Prof. univ. dr. Marieta Costache Lector. univ. dr. Sorina Dinescu Absolventă Liliana-Roxana Balahura 2020 UNIVERSITATEA DIN BUCUREȘTI FACULTATEA DE… [308996]

UNIVERSITATEA DIN BUCUREȘTI

FACULTATEA DE BIOLOGIE

LUCRARE DE DISERTAȚIE

Coordonatori științifici:

Prof. univ. dr. Marieta Costache

Lector. univ. dr. [anonimizat]

2020

UNIVERSITATEA DIN BUCUREȘTI

FACULTATEA DE BIOLOGIE

LUCRARE DE DISERTAȚIE

Evaluarea efectului indus de 5-fluorouracil înglobat în materiale compozite pe bază de nanoceluloză destinate reconstrucției mamare

Coordonatori științifici:

Prof. univ. dr. Marieta Costache

Lector. univ. dr. [anonimizat]

2020

Listă de abrevieri

3D – tridimensional

5FU – 5-fluorouracil

A – [anonimizat]-[anonimizat] – [anonimizat]1 – proteina activatoare 1

ASC – [anonimizat] a caspazelor

BAFF-R – receptorul factorului activator al căii celulelor B

CARD – domenii de activare și recrutare a [anonimizat] – [anonimizat] C-[anonimizat] – 2',7'-diclorofluoresceină

DCFDA – 2',7'–[anonimizat]'s [anonimizat] – gazdermina

H2O2 – peroxidul de hidrogen

HER2 – receptorul 2 al factorului de creștere epidermal

HIF1-α – factorul de inducere al hipoxiei 1 alpha

HMGB1 – proteine nucleare cu mobilitate ridicată grupa 1

HRP – [anonimizat] B

IKK – complexul kinaza IkB

IKKε – factorul nuclear kappa-B kinaza ε

IL – [anonimizat] – [anonimizat] – 3- (4,5-dimetiltiаzol-2-il) -2,5-difeniltetrа[anonimizat] a nucleotidelor și oligomerizare

NF-κB – [anonimizat]-chain-enhancer al celulelor B [anonimizat]-[anonimizat]-[anonimizat] – Nottingham prognostic index

NRF2 – factorul nuclear 2

P – [anonimizat] – [anonimizat]α – [anonimizat] a [anonimizat] – [anonimizat] – [anonimizat] – [anonimizat] – [anonimizat]3 – transductorul de semnal și activare al transcripției 3

TNFα – factorul de necroză tumorală α

TRAF3 – [anonimizat] – [anonimizat] – [anonimizat] o afecțiune a celulelor mamare care dobândesc capacitatea de a [anonimizat] o evoluție neprevăzută. Această boală eterogenă este caracterizată de multiple subtipuri și creează o problemă medicală majoră cu o prioritate deosebită în cercetarea biomedicală.

[anonimizat], [anonimizat]. Modificările oncogenice modulate de către micromediul inflamator prin implicarea celulelor inflamatorii, îndeplinesc un rol important în dezvoltarea unui tip de cancer malign cu un fenotip mult mai agresiv și mai provocator. Inflamația dirijată de căile de semnalizare specifice inflamazomului promovează inițierea și progresia cancerului mamar.

Inflamazomul reprezintă un complex citosolic multiproteic alcătuit din receptorul NOD-like, proteina adaptor asociată apoptozei speck-like care prezintă domenii de recrutare și activare a caspazelor și caspaza-1. Acestea sunt implicate în inflamație și într-un tip aparte de moarte celulară inflamatorie numită piroptoză, care este rezultatul activării inflamazomului în multiple tipuri celulare.

Ingineria tisulară reprezintă un domeniu care înglobează științele vieții cu științele inginerești, cu scopul obținerii de substituenți capabili să restabilească, să mențină și să îmbunătățească funcția unui țesut sau organ afectat.

Biomateriale tridimensionale prezintă o rețea cu structură și funcții similare matricei extracelulare, prin care celulele se pot deplasa și pot interacționa cu suportul oferit sau între ele. Aceste materiale trebuie să fie biocompatibile și biodegradabile, cu o rată de descompunere egală cu rata de regenerare a noului țesut.

Scopul acestei lucrări a fost reprezentat de evaluarea efectului anti-tumoral al unor materiale compozite tridimensionale pe bază de nanoceluloză și alginat sau pectină îmbogățite cu agentul anti-tumoral 5-fluorouracil și cuantificarea nivelului speciilor reactive de oxigen intra- și extracelulare produse de către celule în contact cu aceste materiale, în vederea utilizării acestor bioconstructe în potențiale aplicații clinice. De asemenea, a fost evaluată activitatea caspazei-1, implicată în reglarea complexului inflamazom și în inducerea piroptozei sau moartea celulară indusă de inflamație, precum și evaluarea nivelurilor de expresie genică al p53 și NF-kB prin Real-Time PCR.

Capitolul 1

Interconexiunea cu inflamația

Partea teoretică

Interconexiunea cu inflamația

Cancerul mamar

Sânul reprezintă o structură organizată alcătuită din țesut adipos, noduli limfatici, lobuli, lobi și ducte, cele din urmă fiind delimitate de celulele epiteliale și mioepiteliale care formează un epiteliu stratificat, susținut de membrana bazală (Chiorean și colab., 2013).

Cancerul poate fi descris de activități necontrolate ale celulelor datorate degradării ADN sau a factorilor epigenetici (Provenzano și colab., 2018). Creșterea anormală a celulelor epiteliale mamare promovează inițierea cancerului mamar (CM), însă progresia este dependentă de zona ducto-lobulară și țesuturile alăturate afectate. Stadializarea și clasificarea tumorilor mamare reprezintă criterii importante pentru stabilirea unui diagnostic corect și recomandarea unui tratament adecvat. Din această cauză, clasificarea histologică a CM indică două tipuri principale și anume: carcinom in situ și carcinom invaziv. Fiecare tip de carcinom mamar este la rândul lui subclasificat în funcție de caracteristicile pe care tumora respectivă le indică, așadar, carcinomul mamar in situ poate fi lobular sau ductal, cu cinci subtipuri reprezentative (comedo, cribiform, micropapilar, papilar și solid). Cel de-al doilea tip principal, carcinomul invaziv este caracterizat de șapte subtipuri particulare (tubular, ductal lobular, lobular invaziv, ductal infiltrativ, mucos, medular și papilar) (Ullah, 2019).

O altă clasificare a CM este realizată pe baza aspectelor moleculare, precum profilul experesiei receptorului pentru estrogen (RE), receptorului pentru progesteron (RP) și a receptorului 2 al factorului de creștere epidermal (HER2) (Provenzano și colab., 2018). Subtipurile moleculare identificate de-a lungul anilor sunt reprezentate de cel Luminal A (RE sau/ și RP pozitiv, HER2 negativ, proteina Ki-67 negativă), Luminal B (RE sau/ și RP pozitiv, HER2 pozitiv, proteina Ki-67 pozitivă), HER2-enriched (RE sau / și RP negative, HER2 pozitivă), tipul bazal sau triplu negativ (RE negativ, RP negativ, HER2 negativ) (Ullah, 2019), claudin low (RE negativ, RP negativ, HER2 negativ, claudin-3, 4, 7 negative, E-caderin negativ) (Dias și colab., 2017), normal-like (RE sau/ și RP pozitiv, HER2 negativ, nivel relativ mic al proteinei Ki-67) și molecular apocrin (RE negativ, receptorul pentru androgeni pozitiv) (Lehmann-Che și colab., 2013) (Figura 1).

Figura 1. Clasificarea cancerului mamar (Lehmann-Che și colab., 2013)

De asemenea, este sugerat faptul că inițierea, progresia și metastazarea anumitor forme de tumori mamare sunt cauzate de celulele stem canceroase, datorită capacității acestora de auto-reînnoire, al potențialului de diferențiere și al similitudinii cu celulele stem epiteliale mamare (Shipitsin și Polyak, 2008). Potențialul de auto-reînnoire este considerat responsabil pentru creșterea numărului mutațiilor genetice prezente la nivelul GATA3, RUNX1, NCOR1, RB1, CDH1, care sunt asociate cu diferite subtipuri de CM (Anstine și Keri, 2019). Totodată, există și alți factori de risc care pot cauza CM, de exemplu: un istoric familiar riscant, nuliparitatea, debutul menopauzei, utilizarea contraceptivelor orale, avortul, terapia ce utilizează hormoni sexuali, radiațiile, stilul de viață dezorganizat sau nutriția dezechilibrată (Buyukavcu și colab., 2016).

Descoperirea primei gene de susceptibilitate pentru dezvoltarea cancerului de sân BRCA1, în anul 1994, a evidențiat moștenirea unei mutații în BRCA1 sau BRCA2 ca factor de risc. Aceste gene supresoare tumorale sunt implicate în funcții critice, cum ar fi răspunsul la degradarea și repararea ADN. Identificarea femeilor predispuse la dezvoltarea cancerului de sân sau ovar nu este simplă, deoarece pierderea unei copii funcționale a BRCA1/2 nu este evidentă din punct de vedere clinic. De aceea analiza genomică a devenit un instrument predictiv important și s-au dezvoltat modalități de reducere a riscului de cancer, morbiditate și mortalitate a femeilor care prezintă mutații BRCA1 și BRCA2. De asemenea, doar 5% din cazurile de cancer de sân dezvoltate și diagnosticate sunt corelate cu mutațiile de la nivelul BRCA1 și BRCA2 (Couch și colab., 2014).

Profilul expresiei genice îmbunătățește identificarea genelor a căror activitate poate oferi informații despre prognosticul bolii și o potențială terapie. Aceste profile ale expresiilor genice sunt aplicabile nu numai ca instrument de prognostic, ci și ca predictor al sensibilității la chimioterapie, identificând pacienții cu un prognostic slab sau favorabil și determinarea riscului și beneficiilor chimioterapiei adjuvante (Van’t Veer și colab., 2002).

Inflamația

Inflamația este un mecanism nespecific de răspuns și apărare al organismului la anumiți iritanți, fiind totodată, un proces patologic care condensează numeroase fenomene (destructive, vasculo-exudative, proliferative și reparative) (Grivennikov și colab., 2010).

Aspectul histologic al inflamației este reprezentat de infiltratul leucocitar. În stadiul inițial, celulele predominante sunt neutrofilele. În stadiile târzii și în timpul procesului inflamator, celulele mononucleate sunt cele care predomină și care fagocitează și degradează în vacuolele fagocitare agenții etiologici și necrotici remanenți ai procesului inflamator, eliberând enzimele proteolitice extracelulare, alterând zona inflamată (Baumgarten și Frasor, 2012).

Indiferent de cauză, inflamația a evoluat ca un răspuns adaptativ pentru restabilirea homeostaziei. Răspunsul inflamator este coordonat de o mare diversitate de mediatori care formează o rețea complexă de reglare. În general, o cale de semnalizare specifică inflamației cuprinde inductori, senzori, mediatori și efectori, fiecare componentă determinând tipul răspunsului inflamator.

Răspunsul inflamator acut declanșat de infecții sau leziuni tisulare implică migrarea coordonată a componentelor sangvine (plasmă și leucocite) la situsul infecției sau leziunii. Acest răspuns inflamator este caracterizat cel mai bine în cazul infecțiilor microbiene bacteriene și este declanșat de receptorii sistemului imunitar înnăscut, cum ar fi receptorii Toll-like (TLR) și receptorii cu domeniu de oligomerizare și legare de nucleotide (NOD)-like (NLR). Această recunoaștere inițială a infecției este mediată de macrofagele din țesuturile rezidente și mastocite, ceea ce influențează producerea mediatorilor specifici inflamației, printre care chemokine, citokine, amine vasoactive, eicosanoide și produși ai cascadei proteolitice. Principalul și cel mai rapid efect al acestor mediatori este provocarea unui exudat inflamator, în urma căruia, proteinele plasmatice și leucocitele, care în mod normal sunt localizate la nivelul vaselelor de sânge, sunt transportate prin venulele postcapilare, la țesuturile extravasculare de la nivelul situsului inflamat sau lezat. Endoteliul vaselor de sânge permite extracția selectivă a neutrofilelor. Această selectivitate este asigurată de ligarea inductibilă a selectinelor de integrinele și receptorii specifici chemokinelor de la nivelul leucocitelor (Pober and Sessa, 2007). La nivelul țesutului activat, neutrofilele sunt activate, fie prin contact direct cu agenții patogeni, fie prin intermediul citokinelor secretate de celulele rezidente. Rolul neutrofilelor este de a elimina agenții patogeni prin eliberarea conținutului toxic al granulelor din structura lor, care includ specii reactive de oxigen (ROS) și specii reactive de azot (RNS), proteina 3, catepsina G și elastaza (Nathan, 2006). Însă, acest conținut toxic afectează și țesuturile gazdă, întrucât deteriorarea colaterală este inevitabilă (Serhan and Savill, 2005).

Inductorii exogeni pot fi clasificați în două grupe: microbieni și non-microbieni. Există două clase de inductori microbieni: tipurile moleculare asociate cu agentul patogen (PAMP) și factorii de virulență. Prima clasă de inductori microbieni, PAMP, este un set limitat și definit de tipare moleculare conservate, gazda dezvoltând un set corespunzător de receptori (cunoscuți ca receptori de recunoaștere a tiparului) care le detectează prezența (Medzhitov și Janeway, 1997).

A doua clasă de inductori microbieni cuprinde o varietate de factori de virulență și, prin urmare, este limitată la agenți patogeni. Spre deosebire de PAMP, aceștia nu sunt detectați direct de receptorii specifici. În schimb, efectele lor adverse asupra țesuturilor gazdă, sunt responsabile de debutul răspunsului inflamator. Activitățile tipice ale factorilor de virulență pot fi detectate de senzori specializați. De exemplu, bacteriile Gram negative produc exotoxine care formează pori și care sunt detectate de inflammomul NLRP3, sensibil la efluxul ionilor de potasiu (K+) prin pori. O modalitate alternativă de a detecta o posibilă virulență este nespecifică și indirectă, prin detectarea efectelor asupra morții celulare și a afectării tisulare. În acest caz, inductorii efectivi ai răspunsului inflamator sunt produși endogeni ai celulelor și țesuturilor afectate. Important, răspunsurile inflamatorii care sunt induse de mecanismele de detectare a virulenței diferă, deoarece poate fi caracteristice pentru agenții patogeni sau nu. Este probabil ca aceste răspunsuri inflamatorii să aibă caracteristici diferite, însă activități de cercetare sunt în desfășurare pentru a se afla dacă au rezultate fizice și patologice distincte (Medzhitov, 2008).

Cancerul înglobează numeroase și eterogene tipuri celulare, printre care și fibroblaste, celule immune, adipocite sau celule endoteliale. Legatura dintre ele este capacitatea acestora de a secreta citokine și chemokine care influențează celulele canceroase, inițierea și progresia tumorală și metastazarea (figura 2) (Coussens și colab., 2013).

Figura 2. Inflamația joacă un rol esențial în inițierea, propagarea cancerului și metastază (adaptată după Raposo și colab., 2015)

Considerând eliberarea citokinelor pro-inflamatorii, nivelul ridicat al expresiei factorului de necroză tumorală (TNF)-α, interleukinei (IL)-6, IL-1β și dezvoltarea rezistenței la insulină, poate fi luată în considerare o strânsă asociere între inflamația cronică și debutul CM. Inițierea tumorigenezei și propogarea acesteia sunt determinate de inflamație prin factorii de transcripție implicați în elaborarea răspunsului inflamator: factorul nuclear kappa-light-chain-enhancer al celulelor B activate (NF-κB), transductorul de semnal și activare al transcripției 3 (STAT3), factorul nuclear 2 (NRF2), proteina activatoare 1 (AP1), factorul de inducere al hipoxiei 1 alpha (HIF1-α), și receptorul activator de proliferare peroxizomală (PPARα) (Zimta și colab., 2019).

Inflamația și cancerul mamar

Unii carcinogeni pot induce modificări somatice care conduc la dezvolatrea cancerului dintr-un stadiu neoplazic care se află sub limita prag, caracterizat de degradarea ADN. A doua etapă numită promoția, este descrisă prin expunerea celulelor la iritanți (esteri forbol, hormoni, iritații sau inflamație); această etapă este responsabilă de proliferarea celulară, recrutarea celulelor inflamatorii și degradarea oxidativă a ADN, datorită nivelului ridicat al ROS, care afectează și interacția cu ADN, culminând cu alterările genomice (mutații punctiforme, deleții, rearanjări) (Yamanishi și colab., 2002).

Replicarea, proliferarea aberantă a celulelor și metastazarea sunt susținute de țesuturile inflamate, modificările întâlnite în programele de reparare, moarte celulară și mecanismele inflamatorii alterate, precum interacțiile selectină-ligand, producere de metaloproteaze matriceale și funcțiile chemokinelor (Coussens și Werb, 2002).

O presupunere credibilă este aceea că zonele expuse infecției și inflamației sunt responabile de apariția și dezvoltarea structurilor maligne. Legătura dintre aceste trei procese este dirijată prin semnalizarea moleculară, prin intermediul celulelor inflamatorii și a celulelor tumorale, cum ar fi citokina pro-inflamatorie TNF-α care mediază populațiile de celule inflamatorii, a cărei degradare poate duce la modificarea funcției sale și poate determina procese aberante și procese patogene (Moustakas și colab., 2002).

Celulele inflamatorii sunt capabile de secreția de chemokine și citokine, prin care realizează controlul asupra creșterii, migrării și diferențierii celulelor care formează micromediul tumoral, cum ar fi celulele tumorale, fibroblastele sau celulele endoteliale (figura 3). La pacienții diagnosticați cu CM, creșterea nivelului celular de markeri inflamatori are efecte asupra supraviețuirii celulare indiferent de vârstă sau stadiu al tumorigenezei (Coussens și Werb, 2002).

Figura 3. Cancerul asociat inflamației poate fi provocat de factori extrinseci precum infecția sau factorii din mediul înconjurător, de prezența tumorii (ce are efect pro-inflamator) sau de efectele adverse ale terapiei utilizate (adaptată după Raposo și colab., 2015)

Un exemplu conform căruia se sugerează faptul că inițierea și evoluția CM este corelată cu inflamația cronică este reprezentat de suprareglarea aromatazei, o enzimă implicată în biosinteza estrogenului la nivelul țesutului mamar. Suprareglarea aromatazei este responsabilă de producerea anormală de estrogen în țesutul mamar, ceea ce sugerează faptul că inflamația este corelată cu CM printr-un panel comun de biomarkeri precum IL-1, IL-6, TNF-α și proteina C-reactivă (CRP).

În anumite condiții specifice, activarea căii de semnalizare NF-kB poate promova moartea celulară, prin intermediul TNF-α și IL-1, care pot determina și inflamația cronică. De exemplu, prezența doxorubicinei influențează moartea celulelor tumorale prin inhibarea căii de semnalizare NF-kB, dar toate aceste date preliminare necesită o confirmare in vivo (Ivanov și Ronai, 2000). O alternativă de activare a căii NF-kB, ca urmare a inactivării factorului asociat cu receptorul TNF (TRAF3) și a inactivării kinazei inducătoare de NF-kB (NIK), se crede a fi implicată în CM (Demicco și colab., 2005).

