Produse Biofarmaceutice Obtinute cu Ajutorul Adn Recombinat

5. Produse biofarmaceutice obținute cu ajutorul adn recombinat

Unele proteine ale eucariotelor de mare interes pentru terapeutică se găsesc în cantități foarte mici în sursele naturale. Pentru a se obține cantități mari, adaptate nevoilor terapeutice, s-au utilizat tehnici de inginerie genetică , ce au permis introducerea genelor producătoare de astfel de proteine în microorganisme de tipul Escherichia coli și Saccharomyces cerevisiae. Cele mai spectaculoase rezultate s-au obținut prin utilizarea bacteriei Escherichia coli, la care s-a reușit exprimarea a peste 70 de proteine de interes terapeutic.

Utilizând tehnologia ADN recombinat, s-a reușit producerea industrială a insulinei, utilizată în tratamentul diabetului, a hormonului de creștere uman, a interferonului, a unor factori de creștere sanguini etc.. Principalele componente ale tehnologiei ADN recombinat sunt:

endonucleazele de restricție și ADN ligazele;

vectorul de clonare sau vehicolul;

gena producătoare de proteină de interes;

receptorul sau celula microbiană în care se va exprima ADN recombinat.

Endonucleazele de restricție taie molecula de ADN în fragmente mai mici, după care fragmentul de ADN de clonat cu ajutorul ADN ligazelor de vector, care apoi este introdus în celula gazdă, unde are loc exprimarea genelor și sinteza produsului de interes.

Ca vectori de clonare, se pot utiliza plasmidele, bacteriofagul landa și unele cosmide.

Gena reprezintă un fragment foarte mic dintr-un cromozom iar totalitatea fragmentelor provenite dintr-un cromozom celular reprezintă o bibliotecă genomică de ADN. Pentru sinteza chimică a unei gene de interes, este necesara determinarea secvenței sale nucleotidice.

5.1 Biosinteza insulinei

Insulina este un hormon produs de celulele beta ale pancreasului și este utilizată în tratamentul diabetului, maladie cu o incidență tot mai mare în rândul populației. Inițial, insulina era extrasaă din pancreasul de bovine și de porc, obținându-se aproximativ 100 g din o tonă de pancreas. În prezent, companiile Ely Lilly, din SUA, și NOVO, din Danemarca, produc insulină cu ajutorul tehnologiei ADN recombinat, folosind bacteria recombinată Escherichia coli.

Insulina are, în structura sa, două catene polipeptidice, care conțin 21, respectiv 30 de aminoacizi. În anul 1979, cercetătorii americani au sintetizat cele două gene care determină sinteza insulinei. Aceste gene au fost introduse într-o plasmidă și apoi au fost transferate în celula bacteriei Escherichia coli. A fost realizat un proces biotehnologic, în urma căruia fiecare celulă bacteriană produce aproximativ 100 000 de molecule de insulină, care ocupă circa 20% din volumul celulei. Într-un bioreactor cu o capacitate utilă de 1 m3 de mediu de cultură, se utilizează200 g de insulină, cantitate ce este egală cu cea obținută prin procedee de extracție din 1600 kg de pancreas animal. Denumirea comercială a insulinei, produsă de tehnologia ADN recombinat, este de humulină.

Lanțuri polipeptidice ale insulinei formează o proteină care conține 109 aminoacizi și se numește preproinsulină. La sintetizarea acestei proteine în pancreas, primii 23 de aminoacizi, au rolul unui semnal care permite acestei molecule să traverseze membrana celulară, după care acești aminoacizi sunt detașați și rămâne proinsulina formată din 46 de aminoacizi. Molecula de proinsulină se îndoaie în așa fel încât să reunească primul și ultimul segment al lanțului, în timp ce partea centrală a moleculei este separată cu ajutorul unor enzime.

