Produse Farmaceutice și Cosmetice DETECTAREA MICOTOXINELOR PRIN METODE CU IMUNOSENZORI -METODA ELISA Coordonator : Masterand : Conf. Dr. Ing. Ing…. [625683]

1

Universitatea Tehnică “Gheorghe Asachi”, Iași
Facultatea de Inginerie Chimică și Protecția Mediului
“Cristofor Simionescu”
Produse Farmaceutice și Cosmetice

DETECTAREA MICOTOXINELOR PRIN METODE CU
IMUNOSENZORI -METODA ELISA

Coordonator :
Masterand: [anonimizat]. Ing. Elena
POP A
Adrian UNGUREANU

2019

2
Cuprins

1. Introducere
2. Micotoxine – generalităț i
3. Clasificare micotoxine
4. Aflatoxine totale – noțiuni teoretice
5. Ochratoxina A – noțiuni teoretice
6. Deoxinivalenol – noțiuni teoretice
7. Efectele micotoxinelor asupra sistemelor biologice
8. Efectele micotoxinelor asupra imunităț ii
9. Efectele micotoxinelor asupra formă rii anticorpilor
10. Interferenț a micotoxinelor cu trofinel e (substanțe proteice, lipide,
meta bolismul glu cidic, vitaminele)
11. Efectele micotoxinelor asupra organismului uman
12. Detectarea micotoxinelor prin imuno senzori – metode ELISA generalităț i
13. Partea experimentală
14. Aflatoxine totale – principiul metodei, mod de lucru, rezultate, analiza
rezultatelor
15. Ochratoxina A – principiul metodei, mod de lucru, rezultate, interpretarea
rezultatelor
16. Deoxinivalenol (DON) – principiul metodei, mod de lucru, rezultate, analiza
rezultatelor
17. Impactul micotoxinelor asupra sănătăț ii omului
18. Concluzii

3

Tema lucrării de disertație

Detectarea micotoxinelor (aflatoxinelor și ochratoxinelor) prin metode cu
imunosenori, metoda Elisa.

Capitolul 1. Introducere

4

5
Capitolul 2. Generalități

Termenul de micotoxin ă vine de la cuv ântul grecesc “mycos” care ȋnseamnă “ciupercă” și
de la cuv ântul latin “toxicum” care ȋnseamnă otravă. Ele desemneaz ă metaboliți secundari
secretați de mucegaiurile care apar țin ȋn principal genurilor Aspergillus, Penicillium și
Fusarium, prezente ȋn mod natural ȋn aerul ambient, pe p ământ și pe culturi.
Micotoxinele sunt considerate ca fi ind parte din contaminan ții alimentari cei mai
semnificativi ȋn ceea ce prive ște impactul asupra s ănătății publice, securit ății alimentare și
asupra economiei a numeroaselor țări. Ele se g ăsesc pe o mare varietate de produse
alimentare ȋnainte, ȋn timpul și după recoltă. Afecteaz ă numeroase produse agricole, anume
cereale, fructele, nucile, boabele de cafea, orezul și plantele oleaginoase, care sunt substraturi
foarte sensibile la contaminarea cu mucegaiuri și la producerea de micotoxine. Contaminarea
produ selor de c ătre micotoxine se realizeaz ă ȋn cazul c ând ȋntrunesc condi țiile de mediu pe
câmp pentru apari ția lor, precum și procedee neadecvate de recoltare, de stocare și de
transformare atunci c ând sunt cumulate. Prin diversitatea efectelor lor toxice și a
proprietăților lor sinergice, micotoxinele prezint ă un risc pentru consumatorul alimentelor
contaminate.
Tabel 1. Specii fungice produc ătoare de micotoxine
Micotoxine Mucegaiuri
Aflatoxina B1, B2,G1,G2 Aspergillus parasiticus,Aspergi llus
Flavus
Ochratoxina A, B, C Aspergillus ochraceus,Aspergillus
carbonarius, Penicillium verrucosum
Zearalenona Fusarium roseum, Fusarium sp.
Desoxinivalenol, Fusarenona,
Toxina T2 Fusarium tricinatum, Fusarium sp.
Fumonisine F. moniliforme, F. prol iferatum,
Fusarium sp.
Citrinina P. citrinum
Patulina P. patulum
Acidul penicilic A. ochraceus, A. cyclopium
Moniliformina A. proliferatum

6
Capitolul 3. Clasificarea micotoxinelor
Principalele tipuri de micotoxine de importan ță economic ă
Un consum de alimente contaminate cu anumite tipuri de mucegaiuri poate provoca la om
și la animal, efecte nefavorabile pentru s ănătate, de la apari ția unor forme de “hepatite
exudative”, p ână ȋn prezent la consumatorii cronici a unor hepa toame (cancer hepatic).
Majoritatea micotoxinelor au capacitate cancerigen ă.
Mecanismul cancerigen al acestora se manifest ă prin capacitatea lor de a se fixa pe ADN, cu
producerea de alter ări la acest nivel și cu determinarea de schimb ări, sub forma de m utații.
Din gama mare de micotoxine aten ția este ȋndreptată spre aflatoxine, ochratoxine,
sterigmatocistine, patulina.
Micotoxinele pot avea asupra organismului uman și animal o serie de efecte
negative (fig. 1).

Fig. 1. Efect e toxice asociate micotoxinelor

7
Capitolul 4. Aflatoxine totale
Aflatoxine
După accidentele observate ȋn 1960 ȋn crescătoriile de curci (100.000 p ăsări
moarte), numeroase cercet ări au fost conduse spre un grup de molecule cu ȋnalte
proprietăți toxice: aflatoxinele. Aflatoxinele constituie un grup de 18 compu și cu
structuri apropiate unde 4 compu și au forme foarte frecvent ȋntâlnite ȋn alimente: B 1,
B2, G 1 si G 2.
Din punct de ved ere chimic, aflatoxinele sunt un ansamblu dintre o cumarin ă
și trei furani (figura 2). Sunt molecule cu mas ᾰ molecular ă mică (312 – 330 g/mol),
foarte pu țin solubile. Sunt solubile ȋn apă, insolubile ȋn solvenți nepolari. Foarte
solubile ȋn solvenți organi ci (cloroform și alcool metilic), fiind u șor de extras. La
lumină ultraviolet ă, sunt fluorescente (albastru pentru AFB, verde pentru AFG,
AFM1 prezint ă o fluorescen ță albastru -mov).

Fig. 2 Structura chimic ă a aflatoxinelor

8

Sunt micotoxine produse de mu cegaiuri din genul Aspergillus: Aspergillus
flavus și Aspergillus parasiticus, mucegaiuri prezente ȋn multe locuri și sunt pu țin
exigente la cre ștere: temperatura cuprins ă ȋntre 6 și 50˚C, sursa de carbon și azot , și o
valoare a a w -ului mai mare de 80%.
Din acest motiv, numeroase produse alimentare destinate consumului pot
conține aflatoxine ȋn cantități uneori importante: alune, porumb, gr âu, fistic, cacao,
cafea, manioc, soia. Metabolizate de diverse enzime microzomiale, aflatoxinele sunt
eliminate sub formă de glucorani pe cale urinar ă, prin lapte sau bila, dar pot ap ărea
anumiți derivati epoxidici. Fiind electrofile, ele reac ționează la grupuri nucleofile de
ADN sau de proteine. Microzomii hepatici, con țin enzime cu ȋnaltă activitate,
capabile s ă oxide ze numeroase substraturi lipofile.
Aceste reac ții necesită prezența oxigenului și a NADPH (redus). Un atom de
oxigen este fixat pe substrat și altul este redus ȋn apă (NADP este oxidat). Astfel,
aflatoxinele sunt toxice pentru numeroase organisme vegetale și animale procariote si
eucariote (alge, ciuperci, bacterii).
Aflatoxinele au de asemenea un efect puternic teratogen și pot provoca
moartea ȋn câteva ore sau c âteva zile , ȋn funcție de cantitatea de micotoxin ă și
sensibiltatea animalului.
Aflatoxinele au pe de altă parte un rol asupra fosforil ărilor și lipogenezei.
Ȋn concluzie, aflatoxinele sunt recunoscute ca fiind cei mai cancerigeni compu și
naturali, și este posibil s ă se obțină o relație liniară ȋntre inciden ța cancerului primitiv
de ficat și logaritmul procentului de aflatoxin ă ingerată. Intoxicatia acut ă cu
aflatoxină se traduce prin moarte și ȋn general cu simptome de depresie, anorexie,
diaree, icter sau anemie. Mai presus de orice, leziunile hepatice (necrozele și cirozele)
evoluează ȋn final cu hepatome sau carcinome. Formele cronice ale aflatoxicozelor se
traduc printr -o scădere a performan țelor de cre ștere a animalelor, anemie, icter lejer și
o evolutie canceroas ă ȋn final. O doza de 0.2μg/kg timp de 470 zile declan șeaza un
hematom la șoareci.

