Procedee Complexe de Analiza Si Evaluare a Moleculelor de Acizi Nucleici Si Proteine

PROCEDEE COMPLEXE DE ANALIZĂ ȘI EVALUARE A MOLECULELOR DE ACIZI NUCLEICI ȘI PROTEINE

5.1. METODE DE INVESTIGAȚIE BAZATE PE PCR (Polymerisation Chain Reaction)

O dată cu dezvoltarea tehnicilor de investigație în biologia moleculară, tehnica PCR a suferit o serie de modificări, care permit lărgirea posibilităților de utilizare. În continuare vor fi prezentate cele mai importante variante ale amplificării PCR.

5.1.1. METODA AMPLIFICĂRII PRIN REACȚIA ÎN LANȚ A POLIMERAZEI – PCR cu punct final

În literatura de specialitate acronimul PCR este utilizat pentru tehnica PCR tradițional, care mai este denumită ca PCR cu punct final, deoarece rezultatul poate fi evidențiat numai la sfârșitul reacției de amplificare. În literatura de limba engleză metodă este cunoscută sub denumirea de” End-point PCR”.

În acest caz amplificarea fragmentului specific de ADN dublu catenar, denumit și fragment țintă se desfășoară după principiile metodologice descrise în capitolul 4.3.1.

Pentru a verifica dacă în urma amplificării au fost sintetizate fragmentele așteptate, produșii PCR sunt separați prin electroforeză în gel de agaroză. Dimensiunile fragmentelor sunt determinate prin compararea cu un marker molecular de greutate (în limba engleză „molecular weight marker”).

Se poate aprecia astfel dacă secvența țintă este prezentă în proba analizată și totodată dacă are dimensiunea așteptată. Din acest considerent metoda amplificării prin PCR cu punct final este indicată pentru “detectarea” secvențelor dintr-un eșantion biologic, fiind deci o metodă calitativă.

Accesibilitatea metodei de amplificare prin PCR cunoaște și limite, condiționate de lungimea fragmentului amplificabil, deci a ADN inițial. Astfel amplificarea fragmentelor de 100-1000 nucleobaze este relativ facilă. Se estimează că limita superioară a lungimii fragmentelor amplificabile este de 3 kb, pentru că, la valori mai mari scade randamentul amplificării. Totodată este posibilă evidențierea prezenței unei anumite secvențe de ADN, fără a oferi informații privitoare la numărul de copii sau cantitatea de ADN existentă în proba de analizat.

5.1.1.1. PCR MULTIPLEX

PCR multiplex se încadrează în categoria PCR cu punct final, deoarece analiza produșilor de amplificare se realizează la sfârșitul reacției, dar se diferențiază prin posibilitatea de desfășurare a mai multor reacții de amplificare în același timp.

În amestecul de amplificare se introduc mai multe seturi de primeri, fiecare specific pentru o anumită secvență. Teoretic, reacțiile de amplificare ar trebui să aibă loc în același timp, fiecare set de primeri amplificând o anumită secvență ADN. Practic, în astfel de reacții de amplificare va exista întotdeauna un risc ridicat al obținerii unor rezultate eronate deoarece:

Fiecare set de primeri necesită condiții de reacție diferite (de exemplu regim de temperaturi diferit sau o concentrație diferită a reactanților);

Combinarea diferitelor seturi de primeri poate să crească riscul amplificării altor fragmente decât secvențele țintă;

Atunci când mai multe fragmente țintă sunt amplificate într-o reacție PCR, ele concurează pentru reactanți. În această competiție, un fragment care este prezent într-un număr mai mare de copii la început va predomina asupra altor fragmente care sunt prezente în număr mai redus.

Chiar dacă tehnica PCR multiplex prezintă și o serie de dezavantaje este totuși utilizată pentru un screening general al probelor de analizat, după care probele posibil pozitive sunt reanalizate cu un singur set de primeri.

5.1.1.2. PCR CANTITATIV COMPETITIV

Tehnica PCR cantitativ competitiv este asemănătoare cu PCR clasic, dar în acest caz are loc amplificarea simultană a două tipuri de ADN, care conțin secvențe asemănătoare, amplificabile cu același set de primeri. Primul tip de ADN este extras din proba de analizat, iar cel de-al doilea este un standard intern denumit competitor. La fel ca la PCR calitativ, produșii de amplificare sunt analizați la sfârșitul reacției.

PCR competitiv furnizează posibilități foarte bune pentru o detectare simplă și sigură a anumitor secvențe în probele de analizat și totodată o determinare semi- cantitativă a acestora.

În acest caz, în reacția de amplificare se introduce ADN extras din proba de analizat care este purtătorul potențial al unei secvențe țintă și un ADN competitor, sau standard intern, care poartă o secvență țintă puțin modificată, dar care poate fi amplificată cu același set de primeri. În cazul competitorului secvența țintă a fost fie scurtată, prin deleție, fie mărită prin inserție. Aceste modificări nu afectează însă situsurile de legare ale primerilor.

Ca standarde interne sau competitori sunt utilizate produse care conțin secvența țintă cu o concentrație cunoscută.

Deci, ADN standard intern cu concentrație cunoscută este adăugat în amestecul de reacție și amplificat împreună cu ADN țintă al probei cu concentrație necunoscută. La sfârșitul reacției de amplificare produșii obținuți se analizează prin electroforeză în gel de agaroză și sunt vizualizați prin iluminare UV în prezența bromurii de etidiu. Produșii au o intensitate a fluorescenței care este proporțională cu cantitatea de ADN amplificat și ei apar în gelul de agaroză ca două benzi distincte, cu intensități diferite (Fig. 5.1).

Dacă se realizează o singură reacție de amplificare se poate preciza numai dacă concentrația probei necunoscute este mai mare, sau mai mică comparativ cu standardul intern.

În scopul obținerii unor rezultate mai complexe, se realizează mai multe amestecuri de amplificare în care pentru standardul intern se realizează diluții seriale, iar proba cu concentrație necunoscută se menține constantă. Produșii de reacție se analizează prin electroforeză în gel de agaroză și se compară intensitatea benzilor rezultate din fiecare amestec de amplificare. Apoi, se identifică amestecul pentru care intensitatea celor două benzi este identică, considerându-se că în acest caz concentrația probei necunoscute este identică cu cea a standardului intern. Dacă pentru nici unul dintre amestecurile de reacție nu se vizualizează fragmente cu aceiași intensitate, atunci se pot efectua alte diluții ale probei standard, în așa fel încât să fie posibilă în final evaluarea concentrației probei necunoscute.

O variantă mai complexă a PCR cantitativ competitiv este PCR cantitativ dublu competitiv, care are la bază același principiu, aplicat de două ori: o dată pentru o genă specifică speciei și standardului ei intern și a doua oară unei gene specifice și standardului intern corespunzător. Rezultatele obținute din ambele amplificări PCR permit calcularea conținutului de inițial al secvenței de interes, comparativ cu genă specifică speciei..

Atât PCR cantitativ competitiv, cât și sistemul dublu competitiv prezintă un avantaj major deoarece nu necesită nici un echipament în plus, comparativ cu PCR cantitativ. Metodele mai sus menționate sunt totuși considerate a fi semi cantitative, deoarece ele necesită un standard cu care să fie comparate. Compararea se realizează vizual, din această cauză fiind posibilă apariția unor erori. Rezultatul poate fi de formă mai mare, egal sau mai mic comparativ cu proba standard.

Fig. 5.1. Desfășurarea unui proces PCR semi-cantitativ competitiv

5.1.1.3. AMPLIFICAREA PRIN REACȚIA ÎN LANȚ A POLIMERAZEI – PCR CU TEMPERATURĂ VARIABILĂ DE LEGARE A PRIMERILOR

În cazul utilizării tehnicii PCR, uneori rezultatele așteptate nu sunt corespunzătoare, deoarece legarea primerilor la catena matriță are loc cu o eficiență scăzută. În această situație se consideră că temperatura de legare a primerilor, stabilită teoretic nu asigură condițiile optime de desfășurare a reacției. De aceea este necesară optimizarea procesului prin urmarea unui program cu gradient de temperatură, sau „PCR Touchdown”.

Programele cu gradient de temperatură presupun folosirea condițiilor similare de amplificare și anume același amestec de reacție, aceeași matriță ADN, aceiași primeri; reacțiile se desfășoară în același timp în aparatul thermalcycler, dar temperatura de legare a primerilor diferă pe coloane. Astfel se poate stabili temperatura optimă a acestui pas de care depinde în mare măsură reușita unei reacții de amplificare.

Programele PCR Touchdown se utilizează mai ales atunci când se urmează tehnica PCR Multiplex și anume se dorește amplificarea unui ADN matriță în același timp cu mai mulți primeri.

Programul de tip Touchdown presupune folosirea unei variații a temperaturii de legare a primerilor, în cadrul aceleiași reacții de amplificare. Diferențele față de programele cu gradient de temperatură constau în faptul că nu se mai urmărește stabilirea unei temperaturi optime de legare ci se dorește ca amplificarea să se producă în cadrul aceluiași program pentru un număr cât mai mare de perechi de primeri, în condiții optime.

Un astfel de program este compus din aceeași pași ai reacției de amplificare, dar temperatura fiecărui ciclu de legare a primerilor diferă. Într-o etapă de amplificare temperatura crește cu o rată de 2°C la fiecare două cicluri, pornind de la premisa că perechile de primeri folosite vor atinge optimul de legare la una dintre temperaturile folosite.

Aceste programe se folosesc cu succes, deoarece pentru anumiți primeri este necesară o temperatură optimă de legare doar la debutul amplificării, după care procesul decurge normal chiar dacă temperatura de legare scade.

De menționat că primerii folosiți în acest program de amplificare trebuie să fie specifici, preciși și robuști, pentru a preîntâmpina apariția posibilă a produșilor de amplificare nespecifici.

5.1.2. PCR ÎN TIMP REAL

În biologia moleculară tehnica PCR în timp real, denumită și PCR cantitativ în timp real (Q-PCR/qPCR) este o tehnică de laborator care permite amplificarea și cuantificarea simultană a unei secvențe țintă de ADN.

În literatura de specialitate de limbă engleză metoda este cunoscută sub denumirea de „real-time polymerase chain reaction” – reacția în lanț a polimerazei urmărită în timp real sau „quantitative real time polymerase chain reaction” – reacția în lanț a polimerazei, cantitativă, urmărită în timp real, notată abreviat prin acronimul (Q-PCR/qPCR).

Această tehnică urmează principiul PCR, caracteristic fiind faptul că ADN amplificat este cuantificat în timp real, pe măsură ce se acumulează în reacție, după fiecare ciclu de amplificare. Astfel este posibilă determinarea numărului absolut al copiilor unei secvențe ADN specifice sau poate avea loc o cuantificare relativă, atunci când se raportează la o genă de referință.

Tehnica PCR în timp real a devenit disponibilă în anul 1996, o dată cu introducerea pe piața a primului echipament care a permis urmărirea desfășurării reacției de amplificare în timp. De atunci și până în prezent a rămas cea mai precisă și sensibilă tehnică aplicată pentru detectarea și cuantificarea acizilor nucleici.

PCR în timp real este un sistem bazat pe o monitorizare continuă a produșilor PCR, care se realizează prin măsurarea semnalului fluorescent al unei probe interne de-a lungul reacției. O problemă în procesul de monitorizare a desfășurării procesului a fost găsirea unei metode care să permită detecția produșilor PCR pe măsură ce ei se formează. În acest scop se aplică în prezent două strategii importante: una utilizează un colorant fluorescent care are capacitatea de a se lega numai la moleculele de ADN bicatenare iar cea de-a doua se bazează pe prezența unor sonde oligonucleotidice, alcătuite din ADNmc, care se leagă în interiorul fragmentului ADN care urmează să fie amplificat și devin fluorescente după ce reacția a avut loc.

5.1.2.1. CUANTIFICAREA ACIZILOR NUCLEICI CU AJUTORUL COLORANȚILOR SPECIFICI

Cea mai simplă și economică modalitate pentru detectarea și cuantificarea produșilor PCR este utilizarea SYBR Green, o substanță fluoroforă care are proprietatea de a se cupla cu moleculele ADN bicatenar (ADNbc), mărindu-și astfel fluorescența de peste 1000 de ori.

SYBR green este un colorant fluorescent sintetic, introdus la începutul anilor 1990, care se leagă la fragmentele ADN dublu catenar cu o specificitate foarte mare. Este utilizat pe scară foarte largă în cercetările de biologie moleculară pentru a cuantifica și vizualiza ADN dublu catenar.

Este un colorant cianinic asimetric, stabil într-un interval larg de temperatură, ceea ce înseamnă că poate fi utilizat pentru a monitoriza reacțiile biochimice (Fig. 5.2.). Complexele ADN-colorant absorb lumina în spectrul albastru (λmax = 488 nm) și emit lumină verde (λmax = 522 nm).

Fig. 5.2. Structura colorantului SYBR Green

Pe măsură ce cantitatea de ADNdc crește, ca rezultat al amplificării secvențelor specifice, crește și cantitatea de SYBR Green fixat la ADN și deci gradul de fluorescență al amestecului de reacție. Energia emisă de fluorofor în urma excitării în UV este înregistrată la sfârșitul fiecărui ciclu de amplificare, fiind proporțională cu cantitatea inițială a secvențelor ADN țintă.

Dezavantajul utilizării colorantului SYBR green este legarea lui la orice moleculă de ADN dublu catenar din reacție, inclusiv dimerii alcătuiți de primeri și alți produși de reacție nespecifici, ceea ce conduce la o supraestimare a concentrației secvențelor țintă.

SYBR Green este totuși cea mai economică alegere pentru detectarea produșilor PCR în timp real, deoarece este ieftin, ușor de utilizat și sensibil. El poate fi utilizat în orice reacție de amplificare, fără a fi necesară pregătirea unor sonde pentru fiecare secvență țintă particulară care urmează să fie analizată. Pentru că legarea este nespecifică procesul de detecție necesită o optimizare considerabilă și sunt necesare alte metode ulterioare pentru validarea rezultatelor.

5.1.2.2. CUANTIFICAREA ACIZILOR NUCLEICI CU AJUTORUL SONDELOR MOLECULARE SPECIFICE

De-a lungul timpului au fost dezvoltate mai multe sisteme de marcare, denumite sonde moleculare, care se leagă la fragmentul țintă, dar devin fluorescente numai după ce reacția de amplificare a avut loc. În continuare sunt prezentate cele mai uzuale tipuri de sonde moleculare, cu utilizare în tehnica Real-Time PCR.

SONDE MOLECULARE TaqMan

Sondele moleculare TaqMan sunt fragmente scurte de ADN, marcate cu un colorant raportor fluorescent (R) și un colorant absorbant pentru fluorescența (Q), fiind denumite și sonde interne. Atunci când cei doi coloranți se află în apropiere, legați la același fragment ADN nu este emis semnal fluorescent.

Secvența sondelor este astfel stabilită încât să se lege exact în regiunea care urmează să fie amplificată. Deci, pentru fiecare secvență țintă trebuie să fie utilizată o „probă TaqMan” specifică.

În cadrul fiecărui ciclu de amplificare ADN este prima dată denaturat și separat în două molecule monocatenare. A doua etapă este legarea primerilor și în același timp și a probei interne. Primerii se leagă la capetele fragmentului care urmează a fi amplificat, iar proba se leagă în mijlocul acestuia. În ultima etapă ADN polimeraza sintetizează noile catene de ADN, pornind de la primeri. Deoarece polimeraza aleasă are o activitate exonucleazică 5’ – 3’ foarte pronunțată, atunci când ajunge în dreptul probei o secționează în nucleotidele componente. În această situație colorantul raportor fluorescent și cel absorbant nu mai sunt apropiați, astfel ca semnalul fluorescent poate fi detectat. Semnalul fluorescent este înregistrat la sfârșitul fiecărui ciclu de amplificare, fiind proporțional cu cantitatea inițială a secvențelor DNA țintă (Fig. 5.3).

Monitorizarea în timp real a desfășurării reacției de amplificare prin măsurarea fluorescenței conduce la trasarea unor curbe de amplificare alcătuite dintr-o fază exponențială, una liniară și una de platou. Se investighează în paralel probe standard, cu concentrații cunoscute și totodată probele de analizat.

