Prezentată și susținută public la FACULTATEA DE MEDICINĂ BUCUREȘTI În data de … De către Mădălina GRIGOROIU PROFIL GENOMIC AL CANCERELOR… [307122]

UNIVERSITATEA DE MEDICINĂ CAROL DAVILA BUCUREȘTI

FACULTATEA DE MEDICINĂ

ȘCOALA DOCTORALĂ …..

TEZĂ DE DOCTORAT

Prezentată și susținută public la

FACULTATEA DE MEDICINĂ BUCUREȘTI

În data de …

[anonimizat]-MICI ȘI INVAZIE DE GANGLIOI MEDIASTINALI

Coordonator de teză: Profesor Doctor Teodor HORVAT

DISCIPLINA: CHIRURGIE

SPECIALITATEA: Chirurgie Toracică

Membrii juriului:

– raportor

– raportor

– examinator

– președinte

–

MULȚUMIRI

CUPRINS

Rezumat

Lista tabelelor și a [anonimizat]-[anonimizat] (GPN2)

REZUMAT

OBIECTIVE

STRATEGIE

PARTENERI

MATERIALE ȘI METODE

EȘANTIOANE PRELEVATE

Eșantioane de țesuturi

Eșantioane sanguine și urinare

Transportul eșantioanelor

HISTOLOGIE

PROFIL GENOMIC

Prepararea eșantioanelor și extracția ARN

Controlul calității ARN

Analiza datelor

SECVENȚIERE

REZULTATE

PACIENȚI INCLUȘI ÎN PROTOCOL

CHIMIOTERAPIE NEOADJUVANTĂ ȘI RĂSPUNS

CLASIFICAREA ÎN LOTURI PROGNOSTICE

PROFILE DE EXPRESIE microARN ȘI CĂI DE SEMNALIZARE

SECVENȚIERE

SEMNĂTURI GENICE PROGNOSTICE

DISCUȚII

CONCLUZII

BIBLIOGRAFIE

ANEXE

Rezumat

Cancerul pulmonar este o problemă majoră de sănătate în România și în lume. [anonimizat] a [anonimizat].

Supraviețuirea la 5 ani a tuturor stadiilor este în jur de 16% atât în Europa cât și în Statele Unite ale Americii [1]. Acest prognostic sumbru se explică în parte prin apariția tardivă a [anonimizat]. La acestea se adaugă o agresivitate și o capacitate de metastazare destul de ridicată a majorității cancerelor pulmonare.

Iată doar câteva motive pentru care este necesar să se realizeze progrese în studiul cancerului pulmonar în general și a formelor agresive și/[anonimizat].

[anonimizat]-un stadiu de evoluție avansat (IIIA cu invazia ganglionilor mediastinali) [anonimizat], un profil molecular cu prognostic favorabil. [anonimizat] 2011 și până în decembrie 2012.

Această lucrare a fost totodată ocazia realizării unei treceri în revista a [anonimizat], precum și a stadiului dezvoltării tehnicilor de studiu în biologia moleculară.

[anonimizat]. [anonimizat] „[anonimizat]. Fără Răspuns La Chimioterapie” a fost depus în mai 2014.

Lista tabelelor și a figurilor

Tabele

Tabel 1. Incidența, Mortalitatea și Prevalența la 5 ani a cancerului pulmonar în lume.

Tabel 2. Estimarea mortalității și incidenței în funcție de vârstă în România: ambele sexe.

Tabel 3: Mortalitatea și incidența cancerului pulmonar în România în anul 2012, pe decade de vârstă (Globocan 2012).

Tabel 4. Stadializarea cancerului bronhopulmonar după American Joint Committee on Cancer (AJCC) 2009, ediția a 7-a.

Tabel 5. Incidența, mortalitatea și prevalența cancerului pulmonar în funcție de diferitele regiuni ale Globului (Globocan 2014).

Tabel 6. Evoluția supraviețuirii la 5 ani a cancerului pulmonar în Statele Unite ale Americii.

Tabel 7. Supraviețuirea la 5 ani în funcție de stadializarea clinică versus stadializarea postoperatorie după Goldstraw.

Tabel 8. Criteriile OMS de definire a răspunsului la chimioterapia neoadjuvantă în tratamentul cancerului bronho-pulmonar cu celule non-mici.

Tabel 9. Exemple de concentrații și raportul 260/280 pentru probele ARN purificate.

Tabel 10. Statistica datelor pentru o probă.

Tabel 11. Statistica de distribuție pentru o probă.

Tabel 12: Statistica SNP-urilor pentru o probă.

Tabel 13: Statistica InDel pentru o probă.

Tabel 14. Cauzele de excludere.

Tabel 15. Caracteristicile generale ale populației studiate.

Tabel 16. 16A. Gene sub-exprimate

16B. Gene supra-exprimate.

Tabel 17. Lista celor 44 de gene cu un p ≤ 0.01.

Tabel 18. Termeni GO semnificativi pentru seturile de gene de variantă mare la responders.

Tabel 19. Termeni GO semnificativi pentru seturi de gene de variantă mare la non-responders.

Tabel 20. Valoarea p pentru căile KEGG care sunt semnificative cu un p <0.05, pentru cel puțin unul din cele 5 seturi de date de in-put, definite de la A la E. Valorile aflate sub cutoff sunt subliniate. Prima linie a antetului arată sexul pacienților (M=masculin, F=feminin) din subgrup. A doua linie arată tipul ganglionilor limfatici. Ultima linie a antetului arata numărul de non-responders și de responders (non-responders/responders) luați în calcul. De notat că există doar o singură femeie în grupul de responders, și prin urmare nu a fost luat în considerare un subgrup numai de femei.

Tabel 21. Cele 19 căi semnificative, bazate pe diferențele de sex.

Tabel 22. Mediile numărului de secvențieri a țintei per probă.

Tabel 23. Numărul total de SNP per probă.

Tabel 24. Numărul total de In/Del per probă.

Tabel 25. Gene cu mutații cu un p-value ≤ 0.01.

Tabel 26. Secvența SNPs (Single Nucleotid Polymorphism).

Figuri

Figura 1. Incidența, Mortalitatea și Prevalența la 5 ani a cancerului pulmonar în lume, în funcție de sex (GLOBOCAN 2012, IARC).

Figura 2. Incidența estimată a cancerului pulmonar în lume în 2012: bărbați.

Figura 3. Incidența estimată a cancerului pulmonar în lume în 2012: femei.

Figura 4. Incidența, Mortalitatea și Prevalența la 5 ani a cancerului pulmonar în România, în funcție de sex (GLOBOCAN 2012, IARC).

Figura 5. Evoluția epidemiologiei cancerului pulmonar în funcție de sex (Studiul KBP-2010).

Figura 6. Incidența cancerului pulmonar în lume.

Figura 7. Harta ganglionilor loco-regionali.

Figura 8. Anomalii moleculare ale cancerelor pulmonare epidermoide.

Figura 9. Prevalența mutațiilor în Adenocarcinomul pulmonar după Lung Cancer Mutation Consortium (http://www.golcmc.com).

Figura 10. Riscul de a deceda prin cancer pulmonar înainte de 75 de ani (%).

Figura 11. Supraviețuirea la 5 ani a pacienților diagnosticați cu cancer pulmonar în 2003, toate stadiile cumulate după OMS – AICC/Raportul Mondial asupra Cancerului (NCI Lung Cancer Homepage: http://www.cancer.gov/cancer_information/cancer_type/lung/).

Figura 12. Bioterapii țintite disponibile pentru tratamentul cancerului pulmonar.

Figura 13. Mutații ale EGFR care conferă o sensibilitate crescută sau o rezistență la Inhibitorii de Tirozinkinaza a EGFR.

Figura 14: Tratamente ce țintesc mecanisme moleculare specifice în cancerul pulmonar.

Figura 15. Schema de design pentru cercetarea prin tehnologie microarray.

Figura 16. Protocol de analiza microarray.

Figura 17. Tehnologia de capturare a exomului, după Agilent Technologies (http://www.genomics.agilent.com/article.jsp?pageId=3083 )

Figura 18. Partenerii proiectului GPN2

Figura 19. Traseul eșantioanelor biologice.

Figura 20. Metodologia proiectului

Figura 21. Raport ARN total Bioanalizor 2100.

Figura 22: Pașii de lucru pentru estimarea concentrației gDNA cu ajutorul Qubit

(http://www.lifetechnologies.com/ro/en/home/brADNs/product-brADN/qubit/qubit-fluorometer.html#how)

Figura 23: Migrare electroforetică în gel de agaroză 1%, Ladder 100-3000 bp.

Figura 24. Planul de realizare al experimentului microarray.

Figura 25. Raportul de calitate al experimentului microarray (este prezentat raportul pentru un array (o probă).

Figura 26. Semnalele înregistrate pentru un array după extracția datelor din fișierele .tif cu Feature Extraction.

Figura 27. Graficul de tip heat map al expresiilor genice pentru primele 100 cele mai variabile gene.

Figura 28. Rezultatele analizei bio-informatice: Procedura experimentala standard de whole exome sequencing.

Figura 29: Statistica de distribuție pentru o probă.

Figura 30: Statistica InDel pentru o probă.

Figura 31. Formarea loturilor prognostice.

Figura 32. 32A: Selecția a 3745 gene cu un p value < 0.05.

32B: Selecția a 2550 gene cu un p value < 0.05 și un fold change ≥2.

Figura 33. Analiza clusterelor pentru genele cu expresie diferențială între țesutul normal și tumoral (culoarea roșie indică nivele crescute de expresie în țesutul tumoral față de cel normal, culoarea albastră indică nivele scăzute de expresie, culoarea galbenă – fără modificare de expresie).

Figura 34. Căile de semnalizare identificate

Figura 34A. Calea receptor ADNrogen.

Figura 34B. Calea BCR.

Figura 34C. Calea EGFR1.

Figura 34D. Calea IL2.

Figura 34E. Calea IL5.

Figura 34F. Calea IL7.

Figura 34G. Calea KIT receptor.

Figura 34H. Calea TCR.

Figura 34I. Calea Wnt.

Figura 35. Acumularea totală de perturbare în calea poliartritei reumatoide la pacienții de sex masculin non-responders/responders (A) și femei/bărbați (B). În albastru sunt CTLA4 și CD28. În portocaliu este FLT1. Această cale poate fi analizată interactiv și mai în detaliu la www.genome.jp/kegg-bin/show_pathway?hsa05323.

Figura 36. Acumularea totală de perturbare în calea tiroiditei autoimune la pacienții de sex masculin non-responders/responders (A) și femei/bărbați (B). În albastru este CD28. CD40 și FAS sunt activate la femei comparativ cu bărbații (portocaliu), dar down-regulate (albastru) la non-responders față de responders. Această cale poate fi analizată interactiv și mai în detaliu la www.genome.jp/kegg-bin/show_pathway?hsa05320 .

Figura 37. Acumularea totală de perturbare în calea de semnalizare a citokinelor pentru pacienții de sex masculin non-responders/responders (A) și femei/bărbați (B). Cascadele coerente de perturbare sunt trasate prin linii de culoare roșie. Marea majoritate a efectelor asupra acestei căi sunt opuse. Față de responders, non-responders au o down-regulare generală a întregii căi iar pacienții de sex feminin au o activare generală a întregii căi comparativ cu bărbații. Această cale poate fi analizată interactiv și mai în detaliu la www.genome.jp/kegg-bin/show_pathway?hsa04062.

Figura 38. Genele identificate, cu p value semnificativ statistic, prin whole genome sequencing între loturile de pacienți analizați.

Figura 39. Rețeaua generată de programul String 9.05 pentru SENP5.

Figura 40. Rețeaua generată de programul String 9.05 pentru NCBP2.

Figura 41. Rețeaua generată de programul String 9.05 pentru RGP1.

Figura 42. Rețeaua generată de programul String 9.05 pentru GBA2.

Figura 43. Rețeaua generată de programul String 9.05 pentru SLFN12L.

Lista abrevierilor

ADK: Adenocarcinom

ADN: Acid dezoxiribonucleic

ADNc: ADN complementar

ARN : Acid ribonucleic

ARNm : ARN mesager

ASR (W): Age-stADNardised rate (W)

CPCNM: Cancer pulmonar cu celule non-mici

CT: Computer Tomograf

EGFR: Receptorul Factorului de Creștere Epidermic (Epidermal Growth Factor Receptor)

IARC: Agenția Internațională de Cercetare a Cancerului

OMS: Organizația Mondială a Sănătății

PCR : Reacție de Polimerizare în Lanț

RMN: Rezonanță Magnetică Nucleară

RT: Revers Transcripție

TEP: Tomografie prin Emisie de Pozitroni

Lista publicațiilor, prezentărilor și brevet

1. Gene-expression Profiling in Non-small Cell Lung Cancer with Invasion of Mediastinal Lymph Nodes for Prognosis Evaluation. Mădălina Grigoroiu, Rebecca Tagett, Sorin Drăghici, Simona Dima, Anca Năstase, Raluca Florea, Andrei Sorop, Veronica Ilie, Nicolae Bacalbașa, Valeria Tica, Viktoria Laszlo, Audrey Mansuet-Lupo, Dianne Damotte, Walter Klepetko, Irinel Popescu ADN Jean-Francois Regnard. Cancer Genomics & Proteomics 12(5): 231-242 (2015).

2. The Gene Profile Of Non-Small Cell Lung Cancer ADN The Invasion Of Mediastinal Ganglia. Mădălina Grigoroiu, Simona Dima, Anca Năstase, N. Bacalbașa, Viktoria Laszlo, W. Klepetko, I. Popescu, J.F. Regnard. Journal of Translational Medicine ADN Research, volume 19, no. 1 – 2, 2014.

3. Prognostic Genetic Signatures In Stage Iiia Non-Small Cell Lung Cancer. Mădălina Grigoroiu, Simona Dima, Anca Năstase, Viktoria Laszlo, N. Bacalbașa, V. Herlea, W. Klepetko, I. Popescu, J.F. Regnard. Annals of Fundeni Hospital, volume 18, no. 1 – 4, January – December 2013.

4. Poster la Simpozionul “Academician Nicolae Cajal”, 12 – 14 mai 2014, București: Identification of Gene expression profiles in non-small cell lung carcinoma. Anca Năstase, Mădălina Grigoroiu, Simona Dima, Irinel Popescu, Jean-Francois Regnard.

5. Poster la Simpozionul "Academician Nicolae Cajal", 27-29 martie, București: Analysis of Molecular Profiles ADN Identification of new possible biomarkers in non-small cell lung cancer patients. Anca Năstase, Mădălina Grigoroiu, Simona Dima, Viktoria Laszlo, Irinel Popescu, Jean-Francois Regnard.

6. Depunerea brevetului de invenție cu titlul „Mutații Genice Ca Semnături Prognostice În Cancerul Pulmonar Cu Celule Non-Mici La Pacienții Cu Răspuns Vs. Fără Răspuns La Chimioterapie” (nr OSIM A00349/ 7.05.2014 și modificarea din 014531/19.05.2014)

INTRODUCERE

Chimioterapia citotoxica standard este eficientă pentru anumite tipuri de cancer, dar pentru multe alte tipuri, tratamentele disponibile oferă doar un beneficiu de supraviețuire limitat. Cancerul pulmonar este un astfel de cancer. Dezvoltarea de terapii specifice este cea mai mare promisiune pentru tratarea cu succes a acestei boli, dar o abordare orientată depinde de înțelegerea genomului celulelor tumorale. Secvențierea exomului unui număr mare de probe tumorale de cancer pulmonar a oferit o primă imagine a profilului mutațiilor somatice a acestor tumori. Astfel de studii de secvențiere au confirmat frecvența mare de mutații TP53 și KRAS în cancerul pulmonar, au descoperit mutații de inactivare în unele gene supresoare de tumori cunoscute și neasociate anterior cu cancerul pulmonar, și au identificat mutații ale oncogenei EGFR pe care s-a bazat prima terapie țintită pentru adenocarcinomul pulmonar. Și alte oncogene candidate așteaptă validarea funcțională. Este de așteptat ca secvențierea viitoare a întregului exom și a întregului genom al cancerului pulmonar să dezvăluie un peisaj mai detaliat al mutațiilor somatice care pot fi exploatate în scopuri terapeutice.

Cancerul pulmonar este principala cauza de deces prin cancer în lume reprezentând aproximativ 1,2 milioane de decese în fiecare an [1]. La momentul diagnosticului, 30% dintre pacienți sunt diagnosticați într-un stadiu local avansat, pentru care strategia de tratament este încă controversată și depinde starea patologică a ganglionilor limfatici. Rata de supraviețuire globala la 5 ani a cancerului pulmonar este de numai 16%, în mare măsură determinată de frecvența mare a diagnosticului tardiv, cu tumori nonrezecabile [1]. Cancerul pulmonar poate fi clasificat din punct de vedere histologic, în 2 mari categorii [2]. Prima categorie este Cancerul pulmonar cu celule non-mici (CPCNM) ce cuprinde 3 mari categorii de forme histologice și anume: adenocarcinom pulmonar, carcinom cu celule scuamoase și carcinom cu celule mari. A doua categorie este reprezentată de carcinomul pulmonar cu celule mici.

Rata de supraviețuire foarte redusă a cancerului pulmonar reflectă insuficiența chimioterapiei citotoxice tradiționale; tratamentele specifice orientate către anumite puncte slabe ale celulelor tumorale sunt cea mai importantă promisiune pentru viitor. Mutațiile somatice care activează oncogene duc frecvent la dependența celulelor tumorale de produsele oncogenice modificate [3,4] o proprietate exploatată de terapia țintită. Prin urmare, identificarea leziunilor oncogenice recurente de care depinde supraviețuirea celulei tumorale ar putea duce la noi terapii ale cancerului pulmonar.

Un experiment pe scară largă de secvențiere directă a exomului tumoral, Proiectul de Secvențiere Tumorală (TSP), a fost realizat cu scopul de a determina mutațiile somatice recurente în adenocarcinomul pulmonar. În acest experiment, toți exonii codanți a 623 de gene cu rol în oncogeneză, au fost secvențiate în 188 de perechi de ADN din tumori / țesut normal, ceea ce a dus la identificarea de 1.013 mutații somatice nonsinonime [5]. Analiza statistică a indicat 26 de gene cu mutații semnificative.

Aceste 26 de gene cu mutații semnificative au inclus mai multe oncogene și genele supresoare deja cunoscute a fi implicate în cancerul pulmonar: KRAS, TP53, STK11, EGFR, și CDKN2A. În plus au mai fost identificate câteva gene cu mutații semnificative, neidentificate până atunci în adenocarcinomul pulmonar, inclusiv câteva gene supresoare cunoscute și câteva gene ale tirozin kinazei care sunt în curs de validare funcțională.

Descriem aici cunoștințele actuale în legătura cu genomul cancerului pulmonar, subliniind implicațiile terapeutice.

Cunostințele viitoare rezultate din secventierea întregului exom și a intregului genom, facilitate de tehnologii de secvențiere de ultimă generație, va revoluționa probabil încă o dată înțelegerea genomului acestei boli.

În ciuda progreselor semnificative în dezvoltarea de noi terapii țintite, rata ridicată a mortalității în cancerul pulmonar subliniază cu fermitate necesitatea unei prevenții și a unei depistări mai eficiente a cancerului pulmonar, precum și o mai bună clasificare a pacienților care vor putea astfel beneficia de un anumit tip de terapie.

Microarrays este o tehnologie folosita de mai mult de două decenii în cercetarile preclinice cu scopul de a determina profilele de expresie genică asociate cu diferite subgrupuri tumorale histopatologice sau diferitele evoluții clinice, și pentru a evalua funcțiile biologice și celulare determinate de aceste seturi de gene.

Pacienții cu cancer pulmonar cu celule non-mici (CPCNM) în stadiul IIIA (invazia ganglionilor mediastinali – N2+) reprezintă un grup heterogen de pacienți: Ruckdeschel [6], împarte acești pacienți în trei grupe: ganglioni N2 cu invazie minimă sau microscopică, descoperiți întâmplător în timpul sau după intervenția chirurgicală; pacienți cu N2+ diagnosticați pre-operator, imagistic sau chirurgical; și pacienții cu N2+ masiv, din mai multe stații ganglionare. În ultimii 20 de ani, au fost propuse mai multe strategii de tratament diferite pentru a trata pacienții cu CPCNM în stadiul IIIA [7]. Diferitele opțiuni terapeutice includ: un tratament neoadjuvant prin chimioterapie sau chimio-radioterapie urmat de chirurgie; chirurgie primară urmata de chimioterapie adjuvantă, cu sau fără radioterapie secvențială; chimio-radioterapie definitivă, fără intervenție chirurgicală [8-10].

Mai multe studii clinice de faza II și III au demonstrat fezabilitatea clinică și îmbunătățirea supraviețuirii prin administrarea chimioterapiei neoadjuvante [8, 10, 11-17]. În cele mai multe dintre aceste studii, sterilizarea ganglionilor mediastinali (downstaging) și rezecția chirurgicală completă sunt predictori ai supraviețuirii pe termen lung [11, 12].

În cazul unui cancer bronho-pulmonar cu celule non-mici cu invadarea ganglionilor mediastinali (N2+), atitudinea terapeutică acceptată în prezent este cea a unui abord multimodal ce constă din chimioterapie neoadjuvanta pe baza de săruri de platina, urmata de rezecție chirurgicală completă pentru pacienții care au răspuns sau au fost stabilizați de chimioterapie. După chimioterapia neoadjuvanta, aproximativ 5% din pacienți vor avea un răspuns complet. Majoritatea pacienților vor avea un răspuns parțial (mai mult de 50% reducție tumorală), dar numărul pacienților care vor fi doar stabilizați sau vor avea un răspuns minor, rămâne foarte important (aproximativ 40%). Supraviețuirea globala la 5 ani a pacienților cu cancer bronho-pulmonar cu celule non-mici cu invadarea ganglionilor mediastinali (N2) este de 20-25%, însa analiza de subgrup arată că supraviețuirea la 5 ani a celor care au răspuns la chimioterapie este de 42%, versus 10% la cei care nu au răspuns la chimioterapie (18).

Este prin urmare evident că pentru aproximativ 40% dintre pacienții în stadiul IIIA tratamentul prin chimioterapie neoadjuvanta nu aduce niciun beneficiu, în schimb expune pacientul riscului efectelor adverse și al diferitelor complicații dintre care unele majore. În plus, aceste tratamente sunt în general foarte costisitoare.

Studiul de fața are ca obiectiv determinarea unei semnături genice cu valoare de prognostic, care sa permită definirea acestui grup de pacienți înainte de orice tratament.

Astfel, am realizat experimente microarray pe eșantioane de țesut tumoral provenit din ganglionii tumorali mediastinali recoltați chirurgical înainte de tratamentul prin chimioterapie neoadjuvanta, de la 27 de pacienți cu CPCNM în stadiul IIIA. În funcție de răspunsul la tratamentul neoadjuvant în conformitate cu criteriile OMS [19], s-au determinat două grupuri de pacienți: Lotul A – pacienții care au avut un răspuns parțial, au fost stabilizați sau nu au răspuns la chimioterapie; Lotul B – pacienții care au avut un răspuns major sau complet la tratamentul de inducție. În fine, s-au realizat expresiile genice pentru cele două grupuri de pacienți prin analiza microarray utilizând tehnologia Agilent One-Color Microarray. Datele microarray au fost apoi analizate și pentru identificarea principalelor căi de semnalizare implicate în diferențierea celor două grupuri de pacienți.

Ulterior s-a realizat secvențierea exomului (Whole Exome Sequencing) țesutului tumoral din ganglionii tumorali mediastinali recoltați chirurgical înainte de tratamentul prin chimioterapie neoadjuvanta și s-au comparat cele două grupuri de pacienți. Am determinat astfel 5 gene modificate specific fiecărui grup de pacienți, în raport cu răspunsul la chimioterapia neoadjuvantă.

CANCERUL PULMONAR

Termenul de “cancer primitiv de plămân” sau “cancer bronșic primitiv” definește tumorile maligne ale căror origine este o celulă a parenchimului pulmonar sau a bronșiilor.

Acest termen regrupează deci un mare număr de tipuri de tumori ce au un comportament și un prognostic diferit. Aceste tumori pot fi însă împărțite în două mari categorii foarte distincte: cancerul pulmonar cu celule non mici (CPCNM) și cancerul pulmonar cu celule mici (CPCM).

Prima categorie este de departe cea mai frecventă, reprezentând aproximativ 80% din cancerele pulmonare.

Clasificarea cancerelor pulmonare este în plină evoluție.

Mult timp bazată în exclusivitate pe caracteristicile histologice ale tumorii, această clasificare tinde din ce în ce mai mult să ia în considerare date genetice și moleculare ce și-au dovedit valoarea de prognostic și care pot ghida alegerea tratamentelor aplicate.

EPIDEMIOLOGIE

Incidența

Cancerul pulmonar a fost cel mai frecvent cancer în lume timp de câteva decenii. Din raportul Globocan 2012 al Agenției Internaționale de Cercetare a Cancerului (IARC) de la Organizația Mondială a Sănătății (http://globocan.iarc.fr/Default.aspx) reiese că în 2012 au fost diagnosticate 1,8 milioane de cazuri noi (12,9% din totalul cancerelor). Din acestea, 58% s-au regăsit în regiunile cele mai slab dezvoltate (Tabelul 1).

ASR (W): Age-standardised rate (W) = rata de decese într-un an la 100000 persoane dacă populația luată în considerare ar avea o structură standardizată de vârstă.

Tabelul 1: Incidența, Mortalitatea și Prevalența la 5 ani a cancerului pulmonar în lume.

Cifrele mortalității, foarte apropiate de cele ale incidenței, îl plasează ca primă cauză de deces prin cancer la bărbați și pe locul trei la ambele sexe (Figura 1).

Figura 1: Incidența, Mortalitatea și Prevalența la 5 ani a cancerului pulmonar în lume, în funcție de sex (GLOBOCAN 2012, IARC).

Cancerul pulmonar rămâne cel mai frecvent cancer la bărbați în lume (1,2 milioane, 16,7% din totalul cancerelor) (Figura 2). Cea mai mare incidența normalizată după vârsta estimată este în Europa Centrală și de Est (53,5 la 100000) și Asia de Est (50,4 la 100000). Incidențe extrem de scăzute se înregistrează în Africa Centrală și de Vest (2,0 și 1,7 la 100000 respectiv) (http://globocan.iarc.fr/Default.aspx).

Figura 2: Incidența estimată a cancerului pulmonar în lume în 2012: bărbați.

La femei, incidența cancerului pulmonar este mai scăzută și distribuția geografică este un pic diferită, reflectând în principal diferența istorică de expunere la tabagism (Figura 3). Astfel cele mai mari incidențe se înregistrează în America de Nord (33,8) și Europa de Nord (23,7) și o rată relativ ridicată în Asia de Est (19,2), iar incidența cea mai scăzută se regăsește din nou în Africa de Vest și Centrală (1,1 si 0,8 respectiv) (http://globocan.iarc.fr/Default.aspx).

Figura 3: Incidența estimată a cancerului pulmonar în lume în 2012: femei.

În România, peste 70% dintre bolnavii de cancer pulmonar sunt diagnosticați în stadii avansate, iar 90% dintre aceștia nu supraviețuiesc mai mult de un an de la diagnostic. Cancerul bronhopulmonar se situează pe locul II după cel de prostată la bărbați și cel de sân la femei, însă ca mortalitate ocupă primul loc la ambele sexe. Unul din trei decese prin cancer in rândul bărbaților și unul din patru decese prin cancer în rândul femeilor sunt cauzate de cancerul pulmonar. Între 1960 și 1990, decesele prin cancer pulmonar în rândul femeilor au crescut cu aproximativ 40%. Anual, mai mult de 330.000 de români sunt diagnosticați ca având cancer pulmonar și mai mult de 300.000 decedează din cauza acestei boli.

În tabelele 2 si 3 se regăsesc incidența, mortalitatea și prevalența la 5 ani a cancerului pulmonar în România, iar în figura 4 și în funcție de sex așa cum sunt raportate în Globocan 2012 (GLOBOCAN 2012, IARC).

Tabel 2: Estimarea mortalității și incidenței în funcție de vârsta în România: ambele sexe.

Numărul brut și ASR(W) sunt exprimate la 100,000.

Cum.[0-74] = Risc Cumulativ, exprimat în procente.

Tabel 3: Mortalitatea și incidența cancerului pulmonar în România în anul 2012, pe decade de vârstă (Globocan 2012).

Figura 4: Incidența, Mortalitatea și Prevalența la 5 ani a cancerului pulmonar în România, în funcție de sex (GLOBOCAN 2012, IARC).

Vârsta, sexul și variația în timp

Vârsta mediana de diagnostic a cancerului pulmonar se situează în jur de 70 de ani (20). Această vârstă variază de la o țară la alta și depinde în parte de politica de sănătate.

În Franța, anchetele epidemiologice KBP 2000 și KBP 2010 (21, 22) au arătat că 56,2% din pacienții diagnosticați cu cancer bronho-pulmonar au între 51 și 70 de ani. Media de vârstă la momentul diagnosticului este în ușoară creștere, fiind de 65,5+/-11,3 ani în 2010 fața de 64,3 +/- 11,5 ani în 2000 (p<0,0001).

Femeile fumează din ce în ce mai mult. Anchetele epidemiologice KBP 2000 și KBP 2010 realizate în Franța (23) arată o creștere a procentului de femei bolnave de cancer pulmonar, care era de 11% în 1993 și de 24,5% în 2010 (Figura 5).

