M., Meugnier H., Lina G., Bozdogan B., Courvalin P., Reverdy M.E., Enright M.C., Vandenesch F., Etienne J., 2007, Global distribution of Pantone-Valentine leukocidine positive methicillin-resistant Staphylococcus aureus, 2006, Emerg. Infect. Dis., 13, 594-600.
Trzcinski K., Cooper B.S., Hryniewicz W., and Dowson C.G., 2000, Expression of resistance to tetracyclines in strains of methicillin-resistant Staphylococcus aureus, J. Antimicrob. Chemother., 45, 763–770.
Tsiodras S., Gold H.S., Sakoulas G., Eliopoulos G.M., Wennersten Ch., Venkataraman L., Moellering Jr R.C., Ferraro M.J., 2001, Linezolid resistance in a clinical isolate of Staphylococcus aureus, Lancet, 358, 207–208.
Tsompanidou E., Denham E.L., Becher D., de Jong A., Buist G., van Oosten M., Manson W.L., Back J.W., van Dijl J.M., Dreisbacha A., 2013, Distinct Roles of Phenol-Soluble Modulins in Spreading of Staphylococcus aureus on Wet Surfaces, Applied and Environmental Microbiol., 79(3), 886 – 895.
Tung H.S., Guss B., Hellman U., Persson L., Rubin K., Ryden C., 2000, A bone sialoprotein-binding protein from Staphylococcus aureus: a member of the staphylococcal Sdr family, Biochem. J., 345, 611-619.
Vakulenko S.B., Donabedian S.M., Voskresenskiy A.M., Zervos M.J., Lerner S.A., Chow J.W., 2003, Multiplex PCR for Detection of Aminoglycoside Resistance Genes in Enterococci, Antimicrob. Agents Chemother., 47, 1423-1426.
Van de Velde H., 1894, E´tude sur la mecanisme de la virulence du staphylocoque pyogene, Cellule, 10, 402–460.
van Belkum A., Melles D.C., Nouwen J., van Leeuwen W.B., van Wamel W., Vos M.C., Wertheim H.F., Verbrugh H.A., 2009, Co-evolutionary aspects of human colonisation and infection by Staphylococcus aureus, Infect. Genet. Evol., 9, 32-47.
Vandenesch F., Naimi T., Enright M.C., Lina G., Nimmo G.R., Heffernan H., Liassine N., Bes M., Greenland T., Reverdy M.E., Etienne J., 2003, Community-acquired methicillin-resistant Staphylococcus aureus carrying Pantone-Valentine leukocidin genes: worldwide emergence, Emerg. Infect. Dis., 9, 978-984.
Vandenesch F., European CA-MRSA: a singular situation?, 18th European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases Barcelona, Spain, 19–22 April 2008 – Abstract number: S468.
Vazquez V., Liang X.W., Horndahl J.K., Ganesh V.K., Smeds E., Foster T.J., Hook M., 2011, Fibrinogen is a ligand for the Staphylococcus aureus microbial surface components recognizing adhesive matrix molecules (MSCRAMM) bone sialoprotein-binding protein (Bbp), J. Biol. Chem., 286, 29797–805.
Ventura C.L., Malachowa N., Hammer C.H., Nardone G.A., Robinson M.A., Kobayashi S.D., DeLeo F.R., 2010, Identification of a Novel Staphylococcus aureus Two-Component Leukotoxin Using Cell Surface Proteomics, PLoS ONE, 5, e11634.
Verdon J., Girardin N., Lacombe C., Berjeaud J.M. and Hechard Y., 2009, delta-hemolysin, an update on a membrane interacting peptide, Peptides, 30, 817-823.
Visai L., Yanagisawa N., Josefsson E., Tarkowski A., Pezzali I., Rooijakkers S.H., Foster T.J. and Speziale P., 2009, Immune evasion by Staphylococcus aureus conferred by iron-regulated surface determinant protein IsdH, Microbiology, 155, 667-679.
Vlack S., Cox L., Peleg A.Y., Canuto C., Stewart C., Conlon A., Stephens A., Giffard Ph., Huygens F., Mollinger A., Vohra R. and Mccarthy J.S., 2006, Carriage of methicillin-resistant Staphylococcus aureus in a Queensland indigenous community, Med. J. Aust., 184, 556-559.