Pe de altă parte, un nivel mai ridicat al TNF-α și IL-6 induse de prezența macrofagelor de tip M1, este asociat cu inflamația cronică, cu evoluția tumorii mamare și disfuncția sistemului imunitar. Aceste procese combinate susțin răspândirea cancerului (metastaze) (De Boer și colab., 2017).

Majoritatea celulelor neoplazice umane, induc expresia factorilor solubili numiți chemokine la nivelul celulelor gazdă, care în mod normal reglează migrarea leucocitelor în timpul inflamației, dar în țesutul neoplazic, sistemul lor receptor este modificat pentru susținerea creșterii și progresiei tumorii (Mantovani și colab., 2001). Potențialul metastatic al celulelor maligne presupune invazia și supraviețuirea în țesutul ectopic, localizarea și proliferarea în alte zone (figura 4). O particularitate a metastazelor specifice CM este reprezentată de interacțiunea dintre CXCR4 și ligandul SDF-1/CXCL12, CXCL12 este o chemokină exprimată în metastazele CM, care generează chimiotaxia celulelor tumorale mamare și mediază procesul metastatic (Muller et al., 2001).

Corelația dintre inflamație și inflamazom este directă, activarea inflamazomului va duce la activarea caspazei-1 și are loc eliberarea IL-1β și IL-18, acestea fiind capabile să se lege de receptorii lor și să activeze căile de semnalizare NF-kB și MAPK implicate în inflamație (Kasza, 2013).

Figura 4. Bazele moleculare ale cancerului asociate inflamației. Inflamația sau activarea oncogenelor au ca rezlutat exprimarea factorilor de transcripție pro-inflamatori la nivelul celulelor tumorale (NF-kB, STAT3 sau HIF1α). Acești factori de transcripție activați mediază expresia citokinelor și chemokinelor (TNFα și IL-6), precum și a enzimelor inflamatorii (COX-2), formând o rețea bogată și complexă de răspunsuri inflamatorii în cadrul micromediului tumoral. Leucocitele, inclusiv macrofagele, celulele dendritice, mastocitele și celulele T sunt recrutate de chemokine și au rolul de a media răspunsul imun (adaptată după Crusz și Balkwill, 2015).

NF-kB: legătura dintre inflamație și cancerul mamar

Factorul de transcripție NF-kB, numit și „comutatorul principal al transcripției în inflamație” este un mediator în elaborarea răspunsurilor imune înnăscute și în inflamație, care este activat de numeroși stimuli pro-inflamatori. NF-kB modulează activitatea citokinelor, molecule care influențează producția de mediatori inflamatori, îndeplinând funcții importante în procesele celulare, inclusiv în inițierea carcinogenezei. Un exemplu relevant este omologul celular c-rel care codifică una dintre subunitățile NF-kB și prezintă același domeniu de legare la ADN ca și oncogena v-rel (Maeda și Omata, 2008).

Calea de semnalizare NF-kB este activată datorită identificării anumitor factori extracelulari și a fosforilării și degradării unui complex de kinaze numit IkB, care influențează dimerizarea NF-kB și eliberarea acestuia în nucleu, cu scopul reglării procesului inflamator și a asamblării complexului inflamazom (Karin, 2008).

Calea de semnalizare NF-kB, are la bază familia de proteine cu același nume, care este alcătuită din cinci proteine conservate, respectiv: RELA (p65), RELB, c-REL, p50 și p52, toate prezentând domeniul de omologie REL (RHD) care îndeplinește funcții importante în legarea ADN, dimerizare și asocierea cu inhibitorul proteinei represor al kappa B (IkB). Din această cale de semnalizare derivă calea canonică și non-canonică. Calea canonică este în aval de receptorii citokinelor pro-inflamatorii, cum ar fi TNF-α, IL-1β, receptorul celulelor T, TLR, receptorul celulelor B, toți aceștia determină degradarea dependentă de ubiquitinare a represorului IkBα prin fosforilarea de către complexul kinaza IkB (IKK). Degradarea IkBα eliberează dimerul p65-p50 care va transloca în nucleu și va activa transcrierea genelor țintă (Gupta și colab., 2011). Calea non-canonică este în aval de CD40L. Receptorul activator al factorului nuclear kB (RANK) și receptorul factorului activator al căii celulelor B (BAFF-R), determină activarea NIK ce ulterior va fosforila dimerul IKKα, urmând și fosforilarea subunității p100 și procesarea acesteia în p52, aceasta din urmă va determina translocarea nucleară a dimerului p52-RELB (Sun, 2010).

Factorii de transcripție NF-kB îndeplinesc roluri estențiale în procesele biologice, printre care diferențierea în cursul embriogenezei, inflamației, răspunsurilor imune, proliferare și supraviețuire celulară (Karin, 2006). Activarea constitutivă a NF-kB a fost sesizată în anumite tipuri de cancer, printre care și cancerul de sân (Shostak și Chariot, 2011). În tumorile mamare, activarea NF-kB contribuie la proliferarea celulară, angiogeneză, apoptoză, fiind cel mai bine caracterizata în cazul cancerului mamar triplu negativ. Acest factor de transcripție (NF-kB) mediază inițierea tumorilor HER2 pozitive iar inihibția lui este suficientă pentru a reduce populația celulară CD44+ (CD44+ este un marker al celulelor stem canceroase umane) și pentru a reduce microvascularizația tumorală. În momentul în care celulele murine HER2 exprimă IkBα mutant, a fost observată o reducere a numărului de mamosfere și sub-reglarea regiunilor factorilor celulelor stem embrionare Y-box2 și factorului de transcripție cu domeniu homeobox Nanog, toate acestea dovedind faptul că semnalizarea NF-kB definește fenotipul celulelor stem specifice cancerului mamar. Un studiu realizat de Pratt și colab., (2009) sugerează faptul că NF-kB este activat în timpul diferențierii celulelor progenitoare luminale iar prezența acestuia este necesară pentru etapele inițiale ale tumorigenezei cancerului mamar.

Cel mai ridicat nivel de expresie al NF-kB a fost raportat în cancerul mamar triplu negativ datorită supra-exprimării receptorului factorului de creștere epidermal care în cele din urmă activează NF-kB (Biswas și Iglehart, 2006). Un alt studiu realizat de către Kendellen și colab., (2014) raportează faptul că semnalizarea canonică și non-canonică a NF-kB este absolut necesară în formarea xenogrefelor tumorale specifice celulelor cancerului mamar triplu-negativ. De asemenea, Nakshatri și colab., (1997) au afirmat ipoteza conform căreia progresia carcinomului mamar de la RE pozitiv, fenotip non-malign, la fenotip malign RE negativ, este însoțită de activarea constitutiva a căii de semnalizare NF-kB.

Figura 5. Conexiunea dintre inflamație și cancerul mamar. Inflamația și calea de semnalizare NF-kB sunt influențate de numeroși factori. Aceste procese, pot induce inițierea, progresia și metastazarea cancerului mamar, ca rezultat la implicării angiogenezei, degradării ADN și dereglarea secreției de citokine (adaptată după Balahura și colab., 2020).

O legătură dintre inflamație și CM este realizată de calea de semnalizare NF-kB (Figura 5). În urma numeroaselor studii realizate, s-a dovedit că inhibiția NF-kB predispune celulele normale la apoptoză, deoarece acest factor de transcripție este important pentru supraviețuirea, proliferarea, migrarea celulară și angiogeneză, fiind un reglator în aval al receptorilor intracelulari specifici inflamației, cum ar fi receptorii TLR, luând în considerare implicarea sa în nivelurile de expresie ale citokinelor pro- și anti-inflamatorii și supraviețuirea celulelor tumorale (Bhatelia și colab., 2014).

Legătura dintre inflamație și CM este indicată prin amplificarea și supraexprimarea factorului nuclear kappa-B kinaza (IKK) ε, o kinază implicată în calea de semnalizare NF-kB. IKKε este translocată în nucleu după ce a fost indusă de degradarea ADN și este sumoilată. Următorul pas este fosforilarea și activarea NF-kB, care este dependentă de diverși factori sau stimuli ce pot influența supraviețuirea sau moartea celulară (Renner și colab., 2010).

Implicarea speciilor reactive de oxigen

Organitele celulare responsabile de producerea stresului oxidativ sunt mitocondriile, care produc un volum considerabil de ROS datorită unui defect persistent la nivelul lanțului transportor de electroni (Adam Vizi, 2005). ROS reprezintă molecule de semnalizare care prezintă în structura lor un anumit număr de atomi de oxigen implicați în organizarea radicalilor liberi caracterizați de anionul superoxid (O•2-), radicalul hidroxil (HO•), radicalul peroxil (ROO•), radicalul hidroperoxil (HO•2), peroxid de hidrogen (H2O2), acid hipocloros (HOCl), ozon (O3) și oxigen simplu (1O2) (Pavelescu, 2015).

În diferite circumstanțe, producția considerabilă de ROS putea fi asigurată de metabolismul oxidativ al mitocondriilor, dar și de răspunsul la factori diversificați precum hipoxia, iradierea, bacterii, xenobiotice sau citokine (Grivennikova și Vinogradov, 2013).

În plus, în afară de mitocondrii, peroxisomii și sistemul citocromului P450 reprezintă structuri specializate pentru generarea ROS, care contribuie la promovarea, inițierea, progresia și metastazarea CM, ca urmare a modificărilor genetice și a degradării celulare. Debutul carcinogenezei este susținut și de produsul de peroxidare lipidică prezent la nivelul tumorilor, cum ar fi malondialdehida sau 4-hidroxinonenal, toate acestea pot influența dereglarea genelor supresoare tumorale, proces care presupune o asociere puternică între inflamație și cancer (Adam și colab., 2009).

Lu și colab., (2017), au studiat funcția ROS în autofagie și apoptoză, observând corelația dintre degradarea catalazelor și degradarea acizilor nucleici, proteinelor sau lipidelor, care se concretizează în modificarea diferitelor sisteme, moartea celulară sau activarea p53. Generarea și acumularea de ROS modulează detașarea p53 din complexul Mdm2-p53, ceea ce influențează activarea p53 prin calea de semnalizare JNK. Ca o concluzie a studiului, Lu și colab., declară faptul că generarea redusă de ROS a fost cauzată de silențierea genei p53. P53 este implicat în numeroase căi și mecanisme de semnalizare, cum ar fi reglarea punctului de control al ciclului celular, stresul genotoxic sau apoptoză.

Stresul oxidativ este o caracteristică a micromediului tumoral, ROS produse în inflamația cronică sunt induse de activarea neutrofilelor și macrofagelor, care pot modula ADN celular în timpul diviziunii celulare și pot activa mutațiile ADN datorate dezorganizării celulare și proliferării anormale (Maeda și Omata, 2008).

Prezența ROS în celulele inflamatorii și în celulele epiteliale, sunt responsabile de perturbarea biomoleculelor cum ar fi acizii nucleici, proteinele sau lipidele, având un rol cheie în degradarea celulară, necroză, instabilitate genomică, leziuni mutagene și carcinogeneza determinată de inflamație, fiind de asemenea implicate în imunogenitate și piroptoză (Kawanishi și colab., 2017).

Figura 6. Mecanismul de semnalizare mediat de ROS al activării NF-kB. Stimulii inflamatori, producerea ROS de către mitocondrie, NADPH oxidaza și reticulul endoplasmic, declanșează calea kinazelor și rezultă activarea NF-kB. NF-kB poate induce transcripția genelor țintă, precum TNF-a, IL-1B, IL-6 și IL-8 (adaptată după Minatel și colab., 2016).

Prezența inflamației este, de asemenea, identificată în cazul tumorilor solide, care atrag macrofage asociate tumorii (MAT), celule imune înnăscute asociate cu citokine precum IL-6, care stimulează transductorul de semnal și activarea căilor de semnalizare responsabile de creșterea, invazia și metastaza celulelor tumorale (Triner și Shah, 2016). Un număr crescut de celule tumorale sau celule moarte poate indica prezența inflamației sau necrozei tisulare împreună cu monocitele și implicarea macrofagelor în eliminarea acestor celule (Germolec și colab., 2009).

A fost demonstrată experimental corelația dintre ROS și diferite căi de semnalizare (figura 6). În calea de semnalizare NF-kB, ROS inhibă fosforilarea factorului nuclear al genei kappa ușoare polipeptidice în celulele inhibitoare B, alfa (IkBα) de către IKK cu activarea căii de semnalizare NF-kB (Reynaert și colab., 2006), dar, în același timp, ROS reglează o kinază redox sensibilă în amonte de IKK, numită proteină mitogen activată kinaza kinazei kinază 1 (MEKK1) și care activează NIK (Kim și colab., 2008).

Inflamația cronică reprezintă un factor de risc pentru dezvoltarea cancerului. Inflamația persistentă poate induce instabilitate genetică și modificări epigenetice, direct prin semnalizarea mediată de citokine, fie indirect prin generarea de ROS și RNS, ceea ce influnețează inițierea carcinogenezei (Nakamura și Smyth, 2017).

Capitolul 2

Rolul inflamazomului

Rolul inflamazomului

Un ansamblu molecular critic care induce inflamația este inflamazomul, un complex proteic citoplasmatic responsabil pentru activarea proteazei caspază-1, care îndeplinește un rol important în recunoașterea patogenului și implicit în apărarea gazdelor. Conceptul de inflamazom include senzori, proteine adaptoare și enzime, capabile să asambleze inflamazomul și să activeze enzima. Prezența stimulilor specifici și depistarea lor, nucleează proteina adaptor asociată apoptozei speck-like care prezintă domenii de recrutare și activare a caspazelor (ASC) pentru a forma structuri de tipul „speck” sau foci și pentru a interacționa cu caspaza-1, care dirijează clivarea autocatalitică a subunităților active p10 și p20. Ca urmare a activării celor două subunități, moartea celulară prin inflamație sau piroptoza este indusă prin procesul proteolitic al citokinelor IL-1β și IL-18 (Sharma și Kanneganti, 2016). Toate aceste componente ale complexului inflamazom formează o structură în formă de roată similară cu cea formată de complexul apoptozom, realizând corelația între funcțiile lor similare (Broz și Dixit, 2016).

Inflamazomul reprezintă un complex citoplasmatic multimolecular alcătuit din receptorii NOD-like (NLRP1, NLRP3, NLRC4), membrul pirin AIM2, proteina adaptor ASC și caspaza-1, care sunt implicate în inflamația cronică și acută prin căi de semnalizare cheie. Numeroasele activități de cercetare desfășurate în acest domeniu au sugerat faptul că multe afecțiuni, precum cancerul, bolile autoinflamatorii sau infecțiile sunt dezvoltate din cauza mutațiilor prezente în genele asociate componentelor inflamatorii. CM este influențat de producția IL-1β prin intermediul activității caspazei-1, datorită activării complexului inflamazom, care reglează angiogeneza și mediază activitatea factorului A de creștere endotelial vascular mediat de adipocite (Karki și colab., 2017).

Sistematizare și asamblare

Asamblarea inflamazomului este realizată de trei elemente, platforma, adaptorul și efectorul, dar sistematizarea tipurilor de inflamazom se bazează pe proteinele cu rol de platformă, care reglează proteinele adaptoare adecvate, generând structura specifică a complexului inflamazom. Proteinele platformă sunt reprezentate de familia de receptori NOD-like (NLR) care este clasificată în trei subcategorii: NODs, NLRPs (NLRP1, NLRP3, NLRP6, NLRP4) și IPAFs (NOD1 și NLRP4). Există două subtipuri de inflamazom, NLRP3 și NLRP6, care nu au domenii de activare și recrutare a caspasei (CARD) capabile să recruteze caspazele, de aceea pentru obținerea răspunsurilor inflamatorii este necesară proteina adaptoare (Lamkanfi și Dixit, 2012 ).

Unele studii propun teoria conform căreia reticulul endoplasmatic și interfața mitocondrială reprezintă o platformă pentru asamblarea inflamazomului, care împreună cu proteina receptor 3 NOD-like (NLRP3) detectează modele moleculare endogene asociate cu degradarea (DAMP) sau modele moleculare asociate cu agentul patogen (PAMP) și ulterior urmând oligomerizarea inflamazomului, activarea caspasei-1, secreția și maturarea IL-1β în faza următoare. Simultan, activarea NLRP3, secreția și eliberarea IL-1β sunt influențate de oxidarea ADN mitocondrial determinată de moartea celulară (Bhatelia și colab., 2014).

Mecanismul activării caspazei-1 este completat de complexul inflamazom. Proteina adaptoare ASC este recrutată și interacționează cu domeniile NLR sau AIM2, rezultând în formarea de ASC speck și recrutarea pro-caspazei-1. Pro-caspaza-1 parcurge modificări conformaționale, urmând activarea caspazei-1. În continuare, caspaza-1 intervine în maturarea pro-IL-1β și pro-IL-18, formarea porilor, elaborarea răspunsului inflamator și piroptoză (Gassart și Martinon, 2015).

Există două modalități de activare a inflamazomului: canonică și non-canonică. Activarea canonică a inflamazomului parcurge două etape importante, prima etapă se bazează pe activarea căii de semnalizare NF-κB, având în vedere transcrierea pro-IL-1β și pro-IL-18 prin stimularea TLRs, proteină ce prezintă domenii de oligomerizare care leagă nucleotide (NOD) 1 și NOD2 prin DAMP, PAMP sau calea de semnalizare TNF-α; a doua etapă presupune recunoașterea DAMP și PAMP, molecule eliberate din celulele deteriorate, de către NLRs (Kolb și colab., 2016).

Forma non-canonică a activării inflamazomului este asociată cu caspaza-8 sau caspaza-11, CARD 9, Malt1, Bcl-10 și ASC, care pot induce piroptoza (Gringhuis și colab., 2012). Calea non-canonică se bazează pe caspaza-11 și caspaza-4, -5, din cauza problemelor etice, cea mai studiată este caspaza-11, care interacționează cu lipopolizaharidele, promovând legarea, activarea caspazei-11, împreună cu activarea caspazei-1, detașarea domeniilor din structura gazderminei D (GSDMD) și inducerea piroptozei (Kayagaki și colab., 2015).

Activarea canonică și non-canonică a complexului inflamazom (figura 7) sunt asociate prin activarea caspazei-1, caspazei-4 și a caspazei-5, activarea substratelor pro-IL-1β, pro-IL-18 și GSDMD în structura lor activă (Kesavardhanna și Kanneganti, 2017).