Acest fenomen este observat în toate tările industrializate și se estimează că în 2020 cancerul bronhopulmonar ar putea ajunge pe primul loc în ierarhia îmbolnăvirilor prin cancer la femei, depășind cancerul de sân. În 2050, femeile ar putea fi atinse de acesta maladie în aceeași proporție ca și bărbații.

Figura 5: Evoluția epidemiologiei cancerului pulmonar în funcție de sex (Studiul KBP-2010).

Repartiție geografică, etnicitate

Figura 6 preluată din GLOBOCAN 2012 (http://globocan.iarc.fr/Pages/Map.aspx#) arată că incidența cancerului pulmonar se caracterizează printr-o mare disparitate geografică. Nivelele cele mai mari de incidentă și mortalitate sunt regăsite în Statele Unite ale Americii și Europa. În Asia, printre țările cele mai atinse se numără China, Kazahstan și cele două Coree. Țările cele mai puțin atinse sunt India și țările din Africa.

Figura 6. Incidența cancerului pulmonar în lume.

FACTORI DE RISC

Este dovedită existența unor factori de risc în declansarea cancerului pulmonar.

IntoxicaȚia tabagicĂ

Intoxicația tabagică este primul factor de risc în cancerul pulmonar. Rolul sau a fost pus în evidență atât prin studii epidemiologice cât și prin studii de biologie moleculară.

Astăzi se știe ca aproape un cancer din trei este datorat intoxicației tabagice.

Un fumător are un risc de aproape 10 ori mai mare de a declanșa un cancer pulmonar față de o persoană care nu a fumat niciodată (Agenția Internațională de Cercetare a Cancerului, 2007). Tabagismul activ este responsabil de 80% din cancerele bronșice.

În ziua de azi 92% din decesele prin cancer pulmonar la bărbați și 71% din decesele prin cancer pulmonar la femei sunt datorate tabacului.

Riscul de a dezvolta un cancer bronșic este direct proporțional cu doza (cantitatea) de tutun precum și cu durata intoxicației.

Tutunul este nociv indiferent de doză. Nu există un prag sub care tutunul nu este cancerigen.

Fumul de tutun conține mai mult de 4000 de substanțe chimice din care cel puțin 50 sunt cancerigene. Leziunile pre cancerigene apar rapid după începerea intoxicației cu tutun; acestea au fost regăsite la fumători în vârstă de 20 de ani.

Tabagismul pasiv (inhalarea fumului de țigară degajat de unul sau mai mulți fumători) crește riscul de cancer pulmonar cu 26% în raport cu un nefumător.

EXPUNEREA PROFESIONALĂ

Institutul Național de Cercetare și Securitate (INRS) din Franța estimează că 4 până la 8,5% din cazurile de cancer ar fi de origine profesională. În ceea ce privește cancerul pulmonar, această cifră s-ar ridica la 15%. Dacă se asociază tabagismul la una din expunerile profesionale, riscul crește cu 20 până la 50%.

RADONUL

Radonul este un gaz radioactiv incolor și inodor prezent în mod natural în atmosferă. Acest gaz este eliberat în aer prin dezintegrarea naturală a uraniului în sol. Radonul poate fi prezent în unele locuințe, în mod special în regiunile ale cărui sol este bogat în uranium sau în zonele vulcanice.

ASZBESTUL

Inhalarea de fibre de aszbest este recunoscută ca factor de risc de cancer bronșic.

La fumători, acest risc este de 50-90 de ori mai mare decât în populația generală.

IRADIEREA MEDICALA

Persoanele care au avut un tratament prin radioterapie toracică (cancer de sân, boala Hodgkin etc) au un risc crescut de a dezvolta un cancer pulmonar. Acest risc este și mai crescut la fumători.

ANTECEDENTELE PERSONALE

Afecțiunile pulmonare care cresc riscul de a dezvolta un cancer bronșic sunt:

Bronhopatia cronică obstructivă – obstrucția progresivă a căilor respiratorii

Silicoza – fibroza pulmonară secundară inhalării de prafuri de siliciu (cuart)

Berilioza – inflamația bronșică determinată de inhalarea de prafuri sau vapori de beriliu

Tuberculoza – infecție pulmonară cauzată de bacilul tuberculozei

Persoanele care au avut deja un cancer pulmonar au un risc crescut de a dezvolta un al doilea cancer pulmonar.

VÂRSTA

Îmbătrânirea favorizează apariția cancerelor în general. Vârsta medie de apariție a cancerului pulmonar este de 64 de ani la femei și 65 de ani la bărbați.

ALIMENTAȚIA

Consumul de alimente bogate în beta caroten (morcovi, roșii, broccoli, caise etc) de către fumători sau foști fumători crește riscul de apariție a cancerului pulmonar.

ALTELE

– Inhalarea de praf și vapori de arsenic.

– Inhalarea de praf și vapori de cadmiu.

– Berilium, siliciul și gazele de eșapament al motoarelor diesel

– Prafuri de cobalt asociate cu carbura de tungsten.

DIAGNOSTIC ȘI STADIALIZARE

CLASIFICAREA TNM American Joint Committee on Cancer (AJCC) 2009 (Tabel 4):

TX – Tumora nu poate fi evaluată sau este demonstrată prin prezența de celule maligne în expectorație sau în lavaj broncho-alveolar fără ca să poată fi văzută prin examene endoscopice sau imagistice

T0 – Tumora primitivă nu este pusă în evidența

Tis – Carcinom in situ.

T1 – Tumora de 3 centimetrii (cm) sau mai puțin în diametrul său cel mai mare

– T1a – Tumora de 2 cm sau mai puțin în diametrul său cel mai mare

– T1b – Tumora mai mare de 2 cm dar care nu depășește 3 cm în diametrul său cel mai mare

T2 – Tumora mai mare de 3 cm dar care nu depășește 7 cm în diametrul său cel mai mare sau care prezintă caracterele următore:

invazia bronșiei principale la 2 cm de carină sau mai departe

invazia pleurei viscerale

prezența de atelectazie sau de pneumopatie obstructive fără să atingă tot plămânul

– T2a – Tumora mai mare de 3 cm dar care nu depășește 5 cm în diametrul său cel mai mare

– T2b – Tumora mai mare de 5 cm dar care nu depășește 7 cm în diametrul său cel mai mare

T3 – Tumora mai mare de 7 cm sau:

invazia directă a uneia din structurile următoare: perete toracic, diafragm, nerv frenic, pleura mediastinala, pleurala sau parietala sau pericard

prezența tumorii în bronșia principală la 2 cm de carină sau mai aproape

prezența de atelectazie sau de pneumopatie obstructive care atinge tot plămânul

prezența unui nodul tumoral distinct în același lob

T4 – tumora de orice mărime care invadează direct cel putin una din structurile următoare: mediastin, cord, vase mari, trahee, nerv laringeu recurent, esofag, corp vertebral, carenă, sau prezența unui alt nodul tumoral distinct în alt lob pulmonar de aceeași parte

NX – ganglionii nu pot fi evaluați

N0 – nu exista metastaze ganglionare regionale

N1 – metastaze în ganglionii limfatici intrapulmonar, peribronșici și/sau hilari de aceeași parte, inclusiv prin invazie directă

N2 – metastaze în ganglionii limfatici mediastinali de aceeași parte și/sau subcarinari

N3 – metastaze în ganglionii limfatici mediastinali controlaterali, hilari controlaterali, scalene sau sub claviculari de aceeași parte sau controlaterali

MX – metastazele la distanță nu au fost evaluate

M0 – nu sunt metastaze la distanță

M1 – metastaze la distantă

M1a – nodul(i) tumoral distinct într-un lob controlateral; noduli pleurali sau epanșament pleural malign.

M1b – metastaze la distanță

Tabel 4. Stadializarea cancerului bronhopulmonar după American Joint Committee on Cancer (AJCC) 2009, ediția a 7-a.

Stadiile I și II sunt considerate precoce.

Stadiile III și IV sunt considerate local avansate și metastatice.

În figura 7 este redată harta ganglionilor de drenaj pulmonar loco-regional.

Figura 7. Harta ganglionilor locoregionali.

ANATOMOPATOLOGIE

Marea majoritate a cancerelor bronșice sunt carcinoame – proliferări maligne ale celulelor epiteliale.

Din punct de vedere histologic există două mari categorii de carcinoame pulmonare:

carcinoame cu celule non mici ce reprezintă aproximativ 80% din cancerele pulmonare primitive

carcinoame cu celule mici ce reprezintă aproximativ 17% din cancerele pulmonare primitive (2).

Alte tipuri de cancere pulmonare primitive sunt:

tumori carcinoide 0,8% (24).

Sarcoame 0,1%

cancere necaracterizate 1,9% (25).

Carcinoamele cu celule non mici au un prognostic și tratament similar. În această categorie există trei subtipuri:

carcinomul epidermoid 31,2% (2), derivate din țesutul pulmonar.

adenocarcinomul cu subtipurile papilar, solid, acinar și lepidic, 29,4% (2), derivate din glandele bronșice.

carcinomul pulmonar cu celule mari

Frecvența adenocarcinoamelor este în creștere, în mod particular la femei, la care acest tip de cancer reprezintă jumătate din cancerele bronho-pulmonare diagnosticate (22).

Această schimbare a repartiției tisulare a cancerului pulmonar, este pusă în legătură cu schimbarea compoziției țigaretei și utilizarea din ce în ce mai frecventă a tabacului blond cu filtru.

Din același studiu, reiese că proporția de cancere cu celule mici (16,5%) este constantă.

SUSCEPTIBILITATE GENETICĂ ȘI EPIGENETICĂ

În declanșarea cancerului pulmonar poate interveni o susceptibilitate genetică individuală.

Au fost descrise diferite mutații genetice favorizante:

la nivelul EGFR (26).

în regiunea ce corespunde genei ce codează un receptor al unui derivat de nicotină din cromozomul 15q (27).

mutații ale unor gene ce intervin în repararea ADN (28).

Unele polimorfisme genetice sunt de asemeni asociate cu riscul crescut de a declanșa un cancer pulmonar în cazul expunerii la factori de risc. Aceste polimorfisme includ gene ce codifică Interleukina 1 (29), citocromul P450 (30), diferiți promotori ai apoptozei cum este caspaza 8 și ai moleculelor reparatoare de ADN cum ar fi XRCC (31).

Studii recente sugerează ca alela 309G a MDM2 este un factor de risc cu penetrație slabă a cancerului pulmonar la asiatici (32).

CARACTERISTICI GENETICE SI MOLECULARE

Ca și alte tipuri de cancere, cancerul de plămân este provocat prin activarea oncogenelor sau prin inactivarea genelor supresoare de tumori (33).

Sub acțiunea diferiților factori cancerigeni, proto-oncogenele se transformă în oncogene (34). Între 10 și 30% din adenocarcinoamele pulmonare sunt consecința unor mutații ale proto-oncogenei K-ras (35, 36). Receptorul EGFR (factor de creștere epidermică) controlează proliferarea, apoptoza, angiogeneza și invazia tumorală. Diferite mutații și amplificari ale EGFR sunt frecvente în cancerul pulmonar cu celule non mici (35).

MUTAȚII GENICE CUNOSCUTE ÎN CANCERUL PULMONAR

Analiza genomică detaliată a cancerelor pulmonare și progresele tehnologice au permis punerea în evidență numeroase alterări moleculare și căi de activare a mecanismului oncogenic.

În prezent, 63% din cancerele pulmonare epidermoide prezintă alterări moleculare ce ar putea deveni o țintă terapeutică (Figura 8).

Ampl: amplificare; del: deleție; mut: mutație

Figura 8. Anomalii moleculare ale cancerelor pulmonare epidermoide.

Inhibitori ai FGFR-1, FGFR-2, PI3KCA și DDR2 sunt în curs de cercetare în studii terapeutice de fază I.

Studierea mutațiilor moleculare în adenocarcinomul pulmonar a făcut obiectul mai multor studii. Proiectul de Secvențiere Tumorală (TSP) este unul dintre acestea (5). În acest studiu, s-a realizat secvențierea tuturor exonilor codanți a 623 de oncogene implicate în adenocarcinomul pulmonar, permițând identificarea a 1013 mutații somatice distincte. Analiza statistică a indicat faptul că 26 de gene erau mutate în mod semnificativ, dintre care unele cum ar fi KRAS, TP53, STK11, EGFR, și CDKN2A, sunt deja cunoscute ca fiind implicate în cancerul pulmonar (Figura 9).

Figura 9. Prevalența mutațiilor în Adenocarcinomul pulmonar după Lung Cancer Mutation Consortium (http://www.golcmc.com).

Mutații exclusive

Modificări somatice ale 7 oncogene în cancerul pulmonar [37]: KRAS, EGFR, ALK, ERBB2, BRAF HER2 și ROS1 se exclud reciproc. Cinci dintre aceste gene (KRAS, EGFR, ALK, ERBB2, BRAF) sunt regăsite în mai mult de 50% din adenocarcinoamele pulmonare. De fapt, pacienții cu mutații în aceste cinci gene pot reprezenta până la 90% dintre pacienții asiatici care nu au fumat niciodată [38]. Prin urmare, posibilitatea de a inhiba terapeutic funcțiile acestor gene modificate ar reprezenta un progres semnificativ în lupta împotriva cancerului pulmonar.

KRAS

La om, au fost identificate trei gene RAS diferite: KRAS (omoloagă cu oncogena virusului lui Kirsten al sarcomului șobolanului), HRAS (omoloagă cu oncogena virusului lui Harvey al sarcomului șobolanului) și NRAS (inițial izolată de la un neuroblastom uman). Diferitele gene RAS sunt foarte asemanatoare structural, dar distincte funcțional. Proteine ​​RAS sunt GTPaze mici, care trec de la forme inactive legate de guanozin difosfat (GDP) în forme active legate de trifosfat guanozina (GTP). Proteine ​​RAS sunt mediatori cheie în aval de receptorii factorilor de creștere și sunt esențiale pentru proliferarea, supraviețuirea și diferențierea celulelor. RAS are capacitatea de a activa căile de semnalizare în aval din celulă. Aceste căi includ calea PI3K – AKT – mTOR, care este implicată în supraviețuirea celulară, și calea RAS – RAF – MEK – ERK, care este implicată în proliferarea celulară.

RAS a fost implicat în patogeneza mai multor tipuri de cancer. Mutațiile activatoare ale genei RAS au ca și consecința activarea constitutivă aRAS GTPazei, chiar și în absența semnalizării de către factorii de creștere. Rezultatul este un semnal continuu de proliferare celulară. Gene specifice RAS sunt frecvent mutate în diferite forme de cancer. Mutațiile KRAS sunt deosebit de frecvente în cancerul de colon, cancerul pulmonar și cancerul pancreatic [39].

Mutații KRAS în cancerul pulmonar cu celule non mici (CPCNM)

Aproximativ 15-25 % dintre pacienții cu adenocarcinom pulmonar au mutații KRAS. Mutațiile KRAS sunt rare în carcinoamele cu celule scuamoase [40]. În cele mai multe cazuri, aceste mutații sunt mutații punctiforme rezultate prin înlocuirea unui aminoacid la poziția 12 (cel mai frecvent), 13 sau 61. Acest lucru duce la activarea constitutivă a căilor de semnalizare ale KRAS. Mutații KRAS sunt găsite în tumori atât la fumători cât și la foști fumători și nefumători. Ele sunt mult mai rare la nefumători, precum și la pacienții asiatici, comparativ cu cei nord-americani sau europeni [38, 41, 42]. KRAS nu pare a avea o valoare prognostică în CPCNM netratat [43]. Foarte puține studii prospective randomizate au fost efectuate folosind KRAS ca un biomarker pentru stratificarea opțiunilor terapeutice în tratamentul cancerului metastatic. Spre deosebire de cancerul de colon, mutațiile KRAS în CPCNM nu sunt un predictor negativ al rezultatului tratamentului prin anticorpi anti – EGFR. În schimb, mutațiile KRAS sunt un factor predictiv negativ al răspunsului radiologic la inhibitori ai tirozin kinazei EGFR, gefitinib și erlotinib [41, 44]. Într-un studiu care a inclus 17 de pacienți cu mutații KRAS, ganetespibul, un inhibitor de HSP90, a demonstrat o activitate redusă [45]. La om, în asociere cu docetaxel, selumetinib, un inhibitor de MEK1/MEK2, a demonstrat o activitate la pacienții aflați în tratament de linia a doua pentru CPCNM metastatic având KRAS mutantă. În acest studiu randomizat, perioada fără recidiva (PFR) a fost de 5,3 luni în grupul selumetinib / docetaxel față de 2,1 luni în grupul placebo / docetaxel (HR 0,58 p = 0,014) [46].

În prezent, nu există nici un medicament cu efect direct anti KRAS.

EGFR

Receptorul factorului de creștere epidermală (EGFR) aparține unei familii de receptori de tirozin kinaza (RTK), care includ EGFR/ERBB1, HER2/ERBB2/NEU, HER3/ERBB3 și HER4/ERBB4. Legarea liganzilor, cum ar fi factorul de creștere epidermal (EGF) induce o modificare conformațională care permite homo-sau hetero-dimerizarea receptorului, iar rezultatul este începutul activității EGFR kinazei. Astfel activat, EGFR își fosforilează substraturile sale, ducând la activarea mai multor căi de semnalizare în aval, din celula: PI3K-AKT-mTOR, care este implicată în supraviețuirea celulară, și RAS-RAF-MEK- ERK, care este implicată în proliferarea celulară.

Mutații EGFR în cancerul pulmonar cu celule non-mici (CPCNM)

Aproximativ 10% dintre pacienții cu CPCNM în SUA și 35% în Asia de Est au mutații EGFR în tumori [47-49]. Aceste mutații se produc în exonii 18 și 21 ai genei EGFR, care codifică o porțiune din domeniul kinazei a receptorului. Aproximativ 90% dintre aceste mutații sunt deleții în exonul 19 sau mutații punctiforme L858R în exonul 21 [50]. Aceste mutații determină creșterea activității kinazei EGFR, care duce la hiperactivarea căilor de semnalizare în aval [51] și o sensibilitate la tratamentul cu inhibitori ai tirozin kinazei [50]. Cu toate acestea, anumite mutații (inserții în exonul 20, mutația T790M) semneaza prezența unei rezistențe inițiale sau, mai frecvent, dobândită la inhibitorii de tirozin kinaza [52).

Indiferent de apartenența etnică, mutațiile EGFR sunt mult mai frecvente în tumorile de tip adenocarcinom la pacienții nefumători (definiți ca mai puțin de 100 de țigări în viața pacientului), de sex feminin [47-49]. Cu toate acestea, mutații EGFR pot fi de asemenea găsite și în alte subgrupuri de CPCNM: fumători actuali și foști fumători, alte tipuri histologice.

ALK

Fuziuni ale genei ALK sunt prezente la aproximativ 3-7% din tumorile pulmonare. Prezența lor a demonstrat eficacitatea primului inhibitor de ALK, crizotinib.

ALK este un receptor de tirozin kinază, care poate fi anormal în multe tipuri de cancer. De exemplu, mutații activatoare ale ALK sunt găsite în unele neuroblastoame [53-56]. Fuziuni ALK au fost descrise în limfomul anaplazic cu celule mari (NPM-ALK) [57], la tumori myofibroblastice inflamatorii (IMT) [58] și în cancerul pulmonar cu celule non-mici (CPCNM) [59-63]. Toate fuziunile ALK conțin întregul domeniu tirozin kinaza al receptorului. Până în prezent, toate fuziunile ALK evaluate biologic au demonstrat o activitate oncogenică in vitro și in vivo [57, 59, 62, 63].

Diferiții partenerii de fuziune N-terminală favorizează dimerizarea și prin urmare activitatea kinazei [64]. Semnalizare în aval a acestor fuziuni se traduce prin activarea căilor implicate în creșterea și proliferarea celulară.

Fuziuni ALK în cancerul pulmonar cu celule non mici (CPCNM)

Fuziuni ale genei ALK sunt prezente la aproximativ 3-7% din tumorile pulmonare [60, 62, 65-68]. Aceste fuziuni ALK sunt mai des întâlnite în rândul fumătorilor de mici cantități (<10 PA) și / sau nefumători [60, 62, 65, 68, 69]. Fuziuni ALK sunt de asemenea mai frecvente în tumorile la tineri [65, 68, 69] în adenocarcinoamele cu componență acinară [68, 69], sau prezență de celule în inel cu pecete [665].

Terapeutic, prezența fuziuni EML4-ALK este asociată cu rezistența la inhibitori de EGFR (EGFR TKI) [70].

Mai multe tipuri de rearanjări de ALK au fost descrise în CPCNM. Majoritatea acestor variante de fuziune cuprind o parte a genei EML4 asociată cu gena ALK. Au fost identificate cel puțin nouă variante de fuziune EML4-ALK în CPCNM [59, 60, 62, 63, 67, 8, 71]. În plus, au fost identificate variante de fuziune non-EML4, de exemplu KIF5B-ALK [63] și TFG-ALK [61]. În practică, prezența unei rearanjari a ALK este detectată prin fluorescență în hibridizarea in situ (FISH). FISH nu poate determina subtipul specific de fuziune ALK prezentă într-o probă de țesut. Dezvoltarea detectării anomaliilor ALK prin RT-PCR [72] ar trebui să permită identificarea subtipurilor de anomalii. În plus, rezultatele RT-PCR par să fie bine corelate cu cele ale FISH. S-a dovedit ca rearanjarea ALK ar putea fi, de asemenea, detectată pe celule tumorale circulante printr-o tehnica FISH modificată. Această tehnică permite realizarea pe țesut atunci când cADN din țesutul tumoral nu este disponibil și urmărirea evoluției în timp a numărului acestor celule [73]. În fine, au început să se dezvolte tehnici de imunohistochimie pentru a detecta anomalii ale ALK [74].

În cele mai multe cazuri, prezența unor rearanjamente ALK exclude prezența altor mutații oncogene în CPCNM (mutații EGFR, mutații KRAS, etc). [65, 66, 68, 38, 75]. Cu toate acestea, a fost descrisă coexistența cu alte anomalii moleculare (mutații EGFR și mai ales MET) [76].

Crizotinibul (Xalkori), un inhibitor de ALK și al receptorului c-Met, a fost recent aprobat de către autoritățile americane și europene în tratamentul CPCNM la pacienții care prezintă o fuziune ALK [77].

Într-un studiu de fază I care implică 149 de pacienți cu fuziune ALK, rata de răspuns radiologic a fost de 61% la tratamentul cu crizotinib, un inhibitor (TKI) de ALK / MET [78]. Mediana de supraviețuire fără progresiune a fost de 9,7 luni, iar 75% dintre pacienți au fost în viața la un an. Un studiu internațional de fază III, randomizat, în cancerul pulmonar avansat ce prezintă fuziuni ALK, a comparat crizotinibul cu chimioterapia standard, ca tratament după progresia bolii după tratamentul standard în prima linie. Rezultatele arată un beneficiu pentru crizotinib în termeni de supraviețuire fără progresia bolii 7.7 luni vs 3.0 luni pentru chimioterapia standard [79]. Noi Inhibitori de ALK sunt în dezvoltare, cum ar fi CH5424802, care a dat o rată de răspuns de 93,5% într-un studiu de fază 2 la pacienți netratați anterior cu inhibitor de ALK [80].

Sensibilitate la pemetrexed la pacienții cu cancer pulmonar ce prezintă o rearanjament ALK a fost obiectul unor studii retrospective care nu au permis se se facă o concluzie. Un studiu a arătat că pacienții cu cancer pulmonar și un rearanjament ALK au avut o rată de răspuns și o supraviețuire fără progresie mai bună daca au fost tratați cu pemetrexed în monoterapie sau în combinație [81]. Trebuie remarcat faptul că nici unul dintre pacienți ALK incluși în acest studiu nu au fost tratați anterior cu crizotinib. În schimb, un alt studiu retrospectiv a arătat o supraviețuire fără progresie similara cu ceea a pacienților fără acest tip de anomalie [82].

Într-un studiu ne-randomizat de fază II a IPI-504, un inhibitor de HSP-90, la pacienții cu cancer pulmonar avansat, aflați în progresie sub tratament cu EGFR TKI, tumorile a trei dintre pacienți s-au dovedit a avea un rearanjament ALK. Doi dintre acești pacienți au avut un răspuns parțial, iar cel de-al treilea au avut o stabilizare prelungită a bolii (7.2 luni, scădere de 24% a dimensiunii tumorii) [83]. Într-un studiu de fază 2 a unui alt inhibitor de HSP-90, ganetespib, 7 din 8 pacienți cu cancer pulmonar și o rearanjare ALK, netratați cu crizotinib, au avut un beneficiu clinic sub formă de răspuns parțial (4 pacienți) sau boala stabilă (3 pacienți) [45].

Până în prezent au fost găsite mai multe mutații punctiforme în domeniul tirozin kinazei ALK la pacienții cu rezistență dobândită la crizotinib, inhibitor TKI ALK.

Prin rezistență dobândită se înțelege progresia maladiei, după un răspuns inițial obținut cu tratamentul aplicat. În prezent nu sunt bine cunoscute mecanismele de dobândire a rezistenței la crizotinib, inhibitorul de ALK / MET. Câteva studii pe cohorte mici de pacienți au arătat că mutații în domeniul kinazei a ALK pot duce la rezistență dobândită la crizotinib. Mutațiile descrise pot conferi diferite grade de sensibilitate sau rezistență la ALK TKI de a doua generație.

Noi strategii terapeutice sunt în curs de evaluare la pacienții cu CPCNM ALK +, cu scopul de a trata sau preveni rezistența asociată cu aceste mutații [84].

ERBB2

Mutații somatice ale ERBB2 au fost descrise în adenocarcinomul pulmonar pentru prima dată în același an ca și mutațiile EGFR, deși la o frecvență mai mică, de aproximativ 2-4% [85,86]. Aceste mutații sunt de obicei mici inserții în domeniului kinazei al exonului 20, analog mutațiilor de rezistența primara ale EGFR în exonul paralog 20. ERBB2 este un receptor tirozin kinaza care nu leagă nici un ligand cunoscut, dar homodimerizeaza sau heterodimerizeaza cu EGFR și alți membrii ai familiei ERBB, ERBB3 și ERBB4, pentru a activa semnalul căilor în aval [87]. Aceste mutații sunt activatoare și stau la baza testelor de transformare a oncogenelor celulare și răspund in vitro la inhibitorii ireversibili ai EGFR, care de asemenea leagă și inhibă ERBB2 [88, 89-91]. Rămâne de demonstrat în ce măsură acești inhibitori sunt eficienți clinic împotriva mutațiilor în domeniul kinazei ale ERBB2 găsite în adenocarcinomul pulmonar. Anticorpul Trastuzumab activ în cancerul de sân nedeterminat pentru ERBB2 amplificat, nu este promițător în modelele preclinice cu ERBB2 mutant [91-93].

Mutații oncogene sensibile la medicamente ale domeniului extracelular al EGFR au fost descrise în glioblastom [94,95] ceea ce sugerează posibilitatea că mutații ale domeniului extracelular al ERBB2 sa fie găsite de asemenea, la pacienții cu cancer. De fapt, în adenocarcinomul pulmonar a fost raportat existența mutației S310F, mutație codantă ERBB2. Această mutație, deși nu frecventă în adenocarcinomul pulmonar, a fost găsită și în alte tipuri de cancer, și este oncogenică și sensibilă la inhibitori ireversibili de EGFR / ERBB2 in vitro, subliniind necesitatea de a căuta dincolo de domeniul kinazei al ERBB2 pentru a găsi mutații somatice activatoare relevante clinic.

BRAF

BRAF este o kinază care joacă un rol cheie în calea de semnalizare a kinazelor MAP. În cancerul pulmonar, aceste mutații sunt rare și sunt în mare parte regăsite la adenocarcinomul fumătorilor.

BRAF aparține unei familii de serin-treonin kinaze care include ARAF, BRAF, și CRAF (RAF1). Kinazele RAF sunt mediatori cheie în calea de semnalizare a MAP kinazei. Ele își exercită efectul în mod principal prin fosforilarea și activarea MEK care are loc prin dimerizare (homo sau hetero-) a moleculelor RAF. Ca parte din calea MAP kinazei, RAF joacă un rol esențial în multe procese celulare, cum ar fi proliferarea, diferențierea și reglementarea transcrierii.

Mutații ale BRAF au fost implicate în patogenia mai multor tipuri de cancer, incluzând melanomul, cancerul pulmonar cu celule non-mici, cancerul colorectal, cancerul papilar tiroidian, și cancerul ovarian [96].

Mutații BRAF în cancerul pulmonar cu celule non mici (CPCNM)

Mutațiile somatice ale BRAF au fost găsite în aproximativ 3-5% din CPCNM [40, 96-99], în principal în adenocarcinoame. Mutațiile BRAF se găsesc în principal la fumători sau foști fumători [97, 98, 100].

Spre deosebire de melanom unde majoritatea mutațiilor BRAF apar pe valina 600 (mutația V600) în exonul 15 al domeniului kinazei, mutațiile BRAF în cancerul pulmonar apar și la alte niveluri ale domeniului kinazei. Într-un studiu pe 739 de pacienți cu adenocarcinom pulmonar, 36 de pacienți prezentau mutații BRAF (4,9%). La acești 36 de pacienți, mutațiile BRAF identificate au fost de tipul V600E la 57% din aceste cazuri și non V600E la 43% din cazuri [99]. Într-o alta serie a fost găsită o proporție de 50% V600E și 50% non V600E [101].

