Prin electroforeză se întelege în general migrarea unor particule coloidale într-un câmp electric. Dacă se admite că o particulă coloidală oarecarea… [305586]

PARTEA TEORETICĂ

Capitolul I – Electroforeza

1.1 [anonimizat]. Dacă se admite că o particulă coloidală oarecarea e [anonimizat], [anonimizat] (dipol) ce înconjoară particula. Sistemul este astfel echilibrat și poate fi stricat prin introducerea a doi electrozi. [Dr.Sorin Marius Idu 1957]

Fig 1.1 [anonimizat] o metodă de separare bazată pe migrarea diferențială a [anonimizat].

[anonimizat]. Drumul de migrare va fi parcurs astfel cu viteze diferite rezultând astfel separarea.

Denumirea de electroforeză provine din asocierea cuvântului grec „elektron” (electric) cu cel latin „phore” (purtător) evidențiindu-se astfel rolul esențial al câmpului electric în procesul descris.

Electroforezei i se atribuie și alte denumiri ca: ionoforeza, electro-cromatografie, electroferografie, ionografie, electromigrare, electrocromatoforeză.

Electroforeza, [anonimizat]-lea (1809) când F.Reiss a [anonimizat]. Electroforeza ca metodă de separare a [anonimizat] a fost folosită cu succes prima dată în 1937 de Tiselius.

Prin termenul de ionoforeză se definește electromigrarea substanțelor cu masa moleculară mică pentru a se deosebi de procedeul aplicat particulelor coloidale mari. [anonimizat]-[anonimizat].

Electrocromatografia se referă la un proces care asociază efectele echilibrelor interfazice cromatografice cu cele ale forțelor de natură electrică în scopul realizării unor separări de performanță.

Electroforeza, [anonimizat], s-[anonimizat]. [anonimizat], în electroforeză separarea rezultă din deplasarea particulelor încărcate electric la aplicarea unui gradient de potențial. [O.V.Popescu 1988]

1.2 [anonimizat] (foi, membrane, strat subțire) rezultă principala clasificare a metodelor electroforetice:

Electroforeza în mediu liber în coloană de lichid sau electroforeza cu front mobil (frontală).

Electroforeza pe medii stabilizate sau electroforeza în zone (zonală).

Electroforeza în mediu liber se bazează pe electromigrarea liberă a speciilor ionice într-o soluție tampon corespunzătoare.În final se obțin fracțiuni delimitate prin fronturi,iar separarea este eficientădacă se aplică un câmp electric constant,dacă se evită variațiile de pH și dacă se lucrează în condiții izoterme.

Metodele din a doua clasă (electroforeza în mediu stabilizant) folosesc diferite medii suport cu rol stabilizant, eliminând sau atenuând aspectele negative întâlnite la electroforeza în mediu liber. Mediile suport pot fi relativ inerte: acetat de celuloză, silicagel, alumină, celuloză, sau dimpotrivă pot participa activ în separare interacționând cu particule care migrează. Prin separarea electroforetică în medii stabilizante se obțin fracțiuni cu aspect de zone bine delimitate,curenții de convecție fiind practic eliminați, mediul suport stabilizează zonele separate. [O.V.Popescu 1988]

1.2.1 Electroforeza în mediu liber-metoda Tiselius

Electroforeza în mediu liber oferă rezultate corelate cu punctele izoelectrice și în funcție de mobilitățile electrice, ale particulelor încărcate. Prin această metodă se pot studia substanțe cu caracteristici nete cum sunt: proteine, enzime și alți compuși coloidali.

De asemenea electroforeza în mediu liber sau frontal constituie procedeul de separare bazat pe electromigrarea speciilor ionice într-o coloană de lichid în care deplasarea are loc în mod „liber”.

Aparatura utilizată include celula electroforetică de tip Tiselius formată dintr-un tub de sticlă în forma literei U. Celula este umplută cu o soluție tampon și este menținută la o temperatură constantă, de preferință +4C. Soluția este omogenă cu excepția părții care conține proba. La trecerea curentului electric particulele încărcate migrează cu viteze diferite spre electrozi, în funcție de sarcina și caracteristicile lor realizându-se o serie de suprafețe de separare – fronturi- care despart spații corespunzătoare numărului de componenți.

Fig 1.2 Schema aparatului Tiselius

Procedeul electroforezei frontale este aplicabil substanțelor cu masă moleculară mare, deoarece acestea prezintă conductibilități moderate neinfluențând valoarea câmpului aplicat. Electrolitul purtător este constituit dintr-o soluție tampon, deoarece nu este permisă variația pH-ului care poate interveni cu efect perturbator.

În mod practic, electroforeza liberă este eficientă numi în condiții izoterme, prin aplicarea unui câmp electric cunoscut și fără variații sensibile ale pH-ului. [O.V.Popescu 1988]

1.2.1.1 Electroforeza celulară

Electroforeza celulelor vii este una dinte cele mai importante metode fizice de separare alături de centrifugarea diferențială sau în gradient de densitate și sortarea centrifugală contracurent.

În mod ipotetic, separarea după parametrii fizici ar trebui să fie și o separare după caracteristicele funcționale ale celulelor. Între funcțiile unei celule și proprietățile membranei sale plasmatice există o strânsă legătură. Modificarea încărcăturii electrice a membranelor reflectă, de cele mai multe ori, procese de diferențiere sau transformare influențate sau nu de factori stimulatori. Practic, separarea se face în funcție de densitatea sarcinii electrice negative de suprafață, care este un parametru fizic natural al celulelor vii. Multe subpopulații celulare, la organismele superioare, cu diferite densități de sarcină electrică superficială îndeplinesc funcții biologice diferite.

În prezent, separarea celulelor prin electroforeză este favorizată și de standardul foarte ridicat al aparaturii folosite care permite obținerea de rezultate reproductibile. Soluția tampon folosită în electroforeza celulelor are o importanță esențială. Capacitatea de tamponare trebuie să fie mare pentru a preveni variațiile de pH care dăunează vitalității celulelor.

Se cunosc mai multe metode de electroforeză a celulelor: microelectro-foreza, electroforeza în flux liber continuu și electroforeza pe coloană. [O.V.Popescu 1988]

1.2.2 Electroforeza pe medii stabilizate

Electroforeza pe medii stabilizate se efectuează pe suporturi poroase care rezolvă principalele dezavantaje menționate în cazul migrării libere. În principal, se realizează separarea integrală a constituienților sub formă de zone bine delimitate, deoarece sunt eliminați curenții de convecție. Ca mediu de stabilizare se poate utiliza o varietate de suporturi cum sunt: hârtia de filtru, pulberi, geluri și alte substanțe poroase.

Electroforeza zonală se efectuează într-un mediu eterogen pe suporturi solide de migrare. Suportul stabilizează zonele de migrare fixându-le în poziții corespunzătoare deplasărilor care au avut loc în funcție de timp și de gradientul de potențial aplicat.

Procedeul electroforezei pe medii stabilizate oferă informații calitative și cantitative asupra unor substanțe anorganice, organice sau biologice, fără restricții privind masa lor moleculară.

Electroforeza pe medii stabilizate permite utilizarea unei game largi de soluții tampon-electroliți-purtători caracteristici prin diferite tării ionice și prin compoziții complexe. Procesul de separare se poate executa la tensiune joasă sau la tensiune înaltă, luându-se precauțiile corespunzătoare.

Suportul utilizat pentru stabilizarea zonelor trebuie să îndeplinească o serie de condiții printre care:

să posede proprietăți mecanice favorabile pentru a fi ușor manipulat;

să fie stabil fizic, chimic și termic;

să fie accesibil metalic și dacă e posibil transparent pentru reperarea ușoară a zonelor.

Suporturile se pot prezenta sub forma de foi, granule sau geluri.

Ca stabilizanți granulari au importanță practică celuloza, polivinilclorura, amidonul și dixtronul reticulat. Din categoria gelurilor au aplicații: silicagelul, gelul de agar, gelurile de amidon, poliacrilamida, polivinilalcoolul.

1.2.2.1 Elecroforeza pe hârtie de filtru

Acest mediu stabilizant este din ce în ce mai puțin folosit, chiar și în laboratoarele clinice. Hârtia de filtru folosită pentru electroforeză trebuie să conțină cel puțin 96% alfa celuloză. Cantitatea de lichid absorbită de hârtia de filtru în cursul electroforezei este un factor foarte important de care depinde conductibilitatea electrică și, în cele din urmă, separarea. Se cunosc trei categorii de hârtii de filtru: în funcție de compactarea fibrelor de celuloză: fină, medie și grosieră. Hârtia de filtru fină sau medie permite formarea unor zone clare, în timp ce hârtia grosieră, cu o mare capacitate de absorbție formează zone difuze, nedistincte. De asemenea foarte important este ca nivelul soluției tampon în compartimentele electrozilor să fie egal, pentru a se preîntâmpina apariția fenomenului de șifonare.

