Profiluri de rezistență și virulență ale unor tulpini de Staphylococcus aureus izolate din leziuni cutanate pustuloase [302685]
Universitatea din București
Facultatea de Biologie
Catedra de Biologie
LUCRARE DE LICENȚĂ
Profiluri de rezistență și virulență ale unor tulpini de Staphylococcus aureus izolate din leziuni cutanate pustuloase
Coordonator științific:
Prof. Dr. Carmen Mariana Chifiriuc
Îndrumător:
Asist. Univ. Dr. Irina Gheorghe
Absolventă:
Andreea-Daniela Ion
București
Iunie, 2016
CUPRINS
INTRODUCERE…………………………………………………………………..……….…3
PARTEA TEORETICĂ
CAPITOLUL I. Caracterizarea generală a [anonimizat]……………………………………………….…………………………………………….4
1.1. Caractere generale……………………………………………………………………………………………………4
1.2 Profilul de virulență și antibiorezistență la tulpinile aparținând specie S. aureus….…………8
Capitolul II. Antibiotice………………………………………………………………….…..12
2.1 Caratere generale……………………………………………………………………………12
2.2 Antibiotice-metaboliți secundari…………………………………………………………….12
2.2.1 Clasificarea antibioticelor în funcție de structura chimică……………………………….13
2.2.2 Clasificarea antibioticelor în raport cu mecanismele prin care inhibă dezvoltarea microorganismelor………………………………………………………………………………..14
2.2.2.1 Antibiotice ce inhibă sinteza peretelui celular……………………………………………15
2.2.2.2 Antibiotice ce modifică permeabilitatea membranei plasmatice……………………………….18
2.2.2.3 Antibiotice ce inhibă sinteza proteinelor……………………………………………………………….18
2.2.2.4 Antibiotice cu țintă de acțiune asupra replicării ADN…………………………………………….20
2.2.2.5 Antibiotice cu țintă asupra transcrierii………………………………………………………………….21
2.2.2.6 Antibiotice ce blochează sinteza metaboliților secundari………………………………………..21
Capitolul III. [anonimizat]….………………………………………………………….22
3.1 Rezistența naturală…………………………………………………….……………………22
3.2 Rezistența dobândită……………………………………………………..………………….23
3.2.1 Rezistența cromozomală……………………………………………….…………………25
3.2.2 Rezistența mediată de elemente genetice mobile…………………………………………26
3.2.2.1 Rezistența plasmidială………………………………………………….………………26
3.2.2.2 Rezistența mediată de elemente genetice transpozabile………………….…………….28
3.2.3 Mecanisme biochimice ale rezistenței…………………………………….………………32
3.2.3.1 Afectarea antibioticului…………………………………………………………………32
3.2.3.2 Afectarea tintei antibioticului…………………………………..………………………33
3.2.3.3 Modificări de permeabilitate și transport……………………………………………….33
PARTEA EXPERIMENTALĂ
CAPITOLUL IV. Markeri genotipici de rezistență și virulență la meticilină la tulpini de S. aureus izolate din pustule infecțioase ……………………………………………………..33
4.1. Scop și obiective……………………………………………………………………….…..33
4.2. Obiectivele studiului………………………………………………………………….…….33
4.3. Materiale și metode……………………………………………………………………..….33
4.3.1 Materiale de lucru…………………………………………………………………………………………………33
4.3.2. Extracția ADN din tulpinile de S. aureus ………………………………………………………………34
4.2.3. Amplificarea ADN (tehnica PCR).……………………………..…………………………35
4.3.4 Electroforeza ADN……………….………………………………………………………36
4.4. Rezultate și discuții………………………………………………………..……..…………36
4.4.1 Testarea rezistenței la antibiotice a tulpinilor de S. aureus prin metoda difuzimetrică…..36
4.4.2 Studiul genotipic al factorilor de virulență și corelația cu rezistența genotipică la meticilină a tulpinilor de S. aureus ………………………………………………………………………………..38
4.4.3 Rezistența la meticilină a tulpinilor de S. aureus ………………………………………..43
CONCLUZII………………………………………………………………………………….50
BIBLIOGRAFIE………………………….…………………………………………………51
INTRODUCERE
Staphylococcus aureus, deși se găsește în mod normal în microbiota umană a tractului respirator superior, poate deveni patogen în anumite condiții și poate cauza infecții în aproape orice organ sau țesut al corpului uman, dând naștere la boli cu tablou clinic variat și sever, de la infecții ale pielii și țesuturi moi, la osteomielite și pneumonie. S.aureus este cel mai frecvent patogen raportat, asociat cu infecții chirurgicale după stafilococii coagulazo-negativi. S-a observat o creștere a ratei infecțiilor nosocomiale cu tulpini de Staphylococcus aureus meticilino-rezistente (MRSA).
Aproximativ 20% din populația umană este purtătoare a cel puțin unui tip de stafilococ. Studiile arată că ratele cele mai ridicate de colonizare cu acest microorganism se întâlnesc la personalul medical, consumatorii de droguri intravenoase, pacienți diabetici insulino-dependenți, cu leziuni ale pielii și catetere venoase folosite pentru o perioadă lungă de timp.
Folosirea largă a antibioticelor a dus la o răspândire a tulpinilor rezistente la antibiotice. Tulpinile de S. aureus rezistente la meticilină reprezintă o problemă severă de sănătate în întreaga lume, iar antibioticele din clasa glicopeptidelor (vancomicina – introdus în practică la începutul anilor ‘90) sunt considerate tratamentul standard pentru tulpinile de S. aureus MRSA.
Epidemiologia tulpinilor MRSA s-a schimbat drastic în ultimii ani, deoarece infecția cu acest patogen devine tot mai comună printre indivizii care nu au avut contact cu centrele de sănătate.
Scopul acestei lucrări a fost investigarea moleculară a profilulei de virulență și rezistență și antibiorezistență a unor tulpini de Staphylococcus aureus izolate din leziuni cutanate pustuloase.
Capitolul 1. Cocii Gram-pozitivi de interes medical
Caractere generale
Bacteriile Gram-pozitive sunt celule simple. Pe baza criteriilor morfologice, pot fi distinse trei compartimente celulare: citosol, membrană citoplasmatică și peretele celular. Unele specii bacteriene Gram-pozitive sintetizează o capsulă polizaharidică în timp ce altele pot genera un strat de proteine de suprafață; ambele structuri pot învalui întreaga celulă.
Peretele celular al sporilor diferă de peretele celulelor mamă și conține seturi specifice de proteine. Unele bacterii Gram-pozitive se divid fără a-și sepra pereții celulelor, prin urmare, cresc în șiruri de celule (streptococi) sau clustere(stafilococi) (Navarre și colab.1990).
Fig. 1: Imagine la TEM – celule aparținând speciei Staphylococcus aureus, aflate în diviziune (Navarre și colab.1990).
În Figura 1 este reprezentată morfologia caracteristică a compartimentelor subcelulare ale bacteriilor Gram-pozitive, în cursul diviziunii celulare. Septurile indicate printr-un singur vârf de săgeată sunt complet divizate iar septurile nou-divizate sunt marcate cu săgeti cu vârfuri duble. De asemenea este vizibil cromozomul bacterian (CHR) și corpurile membranoase citoplasmatice (M) (Navarre și colab.1990).
Peretele celular al bacteriilor Gram-pozitive (Fig. 2) este gros (20-50nm la microscopul electronic), este relativ omogen și greutatea sa este reprezentată de 80-90% peptidoglican (Fig. 3) ( aproximativ 20 straturi), polizaharide și proteine.
Fig. . 2 –Structura peretelui celular la bacteriile Gram-pozitive (http://www.scritub.com/biologie/STRUCTURA-CELULEI-BACTERIENE71549.php).
Fig. 3 –Structura peptidoglicanului la bacteriile Gram-pozitive (http://www.scritub.com/biologie/STRUCTURA-CELULEI-BACTERIENE71549.php).
Polizaharidele caracteristice bacteriilor Gram-pozitive sunt acizii teichoici. Acizii teichoici sunt molecule polimere, sub formă de lanțuri lungi ce ies la suprafață. Există acizi teichoici legați de celule și acizi teichoici solubili.
Acizii teichoici legați de celule fac parte din două clase: 1). Acizi teichoici de perete, atașați de resturile de NAM ale peptidoglicanului și 2) Acizi lipoteichoici ce traversează peptidoglicanul, având un capăt expus la exterior și un capăt legat de un glicolipid din membrana plasmatică.
Rolul acizilor teichoici din peretele celular este de a oferi peretelui celular rigiditate crescută iar în cazul bacteriilor patogene conferă un plus de virulență, opunându-se procesului de fagocitoză (Herlea,1998).
Cocii piogeni de importanță medicală, în general sunt implicați în etiologia unor infecții multiple de tip supurativ și non-supurativ.
Cocii Gram-pozitivi generează infecții supurative, producând aproximativ 1/3 din totalul infecțiilor bateriene umane.
Clasificarea cocilor Gram-pozitivi după (Maza și colab., 1997).
1.Aerobi
a.Staphylococcus aureus
b.Staphylococcus epidermidis
c.Staphylococcus saprophyticus
d.Streptococcus pyogenes
e.Streptococcus pneumoniae
f.Streptococcus agalactiae
2.Anaerobi
a.Enterococus faecalis
b.Enterococus faecium
COCI GRAM-POZITIVI, CATALAZĂ-POZITIVI, AEROBI
Genul Staphylococcus
Ediția din 2004 a Manualului Bergey’s de Bacteriologie Sistematică, încadrează genul Staphylococcus în familia Staphylococcaceae, acestea reprezentând cea de-a VIII–a Familie a Ordinului Bacillales din Clasa III, Bacilli, aparținând Phylum-ului BXIII, Firmicutes al Domeniului Bacteria. Manualul Bergey’s, ediția 1986, încadra genul Staphylococcus în familia Micrococcaceae, alături de genurile Micrococcus, Planococcus și Stomatococcus, dar studii la nivel molecular, bazate pe experimente de hibridizare și stabilirea gradului de omologie a acizilor nucleici, alături de studii privind compoziția chimică a peretelui celular au demonstrat că genul Micrococcus este mai înrudit cu actinomicetele, iar speciile genului Staphylococcus prezintă similitudini mai mari cu lactococii, enterococii, lactobacilii, precum și cu specii ale
genului Bacillus (Buiuc și Neguț, 2009).
În prezent Familia Staphylococcaceae cuprinde 5 genuri: Staphylococcus, Gemella, Jeotgalicoccus, Macrococcus, Salinicoccus.
Genul Staphylococcus cuprinde 38 de specii, dintre care 18 au putut fi izolate de la om Speciile cel mai frecvent incriminat în infecții umane sunt: S. aureus, specie coagulazo-pozitivă, S. epidermidis, S. haemolyticus și S. saprophyticus, specii coagulazo-negative (Buiuc și Neguț, 2009; Chifiriuc și colab., 2011).
Caracterizare fenotipică
Stafilococii sunt bacterii Gram-pozitive cu un diametru de aproximativ 0,5-1,5 µm, imobili, non-formatori de spori, anaerobi facultativi (cu exceptia S.aureus anaerobius), care de obicei formează clustere. Stafilococii sunt o parte a florei umane, se găsesc în special în nas și pe piele (http://www.phac-aspc.gc.ca/lab-bio/res/psds-ftss/staphylococcus-aureus-eng.php).
Stafilocicii apar la microscop sub forma unor aglomerări asemănătoare unui ciorchine de strugure, iar cultivat pe agar-agar produce colonii mari, rotunde, galben-aurii (Fig.4).
Aglomerările apar pentru că stafilococii se divid (Albrecht și colab., 2004).
Fig. 4. Colonie de S. aureus – imagini de microscopie electronică de baleiaj (McCormick, 2013).
S-a estimat faptul că aproximativ 20% dintre indivizi sunt colonizați permanent la nivelul foselor nazale, alti 60% sunt purtători intermitenți iar restul de 20% nu sunt purtători niciodată în timpul vieții (Foster, 2004).
Din punct de vedere al exigențelor nutritive, S. aureus posedă cerințe minore însa totuși este necesară prezența în mediul de cultură a aminoacizilor precum și factorilor de creștere.
Datorită acestor minime cerințe, stafilococii pot fi cultivați pe medii nutritive simple dar și pe medii mai complexe sau selective. După ce are loc incubarea în aerobioză, timp de 18-24 ore, la 35-37°C (pH de 7-7,5), culturile din mediu lichid au aspect tulbure iar coloniile din mediu solid au aspect circular, bombate, opace, cu margini neregulate, consistență cremoasă, lucioase, cu suprafață netedă, pigmentate de regulă în galben citrin. Rar, stafilococii formează colonii mucoase (de tip M), sau colonii G( glossy-lucios) (Chifiriuc și colab., 2011).