Se stabilește o valoare de prag „Threshold” în zona de amplificare exponențială, după care se stabilește valoarea CT („threshold cycle”), care reprezintă numărul de cicluri necesare unei probe pentru a ajunge la valoarea de prag. Cu cât cantitatea inițială de ADN a fost mai mare, cu atât valoarea CT va fi mai mică. Valorile CT pentru probele standard vor sta la baza trasării unei drepte de etalonare. Raportarea valorilor CT ale probelor de analizat la dreapta de etalonare permite stabilirea concentrației inițiale de secvență țintă în probă ADN analizată.

Analizele Real-Time PCR cu sonde moleculare TaqMan sunt utilizate în studiile de expresie a genelor, identificarea virusurilor și a bacteriilor, discriminarea alelelor, cuantificarea ADN și genotiparea polimorfismului unei singure nucleotide.

Fig. 5.3. Desfășurarea procesului Real-Time PCR cu sonde moleculare TaqMan

Fig. 5.4. Stabilirea pragului de amplificare, determinarea valorilor CT și trasarea dreptei de etalonate

SONDE “molecular beacons”

Sondele “molecular beacons” sunt oligonucleotide monocatenare, cu o structură de “ac de păr”. În prezența unei secvențe țintă ele se desfac, se leagă și devin fluorescente. Sondele menționate sunt compuse din patru subunități (Fig. 5.5).

Fig. 5.5. Structura unei sonde „Molecular beacons”

Aceste sonde pot să identifice prezența unui acid nucleic specific dintr-o soluție omogenă. În prezența unei secvențe complementare regiunile liniare (“stem”), se separă, rezultând o sondă care hibridizează cu secvența țintă.

Pe parcursul procesului de amplificare sonda moleculară intervine activ, după cum urmează: în timpul unei etape de denaturare sonda are o conformație alungită și emite fluorescență; pe măsură ce temperatura scade, pentru a permite legarea primerilor, regiunile liniare se asociază rapid, astfel că semnalul fluorescent nu mai este emis; dacă însă sondele se leagă la secvența țintă, fluorescența este emisă din nou; la creșterea temperaturii, pentru a facilita sinteza ADN, sondele disociază de secvențele țintă, ne- interferând cu polimerizarea; câte o nouă reacție de hibridizare are loc în timpul fiecărei etape de legare a primerilor, din fiecare ciclu, iar intensitatea fluorescenței este corelată cu acumularea de produși de amplificare (Fig. 5.6).

Fig. 5.6. Desfășurarea procesului Real-Time PCR cu sonde „Molecular beacons”

Deci, fluorescența este monitorizată și înregistrată în cursul fiecărei etape de legare a primerilor, când sonda se atașează la secvența țintă complementară.

Pe baza informațiilor cu privire la semnalul fluorescent înregistrat este posibilă cuantificarea numărului inițial de copii ale secvenței ADN de interes.

Utilizarea sondelor “molecular beacons” permite dezvoltarea unui număr mare de aplicații cum ar fi: identificarea polimorfismului la nivel de nucleotide; detecția acizilor nucleici în timp real; cuantificare prin tehnica Real-Time PCR; identificarea și discriminarea alelică; tehnici de diagnostic clinic.

Avantajele utilizării sondelor „Molecular beacons”

Structura specifică a acestor sonde permite evidențierea nepotrivirii unei singure perechi de baze, deoarece moleculele legate greșit sunt mai puțin stabile din punct de vedere termodinamic, comparativ cu moleculele hibride formate între sondele liniare și secvențele țintă parțial complementare.

Mai mult, spre deosebire de sondele liniare, în cazul sondelor „molecular beacons” transferul de energie se realizează direct, de la colorantul raportor la cel absorbant. Astfel se pot utiliza ca raportori un număr mare de posibili fluorofori, cu un colorant absorbant comun.

Acest avantaj are o importanță deosebită atunci când se dorește identificarea concomitentă a mai multor secvențe țintă (experiment multiplex), situație în care pot fi utilizate mai multe sonde, cu diferiți fluorofori ca raportori.

Sonde – primeri Scorpions

Primerii Scorpions sunt molecule bifuncționale în care un primer este linkat covalent cu o sondă moleculară, astfel că sunt alcătuiți dintr-o structură similară sondelor „Molecular beacons” și o oligonucleotidă. Moleculele conțin deci atât un colorant raportor, cât și unul absorbant.

În timpul reacției PCR, primerul hibridizează cu secvența țintă și are loc extensia, datorită acțiunii ADN polimerazei. Primerii Scorpion pot fi utilizați pentru a examina și identifică puncte de mutație utilizând probe multiple. Fiecare sondă poate fi marcată cu un fluorofor diferit pentru a emite la lungimi de undă diferite.

Primerii Scorpion au legat la capătul 5' o sondă moleculară. Sonda este alcătuită dintr-o regiune liniară cu un fluorofor la un capăt și un absorbant la celălalt capăt.

Funcționarea Scorpion

În cazul primerilor Scorpion. Sonda trebuie să fie legată fizic la primer, ceea ce înseamnă că reacția care conduce la generarea de semnal este una uni moleculară. Aceasta este în contrast cu coliziunea bimoleculară necesară pentru alte tipuri de sonde, cum ar fi TaqMan sau molecular Beacons.

După ce a avut loc un ciclu complet. Secvența țintă nou sintetizată se va atașa la aceiași catena ca și sonda. Urmând cel de-al doilea ciclu de denaturare și legare, sonda și ținta hibridizează. Denaturarea buclei necesită mai puțină energie decât noul ADNbc produs. În consecință, secvența hairpin hibridizează cu o parte a produșii nou formați în PCR. Aceasta conduce la separarea fluoroforului de absorbant și cauzează emiși

Aplicații – analiza SNP, Real-time PCR, discriminare alelica, testări de genotipare într-un singur tub

Fig. 5.7. Desfășurarea procesului Real-Time PCR cu sonde-primeri Scorpions

5.1.3. PCR ASOCIAT CU REVERS-TRANSCRIEREA

(RT-PCR)

În ultima vreme, în biologia moleculară se acordă o atenție tot mai mare studiului expresiei genelor, deoarece o serie de procese metabolice din celulele vii sunt controlate pe această cale.

Astfel s-au dezvoltat tehnici de investigare asupra ARN, cum ar fi tehnica PCR asociată cu revers-transcrierea. În literatura de limba engleză metoda este cunoscută sub denumirea de ”Reverse transcription polymerase chian reaction”, notată abreviat cu RT-PCR.

În cazul în care revers transcrierea este asociată unei reacții PCR în timp real, tehnica poartă numele de tehnica PCR asociată cu reverstranscrierea urmărită în timp real. În literatura de limba engleză metoda este cunoscută sub denumirea de ”Real-time reverse-transcription polymerase chian reaction”, notată abreviat cu qRT-PCR, RRT-PCR, sau RT-rt PCR.

În general, acronimul RT-PCR semnifică PCR asociat cu revers transcrierea și nu PCR în timp real, dar unii autori nu au aderat la această convenție.

Tehnica RT-PCR presupune două etape și anume revers-transcrierea (RT), proces în care ARN este copiat într-o moleculă de ADN complementar (ADNc), cu ajutorul revers-transcriptazei și a primerilor, după care are loc o amplificare PCR, care urmează toate etapele descrise anterior. Etapa de sinteză a ADNc este foarte importantă deoarece în cadrul PCR pot fi amplificate numai molecule ADN.

Procesul RT-PCR a fost dezvoltat după ce au fost caracterizate revers- transcriptazele sau ADN-polimerazele dependente de ARN de către H.M. Temin și D. Baltimore, la virusurile tumorale, descoperire pentru care au primit Premiul Nobel pentru Medicină în anul 1975. Revers-transcriptazele sintetizează ADN în direcția 5’-3’, la fel ca ADN polimerazele ADN-dependente și ARN-polimerazele, utilizând dezoxi-ribonucleozid-5’-trifosfați (dNTP) ca precursori și necesitând atât prezența matriței pe care o vor copia, cât și o catenă primer (amorsă) care să furnizeze capetele 3’-hidroxil libere.

Astfel, în cazul procesului de revers-transcriere este necesară prezența unei matrițe, care este constituită din moleculele de ARN și de un primer care să furnizeze punctul de pornire al sintezei ADN.

În stabilirea mecanismelor după care se desfășoară revers- transcrierea, o importanță deosebită o reprezintă structura moleculelor ARNm. Se cunoaște că moleculele ARNm suferă o serie de modificări post translaționale prin atașarea la capătul 3’a unui fragment poly (A), conținând 100-250 de resturi adenozin-monofosfat (AMP), denumit extremitatea poly A („poly-A-3’ tail”). Această structură specifică a moleculelor ARNm stă la baza dezvoltării sistemelor de primeri (amorse) care să inițieze sinteza ADNc.

În prezent se cunosc trei tipuri de primeri:

o oligonucleotidă alcătuită din resturi poly-T, denumită primer oligo-dT, care se poate lega la toate moleculele de ARNm în același timp, pe baza complementarității poly-A – poly –T (Fig. 5.8 A)

un primer cu o secvență specifică, care va conduce la o copiere selectivă a unei singure molecule ARNm (Fig. 5.8 B)

un primer cu o secvență întâmplătoare, care se poate lega la orice moleculă ARNm, în orice poziție. Se produc astfel fragmente ADNc mai scurte, deoarece primerul nu se va lega exclusiv la capătul 3’ al moleculei de ARNm (Fig. 5.8 C).

Utilizarea primerului cu secvență întâmplătoare mărește probabilitatea ca extremitatea 5’ a moleculei de ARNm să fie convertită în ADNc, deoarece de obicei revers-transcriptaza nu atinge capetele 3’ ale moleculelor de ARNm cu o lungime mare.

Fig. 5.8. Tipurile de primeri și acțiunea lor în procesul de sinteza a ADNc (A) primer oligo-dT, (B) primer cu secvența specifică; (C) primer cu secvență întâmplătoare

ADNc sintetizat cu ajutorul revers-transcriptazei poate fi supus apoi amplificării prin PCR cu punct final, dacă se dorește o evaluare calitativă sau semicantitativă. În acest caz produșii de amplificare sunt analizați prin electroforeză în gel de agaroză, iar benzile obținute pot fi analizate comparativ. Revers-transcrierea poate avea loc în același tub cu amplificarea PCR, procesul numindu-se RT-PCR într-o singură etapă (“one-step RT-PCR”) sau cele două reacții pot avea loc succesiv.

Dar, PCR cu punct final este o tehnică cu o sensibilitate mai redusă, cu un risc mai mare de contaminare a probelor datorită proceselor de manipulare care au loc după amplificare. De aceea se utilizează pe scară tot mai largă tehnica PCR asociată cu revers-transcrierea urmărită în timp real. În acest caz în reacția de amplificare se introduce ADNc, urmându-se apoi toate etapele descrise în cadrul tehnicii PCR în timp real.

Astfel ADN amplificat este cuantificat în timp real, pe măsură ce se acumulează în reacție, fiind posibilă evaluarea cantității inițiale de ARN specific, care a fost prezentă în proba de analizat.

5.1.4. APLICAȚII ALE AMPLIFICĂRII PRIN REACȚIA ÎN LANȚ A POLIMERAZEI (PCR)

5.1.4.1. APLICAȚII ALE PCR CU PUNCT FINAL”End-point PCR”

EVIDENȚIEREA PREZENȚEI SAU ABSENȚEI UNEI GENE SAU SECVENȚE ADN

Datorită posibilității de evidențiere a unei secvențe ADN prin amplificare, urmată de analiză prin electroforeză în gel de agaroză sau poliacrilamidă, tehnica PCR poate fi utilizată pentru evidențierea prezenței sau absenței unei gene/secvențe ADN într-o probă analizată. În funcție de tipul genei identificate se pot desprinde o serie de aplicații practice ale tehnicii PCR.

Aplicații în medicină

detectarea infecțiilor bacteriene sau virale, dacă secvența a cărei prezență a fost identificată este constituită din ADN viral sau bacterian;

detectarea unor boli, dacă acestea sunt condiționate de apariția unor mutații ale unor gene cunoscute;

posibilitatea pronosticului unor boli congenitale, în cazul în care acestea au un determinism genetic;

stabilirea sexului la produsul de concepție, chiar din stadiul embrionar, investigație posibilă datorită markerilor specifici amplasați pe cromosomul Y.

Aplicații în agricultură și industria alimentară

identificarea prezenței OMG (organisme modificate genetic) în produsele agricole și alimentare, investigație posibilă deoarece genele transferate la plante sunt cunoscute;

identificarea infecțiilor bacteriene sau virale în produse agricole, dacă secvența identificată este constituită din ADN viral sau bacterian;

AMPLIFICAREA UNOR FRAGMENTE ADN

Datorită posibilității amplificării unei secvențe, prin tehnica PCR pot fi obținute cantități mari de ADN care să fie apoi utilizate în diferite scopuri:

generarea de sonde moleculare care, în urma marcării radioactive sau chimice sunt utilizate în procese de hibridizare în tehnicile Southern sau Northern;

producerea unor fragmente ADN care să poată fi secvențializate prin tehnica Sanger, pornind de la secvența unuia dintre primerii utilizați la amplificare;

producerea unor cantități suficiente dintr-un fragment ADN, astfel încât să fie posibilă obținerea unei molecule ADN recombinant.

GENERAREA UNOR MARKERI ADN

Tehnica PCR poate sta la baza generării unui număr mare de markeri moleculari cum ar fi: EST – etichetarea secvențelor exprimate („Expressed Sequence Tag”), RAPD – amplificarea întâmplătoare a ADN polimorfic („Random Amplified Polymorphic DNA”), AFLP – polimorfismul lungimii fragmentelor amplificate („Amplified Fragment Length Polymorphism”), SSR – secvențe simple repetate („Simple Sequence Repeats”), CAPS – polimorfismul fragmentelor amplificate și secționate („Cleaved Amplified Polymorphic Sequence”), SCAR- Regiuni amplificate secventializate („Sequence characterized amplified region”).

Markerii moleculari, care evidențiază polimorfismul la nivel de ADN cu ajutorul tehnicii PCR pot să-și găsească o paletă foarte largă de aplicații: cartarea genomului, în cadrul căreia se stabilește poziția fiecărui marker molecular pe harta genetică, pe baza frecvenței de recombinare; selecția asistată de markeri, care poate avea loc dacă anterior au fost identificați markeri moleculari linkați cu caractere fenotipice de interes; evaluarea diversității genetice intra sau inter specifice; analiza distanțelor genetice, prin stabilirea gradului de înrudire; verificarea și perfecționarea clasificărilor taxonomice; analiza filogenetică; investigații criminalistice și teste de paternitate, posibile în cazul organismului uman, care a fost secvențializat în totalitate.

5.1.4.2. APLICAȚII ALE TEHNICII PCR ÎN TIMP REAL („Real-time PCR”)

PCR în timp real sau PCR cantitativ permite estimarea cantității unei secvențe date, prezente într-o probă. În funcție de tipul secvenței identificate și cuantificate se desprind aplicațiile acestei tehnici:

Detectarea și cuantificarea ADN viral în diferite probe biologice; tehnica este precisă, cu o sensibilitate foarte ridicată, permițând detecția virusului imediat după infecție;

Detecția și cuantificarea unor gene, provenite de la organisme modificate genetic;

În cazul în care PCR este combinat cu procesul de revers-transcriere este posibilă determinarea cantitativă a abundenței unor molecule de ARNm, ca măsură a expresiei genelor. Pot fi astfel evidențiate modificările induse la nivelul expresiei genelor de către factorii de mediu, apariția unor boli etc. Identificarea genelor a căror expresie este modificată în anumite condiții reprezintă un pas important în descifrarea mecanismelor de apărare care se declanșează în organismele vii pentru contracararea efectului factorilor de stres.

5.1.4.3. APLICAȚII ALE TEHNICII PCR ASOCIAT CU REVERS-TRANSCRIEREA ( ”Reverse transcription polymerase chian reaction”)

Având în vedere că în cadrul reacției PCR asociat cu revers-transcrierea (RT-PCR) se analizează ARN, aplicațiile tehnicii sunt specifice acestui tip de acid nucleic:

Studiul genomului retrovirusurilor cum ar fi virusul gripal sau virusul HIV;

Clonarea genelor eucariote în organisme procariote în scopul producerii proteinelor; ADNc generat în urma reacțiilor RT-PCR reprezintă exact secvența de acid nucleic care se regăsește în secvența proteinei sintetizate;

Determinarea semi-cantitativă a abundenței diferitelor molecule de ARNm într-o celulă sau un țesut, ca o măsură a expresiei genelor.