În această metodă trebuie să prevenim evaporarea excesivă a soluției tampon din hârtie,datorită efectului termic Joule,evaporarea poate fi menținută în limite rezonabile dacă se folosesc soluții tampon cu forța ionică mică și un sistem efficient de răcire.Evaporarea excesivă poate fi prevenită prin saturarea compartimentului de separare cu vapori sau prin adăugarea de propil-glicol sau glicerină în soluția tampon,iar în cazul electroforezei la tensiune înaltă prin plasarea hârtiei de filtru în solvenți organic hidrofobi. [Dr.Sorin Marius Idu1957]

Aparatura este format din două rezervoare cu soluție tampon, în care se află electrozii și un sistem care să mențină hârtia de filtru întinsă între acestea.

Fig.1.3 Schema unui aparat pentru electroforeza pe hârtie de filtru

1.2.2.2 Electroforeza în strat subțire

Dezavantajele electroforezei pe hârtie la tensiune înaltă pot fi evitate prin folosirea electroforezei în strat subțire, care de cele mai multe ori permite separări la fel de bune. Această metodă se folosește pentru separarea aminelor, aminoacizilor, peptidelor, fenolilor, acizilor carboxilici, coloranților organici și a unor substanțe anorganice. Față de hârtia de filtru zonele sunt mai bine delimitate, timpul de separare mai scurt, sensibilitatea mai bună și se pretează la determinări cantitative mai precise.

De multe ori această metodă se poate combina cu cromatografia în strat subțire. Electroforeza urmată de electrocromatografie a fost folosită inițial pentru separarea aminelor și apoi a aminoacizilor din urină. Probele nu trebuie desalinizate, ci se aplică direct pe stratul subțire. Ureea și glucidele rămân la start, iar ionii sărurilor migrează rapid în afara startului subțire. Grosimea optimă a stratului subțire este în jur de 250 µm.

1.2.2.3 Electroforeza pe acetat de celuloză

Membranele de acetat de celuloză produse inițial pentru filtrare au fost folosite pentru prima dată ca mediu suport de Kohn. Acestea sunt de culoare albă cu o suprafață netedă, uniformă și cu o structură omogenă, microporoasă, asemănătoare unui burete microscopic; dimensiunile porilor sunt cuprinse între 1,0 și 5,0 µm pentru membranele uscate și între 0,1 și 0,5 µm pentru Cellogel. Asemenea dimensiuni mici împiedică difuziunea zonelor sau a spoturilor, astfel încât se obține o bună separare a proteinelor plasmatice, chiar la o tensiune mică: globulinele α1 se separă clar de albumină, iar globulinele β se separă în două zone β1 și β2. Membranele de acetat de celuloză au o puritate înaltă; hemicelulozele și lignina sunt absente, iar metalele grele sunt prezente numai în urme.

Capacitatea de absorbție față de proteine este mult mai mică, comparativ cu hârtia de filtru, ceea ce elimină apariția „cozilor” sau a zonelor cu aspect de cometă și micșorează fondul colorat. Timpul de migrare este mai scurt. În plus, acetatul de celuloză este un mediu adecvat pentru imunodifuziune și imunoelectroforeză. Totuși acetatul de celuloză este mult mai scump decât hârtia de filtru și necesită mult mai multă atenție pentru obținerea unor rezultate reproductibile. Membranele rețin puțin lichid și deci evaporarea excesivă trebuie prevenită în timpul migrării, prin mijloace diferite. În microtehnici, folosirea acetatului de celuloză este mai economică, atât din punct de vedere al timpului cât și al mediului suport, iar rezoluția este superioară. În același timp, s-au adus îmbunătățiri și produsului inițial apărând acetatul de celuloză gelatinizat denumit Collagel. [O.V.Popescu 1988]

1.2.3 Electroforeza în gel de agaroză

Gelul de agaroză este în prezent folosit pentru folosirea particulelor cu o rază efectivă mare: proteine, lipoproteine, acizi nucleici, ribozomi și virusuri. Pentru particulele mai mici se recomandă gelul de poliacrilamidă. Comparativ cu poliacrilamida, agaroza prezintă și avantaje și dezavantaje. Principalele avantaje sunt:

agaroza formează geluri termic reversibile, gelificarea prin răcire este mult mai simplă, foarte reproductibilă și fără risc;

gelurile de agaroză au pori mari și sunt potrivite pentru metodele electroforetice „nerestrictive”; cu astfel de geluri este posibilă separarea particulelor mari cu raza de 20-50 nm (virusuri);

gelurile de agaroză sunt utilizate în separări preparative; fracțiunile separate pot fi eluate repede și cu randament bun prin difuziune sau prin topirea agarozei;

agaroza nu este toxică;

gelurile de agaroză se pot usca ușor și se pot păstra multă vreme fără a se modifica.

Ca dezavantaje se cunosc:

stabilitate mecanică și aderență scăzute;

sensibilitate crescută la efectul termic Joule;

electroosmoză mare;

adsorbția proteinelor încărcate pozitiv, datorită sarcinilor negative ale agarozei;

eterogenitatea compoziției, variabilă de la o șarjă la alta.

Agaroza se obține din agar care la rândul său se extrage din algele roșii. Din punct de vedere chimic agaroza este un copolimer liniar, cu unitatea respectivă, agarobioza, formată din β-D-galactospiranoza și 3,6-anhidro-α-L-galactospiranoza; legătura în acest dimer este de tip 1,4-α-glicozidică, iar între dimeri de tip 1,3-β-glicozidică.

În funcție de procedura de purificare, agaroza poate conține resturi de sulfat, piruvat și chiar radicali metoxil; între substituția cu aceste resturi sau radicali și proprietățile agarozei există o strânsă corelație.

În timpul gelificării, catenele de agaroză se asociază formând lanțuri dublu-elicoidale cu o simetrie triaxială; pentru gelificare, după formarea lanțului dublu-elicoidal, se desfac și legăturile 3,6 din 3,6-anhidro-galactospiranoza, care duc la „fragmentarea” lanțului inițial în lanțuri dublu elicoidale mai scurte ale căror capete se vor lega între ele încrucișat, proces numit „schimbarea partenerului”. Această „supraînfășurare” ar explica rezistența mai mare și porii mai mari ai gelurilor de agaroză, comparativ cu alte geluri care nu formează suprafibre. În legătură directă cu dimensiunile poriloreste efectul de „sită moleculară”. Acest efect nu este prezent în gelurile de agaroză 2% dar se manifestă la concentrații mari ale agarozei când distanța între și în interiorul suprafețelor devin egale și ia naștere un gel cu o singură dimensiune a porilor. [E.Jurcan 1983]

1.2.3.1 Electroforeza in gel de amidon

Electroforeza în gel de amidon a fost prima metodă electroforetică care a pus în valoare efectul de „sită moleculară” al mediului suport și a fost introdusă de Smithies în 1955.

Amidonul este un polizaharid insolubil în apă; în stare nativă în prezența apei se umflă. Prin hidroliză parțială amidonul poate fi convertit într-o formă care se solubilizează la temperaturi ridicate și care apoi se solidifică într-un gel ferm la temperatura camerei. La început s-a folosit amidon din cartofi și mai târziu din orez.

Gelul de amidon combină virtuțile „țesăturii” fine și absența adsorbției proteinelor cu efect de „sită moleculară” astfel că separarea macromoleculelor depinde de sarcina electrică, masa moleculară și forma acestora. Mărimea porilor în gelul de amidon este determinată de concentrația amidonului și de gradul de hidroliză. Porozitatea gelului de amidon variază într-un domeniu mai injust, comparativ cu gelul de poliacrilamidă, deoarece nici gradul de hidroliză și nici concentrația gelului nu pot fi schimbate în afara unor limite bine definite fără a fi afectate caracteristicile mecanice ale gelului.Gelurile de amidon se pot pastră o perioadă îndelungată la temperatura camerei. [O.V.Popescu 1988]

1.2.3.2 Electroforeza în gel de poliacrilamidă

Utilizarea gelului de poliacrilamidă nu a fost imediată. Față de alte medii suport, gelul de poliacrilamidă prezintă unele avantaje practice importante: reproductibilitatea, puterea mare de rezoluție, posibilitatea controlului mărimii porilor pe un domeniu larg de dimensiuni, inerția și stabilitatea chimică la variații mari de pH, temperatură și forța ionică, transparența perfectă, rezistența și flexibilitatea.