Pentru a indentifica tulpinile de S.aureus, se ține seama atât de particularitățile biochimice cât și fiziologice ale speciei:
Specie catalazo-pozitivă, diferențiindu-se astfel de specii ale genului Streptococcus
Specie oxidazo-negativă
Specie coagulazo-pozitivă
Specie halotolerantă, presupune creșterea în prezența unor concentrații de aproximativ 7,5-10% de NaCl; fermentarea manitolului cu producere de acid determină virajul culorii indicatorului de pH al mediilor de cultură de tip Chapman de la rosu-roz la galben, astfel diferențiindu-se specii de S.aureus de S. epidermidis.
Specie sensibilă la novobicină
Specie producătoare de DN-aze, enzime termorezistente elaborate de aproximativ 95% din tulpinile patogene coagulazo-pozitive (Chifiriuc și colab., 2011).
1.2. Profiluri de virulență la tulpinile aparținând speciei S. aureus
S. aureus posedă o varietate largă de mecanisme de virulență întâlnită la toate microorganismele patogene pentru om, astfel reprezintă un model de studiu al patogenezei bolilor infecțioase. S. aureus are capacitatea de a determina un spectru larg de infecții la om care se datorează unui repertoriu bogat de factori de virulență ( aprox. 70), acești factori fiind exprimați în cursul diferitelor etape ale infecțiilor determinate (Chifiriuc și colab., 2011).
S. aureus secretă o serie de proteine extracelulare (lipaze, nucleaze, hemolizine, leucocidina, hialuronidaza) ce au rol în degradarea componentelor țesuturilor gazdă și toxine (enterotoxine, exfoliatine, TSST-1) ce au ca funcție principală inhibarea răspunsurilor imune ale gazdei față de S. aureus, însă fiecare toxină exercită și funcții biologice specifice, responsabile pentru manifestările clinice particulare( Chifiriuc și colab., 2011).
Principalele etape ale patogenezei infecțiilor de S. aureus sunt: (1). colonizarea, (2). internalizarea, (3). invazia și diseminarea sistemică, (4). toxigeneza.
Factorii de virulență sunt asociați celulei bacteriene sintetizate sau pot fi exprimați extracelular. Proteinele extracelulare care constituie toxinele implicate în infecțiile invazive și neinvazive, aparțin uneia din următoarele categorii: receptine (adezine), toxine (invazive) și enzime.
Etapa de colonizare
În etapa de colonizare intervin adezinele ce asigură aderența S. aureus la proteinele plasmatice precum și proteinele matricei extracelulare de pe dispozitivele medicale implantate conducând la
infecții (Harris, 2002).
Adezinele sunt de două tipuri, numite receptine, capacitatea lor fiind de a media aderența la celulele eucariote precum și la dispozitivele medicale implantate (etapă importantă pentru inițierea infecției cu S. aureus și persistența acestuia în diferite situsuri ale organismului uman). (Kronwall și Johnsson, 1999).
Primul grup de adezine e repezentat de receptinele asociate suprafeței celulare ce se leagă covalent de peptidoglicanul coținut de peretele celular prin liganzii reprezentați de către molecule de colagen, elastină, fibriongen și fibronectină. Aceste receptine sunt molecule MSCRAMMs( microbial surface components recognizing adhesive matrix molecules) și anume: a. Proteina A, b. Proteinele de legare a fibronectinei (FnBPs, FnbpA și FnbpB), c. Factorii clumping (ClfA și ClfB), d. Proteina de legare a colagenului, e. Proteina de legare a sialoproteinei osului (Bpb) (Chifiriuc și colab., 2011).
Al doilea grup este reprezentat de receptinele secretate sau molecule de aderență secretate- SERAMs ( secretable expanded repertorie adhesive molecules): Efb(extracellular fibrinogen binding protein) – proteina extracelulară de legare a fibrinogenului, Eap (Extracellular adherence protein), Emp(Extracellular matrix binding protein) și coagulaza.
PROTEINA A (Spa)- Această proteină este exprimată de majoritatea tulpinilor de S. aureus pe suprafața celulei bacteriene, având ca scop evitarea fagocitozei prin legarea la domeniul Fc al IgG. Proteina este implicată în patogeneza afecțiunilor endovasculare prin legarea proteinei gClqR prezentă pe suprafața trombocitelor aderate, dar și a factorului von Willebrand(Vwf) (Cotar și colab., 2010).
Ținând cont de faptul că proteina A are afinitate pentru IgG, este considerat ca fiind un reactiv important în imunologie. In vitro, proteina A are proprietăți mitogene față de celulele T și este super-Ag pentru LB (Chifiriuc și colab., 2011). Selectivitatea înaltă a proteinei A pentru regiunea Fc a anticorpilor din complexele imune, a condus la folosirea proteinei A în locul anticorpilor secundari în tehnici de imunologie.
FnBPs( fibrinogen binding proteins) cuprinde FnbpA și FnbpB – eliberate în faza exponențială a curbei de creștere a culturii bacteriene la suprafața celulei secretante ; sunt proteine de legare a fibronectinei, FnbpA favorizeză internalizarea S. aureus prin aderența la valvele lezate ale inimii.
Factorii clumping( ClfA și ClfB) – favorizează aderența S. aureus la suprafețele dispozitivelor medicale implantate, fiind principalele adezine ce mediază legarea bacteriei la fibrinogen (Entenza și colab., 2000).
Proteina de legare a colagenului este implicată în infecțiile musculoscheletice. Prezintă o mare importanță în patogeneza infecțiilor musculoscheletale.
Bpb=proteina de legare a sialoproteinei osoase prezentă în infecțiile osoase și articulare.
Siloproteina osoasa este o glicoproteină a osului și matrixului extracelular al dentinei, ce se leagă la tulpinile de S. aureus, izolate din infecțiile osului și ale țesuturilor ușoare. Această glicoproteină este prezentă în concentrație mare în osteoid, țesutul osos nou format, care este cel mai frecvent situs pentru dezvoltarea osteomielitei (Chifiriuc și colab., 2011).
EbpS=Proteina de legare a elastinei promovează prezența și persistența S. aureus în plămâni, piele etc. Elastina este o componentă majoră a fibrei elastice a ECM care este o fibră polimerică insolubilă alcătuită din monomeri legați încrucișat de tropoelastină, ce sunt secretați ca precursori solubili în celule. Elastina joacă rol crucial în menținerea integrității structurale și funcționale a țesuturilor în care extensibilitatea reversibilă sau deformabilitatea este necesară (Chifiriuc și colab., 2011). Astfel, fibrele elastice și elastina sunt prezente în abundență în țesuturile ce necesită elasticitate: vase mari de sânge, piele, plămâni.
Efb= Proteina extracelulară de legare a fibrinogenului este secretată în mediu de culură în timpul fazei terminale a creșterii exponențiale, se leagă la fragmentul C3b și inhibă activarea clasică precum și cea alternativă a complementului. Efb atinge niveluri mari în faza târzie de creștere, prin inhibiția atașamentului mediat de Clf și astfel facilitează raspândirea bacteriilor în țesuturi. Studiile experimentale au demonstrat că Efb întârzie vindecarea leziunilor datorită inhibiției specifice a agregării plachetare (Cotar și colab., 2010).
Coagulaza- este o proteină extracelulară, bifuncțională fiind implicată în formarea cheagului de fibrină prin trecerea fibrinogenului în fibrină, se leagă de protrombină, ducând la coagularea plasmei recoltată pe anticoagulant (Entenza și colab., 2000).
Sinteza coagulazei de tulpinile de S. aureus, conferă potențial invaziv fiind un factor de virulență ce blochează accesul leucocitelor și a factorilor bactericizi (sintetizați de organismul uman în plasmă) la locul exudatului inflamator.
Eap=Proteina extracelulara de aderență sau adezina Eap- multifuncțională, prin care S. aureus leagă o serie de proteine plasmatice și ale matricei extracelulare, scopul principal fiind de a produce boli cronice ca artrita sau osteomielita printr-o serie de mecanisme ce favorizează internalizarea S. aureus în celule epiteliale și fibroblaste precum și modularea răspunsului imun (Foster și colab.,1998).
Etapa de internalizare se caracterizează prin interacțiuni specifice între anumite adezine ce asigură apoi supraviețuirea intracelulară a S. aureus ce determină persistența bacteriei pe termen lung, situație neexplicată.
Etapa de invazie și diseminare sistemică
În această etapă, invazinele sunt proteine extracelulare, secretate de S. aureus ce intervin în degradarea componentelor tisulare, precum și în invazie. Acestea pot fi și lipaze, nucleaze, coagulaze, hialuronidaza, stafilokinaza(Sak) (Gordon, 1998).
Peptidele bactericide sunt denumite și α-defensine, fiind sintetizate de gazde în scop de apărare, neutralizate de Sak astfel favorizând diseminarea S.aureus în organismul gazdă prin eliberarea acestuia din cheagul de fibrină.
Exoenzime=exoproteine=proteine extracelulare reprezintă factori de virulență secundari ce permit tulpinilor de S. aureus să treacă de la fenotipul adeziv la cel invaziv și transformând țesutul gazdă în nutrienți necesari dezvoltării tulpinilor de S.aureus. Acești factori sunt prezenți și la stafilococii coagulazo-negativi (Dinges și colab, 2000).
Hemolizinele sunt enzime ce au rol citopatic și citolitic asupra limfocitelor, trombocitelor, hematiilor, leucocitelor, macrofagelor, neutrofile, celule hepatice, fibroblaste, limfoblaste. Cele mai frecvente în patologia stafilococică la om sunt α și δ hemolizinele ce formează pori in membrana celulelor gazdă cu alterarea balanței ionice a celulelor, ceea e duce la edem pulmonar și la sindromul de detresă respiratorie, pot conduce la distrugeri la nivelul tecii de mielină astfel declanșându-se artrita septică (Prevost și colab., 1995).
Lipazele și lecitinazele sunt enzime ce au capacitatea de a forma pori în membrana celulelor eucariote și acționează la nivelul stratului lipidic de la nivelul tegumentelor a glandelor sebacee, modificând citoscheletul. Lipazele au și rol de a inactiva lipidele bacteriide de la acest nivel (Chifiriuc și colab., 2011).
Hialuronidaza(hialuronat-liaza) distruge acidul hialuronic, component ce intră în compoziția matrixului celular. Este un factor de invazie-difuziune (Chifiriuc și colab.,2011).
Capitolul II- Antibiotice
2.1. CARACTERIZARE GENERALĂ
Termenul de antibiotic este folosit pentru acele substanțe chimice care au o greutate moleculară mică, ele fiind produse de microorganisme prin procese de biosinteză.
Antibioticele sunt substanțe care prin mecanismul lor inhibă creșterea de noi microorganisme. Antibioticele pot intra în competiție cu microorganismele pentru resurse, acest fenomen numindu-se antibioză. Antibioza este mecanismul opus simbiozei (Mihăescu și colab., 2007).
Trei grupe de microorganisme sunt producătoare de antibiotice: actinomicete, fungi filamentoși microscopici și bacilli Gram-pozitivi (Mihăescu și colab., 2007).
S-au inventariat aproximativ 5000 antibiotice identificate, însa s-au evaluat cifre de ordinul a zeci de mii (Mihăescu și colab., 2007).
2.2. ANTIBIOTICE-METABOLIȚI SECUNDARI
Substanțele asimilate de celulă, sunt folosite de aceasa în diferite mecanisme: sinteza de metaboliți primari (aminoacizi, enzime), pentru biosinteza constitenților ce ajută la creșterea celulei. Un alt mecanism este reprezentat de producerea energiei prin metabolism energetic precum și producerea metaboliților secundari (alcaloizi, giberelina) (Mihăescu și colab., 2007).
Metaboliții secundari au numeroase caracteristici definitorii: au structuri chimice particulare, conțin legături neobișnuite precum inele β-lactamice, legături nesaturate de poliacetilene și poliene precum și inelul macrolidelor.
O caracteristică importantă este faptul că metaboliții secundari sunt produși doar de unele specii ale unui gen astfel în prezent există cel puțin 10 peniciline naturale, cel puțin 10 bacitracine, 25 actinomicine etc (Mihăescu și colab., 2007).