Figura 7. Mecanismul molecular al piroptozei. Piroptoza este declanșată prin intermediul a două căi: calea canonică de activarea a inflamazomului, calea non-canonică de activare a inflamazomului și o cale încă studiată. În calea canonică de activarea a inflamazomului. A. Acest tip de inflamazom recrutează și se leagă de ASC, rezultând focalizarea ASC, care recrutează procaspaza-1 și activează caspaza-1. Caspaza-1 este implicată în clivajul și maturarea pro-IL-18 și pro-IL-1β și scindarea GSDMD. Fragmentul N-terminal al GSDMD (GSDMD-NT) formează pori în membrană, intervenind în secreția IL-18 și IL-1β și în influxul de apă, determinând liza osmotică. Fragmentul C-terminal al GSDMD (GSDMD-CT) este atașat la citoplasmă. B. În calea non-canonică de activare a inflamazomului, lipopolizaharidele derivate din bacterii intervin în recunoașterea și activarea caspazelor-4, -5, -11, inducând piroptoza prin scindarea GSDMD. C. S-a studiat o cale alternativă de activare a piroptozei ce determină activarea caspazei-3, o moleculă considerată un substrat al apoptozei. Caspaza-3 matură induce clivajul gazderinei E (GSDME), inclusiv fragmentul C-terminal al GSDME (GSDME-CT) și fragmentul N-terminal al GSDME (GSDMENT). GSDME-NT participă, de asemenea, la formarea porilor, promovând piroptoza. Activarea caspazei-1 influențează fragmentarea ADN (adaptată după Fang și colab., 2020)

Prima etapă parcursă pentru inițierea asamblării inflamazomului este recrutarea ASC prin intermediul interacțiunilor domeniilor pirin și recrutarea caspazei-1 prin intermediul interacțiunilor domeniilor CARD, această intercomunicare influențează formarea ASC speck și eliberarea lor în mediu extracelular pentru a contribui la elaborarea răspunsurilor inflamatorii (Franklin și colab., 2014). ASC speck împreună cu domeniile pirin formează filamente cu o structură elicoidală, dar, pe de altă parte, ASC speck interacționează cu domeniile CARD stimulând recrutarea și activarea caspazei-1, IL-1β, GSDMD-D și promovează piroptoza (Dick și colab., 2016). Asamblarea inflamazomului depinde de NLR, în timp ce diferite forme ale inflmazomului au fost identificate, cea mai studiată este complexul de semnalizare al domeniului 3 al pirinei NLR (Kantono și Guo, 2017).

NLRP3

Unul dintre cele mai studiate tipuri de inflamazom este NLRP3. NLRP3 prezintă trei interpretări plauzibile ale mecanismelor de activare. Primul se bazează pe domeniul de legare a nucleotidelor și oligomerizare (NACHT) și interacțiunea cu repetițiile bogate în leucină (LRR), ceea ce induce auto-suprimarea NLRP3, dar în prezența DAMP și PAMP, auto-suprimarea este inversată, influențând modificările conformaționale și mecanismele care implică familia caspazelor (Man și Kanneganti, 2015). O altă ipoteză depinde de prezența canalelor și a porilor care determină activarea NLRP3 prin moleculele de ATP extracelulare, care se leagă de purino-receptorul P2X7, inducând efluxul K+, permițând DAMP și PAMP să pătrundă în celulă (figura 8). Deși sunt molecule mari, pot determina dezintegrarea fagozomului și ruperea lizozomală (cascadă proteolitică), din cauza eliberării deficitare (Munoz și colab., 2013), efluxul de K+ fiind considerat un mecanism în aval pentru activarea NLRP3. În plus, se consideră că activarea NLRP3 este influențată și de cantitatea de ROS produsă, dar prezența exculsivă a ROS nu poate determina întregul mecanism de activare, fiind necesari și alți factori (Abais și colab., 2015).

Figura 8. Activarea inflamazomului NLRP3 (www.invivogen.com)

Un studiu realizat de Bauernfeind și colab., (2009) propune un mecanism de activare a complexului inflamazom în macrofage, bazat pe prezența a două semnale, primul sau semnalul de pregătire depinde de TLRs și receptorul TNF-α care intervin în calea de semnalizare NF-kB și modulează alterarea post-translațională a NLRP3. Cel de-al doilea semnal sau semnalul de activare este implicat în eliberarea IL-1β și IL-18, mediată de caspază-1 și inițierea piroptozei.

Pe de altă parte, activitatea caspazei-1 modulează clivajul proteolitic și activarea pro-IL-1β și pro-IL-18, stimulează secreția IL-1β și IL-18, promovează inflamația și piroptoza, după activarea inflamazomului, substratul pentru IL-18 fiind produs (Miao și colab., 2011) (figura 9). Activarea inflamazomului NLRC4, stimulează producerea de IL-1β și reglează expresia factorului de creștere vasculară endotelială A și angiogeneza mediată de adipocite și, ca urmare, progresia CM (Kolb și colab., 2016). Un studiu din 2007 a sugerat că expresia IL-1β este mai mare în carcinomul ductal invaziv decât în carcinomul ductal in situ și corelarea cu un fenotip mai agresiv (Chavey și colab., 2007).

Figura 9. Mecanismul inflamazomului implicat în progresia cancerului mamar. Recunoașterea stimulilor (DAMP și PAMP) de către senzori specifici complexului inflamazom, promovează activarea inflamazomului și inițierea piroptozei. Inflamazomul promovează progresia tumorii mamare, accentuată de răspunsul inflamator și angiogeneza induse de secreția de IL-1β și IL-18 (adaptată după Balahura și colab., 2020).

Complexul inflamazom îndeplinește roluri semnificative în evoluția cancerului, inducerea inflamației și moartea celulară determinată de inflamație sau piroptoză ca urmare a activării cistein proteazei caspaza-1, din cauza factorilor microbieni și a DAMP, cum ar fi ATP, acidul uric, heparin-sulfat și ADN (Gringhuis și colab., 2012).

Studii recente sugerează faptul că inflamația indusă de complexul inflamazom sau calea de semnalizare IL-1 promovează inițierea și progresia BC. Tumorigeneza este influențată de proteina adaptoare ASC. Un exemplu este faptul că viabilitatea și proliferarea celulelor tumorale sunt crescute atunci când gena care codifică ASC este silențiată (Liu și colab., 2013).

Guo și colab., (2016) au raportat că activarea inflamazomului influențează infiltrarea MAT și a celulelor supresoare derivate mieloide și că inducerea celulelor mieloide poate fi diminuată în corelație cu inhibarea creșterii tumorale folosind un antagonist IL-1R sau un anticorp anti-IL-1R, blocând astfel calea de semnalizare IL-1R. Concluzia studiului realizat este că un micromediu inflamator este promițător pentru inițierea și progresia CM datorită producției de IL-1β în MAT, iar o posibilă metodă de a reduce progresia tumorii și posibilitatea de apariție a metastazelor este reprezentată de focusarea pe calea de semnalizare inflamazom/IL-1.

Kolb și colab., (2016) au identificat obezitatea ca un factor principal de risc pentru inițierea CM asociată cu inflamazomul NLRC4. Aceștia prezintă obezitatea ca o platformă pentru creșterea nivelului celulelor mieloide împreună cu producerea de IL-1β, care promovează și angiogeneza. Realizând o corelație între acest studiu și cel realizat de Weichand și colab., (2017), activarea inflamazomului NLRP3 și producerea de IL-1β pot fi induse și de receptorul S1P pentru a promova limfogeneza în CM.

Inflamasomul NLRP3 este de asemenea implicat în CM indus de prezența leptinei, deoarece leptina îndeplinește un rol decisiv în activarea inflamazomului NLRP3 prin intermediul receptorului pentru estrogen și al producției de ROS, evenimentele finale fiind reprezentate de apoptoză și promovarea ciclului celular (Raut și colab., 2019).

Piroptoza

De-a lungul anilor, numeroase studii au indicat diferite tipuri de moarte celulară, cum ar fi apoptoza, necroza, autofagia, necroptoza, anoikiza și piroptoza (Shi și colab., 2017). Cuvântul piroptoză este derivat din limba greacă, fiind compus din sufixul „pyro”, care semnifică foc și „ptoză”, adaptat pentru moartea celulelor indusă de inflamație, care urmează să aibă loc (Cookson și Brennan, 2001).

Piroptoza este influențată de capacitatea enzimatică a caspazelor (caspază-1/ -4/ -5/ -11) de a efectua acțiuni inflamatorii. Activarea complexului inflamazom pe cale canonică sau non-canonică va determina activarea caspazelor și mărirea volumului celular, liza celulară și piroptoza. O altă modalitate de a promova și iniția piroptoza este realizată de familia GSDMD, în principal de domeniul N-terminal al GSDMD D, care este recrutat pe membrana plasmatică, cu scopul de a forma pori alcătuiți din 16 protomeri, care schimbă integritatea membranei celulare (figura 10). Un semn al debutului piroptozei este reprezentat de permeabilizarea membranei plasmatice datorată formării porilor ca urmare a activității caspazei-1 (Ding și colab., 2016).

În dezvoltarea embrionară și în condiții homeostatice, piroptoza este absentă, aceasta fiind activată în afecțiuni fiziopatologice, cum ar fi bolile inflamatorii și autoinflamatorii, putând influența inițierea, proliferarea, invazia CM și metastazarea (Walle și Lamkanfi, 2016).

Figura 10. Inducerea piroptozei mediate de GSDMD. PAMP sau DAMP activează caspazele inflamatorii. Aceste caspaze clivează GSDMD în domeniile N- și C-terminale. Domeniul N-terminal al GSMDD este orientat către membrană și intervine în formarea porilor din membrana plasmatică a celulei pentru a induce piroptoza (adaptată după Kesavardhana și Kanneganti, 2017).

Piroptoza și inflamazomul

Piroptoza este adesea observată la nivelul macrofagelor, neutrofilelor, celulelor dendritice, celulelor T, celulelor endoteliale sau celulelor epiteliale care exprimă niveluri superioare ale caspazelor. Caspaza-1 nu este activă în mediul citosolic, aceasta este activată doar după recrutarea la nivelul inflamazomului cu sau fără proteina adaptoare ASC.

Activarea receptorilor de recunoaștere a modelului (PRR) din structura complexă a inflamazomului poate activa răspunsurile inflamatorii și, în final, să determine inițierea piroptozei. PPR recunoaște molecule precum DAMP sau PAMP, ceea ce duce la asamblarea ASC speck și apoi la leagarea NLR la caspaza-1. Activarea caspazei-1 stimulează inițierea piroptozei prin calea de activare canonică a inflamazomului, dar, pe de altă parte, calea de activare non-canonică a inflamazomului este stimulată prin activarea caspazei-11 și a caspazei-4/ -5 (Kayagaki și colab., 2011).

Activarea caspazei-1 modulează producerea și maturarea substratelor specifice IL-1β și IL-18 iar receptorii IL-1 tip 1 și IL-18R împreună cu liganzii lor contribuie la dezvoltarea răspunsurilor inflamatorii T helper 1 și T helper 2. O posibilă explicație pentru eliberarea IL-1β și IL-18 în mediul extracelular poate fi reprezentată de inducerea piroptozei, care gestionează eliberarea factorilor inflamatori, cum ar fi proteinele nucleare cu mobilitate ridicată grupa 1 (HMGB1) sau IL -1α (Walle și Lamkanfi, 2016).

GSDMD reprezintă un substrat pentru caspaze, care poate fi separat în domenii specifice de către caspazele-1, -4, -5, -11, fiind important în piroptoza indusă de răspunsurile inflamatorii (Shi și colab., 2015). Unele studii sugerează faptul că GSDMD este implicat în procesul de formare al porilor care promovează eliberarea componentelor intracelulare (Liu și colab., 2016) și secreția de IL-1β, dar nu și la maturarea acestuia (Ye și colab., 2018).

Rolul piroptozei în cancer

Piroptoza este o formă inflamatorie de moartea programată dependentă de caspaza-1 a celulelor, care constă în elaborarea răspunsului inflamator, liza celulară și eliberarea componentelor intracelulare datorită degradării membranei celulare. Ca urmare a activării inflamazomului, piroptoza prezintă câteva caracteristici comune cu apoptoza și necroza, cum ar fi marcarea fluorescentăa a anexinei V, maturarea caspazelor, condensarea nucleară, fragmentarea ADN, formarea porilor în membrană, liza osmotică și eliberarea componentelor intracelulare (Lamkanfi și colab., 2008; Sharma și Kanneganti, 2016). S-au observat unele particularități ale piroptozei, cum ar fi afectarea integrității membranei celulare și absența fragmentării nucleare. Un ultim pas în dezvoltarea piroptozei este reprezentat de formarea porilor în membrană (Bergsbaken și Cookson, 2007).

Piroptoza este determinată de activarea GSDMD D ca urmare a clivajului realizat de caspaza-1, fiind de asemenea un substrat pentru această enzimă pro-inflamatorie. Activarea GSDMD D depinde și de degradarea membranei. Mai mult, stimularea piroptozei este un rezultat al activității caspazei-1 implicată în clivajul proteolitic și eliberarea de citokine pro-inflamatorii IL-1β și IL-18 (Karki și colab., 2017).

Activarea inflamazomului este asociată cu piroptoza, datorită funcției sale de efector în aval și implicarea sa în secreția IL-1β, împreună cu asamblarea NLRP3, de exemplu, direcționând efluxul de K+ (Gaidt și Hornung, 2018).

Inflamația, inflamazomul și cancerul mamar

Există două modalități în care se poate realiza legătura dintre inflamație, inflamazom și cancerul mamar, o cale extrinsecă întalnită sub denumirea de carcinogeneză indusă de inflamație și o cale intrinsecă specificată în literatură ca inflamația asociată cancerului (Kundu și Surh, 2012). După inițierea carcinogenezei, calea intrinsecă va fi activată de celulele tumorale, realizând corelația între ambele căi cu scopul progresiei cancerului și inițierea metastazelor (Grivennikov și colab., 2010).

După activarea inflamazomului datorită prezenței anumitor factori, citokinele pro-inflamatorii IL-1β și IL-18 vor fi eliberate și își vor exercita influența asupra celulelor imune, rezultând formarea unui complex imun care este intensificat datorită prezenței altor citokine și chemokine. După inițierea inflamației, este inițiată degradarea celulelor sau țesuturilor și alterarea sistemelor de reparare a ADN (Lin și Zhang, 2017).

Degradarea ADN este amplificată de citokinele proinflamatorii care influențează nivelul ROS și RNS în celule și țesuturi și poate determina apariția mutațiilor la nivelul oncogenelor și genelelor supresoare tumorale (figura 11). De asemenea, stresul oxidativ ridicat poate afecta numeroase molecule, cum ar fi proteine, lipide, acizi nucleici și produși metabolici intermediari și are ca rezultat suprimarea sistemelor de reparare a ADN și inițierea și progresia carcinogenezei (Kundu și Surh, 2012).

Un studiu realizat de Pizato și colab., (2018) a investigat efectul anti-cancerigen al unui acid gras omega-3, acidul docosahexaenoic (ADH), exercitat asupra liniei celulare de cancer mamar MDA/MB 231. Rezultatele au indicat faptul că ADH a indus piroptoza în celulele canceroase prin activarea caspazei-1, clivarea domeniilor GSDMD, secreția și maturarea IL-1β și IL-18 și formarea porilor în membrană. În plus, prezența ADH influențează translocarea HMGB1 din nucleu în citoplasmă, ca urmare a activării caspazei-1. Au concluzionat faptul că piroptoza este un proces esențial pentru apărarea împotriva agenților patogeni, care poate promova expulzarea celulelor infectate.

Figura 11. Calea extrinsecă: carcinogeneză indusă de inflamație. Speciile reactve de oxigen sau azot pot degrada direct ADN, ceea ce poate determina deblocarea oncogenelor și inhibiția genelor supresoare. Speciile reactive de oxigen și azot pot oxida proteinele, lipidele, acizii nucleici, carbohidrații și pot perturba metabolismul. Produșii intermediari modificați de ROS/RNS prezintă o activitate oxidativă puternică pentru degradarea ADN. În cazul inflamațiilor cronice, funcția sistemului de reparare a ADN este afectată. Când deteriorarea ADN nu poate fi prevenită, este provocată instabilitatea genomică. Dacă deteriorarea persistă, carcinogeneza va fi inițiată. Căile inflamatorii precum NF-κB și STAT3 sunt modificate în carcinogeneză (adaptată după Lin și Zhang, 2017).

Pentru a înțelege conexiunea dintre inflamație, inflamazom și CM, evenimentele cheie ale mecanismelor moleculare care leagă aceste procese sunt esențiale a fi cunoscute. Inițierea și progresia CM, susținută de inflamația și inflamazom, trebuie studiate în detaliu, având în vedere că prin intermediul caspazei-1 și complexului inflamazom, pot fi reglate diferite căi de semnalizare. O direcție viitoare în acest domeniu poate fi reprezentată de dezvoltarea terapiei anti-cancerigene bazată pe tratamente anti-inflamatorii în combinație cu alți agenți anti-tumorali.

Capitolul 3

Regenerare mamară post-tumorală

Regenerare mamară post-tumorală

Ingineria țesutului adipos

Ingineria tisulară (TE) reprezintă un sub-domeniu al ingineriei biomedicale, ce presupune dezvoltarea de substituenți biologici capabili de restabilirea, menținerea sau îmbunătățirea funcției unui țesut sau organ, utilizând molecule de semnalizare celulară (factori de creștere și/ sau diferențiere), celule și structuri de tip scaffold (Langer și Vacanti, 1993), hidrogeluri și macro- sau nanoparticule cu rol în transportul substanțelor active (Fernandez-Yague și colab., 2015).

TE presupune regenerarea in vitro a unui țesut sau organ, realizată prin însămânțarea, creșterea și proliferarea celulelor într-un scaffold, urmată de implantarea constructului în organismul gazdă. Avantajul conferit de această tehnică este posibilitatea evaluării țesutului de regenerare înainte de implantarea în organsmul gazdă, deși pentru asigurarea eficienței constructului obținut și integrarea acestuia este necesar un proces de remodelare in vivo a țesutului nou format. Interesul acordat acestui domeniu se datorează posibilității obținerii de substituenți tisulari pentru țesuturile afectate (grefe) și studiului comportamentului celular în contact cu biomaterialele propuse (Place și colab., 2009).

Ingineria țesutului adipos (ATE) este o ramură a TE specializată pe obținerea bioconstructelor favorabile pentru stimularea refacerii sau reconstrucției țesutului adipos lezat. ATE este utilă pacienților care au prezentat diverse traume la nivelul țesutuluia adipos, precum arsuri severe, masectomie, excizie secretoriala sau malformații congenitale (Hemmrich și von Heimburg, 2006).

Figura 12. Obținerea unui bioconstruct pentru ATE (adaptată după Murphy și colab., 2013)

Biomateriale utilizate în ingineria țesutului adipos

Scaffold-ul reprezintă un înlocuitor artificial al matricei extracelulare (MEC), ce asigură un micromediu 3D favorabil pentru menținerea viabilității și proliferării celulare. Structura de tip scaffold asigură fixarea, proliferarea celulară și menținerea formei țesutului substituit, intervenind în reglarea funcțiilor celulare prin compoziția chimică, prezența sau absența structurii poroase și proprietățile de suprafață ale acestuia. Orice scaffold propus pentru includerea în studiile de TE, trebuie să prezinte anumite proprietăți și caracteristici. Biodegradabilitatea acestora este un indice important, deoarece MEC sintetizată de celulele însămânțate în scaffold trebuie să imite MEC naturală și să o înlocuiască. Compoziția chimică și gradul de porozitate influențează comportamentul celular, proprietățile mecanice și viteza de degradare ale scaffold-ului (Place și colab., 2009).