Gelul de poliacrilamidă se obține prin comolimerizarea acrilamidei N,N-metilen-bisacrilamidei. Polimerizarea este inițiată fie de riboflavină, iar accelerator al procesului este N, N, N, N’ tetrametiletilendiamina care catalizează formarea de radicali liberi din persulfat, iar aceștia la rândul lor, inițiază polimerizarea.

Se folosesc geluri cu concentrația omogenă sau cu gradient de concentrație. Sistemul tampon folosit depinde de proba ce urmează a fi separată electroforetic. Se folosesc sisteme tampon continue sau discontinue. Sistemele tampon trebuie să conțină unul sau mai mulți agenți de disociere. Cei mai cunoscuți agenți de disociere sunt fie detergenții ionici ca dodecilsulfatul de sodiu (SDS) fie ureea. [Text of clinical chemistry]

1.2.3.3 Electroforeza în gel mixt de agaroză și poliacrilamidă

Gelurile mixte sau compozite, constând din agaroză și poliacrilamidă, au început să fie folosite pentru separarea proteinelor și a acizilor nucleici. Pe o singură electroforegamă, este posibil să se obțină:

informații calitative privind tipul și distribuția speciilor ARN prezente;

date cantitative privind încorporarea unui izotop radioactiv;

estimarea masei moleculare a fiecărei specii.

Prepararea gelurilor mixte

Gelurile mixte pot fi preparate în două moduri:

Amestecul conținând toate componentele necesare formării gelului mixt se menține în matriță, la 35C pentru a preveni gelificarea agarozei, până când polimerizează acrilamida și numai după aceea se va forma și gelul de agaroză prin răcirea „sistemului”.

Amestecul cu componente necesare formării gelului mixt, turnat în matriță, se răcește la temperatura camerei pentru a permite gelificarea agarozei înaintea polimerizării acrilamidei.

Alegerea unuia din cele două moduri de preparare depinde de concentrația acrilamidei. Gelurile mixte se folosesc cu succes și în separarea proteoglicanilor.

CAPITOLUL II

Electroforeza proteinelor serice

Proteinele serice sunt sintetizate din aminoacizi. Sunt molecule organice din celulele animale ce reprezintă 50% din masa lor proprie. Acestea sunt direct implicate în structura lor și participă la funcționarea acestora. Având proprietăți biologice multiple și variate proteinele intervin de asemenea în fenomene de repartizare a apei în diferitele sectoare ale organismului, în transportul anumitor molecule, în marcajul funcțional al anumitor țesuturi (enzime, imunoglobuline, citochinine).

Sediul principal al sintezei proteinelor este ficatul.

Proteinele au rol in:

țesuturi, menținerea echilibrului acido bazic (sisteme tampon);

menținere a presiunii coloidosmotice (albumina);

intervin în apărare imună (imunoglobulinele, sistemul complet);

hemostază (factori ai coagulării și fibrinolizei);

procesele metabolice (enzime);

reglarea endocrină (hormoni);

transport (transportă metaboliți, hormoni, vitamine, metale, medicamente);

sunt inhibitori de proteaze și au rol nutritiv pentru

Determinarea proteinelor totale este utilizată pentru a evalua proteosinteza hepatică, pentru a cuantifica pierderile de proteine (sindrom nefrotic, enteropatie exudativă, arsuri, hemoragii acute), pentru a aprecia starea de nutriție. Proteinele totale cuprind albumina cca 60% și globulinele. [C.Popa 2016]

2.1 Principiul electroforezei

Proteinele se vor orienta în câmp electric către catod sau anod după pH-ul mediului electrolitic în care se desfășoară deplasarea. La pH acid proteinele au sarcină pozitivă și se vor mișca către catod în timp ce la pH bazic ele vor fi încărcate pozitiv și vor migra spre anod. La o anumită valoare pH particulară pentru fiecare specie, nu va exista nici o deplasare deoarece sarcina netă va fi nulă. Acest pH cunoscut sub numele de punct izoelectric al proteinei respective este dependent într-o oarecare măsură de natura și concentrația tamponului în care se lucrează. Proteinele pot prezenta puncte izoelectrice la pH mai mic decât 1 (exemplu pepsina bovină) sau la pH mai mare de 11 (exemplu eritrocroma bovină).

O proteină în soluție care are un pH inferior punctului său izoelectric se va comporta ca o bază și va accepta protonii H.

Ea va deveni astfel încărcată pozitiv în mediu acid:

H2N-R-COOH + H+ → H3N+-R-COOH

O proteină în soluție care are un pH superior punctului izoelectric se va comporta ca un acid și va ceda protonii H+.

Ea va deveni astfel încărcată negativ în mediu bazic:

H2N-R-COOH + HO- → H2N-R-COO- + H2O

Prin urmare stabilizarea pH-ului electrolitului purtător constituie condiția esențială pentru obținerea separărilor.

Prin electroforeza serului, în condițiile amintite mai sus, se obțin cinci fracțiuni: albumina serică, alfa1-globuline, alfa2-globuline, beta-globuline, gama-globuline.

Albumina – este mai abundenta, cu deplasare mai rapida la pH bazic (pH=8,6), deoarece este proteina mai acida.

Globulinele (Gl) – prezintă mobilitate descrescânda in seria subfracțiunilor α1Gl; α2Gl; βGl si γGl.

α1Gl cuprind: α1-antitripsina, α1-fetoproteina, α1-glicoproteina acida, α1-antichemotripsina, inhibitorul inter-1-tripsinei, HDL, proteina de legare a vitaminei D/cortizolului/hormonilor tiroidieni.

α2Gl cuprind: haptoglobina, ceruloplasmina, protrombina, colinesteraza, α2-macroglobulinele

βGl cuprind: transferina, plasminogenul, hemopexina, VLDL, LDL, β2-microglobulina, fibrinogenul, complementul, proteina C reactiva.

γGl cuprind IgA, IgM, IgD, IgE si IgG.

Se poate realiza astfel o electroforegamă a fiecărei migrări.

2.2 Fracțiunile electroforetice ale proteinelor sanguine

Aplicarea metodei electroforetice la stadiul componenței proteice a serului sau plasmei sanguine a permis izolarea unor fracțiuni proteinice care se deosebesc între ele prin viteza lor de migrare în câmpul electric. Fracțiunile astfel izolate au fost studiate apoi din punct de vedere fizico-chimic și biologic, ajungându-se la concluzia că, pe lângă viteza de migrare diferită, ele au încă o serie de caracteristici care se deosebesc între ele, cum ar fi de pildă: greutatea moleculară, configurația spațială și structura intimă.

Pe electroforegamă, după colorare, proteinele apar sub formă de benzi cărora li se măsoară densitatea optică, fiecare bandă având un maxim de absorbție.

Fracțiunile proteinice pot fi împărțite în două mari grupe:

grupa albuminelor

grupa globulinelor

2.2.1 Fracțiunea albuminică

Reprezintă porțiunea cea mai mare din valoarea proteinemiei totale. Albumina, care este produsă în ficat reprezintă 60% din proteinele din sânge, iar globulinele reprezintă restul de 40%.

Molecula de albumină este cea mai apropiată de forma sferică. Punctul izoelectric al albuminei este la pH 4,6-4,9.

Solubilitatea în apă a particulelor de albumină este foarte mare.

Deși din punct de vedere coloido-chimic fracțiunea albuminică apare monodispersă, s-au putut pune în evidență trei subfracțiuni ale ei; dintre care una a fost denumită seroglicoid și conține până la 8% glucide, este solubilă și necristalizabilă,alta a fost denumită cristalbumină, nu conține glucide în molecula sa, e mai puțin solubilă și cristalizează ușor. A treia componentă nu e definită încă.

Rolul fundamental al albuminei este în menținerea presiunii coloidosmotice a serului, ceea ce îi asigură implicit un loc de frunte în metabolismul apei.

Albumina scăzută (hipoalbulinemie) apare în: malnutriție sau malabsorție, sarcină, boli renale, boli ale ficatului, sindromul pierderii de proteine.

Creșteri ale albuminei apar în urma deshidratării. În cazuri speciale, în zona de migrare a albuminei se constată o bandă suplimentară, datorată unor variații genetice fără relevanță clinică (aloalbulinemie și bisalbulinemie).

2.2.2 Fracțiunea globulinică

Prezintă următoarele patru zone (fracțiuni): alfa1 globulinele, alfa2 globulinele, beta globulinele și gama globulinele.

ALFA1 GLOBULINE: Zona reflectă în special concentrația serică de alfa1-antitripsină, astfel că reducerea acestei fracțiuni se întâlnește în deficitul de alfa1-antitripsină asociat cu anumite boli pulmonare și hepatice. Creșteri se înregistrează în toate reacțiile inflamatorii. În cazuri rare, obținerea unei benzi suplimentare largi în această zonă poate sugera prezența alfa-fetoproteinei.