Antibioticele sunt metaboliți secundari ce au perioadă de sinteză târzie, la intrarea în faza staționară. Se consideră că sinteza metaboliților secundari ce fac parte din categoria antibioticelor este rapida când celula intră în faza staționară și este supresată în momentul în care celula se află în faza de multiplicare activă (Mihăescu și colab., 2007).
Se consideră că microorganismele produc antibiotice doar când scade sub un anumit nivel rata specifică de crșstere. S-a constatat că în medii bogate în substanțe nutritive, producerea de antibiotice nu este necesară datorită resurselor ce satisfac metabolismul organismului.
Microorganismele evită efectul letal al antibioticelor prin modificarea acestora de către enzime sintetizate de organismele ce le produc (Mihăescu și colab., 2007).
Metaboliții secundari sunt substanțe neesențiale pentru organismul care le produce, acești metaboliți prezintă o serie de activități biologice precum: Inhibiția creșterii și uneori efectul letal asupra altor microorganisme prezente în mediu, efecte toxice, stimularea diferențierii microorganismelor și rolul lor în transportul de ioni metalici (Mihăescu și colab., 2007).
2.2.1. CLASIFICAREA ANTIBIOTICELOR ÎN FUNCȚIE DE STRUCTURA CHIMICĂ (Tabel 1)
Tabelul nr. 1 – Clasificarea antibioticelor în funcție de structura chimică (Mihăescu și colab., 2007).
2.2.2. CLASIFICAREA ANTIBIOTICELOR ÎN RAPORT CU MECANISMUL PRIN CARE INHIBĂ DEZVOLTAREA MICROORGANISMELOR(Tabel 2)
Tabelul nr. 2- Clasificarea antibioticelor în funcție de mecanismul prin care inhibă dezvoltarea microorganismelor (Duca și colab., 1979).
2.2.2.1. Antibiotice care inhibă sinteza peretelui celular
Peretele celular are rol de a conferi forma specifică și rigiditate celulei bacteriene precum și de a asigura menținerea integrității structurale a celulei (Mihăescu și colab., 2007).
Bacteriile Gram-pozitive au peretele celular gros (Fig. 5), greutatea sa fiind împartită în 80-90% peptidoglican, restul fiind reprezentat de proteine și polizaharide. Acizii teichoici sunt polizaharidele caracteristice, ei fiind molecule polimere sub formă de lanțuri lungi care ies la suprafață (Herlea,1998).
La bacteriile Gram-pozitive, antibioticele penetrează ușor stratul superficial(Duca și colab., 1979).
Fig. 5: Strucura peretelui celular la bacteriile Gram-pozitive (http://www.scritub.com/biologie/STRUCTURA-CELULEI-BACTERIENE71549.php).
Antibioticele β-lactamice inhibă sinteza peretelui celular și inhibă polimerizarea peptidoglicanului.
Antibioticele β-lactamice se clasifică în 4 grupe: peniciline, cefalosporine, monobactami și carbapeneme (Mihăescu și colab., 2007).
Penicilinele V și G:
Acestea sunt în general active față de toate speciile de bacterii Gram-pozitive precum și față de cocii Gram-negativi.
În prezent, acestea sunt folosite cel mai des, ele oferind un procent mare de sensibilizări în traumele repetate (Duca și colab., 1979).
Penicilinele de semisinteză rezistente la penicilinază:
Acestea au fost concepute pentru obținerea de peniciline superioare celor naturale.
Semisinteza de peniciline presupune două etape: O primă etapă reprezentată de obținerea acidului 6-aminopenicilanic și o a doua etapă reprezentată de actilarea chimică a acidului 6-aminopenicilanic .
Penicilinele de semisintezaă se clasifică în funcție de rezistența la penicilinază și spectrul de activitate în: peniciline rezistente la penicilinaze, fenoximetilpeniciline de uz oral și peniciline cu spectru larg (Oniga și colab., 2003).
Ele folosesc nucleul activ al produsului de biosinteză al penicilinelor.
Aceste peniciline se folosesc strict pentru tratarea infecțiilor cu stafilococi care sunt rezistenți la penicilinele G și V (Duca și colab., 1979).
Vancuomicina:
Acestea sunt antibiotice glicopeptidice fiind componente esențiale ale terapiei antiinfecțioase ele fiind active față de agenții infecțioși comuni.
Sunt active exclusiv față de bacteriile Gram-pozitive prin formarea unor complexe stabile și specifice, necovalente astfel se va inhiba formarea punților peptidice precum și creșterea peretelui celular (Mihăescu și colab., 2007).
Vancomicina este un antibiotic glicopeptidic, izolat inițial dintr-o tulpină de Streptomyces orientalis, antibioticul fiind folosit pentru tratamentul infecțiilor cu bacterii Gram-pozitive (Mihăescu și colab., 2007).
Vancomicina este o moleculă ce conține azot și glucide, usor solubilă în apă și rezistentă la acțiunea unor enzime hidrolitice. Este activă atât față de bacteriile Gram-pozitive precum și față de unele spirochete (Mihăescu și colab., 2007).
Ca mecanism de acțiune, Vacomicina inhibă sinteza peretelui celular dar și lezează componentele membranei astfel se produce moartea celulei.
Vancomicina formează un complex cu resturile de D-ala carboxiterminale ale precursorilor peptidoglicanului ceea ce duce la întreruperea sintezei peretelui celular.
Rezistența la Vancomicină este naturală. La Lactobacillus, bacil Gram-pozitiv, rezistența se datorează faptului că lactat (D-alanil-D-lactat) înlocuiește alanina terminală din gruparea laterală a moleculei de peptidoglican.
La S. aureus, în vitro, are o sensibilitate uniformă la vancomicină însă în cazul endocarditei, apar adesea insuccese ale tratamentului. Cauza acestor nereușite se consideră a fi toleranța care reprezintă un fenomen ce se manifestă prin faptul că mici concentrații de antibiotic sunt inhibitoare ale creșterii astfel efectul bactericid se produce doar când concentrațiile sunt mari (Mihăescu și colab., 2007).
Bacitracina:
Inițial a fost folosită pentru tratamentul infecțiilor severe cu stafilococi.
Antibioticul este tolerant în aplicații locale, răni chirurgicale precum și ochi, urechi și mucosae.
Funcțiile antibioticului sunt numeroase, acesta inhibă dezvltarea altor mecanisme în mediu, alterează membranele celulelor producătoare astfel se ușurează eliberarea produselor. Alte funcții sunt reprezentate de capacitatea de represare a creșterii vegetative sau inițierea sporulării precum și rolul de unitate structurală a învelișului sporal.
Datorită toxicității, utilizarea antibioticului a fost limitată la aplicarea locală.
Ca mecanisme de acțiune, Bacitracina dezorganizează membrana externă a unor bacterii și inhibă sinteza de proteine și perete celular (Mihăescu și colab., 2007).
Ampicilina, Cefotaximul și Meticilina – au cea mai mare activitate bactericidă. Ele induc schimbări morfologice ample ce includ chiar formarea de leziuni membranoase prin care se pierde din conținutul citoplasmatic (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/2296040).
Monobactamii sunt antibiotice β-lactamice cu nucleu β-lactamic monociclic. Acestea sunt în principal active pe bacilli Gram-negativi aerobi.
Ex: Aztreonam, prin fixare de proteine receptoare, împiedică sinteza peretelui celular al bacililor Gram-negativi (http://www.qreferat.com/referate/medicina/MONOBACTAMII114.php).
Tribactamii reprezintă o grupă majoră de betalactamine, ei având o structură chimică alcătuită din 3 nuclee condensate.
Ex: Sanfetrinem- primul preparat folosit, are spectru larg fiinf activ pe bacteriile Gram-pozitive dar și pe cele Gram-negative aerobe precum și anaerobe. Acesta este rezistent la acțiunea betalactamazelor din toate clasele. Efectul pe care îl exercită este unul bactericid rapid (Anghelescu,1998 ).
Carbapenemele este un grup de antibiotic care prezintă un efect bactericid. Ele conțin un antibiotic β-lactamic precum și un compus care va împiedica degradarea medicamentelor în rinichi (Mihăescu și colab., 2007).
2.2.2.2. Antibiotice care modifica permeabilitatea membrane plasmatice
Prin interacțiunea unor antibiotice cu membrana plasmatică a celulelor bacteriene se produce o creștere a permeabilității membranei selective precum și pierderea unor proprietăți ale membranei. În urma acestor modificări are loc moarte celulelor prin liză osmotică(Mihăescu și colab.,2007).
Protoplastul bacteriilor și al fungilor este limitat de o membrană ce prezintă o structură similară cu cea a celulelor animale ceea ce explică toxicitatea mare a antibioticelor polienice antifungice și polipeptidice antibacteriene (Duca și colab., 1979).
Polimixinele sunt singurele antibiotice care acționează și în faza staționară și de latența metabolică a bacteriilor (Mihăescu și colab., 2007). Acestea acționează ca un detergent asupra membranei plasmatice. Sensibilitatea speciilor variază ceea ce explică specificitatea interacțiunii dintre microorganism și antibiotic (Mihăescu și colab., 2007).
Polienele inhibă creșterea micoplasmelor care conțin steroli și măresc eficiența altor antibiotice.
Aceste antibiotice se utilizează în general în tratamentul micozelor (Mihăescu și colab., 2007).
Polienele au toxicitate mai mare pe cale parentală deoarece membrana hematiilor conțin sterolul (Duca și colab., 1979).
Amfotericina B are ca mecanism de acțiune ce constă în legarea ergosterolului (din membrana plasmatică a celulei fungice). Ca efect se observă creșterea permeabilității membranei ceea ce duce la ieșirea din celulă a unor molecule esențiale.
Nistatinul se administrează pentru tratamentul infecțiilor cu Candida (Mihăescu și colab., 2007).
2.2.2.3. Antibiotice care inhibă sinteza proteinelor
Sinteza proteinelor implică selecția ARNt inițiator, selecția codonului de inițiere pe ARNm și interacția ARNm și ARNt inițiator.
Unele antibiotice sunt active față de ribosomii celulelor EK și altele acționează selectiv asupra ribosomilor celulei PK.
Unele antibiotice se leagă de subunitatea ribosomală mare iar altele se leagă de subunitatea ribosomală mică (Mihăescu și colab., 2007). Antibioticele ce au acțiune asupra ribosomilor sunt molecule complexe, ele favorizând interacțiunile ionice cu ARNt (Mihăescu și colab., 2007).
Antibioticele cu acțiune asupra ribosomilor trebuie să pătrundă în citoplasmă spre deosebire de cele care blochează sinteza de mureină la nivelul suprafeței externe a membranei citoplasmatice.
Din punct de vedere chimic, majoritatea antibioticelor din această clasă sunt aminoglicozide policationice care prezintă molecule polare. Acestea au o regiune hidrofobă mare ce are rol în a ușura difuzia prin stratul lipidic al membranei (Mihăescu și colab., 2007).
Tabelul nr. 3: Inhibitori ai sintezei proteice (Cristea și colab., 1991).
Exemple de antibiotice inhibitoare ale sintezei proteinelor:
Aminoglicozidele (Streptomicina și Kanamicina): Sunt antibiotice cu activitate bactericidă dependentă de concentrație. Aceste antibiotice sunt solubile în apă și insolubile în solvenți organici. Antibioticele interacționează ionic cu suprafața externă a celulei fiind ulterior transportate în celulă (Mihăescu și colab., 2007).
Aminoglicozidele au spectru larg de acțiune, fiind utilizate în tratamentul tuberculozei. Aceste antibiotice fac parte din categoria antibioticelor cele mai rapid bactericide (Matinca, 2002).
În funcție de natura agliconului, aminoglicozidele se clasifică în: aminoglicozide cu aglicon streptidinic, și aminoglicozide cu aglicon 2-dezoxistreptaminic.
Ca mecanism de acțiune, aminoglicozidele sunt bactericide pe germeni în curs de multiplicare. Acestea penetrează în celula printr-un mecanism de transport activ ce implică prezența oxigenului astfel, bacteriile anaerobe sunt excluse din spectrul de activitate al lor.
Rezistența bacteriană la aminoglicozide poate fi naturală pentru bacteriile anaerobe și câștigată plasmatic pentru bacteriile aerobe. Rezistența câștigată plasmatic apare ca urmare a modificării activităților enzimatice a germenilor, ceea ce duce la transformarea unor funcții importante activității aminoglicozidelor (acetilarea grupărilor funcționale amino ale glicozidelor, fosforilarea grupelor hidroxilice și nucleotidilarea grupelor hidroxilice) (Oniga și colab., 2003).