Biomaterialele influențeaza adeziunea și polarizarea celulară, stimulează interacțiile intercelulare și pe cele dintre celule și matrice, favorizează procesul de regenerare prin restabilirea formei țesutului lezat și protejarea bioconstructelor de țesutul înconjurător. Având în vedere efectul biomaterialului asupra celulelor cu care intră în contact, se poate sugera faptul că acesta determină forma și dimeniunea țesutului regenerat (Patrick, 2001).

Obținerea bioconstructelor se poate realiza prin mai multe procedee și anume: însămânțarea celulelor în biomateriale, populare cu celule a hidrogelurilor injectate in vivo sau a scaffold-urilor implantate. După ce au aderat la suprafața sau la nivelul porilor biomaterialelor, celulele proliferează și pot secreta componenete specifice MEC sau factori de creștere implicați în formarea unui țesut nou sau restabilirea țesutului lezat (O’Brien, 2011).

Compoziția biomaterialului reprezintă un aspect important, deoarece influențează biocompatibilitatea materialului sau capacitatea acestuia de a susține aderarea celulelor și îndeplinirea funcțiilor celulare, în vederea eficientizării procesului de regenerare tisulară (Helmus și colab., 2008). Cercetările realizate în acest domeniu se axează pe testarea biomaterialelor formate din componente naturale, precum: alginat, pectină, nanoceluloză, agaroză, amidon, fucoidan sau caragenan (Jovic și colab., 2019).

Alginatul este unul dintre cei mai studiați compuși destinați formării scaffold-urilor. Sursele de alginat sunt diferitele specii de alge brune, precum Laminaria hyperborean, Laminaria digitate, Laminaria japonica, Ascophyllum nodosum, and Macrocystis pyrifera (Lee și Mooney, 2012). Din punct de vedere structural, este format din acidul β-D-mannuronic ce conferă flexibilitatea caracteristică și acidul α-L-gluloronic responsabil de capacitatea de gelifiere și rigiditatea copolimerului (Axpe și Oyen, 2016).

Pectina este un component natural de la nivelul perețiilor celulelor vegetale, ce prezintă o mare hidrofilicitate. Pe plan industrial, pectina este obținută din sucuri, mere sau citrice, prin extracție acidă și termică (Jayani și colab., 2005). Gradul de vâscozitate este dependent de creșterea concentrației soluției de pectină, dar și de expunerea la condiții acide și cationi divalenți sau trivalenți (Munarin și colab., 2012). În mod similar alginatului, pectina este ușor reticulată în prezența ionilor de calciu divalenți, care interacționează prin grupările carboxilice pentru a induce punți între lanțurile homogalacturonice (Fang și colab., 2008).

Nanoceluloza un polimer natural caracterizat de biocompatibilitatea ridicată, biodegradabilitatea scăzută și efectul non-toxic asupra viabilității celulare. Aceasta este clasificată în trei tipuri: nanocristale de celuloză, celuloză nanofibrilară și celuloză bacteriană.

Structura sa presupune regiuni cristaline extrem de organizate, cu domenii amorfe alternante (Gumrah Dumanli, 2017). Această structură determină proprietățile mecanice ale celulozei, regiunile dezordonate (amorfe) conferind flexibilitate și plasticitate, în timp ce fracția ordonată (cristalină) contribuie la rezistența și elasticitatea biomaterialului (Lin și Dufresne, 2014).

Sisteme de cultură tridimensionale

Sistemul de cultură 3D reprezintă un micromediu optim pentru proliferarea și diferențierea celulară și pentru formarea construcților tisulari in vitro. Avantajele utilizării culturilor 3D, în detrimentrul sistemelor de cultură 2D, sunt menținerea formei 3D, structurii și funcțiilor celulare, realizarea interacțiilor intercelulare, diminuarea stresului celular și posibilitatea creerii unei structuri native, asemănătoare cu cea prezentă în structurile tisulare (Luo și colab., 2012).

Alegerea scaffold-urilor potrivite pentru o anumită cultură 3D depinde de tipul celular testat și de funcțiile celulelor respective. Proprietățile scaffold-urilor variază în funcție de concentrația polimerului din compoziție, densitatea ligandului, dimensiunea porilor, structura, flexibilitatea și rigiditatea biomaterialului (Geetha Ba și colab., 2019).

Într-o cultură 3D, scaffold-ul oferă suport celulelor, pentru a menține interacțiunea biofizică și biomecanică, acționând similar MEC. Acesta creează un micromediu biologic activ și o arhitectură de suprafață favorabilă pentru ca o varietate de celule să supraviețuiască, să prolifereze și să se diferențieze, oferind condiții optime (Geetha Ba și colab., 2019).

Optimizarea compoziției, structurii și proprietăților biomaterialelor a promovat dezvoltarea tehnologiei de bioprinting. Au fost studiați construcți 3D bioprintați compuși din biomaterialul studiat, celule stem și factori de creștere care susțin procesele de diferențiere și regenerare. (Dinescu și colab., 2018).

Figura 13. Reprezentarea schematică a sistemelor de cultură 2D și 3D (adaptată după Geetha Ba și colab., 2019)

Regenerarea mamară

În timp ce metodele de tratament au evoluat de la mastectomie radicală la lumpectomie (excizia locală a tumorii) și terapii adjuvante, cum ar fi chimioterapia, radiația sau terapia hormonală, încă există un număr semnificativ de paciente care prezintă efectele adverse ale îndepărtării chirurgicale a țesutului mamar. Astfel de proceduri au adesea efecte psihologice negative asupra psihicului pacientelor (Choi și colab., 2010). Studiile realizate de către Renneker și echipa sa, au indicat faptul că mastectomia este corelată cu un sindrom psihologic caracterizat de anxietate, insomnie, atitudini depresive, idei ocazionale de sinucidere și sentimente de rușine și lipsă de stimă (Ray, 1977).

Deși există multe abordări pentru a reconstrui anatomic țesutul mamar, unele paciente prezintă tulburări psihice, întrucât metodele reconstructive înlocuiesc, dar nu regenerează țesutul adipos mamar, care este necesar pentru restabilirea formei naturale a sânului. Implanturile pe bază de silicon protetic sunt asociate cu inițierea unui răspuns imun, încapsulare implantului de un strat de țesut fibros, care modifică forma sânului și cu senzațiile de durere și disconfort (Baran și colab., 2001). Transplantul autolog de țesut adipos este deseori utilizate în chirurgia plastică, dar, cu toate acestea, este asociat cu un risc ridicat de contracție tisulară, necroză și formarea chisturilor (Chhaya și colab., 2015).

Terapiile chirurgicale actuale utilizate pentru reconstrucția mamară (tabelul 1), pot fi clasificate în terapii vascularizate sau în abordări nevascularizate (Choi și colab., 2010).

Tabel 1. Strategii utilizate pentru reconstrucția țesutului adipos mamar

(adaptat după Choi și colab., 2010)

Terapiile vascularizate constau, într-o masă de țesut adipos, care este transferat cu aportul său de sânge (Tachi și Yamada, 2005). Transferul de țesut adipos poate include, de asemenea, fragmente de țesut muscular, dar și a fasciei (Bajaj și colab., 2006). Artera epigastrică inferioară, rectul abdominal transvers miocutanat și artera epigastrică profundă inferioară sunt printre cele mai frecvente țesuturi autologe vascularizate utilizate pentru reconstrucția sânului. Deși sunt eficiente în reconstrucția țesutului moale afectat, acestea pot determina morbiditate la nivelul situsului donator (Chevray, 2004).

Printre alternativele nevascularizate adoptate în mod frecvent în clinică, este cea protetică, a implanturilor de silicon, care întâmpină complicații pe termen lung (ruperea implantului și contracția capsulară) (Levenberg și Langer, 2004). Pentru dezvoltarea acestui domeniu, pe lângă implanturile de silicon, au fost studiate diverse componente ale MEC, uleiuri minerale, uleiuri vegetale, parafine și diverși polimeri sintetici (Patrick, 2001). Aceste materiale au limitări precum lipsa integrității mecanice în comparație cu țesutul autohton, pierderea volumului în timp, ce determină modificări ale formei și structurii și formarea unei capsule fibroase (Choi și colab., 2010).

Printre metodele de regenerare a țesuturilor moi se află și utilizarea biomaterialelor naturale sau sintetice pentru a acționa ca un scaffold pentru a permite obținerea unor culturi celulare 2D sau 3D. Diferențierea celulelor stem realizată în mediul extracelular necesită un ansamblu complex de interacțiuni, care este dificil de reprodus. Proprietățile biomaterialelor propuse ca și scaffold pot influența diferențierea celulară ca urmare a proprietăților lor mecanice, mineralizării și funcționalității chimice (Combellack și colab., 2016).

Regenerarea mamară asistată de celule stem

Celulele sunt izolate din diverse surse, cultivate în laborator, apoi implantate în biomaterial, o structură care oferă sprijin temporar și este capabilă să susțină creșterea și proliferarea celulară (Fernandez-Yague și colab., 2015).

Celulele stem (CS) prezintă caracteristici importante și anume plasticitatea, capacitatea de a diferenția în numeroase tipuri celulare și capacitatea de auto-reînnoire. Implicarea acestora în ATE este preferată astfel încât pot fi obținute prin protocoale relativ ușoare, din multiple surse biologice și pot fi utilizate atât în stadiul diferențiat cât și nediferențiat, cu observația că nu întotdeauna CS vor diferenția în fenotipul celular propus și pot dobândi potențial tumorigen (Dinescu și colab., 2018).

Clasificarea CS pot fi realizată în funcție de potențialul lor de diferențiere, dar și în funcție de originea lor. Capacitatea de diferențiere indică CS totipotente, pluripotente, multipotente, oligopotente și unipotente. În funcție de originea embrionară, se disting CS embrionare și CS adulte (Fortier, 2005).

Celulele stem derivate din țesut adipos (hASC) reprezintă o sursă semnificativă de celule stem mezenchimale, cu proprietăți similare celor izolate din măduva osoasă, dar provenite dintr-o sursă mult mai accesibilă și anume țesutul adipos. Terapiile regenerative moderne utilizează hASC, datorită abundenței, distribuției și capacității acestora de diferențiere (adipogenică, osteogenică, condrogenică, neuronală) (Safford și colab., 2004). De asemenea, hASC sunt utilizate pentru tratarea anomaliilor congenitale, pentru mărirea sânilor dar și pentru reconstrucția mamară realizată după mastectomie (Khouri și Del Vecchio, 2009).

În studiile desfășurate anterior, hASC au fost puse în contact cu scaffold-uri pe bază de polimeri biodegradabili, pentru a optimiza sistemele ce promovează adipogeneza. Diferențierea adipogenică este utilizată deseori pentru reconstrucția mamară, în condiții normale, fie după excizia unei tumori. Spre deosebire de materialele inerte utilizate pentru implanturile mamare, bioconstructul obținut după diferențierea hASC prezintă o biocompatibilitate optimă, este bine vascularizat, nu se micșorează, nu este absorbit în timp și nu declanșează reacții alergice (Wankhade și colab., 2016).

Într-un studiu realizat de Siqueira și echipa sa în anul 2019, a fost observat efectul reticulării și a proprietăților mecanice ale materialelor pe bază de nanoceluloză și alginat asupra biocompatibilității și proliferării celulare. Rezultatele au indicat faptul că biomaterialele propuse prezintă anumite proprietăți fizico-chimice și mecanice similare țesuturilor vii. De asemenea, porozitatea materialului și capacitatea sa de absorbție au promovat o bună adeziune celulară și stabilitatea dimensională (Siqueira și colab., 2019).

Capitolul 4

Materiale și metode

Partea experimentală

Materiale și metode

Toate studiile prezente în această lucrare au fost realizate în cadrul Departamentului de Biochimie și Biologie Moleculară (DBBM) al Universității din București, în condiții de biosecuritate și nu contravin legislației de protecție a mediului.

Obținerea culturilor

Principiu:

Celulele stem izolate din țesut adipos sau hASC au fost izolate și a fost obținută o cultură primară din lipoaspirat, colectat după consimțământul în cunoștință de cauză al pacientului, prin utilizarea unui protocol de lucru eficient și corespunzătoe elaborat (Gălățeanu și colab., 2012).

MDA/MB 231 este o linie celulară tumorală, care a fost obținută în urma unei efuzii pleurale a unei paciente diagnosticate cu adenocarcinom mamar metastatic. Este o linie celulară agresivă, invazivă și slab diferențiată de cancer mamar triplu negativ, lipsită de receptorii estrogenici sau progesteronici, precum și de amplificarea genei HER2 (Simmons și colab., 2015).

ZR 75-1 este o linie celulară derivată dintr-o efuzie ascitică malignă de la o femeie caucaziană diagnosticată cu carcinom ductal infiltrat, ai cărei celule exprimă receptorii estrogenici și genele apomucin, MUC-1 și MUC-2.

Pasajul celular, constă în eliminarea mediului de cultură din care s-au epuizat substanțele nutritive și transferul celulelor pe un alt mediu de cultură proaspăt, astfel încât creșterea celulelor să se poată realiza în condiții favorabile. Pentru a se menține creșterea optimă și a se stimula în continuare proliferarea, se realizează pasajul celulelor.

Criogenizarea este folosită în principal cu scopul conservarii materialului biologic prin înghețare, utilizând-se un mediu de crioconservare specific pentru fiecare linie celulară.

Materiale utilizate: Liniile celulare hASC, MDA/MB 231 și ZR 75-1, soluție tampon fosfat (PBS), Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), RPMI-1640, ser fetal bovin (SFB), antibiotic-antimicotic (ABAM), dimetilsulfoxid (DMSO).

Dezghețarea liniilor celulare

Mod de lucru:

Criotuburile cu celule și mediu de crioconservare au fost dezghețate pe baie de apă;

Suspenia a fost centrifugată la 1500 rotații pe minut (rpm) timp de 5 minute;

A fost preparat mediul de cultură specific pentru fiecare tip celular (DMEM sau RPMI suplimentat cu 10% SFB și 1% ABAM);

Au fost distribuite câte 9 mL de mediu de cultură în flask-uri și câte 1 mL din fiecare suspensie celulară;

Au fost omogenizate celulele cu mediul de cultură pe suprafața flask-urilor;

Culturile celulare au fost menținute în incubator în condiții standard (37oC, 5% CO2, umiditate).

Menținerea în cultură și pasajul

Mod de lucru:

Confluența celulară a fost verificată la microscopul optic;

A fost aruncat mediul de cultură iar suprafața a fost spălată cu PBS;

Au fost adăugați câte 2 mL tripsină și flask-urile au fost introduse la incubator pentru 5 minute, temperatură la care tripsina acționează eficient;

Ulterior activitatea enzimatică a tripsinei a fost neutralizată prin adăugarea unui volum dublu de mediu complet;

Suspensia celulară a fost colectată în tuburi sterile și centrifugate la 1500 rpm timp de 5 minute pentru obținerea peletelor;

După terminarea centrifugării, supernatantul a fost aruncat, peletele resuspendate și redistribuite în fiecare flask;

Au fost omogenizate celulele cu mediul de cultură pe suprafața flask-urilor;

Culturile celulare au fost menținute în incubator în condiții standard (37oC, 5% CO2, umiditate).

Criogenarea culturii

Mod de lucru:

Suprafața flask-urilor a fost spălată cu PBS, au fost adăugați câte 2 mL tripsină, iar flask-urile au fost introduse în incubator pentru 5 minute;

A urmat neutralizarea tripsinei cu un volum dublu de mediu complet, colectarea suspensiei celulare și centrufugarea acesteia la 1500 rpm, timp de 5 minute;

Supernatantul a fost aruncat, iar peletul a fost resuspendat într-un mL de mediu de crioconservare specific pentru linia celulară înghețată;

Suspensiile celulare au fost distribuite în criotuburi și menținute la congelator, la -80oC.

Obținerea modelului experimental

Experimentul pe care l-am realizat are ca scop evaluarea biocompatibilității unor materiale compozite tridimensionale pe bază de nanoceluloză și alginat sau pectină îmbogățite cu 5-fluorouracil și cuantificarea nivelului de ROS produse de către celule în contact cu aceste materiale. De asemenea, a fost evaluată activitatea caspazei-1, implicată în reglarea complexului inflamazom și în inducerea piroptozei, nivelul de expresie genică al p53 și NF-kB a fost evaluat prin Real-Time PCR.

Această lucrare a cuprins materiale tridimensionale (3D) pe bază de nanoceluloză (CN), alginat (A) sau pectina (P), îmbogățite cu un agent anti-tumoral, 5-fluorouracil (5FU), sintetizate de colaboratorii de la Facultatea de Știința și Ingineria Materialelor, Universitatea Politehnică București. Toate materialele prezintă același raport de CN:A/P, respectiv 1:3, însă cantitatea de 5FU diferă, astfel procentele de agent anti-tumoral utilizate pentru îmbogățirea materialelor sunt cele de 1% și 5%. Compoziția materialelor este prezentată în Tabelul 2.

Tabelul 2. Compoziția materialelor

Mod de lucru:

Materialele au fost sterilizate prin expunere la UV pe ambele părți și decupate la diametrul de 1 cm2;

Pentru testele in vitro de evaluare a biocompatibilității, activității capsazei-1 din complexul inflamazon, de observarea a nivelului de expresie genică prin Real-Time PCR, celule hASC, MDA/MB 231 și ZR 75-1 au fost însămânțate pe suprafața materialelor 3D la o densitate de 2×105 celule/cm2 pentru hASC și la o densitate de 3×105 celule/cm2 în cazul celulelor tumorale. Celulele au fost lăsate să adere în porii materialelor 24h în condiții de cultură standard, în mediu de cultură complet, având ca rezultat formarea unor bioconstructe;

Pentru evaluare in vitro a producerii ROS intracelulare și extracelulare de către celulele expuse extractelor din materialele 3D, celulele hASC, MDA/MB 231 și ZR 75-1 au fost cultivate în sistem 2D în plăcuțe de 6 și respectiv 96 de godeuri. Pentru testul DCFDA celulele normale au fost însămânțate la o densitate de 2×104 celule/cm2 iar celulele tumorale au fost însămânțate la o densitate de 3×104 celule/cm2, în plăcuțe cu 6 godeuri. Pentru testul Amplex Red, celulele au fost însămânțate la aceeași densitate ca și la testul precedent, însă în plăcuțe cu 96 de godeuri.

Evaluarea in vitro al efectului anti-tumoral

Biocompatibilitatea scaffold-urilor a fost evaluată la 2 și 7 zile de la însămânțarea celulelor, care au fost menținute în aceleași condiții standard de cultivare (37oC, 5% CO2, umiditate), toate testele realizându-se în triplicat.

Evaluarea cantitativă a viabilității și proliferării celulare – testul MTT

Principiu:

Testul MTT permite evaluarea cantitativă a viabilității și ratei de proliferare a celulelor aflate în contact cu materialele. Principiul acestui test are la bază metabolizarea bromurii de 3-(4,5-dimetiltiаzol-2-il)-2,5-difeniltetrаzoliu sau MTT, la nivel mitocondrial, de către aparatul enzimatic al celulelor vii și transformarea acestuia în cristale de formazan de culoare violet.