5.2. TEHNICILE DE TRANSFER ȘI ANALIZĂ A ACIZILOR NUCLEICI/PROTEINELOR

Tehnica SOUTHERN BLOTTING a fost imaginată în 1975 de către Southern, în scopul identificării unor fragmente specifice de ADN cu ajutorul sondelor moleculare marcate. Tehnica se bazează pe proprietatea ADN de a se denatura și de a renatura alături de orice fragment ADN care posedă secvențe complementare.

Prin analogie, au fost imaginate tehnicile NORTHERN BLOTTING, care presupune analiza ARN și WESTERN BLOTTING, care presupune analiza proteinelor.

Tehnicile menționate se desfășoară după aceleași principii, dar prezintă și particularități datorate tipului de molecule analizate.

5.2.1. TEHNICA SOUTHERN BLOTTING

Tehnica Southern presupune parcurgerea mai multor etape și anume: separarea fragmentelor de ADN, transferul fragmentelor de ADN, în formă denaturată pe membrane solide, hibridizarea cu sonde moleculare marcate și identificarea prezenței secvențelor țintă.

5.2.1.1. SEPARAREA FRAGMENTELOR ADN

Într-o primă etapă are loc izolarea și purificarea ADN, cu metode specifice speciei sau țesutului din care se realizează extracția. Apoi, ADN este secționat cu enzime de restricție, care taie molecula de ADN la nivelul unor secvențe specifice (capitolul 4.2).

Apoi, fragmentele secționate sunt separate în funcție de greutatea lor moleculară prin electroforeză în gel de agaroză, sau poliacrilamidă (capitolul 4.7).

Fragmentele de ADN nu pot fi analizate direct în gelurile în care au fost separate și de aceea sunt transferate pe suporturi solide, care permit evaluarea ulterioară.

5.2.1.2. TRANSFERUL FRAGMENTELOR ADN DIN GEL, PE MEMBRANE SOLIDE

Fragmentele ADN sunt transferate pe membrane de nitroceluloză sau nylon pe care pot fi păstrate timp nelimitat. Aceste membrane au o încărcare pozitivă, pentru a asigura o afinitate bună pentru acizii nucleici, care posedă grupări negative. Poziția fragmentelor de ADN pe membrane este identică cu cea din gel, ceea ce permite identificarea lor după hibridizarea cu sonde moleculare.

MECANISMUL PROCESULUI DE TRANSFER

Pentru a realiza transferul efectiv al fragmentelor ADN din gel pe membrană se realizează ansambluri alcătuite dintr-o structură tip „sandwich”. Astfel, gelul se va așeza pe un suport poros, care este imersat într-o soluție implicată atât în procesul de transfer, cât și în denaturare. Peste gel se va așeza membrana, care va fi acoperită la rândul ei cu un strat de hârtii absorbante. Este necesar ca tot acest ansamblu, menținut cu ajutorul unei greutăți, să fie aranjat pe verticală.

Datorită hârtiilor absorbante soluția de denaturare/transfer va fi antrenată din vasul în care se află, spre partea superioară a ansamblului. Astfel soluția va trece prin gel, va denatura fragmentele de ADN și le va antrena în sus, unde vor întâlni membrana. Soluția de transfer va fi absorbită spre partea superioară, dar fragmentele de ADN vor rămâne imobilizate pe membrană.

După terminarea transferului, fragmentele denaturate sunt fixate pe suport prin tratament termic sau prin iradiere UV.

5.2.1.3. HIBRIDIZAREA MEMBRANELOR CU SONDE MOLECULARE MARCATE ȘI IDENTIFICAREA FRAGMENTELOR ȚINTĂ

Hibridizarea este o tehnică de recombinare a acizilor nucleici, care vizează alcătuirea unei molecule de acid nucleic dublu catenar din două lanțuri unice, separate, pe baza complementarității perechilor de baze. Împerecherea de baze complementare se poate realiza între ADN-ADN, ADN-ARN sau ARN-ARN.

Prin această tehnică este posibilă identificarea unei secvențe de acid nucleic monocatenar (secvența țintă), cu ajutorul unei sonde moleculare marcate. Sonda moleculară reprezintă un fragment de acid nucleic (ADN sau ARN), cu secvență cunoscută, care este marcat radioactiv sau chimic și denaturat în prealabil.

Dacă sonda și secvența țintă sunt total sau parțial complementare din punctul de vedere al secvențelor de baze nucleotidice, se formează o moleculă hibrid de acid nucleic în care se identifică secvențele nucleotidice pe secvența țintă, în raport cu bazele (complementare) de pe secvența nucleotidică cunoscută a sondei moleculare.

Atât ADN țintă cât și sonda moleculară marcată sunt supuse unui proces de denaturare, după care are loc procesul de hibridizare, în condiții de temperatură și concentrație a sărurilor bine precizate.

După ce procesul de hibridizare a avut loc, sonda moleculară în exces se elimină, pentru a evita identificarea unor probe fals pozitive. Apoi membrana este supusă unui proces de developare și analiză, specific sistemului de marcare utilizat.

Acele fragmente ADN la care s-a atașat sonda moleculară sunt vizualizate sub forma unor spoturi întunecate, colorate sau fluorescente, în funcție de metoda de marcare aplicată.

În figura următoare (5.9) sunt prezentate etapele parcurse pentru identificarea prezenței unor secvențe prin tehnica Southern Blotting.

Fig. 5.9. Etapele care alcătuiesc un experiment de identificare a fragmentelor ADN prin tehnica Southern blotting

O etapă metodologică necesară, după ce fragmentele ADN denaturate au fost fixate pe membrane este marcarea sondelor moleculare.

MARCAREA SONDELOR MOLECULARE

Sondele moleculare reprezintă fragmente de ADN, cu secvențe cunoscute, care trebuie să fie marcate radioactiv sau chimic, înainte de utilizare. Inițial se obțin dezoxi-ribonucleozid trifosfați marcați, care se înglobează apoi în fragmente de acizi nucleici, copii ale secvenței sondei moleculare.

MARCAREA RADIOACTIVĂ

Marcarea radioactivă se realizează cu radioizotopi 3H, 35S, 125I, 32P, introduși într-un anumit dezoxi-ribonucleozid trifosfat, care prin dezintegrare emit raze β. Astfel, după cuplarea sondei moleculare cu secvența țintă, izotopul radioactiv va emite radiații care pot fi evidențiate prin auto-radiografiere (impresionarea unei plăci Roentgen sau a unui clișeu autoradiografic care se developează ulterior), sau pot fi preluate direct, prin intermediul unor echipamente speciale.

La alegerea izotopilor trebuie ținut cont de timpul de înjumătățire, timp necesar pentru ca substanța radioactivă să se descompună în proporție de 50%: 3H- 12,35 ani, 35S- 87,4 zile, 125I- 60 zile, 32P- 14,3 zile.

În cazul în care izotopul ales este 32P, înregistrarea semnalului radioactiv și transmiterea la un sistem computerizat se realizează cu ajutorului unui echipament denumit Phosphoimager.

Una dintre cele mai utilizate metode pentru marcarea radioactivă este „Random Priming Oligolabelling”.

În acest caz se folosesc ca matrițe catene unice de ADN, rezultate dintr-o denaturare prealabilă a unei catene de ADN. Se folosește enzima Klenow polimeraza, care reprezintă un fragment de ADN-polimerază căruia îi lipsește activitatea 5’-3’exonucleazică.

Reacțiile de sinteză a noilor catene de acid nucleic pornesc de la primeri cu o lungime de 6 nucleotide, cu secvență întâmplătoare, care găsesc secvențe complementare în mai multe puncte în fragmentul care urmează a fi copiat. Acestea furnizează grupările OH, la capetele 3’, necesare ADN polimerazei pentru a începe sinteza.

În catena nou formată vor fi înglobați nucleozid trifosfații, în funcție de complementaritatea bazelor, dintre care numai unul a fost marcat în prealabil radioactiv (Capitolul 4.3.3).

Fragmentele ADN astfel pregătite sunt utilizate apoi ca sonde marcate în diferite variante ale reacțiilor de hibridizare.

În ultima vreme există tendința ca substanțele radioactive să fie abandonate din cauza efectului lor nociv asupra experimentatorului și înlocuite cu marcarea enzimatică.

MARCAREA CHIMICĂ

În procesele de marcare chimică se utilizează cel mai adesea oligomarcarea, principiul fiind similar cu cel al marcării radioactive, cu deosebirea că nucleozid-trifosfatul marcat radioactiv este înlocuit cu un nucleozid-trifosfat marcat chimic. Marcarea chimică se realizează cel mai frecvent cu biotină sau digoxigenină.

Biotina se leagă printr-o structură de atașare, denumită spacer de uracilul dintr-un nucleozid-trifosfat. Acest braț de legare va ușura și legarea ulterioară a biotinei la sistemele de identificare.

Bio-UTP: Biotina-spacer-uracil-riboză-trifosfat

În mod normal, uracilul se înglobează numai în ARN, dar nu și în ADN. Pentru a fi totuși posibilă și marcarea ADN, sunt create structuri artificiale uracil-dezoxiriboză, care vor putea ulterior să facă parte dintr-o catenă ADN.

Bio-dUTP: Biotina-spacer-uracil-dezoxiriboză-trifosfat

Atât Bio-UTP cât și Bio-dUTP sunt derivate biotinate ale dezoxi-uridin-trifosfatului, respectiv ribo-uridin-trifosfatului și vor fi înglobate în ADN (în locul dezoxi-timidin-trifosfatului), respectiv în ARN.

Prezența biotinei poate fi detectată apoi prin legarea la compuși cu afinitate ridicată – avidina și streptavidina sau anticorpi specifici, marcați în prealabil cu substanțe care pot fi identificate ulterior.

Digoxigenina este un steroid izolat din Digitalis pupurea și Digitalis lanata. Deoarece florile și frunzele acestor plante sunt singurele surse naturale de digoxigenină (DIG), anticorpii anti-DIG nu se vor lega la alți compuși.

Digoxigenina se va lega în poziția 5 a unei uridine prin intermediul unei structuri de atașare – spacer, alcătuită din 11 atomi de carbon (Fig. 5.10).

Nucleotidele marcate cu DIG pot fi încorporate în probe de acizi nucleici de către ADN polimerază și totodată de către ARN polimerază și terminal transferază prin procese de: oligomarcare întâmplătoare (“random primed labelling”), translație prin tăiere (“nick translation”), PCR, marcarea terminală a lanțurilor ADN (“3’–end labelling/tailing”) sau transcriere in vitro.

Fragmentele hibridizate cu DIG pot fi detectate cu ajutorul anticorpilor cu afinitate ridicată – anticorpi anti -DIG care sunt conjugați cu fosfataza alcalină, peroxidaza, fluoresceina, rodamina sau particule coloidale de aur.

Figura 5.10 Digoxigenin-UTP /dUTP/ddUTP

Digoxigenin-UTP: R1=OH, R2=OH

Digoxigenin-dUTP: R1=OH, R2=H

Digoxigenin-ddUTP: R1=H, R2=H

Sensibilitatea procesului de detecție depinde de metoda utilizată pentru vizualizarea anticorpului anti-DIG conjugat. Dacă acesta este marcat cu fosfataza alcalină poate fi vizualizat:

– Colorimetric, în prezența substratului NBT – (Nitro-Blue Tetrazolium Chloride) și BCIP (5-Bromo-4-Chloro-3-Indolyphosphate p-Toluidine); acești reactivi reacționează cu fosfataza alcalină, formând un precipitat albastru-violet sau

– Fluorescent, în prezența HNPP (2-hydroxy-3-naphtoic acid-2-phenylanilide phosphate).

Un alt sistem de marcare chimică utilizează nucleotidele marcate cu fluoresceină (fluorescein-dUTP/UTP/ddUTP), care pot fi încorporate enzimatic într-o secvență de acid nucleic (Fig. 5.11).

Deoarece fluoresceina reprezintă un sistem de marcare direct, nu sunt necesare proceduri de vizualizare imunocitochimică, semnalul de fond fiind mai redus. Totuși această metodă prezintă un dezavantaj comparativ cu metodele indirecte și anume sensibilitatea mai redusă.

Nucleotidele marcate cu fluoresceină pot fi detectate și cu anticorpi anti-fluoresceină conjugați enzimatic, procesul având în acest caz o sensibilitate similară cu cea a metodelor indirecte.

Figura 5.11 Fluorescein-dUTP

5.2.1.4 APLICAȚII ALE TEHNICII SOUTHERN BLOTTING

Tehnica Southern permite localizarea în mod particular a unor fragmente ADN, dintr-un amestec complex, astfel că pot fi identificate gene sau fragmente anonime de ADN.

Pe baza acestei tehnici s-au dezvoltat markerii RFLP („Restriction Fragment Length Polymorphism”) care asigură investigații directe sau indirecte și datorită preciziei și versatilității au devenit un instrument indispensabil în domeniile identificării genelor și cartare, în diagnostic, criminalistică, filogenie și evoluționism.

Este posibilă de asemenea determinarea greutății moleculare a fragmentelor de restricție, detectarea prezenței unei secvențe ADN într-o probă, determinarea numărului de copii al unei secvențe ADN, evaluarea amprentei genetice a unui individ etc.

5.2.2. TEHNICA NORTHERN BLOTTING

Tehnica Northern Blotting a fost dezvoltată în anul 1977, de către James Alwine, David Kemp și George Stark, iar denumirea a fost dată prin analogie cu tehnica Southern, dezvoltată de un cercetător cu același nume.

În cazul aplicării acestei tehnici, care permite evaluarea nivelului de expresie a genelor în timpul diferențierii, morfogenezei sau în anumite condiții de mediu, sunt urmate aceleași etape ca la transferul Southern, cu câteva particularități date de caracteristicile moleculei ARN.

Astfel, fragmentele ARN sunt extrase, moleculele de ARNm sunt separate pe baza structurii lor specifice (capete poly(A)), după care sunt analizate prin electroforeză în gel de agaroză sau poliacrilamidă.

Nu este necesară secționarea cu enzime de restricție deoarece fragmentele analizate au dimensiuni reduse, corespunzătoare regiunilor codificatoare ale fiecărei gene.

Moleculele ARNm sunt oligonucleotide monocatenare care pot adopta diverse structuri secundare, care le măresc volumul. Pentru a preîntâmpina astfel de situații, gelul de electroforeză trebuie să asigure condiții denaturante.

Fragmentele ARN sunt apoi transferate pe membrane solide, fără a mai fi necesară denaturarea și fixate prin tratament termic sau cu radiații UV.

Etapele de hibridizare, marcare a sondelor moleculare și analiză a rezultatelor obținute se desfășoară după aceleași reguli ca cele de la transferul Southern.

APLICAȚII ALE TEHNICII NORTHERN BLOTTING

Tehnica Northern Blotting permite evaluarea expresiei unei anumite gene, în diferite țesuturi, organe, stadii de dezvoltare, în diferite condiții de stres, la atacul patogenilor sau în cursul unui tratament.

Tehnica poate fi de asemenea utilizată pentru a determina supra/sub expresia anumitor gene. Dacă expresia unei gene este accentuată („up-regulate”) se observă un semnal mai intens pe membrana hibridizată, în dreptul genei respective. Apoi, fragmentul ADN poate fi secvențializat, pentru a determina dacă reprezintă o genă cunoscută sau nu, prin comparare cu bazele de date existente în prezent.

Dacă se utilizează o singură sondă moleculară este posibilă determinarea aproximativă a dimensiunii produsului de transcriere maturat (ARNm), ceea ce furnizează informații cu privire la reglarea post-transcripțională a genei – modificări care au avut loc după transcripție.

5.2.3. TEHNICA WESTERN BLOTTING

Tehnica Western Blotting a fost dezvoltată de către George Stark, iar denumirea a fost introdusă de către W. Neal Burnette, în 1981, prin analogie cu tehnicile Southern și Northern.

În acest caz este posibilă detectarea unor proteine specifice într-un extract; proteinele, în formă nativă sau denaturată se separă prin electroforeză în funcție de lungimea lanțului polipeptidic, dacă se utilizează condiții denaturante sau de structura lor tridimensională, în condiții non-denaturante.