9

Mecanismul actiunii aflatoxinelor:
Aflatoxina B1 p ătrunde ȋn celulă și este fie metabolizat ă de monooxigenaz ă ȋn
reticulul endoplasmatic ob ținându-se produși metabolici hidroxila ți care sunt ulterior
metaboliza ți la glucuronid și conjuga ți sul furați; fie este oxidat ă obținându-se
epoxidul reactiv care este hidrolizat spontan și se poate lega de proteine devenind
citotoxic. Epoxidul poate reac ționa cu ADN -ul sau cu proteinele, sau poate fi
transformat de o glutation ă, S-transferaza la (GSH) – conjugat.
Datorită efectelor negative asupra organismului animal și uman, limitele maxime
admise de aflatoxine ȋn produsele alimentare sunt cuprinse ȋntre 0.05 -15 (μg/kg)
(tabel 2).

Aflatoxina M1
Ȋn 1963 s -a demonstrat c ă la vite, aflatoxina B1 este absorbit ă cu hrana contaminat ă,
este metabolizat ă ȋntr-un derivat numit aflatoxina M 1 care este reg ăsit ȋn lapte. 0.5 -4% de
aflatoxina B 1 ingerată se reg âsesc sub form ă de aflatoxina M 1 ȋn lapte. Această micotoxin ă
păstrează, la o treapt ă inferioa ră, importantele propriet ăți cancerigene ale aflatoxinei B 1.
Astfel, efectul cumulativ legat cu ingerarea regulat ă a acestor toxine, face s ă se
expună la mari riscuri copii și sugarii, marii consumatori de lapte și produse lactate. Aceste
riscuri sunt cu atât mai importante deoarece aflatoxina M 1 rezistă la tratamentele uzuale de
conservare și procesare a produselor lactate. Aflatoxina M 1 se regăsește ȋn totalitate ȋn laptele
smântânit și ȋn produsele lactate (iaurt, br ânză), se regăsește foarte pu țin ȋn unt. Aceasta este
legată de prezen ța interacțiunilor hidrofobe ȋntre aflatoxina M 1 și cazeină.

10
Tabel 2. Aflatoxine – limitele maxime admise
Produs Nivelul maxim de
aflatoxina
(μg/kg)
B1 B1+B2+G1+G2 M1
Aflatoxine
Arahide, nuci și fructe uscate
Arahi dele, nucile și fructele uscate și produsele procesate din
acestea, destinate consumului direct sau folosite ca ingredient
alimentar 2.0 4.0 –
Arahidele supuse sort ării sau altui tratament fizic, ȋnainte
de a fi consumate de c ătre om sau de a fi folosit e ca ingredient
alimentar 8.0 15.0 –
Nucile și fructele uscate supuse sort ării sau altui tratament
fizic, ȋnainte de a fi consumate de c ătre om sau de a fi
folosite ca ingredient alimentar 5.0 10.0 –
Cereale (inclusiv hri șca, Fagopyrum sp)
Cereale (inclusiv hri șca) și produsele procesate din acestea
destinate consumului uman direct sau folosite ca
ingredient alimentar 2.0 4.0 –
Cereale (inclusiv hri șca) cu excep ția porumbului, destinate
sortării sau altui tratament fizic, ȋnainte de consumul de c ătre
om sau de a fi folosite ca ingredient alimentar 2.0 4.0 –
Porumbul destinat sort ării sau altui tratament fizic, ȋnainte
de a fi consumat de c ătre om sau de a fi folosit ca
ingredient alimentar 5.0 10.0 –
Lapte (lapte bătut, lapte pentru fabricare a produselor pe
bază de lapte și laptele tratat prin c ăldură, așa cum este – – 0.05

11
definit prin legisla ția sanitară veterinară ȋn vigoare
Următoarele specii de condimente :
– Capsicum spp . (fructele uscate ale acestuia, ȋntregi sau
măcinate, inclusiv chi lli, pudră de chilli, cayennesi paprika)
– Piper spp .(fructele acestuia, inclusiv piper alb sau negru)
– Myristica fragrans (nucșoara)
– Zingiber officinale (ghimbir)
– Curcuma longa (turmeric) 5.0 10.0 –
Alimentele pentru copii și alimentele pe baz ă de cereale
procesate, pentru sugari și copii de v ârstă mică 0.10 – –
Formulele pentru sugari și formulele ȋn continuare in clusiv laptele pentru
sugari și laptele ȋn continuare – – 0.025
Alimente cu destina ție nutrițională specială destinate ȋn special sugar ilor 0.10 – 0.025

Capitolul 5. Ochratoxina A
Ochratoxina A a fost izolat ă pentru prima dat ă ȋn 1965, de un grup de cercet ători sud
africani. Din punct de vedere chimic este o molecul ă de 3-metil -5 cloro -8 hidroxi -3,4
dehidroizocumarin ă, legată prin lega tură peptidică, la nivelul grup ărilor carboxil ȋn
C7, cu o grupare aminic ă a L-β fenilalanin ă (figura 3).

Exista și alte ochratoxine ca ochratoxina B, care este derivat al ochratoxinei A și
ochratoxina C – ester etilic. Aceste dif erențe de structur ă, au efecte marcante asupra
potențialului toxic.

12
Ochratoxina A este micotoxina cea mai toxic ă și cea mai rasp ândită.
Ochratoxina A are o mas ă molecular ă de 403,8 g/mol, cu un punct de topire la 90 ⁰C, când se
cristalizeaz ă ȋn xilen. Spe ctrul de adsorb ție UV variaz ă cu pH -ul și polaritatea
solvantului. Ochratoxina A posed ă un maxim de adsorb ție de 333 nm, cu un coeficient de
extincție molară de 5500 ml cm ȋn metanol.
Este o micotoxin ă toxică, o doză de 2 ppm este suficient ă pentru a opri creșterea
animalului. Este un contaminant frecvent al cerealelor, al cafelei, nucilor, fructelor uscate,
piperului.
Ochratoxina A este un metabolit secundar, elaborat de diferite mucegaiuri din genurile
Aspergillus și Penicillium. Produc ția de ochr atoxina A este legat ă de temperatur ă, umiditatea
mediului ambiant și conținutul de ap ă al suportului contaminant. Valorile minimale ale
umidității pentru produc ția de ochratoxina oscileaz ă ȋntre 0,83 și 0,90, ȋn funcție de
mucegaiul studiat. Temperatura op timă pentru produc ția de ochratoxin ă de către Aspergillus
ochraceus este de 28 ⁰C, sinteza poate avea loc la temperaturi cuprinse ȋntre 15 și 37⁰C.
Penicillium veridicatum ȋnsă crește ȋntr-o gamă de temperaturi care variaz ă ȋntre 4 și 30⁰C ȋn
prezența unei umidități de 22%. Ȋn regiunile reci, ochratoxina este produs ă de mucegaiuri din
genul Penicillium, iar ȋn regiunile calde , ochratoxina este sintetizat ă de mucegaiuri din genul
Aspergillus .
Producția de ochratoxina A este legat ă de psihologia proprie a fi ecarei specii de mucegai și
de parametrii ecologici.
Ȋn Europa și Canada, Penicilium verrucosum este considerat ca fiind principalul mucegai
producător de ochratoxina A ȋn cereale, form ându-se ȋn general pe alimente acide.
Concentra țiile de ochratox ina A, reg ăsite ȋn alimente sunt foarte variate, și sunt cuprinse
ȋntre c âteva ng/kg p ână la multe zeci de mg/kg.
Mucegaiurile produc ătoare de ochratoxina A pot produce și alte toxine sau pot cu alte
mucegaiuri s ă producă toxine diferite ca citrinina sau aflatoxine. Un fenomen de sinergism
cu ochratoxina A se poate deci produce și poate complica analiza efectelor toxice, ceea ce
nu poate fi atribuit exclusiv ochratoxinei A.

13

Prezența ochratoxinei A ȋn alimente prezint ă un pericol pen tru sănătatea uman ă și
animală.
Ochratoxina A, odat ă ingerată este absorbit ă parțial la nivelul stomacului prin difuzia
pasivă a formei neionizate. Totu și, acest mecanism pasiv nu contribuie dec ât la absorb ția
scăzută a ochratoxinei A.
Principala cale de absorb ție este nivelul intestinal. Procentul de absorb ție al
ochratoxinei A la nivel intestinal este de 66, 56, 56 și 40% la porc, șobolan, iepure și
pui. Este apoi distribuit ă la diferite organe. Urmeaz ă apoi ciclul enterohepatic. Se pot
ȋntâlni canti tăți mici de ochratoxina A liber ă ȋn sânge. Ochratoxina A are o mare
afinitate pentru anumite proteine plasmatice de care este fixat ă (aproximativ 90%). Se
fixează pe albumina seric ă și pe o macromolecula seric ă neidentificat ă cu masa
molecular ă de 20 KDa.
Fixarea ochratoxinei de aceste proteine este un fenomen saturat. Mecanismul prin
care ochratoxina A se leag ă de proteine este pu țin cunoscut. S -a arătat că ochratoxina A
sub forma de di -anion, este legat ă la nivelul a dou ă poziții de fixare pe albumina s erică.
Aceste pozi ții de fixare apar țin subunit ăților II A și II B a albuminei serice. S -a arătat de
asemenea c ă aceste leg ături pot fi deplasate prin leg ături anionice, ca aspartamul,
fenilalanina și anti -inflamatorii. Aceasta fixare ȋntârzie transportul ochratoxinei, la
nivelul diferitelor organe, și contribuie la dezvoltarea efectelor cronice și toxice ale
acestei toxine.
Profilul toxicogenic al ochratoxinei A variaz ă foarte mult ȋn funcție de specie. La om,
calea de eliminare a ochratoxinei este ȋncă foarte lungă, și a fost estimat ă la o lună. Pe de
altă parte, eliminarea ochratoxinei A a fost descompus ă ȋn două faze: una rapid ă cu o
trecere a OTA ȋn sânge de 20 ore, și una secund ă, mult mai lent ă, unde trecerea OTA ȋn
sânge este de 25,5 zile. OTA este d istribuită la organe, unde este metabolizat ă ȋn vederea
eliminării sale.