Macrolidele (Eritromicina, Clindamicina): Sunt antibiotice a căror structură e reprezentată de un macrociclu lactonic ce este substituit cu numeroși radicali. În funcție de structura chimică a macrociclului, macrolidele pot fi polienice (au acțiune antimicotică) și nepolienice (au acțiune antibacteriană) (Oniga O. și colab., 2003).
Rezistența bacteriană este de natură plasmidică, ea dezvoltându-se prin metilarea situsului de fixare al antibioticului astfel aparând o rezistență de tip încrucișată față de macrolide dar și față de alte clase de antibiotice ce acționează după fixarea pe același situs.
Creșterea rezistenței bacteriene la macrolide a apărut în principal la bacteriile Gram-pozitive ( Streptococcus pneumoniae și pyogenes și Staphylococcus aureus) (Oniga O. și colab., 2003).
Puromicina: Este un antibiotic ce inhibă sinteza proteinelor și creșterea tuturor organismelor. Ca principal mecanism de acțiune, puromicina a fost definită ca rezultat al investigației mecanismului de biosinteză a proteinelor. Efectul puromicinei este bacteriostatic și constă în oprirea creșterii celulei, sinteza de ARN și ADN continuând în mod normal, însă sinteza de proteine fiind inhibată total (Mihăescu și colab., 2007).
Bacteriile Gram-pozitive sunt mai sensibile spre deosebire de cele Gram-negative, diferența de sensibilitate datorându-se înglobării reduse a puromicinei (Mihăescu și colab., 2007).
2.2.2.4. Antibiotice cu țintă asupra replicarii ADN
Quinolonele sistemice: sunt antibiotice care au ca acțiune subunitatea A a ADN-girazei de care se fixează și împiedică sinteza ADN astfel având un efect bactericid.
ADN giraza este o topoizomerază ce are rol important în menținerea geometriei spațiale a moleculei de ADN. Alterările la nivelul mecanismului de funcționare a topoizomerazei duc la dereglarea cantitativă și calitativă a exprimării genelor precum și alte procese ce vor suferi modificări(Matinca,2002).
Pentru a își atinge ținta, quinolonele traversează peretele bacterian, folosindu-se de lipopolizaharide, fie de porine, în ambele cazuri fiind vorba de o difuzie pasivă.
La bacteriile Gram-pozitive, ținta principală de acțiune a floroquinolinelor este topoizomeraza IV care prezintă din punct de vedere structural, similitudini cu ADN giraza.
La S. aureus, diminuarea acumulării intracitoplasmatice apare datorită unui mecanism de eflux ce afectează în general moleculele hidrofile de antibiotic (Matinca, 2002).
2.2.2.5.Antibiotice cu tinta asupra transcrierii
Rifamicinele: Sunt antibiotice cu activitate bactericidă specifică bacteriilor Gram-pozitive aerobe dar și anaerobe. Ținta de acține a acestor antibiotice este reprezentată de transcriptaza căreia îi inhibă activitatea astfel fiind împiedicată transcrierea.
Rezistența la acest tip de antibiotic este de deterinism cromozomial, cel mai frecvent apărând în monoterapie astfel s-a stabilit că este inidicată asocierea acestui tip de antibiotic cu alte antibiotice.
Nitrofuranii: Sunt antibiotice utilizate în general în tratarea infecțiilor urinare și digestive.
Aceste antibiotice au spectru larg, cocii Gram-pozitivi fiind sensibili în general.
Ținta lor de acțiune e reprezentată de ADN, interacția acestor antibiotice cu ADN provocând rupturi ale catenelor ceea ce duce la substituții ale bazelor azotate.
Mecanismul de producere este reprezentat de scăderea permeabilității membranare precum și de determinism cromozomial (Matinca, 2002).
1.2.2.6 Antibiotice care blochează sinteza metaboliților secundari
Sulfamidele: Sunt antibiotice cu spectru larg, la unele specii însă, prezinta o rezistență naturală ( ex: Enterococcus fecalis).
Bacteriile realizează sinteza folaților exogeni în 2 etape, prima etapă fiind cea de sinteză a acidului dihidrofolic, a pteridinei, acidului paraaminobenzoic precum și a enzimei dihidropteroat, în a două etapă intervinind enzima dihidrofolatreductaza.
Sulfamidele inhibă sinteza folaților, ele acționând ca inhibitori competitivi ai celor două enzime.
Acțiunea sulfamidelor este reversibilă prin adăugare de metaboliți terminali.
Diminuarea permeabilității bacteriene este un mecanism de rezistență bacteriană la suflamide.
Un alt tip de mecanism de rezistență bacteriană e reprezentat de hiperproducția de acid paraaminobenzoic precum și modificarea dihidropteronatului prin hiperproducție de enzimă precum și sinteza unor enzime nefuncționale codificate de plasmide (Matinca , 2002).
Capitolul III- Mecanisme de rezistență la antibiotice la cocii Gram-pozitivi de interes medical din genul Staphylococcus
Utilizarea antibioticelor reprezintă o modalitate importantă de control al unor maladii infecțioase. Majoritatea microorganismelor producătoare de astfel de maladii sunt rezistente la antibiotice.
Rezistența este definită ca fiind capacitatea unui organism de a crește în prezența unui agent microbian. Rezistența se datorează nu numai unor gene cromosomale ci și a prezenței ADN-ului extracromosomal (rezistență mediată de plasmide) (Mihăescu și colab., 2007).
Unele specii prezintă rezistență naturală, denumită și rezistență intrinsecă sau înnascută iar altele sunt rezistente ca urmare a unor modificări genetice, aceasta din urmă fiind denumită rezistență dobandită.
Bacteriile care supraviețuiesc în prezența antibioticelor, au capacitatea de a se multiplica în continuare astfel se prelungesc afecțiunile, putând avea loc chiar și decesul (http://ecdc.europa.eu/ro/eaad/antibiotics-get-informed/factsheets/Pages/general-public.aspx).
3.1. Rezistența naturală
Acest tip de antibiotic se referă la bacteriile care nu prezintă nici un fel de sensibilitate la un anumit antibiotic, în stare naturală, fără a avea capaciatea de a dobândi factori de rezistență.
Ținta de acțiune a antibioticului este inaccesibila. Structurile care fac parte din învelișul celulei bacteriene vor forma bariere fizice de permeabilitate, aceste bariere având rol de a limita difuzia moleculară liberă. Absența țintei de acțiune a unui antibioticului este o cauză a rezistenței moleculare. La bacteriile Gram-pozitive, peretele celular gros și rigid, nu le conferă acestora protecție față de antibiotice.
Microorganismele prezintă o rezistență naturală fața de antibioticele pe care le sintetizează, acesta fiind un aspect important al rezistenței naturale (Mihăescu și colab., 2007).
Enterococii ca și streptococii, sunt în mod natural rezistenți la albastru de metilen, polimixine, cefalosporine, peniciline de semisinteză și aminoglicozide.
În comparatie cu streprococci, enterococci sunt mai puțin sensibili la penicilină și ampicilină, acestea având doar acțiune bacteriostatică (Straut, 1997).
3.2. Rezistența dobândită
Primul stadiu în obținerea rezistenței dobândite este reprezentat de toleranța sau de capacitatea bacteriei sa supraviețuiasca în prezența antibioticului, fără să continuie creșterea și diviziunea (Mihăescu și colab., 2007).
Rezistența se instalează când bacteriile, pe lânga faptul că supraviețuiesc, se și multiplică în mediu în care este prezent antibioticul. Toleranța va favoriza dezvoltarea rezistenței.
Rezistența la antibiotice, în majoritatea cazurilor, are un substrat genetic.
Bacteriile pot să dobândească rezistență la un antbiotic prin apariția unei mutații al unei gene cromosomale ce va determina ținta sau expresia genei cromosomale latente.
Pentru genele ce codifică factorii de rezistență la antibiotice se accepta două origini:
– Prin mutațiile unor gene cu rol în biosinteză ce au evoluat prin schimbarea substratului asupra căruia acționeaza, modificarea și inactivarea antibioticelor.
-Din genele de rezistență existente în mod natural (Mihăescu și colab., 2007).
Se cunosc mai multe tipuri de rezistență dobândită, clasificată după diferite criterii după Mărculescu și colab., 2007:
Tabelul nr. 4- Clasificarea rezistenței dobândite (Mărculescu și colab., 2007 ).
3.2.1. Rezistența cromozomală
Rezistența dobandita prin mutații:
Rezistența cromozomală este un tip de rezistență ce apare în urma unor mutații în secvențele de nucleotide a cromozomului bacterian ce va determina sinteza de proteine sau macromolecule ce diferă într-o masură mare de entitațile originale astfel nu vor putea să interfereze cu activitatea antibioticelor (Mărculescu și colab., 2007 ). Totodată, acest tip de rezistență se datorează fie unor mutații a unei gene ce codifică fie ținta antibioticului, fie sistemul de transport la nivelul membranei, fie controlează pătrunderea antibioticului. Frecvența mutațiilor spontane este cuprinsă între 10-7 – 10-9 (Lazăr, 2001).
Majoritatea studiilor referitoare la rezistența bacteriană s-au concentrat pe evenimentele mutaționale ale unor gene cromosomale (Mihăescu și colab., 2001).
Mutația este un proces genetic ce duce la dobândirea rezistenței la antibiotice. Modificările genetice de tipul mutațiilor punctiforme pot modifica sensibilitatea organismelor la diferite antibiotice prin modificarea structurală a țintei. Rezistența la sufonamide este o consecință a schimbării unui singur aminoacid în secvența enzimei pteridin-sintetaza ce determină sulfonamidele să se lege mai puțin eficient decât APAB (Mihăescu și colab., 2007).
Schimbările genetice macroevolutive implică rearanjarea segmentelor mari de ADN prin intermediul transpoziției. Dacă prin intermediul schimbărilor se vor deplasa gene de rezistență ce vor trece sub controlul unui nou promotor, organismul poate să devină rezistent.
În condiții de stres, bacteriile saprobiote și cele patogene iși sporesc net rata de mutații, adică vor deveni hipermutabile. Acestea își vor duplica informația de supraviețuire precum gene de rezistență la medicamente, localizea lor fiind pe transpozoni, plasmide și integroni.
Totodată, bacteriile au capacitatea de a își păstra materialul genetic ce le conferă un caracter selectiv-evolutiv și le oferă capacitatea de a conserva mutații avantajoase și în prezența acțiunii mecanismelor de reparare a ADN (Mihăescu și colab., 2007).
3.2.2. Rezistența mediată de elemente genetice mobile
3.2.2.1. Rezistența plasmidială
Plasmidele sunt molecule de ADN extracromozomal cu capacitate de replicare, ce poate conține gene de rezistență. Replicarea acestora are loc independent de ADN-ul cromozomal.
Plasmidele sunt importante în evoluția bacteriană deoarece afectează rezistența la antibiotice și bacteriofungi astfel asigurând o șansă mai mare de supraviețuire. În ciuda tuturor acestor aspecte, plasmidele nu sunt necesare pentru supraviețuirea bacteriei (Mărculescu și colab., 2007).
Genele codificate de plasmide sunt mobile intrinsec deoarece plasmidele pot fi transferate în interiorul unei specii sau chiar între specii bacteriene diferite.
Plasmidele R (Fig. 6) sunt plasmide ce conțin gene de rezistență, acestea fiind implicate mai rapid în aparția rezistenței față de mutația genetică (Mărculescu și colab., 2007 ).
Plasmidele R sunt plasmide de rezistență transmisibilă ce prezintă un caracter infecțios. Aceste plasmide sunt elemente genetice extractomosomale ce conferă celulei bacteriene rezistență simultană la mai multe antibiotice (Mihăescu și colab., 2007).
S-au identificat o serie plasmide R diferite. O singură celulă bacteriană poate să conțină mai multe plasmide diferite, o singură plasmidă poate avea mai multe gene de rezistență. O singură plasmidă R poate codifica simultan pentru mai mult de 10 antibiotice diferite (Mărculescu și colab., 2007 ).
Înrudirea chimică dintre diferite familii de antibiotice și o plasmidă, va duce la suprarezistența calitativă și cantitativă a bacteriilor.
Plasmidele R au fost evidențiate la mai multe bacterii însa au o importanță deosebită pentru stafilococi și alte bacterii Gram-pozitive la care determină rezistența la antibitoice și medicamente (Mihăescu și colab., 2007).
Fig. 6: Structura genetică a plasmidei R (http://bio3400.nicerweb.com/Locked/media/ch06/plasmid.html).