ALFA1 GLOBULINE LE cuprind:

alfa1-antitripsina;

alfa1-fetoproteina;

alfa1-glicoproteina acidă;

alfa1-antichemotripsina.

ALFA2 GLOBULINELE: Zona este constituită din două componente proteice: alfa2 macroglobulina și haptoglobulina. Creșterea de alfa2 apare în infecții acute, reumatismul articular acut, arterita, sindromul nefrotic, diabetul zaharat, neoplazii; scăderea acestei fracțiuni se poate întâlni în pancreatite acute severe, leziuni hepatocelulare, sindroame de coagulare intramusculară diseminată, anemii hemolitice, anemii megaloblastice.

ALFA 2 GLOBULINELE cuprind:

ceruloplasmina;

haptoglobina;

protombina;

colinesteraza;

alfa2- macroglobulinele.

BETA GLOBULINELE: Zona este alcătuită din două benzi distincte: beta1 corespunzătoare transferinei și beta2 care include fracțiunile complementului C3 și C4. Al treilea component al acestei zone este beta lipoproteina, a cărei bandă se poate suprapune pe cea a transferinei sau C3 sau poate fi situată în zona beta-gama. Nivelul seric de beta globuline crește în boli autoimune aflate în puseu activ, nefroza, afecțiuni hepatice, infecții acute și cronice. În unele cazuri de mielom de tip IgA se poate prezenta unui component monoclonal în această zonă.

BETA GLOBULINELE includ:

plasminogenul;

transferina;

hemopexina;

microglobulina;

fibrinigenul;

proteina C reactivă.

GAMA GLOBULINELE: acestea sunt globulinele cele mai importante. Gama globulinele sunt de formă globulară elipsoidă. Punctul izoelectric este pentru gama globulinele cu greutate moleculară mai mică la pH 6,3, iar pentru cele cu greutatea moleculară mai mare la pH 7,3, indicând împreună cu greutatea moleculară variabilă, marea lipsă de omogenitate a gama globulinelor.

Din această categorie fac parte imunoglobulinele (IgA, IgG, IgG, IgM, IgD și IgE). Anomaliile suferite de imunoglobuline se traduc fie prin cresteri ale gamaglobulinelor (ex.: hipergamaglobulinemii policlonale sau hipergamaglobulinemii monoclonale) fie prin scaderi ale gamaglobulinelor (ex.: agamaglobulinemie, hipogamaglobulinemii, sindrom nefrotic).

Hipogamaglobulinemia poate fi congenitală sau dobândită și poate fi ușor detectată la electroforeza proteinelor serice atunci când concentrațiile principalelor trei clase de imunoglobuline sunt scăzute (IgA, IgG, IgM). Prezența hipogamaglobulinemiei la adult impune continuarea investigațiilor în vederea depistării unei posibile boli limfoproliferative (mielom cu lanțuri ușoare, leucemie limfatică cronică, limfoane).

Creșterile policlonale de gama globuline indică un proces imunologic cronic asociat cu afecțiuni hepatice (hepatita cronică activă, ciroza), boli de colagen (LES, poliartrita reumatoidă), neoplazii (exemplu, boala Hodgkin), leucemie mielo-monocitară cronică. În aceste cazuri, hipergamagolbulinemia se datorează activării unui număr mare de clone plasmatice care eliberează imunoglobuline. Trebuie menționat aspectul caracteristic cirozei alcoolice de punte beta-gama, vizualizat pe gel ca o zonă intens colorată între zonele beta și gama. Uneori, în zona gama se pot observa câteva benzi mici, înguste, denumite oligoclonale, întâlnite la pacienți cu hepatită, boli ale complexelor imune, sindromul imunodeficienței dobândite, limfomul angioimunoblastic.

Gamapatiile monoclonale includ un număr mare de condiții clinice și biologice asociate cu afecțiuni maligne (mielom multiplu, boala Waldenstrom, amiloidoza, limfoame) dar și cu unele afecțiuni benigne sau chiar cu absența unei modificări patologice (gamapatii monoclonale cu semnificație nedeterminată). În aceste cazuri, se depistează la electroforeza proteinelor un component monoclonal (banda M), rezultat ca urmare a proliferării unei singure clone plasmocitare. Pe gel, componentele monoclonale apar sub forma unor benzi înguste, net definite, iar după scanarea densitometrică, se obțin „vârfuri” (peak-uri) caracteristice, ce pot fi întâlnite oriunde între zonele alfa și gama, datorită mobilității electroforetice variabile, cel mai frecvent însă în zona gama.

Imunoglobulinele monoclonale sunt omogene din punct de vedere structural și biochimic, fiind alcătuite dintr-un singur tip de lanț ușor (kappa și lambda). În circulație pot fi eliberate imunoglobuline complete sau numai subunități ale acestora (exemplu: lanțuri, ușoare monoclonale denumite proteine Bence-Jones). Prezența componentului monoclonal va fi precizat pe buletinul de analize al pacientului cu recomandarea de a se efectua electroforeza proteinelor serice cu imunofixare.

Imunoglobulinele sunt proteine cu valori de apărare împotriva microorganismelor: bacterii, virusuri, paraziți. Sunt proteine solubile, se află majoritar în plasmă și reprezintă elementele de recunoaștere ale sistemului imun umoral. Imunoglobulinele sunt sintetizate ca un răspuns la pătrunderea în organism a unui microoragnism sau a unui compus macromolecular străin.

Imunoglobulinele M (IgM) se găsesc în principal în plasmă, în concentrații mici sunt sintetizate ca răspuns la primul contact al organismului cu antigenul.

Imonoglobulinele G (IgG) constituie fracțiunea majoră a imunoglobulinelor plasmatice. Sunt sintetizate în cantitate mare la al II-lea contact cu antigenul.

Imunoglobulinele A (IgA) se găsesc în concentrații mici în plasmă și în secrețiile mucoase din intestin, plămâni, lacrimi, salivă. IgA constituie prima linie de apărare împotriva invaziilor cu agenți patogeni.

Imunoglobulinele E (IgE) sunt recunoscute ca fiind responsabile de unele manifestări ale răspunsurilor alergice. Se află pe leucocite bazofile plasmatice și pe mastocitele din pereții vaselor și după interacția cu antigenele celulare activate mediază răspunsurile alergice.

Imunoglobulinele D (IgD) sunt prezente în plasmă în cele mai mici concentrații; nu se cunoaște exact ce funcție specifică au. [Dr.Sorin Marius Idu 1957]

2.3 Clasificarea modificarilor proteinemiei

Modificări fiziologice ale proteinemiei

Modificări dependente de vârstă – apar valori diferite ale proteinei la un nou născut, în primul an de viață, la un copil de 5 ani, la un adult și la un bătrân.

Cercetările electroforetice ale lui Antogneti au arătat că în cursul îmbătrânirii se produce o scădere a valorilor fracțiunii albuminice și o creștere globală a valorii globulinelor. Creșterea valorilor globulinelor este determinată în mod prevalent de beta și gama globuline. De asemenea creșterea fracțiunii gama globulinice ar fi expresia unei evoluții mezenchimale spre fibroscleroză sau poate a unei încercări de contrabalansare a scăderii albuminelor.

S-a constatat că:

între 60 și 90 de ani există o scădere generală și progresivă a fracțiunii albuminice;

între 60 și 70 de ani fracțiunea gama globulinică e găsită normală sau ușor crescută;

între 70 și 80 de ani valorile fracțiunii alfa globilinice sunt în general subnormale, iar la 90 de ani tabloul este același;

fracțiunea beta globulinică are o tendință netă de creștere de la 60 la 90 de ani;

Modificări patologice ale proteinemiei: disproteinemii propriu-zise

Modificări preponderente ale fracțiunii albuminice

Congenitale: lipsa congenitală, totală din ser – analbuminemia.

Hipoalbulinemii câștigate:

– Boli renale: nefroza lipoidică;

= sindromul nefrotic din cursul infecțiilor cronice, intoxicațiilor cronice și tumorilor;

= nefroza amiloidă;

= pseudonefroza.

– Boli cronice hepatice:

= hepatitele cronice;

= ciroze și boli similare;

= tablouri patologice hepato-renale.

– Boli ale tractului digestiv:

= enterite cronice, pancreatite;

= fistule intestinale;

= subnutriție – denutriție la adult.

Nu se cunosc cazuri de hiperalbulinemie.

Modificări preponderente ale fracțiunilor globulinice

Hiperglobulinemii:

Hiper-gama-globulinemie (disproteinemia de tipul I a lui Riva). Creșterea fracțiunii gama globulinice poare fi izolată, combinată cu o creștere a beta globulinelor sau asociată cu o creștere a fracțiunii gama globulinice.

