Procesul de Selectie al Unor Microorganisme cu Potential Oenologic

Diverse2

Procesul de Selectie al Unor Microorganisme cu Potential Oenologic

Byadmin ianuarie 1, 2024

Procesul de selecție al unor microorganisme cu potențial oenologic

Rezumat

Scopul lucrarii a fost acela de a selecționa una din tulpinile izolate din podgoria Dealurile Bujorului și identificate, în vederea propunerii acesteia spre utilizare la nivel pilot si apoi pe linia tehnoloigcă de obținere a vinurilor la SCDVV Bujoru.

Tulpinile de drojdii au fost suspuse testelor de fermentatie pe medii sintetice (YPG) si naturale (musturi din soiurile de struguri: Feteasca Regala, Fetesca Alba, Babeasca Gri). In final au fost efectuate analizele fizico-chimie ale vinurilor obtinute (determinarea aciitatii, a aciditatii volatile, a acidului tartric, a etanolului si determinarea glicerolului).

Rezultatele acestor analize reflecta faptul ca tulpina Saccharomyces oviformis 43 are cea mai mare putere fermentativa, conducand la vinuri cu un continut in alcool de 14,1 – 14,5 vol.%.

Valorile analizelor efectuate se incadreaza intre urmatoarele limite: etanol 8,1-14,5 vol.%, aciditate 2,74-5,68 g/l H2SO4, aciditate volatila 0,3-0,72 g/l acid acetic, acid tartric 1,7-4,5 g/l, glicerol 10,35-14,72 g/l.

Cuprins

1.Introducere

2. Importanța utilizării culturilor starter în vinificație

2.1. Perspectiva istorică a culturilor starter

2.2. Fermentația alcoolică

2.3. Răspunsul drojdiilor la stres în timpul vinificației

3. Culturi starter comerciale versus culturi starter locale în vinificație

3.1. Culturi starter comerciale în vinificație

3.2. Tulpini de drojdie autohtone utilizate în vinificație

4. Criterii de selecție a drojdiilor pentru vinificație

5. Etapele izolării și selecției drojdiilor pentru vinificație

6. Parte experimentală

6.1. Material și metodă

6.1.1. Medii de cultură și microorganisme

6.1.2. Studierea puterii de fermentare a drojdiilor pe mediu sintetic (YPG)

6.1.3. Studierea puterii de fermentare a drojdiilor pe mediu natural (must)

6.1.4. Analizele fizico–chimice ale probelor de vin

6.2.Rezultate și discuții

6.2.1. Rezultatele testelor fermentative pe mediu sintetic

6.2.2.Testarea puterii fermentative pe mediu natural must

6.2.3. Rezultatele analizelor fizico-chimice

6.3. Concluzii și recomandări

Bibliografie

1.Introducere

În prezent, înțelegerea microbiologiei de fabricare a vinului își are originea în primele studii ale lui Louis Pasteur de acum 125 de ani. Pasteur a arătat că drojdiile sunt responsabile de fermentația alcoolică a mustului în vin și că anumite specii de bacterii pot crește în vin cauzând alterarea acestuia. Până la Pasteur, microbiologia fabricării vinului a fost studiată intens și, din ce în ce mai mult, aceste studii au relevat complexitatea ecologiei implicate.

Tabelul 1.1 oferă câteva informații despre diversitatea microorganismelor care sunt importante în producția de vin.

În esență, majoritatea proceselor sunt un complex de interacții ecologice și biochimice între diferitele specii de drojdii, bacterii, fungi și virusuri.

Abilitatea de evaluare a prezenței și a populației acestor specii pe struguri, în vin, pe suprafața echipamentului de vinificație, în preparatele comerciale de drojdii, în enzime etc. este fundmentală pentru înțelelegerea fabricării vinului și implementarea garanției calitative și a calității programelor de management.

Tabel 1.1. Diversitatea și importanța microorganismelor asociate cu fabricarea vinurilor

2. Importanța utilizării culturilor starter în vinificație

Deși mustul coține o populație mică de Saccharomyces, fermentația va decurge în condiții normale. Totuși inițierea acestor fermentații poate necesita mai mult timp decât majoritatea vinurilor ar avea nevoie, iar ceea ce rezultă nu este un rezultat ce poate fi anticipat. Din această cauză se folosesc culturi starter de drojdii de Saccharomyces. Scopul folosirii culturilor starter este acela de a iniția fermentația cât mai repede posibil, pentru a limita fenomenul de alterare a vinului prin faptul că speciile indigene din must sunt dominante. Deși culturile comerciale de Saccharomyces pot să depășească numeric și să inhibe populațiile indigene (Henick-Kling, și colab., 1998), totuși aceasta nu se întâmplă în toate cazurile (Heard și Fleet, 1985; 1988). Ca dovadă, Heard și Fleet (1985) au observat dezvoltarea tulpinilor de Kloeckera apiculata și Candida în mustul inoculat cu Saccharomyces.

2.1. Perspectiva istorică a culturilor starter

Înaintea dezvoltării culturilor de drojdii active uscate, producătorii de vinuri, ce doreau să folosească culturi starter, erau obligați să le înmulțească din culturile stoc păstrate. Acest proces implică transferarea culturilor pure pe un suc steril și pe o perioadă de câteva săptămâni își mărește volumul de la 1% la 5% din volumul de fermentație, printr-o serie de transferări aseptice. Când volumul de culturi starter necesar era produs și nu era contaminat microbiologic, era folosit apoi pentru a inocula mustul de struguri. Menținerea culturilor pure pe durata multiplelor transferărilor era problematică, datorită riscului unei eventuale contaminări, pe lângă necesarul de timp și resurse ce trebuia investit. Dată fiind dificultatea preparării culturilor starter din stocuri, oenologii au fost încântați de dezvoltarea comercială a culturilor starter de drojdii pentru vinuri în anii ’50. Cercetările timpurii au pus în evidență folosirea drojdiilor comprimate, un produs similar cu cel folosit în industria panificației (Foy, 1994). Datorită umidității ridicate (70%) conținute de aceste produse, s-a pus problema perisabilității. Spre deosebire de industria panificației unde drojdiile sunt folosite tot timpul anului, fabricile de vin au nevoie de mari cantități de drojdie doar pe perioada recoltei. Această problemă a fost rezolvată în anul 1963 când drojdiile comprimate au fost deshidratate cu succes. Doi ani mai târziu, Red Star Yeast (Universal Foods Corporation) au scos pe piață în SUA primul produs de drojdie de vin uscată și comprimată (wine active dry yeast WADY). S-a estimat că drojdiile active, uscate sunt folosite în toate regiunile viticole ale lumii (Foy, 1994).

În ciuda avantajelor culturilor comerciale de drojdii, comunitatea producătorilor de vinuri rămâne împărțită cu privire la filosofia și folosirea culturilor starter. La o extremă se găsesc acei producători care se bazează doar pe drojdiile și bacteriile proprii în speranța creării unor produse originale. Alții încurajează creșterea unor microorganisme altele decât cele din genul drojdiilor Saccharomyces la începutul fermentației alcolice, dar totuși să se inoculeze și cu Saccharomyces. Unii folosesc culturi starter de Saccharomyces, dar la nivele de inoculare mai mici decât cele recomandate. Majoritatea producătorilor de vinuri respectă recomandările producătorilor de culturi starter de drojdii.

2.2. Fermentația alcoolică

La ora actuală, la nivel industrial, sunt utilizate o serie întreagă de metode de inducere a fermentației alcoolice. Acestea vor fi prezentate prin comparație cu derularea spontană a acestor procese.

Inducerea fermentației alcoolice

Inițial, toate vinurile au fost produse prin fermentație spontană cu ajutorul microflorei naturale. Tradiția a fost întreruptă de către Hansen (Carlsberg Brewery, Danemarca) care a izolat o cultură pură pornind de la o singură celulă de drojdie în 1890. Muller – Thurgau a introdus conceptul de inoculare cu o cultură starter pură pentru realizarea fermentației (F. Matei, 2011).

Fermentația spontană

În fermentația spontană, în must, inițial, intra în fermentație speciile Kloeckera apiculata și Torulopsis bacilaris, până în momentul când se acumulează 6-8% alcool etilic, când intră în acțiune drojdiile fundamentale, tipice de fermentație, alcool rezistente ce aparțin genului Saccharomices.

Sub acțiunea drojdiilor fundamentale are loc, în anaerobioză, fermentația alcoolică propriu-zisă prin care glucidele fermentescibile din must sunt metabolizate la alcool etilic, dioxid de carbon și produse secundare ce vor da aroma vinului.

Fermentația spontană a mustului prezintă o serie întreagă de inconveniente: derularea necontrolată a fermentației alcoolice; oprirea fermentației sau sfârșit de fermentație dificil; obținerea de vinuri cu defecte (grad scăzut de alcool, gusturi străine, etc.); creșterea acidității volatile și a anhidridei sulfuroase.

Pornind de la aceste „accidente” repetate în mod regulat, s-a ajuns la utilizarea drojdiilor selecționate. Acestea aparțin genului Saccharomyces și în cea mai mare parte speciei S. Cerevisiae. Ele se caracterizează printr-o capacitate de a fermenta cantități importante de zahăr (170-240 g/l) cu un sfârșit de fermentație în mediu bogat în alcool (10-14˚). În cazul fermentației controlate cultura starter activă domină speciile sălbatice prezente în must. Pentru a se ajunge la acest fenomen este recomandată o densitate celulară la inoculare de 1-3 milioane UFC/ml (F. Matei, 2011).

Fermentația cu maia de drojdii indigene

Pentru a fi folosită în producție se prepară o maia cu cultura de drojdie în plină activitate ce va fi adăugată în must în vederea fermentației alcoolice.

Prepararea maielei indigene: 15 kg de struguri sănătoși și copți, se sulfitează (pentru a preveni dezvoltarea patogenilor), se lasă la temperatură scăzută pentru limpezire, iar apoi cei aproximativ 10 litri rezultați se pun într-o damigeană, la temperatură mai ridicată, pentru a declanșa fermentația alcoolică. După 2-3 zile se poate folosi pentru însămânțare (4-5 litri maia/100 litri must) (F. Matei, 2011).