HER2

Mutațiile HER2 sunt rare în cancerul pulmonar. Rezultatele preliminare sugerează eficacitatea unor terapii anti HER2.

HER2 aparține unei familii de receptori de tirozin kinaza (RTKs), care includ EGFR/ERBB1, HER2/ERBB2/NEU, HER3/ERBB3 și HER4/ERBB4. Gena HER2 este localizată pe cromozomul 17 ; acesta este amplificat cu mai multe copii ale genei în diferite tipuri de cancer [102].

Nu se cunosc în ziua de azi liganzi HER2. Cu toate acestea, HER2 pare a fi partenerul de dimerizare preferat pentru toți receptorii familiei ERBB [103]. Legarea liganților, urmată de hetero dimerizarea receptorului determină activarea activității de kinază a HER2. HER2 activat își fosforilează substraturile sale, ducând la activarea mai multor căi de semnalizare în aval în celulă. Aceste căi includ PI3K – AKT – mTOR, care este implicată în supraviețuirea celulară, și calea RAS – RAF – MEK – ERK, care este implicată în proliferarea celulară.

Mutații HER2 în cancerul pulmonar cu celule non mici (CPCNM)

Mutațiile HER2 se găsesc în aproximativ 2-4 % din CPCNM [85, 86, 104]. Cea mai frecventă mutație este o inserție în exonul 20 [105]. Mutațiile HER2 sunt mai frecvente la nefumători (definit ca mai puțin de 100 de tigări fumate pe durata vieții), și în adenocarcinom [85, 86, 104, 105]. Cu toate acestea, mutațiile HER2 pot fi găsite în alte subtipuri de CPCNM, inclusiv la fumători sau foști fumători, sau în prezența altor tipuri histologice [85, 86, 104]. Inserțiile de la nivelul exonului 20 antrenează o hiperactivitate a HER2 kinazei, urmată de activarea căii de semnalizare în aval, având ca rezultat : creșterea supraviețuirii celulare, invazia și dezvoltarea tumorii [91].

Amplificare HER2 nu pare legată de mutații HER2 [85, 104]. Și spre deosebire de ceea ce se observă în cancerul de sân, amplificarea HER2 nu este un factor de prognostic în CPCNM.

ROS1

Fuziunile genei ROS1 sunt prezente în aproximativ 2 % din tumorile pulmonare. Rezultate preliminare indică eficacitatea crizotinib, un inhibitor de ALK / MET cu acțiune asupra ROS1.

ROS1 este un receptor de tirozin kinază (RTK) aparținând familiei de receptori de insulină. Rearanjamente cromozomiale care implică gena ROS1, la nivelul cromozomului 6q22, au fost descrise inițial în glioblastoame (de exemplu, FIG – ROS1) [106-108]. Mai recent fuziuni ale ROS1 au fost identificate ca anomalii cauzale în cancerul pulmonar cu celule non mici [92].

Fuziunile ROS1 încorporează un domeniu tirozin kinază intact. Biologic, fuziunile care au fost studiate au activitate oncogenica [92, 108]. În aval de fuziunile ROS1, semnalizarea activează căile celulare cunoscute ca fiind implicate în creșterea și proliferarea celulelor. In vitro, fuziunile ROS1 sunt asociate cu o sensibilitate la inhibitori ai tirozin kinazei activi pe ROS1 [109].

Fuziuni ROS1 în cancerul pulmonar cu celule non mici (CPCNM)

S-au găsit fuziuni ROS1 în aproximativ 2 % din cazurile de cancer pulmonar [110]. La fel ca și pentru fuziunile ALK, fuziunile ROS1 sunt mai des întâlnite in rândul fumătorilor mici (< 10 pachete ani) și / sau nefumătorilor. Fuziunile ROS1 sunt mai des asociate cu vârstele tinere și histologie de adenocarcinom [110]. Două serii asiatice recente au raportat 31 de cazuri de fuziuni ROS1 ; toate cazurile au fost adenocarcinom [111, 112]. La modelele preclinice, fuziunile ROS1 arată o sensibilitate la inhibitorii de tirozin kinaza care prezintă o activitate colaterala pe ROS1, cum ar fi crizotinibul [110]. Doi pacienți cu CPCNM metastatic și fuziune ROS1 au avut un răspuns parțial la crizotinib [110, 113].

Au fost găsite mai multe rearanjamente ROS1 în CPCNM. Acestea includ SLC34A2 – ROS1 și CD74 – ROS1 [109]. În practică, prezența unui rearanjament ROS1 este detectata prin hibridizare in situ în fluorescență (FISH) folosind o sondă ROS1 "break apart". FISH nu determina subtipul specific de fuziune ROS1 prezent în proba de țesut.

Mutații non-exclusive

DDR2

DDR2 (Discoidin Death Receptor 2) este un membru al familiei de receptori de tirozin kinaza DDR care sunt stimulate de colagen și nu de factori de creștere peptidici. Semnalizarea în aval în celulele canceroase nu este bine cunoscută, dar ar putea fi făcută prin căile de semnalizare SRC și STAT. Ca și la receptorii integrină, DDR2 poate juca un rol prin modularea interacțiunilor celulare cu matricea extracelulară.

Mutații DDR2 au fost găsite (nu foarte frecvent) în câteva tipuri de cancer, inclusiv carcinom cu celule renale, glioblastomul multiform, cancer endometrial, cancer colorectal (Catalogue of Somatic Mutations in Cancer – COSMIC). Cel mai frecvent se întâlnește în carcinomul pulmonar cu celule scuamoase [114].

Mutații DDR2 au fost găsite în 3,8% din carcinoamele cu celule scuamoase ale plămânului, dar la mai puțin de 1% din tumorile cu celule non-scuamoase ale plămânului [COSMIC; 114]. Nici o locație specifică nu a fost identificată, mutațiile fiind în domeniul kinazei și al discoidinei (acesta din urmă fiind parte a regiunii extracelulare care se leagă de colagen; 115). Nu au fost raportate nici supraexprimari ale DDR2 nici modificări ale numărului de copii ale locusului DDR2 (1q23).

Caracteristicile clinice ale pacienților cu mutații DDR2 sunt puțin cunoscute, și nici o asociere semnificativă cu sexul, vârsta, sau fumatul nu a fost găsita.

FGFR1

Amplificările FGFR1 genei sunt frecvente, găsite în aproximativ 20% din cancerul pulmonar cu celule scuamoase și legate de fumat. Inhibitori de FGFR sunt în curs de dezvoltare.

Gena receptorului factorului de creștere a fibroblastelor de tip 1 (FGFR1) codifică unul dintre subtipurile familiei receptorilor FGFR ai tirozin kinazei (TK). În total sunt patru astfel de familii: FGFR1, 2, 3, și 4. FGFR TK au un rol-cheie în dezvoltare și sunt de multe ori deregulate în cancer, prin fenomene de amplificare, mutații punctiforme, sau translocații [116]. Fenomene de amplificare sau de activare a FGFR1 au fost descrise în numeroase tipuri de cancer, inclusiv cancer cu celule scuamoase ale gurii [117], cancerul de sân [116], carcinom cu celule scuamoase de esofag [118] cancerul ovarian [119], cancer de vezică urinară [120], cancerul de prostată [121], și cancerul pulmonar, în special cu celule scuamoase [122- 124].

Mutații FGFR1 în CPCNM

Amplificări ale FGFR1 se găsesc în principal în pulmonar cu celule scuamoase, la pacienți fumători sau foști fumători. La pacienții asiatici, amplificarea FGFR1 este legată de importanța tabagismului ; este de asemenea un factor independent de prognostic prost [125]. Regiunea cromozomiala 8p12 pe care se afla locusul genei FGFR1 este amplificat în ~ 20% din tumorile pacienților cu cancer pulmonar cu celule scuamoase. Modificări în numărul de copii ale genei au fost identificate cu diferite tehnici, printre care hibridizare in situ în fluorescență (FISH) [122, 124, 126]; semnificația clinică a pragurilor de pozitivitate a testelor nu este determinată până în prezent. La pacienții care suferă de alte tipuri histologice de cancer pulmonar cum ar fi adenocarcinoamul, amplificarea FGFR1 este rară (mai puțin de 2%) [125]. Regiunea cromozomiala 8p12 pe care se află locusul genei FGFR1 este amplificat în ~ 20% din tumorile pacienților cu cancer pulmonar cu celule scuamoase. Modificări în numărul de copii ale genei au fost identificate cu diferite tehnici, printre care hibridizare in situ în fluorescența (FISH) [122, 124, 126]. Date preclinice sugerează că celulele canceroase care prezintă o amplificare a FGFR1 sunt dependente de calea de semnalizare FGFR.

MET

Anomaliile MET întâlnite în cancerul pulmonar constau în principal dintr-o amplificare genica, în special prezența la pacienții cu mutații EGFR, și rezistenți la inhibitori de tirozin kinaza.

Gena MET (gena de transformare MNNG – HOS [126]), localizată pe cromozomul 7, codifică pentru un receptor de tirozin kinază (RTK) aparținând familiei MET / RON. Legarea ligandului, factorul de creștere a hepatocitelor (HGF, de asemenea, cunoscut ca scuatter factor (SF)), produce o modificare conformațională a receptorului MET care induce fosforilarea și activarea receptorului. MET astfel activat, își fosforilează substraturile sale, ducând la activarea mai multor căi de semnalizare în aval în celulă. Aceste căi includ PI3K – AKT – mTOR, care este implicată în supraviețuirea celulară, și calea RAS – RAF – MEK – ERK, care este implicată în proliferarea celulară.

În cancer, semnalizarea anormala la nivelul receptorului MET induce reacții ce conduc la procesul de metastazare [128, 129].

S-a arătat că receptorul MET și ligantul său HGF au fost anormal activate în multe cancere la om (vezi http://www.vai.org/met/). Mutații germinale în domeniul tirozin kinazei a MET se găsesc în 100 % din cazurile de cancer renal papilar ereditar, și mutații somatice ale MET sunt prezente în 10-15 % din carcinoamele papilare renale sporadice [130]. Cu o frecvență mai mică, au fost găsite mutații ale MET în cazurile de cancer cu celule scuamoase al capului și gâtului [131], în carcinomul hepatocelular al copilului [132], în CPCNM [133, 134] și în cancerul pulmonar cu celule mici [134]. Amplificări MET au fost descrise în cancerul gastric [135], în cancerul de esofag [136], în cancerul colorectal [137], în glioame [138] în cancerul ovarian cu celule clare [139] și CPCNM [140-146].

MET în cancerul pulmonar cu celule mici non (CPCNM)

Au fost descrise mai multe mecanisme de activare a MET în CPCNM, inclusiv amplificarea genică [140-146] și a mutațiilor [133, 134].

Nu este cunoscută activitatea inhibitorilor de MET în CPCNM și în cancerul pulmonar cu celule mici, pentru tumorile cu mutații în afara domeniului kinazei. În schimb, au fost raportate răspunsuri la foretanib (XL880 sau GSK136308), un inhibitor al MET și a altor tirozin kinaze, inclusiv VEGFR2, activ pe cale orală, la pacienții cu carcinom papilar renal [147].

O supraexprimare a proteinei în țesutul tumoral comparativ cu țesutul normal adiacent, este prezentă în 25-75 % din CPCNM și este un factor de prognostic prost [148-155]. Într-un studiu recent de fază II, pacienții cu CPCNM au fost randomizați între MetMAb (anticorpi anti – MET), în asociere cu erlotinib fața de erlotinib singur. Supraexprimarea proteinei MET a fost asociată cu o creștere a supraviețuirii fără progresie a bolii și supraviețuirii globale la pacienții tratați cu MetMAb plus erlotinib [156]. În acest studiu, supraexprimarea proteinei MET a fost definită, atunci când mai mult de 50 % din tumoră prezintă o expresie moderată sau înaltă a MET la imunohistochimie, folosind un anticorp specific anti – MET (Ventana CONFIRM anti-CMET clona SP44).

NRAS

Mutații NRAS sunt rare în cancerul pulmonar. Inhibitori MEK ar putea avea o activitate clinică.

La om, au fost identificate trei gene RAS diferite: KRAS (omoloagă cu oncogena virusului sarcomului Kirsten la șobolan), HRAS (omoloagă cu oncogena virusului sarcomului Harvey la șobolan) și NRAS (inițial izolată într-un neuroblastom uman). Diferitele gene RAS sunt foarte omologe, dar distincte funcțional. Proteinele ​​RAS sunt GTPaze mici, care trec de la forme inactive legate de guanozin difosfat (GDP) la forme active legate de trifosfat guanozina (GTP). Proteine ​​RAS sunt mediatori cheie în aval de receptorii factorului de creștere și sunt critice pentru proliferarea, supraviețuirea și diferențierea celulelor. RAS are capacitatea de a activa în celulă căi de semnalizare în aval. Aceste căi includ PI3K-AKT-mTOR, care este implicată în supraviețuirea celulară, și calea RAS-RAF-MEK-ERK, care este implicată în proliferarea celulară.

RAS a fost implicată în patogeneza multor tipuri de cancer. Mutații activatoare ale genei RAS au dus la activarea constitutiva a RAS GTPazei, chiar și în absența semnalizării de către factorii de creștere. Rezultatul este un semnal continuu de proliferare celulară. Genele RAS specifice sunt deseori mutate în multe forme de cancer. Mutațiile NRAS sunt deosebit de frecvente în cancerul de colon, melanom, carcinom hepatocelular, leucemie mieloidă, și cancer tiroidian [126].

Mutații NRAS în cancerul pulmonar cu celule non mici (CPCNM)

Aproximativ 1% din pacienții cu cancer pulmonar cu celule non mici au mutații NRAS. Mutațiile NRAS sunt rare în carcinoame cu celule scuamoase și la nefumători [5, 40, 157]. În cele mai multe cazuri, aceste mutații sunt mutații missens prin înlocuirea unui aminoacidul din poziția 12 și 61. Acest lucru duce la activarea constitutivă a căilor de semnalizare NRAS.

Nu exista încă tratamente țintite anti-NRAS, dar studiile pre-clinice sugereaza ca inhibitori ai MEK (selumetinib, trametinib) ar putea fi activi [158].

În cele mai multe cazuri, mutațiile NRAS sunt exclusive altor mutații oncogene găsite în CPCNM (de exemplu mutații EGFR, rearanjare de ALK, etc).

PIK3CA

Mutațiile PIK3CA sunt rare ; ele par a fi mai frecvente în cazurile de cancer cu celule scuamoase. Inhibitori ai PIK3 și ai PIK3/mTOR sunt în curs de dezvoltare clinică.

Fosfatidil 3-kinazele (PI3K) sunt o familie de kinaze lipidice implicate în numeroase procese celulare cum ar fi creșterea, proliferarea, diferențierea, mobilitatea și supraviețuirea. PI3K este un heterodimer compus din două subunități – o subunitate de reglare a 85 kDa (p85) și o subunitate catalitică a 110 kDa. Gena PIK3CA codifică p110α, una dintre subunități catalitice.

PI3K convertește PI (4,5) P2 [fosfatidilinozitol 4,5-bifosfat] în PI (3, 4, 5) P3 [fosfatidilinozitol (3, 4, 5)-trifosfat] în interioarul foiței interne a membranei celulare. PI (3, 4, 5) P3 activează la nivelul membranei importante proteine ​​de semnalizare, cum ar fi AKT, ducând la creșterea activității acestor proteine.

PIK3CA mutantă este implicată în patogeneza multor tipuri de cancer, printre care glioamele, cancerele de colon, de stomac, de sân, de endometru, și de plămân [COSMIC; 159].

Mutații PIK3CA în cancerul pulmonar cu celule non mici (CPCNM)

Mutații somatice în PIK3CA au fost găsite în 1-3% din toate CPCNM [COSMIC; 150, 160]. Aceste schimbari au loc, de obicei, la două puncte critice ale exonului 9 (domeniul elicoidal) și exonul 20 (domeniul kinazei). Mutațiile PIK3CA par a fi mai frecvente în carcinoame cu celule scuamoase, comparativ cu adenocarcinomul [160, 161] și s-au găsit atât în ​​rândul fumătorilor cât și la nefumători. Mutații PIK3CA pot coexista cu mutații EGFR [38, 160]. Mai mult decât atât, au fost detectate mutații PIK3CA într-un procent mic (~ 5%) din cazurile de cancer pulmonar cu mutații EGFR prezentând o rezistență dobândită la inhibitorii de tirozin kinaza a EGFR [162].

RET

Fuziuni RET sunt descrise în aproximativ 1 la 2% din cazurile de cancer de plămân cu celule non mici, de obicei adenocarcinoame. Mai multe studii explorareza activitatea inhibitorilor de tirozin kinaza a RET.

Gena RET ("rearranged during transfection") [163], este localizată pe cromozomul 10 ; acesta codifică un receptor de tirozin kinază (RTK) aparținând familiei RET. Legarea cu liganzii săi aparținând familiei "glial cell line derived neurotrophic factor (GDNF)" induce fosforilarea și activarea receptorului ; acești liganzi sunt molecule de semnalizare extracelulară [164]. Odată activat, RET fosforilează substraturile sale, determinând activarea căilor de semnalizare în aval [165].

Anomalii RET se găsesc mai ales în cazurile de cancer tiroidian. Mutații somatice punctuale și germinale sunt găsite în cancerul tiroidian medular [166, 167]. Fuziuni RET sunt, de asemenea, găsite în unele adenocarcinoame pulmonare [168].

RET în cancerul pulmonar

Aproximativ 1,3% din tumorile pulmonare prezintă modificări cromozomiale de tipul genelor de fuziune RET [72, 169-172]. Aceste rearanjamente de gene par să existe aproape exclusiv în tumori de tip adenocarcinom. Când s-au căutat alte anomalii, fuziuni RET apar mutații oncogene exclusive în CPCNM (exclud existența mutațiilor EGFR, KRAS, ALK). Cele mai frecvente gene de fuziune sunt CCDC6-RET și KIF5B-RET și, mai recent, NCOA4-RET [72].

Într-o serie importantă de pacienți chinezi [72], pacienții ce prezintă o fuziune RET sunt mai degrabă tineri, nefumători și cu tumori slab diferențiate, comparativ cu pacienții fără această anomalie.

Consecințele funcționale ale proteinelor de fuziune RET în adenocarcinomul pulmonar nu sunt pe deplin înțelese, dar se știe ca ele sunt oncogenice in vitro și in vivo. La modelele in vitro, produșii de fuziune RET pot fi sensibili la inhibitorii de kinazei multi-țintă precum vandetanib, sorafenib, sunitinib și cabozantinib [170, 172, 173]. În clinică, sunt încă puține datele prospective permit să se facă legătura între prezența de fuziuni RET cu răspunsul la anumite tratamente [174].

Fuziuni RET au fost inițial identificate prin RT-PCR, imunohistochimie, și secvențiere de a doua generație. Nu există nici un test standard pentru identificarea fuziunilor RET în probele de tumorale, dar hibridizare in situ în fluorescența (FISH) sau captura țintită / secvențiere de a doua generație sunt metode utile potențial.

PROGNOSTIC ȘI FACTORI PROGNOSTICI

Cancerul pulmonar are un prognostic prost în general.

În ciuda ameliorarilor în plan diagnostic și terapeutic din ultimii ani, nu s-a putut realiza nici o ameliorare notabila a supraviețurii de-a lungul timpului.

În lume, cancerul pulmonar reprezintă cea mai frecventa cauza de deces prin cancer. Numărul deceselor prin cancer pulmonar în lume este estimat la aproximativ 1 din 5 (1,59 milioane de decese, 19,4% din decesele prin cancer). Datorită mortalității ridicate (rata mortalității globale în raport cu incidența este de 0,87) și lipsei de variabilitate geografică în diferitele regiuni ale lumii, patternul mortalității se suprapune pe cel al incidenței. În tabelul 5 sunt redate cifrele de mortalitate și prevalența în funcție de diferitele regiuni ale Globului așa cum reies din Raportul OMS 2014.

P5ani =Prevalența la 5-ani.

Tabel 5. Incidența, mortalitatea și prevalența cancerului pulmonar în funcție de diferitele regiuni ale Globului (Globocan 2014).

Probabilitatea (riscul) unui individ de a se îmbolnăvi/deceda prin cancer este exprimată ca procentul de noi născuți care se așteaptă ca vor dezvolta/deceda un/prin cancer pulmonar înainte de vârsta de 75 ani, în absența altor cauze de deces (Figura 10).

Tabel 5. Incidența, mortalitatea și prevalența cancerului pulmonar în funcție de diferitele regiuni ale Globului (Globocan 2014).

Probabilitatea (riscul) unui individ de a se îmbolnăvi/deceda prin cancer este exprimată ca procentul de noi născuți care se așteaptă ca vor dezvolta/deceda un/prin cancer pulmonar înainte de vârsta de 75 ani, în absența altor cauze de deces (Figura 10).

Figura 11. Supraviețuirea la 5 ani a pacienților diagnosticați cu cancer pulmonar în 2003, toate stadiile cumulate dupa OMS – AICC/Raportul Mondial asupra Cancerului (NCI Lung Cancer Homepage:

http://www.cancer.gov/cancer_information/cancer_type/lung/).

În Statele Unite ale Americii supraviețuirea la 5 ani s-a ameliorat de-a lungul anilor (175), însă rămâne foarte scăzută (Tabelul 6).

a: SEER 9 zone – San Francisco, Connecticut, Detroit, Hawaii, Iowa, New Mexico, Seattle, Utah, Atlanta

b: SEER 18 zone – San Francisco, Connecticut, Detroit, Hawaii, Iowa, New Mexico, Seattle, Utah, Atlanta, San Jose-Monterey, Los Angeles, Alaska Native Registry, Rural Georgia, California, Kentucky, Louisiana, New Jersey și

Georgia

e: diferența între 1975-1977 și 2002-2008 este statistic semnificativă (p<0,05)

Tabel 6. Evoluția supraviețuirii la 5 ani a cancerului pulmonar în Statele Unite ale Americii.

FACTORI PROGNOSTICI GENERALI

STADIUL

Este cel mai important factor prognostic în cancerul pulmonar cu celule non mici.

GANGLIONII LIMFATICI

Starea ganglionilor limfatici este parte componentă a stadializarii. Localizarea ganglionilor metastatici influentează prognosticul și supraviețuirea. Prognosticul este mai nefavorabil dacă sunt atinși ganglioni din stațiile N2 (mediastinali ipsilaterali) sau N3 (mediastinali controlaterali și la baza gâtului)

REZECABILITATEA CHIRURGICALĂ

Prognosticul este mai favorabil dacă tumora poate fi rezecată în totalitate.

PIERDEREA ÎN GREUTATE este un factor prognostic negativ.

SEXUL

Femeile au un prognostic mai favorabil.

VÂRSTA

Vârsta este un factor prognostic important.

Supraviețuirea variază între 24,3% (23,4-25,1) la pacienții cu vârste cuprinse între 15 și 44 ani, la 7,9% (7,7-8,1) la pacienții peste 75 de ani.

FACTORI PROGNOSTICI PENTRU CPCNM

Prezența sau absența simptomelor pulmonare, mărimea tumorii, tipul histologic, numărul de stații ganglionare metastatice, extensia vasculară

PACIENȚII INOPERABILI

– starea generală alterată, pierdere în greutate mai importantă de 10% (176).

PACIENȚII OPERAȚI

– după rezecția chirurgicală completă în stadiu IA, supraviețuirea la 5 ani este de 73%. În stadiul IB este de 58% (177, 178, 179).

În tabelul 7 sunt redate comparativ supraviețuirile la 5 ani în funcție de stadializarea clinică versus postoperatorie după Goldstraw (178).

cTNM : TNM clinic/radiologic ; pTNM : TNM postoperator

Tabelul 7. Supraviețuirea la 5 ani în funcție de stadializarea clinică versus stadializarea postoperatorie după Goldstraw.

FUMATUL

– stoparea intoxicație tabagică în momentul diagnosticului poate ameliora prognosticul, mai ales dacă afecțiunea este într-un stadiu precoce (180).

TRATAMENTE

Alegerea tratamentului se face după luarea în considerare a mai multor factori:

cancerul: tip, formă, stadiu

vârsta pacientului

starea generală exprimată prin scorul de performanță și/sau indicele Karnovsky

maladiile asociate ale pacientului și tratamentele în curs

Posibilitățile terapeutice în funcție de stadiu sunt următoarele:

Stadiul IA și IB

Tratamentul chirurgical este tratamentul de referință.

În stadiul IB poate fi discutată chimioterapia adjuvantă în cazul prezenței de factori prognostici negativi.

Pentru ambele stadii, radioterapia (eventual de tip stereotaxică) poate fi propusă ca alternativă a chirurgiei în cazurile non rezecabile sau non operabile.

Stadiul II

Tratamentul chirurgical este tratamentul de referința, deși nu există o atitudine terapeutică standardizată. Tratamentul este multimodal (asocierea a mai multor tratamente) și combină un tratament sistemic (chimioterapie) și local (chirurgie și/sau radioterapie).

Chimioterapia este recomandată în adjuvant.

Radioterapia poate fi discutată în adjuvant în caz de atingere parietală sau de exereză incompletă.

Stadiul IIIA

În cazul tumorilor T1-3, N2 rezecabile, se pot discuta două atitudini:

chimioterapie urmată de chirurgie +/- radioterapie adjuvantă

chirurgie urmată de chimioterapie +/- radioterapie adjuvantă

Dacă rezecția este incompletă, se poate recomanda o radioterapie mediastinală și/sau parietală în situațiile următoare:

N2 rezidual – în absența unei contraindicații, se propune radioterapie mediastinală postoperatorie

T3 parietal rezidual – în absența unei contraindicații, se propune radioterapie parietală postoperatorie. Aceasta se poate asocia sau nu cu o radioterapie mediastinală.

Dacă rezecția este completă:

tumora fără invazie parietală, se poate propune o radioterapie mediastinală. Ea va fi în mod particular discutată în caz de ruptură capsulară a ganglionilor mediastinali sau dacă sunt invadate mai multe stații ganglionare

dacă tumora are invazie parietală, se poate realiza o radioterapie mediastinală și parietală.

La acești pacienți nu este indicată radioterapia cerebrală adjuvantă în scop profilactic.

Stadiul IIIB

Tratamentul de referință este radio-chimioterapia concomitentă. Chirurgia este propusă în mod excepțional.

Stadiul IV

Tratamentul de referință este reprezentat de chimioterapie ce poate include bioterapii țintite (Figura 12).

Figura 12. Bioterapii țintite disponibile pentru tratamentul cancerului pulmonar.

Bioterapiile țintite sunt medicamente ce blochează mecanismele de creștere proprii celulei canceroase.

Cele mai utilizate tratamente țintite utilizate în prezent pentru tratarea cancerului pulmonar sunt:

Erlotinib (Tarceva®)

Bevacizumab (Avastin®)

Gefitinib (Iressa®)

Afatinib (Giotrif®)

Osimeritinib (Tagrisso®)

ERLOTINIB (Tarceva®)

Este un medicament care țintește o proteină prezentă pe suprafața celulei și care se numește Receptor al Factorului de Crestere Epidermica (EGFR), și care contribuie la dezvoltarea celulei canceroase. Acest tratament este numit “inhibitor al tirozinkinazei” receptorului factorului de creștere EGFR (ITK-EGFR) (Figura 13) după Sharma (3).

Figura 13. Mutații ale EGFR care conferă o sensibilitate crescută sau o rezistentă la Inhibitorii de Tirozinkinaza a EGFR.

BEVACIZUMAB (Avastin®)

Pentru a se hrăni și a se dezvolta, o tumoră necesită formarea de noi vase de sânge.

Bevacizumab-ul este un anticorp monoclonal “umanizat” ce împiedică formarea de neo-vaselor de sânge.

GEFITINIB (Iressa®)

Este folosit în tratarea cancerelor local avansate sau metastatice ale cancerului pulmonar cu celule non-mici.

Este administrat pacienților care prezintă o mutație genetică particulară ce duce la activarea receptorului Factorului de Creștere Epidermică (EGFR) și deci la multiplicarea celulară.

Afatinib (Giotrif®)

Este administrat pacienților ce prezintă o mutație activatoare de EGFR și care nu au mai avut tratamente cu Inhibitori de Tirozinkinaza sau pacienților ce au un cancer pulmonar de tip scuamos și care nu răspund la chimioterapia clasică bazată pe săruri de platină.

Osimeritinib (Tagrisso®)

E utilizat la pacienții în stadiu avansat a căror tumoră prezintă mutația T790M a EGFR.

Progresul remarcabil realizat în decriptarea mecanismelor de carcinogeneză în ultimele trei decade, au permis dezvoltarea mai multor tipuri de molecule terapeutice ce țintesc în mod specific unul dintre aceste mecanisme. Câteva dintre ele sunt reprezentate în figura 14 (181).

Figura 14: Tratamente ce țintesc mecanisme moleculare specifice în cancerul pulmonar.