Fig 2.1 Electroforeza de tip γ-globulinemie

Acest tip de disproteinemie a fost observat în următoarele afecțiuni:

boli ale parenchimului hepatic (ciroza hepatică, distrofia hepatică);

inflamații subcronice și cronice;

boli virotice sau cu protozoare.

Hiper-alfa-globulinemie (disproteinemie de tipul II după Riva). Creștera fracțiunii alfa globulinice poate apărea în mod izolat sau asociată cu o creștere concomitentă a fracțiunii beta globulinice.

Fig.2.2 Electroforeza de tip hiper α-globulinemie

Acest tip de disproteinemie se întâlnește în următoarele boli:

sindrom nefrotic;

nefropatia diabetică;

tumori maligne;

unele mieloame.

Hiper-alfa-gama-globulinemii (disproteinemie de tipul al III-lea a lui Riva). În aceste disproteinemii este vorba de o combinație între hiperglobulinemiile de tipul I și II. Uneori se asociază și o creștere a fracțiunii beta globulinice, realizând un tablou de hiperglobulinemie totală.

Fig 2.3 Electroforeza de tip hiper α-γ-globulinemie

Asemenea tablouri au fost întâlnite în următoarele afecțiuni:

inflamații subcutanate sau subcronice;

tumori maligne.

Hiper-beta-globulinemie izolată (disproteinemie de tipul IV a lui Riva). Acest tip de proteinemie este relativ rar întâlnită. Forma pură a ei este reprezentată de tip beta-mielom. Creșteri izolate ale beta globulinelor se observă în momentul declinului unui proces infecțios sau al unei nefroze.

Fig 2.4 Electroforeza de tip hiper β-globulinemie

Hipogamaglobulinemiile pot fi congenitale sau dobândite și ușor detectate prin metoda electroforezei. [Dr.Sorin Marius Idu 1957]

2.4 Interpretarea modificarilor proteinelor plasmatice

Valorea diagnostică a determinarii proteinelor plasmatice totale este limitată. În medie proteinele plasmatice sunt de 7 g/100 ml.

Hipoproteinemii (scaderea proteinelor totale sub 6 g/100 ml) se pot întâlnii în sindromul nefrotic, în denutriția gravă, fenomene ale malabsorției și unele ciroze hepatice.

Heperproteinemii (creșterea proteinelor totale peste 8 g/100 ml) se constată în inflamații cronice, colagenoze, leucemii și în special în hiperimunoglobulinemiile neoplazice (mielom multiplu, macroglobulinemie Waldenstrom). Aceste modificare ale concentrației proteinelor plasmatice pot surveni în caz de hiperhidratare sau dezhidratare, producând hipo- si hiperproteinemii aparente.

Scăderea albuminelor survine de regulă în toate disproteinemie fiind însă mai accentuată în cauzul unui deficit în aportul de proteine, simdrom de malabsorție, în deficitul de sinteză sau în pierderi de proteine (arsuri, sindrom nefrotic).

Creșterea alfa 1 si alfa 2 globulinelor se însoțește de regulă de o creștere a fibrinogenului și a glicoproteinelor și de o accelerație a VSH-ului. Aceste modificări intervin de obicei în caz de inflamație acută, distrucții tisulare, neoplasm și colagenoze. O creștere marcată a alfa2 globulinelor se întalâlnește și în sindromul nefrotic.

Modificariile beta globulinelor au o importanță diagnostică mai redusă, dar creșterea gama globulinelor indică prezența unei inflamații cronice sau sugerează o proliferare reactivă sau tumorală a imunocitelor producătoare de imunoglobuline. Scăderea gama globulinelor survine în sindromul nefrotic, malnutriție și are uneori un caracter familial.

Modificările electroforetice cele mai caracteristice realizează așa-zisele tipuri de disproteinemie care sunt prezentate în figura urmatoare.

Fig 2.5 Tipuri de disproteinemie

Așa cum reiese din Fig 2.4. inflamația acută se caracterizează prin creșterea alfa1 și alfa2 glicoproteinelor și coincide cu o accelerare accentuată a VSH-ului, inflamația cronică se caracterizază prin creșterea gama globulinelor care are un caracter difuz. De notat că în endocardita bacteriană creșterea gama globulinelor este foarte marcată în timp ce în endocardita reumatică recidivantă cresc alfa2 globulinele.

Pierderea de proteine pe cale renală realizează un aspect tipic cu scăderea marcată a albuminelor și scaderea moderată a gama globulinelor în timp ce alfa2 și beta globulinele cresc.

Pierderea enterală de proteine evoluează cu scăderea albuminelor și creșterea procentuală a celorlalte fracțiuni.

Ciroza hepatică este caracterizată prin scăderea albuminelor și creșterea marcată a gama globulinelor.

Mielomul multiplu evoluează cu o creștere de tip particular a fracțiunii gama. Spre deosebire de aspectul întâlnit în creșterile reactive la gama globulinelor (inflmație cronică, ciroză) în mielom creșterea gama globulinelor e omogenă (banda îngustă și intensă care la fotometrare realizează un pisc ascuțit).

Separarea electroforetică în gel de poliacrilamidă sau în gel de amidon este superioară, dar semnificația clinică a subfracțiunilor izolate cu aceste metode este încă în curs de studiere. De asemenea studierea avansată a proteinelor plasmatice se poate obține prin metode imunologice. Importanța acestor metode constă mai ales în posibilitatea de a se detecta lipsa unor proteine plasmatice.

Testele de labilitate coloidală a serului sunt depășite la ora actuală de metodele electroforetice. Datorită simplității lor, ele nu si-au pierdut însă utilitatea în laboratoarele mai mici, mai ales că metodele moderne au contribuit la o mai bună fundamentare științifică a acestor teste. Se constată astfel un paralelism remarcabil între nivelul gama globulinelor și testul cu sulfat de zinc, iar testul cu timol se pozitivează și în cazul unor procese exudative. Pozitivarea reacției Takata corespunde unei disporteinemii avansate care implică și o scădere marcată a albuminelor altături de creșterea gama globulinelor. [I.Manta 1976]

Capitolul III – Electroforeza în bolile ficatului

Proteinele plasmatice sunt în stare de echilibru cu proteinele tisulare, realizând un shimb continuu între spațiile intravasculare și extravasculare. În jocul acesta permanent ficatul are un rol deosebit de important. El este în mod neîndoielnic locul de formare a fracțiunii albuminice și aproape în întregime a fibrinogenului. Pe lânga rolul sau generator al unor fracțiuni peoteice plasmatice, ficatul intervine și în fenomenele de reglare a schimbului de proteine dintre țesuturi și organe.

În funcția de reglare asupra componenței proteinelor plasmatice, experiențele sugerează o activare pozitivă a ficatului prin hormonul somatotrop hipofizar.

Fig.3.1 Rolul ficatului în ansamblul funcțiilor de reglare a componenței proteice plasmatice

3.1 Hepatita virotică

Prima modificare din tabloul electroforetic al serului se pare că este scăderea procentului de albumină prezentă încă din perioada în care colorația icterică nu a apărut. Hipoalbuminemia se pronuntă apoi în perioada de icter fiind mai importantă în formele cu evoluție prelungită. Aproape în mod concomitent cu scăderea valorilor albuminelor se constată o hiperglobulinemie absolută și relativă. Ea este datorită în primul rând unei creșteri pronunțate a γ-globulininelor. Pe traseele electroforetice unda corespunzătoare fracțiunii γ-globulinice atinge înalțimea fracțiunii albuminice și are o formă zveltă, deci etalată mai mult în înalțime decât în lățime.

În interpretarea clinică modificarea electroforetică din cursul hepatitei virotice acute nu sunt patagnomonice,deci acestea nu pot constitui un element de diagnostic pozitiv, dar acestea permit însă efectuarea unui diagnostic diferențiat astfel:

– în prezența sindromului icteric, față de un icter mecanic, în cursul căruia nu apare imaginea în oglindă din hepatita virotică și în care predomină creșterea fracțiunii β-globulinice și subfracțiunii α2-globulinice;

– în prezența semnelor de insuficiență hepatică, față de ciroza hepatică în care curba fracțiunii γ-globulinice are un aspect de clopot, cu baza mult lărgită.

O creștere moderată a fracțiunii γ-globulinelor cu o sporire netă a fracțiuniilor β-globulinice, alături de o scădere mică a fracțiunilor albuminice, sunt considerate în general ca îndicând un prognostic bun. Creșterea fosfolipidelor în cursul bolii este de asemenea semnul unui bun prognostic. Dimpotrivă scăderile mari ale fracținii albuminice și creșterile persistente ale γ-globulinelor cu tendința la aspect de clopot al diagramei indică o evoluție nefavorabilă.