Fermentația cu maia de drojdii selecționate se derulează cu ajutorul preparatelor

obținute în laboratoarele de microbiologie.

În general, fiecare regiune viti-vinicolă și-a selecționat diferite tulpini de drojdii, în funcție de caracteristicile lor oenologice. Criteriul primordial în selecție este cel organoleptic, fiind apoi luate în considerare criteriul tehnologic și cel analitic și biochimic. Mulți practicieni preferă fermentația cu microbiota spontană pentru a păstra tipicitatea podgoriei.

După selecționare și adaptare, drojdiile pot fi păstrate în laborator în eprubete cu must steril la 5˚C timp de 6 luni, când se impune repicarea lor. Drojdiile provin din speciile Saccharomyces ellipsoideus, S. oviformis, S. bayanus și S. pombe.

În faza de laborator se face transfer de celule în 500 ml must steril, apoi în volume de 3 l, 10 l, 20 l, cu termostatare la 25-28˚C și cu transvazare în faza fermentației tumultoase. În faza de producție celulele se înmulțesc în tancuri de 300-500 l, cu alimentare cu must (continuu sau discontinuu). Cultura de producție (conține celule din generația a IV-a sau a V-a) se introduce în must în cantitate de 1-3% (v-v), astfel încât să predomine numeric microbiota spontană (F. Matei, 2011) .

Fermentația cu drojdii liofilizate s-a extins în ultimii ani mai ales pentru obținerea

vinurilor dulci, a vinurilor spumante și la vinificația în roșu (macerare-fermentare).

După însușirile lor tehnologice drojdiile selecționate pot fi: drojdii calde, drojdii reci, drojdii nespumante și drojdii peliculare. Pentru a fi utilizate la nivel industrial, drojdiile trebuie să întrunească anumite caracteristici tehnologice și metabolice.

Drojdiile liofilizate se obțin din culturi tinere, prin congelare (-30 sau -40˚C) și uscate sub vid la 10atm, într-un mediu coloidal de protecție (gumă arabică sau amestec de gelatină și glucoză). Celulele viabile sunt de ordinul 10-10pe gramul de preparat.

Tabel 2.2.1.: Caracteristici dorite ale drojdiilor de vin (după Pretorius, 2000)

Introducerea lor în must se face după o rehidratare prealabilă în apă, la 35-40˚C, timp de 10-15 minute sau în apă cu must pentru a evita șocul osmotic (F. Matei, 2011) .

2.3. Răspunsul drojdiilor la stres în timpul vinificației

Răspunsul la stres este o problemă importantă în vinificare, nu numai în cursul fermentației alcoolice, ci și în cursul utilizării drojdiilor uscate active. În perioada de producere a drojdiilor, acestea sunt expuse la diferite situațiifermentare).

După însușirile lor tehnologice drojdiile selecționate pot fi: drojdii calde, drojdii reci, drojdii nespumante și drojdii peliculare. Pentru a fi utilizate la nivel industrial, drojdiile trebuie să întrunească anumite caracteristici tehnologice și metabolice.

Drojdiile liofilizate se obțin din culturi tinere, prin congelare (-30 sau -40˚C) și uscate sub vid la 10atm, într-un mediu coloidal de protecție (gumă arabică sau amestec de gelatină și glucoză). Celulele viabile sunt de ordinul 10-10pe gramul de preparat.

Tabel 2.2.1.: Caracteristici dorite ale drojdiilor de vin (după Pretorius, 2000)

Introducerea lor în must se face după o rehidratare prealabilă în apă, la 35-40˚C, timp de 10-15 minute sau în apă cu must pentru a evita șocul osmotic (F. Matei, 2011) .

2.3. Răspunsul drojdiilor la stres în timpul vinificației

Răspunsul la stres este o problemă importantă în vinificare, nu numai în cursul fermentației alcoolice, ci și în cursul utilizării drojdiilor uscate active. În perioada de producere a drojdiilor, acestea sunt expuse la diferite situații stresante care induc multiple modificări intracelulare. Stresul osmotic și oxidativ sunt două dintre principalele condiții adverse pe care le suportă S. cerevisiae. În cursul procesului de multiplicare a biomasei pentru producerea de drojdii uscate active s-a observat exprimarea mărită a genei GPD1 care codifică glicerol-3-fosfat-dehidrogenaza și care induce un răpuns specific la stresul osmotic și a genei TRX2 (tioredoxin-2) care este un marker al răspunsului specific la stresul oxidativ.

În plus, exprimarea genei HSP12 ce reglează una din proteinele șoc ale S. cerevisiae, pe parcursul diferitelor stadii de producere a drojdiei, demonstrează că drojdia sesisează stresul continuu (Perez Torrado și colab., 2002). Inocularea în melasă generează șoc osmotic, demonstrat prin inducerea activității GPD1. Aceste condiții de mediu afectează randamentul de biomasă, capacitatea fermentativă, vitalitatea și vibilitatea celulelor.

Când drojdiile uscate active sunt inoculate în must, ele sunt supuse unui stres hiperosmotic considerabil, datorat conținutului ridicat în zahăr al mustului (aproximativ 200 g/l soluție echimolară de glucoză și fructoză) și pe măsură ce fermentația avansează, ele trebuie să se confrunte cu epuizarea progresivă a nutrienților și cu producerea de etanol (Pretorius, 2000). În timp ce stresul osmotic inițial este temporar și tranzitoriu, în faza staționară răspunsul este general și conține numeroase semnale de stres (etanol, acid, epuizarea nutrienților). Pentru a se adapta la aceste condiții schimbătoare, drojdia activează și reprimă secvențial un număr mare de gene implicate în căile metabolice. Glicoliza, preluarea de ergosterol și biosinteza tiaminei sunt exprimate puternic pe tot parcursul procesului fermentație. Creșterea drojdiei nu este niciodată restrisctionată de limitarea carbonului, ci întotdeauna de un alt nutrient, cel mai adesea azot.

Mecanismele principale implicate în fermentațiile lente au fost elucidate: deficiențele de azot, epuizarea tiaminei din must, lipsa oxigenului, limpezirea excesivă a mustului și inhibarea celulelor de drojdii de către produșii secundari ai fermentației ( în mod special acizii octanoic și decanoic), toxine killer și pesticide. În funcție de procesul de vinificare, pot să apară și alți factori de stres: creșterea temperaturii, stresul la frig și nivelul ridicat de dioxid de carbon ( mai ales în fermentarea spumantelor) (Matei, F., 2011).

3. Culturi starter comerciale versus culturi starter locale în vinificație

3.1. Culturi starter comerciale în vinificație

De la începutul utilizãrii lor, drojdiile selecționate au fost și sunt folosite în scopul obținerii unor vinuri calitativ mai bune decât cele fermentate spontan.Un vin corect și sãnãtos se realizeazã cu drojdii din genul Saccharomyces, cele mai frecvent folosite sunt speciile: Saccharomyces ellipsoideus, Saccharomyces oviformis și Saccharomyces bayanus. De curând, au început sã se foloseascã și drojdii selecționate din genul Schizosaccharomyces și anume din specia Schizosaccharomyces pombe.

Drojdii din specia Saccharomyces ellipsoideus

De la început, de când se folosesc în vinificație, s-au preferat levurile selecționate din specia Saccharomyces ellipsoideus. Operațiunea pentru drojdiile eliptice a fost și este justificatã de faptul cã acestea, comparativ cu drojdiile sãlbatice, au o putere alcooligenã suficient de mare, suportã concentrații de dioxid de sulf relativ ridicate, dau un randament ridicat în alcool, pun rapid stãpânire pe mediu și conduc întotdeauna la realizarea unui vin corect și sãnãtos. Prin drojdii sãlbatice se înțeleg celelalte drojdii, prezente în mod natural pe strugure, care dau rezultate mai puțin satisfãcãtoare la fermentarea mustului.

În prezent este unanim recunoscut cã folosirea drojdiilor selecționate din specia Saccharomyces ellipsoideus trebuie sã fie consideratã ca o mãsurã oenologicã indispensabilã la vinificarea recoltelor avariate, a celor provenite din podgorii recent înființate, în care predominã drojdii sãlbatice, la cele rezultate din plantații care au primit numeroase tratamente cu fungicide și insecticide, precum și în procesul producerii vinurilor spumante.

Folosirea drojdiilor de Saccharomyces ellipsoideus prezintã o serie de avantaje:

 fermentația se poate regla mai ușor, dupã dorință, deoarece ea nu este provocatã de drojdii necunoscute ajunse în must în mod întâmplãtor, ci numai de o anumitã clonã cu însușiri cunoscute;

 garanția obținerii unui vin corect și sãnãtos este mai mare, parte din cauzele care duc la

apariția unor defecte sunt îndepãrtate sau atenuante cu ocazia deburbãrii prin sulfitare, fermentația alcoolicã nu este însoțită de alte fermentații, introduse în must drojdiile eliptice se înmulțesc rapid și pun stãpânire pe mediu, înlãturând posibilitatea apariției altor fermentații datorate bacteriilor și în mare parte drojdiilor sãlbatice ce eventual au mai rãmas dupã deburbare;

 faza prefermentativã este mult redusã, procesul se declanșează rapid, la 1-2 zile de la însămânțare, decurge normal, iar pericolul întreruperii este de obicei exclus. Pentru o mai mare garanție se impune ca drojdiile sã fie sã fie înmulțite într-un mediu sulfitic, încât la introducerea lor în must, ele sã fie deja adaptate la un asemenea mediu;

 vinul se limpezește mai ușor și într-un timp mai scurt, creându-se posibilitatea de a fi dat în consum mai devreme decât ce a fermentat spontan. La această din urmã, microflora și diferitele precipitate, prin sedimentare, formeazã un depozit pulverulent care se separã mai greu decât cel care rezultã din fermentarea cu levuri eliptice, care de obicei este granular;

 gustul de pãmânt care apare la unele vinuri, datoritã naturii solului și soiului din care provin, nu se reliefeazã pregnant ca la cele fermentate spontan, ci din contră este ceva mai atenuat;

 tãria alcoolicã a vinului este mai ridicatã cu câteva zecimi de grad (pânã la 0,5% vol. alcool) fatã de cel fermentat sub influența microflorei naturale, iar parfumul de vin tânãr este mai agreabil.