PROFIL GENOMIC AL CANCERELOR BRONHO-PULMONARE PRIMITIVE CU CELULE NON-MICI ȘI INVAZIE DE GANGLIONI MEDIASTINALI (GPN2)

REZUMAT

În cancerul bronho-pulmonar cu celule non-mici cu invadarea ganglionilor mediastinali (N2+), atitudinea terapeutică acceptată în prezent este cea a unui abord multimodal ce constă de cele mai multe ori din chimioterapie neoadjuvantă pe baza de săruri de platină, urmată de rezecție chirurgicală completă pentru pacienții care au răspuns sau au fost stabilizați de chimioterapie. După chimioterapia neoadjuvantă, aproximativ 5% din pacienți vor avea un răspuns complet. Majoritatea pacienților vor avea un răspuns parțial (mai mult de 50% reducție tumorală), dar numărul pacienților care vor fi doar stabilizați sau vor avea un răspuns minor, rămâne foarte important (aproximativ 40%). Pacienții care evoluează sub chimioterapie neoadjuvantă (aproximativ 55%) nu vor fi operați. Supraviețuirea globală la 5 ani a pacienților cu cancer bronho-pulmonar cu celule non-mici cu invadarea ganglionilor mediastinali (N2) este de 20-25%, însă analiza de subgrup arată că supraviețuirea la 5 ani a celor care au răspuns la chimioterapie este de 42%, versus 10% la cei care nu au răspuns la chimioterapie (14).

Este prin urmare evident că beneficiul chimioterapiei neoadjuvante este foarte important în stadiul IIIAN2+ însă numai pentru o minoritate de pacienți.

Pentru restul pacienților tratamentul prin chimioterapie neoadjuvantă nu aduce niciun beneficiu, în schimb expune pacientul riscului efectelor adverse și al diferitelor complicații dintre care unele majore. În plus, aceste tratamente sunt în general foarte costisitoare. Determinarea celor două grupuri de pacienți înainte de stabilirea strategiei terapeutice ar permite pe de o parte evitarea unui tratament inutil majorității pacienților. Pe de altă parte, cunoașterea factorilor care sunt răspunzători de rezistența la tratamentele clasice și a mecanismelor lor de acțiune ar putea permite dezvoltarea unor tratamente orientate, a unei terapii personalizate.

Studiul de fața și-a propus acest obiectiv ambițios de a determina o semnătura genică prognostică, care să permită definirea celor două grupuri de pacienți înainte de orice tratament.

Metode: Am prelevat chirurgical (mediastinoscopie sau videotoracoscopie) eșantioane de ganglioni mediastinali tumorali de la 27 pacienți cu cancer pulmonar cu celule non-mici în stadiul IIIA N2+ înainte de tratamentul prin chimioterapie neoadjuvantă. Pacienții au fost apoi tratați prin chimioterapie (biterapie bazată pe săruri de platină). O primă evaluare a răspunsului la chimioterapie s-a făcut după două cicluri și pacienții care au evoluat sub tratament nu au fost tratați chirurgical. O a doua evaluare a răspunsului la chimioterapie a fost făcută pe piesa de rezecție chirurgicală. Cu pacienții care au avut un răspuns complet la chimioterapie (lipsa de țesut tumoral rezidual în tumoră și ganglioni) și pacienții la care ganglionii mediastinali nu mai prezentau țesut tumoral rezidual (downstage) s-a constituit Lotul B, al pacienților cu prognostic favorabil. Pacienții care mai prezentau țesut tumoral residual în cel puțin o stație ganglionară mediastinală pe piesa operatorie, împreuna cu pacienții care nu au fost operați, au constituit Lotul A, al pacienților cu prognostic nefavorabil.

Două tipuri de analize de genom au fost realizate pe eșantioanele de țesut ganglionar tumoral prelevat din ganglionii mediastinali înainte de tratamentul prin chimioterapie neoadjuvantă: hibridizare prin microarrays și secvențierea exomului total (Whole Exome Sequencing).

Rezultate: În urma hibridizării prin microarrays s-au putut identifica un număr de 1127 gene cu expresie modificată în țesutul tumoral comparativ cu țesutul normal cu p-value ≤ 0.05 și 44 de gene cu p-value ≤ 0.01. Dintre acestea, genele cu cele mai mari diferențe de expresie genică identificată între țesutul tumoral față de cel normal sunt COL1A1, INHBA sau TXNIP. Căile de semnalizare identificate cu FDR (false discovery rate) < 0.005 includ: căile de semnalizare a citokinelor, adeziune focală sau interacția ECM-receptor.

Experimentele de whole exome sequencing au condus la identificarea unui număr de 216 gene cu mutații având un p-value ≤ 0.05 care sunt asociate cu fenotipul cancerului bronho-pulmonar cu celule non-mici.

Selecția genelor cu p-value ≤ 0.01, a condus la identificarea mutațiilor RGP1 (rs1570248), SLFN12L (rs2304968 si rs9905892) și GBA2 (rs3833700) prezente cu o frecvență mult mai mare la pacienții cu răspuns obiectiv la tratamentul de inducție și a mutațiilor SENP5 (rs63736860 si rs1602) și NCBP2 (rs553783) identificare cu o frecvență mult mai crescută la pacienții fără răspuns sau cu răspuns minor la tratamentul chimioterapeutic neoadjuvant.

OBIECTIVE

Determinarea profilului genic corelat cu un prognostic favorabil în cancerele bronho-pulmonare cu celule non-mici și invazia ganglionilor mediastinali

Determinarea unui profil genic favorabil chimioterapei neoadjuvante

Recoltarea și conservarea în banca de tumori a probelor de sânge și de urină de la pacienții incluși, pentru analize ulterioare de proteomică și definire de biomarkeri

STRATEGIE

Cu ajutorul țesutului ganglionar tumoral și non-tumoral prelevat de la pacienții cu cancer bronho-pulmonar cu celule non-mici și ganglioni mdiastinali invadați, am realizat tehnici de “Omics” de capacitate înaltă:

o ARN : Profil ARNm și miARN

o ADN : tehnici de secvențiere de genom

o Determinarea de căi de semnalizare

Etapele proiectului:

1. Generarea materialului biologic preterapeutic pentru investigația genomică și activități specifice băncii de țesuturi și organe

2. Definirea loturilor de prognostic.

3. Analiza microarray și validarea rezultatelor

4. Analiza bioinformatică

5. Secvențierea exomului tumoral

Generarea materialului biologic preterapeutic

Suspiciunea clinica de invazie a ganglionilor mediastinali la pacienții atinși de cancer bronho-pulmonar cu celule non-mici se face pe baza examenelor imagistice prin Computer Tomografie (CT) și Tomografie cu Emisie de Pozitroni (TEP). Confirmarea invaziei tumorale a ganglionilor mediastinali se face prin examinarea histo-patologice a unei probe de țesut prelevată de la nivelul ganglionilor suspectați.

Pentru a putea realiza analize de microarray și secvențiere de genom sunt necesare cantități de țesut superioare celor obținute prin diferitele tehnici de puncție. De aceea, am optat pentru realizarea unei intervenții chirurgicale prin mediastinoscopie înainte de orice tratament, pentru a realiza prelevarea de țesut ganglionar tumoral și non-tumoral de la fiecare pacient la care s-a suspectat invazia tumorală a ganglionilor mediastinali.

În aceasta etapa s-a realizat:

Selectarea și introducerea în studiu a pacienților: criterii de includere, criterii de excludere

Înregistrare a datelor civile și clinice pentru fiecare pacient

Anonimizare a pacienților după introducerea în studiu

Recoltarea materialului biologic prin mediastinoscopie (Anexa X – Protocoale de prelevare a țesuturilor) și confirmare a invaziei ganglionilor mediastinali. Prin tehnici de apoziție celulară realizate înainte de depozitarea în băncile de tumori a materialului biologic, s-a determinat procentul de țesut tumoral, țesut necrotic și fibroza. S-au inclus definitiv în studiu eșantioane tisulare cu un conținut de țesut tumoral superior la 70%.

Crio-conservarea în nitrogen lichid la -196°C a materialului biologic destinat analizei genomice

Reevaluare a pacienților după chimioterapia neoadjuvantă

2. Definirea loturilor de prognostic

În funcție de răspunsul la tratamentul prin chimioterapie se vor determina două loturi prognostice :

Lotul A – cu răspuns obiectiv la chimioterapia neoadjuvantă

Lotul B – cu răspuns minor sau stabilizare la chimioterapia neoadjuvanta sau pacienți care au progresat sub tratament prin chimioterapie neoadjuvantă.

Pentru aceasta s-au utilizat criteriile OMS de reevaluare după tratamentul prin chimioterapie neoadjuvantă (Tabel 8):

Tabel 8. Criteriile OMS de definire a răspunsului la chimioterapia neoadjuvantă în tratamentul cancerului bronho-pulmonar cu celule non-mici.

4. Analiza microarray și validarea rezultatelor

Probele biologice din toate centrele participante, au fost transportate la Institutul Clinic Fundeni București pentru analize genomice.

Protocolul analizelor microarray este schematizat în figura 15.

Tehnologia folosită pentru experimentele de microarray a fost Agilent. Analiza de expresie genică s-a făcut utilizând protocolul one-color microarray (figura 16). Acest protocol oferă posibilitatea comparării ulterioare a materialului genic studiat și mai ales a realizării unor comparații de subgrup, rezultate din analiza inițiala.

ARN total s-a obținut folosind protocolul Sigma TRIREAGENT. ARN total a fost purificat cu Rneasy (Qiagen), în timp ce ADN a fost purificat cu coloane de ADN Qiagen. Concentrațiile au fost calculate cu ajutorul tehnologiei spectrofotometrice (Nanodrop ND1000) iar degradarea ARN a fost evaluată cu Agilent Lab-on-a-chip technology (Bioanalyser 2100).

Figura 15. Schema de design pentru cercetarea prin tehnologie microarray.

Figura 16. Protocol de analiză microarray.

S-a efectuat analiza biostatistică a datelor obținute, incluzând și un control al tuturor parametrilor de calitate, o normalizare a datelor folosind algoritmi consacrați, analiza pe grupuri și analiza statistică, toate realizate în fișiere clasice tip „.xls”.

5. Analiza bioinformatică

Softuri specializate de tratare a bioinformațiilor obținute prin microarray permit în urma unor procedee complexe, determinarea calitativă a gradului de expresie genică. Se poate astfel realiza asocierea expresiilor genice cu un anumit moment evolutiv sau stare funcțională celulară.

În această etapă s-a realizat procesarea datelor de microarray pentru a identifica genele și căile de semnalizare activate în cancerul bronho-pulmonar cu celule non-mici în stadiul de invazie a ganglionilor mediastinali. S-a realizat asocierea genelor determinate ca fiind supra- sau sub-exprimate în experimente, unor căi relevante din punct de vedere biologic, conform informațiilor existente despre aceste căi în baze de date specializate cum ar fi: KEGG, Biocarta, Gene Ontology, GENMAPP. S-au determinat căile de semnalizare cele mai promițătoare după integrare și interpretarea tuturor datelor experimentale.

6. Secvențierea întregului exom tumoral – s-a făcut la Beijing Genomics Institute (BGI) și s-a utilizat platforma HiSeq2000 Illumina, cu 50X coverage mediu pentru zonele de interes.

Procesul de secvențiere parcurge patru etape:

Prepararea eșantioanelor

Generarea clusterelor

Secvențierea

Analiza datelor

Prin definiție, exomul reprezintă totalitatea secvențelor ADN din genom care servesc la codarea proteinelor (aproximativ 180000). În specia umană, exomul reprezintă aproximativ 1,5% din genom și este format din aproximativ 30 milioane de perechi de baze.

Secvențierea exomului se desfășoară în două etape:

capturarea și izolarea exomului

secvențierea, ce permite determinarea variantelor genetice ce prezintă secvențe proteice alterate

Tehnologia de capturare a exomului utilizată (Figura 17) a fost de tipul “solution-based”. Prin această tehnologie, eșantioanele de ADN sunt fragmentate și puse în contact cu oligonucleotide legate de biotina (baits) care vor hibridiza în mod selectiv regiunile țintă din genom (exomul). Pentru aceasta sunt utilizate câmpuri magnetice de streptavidină ce vor lega bazele biotinilate (biotina se leagă de streptavidina cu o afinitate extrem de mare). Părțile din genom care nu au fost legate de streptavidină sunt eliminate și eșantionul obținut este amplificat printr-o reacție de polimerizare în lanț (PCR).

Figura 17. Tehnologia de capturare a exomului, după Agilent Technologies (http://www.genomics.agilent.com/article.jsp?pageId=3083 )

Secvențierea produșilor obținuți s-a realizat prin secvențiere paralelă în masă (HiSeq2000 Illumina ) ce se bazează pe secvențierea prin sinteză.

Secvențierea prin sinteză utilizează patru nucleotide marcate prin fluorescența pentru a secvenția zeci de milioane de clustere în paralel pe suprafața celulei. În timpul fiecărui ciclu de secvențiere, se adaugă o singură trifosfat dezoxinucleotidă marcată (dNTP) la lanțul de acid nucleic. Nucleotida marcată servește de terminator de polimerizare, astfel încât după fiecare încorporare dNTP, colorantul fluorescent vizualizat pentru identificarea bazei și apoi este scindată enzimatic pentru a permite încorporarea următoarei nucleotide. Deoarece toate cele patru dNTP (A, C, T, G) sunt prezente ca molecule singulare, separat, concurența naturală minimizează greșelile de încorporare. Prin urmare, secvențierea bază-cu-bază ce se realizează este extrem de precisă, eliminând erorile de context specifice secvențierii.

Analiza datelor: tehnologia Illumina se bazează pe o cantitate foarte mare de secvențe citite in paralel. O eșantionare în profunzime (numărul mediu de nucleotide care a contribuit la determinarea secvenței) și o acoperire uniformă asigură o determinare a diferențelor genetice cu mare precizie. Eșantionarea profundă permite utilizarea votului majorității ponderate și analiza statistică, similară cu metodele convenționale, pentru a identificarea homozigoților și heterozigoților și pentru a diferenția erorile de secvențiere. Fiecare bază de citire brută are atribuit un scor de calitate, astfel încât software-ul poate aplica un factor de ponderare în definirea diferențelor și generarea scorurilor de încredere.

PARTENERI

Mai multe instituții din Europa, Asia și România au fost implicate în Realizarea proiectului (Figura 18).

În calitate de conceptor și responsabil clinic al proiectului GPN2, misiunile mele au concentrat buna desfășurare a incluziunii pacienților, în conformitate cu bunele practici medicale clinice, recoltarea datelor clinice ale pacienților, organizarea transportului materialelor biologice în condiții de crio-conservare, analiza datelor și a rezultatelor provenite din diferitele tehnici de experimentare științifică.

Figura 18. Partenerii proiectului GPN2

Astfel, recoltarea materialului biologic s-a făcut în Serviciul de Chirurgie Toracică și Transplant pulmonar de la Allgemeines Krankenhaus – Universitätskliniken, din Viena, Austria sub îndrumarea Prof. Dr. Walter Klepetko și în Serviciul de Chirurgie Toracică de la Spitalul Hôtel Dieu, din Paris, sub îndrumarea Prof. Dr. Jean-Francois Regnard.

Materialul biologic recoltat, a fost initial condiționat și conservat în băncile de tumori ale acestor instituții de unde, a fost transportat la Institutul Clinic Fundeni. În cadrul Laboratorului de Analiza Genomică al Institutului Clinic Fundeni s-a realizat analiza materialului genomic prin tehnici specifice de microarray. Datele brute rezultate au fost supuse analizei bioinformatice sub îndrumarea Prof. Dr. Sorin Draghici șeful catedrei de Sisteme Biologice din Departamentul de Computer Science de la Wayne State University din Detroit. Programul de analiză a căilor de semnalizare folosește tehnologia Advaita, tehnologie folosită în mai multe Universități din Statele Unite ale Americii (Harvard, Columbia, California, Karmanos Cancer Institute), Franța și Anglia.

În sfârșit, secvențierea genomului prin tehnici de capacitate inaltă și analiza statistică a rezultatelor s-a realizat în China, la Beijing Genomics Institute (www.bgi.com ).

Rezultatele provenite de la diferiții parteneri ai proiectului GPN2 au fost centralizate la Institutul Clinic Fundeni.

MATERIALE ȘI METODE

Materialul biologic recoltat a fost stocat în biobănci in congelare. Toate probele de țesut și datele clinice relevante au fost obținute prospectiv de la departamentele de chirurgie toracică de la Spitalul Hotel Dieu din Paris afiliat la Facultatea de Medicină Paris 5 Rene Descartes și de la Spitalul Allegemeines Krakenhaus Universitatskliniken din Viena în perioada ianuarie 2011 – decembrie 2012.

Criteriile de eligibilitate a pacienților au fost următoarele:

Criterii de includere:

pacient > 18 ani

semnarea consimtământului

tumora pulmonară confirmată prin examinare computer tomografică și/sau fibroscopie bronșică

adenopatie mediastinala confirmata prin CT și/sau TEP

bilanț negativ de extindere la distanța confirmat prin examinare CT a suprarenalelor, examinare CT sau/și RMN cerebrală, examinare TEP

histologie de CPCNM confirmat prin fibroscopie bronșică, puncție-biopsie sub control CT și/sau mediastinoscopie/toracoscopie.

Criterii de non-includere

refuzul pacientului

pacient > 18 ani dar incapabil de discernamant, chiar daca aceasta incapacitate este temporară

chimioterapie pentru un alt cancer în anul ce precede diagnosticul CPCNM

Criterii de excludere

la cererea pacientului, după semnarea consimțământului

ganglioni mediastinali negativi la examenul histologic extemporaneu efectuat în timpul mediastinoscopiei

mai puțin de 70% țesut tumoral în eșantioanele de ganglioni mediastinali prelevate prin mediastinoscopie

anularea intervenției chirurgicale la pacienții care au răspuns la chimioterapia neoadjuvantă

cancer pulmonar secundar la examinarea histopatologica definitivă

Consimțământul pacienților

În cadrul cercetării biomedicale, pacientul și-a exprimat liber consimțământul de a participa la studiu, după ce a fost pe deplin informat de către medical investigator, în cadrul unei consultații unde a avut ocazia să pună toate întrebările pe care le-a considerat necesare și după ce a avut un timp de gândire.

Formularele de informare a pacientului și consimțământul au fost asociate într-un singur document pentru a se asigura faptul că întreaga informație a fost dată pacienților participanți la studiu și pot fi consultate în Anexa 1.

Deasemeni, pentru a putea realiza analize genomice și proteomice, formularul de informare precizează tipul de cercetare realizată și pacientul are posibilitatea de a accepta sau refuza conservarea probelor biologice în scopul cercetării știintifice.

În sfârsit, având în vedere că prelevarea preoperatorie de sânge destinat cercetărilor proteomice este o manevra agresivă ce poate avea complicații și care nu intră în mod uzual în bilanțul preoperator, o polița de asigurare a fost contractată pentru perioada de includere a pacienților în studiul GPN2 (Anexa 2).

Consimțământul informat a fost obținut de la toți pacienții și protocoalele pentru acest studiu au fost aprobate de către Comitetul de Protecție al Persoanelor ile de France V și Ethik-Kommission al Universității de Medicină din Viena (Anexa 3).

Înregistrarea și anonimizarea pacienților

Pacienții eligibili și care au semnat consimțământul, au fost înregistrați în studiul GPN2 folosind un soft de anonimizare. Fiecărui pacient îi este atribuit un număr de cod propriu. Fiecare centru de includere a fost responsabil de confidețialitatea acestor informații.

EȘANTIOANE PRELEVATE

Prelevarea eșantioanelor biologice

Mai multe tipuri de eșantioane biologice au fost prelevate:

aproximativ 10 ml de urină în dimineața intervenției de mediastinoscopie sau videothoracoscopie

18 ml de sânge periferic pe masa de operație înainte de mediastinoscopie sau videothoracoscopie

ganglioni mediastinali tumorali și non-tumorali prin mediastinoscopie sau videothoracoscopie

la pacienții care au răspuns la chimioterapia neoadjuvantă și au beneficiat de rezecție pulmonară, s-a prelevat țesut tumoral și non-tumoral din tumora primitivă și ganglionii mediastinali precum și țesut pulmonar la distanță de tumora pulmonară

Toate probele de țesut și datele clinice relevante au fost obținute prospectiv de la departamentele de chirurgie toracică de la Spitalul Hotel Dieu din Paris afiliat la Facultatea de Medicină Paris 5 Rene Descartes și de la Spitalul Allegemeines Krakenhaus Universitatskliniken din Viena în perioada ianuarie 2011 – decembrie 2012.

Pentru toate eșantioanele tisulare, după confirmarea existenței invaziei tumorale la examenul histopatologic extemporaneu prin tehnici de apoziție celulară, au fost selecționate numai eșantioanele ce au avut un conținut tumoral superior la 70%.

Toate eșantioanele biologice destinate studiului GPN2 au fost cântărite, etichetate și conservate în azot lichid la -80°C.

Eșantioanele sanguine și urinare

Eșantioanele de sânge și de urină au fost prelevate în dimineața intervenției chirurgicale pentru mediastinoscopie și/sau videotoracoscopie, înainte de orice tratament specific. După prelevare, toate eșantioanele au ajuns în maxim 30 de minute în Laboratorul de Anatomie Patologică a centrului în care s-a făcut prelevarea și au fost condiționate și conservate.

Probele prelevate au constat din:

10 ml de urină recoltata într-un flacon steril de urocultura cu eticheta pacientului și ora la care s-a prelevat. În Laboratorul de Anatomie Patologica a fost fragmentată în 5 alicoturi de 1 ml și congelată la -80°C.

2 tuburi fară anticoagulant de 10 ml pentru ser. În Laboratorul de Anatomie Patologica au fost lăsate între 30 și 60 de minute la temperatură ambiantă și apoi centrifugate cu 3000rpm/10 minute la temperatura ambiantă. Din serul obținut s-au realizat alicoturi de 1 ml care au fost congelați la -80°C.

3 tuburi cu EDTA de 5 ml pentru plasmă. Aceste tuburi se agită fiecare de câte 10 ori aproximativ. Pe fiecare tub s-a apozat eticheta pacientului și ora la care s-a prelevat. De îndată ce eșantioanele au ajuns în Laboratorul de Anatomie Patologică, au fost centrifugate cu 3500rpm/10min la temperatură ambiantă. Din plasma obținută s-au realizat alicoturi de 1 ml care au fost congelați la -80°C.

Eșantioanele tisulare

Cu ocazia mediastinoscopiei sau videotoracoscoiei s-au recoltat minim 4 fragmente de ganglion mediastinal tumoral și 3 fragmente de ganglion mediastinal normal care au fost transportate imediat în stare proaspătă la Laboratorul de Anatomie Patologică. În Laboratorul de Anatomie Patologică unul dintre fragmentele tumorale s-a analizat la microscop prin tehnica de examinare histologică extemporanee și s-a confirmat statusul oncologic. În caz de invazie tumorala prin CPCNM, 3 dintre fragmentele de ganglion tumoral s-au analizat prin tehnici de apoziție celulară pentru a determina cantitatea de țesut tumoral existent în eșantion. Doar eșantioanele cu >70% țesut tumoral au fost păstrate pentru analiza de genom. Eșantioanele tumorale păstrate au fost etichetate și conservate în azot lichid. Al patrulea fragment de țesut tumoral s-a inclus la parafină. Fiecare fragment de ganglion normal a fost pus în câte un tub etichetat și s-a congelat în azot.

Cu ocazia rezecției pulmonare pentru pacienții eligibili în urma tratamentului prin chimioterapie adjuvantă, procedura de prelevare și preparare a eșantioanelor a fost identică. S-au conservat în azot lichid 3 fragmente de țesut tumoral, 3 fragmente de parenchim pulmonar prelevate la distanță de tumoră, 3 fragmente de ganglion mediastinal tumoral și 3 fragmente de ganglion mediastinal non-tumoral.

Transportul eșantioanelor

Toate eșantioanele au fost transportate periodic din centrele de recoltare către Laboratorul de Genom al Institutului Clinic Fundeni. Transportul s-a efectuat cu avionul, eșantioanele fiind menținute în gheață carbonică pe toată perioada transportului. Firma care a asigurat transportul internațional al produselor biologice (FENI Internațional SRL – http://www.feni.ro) este specializată în astfel de transporturi, astfel încât temperatura eșantioanelor biologice a fost menținută sub -20°C pe toată durata transportului, asigurând stabilitatea moleculară a acestora.

În figura 19 sunt redate etapele parcurse de eșantioanele biologice din momentul suspiciunii clinice a diagnosticului de CPCNM și invazie a ganglionilor mediastinali și până la constitutirea tumorotecii în vederea analizei de genom.

Figura 19. Traseul eșantioanelor biologice.

Constituirea bazei de date clinice

Datele clinice, biologice și histologice ale pacienților au fost înregistrate într-o bază de date sub numărul lor de cod care s-a format în felul următor: GPN2 – inițialele instituției în care s-a făcut prelevarea – inițialele numelui și prenumelui pacientului – numărul ordinii de includere.

Pentru fiecare pacient inclus s-a înregistrat în mod prospectiv următoarele date clinice: ziua de naștere, sex, histologie a tumorii, răspunsul clinic la tratament neoadjuvant, numărul de cicluri administrate, tipul de droguri utilizate, efectele adverse, stadializarea TNM a pieselor rezecate la pacienții operați. Toți pacienții au fost stadializați conform clasificării TNM a American Joint Committee on Cancer, ediția a 7-a. Numărul de cicluri de regim de chimioterapie a fost determinat de către clinicieni și a variat între 2 și 3, în funcție de răspunsul clinic și radiologic. Răspunsul clinic a fost definit prin utilizarea criteriilor OMS de evaluare a răspunsului la tratament în tumorile solide. După chimioterapia neoadjuvantă pacienții au fost reevaluați prin computer tomografie și / sau PET, și rezecția tumorii a fost realizată pentru cei care nu au avut nici o dovada de progresie a bolii. Pacienții care au progresat sub chimioterapie nu au fost operați. Boala stabilă (SD), nu a fost considerat o contraindicație pentru chirurgie și, prin urmare, o restadializare patologica a statutului ganglionilor mediastinali nu a fost considerată necesară. Pacienții care au fost operați au beneficiat de o rezecție pulmonară anatomică și o limfadenectomie sistematică a ganglionilor limfatici mediastinali.

O rezecție a fost considerată completă (R0), atunci când nu a existat nici o tumoare reziduală detectată la marginile de secțiune bronșică sau vasculară și nici boala reziduală în regiunea mediastinală. Downstagingul mediastinal a fost definit ca lipsa de celule tumorale în ganglionii mediastinali rezecați. Răspuns patologic complet a fost definit ca absența celulelor tumorale viabile în piesă sau în ganglionii limfatici rezecați. Pacienții care au progresat sub chimioterapie și care nu au avut un downstaging pe piesa operatorie, au fost considerați ca insensibili la tratamentul chimioterapic și incluși în Lotul A. Pacienții care au avut un downstaging sau au un răspuns patologic complet pe piesa operatorie, au fost considerați ca sensibili la tratamentul chimioterapic și incluși în lotul B.

Figura 20 rezumă metodologia proiectului.

Figura 20. Metodologia proiectului

HISTOLOGIE

PROFIL GENOMIC

Prepararea eșantioanelor și extracția ARN și ADN

Diferitele tehnici de analiză au inclus tehnici de “Omics” (microarray, secventiere). Toate aceste investigații au fost urmate de analize bioinformatice.

După prepararea eșantioanelor tisulare, extracția ADN genomic s-a realizat cu Kit-ul Qiagen Genomic DNA urmărind instrucțiunile producătorului. Extracția ARN a urmat aceleași principii folosind kitul Absolutely RNA Microprep (Agilent Technologies).

Analiza transcriptomului s-a realizat pe Platforma de genomică a Institutului Clinic Fundeni folosind echipamentul Agilent microarray.

Extractiile ARN

Eșantioanele tisulare recoltate de la pacienți eligibili pentru studiu au fost prelucrate în vederea extacției de ARN total.

Pe scurt, ARN-ul total a fost obținut prin extracție în două etape: prima etapă reprezentată de extracția cu Trizol (Invitrogen) și cea de-a doua reprezentată de purificarea ARN (clean-up) folosindu-se kitul Absolutely RNA Microprep (Agilent Technologies).

În prima etapa a protocolul de extracție s-a omogenizat țesutul cu 1 ml trizol, s-a adăugat cloroform care a permis izolarea ARN în faza apoasă. Aceasta fază a fost tratată cu izopropanol, iar peletul (ARN precipitat) a fost spălat cu etanol 75%. Ulterior ARN precipitat a fost dizolvat în apa Rnase Dnase free.

Cea de-a doua etapă în procesul de izolare, clean-up-ul a presupus amestecarea soluției ARN cu tampon de liză și beta-mercaptoetanol; ulterior a fost adăugat etanol 70% care a facilitat legarea selectivă a ARN de membrana coloanelor din kit.

Pentru probele de ARN astfel obținute au fost realizate controalele cantitative și respectiv calitative (Tabel 9) prin citirea spectrofotometrică a concentrațiilor ARN și a raportului A260/A280 și respectiv prin electroforeza capilara în polimer de acrilamida cu ajutorul Agilent 2100 Bioanalyser și a chipurilor din kitului RNA 6000 Nano kit (rapoarte Bioanalyser prezentate în Figura 21). Agilent 2100 Bioanalyzer cuantifică calitatea ARN prin atribuirea unui RNA Integrity Number (RIN) fiecărei probe citite. Aceste RIN poate lua valori de la 1 la 10; un RIN de valoare 1 fiind atribuit unui ARN degradat, iar un RIN de valoare 10 fiind atribuit unui eșantion ARN integru.

Pe parcursul preparării chipului, microcanalele sunt umplute cu un polimer și cu un marker fluorescent. Apoi probele împreună cu un marker sunt încărcate în fiecare godeu. Pe fiecare chip se va migra, în afară de probe și un standard extern (ladder).