Materiale necesare: Probe, soluție MTT, PBS, DMEM, ABAM, izopropanol, spectrofotometru.

Mod de lucru:

La intervalul de timp corespunzător pentru cei doi timpi stabiliți, scaffold-urile însămânțate au fost spălate cu PBS pentru eliminarea rezidurilor;

Probele au fost incubate cu 1 mL/godeu soluție MTT (1 mg/mL compus MTT în DMEM sau RPMI-1640 fără ser, cu 1% ABAM) timp de 4 ore, la 37oC;

Cristalele de formazan formte, au fost solubilizate cu 400μL izopropanol, iar densitatea optică a soluției a fost măsurată spectrofotometric 550 nm, utilizând FlexStation 3;

Valorile obținute au fost direct proporționale cu intensitatea culorii violet, indicând viabilitatea celulelor de la nivelul materialelor.

Evaluarea cantitativă aprobele au fost citotoxicității materialelor – testul LDH

Principiu:

Citotoxicitatea biomaterialelor a fost evaluată cantitativ prin intermediul testului LDH, care permite dozarea lactat dehidrogenazei (LDH), enzimă localizată citoplasmatic, eliberată în mediul de cultură, ca urmare a pierderii integrității membranare a celulelor.

Materiale necesare: Probe, kit reacție LDH (LDH Assay Substrate, LDH Assay Dye Solution și LDH Assay Cofactor), spectrofotometru.

Mod de lucru:

La intervalul de timp corespunzător pentru cei doi timpi stabiliți, câte 25 μl mediu de cultură din fiecare probă a fost transferat într-o placă nouă cu 96 de godeuri;

A fost adăugat un volum dublu din mixul de reacție LDH (substrat LDH Assay Substrate, soluție de colorare LDH Assay Dye Solution și cofactor LDH Assay Cofactor (NAD+), în cantități egale);

Placa cu probele și mixul de reacție a fost menținută la întuneric, timp de 10-15 minute;

Cantitatea de LDH a fost cuantificată spectrofotometric prin măsurarea absorbanței la 490 nm;

Valorile obținute au fost direct proporționale cu intensitatea colorației roz, respectiv cu numărul de celule moarte din fiecare probă.

Evaluarea calitativă a viabilității și proliferării celulare – testul LiveDead

Principiu;

Testul LiveDead permite evaluarea calitativă a viabilității și proliferării celulare prin marcarea selectivă a celulelor cu două tipuri de compuși fluorescenți, ce alcătuiesc kitul LiveDead: calceina acetoximetil (AM) pentru celulele viabile și bromura de etidiu pentru celulele moarte. Calceina AM este permeabilă pentru membrana celulară și poate pătrunde în celulele vii, unde este metabolizată de către esterazele intraceluare și transformată în calceină, compus care emite fluorescență verde la 488 nm. Bromura de etidiu este un agent intercalant care se leagă la nivelul fosei minore al ADN și emite o fluorescență roșie la 530 nm, marcând astfel celulele moarte a căror integritate membranară a fost distrusă.

Materiale necesare: Probe, kit LiveDead, PBS, microscop.

Mod de lucru:

Mediul de cultură de la nivelul probelor a fost aruncat și acestea au fost spălate cu PBS;

Au fost adăugați câte 500 μl de soluție LiveDead peste fiecare probă;

Probele au fost menținute la întuneric, la temperatura camerei, timp de 15 min, după care fiecare material a fost analizat la microscop;

Soluția cu bromură de etidiu și calceină a permis vizualizarea celulelor moarte în fluorescență roșie și a celulelor viabile în fluorescență verde.

Evaluarea activității caspazei-1

Principiu:

Testul Caspase-Glo® 1 Inflammasome reprezintă o metodă omogenă, bioluminescentă pentru măsurarea activității caspazei-1, un element component esențial al complexului inflamazom. Activarea caspazei-1 are ca rezultat: procesarea și eliberarea citokinelor IL-1β și IL-18 și piroptoza. Testul Caspase-Glo® 1 Inflammasome conține un substrat luminogen speficic pentru caspaza-1, Z-WEHD-aminoluciferina, într-o soluție litică optimizată pentru activitatea caspazei-1 și a luciferazei. Adăugarea acestui reactiv duce la liza celulelor, clivarea substratului și generarea de lumină prin intermediul unei luciferaze. Sistemul enzimatic cuplat atinge o stare de echilibru între clivarea caspazei-1 și conversia luciferazei la aminoluciferinei. Aceste reacții simultane generează un semnal luminiscent stabil, care este proporțional cu activitatea caspazei-1.

Materiale necesare: Probe (mediul de cultura colectat de pe materialele însămânțate), kit Caspase-Glo® 1 Inflammasome, luminometru.

Mod de lucru:

Prepararea reactivilor Caspase-Glo® conform protocolului și aducerea acestora la temperatura camerei;

50 μL din fiecare probă, în triplicat, a fost transferat în godeul corespunzător din noua placuță;

În jumătate din numărul godeurilor ce conțin probele, au fost adăugați câte 50 μL de reactiv Caspase-Glo®;

În cealalte godeuri cu probe, au fost adăugați câte 50 μL de reactiv Caspase-Glo® 1 YVAD-CHO, pentru inhibarea activității caspazei-1 și măsurarea precisă a activității acesteia;

Plăcuța a fost acoperită cu folie și menținută la temperatura camerei, timp de o oră pentru stabilizarea semnalului luminescent;

Semnalul luminescent măsurat utilizând un luminometru, este direct proporțional cu activitatea caspazei-1 din proba respectivă.

Evaluare in vitro a producerii ROS de către celulele expuse extractelor din materialele 3D

Sursele majore de producere ROS pot fi reprezentate de metabolismul oxidativ al mitocondriilor și de sistemul imun ca răspuns la factori externi sau interni, cum ar fi hipoxia, iradierea, bacteriile, xenobiotice sau citokinele.

Niveluri scăzute ale ROS care au rezultat din reacțiile redox, mediază unele funcții celulare datorită acțiunii lor ca molecule de semnalizare în transducția normală a semnalului, reglarea genelor și ciclul celular. Prin intermediul aminoacizilor, ROS poate determina modificări structurale și funcționale ale proteinelor, din cadrul proceselor de stres oxidativ.

Evaluare in vitro a producerii ROS extracelulare prin testul DCFDA

Principiu:

Testul DCFDA este un kit pentru evaluarea speciilor reactive de oxigen produse, ce utilizează reactivul 2',7'–dicetofluorescin diacetat (DCFDA), un colorant fluorescent care măsoară nivelul speciilor reactive de oxigen, hidroxil și peroxil prezente în interiorul celulei. După difuzia în celulă, DCFDA este deacetilat de esterazele celulare la un compus non-fluorescent, care este ulterior oxidat de ROS în 2',7'-diclorofluoresceină (DCF). DCF este un compus extrem de fluorescent care poate fi detectat prin spectroscopie fluorescentă cu excitație/emisie la 485 nm/535 nm.

Materiale necesare: Probe, kit DCFDA, camera de numărare, PBS, tripsină, mediu complet, fluorimetru.

Mod de lucru:

Însămânțarea celulelor în placuțe cu 6 godeuri;

Materialele studiate au fost lasate timp de trei ore la gonflat în mediul de cultura complet;

După 24 de ore de la însămânțare, peste celule este adăugat extract din fiecare material;

La 6 respectiv 24 de ore de la adăugarea extractelor, au fost adăugați câte 500 μL de soluție DCFDA și lăsată să acționeze timp de 45 de minute, la întuneric

Soluția de DCFDA a fost îndepărtată, probele spălate cu PBS, tripsinizate, neutralizate și centrifugate, pentru obținerea peletelor;

Peletele au fost resuspendate în 500 μL de PBS, iar 200 μL din fiecare suspensie a fost transferată într-o plăcuță cu 96 de godeuri;

Probele au fost măsurate fluorescent, în cinci puncte diferite, utilizând FlexStation 3;

Celulele au fost numărate utilizând o cameră de numărare pentru normalizarea semnalului fluorescent la numărul de celule din fiecare probă.

Evaluare in vitro a producerii ROS intracelulare prin testul Amplex

Principiu:

Kit-ul Amplex Red utilizează reactivul 10-acetil-3,7-dihidroxifenoxazina, pentru a detecta peroxidul de hidrogen (H2O2) sau activitatea peroxidazei. Reactivul Amplex Red, în combinație cu peroxidaza din hrean (HRP), a fost utilizat pentru a detecta H2O2 eliberat din probe biologice. În prezența peroxidazei, reactivul Amplex Red reacționează stoechiometric cu H2O2 și rezultă un produs de oxidare roșu fluorescent, numit resorufin. Resorufin are maxime de excitare și emisie de aproximativ 571 nm și, respectiv, 585 nm, iar coeficientul de extincție ridicat, permițând efectuarea testului fluorometric sau spectrofotometric.

Materiale necesare: Probe, kit Amplex Red, spectrofotometru.

Mod de lucru:

Însămânțarea plăcuțelor de 96 de godeuri cu celule la o densitate de 2×104 pentru hASC și 3×104 pentru celulele tumorale și lăsate să adere pentru 24 de ore;

Prepararea reactivilor din kit-ul Amplex Red conform indicațiilor oferite de către producător;

Pregătirea controlului pozitiv reprezentat de o soluție de H2O2 de concentrație 10 μM;

Au fost adăugați câte 50 μL de soluție Amplex Red preparată conform indicațiilor producătorului;

Probele au fost omogenizate și incubate pentru șase și 24 de ore, la 37oC;

La intervalul de timp corespunzător, absorbanța probelor a fost măsurată la 570 nm.

Evaluarea expresiei genice a p53 și NF-kB

Izolare ARN

Principiu:

Extracția de ARN total din celule se poate realiza în numeroase moduri, cea mai simplă metodă fiind cea clasică, care presupune utilizarea unui reactiv special numit TRIzol. ARN este o moleculă fragilă, monocatenară, foarte sensibilă la RN-azele prezente în mediu, așadar, după izolare, ARN total obținut se hidratează în apă liberă de ribonucleaze și este depozitat la temeraturi scăzute.

Materiale utilizate: Pelet de celule, TRIzol, cloroform, izorpopanol, etanol, apă liberă de ribonucleaze.

Mod de lucru:

A fost obținut peletul de celule care urmează a fi utilizat pentru a izola ARN;

Peletul a fost reluat într-un volum de 500 μL TRIzol și lăsat 15 minute la temperatura camerei;

TRIzolul a fost îndepărtat și peste probe au fost adăugați 100 μL de cloroform, urmând vortexarea și incubarea la temeratura camerei timp de două minute;

După perioada de incubare, probele au fost centrifugate 15 minute, la 14000 rpm, la 4oC;

Supernatantul rezultat în urma centrifugării a fost transferat într-un tub nou;

Peste supernatant au fost adăugați 250 μL izopropanol, urmând vortexarea și incubarea la temeratura camerei timp de două minute;

După perioada de incubare, probele au fost centrifugate 10 minute, la 14000 rpm, la 4oC;

Supernatantul a fost îndepărtat, iar peletul (ARN de interes) a fost spălat în două etape cu 250 μL cu etanol 70%;

Probele au fost centrifugate 5 minute, la 14000 rpm, la 4oC;

Supernatantul a fost îndepărtat, iar sedimentul a fost uscat pe fluxul hotei, până la vaporarea etanolului;

Peletele uscate de ARN au fost hidratate în 20 μL de apă liberă de ribonucleaze.

Evaluarea concentrației și purității ARN izolat

Principiu:

Determinarea absorbanței în ultraviolet cu ajutorul spectrofotometrului permite verificarea purității unei probe de ARN. În urma determinării densității optice se va obține un semnal la 260 nm. Pentru estimarea purității este necesară calcularea rapoartelor densităților optice la 260 nm/280 nm și respectiv la 260 nm/230 nm care, în condiții normale, trebuie să fie cuprins în intervalul 1,8-2,0, respectiv mai mare decât 2.

Materiale utilizate: Aparat NanoDrop™ 8000 Spectrophotometer (Thermo Scientific), izopropanol, probe ARN, apă liberă de nucleze.

Mod de lucru:

Canalele aparatului au fost șterse cu izopropanol;

Setările programului conform principiului au fost selectate;

A fost citit blank-ul realizat cu 1μL de apă Nuclease free pentru inițializare;

A fost repetată etapa de citire a blank-ului;

Pe rând, au fost încărcate câte 1 μL din fiecare probă de ARN și măsurătorile au fost realizate;

Au fost salvate datele obținute.

Evaluare RIN

Principiu:

Numărul de integritate ARN (RIN) este un algoritm pentru atribuirea valorilor integrității la măsurătorile ARN. Integritatea ARN este evaluată utilizând raportul 28S la 18S ARNr. Algoritmul RIN se bazează pe o combinație de caracteristici diferite care contribuie la obținerea de informații despre integritatea ARN.

Materiale utilizate: RNA Nano Cip (Agilent Technologies), bioanalizor Agilent 2100, stație de primare, vortex IKA, soluție RNaseZAP, apă liberă de nucleze, agilent RNA 6000 Nano Reagents Part I.

Mod de lucru:

Pentru a decontamina electrozii, au fost umplute godeurile unui cip pentru curățare cu 350 μL soluție RNaseZAP și un altul cu 350 μL apă liberă de nucleaze;

Reactivii au fost ținuți la temperatura camerei pentru 30 de minute;

A fost vortexată scurt soluția de colorare RNA 6000 Nano Dye;

A fost adăugat 1 μL din aceasta în aliquoturile de 65 μL de gel filtrat;

A fost vortexat puternic gelul, apoi centrifugat tubul 10 minute la 13400 rpm;

A fost plasat un RNA Nano Cip în stația de primare și în godeul corespunzător a fost pipetat 9 μL din mixul preparat anterior;

Pistonul seringii a fost apăsat până acesta a fost ținut de clip, cronometrul a fost setat la 30 de secunde, după care eliberat pistonul;

Cipul a fost scos din stația de primare și pipetați 9 μL din mixul gel-colorant în celelalte godeuri marcate;

Au fost încărcați 5 μL din markerul ARN 6000 Nano Marker în godeul marcat specific și în celelalte 12 godeuri;

A fost încărcat 1 μL de ladder (marker de masă moleculară);

Probele de ARN, înainte de încărcarea în cip, au fost denaturate prin încălzire la 70°C pentru două minute;

A fost pipetat 1 μL din fiecare probă, în fiecare godeu destinat probelor;

Cipul a fost plasat în vortexul IKA și vortexat scurt la 2400 rpm;

Cipul a fost plasat în bioanalizorul Agilent 2100 și setate măsurătorile în vederea obținerii valorilor RIN.

Reacția de revers-transcriere

Principiu:

Reacția de revers-transciere reprezintă o reacție de polimerizare în lanț (PCR) simplificată ce presupune conversia ARN monocatenar obținut, în ADN complementar (ADNc) monocatenar.

Materiale utilizate: Probe de ARN, iScriptTM cDNA Synthesis Kit, BIO-RAD, aparat Veriti 96 Well Thermal Cycler.

Mod de lucru:

Pe tot parcursul experimentului, probele de ARN au fost păstrate pe gheață;

Au fost diluate probele de ARN astfel încât să se inițieze reacția de revers-transcriere cu o concentrație de1000 ng/μL;

Peste 1 μL din proba de ARN, au fost adăugați 9 μL de apă RNase free astfel încât să fie obținut un volum final de 10 μL;

În tub separat a fost realizat mixul de reacție conform Tabelului 3:

Tabelul 3. Componentele și volumele necesare reacție de Revers-Transcriere

Au fost pipetați 10 μL mix în tuburile cu probele diluate;

A fost vortexat și centrifugat la 13400 rpm;

Probele au fost plasate în aparat și pornit programul de Revers-Transcriere, care a rulat după urmatorul protocol: 5 minute la 25°C, 45 minute la 42°C, 5 minute la 85°C și probele au fost păstrate la 4°C un timp mai îndelungat.

Reacția PCR în gradient de temperatură

Principiu:

Optimizarea temperaturii de hibridizare a primerilor prin realizarea unei reacții PCR în gradient de temperatură, presupune hibridizarea ADN matriță, concomitent, la temperaturi diferite cu aceeași primeri în scopul stabilirii temperaturii optime, care să permită eliminarea amplificărilor parazite și realizarea cu un randament ridicat a reacției PCR.

Materiale utilizate:

Probe de ADNc, reactivi PCR: amestec dNTP (10 mM), MgCl2 (25mM), tampon 5x (100 mM TRIS-HCl, 500 mM KCl, pH= 8,3), ADN polimeraza GoTaq 5U/μL, primer sens p53: (5` → 3`) …, primer antisens p53: (5` → 3`) …, primer sens NF-kB: (5` → 3`) …, primer antisens NF-kB: (5` → 3`)…, apă ultrapură Nuclease-free; aparat Veriti 96 Well Thermal Cycler.

Mod de lucru:

Probele de ADN au fost diluate până la o concentrație de 100 ng/μL;

Au fost pipetați câte 1 μL în fiecare dintre tuburile destinate reacțiilor PCR finale;

În câte un tub pentru fiecare probă, au fost adăugați reactivii necesari în cantitățile din Tabelul 4:

Tabelul 4.Reactivii și cantitățile necesare reacției PCR

Înainte de utilizare toți reactivii au fost vortexați, cu excepția polimerazei;

Tuburile au fost vortexate și centrifugate scurt;

Tuburile au fost așezate în aparatul PCR care a permis realizarea unui gradient de temeratură;

A fost programat aparatul după următorul program din Tabelul 5:

Tabelul 5. Timpii și temperaturile de incubare

Electroforeză în gel de agaroză

Principiu:

Electroforeza ADN este o tehnică de separare a moleculelor de ADN în funcție de masa moleculară într-un gel preparat într-o soluție de agaroză, urmată de aplicarea unei diferențe de potențial între anod și catod. În cazul fragmentelor liniare, viteza de migrare este invers proporțională cu mărimea fragmentului.

Materiale necesare: Tanc de electroforeză, sursă de curent continuu, sursă UV pentru vizualizarea gelului, probe ADNc, gel pentru migrarea electroforetică, tampon de electroforeză, marker pentru migrarea electroforetică, marker de masă moleculară.

Mod de lucru:

Prepararea gelului:

Din soluția stoc de 50X, a fost preparat volumul necesar de tampon de electroforeză TAE 1X;

Cantitatea de agaroză necesară pentru obținerea unui gel de agaroză 2% a fost cântărită, adică 0,7 grame pentru 35 mL TAE 1X;

Prin încălzire până la fierbere, a fost dizolvată agaroza în tamponul de electroforeză;

A fost răcit vasul sub jet de apă până la temperatura de 50°C;

Au fost adăugați 2,7 μL bromură de etidiu și omogenizată soluția;

A fost turnată soluția într-o tăviță de gel și lăsată la solidificat;

A fost adăugat un pieptene pentru crearea godeurilor de încărcare a probelor.

B. Încărcarea probelor:

A fost scos pieptenul și introdus gelul solidificat în tancul de electroforeză umplut cu tampon TAE 1X;

Au fost amesctecate și încărcate probele cu albastru de bromfenol;

A fost încărcat markerul de masă moleculară.