14
EFECTE PATOGENICE/TOXICE -OTA
Mecanismul de actiune ipotetic al ochratoxinei A:
Ochratoxina A (OTA) este transportat ă ȋn celulă prin intermediul transportorilor organici
anionici multispecifici. Structura chimic ă a OTA con ține o grupare izocumarinic ă legată de
fenilalanin ă (PHE). Multe studii au demonstrat faptul c ă OTA poate altera procesele care
implică fenilalanina și multe dintre efectele biologice ale OTA pot fi prevenite pa rțial prin
suplimentarea cu fenilalanin ă sau substan țe analoage.

Datorită efectelor negative pe care le are ochratoxina A asupra s ănătății omului și
animalului, limitele maxime admise ȋn produsele alimentare sunt cu prinse ȋntre 2 – 10
ppb ( tabel 3 ).
Tabel 3. Limite maxime admise pentru ochratoxina A
Produsul Nivelul
maxim
(μg/kg sau
ppb)
Ochratoxina A
Cereale (inclusiv orez și hrișcă) și produse cerealiere derivate

15
Cereale brute (inclusiv orez și hrișcă brute) 5.0
Toate produsele derivate din cereale (inclusiv produse cerealiere procesate si boabe de
cereale destinate consumului uman direct) 3.0
Stafide uscate 10.0
Cafea crud ă prăjită și cafea prăjită și măcinată cu excepția cafelei solubile
Cafea solubi lă (cafea instant) 5.0
10.0
Vin (vin ro șu, alb roze) și alte tipuri de vin și/sau băuturi
răcoritoare pe baza de must de struguri 2.0
Suc de struguri, suc de struguri ca ingredient ȋn alte băuturi
răcoritoare, inclusiv nectarul de struguri și sucul de struguri
concentrat a șa cum este reconstituit 2.0
Must de struguri și must de struguri concentrat destinat consumului uman direct 2.0
Alimente pentru copii și alimente pe baz ă de cereale
procesate pentru sugari și copii de v ârsta mică 0.50
Alimente cu destina ție nutrițională specială destinate ȋn special
Sugarilor 0.50
Cafea verde, fructe uscate altele dec ât stafidele, cacao și produsele din cacao, vinurile
licoroase, produsele din carne, condimentele și
lemnul dulce (Glycyrrhiza glabra) –

Capit olul 6. Trichotecinele
Au fost asociate ȋncă de la ȋnceputul secolului cu consumul de “ cereale ame țitoare”
(de fapt muceg ăite) ȋn Siberia, av ând ca simptome grea ța, vărsături, ame țeli și tulburări
vizuale. Dup ă descoperirea lor ȋn anul 1974, s -a putut con stata că sunt responsabile
de “Aleucie Toxic ă Alimentar ă” ( descre șterea num ărului de globule albe), ca o consecin ță a
consumului de cereale muceg ăite. Ȋn plus s -a văzut că tricotecinele sunt capabile s ă inducă
reacții chimice cu iriga ții severe, inflama ții, descuam ări ale pielii ȋn contact cu micotoxina.
Sub acest nume, sunt cunoscute mai mult de 75 de micotoxine, produse de Fusarium, dar și
de Tricothecium, Mycothecium.
Toxicitatea poate fi folosit ă ca arma clinic ă dar se poate folosi și ȋn chimioterapii
datorită efectelor benefice.
Sunt grupate ȋn tricotecine de tip A ( Toxina T -2 și HT -2) și de tip B
(desoxinivalenolul, nivalenolul). Sunt formate dintr -un nucleu 12, 13 epoxitricotecine,
format din patru cicluri sixterpenice cu o dubl ă legătură și un epoxid stabil. Cei cinci

16
substituien ți care pot fi inserați pe acest nucleu formeaz ă 148 compu și cunoscu ți, grupați ȋn
patru grupe.
Grupele A și B sunt cele mai frecvente, și sunt caracterizate prin prezen ța sau nu a unei
funcții atomice ȋn poziția C8. Au o mare stabilitate și rezistă atât la tratamente termice c ât și
alcaline. Toxicitatea este legat ă de numărul radicalilor substitui ți ȋn nucleul central. Nu se
acumuleaz ă ȋn organism, sunt eliminate prin fecale și urină.
Toxina T -2 este produ să de numeroase specii de Fusarium, ȋn special de Fusarium
tricinctum, Fusarium sporotrichioides, Fusarium solani și Fusarium equiseti .
– formula brut ă: C24H34O9,
– masa molecular ă: 466,50 g/mol,
– solubilă ȋn solvenți organici polari ca acetona sau acet onitrilul;
– stabilă ȋn solvenți ca acetatul de etil.
Toxina HT -2, este produs ă de numeroase specii de Fusarium, ȋn special de Fusarium
sporotrichioides și Fusarium poae :
– formula brut ă: C22H32O8,
– masa molecular ă: 424,5 g/mol,
– solubilă ȋn solvenți organici polari,
– stabilă ȋn diferiți solvenți ca acetatul de etil .
Desoxinivalenolul (DON) , trichotecina cea mai r ăspândită ȋn lume și este produs ă de F.
graminearum și F. culmorum :
– formula brut ă: C15H20O6,
– masa molecular ă: 296,36 g/mol,
– solubil ȋn etanol, metanol, acetat de etil și apă ;
– stabil ȋn acetat de etil la -18 °C.
Dintre trichotecine, cea mai frecvent ȋntâlnită este desoxinivalenolu l. Limita maxim ă admisă
conform Monitorului oficial al Romaniei din 26 noiembrie 2006 este de 20 0 ppb (tabel 6).

17
Tabel 6. Limite maxime admise pentru con ținutul de desoxinivalenol
Produsul Nivelul maxim
(μg/kg sau ppb)
Desoxinivalenol (DON)
Cereale neprocesate altele dec ât grâul dur, ov ăz și porumb 1250
Grâul dur și ovăzul 1750
Porumb neproce sat –
Făina de cereale, inclusiv f ăina de porumb 750
Pâine, produse de patiserie, biscui ți, batoane de cereale și cereale pentru
micul dejun 500
Paste făinoase (uscate) 750
Alimente pentru copii și alimente pe baz ă de cereale procesate
pentru sugari și copii de v ârstă mica 200
Modul de ac țiune la nivel molecular al DON și al altor tricotecene: DON pătrunde ȋn
celulă prin difuzie și se leagă de ribozomii activi care transmit un semnal la proteinkinazele
activate de ARN (PKR) și la hematopoetokinaza ce lulară (HCK). Are loc fosforilarea
protein -kinazelor activate (MAPKS) și se obține activarea factorului de transcrip ție av ând ca
rezultat efectele cronice și imunotoxice.
EFECTE PATOGENICE/TOXICE -TRICHOTECINE

18
Capitolul 7. Zearalenona

Poate fi produ să de diferite specii de Fusarium: Fusarium culmorum, Fusarium
graminearum și Fusarium Crookwellense. Este un compus cristalin, de culoare alb ă.
A fost numit ă initțal toxina F2. Condi țiile optime pentru a se produce sunt umiditate
ridicată și temperatura s căzută.

Fig. 5. Structura chimic ă a zearalenonei
Se prezint ă ca o lacton ă nesaturată a acidului β exorcilic (figura. 5). Este termostabil ă
și rezistă la o depozitare prelungit ă. Prin hidrogenare, se reduce func ția cetonic ă ȋn alcool
astfel ȋncât se obțin izomerii zearalenonei: izomerul α este folosit ca stimulent de cre ștere
pentru ovine. Nu are efecte toxice cronice. Porcul este animalul cel mai sensibil.
Contaminarea fungic ă intervine pe c âmp, porumbul prezent ând un mucegai ro șu. Dar
producția de toxine se realizeaz ă ȋn principal ȋn timpul depozit ării. Nu prezint ă efecte
toxice cronice.
Limita maxim ă admisă pentru con ținutul de zearalenon ă este de 20 μg/kg (tabel 6).
Tabel 5. Limite maxime admise pentru con ținutul de zearalenona
Produsul Nivelul maxim
(μg/kg sau ppb)
Zearalenona
Cereale neprocesate altele dec ât porumbul 100
Porumbul neprocesat –
Făina de cereale cu excep ția făinii de porumb 75

19
Făina de porumb, pud ra de porumb, șrot și ulei rafinat de porumb –
Pâine, produse de patiseri e, biscuiți
Batoane de porumb și cereale pentru micul dejun pe baz ă de porumb
Batoane din alte cereale și cereale pentru micul dejun altele dec ât
cele pe baz ă de porumb 50
–
50
Alimente pe baz ă de porumb procesat pentru sugari și copii de
vârsta mică
Alimente pe baz ă de alte tipuri de cereale pentru sugari și copii
de vârstă mica –
20
EFECTE PATOGENICE/TOXICE -ZEARALENONA
Mecanismul de ac țiune al zearalenonei:
Zearalenona (Z), asemenea poliestrogenilor (PE) și al estrogenilor din mediu (AE),
traverseaz ă pasiv membrana celular ă și se leagă de receptorii estrogeni. Complexul receptor –
Z ajunge ȋn nucleu foarte rapid unde se leag ă de receptori nucleari specifici și genereaz ă
răspunsuri estrogene prin activarea genelor: acest lucru are ca rezultat producerea de ARN
mitocondrial (mARN) care codific ă ȋn mod normal producerea de proteine care apar ȋn mod
normal prin legarea de receptorii estrogeni.