Fiecare chip ARN conține un set de microcanale din sticlă interconectate care formează o rețea între godeurile chipului și care ajută la separarea și migrarea ARN în funcție de mărime. O dată ce godeurile și canalele sunt umplute, chipul devine un circuit electric integrat. Moleculele mici migrează mai repede decât cele mari. Moleculele de marker fluorescent se leagă de catena ARN, astfel ca aceste complexe sunt detectate prin fluorescența indusă de laser. Software ul compară automat probele cu fragmentele ladderului pentru a detremina concentrația și peakurile de ARN ribosomal al fiecărei probe.

Tabel 9. Exemple de concentrații și raportul 260/280 pentru probele ARN purificate.

Figura 21. Raport ARN total Bioanlizor 2100.

Extracții ADN

Protocolul de extracție ADN (conform protocolului DNA Extraction kit (Startagene) și QIAamp Dna Mini Kit (Qiagen)), presupune următoarele etape (Figura 22):

mojararea în azot lichid a ~30 mg țesut

amestecarea cu tampon de liză

adăugare proteinază K

incubare peste noapte în termobloc la temperatura de 56˚C

tratament cu Rnaza. Concentrația inițială a enzimei este de 10mg/ml, concentrația finală de Rnaza este de 20 ug/ml. Amestecul de reacție se incubează pe termobloc timp de 10 minute la 70˚C

adăugare etanol 100%

încărcare amestec de reacție pe coloane

centrifugare la 8000 rpm timp de 1 minut la temperatura camerei

aruncare eluat

spălare cu 500 ul tampone de spălare

eluare finală cu 50 ul apă liberă de Rnase și Dnase

tratament cu Rnaza.

citire concentrație și raport 260/280 la Nanodrop 1000

citirea concentrațiilor fluorimetric cu ajutorul echipamentului Quibit

Puritatea probelor a fost determinată prin calcularea raportului dintre absorbanța la 260 nm și 280 nm. ADNul izolat a avut un raport între 1.7 și 2.2.

Pentru asigurarea acurateții concentrației, aceasta a fost estimată și cu ajutorului Qubit 2.0 Fluorometer (test: dsDNA BR).

Echipamentul utilizează fluorocromi de tip sonde moleculare pentru cuantificarea gDNA. Acești marcatori emit semnal fluorescent numai când sunt legați de moleculele de interes, în cazul nostru gDNA.

Figura 22: Pașii de lucru pentru estimarea concentrației gDNA cu ajutorul Qubit

(http://www.lifetechnologies.com/ro/en/home/brADNs/product-brADN/qubit/qubit-fluorometer.html#how)

ADNul astfel izolat a fost stocat la -28șC pentru utilizare în reacțiile de secvențiere.

Ulterior, în vederea testării calității, probele de ADN au fost migrate și electroforetic în gel de agaroza 1%, 1X TAE, 100V, timp de 60 minute. Imaginile au fost preluate cu ajutorul echipamentului GelDoc, BioRad (Figura 23).

Figura 23: Migrare electroforetică în gel de agaroza 1%, Ladder 100-3000 bp.

Controlul calității ARN

Experimentele microarray

Planul de realizare al experimentelor microarray este schematizat în Figura 4.

MI

Figura 24. Planul de realizare al experimentului microarray.

În Figura 25 este redat spre exemplificare un raport de calitate al unui experiment microarray.

Figura 25. Raportul de calitate al experimetului microarray (este prezentat raportul pentru un array (o probă)).

Analiza datelor

Pentru analiza microarray s-a utilizat tehnologia Agilent One-Color Microarray- Based Gene Expression Analysis, versiunea 5.5 / februarie 2007. Au fost folosite lamele microarray slides Whole Human Genome Oligo Microarray with SurePrint Technology 4 x 44 K.

Pornind de la 100 ng în 1.5µl, s-au realizat următoarele etape:

Reacția de mârcare, folosind kitul Low Imput Quick Amp Labeling, one-color, marcajul realizându-se cu Cy 3. Din ARN total s-a obținut cDNA printr-o reacție de revers transcriere, urmată de sinteza cARN cu nucleotide marcate cu Cy3.

Reacția de purificare a cARN pe coloane conform protocolului Absolutely RNA Microprep kit

Cuantificare cARN, prin determinarea concentrației/ stocului (μg) și a activității specifice în pmol Cy3/ μg cARN. Activitatea specifică trebuie sa fie mai mare de 8 pmol Cy3/ μg cARN pentru continuarea experimentului.

Hibridizarea. Se realizează pornind de la 1.65 μg cARN marcat și cuantificat anterior, folosindu-se kitul Gene Expression Hybridisation, varianta 4 x 44 k . Amestecul de reacție este încorporat în sadnwichul format de gasket slide și slidul oligo microarray, plasat în camera de hibridizare SureHyb. Pe un gasket slide vor fi pipetate 4 probe. Camera de hibridizare a fost incubată în cuptorul de hibridizare pentru 17 ore la 65 °C, 10 rpm.

Spălarea. Lamele au fost trecute prin băi succesive folosindu-se Gene Expression Wash Buffer 1 și Gene Expression Wash Buffer 2.

Plasarea lamelor în slide holder. Lamele oligo microarray au fost așezate în câte un slide holder versiunea B astfel încât codul numeric sa fie vizibil odată pus în carusel, ceea ce permite citirea prin sticlă.

Scanarea lamelor. Pentru scanarea lamelor a fost folosit programul Scan Control versiunea 7, compatibil cu softul de extracție a datelor Feature Extraction 9.1. Pentru lamele Agilent 4 x 44K (61 x 21.6 mm) este necesară scanarea cu o rezoluție de 5 μm. Lamele au fost scanate folosindu-se următorii parametrii: RPMT 10%, GPMT 100% si XDR 0.10%. Fișierul .tiff creat a avut o rezoluție de 16 bit (Figura 26)

Figura 26. Semnalele înregistrate pentru un array după extracția datelor din fisirele .tif cu Feature Extraction.

Profilele genice au fost identificate prin compararea nivelului de expresie în țesutul tumoral cu țesutul normal. Graficul de tip heat map al expresiilor genice sunt prezentate în Figura 27.

Figura 27. Graficul de tip heat map al expresiilor genice pentru primele 100 cele mai variabile gene.

SECVENȚIERE

Protocolul de secvețiere de următoare generație presupune inițial utilizarea tehnologiei de capturare (SureSelect Target Enrichment) Agilent. Tehnologia SureSelect Target Enrichment permite țintirea regiunilor de interes (precum exomul). Inițial s-a realizat o etapă de fragmentare pentru obținerea unor fragmente de dimensiuni mici pornind de la gADN urmată de o etapă de reparare a capetelor acestor fragmente cu ajutorul enzimei Klenow, iar ulterior au fost adăugate în reacție sonde oligonucleotidice biotinilate care țintesc zonele de interes din genom. Probele au fost purificate iar în final selecția regiunilor țintite s-a realizat cu bile metalice cu streptavidină. În etapele de lucru ulteriore s-a realizat generarea clusterelor, secvențierea, alinierea citirilor și determinarea variațiilor.

Secvețierea de tip whole exome sequencing

Pentru secvențiere s-a utilizat platforma HiSeq2000 Illumina, cu 50X coverage mediu pentru zonele de interes.

Tehnologia Illumina de secvențiere paralelă în masă se bazează pe secvențierea prin sinteză [158]. După preparare țesuturilor, secvențierea începe cu adăugarea ADN-polimerazei și a unui amestec de patru nucleotide, fiecare etichetată cu un terminator reversibil și o etichetă fluorescentă specifică bazelor. Fragmentele sunt alungite treptat cu câte o nucleotidă, și după încorporarea nucleotidelor, activarea prin laser și achiziția de imagini permite identificarea nucleotidelor recent încorporate. Eticheta fluorescentă și terminatorul sunt apoi eliminate, și începe următorul ciclu de secvențiere [159]. Experimentul de secvențiere a permis identificarea genelor responsabile pentru răspunsul la tratament prin determinarea unei semnături genetice a pacienților cu CPCNM.

Într-o primă etapă secvențele adaptor din datele brute precum și datele de calitate inferioară (cu multe N) sunt îndepărtate. Acest pas a permis dobândirea datelor nealterate/ curate. Apoi este realizată alinierea BWA (Burrow-Wheeler Aligner). Acest tip de aliniere generează date în fișiere cu format .bam. Aceste fișiere sunt necesare pentru procesări, precum stabilirea informației pereche a alinierii, adăugarea informației despre grupul de citire, realizarea citirilor duplicat cauzate de PCR. După aceste procesări, fișierele BAM au fost utilizate pentru citirea variantelor. SNP (Single Nucleotide Polymorphism) sunt determinate cu SOAPsnp, inserțiile/delețiile (InDels) mici sunt determinate cu Samtools/GATK, SNVs (Single Nucleotid Variants) sunt detectate cu Varscan. Inserțiile/delețiile (In/Del) somatice sunt detectate cu GATK, CNVs (Copy Number Variation) sunt detectate cu Exome CNV/Varscan. Procedura experimentală include și estimarea purității. Ulterior o serie de filtre au fost aplicate pentru obținerea unor rezultate mult mai sigure. Apoi s-a utilizat ANNOVAR pentru adnotarea variantelor rezultate. Variantele finale pot fi utilizate în procedura avansată ulterioară, în aval.

Procedura experimentală standard este prezentată în figura de mai jos (Figura 28):

Figura 28. Rezultatele analizei bioinformatice: Procedura experimentală standard de whole exome sequencing.

Controlul calității datelor de secvențiere

Definim citirile brute ca citiri care conțin secvența adaptorului, un conținut mare de baze necunoscute și citiri de calitate inferioară. Acestea trebuie să fie înlăturate înaintea analizei de date.

Pașii de filtrare sunt următorii:

Eliminarea citirilor adaptorului: Citirile adaptorului sunt definite ca o citiri care include bazele adaptorului; aceste citiri ale adaptorului vor fi eliminate din datele brute ale FASTQ;

Eliminarea citirilor de calitate inferioară: dacă mai mult de jumătate din bazele dintr-o citire sunt baze de calitate inferioară care a fost definită ca și calitate a bazelor mai mică sau egala cu 5, consideram citirea ca fiind inferioara calitativ și aceasta va fi eliminată din datele brute ale FASTQ;

Eliminarea citirilor în care bazele necunoscute au un procent mai mare de 10%

După filtrare, citirile rămase sunt denumite “citiri curate” sunt utilizate pentru analiza bioinformatică ulterioară. În final s-a realizat o statistică pentru a avea producția de date pentru datele brute FASTQ și datele curate. În același timp, calitatea datelor curate poate fi prezentată într-o imagine.

Controlul de calitate al alinierii

Citirile secvențierii au fost aliniate cu secvența genomului de referință folosind BWA. Pentru cartografiere s-a folosit genomul uman ca genom de referința. BWA a fost selectat după evaluarea performantei sale. BWA este un program eficient, care analizează secvențele de nucleotide relativ scurte în vederea producerii unor rezultate precise și rapide , cu rate de eroare scăzute. BWA furnizează schema flexibila a parametrilor și producția alinierii este prezentată în format SAM (Sequence Alignment/Map).

S-a folosit picard pentru a marca citirile în duplicat (informații în exces produse prin PCR). După care s-au combinat rezultatele de aliniere la un format de fișier BAM care este forma compresată a fișierelor SAM.

S-a considerat genomul uman build 37 (hg19) ca genom de referință pentru acest proiect. Dimensiunea întregului genom hg19 este de 3,137,161,264, în timp ce dimensiunea efectivă este de 2,861,327,131 (excluzând bazele N, regiunile randomice, regiunile hap, cromosomul Un, cromosomul M în referință).

Analiza SNP

Am utilizat SOAPsnp pentru detecția SNPs. Genotipul cu cea mai mare probabilitate la un locus dat este identificat pentru fiecare probă secvențiata a unui individ și secvența consens a probei este asamblată și salvată în format CNS. Utilizând secvența consens, locusul polimorfic între genotipul identificat și cel de referință poate fi filtrat și evidențiat; acesta va constitui setul de date SNP cel mai sigur. Setul de date este salvat într-un fișier separat în format text.

Analiza In/Del si Distrbuția lungimilor

Am utilizat citirea capetelor împerecheate pentru alinierea decalajelor pentru a detecta InDel-urile (small Insertion/Deletion) utilizând programul mpileup în SAMtools.

Distrbuția lungimilor InDelurilor în întreaga regiune ținta și regiunea CDS au fost de asemenea reprezentate. Distribuția lungimii InDel-urilor în regiunea CDS arata faptul ca peak-urile sunt prezente în lungimile 3,6,9. InDel-urile cu această periodicitate nu sunt InDel-uri de tip frameshift, ele afectează relativ puțin genomul în comparație cu InDel-urile de tip frameshift.

Analiza In-Dels

Parametru Java-jar GenomeAnalysisTK.jar – T UnifiedGenotyper – stADN_call_conf50 stADN_emit_conf10.0 – A DepthOfCoverage – A RMSMappingQuality-baq CALCULATE_AS_NECESSARY –glm INDEL

Analiza statistică

În analiza statistică, variabile dihotomice au fost exprimate ca numere absolute și procente și variabilele cantitative au fost rezumate ca valori medii cu primul și al treilea cuartil.

Asocierea dintre variabilele calitative a fost verificată prin intermediul țestului χ2 sau țestul Fisher. Semnificația statistică a diferenței dintre valorile medii a fost testată prin Mann-Whitney U-test pentru probele nepereche.

ANALIZA STATISTICĂ

Analiza statistică și a distribuției rezultatelor secvențierii

În Tabelul 10 este redat un exemplu de rezultate statistice calculate în urma secvențietii unui eșantion tisular.

Tabel 10. Statistica datelor pentru o probă.

Nota:

Regiunea din vecinătatea țintei se refera la regiunile adiacente nu mai departe de 200 pb fața de regiunea țintă.

Citirile efective înseamnă cartarea citirilor după procesul de îndepărtare al duplicaților. Bazele efective înseamnă bazele din citirile efective.

Regiunile țintă utilizate aici se referă la regiuni genomice pe care array-ul exomomic de fapt l-a acoperit.

Citirile cartate unic: citirile alinierii a calității cartografierii >= 1.

Distribuția profunzimii secvențierii per bază și distribuția cumulativă a profunzimii în regiunile ținta au fost de asemenea reprezentate grafic mai jos (Tabelul 11 și Figura 29).

Tabel 11 și Figura 29: Statistica de distribuție pentru o probă.

Distribuția profunzimii secvențierii per bază a urmat aproximativ o distribuție Poisson, care arată că regiunea ținta de capturare a exomului a fost uniform eșantionată. Axa x indică profunzimea secvențierii, în timp ce axa y indica procentul regiunii țintă totală sub o anumită profunzime a secvențieri.

Între timp în graficul distribuției cumulative a profunzimii din regiunile ținta, axa x indică adâncimea secvențierii și axa y indică fracția de baze care atinge sau depășește o anumită profunzime a secvențierii.

Statistica SNPs

După ce SNPs sunt identificate, s-a utilizat ANNOVAR pentru a face adnotările și clasificarea (Tabelul 12).

Nota: Valoarea din prima coloana se ghidează după următoarele priorități: exonic=splicing>ncRNA>>UTR5/UTR3>intron>upstream/downstream>intergenic.

Hom-homozigot; Het-heterozigot;

Exonic se referă numai la porțiunea codantă, dar nu și la porțiunea UTR, după cum există 2 cuvinte UTR5 și UTR3 care sunt special rezervate pentru adnotările UTR.

Stopgain înseamnă ca un SNV nonsinonim care a condus la imediata creare a codonului stop la situsul variant, iar stoploss înseamnă că a condus la o eliminare imediată a codonului stop la situsul variant.

Splicing-ul in ANNOVAR este definit ca varianta care este la 2 bp departare de o limită exon/intron

Dacă o variantă este localizată atât în regiunea exonic cât și la jocțiunea de splicing, atunci au fost calculate atât exonii cât și splicingul (“exonic ADN splicing”).

Termenii upstream și downstream sunt definiți ca fiind la 1kb depărtare de situsul de start al transcrierii sau situsul de terminare a acesteia.

SIFT (Sortarea tolerantului de intolerant) prezice dacă o substituție a unui aminoacid afectează funcția proteică.

Ti se referă la tranziție, TV se referă la transversie.

Tabel 12: Statistica SNP-urilor pentru o probă.

Statistica în Analiza In/Del

După ce InDel-urile sunt identificate utilizam ANNOVAR pentru a face adnotarile și clasificarea (Tabelul 13 și Figura 30).

Nota: Valoarea din prima coloana se ghidează după urmatoarele priorități: exonic=splicing>ncRNA>>UTR5/UTR3>intron>upstream/downstream>intergenic.

Mutațiile de tip frameshift înseamnă o inserție sau o deleție a uneia sau a mai multor nucleotide care cauzează schimbări de tip frameshift în secvența proteică codantă.

Mutațiile de tip nonframeshift înseamnă o inserție sau o deleție care nu cauzează schimbări de tip frameshift în secvența proteică codantă.

Substituția în bloc de tip frameshift sau nonframeshift înseamnă că o susbtituție în bloc a uneia sau a mai multor nucleotide care (nu) cauzează schimbări de tip frameshift în secvența proteică codantă.

Exonic se referă doar la porțiunea exonică codantă, dar nu și la portiunea UTR, după cum există 2 cuvinte UTR5 și UTR3 care sunt special rezervate pentru adnotările UTR.

Stopgain se referă la o inserție sau o deleție de tip frameshift, o inserție sau o deleție de tip nonframeshift sau o substituție în bloc care conduce la o creare imediată de codon stop la situsul variant. Pentru mutații de tip frameshift, crearea unui codon stop downstream de variant nu va fi considerat ca “stopgain”. În timp ce stoploss se referă la faptul că se produce o eliminare imediata a codonului stop la situsul variant.

Splicing-ul in ANNOVAR este definit ca variantă și care este la 2 bp depărtare de o legătura exon/intron

Dacă o variantă este localizata atât în regiunea exonic cât și la joncțiunea de splicing atunci va fi calculată atât ca exon cât și ca splicing (“exonic ADN splicing”).

Termenii upstream și downstream sunt definiți ca fiind la 1kb departare de situsul de start al transcrierii sau situsul de terminare a acesteia.

Tabel 13 și Figura 30: Statistica InDel pentru o probă.

REZULTATE

PACIENȚI INCLUȘI ÎN PROTOCOL

Un total de 73 de pacienți deja diagnosticați sau suspecți de CPCNM în stadiul IIIA clinic au fost incluși inițial în studiu. Toți pacienții au beneficiat de o procedură chirurgicală (mediastinoscopie sau toracoscopie) pentru confirmarea histologică a invaziei ganglionilor mediastinali. Un total de 44 de pacienți au fost excluși din studiu în urma analizei histologice a țesuturilor ganglionare mediastinale prelevate. Cauzele de excludere se regăsesc în Tabelul 14.

Cauza de excludere Număr pacienți

Lipsa țesutului tumoral în ganglionii mediastinali 28

recoltați prin biopsie chirurgicală (pN0)

Leziuni benigne în ganglionii mediastinali 1

Carcinom pulmonar cu celule mici 6

Invazie avansată a ganglionilor mediastinali (bulky N2) 2

Limfom în ganglionii mediastinali 1

Utilizarea țesutului ganglionar tumoral congelat în scop diagnostic 1

Absența țesutului tumoral în țesutul ganglionar congelat 2

Descoperirea fortuită a invaziei ganglionare de tip N3 3

TOTAL 44

Tabel 14. Cauzele de excludere.

Toți pacienții au fost în stadiul IIIA (invazia ganglionilor mediastinali – N2+) dovedit histopatologic. Caracteristicile de bază ale celor 29 de pacienți rămași în studiu sunt detaliate în Tabelul 15. Pacienții de sex masculin au fost predominanți (n = 18; 62%), vârsta medie fiind de 61 ani. Adenocarcinomul (n = 22; 75,8%) a fost cel mai frecvent tip histologic.

Caracteristici Număr (%)

Total pacienți 29

Sex

masculin 18 (62)

feminin 11 (38)

Vârsta medie (ani) 61 [40-75]

Histologie

Adenocarcinom 22 (75,8)

Carcinom scuamos 3 (10)

Carcinom neuroendocrin cu celule mari 3 (10)

Carcinom cu celule mari 1 (3,2)

cT (stadiul clinic al tumorii)

T1a 3 (10)

T1b 8 (27,5)

T2a 10 (34,5)

T2b 2 (7)

T3 6 (20)

Tabel 15. Caracteristicile generale ale populației studiate.

CHIMIOTERAPIE NEOADJUVANTĂ ȘI RĂSPUNS

Chimioterapia neoadjuvantă

Numărul mediu de cicluri de chimioterapie administrate a fost de 3 (interval 2-4): 1 (3,2%) pacient a primit 2 cicluri, 21 (72,6%) au primit 3 cicluri și 6 (21%) au primit 4 cicluri și 1 pacient (3,2%) a primit 5 cicluri. Toți pacienții au fost tratați cu o combinație de două medicamente primul chimioterapic fiind invariabil Cisplatina (n=23, 79%) sau Carboplatina (n=5, 21%), combinația de cisplatina/pemetrexed fiind administrată în majoritatea cazurilor (n = 15; 52%). Al doilea chimioterapic a fost Etoposidul (n=7, 24%), urmată de Gemcitabina (n=3, 10%) și Vinorelbina (n=3, 10%). Toxicitatea la chimioterapia neoadjuvantă a fost în majoritatea cazurilor ușoară sau moderată (gradul 1-2) evenimente adverse (efectele toxice hematologice leucopenie: în 29,4%, anemie la 25,8%, trombocitopenie la 7%, toxice non-hematologice: gastrointestinale, inclusiv în principal greață, vărsături sau diaree în 37,6%, oboseală la 25,8%, alopecie la 14,1% și altele în 8%). Trei (10%) pacienți au avut de grad 3/4 de toxicitate, care a inclus 2 leucopenii și o tromboză venoasă profundă complicată cu embolie pulmonară și deces după primul ciclu de chimioterapie. Răspunsul clinic a fost evaluat la cei 28 pacienți care au terminat tratamentul de inducție prin chimioterapie. Evaluarea răspunsului la tratament s-a realizat prin scanare CT și / sau PET și a arătat 16 pacienți (57%) au evoluat sub chimioterapie, 6 pacienți (21,5%) au fost stabilizați și 6 pacienți (21,5%) au avut răspunsuri parțiale. Nici un pacient nu a avut un răspuns clinic complet. Rata globală de răspuns clinic la chimioterapia neoadjuvantă a fost de 12 pacienți (43%). Acești pacienți au beneficiat ulterior de intervenție chirurgicală.

Chirurgie

Un pacient a avut carcinoza pleurala descoperita la toracotomie și nu a beneficiat de rezecție chirurgicală. Restul de 14 (50%) pacienți au beneficiat de rezecție chirurgicală: 11 lobectomii (78,5%), o bilobectomie (7%) și 2 pneumonectomii (14,5%). Limfadenectomia sistematică a ganglionilor limfatici mediastinali a fost efectuată la fiecare pacient. Toți pacienții au beneficiat de o rezecție completa R0.

Răspuns histopatologic

Un răspuns histopatologic complet a fost observat la 2 (7%) pacienți. Boala reziduală N2 a fost prezent în 6 (21,5%) pacienți, în timp ce 7 (25%) au avut downstaging mediastinal: N1 (n = 1; 3,5%) sau N0 (n = 6; 21,5%).

În total, 7 (25%) pacienți au avut un downstaging al bolii inițiale și au fost incluși în Lotul B al pacienților sensibili la chimioterapie. Restul de 21 de pacienți (cei care au evoluat sub chimioterapie – 13 pacienți, și cei care nu au avut un dowstaging prin chimioterapie – 8 pacienți) au fost incluși în Lotul A ai pacienților care nu au răspuns la chimioterapie.

În figura 31 este redat fluxul de includere al pacienților de la momentul suspiciunii clinice de CPCNM și invazia ganglionilor mediastinali și până la formarea loturilor prognostice.

Figura 31. Formarea loturilor prognostice.

CLASIFICAREA ÎN LOTURI PROGNOSTICE

Lotul A – 21 de pacienți care nu au răspuns la chimioterapie sau au avut răspunsuri minore ori au fost doar stabilizați prin chimioterapie neoadjuvantă (criterii OMS).

Lotul B – 7 pacienți care au avut un răspuns obiectiv la chimioterapie neoadjuvantă (criterii OMS).

Stadiul patologic a fost: nici o boală reziduală în 2 cazuri, stadiul IA în 3, IIA în 3 și IIIA în 6 cazuri.

Nu s-a determinat nici o asociere semnificativă între răspunsul clinic și patologic sau downstaging mediastinal și de sex, vârstă, histologie, numărul de cicluri tipurile de tratament chimioterapic sau răspunsul clinic la chimioterapie.

PROFILE DE EXPRESIE MICROARRAY ȘI CĂI DE SEMNALIZARE

Experimentele microarray și analiza bioinformatică

Datele generate de softwareul Feature Expresion 9.1 au fost analizate cu softwareul Gene Spring 11.0 (Agilent Tchnologies).

Analiza diferențială a expresiei între țesutul normal și tumoral utilizând un t- test nepereche și un test de corecție Benjamini-Hochberg, cu un p value<0.05 a permis identificarea a 3745 gene dintr-un total de 34 183. Ulterior aplicând un fold change ≥ 2 au fost selectate, din cele 3745, 2550 gene (cu expresie diferită între țesutul tumoral față de cel normal) (cele 2550 gene sunt prezentate în figura 32 în verde).

A

B

Figura 32. 32A: Selecția a 3745 gene cu un p value < 0.05;

32B: Selecția a 2550 gene cu un p value < 0.05 și un fold change ≥2

Analiza de tip herardical a permis identificarea genelor supra și sub-exprimate în cele două tipuri de țesut analizate (figura 33 A, pe prima coloană sunt reprezentate țesuturile normale iar pe cea de-a doua, țesuturile tumorale). Au fost identificate 535 gene sub-exprimate și 333 gene supra-exprimate (tabel 16 A și B).

Un altgoritm de clusterizare utilizând o distanță metrică de tip euclidiana și un linkage de tip centroid a clasificat genele în trei clustere: clusterul 0 conține 900 gene, clusterul 1 conține 1648 gene și clusterul 2 conține 2 gene (figura 33 B-D).

Figura 33. Analiza clusterelor pentru genele cu expresie diferențială între țesutul normal și tumoral (culoarea roșie indică nivele crescute de expresie în țesutul tumoral fața de cel normal, culoarea albastră indică nivele scăzute de expresie, culoarea galbenă- fără modificare de expresie).

Tabel 16A. Gene sub-exprimate.

Tabel 16B. Gene supra-exprimate.

Căile de semnalizare identificate în urma analizei sunt: receptor androgen (98 gene din cele 2550 identificate), BCR (148 gene din cele 2550 identificate), EGFR1 (181 gene din cele 2550 identificate), IL2 (72 gene din cele 2550 identificate), IL5 (39 gene din cele 2550 identificate), IL7 (16 gene din cele 2550 identificate), receptor KIT (70 gene din cele 2550 identificate), TCR (140 gene din cele 2550 identificate), Wnt (138 gene din cele 2550 identificate) (figura 34 A-I).

Figura 34A. Calea receptor Androgen

Figura 34B. Calea BCR.

Figura 34C. Calea EGFR1.

Figura 34D. Calea IL2.

Figura 34E. Calea IL5.

Figura 34F. Calea IL7.

Figura 34G. Calea KIT receptor.

Figura 34H. Calea TCR.

Figura 34I. Calea Wnt.

Analizele bioinformatice ale datelor de tip one-color microarray au condus la identificarea unei liste de 1127 gene cu expresie modificată în țesutul tumoral comparativ cu cel normal, cu o valoare p p ≤ 0.05 (Tabel X) și a unei liste de 44 gene cu un p ≤ 0.01.

Controlul calității a fost realizat utilizând pachetul Agi4x4Preprocess R.

În Tabelul 17 sunt prezentate cele 44 de gene cu p ≤ 0.01. Aceste gene au avut un fold change (în valoare logaritmică) care a variat de la -1,7 la 4,23.

Tabel 17. Lista celor 44 de gene cu un p ≤ 0.01.

Analiza datelor de microarray

Datele sunt compuse din două grupuri de pacienți: cei care nu au răspuns la tratamentul prin chimioterapie neoadjuvantă (non-responders) și cei care au răspuns la tratamentul prin chimioterapie neoadjuvantă (responders). De notat că printre responders există doar o singură femeie (nepereche). Unele eșantioane sunt împerecheate la eșantioane de ganglioni non-tumorali de la același pacient, altele nu. Acest tip de date este menționat în literatura de specialitate ca "Parțial imperecheat", și pot fi abordate prin modele liniare cu efecte mixte [182, 183]. Pentru simplificare, am luat în considerare mai întâi datele care sunt împerecheate, și apoi am considerat datele ca un întreg, indepedent de împerechere.

Țesut ganglionar normal versus tumoral: În urma experimentului microarray realizat s-au putut identifica un număr de 1127 gene cu expresie modificată în țesutul tumoral comparativ cu țesutul normal cu p-value ≤ 0.05 și 44 de gene cu p-value ≤ 0.01.

Dintre genele identificate cele cu cele mai mari diferențe de expresie genică identificată între țesutul tumoral față de cel normal sunt COL1A1, INHBA sau TXNIP.