Folosirea drojdiilor eliptice este necesarã ori de câte ori se aplicã sulfitarea. Aceste douã operații, respectiv sulfitarea și inoculare, se completeazã reciproc.

Drojdiile din specia Saccharomyces oviformis

Obținerea de vinuri seci din musturi bogate în zahãr necesitã prezența în mediul de fermentare a drojdiilor din specia Saccharomyces oviformis. Având o putere alcooligenã superioarã drojdiilor din specia Saccharomyces ellipsoideus pot fermenta zahãrul dintr-un mediu care deja este bogat în alcool. La fermentația spontanã, îndeosebi în prima parte, pânã ce gradul alcoolic n-a atins 10% vol. alcool, datoritã competiției, este posibil ca numãrul drojdiilor de Saccharomyces oviformis sã se diminueze foarte mult, iar uneori acestea chiar dispar complet. Pentru a putea evita astfel de situații favorabile apariției diferitelor boli bacteriene, se recomandã folosirea drojdiilor selecționate din specia Saccharomyces oviformis.

Adaosul acestor drojdii se poate face înainte de pornirea în fermentație sau ulterior. În primul caz, preferabil la producerea vinurilor albe, reușita este asiguratã numai în condițiile în care însămânțarea este masivã. Numãrul acestor drojdii, în momentul când vinul a atins tãria alcoolicã de 10% vol. alcool este cu atât mai mare cu cât numãrul inițial a fost mai mare. De obicei un adaos de 10 ori mai mare decât adausul de drojdii din specia ellipsoideus dã certitudine cã la sfârșitul fermentației zgomotoasã se mai gãsesc suficiente drojdii de Saccharomyces oviformis, care prin multiplicare sã punã stãpânire pe mediu. Din acest

moment, când ele devin predominante, fermentarea trece pe seama lor. Când adaosurile se fac în cantități egale, Saccharomyces ellipsoideus predominã mediul așa de tare, încât Saccharomyces oviformis nu mai poate supraviețui pentru ca să-și îndeplineascã rolul de drojdii finisoare.

Dat fiind faptul cã în practică vinicolã, un adaos masiv de maia este greu de realizat, s-a preconizat că introducerea maialei sã se facã și dupã declanșarea fermentației, mai precis în momentul când mediul de fermentare are tãria alcoolicã de 10% vol. alcool. La producerea vinurilor roșii, acest moment coincide, aproximativ, cu termenul de tragere a vinului de pe boștina. Un adaos de Saccharomyces oviformis efectuat în acest moment s-a dovedit suficient pentru că fermentația sã se desăvârșească complet. De altfel și noile orientãri opineazã că adaosul de drojdii, în astfel de cazuri, sã nu se facã dintr-odatã ci succesiv, adicã drojdii de Saccharomyces ellipsoideus la începutul fermentației și drojdii de Saccharomyces oviformis spre sfârșitul ei.

Drojdii din specia Schizasaccharomyces pombe

Drojdiile responsabile de fermentația alcoolicã, pe lângã transformarea zahãrului, produc și o descompunere parțială a acidului malic în produse neacide. Prin aceastã degradarea, independentã de fermentația malolacticã, 15-25% din cantitatea inițială de acid malic este transformatã în alcool etilic și dioxid de carbon.

Drojdiile Schizasaccharomyces, prin natura particularităților lor fiziologice, pot degrada, în aceleași condiții, cantități mult mai mari, ajungând pânã la 95% din acidul malic inițial. De aici s-a nãscut ideea folosirii lor la dezacidifierea recoltelor prea acide. Dintre speciile genului, s-a constatat cã Schizasaccharomyces pombe dã cele mai bune rezultate. Degradând acidul malic drojdia poate diminua aciditatea fixã fãrã formare de acizi volatili. Deci, din acest punct de vedere, specia Schizasaccharomyces pombe are un rol deosebit la fermentația recoltelor acide, unde poate sã înlocuiascã fermentația malolacticã.

Folosirea drojdiilor Schizasaccharomyces prezintã însã și unele dificultăți. Astfel, datoritã competiției, acestea sunt foarte ușor eliminate de celelalte specii. Un rezultat bun se poate obține fie prin utilizarea lor în cantități foarte mari, fie prin sterilizarea completã a mediului de fermentare în care sunt introduse. Pentru a supraviețui în timpul fermentației ele trebuie sã reprezinte minimum 30% fatã de drojdiile inițiale, iar ca sã producã dezacidifierea doritã, proporția lor trebuie sã fie cu mult mai mare. Este suficient ca Saccharomyces oviformis reclamã însămânțări atât de masive încât devin irealizabile. O micșorare a cantității de drojdiilor Schizasaccharomyces poate fi acceptatã numai dacã recolta este în prealabil sterilizatã prin încãlzire la 75oC. Dar cum aceastã operație necesitã un consum ridicat de energie, fiind și foarte greu de efectuat, mai ales la vinificația în roșu, înseamnã cã pentru utilizarea, la scarã industrialã, a proprietăților dezacidifiate ale drojdiilor Schizasaccharomyces mai sunt necesare noi cercetãri.

Un alt inconvenient, nu mai puțin important, pe care-l prezintã întrebuințarea drojdiilor Schizasaccharomyces. În vinificație, constã în faptul cã ele modificã nefavorabil calitatea vinurilor. Sub influența lor se formeazã cantități apreciabile de histaminã. Vinurile rezultate conținând frecvent hidrogen sulfurat, sunt mai puțin plãcute.

3.2. Tulpini de drojdie autohtone utilizate în vinificație

Pe suprafața strugurilor, în special în faza de coacere, se găsesc drojdii, bacterii și mucegaiuri, care la zdrobirea strugurilor ajung în must unde suferă o selecție datorită conținutului acestuia în acizi organici, substanțe tanante și datorită conținutului de zahăr. Cele mai sensibile sunt bacteriile care nu suportă acidități mari.

Pentru producția vinicolă din țara noastră interesează în mod deosebit următoarele specii descrise în continuare:

Saccharomyces cerevisiae varietatea ellipsoideus reprezintă aproximativ 80% din totalul drojdiilor din mustul aflat într-o fază mai avansată de fermentrație (peste 5% alcool). Cunoscute și sub denumirea de drojdii eliptice, aceste drojdii fermentează cea mai mare parte din zahărul care se găsește în must, producând în condiții naturale minimum 7,5° alcool. Prin selecție s-au obținut rase de drojdii care dau 18-18,5° alcool, fiind capabile să fermenteze normal și la temperaturi mai mici de 10°C.

Au o rezistență mare la SO2 (aproximativ 300 ml/l), putându-se dezvolta la un potențial de oxido-reducere scăzut. Sunt rezistente la alcool, fiind capabile să refermenteze vinurile cu 10-12° alcool și cărora li s-a adăugat zahăr sau must concentrat. Sunt capabile să fermenteze și sub presiune de bioxid de carbon, în care caz formează un sediment nisipos. Pot fermenta și musturile concentrate (aproximativ 30% zahăr).

Unele rase peliculare la sfârșitul fermentației, în prezența aerului, formează buchet și aromă, caracteristice vinului Sherry. Din această specie se selecționează sușe care servesc drept culturi starter necesare obținerii de culturi de producție pentru industria vinicolă.

Saccharomyces oviformis Ostervalder se găsește pe struguri, în must prezentându-se sub formă de celule eliptice și mai rar rotunde. Au o putere alcooligenă mai mare decât Saccharomyces ellipsoideus, devenind dominantă la sfârșitul fermentației și după fermentație. Rezistă la un nivel de 300 mg SO2 total/l, respectiv 100 mg SO2 liber/l. Dă rezultate bune la prepararea vinurilor seci din musturi bogate în zahăr. Poate provoca refermentarea vinurilor demiseci, demidulci și dulci și, de aceea, la aceste vinuri drojdia respectivă trebuie îndepărtată. La unele vinuri obținute din podgoria Xeres-Spania și Jura-Franța la suprafața vinului se formează un voal sub influența căruia vinul capătă caracteristici deosebite. La vinurile spumante, la tirajul vinului se utilizează cultura de producție obținută din cultura starter de Saccharomyces oviformis.

Saccharomyces bayanus Saccharodo se aseamănă cu Saccharomyces oviformis în ceea ce privește fermentația și asimilarea zaharurilor, dar se deosebește prin forma celulelor care sunt mai alungite. Au o putere alcooligenă și o rezistență la alcool mai redusă. Necesită pentru dezvoltare mezoinozitol.

Saccharomyces chevalieri Guillemond se aseamănă cu Saccharomyces ellipsoideus în ceea ce privește activitatea fermentativă. Se întâlnește mai mult pe strugurii roșii.

Saccharomyces bailii Linder este rezistentă la SO2 și poate produce, împreună cu Saccharomyces oviformys și Saccharomyces ludwigii, fermentarea vinurilor dulci moderat sulfitate. Deși produce aproximativ 10% volume alcool, este considerată ca o drojdie dăunătoare.

Saccharomyces ludwigii este o drojdie asemănătoare ca aromă lămâii, având o putere de fermentare redusă dar o mare rezistență față de SO2 și acidul acetic. Rezistența față de SO2 este legată de proprietatea de a declanșa fermentarea la un potențial de oxido-reducere scăzut. Înaintea fermentării propriu-zise, drojdiile duc la creșterea pH-ului, ceea ce determină reducerea cantității de SO2 liber, după care începe fermentația. Drojdia se poate folosi pentru desulfitarea musturilor și vinurilor sau pentru creșterea pH-ului. Refermentarea vinurilor dulci puternic sulfitate se poate datora activității acestei drojdii. În practica curentă, dezvoltarea acestei drojdii comunică vinurilor un buchet dezagreabil, oțetit, datorită conținutului ridicat de esteri volatili. Drojdiile aparținând genului Saccharomyces sunt considerate dăunătoare mai ales pentru vinurile dulci conservate cu SO2 până la 1000 mg SO2 total/l și 100 mg SO2 liber/l.