La ora actuală există două metode de obținere a insulinei umane cu ajutorul bacteriilor prin tehnologia clonării genelor. Prima metodă are la bază clonarea genelor catenelor A și B ale insulinei iar a doua se bazează pe clonarea ADNc corespunzător proinsulinei.

5. 2 Biosinteza hormonului de creștere uman

Hormonul de creștere uman sau somototropina este de tip proteic iar absența acestuia din organism provoacă nanismul hipofizar. Inițial, acest hormon se obținea prin extracție din hipofiza cadavrelor, cantitățile obținute fiind foarte mici, circa 4-6 miligrame de hormoni dintr-o hipofiză, de aceea numai o parte din persoanele afectate de nanism puteau fi tratate.

Cercetătorii de la Institutul Genentech au transferat gena care determină sinteza acestui hormon format din 191 de aminoacizi la bacteria Escherichia coli. Obținerea industrială a hormonului s-a efectuat în bioreactoare de 1500 l, 1 litru de cultură bacteriană producând în 7 ore o cantitate de hormon echivalentă cu cea extrasă din 60 de hipofize. Producția obținută este de aproximativ 100 000 de molecule de somatotropina pe fiecare celulă bacteriană.

Gena utilizată pentru obținerea somatotropinei a fost sintetizată chimic și enzimatic. Prima parte a genei care codifică aminoacizii 1-24 a fost sintetizată chimic iar partea a doua, care codifică aminoacizii 25-191, a fost sintetizată enzimatic cu ajutorul enzimei reverstranscriptaza pentru obținerea ADNc corespunzător ARNm. Gena astfel obținută este atașată unui vector plasmidial cu ajutorul ADN ligazei și apoi transferată în celulele de Escherichia coli. Prin acest procedeu se obțin cantități mari de somatotropina având aceleași caracteristici ca și hormonul uman, putându-se trata astfel numeroși pacienți afectați de această maladie.

5. 3 Biosinteza interferonilor

Interferonii sunt o clasă de proteine cu proprietăți antivirale și antitumorale, care au fost sintetizate inițial cu ajutorul culturilor de celule umane. În anul 1980, firma Biogene a reușit să transfere genele interferonului în bacteriaEscherichia coli. Acest lucru s-a realizat prin extragerea ARNm al genelor respective iar, cu ajutorul enzimei revers transcriptaza, au sintetizat secvența de ARN, corespunzătoare genelor respective, care a fost inclusă într-o plasmidă și apoi transferată în celulele bacteriene.

Cercetătorii de la Universitatea din Seattle au reușit, în anul 1981, transferarea genelor interferonului în celulele drojdiei Saccharomyces cerevisiae, fiecare celulă fiind capabilă să producă circa 106 molecule de interferon.

În urma obținerii acestor rezultate, firme din SUA, Japonia, Anglia, Suedia au obținut interferon prin procedee biotehnologice industriale, acesta fiind de 200 de ori mai ieftin decât cel obținut prin culturi de celule umane sau animale.

În prezent, se cunosc trei direcții terapeutice principale ale interferonilor: antivirală, imunomodulatoare și antiproliferantă.

Din punct de vedere structural, interferonii sunt glicoproteine formate din 146-166 aminoacizi și lanțuri polizaharidice cu acizi sialici terminali. Omul are 5 tipuri de interferoni: alfa, beta, gama, tau și omega. Genele pentru interferonii alfa, beta, tau și omega se găsesc pe cromozomul 9 iar, pe cromozomul 12, se găsesc genele pentru interferonul gama.

Sistemul interferonic descoperit în anul 1957, se formează în celulele vertebratelor ca răspuns la acțiunea unor factori numiți inductori sau interferonogeni. Celulele produc în mod natural un prointerferon care, sub acțiunea inductorului, este transformat în interferon. Semnalul pentru inducția de interferon ar fi ARN bicatenar și dublu spiralat al virusurilor animale, care inhibă represorul special al sintezei interferonului.