20

Capitolul 8. Fumonisinele
Sunt produse de diferite specii de Fusarium, ȋn special de Fusarium moniliforme. Cele m ai
toxice fumonisine sunt fumonisina B1 și fumonisina B2. Se g ăsesc ȋn principal ȋn porumb și
produsele pe baz ă de porumb. Are o structur ă liniară din 20 atomi de carbon cu grup ări metil,
hidroxil și doi substituien ți cu masa mai mare (figura 6).
Au de asemenea o func ție aminică primară care ȋi conferă o reactivitate interesant ă și
o solubilitate ȋn mediu apos. Sunt hepatotoxice, nefrotoxice. Se g ăsesc de obicei ȋn porumb,
dar și ȋn orez, mirodenii, bere.

21

Fig. 6. Structura chimic ă a fumonisine lor
EFECTE PATOGENICE/TOXICE -FUMONISINE
Consecin țe: cantitatea crescut ă de sfinganin ă a produs moartea celulei; cantitatea sc ăzută de
ceramidă a produs moartea celulei; a alterat semnalele transmise prin c ăile mediate de baza
sfingoid 1 -fosfat; a alterat funcționarea ȋn procesele modulate de lipide, sfingomielina și
glicosfingolipide; se observ ă niveluri crescute de baze sfingoide 1 -fosfat ȋn ser și ȋn urină.

22
Capitolul 10. Patulina
Este o γ lactona nesaturat ă, produsă de numeroase mucegaiu ri, dar cel mai frecvent
de Aspergillus clavatus, o ciuperc ă a microflorei gr ânelor, Penicillium expansum, agent de
mucegăire a merelor ȋn depozite și Bassochlamys nivea și Bassochlamys fulva prezente sub
forma lor imperfect ă.

Ȋn alimenta ția animală, este o micotoxin ă foarte frecvent ă ȋn furajele depozitate ude
și ȋn cerealele cultivate ȋn slădarii.
Este folosit ă de asemenea ȋn farmacii ca antibiotic pentru a lupta ȋmpotriva
stafilococilor, ȋnsă toxicitatea sa a dus la abandonarea acestei
ȋntrebuințări.
Efectele patulinei se manifest ă prin leziuni congestive la nivelul pl ămânilor,
rinichilor și splinei, dar poate provoca o degenerescen ță de neuroni ȋn cortexul cerebral,
putând rezulta diferite simptome nervoase (paralizii, etc.). Poate avea efecte toxice asupra
globulelor albe (leucocite), c ât și proprietăți cancerigene.
Potrivit Monitorului oficial al Romaniei din 26 noiembrie 2006 limita m aximă
admisă pentru con ținutul de patulin ă este de 10 μg/kg. (tabel 4).
Tabel 4. Limite maxime admise pentru con ținutul de patulin ă
Produsul Nivelul maxim
(μg/kg sau ppb)
Patulina
Suc de fructe și nectar de fructe, ȋn special suc de mere și sucurile de
fructe ca ingrediente pentru alte b ăuturi;
Suc de fructe concentrat dup ă reconstituirea conform instruc țiunilor produc ătorilor 50.0
Băuturi spirtoase, cidru și alte băuturi fermentate derivate din mere sau continand suc
de mere 50.0

23
Produsele solide de mere, inclusiv compot de mere, piure de mere
destinat consumului direct 25.0
Suc de mere și produse solide din mere, inclusiv compot de mere și
piure de mere pentru sugari și copii de vârstă mică și etichetate și comercializate ca
destinate sugarilor și copiilor de v ârstă mică.Alte
alimente pentru copii altele dec ât cele pe baza de cereale procesate 10.0

Capitolul 11 .
Prezen ța micotoxinelor ȋn diverse produse alimentare
 Micotoxinele ȋn cereale
Practica a demonstrat faptul c ă, la depozitarea cere alelor, a produselor de macini ș și
panificație apare ȋn anumite condi ții o microflor ă care favorizeaz ă creșterea mucegaiurilor și
producerea de micotoxine. Mucegaiurile existente ȋn depozitele de cereale se ȋnmulțesc c ând
umiditatea relativ ă a aerului se s ituează ȋntre 80 -85 %, iar temperatura ajunge la peste 26 ⁰C.
Produsele atacate la randul lor devin sursa de infec ție, acumul ând toxine. Aflatoxinele au fost
puse ȋn evidență ȋn pâine, produse de panifica ție, crupe de porumb și ȋn unele tipuri de p âine
dietetică. Ȋn cereale pe l ângă ochratoxina A s-a pus ȋn evidență și alți metaboli ți toxici ai
fungilor, cei mai mul ți din genurile Aspergillus și Penicillium, care trec și ȋn produsele de
maciniș, concentra țiile cele mai mari ȋnregistr ându-se ȋn tărâțe. Și ȋn făina depozitat ă ȋn
condiții de umiditate ridicat ă pot apărea fungi care produc micotoxine (Fusarium, Mucor,
Penicillium, Aspergillus).
Porumbul recolt ându-se la o umiditate ridicat ă poate favoriza apari ția mucegaiurilor
(Aspergillus flavus) chiar ȋncă din câmp.
Orezul poate fi contaminat cu micotoxine, inclusiv aflatoxine, dar prin autoclavare
aflatoxinele sunt inactivate. Micotoxinele din produsele de macini ș pot trece ȋn pâine numai
când se folosesc materii prime puternic contaminate. Este de remar cat faptul c ă fermentarea
aluatului reduce ȋn mică măsură cantitatea de aflatoxine, coacerea nu are nici un efect asupra
lor, dar adaosul ȋn aluat de substan țe oxidante ( tipul broma ților) pot determina reduceri
importante ȋn aflatoxine. Cercetarile efectu ate au scos ȋn evidență faptul că pentru inhibarea
dezvoltării microorganismelor ȋn pâine se pot folosi diver și fungistatici ca: acidul sorbic și
palmitatul de sorboil. P âinea de secar ă cu aciditate ȋntre 8.8 -9.7 grade de aciditate, nu permite
aciditatea, formarea ochratoxinelor, iar pe cea de gr âu se dezvolt ă cantități mici din toate cele
4 tulpini izolate.

 Micotoxinele ȋn semin țe oleaginoase și ȋn ulei
Și semințele oleaginoase (arahidele etc.) pot fi atacate de mucegaiuri (inclusiv Aspergillus
flavu s) care dau na ștere aflatoxinelor; momentele critice fiind recoltarea și depozitarea,
condiții de clim ă, de păstrare etc.

24
Umiditatea arahidelor (apa) ȋn perioade ploioase poate ajunge la 30%; recomand ându-se
uscarea imediat ă a acestora pentru a preveni co ntaminarea cu aflatoxine. La ob ținerea
uleiului prin presare cantitatea mare de micotoxine r ămâne ȋn turte, numai 5% trece ȋn ulei,
respectiv aflatoxinele din ulei reprezint ă 10% din cantitatea existent ă ȋn boabe, ceea ce nu
reprezintă un pericol mare. Pri n prăjire la arahide se reduce con ținutul de substan țe toxice.
Floarea soarelui respectiv semin țele sunt și ele mediu bun pentru dezvoltarea aflatoxinelor.
Uleiul din semin țe de floarea soarelui, con ține cantit ăți mici de aflatoxine, deoarece prin
procesul de rafinare, (tratare cu alcali) și filtrare (prin pl ăci de celuloza -azbest) se reduce
cantitatea de toxine, iar dac ă se execut ă decolorarea ȋn prezența acidului citric detoxifierea
este mai complet ă.

 Micotoxinele din legume și fructe

Legumele și fructele pot fi si ele contaminate cu mucegaiuri care pot sintetiza micotoxine.
Astfel la morcovi Aspergillus parasilicus sintetizeaz ă Aspergillus flavus, iar pe suprafa ța
citricelor se dezvolt ă Aspergillus parasilicus. Dezvoltarea mucegaiurilor pe fru cte, ȋn sucuri
formează ȋn majoritatea cazurilor patulina, cantit ți mai mici s -au gasit ȋn sucuri de pere,
gutui, struguri, excep ții fac ând sucurile de tomate și prune; ȋn sucul de mere concentrat
patulina nu se reduce.
Și pe fructele uscate se pot for ma aflatoxine. Zah ărul are efect de protec ție asupra
micotoxinelor, ceea ce a f ăcut ca patulina s ă existe și in gemuri.