Fig 3.2 Proteinograma în hepatita virotică

3.2 Spirochetoza ictero-hepatică (Boala lui Weil Vasiliev)

Proteinograma serului arată scăderea fracțiunii albuminice, creșterea fracțiunii γ-globulinice, creșterea considerabila a subfracțiunii α2-globulinice, care reprezintă 21,2% din proteinemia toală, deci o sporire la dublu a ei așa cum autorii respectivi nu au mai întâlnit în nici o afecțiune hepatică. Acest aspect ar putea fi datorat distrugerii tisulare și febrei.

În interpretarea clinică electroforeza în boala lui Weil-Vasiliev nu oferă elemente de diagnostic pozitiv, nefiind patognomică în nici una din formele sale. Ea permite efectuarea unui diagnostic diferențiat față de hepatita acută virotică prin prezența marii creșteri a subfracțiunii α2-globulinică.

3.3 Atrofia hepatică acută și subacută (Icterul grav)

Proteinograma serului ne spune că fracțiunea albuminică poate fi apreciată în acestă perioadă în mod normal numai dacă există trasee electroforetice anterioare ale bolnavului. Prin nerespectarea acestui deziderat se explică unele diferențe de interpretarea întâlnite în literatura de specialitate. De exemplu F.Hartmann vorbește de existența unei hipoalbuminemii marcate dar in acest timp Goltman gasește dimpotrivă o creștere a fracțiunii albuminice. Charbonnier și colaboratorii lui au făcut examene electroforetice zi de zi la bolnavii cu icter grav unde au putut lămuri astfel adevăratul comportament al fracțiunii albuminice: pe lângă o hipoprotidemie globală, fracțiunea albuminelor coboară relativ, în toate cazurile scăderea albuminelor preceda apariția icterului. Aceeastă problemă se pune și în cazul fracțiunilor γ-globulinelor, unde van Dommelen și Hartmann semnalează o creștere a acestei fracțiuni, dar dacă traseele electroforetice se cercetează comparativ se constată că fracțiunea γ-globulinică nu are nici o tendință la creștere în cursul comei hepatice, ci dimpotrivă se stabilizează la o anumită valoare sau scade față de valoarea inițială.

Din punct de vedere clinic, electroforeza nu are o valoare diagnostică în icterul grav sau comă hepatică. Prin scăderea premortală a fracțiunii β-globulinice, metoda electroforetică are o importanță prognostică.

3.4 Ciroza hepatică

Din proteinograma serului reiese că fracțiunea albuminică este găsită scăzută de către toți cercetătorii iar fracțiunea γ-globulinică a fost găsită crescută încă de la primele electroforeze efectuate în ciroza hepatică. Este de remarcat însă că spre deosebire de ceea ce se petrece în hepatita virotică, în ciroză fracțiunea γ-globulinică îmbracă un aspect de clopot având o bază largă și vârful rotunjit, acest aspect rezultă dintr-o întrepătrundere a benzilor β- si γ-globulinice. Apariția acestei confluențe ar fi în mod sigur un motiv de suspiciune pentru existența unei ciroze.

Din punct de vedere clinic electroforeza poate constitui un element de diagnostic pozitv, în special când există trasee comparative ale aceluiași individ din perioada precirotică și aceasta numai în concordanță cu datele clinice. Metoda are o valoare diagnostic-diferențiată, prin conformația în clopot a undei α-globulinelor care permite diagnosticul diferențiat față de o hepatită acută virotică, iar prin ridicarea moderată a undei β-globulinice permite diferențierea față de cirozele biliare.

Valoarea prognostică a electroforezei în ciroze este considerabilă, iar modificările electroforetice semnalate în cursul cirozei asociate cu o proteinemie normală sau crescută indică stadiul de compensare a bolii, în timp ce aceeași modificare electroforetică pe un fond de hipoproteinemie însemnează decompensarea cirozei, deci un prognostic grav.

Scăderea raportului fosfolipide/lipide totale depistat electroforetic sau prin alte metode e de asemenea un semn de prost augur. Creșterea fracțiunii β-globulinice, după unii cercetători indică evoluția spre o degenerescență grasă a ficatului spre deosebire de creșterea subfracțiunii α2-globulicice asociată cu scăderea fracțiunii β-globulinice sugerează faza terminală a bolii.

Fig 3.3 Proteinograma în ciroza hepatică

3.5 Ciroza biliară

Proteinograma serului se caracterizează prin scăderea moderată a fracțiunii albuminice, creșterea moderată a fracțiunii γ-globulinice, creșterea importantă a fracțiunii β-globulinice fiind elementul cel mai caracteristic al traseului din această afecțiune.

Prin interpretarea clinică în ciroza biliară, metoda electroforetică are în primul rând o valoare diagnostic diferențială. Cu ajutorul elctroforezei se poate elimina eventualitatea unei ciroze de tip Laennec datorită creșterii excesive a fracțiunii β-globulinice. Ea permite de asemenea eliminarea posibilității unei simple obstrucții coledociene prin scăderea fracțiunii albuminice, creșterea fracțiunii γ-globulinice și preponderența impresionantă a fracțiunii β-globulinice.

Fig.3.4 Proteinograma în ciroza biliară

Metoda electroforetică aplicată cirozelor biliare aduce și elemente de prognostic.Variațiile în plus sau minus ale β-globulinelor indică insuccese sau succese terapeutice, prognostic rău sau ameliorat.

3.6 Icterul mecanic

Proteinograma serului are un aspect diferit după cum examinarea se face în primele 10-15 zile de la obstrucție sau mai târziu când, pe lângă elementul pur mecanic, se adaugă și leziunile secundare ale parenchimului. O electroforeză executată după 15 zile de la instalarea icterului iși pierde valoarea diagnostică prin modificările fracțiunii γ-globulinice și albuminice, în sensul cunoscut din procesele de hepatită.

Electroforeza efectuată în primele zile de debut a icterului mecenic ne prezintă fracțiunea albuminică nemodifictă sau cu o ușoară scădere spre deosebire de fracțiunea γ-globulinică care se menține în limitele normale sau suferă ușoare creșteri neînsemnate, boala fiind un accident mecanic în cursul unei tulburări metabolice. Modificarea cea mai importană a traseului electroforetic va fi la nivelul α-globulinică care este moderat crescută în cazurile de icter mecanic necomplicat.

Fig 3.5 Proteinograma în icterul mecanic

În interpretarea clinică din punct de vedere diagnostic, proteinograma are valoare numai în icterele mecanice recente, prin creșterea fracțiunii β-globulinice și menținerea în limite normale a celorlalte fracțiuni proteice. Dacă icterul evoluează de mai multe săptamâni, valoarea diagnostică a proteinogramei scade repede din cauza suprapunerii valorilor în creștere ale γ-globulinelor și scăderea fracțiunii albuminice.

3.7 Neoplasmul hepatic

Tabloul electroforetic al neoplasmului primitiv sau secundar al ficatului nu îmbracă un aspect specific. Modificările observate în neoplazii sunt datorită, în special, intensificării catabolismului acizilor nucleici, mai ales a acidului dezoxiribonucleic din nucleii celulari. Rezultatul acestor procese litice este apariția unor glicoproteine în circulanție, acestea au o viteză de migrare în câmpul electroforetic corespunzătoare subracțiunii α2-globulinice.

Din proteinograma serului reiese că fracțiunea albuminică nu prezintă modificări caracteristice, deși se observă o tendință la hipoalbuminemie, fracțiunea cu modificariile cele mai sugestive este cea α-globulinică și anume la nivelul subfracțiunii α2-globulinice.

Electroforeza are o valoare diagnostică de mică importanță în neoplasmele hepatice. Creșterea subfracțiunii α2-globulinice când există trebuie interpretată numai în concordanță cu tabloul clinic. E de presupus că valoarea diagnostică a proteinogramei va crește când va fi executată concomitent cu glucidograma.

Fig 3.6 Proteinograma în neoplasmul hepatic

Prin eliminare s-ar parea că în prezența unei tumori hepatice, cu o electroforeză aproape normală ar trebui să ne gândim la un neoplasm. Totuși nu trebuie să se uite că procesele tumorale benigne care evoluează localizat lăsând porțiuni mari de parenchim hepatic indemn, nu sunt de obicei însoțite de modificări electroforetice caracteristice.

Valoarea prognostică a electroforezei e aproape nulă în neoplasmul hepatic. Totuși dacă evoluția se face spre insuficiență hepatică, electroforeza capătă valoare prognostică.