Vremeră T., Iancu L.S., Năstase E.V., Logigan C., Miftode E.G., Mereuță A.I., Luncă C., Dorneanu O.S., 2012, TRIPLEX REAL-TIME PCR FOR DETECTION OF METHICILLIN-RESISTANT STAPHYLOCOCCUS AUREUS AND PANTON-VALENTINE LEUKOCIDIN IN NORTH-EAST ROMANIA, Rev. Med. Chir. Soc. Med. Nat., 116(4), 1171-1176.
Vu B.G., Stach C.S., Kulhankova K., Salgado-Pabón W., Klingelhutz A.J., Schlievert P.M., 2015, Chronic superantigen exposure induces systemic inflammation, elevated bloodstream endotoxin, and abnormal glucose tolerance in rabbits: possible role in diabetes, mBio, 6(2), e02554-14. doi:10.1128/mBio.02554-14.
Walsh E.J., O’Brien L.M., Liang X., Hook M. and Foster T.J., 2004, Clumping factor B, a fibrinogen-binding MSCRAMM (microbial surface components recognizing adhesive matrix molecules) adhesin of Staphylococcus aureus, also binds to the tail region of type I cytokeratin 10, J. Biol. Chem., 279, 50691-50699.
Weiss W.J., Lenoy E., Murphy T., Tardio L., Burgio P., Projan S.J., Schneewind O. and Alksne L., 2004, Effect of srtA and srtB gene expression on the virulence of Staphylococcus aureus in animal models of infection, J. Antimicrob. Chemother., 53, 480-486.
White J.A., Herman A.M., Pullen A.M., Kubo R., Kappler J.W., Marrack P., 1989, The Vβ – superantigen staphylococcal enterotoxin B: Stimulation of mature T cell and clonal deletion in neonatal mice, Cell, 56, 27.
Wu D., Wang Q., Yang Y., Geng W., Yu S., Yao K., Yuan L., Shen X., 2010, Epidemiology and molecular characteristics of community-associated methicillin-resistant and methicillin-susceptible Staphylococcus aureus from skin/soft tissue infections in a children's hospital in Beijing, China, Diagn. Microbiol. Infect. Dis., 67(1), 1-8. doi: 10.1016/j.diagmicrobio.2009.12.006 PMID: 20227225.
Yarovinsky T.O., Monick M.M., Husmann M., Hunninghake G.W., 2008, Interferons increase cell resistance to staphylococcal alpha-toxin, Infect. Immun., 76, 571-577.
Zhang L., Jacobsson K., Vasi J., Lindberg M. and Frykberg L., 1998, A second IgG-binding protein in Staphylococcus aureus, Microbiology, 144, 985-991.
Zhao C., Liu Y., Zhao M., Liu Y., Yu Y, Chen H., Sun Q., Chen H., Jiang W., Liu Y., Han S., Xu Y., Chen M., Cao B., Wang H., 2012, Characterization of community acquired Staphylococcus aureus associated with skin and soft tissue infection in Beijing: high prevalence of PVL+ ST398, PLoS One, 2012; 7(6), e38577. doi: 10.1371/journal.pone.0038577 PMID: 22701673.
Zhou W., Niu D., Cao X., Ning M., Zhang Z., Shen H., Zheng K., 2015, Clonal dissemination of linezolid-resistant Staphylococcus capitis with G2603T mutation in domain V of the 23S rRNA and the cfr gene at a tertiary care hospital in China, BMC Infect. Dis., 15, 97. DOI10.1186/s12879-015-0841-z.
Zygmunt D.J., Stratton C.W., Kernodle D.S., 1992, Characterization of four β-lactamases produced by Staphylococcus aureus, Antimicrob. Agents Chemother., 36, 440-445.