 Micotoxine ȋn cafea și cacao

Ȋn cafea verde muceg ăita s-a identificat Aspergillus ochraceus, iar cu frecven ță mai mică
Aspergillus flavus și Aspergillus versicolor; prin pr ăjire se distrug 75%. Boabele de cacao
conțin micotoxine, produse de Aspergillus parasilicus.

 Micotoxine ȋn băuturi ferme ntate

Ȋn băuturile alcoolice au fost depistate aflatoxine, mai frecvent ȋn cidru, prin fermentarea
pulpei. Cercetările efectuate pe 150 de probe de vin nu a u evidențiat aflatoxine. Maltificarea
necorespunz ătoare a orzului poate forma aflatoxine, ȋn bere trec 5 -10% din cele existente ȋn
malț.

 Micotoxinele ȋn carne și preparate din carne

Micotoxinele pot infecta carnea animalelor ca urmare a inger ării de furaje muceg ăite, cea
mai mare cantitate din micotoxin ă, ochratoxina se acumuleaz ă ȋn rinichi. Ochratoxina are o
termostabilitate ridicat ă; prin prăjire se reduce concentra ția de micot oxină, dar ȋn țesutul gras
nu se schimb ă.
Preparatele din carne pot fi contaminate cu mucegaiuri din genurile: Penicillium,
Aspergillus, Fusarium. Și salamurile fermentate -uscate pot fi contaminate cu tulpini de
Penicillium și mai multe tulpini de Aspe rgillus. Dezvoltarea mucegaiurilor are loc atunci
când păstrarea produselor se face ȋn condiții nefrigorifice, iar pentru prevenirea dezvolt ării

25
acestora este necesar ad ăugarea de sorbat de potasiu. S-a constatat ca o surs ă de infectare a
preparatelor de c arne cu mucegaiuri o constituie și condimentele.

 Micotoxinele ȋn lapte și produsele lactate

Furajele cu con ținut mare de aflatoxine determin ă la vaci, prezen ța ȋn lapte a unui metabolit
al aflatoxinei B1, denumit milktoxin, care este detectat chiar di n primele zile de la ingerare,
declanșând o degerescen ță a celulelor ficatului. Cantitatea de toxin ă este mai mare ȋn lapte
iarna față de primăvara. Și ȋn laptele praf cercet ările au pus ȋn evidență existența unui num ăr
mare de mucegaiuri, ca urmare a depo zitarilor in conditii necorespunzatoare. Laptele praf
contaminat cu Aspergillus versicolor produce diaree puternic ă, iar Penicillium ciclopium
produce simptome nervoase.
Ȋn brânzeturi micotoxinele apar ca urmare a prezen ței mucegaiurilor at ât ȋn mediul ambiant
cât și ȋn urma proceselor tehnologice. Absen ța microorganismelor fungice s -a constatat la
telemea și ȋn unele cazuri la ca șcavalul tip Dobrogea. Valorile maxime de micotoxine s -au
constatat la sortimentele p ăstrate un timp mai ȋndelungat.
Cu c ât consistența pastei este mai tare, cu at ât filamentele de mucegai p ătrund mai
greu ȋn profunzime, num ărul cel mai mic de mucegaiuri se ȋnregistreaz ă la br ânzeturile
opărite; ȋn brânzeturile topite frecven ța aflatoxinelor este mult mai mic ă decât la celelalte
tipuri. Cercet ările au arătat ca mucegaiurile Penicillium caseicolum, Penicillium camemberti
și Penicillium roqueforti nu formeaz ă toxine. Totu și, cercetările ȋntreprinse de Scott au
evidențiat faptul ca Penicillium camemberti și Penicillium roqueforti ut ilizate la fabricarea
brânzeturilor sunt capabile s ă producă substanțe toxice (patulina, acid penicilic și alcaloizi
toxici).

Conform Ordinului nr. 1050/97/1145/505/2005 sunt admise urm ătoarele limite
maxime pentru aflatoxine ȋn produse, care sunt prezent ate ȋn tabelul de mai jos .
Tabel 7. Nivel maxim admis pentru aflatoxine conform Ordin nr.
1050/97/1145/505/2005
Nr. crt. Produs Nivel maxim de aflatoxin a
(µg/kg = ppb)
B1 B1+B2+G1+G2 M1
1 Arahide, nuci și fructe uscate și
produse procesate din acestea
destinate consumului uman direct sau
folosite ca ingredient alimentar 2 4 –
2 Arahide supuse sort ării sau altui
tratament fizic, ȋnainte de a fi
consumate de c ătre om sau de a fi
folosite ca ingredient alimentar 8 15 –
3 Nuci și fructe uscate supuse sor tării 5 10 –

26
sau altui tratament fizic ȋnainte de a fi
folosite ca ingredient alimentar
4 Cereale (inclusiv
hrișcă, Fagopyrum sp.) și produse
procesate din acestea destinate
consumului uman direct sau folosite
ca ingredient alimentar 2 4 –
5 Cereale (inc lusiv
hrișcă, Fagopyrum sp.) cu excep ția
porumbului, destinate sort ării sau altui
tratament fizic, ȋnainte de consumul
uman sau ca ingredient alimentar 2 4 –
6 Porumb destinat sort ării sau altui
tratament fizic, ȋnainte de a fi
consumat de c ătre om sau de a fi
folosit ca ingredient alimentar 5 10 –
7 Lapte (lapte brut, lapte pentru
fabricarea produselor pe baza de lapte
și lapte tratat prin c ăldură, așa cum
este definit prin legisla ția sanitar –
veterinară ȋn vigoare) – – 0,05
8 Condimente (piper, nuc șoara, ghimbir,
turmeric, chilli, pudr ă de chilli,
paprika) 5 10 –
9 Alimente pentru copii și alimente pe
baza de cereale procesate, pentru
sugari și copii de v ârstă mică 0,10 – –
10 Alimente cu destina ție nutrițională
specială, pentru sugari 0,10 – 0,025

Datorită faptului ca micotoxine se g ăsesc ȋn unele produse alimentare, pentru a proteja
sănătatea consumatorilor ȋntr-o serie de țări s-au luat m ăsuri de limitare a cantit ății de
micotoxine.

Tabel 8. Limita concentratiei admisibile (LCA) de aflatoxin e in diferite tari

Nr crt Țara Produse alimentare LCA Mg/kg
aflatoxina
1 Belgia Toate produsele alimentare 40
2 Brazilia Unt de cocos (export), f ăina din arahide 50
3 Canada Nuci, produse cu nuci, unt de cocos , alune comestibile și derivate 15
4 Danemarca Produse importate de U.E, produse din Brazilia 5-10

27
(arahide și făină de arahide).
5 Franța Toate produsele alimentare (admite limitele impuse de U.E) 5-10
6 Italia Arahide din import ( și derivatele de prelucrare). 50
7 India Făină de arahide 30
8 Israel Toate produsele alimentare 20
9 Japonia Toate produsele alimentare 10
10 Anglia Arahide 50
11 Polonia Toate produsele alimentare 5
12 Suedia Toate produse le alimentare 5-10
13 Germania Toate produsele alimentare 5-10
14 S.U.A Arahide de consum și alte alimente 20
15 Rom ânia Produse alimentare 5

 Micotoxinele ȋn preparatele enzimatice fungice

O preocupare important ă a cercetării științifice actuale o constituie și problema folosirii
preparatelor enzimatice ȋn industria alimentar ă, ca urmare a eficien ței economice, reducerii
timpului de fabrica ție și a consumurilor specifice, mbun ătățirii calității produselor.
Acestea ȋn majoritatea cazurilor fiind de natura fungic ă s-a ridicat problema verific ării
inocuității lor, deoarece ȋn condiții de cultur ă există posibilitatea dezvolt ării de micotoxine.
Părerile speciali știlor ȋn aceasta direc ție sunt contradictorii, deoarece mucegaiurile
Aspergillus ory zae, Aspergillus niger, etc, produc toxine doar ȋn anumite condi ții de cultur ă.
De remarcat este faptul c ă la preparatele ob ținute, la aceleasi mucegaiuri apar diferen țe de
toxicitate.
Preparatele enzimatice nepurificate care sunt ob ținute din aspergi li pot să ducă la apariția
unor deregl ări profunde, datorit ă includerii unor metaboli ți toxici (aflatoxine, ochratoxine,
acid aspergilic etc). Ȋn urma analiz ării preparatelor enzimatice din Rhizopus s -a constatat
acțiunea lor negativ ă asupra organismului a nimal, ceea ce a determinat scoaterea acestora
din fabrica ție. S-au izolat dou ă micotoxine ȋn preparatele pectolitice ob ținute din Sclerotinina
sclerotium și care au ac țiune toxic ă asupra ficatului, dar și un posibil efect cancerigen (tabel
9).
Tabel 9 . Posibilit ăți de reducere a con ținutului de micotoxine ȋn prod use alimentare
Nr.
crt. Metoda aplicat ă Efecte
1. Prevenirea dezvolt ării mucegaiurilor
toxicogene Reducerea dezvolt ării mucegaiurilor toxicogene
2. Procedee prin extrac ție cu
solvenți organic i Aflatoxinele se dizolv ă ȋn aceștia

http://www.scrigroup.com/afaceri/agricultura/Micotoxinele -Ce-sunt-
micotoxin32636.php