Pentru producția vinicolă mai prezintă importanță următoarele specii:

S.rosei care produce foarte puțină aciditate volatilă 0,18–0,52 g/l;

S.carlsbergensis cu o capacitate ridicată de fermentație la temperaturi scăzute de ordinul – 5ºC și formează depozit granular, producând vin cu conținut ridicat în glicerol și scăzut în aciditate volatilă. Poate fi folosită la producerea vinurilor spumante;

S.florentinus care se regăsește în musturile provenite de la strugurii stafidiți.

4. Criterii de selecție a drojdiilor pentru vinificație

În comparație cu alte biotehnologii fermentative, în vinificație materia primă nu se pasteurizează înainte de a fi introdusă în fluxul tehnologic și conține o microfloră de levuri și bacterii, de o valoare tehnologică incertă. De aceea,folosirea levurilor selecționate se impune ca o condiție esențială pentru obținerea vinurilor de calitate.

Selecția unei sușe (tulpini) de levuri valoroase este o muncă îndelungată, 4-5 ani.

Variabilitatea genetică a levurilor din microbiota epifită a strugurilor, reprezintă principala sursă de selecția a levurilor. Criteriile de selecție sunt următoarele:

– comportamentul drojdiei în timpul fermentației (viteza de fermentare, rezistența la factorul Killer, gradul de spumare, cantitatea de depozit formată);

– randamentul în alcool și puterea alcooligenă, cantitatea de zaharuri rămase nefermentate;

– capacitatea de formare a glicerolului și alcoolilor superiori;

– aciditatea volatilă care se formează (compușii volatili);

– rezistența la temperaturile ridicate și temperaturile scăzute.

Drojdiile, deși sunt organisme simple monocelulare, dispun de un echipament enzimatic foarte complex și anume: oxidoreductaze, transferaze, hidrolaze, liaze, izomeraze, ligaze sau sintetaze. Dintre enzimele care activează în procesul de fermentație alcoolică, menționăm: hexokinaza, aldolaza, deshidrogenaza, fosfohexoizomeraza, fosfohexokinaza, triozoizomeraza, piruvatkinaza, piruvatdecarboxilaza, aldodeshidrogenaza etc. Mai mult de 12 enzime diferite provenite de la levuri, sunt implicate în fermentația alcoolică.

Ținând cont de calitățile deosebite care le posedă levurile selecționate folosite în vinificație și compoziția lor biochimică complexă, putem afirma contribuția lor directă și indirectă în ceea ce privește procesele de extracție la producerea vinurilor:

– conțin o serie de enzime din clasa hidrolazelor care au capacitatea de a distruge peretele celular al celulei vegetale favorizând prin aceasta extracția compușilor valoroși;

– având putere alcooligenă sporită, produc cantități importante de alcool, care în consecință contribuie la mortificarea celulei boabe. Această mortificare este însoțită de o deteriorare a membranei cromoplastidelor în care sunt localizate substanțele colorante. În cea de a doua etapă, are loc difuzia între cele două faze, adică din celule, respectiv din cromoplastide, în lichidul din imediata apropiere și apoi în întreaga masă a mustului; fiind termotolerante, levurile selecționate permit fermentarea mustuielii la temperaturi cuprinse între 28-30 °C. La acest nivel, extracția compușilor fenolici decurge mai bine decât la 20 °C

Drojdiile selecționate folosite se prezintã sub formã de drojdii cremã, presate și sub formã de drojdii liofilizate. În industria vinicolã sunt utilizate mai rar drojdiile sub formã de cremã și cele presate, deoarece se pãstreazã greu datoritã umidității ridicate, care depășește 70%. De asemenea, puritatea microbiologicã se poate asigura mai greu, ele se pot degenera ușor și sub aceastã formã sunt supuse infecțiilor cu bacterii, mucegaiuri și alte drojdii.

Drojdiile sub formã de cremã se obțin în urma separãrii prin centrifugare a drojdiilor din mediu lichid. Cele presate se preparã dupã aceeași tehnologie, la care se aplicã în plus o filtrare sterilã, printr-un material filtrant textil, urmatã de separarea lor de pe pânza filtrantã, presarea și ambalarea sterilã.

Livrarea drojdiilor selecționate se face în flacoane, pungi din plastic, etc.de diferite capacități care sunt cuprinse între 100-500ml. Din aceste se preparã maielele de drojdii selecționate.

Fermentarea mustului cu ajutorul culturii pure are urmãtoarele avantaje:

 mustul fermenteazã rapid;

 are loc fermentarea completã a zaharurilor;

 se formeazã o cantitate de alcool, cu 0,5 . 1% vol. alcool, mai mare decât prin fermentaþia naturalã;

 vinul conține mai puțini acizi volatili;

 vinul se limpezește ușor;

 vinul este rezistent la alterãri în timpul pãstrãrii.

Tipurile de culturi pure folosite sunt destinate pentru:

 drojdii pentru vinurile albe;

 drojdii pentru vinurile roșii;

 drojdii alcoolo rezistente;

 drojdii pentru obținerea șampaniei;

 drojdii sulfo-rezistente.

Drojdiile pãstrate în mediu lichid, solid sau sub formã liofilizatã, înainte de întrebuințare se înmulțesc, astfel încât în must sau în mustuialã ele se administreazã numai sub formã de maia.

5. Etapele izolării și selecției drojdiilor pentru vinificație

Cercetările de obținere a unui produs prin biosinteză încep cu lucrări de laborator care sunt prezentate în cele ce urmează.

Izolarea și selecția. Se izolează și se selectează un mare număr de microorganisme cunoscute din literatura de specialitate ca producători ai compusului ce urmează a fi biosintetizat. Tehnicile utilizate în acest scop sunt specifice pentru fiecare microorganism și sunt realizate de microbiologi cu pregătire corespunzătoare. Manualele de specialitate indică mai frecvent, pentru izolarea și selecția microorganismelor, metode ca: tehnica diluțiilor și tehnica granulelor de sol.

Microorganismele sunt preluate din diferite habitate cultivate pe medii solide sau lichide, astfel încât să fie posibilă punerea în evidență a unor caracteristici fiziologice. În prima etapă se urmărește realizarea unei culturi pure prin tehnici microbiologice specifice (epuizarea ansei, diluții succesive etc.). în continuare se stabilește o metodă de triere (screening) adecvată scopului urmărit.

De obicei, microorganismele sunt cultivate pe plăci Petri, pe medii solidificate cu agar-agar.

Testele de identificare a compusului care interesează pot "fi calitative sau cantitative. în cazul enzimelor, de exemplu, se aplică, de obicei, metode de identificare calitativă prin includerea în mediul solid, pe care se cultivă microorganismele, a substratului specific asupra căruia acționează enzima ce se dorește a se sintetiza (amidon în cazul amilazelor, caseină în cazul proteazelor, celuloză în cazul celulazelor). După dezvoltarea coloniilor izolate, enzimele difuzează în gelul de agar-agar, atacând substratul inclus în mediu și, astfel, zona respectivă poate fi vizualizată, în cazul în care devine transparentă sau cu un reactiv specific.
în cazul altor enzime la care nu se poate aplica un test calitativ, coloniile izolate se cultivă pe medii specifice, iar extractul sau lichidul de biosinteză este preluat și prelucrat în scopul dozării cantitative a acesteia prin metode spectrofotometrice, fluorescentă, titrimetrice, polarimetrice. În urma acestor teste se rețin numai câteva tulpini care au dat cele mai bune rezultate în ceea ce privește biosinteza enzimei.

Întreținerea tulpinilor producătoare. După faza de izolare și selecție, tulpinile producătoare se supun unor lucrări de caracterizare după criterii morfologice, biochimice, fiziologice, imunologice, toxicologice. Tulpina astfel caracterizată se înregistrează într-o colecție de microorganisme sub un număr de identificare. De obicei, aceste tulpini sunt supuse unor lucrări de selecție naturală și artificială (mutageneză) în scopul obținerii de tulpini mutante înalt producătoare.

Atât tulpinile parentale cât și tulpinile mutante sunt conservate prin metode speciale și păstrate la temperaturi scăzute. Dintre metodele de conservare amintim: liofilizarea și conservarea în azot lichid.

Tulpinile din colecție utilizate în lucrările de biosinteză curente se păstrează sub diferite forme, după metode de întreținere a culturilor, specifice fiecărui microorganism și formează așa-numita „cultură stoc" de la care se pornește procesul de biosinteză.
De obicei, cultura stoc este păstrată la frigider, pe geloză nutritivă, în tub înclinat. Pentru prepararea unei culturi inocul de laborator, se pornește de la o astfel de cultură vegetativă.
Cultura de inocul. Inoculul reprezintă o cultură microbiană în curs de multiplicare pe un substrat nutritiv corespunzător și în anumite condiții specifice de dezvoltare (pH, temperatură, agitare, aerare).

Inoculul constituie materialul de însămânțare al mediului de biosinteză propriu-zis, din etapa următoare.

Transvazarea culturii inocul în mediul de biosinteză se realizează în condiții aseptice, după o perioadă de dezvoltare bine stabilită de către microbiolog (vârstă, cantitate, aspect microscopic).

Odată ce un microorganism a fost selectat, fie prin metode clasice fie prin folosirea tehnicilor moleculare de modificare și „screening”, este necesară cultivarea sa în condiții care să asigure exprimarea caracteristicilor specifice, utile din punct de vedere practic. În acest fel, folosirea unui microorganism în biotehnologia modernă se bazează pe principiile clasice ale culturilor microbiene, cunoscute și elaborate de multă vreme.

În cadrul biotehnologiei este foarte mult utilizat termenul de fermentație, acesta având mai multe semnificații pentru specialiști și nespecialiști:

• se referă la orice proces ce implică cultivarea unui microorganism, în condiții de aerobioză sau de anaerobioză;

• orice proces microbiologic ce se realizează în absența oxigenului;

• contaminarea alimentelor;

• producerea băuturilor alcoolice;

• utilizarea unui substrat organic ca donor sau acceptor de electroni;

• utilizarea unui substrat organic ca reducător și a aceluiași substrat parțial degradat ca oxidant (acceptor de electroni);

• creșterea dependentă de nivelul fosforilării substratului (Prescott și col., 1996).