ECDC/EMEA,2009,http://ecdc.europa.eu/en/publications/surveillance_reports/Pages/index.aspx
http://spa.ridom.de/index.shtml
http://www.seqnet.org/
https://it.wikipedia.org/wiki/Tetracicline
www.eucast.org
http://www.ridom.de/doc/Ridom_spa_sequencing.pdf
www.megasoftware.net
http://www.cnscbt.ro/index.php/analiza-date-supraveghere/infectii-nosocomiale-1/238-raport-privind-supravegherea-in-rezistenta-microbiana-si-consum-antibiotice-2012/file – Raport privind Consumul de antibiotice, Rezistența microbiană și Infecții Nosocomiale în România – 2012 – CARMIN-ROM 2012
2.7. Anexe
Anexa 1
Prevalența S. aureus la pacienți cu infecții ale pielii și țesuturilor moi: un studiu pilot European multi-centric
Criterii de includere
Toți pacienții (adulți și copii) care se prezintă în urgență cu leziuni purulente ale pielii și țesuturilor moi (furuncul, abces, celulită, celulită necrotizantă, panarițiu, limfagită etc) cu durată de mai puțin de o săptămână.
Definiții (del Giudice et al. Dermatology 2011; 222:167-170; Tomas et al. Acta Radiol Short Rep. Feb 2014; 3(2): 2047981614523172)
Furuncul: Foliculită cu aspect de inflamație papulonodulară, cu diametrul mai mic de 2 cm
Abces: Masă inflamatorie de peste 2 cm în diametru care necesită intervenție chirurgicală cu drenaj al colecției purulente
Celulită: Placă inflamatorie tratată cu succes, exclusiv cu antibiotic
Celulită necrotizantă: Placă inflamatorie care necesită atât terapie cu antibiotic, cât și intervenție chirurgicală
Panarițiu: Reacție inflamatorie implicând structurile cutanate din jurul unghiei
Limfagita: Inflamație a vaselor limfatice prin infecția țesuturilor
Identificarea pacientului
Factori de risc
Parametri clinici
Terapia cu antibiotice
Sensibilitatea la antibiotic (laborator)
Anexa 2
2.8. Lista lucrărilor publicate/ prezentate la conferințe, publicate din teza de doctorat
Articole științifice
Drăgulescu Elena-Carmina, Buzea Mariana, Codiță Irina, Molecular Analysis of Community-Acquired Staphylococcus aureus strains isolated from Skin and Soft-Tissue Infections in Romania. Romanian Biotechnological Letters – acceptat spre publicare.
Drăgulescu Elena-Carmina, Codiță Irina, Nistor Irina, Coldea Ileana Luminița, Șerban Roxana. Linezolid resistant Staphylococcus hominis isolated in a paediatric Romanian hospital. Romanian Biotechnological Letters – acceptat spre publicare.
Coldea I.L., Drăgulescu E.-C., Lixandru B.-E., Dragomirescu C.C., Codiță I., Phenotypic and genotypic characterization of Staphylococcus aureus strains isolated from a familial foodborne outbreak. Romanian Archives of Microbiology and Immunology, 2013, 72(3): 210 – 217.
Drăgulescu E.-C., Coldea I.L., Lixandru B.-E., Codiță I., Compararea sensibilității a două metode utilizate pentru detectarea directă în lapte a S. aureus posibil producător de enterotoxină B. Bacteriologia Parazitologia Imunologia Epidemiologia, 2013, 58(1-2): 7-12.
Drăgulescu E.C., Codiță I., HOST – PATHOGEN INTERACTION IN INFECTIONS DUE TO STAPHYLOCOCCUS AUREUS. STAPHYLOCOCCUS AUREUS VIRULENCE FACTORS, Romanian Archives of Microbiology and Immunology, 2015, 74(1-2): 46-64.
Coldea I.L., Zota L., Dragomirescu C.C., Lixandru E.B., Drăgulescu E.C., Sorokin M., Codiță I., Staphylococcus aureus harbouring egc cluster coding for non-classical enterotoxins, involved în a food poisoning outbreak, Romania, 2012/ Staphylococcus aureus purtător de gene codante pentru enterotoxine non-clasice (cluster egc), implicat într-un focar de toxiinfecție alimentară, România, 2012, Revista Română de Medicină de Laborator, 2015, 23(3): 285-294 (FI 0,171).