5.2.3.1. SEPARAREA PROTEINELOR

Proteinele extrase și purificate se separă prin electroforeză, în funcție de punctul izoelectric (pI), de greutatea moleculară, sarcina electrică sau de o combinație a acestor factori. Natura procesului de separare depinde de tratamentul la care au fost supuse probele de analizat sau de natura gelului.

Cele mai utilizate procedee utilizează geluri în care s-a adăugat SDS (dodecil-sulfat de sodiu), denumite și SDS-PAGE („SDS polyacrylamide gel electrophoresis”). În aceste condiții proteinele sunt menținute într-o formă denaturată, în care punțile disulfidice [S-S] sunt desfăcute.

SDS, adăugat atât în geluri cât și în probe asigură, pe lângă condițiile denaturante o încărcare uniform negativă a proteinelor, ceea ce permite în final separarea numai în funcție de greutatea lor moleculară.

5.2.3.2. TRANSFERUL PROTEINELOR DIN GEL, PE MEMBRANE SOLIDE

Pentru ca proteinele să poată fi accesibile detecției cu anticorpi, este necesar transferul lor pe membrane solide de nitroceluloză sau poliviniliden difluorură (PVDF), suporturi care au o afinitate uniformă pentru toate tipurile de proteine.

Transferul proteinelor din gel pe membrană poate fi realizat printr-o procedură de lucru similară cu cea descrisă anterior (Southern Blotting), prin capilaritate sau poate avea loc sub acțiunea unui câmp electric – electroblotting.

În acest fel fracțiile proteice analizate sunt transferate pe membrane în aceleași poziții în care se află în gel. Deoarece membranele utilizate au o mare afinitate pentru toate proteinele, inclusiv anticorpii este necesară blocarea acesteia imediat după transfer. Astfel, membrana se tratează cu o soluție diluată de proteine (albumină serică bovină – BSA sau lapte praf degresat), care se vor atașa uniform la membrană, în afară de pozițiile în care s-a legat proteina țintă. Acest tratament mărește precizia și claritatea rezultatelor și elimină rezultatele fals pozitive.

5.2.3.3. TRATAREA MEMBRANELOR CU ANTICORPI MARCAȚI ȘI IDENTIFICAREA PROTEINELOR ȚINTĂ

În continuare membrana pe care au fost transferate toate fracțiile proteice se pune în contact cu o soluție de anticorp, care se va lega specific la proteina țintă. Pentru a fi posibilă vizualizarea poziției în care s-a legat anticorpul este necesar ca acesta să fie marcat. Pot fi aplicate două strategii și anume: reacția într-o singură etapă sau în două etape.

Reacția într-o singură etapă necesită un singur anticorp marcat, care se va lega la proteina țintă și este vizualizat printr-un procedeu specific sistemului de marcare.

Reacția în două etape necesită doi anticorpi, dintre care numai unul este marcat. Primul anticorp se leagă la proteina țintă, atașată la membrană, după care este recunoscut de cel de-al doilea anticorp care a fost în prealabil marcat.

Reacția în două etape, deși necesită doi anticorpi este totuși mai ieftină comparativ cu cea într-o singură etapă deoarece cel de-al doilea anticorp marcat poate fi utilizat pentru un număr mare de reacții de identificare. Astfel, primul anticorp recunoaște foarte specific și se atașează la proteina țintă; cel de-al doilea anticorp marcat recunoaște o anumită regiune din primul anticorp, la care se atașează. Regiunea recunoscută de cel de-al doilea anticorp poate fi specifică speciei în care a fost produs anticorpul, deci specificitatea este foarte redusă. De exemplu, se poate utiliza același anticorp marcat pentru orice anticorp primar care a fost produs în cobai "antimouse".

Vizualizarea este specifică procedeului de marcare utilizat care poate fi colorimetric, chemiluminiscent, radioactiv sau fluorescent.

Un exemplu de marcare a anticorpilor este legarea fosfatazei alcaline. Prezența acestei enzime este evidențiată cu ajutorul p-nitro-fenil fosfatului, care este un substrat cromogen.

În urma interacțiunii dintre p-nitro-fenil-fosfat și fosfataza alcalină se formează p-nitrofenol, un produs solubil, de culoare galben intens care permite identificarea probelor pozitive. Dacă reacțiile se desfășoară în mediu lichid este posibilă determinarea cantitativă a proteinei la care s-a legat anticorpul marcat prin determinări spectofotometrice la lungimea de undă de 405 nm.

Fig. 5.12 Prezentarea schematică a tehnicii Western Blotting

A – Separarea prin SDS PAGE a amestecului proteic extras din proba de analizat;

B – Membrana de nitroceluloză, pe care sunt transferate, în aceleași poziții ca în gel, proteinele separate în funcție de dimensiuni;

C – Membrana de nitroceluloză după tratamentul cu anticorp marcat și substrat cromogen – apar semnale pozitive, sub forma unor benzi colorate, numai pentru probele care conțin proteina țintă.

5.2.3.4. APLICAȚII ALE TEHNICII WESTERN BLOTTING

Tehnica Western Bloting își găsește utilizări multiple în medicină, fiind produse kituri pentru confirmarea unor maladii, cum ar fi HIV, encefalită bovină spongiformă sau hepatită B.

De asemenea tehnica menționată poate conduce la identificarea prezenței oricărei proteine într-un preparat, cu condiția ca aceasta să fi fost izolată și purificată în prealabil, pentru a fi posibilă producerea anticorpilor specifici. Este posibilă și determinarea aproximativă a greutății moleculare, ceea ce furnizează informații cu privire la eventualele modificări postranslaționale ale proteinei.

5.2.4. HIBRIDIZAREA  IN  SITU

            Hibridizarea in situ este o metodă citogenetică directă de localizare a unui fragment specific de ADN pe cromozom.

Se utilizează sonde moleculare (fragmente ADN identificate și clonate în prealabil), care se leagă numai la acele regiuni cromozomale în care găsesc un grad înalt de similaritate a secvențelor.

Astfel, o secvență de ADN clonat (sondă moleculară) se hibridizează pe cromozomii prometafazici etalați pe o lamă microscopică, după ce au fost denaturați în prealabil (pentru ca moleculele ADN să devină monocatenare).

Sonda moleculară, marcată radioactiv (cu izotopi de tritiu), sau chimic, cu biotină sau digoxigenină (Dig), se va lega pe o regiune cromozomală complementară.

Dacă marcarea sondei moleculare a fost radioactivă, molecula hibridă poate fi localizată prin acoperirea preparatului cu o emulsie sensibilă la razele X. Poziția granulelor "radioactive" pe o anumită bandă cromozomică reflectă localizarea genei.

Dacă sondele sunt marcate cu biotină, moleculele hibride pot fi identificate cu molecule fluorescente, avidina și streptavidina. Dacă pentru marcare s-a utilizat digoxigenină (Dig), detecția se realizează cu anticorpi anti-DIG conjugați enzimatic. În cazul marcării chimice vizualizarea/

poziționarea semnalului fluorescent pe un anumit cromozom se realizează cu un microscop cu fluorescență, astfel că tehnica poartă numele FISH („Fluorescence in Situ Hibridization”) (Fig. 5.13).

Nivelul de rezoluție al localizării corespunde unei regiuni de 1-2 milioane bp din cromozomul metafazic. Rezoluția crește la 50-500 kb pentru fibrele de cromatină interfazică și la câteva kb pentru fibrele de cromatină alungite/întinse artificial (“fiber-FISH”).

APLICAȚII ALE TEHNICII FISH („Fluorescence în Situ Hibridization”)

Tehnica FISH are a o gamă largă de aplicații în biologia moleculară și în medicină, în investigațiile de diagnostic și mutații cromozomale, studii ale structurii și funcțiilor celulare și în experimentele de cartare.

În cercetările clinice tehnica FISH poate fi utilizată pentru diagnoza prenatală a aberațiilor cromozomale moștenite, diagnoza postnatală a bolilor genetice moștenite, a bolilor infecțioase, virale sau bacteriene, diagnoza citogenetică a tumorilor și detecția expresiei aberante a genelor.

În cercetările de laborator, tehnica FISH poate fi utilizată pentru cartarea genomului, studii de evoluție, analiza organizării și dinamicii nucleare, replicare, sortarea cromozomilor.

Recent, această tehnică a fost tot mai mult utilizată pentru stabilirea ordinii și poziției markerilor moleculari în regiunile cromozomale de interes – cartarea citogenetică.

Fig. 5.13. Identificarea prezenței pe cromozom a unei secvente specifice de ADN, prin tehnica FISH („Fluorescence in Situ Hibridization”)

5.2.5. TEHNICA MICROARRAY

Tehnica microarray este o tehnică modernă, care îmbină descoperiri atât din domeniul biologiei moleculare cât și al automaticii și informaticii, care permite identificarea prezenței anumitor gene, evaluarea expresiei genelor sau identificarea polimorfismului unei singure nucleotide (SNP).

Principiul unui experiment microarray, spre deosebire de analizele clasice Northern-blotting este următorul: ARNm dintr-o anumită linie celulară sau țesut este utilizat pentru a genera sonde marcate, denumite uneori “țintă” care sunt hibridizate în paralel cu un număr mare de secvențe ADN, imobilizate pe o suprafață solidă într-o distribuție ordonată.

Prin această metodă pot fi detectate și cuantificate simultan zeci de mii de specii de produși de transcriere. Pentru derularea unui astfel de experiment este necesară prezență unor suporturi, pe care se fixează sondele moleculare și a moleculelor ADN țintă, care au fost marcate în prealabil.

5.2.5.1. SONDELE MOLECULARE UTILIZATE ÎN MICROARRAY

În timp, suporturile pe care sunt imobilizate fragmentele au evoluat, pornind de la o membrană și ajungând în prezent la cip-uri.

Macrodispozitive ADN (DNA macroarray)

Macrodispozitivele ADN – membrane de hibridizare – sunt predecesoarele micro-dispozitivelor ADN și a chip-urilor ADN. În acest caz sonde provenite din biblioteci ADNc sunt stocate cu o densitate de câteva zeci/cm2 pe suporturi speciale (membrane de nylon), cu dimensiuni de 8×12 cm, pe care sunt fixate cu ajutorul iradierii UV. Secvențele țintă sunt molecule ADNc, marcate radioactiv cu 32P. Detecția produșilor de hibridizare se realizează prin autoradiografiere.

Microdispozitive ADN de sticlă (DNA microarray)

Microdispozitivele sunt constituite din lamele de sticlă, cu dimensiuni de 1,8 x 1,8 cm, pe care sunt fixate câteva mii de sonde, constituite din molecule ADNc sau clone EST (secvențe exprimate), care au fost secvențializate în prealabil. Secvențele țintă sunt molecule ADNc, marcate cu coloranți fluorescenți. Detecția produșilor de hibridizare are loc prin scanare cu un laser confocal.

Chip ADN („DNA chips”)

În ultimii ani tehnologia ADN microarray a avansat rapid, datorită posibilității de producere automatizată a unor chip-uri obținute din materiale speciale, care permit robotizarea. Chip-urile sunt lamele de sticlă sau silicon, acoperite cu expoxi-silan, amino-silan sau poliacrilamidă, care asigură legătura între suport și fragmentele ADN fixate.

Se pot diferenția două tipuri de investigații, în funcție de moleculele fixate pe suport: ADN complementar sau oligonucleotide. Materialul fixat pe suport poate fi asimilat cu termenul “sondă” care se utilizează în tehnica Northern blotting.

În cazul microarray ADNc sondele sunt reprezentate de produși obținuți în urma reacțiilor PCR generate de biblioteci ADNc sau colecții de clone, utilizând fie primeri specifici vectorului fie unor gene și sunt fixate pe suportul solid sub forma unor spoturi, în locații bine stabilite. Spoturile au dimensiuni de 100-300 µm și sunt așezate la o distanță egală unele de altele. Cu ajutorul acestei tehnici suportul (chip-ul) cuprinde mai mult de 30.000 de molecule ADNc.

În cazul microarray oligonucleotide, fragmente cu lungimi de 20-25 nucleotide se sintetizează și se fixează simultan pe suport. Acestea pot reprezenta 10.000 de gene diferite, cu câte 40-50 oligonucleotide/genă. Avantajul acestei metode constă în faptul că oferă o gamă foarte variată de molecule, fără a fi necesară manipularea ADNc. De asemenea, aceste sonde pot fi gândite astfel încât ele să reprezinte părți unice ale unui produs de transcriere, făcând posibilă detecția unor gene înrudite.

Deoarece oligonucleotidele scurte pot să conducă la hibridizări nespecifice și sensibilitate redusă, mai recent au fost dezvoltate tehnici care presupun fixarea pe suport a unor oligonucleotide mai lungi (50 –100 nucleotide), dar costul unor astfel de dispozitive este ridicat.

În prezent, produsele comerciale care se utilizează în aproape toate laboratoarele provin de la Compania Affymetrix, cu dimensiuni de 1,28 cm2 și au fixate un număr mai mare de 500.000 de sonde.

5.2.5.2. SECVENȚE ȚINTĂ UTILIZATE ÎN MICROARRY

În cazul în care se dorește investigarea genomului experimentele au ca obiect de studiu ADN, care poate fi utilizat ca atare.

Dacă studiile se îndreaptă spre evaluarea expresiei genelor, atunci este necesară sinteza ADNc, care reprezintă copia populației ARNm, prezentă la un moment dat în celule (capitolul 4.5).

Moleculele fluorescente cele mai utilizate pentru marcare sunt membri ai familiei cianinelor Cy3 și Cy5. După hibridizare semnalele sunt detectate utilizând un scanner fluorescent. Utilizarea a două substanțe fluorofore permite determinarea semnalelor de hibridizare de la două procese distincte, într-un singur experiment. O dată ce au fost obținute intensitățile fluorescenței, cea mai mare parte a muncii implică analiza datelor pentru a extrage informații interpretabile din punct de vedere biologic.

Scanerele actuale utilizează diferite tipuri de lasere care emit de obicei la 532 și 635 nm și filtre în domeniile (550-600 nm și 655-695 nm), pentru a elimina contaminarea de fond („background”).

Posibilitatea distingerii între două probe marcate cu coloranți diferiți permite analiza comparativă a două probe distincte.

5.2.5.3. ETAPELE UNEI TEHNICI DE INVESTIGARE MICROARRAY

Dacă secvențele țintă au fost marcate și chip-urile care au legate sondele moleculare de interes sunt disponibile, derularea unui experiment microarray presupune parcurgerea mai multor etape și anume:

Hibridizarea, care constă în introducerea secvențelor țintă marcate într-o cameră de hibridizare, în care se află cip-ul care are fixate sondele de interes, procesul având loc în condiții precizate de temperatură.

Spălarea secvențelor țintă în exces, pentru a evita obținerea unor rezultate false.

Scanarea cip-ului și identificarea spot-urilor la care s-au legat secvențele țintă marcate.

Achiziția imaginilor și analiza datelor obținute (Fig. 5.14).

Secvențele țintă, reprezentate de ADN sau ADNc sunt marcate fluorescent, pentru ca identificarea produșilor de hibridizare să fie posibilă.

Fig. 5.14 Etapele parcurse în cadrul unui experiment microarray

În figura de mai sus este prezentat un studiu de evaluare comparativă a genelor provenite din două probe diferite A și B.

ARN total a fost extras din ambele probe, s-a separat ARNm, după care a avut loc sinteza moleculelor ADNc. În fiecare probă va exista un set diferit de molecule ADNc, corespunzătoare genelor transcrise în celule, la momentul la care s-a efectuat extracția ARN.

Cele două seturi de molecule ADNc sunt marcate cu doi coloranți fluorescenți diferiți (A – verde și B – roșu), după care are loc hibridizarea.

Analiza datelor obținute va evidenția pe chip spoturi de culori diferite: roșu, pentru genele transcrise numai în proba B, verde pentru cele din proba A și galben pentru genele exprimate în ambele probe. Această analiză se poate realiza numai cu ajutorul unor soft-uri speciale, care convertesc informația preluată de pe chip (o suprafață de 1,28 cm2 care cuprinde câteva zeci sau sute de mii de spoturi) într-o imagine vizibilă cu ochiul liber. O astfel de imagine cuprinde un număr uriaș de informații, astfel ca poate fi analizată numai computerizat.