Plasmidele R au structură genetică complexă fiind alcătuite din mai multe categorii de determinanți genetici (Fig. 6) :
-gene ce conferă plasmidei funcție de conjugon. Aceste gene sunt grupate într-un transpozon și formează factor de transfer al rezistenței. Aceste gene se numesc tra, și au capacitatea de a codifica sinteza proteinelor necesare în transferul plasmidelor prin conjugare;
-genele „r” ce conferă rezistență la antibiotice. Genele „r” sunt structuri din cadrul unui transpozon, având o mobilitate accentuată, numărul acestor gene fiind variabil într-o celulă ;
-secvențe de inserție;
-secvențele „ori” ce inițiază procesul de replicare;
-gene ce asigură replicarea fizică, autonomă, a plasmidei (Mihăescu și colab., 2007).
Plasmida R nu conține determinanți genetici tra, transferul său facându-se prin transducție sau
prin conjugare inițiată de alte plasmide conjugative.
La enterococi, există o categorie specială de plasmide ce răspund la feromoni. Feromonii sunt peptide hidrofobe ce conțin 7-8 aminoacizi. Plasmidele sensibile la feromoni, codifică rezistență la bacteriocine și hemolizine precum și la antibiotice (Mihăescu și colab., 2007).
3.2.2.2. Rezistența mediată de elemente genetice transpozabile
A: Secvențe de inserție (SI).
Aceste tipuri de secvențe sunt cele mai simple elemente transpozabile. Secvențele de inserție, poartă gena pentru transpozază . Deoarece nu poartă nici o genă care codifică un caracter detectabil.
Lungimea acestor secvențe este mai mica de 1000 pb (Mihăescu și colab., 2007).
B: Integronii.
Integronii sunt secvențe ADN ce conțin determinanții genetici ai componentelor unui sistem de recombinare situs specific, ce recunoaște, captează și înglobează casete de gene mobile. Aceste casete de gene mobile se numesc casete genice (Pace și colab., 2007).
Majoritatea casetelor genice cuprind o singură rezistență la antibiotice.
Un integron este alcătuit dintr-o secvență ce codifică integraza și o altă secvență adiacentă de recombinare. Secvența adiacentă recunoaște situs specific de recombinare (Mihăescu și colab., 2007).
S-au descris 4 clase de integroni, din cele 4, cele mai importante fiind următoarele:
Integroni de clasa I: conțin gena de rezistență la sulfamidă
Integroni de clasa II: asociați cu Tn7.
Deobicei, integronii aparțin structurii unor transpozoni (Mihăescu și colab., 2007).
Caseta genică, se găsește sub două forme:
-Ca secvențp liniară într-un integron, caseta genică fiind flancată de secvențele 5’-3’ bine conservate. Regiunea 5’ conține gena int ce conține integraza- enzimă de recombinare situs specific, la capatul 3’ se gasindu-se o genă de rezistență la antibiotice;
-ca molecula de ADN circular, dublu catenar, ce poartă gene de rezistență și situs de recombinare cu rol de a integra caseta genică la situs specific aparținând unui replicon.
Integrarea într-un replicon a unei casete genice este reversibilă, caseta excizată se va integra într-un alt replicon.
Integronii mediază rezistența multiplă la antibiotice precum aminoglicozide, peniciline,
tetracicline, etc(Mihăescu și colab., 2007).
C. Transpozonii.
Traspozonii sunt secvențe de ADN, repetitive și mobile ce alcătuiesc fracții mari de gene de mamifere, incluzând aproximativ 45% din genomul uman (Pace și colab., 2007).
Genele structurale din alcătuirea transpozonilor sunt delimitate la extremități de SI invers repetate.
Transpozonii sunt secvențe genetice mobile ce au capacitatea de a se deplasa între plasmide și cromosom, de la o plasmidă la alta sau chiar transpozează între diferite situsuri ale aceleiași prasmide (Mihăescu și colab., 2007).
Transpoziția elementelor mobile nu implică schimb de material genetic ci adaos.
Aceste elemente mobile au capacitatea de a modifica exprimarea genelor adiacente, pot bloca transcrierea lor sau chiar pot accelera transcrierea ( Cristea și colab., 1991 ).
Tranpozonii sunt clasificați în 2 categorii (Fig.7):
-Transpozoni de clasă I sau Retrotranspozoni, transpuși printr-un ARN intermediar, utilizând revers-trascriptaza. Acești transpozoni includ secvențe alternante, lungi și scurte dar și elemente repetate lungi (Pace și colab., 2007).
Acești transpozoni folosesc intermediari ARN deci ei nu codifică pentru transpozază ci au capacitatea de a produce ARN transcris și apoi se bazează pe enzime de tipul revers-transcriptaza pentru a transcrie secvențele de ARN în ADN, secvența de ADN fiind apoi inserată în situsul țintă (http://www.nature.com/scitable/topicpage/transposons-the-jumping-genes-518).
-Transpozoni de clasa II sau transpozoni AND, transpuși printr-un ADN intermediar, printr-un mecanism de tipul „cut-paste” (Pace și colab., 2007).
Acesti transpozoni nu folosesc niciodată intermediari, întotdeauna se mută pe cont propriu și se excizează și se inseră în genom prin mecanismul de tip „cut paste” (http://www.nature.com/scitable/topicpage/transposons-the-jumping-genes-518).
Fig. nr. 7: Cantitatea de retrotranspozoni și ADN-transposoni în diferite genomuri EK ( http://www.nature.com/scitable/topicpage/transposons-the-jumping-genes-518).
S-a descoperit faptul că genele de rezistență la antibiotice pot să se transfere de la replicon la altul, această descoperire amplificând studiul transpozonilor (Mihăescu și colab., 2007).
Relocarea transpozonilor duce la instabilitate genetică asociată cu modificări fenotipice în cazul în care transpoziția va duce la inserția unui element transpozabil într-o genă structurală. Dacă transpoziția are loc într-o genă reglatoare care se gasește în stare represată, aceasta poate fi exprimată și la un nivel superior.
Unele secvențe transpozabile poartă secvențe promotoare ce pot influența expresia genelor din aval situsului de inserție, pot produce mutații polare (Mihăescu și colab., 2007).
Datorită capacității de transpoziție și inserție, transpozonii sunt factori majori de reorganizare a informației genetice și astfel se vor aglomera gene de rezistență într-o singură plasmidă.
Pentru ca un transpozon să transpozeze ca o entitate de sine stătătoare e obligatoriu ca endonucleaza (transpozaza) să recunoască extremitățile sale în care se găsesc întotdeauna secvențe invers repetate, secvențele invers repetate având rol de situs de recunoaștere pentru
transpozază ( Mihăescu și colab., 2007).
Astfel, capetele transpozonilor vor avea urmatoarea secvență (Mihăescu și colab., 2007).:
La un capăt secvența: 5’AAAACCCGGT3’
3’TTTTGGGCCTA5’
La celălalat capăt va avea secvența: 5’ACCGGGTTTT3’
3’TGGCCCAAAA5’ (Mihăescu și colab., 2007).
D. Transferul genelor
Transferul orizontal al genelor: Rezistență multiplă, apărută prin mutantele rezistente la
antibiotice, ține seama de 2 factori:
-flxul genetic la bacterii este mai amplu decât la celelalte organisme, rata transferului pe orizontală fiind superioară spre deosebire de rata de apariție și selecție a mutantei
-antibioticele folosite pe scară largă și expunera multiplă a bacteriilor (Mihăescu și colab., 2007).
Una din căile majore de rezistență a bacteriilor este reprezentată de dobândirea pe orizontală a ADN exogen . Schimbul genetic pe orizontală reprezintă transferul informației genetice între celule bacteriene. ADN exogen se dobândește prin transfer, prin conjugare între specii diferite sau pe cale plasmidială între plasmidele ce poartă gene multiple de rezistență la antibiotice.
Fluxul genetic pe verticală reprezintă mecanismul de transmitere a informației genetice în generații succesive de celule, în timpul diviziunii. Schimbul genetic orizontal este reprezentat prin mecanisme precum: conjugare, transformare și transducție (Mihăescu și colab., 2007).
Transferul conjugativ al genelor de rezistență la bacteriile Gram-pozitive
a. Conjugarea reprezintă transferul ADN de la o celulă donoare la una receptoare prin contact direct, mediat de un aparat de conjugare reprezetat de un complex de proteine specializat.
Proteinele esențiale pentru realizarea transferului conjugativ al plasmidelor sunt relaxazele ADN. Generarea unui intermediar plasmidial monocatenar este consecința acțiunii relaxazei ADN ce clivează legătura fosfodiesterică a situsul nic dintr-un dinucleotid (Mihăescu și colab., 2007).
Conjugarea are rol important în răspândirea rezistenței bacteriene la antibiotice. Acest proces implică contactul celular direct al celor două celule precum și transferul ADN-ului. Conjugarea bacteriană se poate produce între specii neînrudite și chiar între genuri diferite (Mihăescu și colab., 2007).
b. Transformarea genetică reprezintă mecanismul de preluare de către celula bacteriana a unui fragment de ADN exogen ce trebuie să fie inserat în cromosomul celulei gazdă prin recombinare omoloagă. Recombinarea omoloagă reperezintă procesul de înlocuire a unei părți de cromosom cu un ADN omolog (Mihăescu și colab., 2007).
3.2.3. Mecanisme biochimice ale rezistenței
Rezistența bacteriilor față de antibiotice, atât rezistența dobândită cât și cea naturală, se realizează prin mecanisme variate (Anghelescu, 1998).:
3.2.3.1. Afectarea antibioticului
Modificări care pot duce la afectarea antibioticului sunt reprezentate mecanisme de degradare ( hidroliza de către β-lactamaze) sau modificare a antibioticului ( prin anexare de radicali) (http://documents.tips/documents/antibiotice-559793f715690.html).
Inactivarea enzimatică a antibioticelor este un mecanism comun prin care se naște rezistență la o varietate largă de tipuri de antibiotice. Genele codificatoare ale enzimelor ce inactivează antibioticele se găsesc în rezerva naturală de gene de rezistență: bacterii din sol ce trăiesc în apropierea organismului ce produce antibiotic. Genele ce codifică sinteza de enzime inactivatoare pot fi transferate prin conjugare plasmidială.
Antibioticele pot fi inactivate prin 2 modalități: clivaj enzimatic și modificare chimică. În urma acestor două mecanisme, antibioticele nu mai pot interacționa cu ținta specifică.
Modificarea chimică oferă rezistență clinică la aminoglicozide, cefalosporine etc (Mihăescu și colab., 2007).
β-lactamazele sunt enzime care au capacitatea de a hidroliza inelul β-lactam al antibioticelor β-lactamice astfel având loc inactivarea completă a antibioticului. β -lactamazele pot avea fie determinism plasmidial, fie cromozomial. Genele pentru β-lactamaze sunt localizate în cromozom sau plasmide și sunt translocate din și în cromozom sau de către transpozoni, în altă plasmidă.
β-lactamazea S. aureus există în patru forme distincte serologic, forme legate strâns la nivel molecular, producerea acesteia putând fi mediată plasmidial sau cromozomal (Mărculescu și colab., 2007 ).
Unele bacterii Gram-pozitive au o enzimă cu funcție dublă, aceasta inactivând aminoglicozidele prin activitatea acetiltransferazei și fosfotransferazei (Mihăescu și colab., 2007).
3.2.3.2. Afectarea țintei antibioticului
a. Modificarea permeabilității învelișurilor bacteriene prin alterări structurale ale învelișurilor bacteriene sau modificarea sistemelor de transport activ al antibioticelor prin învelișurile bacteriene;
b. Alterarea sediului țintă al acțiunii antibioticului prin modifiarea PBP, modificarea proteinei ținta ribozomale și diminuarea afinității țintei de acțiune pentru quinolone, cauzată de o modificare structurală a ADN girazei (Mărculescu și colab., 2007 );
c. Efluxul activ al antibioticelor: Celulele bacteriene au o varietate de sisteme de transport membranar cu funcții vitale. Identificarea acestor sisteme de transport se datorează utilizării unor tehnici de clonare precum și secvențierii (Mihăescu și colab., 2007). Prin acest mecanism, se împiedică realizarea unor concentrații eficiente de antibiotice în celula bacteriană;
d. Modificarea unor enzime;
e. Deficitul de acțiune al unor enzime;
f. Achiziționarea de către bacterii a unor enzime;
g. Producția crescută a metabolitului cu care agentul microbian este în competiție (Mărculescu și colab., 2007 ).