În literatura de specialitate, inductorii sunt clasificați ca inductori naturali și sintetici. Din grupa inductorilor naturali fac parte virusurile animale care conțin ADN și ARN, diferite bacterii și microorganisme ca eubacterii, micoplasme, clamidii și polifenoli naturali. În grupa inductorilor sintetici intră unele substanțe chimice ca: ciclohaxamida, coloranți, și unii polimeri de tipul polifosfaților și polisulfaților.

La om, interferonul alfa este produs de leucocite, betainterferonul este secretat de fibroblaștii diploizi iar gama interferonul sau interferonul imunitar este secretat de limfocitele T.

Preparatele farmaceutice cu interferon sunt utilizate pentru tratamentul sau pentru stimularea formării interferonului în timpul infecțiilor virale. Rezultate foarte bune s-au obținut în tratarea cu interferon a bolilor respiratorii provocate de adenovirusuri, rinovirusuri sau de virusurile gripei herpes, precum și in tratamentul hepatitelor provocate de virusurile B si C. De asemenea, s-au obținut rezultate pozitive în tratamentul limfoamelor maligne cu alfa interferon, precum și în tratamentul tumorilor creierului și al adenocarcinomului glandei mamare.

Procesul biotehnologic de obținere a interferonului alfa recombinat cu ajutorul bacteriei Escherichia coli cuprinde următoarele etape: izolarea ARNm cu ajutorul enzimelor de restricție din leucocitele umane, activate de virusul Sendai ca inductor, urmată de sinteza genei interferonului și inserția acesteia într-o plasmidă de E. Coli, reintroducerea acestei plasmide în E. Coliși producerea interferonului în urma creșterii și multiplicării bacteriei.

Din celulele bacteriene, interferonul a fost extras și purificat cu ajutorul anticorpilor monoclonali. Interferonul astfel obținut are o înaltă puritate și are acțiune asemănătoare cu a celui produs de leucocitele umane.

Însă Escherichia coli conține, în peretele celular, o endotoxină, care este greu de separat de celelalte substanțe proteice produse prin recombinare genetică. De aceea, cercetătorii și-au îndreptat atenția către drojdia Saccharomyces cerevisiae, care este o celulă eucariotă și care este cea mai studiată și cea mai cunoscută din punct de vedere genetic. La drojdie, ADN nuclear este format din 30 de milioane de perechi de nucleotide, având și o cartografie precisă a ADN mitocondrian. Mitocondriile din celula de drojdie conțin mai multe molecule de ADN, fiecare având câte 75000 de perechi de nucleotide. De asemenea, în celula de drojdie se găsesc circa100 de plasmide de 2 ….m, care pot fi recombinate cu gene străine, devenind vectori utilizați în procesul de clonare. Astfel, s-a reușit introducerea genelor unui interferon leucocitar uman în celulele de drojdie și în cele de Escherichia coli. Drojdiile excretă interferonul în mediul de cultură, din care se extrage și se purifică mai ușor.

S-a studiat și s-a obținut mai ușor o drojdie modificată genetic, care producea, în mediul de cultură, interferoni alfa, beta și gama, de puritate avansată și la un preț de cost mult mai mic decât interferonul bacterian.

5. 4 Biosinteza somatostatinei

Somatostatina a fost primul hormon sintetizat cu ajutorul bacteriei Escherichia coli. Este produs de hipotalamus și controlează eliberarea insulinei și a somatotropinei. Are o structură polipeptidică formată din 14 aminoacizi. Gena care determină sinteza acestui hormon are dimensiuni mici și a fost sintetizată artificial și conține 52 de nucleotide, din care 42 codifică informația necesară sintezei hormonului iar restul, de 10, codifică transferul acestuia.

Această genă a fost introdusă într-o plasmidă și apoi transferată celulei de Escherichia coli, producând, în timpul procesului biotehnologic, circa 10000 de molecule de hormon per celulă.