28

Capitolul 12.
Detectarea mi cotoxinelor prin imunosenzori – metode ELISA generalități
În general, m etodele ELISA se realizează utilizând anticorpi imobilizați în
plăci de microtitrare din polistiren cu 96 de godeuri.
Aceste metode se clasfică în două categorii competitive și necompet ititve.
 Metoda ELISA competitivă în cadrul acestei metode, antigenii marcați sunt în
competitive cu antigenii analit nemarcați pentru centrele de legar e ale
anticorpilor imobilizați.
După o etapă de incubare în care are loc formarea imunocomplecșilor,
suportul este spălat pentru a îndepă rta speciile nelegate, urmând adăugarea
substratului care va suferi transformarea chimică catalizată de enzima marker.
Conversia substratului în produs se determină la un anumit timp de
reacție, activitatea catalitică a enzi mei fiind suprimată pin denaturarea sa
(realizată prin ajustarea pH -ului la o valoare extemă).
La final, se trasează o curbă de calibrare pentru care concentrația
produsului descrește cu creșterea concentrației antigenului analit în soluție.
 Metoda ELISA n ecompetitivă se bazează pe formarea unor complecși de
afinitate tip sandwich.
Antigenii analit se leagă într -o primă etapă de anticorpii primari
imobilizați formând un prim complex de afinitate.
După această etapă are lo adăugarea în sistem a anticorpilor secundari
marcați enzimatic, care formează cu primul complex un al doilea complex
care se prezintă sub forma unui sandwich (anticorp primar – antigen – anticorp
secundar marcat).
Concentrația acestui ultim complex este determinate prin măsurarea
activității enzimei marker.
Metoda ELISA necompetitivă conduce le curbe de calibrare în care
concentrația produsului este direct proportională cu concentrația antigenului
analit.
O enzimă marker ideală trebuie să aibă anumite proprietăți
– Activitate catalitică ridica tă
– Să implice substraturi care să nu interfereze cu produsul în timpul
analizei cantitative

29
– Să condică la produse ușor de determinat analitic
– Să fie stabile, ieftină
– Rezistență la componentele ce pot fi prezente în probele biologice
Enzimele utilizate frec vent în calitate de marker prntru imunosenzori sunt
peroxidaza din hrean, fosfataza alcalină, ureaza, catalaza, β – galactozidaza, glucoco –
6- fosfat dehidrogenaza.

Partea experimentală
În cele trei experimente se urmărește evidențierea prezenței micotoxin elor din
materiile prime prin metoda Elisa necompetitivă.
Partea practică a acestei lucrări cuprinde trei experimente în care se analizează
conținutul de micotoxine (aflatoxine totale, ochratoxina A și deoxinivalenol) din
categorii diferite de materii prim e.
Se efectuează experimente prin care se determină trei tipuri de micotoxine
prezente în diferite tipuri de materii prime.
 Aflatoxine totale din nuci, arahide și semințe.
 Ochratoxina din diferite tipuri de făină.
 DON (desoxinivalenolul) din diferite tipur i de făină.
Pentru fiecare tip de determinare se folosesc kituri speiale pentru fiecare
detecție.
În urma realizării expeimentelor se va observa dacă materiile prime testate
conțin sau nu micotoxine în limitele admise.

Experiment nr. 1
Aflatoxine Totale d in nuci, arahide, semințe

1. Scopul experimentului
Determinarea cantității de micotoxine din anumite produse folosind metoda
detecției cu imunosenori, metoda Elisa.

2. Principiul metodei
Primul experiment constă în determinarea de aflatoxine totale din semin țe,
nuci și arahide.
S-au analizat 5 probe și anume semințe de in maro, arahide granulate, semințe
de susan, semințe de floarea soarelui și miez de nucă sferturi.

30
În continuare sunt prezentate etapele analizei, rezultele și analiza acestora
pentru fiecare tip de micotoxine.

3. Modul de lucru

 Aflatoxine Totale din nuci, arahide , semințe

a. Pregătirea probei
 S-au măcinat circa 50 grame de probă de analizat.
 Într-un recipient din plastic cu capac s -au cântărit 5 grame de probă, peste
care s -au adăugat 1 gram de NaCl și 25 ml de soluție de metanol 60%.
 Timp de 3 minute s -au agitat energic probele.
 Supernatantul s -a filtrat într -un flacon Erlenmeyer, iar din soluția filtrată s –
a luat câte 1 ml pentru fiecare probă ce urmează a fi testată și s -au
transferat în tubu ri Eppendorf.
 S-a numerotat și s -a notat fiecare probă pentru a ști ordinea acestora.
b. Enumerarea soluțiilor din kitul pentru aflatoxine totale și condiții de
depozitare a acestora
 Standardele (5 standarde de diferite concentrații, numerotate de la
1 la 5), se agită înainte de folosire.
 Enzyme conjugate, soluție preparată, gata de folosit.
 Soluție de spălare, se diluează în raport de 1ș9 cu apă distilată.
Soluția de spălare diluată este stabilă la temperatura camerei pentru
24 de ore și la 2/ 8 C timp de d ouă săptămâni.
 Soluția de dezvoltare (developing solution) este gata de utilizat,
această soluție este sensibilă la lumină și trebuie ținută departe de
lumină.
 Soluția stop este gata de utilizat. Aceasta conține acid sulfuric 1 M
și trebuie utilizată cu at enție.
c. Procedura de testare
 Kitul de determinare a aflatoxinelor totale conține 96 de godeuri pe
o placă și încă o placă cu 96 de godeuri ce conțin anticorpi anti –
aflatoxine.
 Pentru testare se folosesc 5 godeuri pentru standarde și încă 5
godeuri, un n umăr de godeuri egal cu numărul probelor ce urmează
a fi analizate.
 S-a luat primul set de godeuri și, cu ajutorul micropipetei, s -au
adăugat 100 μl de enzyme conjugate în fiecare godeu de
amestecare.

31
 S-a adăugat 50 μl din fiecare standard în fiecare godeu de
amestecare, pornind de la standardul numerotat cu 1 până la cel
numerotat cu 5. Apoi, s -au adăugat și probele (50 μl) în godeurile
de amestecare următoare.
De fiecare dată s -au schimbat vârfurile pipetei pentru a nu se
obține rezultate eronate.
 Folosin d micropipeta, s -a amestecat de trei ori și imediat s -au
transferat 100 μl de conținut din fiecare godeu de amestecare în
godeul corespunzător ce conține anticorpi anti -aflatoxine.
De fiecare dată s -au folosit tipsuri noi pentru fiecare amestecare,
pentru a evita contaminarea încrucișată.
 S-au incubat godeurile ce conțin soluția transferată la temperature
camerei timp de 10 minute. Acest timp trebuie respectat ca atare,
nu se poate prelungi și godeurile trebuie să fie în stare de repaus,
nu este permisă agi tarea.
 Secvența de spălare
– La sfârșitul incubării, lichidul s -a îndepărtat din godeuri.
– Spălarea s -a făcut folosind o micropipetă multicanal pentru a
facilita și scurta durata pentru această operațiune. Spălarea s -a
făcut de trei ori și de fiecare dată lic hidul este îndepărtat.
– La final, s -a îndepartat total soluția de spălare din godeuri.
 În etapa următoare s -a adăugat 100 μl de development solution în
fiecare godeu și s -a amestecat rapid prin mișcări de rotație pentru
câteva secunde.
Începe să se observ e o modificare a culorii soluției în albastru mai
închis sau mai deschis, în funcție de concentrație.
 S-a incubat din nou la temperatura camerei, pentru 5 minute.
 S-a adăugat 50 μl de soluție stop în fiecare godeu și s -a amestecat
prin mișcări de rotație p entru puține secunde.
În această etapă se observă modificarea culorii soluțiilor în diferite
nuanțe de galben în funcție de concentrație.
 S-a măsurat absorbanța la 450 nm. Placa trebuie citită la cititorul
de plăci ELISA în maxim 60 de minute.

4. Calculul re zultatelor
Se divide valoarea absorbanței la fiecare etalon și eșantion prin absorbanța
standardului 0 (B 0) și se înmulțește cu 100 :

(absorbanța probei/absorbanța standardului 0) *100 =B/B 0

32

Se introduc valorile B/ B0 calculate pentru fiecare standard înt r-un sistem
semi-logaritmic de coordonate față de conc entrația standard de aflatoxine totale și se
trasează curba standard.
Se ia valoarea B/ B0 pentru fiecare probă și se interpolează la concentrația
corespunzătoare din curba de etalonare .