3.2.3.3. Modificări de permeabilitate și transport
În urma acestor modificări se diminuează cantitatea de antibiotic ce pătrunde în celula bacteriană (http://documents.tips/documents/antibiotice-559793f715690.html).
Modificările de permeabilitate pot apărea în urma unor mutații ce pot afecta porinele la bacteriile Gram-negative, modificarea prin mutație ale proteinelor de transport.
Proteinele de eflux sunt proteine particulare ce au rol de pompe de expulzare a antibioticului. Aceste pompe de eflux pot determina rezistență la tetracticlină ( prin intermediul plasmidelor ce codifică proteine de eflux) sau rezistență la fluoroquinolone, cloramfenicol etc (http://documents.tips/documents/antibiotice-559793f715690.html).
Modificarea permeabilității poate duce la observarea fenomenului de corezistență la o anumită familie de antibiotice (ex: rezistență la antibioticele hidrofile)
(http://documents.tips/documents/antibiotice-559793f715690.html).
Partea experimentală
Capitolul IV- Markeri genotipici de rezistență și virulență la meticilină la tulpini de S. aureus izolate din pustule infecțioase
4.1. Scop și obiective
Această lucrare are ca scop descrierea corelațiilor dintre rezistența la meticilină și producerea factorilor de virulență la tulpini de S. aureus izolate din clinică, și evidențierea determinismului genetic al rezistenței la meticilină și al factorilor de virulență ai acestor tulpini.
4.2. Obiectivele studiului
1. Testarea rezistenței la antibiotice a tulpinilor de S. aureus prin metoda disc difuzimetrică adaptată.
2. Studiul genotipic al factorilor de virulență și corelarea acestora cu rezistența la meticilină la tulpinile analizate
4.3. Materiale și metode
4.3.1. Materiale de lucru
În prezenta lucrare au fost analizate un număr de 42 de tulpini de S. aureus izolate în anul curent, din pustule infecțioase în secția de Dermatologie a Spitalului Elias din Bucuresti (tabelul 5).
Tabelul nr. 5 – Codul de laborator și sursa de izolare al tulpinilor de S. aureus izolate din mediul spitalicesc.
4.3.2. Extracția ADN din tulpinile de S. aureus
S-a realizat folosind protocolul de lucru de extracție alcalină a ADN:
20 µl NaOH 0.05M
SDS 0.25%
1-5 colonii S. aureus
din fiecare tulpină s-a obținut o suspensie celulară care a fost denaturată 15 min, la 95 oC
Se adaugă 180 µl TE
Se centrifughează 3 min, la 13.000 rpm
Se recuperează supernatantul care este utilizat în reacția de amplificare
4.3.3. Amplificarea ADN (tehnica PCR)
Amplificarea ADN se realizează prin tehnica PCR multiplex pentru factorii de virulență. Pentru aceasta se realizează un amestec de de reacție ce conține H2O, nucleotide, primeri, enzima Taq-polimeraza, clorură de magneziu și tampon, la care se adaugă în final proba de ADN. Reacția de polimerizare a fost realizată într-un volum de 20 µl.
Primerii utilizați pentru amplificarea ADN sunt prezentați în tabelul 6:
Tabelul nr. 6 – Secvența primerilor de virulență (Cotar și colab., 2013).
4.3.4. Electroforeza ADN
– se prepară gelul de electroforeză 1%: agaroză (1g), tampon TBE 0,5X (Tris, EDTA, acid boric), bromură de etidium (cu rolul de a colora benzile ADN pentru a fi vizibile în domeniul ultravioletelor)
– agaroza se dizolvă în TBE 0,5X pe baie de apă
– gelul cald (aproximativ 60 oC) se toarnă în cuva de electroforeză, se adaugă pieptenele și se lasă la solidificare – după răcire se scoate pieptenele, și gelul se scufundă în tampon de migrare TBE 0,5X
– în godeuri se adaugă probele ce conțin: loading buffer (tampon de încărcare) și 2 µl probă ADN
– în godeurile martor, se pune doar tamponul de încărcare și markerul de greutate moleculară
– se conectează la sursa de curent electric
– timpul de migrare este de 30 minute, iar tensiunea curentului electric – între 90 – 120 V, benzile de ADN migrând în funcție de greutatea moleculară
– gelul este vizualizat în UV la transiluminator.
4.4. Rezultate și discuții
Tulpinile MRSA reprezintă un patogen comunitar și spitalicesc, responsabil de o rată ridicată a mortalitații în ciuda terapiei antimicrobiene (Edwards și colab., 2012).
Experimentele desfășurate au avut în vedere studiul rezistenței moleculare a tulpinilor se S. aureus izolate din leziuni cutanate pustuloase.
4.4.1. Testarea rezistenței la antibiotice a tulpinilor de S. aureus prin metoda difuzimetrică
Pentru studiu au fost alese 42 tulpini de S. aureus recoltate din leziuni cutanate pustuloase, au fost însămânțate pe mediu geloză-sânge pentru obținerea culturilor proaspete de lucru purificate pe mediu Baird-Parker și pe mediu Chapman, pentru a se obține colonii izolate utilizate pentru realizarea antibiogramei.
În urma analizei prin metoda difuzimetrică a tulpinilor de S. aureus s-a observat faptul că 3 tulpini au prezentat fenotipul MRSA, 18 au prezentat rezistență la macrolide (19 la eritromicină și 18 la clindamicina).
Rezultatele antibiogramelor au fost centralizate in figurile 8 și 9.
Fig. 8 Rezistența la Macrolide, Aminoglicozide și Glicopeptide
Fig. 9 Rezistența la alte tipuri de antibiotice
4.4.2. Studiul genotipic al factorilor de virulență și corelarea cu rezistența genotipică la meticilină
Rezultatele reacțiilor PCR și electroforegramelor produșilor de amplificare a evidențiat prezența următoarelor gene de virulență comune la tulpini nosocomiale de S. aureus: gena hlg a fost identificată la un număr de n=7 tulpini; gena fib a fost identificată la n=15 tulpini, gena clfA a fost identificată la n=38 tulpini, gena clfB a fost identificată la n=37 tulpini iar gena bbp a fost identificată la n=6 tulpini (fig.10 ).
Fig. 10 Distribuția genelor de virulență la tulpinile de S. aureus analizate.
Hemolizina (Hla) este produsă de majoritatea tulpinilor, fiind implicată în patogeneză asociată septicemiilor, infecțiilor cutanate severe și pneumoniei. (Wilke, Wardenburg, 2010). Toxina este secretată sub forma unor monomeri inactivi, hidrosolubili ce se inseră în membrana celulei țintă la nivelul căreia formează strucruri cilindrice heptamerice (Dinges și colab.,2000).
Hemolizina este o toxină activă față de eritrocitele umane, fiind relativ rezistente. Ca mecanism de acțiune, hemolizina este o sfingomielinaza C, dependenta de Mg cu specificitate pentru sfingomielina și fosfatidilcolina (Mihaesu și colab.,2005).
Hemolizina (Hlg) și leucocidinele (Luk respectiv Panton- Valentine-PVL) sunt toxine formate fiecare din cate două componente cu acțiune sinergică, ambele necesare pentru hemoliza și toxicitate(Mihăescu și colab.,2005).
Tabelul nr. 7 -Factorii de virulență și rolul în patogeneza infecțiilor cu S. aureus (adaptare după Peacock, 2002 și Archer, 1998).
Fig. 11- Electroforegrama ampliconilor genei hlg. g1-L, g2-27, g3-22, g4-37, g5-20, g6-16, g7-38, g8-35, g9-8, g10-1, g11-11, g12-12, g13-39, g14-32, g15-18, g16-33, g17-9, g18-17, g19-34, g20-26, g21-6, g22-10, g23-28, g24-7. Tulpini pozitive pentru gena hlg: 37,1,9
Fig. 12 – Electroforegrama ampliconilor genei hlg. g1-L, g2-5, g3-13, g4-3, g5-40, g6-30, g7-14, g8- 15, g9-2, g10-19, g11-41, g12-36, g13-4, g14-25, g15-42, g16-31, g17-21, g18-23, g19-29, g20-24. Tulpini pozitive pentru gena hlg: 5,3,2,36
Gena hlg a fost descrisă pentru prima dată în anul 1938, gena cuprinzând 3 ORF-uri desemnate hlgA, hlgC și hlgB ce corespund genelor ce au fost identificate în special de Cooney.
S. aureus reprezintă o excelentă sursă de γ-hemolizină însă nu produce α-,β- sau δ- hemolizină (Kent și colab., 2009).
Această genă, ca și gena hld, Luk, PVL au o caracteristică unică, fiind alcătuite din două proteine separate, solubile în apă. Proteinele LukF, LukS și Hlg2 sunt derivate din locusul Hlg și au fost descoperite la 99% dintre tulpinile de S. aureus izolate (Kaneko J. și colab., 2004).
Hemolizina δ este produsă de 97% din tulpinile de S. aureus . Aceasta are rol de a induce liza eritrocitelor, a unor structuri subcelulare precum și a altor tipuri de celule mamaliene. Prezintă activitate dermonecrotică (Dinges și colab.,2000)
Fig. 13.-Electroforegrama ampliconilor genelor fib, clf A și clfB.g1-L, g2-38, g3-21, g4-20, g5-31, g6-40, g7-6, g8-1, g9-9, g10-7, g11-17, g12-11, g13-12, g14-19, g15-29, g16-2, g17-25, g18-5, g19-15, g20-41, g21-14, g22-33, g23-28, g24-3. Tulpini pozitive pentru gena fib 38; 31; 40; 1; 11; 19; 2; 14; 28; 3. Tulpini pozitive pentru gena
clfA 38; 21; 20; 31; 40; 6; 1; 9; 7; 17; 11; 12; 19; 29; 2; 5; 15; 41; 14; 33; 28; 3. Tulpini pozitive pentru gena clfB 38; 21; 20; 31; 40; 6; 1; 9; 7; 17; 11; 12; 19; 29; 2; 5; 15; 41; 14; 33; 28; 3.
Fig.14 –Electroforegrama ampliconilor genelor fib, clfA, clfB.g1-L, g2-22, g3-10, g4-34, g5-32, g6-13, g7-36, g8-30, g9-23, g10-37, g11-24, g12-26, g13-4, g14-27, g15-18, g16-8, g17-35, g18-16, g19-39. Tulpini pozitive pentru gena fib(34; 24; 26; 4; 16. Tulpini pozitive pentru gena clfA 10; 34; 32; 13; 36; 23; 37; 24; 26; 4; 27; 18; 3;5 16; 39 . Tulpini pozitive pentru gena clfB 10; 34; 32; 13; 36; 23; 37; 24; 26; 4; 27; 18; 35; 16; 39.
ClfA a fost unul dintre primii factori de virulență validat preclinic, apartinând S. aureus iar ca rezultat al acestor descoperiri preclinice, antigenele ClfA au fost autorizate de către mai multe societăți pentru a fi incluse în abordările actuale de vaccin multiantigen în dezvoltarea clinică. Laboratorul Schneewind și altii au descoperit că, ClfA funcționează ca un factor de adeziune și apare ca prim efect în timpul infecției. Funcția primară a ClfA este de a adera la fibrinogenul uman în timpul inițierii unei infecții (Anderson A. și colab., 2016).
Genele clf A și clfB reprezintă factori de virulență importanți pentru capacitatea S. aureus de a adera și a invada celula gazdă precum și de a sustrage răspunsuri imune ale gazdei. Testul Staphaurex latex agglutination a fost realizat pe o colecție de S. aureus izolate de la bovine mastitei. 54% (43/79 izolate) dintre izolate au fost negative pentru testul Staphaurex latex agglutination. Pentru a obține informații referitoare la motivele pentru frecvența mare a Staphaurex-bovin negativ la bovinele matistei, s-au examinat genele clfA, clfB, fnbA și fnbB.
Modificări specifice în interiorul acestor gene precum și pierderea fnbB, pot afecta funcțiile genelor (Stutz K. și colab., 2010).
Fig.15 – Electroforegrama ampliconilor genei bbp. G1-L, g2-28, g3-25, g4-11, g5-32, g6-1, g7-12, g8-36, g9-24, g10-18, g11-7, g12-13, g13-33, g14-5, g15-31, g16-3, g17-6, g18-23, g19-14, g20-27, g21-30, g22-8 g23-39, g24-42, g25-26, g27-16, g28-34. Tulpini pozitive pentru gena bbp (25; 12; 36; 7; 14; 39.)