CONTRIBUȚIA AUTORULUI

Capitolul IV Electroforeza proteinelor serice pe gel de agaroză în laboratorul clinic

Electroforeza proteinelor pe gel de agaroză este tehnica cea mai puțin costisitoare, implicând o cantitate limitată de materiale, timp de lucru scurt și o reproductibilitate foarte bună. Separarea electroforetică a proteinelor serice prezintă un interes major în testele clinice, datorită importantelor informații pe care le oferă acestea în diverse afecțiuni, precum și asupra modalităților de tratare a acestora.

Electroforeza proteinelor se poate testa când medicul investighează simptome ce sugerează prezența mielomului multiplu: dureri de cap, anemie, oboseală, fracturi inexplicabile și infecții recurente, precum și pentru a monitoriza cauza bolii și eficacitatea tratamentului. Producția proteinei monoclonale poate fi urmare a gamapatiei monoclonale cu semnificație nedeterminată. De asemenea se poate testa când simptomele indică o afecțiune inflamatorie, o boală autoimună, infecție acută sau cronică, o dereglare a rinichilor sau a ficatului sau pierderi de proteine.

Se pare că totuși electroforeza nu permite decât o estimare semicantitativă a fracțiunilor de proteine serice deoarece concentrațiile în g/l nu sunt decât extrapolate. Această estimare are o marjă de eroare deoarece prin definiție se bazează pe un principiu fals încă de la început și anume că proteinele din ser au toate aceeași afinitate pentru același colorant, fapt puțin probabil.

Dacă este necesar de a se determina cu precizie albumina, se va face recurs la o tehnică de dozare specifică imunochimică ce va duce la obținerea unui rezultat exact și precis a cărui valoare va fi totdeauna apropiată dar diferită de cea obținută prin electroforeză.

Din aceste motive dar și din altele valoarea în g/l a gama globulinelor prin electroforeză nu poate fi comparată cu suma valorilor obținute în imunochimie pentru cele trei imunoglobuline principale: o parte importantă din imunoglobuline migrează în beta care preia estimarea cantitativă a gama globulinelor din electroforeza și, pe de altă parte, în caz de gamapatie monoclonală rezultatele obținute prin imunochimie cantitativă sunt estimate în funcție de omogenitatea proteinei dozate. Valoarea estimată în g/l a vârfului electroforetic nu are nimic a face cu rezultatele imunochimice. În acest caz, până la dispariția vârfului monoclonal estimarea vârfului electroforetic este mai exactă decât dozarea specifică a imunoglobulinei monoclonale.

Din acest motiv este recomandabil să se supravegheze pacientul prin evoluția vârfului său electroforetic, ceea ce de fapt este mai puțin costisitor.

Toate etapele electroforezei pot fi automatizabile dar există aparate de toate mărimile adaptabile la diferite cantități de muncă care efectuează succesiv toate etapele realizării descrise mai sus.

De fapt evoluția tehnologiilor nefelometrice care permit dozarea specifică și automatizată a proteinelor din ser a redus puternic interesul clinic acordat odinioară acestei metode electroforetice. Acest fapt e paradoxal deoarece pe măsură ce a scăzut acest interes clinic au apărut pe piață aparate foarte performante utile pentru serviciile biologilor.

În prezent diagnosticarea prin electroforeză s-ar putea limita doar la depistarea unei gamapatii monoclonale. În schimb electroforeza proteinelor se păstrează pentru urmărirea pacienților. Ea permite în mod fiabil, sensibil și reproductibil o supraveghere ieftină.

Interpretarea riguroasă a unei electroforeze obligă la urmărirea traseului electroforetic pe gel curba obținută pe densitometru și rezultatele în g/l și %.

4.1 Materiale necesare și modul de lucru pentru electroforeză

Pentru efectuarea analizei de electroforeză a proteinelor serice pe gel de agaroză cu aparatul Platinum folosim urmatoarele materiale si metode din cadrul Laboratorului de analize medicale Sfânta Maria Baia Mare.

Reactivi:

Kit-ul de electroforeză care conține:

gelul de agaroză – 10 folii cu câte 10 locuri pentru probe;

3 flacoane x 100 ml soluție tampon concentrat, fiecare flacon se diluează cu 1000 ml apă distilată pentru obținerea soluției de lucru; după diluare, soluția tampon păstrată la temperatura camerei, este stabilă până la data expirării consemnată pe flacon.

1 flacon x 100 ml cu soluție de colorare concentrată; flaconul se diluează cu 300 ml apă distilată pentru obținerea soluției de lucru; după diluare, soluția de colorare este stabilă până la data expirării consemnată pe flacon;

10 geluri pot fi colorate cu 300 ml soluție diluată de colorare.

1 flacon x 100 ml cu soluție pentru decolorare, concentrată; flaconul se diluează cu 10 l apă distilată sau 10 ml soluție concentrată cu 1000 ml apă distilată;

bandelete de plastic cu fante pentru aplicarea probelor – 10 bucăți

bandelete de hârtie de filtru pentru tamponarea excesului de gel și a excesului de probe.

Kit-ul de electroforeză se păstrează la temperatura camerei, în poziție orizontală, cu fața gelului în sus.

Alți reactivi/materiale necesare care nu sunt incluse în kit-ul de electroforeză:

soluția de fixare – se obține prin amestecul a:

135 ml etanol 96%

30 ml acid acetic glacial

135 ml distilată

Soluția de fixare se prepară cu cel puțin 15’ înainte de utilizare; stabilitatea soluției de fixare este de 3 luni, la temperatura camerei, păstrată într-un flacon bine închis; 5 geluri pot fi procesate cu 300 ml soluție de fixare.

Echipamente de măsurare și materiale necesare: echipament/linie de electroforeză compus din:

Sursa de tensiune care are următoarele caracteristici:

– alimentare: 220 V

– tensiune: 25- 300 V, tensiune stabilizată, curent continuu

– reglaj continuu al tensiunii.

B. Baia de migrare conține baia de electroforeză, cu electrozi din platină și compartiment destinat gelului de agar cu o capacitate pentru soluția tampon de 50 ml pentru fiecare subcompartiment.

C. Densitometru pentru scanarea foliilor de agaroză având softul inclus pentru interpretarea și prelucrarea rezultatelor.

D. Computer și monitor plus:

etuvă;

centrifugă;

balon cotat de 1000 ml (pentru tamponul de lucru );

cilindru gradat cu dop rodat de 1000 ml (pentru soluția de decolorare);

cilindru gradat de 50 ml (pentru măsurarea tamponului);

pipetă semiautomată;

vârfuri (conuri);

băi (pentru fixare, colorare, pentru decolorare o cuvă);

mănuși de protecție.

Mod de lucru:

Pregătirea băii de migrare

Se conectează baia la sursa de alimentare prin introducerea cablurilor de legătură. Se toarnă în cuvă 50 ml soluție tampon în fiecare compartiment. După efectuarea migrării se va elimina soluția tampon.

Pregătirea probelor

Serurile proaspete sau păstrate la frigider și aduse la temperatura camerei înainte de procesare se diluează cu tampon diluat. Se pregătesc 10 probe pentru cele 10 poziții de pe gel.

Pregătirea gelului de agaroză

Se scoate gelul din folia de aluminiu și apoi din ambalajul de plastic, având grijă să nu se atingă suprafața cu agaroză a gelului. Gelul se sprijină pe ambalajul de plastic, în poziție orizontală, cu suprafața cu agaroză în sus. Se utilizează o bandeletă de hârtie de filtru pentru uscarea zonei pe care vor fi aplicate probele; se îndepărtează imediat bandeleta de hârtie de filtru udă. Se aplică pe gel, în zona deja uscată, o bandeletă de plastic, prevăzută cu fante pentru aplicarea probelor; fantele din extremități se poziționează în apropierea celor două puncte negre de orientare de pe gel, se deplasează degetul arătător de-a lungul bandeletei de plastic, presând-o pentru a asigura aderarea fermă a bandeletei pe gel.

Fig.4.1 Pregătirea gelului de agaroză

Aplicarea probelor

Se ia o cantitate de 5 l din prima probă, cu pipeta și se aplică în prima fantă de pe bandeleta de plastic poziționată pe gel asigurând corespondența între numărul de ordine al probei și numărul de ordine al fantei de pe bandeleta de plastic de pe gel. Se așteaptă 5’ după aplicarea ultimei probe. Se înlătură excesul de ser prin tamponarea bandeletei de plastic cu o bandeletă de hârtie de filtru. Se îndepărtează bandeletele de plastic și de filtru cu aceeași mișcare.

Migrarea

Prinzând gelul, cu două mâini de suprafața fără agaroză se curbează și se introduce în baia de migrare cu fața în jos (suprafața cu agaroza) orientând locul de aplicare a probelor spre catod. Se închide camera de migrat, se pornește sursa de tensiune, timpul stabilit pentru migrare este de 20’ la o tensiune de 100 V. După expirarea timpului de migrare, tensiunea se deconectează automat.