Rezultatele obținute sunt următoarele

Std.(ppb) O.D. B/Bo(%)

0 2.086

2 1.860 109.462

8 1.449 77.903

30 0.656 35.269

80 0.247 13.280

B/Bo(%) O.D. ppb
50 0.930 19.001

Sample O.D. B/Bo (%) Cereals/Ginger/Corn
Germ/Feed/
Nuts/Dried
Fruits/Paprika/Chili/
Cottonseed
(ppb)
1 Seminț e de in
maro_Diaspolis 1.969 105.860 2.343
2 Arahide granulate_Adaqo 1.948 104.731 2.462

33
3 Seminț e de susan_Olanda 2.064 110.968 < 2
4 Seminț e de fl oarea
soarelui_Euroconsult 1.872 100.645 2.946
5 Miez de nucă
sferturi_Golden Nuts 1.969 98.118 2.343

Primele cinci valori din primul tabel reprezintă rezultatele obținute pentru
standard. În funcție de acestea, se interpretează și valo rile obținute pentru probe.
În urma analizei efectuate s -a constatat că atât semințele, cât și nucile și arahidele
conțin o cantitate de aflatoxine totale care se încadrează în limitele admise.
5. Graficul realizat în urma experimentului

Curba se realizează în funcție de valorile concentrației (măsurată în ppb) și
valorile absorbanței.

6. Evaluarea rezultatelor
După elaborarea rezultatelor, este necesară verificarea performanței
testului. Verificarea este efectuată prin compararea datelor obțin ute cu cele
specificate în specificațiile kitului .

Specificațiile kitului:
Absorbanța B 0: >= 0,7 OD la 450 nm
B/B 0 50% : 6 -25 ppb
B/Bo(%) O.D. ppb 0102030405060708090100
1 10 100B/Bo (%)
conc. (ppb)

34

Valorile obținute în tabelul ce arată performanța analizei demonstrează
că testul a fost realizat cu o performanță ridicată, deoarece valorile se
încadrează în limitele date de specificația kitului.

Experiment nr. 2
Determinarea Ochratoxinei A din cereale
Caracteristici generale ale analizei
Această procedură se folosește pentru cereale.
Timpul de analiză este de aproximativ 20 de minute.
Limita de detecție este de 2 ppb.

1. Principiul metodei
Analiza s -a desfășurat ȋn microgodeuri care conțin anticorpi anti – ocratoxină.
Ȋn godeurile de preamestecare, enzima marcată cu ochratoxină și soluția sau
probele standard sunt amestecate și apoi transferate în placa de microtitrare anti –
ochratoxină.
În timpul incubării, ochratoxina liberă și ochratoxina enzima marcată
concurează pentru situsurile de legare a anticorpilor anti -ochratoxină p e faza solidă.
Orice conjugat de enzime nelegat și moleculă de ochratoxină este apoi
îndepărtat într -o etapă de spălare. Activitatea enzimatică legată este determinată prin
adăugarea unei cantități fixe de substrat cromogenic. Enzima transformă cromogenul
incolor într -un produs albastru. Adăugarea reactivului de oprire duce la o schimbare
de culoare de la albastru la galben.
Absorbanța este măsurată cu un cititor de microplăci la 450 nm.
Modificarea culorii este invers proporțională cu ochratoxina din eta lon /probă.

2. Pregătirea probelor
Pentru cereale: amestecăm cu grijă probele ce urmează a fi analizate pentru a
le omogeniza.
Se cȃntărește proba, după care se respect următoarele etape:
 50 g probă 1 g NaCl 50 ml metanol 70%
 Agităm energic probele pentr u 3 minute 50 0.930 19.001

35
 Filtrăm proba și colectăm filtratul
 Filtratul este pregătit pentru analiză.
3. Pregătirea soluțiilor pentru analiză
 Standardele pentru ochratoxină: sunt pregătite pentru utilizare, se agită
ȋnainte de folosire.
 Diluentul enzyme conjugate: este preg ătit pentru a fi folosit.
 Enzima conjugată: se calculează și se prepară cantitatea necesară
pentru experiment. Se diluează conjugatul 1/200 cu diluentul enzimă.
 Soluția de spălare: se diluează concentarul 1:10 (1 9) cu apă distilată.
 Soluția de dezvoltare: este pregătită pentru a fi utilizată. Această
soluție este foarte sensibilă și trebuie ținută la ȋntuneric, ferită de
lumină direct.
 Soluția stop: este pregătită de utilizare. Aceasta conține acid sulfuric
1M și trebuie manipulată cu atenție.

4. Procedura d e analiză

 Predispuneți aspectul testului, luând în considerare faptul că
este necesar un singur godeu pentru fiecare standard și mostră;
scoateți godeurile care nu trebuie folosite din placa de
microtitru anti -ochratoxină și înlocuiți -le în pungă cu gelul
deshidratant și reapăsați bine pumnul.
Pregătiți un număr egal de sonde de preamestec.
 Se adaugă 100 µl de conjugat enzimatic în fiecare godeu de
preamestecare.
 Se adaugă 50 µl din fiecare etalon/eșantion în godeurile
corespunzătoare de preamestecare. Eta lonul/eșantionul conține
un procent ridicat de metanol: se clătește vârful de pipetă în
sus și în jos, înainte de adăugarea în godeuri.
 Folosind micropipeta, se pipetează în sus și în jos de trei ori și
se transferă imediat 100 µl din conținutul fiecărui godeu de
preamestecare într -un godeu acoperit cu anticorp anti –
ochratoxină.
Se folosesc vȃrfuri noi de plastic pentru fiecare probă, pentru a evita
contaminarea încrucișată.
 Se incubează 10 minute la temperatura camerei. Nu trebuie prelungit timpul de
incubare și nu se amestecă în timpul incubării.
 Etapa de spălare:
– la sfârșitul incubării, se elimină lichidul din godeuri.
– se complează complet toate godeurile cu soluție tampon de spălare. Se repetă
secvența de spălare pentru toate godeurile de trei ori .
– se ȋndepărtează picăturile rămase prin atingerea microplăcii puternic pe
hârtia absorbantă.

36
Nu trebuie lăsate să se usuce godeurile.
 Se adaugă 100 μl soluție de dezvoltare în fiecare godeu și se amestecă ușor cu
mișcare rotativă timp de câteva secunde.
 Se incubează timp de 10 minute la temperatura camerei.
 Se adaugă 50 µl soluție stop în fiecare godeu și se amestecă ușor cu mișcare
rotativă timp de câteva secunde.
 Se măsoară absorbanța la 450 nm. Placa trebuie citită în decurs de 15 minute.

5. Calculul rezultatelor

 Se divide valoarea absorbanței la fiecare etalon și eșantion prin
absorbanța standardului 0 (B 0) și se înmulțește cu 100 :

(absorbanța probei/absorbanța standardului 0) *100 =B/B 0

 Se introduc valorile B/B 0 calculate pentru fiecare standard într-un
sistem semi -logaritmic de coordonate față de concentrația standard de
ochratoxină și se trasează curba standard.
 Se ia valoarea B/B 0 pentru fiecare probă și se interpolează la
concentrația corespunzătoare din curba de etalonare. Concentrația
standard (ppb) ia în considerare deja factorul de diluție al probei.

Pentru a construi curba de calibrare, poate fi folosit algoritmul spline,
dar este posibilă și utilizarea curbei "punct în punct". Pentru a elabora
rezultatele ELISA folosind metoda punct poi nt punct, foile de calcul
Excel sunt disponibile pe site -ul Techna.

S-au analizat 15 probe de f ăină de diferite tipuri, loturi și furnizori diferiți.
Primele 5 determinᾰri reprezint ă valorile obținute pentru standarde. Ȋn funcție de
valorile acestora, p rogramul va analiza și interpreta și valorile obținute pentru probe.

37

6. Curba realizat ă ȋn urma efectu ării experimentului

0102030405060708090100
1 10 100B/Bo (%)
conc. (ppb)

38

7. Evaluarea rezultatelor

După elaborarea rezultatelor, este necesară verificarea performanței testu lui.
Verificarea este efectuată prin compararea datelor obținute cu cele specificate
în specificațiile kitului .

Specificațiile kitului:
Absorbanța B 0: >= 0,7 OD la 450 nm
B/B 0 50% : 5.5 -12 ppb

Ȋn tabelul urm ător se observ ᾰ faptul că testul a fost realizat cu o acuratețe
ridicată, deoarece valorile OD Și B/B 0(%) se ȋncadreaz ă ȋntre valorile impuse de
specificația kitului folosit pentru analiz ă.
Următoarele date se refer ă la tipurile de f ăina analizate și se observ ă, de
asemenea c ă și acestea conțin Ochratoxina A, dar se ȋncadreaz ă ȋn limitele impuse de
standarde.
Ochratoxina A este determinat ă ȋn ppb.

39

Experiment nr. 3
Determinarea Deoxynivalenolului din cereale
Partea experimentală
Tipurile de probe analizate cu acest kit pot fi din următoarele categorii:
cereale, furaje, DDGS, tărȃțe de grȃu și produse intermediare.

40
DDGS -Borhotul furajer ( DDGS ) este un co -produs bogat în nutrienți ce rezultă în
urma procesului de producere a etanolului .
Prepararea probelor:
– cereale (porumb, grâu), furaje, DD GS: măcinare, extracție în metanol -apă, filtrare,
diluare (opțional).
-grâu: măcinare, extracție în apă, centrifugare, diluare.
– tărâțe și miezuri de grâu: extracția în apă, curățarea activă a cărbunelui, filtrarea,
diluarea .
Timpul de analiză este de a proximativ 20 de minute, exceptȃnd prepararea probelor.
Limita de detecție:
– Porumb, grȃu, furaje, DDGS: 0,04 ppm
– Grȃu: 0,12 ppm
– Tărȃțe și produse intermediare: 0,24 ppm.