Bolile asociate cu gena bbp sunt osteomielita și artrita septică. Prezența genei ce codifică pentru bbp la S. aureus a fost descrisă în 2009 ca fiind cauza unor infecții de implanturi ortopedice. Conform dovezilor, expresia genei la S. aureus se poate corela cu gene pentru rezistență la meticilină și PVL. În 2010 a fost descrisă asocierea dintre reglatorul genei accesorii (agr) și prezența genei bbp la S.aureus.
Frecvența genei bbp la tulpini de S. aureus cauzează bacterimii însa această frecvență nu a fost foarte bine descrisă. În plus, bolile asociate cu bbp pot fi complicate, uneori ajungându-se la septicemie cu stafilococi (Wiśniewska K. și colab., 2013)
4.5.3. Rezistența la meticilină a tulpinilor de S.aureus
Tulpinile de S. aureus prezintă multi-rezistență la antibiotice fiind frecvent asociat cu valori epidemice inițiate de una sau mai multe clone, stafilococul auriu rezistent la meticilină (MRSA) fiind o marcă proeminentă a acestor epidemii.
Meticilina este un antibiotic -lactamic semi-sintetic. Tulpinile de S. aureus au dezvoltat rezistență la acest antibiotic prin achiziționarea unei gene mec (Staphylococcal Cassette Chromosome mec.), un element genetic ce prezintă numeroase variante structurale, păstrând însă unele elemente bine conservate (Plata și colab.,2009).
Expresia genei mec A este reglată de genele reglatorii mecI și mecR1 prin mecanisme similare reglajului genei blaZ de către genele blaI și blaR1 în tipul expunerii la penicilina (Lowy, 2003)
Rezistența la meticilină este indicator pentru multirezistența la antibiotice (Albrecht și colab., 2004).
S-au dezvoltat numerose metode moleculare pentru identificarea tulpinilor MRSA, tehnica SCCmec fiind cea mai importantă (Zhang și colab,2005).
Tulpinile MRSA au la nivel genomic un element mobil numic SCCmec ce conține gena mecA ce dă rezistență la meticilină (Zhang și colab, 2005).
Evidențierea tipului de caseta SCCmec permite detectarea și caracterizarea tulpinilor meticilino-rezistente (Motta Ferreira și olab.,2013).
Casetele SCCmec sunt esențiale pentru întelegerea epidemiologiei tulpinilor MRSA. Aceste casete sunt clasificate în tipuri bazate pe natura complexelor genice mec și ccr, fiind clasificate în funcție de regiune junkyard(J) a segmentelor ADN.
SCCmec este un element genetic mobil, caracterizat de prezența a două regiuni terminale, repetitive (complexul de gene mec și complexul de gene ccr) și a regiunilor J (Ito și colab, 2004; Ma și colab., 2002)
Există trei clase de gene mec (lasa A,B,C) și patru alotipuri de gene ccr (tip 1,2,3 și 5). Elementele SCCmec sunt clasificate în tipuri, în funcție de complexele genice mec și ccr și apoi sunt clasificate în subtipuri în funcție de diferențele regiunii J (Zhang și colab.,2005).
S-au efectuat două reacții multiplex PCR folosindu-se cinci, respectiv patru perechi de primeri specifici pentru diferite secvențe de la nivelul casetelor SCCmec, în vederea detectării simultane a unor elemente constitutive necesare clasificării acestora. Secvențele primeri-lor utilizați precum și parametrii de desfășurare ai reacțiilor au urmărit protocolul elaborat de Miheirico și colab., 2007.
Secvențele primerilor utilizați, specificitatea acestora, precum și programele de amplificare folosite sunt prezentate în tabelele 8 și 9 iar componentele utilizate în aceste reacții sunt redate în tabelul 10.
Tabelul nr. 8 . Secvențele nucleotidice ale primerilor utilizați, specificitatea acestora și dimensiunile ampliconilor obținuți (după Milheirico și colab., 2007).
Tabelul nr. 9. Condițiile PCR utilizate pentru amplificarea elementelor SCCmec (după Milheirico și colab., 2007).
Tabelul nr. 10. Componentele de reacție utilizate în reacțiile PCR.
De asemenea, s-au efectuat două reacții multiplex PCR folosindu-se câte patru perechi de primeri specifici în vederea diferențierii tipurilor și subtipurilor de casete SCCmec I…V. Secvențele primerilor utilizați precum și parametrii de desfășurare ai reacțiilor au urmărit protocolul elaborat de Zhang și colab. (2005).
Secvențele primerilor utilizați, specificitatea acestora, precum și programele de amplificare folosite sunt prezentate în tabelele 11 și 12 iar componentele utilizate în aceste reacții sunt redate în tabelul 10.
Tabelul nr. 11. Secvențele nucleotidice ale primerilor utilizați, specificitatea acestora și dimensiunile ampliconilor obținuți (după Zhang și colab., 2005)
Tabelul nr. 12. Condițiile PCR utilizate pentru amplificarea elementelor genetice corespunzătoare tipurilor de casete SCCmec (după Zhang și colab., 2005)
Toate reacțiile PCR au fost efectuate cu ajutorul aparatului Thermal Cycler Corbet. Produșii de amplificare pentru fiecare reacție PCR (multiplex/ simplex) au fost vizualizați prin electroforeză în gel de agaroză 2%, colorat cu bormură de etidium (10 g/ml) și identificați pe baza dimensiunilor caracteristice cu ajutorul unor markeri specifici de greutate moleculară (100pb, M-Bench Top 100bp DNA Lader, Promega, SUA). Gelurile au fost fotografiate cu instrumentul de documentare pentru geluri UVP
Fig. 16-Distribuția genelor de rezistență la meticilină la tulpinile de S. aureus analizate.
Fig. 17- Electroforegrama ampliconilor obținuti în reacția PCR pentru geneleType I, Type IV b. g1-L, g2-18, g3-30, g4-34, g5-35, g6-26, g7-22, g8-19, g9-42, g10-6, g11-9, g12-17, g13-11, g14-39, g15-1, g16-2, g17-37, g18-24, g19-33, g20-27, g21-25, g22-20, g23-8, g24-29, g25-15, g26-23, g27-3. Tulpini pozitive pentru gena Type IVb 26;27. Tulpini pozitive pentru gena Type IV a 19; 42 17; 32; 27
Deși tulpinile care prezintă casete SCCmec tip IV sunt asociate cu infecțiile comunitare, se observă prevalența acestora, fapt ce corespunde cu raportări ale unor autori care remarcau prezența la 87% din tulpinile de S. aureus, izolate pe o perioadă de doi ani, a casetelor SCCmec tip IV (Valsesia și colab., 2010). Székely și colab. (2012) au raportat, de asemenea, într-un studiu privind epidemiologia moleculară a S. aureus într-un spital clinic din România, procentul semnificativ al tulpinilor care conțin casete SCCmec tip IV sau III, casete SCCmec tip V fiind raportat doar sporadic. De regulă, tulpinile comunitare purtătoare de casete SCCmec tip IV și V sunt susceptibile la majoritatea antibioticelor cu excepția celor β- lactamice, spre deosebire de tulpinile nosocomiale purtătoare ale unor elemente SCCmec de dimensiuni mai mari (Gordon și Lowy, 2008).
Fig. 18- Electroforegrama ampliconilor obținuti în reacția PCR pentru gena Type IV a. g1-L, g2-39, g3-40, g4-41, g5-42, g6-L, g7-17, g8-6, g9-32, g10-14, g11-27, g12-15, g13-34, g14-30, g15-28, g16-38, g17-24, g18-35, g19-18, g20-29, g21-10, g22-5, g23-37, g24-40, g25-16, g26-26, g27-39, g28-13. Tulpini pozitive pentru gena Type IV a 34;28
Deoarece SCCmec tip IV și V au fost asociate cu infecțiile comunitare detectarea tipului V și diferențierea tipului IV în subtipurile IV a, b, c și d joacă un rol important în înțelegerea epidemiologiei și prevenirii și controlului tulpinilor comunitare MRSA (Zhang și colab., 2005) De aceea este necesara o metodă SCCmec mai robustă și mai simplă.
Este posibil ca unele tulpini MSSA (methicillin-sensibilă S.aureus) să conțină elemente SCC, dar să nu conțină gena mecA. Aceste elemente SCC servesc ca vehicul de transfer pentru markeri genetici variați, inclusiv genele ce codifică pentru rezistența la antibiotice și pentru virulență.
Ambele tehnici, cea traditionala PCR SCCmec și tehnica PCR multiplex țintesc un locus unic, dar rata tulpinilor necorespunzător detectate este variabilă (Zhang și colab., 2005)
Perez-Roth și colab. au gasit 11 clone neidentificabile din 375 izolate (2,93%) când au identificat tulpinile MRSA izolate pe o perioada de 5 ani dintr-un spital spaniol (Perez-Roth și colab., 2004). Chung și colab. au detectat 4 tulpini din 113 izolate (3,54%) ca neidentificabile când au izolat tulpinile MRSA dintr-un spital din Florida. Explicația acestor date se poate datora prezenței unor noi tipuri și subtipuri structurale, rearanjamente structurale și recombinări ale elementelor mec (Zhang și colab., 2005)
Fig. 19- Electroforegrama ampliconilor obținuti în reacția PCR pentru genele mec A, mecI, ccrB2. g1-L, g2-2, g3-3, g4-4, g5-5, g6-6, g7-7, g8-8, g9-9, g10-10, g11-11, g12-12, g13-13, g14-14, g15-15, g16-16, g17-17, g18-18, g19-19, g20-20, g21-21, g22-22, g23-23, g24-24, g25-25. Tulpini pozitive pentru gena mec A: 1;4;11. Tulpini pozitive pentru gena mec I:1;4;11;16. Tulpini potizive pentru gena ccr B2:11;16.
Absența genei mecA la tulpini cu fenotip MRSA ar trebui investigată, existând posibilitatea exprimării de către aceste izolate a genei mecALGA251 care codifică pentru o proteină alternativă PBP2a, deși în România nu au fost raportate, până în prezent, astfel de tulpini. Tiparea spa ar putea, de asemenea, oferi datele necesare privind originea acestor tulpini(Brakstad și Maeland, 1997; Plata și colab., 2009).
Fig. 20- Electroforegrama ampliconilor obținuti în reacția PCR pentru genele ccrB, mec A, mec I, SCC mec IIIJI și kdp ccrB ; g1-L, g2-26, g3-27, g4-28, g5-29, g6-30, g7-31, g8-32, g9-33, g10-34, g11-35, g12-36, g13-37, g14-38, g15-39, g16-40, g17-41, g18-42, g19-1, g20-2, g21-3, g22-4, g23-5, g24-6, g25-7, g26-8, 27-9, g28-10 Tulpini pozitive pentru gena mec A 28;31;40. Tulpini potive pentru gena mec I 28;31;40;41. Tulpini pozitive pentru gena SCC mec IIIJ1 4,7. Tulpini pozitive pentru gena kdp 1.
Fig. 21-Electroforegrama ampliconilor obținuti în reacția PCR pentru gena kdp.g1-L, g2-11, g3-12, g4-13, g5-14, g6-15, g7-16, g8-17, g9-18, g10-19, g11-20, g12-21, g13-22, g14-23, g15-24, g16-25, g17-26, g18-27, g19-28, g20-29, g21-30, g22-31, g23-32, g24-33, g25-34, g26-35, g27-36, g28-37, g29-38. Tulpini pozitive pentru gena kdp 19,28
Kdp la Staphylococcus aureus nu este un important transportor de K +.
Funcția principală a Kdp nu este asociat cu transportul de K + dar care în schimb reglementează transcrierea pentru o serie de factori de virulență ( Xue T. și colab., 2011 ).
CONCLUZII
Deși aproximativ 25% din populația sănătoasă a globului este purtătoare continuă sau intermitentă a S. aureus de-a lungul vieții, microorganismul reprezintă un agent infecțios responsabil pentru un număr semnificativ de infecții, de la ușoare, până foarte grave.
Cele 42 de tulpini de S. aureus izolate de la pacienți spitalizați din clinică prezintă rezistență specifică la meticilină ceea ce limitează opțiunile de tratament al acestor infecții.
Analiza moleculară a expresiei genelor de rezistență a relevat faptul că doar 6 au prezentat gena mecA, sugerând faptul că rezistența la meticilină la restul tulpinilor studiate este determinată printr-un alt mecanism.
Tulpinile bacteriene analizate se remarcă prin heterogenitatea structurală a casetelor SCCmec, majoritatea putând , însă, fi incluse în categoria casetelor SCCmec tip III si IV, tipurile SCCmecIIIa și SCCmecIVd cea din urmă categorie, deși caracteristică tulpinilor stafilococice de origine comunitară fiind din ce în ce mai des raportată în contexte clinice.