Pentru aplicațiile industriale, microorganismele pot fi cultivate în tuburi, în baloane de capacitate mică sub agitare sau în instalații de mare capacitate (de la 3-4l până la 100.000 l), în funcție de scopurile urmărite. Instalațiile industriale de mare capacitate necesită investiții însemnate și operatori bine instruiți. De asemenea, toate etapele de lucru, începând cu creșterea microorganismelor și până la obținerea și purificarea produsului final presupun condiții aseptice, strict controlate.

În prezent există mai multe sisteme de cultivare a micro-organismelor, în fermentatoare de diferite tipuri, în funcție de microorganismul de interes. De obicei, instalațiile de cultivare a microorganismelor sunt însoțite de unități de dializă, care asigură atât îndepărtarea compușilor toxici eliminați în cursul procesului de fermentație cât și a produșilor finali și care permit ca noi cantități de mediu proaspăt să fie introduse în instalație pentru a obține culturi continue.Alegerea mediului de cultură pentru cultivarea microorganismelor reprezintă o etapă cheie deoarece poate influența aspectele economice ale procesului de producție; de obicei se apelează la ingrediente ieftine care să constituie sursa de carbon, azot și fosfor. De cele mai multe ori, drept surse complexe de carbon, azot și fosfor sunt utilizate hidrolizatele vegetale, ca și unele subproduse rezultate în diferite industrii (melasă, zeruri etc).

Conentrația și echilibrul între elementele minerale și factorii de creștere constituie un alt punct critic al cultivării microorganismelor la nivel industrial. De exemplu, biotina și tiamina, influențând reacțiile de biosinteză, controlează acumularea produsului de interes în numeroase fermentații. Mediul de cultură trebuie astfel stabilit încât sursele nutritive, după un anumit interval de timp, să devină factori limitativi ai creșterii, procesul fiind asociat deseori cu producerea unor metaboliți de interes.

Nivelul oxigenului limitează deseori procesele fermentative aerobe sau influențează modul de creștere, așa cum se întâmplă în cazul actinomicetelor și al fungilor filamentoși.

În privința selecției microorganismelor utile pentru procesele biotehnologice, acestea provin de obicei din medii naturale (probe de sol, de apă, fructe și produse alimentare contaminate etc). Odată selectate, tulpinile interesante pentru un anumit scop pot fi supuse unor procese de ameliorare, fie prin metode „clasice” (mutageneza chimică sau cu radiații ultraviolete; fuziunea protoplaștilor) fie prin aplicarea tehnicilor moleculare (tehnologia ADN recombinant). De exemplu, tulpină de Penicillium chrysogenum izolată în 1943 a fost supusă unor tratamente succesive de mutație și selecție astfel că, în prezent, culturile microbiene derivate de la tulpina originală produc de 55 ori mai multă penicilină decât aceasta. De asemenea, fuziunea protoplaștilor (celule lipsite de perete celular obținute prin tratamentul cu diferiți agenți de degradare a peretelui celular) mediată de polietilenglicol (PEG) poate asigura obținerea de tulpini recombinate cu proprietăți îmbunătățite sau modificate, avantajul principal fiind acela că pot fi depășite barierele normale de specie. În ultimii ani, aplicarea tehnologiei ADN recombinant a permis obținerea unor tulpini modificate genetic capabile de a sintetiza compuși pe care, în mod normal, nu i-ar putem produce. Tulpinile microbiene de interes selectate (naturale sau ameliorate) sunt conservate prin metode specifice (liofilizare, transfer periodic, conservare sub ulei mineral, uscare etc).

6. Parte experimentală

Scopul final al experimentelor a fost acela de a selecționa una din tulpinile izolate din podgoria Dealurile Bujorului și identificate, în vederea propunerii acesteia spre utilizare la nivel pilot si apoi pe linia tehnoloigcă de obținere a vinurilor la SCDVV Bujoru.

În acest sens tulpinile identificate au fost propuse pentru testarea inițială pe mediu sintetic (must model), iar apoi pe must obținut din soiuri autohtone.

6.1. Material și metodă

6.1.1. Medii de cultură și microorganisme

Repicarea drojdiilor din colecția originală în eprubete cu mediu YPG înclinat pentru a-mi realiza colecția proprie de drojdii cu ajutorul cărora să îmi derulez partea practică a licenței. Pentru aceasta am preparat mediu YPG pentru drojdii și l-am repartizat în eprubete sub formă de mediu înclinat.

Pentru pregătirea mediului s-au cântărit, la balanța analitică, următoarele:

– extract de drojdie – 10 g

– peptonă – 20 g

– glucoză – 20 g

– apă disitilată – 1000 g

– agar – 20 g (2%)

S-au dizolvat ingredientele la cald, pe baie de apă; pH = 7. Acesta se aduce la valoarea 7 cu NaOH. Mediul s-a sterilizat prin autoclavare la 121̊C, 15 minute.

Tabelul 6.1. Codificarea tulpinilor de drojdii autohtone testate pentru puterea fermentativă

6.1.2. Studierea puterii de fermentare a drojdiilor pe mediu sintetic (YPG)

Preparare 2,4 l mediu YPG lichid, cu aceleași ingrediente și în aceleași condiții ca cele prezentate mai sus.

– repartizarea celor 2,4 l de mediu YPG lichid în :

19 eprubete – 10 ml/eprubetă (pentru inoculare)

19 pahare Erlenmayer – 100 ml/pahar

– prelevare inocul (din fiecare eprubetă din colecția proprie care conține câte o tulpină de drojdie) și însămânțarea în cele 11 eprubete cu mediu YPG lichid (10 ml).

După 24 de ore s-au determinat, pentru inocul, celulele viabile cu ajutorul lamei Thoma.

S-a folosit albastru de metilen pe lama Thoma pentru evidențierea celulelor moarte (care vor apărea albastre) și a celor viabile.

Înainte de a număra celulele viabile s-au realizat câte 3 diluții pentru fiecare inocul.

Din fiecare eprubetă cu inocul s-a prelevat 1 ml și s-a însămânțat în paharele Erlenmayer cu 100 ml mediu YPG lichid.

S-a determinat densitatea optică (ʎ = 660 nm) pentru fiecare proba din 6 în 6 ore timp de 3 zile iar la sfârșit s-a realizat curba de creștere pentru fiecare tulpină de drojdie .(fig 6.1)

Fig. 6.1. Aspecte ale testării puterii fermentative ale drojdiilor pe mediu sintetic YPG

6.1.3. Studierea puterii de fermentare a drojdiilor pe mediu natural (must)

Umplerea, în condiții aseptice, a 6 eprubete cu câte 15 ml must steril.

Din drojdiile inoculate în mediu YPG lichid s-au ales două drojdii care au evidențiat o putere de fermentare mai mare(fig 6.2). Dintre cele două drojdii una este drojdie peliculară (Saccharomyces bayanus 27 ) și una este drojdie normală (Saccharomyces oviformis 43).

S-a prelevat inocul din tulpinile celor două drojdii de interes și s-a introdus în eprubetele cu câte 15 ml must steril (3 epubete cu must steril s-au inoculat cu drojdie peliculară și 3 cu drojdie normală).

După 24 de ore conținutul eprubetelor cu inocul a fost repartizat în câte trei tipuri de must astfel:

Must 1 (Fetească Regală):

V 1.1 – must neinoculat (microflora naturală)

V 1.2 – inoculare cu Saccharomyces oviformisMI43

V 1.3 – inoculare cu Saccharomyces bayanusMI27

Must 2 (Fetească Albă):

V 2.1 – must neinoculat (microflora naturală)

V 2.2 – inoculare cu Saccharomyces oviformisMI43

V 2.3 – inoculare cu Saccharomyces bayanusMI27

Must 3(Băbească Gri):

V 3.1 – must neinoculat (microflora naturală)

V 3.2 – inoculuare cu Saccharomyces oviformisMI 43

V 3.3 – inoculare cu Saccharomyces bayanusMI 27

Fig.6.2. Aspecte ale probelor aflate în fermentare pe must de struguri

În vederea urmăririi fermentației alcoolice, celor 9 variante de must li s-a determinat densitatea optică (ʎ = 660 nm) timp de 14 zile până când valoarea acesteia a trecut de 1, ceea ce indica intrarea in faza staționară a fermentației.

După 3 săptămâni de la debutul fermentației, vinul a fost transferat de pe sediment și limpezit la rece (3-4oC), urmat de un nou transfer de pe depozit în vederea derulării analizelor fizico-chimice.

6.1.4. Analizele fizico–chimice ale probelor de vin

Analizele fizico-chimice ale vinurilor obținute au fost determinate sub îndrumarea Dnei Șef lucrări Dr. Luminița Vișan în laboratorul de Biotehnologii fermentative din cadrul Facultății de Biotehnologii.

6.1.4.1. Determinarea etanolului prin metoda ebuliometrică

Principiul metodei – Constă în variația temperaturii de fierbere a vinurilor, în funcție de conținutul lor în alcool. Deoarece apa fierbe la 100ºC iar alcoolul etilic pur la 78,4ºC, ambele la presiunea de 1 atm, vinurile seci, considerate ca amestec între apă și alcool în diferite proporții, vor fierbe la temperaturi mai mici, iar cele cu un conținut mai mic în alcool, la temperaturi mai mari.

Pe baza temperaturii de fierbere a vinului se determină conținutul de alcool, folosind o riglă gradată în grade alcoolice (% vol. alcool).

Întrucât vinul, în afară de apă și alcool, mai conține și extract sec redus (acizi, glicerol, polifenoli, materii minerale etc.) care modifică temperatura de fierbere a vinului, la etalonarea riglei s-au făcut corelațiile necesare.

La vinurile dulci metoda ebuliometrică nu poate fi folosită, deoarece conținutul în zahăr, care poate oscila de la câteva zeci de g/l până la peste 100 g/l, modifică puternic raportul dintre apă și alcoolul din vin, în favoarea alcoolului, ceea ce face să scadă temperatura de fierbere a vinului și, implicit, să indice un grad alcoolic mai mare decât cel real.