1. Principiul metodei

Analiza se efectuează în microplăci din plastic, acoperite cu ani corpi specifici
anti-DON.
În godeurile de preamestecare enzima marcată cu deoxinivalenol și soluțiile sau
probele standard sunt amestecate și apoi transferate în placa de microtitrare anti –
DON.
În timpul primei incubări, deoxinivalenolul liber în soluția / proba standard și
deoxinivalenolul marcat cu enzime concurează pentru situsurile de legare a
anticorpilor anti -DON în faza solidă.
Orice conjugat de enzime nelegate și molecula DON sunt apoi îndepărtate
într-o etapă de spălare.
Activitatea enzimatică legată este determinată prin adăugarea unei cantități
fixe de substrat cromogenic.
Enzima transformă cromogenul incolor într -un produs albastru. Adăugarea
reactivului de oprire duce la o schimbare de culoare de la albastru la galben.
Absorbanța este măsu rată cu un cititor de microplăci la 450 nm.
Dezvoltarea culorii este invers proporțională cu concentrația de deoxinivalenol
din soluția / proba standard.

2. Pregătirea probelor
Pentru cereale și furaje: amestecăm cu grijă probele ce urmează a fi analizate
pentru a le omogeniza.

41
Se cȃntărește proba, după care se respectă următoarele etape:
 50 g probă 1 g NaCl 50 ml methanol 70%
 Agităm energic probele pentru 3 minute
 Filtrăm proba și colectăm filtratul
 Filtratul este pregătit pentru analiză.
3. Modul de utili zare a reactivilor din kitul de analiză
 Standarde: gata de folosit.
 Enzima conjugată: este pregătită de folosire.
 Soluția de spălare: se diluează concentratul ȋn raport 1:10 (1 9) cu apă
distilată. Această soluție este stabilă la temperatur a camerei timp d e 24 de
ore la +2/+8 șC.
 Soluția de dezvoltare: este gata preparată; această solție este sensibilă la
lumină și trebuie ferită de lumina direct.
 Soluția stop: este pregătită de utilizare. Această soluție conține acid
sulfuric 1 M Și trebuie manipulată cu p recauție.
4. Procedura de testare

 Se alege aspectul testului, luând în considerare faptul că este necesar un singur
godeu pentru fiecare standard și mostră;
Se pregătește un număr egal de godeuri de preamestec.
 Se adaugă 100 µl de conjugat enzimatic în fiecare godeu de preamestecare.
 Se adaugă 50 µl din fiecare etalon/eșantion în godeurile corespunzătoare de
preamestecare. Etalonul/eșantionul conține un procent ridicat de metanol: cu
grijă se clătește vârful de pipetă în sus și în jos, înainte de adău garea în
godeuri.
 Cu micropipeta, se pipetează în sus și în jos de trei ori și se transferă imediat
100 µl din conținutul din fiecare godeu de preamestecare într -o micropelucă
acoperită cu anticorp anti -DON.
Se folosesc vȃrfuri noi de plastic pentru fiecar e probă, pentru a evita
contaminarea încrucișată.
 Se incubează 10 minute la temperatura camerei. Nu se prelungește primul timp
de incubare și nu se agită în timpul incubării.
 Etapa de spălare:
– la sfârșitul incubării, se elimină lichidul din godeuri.
– se complează complet toate godeurile cu soluție tampon de spălare folosind
o sticlă de presare.
Se toarnă lichidul de spălare. Se repetă secvența de spălare pentru toate
godeurile de trei ori.
– se ȋndepărtează picăturile rămase prin atingerea microplăcii p uternic pe
hârtia absorbantă.
Nu se lasă godeurile să se usuce.
 Se adaugă 100 μl soluție de dezvoltare în fiecare godeu și se amestecă ușor cu
mișcare rotativă timp de câteva secunde.

42
 Se incubează timp de 10 minute la temperatura camerei.
 Se adaugă 50 µ l soluție stop în fiecare godeu și se amestecă ușor cu mișcare
rotativă timp de câteva secunde.
Se măsoară absorbanța la 450 nm. Se citește placa în decurs de 60 minute la
cititorul de plăci Elisa.

5. Calculul rezultatelor
Se divide valoarea absorbanței la fiecare etalon și eșantion prin absorbanța
standardului 0 (B 0) și se înmulțește cu 100 :

(absorbanța probei/absorbanța standardului 0) *100 =B/B 0

Se introduc valorile B/B 0 calculate pentru fiecare standard într -un sistem
semi-logaritmic de coordonate faț ă de concentrația standard de ochratoxină și se
trasează curba standard.
Se ia valoarea B/B 0 pentru fiecare probă și se interpolează la concentrația
corespunzătoare din curba de etalonare după cum urmează:
– grȃu, porumb, DDGS și furaje: valoarea citită la curba de calibrare
corespunde la contaminarea DON din probă, ca și concentrație standard deja este luat
ȋn considerare factorul de diluție.
– grȃu: se ȋnmulțește valoarea citită la curba de calibrare cu un factor 3.
– tărȃțe și produse intermediare: se ȋn mulțește valoarea citită la curba de
calibrare cu un factor 6.
– toate probele: dacă extractul a fost diluat în continuare pentru a obține un interval de
dozare mai mare, înmulțiți în contin uare rezultatele cu un factor 5

6. Curba realizată în u rma experimentului

0102030405060708090100
0.01 0.1 1 10B/Bo (%)
conc. (ppm)

43

7. Evaluarea rezultatelor
După elaborarea rezultatelor, este necesa ră verificarea performanței testului.
Verificarea este efectuată prin compararea datelor obținute cu cele specificate
în specificațiile kitului .

Specificațiile kitului:
Absorbanța B 0: >= 0,7 OD la 450 nm
B/B 0 50% : 0.06 -0.5 ppm

Ȋn urmᾰtorul tabel se gᾰsesc valorile pentru cele 5 standarde. Ȋn funcție de
valorile acestora, programul interpretez ᾰ și valorile obtinute pentru probe.

44

Acuratețea rezultatelor este prezentat ᾰ ȋn tabelul urm ᾰtor și se observ ᾰ faptul
ca se ȋncadreaz ᾰ ȋn limitele date de specificația kitului.
De asemenea, probele de f ᾰinᾰ analizate conțin o cantitate de micotoxin ᾰ care
se ȋncadreaz ᾰ ȋn limitele admise .
S-au analizat 14 probe de f ᾰinᾰ de la furnizori diferiți.

Intercepts
B/Bo (%) O.D. ppm
50 0.624 0.173
Sample O.D. B/Bo (%) Wheat, Feed Wheat, Feed,
Maize,DDGS Maize,DDGS
(0,04-5 ppm) (0,2-25 ppm)
1 Faina tip 480_Pambac 1.275 102.245 < 0,04 < 0,2
2 Faina tip 480_Sapte Spice 1.533 122.935 < 0,04 < 0,2
3 Faina tip 550_Pambac 1.279 102.566 < 0,04 < 0,2
4 Faina tip 550_Sapte Spice 1.442 115.638 < 0,04 < 0,2
5 Faina tip 650_Mopan 1.469 117.803 < 0,04 < 0,2
6 Faina tip 650_Pambac 1.321 105.934 < 0,04 < 0,2
7 Faina tip 650_Sapte Spice 1.385 111.067 < 0,04 < 0,2
8 Faina 1350_Pambac 1.189 95.349 < 0,04 < 0,2
9 Faina 1350_Sapte Spice 1.545 123.897 < 0,04 < 0,2
10 F. Integrala Secara_Cereal Impex 1.293 103.689 < 0,04 < 0,2
11 F.Integrala Secara_Harmopan 1.183 94.868 < 0,04 < 0,2
12 F. Integrala Secara_Sapte Spice 1.225 98.236 < 0,04 < 0,2
13 F. Integrala de grau_Pambac 1.157 92.783 < 0,04 < 0,2
14 F. dietetica de grau_Dobrogea 1.263 101.283 < 0,04 < 0,2

45

Limitele de micotoxine admise pentru produsele analizate

Materie prima Analize efectuate Limita maxima admisa
Miez de nuca macinat Aflatoxine totale max 10 ug/kg
Arahide granulate Aflatoxine totale max 15 ug/kg
Seminte de in Aflatoxine totale max 4 ug/kg
Seminte de fl.soarelui Aflato xine totale max 4 ug/kg
Faina 480 Ocratoxina A max 3 ug/kg
Deoxinivalenol (DON) max 750 ug/kg
Faina 550 Ocratoxina A max 3 ug/kg
Deoxinivalenol (DON) max 750 ug/kg
Faina 650 Ocratoxina A max 3 ug/kg
Deoxinivalenol (DON) max 750 ug/kg
Faina Graham Ocratoxina A max 3 ug/kg
Deoxinivalenol (DON) max 750 ug/kg
Faina 1350 Ocratoxina A max 3 ug/kg
Deoxinivalenol (DON) max 750 ug/kg
Faina Integrala Ocratoxina A max 3 ug/kg
Deoxinivalenol (DON) max 750 ug/kg

46