În urma analizei genelor de virulență s-a observat că 7 tulpini au prezentat gena hlg (γ – hemolizina) și 6 tulpini gena bbp (proteina de legare a sialoproteinei osoase).
Deși analiza efectuată nu a evidențiat existența unei corelații între profilurile de virulență și cele de rezistență în cazul tulpinilor studiate, prezența concomitentă a acestor determinanți explică implicarea acestora într-o gamă largă de infecții cu diferite localizări, adesea dificil de tratat.
Bibliografie
Albrecht T., J. W. Almond, Michelle J. Alfa, G. G. Alton, R. Aly, D. M. Asher, Ellen J. Baron, S. Baron, D. Baxby, Y. Becker, (2004). Medical Microbiology. 4th edition,,
Angelescu Mircea (1998). –Terapia cu antibiotice, Ed. Medicală, București.
Annaliesa S. Anderson, Ingrid L. Scully, Ed. T. Buurman, Joseph Eiden, Karhrin U. Jansen (2016)- Staphylococcus aureus Clamping Factor A Remains a Viable Vaccine Target for Prevention of S. aureus Infection
Buiuc D. Și Neguț M. 2008. Tratat de Microbiologie medicala, ed. a II-a, Ed. medicala, Bucuresti.
Brakstad, O.G., Maeland, J.A., (1997), Mechanisms of methicillin resistance in staphylococci, APMIS, 105(4):244-76.
Cotar A.I., Chifiriuc M.C., Dinu S., Bucur M., Iordache C., Banu O., Dracea O., Larion C., LazărV. 2010. Screening of Molecular Virulence Markers în Staphylococcus aureus and Pseudomonas aeruginosa Strains Isolated from Clinical Infections. Int J Mol Sci. 11(12).: 5273–5291.
Chifiriuc M.C., Mihăescu G., Lazăr V. 2011. Microbiologie și virologie medicală. Editura Universității din București. Pp 147-177
Cristea E., Dinu V.,Popescu A., Trutia E( 1991). „Tratat de biochimie medicala”, Vol I,Ed. Medicala
Dinges, M., Orwin, P., Schlievert, P., (2000)., Exotoxins of Staphylococcus aureus, Clinical Microbiology Reviews, Vol. 13, No.1.
Duca Eugenia, M. Duca, Furtunescu(1979).”Microbiologie medicala”, Ed. Didatica și Pedagogica
Emswiler Rose, B.S., Johnston, R.W., Harris, M.E., Lee, W.H., (1980)., Rapid Detection of Staphylococcal Thermonuclease on Casings of Naturally Contaminated Fermented Sausages, Applied and Environmental Microbiology, p. 13-18 Vol. 40, No. 1.
Entenza J.M., Foster T.J., Ni Eidhin D., Vaudaux P., Francioli P., Moreillon P. 2000. Contribution of clumping factor B to pathogenesis of experimental endocarditis due to Staphylococcus aureus. Infect. Immun.68:5443–5446.
Foster TJ, Hook M. 1998. Surface protein adhesins of Staphylococcus aureus. Trends Microbiol.12:484–488.
Foster, T., J., (2004)., The Staphylococcus aureus “superbug”, The Journal of Clinical Investigation, 114:1693–1696.
Figueiredo, Agnes Marie Sa; F. Antunes Ferreira (2014). “The multifaceted resources and microevolution of the successuful human and animal pathogen methicillin-resistant Staphylococcus aureus”, Mem Inst Oswaldo Cruz, Rio de Janeiro, Vol. 109(3).: 265-278
Gordon 1998
Gordon, J.R., Lowy, D.F., (2008)., Pathogenesis of Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus Infection, CID 2008:46 (Suppl 5).
Herlea V(1998)-Microbiologie General, Ed. Universitatii din Bucuresti
Jun Kaneko, Yoshiyuki Kamio(2004)- Bacterial Two-component and Hetero-heptameric Pore-forming Cytolytic Toxins: Structures, Pore-forming Mechanism, and Organization of the Genes.
Katrin Stutz, Roger Stephan and Tauurai Tasara (2010)- SpA, ClfA, and FnbA Genetic Variations Lead to Staphaurex Test-Negative Phenotypes în Bovine Mastitis Staphylococcus aureus Isolates. Institute for Food Safety and Hygiene, Vetsuisse Faculty University of Zurich, Switzerland.
Katarzyna Wisniewska, Anna Piorkowska, Joanna Kasprzyk, Marel Bronk and Krystyna Swiec (2013)- Clonal distribution of bone sialoprotein-binding protein gene among Staphylococcus aureus isolates associated with bloodstream infections. Departament of Medical Microbiology, Poland. Do Studzienki 38, 80-227
Kronwall și Johnsson 1999
KentB. Crossley, Kimberly K. Jefferson, Gordon L. Archer, Vance G. Fowler (2009)- Staphylococci în Human Disease. Editor John Wiley & Sons
Lazăr Veronica (2001)Microbiologie Medicala, note de curs și principii de diagnostic microbiologie, Ed. Universitatii din Bucuresti
Lina G., Piemont Y., Godail-Gamot F., Bes M., Peter M.O., et al(1999). “Involvement of Panton-Valentine leukocidin-producing Staphylococcus aureus în primery skin infections and pneumonia”, Clin Infect Dis 29: 1128-1132.
Louis M. De la Maza, Maria T. Pezzlo, Ellen Jo Baron (1997). „Color Atlas of Diagnostic Microbiology”, Ed. University of California http://www.ccmhmtschool.org/uploads/docs/color-atlas-of-diagnostic-microbiology.pdf
Mihăescu, Gr., Carmen Chifiriuc, Lia Mara Ditu, (2007). “Antibiotice și substanțe chimioterapeutice antimicrobiene”, Ed.Academiei Romane
Mihăescu, G., Chifiriuc, C., Ciugulea I., (2005)., Toxine și substanțe potențial toxice, Editura Academiei Române, București.
Motta Ferreira, Cristina; F. Gomaz Naveca, W. Antunes Ferreira, Cintia Mara Costa de Oliveira, Maria das Gracas Vale Barbosa, (2013). “Novel methicillin-resistance coagulase-negative Staphylococcus clone isolated from patients with haematological diseases at the Blood Bank Centre of Amazon, Brazil”, Mem Inst Oswaldo Cruz, Rio de Janeiro, Vol. 108(2).: 233-238.
Ma, X. X., T. Ito, C. Tiensasitorn, M. Jamklang, P. Chongtrakool, S. Boyle-Vavra, R. S. Daum și K. Hiramatsu (2002). “Novel type of staphylococcal cassette chromosome mec identified în community-acquired methicillin-resistant Staphylococcus aureus strains”, Antimicrob. Agents Chemother 46: 1147-1152
Mărculescu A., M. Cernea, Veturia Nueleanu, N.A. Oros, R. Chereji (2007). „Medicamentul Veterinar). Vol I, NR1, Ed Universitatatii de Stiințe Agricole și Medicină Veterinară Cluj-Napoca ( http://www.veterinarypharmacon.com/docs/394-ART.11.pdf).
Mihăescu, Gr., Carmen Chifiriuc, Lia Mara Ditu, (2007). “Antibiotice și substanțe chimioterapeutice antimicrobiene”, Ed.Academiei Romane
Matinca D(2002). „Antibiotice”, Ed. Medicala Universitara „Iuliu Hatieganu”
M – Teza de doctorat: Rezistență la gentamicina și tetracicline a enterococilor: analiza genetică și moleculara- Monica Straut,Coordonator stiintific Dr. Aurora Herold- Institutul Cantacuzino, Bucurest, Universitatea din Bucuresti Facultatea de Chimie, 1997).
Miheirico, C., Oliveira, D.C., de Lencastre, H., (2007), Update to the Multiplex PCR Strategy for Assignment of mec Element Types în Staphylococcus aureus, J Antimicrob. Chemother., vol. 51, no.9, 3374-3377.
Navare W., Schneewind W(1990).,"Surface Priteins of Gram-Positive Bacteria and Mechanisms of Their Targeting to the Cell Wall Envelope”, Ed. UCLA School of Medicine http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC98962/
Oniga O., Tiperciuc B(2003).”Antibiotice Antibacteriene”, Ed. Medicala Universitara “Iului Hatieganu”
Peacock S.J., Moore C.E., Justice A., Kantzanou M., Story L., et al(2002). “Virulent combinations of adhesin and toxin genes în natural populations of Staphylococcus aureus”, Infect Immun 70: 4987-4996.
Plata, K., Rosato, E.A., Wegrzyn, G., (2009)., Staphylococcus aureus as an infectious agent: overview of biochemistry and molecular genetics of its pathogenicity, Acta Biochimica Polonica, Vol. 56 No.4/2009, 597-612.
Prevost G, Cribier B, Couppie P. 1995. Panton-Valentine leucocidin and gamma-hemolysin from Staphylococcus aureus ATCC 49775 are encoded by distinct genetic loci and have different biological activities. Infect. Immun. 63:4121–4129.
Peacock S.J., De Silva L., Lowy F.D. 2001. What determines nasal carriage of Staphylococcus aureus? Trends Microbiol. 9:605-610.
Pace J. K., Feschotte Cedric,(2007). „The evolutionary history of human DNA transposons: Evidence for intense activity în the primate lineage”, Ed. University of Texas at Arlington http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC1832089/
Shaw, L., Golonka, E., Potempa, J., Foster, J., (2004)., The role and regulation of the extracellular proteases of Staphylococcus aureus, Microbiology, vol. 150 no. 1 217-228.
Székely, E., Man, A., Mare, A., Vas, K.E., Molnár, Sz., Bilca, D., Szederjesi, J., Toma, F., Lırinczi, L., (2012), Molecular epidemiology and virulence factors of methicillin-resistant Staphylococcus aureus strains în a Romanian university hospital, Revista Română de Medicină de Laborator Vol. 20, Nr. 4/4.
Valsesia, G, Rossi, M., Bertschy, S., Pfyffer, G.E., (2010), Emergence of SCCmec type IV and SCCmec type V methicillin-resistant Staphylococcus aureus containing the Panton-Valentine leukocidin genes în a large academic teaching hospital în central Switzerland: external invaders or persisting circulators?, J Clin Microbiol.48(3):720-7.
Wilke G., Wardenburg J.B., (2010)., Role of a disintegrin and metalloprotease 10 în Staphylococcus aureus -hemolysin-mediated cellular injury, Proc. Natl. Acad. Sci., 107 (30).: 13473-13478
Ting Xue, Yibo You, De Hong, Haipeng Sun and Baolin (2011)- Sun The Staphylococcus aureus KdpDE Two-Component System Couples Extracellular K+ Sensing and Agr Signaling to Infection Programming; Department of Microbiology and Immunology, School of Life Sciences, University of Science and Technology of China, Hefei, Anhui 230027, China
Zhang, Kunyan; Jo-Ann McClure, Sameer Elsayed, T. L., J. M. Conly (2005). “Novel Multiplex PCR Assay for Characterization and Concomitant Subtyping of Staphylococcal Cassette Chromosome mec Types I to V în Methicillin- Resistant
http://www.scritub.com/biologie/STRUCTURA-CELULEI-BACTERIENE71549.php
http://www.britannica.com/science/Streptococcus
http://www.bacteriainphotos.com/Enterococcus%20faecalis%20light%20microscopy.html
http://atlas.microumftgm.ro/bacteriologie/bactsp/enterococ.php
http://ecdc.europa.eu/ro/eaad/antibiotics-get-informed/factsheets/Pages/general-public.aspx
http://bio3400.nicerweb.com/Locked/media/ch06/plasmid.html
http://www.nature.com/scitable/topicpage/transposons-the-jumping-genes-518
http://documents.tips/documents/antibiotice-559793f715690.html
http://www.qreferat.com/referate/medicina/MONOBACTAMII114.php
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/2296040
Copyright Notice
© Licențiada.org respectă drepturile de proprietate intelectuală și așteaptă ca toți utilizatorii să facă același lucru. Dacă consideri că un conținut de pe site încalcă drepturile tale de autor, te rugăm să trimiți o notificare DMCA.
Acest articol: Profiluri de rezistență și virulență ale unor tulpini de Staphylococcus aureus izolate din leziuni cutanate pustuloase [302685] (ID: 302685)
Dacă considerați că acest conținut vă încalcă drepturile de autor, vă rugăm să depuneți o cerere pe pagina noastră Copyright Takedown.