Aparatura – Ebuliometru de tip Dujardin – Salleron format din :

– rezervor metalic tronconic de circa 90 ml capacitate, în care se fierbe vinul și apa; este prevăzut la partea inferioară cu un tub de scurgere cu robinet și un coș de tiraj fixat pe tub, în care se concentrează flacăra lămpii de încălzire și fierbere a vinului;

– refrigerent ascendent format din două țevi metalice concentrice;

– termometru special gradat de la 86 la 101ºC, în grade și zecimi de grad;

– lampa cu spirt pentru încălzire și fierbere, care se pune sub coșul de tiraj;

– cilindru de sticlă gradat de 50 ml pentru măsurat apă și vinul necesare analizei;

– rigla de calculat, având două scări gradate: o scară cu grade de temperatură de la 86 la 102ºC pe rigleta mobilă și o scară a gradelor alcoolice de la 0 la 25 % vol pe parte fixă a riglei.

Modul de lucru cuprinde trei operațiuni:

– determinarea temperaturii de fierbere a apei;

– determinarea temperaturii de fierbere a vinului;

– calcularea concentrației alcoolice cu rigla.

Determinarea temperaturii de fierbere a apei

În funcție de temperatura de fierbere a apei în momentul determinării în condițiile de presiune locală la timpul respectiv, se fixează rigleta cu temperatura respectivă a apei la 0º alcool.

Se procedează în felul următor: se clătește rezervorul aparatului de 2 ori cu câte 30 – 40 ml apă de robinet sau distilată și se scurge apa de spălare prin robinet. Apoi se toarnă în rezervor 20 ml apă, măsurată cu cilindrul gradat; se fixează refrigerentul prin înșurubare în orificiul din capacul rezervorului, apoi se fixează și termometrul în orificiul corespunzător din capac. Se aprinde flacăra lămpii cu spirt care se așează sub coșul de tiraj de la baza rezervorului și se reglează înălțimea ei la circa 4 cm, pentru ca încălzirea apei până la fierbere să dureze circa 3 – 4 minute; din momentul în care încep să iasă vapori de apă pe țeava centrală a refrigerentului se urmărește coloana de mercur din termometru; când aceasta rămâne staționară timp de 1,5 – 2 minute se citește și se noează temperatura de fierbere a apei.

Determinarea temperaturii de fierbere a vinului

Se golește apa din rezervorul aparatului prin deschiderea robinetului de scurgere; se clătește bine rezervorul de două ori, cu câte 15 – 20 ml vin de analizat, pentru înlăturarea urmelor de apă; clătirea se face prin agitarea energică a aparatului și prin răsturnarea lui, iar scurgerea vinului de spălare se face tot prin robinet.

Se măsoară apoi cu cilindrul gradat de 50 ml vin, care se toarnă în rezervor prin orificiul termometrului; se fixează termometrul și refrigerentului în orificiile corespunzătoare din capac și se umple refrigerentul cu apă rece; se aprinde apoi flacăra lămpii cu spirt, care se așează sub coșul de încălzire. La determinarea temperaturii de fierbere a vinului umplerea refrigerentului cu apă rece este obligatorie, altfel se pierd vaporii de alcool. Apa din refrigerent asigură condensarea vaporilor de alcool și menținerea aceleiași concentrații în rezervor. După 3 – 4 minute se urmărește ascensiunea coloanei de mercur din termometru și, când aceasta rămâne statioanară timp de 1,5 – 2 minute, se notează temperatura de fierbere a vinului în grade și zecimi de grad și se oprește fierberea.

Calculul concentrației alcoolice – se fixează rigleta cu temperatura de fierbere a apei în dreptul gradației care indică 0% vol. alcool, de pe scara gradelor alcoolice. Apoi, în dreptul temperaturii de fierbere a vinului, de pe rigletă se citește, pe scara gradelor alcoolice (de pe partea fixă a riglei), concentrația alcoolică a vinului în % vol. la 15ºC.

6.1.4.2. Determinarea acidității totale din must prin titrare în prezența fenolftaleinei ca indicator

Principiul metodei constă în titrarea acizilor din must cu o soluție alcalină cu titru cunoscut în prezența fenolftaleinei ca indicator.

Reactivi și aparatură:

– NaOH 0,1 N lipsit de CO2;

– fenolftaleină 1%;

– biuretă gradată;

– pipete gradate de 10 ml.

Modul de lucru

Din mustul alb limpezit se ia, cu ajutorul unei pipete, un volum de 10 ml și se introduce într-un pahar Erlenmayer. În continuare, peste must se adaugă 10 ml apă distilată și câteva picături de fenolftaleină 1% și se efectuează titrarea. Dintr-o biuretă se adăugă soluție de NaOH 0,1 N, picătură cu picătură, agitând bine lichidul din pahar, până ce acesta capăta o culoare roz care persistă circa 1 minut.

Calculul acidității se face după formulele:

aciditate exprimată în acid sulfuric;

aciditate exprimată în acid tartric;

în care:

N = ml soluție NaOH folosiți la titrare;

F = factorul soluției

0,0049 = cantitatea de acid sulfuric, în g, corespunzătoare unui ml soluție NaOH 0,1 N cu F = 1,000;

0,0075 = cantitatea de acid tartric, în g, corespunzătoare unui ml soluție NaOH 0,1 N cu F = 1,000;

100 = coeficient pentru raportare la un litru soluție.

6.1.4.3. Determinarea acidității volatile prin metoda distilării cu aparatul “Saunier Cazenave”

Prin aciditate volatilă se înțelege suma acizilor alifatici monocarboxilici saturați aflați în stare liberă, precum și sub formă de săruri, care pot fi extrași din vin prin antrenare cu vapori.

Principiul metodei constă în antrenarea acizilor volatili cu un curent continuu de vapori de apă, urmată de titrarea lor în distilat cu o soluție alacalină titrantă, în prezența fenolftaleinei ca indicator. Din rezultatul obținut prin calcul, se scade valoarea acidității dioxidului de sulf liber și combinat, care se determină în același distilat, precum și valoarea acidității date de acidul sorbic (dacă este cazul), care se determină într-o probă mică luată din distilatul obținut.

Aparatul de distilare cu antrenare prin vapori de tip “Saunier – Cazenave”este alcătuit din:

– un balon cu fund rotund, de 1 litru, generator de vapori, prevăzut cu un tubușor lateral prelungit cu un furtun de cauciuc și cu o clemă Hofman;

– un vas de distilare a vinului ( barbotor), așezat central în interiorul balonului, prevăzut la interior cu un tubușor în formă de U răsturnat, având un vârf ascuțit până la 1 cm de fundul barbotului;

– o bulă de siguranță Kjeldhal;

– un refrigerent vertical cu serpentină sau cu minim 5 bule;

– un pahar Erlenmayer de circa 300 ml pentru colectarea distilatului;

– suport metalic cu inel, mufe și cleme, pentru susținerea refrigerentului;

– placa protectoare de azbest, cu un orificiu circular central cu diametrul de 8 cm, pe care se sprijină generatorul de vapori.

Reactivi și materiale

– hidroxid de sodiu 0,1 N;

– iod, soluție 10%;

– amidon, soluție 1%;

– fenolfaleină, soluție 1%, în alcool de 70 % vol;

– acid clorhidric concentrat (d=1,19);

– acid tartric cristalizat;

– borax, soluție saturată, sau bicarbonat de sodiu;

– clorură de sodiu, soluție 15%.

La determinarea acidității volatile se execută următoarele operații:

– pregătirea probei de vin pentru analiză;

– distilarea vinului;

– titrarea acidității volatile din distilat;

– titratea dioxidului de sulf din ditilat;

– calculul acidității volatile.

Pregătirea probei de vin pentru analiză se face la fel ca pentru aciditatea totală, la trompă de vid.

Distilarea vinului: în balonul generator de vapori se introduc 500 ml soluție NaCl 15%, preparată în prealabil, deoarece clorura de sodiu mărește capacitatea calorigenă a apei și realizează o fierbere mai uniformă.

În soluția salină se adaugă 2 – 3 picături de soluție de fenolftaleină și apoi 1 – 2 ml de NaOH 0,1 N, până apare culoarea roz-violetă, care trebuie să persiste tot timpul distilării. Soluția alcalină neutralizează acidul carbonic care eventual se găsește în apă, excluzând astfel trecerea lui în distilat, ceea ce ar duce la mărirea rezultatului acidității volatile.

În barbotorul (vasul de distilare) aparatului se introduc din proba pregătită 10 ml de vin, măsurați cu pipeta și apoi se adăugă circa 0,3 g acid tartric cristalizat, care eliberează acidul acetic din sarurile lui. Se montează legăturile dintre barbotor, bula Kjeldhal și refrigerent, se pornește curentul de apă de răcire în refrigerent, se aprinde becul de gaze și se încălzește până la fierbere. În acest interval, tubușorul lateral prevăzut cu clemă se ține deschis pentru a permite degajarea dioxidului de carbon care se mai găsește, eventual, în vin. După o fierbere de 1 – 2 minute se închide tubul lateral cu ajutorul clemei. Din acest moment, vaporii de apă formați în generator sunt forțați să intre în barbotor prin tubușorul din interior și, străbătând masa vinului, antrenează acizii volatili, efectuând o distilare continuă până la colectarea a 100 ml distilat.

Intensitatea fierberii și distilării trebuie astfel reglată cu ajutorul flacării becului, astfel încât volumul vinului din barbotor să rămână constant, iar în paharul Erlenmayer să se colecteze 100 ml distilat, în timp de circa 50 de minute.

În acest moment se oprește distilarea, prin deschiderea clemei de la tubul lateral al generatorului și abia apoi se întrerupe flacăra, pentru a evita absorbirea vinului din barbotor în soluția salină, datorită depresiunii ce s-ar forma în balon după stingerea becului.

Titrarea acidității volatile din distilat se face astfel: se introduc 3 – 4 picături de soluție de fenolftaleină și se titrează cu soluție de NaOH 0,1 N, până la colorație roză, care persistă minimum 10 secunde.

Se notează cu volumul, în ml, de soluție alcalină 0,1 N, folosit la titrarea acizilor volatili.