Cotar A.I., Zaharia A., Drăgulescu E.C., Pistol A., Popovici F., Codiță I., The Role of Molecular Typing Methods in the Outbreak Investigation of a Possible Staphylococcal Food Poisoning, Romanian Biotechnological Letters, 2016, 21(2): 11404-11412 (FI 0.404).
Comunicări și postere
Drăgulescu E.-C., Lixandru B.-E., Irimia M., Trifan A., Dobrescu A., Duca E., Codiță I., Pulsotipuri și toxinotipuri de Staphylococcus aureus izolate din toxiinfecție alimentară în anul 2011, lucrare prezentată la Congresul Național de Microbiologie, Conferința Națională de Epidemiologie, 10 – 12 noiembrie 2011, Iași, România, iar rezumatul este publicat în Revista Bacteriologia, Virusologia, Parazitologia, Epidemiologia, vol. 56, supliment 2011, pag. 70 – poster.
Codiță I., Drăgulescu E-C., Dinu S., Lixandru B-E., Șerban R.I. t127 spa type MDR MRSA strains isolated in 2010/2011 from pediatric and new born units în Bucharest, lucrare prezentată la 7th Conference of the Romanian Association of Medical Laboratories with international participation, 10 – 12th May 2012, Brașov, România, iar rezumatul este publicat în Revista Română de Medicină de Laborator (Romanian Review of Laboratory Medicine), vol. 21, no. 2/4, May 2011 – comunicare orală.
Codiță I., Drăgulescu E.-C. Tipizarea Casetei Cromosomale mec stafilococice – evoluții recente și necesități de armonizare, lucrare prezentată la Conferința Națională de Microbiologie și Epidemiologie, 8-10 noiembrie 2012, București, România, iar rezumatul este publicat în Revista Bacteriologia, Virusologia, Parazitologia, Epidemiologia, vol. 57, Nr. 3-4, iulie-decembrie 2012, pag. 28 – referat.
Drăgulescu E.-C., Lixandru B.-E., Coldea I.L., Dinu S., Codiță I. Identificarea unei clone bacteriene endemice de S. aureus circulante într-o secție de nou născuți utilizând metode de tipizare moleculară, lucrare prezentată la Conferința Națională de Microbiologie și Epidemiologie, 8-10 noiembrie 2012, București, România, iar rezumatul este publicat în Revista Bacteriologia, Virusologia, Parazitologia, Epidemiologia, vol. 57, Nr. 3-4, iulie-decembrie 2012, pag. 33 – comunicare orală.
Drăgulescu E.-C., Lixandru B.-E., Mihăescu G., Codiță I., Inducerea rezistenței la telitromicină de către eritromicină la izolate de Staphylococcus spp. rezistente la macrolide, lucrare prezentată la Conferința Națională de Microbiologie și Epidemiologie, 8-10 noiembrie 2012, București, România, iar rezumatul este publicat în Revista Bacteriologia, Virusologia, Parazitologia, Epidemiologia, vol. 57, Nr. 3-4, iulie-decembrie 2012, pag. 52 – comunicare orală.
Coldea I.L., Drăgulescu E.-C., Lixandru B.-E., Dragomirescu C.C., Neguț M., Codiță I. „Reacții multiplex PCR pentru detectarea enterotoxinelor stafilococice și a proteinelor enterotoxin-like”, 2nd Congress of the Romanian Association of Medical Laboratories with international participation, 5-8 Iunie 2013, Brașov, România – poster.
Coldea I.L., Lixandru B.-E., Drăgulescu E.-C., Niculiță D., Codiță I. Focare de toxiinfecții alimentare stafilococice analizate prin metode de tipizare moleculară și determinarea profilului toxic, lucrare prezentată la A VI-a Conferință Națională de Microbiologie și Epidemiologie, 14-16 noiembrie 2013, București, România, iar rezumatul este publicat în Revista Bacteriologia, Virusologia, Parazitologia, Epidemiologia, vol. 58, iulie-decembrie (3-4)/ 2013, pag. 71 – poster.