Rezultatul final permite analiza comparativă a datelor obținute, atât la nivel calitativ – care gene sunt exprimate și care nu, în anumite condiții, dar și la nivel semicantitativ – care gene prezintă supraexpresie sau subexpresie, deci care sunt activate respectiv represate în anumite condiții, în anumite țesuturi, organe etc.

5.2.5.4. APLICAȚII ALE TEHNICII MICROARRAY

Tehnica microarray are în prezent o gamă largă de aplicații, atât pentru analiza ADN cât și ARN.

Profilul expresiei genelor

În cadrul experimentelor care urmăresc profilul expresiei genelor este posibilă monitorizarea simultană a mii de gene pentru a determina efectul unui anumit tratament, al unei boli sau a unui stadiu de dezvoltare asupra procesului de transcriere. De exemplu este posibilă identificarea acelor gene a căror expresie este modificată ca răspuns la acțiunea patogenilor sau a altor organisme, prin compararea probelor extrase din țesuturi infectate și neinfectate.

Identificarea genelor (GeneID)

Atunci când se analizează probe ADN este posibilă detectarea prezenței unor gene în alimente și furaje, provenite din organisme modificate genetic (OMG), din micoplasme în culturile de celule sau de la anumiți patogeni care produc boli.

Detecția polimorfismului unei nucleotide (SNP)

Tehnica microarray permite identificarea polimorfismului unei singure nucleotide între alele, intra sau inter-populațional. Cele mai importante aplicații permit genotiparea, analizele criminalistice, determinarea predispoziției la o anumită boală, evaluarea mutațiilor, evaluarea heterozigoției sau analiza linkage-ului genetic.

Hibridizarea genomică comparativă

Dacă se analizează comparativ două probe ADN, provenite din organisme diferite sau țesuturi diferite ale aceluiași organism este posibilă identificarea genelor comune sau diferite, printr-o hibridizare genomică comparativă.

Imunoprecipitarea cromatinei

Secvențele ADN legate la o anumită proteină pot fi izolate prin imunoprecipitarea acelei proteine; aceste fragmente pot fi apoi hibridizate pe un chip, care permite determinarea situsului de legare al unei proteine în genom.

5.3. PROCESUL DE CLONARE A FRAGMENTELOR DE ADN

Prin clonare se înțelege producerea unor copii identice ale unei gene sau ale oricărui alt fragment de ADN. Metoda a fost aplicată pentru prima dată la începutul anilor ’70 și se bazează pe tehnologia ADN recombinat și anume legarea in vitro a două molecule de ADN, aparținând unor surse diferite (fragmentul ADN de interes și vectorul de clonare) și introducerea lor în celule vii, în care se vor replica.

La baza dezvoltării acestei metode a stat izolarea unor tulpini bacteriene E. coli, care nu au posibilitatea de a secționa moleculele de ADN străin. De asemenea, descoperirea enzimelor de restricție a contribuit mult la dezvoltarea domeniului.

Etapele unui proces de clonare sunt:

Pregătirea inserției – a fragmentului sau fragmentelor care urmează să fie clonate;

Pregătirea vectorului de clonare;

Formarea moleculelor ADN recombinat, în prezența ADN ligazei;

Introducerea moleculei de ADN recombinat în celule bacteriene gazdă.

Selecția bacteriilor eficient transformate.

Vectori de clonare

De-a lungul timpului au fost utilizate diferite tipuri de vectori, care permit clonarea unor fragmente cu lungimi diferite: plasmide (~10kb), bacteriofagi (9-23 kb), cosmide (~40 kb), BAC – Cromosomul Artificial Bacterian (~100-300 kb), YAC- Cromosomul Artificial de Drojdie (~ 500 kb până la 3 Mb). În funcție de scopul urmărit se alege un anumit tip de vectori, care asigură multiplicarea fragmentelor ADN inserate.

Din punct de vedere practic este avantajoasă utilizarea unor vectori care acceptă ca inserții fragmente mari de ADN, pentru că în acest fel probabilitatea ca gena, respectiv secvența de ADN de interes să fie prezentă într-o singură clonă este mai mare.

5.3.1. CLONAREA ÎN PLASMIDE

5.3.1.1 CARACTERISTICILE PLASMIDELOR CA VECTORI DE CLONARE

Plasmidele reprezintă clasa celor mai utilizați vectori de clonare. Acestea sunt molecule de ADN circular închise, cu dimensiuni cuprinse între 1 și 200 kb, prezente în mod natural în celulele bacteriene. Cele mai multe plasmide conțin gene de rezistență la diferite antibiotice, conferind această rezistență și celulelor bacteriene care le poartă.

Unele plasmide au replicarea cuplată cu cea a cromozomului bacterian, astfel încât în fiecare celulă bacteriană este prezentă una, sau cel mult câteva copii ale plasmidei. Alte tipuri însă au o replicare independentă, astfel încât în fiecare celulă bacteriană pot exista 10-200 de copii ale aceleiași plasmide.

Caracteristice naturale ale plasmidelor au fost exploatate în cadrul tehnologiei ADN recombinat, realizându-se plasmide artificiale, care pot să fie utilizate ca vectori de clonare.

Pentru a putea fi utilizată ca vector de clonare o plasmidă trebuie să îndeplinească următoarele condiții:

să fie relativ mică;

să posede o origine a replicării;

să posede una sau două gene marker, care să permită selecția bacteriilor eficient transformate;

să posede un singur loc de recunoaștere pentru una sau mai multe enzime de restricție într-o zonă care nu este importantă pentru replicare, care să fie utilizat ca situs de clonare; este preferabil ca situsul de clonare să fie amplasat în interiorul unei gene de selecție, astfel încât introducerea fragmentului de ADN străin să dezactiveze gena.

Genele marker pot să fie gene care conferă rezistență la anumite antibiotice sau care dau o reacție de culoare.

VECTORUL DE CLONARE pUC 19

O plasmidă reprezentativă pentru vectorii de clonare utilizați pentru clonarea unor fragmente mici de ADN (<10 kb) este pUC 19.

Vectorul pUC19 posedă o genă care-i conferă rezistență la ampicilină și o regiune a operonului lac, care reprezintă factori de selecție (Fig. 5.15). Totodată posedă o secvență care funcționează ca origine a replicării (rep), având rolul de a menține plasmida în celulele bacteriene. Acest vector are o replicare independentă de cea a cromozomului bacterian, ceea ce conduce la acumularea unor cantități mari de ADN plasmidial în celulele bacteriene.

În interiorul operonului lac a fost introdusă o oligonucleotidă (54bp), care conține 13 secvențe de recunoaștere unice pentru mai multe enzime de restricție, care pot să fie utilizate ca situsuri de clonare (MCS – Multiple Cloning Sites) (Fig. 5.16). Sunt de asemenea cunoscuți doi primeri M13 sens și M13 antisens, care pot fi utilizați în procesele de determinare a secvenței inserției prin metoda Sanger.

Fig. 5.15. Harta genetică a vectorului de clonare pUC 19

5' GTT GTAAAACGACGGCCAGT GAATTC GAGCTCGGTACCCGG GGATCC TCTAGA

GTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTTGGCGTAATCATG GTCATAGCTGTTTCCTG 3'

Fig. 5.16 Secvența multiplă de clonare a vectorului pUC 19

Fragmentul operonului lac din E. coli este alcătuit din gena structurală lacZ, responsabilă de sinteza -galactozidazei, gena lacI, responsabilă pentru sinteza represorului proteic și un segment denumit secvență multiplă de clonare (MCS). Aceasta conține secvențe de recunoaștere pentru un număr mare de endonucleaze de restricție, care pot funcționa ca situsuri de clonare.

Atunci când celulele bacteriene care poartă vectorul nemodificat sunt dezvoltate pe mediu care conține izopropil-tiogalactozidază (un inductor al operonului lac), represorul codificat de gena lac I este dezactivat, nu se mai poate lega la operator, astfel că fragmentul genei lac Z este transcris. Proteină rezultată se combină cu o proteină codificată de ADN-ul cromozomal, pentru a alcătui o formă hibridă activă a -galactozidazei. Dacă în mediu este prezent substratul cromogen 5-brom-4-clor-3-indolil–galactozidaza (X-gal), acesta este hidrolizat de către -galactozidaza hibridă, rezultând un produs albastru. Astfel, coloniile bacteriene care conțin vectorul nemodificat au culoare albastră.

Secvența multiplă de clonare este introdusă în interiorul fragmentului operonului lac, dar nu împiedică producerea -galactozidazei, datorită dimensiunilor mici pe care le are. Dacă într-unul dintre situsurile de clonare este introdusă însă o inserție de dimensiuni mai mari, operonul este dezactivat, iar enzima nu se mai produce. Coloniile bacteriene care conțin vectorul modificat au culoare albă.

Segmentul operonului lac, alături de gena care conferă rezistență la ampicilină reprezintă markeri de selecție importanți pentru identificarea celulelor bacteriene eficient transformate.

VECTORUL BAC – Cromosomul Artificial Bacterian

(Bacterial Artificial Chromosom)

Sistemul de clonare BAC se bazează pe factorul de fertilitate F prezent în E.coli. Plasmida F este o moleculă circulară de ADN, mult mai mică decât cromosomul bacterian, având o dimensiune de aproximativ 100kb. Atunci când este utilizată ca vector de clonare sunt eliminate porțiuni de ADN, care nu sunt esențiale pentru funcționare.

În anul 1992 a fost obținut vectorul de clonare pBAC 108L, iar în prezent este utilizat vectorul pBelo BAC II (Fig. 5.17) care are la bază plasmida F, în care a fost introdusă o oligonucleotidă sintetică. Vectorul astfel rezultat are dimensiuni de 7,5 kb și posedă proprietăți specifice plasmidei F și totodată caracteristici provenite de la fragmentul nou introdus.

De la plasmida F a fost preluată gena care îi conferă rezistență la cloramfenicol, genele ori S și rep E, care mediază replicarea unidirecțională și genele par A și par B, care mențin numărul de copii la una sau cel mult două într-o celulă bacteriană.

Oligonucleotida sintetică conține fragmentul operonului lac din E. coli și un segment denumit secvență multiplă de clonare (MCS). Aceasta conține secvențe de recunoaștere pentru un număr mare de endonucleaze de restricție, care pot funcționa ca situsuri de clonare.

Segmentul operonului lac, alături de gena care conferă rezistență la cloramfenicol reprezintă markeri de selecție importanți, utilizați la alcătuirea și caracterizarea bibliotecii de ADN.

Clonele obținute cu ajutorul vectorului BAC au o serie de caracteristici:

au o mare stabilitate în timp;

se mențin într-un număr foarte redus de copii în celulele bacteriene în care au fost introduse, scăzând astfel foarte mult posibilitatea apariției recombinărilor între inserții;

ADN-ul plasmidial poate fi izolat cu ușurință;

Dacă sunt clonate fragmente de dimensiuni mari, în cazul în care numărul de plasmide/celulă bacteriană ar fi ridicat există pericolul aparițiilor unor recombinări necontrolate. Astfel, ADN plasmidial care ar fi recuperat după clonare ar purta inserții cu secvențe diferite.

Pentru a preîntâmpina acest neajuns, atunci când se dorește clonarea unor fragmente de dimensiuni mare se utilizează întotdeauna vectori care se mențin într-o singură copie în fiecare celulă bacteriană.

VECTORI DE EXPRESIE

Vectorii de expresie sunt vectori de clonare care conțin secvențe suplimentare reprezentate de: un promotor inductibil, regiunea care codifică o secvență specifică pentru legarea ARNm pe cromosom și o secvență terminală. La sfârșitul regiunii care codifică secvența de legare pe cromozom este introdusă o secvență de recunoaștere pentru o anumită enzimă de restricție, care se utilizează ca situs de clonare (Fig. 5.17).

Utilizarea vectorilor de expresie are ca scop producerea unei proteine de interes de către o bacterie.

Fig. 5.17. Secvențele suplimentare prezente într-un vector de expresie – promotor și secvențe UTR – transcrise dar netraduse, cu rol în legarea ARNm la ribozom

Orice secvență care începe cu codonul start (AUG) poate fi plasată în poziția marcată de săgeată și va fi transcrisă în celulele bacteriene.

După obținerea moleculei de ADN recombinat, în care a fost inserat fragmentul ADN de interes, aceasta este introdusă în celule bacteriene cărora le-a fost indusă competența. În celulele transformate va fi sintetizată proteină care corespunde exact cu regiunea de codificare inserată.

Dacă este clonată secvența unei gene provenite de la un organism eucariot, pot să apară probleme deoarece bacteriile nu posedă tot mecanismul necesar eliminării intronilor și legării exonilor între ei. Din această cauză este indicat să fie clonată (introdusă într-un vector de exprimare) o moleculă de ADN complementar.

O altă tehnică este aceea de a insera secvența de codificare puțin după începutul unei secvențe care codifică o proteină bacteriană; în acest fel, după translație se produce o proteină hibridă și anume: regiunea N-terminală este constituită dintr-o porțiune de proteină bacteriană a cărei secvența a fost întreruptă, iar restul proteinei corespunde secvenței de codificare străine.

Această secvență N-terminală bacteriană este de obicei scurtă, rolul ei fiind acela de a proteja proteina hibridă împotriva unei eventuale degradări produse de bacterie sau poate constitui secvența semnal care să asigure secreția proteinei hibride în mediu.

VECTORI SPECIFICI PENTRU PRODUȘII DE AMPLIFICARE (PCR)

În capitolul 4.1.1.1 a fost prezentată proprietatea de transferază terminală a Taq polimerazei, aceea de adăugare a unei o grupări dezoxi-adeninfosfat (A) la capetele 3’.

Prezența acestei grupări poate fi exploatată în procesul de clonare denumit „TA”, în care se utilizează un vector de clonare cu o grupare dezoxi-timinfosfat (T) neîmperecheată, la capătul 3', care complementează dezoxi-adeninfosfatul (A) neîmperecheat al produsului PCR.

Un astfel de sistem de clonare este TOPO TA, un vector liniarizat, care permite inserarea directă a produșilor de PCR amplificați cu ajutorul Taq polimerazei, fără a fi necesare proceduri post PCR. Sistemul enzimatic utilizat pentru formarea legăturilor fosfodiesterice este topoizomeraza I.

Un alt sistem de clonare pentru produși PCR, care permite secvențializarea directă este sistemul pGEM.

Acest vector liniar permite clonarea unor produși PCR de dimensiuni mai mici de 1 kb și conține promotorii T7 și SP6 care flanchează regiunea de clonare multiplă. De asemenea are o genă de rezistență la ampicilină și o regiune a operonului lac, care ajută la selecția transformanților. Conține situsuri unice de recunoaștere pentru 16 enzime de restricție și de asemenea cei doi primeri M13 sens și M13 antisens, care pot fi utilizați în procesele de determinare a secvenței inserției prin metoda Sanger (Fig. 5.19).

Fig. 5.19 Harta vectorului pGEM (A) și secvența multiplă de clonare

Catena superioară corespunde moleculei ARN sintetizată de catre

ARN polimeraza T7

Catena inferioarăcorespunde moleculei ARN sintetizată de către

ARN polimeraza SP6

Vectorul prezentat permite deci clonarea produșilor PCR prin sistemul T/A, deoarece posedă situsul de inserție corespunzător; poate funcționa ca un un vector de expresie, deoarece are în structura sa doi promotori și totodată poate fi utilizat în secvențializare pentru că posedă cei doi primeri specifici M13, sens și antisens.

5.3.1.2 ETAPELE PROCESULUI DE CLONARE ÎN PLASMIDE

Clonarea în plasmide presupune parcurgerea etapelor specifice pentru orice proces de clonare, care presupune formarea moleculelor de ADN recombinat, introducerea acestora în celule bacteriene pregătite în prealabil și selecția clonelor care conțin fragmentele de interes.

A. FORMAREA MOLECULELOR DE ADN RECOMBINAT

În principiu, clonarea în plasmide este foarte facilă. Într-o primă etapă vectorul este secționat cu o enzimă de restricție și legat în vitro cu un alt fragment de ADN. În reacția de recombinare poate să fie introdus unul sau mai multe fragmente ADN pentru care se dorește multiplicarea.