Țesut ganglionar tumoral responders versus non-responders: Seturile de gene au fost pregătite pentru analiza GO (ontologia genelor) îmbogățită (bioinfo.vanderbilt.edu/webgestalt) [184, 185] cu ajutorul combinațiilor de gene de varianță mare sau mică la responders și la non-responders. A fost definit un total de 12 grupuri diferite și 50 de gene mai reprezentative (cea mai mare sau cea mai mică varianță) au fost selectate ca in-put pentru fiecare grup. Tabelele 18 și 19 arată termenii GO care au fost semnificativi pentru responders și non-responders, respectiv, folosind genele cu varianță mare.

De notat că pentru seturile de gene cu varianță mica au existat doar rezultate de Proces Molecular, și că în toate cazurile, "activitatea receptorului de semnalizare transmembranara", și grupurile asociate (de exemplu " receptorul de activitate "), au fost semnificative.

Multe categorii GO au fost semnificative pentru unele dintre grupuri, și prin urmare am filtrat pentru a da rezumatele prezentate în Tabelele 18 și 19. Am păstrat termenii GO cu valori p <0,01, cel puțin 5 gene în termen de Proces Biologic, cel puțin 4 gene în termen de Funcții Moleculare, și cel puțin 3 gene în termen de Componente Celulare. A fost selectat un numărul diferit de gene minime pentru fiecare categorie, deoarece a existat o preponderență a rezultatelor în termen de Proces Biologic, față de Funcțiile Moleculare ADN Componentele Celulare, respectiv. Din motive de redundanță, în care există mai multe rezultate similare este redată doar o singură categorie. De exemplu, doar termenul de"regiune extracelulară" (Componența Celulară) în loc de "spațiul extracelular", "o parte a regiunii extracelulare", și "regiune extracelulară".

Analiza GO îmbogățită a arătat ca genele de semnalizare transmembranară nu variază de la un pacient la altul, independent de răspunsul la chimioterapia neoadjuvantă.

Genele cu mare variabilitate ale pacienților care au răspuns la chimioterapia neoadjuvantă implică keratina și cornificarea. Învelișul cornificat al celulelor epidermice ale pielii este format din keratina, și este înconjurat de lipide. Acesta este asociat cu disfuncții de barieră și are ca rezultat un semnal de apoptoză [186].

Genele cu mare variabilitate ale pacienților care au nu răspuns la chimioterapia neoadjuvanta implică activitatea enzimatică și sensibilitatea hormonală.

Tabelul 18. Termeni GO semnificativi pentru seturile de gene de varianță mare la responders.

Tabelul 19. Termeni GO semnificativi pentru seturi de gene de varianță mare la non-responders.

Analiza Căilor moleculare

Am inclus ganglioni limfatici tumorali și non-tumorali și am încercat determinarea unor căi moleculare care să definească diferența răspunsului la chimioterapie. Dacă există un semnal genetic pentru răspunsul la chimioterapie, aceasta este probabil o caracteristică a pacientului, și este prezent atât în ganglionii tumorali cât și în ganglionii non-tumorali.

Datele au fost împărțite în subgrupuri (Tabelul 20). Rezultatele, sugerează faptul că numai eșantioanele de dimensiuni mai mari permit obținerea unor rezultate semnificative. În Tabelul 20 sunt prezentate căile semnificative doar pentru grupurile cu cel puțin 10 eșantioane pe categorie. S-au determinat 7 căi moleculare care au fost semnificative (FDR <0,05) în cel puțin unul din subgrupuri. Toate aceste căi sunt în raport cu sistemul imunitar, una este o cale de semnalizare, iar restul sunt legate de răspunsul imun sau autoimun la țesut străin. Calea de semnalizare a citokinelor este de asemenea legată de bolile autoimune [187]; citokinele sunt implicate în procesul de recrutare al limfocitelor.

Nu este clar dacă semnalul de răspuns la chimioterapie este prezent atât în ganglionii limfatici invadați cât și cei neinvadați. Cu toate acestea, luând în considerare coloanele D și E, vedem că valorile p sunt bine corelate între ele, cu excepția căii de semnalizare a citokinelor, care este mai implicată în ganglionii limfatici invadați.

Tabelul 20. Valoarea p pentru căile KEGG care sunt semnificative cu un p <0.05, pentru cel puțin unul din cele 5 seturi de date de in-put, definite de la A la E. Valorile aflate sub cutoff sunt subliniate. Prima linie a antetului arată sexul pacienților (M=masculin, F=feminin) din subgrup. A doua linie arată tipul ganglionilor limfatici. Ultima linie a antetului arată numărul de non-responders și de responders (non-responders/responders) luați în calcul. De notat că există doar o singura femeie în grupul de responders, și prin urmare nu a fost luat în considerare un subgrup numai de femei.

Căile din Tabelul 20 amintesc de ceea ce s-ar putea aștepta de la compararea transcriptomului unei persoane de sex masculin cu transcriptomul unei persoane de sex feminin, deoarece diferența majoră dintre transcriptomele legate de sexe sunt procesele sistemului imunitar [188, 189]. Cu toate acestea, semnificația căilor grupului pacienților numai de sex masculin ai subgrupului B (ganglioni limfatici invadați și neinvadați) sugerează, de asemenea, o funcție imunitară similara cu comportamentul autoimun.

Ca și control negativ, Ghidul Pathway a fost utilizat în compararea femeilor cu bărbații. Căile semnificative specifice sexului sunt prezentate în Tabelul 21. Multe dintre acestea sunt căi pentru bolile autoimune, care sunt cunoscute a fi mai frecvente la femei decât bărbați [188].

(*) căi care sunt de asemenea semnificative și la responders/non-responders (Tabelul 5).

(**) căi care sunt de asemenea semnificative și numai la bărbații responders/non-responders.

Tabelul 21. Cele 19 căi semnificative, bazate pe diferențele de sex.

Tabelul 21 arată că există 19 căi semnificative atribuite diferențelor de sex. Șapte dintre acestea sunt, de asemenea, semnificative atunci când se compară pacienții care au răspuns la chimioterapia neoadjuvantă cu cei care nu au răspuns. Deși unele sunt, probabil, semnificative doar pentru că în categoria pacienților care au răspuns la chimioterapia neoadjuvantă există doar o singură persoană de sex feminin. Cu toate acestea, luând în considerare numai pacienții de sex masculin, există trei căi importante pentru răspunsul la chimioterapie, și acestea sunt, de asemenea, printre cele mai importante căi atribuite diferențelor de sex: poliartrita reumatoidă, boli tiroidiene autoimune, și semnalizarea citokinelor. Este interesant de a vizualiza aceste 3 căi, comparând rezultatul feminin / masculin cu rezultatele responder / non-responder.

Pathway Guide permite vizualizarea modificărilor, perturbarea totală [190], și totalul perturbarilor acumulate [191] în căile KEGG. În cazurile care au răspuns la chimioterapie, nu au existat gene exprimate diferențiat. De aceea vom analiza doar rezultatele cu privire la acumularea de perturbare. Totalul perturbarilor acumulate rezumă efectul genelor din amonte, asupra fiecărei gene, și deduce modificările acesteia, în timp ce perturbare totală analizează schimbarea fiecărei gene.

În Figura 35 este prezentată acumularea totală de perturbare în calea poliartritei reumatoide pentru pacienții de sex masculin responders / non-responders (partea de sus) și femei / bărbați (partea de jos). Efectul asupra căii este aceeași pentru ambele categorii. Non-responders și sexul feminin are un efect de down-regulare a semnalului pentru celulele T (CTLA4 și CD28), și up-regulează angiogeneza (FLT1), în comparație cu responders și sexul masculin, respectiv. CD28 este important pentru producerea de citokine, precum și activarea și supraviețuirea celulelor T. CTLA4 are un rol în multe boli autoimune; transmite semnale de in-hibare pentru celulele T. FLT1 este implicat în angiogeneza și funcția macrofagelor.

Figura 35. Acumularea totală de perturbare în calea poliartritei reumatoide la pacienții de sex masculin non-responders/responders (A) și femei/bărbați (B). În albastru sunt CTLA4 și CD28. În portocaliu este FLT1. Aceasta cale poate fi analizată interactiv și mai în detaliu la www.genome.jp/kegg-bin/show_pathway?hsa05323 .

În Figura 36 este prezentată acumularea totală de perturbare în calea tiroiditei autoimune pentru pacienții de sex masculin non-responders/responders (partea de sus) și femei / bărbați (partea de jos). Efectul asupra căii are unele asemănări dar și deosebiri. Ca și pentru calea poliartritei reumatoide, non-responders și sexul feminin down-reguleaza de semnalizare CD28 către celulele T. Cu toate acestea, semnalizarea receptorilor celulelor B, fiind mediată de CD40, este down-regulata la non-responders în comparație cu responders, dar up-regulată la femei față de bărbați. CD40 joacă un rol în răspunsurile imune și inflamatorii. Activitatea receptorului de suprafață FAS a morții celulare este down-regulata la non-responders față de responders, dar up-regulată la femei comparativ cu bărbații. Această observație este în concordanță cu faptul că la non-responders nu se produce suficientă apoptoza, dar femeile (care au cele mai multe boli autoimune) prezintă în mod manifest prea multă apoptoza în țesuturile țintă.

Figura 36. Acumularea totală de perturbare în calea tiroiditei autoimune la pacienții de sex masculin non-responders/responders (A) și femei/bărbați (B). În albastru este CD28. CD40 și FAS sunt activate la femei comparativ cu bărbații (portocaliu), dar down-regulate (albastru) la non-responders fața de responders. Aceasta cale poate fi analizată interactiv și mai în detaliu la www.genome.jp/kegg-bin/show_pathway?hsa05320.

În Figura 37 este prezentată acumularea totală de perturbare în calea de semnalizare a Citokinelor pentru bărbați non-responders / responders (partea de sus) și femei / bărbați (partea de jos). Marea majoritate a efectelor asupra acestei căi sunt opuse. În comparație cu responders, non-responderi au o represiune generală a întregii căi, iar femeile au o stimulare generală a întregii căi, comparativ cu bărbații. Unele citokine inflamatorii inițiază răspunsul imun. Represiunea semnalizării citokinelor la non-responders și de activarea ei la femei, confirmă, de asemenea, ipoteza că la non-responders nu se produce suficient răspuns imunitar, în timp ce femeile produc prea mult.

Figura 37. Acumularea totală de perturbare în calea de semnalizare a citokinelor pentru pacienții de sex masculin non-responders/responders (A) și femei/bărbați (B). Cascadele coerente de perturbare sunt trasate prin linii de culoare roșie. Marea majoritate a efectelor asupra acestei căi sunt opuse. Față de responders, non-responders au o down-regulare generală a întregii căi iar pacienții de sex feminin au o activare generală a întregii căi comparativ cu bărbații. Aceasta cale poate fi analizată interactiv și mai în detaliu la www.genome.jp/kegg-bin/show_pathway?hsa04062.

SECVENȚIERE

Secvențierea exomului (Whole exome sequencing)

După analiza calitativă a eșantioanelor recoltate, doar 15 pacienți au îndeplinit aceste criterii. Pacienții ai căror ganglioni mediastinali tumorali pre-chimioterapie sunt analizabili se împart în:

Lotul A – 9 pacienți care nu au răspuns la chimioterapie, au avut răspunsuri minore sau au fost doar stabilizați prin chimioterapie neoadjuvantă.

Lotul B – 6 pacienți care au avut un răspuns obiectiv la chimioterapie neoadjuvantă.

Mediile numărului de secvențieri a țintei per fiecare probă analizată, exprimate procentual, sunt prezentate în tabelul de mai jos (Tabelul 22):

Tabel 22. Mediile numărului de secvențieri a țintei per probă.

În Tabelul 23 sunt prezentate numărul total de SNP obținute prin secvențiere în fiecare probă analizată:

Tabel 23. Numărul total de SNP per probă.

În tabelul de mai jos (Tabelul 24) sunt prezentate numărul total de In/Del obținute prin secvențiere în fiecare probă analizată:

Tabel 24. Numărul total de In/Del per probă.

S-a identificat un număr de 216 gene cu mutații cu un p-value ≤ 0.05 care sunt asociate cu fenotipul cancerului bronho-pulmonar cu celule non-mici (Figura 38).

Figura 38. Genele identificate, cu p value semnificativ statistic, prin whole exome sequencing între loturile de pacienți analizați.

Selecția genelor cu p-value ≤ 0.01 (Tabel 25), a condus la identificarea SNP-urilor pentru genele SENP5 (rs63736860 și rs1602), RGP1 (rs1570248), NCBP2 (rs553783), SLFN12L (rs2304968 și rs9905892) și GBA2 (rs3833700) care permit identificarea pacienților cu răspuns la tratament chimioterapeutic neoadjuvant versus pacienții cu răspuns minor la tratament chimioterapeutic neoadjuvant (Tabel 26).

Mutațiile SENP5 (rs63736860 și rs1602) și NCBP2 (rs553783) sunt identificare cu o frecvență mult mai crescută la pacienții cu răspuns minor la tratament, în timp de mutațiile RGP1 (rs1570248), SLFN12L (rs2304968 si rs9905892) și GBA2 (rs3833700) sunt identificate cu o frecvență mult mai mare la pacienții cu răspuns obiectiv la tratamentul de inducție.

Astfel prezența SNP-urilor menționate pentru genele SENP5 și NCBP2 pot indica un non-răspuns la tratament, în timp ce prezența SNP-urilor meționate pentru genelor RGP1, SLFN12L și GBA2 pot indica un răspuns pozitiv la tratamentul chimioterapeutic neoadjuvant.

*LOT A- include pacienții cu răspuns minor la tratament

**LOT B- include pacienții cu răspuns la tratament

***Valoarea P a fost calculatea conform testului Fischer

Tabelul 25. Gene cu mutații cu un p-value ≤ 0.01.

Tabel 26. Secvența SNPs (Single Nucleotid Polymorphism).

Mutațiile SENP5 (rs63736860 și rs1602) și NCBP2 (rs553783) sunt identificare cu o frecvență mult mai crescută la pacienții fără răspuns la tratament, în timp de mutațiile RGP1 (rs1570248), SLFN12L (rs2304968 și rs9905892) și GBA2 (rs3833700) sunt identificate cu o frecvență mult mai mare la pacienții cu răspuns la tratament.

Mutații la nivelul acestor gene nu au fost depistate până în prezent în asociație cu cancerul pulmonar cu celule non-mici.

SENP5 (Sentrin-specific protease 5), EC=3.4.22.68 (Figura 39), face parte din familia de proteaze cu SUMO-specificitate (SENP). SENP participă în reglarea SUMOilarii prin generarea unor small ubiquitin-related modifiers (SUMO) pentru conjugarea proteinelor (clivarea endopeptidazelor) și deconjugarea țintelor (clivarea izopeptidazelor). Boli asociate modificărilor la nivelul SENP5 sunt carcinomul oral cu celule squamoase și carcinomul cu celule squamoase.

Figura 39. Rețeaua generată de programul String 9.05 pentru SENP5.

NCBP2 (Nuclear Cap Binding Protein Subunit 2), componența complexului de legare a proteinei cap, care se leagă la capatul 5`al pre-miRNA și este implicat în procese variate precum splicingul pre-miRNA, reglarea translației, degradarea mARN, silențiere genică mediată de microARN și exportul mARN (Figura 40).

Figura 40. Rețeaua generată de programul String 9.05 pentru NCBP2.

RGP1 (RGP1 retrograde golgi transport homolog), poate fi necesar pentru fuziunea eficintă a veziculelor derivate din endozomi cu aparatul Golgi (Figura 41).

Boli asociate cu modificări la nivelul RGP1 includ boala periodontală și periodontită.

Figura 41. Rețeaua generată de programul String 9.05 pentru RGP1.

GBA2 (Beta Glucosidase) se găsește în reticulul endoplasmatic și membrane ale aparatului Glogi fiind implicată în metabolismul sfingolipidelor (Figura 42). Mutații la nivelul acestei gene sunt asociate cu boala Gaucher.

Funcția enzimei GBA2 este de a hidroliza, la nivelul ficatului, acid 3-O-glucozidaza din bilă, ca și compus endogen, dar și de a hidroliza glucozilceramidele.

De exemplu, șoarecii deficienți GBA2 prezintă acumularea de GlnCer în diferite țesuturi.

Figura 42. Rețeaua generată de programul String 9.05 pentru GBA2.

SLFN12L (schlafen family member 12-like) este implicat în legarea dependentă de ATP și preferențial exprimată în țesuturile limfoide (Figura 43).

Modificări la nivelul SLFN12L sunt asociate cu diabetul de tip 1.

Figura 43. Rețeaua generată de programul String 9.05 pentru SLFN12L.

SEMNĂTURI GENICE PROGNOSTICE

DISCUȚII

Cancerul pulmonar reprezintă una din principalele cauze de deces la nivel mondial de cancer, de multe ori pentru că doar un număr redus de pacienți au la diagnosticul initial o tumoare în stadiu incipient, care poate beneficia de rezecție chirurgicala. Aproximativ 30% din cazuri sunt într-un stadiu local avansat (stadiul III) la diagnosticul inițial. Tratamentul optim pentru acești pacienți nu a fost încă bine definit și depinde de mai mulți factori [192]. Prognosticul pacienților cu NSCLC în Stadiul III tratați printr-o singură opțiune terapeutică, cum ar fi chimioterapie, radioterapie sau chirurgie, este în general prost. Rata de supravietuire la 5 ani pentru pacienții cu N2 clinic sau dovedit histologic care au fost tratați numai prin rezecție chirurgicală este redusă, variind de 9-16%, iar cei mai mulți pacienți decedează prin recidive locale și sistemice după rezecția primară [193, 194]. Din aceste motive, tratamentul pacienților cu N2 pozitiv rămâne controversat; deși cei mai multe chirurgi cred că există un rol important pentru chirurgie în tratamentul acestei boli, există o lipsă de consens în ceea ce privește extinderea rezecției, rolul downstagingului și regimurile optime de chimioterapie și / sau iradiere care trebuie asociate.

Istorie și rolul terapiei de inducție

Primele utilizări ale chimioterapiei neoadjuvante datează de la sfârșitul anilor 1980, când a fost limitată la cazuri de CPCNM local avansat (stadiul IIIA-N2-III B) și introduse în scopul de a îmbunătăți rata de supraviețuire redusă văzut observată în acest grup. O serie de studii prospectiv randomizate și evaluări retrospective au arătat rate de supraviețuire mai bune pentru pacienții care au primit chimioterapie neoadjuvantă comparativ cu intervenții chirurgicale ca monoterapie [7-18]. Pe baza acestor date, în septembrie 2001, Societatea Europeana de Oncologie Medicală (ESMO) a stabilit liniile directoare de tratament recunoscând chimioterapia neoadjuvantă ca tratament standard pentru stadiul III rezecabil în CPCNM [195]. O meta-analiza recenta a 13 studii randomizate controlate, încluzând 3224 pacienți, a confirmat oportunitatea acestor linii directoare, demonstrând un beneficiu de supraviețuire cu un HR de 0,84 (95% CI 0.77 – 0.92, p <0,0001) la pacienții tratați cu chimioterapie neoadjuvantă comparativ cu intervenția chirurgicală ca monoterapie [196].

După diagnosticarea cancerului pulmonar, parametrii clinicopatologici cum sunt profilul histologic al tumorii, stadializarea și localizarea metastazelor determina prognosticul bolii și alegerea tratamentului [197, 198]. Ghidurile de practică clinică actuale diferențiază cancerul pulmonar cu celule mici (CPCM) și cancerul pulmonar cu celule non-mici (CPCNM), precum și cele mai importante subtipuri de CPCNM: carcinom cu celule scuamoase și non-scuamoase, rezultate din analizele de histopatologie standard.

Analiza microarray a materialului tumoral rezecat permite realizarea unui profil molecular. Astfel, bazat pe profilele de transcriptie, adenocarcinoamele (AC) pulmonare au putut fi stratificate în subgrupuri moleculare care propun diverse caracteristici celulare și de prognostic [199-204]. În raport cu unele similitudini de transcripție ale unor carcinoame definite histologic (carcinom bronchioalveolar, carcinom cu celule scuamoase, și carcinom cu celule mari), diferite paternuri de expresia genică au fost asociate cu diferite subtipuri de adenocarcinom (respectiv bronchioid, squamoid, magnoid) [202]. Recent, o clasificare arhitecturala a adenocarcinoamelor pulmonare invazive a descris cinci modele predominante ce au fost dovedite ca fiind prognostice pentru supraviețuire independent de stadiu [205, 206]. Prezența de mai multe paternuri histologice diferite într-o singură tumoră împiedică evaluarea arhitecturii predominante. Mai mult, diferitele paternuri histopatologice ale adenocarcinomului nu corespund neapărat cu un subtip molecular.

Analizele de subtip similare au fost efectuate pentru carcinoamele pulmonare cu celule scuamoase (CCS) pentru estimarea prognosticului [207-209]. Clasificarea CCS în patru subtipuri de expresie genică diferite (primitiv, clasic, secretoriu și bazal) generate de analizele microarray au fost reproductibile prin analize microarray independente și prin secvențierea de ARN a aproximativ 600 de CCS [209, 210]. Subtipul primitiv a fost asociat cu prognosticul cel mai prost. Mai mult decât atât, diferitele paternuri de expresie genică ale diferitelor subtipuri moleculare au fost corelate cu starea de activare a proceselor biologice și celulare, și căile oncogene.

Mai multe studii pe baza de qPCR-și de microarray au identificat paternuri de miRNA specifice subtipurilor de cancer pulmonar. De exemplu, clasificarea histologica a AC și CCS a fost realizată cu un panel 34-miRNA pe blocuri de parafină la 205 fumători de sex masculin [211].

În studiul de fața a fost investigată expresia genică și căile de semnalizare a pacienților cu cancer pulmonar cu celule non-mici și invazia ganglionilor mesiastinali (stadiul IIIA, N2) în funcție de răspunsul histologic la tratamentul prin chimioterapie neoadjuvantă.

Nu s-au determinat gene corelate statistic semnificativ cu răspunsul la tratament. Nu s-a putut determina un semnal de răspuns la chimioterapie nici prin clusterizarea, nici prin analiza componentelor principale sau a expresiei genice.

În schimb, s-au determinat multe gene corelate cu statusul histologic al ganglionilor limfatici mediastinali precum și în raport cu sexul pacienților. Genele cele mai variabile ale pacienților responders sunt în legătura cu keratinizarea, iar cele ale pacientilor non-responders, în legătură cu stimularea hormonală și activitatea peptidazei. Patenul de expresie genică a pacienților de sex masculin se confundă cu răspunsul la chimioterapie în acest studiu.

Analiza căilor moleculare folosind analiza de impact și studiind modificări ale tuturor genelor a dus la unele rezultate convingătoare în legătura cu mecanismele de răspuns la chimioterapie.

Această analiză sugerează că diferența dintre responders si non-responders se găsește în reglarea mecanismelor imunitare. Toate căile care au fost semnificative pentru răspunsul la chimioterapie s-au suprapus peste cele care sunt, de asemenea, semnificative pentru diferența între bărbați și femei. Pe de alta parte, luând în considerare numai pacienții de sex masculin, au rămas semnificative trei căi de reglare a mecanismelor imunitare: poliartrita reumatoidă, tiroidita autoimună, și calea de semnalizare a Citokinelor.

Acumularea totală de perturbare în calea poliartritei reumatoide a fost, în esență, aceeași pentru responders si non-responders, și pentru pacienții de sex feminin comparativ cu cei de sex masculin. Acumularea totală de perturbare în calea tiroiditei autoimune a fost similară în ceea ce privește activitatea celulelor T, dar diferită între responders și non-responders în ceea ce privește răspunsul imun și inflamator, și apoptoza. Acumularea totala de perturbare pe calea de semnalizare a Citokinelor a fost inhibata în întregime la non-responders față de responders, dar a fost în întregime activată la femei comparativ cu bărbații.

Observațiile rezultate din analiză căilor moleculare sugerează că hormonii sexuali și răspunsul la chimioterapie ar putea fi interconectate. Semnificatia termenilor GO a sistemului hormonal printre genele cu varianta mare la non-responders susține această ipoteză. Având în vedere că acumularea totală de perturbare în poliartrita reumatoida este similară cu cea a răspunsului la chimioterapie, este interesant de observat că estrogenul și citokina CCL13 sunt implicate în severitatea poliartritei rheumatiode datorată deregulării apoptozei [212]. Nilsson [213] arată importanța estrogenilor (atât ERα și ERβ) în controlul evoluției inflamației, în special prin modificarea comportamentului leucocitelor, și prin down-regularea citokinelor și a adeziunii moleculare. Hohla și colab. [214] a constatat că sexul feminin este asociat cu un răspuns favorabil la chimioterapie în cancerul pancreatic. Rodriguez-Lara și colab. [215] a arătat că adenocarcinoamele pulmonare exprima în exces ERβ, precum și citokinele CXCL12 și CXCL4 față de țesutul pulmonar normal, și că aceasta supra-expresie este mai pronunțata la femeile aflate în premenopauza, care au un risc crescut, decât la femeile în postmenopauză sau la bărbați. Cercetarile lui Szymanowska-Narloch și colab. [216] arată utilitatea potențială a terapiei hormonale în CPCNM la pacienți selectați.

Factori de prognostic

Mai mulți factori au dovedit îmbunătățirea supraviețuirii fără boala și supraviețuirii globala la pacienții tratați cu chimioterapie neoadjuvantă, cum sunt: răspunsul clinic și histologic la chimioterapie, rezecția completă a tumorii și downstagingul mediastinal [194-196, 217]. Ca urmare, în anii ‘90 au fost efectuate studii de faza II incluzând pacienți cu CPCNM în stadiul IIIA-N2/IIIB utilizînd diferite regimuri de radiochimioterapie, cu scopul de a crește rata de downstaging mediastinal și astfel, creșterea procentului de rezecție chirurgicală completă [11, 13, 14]. În ciuda unui procent mai mare de downstaging obținut în aceste studii, cu o rată de rezecție chirurgicală completă ce se apropie de 93%, și o rată de răspuns complet la chimioterapie între 15 și 24%, a existat o ușoară creștere în morbiditatea și / sau mortalității perioperatorie, fără nici o creștere semnificativă a ratei de supraviețuire, comparativ cu studiile anterioare. Într-un studiu de faza III al Intergrupului 0139, 396 de pacienți cu CPCNM în stadiul IIIA-N2 au fost randomizați, fie pentru tratament prin radiochimioterapie neoadjuvantă urmată de rezecție chirurgicală și chimioterapie adjuvantă de consolidare, fie pentru a radiochimioterapie concomitentă definitivă. Rata mediană de supraviețuire globală în grupul neoadjuvant versus grupul radiochimioterapie singură nu diferă semnificativ (supraviețuire la 5 ani de 27 vs 20%, risc relativ 0,63; 95% CI 0.36-1.10). Cu toate acestea, o analiză de subgrup a relevat un avantaj statistic semnificativ al ratei de supraviețuire la 5 ani pentru pacienții care au fost tratați prin radiochimioterapie neoadjuvantă și lobectomie, comparativ cu cei care au fost tratați doar prin radiochimioterapie (36 și 18%, respectiv, p = 0,002), si a determinat un rol prognostic negativ în caz de pneumectomie [11]. Astfel, o re-evaluare corectă a pacienților după terapie neoadjuvantă, în mod special a statutului ganglionilor mediastinali, este de o importanță capitală. În experiența noastră, toți pacienții au avut o confirmare histologica a statusului ganglionilor limfatici înainte de începerea tratamentului de inducție, prin abordare chirurgicală (mediastinoscopie sau toracoscopie) și, prin urmare, reevaluarea nu a fost chirurgicala, ci prin examene radiologice (scanare CT toracic și / sau PET-CT). Îmbunătățirea metodelor bronhoscopice neinvazive pentru examinarea ganglionilor limfatici ar putea ajuta în viitor, pentru o mai bună evaluare a răspunsului patologic după tratamentul neoadjuvant, prin combinarea tehnicilor neinvazive înainte de tratament și biopsii chirurgicale invazive după tratament, evitându-se astfel re-mediastinoscopia . Spre deosebire de Liao și colab. [218], în studiul nostru am găsit nici o diferență între răspunsul la chimioterapia de inducție la pacienții cu carcinom de celule scuamoase față de pacienți cu adenocarcinom.

Screeningul și validarea biomarkerilor moleculari capabili de a prezice răspunsul la diferiți agenti-chimioterapeutici constituie un pas important spre un tratament personalizat pentru bolnavii de cancer. În domeniul biomarkerilor de prognostic, progresele în tehnicile de secvențiere și analiza microarray a genomului tumoral au permis identificarea de semnături moleculare și genice care pot determina o clasificare mai precisă și pronosticare a cancerului pulmonar [219-221]. A fost raportata o semnătură de cinci gene strâns asociată cu perioada libera de recidiva și cu supraviețuirea globala la pacienții cu CPCNM, precum și o semnătura de 54 de gene ce ar putea prezice riscul de recidiva în CPCNM [220]. Cu toate acestea, până în prezent, în domeniul biomarkerilor de predicție a chimiosensibilitătii, nu există încă nici o semnătura genică care ar putea fi utilizată pentru personalizarea chimioterapiei în cancerul pulmonar.

În studiul de față, am realizat prin secvențierea întregului exom tumoral al pacienților cu CPCNM în stadiul IIIA, și am izolat un grup de cinci gene asociate semnificativ pacienților care au un răspuns pozitiv la tratamentul chimioterapeutic neoadjuvant (RGP1, SLFN12L si GBA2) si pacienților care nu au răspuns la tratamentul chimioterapeutic neoadjuvant (SENP5 și NCBP2).