C. Migrarea electroforetică:

Sistemul de electroforeză a fost conectat la sursă de curent continuu;

A fost setat voltajul, amperajul și timpul de migrare: 85 V, 45 minute.

D. Vizualizarea produșilor PCR:

După migrare, a fost scos gelul din tamponul de electroforeză și expus la UV într-un transiluminator;

Imaginea a fost captată într-un sistem de viodeodocumentare BioRad.

Evaluarea expresiei genice prin qPCR

Principiu:

Real-Time PCR permite cuantificarea produșilor de reacție în timp real, datorită înglobării unui florocrom cunoscut a cărui concentrație este direct proporțională cu cantitatea de ampliconi formată. Metodele de vizualizare în timp real sunt bazate pe utilizarea de: molecule florescente intercalante Syber Green, sonde Molecular Beacon, oligosonde nucleare Taqman sau cuplurilor de oligosonde. Principiul cuantificării expresiei genice utilizând moleculele intercalante florescente Sybr Green, se bazează pe capacitatea acestora de a se lega la fosa minoră a ADN dublu catenar și de a emite florescență în acel moment. Pe măsură ce are loc amplificarea ADN genei de interes, emisia fluorescentă crește direct proporțional cu creșterea numărului de ampliconi formați.

Materiale utilizate:

Probe de ADNc (100 ng/μL), reactivi PCR: SYBR Select Master Mix, Applied Biosystems, primer sens pentru gena p53: (5` → 3`) …, primer antisens pentru gena p53: (5` → 3`) …, primer sens pentru gena NF-kB: (5` → 3`) …, primer antisens pentru gena NF-kB: (5` → 3`) …, primer sens pentru gena de referință GAPDH: (5` → 3`) …, primer antisens pentru gena de referință GAPDH: (5` → 3`) …, apă ultrapură Nuclease-free; aparat ViiA 7 and QuantStudio 12K systems.

Mod de lucru:

A fost realizată diluția probelor de ADNc până la o concentrație de 100 ng/μL;

A fost desemnată gena de referință GAPDH;

Reacția a fost lucrată în duplicat astfel, a fost pipetat câte 1μL din probele de ADNc obținute în godeurile corespunzătoare;

În tuburi separate, a fost realizat câte un mix de reacție pentru fiecare genă în parte, deoarece perechile de primeri sunt diferiți, conform Tabelelor 6 și 7:

Tabelul 6. Componentele și cantitățile necesare mixului de reacție pentru gena de interes

Tabelul 7. Componentele și cantitățile necesare mixului de reacție pentru gena de referință

A fost pipetat mixul de reacție în placa qPCR peste 1μL ADNc diluat;

A fost sigilată placa cu folie transparentă și pusă pe termobloc;

Setările după care rulează reacția de amplificare în timp real, au fost realizate conform Tabelului 8:

Tabelul 8. Programul de rulare a reacției de amplificare în timp real

Datele obținute în urma experimentelor desfășurate au fost comparate și analizate statistic cu programul GraphPad Prism, One-way ANOVA, metoda Bonferroni. Toate rezultatele cantitative sunt prezentate ca media a n=3 experimente; valorile p < 0.05 au fost considerate statistic semnificative.

Capitolul 5

Rezultate și discuții

Rezultate și discuții

Nanoceluloza reprezintă unul dintre cele mai utilizate materialele avansate, fiind un produs chimic activ ce prezintă trei grupări hidroxil, care îi conferă rezistență, rigiditate și suprafață mărită (Jiang și colab., 2015).

Alginatul este extras din pereții celulari ai algelor brune, fiind unul dintre materialele utilizate în medicina regenerativă și ingineria tisulară datorită biocompatibilității sale, citotoxicității scăzute, stabilității și porozității (Jiang și colab., 2015).

Pectina este prezentă în pereții celulari a unor plante sau fructe. Aplicabilitatea sa în domeniul medical, respectiv ingineria tisulară, medicina regenerativă, vindecarea rănilor sau administrarea de medicamente, este susținută de proprietățile sale de biocompatibilitate, citotoxicitate scăzută, stabilitate, porozitate, vâscozitate și gelifiere (Munarin și Tanzi, 2012).

5FU este un medicament chimioterapeutic utilizat în tratamentul diferitelor tipuri de cancer. Acțiunea sa se bazează pe inhibarea timidilat-sintazei, o enzimă implicată în sinteza nucleotidelor, iar efectul anti-tumoral al 5FU depinde de activitatea p53 (Zargar și colab., 2018), fiind capabil să determine blocarea ciclului celular, să moduleze activitatea caspazei-3/ -7 și în stadiul final să inducă apoptoza prin producerea de ROS (Sui și colab., 2014).

Ingineria tisulară (figura 14) presupune formarea in vitro a unor substitute pentru țesutul lezat, indicate pentru implantare, după cultivarea celulelor în materiale 3D, capabile să susțină creșterea, proliferarea și diferențierea celulelor însămânțate la nivelul acestora, într-un mediu de creștere și diferențiere adecvat.

Figura 14. Principiul ingineriei tisulare (adaptată după Killian și colab., 2012)

Evaluarea in vitro al efectului anti-tumoral

După două, respectiv șapte zile de cultură în condiții standard, a fost evaluată biocompatibilitatea compozitelor 3D pe bază de nanoceluloză, dar și efectul anti-tumoral al medicamentului 5FU, prin intermediul testelor cantitative MTT, LDH și a testului calitativ LiveDead. Evaluarea a constat în determinarea viabilității și proliferării celulare, a toxicității biomaterialelor, raportate la controlul reprezentat de utilizarea celulelor hASC, dar și de efectul anti-tumoral al medicamentului încorporat în materialele studiate, atât asupra celulelor normale, cât și asupra celulelor tumorale implicate în studiu.

Evaluarea cantitativă a viabilității și proliferării celulare – testul MTT

După două zile de cultură în condiții standard, rezultatele testului MTT (figura 15) au confirmat o mai bună biocompatibilitate a materialelor CNP în comparație cu materialele CNA pentru toate cele trei linii celulare utilizate. Adăugarea agentului anti-tumoral 5FU a avut un efect citotoxic asupra sistemelor studiate, ceea ce a scăzut viabilitatea celulelor hASC și a celulelor tumorale. Rezultatele testului MTT au indicat combinația favorabilă dintre nanoceluloză și alginat și nanoceluloză și pectină, în special după șapte zile de cultură, fiind observată o diferență semnificativă statistic între cele două compoziții.

Testul MTT realizat asupra sistemelor 3D alcătuite din materialele pe bază de nanoceluloză și alginat sau pectină, în care a fost încorporat medicamentul 5FU și celulele stem izolate din țesut adipos sau hASC, au indicat rezultate statistic semnificative, între compoziția de bază CNA sau CNP și celelalte compoziții CNA care prezentau 5FU încorporat, sugerând faptul că tratamentul pe bază de 5FU afecteză și celulele normale prezente în țesuturile adiacente. O scădere statistic semnificatvă a proliferării celulare este observată după șapte zile de cultură a hASC în contact cu CNA, ceea ce sugerează un răspuns celular mai favorabil în prezența materialelor pe bază de CNP, fața de rezulatele obținute pe CNA.

În cazul celulelor tumorale MDA/MB 231, se poate observa o diferența statistic semnificativă a viabilității celulare susținute de cele două tipuri de compoziții, după doar două zile de cultură, diferență care este observată și după șapte zile de cultură și care indică prezența pectinei ca fiind benefică pentru proliferarea celulară. Prezența medicamentului încorporat în matricea CNP, indică o scădere statistic semnificativă a viabilității celulelor tumorale, dar și o scădere a ratei de proliferare, cea mai accentuată fiind determinată de concentrația cea mai mare de 5FU.

Figura 15. Viabilitatea celulelor (A) hASC, (B) MDA/MB 231, (C) ZR 75-1 în contact cu materialele studiate, cuantificată cu testul MTT după două și șapte zile de cultură în condiții standard. Din punct de vedere statistic: p< 0,05 (*), p< 0,01 (**), p<0,001 (***), p< 0,05 (#), p< 0,01 (##), p<0,001 (###), p< 0,01 (&&).

Comportamentul celulelor ZR 75-1 la contactul cu materialele propuse este asemanător cu cel al celulelor MDA/MB 231. Diferențe statistic semnificative a viabilității celulare au fost obținute în momentul în care au fost testate ambele tipuri de matriale dar care prezentau agent anti-tumoral înglobat, indicând scăderea acesteia la contacul cu materialele pe bază de CNA, dar mai ales cu o concentrație de 5FU mărită.

Rezultatele obținute au indicat o bună biocompatibilitate a materialelor propuse în contact cu celulele normale hASC, ceea ce sugerează faptul că o combinație între nanoceluloză și alginat sau pectină este favorabilă pentru a susține viabilitatea și proliferarea celulară. Totodată, este evidențiată preferința pentru pectină în detrimetul alginatului. De asemenea, încorporarea medicamentului anti-tumoral 5FU a determinat o scădere a viabilității și proliferării celulelor tumorale, afectând într-o mică măsură și comportamentul celulelor normale.

Evaluarea cantitativă a citotoxicității materialelor – testul LDH

Citotoxicitatea materialelor propuse a fost evaluată utilizând nivelurile de LDH eliberate de celulele deteriorate în mediul de cultură. Rezultatele obținute (figura 16) au indicat un răspuns celular mai favorabil la contactul celulelor normale cu pectina, față de contactul cu alginatul. Totodată, a fost evidențiată efectul unei concentrații mai mare de medicamenet asupra celulelor tumorale implicate în studiu.

Rezultatele testului LDH efectuat asupra celulelor normale, indică o diferență statistic semnificativă între cele două compoziții, atât după primele două zile de cultură, cât și după șapte zile de cultură, ceea ce sugerează o ușoară citotoxicitate a materialului CNA în comparație cu materialul CNP, materialul pe bază de CNP susținând mai eficient atât viabilitatea cât și proliferarea celulară. Este observată o scădere statistic seminificativă a viabilității celulare în prezența unei concentrații mai mari de medicament dar și scăderea proliferării după cele șapte zile de cultură.

Figura 16. Citotoxicitatea scaffold-urilor, cuantificat prin testul LDH la două și șapte zile de la însămânțarea celulelor (A) hASC, (B) MDA/MB 231, (C) ZR 75-1. Din punct de vedere statistic: p< 0,05 (*), p< 0,01 (**), p<0,001 (***), p< 0,05 (&), p< 0,01 (&&), p<0,001 (&&&).

La nivelul celulelor tumorale MDA/MB 231, rezultatele statistic semnificative pot fi observate după cele șapte zile de cultură, atât în cazul sistemelor alcătuite din CNA cât și CNP, rezultate care indică o ușoară citotoxicitate indusă de prezența materialelor. O diferență statistic semnificativă a nivelului de citotoxicitate este indusă de prezența medicamentului 5FU, cu precădere în compozițiile în care concentrația acestuia este mai mare. În compozitele pe bază de CNP, înglobarea 5FU se dovedește a fi mai eficintă astfel încât diferențe statistic semnificative pot fi observate după șapte zile de cultură, între compoziția de bază și cele care prezintă 5FU, conturându-se rolul efectul anti-tumoral al acestui medicament.

Citotoxicitatea materialelor exercitată asupra celulelor ZR 75-1, poate fi observată după doar două zile de cultură, rezultate statistic semnificative fiind identificate între compozițiile de bază și cele care prezintă încorporată o concentrație de 5% de agent anti-tumoral. După șapte zile de la punerea în cultură a sistemelor, doar compozitele pe bază de pectină au dovedit eficacitate în înglobarea și eliberarea 5FU, diferențe statistic semnificative fiind observate între compoziția de bază și cea îmbunătățită cu 5%5FU.

Evaluarea calitativă a viabilității și proliferării celulare – testul LiveDead

Testul LiveDead este un test calitativ care indică distribuția celulelor vii și moarte în sistemele 3D propuse prin microscopie de fluorescență. După marcarea celulelor, o rată ridicată a viabilității celulelor poate fi observată pe toate tipurile de compoziții, probabil datorită compușilor naturali din compoziția materialelor (figura 17).

Observarea rezultatelor obținute prin însămânțatea celulelor normale hASC, indică faptul că materialele care conțin alginat și pectină reprezintă un scaffold favorabil pentru reconstrucția țesutului mamar, totuși materialele care conțin pectină au susținut o viabilitate celulară crescută și o mai bună proliferare a celulelor față de materialele care conțin alginat. De asemenea, după 7 zile de cultură, s-au observat mai multe grupuri pe materialele pe bază de CNP, ceea ce sugerează un răspuns celular mai bun al celulelor normale la pectină în comparație cu alginatul.

Prezența 5-fluorouracil în compoziția materialelor a scăzut viabilitatea și proliferarea celulelor, efectul cel mai accentuat fiind observat atunci când concentrația mai mare de 5-fluorouracil a fost adăugată în compoziția tuturor materialelor propuse. Efectul 5-fluorouracil a fost mai bine observat atunci când celulele tumorale au fost puse în contact cu materialele, cea mai mare scădere a viabilității, proliferării celulare și absența grupurilor celulare a fost predominant în compozițiile cu cea mai mare cantitate de agent anti-tumoral.

Figura 17. Analiza calitativă a celulelor vii (verde) și moarte (roșu) observate la microscopul de fluorescență după două și șapte zile de cultură a (A) hASC, (B) MDA/MB 231, (C) ZR 75-1, în contact cu materialele pe bază de nanoceluloză, în condiții standard.

Evaluarea in vitro a activității caspazei-1

Profilul inflamator al sistemelor 3D obținute, a fost analizat prin evaluarea complexului proteic numit inflamazom (figura 18), compus din receptorul Nod-Like (NLR), proteina ASC și caspaza-1, implicate în inflamație și moartea celulară indusă de inflamație. Caspaza-1 îndeplinește un rol important în imunitatea celulară și în răspunsului inflamator, iar activitatea sa poate fi măsurată, după activarea inflamazomului, utilizând testul Caspase-Glo 1 Inflammasome (Promega, SUA), care furnizează un semnal luminiscent direct proporțional cu activitatea caspazei-1.

Activitatea caspazei-1 a crescut statistic semnificativ în sistemele 3D ce conțineau medicament anti-tumoral și celule normale, atât după primele 12 ore cât și după 24 de ore de la contact. În primele 12 ore, cele mai semnificative rezultate sunt obervate între controalele reprezentate de mediul de cultură cu sau fără celule și compozitele cu 5% 5FU înglobat, totodată fiind identificate și diferențe statistic semnificative între compozițiile de bază și cele îmbogățite, ceea ce sugerează faptul că activitatea caspaze-1 este stimulată în prezența agentului anti-tumoral. După cele 24 de ore de cultuvare, au putut fi confirmate rezultatele oținute anterior și anume că încorporarea 5FU în compoziția materialelor promovează activarea caspazei-1.

Figura 18. Analiza nivelului de expresie al caspazei-1 prezente în sistemele alcătuite din (A) hASC, (B) MDA/MB 231, (C) ZR 75-1 și materialele 3D studiate, prin intermediul testului Caspase-Glo® 1 Inflammasome. Din punct de vedere statistic: p< 0,05 (*), p< 0,01 (**), p<0,001 (***), p< 0,05 (#), p<0,001 (###), p< 0,01 (&&), p<0,001 (&&&).

La nivelul celulelor tumorale, activitatea caspazei-1 este mărită în comparație cu controlul reprezentat de celulele normale. Diferențe statistic semnificative au fost obținute între controale și compozitele îmbogățite cu 5FU, atât la o concentrație mai mică cât și la o concentrație mai mare, scoțând în evidență activarea caspazei-1 și nivelurile ridicate ale acesteia în sistemele funcționalizate cu medicamentul propus. La 24 de ore de la însămânțarea celulelor tumorale, nivelul de expresie al caspazei-1 a fost de aproximativ două ori mai mare ca cel măsurat la 12 ore, la nivelul sistemelor ce prezentau cea mai mare concentrație de agent anti-tumoral.

Caspaza-1 este un marker al piroptozei sau moarte celulară indusă de inflamație, fiind posibilă de identificat după activarea complexului proteic inflamazom. Prezența acesteia în cantități considerabile în probele îmbogățite cu 5FU, indică rolul și eficiența medicamentului asupra celulelor tumorale, care și-au pierdut viabilitatea și capacitatea de proliferare.

Evaluare in vitro a producerii ROS

ROS reprezintă molecule reactive și radicali liberi, care sunt produși în celulele vii și neutralizate prin mecanisme de apărare antioxidante. Cu toate acestea, sub influența anumitor condiții, nivelul de producere al ROS este mai ridicat, antioxidanții nu au capacitatea de a elimina aceste molecule și, prin urmare, intervine stresul oxidativ.

Evaluare in vitro a producerii ROS extracelulare

Badea și colab., (2018) au indicat faptul că celulele tumorale sunt mai rezistente față de acțiunea ROS, în comparație cu celulele normale, deoarece prezintă un sistem de eliminare a ROS care intervine în menținerea homeostaziei și imortalității.

Nivelul ROS produs de celulele normale la contactul cu compozitele îmbogățite cu 5FU este statistic semnificativ mai scăzut comparativ cel produs la expunerea celulelor la H2O2 (figura 19). Însă producerea ROS după expunerea celulelor normale la agentul anti-tumoral, a crescut proporțional și dependent de doză utilizată. Aceste rapoarte fiind observate la șase și 24 de ore în cazul ambelor compoziții de bază, CNA sau CNP, sugerând un răspuns anti-oxidant al celulelor normale la stresul oxidativ produs.

Pentru evaluarea stresului oxidativ produs de celulele tumorale după ce au fost însămânțate în materialele 3D, a fost efectuat testul Amplex Red, ce a indicat un nivel ridicat al ROS, iar generarea ROS după cultivarea sistemelor ce conțineau medicament, reprezintă un parametru important pentru evaluarea eficienței acestuia. Diferențe statistic semnificative pot fi observate între controale și compozițiile de bază, dar nu și între controale și compozițiile îmbogățite, ceea ce indică nivelul aproape similar de ROS produs de celulele tumorale în condiții diferite.

Figura 19. Nivelul relativ al ROS extracelulare produse după expunerea celulelor (A) hASC, (B) MDA/MB 231, (C) ZR 75-1 la materialele 3D pe bază de nanoceluloză. Din punct de vedere statistic: p< 0,05 (*), p< 0,01 (**), p< 0,05 (#), p< 0,01 (##), p<0,001 (###).

Conform Kim și colab., (2014), celulele canceroase se pot adapta circumstanțelor ROS ridicate și uneori, ROS induce proliferarea celulelor canceroase, ceea ce ar putea explica nivelul ridicat de viabilitate celulară. Această caracteristică a celulelor canceroase permite dobândirea unei rezistențe la condițiile de stres oxidativ în comparație cu celulele normale.

Evaluare in vitro a producerii ROS intracelulare

Testul pentru evaluarea nivelului de radicali liberi produși de celule presupune ca după interacțiunea cu ROS, H2DCF-DA să fie transformat în DCF, un compus fluorescent care este detectat prin spectroscopie de fluorescență (figura 20).