Legarea se realizează în prezența ADN ligazei, care are capacitatea de a reface legături fosfodiesterice între o grupare OH aflată la un capăt 3’ și o grupare fosfat aflată la un capăt 5’ al unui fragment ADN. Pentru a fi posibilă desfășurarea unor astfel de reacții este necesar ca ambele tipuri de ADN, atât vectorul cât și fragmentele de interes să aibă capete compatibile.

Fragmentele ADN au capete compatibile fie dacă au rezultat în urma secționării cu aceiași enzimă de restricție (în cazul în care enzimele utilizate generează capete coezive) fie au fost secționate cu enzime diferite, care generează capete netede.

În cazul în care fragmentele care urmează să fie legate nu au capete compatibile, este posibilă sinteza acestora cu ajutorul ADN polimerazelor specifice (capitolul 4.3.2).

Pentru a mări specificitatea reacțiilor, de obicei se realizează secționări cu enzime de restricție care generează capete coezive, atât pentru vector cât și pentru fragmentul/fragmentele de clonat. Astfel, reacția de ligare are loc cu ușurință, generându-se molecule ADN recombinat – alcătuite din vectorul de clonare, care a inclus un fragment de ADN străin (Fig. 5.20).

Fig. 5.20 Formarea moleculelor ADN recombinat

Atât vectorul, cât și moleculele ADN au fost secționate cu aceiași enzimă de restricție (EcoR I), care a generat capete coezive complementare, fiind astfel posibilă apropierea fragmentelor, formarea legăturilor de hidrogen între bazele complementare și apoi refacerea legăturilor fosfodiesterice în prezența ADN ligazei.

Una dintre problemele majore care apare în cazul clonării în plasmide este recircularizarea acestora fără a include fragmentul ADN străin. Acest proces poate fi limitat prin ajustarea concentrațiilor de ADN străin și vector, în timpul reacției de ligare sau prin tratarea vectorului secționat cu fosfatază.

În timpul legării celor două molecule, ADN ligaza catalizează formarea unei legături fosfodiesterice între două nucleotide adiacente numai dacă una dintre nucleotide posedă o grupare fosfat la capătul 5’ iar cealaltă o grupare OH la un capăt 3’.

Recircularizarea plasmidei poate fi împiedicată dacă gruparea 5’ fosfat este îndepărtată de la ambele capete ale ADN plasmidial liniarizat, utilizând fosfataza alcalină bacteriană.

Ca rezultat, nici una dintre catenele duplexului nu mai poate forma o legătură fosfodiesterică. Totuși, segmentul de ADN străin, care posedă o grupare fosfat la capătul 5’ poate fi legat eficient cu plasmida defosforilată, rezultând o moleculă circulară (Fig. 5.21).

Moleculele de ADN recombinat formate în urma reacției de ligare sunt introduse apoi în celule bacteriene în vederea multiplicării, proces care poartă numele de transformare.

În procesele de transformare se utilizează tulpini bacteriene selecționate, care nu au capacitatea de a distruge ADN străin pătruns în celule. Totodată din aceste celule au fost îndepărtate toate plasmidele naturale, astfel încât, în urma transformării să se regăsească numai moleculă de ADN recombinat nou introdusă.

Celulelor bacteriene care vor fi utilizate în reacția de transformare trebuie să li se fi indus în prealabil competența, adică învelișul lor celular să fie permeabilizat, astfel încât să permită pătrunderea ADN străin.

B. INTRODUCEREA MOLECULEI DE ADN RECOMBINANT ÎN CELULE BACTERIENE GAZDĂ

Moleculele de ADN recombinat se introduc într-o celulă gazdă, care devine tranzitoriu acceptoare de ADN străin. Se pot utiliza în acest scop bacteriile (E. coli), drojdiile (Saccharomices cerevisiae) sau culturile de celule (linii celulare CHO – Chinese hamster ovary), care îndeplinesc condițiile necesare: să aibă o rată de multiplicare ridicată, să prezinte susceptibilitate pentru vector și să prezinte un balast proteic minim.

Cel mai des sunt utilizate tulpini speciale E. coli naturale (E. Coli DH 10B sau E.coli HB 104) care au o rată de multiplicare ridicată.

Cu cât celula gazdă este mai prolifică, cu atât se obțin cantități mai mari de ADN recombinat, conducând la sinteza de copii ADN identice fragmentului genic înserat. Pornind de la o singură moleculă se poate ajunge la 1012copii de ADN recombinat.

PREPARAREA CELULELOR COMPETENTE E. coli

Susceptibilitatea celulelor bacteriene față de vector, sau competența se induce artificial prin metode specifice procedurii utilizate la transformare. Dacă celulele competente vor fi transformate prin metoda șocului termic, este necesară permeabilizarea lor, prin crearea unor pori în membrană, cu ajutorul CaCl2. În cazul în care, pentru transformare se va utiliza electroporarea nu este necesară o permeabilizare prealabilă, ci numai o îndepărtare a urmelor de săruri provenite de la mediul de cultură, în scopul evitării formării unor arcuri electrice.

În condiții ideale, diviziunea bacteriei E. coli se produce exponențial, rata de creștere depinzând de mediul de cultură, de genotipul bacteriei, de temperatură și de gradul de aerare.

Dacă densitatea culturii crește, rata diviziunii descrește. În momentul în care cultura bacteriană atinge o anumită concentrație – valoarea de saturație, diviziunea este oprită, dar bacteriile sunt încă viabile.

Rata de multiplicare este urmărită prin măsurarea periodică a densității optice la o lungime de undă de 600 nm. Relația dintre densitatea optică și numărul de celule variază de la o tulpină la alta și este recomandabil să se alcătuiască curbe de calibrare care să reflecte această relație.

Pentru a obține celule competente care dau o rată mare de transformare este necesar ca în cultura bacteriană numărul de celule să fie de 5×107 celule/ml. Din curba de calibrare se poate determina densitatea optică corespunzătoare acestui număr de celule, pentru fiecare tulpină bacteriană în parte.

În mod practic densitatea optică se măsoară din timp în timp, iar dezvoltarea se oprește atunci când aceasta a atins valoarea corespunzătoare numărului de 5×107 celule/ml, pentru tulpina bacteriană cu care se lucrează.

După ce celulele bacteriene au fost pregătite, are loc introducerea moleculelor de ADN recombinat în acestea, proces care poartă numele de transformare.

În cazul în care vectorul de clonare a fost o plasmidă, sau plasmida specială BAC, transformarea poate avea loc prin șoc termic sau prin electroporare. În urma procesului de transformare moleculele de ADN recombinat ajunse în celulele bacteriene au o replicare corelată, respectiv independentă față de cea replicarea bacteriană.

Cultura bacteriană rezultată în urma transformării se cultivă pe mediu de cultură solid suplimentat cu factorii de selecție potriviți.

Fiecare celulă eficient transformată va generă un ansamblu de celule care poartă numele de clonă. Deci, fiecare colonie care se dezvoltă pe mediul de cultură solid este o clonă, în care toate celulele poartă același tip de ADN recombinat (Fig. 5.22).

Fig. 5.22. Transformarea celulelor bacteriene și selecția bacteriilor eficient transformate

C. SELECȚIA CLONELOR OBȚINUTE

Cultivarea pe medii suplimentate cu factori de selecție permite numai dezvoltarea celulelor care au fost eficient transformate (care conțin vectorul de clonare purtător al genelor de selecție).

În continuare este necesară identificarea acelor clone care conțin moleculele de ADN recombinat și cele care conțin vectorul recircularizat. Această selecție se realizează de obicei pe baza testării rezistenței la anumite antibiotice sau prin apariția unor reacții de culoare. De cele mai multe ori se realizează pe baza reacției de culoare, în prezența substratului X-gal (5-brom-4-clor-3-indolil–galactozidaza). Astfel, vor fi analizate în continuare numai acele clone care au generat colonii de culoare albă. Clonele care au generat colonii albastre conțin vectorul recircularizat, neavând importanță din punctul de vedere al procesului de clonare.

Apoi este necesară selectarea acelor clone care conțin ADN recombinat purtător al unei secvențe ADN de interes. În acest scop pot fi aplicate mai multe metode.

5.3.1.3 TESTAREA CLONELOR EFICIENT TRANSFORMATE

Pentru a fi posibilă testarea cu ajutorul sondelor moleculare este necesară obținerea unor suporturi solide (membrane de nylon sau nitroceluloză) care să aibă fixate pe ele ADN plasmidial corespunzător tuturor clonelor care urmează a fi testate, sub formă denaturată (Fig. 5.23).

Testarea imunologică

Testarea imunologică poate fi aplicată atunci când sunt folosiți la clonare vectori de exprimare.

În acest caz biblioteca ADN conține clone care au ca inserții molecule de ADN complementar. Având în vedere că s-au utilizat vectori de expresie, în cultura bacteriană trebuie să fie prezentă proteina codificată de gena care a fost clonată.

Procesul de testare este asemănător cu cel care utilizează sonde moleculare și presupune parcurgerea mai multor etape (Fig. 5.24).

În primul rând cultura de clone este acoperită cu o membrană de nylon, pe care rămân fixate coloniile bacteriene.

Prin metode specifice are loc o extracție și o fixare a proteinelor din celulele bacteriene direct pe membrană (inclusiv proteina de interes).

Apoi, membrana este incubată cu un anticorp specific, care se va lega selectiv la proteina de interes. După spălarea anticorpului care nu s-a legat la proteina țintă, membrana este incubată cu cel de-al doilea anticorp, care prezintă afinitate pentru primul anticorp folosit și a fost marcat în prealabil.

În urma examinării membranei se poate evidenția exact poziția coloniei bacteriene care a sintetizat proteina de interes, deci cea care posedă ca inserție a vectorului de clonare gena căutată.

Fig. 5.23 Identificarea clonelor care posedă ca inserție fragmente ADN complementare cu sondele moleculare

5.3.2. CLONAREA ÎN BACTERIOFAGI

Posibilitatea urmării ciclului lizogenic al bacteriofagilor a fost exploatată pentru utilizarea acestora în tehnologia ADN recombinat.

Astfel au fost obținuți mutanți ai bacteriofagului λ care posedă toate proprietățile pentru a putea fi folosiți ca vectori de clonare. Utilizarea bacteriofagului λ în procesul de clonare implică următoarele etape:

ADN vectorului este secționat cu o enzimă de restricție potrivită;

Capetele vectorului sunt legate cu fragmentele de ADN străin (este necesar ca fragmentele care urmează să fie legate să posede capete compatibile);

ADN recombinat este împachetat în vitro într-o particulă de bacteriofag viabilă care poate infecta celulele bacteriene.

Dezavantajul utilizării ADN fagic ca vector de clonare este că în acest caz pot fi introduse fragmente foarte mici de ADN. Introducerea unor fragmente mai mari împiedică împachetarea ADN în „capul” bacteriofagului.

Din acest motiv se practică o altă metodă și anume eliminarea unei părți de ADN din genomul bacteriofagului astfel încât să nu fie perturbată posibilitatea de împachetare și infectare. În urma acestor modificări, capetele coezive (cos) ale ADN fagic trebuie să rămână nealterate, deoarece sunt implicate în împachetarea noilor particule virale. Apoi, genomul modificat al bacteriofagului este secționat cu o enzimă de restricție.

În paralel ADN care urmează a fi clonat este secționat cu aceiași enzimă de restricție, după care sunt separate fragmentele care au o lungime de aproximativ 20 kb.

Fragmentele rezultate în urma secționării cu aceiași enzimă de restricție a vectorului și a fragmentelor cu lungimea de 20 kb din ADN de clonat sunt puse în contact, în prezența ADN ligazei.

În continuare pot fi urmate două căi (Fig. 5.25):

Unirea fragmentelor inițiale ale genomului bacteriofagului, conducând la formarea unei catene de ADN cu o lungime egală cu 72% din lungimea genomului normal (nemodificat); această lungime este prea mică pentru a permite împachetarea într-o particulă de bacteriofag.

Pot fi împachetate numai fragmente cu o lungime cuprinsă între 75 și 105% dintr-un genom normal.

Introducerea unei inserții potrivite (10-25 kb) între cele două capete ale ADN al bacteriofagului, care conduce la formarea unei molecule cu o lungime potrivită, care poate fi împachetată.

Aproape toate particulele λ formate în acest fel vor conține ca inserție fragmentul de ADN străin.

Fig. 5.25 Etapele procesului de obținere a ADN recombinat, în cazul clonării în bacteriogfagi

După ce a fost manipulată molecula ADN recombinat, aceasta este împachetată în vitro într-o particulă fagică, care are posibilitatea de a infecta celulele bacteriene.

Se cunoaște că acțiunea de infectare are loc după următorul mecanism: fagul se prinde cu cele șase fibre proteice codale și cu placa terminală de suprafața celulei bacteriene, după care cilindrul cozii se contractă și partea sa interioară pătrunde întocmai ca un ac de seringă, ADN fagic fiind injectat în celula gazdă.

După pătrunderea în celula gazdă este urmat ciclul lizogenic, adică ADN provenit de la bacteriofag este inserat în cromozomul bacterian, fiind menținut în populația celulelor bacteriene o dată cu replicarea ADN bacterian.

Avantajul clonării cu ajutorul bacteriofagilor este că introducerea moleculei de ADN recombinat în celule se realizează mai ușor decât în cazul plasmidelor, nefiind necesară inducerea competenței pentru celulele gazdă.

Dezavantajele acestui procedeu sunt reprezentate de lungimea relativ redusă a fragmentelor care pot fi clonate (25 kb) și de faptul că fragmentul de ADN străin se regăsește ca parte a cromozomului bacterian. De aceea, atunci când se dorește analizarea fragmentelor clonate este necesară izolarea ADN cromozomal bacterian și apoi separarea fragmentelor provenite din genomul bacterian de cele care au fost introduse în mod artificial.

5.3.3. CLONAREA ÎN COSMIDE

Cosmidele reprezintă un alt tip de vectori de clonare, care sunt hibrizi între plasmide și bacteriofagi, permițând clonarea unor fragmente cu lungimi de până la 40 kb. Au fost construite pentru prima dată în anul 1978.

Cosmidele sunt structuri artificiale care conțin:

O genă care le conferă rezistență la un antibiotic și o origine a replicării, preluate de la plasmide;

Unul sau mai multe locuri de recunoaștere pentru enzime de restricție;

Capetele coezive ale bacteriofagului λ (capetele cos), care permit împachetarea moleculei ADN hibride într-o particulă fagică.

Caracteristica esențială a acestui vector este că produce infecția ca un bacteriofag, adică direct, fără a necesita procese de pregătire prealabilă a celulelor bacteriene și se menține apoi în celulele bacteriene ca o plasmidă.

5.3.4. UTILIZAREA TEHNOLOGIEI ADN RECOMBINAT ÎN PRODUCEREA INSULINEI

În perioada 1963-1965, trei grupe de cercetători (americani, germani și chinezi) au reușit sinteza artificială a insulinei prin intermediul a 170 de reacții chimice, lucru ce făcea imposibilă producerea insulinei pe cale industrială.

Noile tehnologii industriale de obținere a insulinei umane au fost posibile odată cu identificarea genei insulinei (anul 1980) și crearea moleculelor recombinate de ADN, utilizând o plasmida ca vector de clonare. Insulina este o proteină mică, cu masa de 5734 daltoni și cuprinde 51 resturi aminioacidice. Este alcătuită din două lanțuri, un lanț A (cu 21 resturi aminoacidice) și unul B (cu 30 resturi aminoacidice) legate prin două punți disulfurice (A7-B7 și A20-B19); o a treia legătură disulfurică leagă restul Cys-A6 cu Cys-A11.

În procesul de clonare, segmente de gene corespunzătoare lanțurilor mature de insulină A și B sunt introduse în plasmide diferite, care prezintă rezistență la un antibiotic și gena structural β-gal ca markeri.

Plasmidele sunt transferate separat în E. coli. În cultura de bacteriană, în prezența antibioticului de selecție se dezvoltă numai acele celule bacteriene care au fost eficient transformate. Inducția expresiei β-gal (prin adăugarea de β-galactoză) determină exprimarea genelor pentru insulină, care sunt transcrise și traduse în celulele bacteriene. Lanțurile insulinice sunt extrase din celulele bacteriene după care sunt puse în contact, formându-se insulina activă biologic (Fig. 5.26).