Direcții de viitor

Progrese continue în tehnologii experimentale și bioinformatică sunt în dezvoltare pentru explorarea genomului. Platformele de astăzi, care sunt, în esență, limitate la replicarea de secvențe de nucleotide ADN-ului, ar putea fi înlocuite cu sisteme capabile să capteze ADN-ul cu modificări epigenetice [222]. Sunt necesare instrumente analitice mai bune pentru a facilita detectarea sensibilă a mutațiilor cheie și a realiza cataloage complete de date de genom, ceea ce va putea facilita diseminarea acestor cunoștințe către comunitățile științifice și medicale [223]. Alte progrese tehnologice, cum ar fi secvențierea unei singure celule, sunt susceptibile de a ne ajuta să înțelegem complexitatea și heterogenitatea genomului tumoral [224].

Mai mult decât atât, o deplina înțelegere a relațiilor complexe dintre căile intracelulare de activare și mutațiile existente, împreună cu procesele de mutageneză care stau la bază, va putea ghida dezvoltarea de terapii cu țintă moleculară. Pe măsura ce secvențierea genomului devine disponibilă pe scară largă și interpretabilă cu mare precizie, la un cost redus, aceste informații vor fi din ce în ce mai utile pentru clinicieni și mai importante pentru pacienții lor.

CONCLUZII

În concluzie, analiza căilor moleculare sugerează că diferența dintre responders și non-responders se găsește în reglarea mecanismelor imunitare. Trei căi de reglare a mecanismelor imunitare au reieșit semnificativ: poliartrita reumatoidă, tiroidita autoimună, și calea de semnalizare a Citokinelor.

Căile de semnalizare identificate cu FDR (false discovery rate) < 0.005 includ: căile de semnalizare a citokinelor, adeziune focală sau interacția ECM-receptor.

Pe de alta parte, observațiile rezultate din analiza căilor moleculare sugerează că hormonii sexuali și răspunsul la chimioterapie ar putea fi de asemeni interconectați.

O mai bună înțelegere a relației dintre diversitatea histopatologică a tumorilor pulmonare, caracteristicile moleculare și evoluția bolii, va contribui la dezvoltarea patologiei moleculară și a biomarkerilor.

Cercetările pentru determinarea unor semnături specifice de expresie a genelor, mutații genice și alte modificări genomice, sunt promițătoare și vor permite identificarea de biomarkeri și de ținte terapeutice adresate diferitelor tipuri de arhitecturi tumorale.

Mutațiile RGP1 (rs1570248), SLFN12L (rs2304968 si rs9905892) și GBA2 (rs3833700) sunt identificate cu o frecvență mult mai mare la pacienții cu răspuns obiectiv la tratamentul de inducție.

Instituirea acestei semnături genice compuse din trei gene ca un nou model de estimarea a sensibilității la tratamentul prin chimioterapie neoadjuvantă, asociata semnificativ pacienților care au un răspuns pozitiv la tratamentul chimioterapeutic neoadjuvant pe baza de săruri de platină, constituie un nou pas către realizarea unui tratament individualizat la pacienții cu CPCNM. Rezultatele noastre sugerează ca un pacient cu CPCNM stadiu IIIA, care are un nivel ridicat al indicelui de semnătura a celor trei gene, ar fi un candidat ideal pentru a primi un tratament de inducție prin chimioterapie dublă, asociind cel puțin o sare de platină. Aceste constatări sunt preliminare și doar sugestive în acest moment, și această semnătură de trei gene trebuie să fie validată înainte de a fi utilizată în practica clinică de rutină. Este necesară realizarea unui studiu clinic în scopul de a valida rolul unui tratament personalizat pe baza acestei semnături de trei gene.

Secvențierea exomului cancerului pulmonar a permis înțelegerea multor mecanisme ale oncogenezei.

Mai mulți factori influențează aceste experimente, inclusiv pierderea de putere în a detecta mutațiile somatice specific tumorale în prezența contaminarii stromale și o capacitate limitată de a detecta mutații la un subset de secvențe de codificare. Scăderea costurilor legate de secvențiere a permis lansarea recentă a proiectelor de secvențiere a întregului exom și a întregului genom al cancerului pulomnar, care permite o analiză a mutațiilor într-o maniera complet imparțială. Mai mult decât atât, colectarea datelor rezultate prin metodele de secvențiere next-generation, este "digitală", realizată pentru fiecare moleculă, astfel încât capacitatea de a detecta alelele de slabă abundența, fie din cauza contaminării stromale sau datorita heterogenității tumorii, depinde doar de capacitatea de acoperire. Generarea datelor de secvențiere a întregului exom și a întregului genom de la un număr tot mai mare de probe, se va putea realiza o imagine mai globală a mutațiilor somatice în cancerul pulmonar, oferind o imagine de ansamblu a genomului cancerului pulmonar și o orientare adecvata a obiectivelor terapeutice.

Acest studiu ne-a permis să punem în evidență noi semnături de mutații genetice predictive de supraviețuire și de răspuns la diferitele tratamente antitumorale la pacienții bolnavi de cancer pulmonar cu celule non mici și invazia ganglionilor mediastinali. Printr-o abordare originală în care am prelevat țesut ganglionar mediastinal invadat tumoral înainte de orice tratament antitumoral, s-a putut determina un lot de gene ale căror mutații apar a fi asociate fie cu un prognostic prost pentru unele fie cu un prognostic bun pentru celelalte. Pacienții prelevați au fost urmăriți și reevaluați clinic. Profilul de expresie ARN observat prezenta o mare heterogenitate (1127 gene cu expresie modificată în țesutul tumoral comparativ cu țesutul normal – p-value ≤ 0.05), însa analiza prin secvențiere a exomului a permis determinarea unui număr restrâns de modificări punctuale SNP asociate cu diferențele de sensibilitate la tratamentele chimioterapice convenționale.

Cu toate acestea, limita acestei lucrări este numărul mic de pacienți analizați. Acest fapt îl explicam prin diminuarea considerabilă a indicației de prelevare a ganglionilor mediastinali prin mediastinoscopie datorită apariției explorării mediastinale prin tehnici mult mai puțin invazive, sub control ecografic (Endo Bronchial UltraSound – EBUS) chiar în timpul desfășurării perioadei de includere a pacienților. Datorită răspândirii și adopției extrem de rapide a acestei tehnologii, impactul ei asupra proiectului nu a putut fi integrat, proiectul având o perioada de desfășurare pre-determinată, iar continuarea realizării sistematice a mediastinoscopiei, metoda mai agresivă, ar fi necesitat aprobări suplimentare.

Cu toate aceste, datorită interesului clinic major pe care o astfel de semnătură genetică îl poate reprezenta, credem că această lucrare poate fi continuată prin includerea unui număr mare de pacienți cu CPCNM și invazia ganglionilor mediastinali, la care să se determine statusul mutațional în genele determinate prin GPN2, cu scopul de a valida aceste rezultate.

Validarea unei “semnături genice de chimiosensibilitate” ar putea ajuta în luarea deciziei terapeutice și alegerea tipului de chimioterapie.

O alta direcție de cercetare ar putea fi determinarea unor markeri biologici sanguini sau urinari prin determinarea proteinelor codate de aceste gene și analiza existentei acestor proteine în plasma sau urina pacienților.

În sfârșit, genele implicate în această semnătura, sau căile de semnalizare în care participă, ar putea reprezenta noi ținte terapeutice în tratamentul cancerului pulmonar.

BIBLIOGRAFIE

1. Jemal A, Siegel R, Xu J, Ward E. Cancer statistics, 2010. CA Cancer J Clin. 2010;60:277-300.

2. Travis WD, Travis LB, Devesa SS. Lung cancer. Cancer. 1995;75:191-202. A multicenter phase II study of ganetespib monotherapy in patients with genotypically defined advanced non-small cell lung cancer. Clin Cancer Res. 2013 Jun 1;19(11):3068-77.

3. Sharma SV, Settleman J. Exploiting the balance between life and death: targeted cancer therapy ADN “oncogenic shock.”. Biochem Pharmacol. 2010;80:666-73.

4. Weinstein IB. Cancer. Addiction to onco-genes: the Achilles heal of cancer. Science. 2002;297:63-4.

5. Ding L, Getz G, Wheeler DA, et al. Somatic mutations affect key pathways in lung adeno- carcinoma. Nature. 2008; 455:1069-75.

6. Ruckdeschel JC. Combined modality therapy of non-small cell lung cancer. Semin Oncol 1997;24:429–39.

7. Stinchcombe TE, Fried D, Morris DE, Socinski MA. Combined modality therapy for stage III non-small cell lung cancer. Oncologist 2006;11:809–23.

8. Albain KS, Swann RS, Rusch VW, Turrisi AT III, Shepherd FA, Smith C et al. Radiotherapy plus chemotherapy with or without surgical resection for stage III non-small-cell lung cancer: a phase III rADNomised controlled trial. Lancet 2009;374:379–86.

9. Sause W, Kolesar P, Taylor S IV, Johnson D, Livingston R, Komaki R et al. Final results of phase III trial in regionally advanced unresectable non- small cell lung cancer: Radiation Therapy Oncology Group, Eastern Cooperative Oncology Group, and Southwest Oncology Group. Chest 2000;117:358–64.

10. Roth JA, Fossella F, Komaki R, Ryan MB, Putnam JB Jr, Lee JS et al. A randomized trial comparing perioperative chemotherapy and surgery with surgery alone in resectable stage IIIA non-small-cell lung cancer. J Natl Cancer Inst 1994;86:673–80.

11. Albain KS, Rusch VW, Crowley JJ, Rice TW, Turrisi AT III, Weick JK et al. Concurrent cisplatin/etoposide plus chest radiotherapy followed by surgery for stages IIIA (N2) and IIIB non small cell lung cancer: mature results of Southwest Oncology Group Phase II Study 8805. J Clin Oncol 1995;13:1880–92.

12. Rosell R, Gómez-Codina J, Camps C, Maestre J, Padille J, Cantó A et al. A randomized trial comparing preoperative chemotherapy plus surgery versus surgery alone in patients with non-small-cell lung cancer. N Engl J Med 1994;330:153–8.

13. Strauss GM, Langer MP, Elias AD, Skarin AT, Sugarbaker DJ. Multimodality treatment of stage IIIA non-small-cell lung carcinoma: a critical review of the literature and strategies for future research. J Clin Oncol 1992;10: 829–38.

14. Albain KS. Induction chemotherapy with/without radiation followed by surgery in stage III non-small-cell lung cancer. Oncology 1997;11:51–7.

15. Rosell R, Gómez-Codina J, Camps C, Javier Sánchez J, Maestre J, Padilla J et al. Preresectional chemotherapy in stage IIIA non-small-cell lung cancer: a 7-year assessment of a randomized controlled trial. Lung Cancer 1999;26:7–14.

16. Martini N, Kris MG, Flehinger BJ, Gralla RJ, Bains MS, Burt ME et al. Preoperative chemotherapy for stage IIIa (N2) lung cancer: the Sloan-Kettering experience with 136 patients. Ann Thorac Surg 1993;55: 1365–73.

17. Goldberg M, Burkes RL. Induction chemotherapy for stage IIIA unresect- able non-small cell lung cancer: the Toronto experience ADN an overview. Semin Surg Oncol 1993;9:108–13.

18. Stefani A, Alifano M, Bobbio A, Grigoroiu M, Jouni R, Magdeleinat P, Regnard JF. Which patients should be operated on after induction chemotherapy for N2 non-small cell lung cancer? Analysis of a 7-year experience in 175 patients. J Thorac Cardiovasc Surg. 2010 Aug;140(2):356-63.

19. Miller AB, Hoogstraten B, Staquet M, Winkler A. Reporting results of cancer treatment. Cancer 1981; 47: 207–14.

20. Quoix E, Lemarié E. Épidémiologie du cancer bronchique primitif : aspects classiques et nouveautés. Rev Mal Respir. 2011 Oct;28(8): 1048-1058.

21. Grivaux M, Duvert B, Ferrer-Lopez P, Hominal S, Goarant E, Brichet-Martin A, Romand P, Fournier E, Asselain B, Debieuvre D. One-year survival improvement in lung cancer in France. Results of the prospective real life studies KBP-2000-CPHG and KBP-2010-CPHG. Rev Pneumol Clin. 2016 May;72(3):163-70.

22. Locher C, Debieuvre D, Coëtmeur D, Goupil F, Molinier O, Collon T, Dayen C, Le Treut J, Asselain B, Martin F, Blanchon F, Grivaux M. Major changes in lung cancer over the last ten years in France: the KBP-CPHG studies. Lung Cancer. 2013 Jul;81(1):32-8.

23. Debieuvre D, Locher C, Neidhardt AC, Goupil F, Lemaire B, Blanchet-Legens AS, Renault D, Tavernier JY, Tagu P, Mahmoud H, Figueredo M, Grivaux M. Ten-year evolution in non-small-cell lung cancer according to sex. Results of the KBP-2010-CPHG study by the College of General Hospital Respiratory Physicians. Rev Mal Respir. 2014 Nov;31(9):805-16.

24. Morandi U, Casali C et Rossi G. Bronchial typical carcinoid tumors. Seminars in Thoracic and Cardiovascular Surgery 2006;18(3):191–198.

25. B Etienne-Mastroianni, L. Falchero, L. Chalabreysse et al. Primary sarcomas of the lung: a clinicopathologic study of 12 cases. Lung Cancer 2002 Dec; 38(3):283–289.

26. Bell et I. Gore, R.A. Okimoto et al. Inherited susceptibility to lung cancer may be associated with the T790M drug resistance mutation in EGFR. Nat. Genet. 2005;37:1315-1316.

27. Amos CI, Wu X, Broderick P et al. Genome-wide association scan of tag SNPs identifies a susceptibility locus for lung cancer at 15q25.1. Nat. Genet 2008;40: 616-622.

28. Yu D, Zhang X, Liu J et al. Characterization of functional excision repair cross-complementation group 1 variants ADN their association with lung cancer risk and prognosis. Clin. Cancer Res. 2008; 14: 2878-2886.

29. Engels EA, Wu X, Gu J et al. Systematic evaluation of genetic variants in the inflammation pathway and risk of lung cancer. Cancer Research, American Association for Cancer Research 2007 Jul; 67(13): 6520–6527.

30. Wenzlaff AS, Cote ML, Bock CH et al. CYP1A1 and CYP1B1 polymorphisms and risk of lung cancer among never smokers : a population-based study. Carcinogenesis, Oxford University Press 2005 Dec; 26(12): 2207–2212.

31. Yin J, Vogel U, Ma Y et al. The DNA repair gene XRCC1 and genetic susceptibility of lung cancer in a northeastern Chinese population. Lung Cancer 2007 May; 56(2): 153–160.

32. Tomoda K, Ohkoshi T, Hirota K, et al. Preparation and properties of inhalable nanocomposite particles for treatment of lung cancer. Colloids Surf. B : Biointerfaces 2009 Fev;71: 177

33. Fong KM, Sekido Y, Gazdar AF, Minna JD. Lung cancer. 9: Molecular biology of lung cancer : clinical implications. Thorax, BMJ Publishing Group Ltd. 2003 Oct; 58(10):892–900.

34. Salgia R, Skarin AT. Molecular abnormalities in lung cancer. Journal of Clinical Oncology 1998 Mar;16(3):1207–1217.

35. Herbst RS, Heymach JV, Lippman SM. Molecular origins of cancer : lung cancer. N. Engl. J. Med. 2008 Sept; 359(13):‎ 1367–1380.

36. Aviel-Ronen S, Blackhall FH, Shepherd FA, Tsao MS. K-ras mutations in non-small-cell lung carcinoma: a review. Clinical Lung Cancer, Cancer Information Group 2006 Jul; 8(1):‎30–38.

37. Gandhi J, Zhang J, Xie Y, et al. Alterations in genes of the EGFR signaling pathway ADN their relationship to EGFR tyrosine kinase inhibitor sensitivity in lung cancer cell lines. PLoS ONE. 2009;4:e4576.

38. Sun Y, Ren Y, Fang Z, et al. Lung adenocarcinoma from East Asian never-smokers is a disease largely defined by targetable oncogenic mutant kinases. J Clin Oncol. 2010;28:4616-20.

39. Schubbert S, Shannon K, Bollag G. Hyperactive Ras in developmental disorders and cancer. Nat Rev Cancer. 2007 Apr;7(4):295-308. Review. Erratum in: Nat Rev Cancer. 2007 Jul;7(7):563.

40. Brose MS, Volpe P, Feldman M, et al. BRAF and RAS mutations in human lung cancer and melanoma. Cancer Res. 2002 Dec 1;62(23):6997-7000.

41. Riely GJ, Kris MG, Rosenbaum D, et al. Frequency and distinctive spectrum of KRAS mutations in never smokers with lung adenocarcinoma. Clin Cancer Res. 2008 Sep 15;14(18):5731-4.

42. Dogan S, Shen R, Ang DC, et al. Molecular epidemiology of EGFR and KRAS mutations in 3,026 lung adenocarcinomas: higher susceptibility of women to smoking-related KRAS-mutant cancers. Clin Cancer Res. 2012 Nov 15;18(22):6169-77.

43. Shepherd FA, Domerg C, Hainaut P, et al. Pooled analysis of the prognostic ADN predictive effects of KRAS mutation status and KRAS mutation subtype in early-stage resected non-small-cell lung cancer in four trials of adjuvant chemotherapy. J Clin Oncol. 2013 Jun 10;31(17):2173-81.

44. Riely GJ, Marks J, Pao W. KRAS mutations in non-small cell lung cancer. Proc Am Thorac Soc. 2009 Apr 15;6(2):201-5.

45. Socinski MA, Goldman J, El-Hariry I, et al. A multicenter phase II study of ganetespib monotherapy in patients with genotypically defined advanced non-small cell lung cancer. Clin Cancer Res. 2013 Jun 1;19(11):3068-77.

46. Jänne PA, Shaw AT, Pereira JR, et al. Selumetinib plus docetaxel for KRAS-mutant advanced non-small-cell lung cancer: a randomised, multicentre, placebo-controlled, phase 2 study. Lancet Oncol. 2013 Jan; 14(1):38-47.

47. Lynch TJ, Bell DW, Sordella R, et al. Activating mutations in the epidermal growth factor receptor underlying responsiveness of non-small-cell lung cancer to gefitinib. N Engl J Med. 2004 May 20;350(21):2129-39. Epub 2004 Apr 29.

48. Paez JG, Jänne PA, Lee JC, et al. EGFR mutations in lung cancer: correlation with clinical response to gefitinib therapy. Science. 2004 Jun 4;304(5676):1497-500. Epub 2004 Apr 29.

49. Pao W, Miller V, Zakowski M, et al. EGF receptor gene mutations are common in lung cancers from "never smokers" ADN are associated with sensitivity of tumors to gefitinib ADN erlotinib. Proc Natl Acad Sci U S A. 2004 Sep 7;101(36):13306-11. Epub 2004 Aug 25.

50. Ladanyi M, Pao W. Lung adenocarcinoma: guiding EGFR-targeted therapy and beyond. Mod Pathol. 2008 May;21 Suppl 2:S16-22.

51. Sordella R, Bell DW, Haber DA, Settleman J. Gefitinib-sensitizing EGFR mutations in lung cancer activate anti-apoptotic pathways. Science. 2004 Aug 20;305(5687):1163-7. Epub 2004 Jul 29.

52. Cadranel J, Ruppert AM, Beau-Faller M, Wislez M. Therapeutic strategy for advanced EGFR mutant non-small-cell lung carcinoma. Crit Rev Oncol Hematol. 2013 Dec;88(3):477-93.

53. Chen Y, Takita J, Choi YL, et al. Oncogenic mutations of ALK kinase in neuroblastoma. Nature. 2008 Oct 16;455(7215):971-4.

54. George RE, SADNa T, Hanna M, et al. Look AT Activating mutations in ALK provide a therapeutic target in neuroblastoma. Nature. 2008 Oct 16; 455(7215):975-8..

55. Janoueix-Lerosey I, Lequin D, Brugières L, et al. Somatic ADN germline activating mutations of the ALK kinase receptor in neuroblastoma. Nature. 2008 Oct 16; 455(7215):967-70.

56. Mossé YP, Laudenslager M, Longo L, et al. Identification of ALK as a major familial neuroblastoma predisposition gene. Nature. 2008 Oct 16;455(7215):930-5.

57. Morris SW, Kirstein MN, Valentine MB, et al. Fusion of a kinase gene, ALK, to a nucleolar protein gene, NPM, in non-Hodgkin's lymphoma. Science. 1994 Mar 4;263(5151):1281-4.

58. Lawrence B, Perez-Atayde A, Hibbard MK, et al. TPM3-ALK ADN TPM4-ALK oncogenes in inflammatory myofibroblastic tumors. Am J Pathol. 2000 Aug;157(2):377-84.

59. Choi YL, Takeuchi K, Soda M, et al. Identification of novel isoforms of the EML4-ALK transforming gene in non-small cell lung cancer. Cancer Res. 2008 Jul 1;68(13):4971-6.

60. Koivunen JP, Mermel C, Zejnullahu K, et al. EML4-ALK fusion gene and efficacy of an ALK kinase inhibitor in lung cancer. Clin Cancer Res. 2008 Jul 1; 14(13): 4275-83.

61. Rikova K, Guo A, Zeng Q, et al. Global survey of phosphotyrosine signaling identifies oncogenic kinases in lung cancer. Cell. 2007 Dec 14;131(6):1190-203.

62. Soda M, Choi YL, Enomoto M, et al. Identification of the transforming EML4-ALK fusion gene in non-small-cell lung cancer. Nature. 2007 Aug 2;448(7153):561-6.

63. Takeuchi K, Choi YL, Togashi Y, et al. KIF5B-ALK, a novel fusion oncokinase identified by an immunohistochemistry-based diagnostic system for ALK-positive lung cancer. Clin Cancer Res. 2009 May 1;15(9):3143-9.

64. Mossé YP, Wood A, Maris JM. Inhibition of ALK signaling for cancer therapy. Clin Cancer Res. 2009 Sep 15;15(18):5609-14.

65. Kwak EL, Bang YJ, Camidge DR, et al. Anaplastic lymphoma kinase inhibition in non-small-cell lung cancer. N Engl J Med. 2010 Oct 28; 363(18):1693-703.

66. Shinmura K, Kageyama S, Tao H, et al. EML4-ALK fusion transcripts, but no NPM-, TPM3-, CLTC-, ATIC-, or TFG-ALK fusion transcripts, in non-small cell lung carcinomas. Lung Cancer. 2008 Aug;61(2):163-9.

67. Takeuchi K, Choi YL, Soda M, et al. Multiplex reverse transcription-PCR screening for EML4-ALK fusion transcripts. Clin Cancer Res. 2008 Oct 15;14(20):6618-24..

68. Wong DW, Leung EL, So KK, et al. University of Hong Kong Lung Cancer Study Group. The EML4-ALK fusion gene is involved in various histologic types of lung cancers from nonsmokers with wild-type EGFR ADN KRAS. Cancer.2009 Apr 15;115(8):1723-33.

69. Inamura K, Takeuchi K, Togashi Y, et al. EML4-ALK lung cancers are characterized by rare other mutations, a TTF-1 cell lineage, an acinar histology, and young onset. Mod Pathol. 2009 Apr;22(4):508-15.

70. Shaw AT, Yeap BY, Mino-Kenudson M, et al. Clinical features and outcome of patients with non-small-cell lung cancer who harbor EML4-ALK. J Clin Oncol. 2009 Sep 10;27(26):4247-53.

71. Horn L, Pao W. EML4-ALK: honing in on a new target in non-small-cell lung cancer. J Clin Oncol. 2009 Sep 10; 27(26): 4232-5.

72. Wang R, Pan Y, Li C, et al. The use of quantitative real-time reverse transcriptase PCR for 5' and 3' portions of ALK transcripts to detect ALK rearrangements in lung cancers. Clin Cancer Res. 2012 Sep 1;18(17):4725-32.

73. Pailler E, Adam J, Barthélémy A, et al. Detection of circulating tumor cells harboring a unique ALK rearrangement in ALK-positive non-small-cell lung cancer. J Clin Oncol. 2013 Jun 20;31(18):2273-81.

74. To KF, Tong JH, Yeung KS, et al. Detection of ALK rearrangement by immunohistochemistry in lung adenocarcinoma and the identification of a novel EML4-ALK variant. J Thorac Oncol. 2013 Jul;8(7):883-91.

75. Gainor JF, Varghese AM, Ou SH, et al. ALK rearrangements are mutually exclusive with mutations in EGFR or KRAS: an analysis of 1,683 patients with non-small cell lung cancer. Clin Cancer Res. 2013 Aug 1;19(15):4273-81.

76. BolADN JM, Jang JS, Li J, et al. MET and EGFR mutations identified in ALK-rearranged pulmonaradenocarcinoma: molecular analysis of 25 ALK-positive cases. J Thorac Oncol. 2013 May;8(5):574-81.

77. Bang YJ. Treatment of ALK-positive non-small cell lung cancer. Arch Pathol Lab Med. 2012 Oct;136(10):1201-4.

78. Camidge DR, Bang YJ, Kwak EL, et al. Activity and safety of crizotinib in patients with ALK-positive non-small-cell lung cancer: updated results from a phase 1 study. Lancet Oncol. 2012 Oct;13(10):1011-9.

79. Shaw AT, Dong-Wan Kim, M.D., Ph.D., et al. Crizotinib versus Chemotherapy in Advanced ALK-Positive Lung Cancer. N Engl J Med 2013; 368:2385-2394June 20, 2013.

80. Seto T, Kiura K, Nishio M, et al. CH5424802 (RO5424802) for patients with ALK-rearranged advanced non-small-cell lung cancer (AF-001JP study): a single-arm, open-label, phase 1-2 study. Lancet Oncol. 2013 Jun;14(7):590-8.

81. Camidge DR, Kono SA, Lu X, et al. Anaplastic lymphoma kinase gene rearrangements in non-small cell lung cancer are associated with prolonged progression-free survival on pemetrexed. J Thorac Oncol. 2011 Apr;6(4):774-80.

82. Shaw AT, Varghese AM, Solomon BJ, et al. Pemetrexed-based chemotherapy in patients with advanced, ALK-positive non-small cell lung cancer. Ann Oncol. 2013 Jan;24(1):59-66.

83. Sequist LV, Gettinger S, Senzer NN, et al. Activity of IPI-504, a novel heat-shock protein 90 inhibitor, in patients with molecularly defined non-small-cell lung cancer. J Clin Oncol. 2010 Nov 20;28(33):4953-60.

84. Solomon B, Wilner KD, Shaw AT. Current status of targeted therapy for anaplastic lymphoma kinase-rearranged non-small cell lung cancer. Clin Pharmacol Ther. 2014 Jan;95(1):15-23.

85. Shigematsu H, Takahashi T, Nomura M, et al. Somatic mutations of the HER2 kinase domain in lung adenocarcinomas. Cancer Res. 2005 Mar 1;65(5):1642-6.

86. Stephens P, Hunter C, Bignell G, et al. Lung cancer: intragenic ERBB2 kinase mutations in tumours. Nature. 2004 Sep 30;431(7008):525-6.

87. Hynes NE, Lane HA. ERBB receptors and cancer: the complexity of targeted inhibitors. Nat Rev Cancer. 2005;5:341-54.

88. Li D, Ambrogio L, Shimamura T, et al. BIBW2992, an irreversible EGFR/HER2 inhib- itor highly effective in preclinical lung cancer models. Oncogene. 2008;27:4702-11.

89. Minami Y, Shimamura T, Shah K, et al. The major lung cancer-derived mutants of ERBB2 are oncogenic and are associated with sensitiv- ity to the irreversible EGFR/ERBB2 inhibitor HKI-272. Oncogene. 2007;26:5023-7.

90. Shimamura T, Ji H, Minami Y, et al. Non-small- cell lung cancer and Ba/F3 transformed cells harboring the ERBB2 G776insV_G/C mutation are sensitive to the dual-specific epidermal growth factor receptor ADN ERBB2 inhibitor HKI-272. Cancer Res. 2006;66:6487-91.

91. Wang SE, Narasanna A, Perez-Torres M, et al. HER2 kinase domain mutation results in consti- tutive phosphorylation and activation of HER2 and EGFR and resistance to EGFR tyrosine kinase inhibitors. Cancer Cell. 2006;10:25-38.

92. Baselga J, Swain SM. Novel anticancer targets: revisiting ERBB2 and discovering ERBB3. Nat Rev Cancer. 2009;9:463-75.

93. Perera SA, Li D, Shimamura T, et al. HER2YVMA drives rapid development of adenosquamous lung tumors in mice that are sensitive to BIBW2992 and rapamycin combination therapy. Proc Natl Acad Sci U S A. 2009;106:474-9.

94. Lee JC, Vivanco I, Beroukhim R, et al. Epidermal growth factor receptor activation in glioblastoma through novel missense mutations in the extracellular domain. PLoS Med. 2006;3:e485.

95. Network CGAR. Comprehensive genomic characterization defines human glioblastoma genes and core pathways. Nature. 2008;455:1061-8.

96. Davies H, Bignell GR, Cox C, et al. Mutations of the BRAF gene in human cancer. Nature. 2002 Jun 27;417(6892):949-54.

97. Pratilas CA, Hanrahan AJ, Halilovic E, et al. Genetic predictors of MEK dependence in non-small cell lung cancer. Cancer Res. 2008 Nov 15;68(22):9375-83.

98. Paik PK, Arcila ME, Fara M, et al. Clinical characteristics of patients with lung adenocarcinomas harboring BRAF mutations. J Clin Oncol. 2011 May 20;29(15):2046-51.