Fig.4.2 Baia de migrare

Fixarea

După terminarea migrării se scoate gelul din baia de migrare și se imersează în cuva cu soluție de fixare, în poziție verticală pentru 15’ apoi se introduce în etuvă pentru uscarea foliilor, în poziție orizontală, unde se lasă până ce gelul este complet uscat.

Colorarea

Se imersează gelul în soluție de colorare în poziție verticală timp de 3’.

Decolorarea

Se pregătesc două cuve cu soluție de lucru de decolorare și o cuvă cu apă distilată. La expirarea perioadei de colorare se scoate gelul din soluția de colorare, se introduce și se clătește în băile cu soluție de decolorare și apa distilată succesiv, astfel încât partea unde nu a avut loc migrarea să devină transparentă.

Uscarea

Se scoate gelul din cuva cu apă distilată și se introduce în poziție orizontală în etuva pentru uscarea foliilor până la uscarea lui completă.

Fig.4.3 Uscarea gelului

Citirea gelului la densitometru.

Fig.4.4 Densinometru si calculator

4.2 Rezultate obținute

Probele de sânge studiate au fost analizate în cadrul Laboratorului de analize medicale apartinând Policlinicii Sfânta Maria Baia Mare, unde s-a urmarit efectuarea analizei de electroforeză pe gel de agaroză .

Buletinul nr.1

Tipul analizei: Electroforeza proteinelor serice

Operator: Chimist Slavita Gabriel

Echipament: PLATINUM

Nume Pacient:Z.G

Vârstă:28 ani

Sex: F

Diagnostic:Hepatita B (HbS)

Buletinul nr.2

Tipul analizei: Electroforeza proteinelor serice

Operator: Chimist Slavita Gabriel

Echipament: PLATINUM

Nume Pacient:S.P

Vârstă:20 ani

Sex: M

Diagnostic:Hepatita B (HbS)

Buletinul nr.3

Tipul analizei: Electroforeza proteinelor serice

Operator: Chimist Slavita Gabriel

Echipament: PLATINUM

Nume Pacient:D.D

Vârstă:64 ani

Sex: M

Diagnostic:Hepatita B (HbS)

Buletinul nr.4

Tipul analizei: Electroforeza proteinelor serice

Operator: Chimist Slavita Gabriel

Echipament: PLATINUM

Nume Pacient:P.I

Vârstă:61 ani

Sex: M

Diagnostic:Hepatita C (Hcv)

Buletinul nr.5

Tipul analizei: Electroforeza proteinelor serice

Operator: Chimist Slavita Gabriel

Echipament: PLATINUM

Nume Pacient:C.M

Vârstă:64 ani

Sex: F

Diagnostic:Hepatita C (Hcv)

Buletinul nr.6

Tipul analizei: Electroforeza proteinelor serice

Operator: Chimist Slavita Gabriel

Echipament: PLATINUM

Nume Pacient:C.V

Vârstă:53 ani

Sex: M

Diagnostic:Hepatita B (Hbs)

Buletinul nr.7

Tipul analizei: Electroforeza proteinelor serice

Operator: Chimist Slavita Gabriel

Echipament: PLATINUM

Nume Pacient:V.R

Vârstă:27 ani

Sex: F

Diagnostic:Hepatita B (Hbs)

Buletinul nr.8

Tipul analizei: Electroforeza proteinelor serice

Operator: Chimist Slavita Gabriel

Echipament: PLATINUM

Nume Pacient:B.I

Vârstă:31 ani

Sex: F

Diagnostic:Hepatita B (Hbs)

Buletinul nr.9

Tipul analizei: Electroforeza proteinelor serice

Operator: Chimist Slavita Gabriel

Echipament: PLATINUM

Nume Pacient:O.T

Vârstă:63 ani

Sex: F

Diagnostic:Hepatita C (Hcv)

Buletinul nr.10

Tipul analizei: Electroforeza proteinelor serice

Operator: Chimist Slavita Gabriel

Echipament: PLATINUM

Nume Pacient:B.D

Vârstă:57 ani

Sex: M

Diagnostic:Hepatita C (Hcv)

Buletinul nr.11

Tipul analizei: Electroforeza proteinelor serice

Operator: Chimist Slavita Gabriel

Echipament: PLATINUM

Nume Pacient:B.V

Vârstă:46 ani

Sex: F

Diagnostic:Hepatita C (Hcv)

Buletinul nr.12

Tipul analizei: Electroforeza proteinelor serice

Operator: Chimist Slavita Gabriel

Echipament: PLATINUM

Nume Pacient:P.O

Vârstă:67 ani

Sex: M

Diagnostic:Hepatita B (Hbs)

Buletinul nr.13

Tipul analizei: Electroforeza proteinelor serice

Operator: Chimist Slavita Gabriel

Echipament: PLATINUM

Nume Pacient:O.D

Vârstă:51 ani

Sex: M

Diagnostic:Hepatita C (Hcv)

Buletinul nr.14

Tipul analizei: Electroforeza proteinelor serice

Operator: Chimist Slavita Gabriel

Echipament: PLATINUM

Nume Pacient:M.L

Vârstă:35 ani

Sex: F

Diagnostic:Ciroză hepatică

Buletinul nr.15

Tipul analizei: Electroforeza proteinelor serice

Operator: Chimist Slavita Gabriel

Echipament: PLATINUM

Nume Pacient:F.F

Vârstă:54 ani

Sex: F

Diagnostic:Sindrom nefrotic

Buletinul nr.16

Tipul analizei: Electroforeza proteinelor serice

Operator: Chimist Slavita Gabriel

Echipament: PLATINUM

Nume Pacient:F.M

Vârstă:94 ani

Sex: F

Diagnostic: Hepatita cronică neclasata la alte locuri

Buletinul nr.17

Tipul analizei: Electroforeza proteinelor serice

Operator: Chimist Slavita Gabriel

Echipament: PLATINUM

Nume Pacient:P.A

Vârstă:62 ani

Sex: F

Diagnostic: Sindrom nefrotic

Buletinul nr.18

Tipul analizei: Electroforeza proteinelor serice

Operator: Chimist Slavita Gabriel

Echipament: PLATINUM

Nume Pacient:B.A

Vârstă:62 ani

Sex: M

Diagnostic: Sindrom nefrotic

Buletinul nr.19

Tipul analizei: Electroforeza proteinelor serice

Operator: Chimist Slavita Gabriel

Echipament: PLATINUM

Nume Pacient:V.M

Vârstă:55 ani

Sex: F

Diagnostic: Ciroză hepatică

Buletinul nr.20

Tipul analizei: Electroforeza proteinelor serice

Operator: Chimist Slavita Gabriel

Echipament: PLATINUM

Nume Pacient:N.F

Vârstă:63 ani

Sex: F

Diagnostic: Hepatită cronică

Buletinul nr.21

Tipul analizei: Electroforeza proteinelor serice

Operator: Chimist Slavita Gabriel

Echipament: PLATINUM

Nume Pacient:R.B

Vârstă:55 ani

Sex: F

Diagnostic: Hepatită cronică neclasată la alte locuri

Buletinul nr.22

Tipul analizei: Electroforeza proteinelor serice

Operator: Chimist Slavita Gabriel

Echipament: PLATINUM

Nume Pacient:C.L

Vârstă:40 ani

Sex: M

Diagnostic: Hepatită cronică neclasată la alte locuri

Buletinul nr.23

Tipul analizei: Electroforeza proteinelor serice

Operator: Chimist Slavita Gabriel

Echipament: PLATINUM

Nume Pacient:C.L

Vârstă:40 ani

Sex: M

Diagnostic: Hepatită C (Hcv)

4.3 Interpretarea rezultatelor

Control Normal

Tipul analizei: Electroforeza proteinelor serice

Operator: Chimist Slavita Gabriel

Echipament: PLATINUM

Nume Pacient:Control Normal

Vârstă:-

Sex:-

Diagnostic:-

Control Patologic

Tipul analizei: Electroforeza proteinelor serice

Operator: Chimist Slavita Gabriel

Echipament: PLATINUM

Nume Pacient:Control Patologic

Vârstă:-

Sex: –

Diagnostic:-

4.4 Discuții

Fig.4.1Fregvența pacienților pe sexe, vârstă și diagnostic

Din totalul pacienților analizați (23) se poate observa că numarul femeilor (56,52 %) este mai mare decât al barbaților (43,48%).

Fig 4.2 Fregvența fracțiunilor electroforetice analizate

Fig 4.3 Fregvența valorilor biochimice efectuate din serul pacienților analizați pentru electroforeză