Datorită utilizării tehnologiei ADN recombinant, se obțin aproximativ 200 grame de insulină de pe 1 m3 de mediu de cultură, adică tot atât cât se poate extrage din aproape 1600 kg de pancreas de bou sau porc.

Insulina umană este singura proteină animală produsă în bacterii pentru care structura este absolut identică cu cea a moleculei naturale.

Inițial au apărut unele probleme cauzate de contaminarea produșilor finali cu celule bacteriene, care prezentau un risc de îmbolnăvire pentru pacienți, problemă care a fost rezolvată prin introducerea unor procedee avansate de purificare. În prezent insulina este produsă în drojdii, care secretă o moleculă cu o structură tridimensională perfectă, care nu mai necesită operațiuni costisitoare de purificare avansată.

Probele clinice efectuate cu insulina umană, produsă prin tehnici de inginerie genică, au demonstrat că ea nu are efecte secundare și că poate fi comercializată, adică folosită la tratarea bolnavilor de diabet (din 1982 în SUA și din 1983 în Marea Britanie).

5.26. Procesul de producere a insulinei prin tehnologia ADN recombinant

5.4. ALCĂTUIREA BIBLIOTECILOR ADN

Bibliotecile ADN sunt colecții de clone care au ca inserții fragmente ADN genomic sau complementar, care pot fi menținute în condiții specile și care pot fi multiplicate în funcție de necesități.

5.4.1. BIBLIOTECILE ADN GENOMIC

Bibliotecile de ADN genomic conțin câteva zeci de mii de clone, fiecare dintre acestea având ca inserție un fragment din ADN genomic. Având în vedere că procesul de clonare are loc la întâmplare este posibil ca unele fragmente să fie prezente în mai multe clone, iar altele să nu fie reprezentate, dar în general inserțiile clonelor sunt diferite. Pentru a fi siguri că a fost acoperit tot genomul, deci probabilitatea de a exista fragmente nereprezentate să fie foarte mică este necesar ca suma inserțiilor tuturor clonelor să fie de aproximativ 7 ori mai mare decât dimensiunea genomului

5.4.1.1. OBȚINEREA BIBLIOTECILOR GENOMICE

Bibliotecile genomice se obțin prin procedee clasice de clonare, cu unele caracteristici specifice. Este necesară existența unei surse de ADN genomic pentru specia de interes și un vector de clonare care să-i confere următoarele caracteristici:

clonele care o alcătuiesc să fie stabile, pentru a putea fi utilizate un timp îndelungat;

să aibă dimensiunile inserțiilor suficient de mari, astfel încât un număr cât mai mic de clone să acopere fragmente cât mai mari din genom;

ADN-ul plasmidial să poată fi izolat și purificat cu ușurință, pentru a simplifica procesele de analiză a clonelor;

Există mai multe sisteme de clonare care îndeplinesc aceste condiții, și anume cromozomul artificial de drojdie – YAC și cromozomul artificial bacterian – BAC. Acesta din urmă este cel mai mult utilizat pentru producerea de biblioteci genomice.

În alcătuirea bibliotecii genomice se parcurg mai multe etape și anume (Fig. 5.27):

Izolarea nucleilor intacți;

Extracția ADN genomic din nuclei prin liza învelișului nuclear.

Este necesară aplicarea unei proceduri speciale de extracție a ADN pentru că în cazul metodelor uzuale de extracție și purificare a ADN genomic, din cauza secționărilor mecanice care apar în timpul diferitelor etape de lucru se obțin fragmente ADN cu dimensiuni relativ reduse (100 -200 kb).

Secționarea parțială a ADN genomic cu o endonucleaza de restricție.

Este necesară secționarea parțială a ADN genomic, pentru ca fragmentele care se vor regăsi ca inserții în clonele bibliotecii de genomice să se suprapună pe anumite porțiuni. Astfel, va fi posibilă alcătuirea hărților fizice prin identificarea clonelor cu inserții suprapuse.

Separarea prin electroforeză în câmp electric pulsatoriu (PFGE – pulsed field gel electroforesis) și izolarea porțiunii de gel care conține fragmentele de ADN cu dimensiuni cuprinse între 200 și 500kb;

Sunt selectate fragmentele cu lungimi mari (200-500 kb), deoarece în cazul introducerii în reacția de ligare a unui amestec cu fragmente de diferite dimensiuni, includerea fragmentelor mici în moleculele de ADN recombinat este favorizată din punct de vedere energetic.

În cazul construirii bibliotecilor genomice se dorește obținerea unor clone cu inserții mari, care să asigure acoperirea întregului genom.

Secționarea vectorului de clonare cu aceiași enzimă de restricție, care trebuie să posede un situs de recunoaștere unic, plasat în secvența multiplă de clonare (MCS);

Obținerea ADN-ului recombinat prin punerea în contact a vectorului de clonare și a fragmentelor de ADN genomic, ambele secționate cu aceiași endonuclează de restricție, în prezența ADN ligazei. Între cele două tipuri de fragmente se formează legături fosfodiesterice, datorită existenței capetelor coezive.

Electroporarea, adică introducerea moleculelor de ADN recombinat în celule bacteriene electrocompetente, cărora li s-a indus în prealabil competența;

Selecția coloniilor bacteriene eficient transformate pe baza rezistenței la antibioticul specific;

Selecția coloniilor bacteriene care conțin ADN recombinat, pe baza reacției de culoare.

Având în vedere că noțiunea de clonă definește ansamblul de celule care provin de la o celulă unică, se consideră că fiecare colonie albă reprezintă o clonă BAC, constituită din celule bacteriene E. coli, care posedă același tip de ADN recombinat.

În general se selectează un număr de 30-40.000 de clone, care sunt transferate pe plăci speciale, distribuite pe rânduri și coloane și alcătuiesc biblioteca genomică.

Fig. 5.27 Etapele principale de alcătuire a unei biblioteci genomice

5.4.1.2 TRANSFERUL CLONELOR BAC CARE ALCĂTUIESC BIBLIOTECA GENOMICĂ PE SUPORTURI SOLIDE

Pentru ca biblioteca genomică să poată fi analizată în continuare este necesar ca toate clonele care o alcătuiesc să fie transferate pe suporturi solide – membrane de nylon. Acestea sunt transferate cu ajutorul unor roboți speciali, pentru a asigura o distribuție foarte ordonată.

De exemplu, în cazul unei biblioteci ADN, pe o membrană cu dimensiunile de 8×12 cm sunt transferate 1536 de clone, aranjate în 384 de careuri (3x3mm), dispuse în 24 coloane și 16 rânduri. Fiecare clonă se aplică în două spoturi dispuse simetric în cadrul careului, conform schemei de mai jos (Fig.5.28). Astfel, în fiecare careu sunt prezente patru clone BAC diferite.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24

A

B

C

D

E

G

H

I

J

K

L

M

N

O

P

Fig. 5.28 Distribuția clonelor BAC pe membrana cu numărul (1-4), din biblioteca genomică

Literele (A,B,C..P) reprezintă simbolul liniei iar cifrele (1,2,…. 24) simbolul coloanei de pe placa de pe care provin clonele BAC. In careul corespunzător poziției C 12 a fost prezentată distribuția celor 4 clone BAC care îl alcătuiesc. Prima cifră din codul fiecărei clone BAC reprezintă numărul plăcii de pe care aceasta provine ( în acest caz 1, 2, 3 sau 4).

5.4.1.3 CARACTERIZAREA BIBLIOTECII GENOMICE

O bibliotecă genomică conține deci 30- 40.000 de clone BAC, cu o dimensiune medie a inserțiilor de aproximativ 100 – 150 kb.

Dimensiunile însumate ale inserțiilor clonelor trebuie să depășească de 5-7 ori genomul speciei, pentru a fi siguri că fiecare fragment de ADN genomic este prezent în cel puțin o clonă.

Deoarece ADN genomic a fost secționat parțial, cel mai probabil este ca fragmentele de ADN care alcătuiesc inserțiile clonelor BAC să se suprapună în anumite porțiuni. Având în vedere că procesul de clonare este statistic, există posibilitatea ca unele fragmente de ADN să nu fie regăsite ca inserții ale clonelor BAC iar altele să fie prezente în mai multe clone.

În cazul în care se alcătuiesc biblioteci genomice ale plantelor superioare, trebuie să se țină cont de faptul că acestea dețin o cantitate mare de ADN repetitiv, care nu se exprimă dar care produc o cantitate mare de fragmente de restricție.

Pentru a depăși acest inconvenient se utilizează enzime de restricție sensibile la metilare, deoarece regiunile transcrise sunt mult mai puțin metilate decât regiunile cu secvențe repetitive.

O enzimă precum Pst I va genera fragmente foarte mari în regiunile repetate metilate, fragmente care nu pot fi clonate și/sau amplificate și fragmente de mărimi medii în regiunile care conțin gene sau secvențe moderat repetate.

5.4.2. BIBLIOTECILE ADN complementar (ADNc)

O bibliotecă ADN complementar reprezintă o colecție de clone, care

au ca inserții moleculele de ADN complementar (ADNc) corespunzătoare populației de ARNm existentă la un moment dat în celule.

O astfel de bibliotecă cuprinde numai informația pură, formată numai din secvențe de exoni. Spre deosebire de bibliotecă de ADN genomic, care rezultă din clonarea fragmentelor de ADN originare direct din genom, fragmentele ADNc se sintetizează artificial în laborator, pe o moleculă de ARN mesager matur, ca o copie complementară (capitolul 4.5).

În timp ce clonele de ADN genomic sunt identice pentru toate celulele aceluiași organism, clonele ADNc sunt specifice țesutului, stadiului de dezvoltare, condițiilor de mediu etc. Prin urmare, atunci când se alcătuiește o bibliotecă ADNc, trebuie să se țină seama de aspectele menționate, iar alegerea materialului să se realizeze în funcție de scopul urmărit.

De exemplu, dacă se dorește evaluarea expresiei genelor în condiții de stres, este necesară alcătuirea a două biblioteci ADNc. Una va proveni din ARNm al lotului control, iar cea de-a doua de la un lot supus factorilor de stres.

5.4.2.1. OBȚINEREA BIBLIOTECILOR ADNc

Pentru obținerea bibliotecilor ADNc, prima etapă este extracția ARN, separarea ARNm, după care are clonarea, urmând toate etapele specifice acestui proces, cu câteva particularități datorate structurii moleculelor de ADNc.

Ca vectori de clonare se aleg în general plasmidele sau vectorii de expresie. Având în vedere că fragmentele clonate sunt gene, secvențe codante de ADN, este posibilă alegerea unor vectori de expresie atunci când scopul nu este numai multiplicarea ADN, ci și producerea de proteine.

În procesul de clonare nu mai este necesară secționarea moleculelor de ADN, deoarece populația de ADNc este alcătuită din fragmente cu dimensiuni mici. Dar, pentru a mări eficiența procesului de formare a moleculelor de ADN recombinat, ADNc este prelucrat suplimentar, după cum urmează:

Metilarea moleculelor de ADNc, pentru a le proteja împotriva secționării cu enzime de restricție;

La capetele moleculelor ADNc se leagă fragmente de ADN denumite adaptoare cu situs de restricție („Restriction site linker”) care sunt oligonucleotide care conțin în secvența lor un situs de recunoaștere al unei enzime;

Fragmentele ADNc modificate, sunt secționate cu enzima de restricție al cărui situs se află în adaptori;

Vectorul de clonare este secționat cu aceiași enzimă de restricție;

Obținerea moleculelor ADN recombinat prin punerea în contact a vectorului de clonare și a fragmentelor de ADN genomic, ambele secționate cu aceiași endonuclează de restricție, în prezența ADN ligazei. Între cele două tipuri de fragmente se formează legături fosfodiesterice, datorită existenței capetelor coezive.

Transformarea, adică introducerea moleculelor de ADN recombinat în celule bacteriene, cărora li s-a indus în prealabil competența;

Selecția coloniilor bacteriene eficient transformate pe baza rezistenței la antibioticul specific;

Selecția coloniilor bacteriene care conțin ADN recombinat, pe baza reacției de culoare.

Dintre coloniile bacteriene, care reprezintă fiecare o clonă este selectat un număr de 106-107, care sunt transferate pe membrane solide, după un procedeu similar cu cel aplicat în cazul bibliotecii ADN genomic.

Fig. 5.29 Etapele procesului de clonare a moleculelor de ADNc

5.4.2.2. CARACTERIZAREA BIBLIOTECII ADNc

O bibliotecă ADNc trebuie să conțină deci 106-107 de clone ADNc, cu o dimensiune a inserțiilor care depinde de lungimea produsului de transcriere.

Este necesar un număr atât de mare de clone pentru ca probabilitatea ca anumiți produși de transcriere să nu fie prezenți.

Având în vedere că procesul de clonare este statistic, fragmentele ADNc care corespund unor gene cu o transcriere abundentă se vor găsi într-un număr foarte mare de clone, iar cele care provin de la gene cu transcriere ocazională vor fi extrem de rare, sau chiar vor lipsi.

5.5. SECVENȚIALIZAREA FRAGMENTELOR ADN

Metodele pentru determinarea secvenței nucleotidice a unor fragmente de ADN au fost dezvoltate independent de Walter Gilbert – o tehnică de degradare chimică și Fred Sanger – o tehnică de sinteză enzimatică, care în 1980 au primit premiul NOBEL.

Metoda Gilbert se bazează pe modificarea ADN, urmată de secționarea la nivelul bazelor specifice. Metoda necesită marcare radioactivă și o purificare avansată a fragmentelor care urmează să fie secvențializate, și de aceea a fost abandonată, fiind înlocuită de metoda Sanger.

Pentru ca o reacție de secvențializare să aibă loc, este necesară utilizarea unui primer specific, prin urmare este necesară cunoașterea secvenței care mărginește fragmentul țintă de analizat. De aceea, în prezent fragmentele de secvențializat sunt clonate în vectori specifici, cu secvențe cunoscute (care au fost prezentați în capitolul 5.3.1). În acest caz secvențele care flanchează orice fragment clonat sunt cunoscute, pentru ele fiind disponibili primeri care pot fi utilizați în orice reacție de secvențializare. Pentru fiecare vector de clonare, care poate fi utilizat la secvențializare, există pe piață primeri specifici care pot fi utilizați în acest proces.

5.5.1. METODA DE SECVENȚIALIZARE SANGER

Metoda Sanger se bazează pe utilizarea unei molecule, dideoxinucleozid trifosfat (ddNTPs), un compus care, spre deosebire de deoxiriboză nu are o grupare OH în poziția 3’. Această moleculă are proprietatea de a bloca sinteza ADN, deoarece îi lipsește gruparea necesară pentru formarea unei legături fosfodiester între două nucleotide.

Pentru a se desfășura o reacție de secvențializare sunt necesare următoarele componente: o moleculă de ADN matriță, monocatenară; un primer, ADN polimerază, nucleotide marcate radioactiv sau fluorescent și nucleotidele modificate (dideoxi), care au proprietatea de a bloca sinteza ADN.

Având în vedere că procesul de secvențializare se bazează pe o reacție de sinteză a ADN, el începe întotdeauna la capătul 5’ al fragmentului de analizat.

Proba de ADN se împarte în patru reacții, fiecare conținând toate cele patru deoxinucleotide marcate (dATP, dGTP, dCTP și dTTP) și ADN polimeraza (Fig. 5.30). În fiecare reacție se adaugă una dintre cele patru dideoxinucleotide (ddATP, ddGTP, ddCTP, sau ddTTP).

Fig. 5.30 Desfășurarea reacției de secvențilaizare, cu nucleotide marcate

De exemplu, dacă fragmentul de analizat are secvența de mai jos, în reacția ce va stabili localizarea C se va adauga ddGTP; atunci când dideoxiribonucleotidul respectiv este încorporat în catena în curs de formare, sinteza se oprește. Când polimeraza întâlnește următorul nucleotid C fenomenul se repetă și rezultă astfel fragmente de 3, 6, 9 și 13 nucleotide.

Reacții similare pentru nucleotidele cu A, T și C vor furniza serii corespunzătoare de fragmente.

Catenele nou sintetizate, marcate datorită includerii dideoxi-nucleotidelor marcate, sunt denaturate termic și separate în funcție de dimensiuni (cu o rezoluție de o nucleotidă) prin electroforeză într-un gel denaturant de poliacrilamidă. Amestecurile de reacție migrează în același gel, în godeuri individuale (linia A, T, C, sau G).