La nivelul celulelor normale, nivelul ROS produs este relativ constant de-a lungul perioadei de cultură, cu excepția sistemelor care aveau înglobată cea mai mare concentrație de tratament, prezența acestuia afectând și celulele normale într-o manieră dependentă de concentrația utilizată. Diferențele statistic semnificative putând fi raportate cu precădere la nivelul controlului, după 24 de ore, deoarece nivelul ROS a crescut semnificativ, comparativ cu controlul atât în cazul celulelor normale cât și în cazul celulelor tumorale.

Figura 20. Nivelul relativ al ROS intracelulare produse după expunerea celulelor (A) hASC, (B) MDA/MB 231, (C) ZR 75-1 la materialele 3D pe bază de nanoceluloză. Din punct de vedere statistic: p< 0,05 (*), p< 0,01 (**), p<0,001 (***), p< 0,05 (#), p< 0,01 (##), p<0,001 (###).

Creșterea producției intracelulare de ROS de către celulele tumorale, este direct proporțional mediată de concentrația de medicament introdusă și poate provoca oprirea ciclului celular, senescența sau moartea celulelor. După doar șase ore de cultură în sisteme, nivelul ROS produs este relativ constant, însă după 24 de ore, diferențe statistic semnificative încep a fi observate între controale sau compozițiile de bază și culturile 3D cu 5% 5 FU, indicând pe de o parte eficacitatea în timp a medicamentului pentru a acționa asupra celulelor tumorale dar și timpul necesar pentru elaborarea unui răspuns celular.

Evaluarea expresiei genice a p53 și NF-kB

Expresia genelor p53 și NF-kB au fost evaluate la 12 și 24 de ore de la punerea celulelor în contact cu materialele 3D propuse și evaluată prin Real-Time PCR.

P53 este o genă supresoare tumorală care este stimulată de stresul celular, precum și de hipoxie, radiații ultraviolete și stres oxidativ. Rezultatele nivelului comparativ al profilului de expresie p53 au indicat o creștere statistic semnificativă între compozițiile de bază, CNA și CNP, și cele care au prezentat 1% 5FU, respectiv 5% 5FU. O creștere considerabilă a p53 a putut fi observată la 24 de ore de la contactul celulelor cu materialele propuse, cea mai eficientă compoziție fiind cea bazată pe CNP + 5% 5FU.

Figura 21. Variația expresiei p53 evaluată la 12 și 24 de ore de cultivare a (A) hASC, (B) MDA/MB 231, (C) ZR 75-1 în sistemele 3D. Din punct de vedere statistic: p< 0,05 (*), p< 0,01 (**), p<0,001 (***), p< 0,05 (#).

Nivelul p53 (figura 21) a crescut direct proporțional cu creșterea concentrației de 5FU adăugată la nivelul materialelor. Celulele normale dobândesc o variație crescătaore a expresiei p53 în momentul adăugării unei concentrații mai mare de medicament.

Nivelul expresiei p53 măsurat în sistemele ce cuprind celulele tumorale este relativ de două ori mai mare față de controlul reprezentat de celulele normale. Comparativ cu materialele de bază, cele îmbogățite determină o expresie a p53 statistic semnificativ mai crescută, la nivelul tuturor compozițiilor, această creștere fiind observată la 12 și 24 de ore de la cultivarea în sisteme. Diferențe semnificative pot fi observate și în timp, la nivelul compoziției CNP+5%5FU, ceea ce sugerează eficacitatea acestui material îmbogățit și efectul anti-tumoral exercitat asupra celulelor MDA/MB 231 și ZR 75-1.

Comparativ, nivelul de expresie al NF-kB (figura 22) a indicat o creștere exponențială similară în timpul celor două perioade evaluate, dar cea mai semnificativă creștere existentă este la intervalul de 24 de ore.

Figura 22. Variația expresiei NF-kB evaluată la 12 și 24 de ore de cultivare a (A) hASC, (B) MDA/MB 231, (C) ZR 75-1 în sistemele 3D. Din punct de vedere statistic: p< 0,05 (*), p< 0,01 (**), p<0,001 (***), p< 0,05 (#),p< 0,01 (##), p<0,001 (###).

NF-kB este implicat în reglarea răspunsului celular, în controlul supraviețuirii și proliferării celulare. Așadar, nivelul ridicat al acestuia în celulele tumorale este justificat, deoarece NF-kB activat determină exprimarea anumitor gene care susțin proliferarea celulară și protejează celulele de condiții care în mod normal ar determina apoptoza celulară.

Variația expresiei NF-kB evaluată la nivelul celulelor normale hASC indică efectul medicamentului anti-tumoral exercitat asupra acestora, întrucât nivelul de NF-kB crește direct proporțional cu creșterea dozei de 5FU încorporat, o diferență statistic semnificativă considerabilă putând fi observată după cele 24 de ore de cultivare în sistemele 3D. După 12 ore de cultură, nivelul de NF-kB a crescut statistic semnificativ la contactul celulelor normale cu materialele care conțineau cea mai mare doză de tratament adăugată, față de compozițiile de bază.

Celulele tumorale din sistemele 3D propuse prezintă cea mai mare variație a expresiei NF-kB. Diferențe statistic semnificative pot fi observate între CNA sau CNP la nivelul cărora expresia NF-kB are valori scăzute și valorile măsurate în prezența tratamentului, acestea fiind semnificativ mai ridicate, atât la primul timp măsurat, cât și la cel de-al doilea. Creșterea expresiei poate fi observată și în timp, creșterea acestuia fiind semnificativă și indicând răspunsul agresiv al celulelor tumorale la doza de medicament administrată.

Concluzii

Proliferarea, invazia și metastazarea CM sunt influențate de inflamație prin intermediul factorilor de transcripție și promovate de prezența MAT, celulelor tumorale, adipocitelor și fibroblastelor, care produc citokine pro-inflamatorii. Împreună cu diverși factori de risc, conferă un micromediu inflamator care asigură dezvoltarea acestei boli, activarea inflamazomului indusă de inflamație, inițierea și progresia tumorii.

Factorul de transcripție NF-kB, este un modulator în elaborarea răspunsului inflamator, fiind implicat în inițierea și evoluția carcinogenezei. Modificările căii de semnalizare a NF-kB, precum amplificarea și supraexpresia IKKε, pot determina degradarea ADN și pot determina moartea celulară.

Corelația dintre inflamație și complexul inflamazom este realizată prin intermediul căii de semnalizare NF-kB. TLR și receptorii TNF-α interferă în această cale și inițiază semnalul de activare reprezentat de producerea de IL-1β și IL-18 modulate de activitatea caspazei-1. La rândul său, caspaza-1 activată stimulează clivajul proteolitic, promovând inflamația și piroptoza sau moartea celulelor determinate de inflamație, după activarea inflamazomului.

Ansamblarea inflamazomului este asigurată de platforme, cum ar fi reticulul endoplasmatic și interfața mitocondrială, care permit activarea caspazei-1, secreția și maturarea citokinelor pro-inflamatorii și într-un stadiu final inițierea piroptozei.

Pentru a înțelege conexiunea dintre inflamație, complexul inflamazom și CM, această lucrare a evaluat șase materiale 3D pe bază e nanoceuloză și alginat sau pectină, îmbogățite cu 1% și respectiv 5% medicament anti-tumoral 5FU (2, 2A, 2B, 4, 4A, 4B).

Materialele 3D au fost însămânțate cu celule stem izolate din țesut adipos uman, iar sistemele rezultate au fost testate în vederea stabilirii efectului anti-tumoral indus de prezența medicamentului, prin evaluarea viabilității și proliferării celulare și citotoxicității. Potențialul inflamator al materialelor a fost studiat prin intermediul testului Caspase – Glo Inflammasome care permite evaluarea activității caspazei-1, implicată și în piroptoză. Printre factorii de risc ce pot determina piroptoza, se identifică și ROS, astfel pentru corelarea rezultatelor, a fost analizat și nivelul de ROS intra- și extracelulare produse de celulele normale și tumorale însămânțate în materialele propuse. În final, Real-Time PCR a permis evaluarea varieției expresiei p53 și NF-kB de la nivelul bioconstructelor analizate, pentru justificarea rezultatelor obținute în experimentele anterioare.

Rezultatele obținute au indicat realizarea eficientă a bioconstructelor și au sugerat materialul de bază CNP ca fiind cel mai indicat pentru susținerea viabilității și proliferării celulare, iar eficiența medicamentului anti-tumoral 5FU asupra celulelor tumorale, s-a înregistrat în compozițiile în care concentrația acestuia era cea de 5%. De asemenea, activitatea caspazei-1 a crescut statistic semnificativ la nivelul bioconstructelor ce prezentau încorporat medicament, indicând acțiunea eficientă a acestuia și asupra celulelor normale prezente în țesuturile adiacente.

Nivelul ROS produs atât de celulele normale cât și de cele tumorale, au justificat rezultatele obținute anterior, întrucât activitatea caspazei-1 este influențată și de nivelul stresului oxidativ exercitat. Variația expresiei genice a p53 și NF-kB a indicat o creștere a acestora dependentă de creșterea concentrației de agent anti-tumoral adăugată, sugerând eficiența în elaborarea unui răspuns celular la acțiunea unor factori externi.

Perspectivele acestui studiu sunt reprezentate de validarea rezultatelor obținute prin realizarea experimentelor in vivo, pe modele animale, atât a materialelor de bază, CNA și CNP, cât și a eficienței 5-fluorouracil. Complexul inflamazom oferă numerose direcții de studiu, însă o înțelegere aprofundată a implicației sale în inițierea și progresia cancerului mamar este necesară dar presupune efectuarea a numerose activități experimentale ce pot reprezenta o continuare a acestui studiu.

Bibliografie

Abais J.M., Xia M., Zhang Y., Boini K.M., Li P.L., 2015. Redox regulation of NLRP3 inflammasomes: ROS as trigger or effector? Antioxid. Redox. Signal. 22, 1111–1129.

Adam Vizi V., 2005. Production of reactive oxygen species in brain mitochondria: contribution by electron transport chain and non-electron transport chain sources. Antioxid. Redox. Signal. 7, 1140-1149.

Ahmad A., Banerjee S., Wang Z., Kong D., Majumdar A.P., Sarkar F.H., 2009. Aging and inflammation: etiological culprits of cancer. Curr. Aging. Sci. 2, 174-86.

Anstine L.J., Keri R., 2019. A new view of the mammary epithelial hierarchy and its implications for breast cancer initiation and metastasis. J. Cancer Metastasis Treat. 5. doi: 10.20517/2394-4722.2019.24.

Axpe E., Oyen M.L., 2016. Applications of alginate-based bioinks in 3d bioprinting. Int. J. Mol. Sci. 17, 1976.

Badea M., Prodana M., Dinischiotu A., Crihana C., Ionita D., Balas M., 2018. Cisplatin Loaded Multiwalled Carbon Nanotubes Induce Resistance in Triple Negative Breast Cancer Cells. Pharmaceutics. 10, 228-253.

Bajaj A.K., Chevray P.M., Chang, D.W., 2006. Comparison of donor-site complications and functional outcomes in free muscle-sparing TRAM flap and free DIEP flap breast reconstruction. Plast. Reconstr. Surg. 117, 737-746.

Bauernfeind F.G., Horvath G., Stutz A., Alnemri E.S., MacDonald K., Speert D., Fernandes-Alnemri T., Wu J., Monks B.G., Fitzgerald K.A., Hornung V., Latz E., 2009. Cutting edge: NF-kappaB activating pattern recognition and cytokine receptors license NLRP3 inflammasome activation by regulating NLRP3 expression. J. Immunol. 183, 787-791.

Baran C.N., Peker F., Ortak T., Sensoz O., Baran N.K., 2001. A different strategy in the surgical treatment of capsular contracture: leave capsule intact. Aesthetic. Plast. Surg. 25, 427e31.

Baumgarten S.C., Frasor J., 2012. Minireview: Inflammation: An Instigator of More Aggressive Estrogen Receptor (ER) Positive Breast Cancers. Mol. Endocrinol. 26, 360–371.

Bergsbaken T., Cookson B.T., 2007. Macrophage activation redirects yersinia-infected host cell death from apoptosis to caspase-1-dependent pyroptosis. PloS. Pathog. 3. doi:10.1371/journal.ppat.0030161.

Bhatelia K., Singh K., Singh, R., 2014. TLRs: Linking inflammation and breast cancer. Cell. Signal. 26, 2350–2357.

Biswas D.K., Iglehart J.D., 2006. Linkage between EGFR family receptors and nuclear factor kappaB (NF-kappaB) signaling in breast cancer. J. Cell. Physiol. 209, 645-652.

Broz P., Dixit V.M., 2016. Inflammasomes: mechanism of assembly, regulation and signalling. Nat. Rev. Immunol. 16, 407-420.

Buyukavcu A., Albayrak Y.E., Goker N., 2016. A fuzzy information-based approach for breast cancer risk factors assessment. Appl. Soft. Comput. 38, 437–452.

Chavey C., Bibeau F., Gourgou-Bourgade S., Burlinchon S., Boissiere F., Laune D., Roques S., Lazennec G., 2007. Oestrogen receptor negative breast cancers exhibit high cytokine content. Breast Cancer Res. 9, R15. doi: 10.1186/bcr1648.

Chevray P.M., 2004. Breast reconstruction with superficial inferior epigastric artery flaps: a prospective comparison with TRAM and DIEP flaps. Plast. Reconstr. Surg. 114, 1077-1083.

Chhaya M.P., Melchels F.P.W., Holzapfel B.M., Baldwin J.G., Hutmacher D.W., 2015. Sustained regeneration of high-volume adipose tissue for breast reconstruction using computer aided design and biomanufacturing. Biomaterials. 52, 551–560.

Chiorean R., Braicu C., Berindan-Neagoe I., 2013. Another review on triple negative breast cancer. Are we on the right way towards the exit from the labyrinth? Breast. 22, 1026–1033.

Combellackv E.J., Jessop Z.M., Naderi N., Griffin M., Dobbs T., Ibrahim A., Evans S., Burnell S., Doak S.H., Whitaker I.S., 2016. Adipose regeneration and implications for breast reconstruction: update and the future. Gland. Surg. 5, 227–241.

Cookson B.T., Brennan M.A., 2001. Pro-inflammatory programmed cell death. Trends. Microbiol. 9, 113–114.

Couch F.J., Nathanson K.L., Offit K., 2014. Two decades after BRCA: setting paradigms in personalized cancer care and prevention. Science. 343, 1466–1470.

Coussens L.M., Werb Z., 2002. Inflammation and cancer. Nature. 420, 860–867.

Coussens L.M., Zitvogel L., Palucka A.K., 2013. Neutralizing tumorpromoting chronic inflammation: a magic bullet? Science. 339, 286–291.

Crusz S., Balkwill F., 2015. Inflammation and cancer: advances and new agents. Nat. Rev. Clin. Oncol. 12, 584–596.

De Boer M.C., Worner E.A., Verlaan D., van Leeuwen P.A.M., 2017. The mechanisms and effects of physical activity on breast cancer. Clin. Breast Cancer. 17. 272–278.

Demicco E.G., Kavanagh K.T., Romieu-Mourez R., Wang X., Shin S.R., Landesman-Bollag E., Seldin D.C., Sonenshein G.E., 2005. RelB/p52 NF-kappaB complexes rescue an early delay in mammary gland development in transgenic mice with targeted superrepressor IkappaB-alpha expression and promote carcinogenesis of the mammary gland. Mol. Cell. Biol. 25, 136–147.

Dias K., Dvorkin-Gheva A., Hallett R.M., Wu Y., Hassell J., Pond G.R., Levine M., Whelan T., Bane A.L., 2017. Claudin-low breast cancer; Clinical & pathological characteristics. PLOS ONE. 12. doi:10.1371/journal.pone.0168669.

Dick M.S., Sborgi L., Ruhl S., Hiller S., Broz P., 2016. ASC filament formation serves as a signal amplification mechanism for inflammasomes. Nat. Commun. 7, 11929. doi: 10.1038/ncomms11929.

Dinescu S., Hermenean A., Costache M., 2018. Human adipose-derived stem cells for tissue engineering approaches: current challenges and perspectives. În stem cells in clinical practice and tissue engineering. doi:10.5772/intechopen.68712.

Ding J., Wang K., Liu W., She Y., Sun Q., Shi J., Sun H., Wang D.C., Shao F., 2016. Pore-forming activity and structural autoinhibition of the gasdermin family. Nature. 535, 111-116.

Fang H., Li X., Song S., Xu Y., Zhu J., 2008. Fabrication of slantingly-aligned silicon nanowire arrays for solar cell applications. Nanotechnology. 19, 255703.

Fang Y., Tian S., Pan Y., Li W., Wang Q., Tang Y., Tao Yua T., Wua X., Shib Y., Maa P., Shu Y., 2020. Pyroptosis: A new frontier in cancer. Biomed. Pharmacother. 121, 109595. doi:10.1016/j.biopha.2019.109595.

Fernandez-Yague M.A., Abbah S.A., McNamara L., Zeugolis D.I., Pandit A., Biggs M.J., 2015. Biomimetic approaches in bone tissue engineering: Integrating biological and physicomechanical strategies. Adv. Drug Deliv. Rev. 84, 1–29.

Franklin B.S., Bossaller L., De Nardo D., Ratter J.M., Stutz A., Engels G., Brenker C., Nordhoff M., Mirandola S.R., Al-Amoudi A., Mangan M.S., Zimmer S., Monks B.G., Fricke M., Schmidt R.E., Espevik T., Jones B., Jarnicki A.G., Hansbro P.M., Busto P., Marshak-Rothstein A., Hornemann S., Aguzzi A., Kastenmüller W., Latz E., 2014. The adaptor ASC has extracellular and ‘prionoid’ activities that propagate inflammation. Nat. Immunol. 15, 727-737.

Fortier L.A., 2005. Stem Cells: Classifications, Controversies, and Clinical Applications. Vet. Surg. 34, 415–423.

Gaidt M.M., Hornung V., 2018. The NLRP3 Inflammasome Renders Cell Death Pro-inflammatory. J. Mol. Biol. 430, 133–141.

Galateanu B., Dinescu S., Cimpean A., Dinischiotu A., Costache M., 2012. Modulation of adipogenic conditions for prospective use of hADSCs in adipose tissue engineering. Int. J. Mol. Sci. 13, 15881-15900.

de Gassart A., Martinon F., 2015. Pyroptosis: caspase-11 unlocks the gates of death. Immunity. 43, 835–837.

Geetha Bai R., Muthoosamy K., Manickam S., Hilal-Alnaqbi A., 2019. Graphene-based 3D scaffolds in tissue engineering: fabrication, applications, and future scope in liver tissue engineering. Int. J. Nanomed. 14, 5753–5783.

Germolec D.R., Frawley R.P., Evans E., 2009. Markers of Inflammation. În: Immunotoxicity Testing, Bietert R.R. (ed.), Humana Press, Springer Science, 53–73.

Gringhuis S.I., Kaptein T.M., Wevers B.A., Theelen B., van der Vlist M., Boekhout T., Geijtenbeek T.B., 2012. Dectin-1 is an extracellular pathogen sensor for the induction and processing of IL-1beta via a noncanonical caspase-8 inflammasome. Nat. Immunol. 13, 246-254.