Titrarea dioxidului de sulf liber și combinat din distilat se face procedând astfel: mai întâi distilatul se trece din mediul alcalin în mediu acid, adăugând 3 picături de acid clorhidric, apoi se adaugă 0,5 ml din soluția de amidon și 1 ml din soluția de iodura de potasiu 10% și se titrează cu o soluție de iod 0,01 N, până la o colorație albastră, persistentă.

Se notează cu volumul, în ml, de soluție de iod consumată pentru oxidarea combinat (de obicei, cu aldehida acetică), se adăugă, cu atenție, în probă circa 10 – 20 ml soluție saturată de borax sau câteva grame de bicarbonat de sodiu, numai până când dispare colorația albastră, apoi se titrează din nou cu soluție de iod, până la reapariția culorii albastre. Se notează cu volumul de iod 0,01 N consumat la a doua titrare.

Reacțiile care au loc în cazul acestor titrări sunt:

– neutralizarea acizilor și combinarea cu NaOH:

– dozarea prin titrarea iodometrică a ionilor de sulfit și sulfit acid din soluția apoasă rezultată după neutralizarea acizilor:

sau

– din combinarea cu aldehida acetică rezultă acidul l-hidroxietan sulfonic instabil, care eliberat din sărurile sale se descompune astfel:

Ionul de sulfit acid se titrează, de asemenea, iodometric.

Calcul:

Rezultatul final se calculează și se exprimă în g/l acid acetic folosind următoarea formulă:

în care:

= ml soluție NaOH 0,1 N folosită la titrarea acizilor volatili;

= ml soluție de iod 0,01 N folosită la titrarea liber;

= ml soluție de iod 0,01 N folosită la titrarea combinat;

0,0049 = cantitatea în g de acid sulfuric corespunzătoare unui ml de soluție de NaOH 0,1 N.

6.1.4.4. Metoda volumetrică de dozare a glicerolului

Principiul metodei:

Metoda se bazează pe reacția Malaprade, care constă în oxidarea glicerinei cu acid periodic în exces până la formaldehidă și acid formic.

Excesul de acid periodic se titrează cu tiosulfat de sodiu:

Reactivi:

– acetat neutru de plumb , soluție 20%;

– sulfat de sodiu , soluție saturată la rece;

– hidroxid de bariu uscat și fin pulverizat;

– alcool etilic 96 % vol;

– acid periodic, soluție 0,1 N;

– tiosulfat de sodiu (, soluție 0,1 N;

– acid clorhidric 20%;

– iodură de potasiu, soluție 16% (circa 1N);

– amidon, soluție 1%.

Mod de lucru

–> Separarea glicerinei:

50 de ml din probă de analizat se introduc într-un balon cotat de 100 ml, se adaugă 5 ml soluție de acetat neutru de plumb, se agită și se lăsă în repaus. După 15 minute, se adăugă treptat soluție saturată de sulfat de sodiu, până la indeprtarea excesului de plumb, se aduce la semn cu apă, se agită amestecul și se lasa să stea o oră, după care se filtrează. Din filtrat se iau 10 ml și se trec într-un balon cotat de 100 ml, în care s-a introdus în prealabil hidroxid de bariu uscat și fin pulverizat, în următoarele cantități:

– 1 g pentru vinurile cu conținut în zahăr până la 30 g/l;

– 2,5 g pentru vinurile cu conținut în zahăr între 30 – 100 g/l;

– 3,5 g pentru vinurile cu conținut în zahăr peste 100 g/l.

După agitare, se introduce balonul într-o baie de apă la 50 – 55ºC unde se menține 30 minute, se răcește, apoi se adăugă treptat alcool etilic sub agitare repetată; se aduce la semn cu alcool etilic, se agită, apoi se lăsă în repaus 10 – 12 ore sau până a doua zi, după care se filtrează.

–>Dozarea glicerinei:

Într-un pahar Erlenmayer de 250 ml se introduce un volum de filtrat ( în general 20 ml), care conține 5 – 20 mg glicerină. Se adaugă 5 ml soluție de acid periodic exact măsurați și se lăsă în repaus 20 de minute la temperatura camerei (cât mai aproape de 20ºC). Apoi se adaugă 100 ml de apă, 5 ml soluție de iodură de potasiu și 20 ml soluție de acid clorhidirc și se titrează cu soluție de tiosulfat de sodiu până la colorația galben – deschis. În acest moment se adaugă 1 ml soluție de amidon și se continuă titrarea până la decolorarea soluției.

În paralel se face o determinare martor, cu aceleași cantități de reactivi, la care în locul filtratului se ia un volum egal de apă, se titrează și se determină în același mod volumul de soluție de tiosulfat de sodiu echivalent în condițiile de lucru cu 5 ml soluție de acid periodic.

Calcul

Conținutul de glicerină se determina astfel:

=

= volumul soluției de tiosulfat întrebuințat pentru martor;

= volumul soluției de tiosulfat întrebuințat pentru probă analizată;

V = volumul de filtrat luat pentru determinare (20 ml).

6.1.4.5. Determinarea acidului tartric din vinuri prin metoda volumetrică rapidă ”Schneyder-Pluher”

Reactivi:

-soluție de precipitare ce conține clorură de K, sare Seignette și oxalat de K;

-acid acetic glacial pur;

-alcool etilic de 96˚;

-soluție de spălare ce conține KCl și alcool etilic de 96˚;

-hidroxid de Na;

-albastru de bromtimol, sol 1 g/l;

Modul de lucru:

– Într-un tub (eprubetă) de sticlă sau plastic pentru centrifugă se introduc 10 ml vin de analizat, 0,4 ml acid acetic glacial, 7,5 ml soluție de precipitare și 2 ml alcool etilic de 96˚.

– Se agită conținutul eprubetei cu o baghetă de sticlă timp de 15-30 secunde până apare o tulbureală cristalină, cauzată de precipitarea tartraților.

– Se ține tubul 1 oră la 8˚C, după care se agită încă o dată repede conținutul cu bagheta, amestecând bine în lichid tot precipitatul depus; se ține încă 1 oră la rece; această a doua agitare este indispensabilă pentru precipitarea completă a acidului tartric.

– Se supune proba la centrifugare , la 4000-5000 rot/min, timp de 2-5 minute, după care lichidul supernatant, perfect limpezit se decantează cu atenție, pentru a nu antrena și precipitatul.

– Precipitatul se spală cu 2 ml soluție de spălare, agitând bine conținutul eprubetei și se centrifugheză din nou pentru a se limpezi ; lichidul limpezit se decantează cu atenție pentru a nu antrena și precipitatul.

– Se face o a doua spălare, cu încă 2 ml soluție de spălare, urmată de centrifugare și decantarea lichidului limpezit.

– După ultima spălare și decantare, precipitatul cristalin se trece din tubul de centrifugă într-un pahar Erlenmeyer de 100-200 ml capacitate, prin spălare de 3-4 ori cu cca 10 ml apă distilată.

– Se adaugă 1 picătură de soluție de indicator albastru de bromtimol și se titrează cu NaOH 0,1 n, până când culoarea galbenă virează în albastru.

Calcul:

g/l acid tartric = 1,5 x V x F – 2

V = volumul de NaOH 0,1 n, in ml folosiți la titrare;

F = factorul soluției de Na OH;

2 = acid tartric adăugat în vin prin soluția de precipitare, în g/l

6.2.Rezultate și discuții

În studiile noastre au fost testate 19 tulpini de drojdii izolate anterior din Podgoria Dealurile Bujorului și conservate în colecția Facultății de Biotehnologii. Puterea lor fermentativă a fost testată inițial pe mediu sintetic, iar apoi, cele mai valoroase, au fost testate pe mediu natural must, provenit din podgoria de origine. Rezultatele obținute vor fi prezentate în cele ce urmează.

6.2.1. Rezultatele testelor fermentative pe mediu sintetic

Cele 19 tulpini preluate în testări au fost cultivate în condiții de laborator pe mediu YPG și, prin metode spectofotometrice, a fost construită curba de creștere a populației microbiene pe parcursul procesului fermentativ. O parte din curbele de creștere sunt redate in imaginile de mai jos.

Ca o remarcă generală, se constată că toate tulpinile luate în studiu a prezentat curbe de creștere tipice, iar faza logaritmică a debutat în primele 12 ore de fermentare în condiții de laborator pe mediu sintetic (Fig. 10.3 – 10.6). A fost evidențiată o singură excepție, în cazul tulpinii S. oviformis MI 16 care a prezentat o pornire defectuoasă în fermentație (42 de ore). Motivația poate fi legată fie de caracteristica genetică a speciei, fie dintr-o eroare de cuantificarea nivelul de celule din inoculul inițial.

Pornind de la același volum de fermentație si același nivel al inoculului, cea mai rapidă pornire în procesul fermentativ s-a înregistrat în cazul tulpinilor S. bayanus MI 27 și S. oviformis MI 43 (în primele 6 ore de la inoculare); în cazul acestor tulpini faza staționară a fost atinsă după doar 48 de ore de fermentație.

Fig. 6.3. Curbele de dezvoltare ale drojdiilor din grupa Saccharomyces bayanus

Fig. 6.4. Curbele de dezvoltare ale drojdiilor din grupa Saccharomyces oviformis

Fig. 6.5. Curbele de dezvoltare ale drojdiilor din grupa Saccharomyces ellipsoideus

Fig. 6.6. Curbele de dezvoltare ale drojdiilor din grupa Saccharomyces rosei

S-a constatat că grupurile de drojdii aparținând speciile S.ellipsoideus și S.rosei prezintă curbe de creștere foarte asemănătoare, cu o fază exponențială foarta rapidă, dar cu o pornire în fermentație mai lentă (fig. 6.5 și 6.6).

Un aspect important care a fost evidențiat pe parcursul testelor preliminare a fost acela că trei dintre tulpini au format peliculă la suprafața mediului de cultură, respectiv tulpinile S. bayanus MI 27 și MI 156, precum și S. oviformis MI 24. Literatura de specialitete evidențiază faptul că în vinurile de tip ”sherry”, oxidative, sunt prezente drojdii aparținând speciilor S.rouxi, S.oviformis, S.oxydanssau, S.hispanica (Vaughan et al., 2011). În cazul nostru, două tulpini aparțin speciei S. bayanus, care a fost foarte rar raportată ca fiind drojdie peliculară.