Benzile ADN sunt vizualizate apoi prin autoradiografiere sau prin iluminare UV, astfel că ansamblul celor patru reacții poate fi citit pe o “scară” pozițională direcționată de la fragmentele cele mai mici la cele mai mari; astfel se poate determina secvența de nucleotide a fragmentului analizat.

O altă variantă a acestei metode se desfășoară similar cu cea prezentată anterior, diferențiindu-se prin tipul de marcare (Fig. 5.31).

Fig.5.31 Desfășurarea reacției de secvențilaizare, cu primeri marcați

În acest caz, cele patru tipuri de amestecuri de reacție sunt marcate datorită marcării anterioare a primerilor.

Cea mai utilizată metodă în prezent este cea în care dideoxi-nucleozid-trifosfații sunt marcați cu coloranți fluorescenți diferiți, denumită și metoda cu colorant terminal “Dye-terminator sequencing”

Astfel, amplificarea are loc într-o singură reacție, iar produșii de amplificare sunt analizați prin electroforeză capilară. La ieșirea din gel fragmentele ADN sunt scanate de către un laser, care înregistrează automat colorantul corespunzător fragmentului respectiv. Separarea fragmentelor ADN se realizează în funcție de dimensiuni, astfel încât este posibilă trasarea unei diagrame care precizează ordinea bazelor azotate în fragmentul matriță (Fig. 5.32).

Fig. 5.32. Etapele procesului de secvențializare prin metoda

“Dye-terminator sequencing”

La interpretarea rezultatelor trebuie să se țină seama de faptul că în prima parte a secvenței 15-40 de nucleotide corectitudinea procesului de secvențializare este mai redusă, la fel ca și după ce a fost parcursă o lungime a fragmentului de 700-900 nucleotide. Prin urmare, secvențializarea unui fragment mai mare 700-800 nucleotide nu va furniza rezultate reale. Dacă se dorește analizarea unor fragmente cu o lungime mai mare este posibilă secvențializarea din două direcții (pornind de la cele două situsuri de inserție ale fragmentului ADN în vectorul de clonare). Se vor obține două secvențe cu orientare opusă, care vor fi comparate și apoi suprapuse, pentru a determina secvența reală a fragmentului analizat (Fig. 5.33.).

De asemenea este posibil ca prima parte a secvenței determinate să provină din vectorul de clonare (care flanchează fragmentul de analizat), fapt care trebuie să fie luat în considerare atunci când se interpretează rezultatele obținute.

Fig. 5.33 Secvențializarea unui fragment ADN, pornind din două direcții de sinteză

Determinarea secvenței are loc în direcția 5’-3’, pentru fiecare catenă ADN

Metoda de sinteză enzimatică descrisă de Sânger este din ce în ce mai mult folosită fiind perfecționată continuu. Folosind ca vectori, pentru secvența de determinat, plasmide de generația III-a se pot secvențializa molecule de ADN bicatenar. Marcajul radioactiv a fost înlocuit cu marcajul prin fluorocromi specifici fiecărui nucleotid. Informatizarea a deschis drumul automatizării și sunt deja folosite secvențializatoare automate.

Instrumentele automatizate pot să secvențializeze până la 384 de probe ADN în același timp, într-o singură migrare, fiind posibile 24 de migrări pe zi. Secvențializatoarele sunt dotate cu sistem de electroforeză capilară pentru separarea fragmentelor ADN în funcție de dimensiuni iar detecția, înregistrarea fluorescenței și a rezultatelor are loc sub forma unor cromatograme (5.34). Reacțiile de amplificare, purificare și resuspendare în soluție tampon, care se desfășoară înainte de secventializare sunt automatizate. Există soft-uri care pot să elimine automat urmele de ADN de calitate redusă. Precizia unor astfel de algoritmi este mai redusă comparativ cu examinarea vizuală de către un operator, dar suficientă pentru a permite automatizarea procesării unei game foarte mari de date.

Fig. 5.34. Cromatogramă, care reprezintă rezultatul final al unui proces de secvențializare automatizată

5.5.2. APLICAȚII ALE PROCESULUI DE SECVENȚIALIZARE

Metodele aplicate în prezent permit determinarea directă, într-o singură reacție, a secvențelor pentru fragmente de DNA relativ scurte (maxim 1000 de nucleotide). De aceea secventializarea diferitelor genomuri, cu dimensiuni cuprinse între 104 și 1011 nucleotide (genomul uman este alcătuit din 3,3 x 109 nucleotide) necesită parcurgerea unor etape de clonare, urmate apoi de secvențializare.

În unele cazuri în care genomul are dimensiuni reduse (virusuri, bacterii) sau dacă organismul investigat prezintă importanță deosebită (om) secventializarea genomului a fost realizată în totalitate. În cazul altor tipuri de organisme a fost realizată secventializarea unor regiuni cromozomale de interes. Toate secvențele determinate până în prezent se găsesc în baze de date, cum ar fi „EMBL Nucleotide Sequence Database” sau „BLAST -Basic Local Alignment Search Tool”, cu caracter public. Informațiile existente în aceste baze de date pot sta la baza cercetărilor ulterioare cu privire la identificarea și caracterizarea genelor.

5.5.2.1. DETERMINAREA UNOR SECVENȚE ADN

De cele mai multe ori fragmentele pentru care se dorește identificarea secvenței fac parte din regiunile codante ale genelor și de aceea atenția s-a îndreptat spre investigarea ARNm, respectiv a ADNc. Pentru a extinde mai mult cercetările atenția s-a îndreptat spre bibliotecile ADNc, ale căror clone sunt sunt reprezentante ale tuturor moleculelor ARNm prezente la un moment dat în țesutul analizat. La rândul lor, moleculele ARNm au suferit procesele de prelucrare specifice (structura moleculei ARNm, după prelucrare a fost prezentată în fig. 3.11).

Secvențializarea integrală a inserțiilor acestor clone nu este posibilă, deoarece lungimea lor medie este mai mare comparativ cu posibilitatea de secvențializare (700-900 nucleotide).

Prin urmare se determină secvențele ambelor extremități 5’ și 3’, denumite EST – etichete ale secvențelor exprimate („Expressed Squence Tags”, care furnizează informații cu privire la secvența moleculei ARNm, 5’ EST reprezintă secvența unei părți a transcriptului, care de obicei codifică o proteină (exoni). Aceste regiuni sunt conservate între specii și nu se modifică prea mult în cadrul unei familii de gene.

Secvența 3’ EST provine într-o mai mare măsură din secvența 3’ UTR (secvență transcrisă dar netradusă) și de aceea conține într-o proporție mai mare secvențe necodante. Această situație se datorează lungimii mai mări a secvenței 3’ UTR comparativ cu 5’ UTR.

Toate secvențele EST determinate până în prezent (mai mult de 60 de milioane) se găsesc în baza de date “GenBank” – dbEST”, EST -NCBI site – (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/dbEST/).

Acest tip de secvențe a fost dezvoltat inițial pentru identificarea produșilor de transcripție ai unor gene, dar pe parcurs utilizarea lor s-a extins în domeniul identificării genelor, pentru obținerea unor date privind expresia și reglarea genelor, determinarea secvențelor și pentru dezvoltarea unor sisteme de markeri moleculari cum ar fi: RFLP– polimorfismul lungimii fragmentelor de restricție („Restriction fragment length polymorphism”), SSR – secvențe simple repetate (microsateliți) („Simple sequence repeats”), SNP polimorfismul unei singure nucleotide („Single nucleotide polymorphism”), CAPS – polimorfismul fragmentelor amplificate și secționate („Cleaved amplified polymorphic sequence”).

De asemenea secvențele EST pot fi utilizate în scopul design-ului unor sonde ADN cu utilizare în analizele microarray, pentru evaluarea expresiei genelor.

Sondele moleculare dezvoltate pe baza EST vor recunoaște secvențe unice în genom, ceea ce constituie un avantaj major în procesele de alcătuire a unor hărți genetice cu densitate mare și a hărților fizice.

O altă posibilitate de investigare este secvențializarea moleculelor dintr-o bibliotecă DNAc în scopul evidențierii secvențelor genelor transcrise la un moment dat în celule.

Procesul de secvențializare poate sta la baza identificării mutațiilor punctiforme, denumite în literatura de limba engleză SNP (single nucleotide polymorphism) – polimorfismul unei singure nucleotide, care pot să însoțească apariția unei boli. Evidențierea acestor mutații prin secvențializare permite diagnosticarea precisă și precoce a bolii.

Alteori procesele de secvențializare au ca obiect de analiză fragmente ADN, care provin din regiuni cromosomale diferite.

Astfel, dacă se identifică regiuni cromosomale de interes, în care se află aplasate gene, cu ajutorul bibliotecilor genomice este posibilă cartarea fizică, urmată de secvențializare. Modalitatea de alcătuire a hărților fizice este descrisă în capitolul…

Au fost secventializate +++genomuri

MARKERII SNP (Single Nucleotide Polymorphism)

Metoda evaluării SNP se bazează pe identificarea diferențelor apărute în secvențele genomurilor la nivelul unei singure nucleotide.

În literatura de specialitate de limba engleză metoda este cunoscută sub denumirea de” Single Nucleotide Polymorphism” – Polimorfismul unei Singure Nucleotide, notat abreviat prin acronimul SNP.

Dezvoltarea acestui tip de markeri a fost posibilă datorită perfecționării unor tehnici moderne de analiză cum ar fi secvențializarea, microarray, Real-Time PCR și totodată extinderii bazelor de date informatizate referitoare la secvențele ADN studiate până în prezent.

Diferențele care apar la nivelul unei singure nucleotide sunt generate de mutații punctiforme, care pot avea sau nu efect asupra fenotipului. Markerii SNP sunt prezenți de obicei în număr mai mare în regiunile necodante ale genomului, deoarece modificarea unei singure nucleotide în interiorul regiunilor codante poate să genereze un codon care să nu fie sinonim cu cel inițial, conducând astfel la modificarea unui aminoacid din lanțul polipeptidic codificat. În cazul în care modificarea conduce la generarea unui codon sinonim secvențele aminoacizilor nu vor fi alterate. Modificările sinonime pot însă să modifice procesul de excizie și sudare a ARN (ARN splicing), conducând la modificări fenotipice.

Markerii SNP se gasesc în număr mare în genom, dar peste tot in abundența și distribuția lor depinde de specie. De exemplu porumbul are un marker SNP la fiecare 60-120 bp, în timp ce genomul uman are un marker la fiecare 1000 bp.

SNP este un marker genotipic codominant, care permite diferențierea homozigoților de heterozigoți.

PRINCIPII METODOLOGICE

În ultima perioadă tehnologia determinării secvențelor s-a dezvoltat tot mai mult, astfel că în bazele de date există un număr tot mai mare de secvențe EST-secvențe țintă exprimate, ceea ce a condus la lărgirea posibilităților de analiză directă a variațiilor apărute la nivelul secvențelor ADN.

Tehnicile de genotipare a polimorfismului unei singure nucleotide SNP se bazează pe unul sau două dintre următoarele mecanisme moleculare: hibridizarea specifică a alelelor, extensia primerilor, ligarea oligonucleotidelor și secționarea invazivă. Metode foarte specializate de genotipare, cum ar fi chip-uri ADN, Real-time PCR specific alelelor fac SNP o tehnică atractivă în domeniul markerilor moleculari. Aceasta poate fi automatizată și se poate aplica pentru o categorie mare de scopuri cum ar fi: identificarea rapidă a cultivarelor și alcătuirea unor hărți genetice cu o densitate foarte mare de markeri.

În figurile prezentate în continuare sunt evidențiate tehnicile care permit identificarea markerilor SNP, în care este studiată o singură alelă- A, care a suferit o modificare A/G. Alela G poate fi detectată în acelașăi mod, într-o reacție paralelă.

Hibridizarea specifică a alelelor sau hibridizarea cu o oligonucleotidă specifică alelei ASO („hybridization with allele-specific oligonucleotides”).

În acest caz se utilizează două sonde moleculare scurte, având o nucleotidă complementară cu varianta alelică a SNP în poziția centrală.

Sondele sunt hibridizate la secvența țintă care conține SNP, în condiții în care numai fragmentele formate pe baza unei complementarități de 100% sunt stabile, iar hibrizii care conțin nepotriviri sunt instabili. Prezența hibrizilor stabili este evidențiată prin metode specifice, caracteristice sistemului de marcare al sondei moleculare.

O îmbunătățire a acestei tehnici este utilizarea unor chip-uri ADN pe care sondele moleculare sunt sintetizate direct. Pot fi astfel identificate SNP prin tehnica microarray, urmărind oligonucleotidele la care s-au atașat probele țintă de ADN.

Extensia primerului specific alelei („allele-specific primer extension”)

Această metodă presupune utilizarea a doi primeri care se leagă la secvența lor țintă adiacentă SNP, iar la capătul 3’au nucleotide complementare cu variantă alelică. În prezența Taq polimerazei numai primerii cu o potrivire perfectă la capătul lor 3’ vor genera produși de amplificare.

În urma analizei prin electroforeză în gel de agaroză se va evidenția un fragment amplificat numai în cazul în care în probă este prezentă varianta alelică nemodificată.

Minisecvențializarea extensiei unui primer („minisequencing single nucleotide primer extension”)

În cazul aplicării acestei metode se utilizează un singur primer, a cărui secvență țintă este adiacentă unei secvențe SNP. În prezența unei polimeraze primerul este extins cu o singură nucleotidă, complementară cu cea aflată la situsul SNP. Apoi secvența amplificată este secvențializată, iar identificarea nucleotidei după care a fost extins primerul definește genotipul.

Ligarea unor sonde specifice alelelor („Allele specific ligation probes”)

Această metodă presupune utilizarea unor perechi de sonde oligonucleotidice care se leagă la secvențele complementare adiacente. La joncțiunea dintre aceste sonde este prezentă o nucleotidă specifică alelei, la capătul 3' respectiv 5'. Atunci când potrivirea sondelor moleculate la secvențele lor țintă este de 100% ele vor fi legate de către ADN ligază, iar o nepotrivire de o nucleotidă inhibă această reacție.

Secționarea invazivă („invasive cleavage”)

În cadrul acestei metode se utilizează o pereche de sonde, dar secvența 5' a SNP nu este legată la secvența țintă. În plus se utilizează o oligonucleotidă invazivă care este complementară cu secvența 5' a SNP. Atunci când o oligonucleotidă se atașează perfect la secvența țintă, ea este înlocuită la nivelul situsului SNP de către oligonucleotida invazivă, formând o structură recunoscută și secționată de către o endonuclează specifică, care elimină regiunea 5' a sondei.

Secționarea unui situs de restricție („restriction site cleavage”)

În cazul aplicării acestei metode pentru secționarea moleculei ADN țintă sunt utilizate endonucleaze de restricție cu situs de recunoaștere specific alelelor. Această tehnică este aplicabilă atunci când SNP alterează secvența de recunoaștere a unei enzime.

Moleculele țintă cu situsuri nealterate rămân nesecționate, iar celelelte conduc la formarea a două fragmente ADN.

Discriminarea alelelor cu ajutorul tehnicii Real-Time PCR

O metodă care câștigă o tot mai largă aplicabilitate în domeniul evidențierii SNP este real-Time PCR.

Dacă se utilizează sonde moleculare marcate fluorescent TaqMan (capitolul…) acestea trebuie să aibă secvențe complementare cu regiunea din ADN țintă în care a apărut mutația (SNP). Sondele se vor lega la această secvență dacă potrivirea este perfectă; dacă nu procesul de atașare nu va avea loc.

Desfășurarea reacției de amplificare, în cazul variantelor care au legat sonda moleculară va conduce la o creștere a fluorescenței, deoarece polimeraza aleasă are o activitate exonucleazică 5’ – 3’ foarte pronunțată, iar atunci când ajunge în dreptul sondei o secționează în nucleotidele componente, separâd colorantul raportor fluorescent și cel absorbant.

Atunci câd sonda moleculară nu se leagă la fragmentul țintă din cauza SNP, nu va apărea semnal fluorescent.

Aplicarea acestei tehnici de investigare permite evidențierea a două situații – detectarea fluorescenței, legată de prezența alelei sălbatice și absența acesteia, determinată de alela mutantă (SNP).