Drăgulescu E.-C., Coldea I.L., Lixandru B.-E., Zorescu C., Șerban R., Codiță I., Contaminare încrucișată cu tulpini de Staphylococcus aureus t008 PVL pozitive, t127 și t015, într-o secție de nou-născuți din România, 2013, lucrare prezentată la A VII-a Conferință Națională de Microbiologie și Epidemiologie, 13-15 noiembrie 2014, București, România, iar rezumatul este publicat în Revista Bacteriologia, Virusologia, Parazitologia, Epidemiologia, vol. 59, iulie-decembrie (3-4)/ 2014, pag. 43 – comunicare orală.
Coldea I.L., Drăgulescu E.-C., Lixandru B.-E., Dragomirescu C.C., Neguț M., Codiță I., Rezistența la antibiotice a tulpinilor de Staphylococcus aureus asociate focarelor de toxiinfecții alimentare izolate în perioada 2009-2013 în România, lucrare prezentată la A VII-a Conferință Națională de Microbiologie și Epidemiologie, 13-15 noiembrie 2014, București, România, iar rezumatul este publicat în Revista Bacteriologia, Virusologia, Parazitologia, Epidemiologia, vol. 59, iulie-decembrie (3-4)/ 2014, pag. 51 – comunicare orală.
Cotar A.I., Zaharia A., Pistol A., Popovici F., Drăgulescu E.-C., Codiță I., Un posibil focar de toxiinfecție alimentară într-un restaurant din București, 26 iulie 2014, lucrare prezentată la A VII-a Conferință Națională de Microbiologie și Epidemiologie, 13-15 noiembrie 2014, București, România, iar rezumatul este publicat în Revista Bacteriologia, Virusologia, Parazitologia, Epidemiologia, vol. 59, iulie-decembrie (3-4)/ 2014, pag. 51 – comunicare orală.
Cotar A.I., Zaharia A., Drăgulescu E.C., Pistol A., Popovici F., Codiță I. Investigation of a possible outbreak of staphylococcal food poisoning, Bucharest 2014. Lucrare acceptată la European Scientific Conference on Applied Infectious Disease Epidemiology (ESCAIDE), 11-13 November 2015, Stockholm, Sweden – Abstract ID: 2997 – poster.
Drăgulescu E.C., Buzea M., Lixandru B.E., Ionescu G., Codiță I. Sensibilitatea la antibiotice a unor tulpini de Staphylococcus aureus izolate din infecții comunitare cutanate și ale părților moi, lucrare prezentată la A VIII-a Conferință Națională de Microbiologie și Epidemiologie, 12-14 noiembrie 2015, București, România, iar rezumatul este publicat în Revista Bacteriologia, Virusologia, Parazitologia, Epidemiologia, vol. 60, iulie-decembrie (3-4)/ 2015, pag. 68 – poster.
Drăgulescu E.C., Lixandru B.E., Codiță I., Markeri de patogenitate la tulpini de Staphylococcus aureus izolate din infecții de piele și țesuturi moi, lucrare prezentată la Prima Conferință Națională a Asociației de Medicină de Laborator din România cu participare internațională, 18-21 mai 2016, Cluj-Napoca, România, iar rezumatul este publicat în Revista Română de Medicină de Laborator (indexată ISI Thompson Reuters, cu factor de impact 0.143/ 2015), supliment la vol. 24(1), martie 2016, pag. S146 – S147 – poster.
Irina Codiță, Elena-Carmina Drăgulescu, Brîndușa-Elena Lixandru, Roxana Șerban, Staphylococcus aureus clones in community and hospital settings, 2013-2014, lucrare prezentată la Congresul Universității de Medicină și Farmacie Carol Davila București, ediția a4-a, 2-4 iunie 2016, Palatul Parlamentului, București, iar rezumatul este publicat în broșura evenimentului.
Copyright Notice
© Licențiada.org respectă drepturile de proprietate intelectuală și așteaptă ca toți utilizatorii să facă același lucru. Dacă consideri că un conținut de pe site încalcă drepturile tale de autor, te rugăm să trimiți o notificare DMCA.
Acest articol: Profiluri genice de virulență și rezistență la tulpini de [311079] (ID: 311079)
Dacă considerați că acest conținut vă încalcă drepturile de autor, vă rugăm să depuneți o cerere pe pagina noastră Copyright Takedown.