Grivennikov S.I., Greten F.R., Karin M., 2010. Immunity, inflammation, and cancer. Cell. 140, 883– 899.

Grivennikova V.G., Vinogradov A.D., 2013. Mitochondrial production of reactive oxygen species. Biochemistry. 78, 1490–1511.

Gumrah Dumanli A., 2017. Nanocellulose and its composites for biomedical applications. Curr. Med. Chem. 24, 512-528.

Guo B., Fu S., Zhang J., Liu B., Li Z., 2016. Targeting inflammasome/IL-1 pathways for cancer immunotherapy. Sci. Rep. 6. doi:10.1038/srep36107.

Gupta S., Sundaram C., Reuter S., Aggarwal B., 2011. Inhibiting NF-ĸB activation by small molecules as a therapeutic strategy. Biochim. Biophys. Acta. 1799, 775-787.

Helmus M.N., Gibbons D.F., Cebon D., 2008. Biocompatibility: meeting a key functional requirement of next-generation medical devices. Toxicol. Pathol. 36, 70–80.

Hemmrich K., von Heimburg D., 2006. Biomaterials for adipose tissue engineering. Expert. Rev. Med. Devices. 3, 635–645.

Ivanov V.N., Ronai Z., 2000. p38 protects human melanoma cells from UV-induced apoptosis through down-regulation of NF-kappaB activity and Fas expression. Oncogene. 19, 3003–3012.

Jayani R.S., Saxena S., Gupta R., 2005. Microbial pectinolytic enzymes: A review. Process. Biochem. 40, 2931–2944.

Jiang T., Singh B., Choy Y.J., Akaike T., Cho C.S., 2015. Liver tissue engineering using functional marine biomaterials. J. Funct. Biomater. 6, 91–106.

Jovic T.H., Kungwengwe G., Mills A.C., Whitaker I.S., 2019. Plant-derived biomaterials: a review of 3d bioprinting and biomedical applications. Front. Mech. Eng. 5, 19.

Kasza A., 2013. IL-1 and EGF regulate expression of genes important in inflammation and cancer. Cytokine. 62, 22–33.

Kantono M., Guo B., 2017. Inflammasomes and Cancer: The Dynamic Role of the Inflammasome in Tumor Development. Front. Immunol. 8. doi:10.3389/fimmu.2017.01132.

Karin M., 2006. Nuclear factor-kappaB in cancer development and progression. Nature. 441, 431-436.

Karki R., Man S.M., Kanneganti T.D., 2017. Inflammasomes and cancer. Cancer Immunol. Res. 5, 94-99.

Kayagaki N., Stowe I., Lee B., O’Rourke K., Anderson K., Warming S., Cuellar T., Haley B., Roose-Girma M., Phung Q.T., Liu P.S., Lill J.R., Li H., Wu J., Kummerfeld S., Zhang J., Lee W.P., Snipas S.J., Salvesen G.S., Morris L.X., Fitzgerald L., Zhang Y., Bertram E.M., Goodnow C.C., Dixit V.M., 2015. Caspase-11 cleaves gasdermin D for non-canonical inflammasome signalling. Nature. 526, 666–671

Kawanishi S., Ohnishi S., Ma N., Hiraku Y., Murata M., 2017. Crosstalk between DNA Damage and Inflammation in the Multiple Steps of Carcinogenesis. Int. J. Mol. Sci. 18, 1808-1821.

Kendellen M.F., Bradford J.W., Lawrence C.L., Clark K.S., Baldwin S., 2014. Canonical and non-canonical NF-ĸB signaling promotes breast cancer tumor-initiating cells. Oncogene. 33, 1297-1305.

Kesavardhana S., Kanneganti T.D., 2017. Mechanisms governing inflammasome activation, assembly and pyroptosis induction. Int. Immunol. 29, 201–210.

Khouri R., Del Vecchio D., 2009. Breast reconstruction and augmentation using pre-expansion and autologous fat transplantation. Clin. Plast. Surg. 36, 269-280.

Killian M.L., Cavinatto L., Galatz L.M., Thomopoulos S., 2012. Recent advances in shoulder research. Arthritis Res. Ther. 14, 214-224.

Kim J.H., Na H.J., Kim C.K., Kim J.Y., Ha K.S., Lee H., Chung H.T., Kwon H.J., Kwon Y.G., Kim Y.M., 2008. The non-provitamin A carotenoid, lutein, inhibits NF-𝜅B-dependent gene expression through redox-based regulation of the phosphatidylinositol 3-kinase/ PTEN/ Akt and NF-𝜅B-inducing kinase pathways: role of H2O2 in NF-𝜅B activation. Free Radic. Biol. Med. 45, 885–896.

Kim D., Park G.B., Hur D.Y., 2014. Apoptotic signaling through reactive oxygen species in cancer cells. World J. Immunol. 4, 158–173.

Kolb R., Liu G.H., Janowski A.M., Sutterwala F.S., Zhang W., 2014. Inflammasomes in cancer: a double-edged sword. Protein Cell. 5, 12–20.

Kolb R., Phan L., Borcherding N., Liu Y., Yuan F., Janowski A.M., Xie Q., Markan K.R., Li W., Potthoff M.J., Fuentes-Mattei E., Ellies L.G., Knudson C.M., Lee M.H., Yeung S.J., Cassel S.L., Sutterwala F.S., Zhang W., 2016. Obesity associated NLRC4 inflammasome activation drives breast cancer progression. Nat Commun. 7, 13007-13019.

Kundu J.K., Surh Y.J., 2012. Emerging avenues linking inflammation and cancer. Free Radic. Biol. Med. 52, 2013–2037.

Lamkanfi M., Kanneganti T.D., Van Damme P., Vanden Berghe T., Vanoverberghe I., Vandekerckhove J., Vandenabeele P., Gevaert K., Núñez G., 2008. Targeted peptidecentric proteomics reveals caspase-7 as a substrate of the caspase-1 inflammasomes. Mol. Cell. Proteomics. 7, 2350–2363.

Lamkanfi M. Dixit V.M., 2012. Inflammasomes and their roles in health and disease. Annu. Rev. Cell. Biol. 28, 137-161.

Langer R., Vacanti J., 1993. Tissue engineering. Science. 260, 920–926.

Lavik E., Langer R., 2004. Tissue engineering: current state and perspectives. Appl. Microbiol. Biotechnol. 65, 1-8.

Lee K.Y., Mooney D.J., 2012. Alginate: Properties and biomedical applications. Prog. Polym. Sci. 37, 106–126.

Lehmann-Che J., Hamy A.S., Porcher R., Barritault M., Bouhidel F., Habuellelah H., Leman-Detours S., de Miao E.A., Rajan J.V., Aderem A., 2011. Caspase-1-induced pyroptotic cell death. Immunol. Rev. 243, 206-214.

Levenberg S., Langer R., 2004. Advances in tissue engineering. Curr. Top. Dev. Biol. 61, 113-134.

Lin N., Dufresne A., 2014. Nanocellulose in biomedicine: Current status and future prospect. Eur. Polym. J. 59, 302–325.

Lin C., Zhang J., 2017. Inflammasomes in inflammation-induced cancer. Front. Immunol. 8. doi:10.3389/fimmu.2017.00271

Liu X., Zhang Z., Ruan J., Pan Y., Magupalli V.G., Wu H., Lieberman J., 2016. Inflammasome-activated gasdermin D causes pyroptosis by forming membrane pores. Nature. 535, 153–158.

Lu Z., Miao Y., Muhammad I., Tian E., Hu W., Wang J., Wand B., Li R., Li J., 2017. Colistin-induced autophagy and apoptosis involves the JNK-Bcl2-Bax signaling pathway and JNK-p53-ROS positive feedback loop in PC-12 cells. Chem.-Biol. Interact. 277, 62–73.

Luo Y., Lode A., Gelinsky M., 2012. Direct plotting of three-dimensional hollow fiber scaffolds based on concentrated alginate pastes for tissue engineering. Adv. Healthc. Mater. 2, 777–783.

Maeda S., Omata M., 2008. Inflammation and cancer: Role of nuclear factor-kappaB activation. Cancer Sci. 99, 836–842.

Man S.M., Kanneganti T.D., 2015. Regulation of inflammasome activation. Immunol. Rev. 265, 6–21.

Mantovani A., Muzio M., Garlanda C., Sozzani S., Allavena P., 2001. Macrophage control of inflammation: negative pathways of regulation of inflammatory cytokines. Novartis. Found. Symp. 234, 120–131.

Medzhitov R., Janeway C.A., 1997. Innate immunity: the virtues of a nonclonal system of recognition. Cell. 91, 295–298.

Medzhitov R., 2008. Origin and physiological roles of inflammation. Nature. 454, 428-435.

Minatel I., Francisqueti F., Correa C., Lima G., 2016. Antioxidant activity of γ-oryzanol: a complex network of interactions. Int. J. Mol. Sci. 17, 1107. doi:10.3390/ijms17081107.

Moustakas A., Pardali K., Gaal A., Heldin C.H., 2002. Mechanisms of TGF-b signaling in regulation of cell growth and differentiation. Immunol. Lett. 82, 85–91.

Muller A., Homey B., Soto H., Ge N., Catron D., Buchanan M. E., McClanahan T., Murphy E., Yuan W., Wagner S.N., Barrera J.L., Mohar A., Verástegui E., Zlotnik A., 2001. Involvement of chemokine receptors in breast cancer metastasis. Nature. 410, 50–56.

Munarin F., Tanzi M.C., Petrini P., 2012. Advances in biomedical applications of pectin gels. Int. J. Biol. Macromol. 51, 681–689.

Munoz-Planillo R., Kuffa P., Martinez-Colon G., Smith B.L., Rajendiran T.M., Nunez G., 2013. K(+) efflux is the common trigger of NLRP3 inflammasome activation by bacterial toxins and particulate matter. Immunity. 38, 1142–1153.

Murphy C.M., O’BrienF.J., Little D.G., Schindeler A., 2013. Cell-scaffold interactions in the bone tissue engineering triad. Eur. Cell. Mater. 26, 120-132.

Nakamura K., Smyth M.J., 2017. Targeting cancer-related inflammation in the era of immunotherapy. Immunol. Cell Biol. 95, 325–332.

Nakshatri H., Bhat-Nakshatri P., Martin D., Goulet R.J., Sledge G.W., 1997. Constitutive activation of NF-kappaB during progression of breast cancer to hormone-independent growth. Mol Cell Biol. 17, 3629-3639.

Nathan C., 2006. Neutrophils and immunity: challenges and opportunities. Nature Rev. Immunol. 6, 173–182.

Naugler W.E., Karin M., 2008. NF-kappaB and cancer-identifying targets and mechanisms. Curr. Opin. Genet Dev. 18, 19-26.

O’Brien F.J., 2011. Biomaterials & scaffolds for tissue engineering. Mater. Today. 14, 88–95.

Place E.S., Evans N.D., Stevens M.M., 2009. Complexity in biomaterials for tissue engineering. Nat. Mater. 8, 457–470.

Patrick C.W., 2001. Tissue engineering strategies for adipose tissue repair. Anat. Rec. 263, 361–366.

Pavelescu L.A., 2015. On reactive oxygen species measurement in living systems. J. Med. Life. 8, 38-42.

Pizato N., Luzete B.C., Kiffer L.F.M.V., Correa L.H., de Oliveira Santos I., Assumpcao J.A.F., Kiyomi M., Magalhaes K.G., 2018. Omega-3 docosahexaenoic acid induces pyroptosis cell death in triple-negative breast cancer cells. Sci. Rep. 8. doi:10.1038/s41598-018-20422-0.

Pober J.S., Sessa W.C., 2007. Evolving functions of endothelial cells in inflammation. Nature Rev. Immunol. 7, 803–815.

Pratt M.C., Tibbo E., Robertson S.J., Jansson D., Hurst K., Perez-Iratxeta C., Lau R., Niu M.Y., 2009. The canonical NF-kappaB pathway is required for formation of luminal mammary neoplasias and is activated in the mammary progenitor population. Oncogene. 28, 2710-2722.

Provenzano E., Ulaner G. A., Chin S.F., 2018. Molecular classification of breast cancer. PET. Clin. 13, 325–338.

Raposo T.P., Beirao B.C.B., Pang L.Y., Queiroga F.L., Argyle D.J., 2015. Inflammation and cancer: Till death tears them apart. Vet. J. 205, 161–174.

Raut P.K., Kim S.H., Choi D.Y., Jeong G.S., Park P.H., 2019. Growth of breast cancer cells by leptin is mediated via activation of the inflammasome: critical roles of estrogen receptor signaling and reactive oxygen species production. Biochem. Pharmacol. 161, 73–88.

Ravi M., Paramesh V., Kaviya S., Anuradha E., Solomon F., 2015. 3D cell culture systems: advantages and applications. J. Cell. Physiol. 230, 16–26.

Ray C., 1977. Psychological implications of mastectomy. Br. J. Clin. Psychol. 16, 373–377.

Renner F., Moreno R., Schmitz M.L., 2010. SUMOylation-dependent localization of IKKepsilon in PML nuclear bodies is essential for protection against DNA-damage-triggered cell death. Mol. Cell. 37, 503–515.

Reynaert N.L., van der Vliet A., Guala A.S., McGovern T., Hristova M., Pantano C., Heintz N.H., Heim J., Ho Y.S., Matthews D.E., Wouters E.F., Janssen-Heininger Y.M., 2006. Dynamic redox control of NF-𝜅B through glutaredoxin-regulated S glutathionylation of inhibitory 𝜅B kinase 𝛽. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 13086–13091.

Roquancourt A., Cahen-Doidy L., Bourstyn E., de Cremoux P., de Bazelaire C., Albiter M., Giacchetti S., Cuvier C., Janin A., Espié M., de Thé H., Bertheau P., 2013. Molecular apocrine breast cancers are aggressive estrogen receptor negative tumors overexpressing either HER2 or GCDFP15. Breast Cancer Res. 15, R37. doi:10.1186/bcr3421.

Safford K.M., Safford S.D., Gimble J.M., Shetty A.K., Rice H.E., 2004. Characterization of neural/glial differentiation of murine adult adipose-derived stromal cells. Exp. Neurol. 187, 319-328.

Serhan C.N., Savill J., 2005. Resolution of inflammation: the beginning programs the end. Nature Immunol. 6, 1191–1197.

Sharma D., Kanneganti T.D., 2016. The cell biology of inflammasomes: Mechanisms of inflammasome activation and regulation. J. Cell Biol. 213, 617–629.

Shostak K., Chariot A., 2011. NF-ĸB, stem cells and breast cancer: the links get stronger. Breast Cancer Res. 13, 214.

Shi J., Zhao Y., Wang K., Shi X., Wang Y., Huang H., Zhuang Y., Cai T., Wang F., Shao F., 2015. Cleavage of GSDMD by inflammatory caspases determines pyroptotic cell death. Nature. 526, 660-665.

Shi J., Gao W., Shao F., 2017. Pyroptosis: gasdermin-mediated programmed necrotic cell death. Trends. Biochem. Sci. 42, 245–254.

Shipitsin M., Polyak K., 2008. The cancer stem cell hypothesis: in search of definitions, markers, and relevance. Lab. Invest. 88, 459-463.

Simmons J.K., Hildreth B.E., Supsavhad W., Elshafae S.M., Hassan B.B., Dirksen W.P., Toribio R.E., Rosol T.J., 2015. Animal Models of Bone Metastasis. Vet. Pathol. 52, 827-841.

Siqueira P., Siqueira E., De Lima A.E., Siqueira G., Pinzón-Garcia A.D., Lopes A.P., Segura M.E.C., Isaac A., Pereira F.V., Botaro V.R., 2019. Three-dimensional stable alginate-nanocellulose gels for biomedical applications: towards tunable mechanical properties and cell growing. Nanomaterials. 9, 78.

Sui X., Kong N., Wang X., Fang Y., Hu X., Xu Y., Chen W., Wang K., Li D., Jin W., Lou F., Zheng Y., Hu H., Gong L., Zhou X., Pan H., Han W., 2014. JNK confers 5-fluorouracil resistance in p53-deficient and mutant p53-expressing colon cancer cells by inducing survival autophagy. Sci. Rep. 4, 4694.

Sun S.C., 2010. Non-canonical NF-ĸB signaling pathway. Nat. Publ. Gr. 21, 71.

Tachi M., Yamada A., 2005. Choice of flaps for breast reconstruction. Int. J. Clin. Oncol. 10, 289-297.

Triner D., Shah Y.M., 2016. Hypoxia-inducible factors: A central link between inflammation and cancer. J. Clin. Investig. 126, 3689–3698.

Ullah M.F., 2019. Breast cancer: current perspectives on the disease status. În: Breast cancer metastasis and drug resistance., Ahmad A. (Ed.). Advances in Experimental Medicine and Biology, 1152, Springer, 51-64.

Van’ t Veer L.J., Dai H., van de Vijver M.J., He Z.D., Hart A.A.M., Mao M., Peterse H.L., van der Kooy K., Marton M.J., Witteveen A.T., Schreiber G.J., Kerkhoven R.M., Roberts C., Linsley P.S., Bernards R., Friend S.H., 2002. Gene expression profiling predicts clinical outcome of breast cancer. Nature. 415, 530–536.

Walle L.V., Lamkanfi M., 2016. Pyroptosis. Curr. Biol. 26, R568-R576.

Wankhade U.D., Shen M., Kolhe R., Fulzele S., 2016. Advances in adipose-derived stem cells isolation, characterization, and application in regenerative tissue engineering. Stem Cells Int. 1, 1–9.

Weichand B., Popp R., Dziumbla S., Mora J., Strack E., Elwakeel E., Frank A.C., Scholich K., Pierre S., Syed S.N., Olesch C., Ringleb J., Oren B., Doring C., Savai R., Jung M., von Knethen A., Levkau B., Fleming I., Weigert A., Brune B., 2017. S1PR1 on tumor associated macrophages promotes lymphangiogenesis and metastasis via NLRP3/IL-1β. J. Exp. Med. 214, 2695–2713.

Yamanishi Y., Boyle D.L., Rosengren S., Green D.R., Zvaifler N.J., Firestein G.S., 2002. Regional analysis of p53 mutations in rheumatoid arthritis synovium. Proc. Natl. Acad. Sci. 99, 10025–10030.

Ye J., Zhang R., Wu F., Zhai L., Wang K., Xiao M., Xie T., Sui X., 2018. Non-apoptotic cell death in malignant tumor cells and natural compounds. Cancer Lett. 420, 210–227.

Zargar P., Ghani E., Mashayekhi F.J., Ramezani A., Eftekhar E., 2018. Acriflavine enhances the antitumor activity of the chemotherapeutic drug 5‑fluorouracil in colorectal cancer cells. Oncol. Lett. 15, 10084-10090.

Zimta A.A., Tigu A.B., Muntean M., Cenariu D., Slaby O., Berindan-Neagoe I., 2019. Molecular links between central obesity and breast cancer. Int. J. Mol. Sci. 20, 5364-5385.

https://www.invivogen.com/review-nlrp3-inflammasome