99. Marchetti A, Felicioni L, Malatesta S, et al. Clinical features and outcome of patients with non-small-cell lung cancer harboring BRAF mutations. J Clin Oncol. 2011 Sep 10;29(26):3574-9.

100. Sasaki H, Shitara M, Yokota K, et al. and Exp Ther Med. 2012 May;3(5):771-775. Epub 2012 Mar 1.

101. Cardarella S, Ogino A, Nishino M, et al. Clinical, pathologic, and biologic features associated with BRAF mutations in non-small cell lung cancer. Clin Cancer Res. 2013 Aug 15;19(16):4532-40.

102. Jørgensen JT. Targeted HER2 treatment in advanced gastric cancer. Oncology. 2010; 78(1): 26-33.

103. Graus-Porta D, Beerli RR, Daly JM, Hynes NE. ERBB-2, the preferred heterodimerization partner of all ERBB receptors is a mediator of lateral signaling. EMBO J. 1997 Apr 1; 16(7): 1647-55.

104. Buttitta F, Barassi F, Fresu G, et al. Mutational analysis of the HER2 gene in lung tumors from Caucasian patients: mutations are mainly prezentin adenocarcinomas with bronchioloalveolar features. Int J Cancer. 2006 Dec 1;119(11):2586-91.

105. Arcila ME, Chaft JE, Nafa K, et al. Prevalence, clinicopathologic associations, and molecular spectrum of ERBB2 (HER2) tyrosine kinase mutations in lung adenocarcinomas. Clin Cancer Res. 2012 Sep 15;18(18):4910-8.

106. Birchmeier C, Sharma S, Wigler M. Expression and rearrangement of the ROS1 gene in human glioblastoma cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 1987 Dec;84(24):9270-4.

107. Birchmeier C, O'Neill K, Riggs M, Wigler M. Characterization of ROS1 cDNA from a human glioblastoma cell line. Proc Natl Acad Sci U S A. 1990 Jun;87(12):4799-803.

108. Charest A, Lane K, McMahon K, et al. Fusion of FIG to the receptor tyrosine kinase ROS in a glioblastoma with an interstitial del (6)(q21q21). Genes Chromosomes Cancer. 2003 May;37(1):58-71.

109. McDermott U, Iafrate AJ, Gray NS, et al. Genomic alterations of anaplastic lymphoma kinase may sensitize tumors to anaplastic lymphoma kinase inhibitors. Cancer Res. 2008 May 1;68(9):3389-95.

110. Bergethon K, Shaw AT, Ou SH, et al. ROS1 rearrangements define a unique molecular class of lung cancers. J Clin Oncol. 2012 Mar 10;30(8):863-70.

111. Yoshida A, Kohno T, Tsuta K, et al. ROS1-rearranged lung cancer: a clinicopathologic and molecular study of 15 surgical cases. Am J Surg Pathol. 2013 Apr;37(4):554-62.

112. Go H, Kim DW, Kim D, et al. Clinicopathologic analysis of ROS1-rearranged non-small-cell lung cancer and proposal of a diagnostic algorithm. J Thorac Oncol. 2013 Nov;8(11): 1445-50.

113. Davies KD, Le AT, Theodoro MF, et al. Identifying and targeting ROS1 gene fusions in non-small cell lung cancer. Clin Cancer Res. 2012 Sep 1;18(17):4570-9.

114. Hammerman PS, Sos ML, Ramos AH, et al. Mutations in the DDR2 Kinase Gene Identify a Novel Therapeutic Target in Squamous Cell. Lung Cancer Cancer Discovery June 2011 1; 78

115. Ichikawa O, Osawa M, Nishida N, et al. Structural basis of the collagen-binding mode of discoidin domain receptor 2. EMBO J. 2007 Sep 19; 26(18): 4168-76. Epub 2007 Aug 16.

116. Turner N, Grose R. Fibroblast growth factor signalling: from development to cancer. Nat Rev Cancer. 2010 Feb;10(2):116-29.

117. Freier K, Schwaenen C, Sticht C, et al. Recurrent FGFR1 amplification and high FGFR1 protein expression in oral squamous cell carcinoma (OSCC). Oral Oncol. 2007 Jan;43(1):60-6. Epub 2006 Jun 27.

118. Ishizuka T, Tanabe C, Sakamoto H, et al. Gene amplification profiling of esophageal squamous cell carcinomas by DNA array CGH. Biochem Biophys Res Commun. 2002 Aug 9; 296(1):152-5.

119. Gorringe KL, Jacobs S, Thompson ER, et al. High-resolution single nucleotide polymorphism array analysis of epithelial ovarian cancer reveals numerous microdeletions and amplifications. Clin Cancer Res. 2007 Aug 15; 13(16):4731-9.

120. Simon R, Richter J, Wagner U, et al. High-throughput tissue microarray analysis of 3p25 (RAF1) and 8p12 (FGFR1) copy number alterations in urinary bladder cancer. Cancer Res. 2001 Jun 1;61(11):4514-9.

121. Edwards J, Krishna NS, Witton CJ, Bartlett JM. Gene amplifications associated with the development of hormone-resistant prostate cancer. Clin Cancer Res. 2003 Nov 1;9(14):5271-81.

122. Dutt A, Ramos AH, Hammerman PS, et al. Inhibitor-sensitive FGFR1 amplification in human non-small cell lung cancer. PLoS One. 2011;6(6):e20351.

123. Weir BA, Woo MS, Getz G, et al. Characterizing the cancer genome in lung adenocarcinoma. Nature. 2007 Dec 6;450(7171):893-8. Epub 2007 Nov 4.

124. Weiss J, Sos ML, Seidel D, et al. Frequent and focal FGFR1 amplification associates with therapeutically tractable FGFR1 dependency in squamous cell lung cancer. Sci Transl Med. 2010 Dec 15;2(62):62ra93.

125. Kim HR, Kim DJ, Kang DR, et al. Fibroblast growth factor receptor 1 gene amplification is associated with poor survival and cigarette smoking dosage in patients with resected squamous cell lung cancer. J Clin Oncol. 2013 Feb 20; 31(6):731-7.

126. Turner NC, Seckl MJ. A therapeutic target for smoking-associated lung cancer. Sci Transl Med. 2010 Dec 15;2(62):62ps56.

127. Cooper CS, Park M, Blair DG, et al. Molecular cloning of a new transforming gene from a chemically transformed human cell line. Nature. 1984 Sep 6-11;311(5981):29-33.

128. Birchmeier C, Birchmeier W, Gherardi E, Vande Woude GF. Met, metastasis, motility and more. Nat Rev Mol Cell Biol. 2003 Dec;4(12):915-25.

129. Peruzzi B, Bottaro DP. Targeting the c-Met signaling pathway in cancer. Clin Cancer Res. 2006 Jun 15;12(12):3657-60.

130. Schmidt L, Duh FM, Chen F, et al. Germline and somatic mutations in the tyrosine kinase domain of the MET proto-oncogene in papillary renal carcinomas. Nat Genet. 1997 May;16(1):68-73.

131. Di Renzo MF, Olivero M, Martone T, et al. Somatic mutations of the MET oncogene are selected during metastatic spread of human HNSC carcinomas. Oncogene. 2000 Mar 16;19(12):1547-55.

132. Park WS, Dong SM, Kim SY, et al. Somatic mutations in the kinase domain of the Met/hepatocyte growth factor receptor gene in childhood hepatocellular carcinomas. Cancer Res. 1999 Jan 15;59(2):307-10.

133. Kong-Beltran M, Seshagiri S, Zha J, Zhu W, Bhawe K, Mendoza N, Holcomb T, Pujara K, Stinson J, Fu L, Severin C, Rangell L, Schwall R, Amler L, Wickramasinghe D, Yauch R. Somatic mutations lead to an oncogenic deletion of met in lung cancer. Cancer Res. 2006 Jan 1; 66(1):283-9.

134. Ma PC, Kijima T, Maulik G, et al. c-MET mutational analysis in small cell lung cancer: novel juxtamembrane domain mutations regulating cytoskeletal functions. Cancer Res. 2003 Oct 1;63(19):6272-81.

135. Nakajima M, Sawada H, Yamada Y, et al. The prognostic significance of amplification ADN overexpression of c-met ADN c-erb B-2 in human gastric carcinomas. Cancer. 1999 May 1;85(9):1894-902.

136. Miller CT, Lin L, Casper AM, et al. Genomic amplification of MET with boundaries within fragile site FRA7G and upregulation of MET pathways in esophageal adenocarcinoma. Oncogene. 2006 Jan 19;25(3):409-18.

137. Umeki K, Shiota G, Kawasaki H. Clinical significance of c-met oncogene alterations in human colorectal cancer. Oncology. 1999;56(4):314-21.

138. Beroukhim R, Getz G, Nghiemphu L, et al. Assessing the significance of chromosomal aberrations in cancer: methodology and application to glioma. Proc Natl Acad Sci U S A. 2007 Dec 11;104(50):20007-12. Epub 2007 Dec 6.

139. Yamamoto S, Tsuda H, Miyai K, et al. Gene amplification and protein overexpression of MET are common events in ovarian clear-cell adenocarcinoma: their roles in tumor progression ADN prognostication of the patient. Mod Pathol. 2011 Aug;24(8):1146-55.

140. Bean J, Brennan C, Shih JY, et al. MET amplification occurs with or without T790M mutations in EGFR mutant lung tumors with acquired resistance to gefitinib or erlotinib. Proc Natl Acad Sci U S A. 2007 Dec 26;104(52):20932-7. Epub 2007 Dec 18.

141. Cappuzzo F, Jänne PA, Skokan M, et al. MET increased gene copy number and primary resistance to gefitinib therapy in non-small-cell lung cancer patients. Ann Oncol. 2009 Feb;20(2):298-304.

142. Onozato R, Kosaka T, Kuwano H, et al. Activation of MET by gene amplification or by splice mutations deleting the juxtamembrane domain in primary resected lung cancers. J Thorac Oncol. 2009 Jan;4(1):5-11.

143. Engelman JA, Zejnullahu K, Mitsudomi T, et al. MET amplification leads to gefitinib resistance in lung cancer by activating ERBB3 signaling. Science. 2007 May 18;316(5827):1039-43. Epub 2007 Apr 26.

144. Kubo T, Yamamoto H, Lockwood WW, et al. MET gene amplification or EGFR mutation activate MET in lung cancers untreated with EGFR tyrosine kinase inhibitors. Int J Cancer. 2009 Apr 15;124(8):1778-84.

145. Okuda K, Sasaki H, Yukiue H, et al. Met gene copy number predicts the prognosis for completely resected non-small cell lung cancer. Cancer Sci. 2008 Nov;99(11):2280-5.

146. Onozato R, Kosaka T, Kuwano H, et al. Activation of MET by gene amplification or by splice mutations deleting the juxtamembrane domain in primary resected lung cancers. J Thorac Oncol. 2009 Jan;4(1):5-11.

147. Eder JP, Shapiro GI, Appleman LJ, et al. A phase I study of foretinib, a multi-targeted inhibitor of c-Met and vascular endothelial growth factor receptor 2. Clin Cancer Res. 2010 Jul 1;16(13):3507-16.

148. Benedettini E, Sholl LM, Peyton M, et al. Met activation in non-small cell lung cancer is associated with de novo resistance to EGFR inhibitors and the development of brain metastasis. Am J Pathol. 2010 Jul;177(1):415-23.

149. Ichimura E, Maeshima A, Nakajima T, Nakamura T. Expression of c-met/HGF receptor in human non-small cell lung carcinomas in vitro and in vivo and its prognostic significance. Jpn J Cancer Res. 1996 Oct;87(10):1063-9.

150. Liu C, Tsao MS. In vitro and in vivo expressions of transforming growth factor-alpha and tyrosine kinase receptors in human non-small-cell lung carcinomas. Am J Pathol. 1993 Apr;142(4):1155-62.

151. Ma PC, Jagadeeswaran R, Jagadeesh S, et al. Functional expression and mutations of c-Met ADN its therapeutic inhibition with SU11274 and small interfering RNA in non-small cell lung cancer. Cancer Res. 2005 Feb 15;65(4):1479-88.

152. Nakamura Y, Niki T, Goto A, et al. c-Met activation in lung adenocarcinoma tissues: an immunohistochemical analysis. Cancer Sci. 2007 Jul;98(7):1006-13. Epub 2007 Apr 24.

153. Olivero M, Rizzo M, Madeddu R, et al. Overexpression and activation of hepatocyte growth factor/scatter factor in human non-small-cell lung carcinomas. Br J Cancer. 1996 Dec;74(12):1862-8.

154. Siegfried JM, Weissfeld LA, Luketich JD, et al. The clinical significance of hepatocyte growth factor for non-small cell lung cancer. Ann Thorac Surg. 1998 Dec;66(6):1915-8.

155. Xu L, Nilsson MB, Saintigny P, et al. Epidermal growth factor receptor regulates MET levels ADN invasiveness through hypoxia-inducible factor-1alpha in non-small cell lung cancer cells. Oncogene. 2010 May 6;29(18):2616-27.

156. Spigel DR, Burris HA 3rd, Greco FA, et al. Randomized, double-blind, placebo-controlled, phase II trial of sorafenib and erlotinib or erlotinib alone in previously treated advanced non-small-cell lung cancer. J Clin Oncol. 2011 Jun 20;29(18):2582-9.

157. Schubbert S, Shannon K, Bollag G. Hyperactive Ras in developmental disorders and cancer. Nat Rev Cancer. 2007 Apr;7(4):295-308.

158. Ohashi K, Sequist LV, Arcila ME, et al. Characteristics of lung cancers harboring NRAS mutations. Clin Cancer Res. 2013 May 1;19(9):2584-91.

159. Samuels Y, Wang Z, Bardelli A, et al. High frequency of mutations of the PIK3CA gene in human cancers. Science. 2004 Apr 23;304(5670):554. Epub 2004 Mar 11.

160. Kawano O1, Sasaki H, Endo K, Suzuki E, Haneda H, Yukiue H, Kobayashi Y, Yano M, Fujii Y. PIK3CA mutation status in Japanese lung cancer patients. Lung Cancer. 2006 Nov;54(2):209-15. Epub 2006 Aug 22.

161. Spoerke JM, O'Brien C, Huw L, et al. Phosphoinositide 3-kinase (PI3K) pathway alterations are associated with histologic subtypes and are predictive of sensitivity to PI3K inhibitors in lung cancer preclinical models. Clin Cancer Res. 2012 Dec 15;18(24):6771-83.

162. Sequist LV, Waltman BA, Dias-Santagata D, et al. Genotypic and histological evolution of lung cancers acquiring resistance to EGFR inhibitors. Sci Transl Med. 2011 Mar 23;3(75):75ra26.

163. Takahashi M, Ritz J, Cooper GM. Activation of a novel human transforming gene, ret, by DNA rearrangement. Cell. 1985 Sep;42(2):581-8.

164. Airaksinen MS, Titievsky A, Saarma M. GDNF family neurotrophic factor signaling: four masters, one servant?. Mol Cell Neurosci. 1999 May;13(5):313-25.

165. Phay JE, Shah MH. Targeting RET receptor tyrosine kinase activation in cancer. Clin Cancer Res. 2010 Dec 15;16(24):5936-41.

166. Ciampi R, Nikiforov YE. RET/PTC rearrangements and BRAF mutations in thyroid tumorigenesis. Endocrinology. 2007 Mar;148(3):936-41. Epub 2006 Aug 31.

167. Salvatore D, Barone MV, Salvatore G, et al. Tyrosines 1015 and 1062 are in vivo autophosphorylation sites in ret and ret-derived oncoproteins. J Clin Endocrinol Metab. 2000 Oct;85(10):3898-907.

168. Pao W, Hutchinson KE. Chipping away at the lung cancer genome. Nat Med. 2012 Mar 6;18(3):349-51.

169. Ju YS, Lee WC, Shin JY, et al. A transforming KIF5B and RET gene fusion in lung adenocarcinoma revealed from whole-genome and transcriptome sequencing. Genome Res. 2012 Mar;22(3):436-45.

170. Kohno T, Ichikawa H, Totoki Y, et al. KIF5B-RET fusions in lung adenocarcinoma. Nat Med. 2012 Feb 12;18(3):375-7.

171. Takeuchi K, Soda M, Togashi Y, et al. RET, ROS1 and ALK fusions in lung cancer. Nat Med. 2012 Feb 12;18(3):378-81.

172. Lipson D, Capelletti M, Yelensky R, et al. Identification of new ALK and RET gene fusions from colorectal and lung cancer biopsies. Nat Med. 2012 Feb 12;18(3):382-4.

173. Verbeek HH, Alves MM, de Groot JW, et al. The effects of four different tyrosine kinase inhibitors on medullary and papillary thyroid cancer cells. J Clin Endocrinol Metab. 2011 Jun;96(6):E991-5.

174. Drilon A, Wang L, Hasanovic A, et al. Response to Cabozantinib in patients with RET fusion-positive lung adenocarcinomas. Cancer Discov. 2013 Jun;3(6):630-5.

175. Howlader N, Noone AM, Krapcho M et al. (2012). Lung cancer. In: SEER Cancer Statistics Review, 1975-2009 (Vintage 2009 Populations). Bethesda, MD: National Cancer Institute. Available at http://seer.cancer.gov/csr/1975_2009_pops09/.

176. DQ for Health Professionals, « Non-Small Cell Lung Cancer Treatment » [archive], National Cancer Institute.

177. Groome PA, Bolejack V, Crowley JJ, Kennedy C, Krasnick M et al. The IASLC lung cancer staging project: Validation of the proposals for revision of the T, N, ADN M descriptors and consequent stage groupings in the forthcoming (seventh) edition of the TNM classification of malignant tumours. J Thorac Oncol 2007, 2:694-705.

178. Goldstraw P, Crowley J, Chansky K, Giroux DJ, Groome PA et al. The IASLC lung cancer staging project: Proposals for the revision of the TNM stage groupings in the forthcoming (seventh) edition of the TNM classification of malignant tumours. J Thorac Oncol 2007, 2:706-14

179. Mountain CF. Revisions in the international system for staging lung cancer. Chest 1997;111:1710-7

180. A Parsons, A Daley, R Begh, P Aveyard. Influence of smoking cessation after diagnosis of early stage lung cancer on prognosis: systematic review of observational studies with meta-analysis. BMJ 2010;340:b5569

181. Hanahan D, Weinberg RA. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell. 2011 Mar 4;144(5):646-74.

182. Johan L, Jayoun K, Sangcheol K, Donghyeon Y, Kyunga K, Byung Soo K. Detection of differentially expressed gene sets in a partially paired microarray data set. Statistical Applications in Genetics and Molecular Biology, 11(3), 2012.

183. Yi S, Park T. Integrated analysis of the heterogeneous microarray data. BMC bioinformatics, 12(Suppl 5):S3, 2011.

184. Jing W, Dexter D, Zhiao S, Bing Z. Web-based gene set analysis toolkit (webgestalt): update 2013. Nucleic acids research, 41(W1):W77–W83, 2013.

185. Zhang B, Kirov S, Snoddy J. Webgestalt. An integrated system for exploring gene sets in various biological contexts. Nucleic acids research, 33(suppl 2):W741–W748, 2005.

186. Candi E, Schmidt R, Melino G. The cornified envelope: a model of cell death in the skin. Nature reviews Molecular cell biology, 6(4):328–340, 2005.

187. Godessart N, Kunkel SL. Chemokines in autoimmune disease. Current opinion in im- munology, 13(6):670–675, 2001.

188. Oertelt-Prigione S. The influence of sex and gender on the immune response. Autoimmunity reviews, 11(6):A479–A485, 2012.

189. Jansen R, Batista S, Brooks AI, et al. Sex differences in the human peripheral blood transcriptome. BMC genomics, 15(1):33, 2014.

190. Draghici S, Khatri P, Tarca AL, et al. A systems biology approach for pathway level analysis. Genome Research, 17(10):1537–1545, 2007.

191. Tarca AL, Draghici S, Khatri P, et al. A novel signaling pathway impact analysis. Bioinformatics, 25(1):75–82, 2009.

192. West H, Albain KS. Current standards and ongoing controversies in the management of locally advanced non-small cell lung cancer. Semin Oncol 2005;32:284–92.

193. Feld R, Rubinstein LV, Weisenberger TH. Sites of recurrence in resected stage I non-small-cell lung cancer: a guide for future studies. J Clin Oncol 1984;2:1352–8.

194. Immerman SC, Vanecko RM, Fry WA, Head LR, Shields TW. Site of recurrence in patients with stages I and II carcinoma of the lung resected for cure. Ann Thorac Surg 1981;32:23–7.

195. Felip E, Pavlidis N, Stahel RA. ESMO Guidelines Task Force. ESMO Minimum Clinical Recommendations for diagnosis, treatment and follow- up of non-small cell lung cancer (NSCLC). Ann Oncol 2005;16:28–31.

196. Song WA, Zhou NK, Wang W, Chu XY, Liang CY, Tian XD et al. Survival benefit of neoadjuvant chemotherapy in non-small cell lung cancer: an updated meta-analysis of 13 randomized control trials. J Thorac Oncol 2010;5:510–6.

197. Ettinger DS, Akerley W, Borghaei H, si colab. Non-small cell lung cancer. J. Natl. Compr. Cancer Netw. 2012, 10, 1236-1271.

198. Kalemkerian GP, Akerley W, Bogner P, et al. Small cell lung cancer. J. Natl. Compr. Cancer Netw. 2013, 11, 78-98.

199. Bhattacharjee A, Richards WG, Staunton J, et al. Classification of human lung carcinomas by mRNA expression profiling reveals distinct adenocarcinoma subclasses. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2001, 98, 13790-13795.

200. Beer DG, Kardia SL, Huang CC, et al. Gene-expression profiles predict survival of patients with lung adenocarcinoma. Nat. Med. 2002, 8, 816-824.

201. Garber ME, Troyanskaya OG, Schluens K, et al. Diversity of gene expression in adenocarcinoma of the lung. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2001, 98, 13784-13789.

202. Hayes DN, Monti S, Parmigiani G, et al. Gene expression profiling reveals reproducible human lung adenocarcinoma subtypes in multiple independent patient cohorts. J. Clin. Oncol. 2006, 24, 5079-5090.

203. Park YY, Park ES, Kim SB, et al. Development and validation of a prognostic gene-expression signature for lung adenocarcinoma. PLoS One 2012, 7,

204. Takeuchi T, Tomida S, Yatabe Y, et al. Expression profile-defined classification of lung adenocarcinoma shows close relationship with underlying major genetic changes and clinicopathologic behaviors. J. Clin. Oncol. 2006, 24, 1679-1688.

205. Warth A, Muley T, Meister M, et al. The novel histologic International Association for the Study of Lung Cancer/American Thoracic Society/European Respiratory Society classification system of lung adenocarcinoma is a stage-independent predictor of survival. J. Clin. Oncol. 2012, 30, 1438-1446.

206. Travis WD, Brambilla E, Riely GJ. New pathologic classification of lung cancer: Relevance for clinical practice and clinical trials. J. Clin. Oncol. 2013, 31, 992-1001.

207. Inamura K, Fujiwara T, Hoshida Y, et al. Two subclasses of lung squamous cell carcinoma with different gene expression profiles and prognosis identified by hierarchical clustering and non-negative matrix factorization. Oncogene 2005, 24, 7105-7113.

208. Raponi M, Zhang Y, Yu J, et al. Gene expression signatures for predicting prognosis of squamous cell and adenocarcinomas of the lung. Cancer Res. 2006, 66, 7466-7472.

209. Wilkerson MD, Yin X, Hoadley KA, et al. Lung squamous cell carcinoma mRNA expression subtypes are reproducible, clinically important, and correspond to normal cell types. Clin. Cancer Res. 2010, 16, 4864-4875.

210. The Cancer Genome Atlas Research Network. Comprehensive genomic characterization of squamous cell lung cancers. Nature 2012, 489, 519-525.

211. Landi MT, Zhao Y, Rotunno M, et al. MicroRNA expression differentiates histology and predicts survival of lung cancer. Clin. Cancer Res. 2010, 16, 430-441.

212. Yamaguchi A, Nozawa K, Fujishiro M, et al. Estrogen inhibits apoptosis and promotes cc motif chemokine ligand 13 expression on synovial fibroblasts in rheumatoid arthritis. Immunopharmacology and immunotoxicology, 34(5):852–857, 2012.

213. Nilsson BO. Modulation of the inflammatory response by estrogens with focus on the endothelium and its interactions with leukocytes. Inflammation Research, 56(7):269–273, 2007.

214. Hohla F, Hopfinger G, Romeder F, et al. Female gender may predict response to folfirinox in patients with unresectable pancreatic cancer: A single institution retrospective review. International journal of oncology, 44(1):319–326, 2014.

215. Rodriguez-Lara V, Peña-Mirabal E, Baez-Saldana R, et al. Estrogen receptor beta and cxcr4/cxcl12 expression: Differences by sex and hormonal status in lung adenocarcinoma. Archives of Medical Research, 2014.

216. Szymanowska-Narloch A, Jassem E, Skrzypski M, et al. Molecular profiles of non-small cell lung cancers in cigarette smoking and never-smoking patients. Advances in medical sciences, pages 1–11, 2014.

217. Betticher DC, Hsu Schmitz SF, Tötsch M, Hansen E, Joss C, von Briel C et al. Prognostic factors affecting long term outcomes in patients with resected stage IIIA pN2 non-small-cell lung cancer: 5-year follow-up of a phase II study. Br J Cancer 2006;94:1099–106.

218. Liao WY, Chen JH, Wu M, Shih JY, Chen KY, Ho CC et al. Neoadjuvant chemotherapy with docetaxel-cisplatin in patients with stage III N2 non-small-cell lung cancer. Clin Lung Cancer 2013;14:418–24.

219. Chen HY, Yu SL, Chen CH, Chang GC, Chen CY, Yuan A, Cheng CL, Wang CH, Terng HJ, Kao SF, et al: A five-gene signature and clinical outcome in non-small-cell lung cancer. N Engl J Med 2007, 356:11–20.

220. Larsen JE, Pavey SJ, Passmore LH, Bowman RV, Hayward NK, Fong KM: Gene expression signature predicts recurrence in lung adenocarcinoma. Clin Cancer Res 2007, 13:2946–2954.

221. Dowsett M, Cuzick J, Wale C, Forbes J, Mallon EA, Salter J, Quinn E, Dunbier A, Baum M, Buzdar A, et al: Prediction of risk of distant recurrence using the 21-gene recurrence score in node-negative and node-positive postmenopausal patients with breast cancer treated with anastrozole or tamoxifen: a TransATAC study. J Clin Oncol 2010, 28:1829–1834.

222. Marx V. Next-generation sequencing: The genome jigsaw. Nature 2013;501:263-8.

223. Green ED, Guyer MS, National Human Genome Research Institute. Charting a course for genomic medicine from base pairs to bedside. Nature 2011;470:204-13.

224. Leary RJ, Sausen M, Diaz LA Jr, et al. Cancer detection using whole- genome sequencing of cell free DNA. Oncotarget 2013;4:1119-20.

ANEXE

Traducere din limba franceză

Președinte:

V.G. LEVY

Vicepreședinte:

A. KURTZ

Secretar general:

J.L. PRUGNAUD

Secretar general adjunct:

F. BERGIER DESCOMBES tel.: 01 49 28 20 25

Trezorier: fax: 01 49 28 20 46

A. OLYMPIE

Trezorier adjunct: cpp.iledefrance5@sat.aphp.fr

A. ROUSSEAU

Paris, 5 octombrie 5 octombrie 2010

Doamna Madalina GRIGOROIU

Serviciul de chirurgie toracică

Spitalul HOTEL DIEU FOCH

40 rue Worth

92151 SURESNES

Proiect de cercetare biomedicală înregistrat cu numărul: 10794

Comitetul a fost sesizat la 1 februarie 2010

cu privire la proiectul de cercetare medicală următor:

Profilul genic al cancerelor bronho-pulmonare primitive cu celule non-mici și invazia ganglionilor mediastinali

Promotor: Institutul Clinic Fundeni – București – România

Cercetător principal: Prof. J.F. REGNARD

Comitetul a examinat informațiile referitoare la acest proiect în timpul ședinței de marți, 5 octombrie 2010

Raportorii mandatați au fost: dna FELDMANN, dl BESSIERE

Comitetul a adoptat următoarea decizie: AVIZ FAVORABIL, modificările solicitate fiind acceptate

Președinte

V.G. LEVY

Semnătură indescifrabilă

Traducere din limba franceză

Președinte:

V.G. LEVY

Vicepreședinte:

A. KURTZ

Secretar general:

J.L. PRUGNAUD

Secretar general adjunct:

F. BERGIER DESCOMBES tel.: 01 49 28 20 25

Trezorier: fax: 01 49 28 20 46

A. OLYMPIE

Trezorier adjunct: cpp.iledefrance5@sat.aphp.fr

A. ROUSSEAU

Au participat la deliberare

Primul colegiu:

Cercetare biomedicală: dl BOFFA (T), dl BOUILLE (S), dl DONADIEU (T), dna FELDMANN (S), dl LEVY (T)

Medic generalist: dl TAULERA (T)

Farmacist de spital: dna BERGIER DESCOMBES (T), dna ZOUAI (S)

Al doilea colegiu:

Competență juridică: dra DELVA (T), dl PRADEAU (T)

Probleme etice: dna DAUXOIS (T)

Psiholog: dna KURTZ (T), dna LEFEVRE

Asociații agreate: dl BESSIERE (T), dl OLYMPIE (T)