Ca urmare a acestor rezultate preliminare, în studiile realizate pe must de struguri proveniți din podgoria Dealurile Bujorului au fost preluate spre testare tulpiniile de drojdie cu cea mai rapidă pornire în fermentație, respectiv S. bayanus MI 27 și S. oviformis MI 43, prima dintre acestea prezentând și carcater pelicular.

6.2.2.Testarea puterii fermentative pe mediu natural must

Au fost reținute pentru testare cele două tulpini amintite mai sus (S.bayanus 27 și S.oviformis 43). Fermentarea a fost realizată pe musturi provenite din podgoria de orgine a tulpinilor de drojdii din recolta anului 2012. Mai mult, acest musturi au provenit strict din soiuri de struguri autohtone utilizate pentru obținerea de vinuri albe de calitate superioară, respectiv Fetească Albă, Fetească Regală și Babească Gri.Conținutul lor inițial în glucide a variant între 210 g/l (Babeasca Gri)și 284 g/l (Feteasca Regală), iar pH-ul a prezentat valori caracteristice între 3,2 și 3,5.

Fig. 6.7. Curba de dezvoltare a drojdiilor pe must de Fetească Regală. V1.1- microfloră naturală, V1.2 S.bayanus MI 27 și V 1.3 S.oviformis MI 43

Fig. 6.8. Curba de dezvoltare a drojdiilor pe must de Fetească Albă. V2.1- microfloră naturală, V2.2 – S.bayanus MI 27 și V2.3 – S.oviformis MI 43

Ca remarcă generală, procesul fermentativ s-a derulat în toate variantele în mod clasic, urmărind curbă tipică de dezvoltare a unei culturi de drojdii (fg. 6.7-6.9). Musturile neinoculate, fermentate cu flora spontană, au pornit în fermentație cu 1-2 zile întarziere față de variantele inoculate, ceea ce coincide cu datele descrise în literarura de specialitate. Dintre cele două tulpini autohtone, prima care pornește în fermentație, la același nivel al inoculului și volume identice inoculate, prima tulpină care pornește în fermentare este S.oviformis 43.

Fig. 6.9. Curba de dezvoltare a drojdiilor pe must de Băbească Gri. V3.1- microfloră naturală, V3.2 – S.bayanus MI 27 și V3.3 – S.oviformis MI 43

În toate variantele inoculate, fermentația a intrat în faza staționară după aproximativ 6 zile de la inoculare. Vinul a fost menținut pe depozit până în a 14-a zi de la inoculare, fiind apoi transferat în alte vase pentru decantare/limpezire, urmat de analiza proprietăților fizico-chimice.

Un alt aspect care a fost urmărit a fost acela al tendinței de formare a peliculei în cazul tulpinii autohtone S.bayanus 27 (fig. 6.10). După fermentația tumultuosă și scăderea stratului de spumă, pelicula a început să se formeze la 2-3 zile după intrarea în faza staționară.

Fig. 6.10. Aspecte ale tendinței tulpinii S.bayanus 27 în formarea de peliculă la suprafața mustului aflat în fermentare

6.2.3. Rezultatele analizelor fizico-chimice

De la producător au fost preluate musturi de la soiurile Fetească Albă, Fetească Regală și Băbească Gri care au avut un conținut inițial de zahăr cuprins între 284 g/l (Feteasca Regală) și 210 g/l (Băbească Gri). Musturile au avut un nivel normal de pH cuprins între 3,2 si 3,5. (tab 6.2)

Tabelul 6.2. Rezultatele analizelor chimice ale vinurilor obținute

Legenda:

V11 = Fetească Regală neînsămânțat;

V12 = Fetească Regală + Saccharomyces oviformis 43;

V13 = Fetească Regală + Saccharomyces bayanus 27(drojdie peliculară);

V21 = Fetească Albă neînsămânțat;

V22 = Fetească Albă + Saccharomyces oviformis 43;

V23 = Fetească Albă + Saccharomyces bayanus 27(drojdie peliculară);

V31 = Băbească Gri neînsămânțat;

V32 = Băbească Gri + Saccharomyces oviformis 43;

V33 = Băbească Gri + Saccharomyces bayanus 27(drojdie peliculară).

După încheierea procesului fermentativ, vinul a fost „tras” de pe sediment și lăsat să se limpezească la frig, iar apoi au fost analize din punctul de vedere al conținutului în alcool, acid tartric, glicerol și s-au determinat aciditatea totală și volatilă. Rezultatele sunt redate in tabelul 6.2.

Analizând rezultatele obținute se pot evidenția o serie de observații.

În toate cazurile cea mai mare putere alcooligenă o are tulpina S.oviformis 43, cu valori cuprinse între 13 și 14,5% (fig. 6.11); acest aspect, poate fi explicat și prin faptul că specia oxidativă de S.bayanus (specie facultativ peliculară) poate metaboliza mici cantități de etanol (0,7-1,5% conform literaturii de specialitate). Cea mai mică putere alcooligenă o are microflora spontană (între 11,7% și 13,1%).

Fig. 6.11. Puterea alcooligenă a tulpinilor autohtone în raport cu microflora spontană

În ceea ce privește aciditatea totală și conținutul în acid tartric toate vinurile au înregistrat valori normale în raport cu soiurile autohtone de vinuri și condițiile climatice ale anului 2012.

Așa cum era de așteptat, în cazul drojdiei facultativ peliculare S. bayanus MI 27 a fost înregistrată cea mai ridicată aciditate volatilă, precum și cel mai ridicat conținut în glicerol (fig.6.12). Este binecunoscut faptul că glicerolul nu contribuie la aroma vinului, dar este esențial pentru senzația de catifelare a vinului. Concentrația uzuală de glicerol în vin variază între 4 și 10 g/litru, în timp ce în vinurile obținute nivelul acestuia este mult mai mare decât valorile raportate anterior, chiar duble în cazul tulpinii S. bayanus MI 27 pe soiul Fetească Regală. Totuși, cantitatea de glicerol produsă de drojdii în vin poate fi influențată și de alți factori precum concentrația în sulfiți, pH, temperatura de fermentare, aerarea, nivelul inoculului, soiul de strugure și gradul de coacere, ca și de compoziția în azot (Radler și al., 1982). Sunt necesare investigații suplimentare pentru caracterizarea activității acestei drojdii peliculare.

Fig. 6.12. Capacitatea de producere a glicerolului tulpinilor autohtone în raport cu microflora spontană

6.3. Concluzii și recomandări

După trei ani de lucrări de izolare în podgoria Dealurile Bujorului, au fost preluate la nivel de testare 19 tulpini de drojdii aparținînd din punct de vedere taxonomic genului Saccharomyces. Din punct de vedere tehnologic, aceste tulpini aparțin speciilor S. bayanus, S. oviformis, S. ellipsoideus și S. rosei.

Trei dintre tulpinile izolate și pre-selecționate au prezentat proprietăți peliculare, având potențial să conducă la obținerea de vinuri mult mai catifelate, cu profil aromatic diferit. Aceste tulpini sunt S.bayanus MI 27 and MI 156, de asemenea S.oviformis MI 24 și sunt propuse pentru pentru a fi incluse în cercetări viitoare la nivel olfactometric.

Două din cele 19 tulpini, S.bayanus MI 27 și S.oviformis MI 43 au prezentat o pornire rapidă în fermentare, prin urmare au fost preluate în testarea potențialului lor oenologic prin fermentarea pe musturi din soiuri autohtone (Fetească Albă, Fetească Regală și Băbească Gri).

Cel mai mare conținut în alcool a fost atins în cazul tulpinii S.oviformis MI 43, în timp ce conținutul cel mai mare în aciditate volatilă și glicerol s-au obținut în cazul tulpinii S.bayanus MI 27, martorul fiind în toate cazurile mustul fermentat cu microflora spontană. Din punct de vedere fizico-chimic, toate vinurile obținute prin inoculare cu tulpini autohtone au înregistrat valori superioare în raport cu microflora naturală.

Ambele tulpini vor fi păstrate în colecția USAMV București, Facultatea de Biotehnologii, ca drojdii valoroase pentru vinificație. Luând în considerare tendința actuală de pe piață, care cere vinuri cu un conținut alcoolic mai scăzut, dar cu un profil aromatic mai pronunțat și caracteristic podgoriei, este cel mai probabil ca tulpina S.bayanus MI 27 să fie propusă pentru testarea la nivel pilot, iar apoi la scară industrială, în special pe musturi obținute din soiul autohton Fetească Regală în condițiile pedo-climatice din podgoria Dealurile Bujorului.

Bibliografie

1. Croitoru C., Tratat de știință oenologică – Produse de eleborare și maturare a vinurilor, Editura AGIR, București, 2009;

2. Fleet G. H., (2002), Wine microbiology and biotechnology, Department of Food Science and Technology The University of New South Wales Sydney, Australia, London;

3. Jirku, V., Masak, J., Cejkova, A.Yeast cell attachment: A tool modulating wall composition and resistance to 5bromo-6azauracil. In: Enz. and Microb. Technol., 2000

4. Matei F., Microbiologie aplicată, Editura PRINTECH, București, 2011;

5. Nicolae G., Proiect de diplomă: “Conservarea tulpinilor de drojdii de interes industrial”(2010);

6. P. Rybereau – Gayon, Y. Glories, A. Maujean, D. Dubourdieu, Handbook of Enology

Vo l u m e 2 – The Chemistry of Wine Stabilization and Treatments 2ndEdition, 2006;

7. Pomohaci N., Stoian V., Gheorghiță M., Sirghi C., Cotea V.V., Namolosanu I., Oenologie – Prelucrarea strugurilor și producerea vinurilor – vol.I, Editura CERES, București, 2000;

8.http://www.biotehnologii.usamv.ro/fisiere/file/MICROBIOLOGIE%20APLICAT%C4%82.pdf

9. http://ebooks.unibuc.ro/biologie/drojdii/3.htm;

10. http://ro.scribd.com/doc/85501895/Fermenta%C5%A3ia-alcoolic%C4%83;

11. http://www.slideshare.net/ukabularca/diploma-2009;

12. http://en.wikipedia.org/wiki/Flor;